CN103118699B - 白介素-22在治疗病毒性肝炎中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人白介素-22的二聚体及其药物组合物。本发明还公开了人白介素-22或其二聚体在制备治疗病毒性肝炎的药物中的用途。

Description

白介素-22在治疗病毒性肝炎中的应用
技术领域
本发明涉及生物和医药技术领域。更具体地，本发明涉及白介素-22(Interleukin-22)在治疗病毒性肝炎(viral hepatitis)中的用途。 
背景技术
病毒性肝炎是由甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒引起的肝脏炎症疾病。所有肝炎病毒都能引起急性肝炎(acute hepatitis)，此外乙、丙、丁型病毒还可引起慢性肝炎(chronic hepatitis)，慢性肝炎可以导致肝硬化、肝功能衰竭以及肝癌。 
以美国为例,每年大约新增的50-60万病毒性肝炎患者,其中甲型肝炎患者为15万，甲型肝炎是由甲型肝炎病毒引起的一种急性疾病。同时新增20-30万乙型肝炎患者。大约6-10%的乙型肝炎患者发展成慢性乙肝。慢性乙肝患者容易转化成肝硬化、肝功能衰竭及肝癌。据估计全世界有2-3亿慢性乙肝患者，美国有120万。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的。除此之外,每年还新增大约15万丙型肝炎患者(之前丙型肝炎被称为非甲非乙型肝炎)。大约50-70%的急性丙型肝炎发展成慢性丙型肝炎。慢性丙型肝炎容易转化成肝硬化、肝功能衰竭及肝癌。据估计，在美国大约有350万慢性丙型肝炎患者。乙、丙型肝炎患者可以转化成慢性肝炎。慢性肝炎状态下，病毒长期在肝脏中生存并复制，同时引起肝脏的慢性炎症，从而导致肝硬化、肝功能衰竭和肝癌的发生和发展。 
以中国为例,每年大约新增的50-60万病毒性肝炎患者,其中甲型肝炎患者为15万。 
病毒性肝炎的诊断基础是检测病毒抗体、病毒遗传物质、蛋白、抗原的存在与否。肝脏炎症导致肝组织损伤的重要生物标志(biomarker)是血液各种酶和转氨酶的活性增加,例如：天冬氨酸转氨酶(AST或S(GOT)，丙氨酸转氨酶(ALT或SGPT)。 
急性肝炎和慢性肝炎的治疗方法有所不同。急性病毒性肝炎(甲型肝炎)的治疗首先是减轻病人恶心、呕吐和腹痛的症状。目前对于甲型肝炎临床上还没有特效药，治疗重点是保证患者有足够的营养补充和避免肝脏的永久性损伤。急性肝炎患者在发病2周内可以使用免疫球蛋白。慢性乙肝患者的治疗主要是干扰素(干扰素α-2b或干扰素A)和聚乙二醇干扰素α-2a(Pegasys)，以及抗病毒药物，如：替比夫定(Tyzeka)、恩替卡韦(Baraclude)、拉米夫定 (Epivir-HBV)、阿德福韦酯(Hepsera)。慢性丙肝患者的治疗主要以抗病毒药物和干扰素或者干扰素的复方，比如：聚乙二醇干扰素α-2a和聚乙二醇干扰素α-2b配合抗病毒药物病毒唑联合应用。目前,对由于病毒引起的肝损伤本身,并无有效的治疗药物。 
白介素-22(Interleukin-22，IL-22)是一种T细胞分泌的糖蛋白，又名白介素10诱导的T细胞因子(IL-10-related T cell-derived inducible factor，IL-TIF)。白介素22mRNA的表达最初证明在小鼠的IL-9刺激后的T细胞株和IL-9刺激的肥大细胞株(mast cells)，以及concanavalinA激活后的脾细胞。人白介素22mRNA的表达主要在外周自分离的T细胞并通过抗CD-3的抗体或ConA刺激。白介素22mRNA在激活后的NK细胞也有表达。活化的T细胞主要是CD4+，特别是由CD28通路的Th1细胞。 
白介素-22前体由179个氨基酸残基组成(成熟肽为146个氨基酸残基)，Dumoutier等最先报道了克隆小鼠和人的白介素-22基因(Dumoutier,et al,JI,164:1814-1819，2000)。此外，Dumoutier还取得了IL-22的专利(US专利号6,359,117和6,274,710)。Gurney也取得了IL-22在治疗人胰腺病变方面的应用专利(US专利号6,551,799)。 
白介素-22主要在胸腺、大脑、活化的T细胞和肥大细胞、lectin刺激后的脾细胞(Duroutier JI2002)、白介素-2/白介素-12刺激后的NK细胞(Wolk,K JI2002)，以及LPS刺激后的多个器官和组织中表达(Dumoutier PNAS paper)，包括肠道，肝，胃，肾，肺，心脏，胸腺，脾都可测到IL-22的表达升高。 
IL-22通过结合IL-22RI受体和IL-10R2受体，发挥生物学功能。IL-22R1是IL-22特异的受体，它表达在皮肤，肾，消化系统(胰腺，小肠，肝，大肠，结肠)以及呼吸系统(肺，支气管)。已公开的研究表明，白介素22是一个免疫调节剂。 
在专利申请白介素-22的医药用途中，已报道IL-22对降低血清甘油三酯，肥胖的医疗用途(见专利：WO2006/073508,CN200510023103.0)。 
然而，目前并未发现白介素-22可以在治疗病毒性肝炎中可发挥积极的作用。 
发明内容
本发明的目的就是一种有效的治疗病毒性肝炎的药物及其用途，即白介素-22(Interleukin-22)在治疗哺乳动物病毒性肝炎(Viral hepatitis)中的用途。 
在本发明的第一方面，提供了一种人白介素-22或其二聚体的用途，它用于制备治疗病毒性肝炎的药物。 
在另一优选例中，所述的病毒性肝炎包括：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎。 
在另一优选例中，所述的人白介素-22的二聚体是式I所示的人白介素-22的二聚体： 
M1-L-M2    式I 
式中， 
M1是人白介素-22的第一单体； 
M2是人白介素-22的第二单体； 
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件， 
其中，所述的白介素-22二聚体保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。 
在另一优选例中，所述的接头元件L选自下组： 
(i)3-50个氨基酸的短肽； 
(ii)式II所示的多肽元件： 
-Z-Y-Z-    式II 
式中， 
Y为载体蛋白； 
Z为无、或1-30个氨基酸的短肽； 
“-”为化学键或共价键。 
在另一优选例中，所述的第一单体和第二单体是相同的。 
在另一优选例中，所述的第一单体和第二单体是不同的。 
在另一优选例中，所述的生物活性包括： 
(a)降低肝脏炎症和减少肝细胞坏死，对肝炎病毒引起的肝细胞损伤起到保护作用； 
(b)抑制由肝炎病毒引起的ALT/AST的升高。 
在另一优选例中，所述的载体蛋白是二个IgG的Fc片段之间通过二硫键连接而形成。在另一优选例中，所述二硫键的数量为2-4个。 
在另一优选例中，所述的载体蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片段。 
