CN103160531B - Ngr-vegi融合蛋白及其编码基因与表达纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种NGR-VEGI融合蛋白基因，其序列见SEQ ID NO.1，还公开了采用该基因编码的NGR-VEGI融合蛋白以及表达纯化NGR-VEGI融合蛋白的方法，该方法为：一、合成NGR-VEGI融合蛋白基因；二、构建得到融合蛋白原核表达载体；三、将融合蛋白原核表达载体转入大肠杆菌中进行融合蛋白的诱导表达；四、采用镍柱亲和层析进行分离纯化，得到NGR-VEGI融合蛋白。本发明通过设计NGR-VEGI融合蛋白基因，将NGR基序的肿瘤血管靶向性和VEGI较强的抗肿瘤血管生成作用结合在一起，采用高浓度的蛋白诱导表达方法，成功合成了NGR-VEGI融合蛋白，提高了VEGI在肿瘤组织的富集浓度。

Description

NGR-VEGI融合蛋白及其编码基因与表达纯化方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种NGR-VEGI融合蛋白及其编码基因与表达纯化方法。

背景技术

众所周知血管形成是实体肿瘤生长的限速步骤，肿瘤生物治疗是近年来发展的继手术、放疗、化疗之后肿瘤治疗方法学中的又一重要手段。由于肿瘤的生长、局部浸润与转移均依赖于肿瘤新血管的形成，使得抗血管生成治疗成为了肿瘤生物治疗研究领域的热点之一。新生血管常高表达一些在正常血管低表达甚至无表达的分子标志，包括αvβ3和αvβ5整合素、氨肽酶N、血管生长因子受体、基质金属蛋白酶（氨肽酶N属于基质金属蛋白酶）等。靶向分子的单克隆抗体具有高特异性，但其生产成本较高、长期使用有诱发产生抗抗体的风险。其它非抗体类制剂由于靶向性较差，使用剂量偏高，容易诱发毒副作用。虽然肿瘤血管靶向基序，包括RGD基序和NGR基序等，可以大幅度提高非抗体类生物制剂的肿瘤靶向性和肿瘤控制率并可在一定程度上减少使用剂量，但其仍存在使用周期长、不具备直接肿瘤细胞杀伤作用等缺点。

VEGI又称TNFSF-15，是肿瘤坏死因子家族成员，作为内皮细胞特异性基因，重组VEGI能有效抑制内皮细胞增生、血管形成和肿瘤生长。VEGI对内皮细胞的作用表现为可使生长刺激作用下的G0/G1细胞阻滞在G1期，另外可以诱导增生的内皮细胞凋亡。人VEGI基因长约17kb，由4个外显子构成，可产生3个剪接变异体，分别为VEGI-174、VEGI-192和VEGI-251。资料表明VEGI可以通过高效抑制肿瘤血管形成，达到有效控制肿瘤演进并诱发肿瘤消退，因此VEGI可以作为一种新的抗血管生成制剂用于恶性肿瘤治疗，但是单纯VEGI在肿瘤部位富集性差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种NGR-VEGI融合蛋白基因。该基因将NGR基序的肿瘤血管靶向性和VEGI较强的抗肿瘤血管生成作用结合在一起，利用柔性接头连接肿瘤血管靶向基序NGR和VEGI，避免因空间阻碍影响两个功能域同时发挥作用，提高了VEGI在肿瘤组织的富集浓度。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种NGR-VEGI融合蛋白基因，其特征在于，其序列（SEQ ID NO.1）如下：

ATGGGCAGCA GCCATCATCA TCATCATCAC AGCAGCGGCC TGGTGCCGCG CGGCAGCCAT  60

ATGTGCAACG GCCGCTGCGT GAGCGGCTGC GCGGGCCGCT GCGGCAGCGG CCGCCAGACC  120

CCGACCCAGC ATTTTAAAAA CCAGTTTCCG GCGCTGCATT GGGAACATGA ACTGGGCCTG  180

GCGTTTACCA AAAACCGCAT GAACTATACC AACAAATTTC TGCTGATTCC GGAAAGCGGC  240

GATTATTTTA TTTATAGCCA GGTGACCTTT CGCGGCATGA CCAGCGAATG CAGCGAAATT  300

CGCCAGGCGG GCCGCCCGAA CAAACCGGAT AGCATTACCG TGGTGATTAC CAAAGTGACC  360

GATAGCTATC CGGAACCGAC CCAGCTGCTG ATGGGCACCA AAAGCGTGTG CGAAGTGGGC  420

AGCAACTGGT TTCAGCCGAT TTATCTGGGC GCGATGTTTA GCCTGCAGGA AGGCGATAAA  480

CTGATGGTGA ACGTGAGCGA TATTAGCCTG GTGGATTATA CCAAAGAAGA TAAAACCTTT  540

TTTGGCGCGT TTCTGCTGTA ACTCGAG                                      567

本发明还提供了一种NGR-VEGI融合蛋白，其特征在于，其由所述NGR-VEGI融合蛋白基因编码。

另外，本发明还提供了表达纯化上述NGR-VEGI融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、采用人工方法合成NGR-VEGI融合蛋白基因；

