CN102219850A

CN102219850A - 新的长效glp-1化合物

Info

Publication number: CN102219850A
Application number: CN2011101121334A
Authority: CN
Inventors: 刘恒; 余佳凌
Original assignee: SHANGHAI GENE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: SHANGHAI GENE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2011-05-03
Filing date: 2011-05-03
Publication date: 2011-10-19

Abstract

本发明公开了新型的长效GLP-1化合物、包含这些化合物的药物组合物及所述化合物的治疗用途包括（1）高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖症、高血压、X综合症、血脂障碍、认知障碍、心肌梗赛、冠心病和其它心血管疾病、中风、消化不良和胃溃疡（2）或在减少食物摄取、减少β-细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性中的作用。

Description

新的长效GLP-1化合物

技术领域

本发明涉及治疗性多肽领域，具体涉及新、新型的长效GLP-1化合物、包含这些化合物的药物组合物及所述化合物的医疗用途。具体涉及新的长效GLP-1化合物、包含这些化合物的药物组合物及所述化合物（GLP1类似物）在治疗（1）高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖症、高血压、X综合症、血脂障碍、认知障碍、心肌梗赛、冠心病和其它心血管疾病、中风、消化不良和胃溃疡（2）或在减少食物摄取、减少β-细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性中的作用。

背景技术

中文名：胰高血糖素样肽1

英文名：GLP-1

CAS号： 106612-94-6

分子式：C₁₅₁H₂₂₈N₄₀O₄₇

分子量： 3355.67 Da

结构式:

H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH₂

糖尿病分为I型糖尿病、II型糖尿病与妊娠型糖尿病。I型糖尿病是由于自身免疫系统紊乱导致胰岛细胞被破坏，自身无法产生胰岛素，所以需要外源的胰岛素来维持自身的新陈代谢，因此被称作胰岛素依赖的糖尿病。II型糖尿病，其胰岛素的分泌量并不低，甚至还偏高，临床表现为机体对胰岛素不够敏感，即胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)。胰岛素抵抗既有可能来自胰腺无法产生足够的胰岛素也有可能来自体内周围组织对胰岛素的敏感性降低，外周组织如肌肉、脂肪的胰岛素受体的不敏感导致，因此也被称作非胰岛素依赖的糖尿病。妊娠型糖尿病大多伴随着怀孕时期的妇女，也有可能发展成II型糖尿病。I型糖尿病的病因为自身免疫系统缺陷。在I型型糖尿病患者的血液中可查出多种自身免疫抗体，如谷氨酸脱羧酶抗体（GAD抗体）、胰岛细胞抗体（ICA抗体）等。这些异常的自身抗体可以损伤人体胰岛分泌胰岛素的β细胞，使之不能正常分泌胰岛素。II型糖尿病的病因分为遗传因素，有家族发病史的特点；另一个重要因素肥胖症和年龄也是II型糖尿病形成的一个重要因素。糖尿病可导致严重的并发症包括肾功能衰竭、眼部疾病、心脏病、脑血管病变等。对糖尿病人的健康产生了严重的影响。治疗糖尿病疗法主要为胰岛素的治疗，GLP1类似物治疗，化学类的促胰岛素分泌剂、双胍类、AGI 等和胃转流手术治疗

随着人们生活水平的提高，人口老龄化以及肥胖发生率的增加，II 型糖尿病的发病率呈逐年上升趋势。糖尿病在中国的发病率达到 2% ，据统计，中国目前已有3980万糖尿病病人，位居全球第二。到2025年，中国糖尿病患者将达到5900万人。中国目前每年约有100多万新增病例。其中I 型糖尿病患者占 10%, II 型糖尿病患者占 90% 。据业内专家估计，目前国内糖尿病药的市场容量在70亿元左右，根据卫生部公布的数据分析显示，未来几年，中国糖尿病类药物的销售量将会超过100亿元。