在另一优选例中，所述的“-”是肽键。 
在另一优选例中，所述的IL-22二聚体的血清半衰期是所述第一单体和/或第二单体的血清半衰期的3倍以上、5倍以上或10倍以上。 
在另一优选例中，所述二聚体是由氨基酸序列如SEQ ID NO:2-5所示的单体所构成的二聚体。 
在本发明的第二方面，提供了式I所示的人白介素-22的二聚体： 
M1-L-M2    式I 
式中， 
M1是人白介素-22的第一单体； 
M2是人白介素-22的第二单体； 
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件， 
其中，所述的白介素-22二聚体保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。 
在本发明的第三方面，提供了一种可用于治疗病毒性肝炎的药物组合物，它含有药学上可接受的载体以及式I所示的人白介素-22的二聚体， 
M1-L-M2    式I 
式中， 
M1是人白介素-22的第一单体； 
M2是人白介素-22的第二单体； 
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件， 
其中，所述的白介素-22二聚体保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上。 
在另一优选例中，所述二聚体是由氨基酸序列如SEQ ID NO:3或5所示的单体所构成的二聚体。 
在另一优选例中，所述集落刺激因子IL-22的二聚体采用以下步骤制备： 
(a)采用包含编码IL-22-Fc复合物的DNA序列的表达载体转化哺乳动物细胞。 
(b)培养所述哺乳动物细胞，和 
(c)分离纯化所述IL-22二聚体。 
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。 
附图说明
图1显示了本发明一种IL-22二聚体的示意图。其中，“-”表示连接肽，IL-22椭圆形表示IL-22单体。 
该IL-22二聚体的一种序列如SEQ ID NO:1所示，其中第1-146位为IL-22，第147-162位为连接肽，第163-308位为另一IL-22。 
图2A和2B显示了本发明IL-22二聚体的示意图。其中，“-”表示氨基酸连接肽，IL-22椭圆形表示IL-22单体，标记为“C”的椭圆形表示载体蛋白，并且IL-22位于载体蛋白的N-末端，图2B中显示二个Fc通过二硫键配对
一种用于构成该IL-22二聚体的、带有Fc片段的IL-22单体的序列如SEQ ID NO:2所示，其中第1-146位为IL-22，第147-162位为连接肽，第163-385位为人IgG2的Fc片段。二个带有Fc片段的IL-22单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。 
一种用于构成该IL-22二聚体的、带有Fc片段的IL-22单体的序列如SEQ ID NO:3所示，其中第1-146位为IL-22，第147-152位为连接肽，第153-375位为人IgG2的Fc片段。二个带有Fc片段的IL-22单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。 
图3A和3B显示了本发明IL-22二聚体的示意图。其中，“-”表示氨基酸连接肽，IL-22椭圆形表示IL-22单体，标记为“C”的椭圆形表示载体蛋白，并且IL-22位于载体蛋白的C-末端，图3B中显示二个Fc通过二硫键配对。 
一种用于构成该IL-22二聚体的、带有Fc片段的IL-22单体的序列如SEQ ID NO:4所示，其中第1-223位为人IgG2的Fc片段，第224-239位为连接肽，第240-385位为IL-22。二个带有Fc片段的IL-22单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。 
一种用于构成该IL-22二聚体的、带有Fc片段的IL-22单体的序列如SEQ ID NO:5所示，其中第1-223位为人IgG2的Fc片段，第224-229位为连接肽，第230-375位为IL-22。二个带有Fc片段的IL-22单体，通过Fc的配对作用构成二聚体。 
图4显示了IL-22和IL-22二聚体(IL-22-Fc)对激活小鼠肝STAT3的影响。结果显示，IL-22二聚体激活STAT3的生物活性明显高于单体IL-22的活性。 
图5显示了小鼠感染肝炎病毒后,血清ALT水平变化。重组人IL-22单体(IL-22,PEG化的IL-22)和IL-22二聚体都可以抑制由肝炎病毒引起的ALT的升高，其中IL-22二聚体的抑制效果尤为显著。 
图6显示了小鼠感染肝炎病毒后,血清AST水平变化。重组人IL-22单体(IL-22，PEG化的IL-22)和IL-22二聚体都可以显著地抑制由肝炎病毒引起的AST的升高，其中IL-22二聚体的抑制效果尤为显著。 
图7显示了小鼠感染肝炎病毒后肝脏组织学形态变化。小鼠感染MHV-A59病毒后第5天可见肝组织严重炎症，细胞坏死亡灶，形态异常改变。使用IL-22或其二聚体治疗后的动物，可见明显的肝脏组织学形态的保护作用，明显降低的炎症和细胞坏死。 
图8显示了IL-22二聚体、IL-22单体的体外活性分析结果。 
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现：白介素-22在病毒性诱导的肝炎表现出明显的治疗效果。IL-22能有效地保护肝脏功能,显著地降低由病毒引起的血液ALT/AST的升高。此外，与IL-22单体相比，本发明的二聚体IL-22能够延长体内半衰期，改善药物的动力学，减少注射频率；尤其是能显著增强体内生物活性，因而能够更有效地治疗病毒性肝炎。在此基础上完成了本发明。 
术语 
术语“氨基酸序列基本相同”是指序列相同或由一个或多个氨基酸改变(缺失、增加、取代)引起的不同，但这种改变基本上不降低其生物学活性，即可以通过结合IL-22靶细胞受体而发生生物学功能。任何符合“基本相同”要求的白介素-22均包括在本发明内，无论它是糖基化的(即来源于天然的或来源于真核生物表达系统的)或是非糖基化的(即来源于原核生物表达系统或化学合成的)。 
术语“治疗”是指基于治愈、缓解、改善、减轻、影响治疗对象疾病、症状、疾病体质(predisposition)的目的而给予需要治疗的对象本发明的白介素-22。 
术语“治疗对象”是指鼠、人及其他哺乳动物。 
术语“治疗有效量”是指能够在治疗对象体内达到治疗目的的白介素-22的量。本领域的普通技术人员应理解，所述“治疗有效量”可随白介素-22的给药途径、所用药物辅料以及与其他药物联合用药情况的不同而有所不同。 
白介素22及其制备 
如本发明所用，“白介素-22”或“IL-22”是指一种蛋白质，该蛋白质(a)具有与Dumoutier等人在US Patent No.359,117中描述的人/鼠白介素-22基本相同的氨基酸序列和(b)具有与天然白介素-22相同的生物学活性。本发明的白介素-22包括，但不限于：人白介素-22、重组人白介素、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。 