步骤二、构建融合蛋白原核表达载体：将步骤一中所述NGR-VEGI融合蛋白基因克隆至原核表达载体，构建得到融合蛋白原核表达载体；

步骤三、融合蛋白的诱导表达：将步骤二中所述融合蛋白原核表达载体转入大肠杆菌中进行融合蛋白的诱导表达；

步骤四、融合蛋白的分离纯化：将步骤三中经诱导表达融合蛋白的大肠杆菌裂解后离心，然后将离心后收集的上清液采用镍柱亲和层析进行分离纯化，得到NGR-VEGI融合蛋白。

上述的方法，步骤二中所述构建融合蛋白原核表达载体的方法为：将NGR-VEGI融合蛋白基因的5’端融合NdeI酶切位点，3’端融合XhoI酶切位点，进行双酶切，然后装入PET-28a载体，利用载体上的序列，N端融合His-Tag，构建得到融合蛋白原核表达载体。

上述的方法，步骤三中所述融合蛋白的诱导表达采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷作为诱导剂。

进一步的，本发明还提供了上述NGR-VEGI融合蛋白作为NGR靶向血管诊疗用药物的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明通过设计NGR-VEGI融合蛋白基因，将NGR基序的肿瘤血管靶向性和VEGI较强的抗肿瘤血管生成作用结合在一起，利用柔性接头连接肿瘤血管靶向基序NGR和VEGI，避免因空间阻碍影响两个功能域同时发挥作用，并采用高浓度的蛋白诱导表达方法，成功合成了NGR-VEGI融合蛋白，提高了VEGI在肿瘤组织的富集浓度。

2、本发明纯化合成的NGR-VEGI在大幅度提高肿瘤血管靶向生物制剂对恶性肿瘤治疗效果的同时，降低了生物制剂的使用剂量，能最大限度避免发生药物毒副作用，实现了NGR基序介导的VEGI肿瘤靶向给药。

下面结合附图和实施例，对本发明技术方案做进一步的详细说明。

附图说明

图1为重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-NGR-VEGI不同诱导时间的SDS-PAGE图。

图2为纯化后得到的NGR-VEGI融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图3为未经处理的HUVEC细胞的流式细胞仪检测图。

图4为经20ng/mL NGR处理后的HUVEC细胞的流式细胞仪检测图。

图5为经200ng/mL NGR处理后的HUVEC细胞的流式细胞仪检测图。

图6为经20ng/mL VEGI处理后的HUVEC细胞的流式细胞仪检测图。

图7为经200ng/mL VEGI处理后的HUVEC细胞的流式细胞仪检测图。

图8为经20ng/mL本发明NGR-VEGI融合蛋白处理后的HUVEC细胞的流式细胞仪检测图。

图9为经200ng/mL本发明NGR-VEGI融合蛋白处理后的HUVEC细胞的流式细胞仪检测图。

图10为¹⁸⁸Re-NGR-VEGI的SPECT显像图。

具体实施方式

实施例1、采用人工方法合成NGR-VEGI融合蛋白基因：

依据大肠杆菌偏爱的密码子，将NGR与VEGI的氨基酸序列转化为基因序列，经柔性肽段甘氨酸和丝氨酸相连，5’端引入NdeⅠ酶切位点，3’端引入XhoⅠ酶切位点，人工合成NGR-VEGI融合蛋白基因，其序列（SEQ IDNO.1）如下：