人GLP-1是人体内存在的一种生理性多肽, 源于前胰高血糖素原的37个氨基酸残基的多肽，所述的前胰高血糖素原是在末端回肠、胰腺和脑中的L-细胞中合成。GLP-1是一种在葡萄糖代谢和胃肠分泌以及新陈代谢中具有调节功能的重要的胃肠激素。在膳食时，它从肠中的L-细胞中释放，并且从胰腺中的?-细胞中有效释放胰岛素。它能够根据体内葡萄糖水平高低,按需促进胰岛β细胞分泌胰岛素,抑制胰岛素拮抗激素胰高血糖素的分泌,从而发挥降糖作用。GLP-1还具有其他的功能性重要作用：减小胰高血糖素物分泌、胃排空和食物摄取；恢复胰岛的葡萄糖敏感性；刺激葡萄糖激酶的表达增加。然而,人体产生的GLP-1很不稳定,很快就会被体内的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)降解,因此若使用天然GLP-1降低血糖,需持续静脉输注或持续皮下注射。

人GLP-1和Exendin-4已有多项相关专利申请。一系列不同的方法已经用于修饰胰高血糖素样肽1（GLP-1）化合物的结构以便提供体内更长的作用持续时间。

许多糖尿病患者十分恐惧他们自己受到注射。多数患者使用口服降血糖药物治疗，并且自从期望GLP-1化合物是这些患者将施用的首选注射产品，对注射的恐惧可能会成为广泛使用这种临床上非常有希望的GLP-1化合物的严重障碍。因此，需要开发能够每天施用少于一次，同时保持可接受的临床特性的新的GLP-1化合物。

发明内容

本发明提供了相对于序列GLP-1（7-37）在位置9的氨基酸残基替换的GLP-1类似物。

本发明提供了含有这种GLP-1类似物为母体的一系列的GLP-1类似物。

本发明提供了含有这种GLP-1类似物的药物组合物。

本发明提供了这种GLP-1类似物用于治疗疾病的药物的用途。

本发明旨在提供GLP1类似物在治疗高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖症、高血压、X综合症、血脂障碍、认知障碍、心肌梗赛、冠心病和其它心血管疾病、中风、消化不良和胃溃疡中的用途。

本发明的第二个目的是提供GLP1类似物在减少食物摄取、减少β-细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性的作用。

在本发明的第一方面，提供了一种GLP1类似物在制备用于治疗高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖症、高血压、X综合症、血脂障碍、认知障碍、心肌梗赛、冠心病和其它心血管疾病、中风、消化不良和胃溃疡的组合物中的用途。

在另一优选例中，所述的组合物还用于减少食物摄取、减少β-细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性。

在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物或保健品组合物。

在另一优选例中，所述的GLP1类似物包括化学合成的GLP1类似物、大肠杆菌重组表达或哺乳动物细胞重组表达的GLP1类似物。

在另一优选例中，所述的GLP1类似物包括GLP1类似物与异种蛋白质或多肽所形成的嵌合分子（Chimeric Molecule）或融合蛋白（Fusion Protein）从而增强其生物学活性或延长其体内的生物半衰期。比如与人的整个和部分免疫球蛋白基因（Fc）或人血清白蛋白。

在另一优选例中，所述的组合物包括选自下组的额外组分：具有降血糖的或减低血脂提取物或化合物,炎症性细胞因子(inflammatory cytokines)的抑制剂和抗体药物,增加糖和脂肪代谢的激素,调节代谢的蛋白因子,或其混合。

在另一优选例中，所述的具有降血糖的或减低血脂物质(提取物或化合物)包括胰岛素、exenatide（艾塞那肽）、胰岛素增敏类药物、茶叶提取物、他汀类化合物（如辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀）、抗氧化类药物、血管紧张素转移酶抑制剂、和/或免疫调节功能类药物。

在另一优选例中，所述的调节代谢的蛋白因子包括胰岛素,胰高糖素(glucagon),瘦素(leptin),和/或脂联素(adiponectin)等。

用于增加GLP-1 类似物在患者中的作用时间的方法，所述方法的特征是在所述GLP-1 类似物位置9的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Asp来替代。

用于增加GLP-1 类似物在患者中的作用时间的方法，所述方法的特征是在所述GLP-1 类似物位置9的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Asp来替代，将位置34的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的Arg来替代。

