CN105753990B - 一种血管活性肠肽的融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程制药领域，具体涉及一种血管活性肠肽的融合蛋白，所述融合蛋白包含1个人血清白蛋白（Albumin Human，HSA)和1个血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）,该融合蛋白所具有的独特的氨基酸序列可以保证其在宿主体内高水平稳定表达，在保留VIP原有功能的同时，体内半衰期显著延长。本发明同时提供该融合蛋白的制备方法及其在制备抗炎、抗损伤、脑血管疾病、提高睡眠质量的药物中的应用。

Description

一种血管活性肠肽的融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程制药领域，具体涉及一种血管活性肠肽的融合蛋白及其制备方法和应用.

背景技术

血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)是一种由28个氨基酸组成的多肽，主要是由外周神经和中枢神经系统产生，由副交感神经节后纤维释放，并且与乙酰胆碱共同存在，被认为是胰高血糖素-胰泌素家族的一员。广泛分布在中央神经系统的类胆碱突触前神经细胞和外周肽能神经细胞中，通过它可对多种器官进行神经支配，比如心脏，肺，消化系统和泌尿生殖道，眼睛，皮肤，卵巢和甲状腺。

VIP在中枢和外周神经系统中是一种重要的信号肽，通过其受体发挥生理作用，迄今为止，已有3种类型的VIP受体被克隆和分类，分别为VPAC1、VPAC2和PAC1。血管活性肠肽在生物体内涉及到多种生物学功能，包括参与新陈代谢、外分泌和内分泌、细胞分化和平滑肌舒张、激素分泌和免疫应答调控。基于它的多种生物学功能，VIP被认为是一种对多种疾病包括糖尿病、哮喘，阳痿和风湿有治疗前景的药物候选物。

VIP具有广泛的生物学活性，表明VIP具有广阔的临床应用前景。但是，到目前为止只开展了少数临床实验。VIP临床应用的一个主要障碍就是它在体内受到蛋白酶作用、抗体中和、自发水解而半衰期很短，这使VIP在体内半衰期不足1分钟。为了延长VIP的半衰期，就要通过对其进行结构的修饰和改造以及其他方法来提高其稳定性。

尝试提高VIP的稳定性的方法，包括对其母体进行化学修饰、使用稳定的VIP受体激动剂或VIP类似物、VIP与肽酶抑制剂组合使用或将VIP准确地嵌入到微粒或纳米粒子中。氨基酸的化学修饰或替换作为一种常用的方法早已被提出并用来增加神经肽的稳定性。Onoue和他的同事得到了两个VIP的衍生物具有相当可观的稳定性(在40℃超过60天)，它被做成可吸入的粉末制剂在哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)模型上具有一定功效。但是这些VIP的衍生物在治疗其他疾病上面受到了限制。之前也有提出使用微胶粒或脂质体包埋神经肽使其在体内缓慢释放，近期这种方法也被用于VIP的体内抗炎模型的应用上。然而这种脂质体包埋的神经肽进入目标器官受到了其颗粒大小的限制。为了克服这个潜在的问题，一个研究描述了一种将VIP包埋于由银保护的纳米粒子，它的功能和体内固定VIP的小神经胶质细胞相类似，这项研究第一次提供了使用金属纳米粒子对神经肽靶向给药的资料，但是在炎症状态下的基于纳米粒子的治疗效果还需进一步证明。虽然已有多种延长VIP在体内半衰期的方法，但是仍需找到一种简单、经济且安全可靠的方法。

以人血清白蛋白(Albumin Human，HSA)为载体的融合蛋白技术是一个受关注的延长蛋白质半衰期的方法。由于HSA是人血清的主要成分，对体内血浆体积和渗透压的维持起到了至关重要的作用，而且无酶活性和免疫原性，人体相容性好，分子量大(约为66KDa),具有非常低的肾清除率，半衰期长，约为19天，微生物发酵表达量高等优点，在体内常作为体内因子和药物的转运载体。通过构建融合蛋白技术增加多肽/蛋白类药物分子量可延长药物半衰期。所以，HSA可以作为小分子蛋白在血液中的载体，从而延长小分子蛋白在人体内的半衰期。Yeh等的研究发现，通过克鲁维氏酵母表达的HSA-CD4融合蛋白在以家兔作为动物模型的实验中，其半衰期达到了CD4单体的140倍。通过维氏酵母表达的HSA-IFNα融合蛋白，它的半衰期在猕猴体内比IFNα单体延长了18倍。