“白介素-22”还包括PEG化的IL-22以及共价修饰的IL-22蛋白质。例如，可用各种活化的分子量为5,000～100,000的聚乙二醇(PEG)修饰以使IL-22高分子化，延长其半衰期。具体操作可参见Greenwald et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.1994,4,2465;Caliceti et al.,IL Farmaco,1993,48,919;Zalipsky and Lee,《聚乙二醇化学：生物技术与生物医学应用》，J.M.Harris编，Plenum Press,N.Y.,1992。优选使用多臂树杈型活性PEG(CNZL02101672.0,WO9932139,PCT/US95/0755,PCT/US94/13013，US Pat:4,640,835，4,496,689，4,301,144，4,670,417，4,791,192，4,179,337)。 
本发明的白介素-22可用基因重组技术克隆表达的。表达的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞或者高等真核生物细胞。适用的原核宿主细胞包括，但不限于：G+或G-菌，如大肠杆菌E.coli.，能够通过公共途径得到的E.coli.菌 株包括：K12MM294(ATCC31,446)、X1776(ATCC31,537)、W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53,635)等。其他可用的原核细胞包括但不限于：欧式杆菌(Erwinia)、克雷伯杆菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、沙门杆菌(Salmonella)如鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)、沙雷菌属(Serratia)如粘质沙雷菌(Serratia marcescans)、志贺菌属(Shigella)、枯草杆菌.(B.subtilis)、地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)如绿脓杆菌(P.aeruginosa)、链球菌(Streptomyces)。E.coli.W3110因其常被用作重组DNA产品的发酵宿主而被推荐为优选。 
除了原核细胞，真核细胞如丝状真菌(filamentous fungi)或酵母菌(yeast)等同样适用于表达或者克隆本发明的白介素-22。酿酒酵母菌(Saccharomyces)就是一种常用的低等真核宿主微生物，其他宿主如非洲粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse,Nature,290:140[1981];EP139,383)；克鲁维酵母菌(Kluyveromyces hosts)(U.S.Pat.No.4,943,529;Flee et al.,Bio/Technology,9:968-975(1991))如K.lactis(MW98-8C,CBS683,CBS4574;Louvencourt et al.,J.Bacteriol.,154(2):737-742[1983])，K.fragilis(ATCC12,424)，K.waltii(ATCC56,500)，K.drosophilarum(ATCC36,906;Van den Berg et al.,Bio/Technology,8:135(1990))，K.thermotolerans，K.marxianus；yarrowia(EP402,226)；巴氏毕赤酵母菌(Pichia Pastoris)(EP183.070;Sreekrishna et al.,J.Basic Microbiol.,28:265-278[1988])；念珠菌(Candida)；Trichoderma reesia(EP244,234)；脉胞菌(Neurospora crassa)(Case et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:5259-5263[1979])；施万异样霉菌(schwanniomyces)如Schwanniomyces occidentalis(EP394,538)；丝状真菌(filamentous fungi)如Neurospora，青霉菌(Penicillium)，Tolypocladium(WO91/00357)，曲霉菌(Aspergillus)如A.nidulans(Balance et al.,Biochem.Biophys.Res.Commum.,112:284-289[1983];Tilburm et al.,Gene,26:205-221[1983];Yelton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:1470-1474[1984])和黑曲霉(A.niger)(Kelly and Hynes,EMBO J.,4:475-479[1985])。甲基营养酵母菌(Methylotropic yeasts)同样可用于表达本发明的白介素-22，包括但不限于各种能够在甲醇中生长的酵母菌如汉逊酵母菌(Hansenula)，念珠菌(Candida)，克勒克酵母菌(kloeckera)，毕赤酵母菌(Pichia)，酿酒酵母菌(Saccharomyces)，球拟酵母菌(Torulopsis)，红酵母菌(Rhodotorula)。属于甲基营养酵母菌类的典型菌种参见C.Anthony,The Biochemistry of Methylotrophs,269(1982)。 
用于表达糖基化的本发明的白介素-22的宿主细胞来源于多细胞有机体。 无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞如Drosophila S2和Spodoptera Sf9，植物细胞。适用的哺乳动物宿主细胞的例子包括中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，COS细胞。特别是，经SV40转化的猴肾CV1细胞株(COS-7,ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞株293(Graham et al.,J.Gen Virol.,36:59(1977))；CHO/-DHFR(Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；小鼠睾丸滋养细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；人肺细胞(WI38,ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳腺癌细胞(MMT060562,ATCC CCL51)。本领域的普通技术人员应知如何选择合适的宿主细胞。 