用于增加GLP-1 类似物在患者中的作用时间的方法，所述方法的特征是在所述GLP-1 类似物位置9的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Asp来替代，将位置8的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的2-methyl-Ala来替代。

用于增加GLP-1 类似物在患者中的作用时间的方法，所述方法的特征是在所述GLP-1 类似物位置9的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Asp来替代，将位置34的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的Arg来替代，将位置8的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的2-methyl-Ala来替代。

用于增加GLP-1 类似物在患者中的作用时间的方法，所述方法的特征是在所述GLP-1 类似物位置9的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Asp来替代，将位置8的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Gly来替代，将位置34的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Arg来替代。

用于增加GLP-1 类似物在患者中的作用时间的方法，所述方法的特征是在所述GLP-1 类似物位置9的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的Asp来替代，将位置8的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的Gly来替代，将位置36的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的2-methyl-Ala来替代。

一个实施方案提供了根据上述实施方案任意之一的化合物用于制备药物的用途，所述的药物用于治疗或预防高血糖症状、2型糖尿病、1型糖尿病、高血压、认知障碍、心肌梗塞、中风、血脂障碍和消化不良。

一个实施方案提供了根据上述实施方案任意之一的化合物的用途，用于制备延缓或预防2型糖尿病的疾病发展的药物。

一个实施方案提供了根据上述实施方案任意之一的化合物的用途，用于制备降低食物摄取、降低β-细胞凋亡、增加β-细胞功能或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性的药物。

本发明的另一目标是提供含有根据本发明的化合物的药物制剂，除了含有所述的化合物外，还包含防腐剂、稳定剂、螯合剂、缓冲系统和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，药物制剂是含水制剂。这种制剂通常是溶液或悬液。

在本发明的进一步实施方案中，防腐剂选自苯酚、苯甲酸、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、脱氢醋酸钠、对羟苯甲酸乙酯或其混合物。

在本发明的进一步实施方案中，稳定剂在药物组合物中的使用是技术人员熟知的。稳定剂选自聚乙二醇、聚乙烯醇、环糊精、含硫的物质以及不同的盐。

在本发明的进一步实施方案中，螯合剂选自乙二胺四乙酸（EDTA）、柠檬酸和天门冬氨酸的盐及其混合物。

在本发明的进一步实施方案中，缓冲剂选自乙酸钠、碳酸钠、组氨酸、赖氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、苹果酸、马来酸、酒石酸、天门冬氨酸或其混合物。

在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包含表面活性剂。表面活性剂降低了液体的表面张力。阴离子表面活性剂可选自胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸钠盐、1-丁烷磺酸钠、胆酸钠水合物、脱氧胆酸钠、辛基硫酸钠、十二烷基硫酸钠和辛酸钠和或熊果脱氧胆酸。

阳离子表面活性剂可选自烷基三甲基溴化铵、二甲基双十八烷基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、乙基十六烷基二甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵。

非离子表面活性剂可自烷基多聚葡萄糖苷、乙氧蓖麻油、七乙二醇单十四烷基醚、六乙二醇单十二烷基醚、六乙二醇单十六烷基醚、六乙二醇单十八烷基醚、六乙二醇单十四烷基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单十四烷基醚、三乙二醇单十二烷基醚。

两性离子表面活性剂可自3-（十二烷基二甲基铵）丙磺酸内盐、3-（N,N-二甲基十四烷基铵）丙磺酸盐、3-（N,N-二甲基十八烷基铵）丙磺酸盐。

在本发明的进一步实施方案中，所述的制剂还包括蛋白酶抑制剂例如EDTA（乙二胺四乙酸）和苄脒HCl，也可以使用其他可商业获得的蛋白酶抑制剂。

其他成分可以存在于本发明的肽药物制剂中。这些额外的成分可以湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节剂、螯合剂、油质载体、蛋白质（如人血清白蛋白、明胶或蛋白质）以及两性离子（如牛磺酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸）。这些额外成分不应该不能影响本发明药物制剂的整体稳定性。