虽然现有技术中公开了通过融合蛋白的表达的策略可以延长目的蛋白的半衰期，但是融合蛋白的设计本身是一个程序复杂、影响因素众多的过程，仅通过序列的简单加和是无法实现VIP的稳定高效表达、延长其半衰期的目的的，这是本领域技术人员所公知的。

基于上述现状，发明人公开了一种血管活性肠肽的融合蛋白，该融合蛋白所具有的独特的氨基酸序列可以保证其在宿主体内高水平稳定表达，在保留VIP原有功能的同时，体内半衰期显著延长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血管活性肠肽的融合蛋白，该融合蛋白半衰期长，能在宿主体内高水平稳定表达。

本发明的另一个目的在于提供一种血管活性肠肽的融合蛋白的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供一种重组表达载体。

本发明的另一个目的在于提供一种宿主表达系统。

本发明的另一个目的在于提供一种血管活性肠肽的融合蛋白的应用。

本发明所述的血管活性肠肽的融合蛋白，包含1个HSA和1个VIP。

所述融合蛋白包还含有一个连接肽，HSA通过连接肽与VIP连接。

所述融合蛋白采用酵母细胞表达制备，其中，酵母为嗜甲醇毕赤酵母(Pichiapastoris)。

(一)VIP-L1-HSA

所述VIP位于融合蛋白的N-末端，HSA位于融合蛋白的C-末端，融合蛋白用结构式表示为VIP-L1-HSA，其中L1表示连接肽，L1的DNA序列为GGCGGTGGCGGCAGCGGTGGCGGC，氨基酸序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly。

其中，所述VIP具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，编码所述VIP的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：1所示；或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述VIP的活性的氨基酸序列，及编码所述的氨基酸序列的DNA序列。

所述HSA具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，编码所述HSA的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：3所示；或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA的活性的氨基酸序列，及编码所述的氨基酸序列的DNA序列。

所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：5所示。

其中，所述的血管活性肠肽的融合蛋白的制备方法包含以下步骤：

①全基因合成VIP序列；

②通过PCR扩增获取HSA序列；

③通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，获得含编码所述血管活性肠肽的融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列的重组表达载体；

④将步骤③所述的重组表达载体转化到感受态大肠杆菌TOP10，再转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白。

步骤④所述宿主表达系统是酵母，所述的酵母为嗜甲醇毕赤酵母。

(二)HSA-L2-VIP

所述VIP位于融合蛋白的C-末端，HSA位于融合蛋白的N-末端，融合蛋白用结构式表示为HSA-L2-VIP，其中L2表示连接肽，L2的DNA序列为GGTGGTGGCGGCAGC，氨基酸序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。

所述VIP具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，编码所述VIP的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：7所示；或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述VIP的活性的氨基酸序列，及编码所述的氨基酸序列的DNA序列。

所述HSA具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，编码所述HSA的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：9所示；或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述HSA的活性的氨基酸序列，及编码所述的氨基酸序列的DNA序列。

所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：11所示。

其中，所述的血管活性肠肽的融合蛋白的制备方法包含以下步骤：

(1)所述血管活性肠肽的融合蛋白的动物表达载体的构建

①全基因合成VIP序列；

②通过PCR扩增获取HSA序列；

③通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，获得含编码所述血管活性肠肽的融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列的重组动物表达载体；

(2)所述血管活性肠肽的融合蛋白的酵母表达载体的构建

①通过PCR扩增步骤(1)③中重组动物表达载体获取HSA-L2-VIP；

②通过限制性内切酶酶切酵母表达载体；

③使用融合PCR技术连接(2)①中HSA-L2-VIP与(2)②中酵母表达载体，并转化大肠杆菌，获得含编码所述血管活性肠肽的融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列的重组酵母表达载体；