上述宿主细胞经白介素-22表达载体或克隆载体转染或者转化后可在传统的营养基(nutrient media)中培养，所述营养基经修饰后适于诱导启动子(promoter)、选择性转化体(selecting transformant)或者扩增白介素-22编码基因序列。培养条件如培养基、温度、pH等的选择对本领域的普通技术人员来说则是应知的。如何使细胞培养繁殖力最大化的一般原则、方案以及操作技术可参见Mammalian Cell Biotechnology:a Practical Approach,M.Butler,ed.(IRL Press,1991)and Sambrook et al.,supra。 
本领域的普通技术人员应熟知真核细胞转染和原核细胞转化的方法，例如CaCl2法、磷酸钙沉淀法、脂质体媒介法或电穿孔法。根据使用的宿主细胞的不同，本领域的普通技术人员可选择相应的标准转化技术，例如CaCl2法(Sambrook et al.,supra.)或电穿孔法通常用于原核细胞；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染主要用于某些植物细胞的转化(Shaw et al.,Gene,23:315(1983)and WO89/05859)；对于没有细胞壁的哺乳动物细胞，则可以使用磷酸钙沉淀法(Graham and van der Eb,Virology,52:456-457(1978))；有关哺乳动物宿主细胞转染的全面描述可参见U.S.Pat.N..4,399,216。有关如何转化酵母细胞可参见Van Solingen et al.,J.Bact.,130:946(1977)和Hsiao et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)。其他将DNA引入细胞的方法，如核酸微量注射、电穿孔、完整细菌细胞原生质体融合(bacterial protoplast fusion with intact cells)、或者聚阳离子法(polycations)如1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)、聚鸟氨酸(polyornithine)等皆可用于本发明中。有关各种哺乳动物细胞转化技术的描述可参见Keown et al.,Methods in Enzymology,185:527-537(1990)和Mansour et al.,Nature,336:348-352(1988)。 
编码本发明的白介素-22的核苷酸序列(即cDNA或基因组DNA)可被插入一可复制载体(replicable vector)进行基因克隆(DNA扩增)或者表达。各种载体如质粒、粘粒(cosmid，装配型质粒)、病毒颗粒或噬菌体等均可通过公共途径获得。运用本领域的公知技术，可将本发明的白介素-22的编码核苷酸序列按 常规步骤插入可复制载体上适宜的限制性核酸内切酶位点。一个可复制载体通常包括但不限于以下部件：一条或多条信号序列(signal sequence)，一个复制起点(origin of replication)，一条或多条标记基因(marker gene)，一个增强子元件(enhancer element)，一个启动子(promoter)，以及一段转录中止序列(transcription termination sequence)。本领域的普通技术人员可运用本领域标准的连接技术(ligation techniques)构建含有一个或多个上述部件的合适的可复制载体。 
本发明的白介素-22不但可以通过基因重组直接表达，也可以通过与异种多肽形成融和多肽的方式生产，后者可以是一段位于成熟蛋白质或多肽N端的信号序列，也可以是位于成熟蛋白质或多肽N端的具有特异性切割位点的其他多肽片段。通常情况下，这段信号序列是上述可复制载体的一部分，或者它也可以是插入可复制载体的本发明的白介素-22编码核苷酸序列的一部分。所述信号序列可以是原核信号序列，例如碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp，或者热稳定肠毒素Ⅱ前导序列。在酵母分泌系统(yeast secretion)中，该信号序列可以是酵母转化酶前导序列(yeast invertase leader)，α因子前导序列(包括酿酒酵母菌和克鲁维酵母菌α因子前导序列，参见U.S.Pat.No.5,010,182)，或酸性磷酸酶前导序列，C.albicans葡萄糖淀粉酶前导序列(EP362,179)。在哺乳动物表达系统中，哺乳动物信号序列可直接用于分泌目标蛋白质，此类序列包括来源于相同或相近物种哺乳动物分泌蛋白的信号序列以及病毒分泌前导序列。 
表达载体和克隆载体均含有一段核苷酸序列，该序列使载体能够在一个或多个相应的宿主细胞内复制。与各种细菌、酵母或病毒宿主细胞对应的核苷酸序列为本领域普通技术人员所公知。例如，质粒pBR322的复制起点适用于大多数G-细菌，2.mu.质粒复制起点适用于酵母细胞，而各种病毒复制起点(SV40，多形瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)则适用于哺乳动物细胞内的克隆载体。 
表达载体和克隆载体通常含有一段选择基因，又名“选择标记”。典型的选择基因编码产生的蛋白质(a)对某些抗生素或毒素如氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤，四环素等具有抗性；(b)能弥补营养缺陷型缺乏(auxotrophic deficiencies)(c)补充复合型培养基不能提供的关键营养物质如杆菌宿主细胞需要的D-丙氨酸消旋酶的编码基因。 
适用于哺乳动物宿主细胞的选择基因应该可以将有能力吸纳本发明的白介素-22编码基因的宿主细胞区分出来，如DHFR或胸(腺嘧啶核)苷激酶。适用的以野生型DHFR为选择基因的宿主细胞是无DHFR活性的CHO细胞株，该细胞株的制备及繁殖方法可参见Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)。适用于酵母细胞的选择基因是在酵母质粒Yrp7中表达的trpl 基因(Stinchcomb et al.,Nature,282:39(1979)；Kingsman et al.,Gene,7:141(1979)；Tschemperet al.,Gene,10:157(1980))。trpl基因可用于筛选不能在色氨酸中生长的酵母菌突变株如ATCC No.44047或PEP4-1(Jones,Genetics,85:12(1977))。 