含有根据本发明化合物的药物组合物可以在多个位点施用给需要这种治疗的患者，如在局部位点（如皮肤和黏膜位点）、在不经过吸收的位点（如在动脉、静脉、心脏）、以及在涉及吸收的位点（如在皮肤、皮下、肌肉或腹部）。

根据本发明的药物组合物的施用可以通过多种给药途径施用给需要这种治疗的患者，如舌、舌下、口中、在胃和鼻、表皮、真皮、经皮肤、直肠、眼、输尿管和肠胃外施用。

本发明组合物可以以多种剂型施用，如作为溶液剂、混悬剂、复合型乳剂、泡沫剂、糊剂、片剂、包衣片剂、冲洗剂、凝胶剂、喷雾剂、粉剂、气溶剂、吸入剂、注射溶液、输涂溶液和埋植剂施用。

本发明组合物可以进一步例如通过共价、疏水性和静电相互作用混合进或连接至药物载体、药物递送系统和高级药物递送系统以便进一步增强本发明化合物的稳定性、提高生物利用率、增强溶解性。

附图说明

图1是本发明的新的长效GLP-1化合物的结构式。

图2 用于测量GLP1化合物的96孔板布局

图3 用于测量GLP1化合物的多功能酶标仪的设置

图4 GLP1化合物1-3的生物学活性

图5 GLP1化合物5-12的生物学活性。

具体实施方式

发明人经过深入的研究，发现无论对于高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖症、高血压、X综合症、血脂障碍、认知障碍、心肌梗赛、冠心病和其它心血管疾病、中风、消化不良和胃溃疡还是延缓或预防2型糖尿病发展的，GLP1类似物都有积极的治疗效果；发明人还发现GLP1类似物能有效减少食物摄取、减少β-细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性。

如本文所用，术语“组合物”包括(1)治疗高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖症、高血压、X综合症、血脂障碍、认知障碍、心肌梗赛、冠心病和其它心血管疾病、中风、消化不良和胃溃疡的组合物和/或(2) 有效减少食物摄取、减少β-细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性水平的组合物。

如本发明所用，“GLP1类似物”是指一种多肽，该多肽具有与天然GLP1相同或相似的生物学活性。本发明的GLP1类似物包括，但不限于：化学合成的GLP1类似物、大肠杆菌重组表达或哺乳动物细胞重组表达的GLP1类似物、GLP1类似物与异种蛋白质或多肽所形成的嵌合分子（Chimeric Molecule）或融合蛋白（Fusion Protein）比如与人的整个和部分免疫球蛋白基因（Fc）或人血清白蛋白从而增强其生物学活性或延长其体内的生物半衰期。

术语“治疗”是指基于治愈、缓解、改善、减轻、影响治疗对象疾病、症状、疾病体质（predisposition）的目的而给予需要治疗的对象本发明的GLP1类似物。

术语“治疗对象”是指人及其他哺乳动物。

术语“治疗有效量”是指能够在治疗对象体内达到治疗目的的GLP1类似物的量。本领域的普通技术人员应理解，所述“治疗有效量”可随GLP1类似物的给药途径、所用药物辅料以及与其他药物联合用药情况的不同而有所不同。

本发明的GLP1类似物是用固相多肽方法合成的。见实施例1

GLP1类似物也可以使用基因重组技术克隆表达。表达的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞或者高等真核生物细胞。适用的原核宿主细胞包括，但不限于：G+或G-菌，如大肠杆菌E. coli.，能够通过公共途径得到的E. coli.菌株包括：K12 MM294（ATCC 31,446）、X1776（ATCC 31,537）、W3110（ATCC 27,325）和K5 772（ATCC 53,635）等。其他可用的原核细胞包括但不限于：欧式杆菌（Erwinia）、克雷伯杆菌（Klebsiella）、变形杆菌（Proteus）、沙门杆菌（Salmonella）如鼠伤寒杆菌（Salmonella typhimurium）、沙雷菌属（Serratia）如粘质沙雷菌（Serratia marcescans）、志贺菌属（Shigella）、枯草杆菌. (B. subtilis)、地衣芽胞杆菌（B. licheniformis）、假单胞菌属（Pseudomonas）如绿脓杆菌（P. aeruginosa）、链球菌（Streptomyces）。E. coli. W3110因其常被用作重组DNA产品的发酵宿主而被推荐为优选。