(3)将步骤(2)③所述的重组酵母表达载体转化到感受态大肠杆菌TOP10，再转化到酵母中进行表达，即得所述融合蛋白。

所述的酵母为嗜甲醇毕赤酵母。

一种含有编码血管活性肠肽的融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列的重组表达载体。

一种含有上述的重组表达载体的宿主表达系统。

一种血管活性肠肽的融合蛋白在制备抗炎、抗损伤、脑血管疾病、提高睡眠质量的药物中的应用。

一种血管活性肠肽的融合蛋白在制备治疗哮喘药物中的应用。

本发明所述融合蛋白所具有的独特的氨基酸序列可以保证其在宿主体内高水平稳定表达，在保留VIP原有功能的同时，体内半衰期显著延长。

附图说明

图1载体pPinkα-HC

图2载体pPinkα-HC/VIP-L1-HSA

图3载体pcDNA3.1

图4载体pcDNA3.1-HSA

图5载体pcDNA3.1-HSA-L2-VIP

图6载体pPinkα-HC/HSA-L2-VIP

具体实施方式

主要实验仪器

移液枪、超净工作台(安泰)、磁力搅拌器、微波炉、高温蒸汽灭菌锅、-80℃低温冰箱(Forma)、超纯水仪(Millipore)、制冰机、离心机(Hitachi)、HDB-PLUS型恒温金属浴、HZQ-F16OA型恒温振荡培养箱(上海一恒)、PCR仪(Applied Biosystems)、台式冷冻离心机(Thermo)、DYY-8B型电泳仪(伯乐)、Image Quant 300型凝胶成像仪(GE)等。

主要实验材料：

1.限制性核酸内切酶StuI、BspEI、KpnI、XbaI、EcoRI、XhoI、HindⅢ、AflII(NEB公司产品，美国)

2.小提质粒试剂盒、PCR纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒(生工公司，中国)

3.T4DNA连接酶试剂盒(Takara公司产品，中国大连)

4.载体pPinkα-HC、载体pcDNA3.1-HSA、嗜甲醇毕赤酵母菌株(Invitrogen公司产品，美国)

5.大肠杆菌TOP10(天根生化科技(北京)有限公司)

6.酵母提取物、蛋白胨(Oxford公司产品，美国)

7.LB培养基

酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，溶于1000ml去离子水中，并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸气灭菌。

8.YPD培养基

酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，Agar 20g，溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却后加入100ml经滤器除菌后的20％的右旋糖。

9.YPDS培养基

酵母提取物10g，蛋白胨20g，山梨糖醇182.2g，溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却后加入100ml经滤器除菌后的20％的右旋糖。

10.BMGY液体培养基

酵母提取物10g，蛋白胨20g，无氨基酸酵母氮源13.4g，甘油10g，磷酸钾26.631g，溶于1000ml双蒸水中高压灭菌，冷至室温，调节pH至6.0，4℃保存备用。

11.1％琼脂糖凝胶的配置

根据用量，每100ml的TAE缓冲液，加入1g琼脂糖，使用微波炉加热煮沸，使琼脂糖完全融解，室温冷却至不烫手时滴加少量溴化乙锭(EB)，混匀后将其倒入事先摆放好梳子的胶槽中，待到室温冷却至完全凝固后拔去梳子即可使用。

实施例1 VIP-L1-HSA融合蛋白酵母表达载体的构建与表达

一、p29-simple-VIP序列的获得

1.委托大连Takara公司合成优化后的VIP基因，VIP的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，并将其装载到p29-simple(p29-simple质粒载体大连Takara公司提供)，获得载体p29-simple-VIP。

2.其中，p29-simple-VIP中已包含L1，即连接肽，L1DNA序列为GGCGGTGGCGGCAGCGGTGGCGGC，氨基酸序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly。

二、HSA序列的获得

1.设计合成PCR引物：

P1:GGTACCTCATAAGCCTAAGGCAGCTTG

P2:TCCGGAGATGCACACAAGAGTGAG

2.PCR扩增：以载体pcDNA3.1-HSA的DNA为模版，以P1和P2分别作为上、下游引物，进行PCR扩增。反应条件如下：①变性：94℃，5min；②变性：94℃，1min；③复性：55℃，30S；④延伸：72℃，2min；⑤返回步骤“②”，35循环；⑥延伸：72℃，5min，总循环次数为30次。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出约1.8kb大小的HSA的DNA条带。

三、VIP-L1-HSA融合蛋白酵母表达载体的构建

1.提取载体p29-simple-VIP，StuI和BspEI双酶切质粒,胶回收对应的VIP(StuI/BspEI)DNA片段,DNA序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

2.将HSA经PCR扩增后的产物KpnI和BspEI双酶切，胶回收对应的HSA(KpnI/BspEI)DNA片段,DNA序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

3.同时，KpnI和StuI双酶切载体pPinkα-HC(Invitrogen公司产品)的DNA，胶回收pPinkα-HC(KpnI/StuI)载体片段。

4.T4DNA酶连接VIP(StuI/BspEI)DNA片段、HSA(KpnI/BspEI)DNA片段和pPinkα-HC(KpnI/StuI)载体片段，转化感受态大肠杆菌TOP10，涂布于氨苄抗性LB板37℃培养过夜，筛选阳性克隆。所得克隆送Invitrogen公司测序，序列正确的克隆命名为pPinkα-HC/VIP-L1-HSA。