表达载体和克隆载体通常含有一个可人工操纵地连接到本发明的白介素-22编码核苷酸序列上的启动子，以指导mRNA的合成。与各种宿主细胞对应的启动子为本领域普通技术人员所公知。适用于原核宿主细胞的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang et al.,Nature,275:615(1978)；Goeddel et al.,Nature,281:544(1979))，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel,Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)；EP36,776)，杂合启动子如tac启动子(deBoer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983))。细菌宿主细胞启动子同样包含一段可人工操纵地连接到本发明的白介素-22编码基因序列的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。 
适用于酵母宿主细胞的启动子序列包括3-磷酸甘油酸激酶启动子(Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.,255:2073(1980))或其他糖酵解酶的启动子(Hess et al.,J.Adv.Enzvme Reg.,7:149(1968)；Holland,Biochemistry,17:4900(1978))，如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，果糖磷酸激酶，葡糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，葡糖磷酸异构酶，和葡糖激酶。 
还有一些可诱导的酵母启动子，它们能更好地根据生长情况来调节转录，包括醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，氮素代谢相关降解酶，金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸，麦芽糖和半乳糖代谢酶等的启动子。有关适用于酵母表达系统的载体和启动子的进一步描述参见EP73,657。 
启动子可以控制哺乳动物宿主细胞内可复制载体上本发明的白介素-22编码基因序列的转录。所述启动子包括来自于多形瘤病毒，禽痘病毒(UK2,211,504)，腺病毒，牛乳头(状)瘤病毒，禽类肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙肝病毒，或猿猴空泡病毒(SV40)等病毒基因组的启动子，来自于异种哺乳动物的启动子如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，以及来自于热休克蛋白的启动子，前提是这些启动子同宿主细胞表达体系相容。 
通过在可复制载体中插入增强子可增强本发明的白介素-22的编码核苷酸序列在高等真核生物表达体系中的转录。增强子是一种DNA分子的顺式作用元件，通常为10到300个bp，通过作用于启动子而增强DNA分子的转录。目前已知很多增强子序列来自于哺乳动物基因(珠蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，α-胎蛋白，胰岛素)。而使用较多的是来自于真核病毒细胞的增强子，如位于复制起点下游(late side)的SV40增强子(100-270bp)，巨细胞病毒早期启动子 增强子，位于复制起点下游的多形瘤病毒增强子，腺病毒增强子。增强子可被剪切插入位于可复制载体上的本发明的白介素-22的编码核苷酸序列的5’端或3’端，优选位于启动子的5’端。 
真核宿主细胞(酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞、人类细胞，或者来源于其他多细胞有机体的有核细胞)中的表达载体同样含有中止转录和稳定mRNA所需的核苷酸序列。此类序列通常取自真核或者病毒DNA或cDNA非翻译区的5’端，有时也可取自3’端。所述“非翻译区”包含的核苷酸片段可转录产生位于本发明的白介素-22mRNA非翻译区的聚腺苷酰化片段。 
其他可在重组脊椎动物培养体系中用于合成本发明的白介素-22的方法、载体和宿主细胞可参见Gething et al.,Nature,293:620-625(1981);Mantei et al.,Nature,281:40-46(1979);EP117,060;以及EP117,058。 
IL-22二聚体 
本发明的IL-22二聚体的结构如式I所示。代表性的结构如图1-3中所示。其中，载体蛋白包括(但并不限于)是指人IgG(1,2,3,4)的Fc片段、或人白蛋白(albumin)。 
IL-22位于可用载体蛋白的C-末端，也可用位于载体蛋白的N-末端。 
如本文所用，术语“连接肽”(linker)指位于IL-22单体和IL-22单体之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度没有特别限制。连接肽的长度通常为5-50个氨基酸。通常，连接肽不影响或不显著影响IL-22单体和IL-22单体形成正确的折叠和空间构象。一些连接肽的例子包括(但并不限于)： 
较佳地，所述的连接肽具有选自下组的氨基酸序列： 
(a)疏水性氨基酸Gly和Pro构成的3-16个氨基酸序列，例如Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro; 
(b)多克隆位点所编码的氨基酸序列。该序列通常为5-20个，较佳地10-20个氨基酸； 
(c)来自于IL-22单体之外的蛋白的氨基酸序列，例如来自于IgG或白蛋白的氨基酸序列； 
(d)由(a)、(b)和(c)组合形成的氨基酸序列。 
优选的连接肽包括：GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1中第147-162位)和ASTKGP(SEQ ID NO:3中第147-152位)。 
此外，在融合蛋白的N端或C末端还可添加其他不影响IL-22单体活性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6×His序列)、酿酒酵母α-因子信号肽切割位点(Glu-Lys-Arg)，或可促进融合蛋白的活性。 
二聚体的制备方法 
编码本发明IL-22二聚体或融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得IL-22第一单体和/或IL-22第二单体的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。 
为了提高宿主细胞的表达量，可以对IL-22二聚体编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。在本发明中，可以采用酵母细胞或哺乳动物细胞偏好的密码子，并采用计算机DNA软件对IL-22二聚体基因进行检测，排除在基因中不利于基因转录及翻译的序列，包括内含子剪切位点，转录终止序列等。 
在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。 
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。 
