CN102432671A - 能够抑制肝癌生长转移的靶向多肽spscvlp及用途 - Google Patents

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张巨波
孙惠川
任正刚
徐泱
张博恒
樊嘉
汤钊猷
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Abstract

本发明本发明提供了一种靶向肝癌血管内皮细胞的多肽及用途，其特征在于，由氨基酸序列SPSCVLP组成。本发明的多肽SPSCVLP可以靶向肝癌血管内皮细胞，主要抑制肿瘤血管内皮细胞的PI3K-AKT信号通路，抑制其生物学功能，而对正常肝组织内皮细胞无显著影响。

Description

能够抑制肝癌生长转移的靶向多肽SPSCVLP及用途
技术领域
 本发明涉及一种能够抑制肝癌生长转移的靶向多肽SPSCVLP。
背景技术
肝细胞肝癌（简称肝癌）是世界上最常见、恶性度最高的肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第6位、死因的第3位，在我国已成为恶性肿瘤的第2位死因。近几十年来尽管对肝癌的基础研究和诊断治疗都取得了显著进步，但肝癌的总体预后仍然很差，并没有显著的改善，5年生存率仅为5%左右。能够有治愈可能的治疗方法是手术切除，但大多数肝癌首次诊断已属晚期，适合手术治疗的肝癌患者只有10％，即使手术切除后还存在复发的问题，术后5年复发率40%-60%；而复发是术后死亡的首要原因，且大多数复发患者也不适合手术切除；对于不适合手术治疗的肝癌患者，目前常用的方法是介入治疗；由于我国肝癌患者大多伴有肝硬化，因此许多患者无法耐受介入治疗的副作用。Sorafenib等靶向药物虽然能延长部分患者的生存，但临床副反应显著，导致部分患者不能耐受。近期的研究还表明Sorafenib会增加肿瘤细胞的侵袭性和肝内播散。因此，临床上迫切需要治疗肝癌的新药。此外，由于疾病本身的特点，治疗肝癌的药物需为低毒、靶向。 
鉴于肝癌治疗的复杂性，目前临床治疗肝癌尚缺乏有效的药物。已有的药物疗效还远不尽如人意，且具有明显的毒副作用。多肽药物除了能够与其靶向的受体分子特异结合外，还具有分子量小，无免疫原性；只与特定受体结合发挥作用，靶向性较好；可人工合成，或基因工程生产等显著优点。但多肽在体内容易被降解，半衰期短，导致针对肿瘤细胞本身的多肽不能产生明显的肿瘤抑制作用。肿瘤血管内皮细胞作为肿瘤微环境中重要的间质细胞对于维持肿瘤的生长发挥着重要的作用。同时肿瘤内新生血管壁的高通透性非常有利于肿瘤细胞离开原发部分向远处转移。因此，抑制肿瘤血管生成是目前肿瘤靶向治疗研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够抑制肝癌生长转移的靶向多肽及其用途。
 为了达到上述目的，本发明提供了一种靶向肝癌血管内皮细胞的多肽，其特征在于，由氨基酸序列SPSCVLP:Ser- Pro- Ser- Cys- Val- Leu- Pro (丝氨酸-脯氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-亮氨酸-脯氨酸)组成。
 优选地，所述的氨基酸序列的氨基端标记FITC绿色荧光基团。
 本发明还提供了上述靶向肝癌血管内皮细胞的多肽在制备抑制肝癌生长转移药物中的用途。
本发明的原理如下：
肿瘤血管内皮细胞和正常血管内皮细胞间存在差异，但如何发现两者的差异是研究的难点之一：首先血管内皮细胞不容易分离纯化；其次血管内皮细胞体外培养会丧失很多固有的生物学属性；再者确认两者具体的分子靶点存在困难。
本发明采用磁珠分选技术，在国际上首先利用CD105磁珠分选到肝癌血管内皮细胞（TEC）和正常肝组织血管内皮细胞（NEC）。在噬菌体展示技术的基础上，采用体外快速差减筛选（BRASIL）方法筛选出针对TEC的多肽SPSCVLP。BLAST结果提示SPSCVLP和胎盘生长因子PlGF高度同源。研究表明，PlGF在正常组织中基本不表达，而在肿瘤环境中PlGF-VEGFR1通路过度激活，促进肿瘤细胞生长转移。体外实验表明SPSCVLP多肽能显著抑制TEC的增殖、运动和成管，并抑制血管内皮细胞生长因子VEGF刺激下TEC膜表面VEGF受体1的再分布和关键分子磷酸化水平。体内实验结果提示该多肽经尾静脉注射后能在肝癌局部富集，而肝组织中仅有微量的表达，静脉给药能抑制肝癌的生长，尤其是减少肺转移。
本发明的多肽SPSCVLP可以靶向肝癌血管内皮细胞，主要抑制肿瘤血管内皮细胞的PI3K-AKT信号通路，抑制其生物学功能，而对正常肝组织内皮细胞无显著影响。
本发明的靶向多肽可以用于肝癌的实验研究：包括体外观察肝癌血管内皮细胞的生物学功能和体内实验观察SPSCVLP多肽对肝癌生长转移的抑制；早期诊断肝内微小转移灶和肺转移灶；在评估毒副作用的前提下开展临床1期实验研究，观察临床肝癌病人应用该多肽治疗后的毒副反应和治疗效果。
附图说明
    图1为脐静脉内皮细胞（HUVECs）、正常肝组织血管内皮细胞（NECs）、肝癌血管内皮细胞（TECs）在不同培养条件下增殖的比较图；
    图2为TECs、HUVECs、NECs的运动和成管能力比较图；
    图3为CD105+TEC、HUVEC、NEC的黏附能力比较图；