四、VIP-L1-HSA融合蛋白在酵母中的表达

将测序正确的载体pPinkα-HC/VIP-L1-HSA的DNA用AflII酶切回收后得到pPinkα-HC/VIP-L1-HSA，转化酵母感受态细胞。然后将转化菌液接种于PAD平板，30℃培养3-4天，挑取阳性克隆。将得到阳性克隆分别接种BMGY液体培养基，30℃培养48小时，然后转接至BMMY培养基中诱导表达，持续96小时后，1500rpm低温离心15分钟，取上清，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，分子量约70kD蛋白条带即为VIP-L1-HSA融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：5所示。选择表达水平最高的菌株作为工程菌，冻存于-80℃保种

实施例2 HSA-L2-VIP融合蛋白酵母表达载体的构建与表达

一、HSA-L2-VIP融合蛋白动物表达载体的构建

1.p29-simple-VIP序列的获得

①.委托大连Takara公司合成优化后的VIP基因，VIP的DNA序列如SEQ ID NO：7所示，并将其装载到p29-simple(p29-simple质粒载体大连Takara公司提供)，获得载体p29-simple-VIP。

②.其中，p29-simple-VIP中已包含L2，即连接肽，L2DNA序列为GGTGGTGGCGGCAGC，氨基酸序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。

2.HSA序列的获得

①设计合成PCR引物：

P1:GAAGAAGCTTTGCTATGGAGACAGACACACTCCTG

P2:GAAGGAATTCGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAGGGAGGGCAGGTGTGGGTCTTG

②PCR扩增：以载体pcDNA3.1-HSA的DNA为模版，以P1和P2分别作为上、下游引物，进行PCR扩增。反应条件如下：①变性：94℃，5min；②变性：94℃，1min；③复性：55℃，30S；④延伸：72℃，2min；⑤返回步骤“②”，35循环；⑥延伸：72℃，5min，总循环次数为30次。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出约1.8kb大小的HSA的DNA条带。

3.HSA-L2-VIP融合蛋白动物表达载体的构建

①提取载体p29-simple-VIP，EcoRI和XhoI双酶切质粒,胶回收对应的VIP(EcoRI/XhoI)DNA片段,DNA序列如SEQ ID NO：7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；

②将HSA经PCR扩增后的产物EcoRI和HindⅢ双酶切，胶回收对应的HSA(EcoRI/HindⅢ)DNA片段,DNA序列如SEQ ID NO：9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；

③同时，XhoI和HindⅢ双酶切pcDNA3.1质粒DNA，胶回收pcDNA3.1(XhoI/HindⅢ)载体片段。

④T4DNA酶连接VIP(EcoRI/XhoI)DNA片段、HSA(EcoRI/HindⅢ)DNA片段和pcDNA3.1(XhoI/HindⅢ)载体片段，转化感受态大肠杆菌TOP10，涂于氨苄抗性LB板37℃培养过夜，筛选阳性克隆。所得克隆送Invitrogen公司测序，序列正确的克隆命名为pcDNA3.1-HSA-L2-VIP。

二、HSA-L2-VIP融合蛋白酵母表达载体的构建

1.HSA-L2-VIP序列的获得

①设计合成PCR引物：

P1:TCTCTCGAGAAAAGGGATGCACACAAGAGTGAGGTTGC

P2:TTAAATGGCCGGCCGGTACCTCAATTCAGAATTGAGTTC

②PCR扩增：以载体pcDNA3.1-HSA-VIP的DNA为模版，以P1和P2分别作为上、下游引物，进行PCR扩增得到。反应条件如下：①变性：94℃，5min；②变性：94℃，1min；③复性：55℃，30S；④延伸：72℃，2min；⑤返回步骤“②”，35循环；⑥延伸：72℃，5min，总循环次数为30次。得到的HSA-L2-VIP DNA片段,DNA序列如SEQ ID NO：11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；

2.HSA-VIP融合蛋白酵母表达载体的构建

①KpnI和StuI双酶切载体pPinkα-HC(Invitrogen公司产品)的DNA，胶回收pPinkα-HC(KpnI/StuI)载体片段。

②使用融合PCR技术将上述pPinkα-HC(KpnI/StuI)载体片段和HSA-L2-VIP DNA片段连接，转化感受态大肠杆菌TOP10，涂布于氨苄抗性LB板37℃培养过夜，筛选阳性克隆。所得克隆送Invitrogen公司测序，序列正确的克隆命名为pPinkα-HC/HSA-L2-VIP。