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。 
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列;如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。 
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是哺乳动物细胞。 
在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。然后再分离出表达的融合蛋白。 
药物组合物和施用方法 
由于本发明IL-22二聚体可产生更强的受体激活序号并具有优异的血清半衰期，因此本发明IL-22二聚体以及含有本发明IL-22二聚体为主要活性成分的药物组合物可用于治疗病毒性肝炎。其中，所述的病毒性肝炎包括：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎。 
本发明的药物组合物包含安全、有效量范围内的本发明IL-22二聚体及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.001-1000mg的IL-22或其二聚体/剂，较佳地0.05-300mg的IL-22或其二聚体/剂，更佳地，含有0.5-200mg的IL-22或其二聚体/剂。 
本发明的化合物及其药理上可接受的盐可制成各种制剂，其中包含安全、有效量范围内的本发明IL-22或其二聚体或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。化合物的安全、有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等具体情况来确定。 
“药理上可以接受的赋形剂或载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药理上可以接受的赋形剂或载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。 
施用本发明IL-22或其二聚体时，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药。 
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。 
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上 述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。 
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。 
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。 
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。 
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。 
用于局部给药的本发明IL-22或其二聚体的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。 
本发明IL-22或其二聚体可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。 
含有本发明的白介素-22或其二聚体的微胶囊可用于本发明的白介素-22的缓释给药。重组蛋白的微囊缓释给药技术已成功应用于重组人生长激素(rhGH)、重组人干扰素(rhIFN)、白介素-2和MNrgp120(Johnson et al.,Nat.Med.,2:795-799(1996);Yasuda,Biomed.Ther27:1221-1223(1993);WO97/03692,WO96/40072,WO96/07399;U.S.Pat.No.5654010)。 
本发明的白介素-22或其二聚体的缓释制剂可用具有良好生物兼容性和宽泛生物可降解性的乳酸羟基乙酸高聚物(PLGA)制备。PLGA的降解产物，乳酸和羟基乙酸可被人体很快清除。而且，该高聚物的降解能力可随其分子量和组成的不同，从几个月延长到几年(Lewis,“Controlled release of bioactive agents form lactide/glycolide polymer,”in:M.Chasin and R.Langer(Eds.),Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker:New York,1990),pp.1-41))。 
本发明的药物组合物的剂量和浓度范围可因实际使用情况的不同而变化。本领域的普通技术人员应知如何根据实际需求去选择合适的剂量和给药途径。对于不同种系，例如人和鼠之间药物剂量范围的调整原则，可参见Mordenti,J. and Chappell,W.“The use of interspecies scaling in toxicokinetics”In Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi et al.;Pergamon Press,New York1989,pp.42-96。 
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明IL-22或其二聚体适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，每次给药剂量通常为0.01～300mg，优选0.5～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。 
本发明的主要优点在于： 
1.白介素-22或其二聚体在动物模型已证实可有效治疗病毒性肝炎。 
2.IL-22二聚体能够延长体内半衰期，改善药物的动力学，减少注射频率；能显著增强体内生物活性。 
3.在相同IL-22摩尔浓度下，与IL-22单体相比，IL-22二聚体具有更强的体内STAT3激活信号，从而提高了治疗效果。 
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 
实施例1 
用常规方法制备和纯化，获得结构如图1-图3所示的IL-22二聚体(序列为SEQ ID NO:1,或单体序列如SEQ ID NO:2-5所示)。 
实施例2  IL-22二聚体体内半衰期 
大鼠皮下单次注射IL-22二聚体(由序列如SEQ ID NO:2所示的二个IL-22单体构成的二聚体)100ug/kg，药代动力学参数如下表所示(n=6)。而单体IL-22在大鼠的半衰期约1.3小时。 
实施例3  IL-22或其二聚体对小鼠肝脏pSTAT3的影响. 