除了原核细胞，真核细胞如丝状真菌（filamentous fungi）或酵母菌（yeast）等同样适用于表达或者克隆本发明的白介素-22。酿酒酵母菌（Saccharomyces）就是一种常用的低等真核宿主微生物，其他宿主如非洲粟酒裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces pombe）(Beach and Nurse, Nature, 290:140 [1981]; EP 139,383 )；克鲁维酵母菌（Kluyveromyces hosts）(U.S. Pat. No. 4,943,529; Flee et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991))如K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983])，K. fragilis (ATCC 12,424)，K. waltii (ATCC 56,500)，K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990))，K. thermotolerans，K. marxianus；yarrowia (EP 402,226)；巴氏毕赤酵母菌(Pichia Pastoris)（EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]）；念珠菌（Candida）；Trichoderma reesia（EP 244,234）；脉胞菌（Neurospora crassa）（Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]）；施万异样霉菌（schwanniomyces）如Schwanniomyces occidentalis（EP 394,538）；丝状真菌（filamentous fungi）如Neurospora，青霉菌（Penicillium），Tolypocladium（WO 91/00357），曲霉菌（Aspergillus）如A. nidulans（Balance et al., Biochem. Biophys. Res. Commum., 112:284-289 [1983]; Tilburm et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）和黑曲霉（A. niger）（Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]）。甲基营养酵母菌（Methylotropic yeasts）同样可用于表达本发明的白介素-22，包括但不限于各种能够在甲醇中生长的酵母菌如汉逊酵母菌（Hansenula），念珠菌（Candida），克勒克酵母菌（kloeckera），毕赤酵母菌（Pichia），酿酒酵母菌（Saccharomyces），球拟酵母菌（Torulopsis），红酵母菌（Rhodotorula）。属于甲基营养酵母菌类的典型菌种参见C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)。

用于表达糖基化的本发明的GLP1类似物的宿主细胞来源于多细胞有机体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞如Drosophila S2和Spodoptera Sf9，植物细胞。适用的哺乳动物宿主细胞的例子包括中华仓鼠卵巢细胞（CHO），COS细胞。特别是，经SV40转化的猴肾CV1细胞株（COS-7, ATCC CRL 1651）；人胚胎肾细胞株293（Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；CHO/-DHFR (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；小鼠睾丸滋养细胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；人肺细胞（WI38, ATCC CCL 75）；人肝细胞（Hep G2, HB 8065）；小鼠乳腺癌细胞（MMT 060562, ATCC CCL5 1）。本领域的普通技术人员应知如何选择合适的宿主细胞。

上述宿主细胞经GLP1类似物表达载体或克隆载体转染或者转化后可在传统的营养基（nutrient media）中培养，所述营养基经修饰后适于诱导启动子（promoter）、选择性转化体（selecting transformant）或者扩增白介素-22编码基因序列。培养条件如培养基、温度、pH等的选择对本领域的普通技术人员来说则是应知的。如何使细胞培养繁殖力最大化的一般原则、方案以及操作技术可参见Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., supra.。

本领域的普通技术人员应熟知真核细胞转染和原核细胞转化的方法，例如 CaCl2法、磷酸钙沉淀法、脂质体媒介法或电穿孔法。根据使用的宿主细胞的不同，本领域的普通技术人员可选择相应的标准转化技术，例如CaCl2法（Sambrook et al., supra.）或电穿孔法通常用于原核细胞；根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）感染主要用于某些植物细胞的转化（Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) and WO 89/05859）；对于没有细胞壁的哺乳动物细胞，则可以使用磷酸钙沉淀法（Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)）；有关哺乳动物宿主细胞转染的全面描述可参见 U.S. Pat. N.. 4,399,216。有关如何转化酵母细胞可参见Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) 和 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979).。其他将DNA引入细胞的方法，如核酸微量注射、电穿孔、完整细菌细胞原生质体融合（bacterial protoplast fusion with intact cells）、或者聚阳离子法（polycations）如1, 5-二甲基-1, 5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物（polybrene）、聚鸟氨酸（polyornithine）等皆可用于本发明中。有关各种哺乳动物细胞转化技术的描述可参见Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 和 Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)。