三、HSA-L2-VIP融合蛋白在酵母中的表达

将测序正确的载体pPinkα-HC/HSA-L2-VIP的DNA用AflII酶切回收后得到pPinkα-HC/HSA-L2-VIP，转化酵母感受态细胞。然后将转化菌液接种于PAD平板，30℃培养3-4天，挑取克隆。将得到阳性克隆分别接种BMGY液体培养基，30℃培养48小时，然后转接至BMMY培养基中诱导表达，持续96小时后，1500rpm低温离心15分钟，取上清，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，分子量约70kD蛋白条带即为HAS-L2-VIP融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：12，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：11所示。选择表达水平最高的菌株作为工程菌，冻存于-80℃保种。

实施例3：血管活性肠肽的融合蛋白生物活性检测

实验材料

人结肠癌细胞HT-29，购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

ELISA试剂盒，购自美国R&D公司。

(1)制备细胞裂解液

以每孔2×105个HT-29细胞进行24孔板铺板，每孔1mL,待细胞汇合度为80％时用PBS洗涤一次后加0.1mmol/L IBMX，每孔500mL,处理30min后，加入嗜甲醇毕赤酵母表达纯化的血管活性肠肽的融合蛋白和VIP，每孔500uL，处理30min后吸掉上清，用冷的PBS洗涤3次，最后洗干净，再加入适当的细胞裂解液放在-20℃的冰箱中冷冻30min，放在室温下慢慢融化，可反复冻融，直至细胞破裂。600g，4℃离心收集上清，-20摄氏度保存待用。

(2)竞争ELISA试剂盒检测融合蛋白的生物活性

用竞争ELISA试剂盒检测上述制备的细胞裂解液的生物活性：除NSB(非特异结合)孔外，每孔加入初抗50uL,37℃孵化1小时后倒掉上清。用Wash Buffer洗涤4次，每次1min，然后每孔加入50uL的cAMP Conjugate，在15min内加入标准液和相应的样品，每孔100uL，在37℃孵化2h。再用Wash Buffer洗涤4次后，加入substrate solution进行显色，每孔200uL,在37℃孵化30min后，每孔加入100uL stop solution终止显色，在酶标仪上测450nm和540nm处的吸光值，计算cAMP浓度。

实验结果如表1所示：

表1 血管活性肠肽的融合蛋白生物活性检测结果

	空白对照	阴性对照	阳性对照	VIP-L1-HSA	HSA-L2-VIP
						cAMP(pmol/mL)	12.7635	12.4238	22.6252	30.9549	37.6488

其中，空白对照为DMEM/F12，阴性对照为空载体(pPinkα-HC)转入嗜甲醇毕赤酵母发酵液的上清，阳性对照为1×10^-9mol/L的VIP。

其中，cAMP的含量越高，表示供试样品的活性越高，抗炎效果越好。从上表可以看出，本发明公开的血管活性肠肽的融合蛋白较阳性对照组相比，具有更高的活性，抗炎效果更好。

实施例4 血管活性肠肽的融合蛋白的功能验证

实验材料

1.实验仪器

注射器、移液枪、金属浴、离心机(Hitachi)、超纯水仪(Millipore)、涡旋仪、恒温培养箱(上海一恒)、酶标仪(Thermo)等。

2.实验动物

30只wister大鼠，购于兰州大学实验动物中心。

实验方法

大鼠的分组及给药方式：

将30只wister大鼠分为六组,180～220g左右：1-对照组，2-模型组，3-地塞米松组，4-VIP组1，5-VIP组2，6-血管活性肠肽的融合蛋白组。

第一天和第八天对照组予1mL生理盐水腹腔注射，其他各组给予1mL生理盐水(含OVA2mg、氢氧化铝100mg)以致敏。第十五天除对照外的其余各组以1％OVA进行激发，每天一次，每次30min，连续7天；对照组以生理盐水代替。每次雾化激发前半小时地塞米松组腹腔注射地塞米松，VIP组1、2腹腔注射VIP，血管活性肠肽的融合蛋白组腹腔注射血管活性肠肽的融合蛋白。

地塞米松组和VIP组1第七天最后一次雾化激发后24小时内取大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)，计数其中多种炎性细胞的计数来考察哮喘后细胞学的变化；腹主动脉取血用ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-4(IL-4)的水平变化；取大鼠肺部组织制作肺组织病理标本观察肺组织形态学变化。