取正常ICR小鼠52只，雌雄各半，体重20-22克。将动物分为13组,每组4只。取1组动物在给药前处死，取肝脏组织液氮保存，测定肝脏的磷酸化STAT3(pSTAT3)基础水平。取6组动物皮下单次注射重组IL-22，剂量40μg/kg；另外6组动物皮下单次注射等摩尔剂量的重组IL-22二聚体(由序列如SEQ ID NO:4所示的二个IL-22-Fc单体构成的二聚体，其中1摩尔二聚体中的IL-22按2摩尔计算)，剂量100μg/kg。注射后，分别在2、4、8、24、48、72小时取肝脏组织，液氮保存，然后制备肝组织匀浆液并测定蛋白质含量，ELISA法(STAT3[pY705]phosphor ELISA Kit，Invitrogen公司产品)检测pSTAT3水平。 
结果如图4所示，正常小鼠注射IL-22(40μg/kg)，可以显著地升高肝脏磷酸化STAT3水平，最大值出现在大约2小时左右，8小时恢复正常水平。正常小鼠注射同摩尔数IL-22的IL-22二聚体100μg/kg，可以显著地升高肝脏磷酸化STAT3水平，最大值出现在大约24小时左右，48小时仍处在较高水平，72小时基本上恢复到正常水平。 
上述结果显示，IL-22、IL-22二聚体均能激活信号转导及转录活化因子3(STAT3)的生物活性。 
值得注意的是，在同摩尔数IL-22分子剂量条件下，IL-22二聚体生物活性明显优于IL-22单体的生物活性。 
实施例4  IL-22或其二聚体在治疗病毒诱导的小鼠肝炎中的作用 
取C57/BL小鼠50只,雌性,6-8周龄,每组10只。四组小鼠分别腹腔注射MHV-A59病毒,2×104pfu/只。MHV-A59病毒制备和病毒滴定方法参见文献Chin J Clin Pharmacol Ther2005，10(11)：1253。注射病毒2小时后,治疗组分别皮下注射重组人IL-22,给药剂量100μg/kg,每天注射1次；或聚乙二醇化人(Pegylated)IL-22100μg/kg，隔天注射1次；或重组人IL-22二聚体(IL-22-IgG-Fc融合蛋白)(由序列如SEQ ID NO:2所示的二个IL-22-Fc单体构成的二聚体，1摩尔二聚体中的IL-22按2摩尔计算)100μg/kg,隔天注射1次。重组人IL-22组共注射5次，聚乙二醇化人(Pegylated)IL-22，和重组人IL-22二聚体治疗组共注射3次。阴性对照组1,为正常C57/BL雌性小鼠,阴性对照组2,为感染了MHV-A59病毒的小鼠,注射溶剂载体(0.5%鼠血清,PBS,pH7.0)。注射病毒前，各组分别取2只动物，眼眶采血100μL,测定ALT、AST水平，作为基础值。各组分别在感染MHV-A59病毒后第3天和第5天，取血测定ALT、AST水平。第5天，以2%戊巴比妥麻醉动物，分离肝脏，4%甲醛固定，病理切片，HE染色。 
结果如图5-7所示，每天注射重组人IL-22单体(IL-22或PEG化IL-22)和 IL-22二聚体都可以抑制由肝炎病毒引起的ALT/AST的升高倍数，降低肝脏炎症和减少肝细胞坏死，对肝炎病毒引起的肝细胞损伤起到保护作用。 
值得注意的是，在换算为同摩尔数IL-22分子剂量条件下，药效比较结果是IL-22二聚体>PEG化IL-22>IL-22。换言之，注射了IL-22二聚体的小鼠，病毒性肝炎的治疗效果，不仅远远优于注射了IL-22单体的动物组，也远优于注射了半衰期较长的PEG化IL-22单体的动物组。因此，IL-22二聚体的治疗效果明显优于IL-22单体和PEG化IL-22的治疗效果。IL-22单体或PEG化IL-22与IL-22二聚体的蛋白质分子量比值约为1:5，因此，IL-22二聚体在IL-22分子给药摩尔剂量低于IL-22或PEG化IL-22时，显示出更明显的治疗效果。 
实施例5  由IL-22-Fc复合物形成的IL-22二聚体 
a．IL-22二聚体表达细胞株的构建 
采用全基因合成IL-22-Fc复合物的cDNA序列(如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示，其中SEQ ID NO.:6编码SEQ ID NO.:2所示的单体，SEQ ID NO.:7编码SEQ ID NO.:3所示的单体)，将人IL-22单体的基因与IgG2的Fc基因片段连接，5’端引入EcoRI位点，以及哺乳动物细胞表达所需要的元件如Kozak序列和信号肽序列，3’端引入XbaI位点，克隆到市售的pUC19质粒，命名为pIL-22-Fc，转化E.coli TG1。用EcoRI和XbaI酶切pIL-22-Fc，回收约1300bp的IL-22-Fc片段，与经EcoRI和XbaI酶切后的pcDNA3(Invitrogen)表达质粒相连接，构建表达质粒pEX-IL-22-Fc。表达质粒pEX-IL-22-Fc通过线性化转染CHO细胞，表达IL-22二聚体，ELISA法检测表达量，筛选出蛋白产量较高的细胞株，并制备细胞库。 
b．IL-22二聚体的分离纯化 
将重组CHO细胞用常规方法进行培养从而表达重组蛋白。培养结束后，收集细胞上清(含有IL-22复合物、IL-22二聚体、IL-22多聚体及代谢物)，细胞上清收集后经过滤、多级凝胶层析纯化，例如，rProtein A Sepharose FF(GE Healthcare,cat#17-1279-04)捕获，用20-50mM柠檬酸缓冲液，0.1-2MNaCl,pH3.5-3.8的缓冲液洗脱，得到纯度>90%的IL-22二聚体，接下来采用PPA复合介质的凝胶层析(PALL Life Sciences Cat#：k364-01)，用20-50mM NaAc/HAC,pH3.0-5.0的缓冲液洗脱，洗脱液经低pH灭活病毒，Nano20膜除病毒过滤等，最终获得IL-22二聚体。 
分离纯化得到的IL-22二聚体的纯度>95%(采用反向HPLC分析)。电泳显示，纯化后IL-22二聚体(由二个SEQ ID NO.:2所示单体构成)分子量为52±10KD(采用还原型SDS-PAGE分析)，与预测值相符。紫外吸收光谱为280nm。IL-22二聚体在体外能刺激Colo205细胞产生IL-10(ED50为10-1000ng/mL)。 