编码本发明的GLP1类似物的核苷酸序列（即cDNA 或基因组DNA）可被插入一可复制载体（replicable vector）进行基因克隆（DNA扩增）或者表达。各种载体如质粒、粘粒（cosmid，装配型质粒）、病毒颗粒或噬菌体等均可通过公共途径获得。运用本领域的公知技术，可将本发明的GLP1类似物的编码核苷酸序列按常规步骤插入可复制载体上适宜的限制性核酸内切酶位点。一个可复制载体通常包括但不限于以下部件：一条或多条信号序列（signal sequence），一个复制起点（origin of replication），一条或多条标记基因（marker gene），一个增强子元件（enhancer element），一个启动子（promoter），以及一段转录中止序列（transcription termination sequence）。本领域的普通技术人员可运用本领域标准的连接技术（ligation techniques）构建含有一个或多个上述部件的合适的可复制载体。

本发明的GLP1类似物不但可以通过基因重组直接表达，也可以通过与异种蛋白质或多肽形成融和蛋白质或多肽的方式生产，后者可以是一段位于成熟蛋白质或多肽N端的信号序列，也可以是位于成熟蛋白质或多肽N端的具有特异性切割位点的其他多肽片段。通常情况下，这段信号序列是上述可复制载体的一部分，或者它也可以是插入可复制载体的本发明的GLP1类似物编码核苷酸序列的一部分。所述信号序列可以是原核信号序列，例如碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp，或者热稳定肠毒素Ⅱ前导序列。在酵母分泌系统（yeast secretion）中，该信号序列可以是酵母转化酶前导序列（yeast invertase leader），α因子前导序列（包括酿酒酵母菌和克鲁维酵母菌α因子前导序列，参见U.S. Pat. No. 5,010,182），或酸性磷酸酶前导序列，C. albicans 葡萄糖淀粉酶前导序列（EP 362,179）。在哺乳动物表达系统中，哺乳动物信号序列可直接用于分泌目标蛋白质，此类序列包括来源于相同或相近物种哺乳动物分泌蛋白的信号序列以及病毒分泌前导序列。

表达载体和克隆载体均含有一段核苷酸序列，该序列使载体能够在一个或多个相应的宿主细胞内复制。与各种细菌、酵母或病毒宿主细胞对应的核苷酸序列为本领域普通技术人员所公知。例如，质粒pBR322的复制起点适用于大多数G-细菌，2.mu.质粒复制起点适用于酵母细胞，而各种病毒复制起点（SV40，多形瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV）则适用于哺乳动物细胞内的克隆载体。

表达载体和克隆载体通常含有一段选择基因，又名“选择标记”。典型的选择基因编码产生的蛋白质（a）对某些抗生素或毒素如氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤，四环素等具有抗性；（b）能弥补营养缺陷型缺乏（auxotrophic deficiencies）（c）补充复合型培养基不能提供的关键营养物质如杆菌宿主细胞需要的D-丙氨酸消旋酶的编码基因。

适用于哺乳动物宿主细胞的选择基因应该可以将有能力吸纳本发明的GLP1类似物编码基因的宿主细胞区分出来，如DHFR或胸（腺嘧啶核）苷激酶。适用的以野生型DHFR为选择基因的宿主细胞是无DHFR活性的CHO细胞株，该细胞株的制备及繁殖方法可参见Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216（1980）。适用于酵母细胞的选择基因是在酵母质粒Yrp7中表达的trpl基因（Stinchcomb et al., Nature, 282:39（1979）；Kingsman et al., Gene, 7:141（1979）；Tschemperet al., Gene, 10:157（1980））。trpl基因可用于筛选不能在色氨酸中生长的酵母菌突变株如ATCC No.44047或PEP4-1（Jones, Genetics, 85:12（1977））。