ATGGGCAGCA GCCATCATCA TCATCATCAC AGCAGCGGCC TGGTGCCGCG CGGCAGCCAT  60

ATGTGCAACG GCCGCTGCGT GAGCGGCTGC GCGGGCCGCT GCGGCAGCGG CCGCCAGACC  120

CCGACCCAGC ATTTTAAAAA CCAGTTTCCG GCGCTGCATT GGGAACATGA ACTGGGCCTG  180

GCGTTTACCA AAAACCGCAT GAACTATACC AACAAATTTC TGCTGATTCC GGAAAGCGGC  240

GATTATTTTA TTTATAGCCA GGTGACCTTT CGCGGCATGA CCAGCGAATG CAGCGAAATT  300

CGCCAGGCGG GCCGCCCGAA CAAACCGGAT AGCATTACCG TGGTGATTAC CAAAGTGACC  360

GATAGCTATC CGGAACCGAC CCAGCTGCTG ATGGGCACCA AAAGCGTGTG CGAAGTGGGC  420

AGCAACTGGT TTCAGCCGAT TTATCTGGGC GCGATGTTTA GCCTGCAGGA AGGCGATAAA  480

CTGATGGTGA ACGTGAGCGA TATTAGCCTG GTGGATTATA CCAAAGAAGA TAAAACCTTT  540

TTTGGCGCGT TTCTGCTGTA ACTCGAG                                      567

实施例2、构建融合蛋白原核表达载体：

设计PCR引物F（SEQ ID NO.2）、R（SEQ ID NO.3），对合成的NGR-VEGI融合蛋白基因进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物F:5’-ACCATATG GTATACACGTTGCCG-3’

下游引物R:5’-GTCTCGAGTTAGAGCAGAAACGC-3’

PCR反应体系如下：

PCR反应的循环参数：95℃预变性5min后，按下列参数循环30次：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min；最后再于72℃延伸10min。

将PCR产物和PET-28a载体分别用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，T4DNA连接酶连接得到连接产物，将连接产物转化DE3感受态细胞，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段，将此质粒命名为融合蛋白原核表达载体pET28a-NGR-VEGI。

实施例3、NGR-VEGI融合蛋白的诱导表达：

将融合蛋白原核表达载体pET28a-NGR-VEGI转入大肠杆菌BL21（DE3），获得重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-NGR-VEGI；将重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-NGR-VEGI于37℃，200rpm，培养1h后离心（4000rpm离心5min），弃上清，重悬细胞沉淀，将重悬后的细胞涂布于含有氯霉素抗性的LB培养皿中，37℃倒置培养过夜；挑取边缘整齐，生长状态良好的菌落接种于4mL LB培养液（含氨苄青霉素100mg/L）中，摇床37℃培养过夜，次日以1∶100的体积比接种于新鲜LB培养液（含氨苄青霉素100mg/L）中，37℃继续培养至细菌密度达到OD₆₀₀=0.4～0.6，向培养液中加入0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导4h后收集菌体。

图1为重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-NGR-VEGI不同诱导时间的SDS-PAGE图。图中泳道1为蛋白marker；泳道2为无IPTG诱导的阴性对照；泳道3为IPTG诱导1h；泳道4为IPTG诱导2h；泳道5为IPTG诱导3h；泳道6为IPTG诱导4h；可见IPTG诱导后随时间延长目的蛋白NGR-VEGI表达增高。

实施例4、NGR-VEGI融合蛋白的分离纯化：

按1g菌体加10mL STE裂菌缓冲液（含20mM Tris-HCl pH7.5、100mMNaCl、1mM EDTA）的比例将菌体重悬，在冰浴中超声裂解菌体，功率300W，工作时间5s，间歇时间10s，全程时间30min，离心（12000rpm×20min，4℃）后收集上清液，向收集的上清液中加入固体(NH₄)₂SO₄至60%饱和度，4℃静置1h后离心（12000rpm×20min，4℃），收集上清液；预装镍亲和层析柱，采用5倍柱体积蒸馏水洗柱，然后用5倍柱体积的缓冲液（20mM Tris-HClpH7.9，10wt%甘油，0.5M氯化钠）平衡柱，将第二次收集的上清液过柱，采用含10mM、50mM和250mM咪唑的缓冲液（20mMTris-HCl pH7.9，10wt%甘油，0.5M氯化钠）连续梯度洗脱25个柱体积，收集洗脱液，采用透析液（20mM Tris-HCl pH7.0，1mM EDTA）对收集的目的蛋白所在洗脱峰进行透析，中间换液三到四次，用0.22μm滤膜过滤除菌，冻干分装后-20℃保存。图2为纯化后得到的NGR-VEGI融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。

实施例5、NGR-VEGI融合蛋白在作为NGR靶向血管药物的应用

1、NGR-VEGI融合蛋白的活性检测

采用流式细胞技术检测NGR、NGR-VEGI和VEGI（Roche公司）分别对HUVEC细胞（人脐静脉内皮细胞）的生长抑制效应，以正常HUVEC细胞作为空白对照，具体过程为：正常培养HUVEC细胞，然后分别加入不同剂量的NGR、VEGI和NGR-VEGI（终浓度20ng/mL和200ng/mL），37℃、5%CO₂条件下处理8h；1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，细胞消化计数离心后用PBS轻轻重悬细胞；取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；加入5μLAnnexin V-FITC，轻轻混匀；室温（20℃～25℃）避光孵育10分钟；加入10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置；进行流式细胞仪检测。结果见图3至图9，其中图3为未经处理的HUVEC细胞空白对照的流式细胞仪检测图。图4至图9分别为经不同剂量的NGR、VEGI和NGR-VEGI处理后的HUVEC细胞的流式细胞仪检测图。从图中可以看出，单纯的NGR对细胞基本无抑制生长作用，NGR-VEGI融合蛋白杀伤效果明显，与VEGI的杀伤效果相当。