实施例6  IL-22二聚体在体内的药代动力学 
成年健康猕猴，8只，雌雄各半，体重3-5公斤，按动物体重随机分成2组，分别为IL-22二聚体30、100μg/kg给药组，其中给药组各组4只/组，雌雄各半。分别皮下注射给予相应剂量的IL-22二聚体(由二个SEQ ID NO.:2所示单体构成)，给药体积0.2ml/kg体重，单次给药，于给药前、给药后0.5、1、2、4、8、16、24、48、72、96、120、144、168小时下肢隐静脉取血0.6ml，室温静置30min后，分离血清，采用ELISA试剂盒(Biolegend，Cat#434507)检测血清中的IL-22二聚体浓度，检测结果采用非房室模型分析药代动力学参数，结果如下表1所示。IL-22在体内的半衰期(t1/2z)约为2hr。 
表1药代动力学参数(均值±SD，n=4) 
实施例7  IL-22二聚体、IL-22的体外活性分析 
Colo205细胞培养于RPMI164010%FBS培养基中，细胞生长至对数期时，弃上清，加入PBS洗去残留培养基，加入2～5mL0.25%Trypsin-EDTA消化，加入培养基吹打均匀，1500rpm离心5min，收集细胞，然后用基础培养基配制成5.0×105Cell/ml的细胞悬液，于96孔板各孔分别添加100μL/孔，于37℃、5%CO2培养箱中过夜。次日，取出CO2培养箱中的96孔板，于4℃条件下，800rpm离心5分钟，从各孔抽出细胞上清液90μL，并补入90μL0.1%BSA/RPMI1640，加入IL-22二聚体(由二个SEQ ID NO.:2所示单体构成)至终浓度1.4、4.1、12.3、37.0、111.1、333.3、1000、3000ng/mL，加入IL-22至终浓度0.01、0.04、0.12、0.37、1.1、3.3、10、30ng/mL，于37℃，5%CO2培养箱中培养20hr，收集细胞上清液，采用IL-10ELISA试剂盒(R&D，Cat#S1000B)检测OD值。结果如图8所示，IL-22二聚体的半数有效浓度(ED50)值为229ng/mL(2675pM),IL-22的ED50为0.54ng/mL(32.4pM)。 
以上结果显示，虽然体外实验中IL-22活性略优于较IL-22二聚体的活性好，而IL-22二聚体在体内的药代动力学参数和有效活性远远优于IL-22，可见评价IL-22二聚体的生物活性宜采用体内实验模型。 
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.一种人白介素-22二聚体，其特征在于，所述二聚体的结构如式I所示的人白介素-22的二聚体，
M1-L-M2  式I
式中，
M1是人白介素-22的第一单体；
M2是人白介素-22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的白介素-22二聚体保持了白介素-22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上；
且所述二聚体是由两个选自如SEQ ID NO:2-5所示的氨基酸序列所构成的二聚体。
2.如权利要求1所述的人白介素-22二聚体，其特征在于，所述的第一单体和第二单体是相同的。
3.如权利要求1所述的人白介素-22二聚体，其特征在于，所述的生物活性包括：
(a)降低肝脏炎症和减少肝细胞坏死，对肝炎病毒引起的肝细胞损伤起到保护作用；
(b)抑制由肝炎病毒引起的ALT/AST的升高。
4.如权利要求1所述的人白介素-22二聚体，其特征在于，所述的二聚体由两个IL-22-Fc复合物组成，每个IL-22-Fc复合物的氨基酸序列选自如SEQ ID NO:2-5所示的氨基酸序列；且每个IL-22-Fc复合物包含一个IL-22单体、一个人IgG2的Fc片段、以及一个连接肽，所述连接肽连接IL-22单体和Fc片段。
5.如权利要求4所述的人白介素-22二聚体，其特征在于，所述二聚体通过Fc片段的二硫键配对形成。
6.一种人白介素-22二聚体的用途，其特征在于，用于制备治疗病毒性肝炎的药物；
所述的人白介素-22二聚体是式I所示的人白介素-22二聚体，
M1-L-M2  式I
式中，
M1是人白介素-22的第一单体；
M2是人白介素-22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的白介素-22二聚体保持了白介素-22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上；
且所述二聚体是由两个选自如SEQ ID NO:2-5所示的氨基酸序列所构成的二聚体。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的病毒性肝炎包括：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的第一单体和第二单体是相同的。
9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的生物活性包括：
(a)降低肝脏炎症和减少肝细胞坏死，对肝炎病毒引起的肝细胞损伤起到保护作用；
(b)抑制由肝炎病毒引起的ALT/AST的升高。
10.一种用于治疗病毒性肝炎的药物组合物，其特征在于，所述药物含有药学上可接受的载体以及式I所示的人白介素-22的二聚体，
M1-L-M2  式I
式中，
M1是人白介素-22的第一单体；
M2是人白介素-22的第二单体；
L是位于所述的第一单体和第二单体之间的，将所述第一单体和第二单体连接在一起的接头元件，
其中，所述的白介素-22二聚体保持了白介素-22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一单体或第二单体的血清半衰期的2倍以上；
且所述二聚体是由两个选自如SEQ ID NO:2-5所示的氨基酸序列所构成的二聚体。
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