图4为HUVEC、NEC、CD105+TEC对氟尿嘧啶的抗性比较图；
图5为HUVEC、NEC、CD105+TEC对阿霉素的抗性比较图；
图6为HUVEC、NEC、CD105+TEC对索拉菲尼的抗性比较图；
图7为SPSCVLP抑制TEC成管并促使VEGF受体1重新分布图；
图8为VEGF刺激条件下肿瘤血管内皮细胞VEGFR/AKT/Src通路关键分子的磷酸化水平图；
图9为FITC-SPSCVLP多肽体内注射不同时间点在肝脏和肿瘤内分布的差异图；
图10为SPSCVLP多肽对肝脏原为种植的人肝癌的抑制作用图。
具体实施方式
下面结合实施例来具体说明本发明。
实施例
（1）采用磁珠分选技术，利用CD105磁珠分选到肝癌血管内皮细胞（TEC）和正常肝组织血管内皮细胞（NEC），并对二者的生物学特性进行了鉴定，发现TEC和NEC存在着较多的生物学差异。如图1～3所示，与NEC相比，TEC具有更强的血管生成、增殖和运动以及黏附能力，如图4～6所示，TEC对抗血管生成的靶向药物以及化疗药物具有更强的耐受力。
（2）通过BRASIL方法筛选随机噬菌体肽库：首先将随机噬菌体肽库与NEC共育, 这样得到的新噬菌体肽库就消除了与NEC细胞表面结合的非特异性噬菌体，然后再筛选与TEC细胞表面结合的噬菌体。由于TEC和相应的NEC具有相似的遗传背景，从而消除了不同样本由于遗传背景不同而固有的性状差异，将混杂因素减少到最低。研究显示：经过3轮连续差减筛选，获得9种肽序列，其中展示SPSCVLP肽的噬菌体被高度富集。
  （3）人工多肽合成及标记： 人工合成SPSCVLP及其随机对照肽，并在氨基端标记FITC绿色荧光，所述人工合成由上海生工生物工程有限公司按照行业标准方法合成，所述随机对照肽为与本发明的靶向多肽氨基酸组分相同但随机组合的多肽。
  （4）靶向多肽的体外实验：
将筛选到的TEC（2～5代）和NEC（2～5代）分别在六孔板培养，加入25nmol/L的SPSCVLP，分别采用MTT法检测TEC和NEC的增殖，流式细胞仪 Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡，划痕实验和成管实验检测TEC和NEC的运动和成管能力。同时给予VEGF刺激，激光共聚焦检测VEGFR1的分别，Western blot方法检测现有关键分子VEGFR1、AKT、ERK、Src磷酸化水平。
体外研究结果提示，如图7所示，SPSCVLP能显著抑制TEC的血管生成，对裸鼠原位种植的人肝癌的生长和转移具有抑制作用。免疫荧光结果表明，在血管内皮细胞生长因子作用下，TEC细胞表面的VEGFR1发生再分布，并成管腔样排列，而SPSCVLP可以抑制VEGFR1的再分布。进一步提取纯化膜蛋白检测发现，SPSCVLP能显著抑制细胞膜上VEGFR1的内吞和循环，进而影响VEGFR1在细胞膜上的再分布。如图8所示，体现在信号通路上表现为VEGFR1、AKT、ERK、Src磷酸化水平显著降低。
  （5）肝癌原位接种肺转移模型的建立：取对数生长期的MHCC-97H细胞，用含0.25%胰蛋白酶和0.25%EDTA的消化液消化，制成浓度为5×105个/0.2ml单细胞悬液，接种于裸鼠右肩背部皮下。长至1cm大小后取出皮下瘤，切割成1mm×1mm×1mm大小，原位接种至裸鼠肝脏。
  （6）体内分布实验：取原位接种的MHCC-97H肝癌长至1.5cm大小的裸鼠，尾静脉注射FITC-SPSSCVLP 5nmol/L 100ul，注射前以及注射后不同时间点在体视荧光显微镜下观察绿色荧光在肝脏以及肿瘤的分布。3小时后取出肾、心、脾观察是否有荧光分布。
体内研究结果表明，如图9所示,FITC-SPSCVLP经尾静脉注射到原位种植人肝癌裸鼠体内，主要分布在肝癌内，而很少分布在肝脏上以及脾、肾、心、肠管等器官。
（7）SPSCVLP抑制MHCC-97H生长和转移：取皮下接种MHCC-97H 10天的裸鼠，尾静脉注射SPSCVLP，静脉给药，每只裸鼠200ul，每4天1次。动态检测皮下瘤的大小。50天后收获肿瘤和肺组织，称量肿瘤重量，肺组织切片HE染色，计数肺转移率。
如图10所示，SPSCVLP尾静脉注射治疗原位种植人肝癌裸鼠发现该多肽能部分抑制原位接种的肿瘤，对肺转移则有显著的抑制作用，同时还发现SPSCVLP治疗组裸鼠的重量高于对照组。
<110> 复旦大学附属中山医院
<120> 能够抑制肝癌生长转移的靶向多肽SPSCVLP及用途
<160> 1
<170> PatentIn Version 3.3
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工合成
<222>（1）...（7）
<400> 1
Ser Pro Ser Cys Val Leu Pro
1 5
 

Claims (3)

1.一种靶向肝癌血管内皮细胞的多肽，其特征在于，由氨基酸序列SPSCVLP组成。
2.如权利要求1所述的靶向肝癌血管内皮细胞的多肽，其特征在于，所述的氨基酸序列的氨基端标记FITC绿色荧光基团。
3.权利要求1所述的靶向肝癌血管内皮细胞的多肽在制备抑制肝癌生长转移药物中的用途。
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