2、NGR-VEGI靶向性活体检测

采用BALB/c小鼠4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型（雌性，4W龄，由第四军医大学实验动物中心提供），经尾静脉注射放射性核素铼-188标记NGR-VEGI（¹⁸⁸Re-NGR-VEGI）0.2mCi后于配备针孔准直器的单探头SPECT进行成像，观察¹⁸⁸Re-NGR-VEGI的体内生物结合特性，结果见图10，从图中可明显看出，肿瘤部位注射药物后1h起开始有放射性浓聚，24h时肿瘤仍有放射性浓聚，证明本发明表达纯化的NGR-VEGI融合蛋白具有肿瘤靶向性，可以作为靶向血管诊疗用药物，用于肿瘤活体显像和后续治疗研究。

综上所述，本发明通过设计NGR-VEGI融合蛋白基因，将NGR基序的肿瘤血管靶向性和VEGI较强的抗肿瘤血管生成作用结合在一起，利用柔性接头连接肿瘤血管靶向基序NGR和VEGI，避免因空间阻碍影响两个功能域同时发挥作用，并采用高浓度的蛋白诱导表达方法，成功合成了NGR-VEGI融合蛋白，提高了VEGI在肿瘤组织的富集浓度。纯化合成的NGR-VEGI在大幅度提高肿瘤血管靶向生物制剂对恶性肿瘤治疗效果的同时，降低了生物制剂的使用剂量，能最大限度避免发生药物毒副作用，实现了NGR基序介导的VEGI肿瘤靶向给药。

Claims (2)

1.一种表达纯化NGR-VEGI融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、采用人工方法合成NGR-VEGI融合蛋白基因；所述NGR-VEGI融合蛋白基因的序列如下：

ATGGGCAGCA GCCATCATCA TCATCATCAC AGCAGCGGCC TGGTGCCGCG CGGCAGCCAT     60

ATGTGCAACG GCCGCTGCGT GAGCGGCTGC GCGGGCCGCT GCGGCAGCGG CCGCCAGACC     120

CCGACCCAGC ATTTTAAAAA CCAGTTTCCG GCGCTGCATT GGGAACATGA ACTGGGCCTG     180

GCGTTTACCA AAAACCGCAT GAACTATACC AACAAATTTC TGCTGATTCC GGAAAGCGGC     240

GATTATTTTA TTTATAGCCA GGTGACCTTT CGCGGCATGA CCAGCGAATG CAGCGAAATT     300

CGCCAGGCGG GCCGCCCGAA CAAACCGGAT AGCATTACCG TGGTGATTAC CAAAGTGACC     360

GATAGCTATC CGGAACCGAC CCAGCTGCTG ATGGGCACCA AAAGCGTGTG CGAAGTGGGC     420

AGCAACTGGT TTCAGCCGAT TTATCTGGGC GCGATGTTTA GCCTGCAGGA AGGCGATAAA     480

CTGATGGTGA ACGTGAGCGA TATTAGCCTG GTGGATTATA CCAAAGAAGA TAAAACCTTT     540

TTTGGCGCGT TTCTGCTGTA ACTCGAG                                         567；

步骤二、构建融合蛋白原核表达载体：设计PCR引物F和R，对步骤一中所述NGR-VEGI融合蛋白基因进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物F: 5’-ACCATATG GTATACACGTTGCCG-3’

下游引物R: 5’-GTCTCGAGTTAGAGCAGAAACGC-3’；

将PCR产物的5’端融合NdeI酶切位点，3’端融合XhoI酶切位点，进行双酶切，然后装入PET-28a载体，利用载体上的序列，N端融合His-Tag，构建得到融合蛋白原核表达载体；

步骤三、融合蛋白的诱导表达：将步骤二中所述融合蛋白原核表达载体转入大肠杆菌中进行融合蛋白的诱导表达；

步骤四、融合蛋白的分离纯化：将步骤三中经诱导表达融合蛋白的大肠杆菌裂解后离心，然后将离心后收集的上清液采用镍柱亲和层析进行分离纯化，得到NGR-VEGI融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的表达纯化NGR-VEGI融合蛋白的方法，其特征在于，步骤三中所述融合蛋白的诱导表达采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷作为诱导剂。