表达载体和克隆载体通常含有一个可人工操纵地连接到本发明的GLP1类似物编码核苷酸序列上的启动子，以指导mRNA的合成。与各种宿主细胞对应的启动子为本领域普通技术人员所公知。适用于原核宿主细胞的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统（Chang et al., Nature, 275:615（1978）；Goeddel et al., Nature, 281:544（1979）），碱性磷酸酶，色氨酸（trp）启动子系统（Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057（1980）；EP 36,776），杂合启动子如tac启动子（deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25（1983））。细菌宿主细胞启动子同样包含一段可人工操纵地连接到本发明的GLP1类似物编码基因序列的Shine-Dalgarno（S.D.）序列。

适用于酵母宿主细胞的启动子序列包括3-磷酸甘油酸激酶启动子（Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073（1980））或其他糖酵解酶的启动子（Hess et al., J.Adv. Enzvme Reg., 7:149（1968）；Holland, Biochemistry, 17:4900（1978）），如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，果糖磷酸激酶，葡糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，葡糖磷酸异构酶，和葡糖激酶。

还有一些可诱导的酵母启动子，它们能更好地根据生长情况来调节转录，包括醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，氮素代谢相关降解酶，金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸，麦芽糖和半乳糖代谢酶等的启动子。有关适用于酵母表达系统的载体和启动子的进一步描述参见EP 73,657。

启动子可以控制哺乳动物宿主细胞内可复制载体上本发明的GLP1类似物编码基因序列的转录。所述启动子包括来自于多形瘤病毒，禽痘病毒（UK 2,211,504），腺病毒，牛乳头（状）瘤病毒，禽类肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙肝病毒，或猿猴空泡病毒（SV40）等病毒基因组的启动子，来自于异种哺乳动物的启动子如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，以及来自于热休克蛋白的启动子，前提是这些启动子同宿主细胞表达体系相容。

通过在可复制载体中插入增强子可增强本发明的GLP1类似物的编码核苷酸序列在高等真核生物表达体系中的转录。增强子是一种DNA分子的顺式作用元件，通常为10到300个bp，通过作用于启动子而增强DNA分子的转录。目前已知很多增强子序列来自于哺乳动物基因（珠蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，α-胎蛋白，胰岛素）。而使用较多的是来自于真核病毒细胞的增强子，如位于复制起点下游（late side）的SV40增强子（100-270 bp），巨细胞病毒早期启动子增强子，位于复制起点下游的多形瘤病毒增强子，腺病毒增强子。增强子可被剪切插入位于可复制载体上的本发明的GLP1类似物的编码核苷酸序列的5’端或3’端，优选位于启动子的5’端。

真核宿主细胞（酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞、人类细胞，或者来源于其他多细胞有机体的有核细胞）中的表达载体同样含有中止转录和稳定mRNA所需的核苷酸序列。此类序列通常取自真核或者病毒DNA或cDNA非翻译区的5’端，有时也可取自3’端。所述“非翻译区”包含的核苷酸片段可转录产生位于本发明的GLP1类似物 mRNA非翻译区的聚腺苷酰化片段。

其他可在重组脊椎动物培养体系中用于合成本发明的GLP1类似物的方法、载体和宿主细胞可参见Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 以及EP 117,058。

用途

GLP1类似物可用作治疗高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖症、高血压、X综合症、血脂障碍、认知障碍、心肌梗赛、冠心病和其它心血管疾病、中风、消化不良和胃溃疡的组合物中的活性成分。所述的GLP1类似物可包括化学合成的GLP1类似物、大肠杆菌重组表达或哺乳动物细胞重组表达的GLP1类似物、GLP1类似物与异种蛋白质或多肽所形成的嵌合分子（Chimeric Molecule）或融合蛋白（Fusion Protein）比如与人的整个和部分免疫球蛋白基因（Fc）或人血清白蛋白从而增强其生物学活性或延长其体内的生物半衰期。