从第八天开始，VIP组2停止注射VIP，血管活性肠肽的融合蛋白组停止注射血管活性肠肽的融合蛋白，两组继续以1％OVA进行激发，每天一次，每次30min，连续3天，最后一次雾化激发后24小时内取大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)，计数其中多种炎性细胞的计数来考察哮喘后细胞学的变化；腹主动脉取血用ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-4(IL-4)的水平变化；取大鼠肺部组织制作肺组织病理标本观察肺组织形态学变化。

实验结果与分析：

表2血管活性肠肽的融合蛋白的功效

a：各项行为正常。

b：较正常鼠体重增长缓慢，并表现为烦躁、打喷嚏、毛色失去光泽；雾化激发时呼吸急促、呛咳、前肢缩抬、点头或腹式呼吸，节律不规则，行动迟缓，呈哮喘样表现，并随着激发次数增加症状逐步加重。

c：未见气道炎症改变，肺内支气管管壁无增厚、支气管管腔规则、粘膜上皮整齐，管腔内无炎性渗出物，气道周围未见明显炎性细胞浸润。

d：支气管周围可见炎症细胞浸润，支气管内可见粘液栓；气道上皮有脱落、断裂。

由表2中的结果可以看出，对照组大鼠行为正常，肺组织病理学切片HE染色观察未见气道炎症改变，肺内支气管管壁无增厚、支气管管腔规则、粘膜上皮整齐，管腔内无炎性渗出物，气道周围未见明显炎性细胞浸润。模型组和VIP组2较正常鼠体重增长缓慢，并表现为烦躁、打喷嚏、毛色失去光泽；雾化激发时呼吸急促、呛咳、前肢缩抬、点头或腹式呼吸，节律不规则，行动迟缓，呈哮喘样表现，并随着激发次数增加症状逐步加重。肺组织病理学切片HE染色观察支气管周围可见炎症细胞浸润，支气管内可见粘液栓；气道上皮有脱落、断裂。VIP组1、血管活性肠肽的融合蛋白组与对照组相似或接近。ELISA检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-4(IL-4)的水平变化，其中模型组和VIP组2IL-4，TNF-α水平较对照组有明显升高。VIP组1、血管活性肠肽的融合蛋白组与对照组相似或接近

以上实验说明本发明提供的血管活性肠肽的融合蛋白与VIP相比具有较长的半衰期，药效维持时间更长。

文献报道，VIP蛋白具有抗炎、抗损伤、脑血管疾病、提高睡眠质量的功效，本发明公开的血管活性肠肽的融合蛋白具有相同的功效，这是本领域技术人员所能理解的。

本发明公开了一种血管活性肠肽的融合蛋白在制备抗炎、抗损伤、脑血管疾病、提高睡眠质量的药物中的应用。

本发明公开了一种血管活性肠肽的融合蛋白在制备治疗哮喘的药物中的应用。

本发明公布的融合蛋白所具有的独特的氨基酸序列可以保证其可以在宿主体内高水平稳定表达，在保留VIP原有功能的同时，体内半衰期显著延长。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110> 兰州大学

<120> 一种血管活性肠肽的融合蛋白及其制备方法和应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 84

<212> DNA

<213> VIP的DNA序列

<400> 1

cattctgatg ctgtttttac tgataactac actcgtttga gaaagcaaat ggctgttaag 60

aagtacttga actctatttt gaac 84

<210> 2

<211> 28

<212> PRT

<213> VIP的氨基酸序列

<400> 2

1 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys

16 Gln MET Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn

<210> 3

<211> 1755

<212> DNA

<213> HSA的DNA序列

<400> 3

gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60

gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120

aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180

aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240

cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgt tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300

tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360

gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420

gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480

tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540

aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600

gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660

cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720

gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780

gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840

aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900

gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960

gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat1020

tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc1080

tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt1140

gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag1200

tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact1260

ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat1320

cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta1380

tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc1440

ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa1500

gagtttaatg ctgaaacgtt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag1560

agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagcttgtga aacacaagcc caaggcaaca1620

aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag1680

gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa1740

gctgccttag gctta 1755

<210> 4

<211> 585

<212> PRT

<213> HSA的氨基酸序列

<400> 4

1 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly

16 Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr

31 Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu

46 Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu

61 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys

76 Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu MET Ala Asp Cys

91 Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His

106 Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

121 Asp Val MET Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu

136 Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr

151 Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe

166 Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro

181 Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys

196 Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala

211 Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys

226 Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

241 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp

256 Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser

271 Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu

286 Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu MET Pro Ala

301 Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val

316 Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly MET Phe

331 Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu

346 Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

361 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp

376 Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln

391 Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn

406 Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr

421 Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser

436 Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg MET Pro Cys Ala Glu

451 Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu

466 Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

481 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

496 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His

511 Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys

526 Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr

541 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val MET Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val

556 Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu

571 Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

<210> 5

<211> 1875

<212> DNA

<213> 融合蛋白VIP-L1-HSA的DNA序列

<400> 5

aggcctcatt ctgatgctgt ttttactgat aactacactc gtttgagaaa gcaaatggct 60

gttaagaagt acttgaactc tattttgaac ggcggtggcg gcagcggtgg cggctccgga 120

gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 180

gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 240

aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 300

aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 360

cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgt tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 420

tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 480

gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 540

gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 600

tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 660

aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 720

gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 780

cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 840

gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 900

gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 960

aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct1020

gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct1080

gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat1140

tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc1200

tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt1260

gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag1320

tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact1380

ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat1440

cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta1500

tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc1560

ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa1620

gagtttaatg ctgaaacgtt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag1680

agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagcttgtga aacacaagcc caaggcaaca1740

aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag1800

gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa1860

gctgccttag gctta 1875

<210> 6

<211> 625

<212> PRT

<213> 融合蛋白VIP-L1-HSA的氨基酸序列

<400> 6

1 Arg Pro His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu

16 Arg Lys Gln MET Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn

31 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ala His Lys Ser

46 Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys

61 Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro

76 Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala

91 Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser

106 Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

121 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu MET Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu

136 Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro

151 Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val MET Cys Thr

166 Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr

181 Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu

196 Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln

211 Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu

226 Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

241 Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala

256 Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu

271 Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys

286 Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu

301 Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu

316 Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile

331 Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu MET Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu

346 Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

361 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly MET Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala

376 Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala

391 Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp

406 Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu

421 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe

436 Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg

451 Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu

466 Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

481 Pro Glu Ala Lys Arg MET Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val

496 Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser

511 Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg

526 Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys

541 Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr

556 Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val

571 Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys

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<210> 7

<211> 84

<212> DNA

<213> VIP的DNA序列

<400> 7

cactcagatg cagtcttcac tgacaactat acccgcctta gaaaacaaat ggctgtaaag 60

aaatatttga actcaattct gaat 84

<210> 8

<211> 28

<212> PRT

<213> VIP的氨基酸序列

<400> 8

1 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys

16 Gln MET Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn

<210> 9

<211> 1755

<212> DNA

<213> HSA的DNA序列

<400> 9

gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60

gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120

aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180

aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240

cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgt tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300

tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360

gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420

gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480

tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540

aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600

gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660

cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720

gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780

gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840

aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900

gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960

gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat1020

tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc1080

tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt1140

gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag1200

tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact1260

ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat1320

cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta1380

tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc1440

ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa1500

gagtttaatg ctgaaacgtt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag1560

agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagcttgtga aacacaagcc caaggcaaca1620

aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag1680

gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa1740

gctgccttag gctta 1755

<210> 10

<211> 585

<212> PRT

<213> HSA的氨基酸序列

<400> 10

1 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly

16 Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr

31 Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu

46 Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu

61 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys

76 Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu MET Ala Asp Cys

91 Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His

106 Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

121 Asp Val MET Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu

136 Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr

151 Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe

166 Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro

181 Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys

196 Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala

211 Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys

226 Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

241 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp

256 Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser

271 Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu

286 Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu MET Pro Ala

301 Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val

316 Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly MET Phe

331 Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu

346 Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

361 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp

376 Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln

391 Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn

406 Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr

421 Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser

436 Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg MET Pro Cys Ala Glu

451 Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu

466 Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

481 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

496 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His

511 Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys

526 Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr

541 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val MET Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val

556 Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu

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<210> 11

<211> 1941

<212> DNA

<213> 融合蛋白HSA-L2-VIP的DNA序列

<400> 11

gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60

gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120

aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180

aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240

cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgt tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300

tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360

gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420

gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480

tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540

aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600

gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660

cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720

gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780

gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840

aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900

gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960

gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat1020

tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc1080

tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt1140

gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag1200

tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact1260

ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat1320

cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta1380

tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc1440

ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa1500

gagtttaatg ctgaaacgtt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag1560

agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagcttgtga aacacaagcc caaggcaaca1620

aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag1680

gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa1740

gctgccttag gcttaggcgg cggcggttcc ggactggagc ccaagagctg cgacaagacc1800

cacacctgcc ctccctgcca ccaccaccac caccacgaat tcggtggtgg cggcagccac1860

tcagatgcag tcttcactga caactatacc cgccttagaa aacaaatggc tgtaaagaaa1920

tatttgaact caattctgaa t 1941

<210> 12

<211> 647

<212> PRT

<213> 融合蛋白HSA-L2-VIP的氨基酸序列

<400> 12

1 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly

16 Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr

31 Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu

46 Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu

61 Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys

76 Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu MET Ala Asp Cys

91 Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His

106 Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

121 Asp Val MET Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu

136 Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr

151 Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe

166 Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro

181 Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys

196 Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala

211 Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys

226 Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

241 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp

256 Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser

271 Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu

286 Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu MET Pro Ala

301 Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val

316 Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly MET Phe

331 Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu

346 Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

361 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp

376 Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln

391 Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn

406 Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr

421 Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser

436 Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg MET Pro Cys Ala Glu

451 Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu

466 Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

481 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

496 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His

511 Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys

526 Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr

541 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val MET Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val

556 Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu

571 Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

586 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

601 His Thr Cys Pro Pro Cys His His His His His His Glu Phe Gly

616 Gly Gly Gly Ser His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr

631 Arg Leu Arg Lys Gln MET Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile

646 Leu Asn

Claims (17)

1.一种血管活性肠肽的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含一个人血清白蛋白(Albumin human,HSA)、一个血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)和一个连接肽，HSA通过连接肽与VIP连接；所述VIP位于融合蛋白的N-末端，HSA位于融合蛋白的C-末端，融合蛋白用结构式表示为VIP-L1-HSA，其中L1表示连接肽，L1的DNA序列为GGCGGTGGCGGCAGCGGTGGCGGC，氨基酸序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly。

2.一种血管活性肠肽的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含一个人血清白蛋白(Albumin human,HSA)、一个血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)和一个连接肽，所述VIP位于融合蛋白的C-末端，HSA位于融合蛋白的N-末端，融合蛋白用结构式表示为HSA-L2-VIP，其中L2表示连接肽，L2的DNA序列为GGTGGTGGCGGCAGC，氨基酸序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。

3.根据权利要求1所述的一种血管活性肠肽的融合蛋白，其特征在于，所述VIP的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码所述VIP的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

4.根据权利要求1所述的一种血管活性肠肽的融合蛋白，其特征在于，所述HSA的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，编码所述HSA的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：3所示。

5.根据权利要求2所述的一种血管活性肠肽的融合蛋白，其特征在于，所述VIP的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，编码所述VIP的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：7所示。

6.根据权利要求2所述的一种血管活性肠肽的融合蛋白，其特征在于，所述HSA的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，编码所述HSA的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：9所示。

7.根据权利要求1所述的一种血管活性肠肽的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白采用酵母细胞表达制备。

8.根据权利要求7所述的一种血管活性肠肽的融合蛋白，其特征在于所述的酵母为嗜甲醇毕赤酵母(Pichiapastoris)。

9.一种如权利要求1所述的血管活性肠肽的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

①全基因合成VIP序列；

②通过PCR扩增获取HSA序列；

③通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，获得含编码所述血管活性肠肽的融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列的重组表达载体；

④将步骤③所述的重组表达载体转化到感受态大肠杆菌TOP10，再转化到宿主表达系统进行表达，即得所述融合蛋白。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤④所述宿主表达系统是酵母。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述的酵母为嗜甲醇毕赤酵母。

12.一种如权利要求2所述的血管活性肠肽的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

(1)所述血管活性肠肽的融合蛋白的动物表达载体的构建

①全基因合成VIP序列；

②通过PCR扩增获取HSA序列；

③通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，获得含编码所述血管活性肠肽的融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列的重组动物表达载体；

(2)所述血管活性肠肽的融合蛋白的酵母表达载体的构建

①通过PCR扩增步骤(1)③中重组动物表达载体获取HSA-L2-VIP；

②通过限制性内切酶酶切酵母表达载体；

③使用融合PCR技术连接(2)①中HSA-L2-VIP与(2)②中酵母表达载体，并转化大肠杆菌，获得含编码所述血管活性肠肽的融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列的重组酵母表达载体；

(3)将步骤(2)③所述的重组酵母表达载体转化到感受态大肠杆菌TOP10，再转化到酵母中进行表达，即得所述融合蛋白。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述的酵母为嗜甲醇毕赤酵母。

14.一种含有编码如权利要求1-6和8中任意一项所述的血管活性肠肽的融合蛋白氨基酸序列的DNA序列的重组表达载体。

15.一种含有权利要求14所述的重组表达载体的宿主表达系统。

16.权利要求1-6和8中任意一项所述的血管活性肠肽的融合蛋白在制备抗炎、抗损伤、脑血管疾病、提高睡眠质量的药物中的应用。

17.权利要求1-6和8中任意一项所述的血管活性肠肽的融合蛋白在制备治疗哮喘药物中的应用。