组合物中的活性成分除了上述的GLP1类似物，还可以含有有助于治疗高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖症、高血压、X综合症、血脂障碍、认知障碍、心肌梗赛、冠心病和其它心血管疾病、中风、消化不良和胃溃疡的额外组分，例如炎症性细胞因子(inflammatory cytokines)的抑制剂和抗体药物,增加糖和脂肪代谢的激素,和/或调节代谢的蛋白因子如:胰岛素,胰高糖素(glucagon), exenatide（艾塞那肽）、瘦素 (leptin),脂联素(adiponectin)等。

在本发明的组合物中，还可以包括其它具有减低血脂或降血糖的物质(提取物或化合物)，例如包括胰岛素、exenatide（艾塞那肽）、胰岛素增敏类药物、茶叶提取物、他汀类化合物（如辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀）、抗氧化类药物、血管紧张素转移酶抑制剂、和/或免疫调节功能类药物。

本发明GLP1类似物还可用作有效减少食物摄取、减少β-细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性的组合物中的活性成分。所述的GLP1类似物可包括化学合成的GLP1类似物、大肠杆菌重组表达或哺乳动物细胞重组表达的GLP1类似物、GLP1类似物与异种蛋白质或多肽所形成的嵌合分子（Chimeric Molecule）或融合蛋白（Fusion Protein）比如与人的整个和部分免疫球蛋白基因（Fc）或人血清白蛋白从而增强其生物学活性或延长其体内的生物半衰期。

本发明的减少食物摄取、减少β-细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性的组合物中还可以包括其它具有减少食物摄取、减少β-细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性用的物质。

本发明的GLP1类似物可被用作治疗药物。本领域的普通技术人员可按本领域的常规方法将其制备成各种药学上有效的制剂（formulation），其中包含有效量的GLP1类似物和药学上可接受的载体。

当制成冻干制剂或溶液剂时，本发明的药物组合物中还需要加入其他一些生理上可接受的载体、赋形剂、稳定剂等以便于储存（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)）。所述“生理上可接受”的载体、赋形剂、稳定剂等其药用剂量和浓度应对给药对象（人、鼠及其他哺乳动物）无毒，包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂如抗坏血酸（Vit C）；低分子量（少于10个氨基酸残基）多肽；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮（PVP），氨基酸如氨基乙酸、谷氨酸盐、天冬酰胺酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖或糊精；鳌合剂如EDTA；糖醇（sugar alcohols）如甘露醇、山梨醇；成盐抗衡离子（counterions）如钠离子；和/或非离子型表面活性剂如TWEEN.TM., PLURONICS. TM. 或PEG.等。

含有本发明的GLP1类似物的制剂在体内给药前必须经过灭菌。该步骤可在冻干和再组成（reconstitution）之前或之后借助灭菌过滤膜（sterile filtration membranes）过滤完成。

本发明的药物组合物通常被置于一配备有“灭菌入口”（sterile access port）的容器中，例如，一个有瓶塞的静脉溶液瓶，所述塞子可被皮下注射针穿透。

本发明的药物组合物可按本领域的常规途径给药，包括但不限于：静脉注射或输注、腹腔注射、脑内注射、肌内注射、眼内注射、动脉注射或输注、局部给药或者通过缓释系统（sustained release systems）给药。本发明的药物组合物的剂量和浓度范围可因实际使用情况的不同而变化。本领域的普通技术人员应知如何根据实际需求去选择合适的剂量和给药途径。对于不同种系，例如人和鼠之间药物剂量范围的调整原则，可参见Mordenti, J. and Chappell, W. “The use of interspecies scaling in toxicokinetics” In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al.; Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96.。

当本发明的GLP1类似物体内给药时，其通常剂量范围为每天1ng/kg－100mg/kg哺乳动物体重，优选范围10ug/kg/d－100ug/kg/d，根据给药途径的不同而有所不同。对于某些特定剂量和给药方法的指导参见U.S. Pat. Nos. 4657760；5206344；或5225212。可以预见的是，不同的GLP1类似物制剂将对不同的病种有效；当药物作用靶点（器官或组织）发生变化时，给药方式也需要做相应的调整。

含有本发明的GLP1类似物的微胶囊可用于本发明的GLP1类似物的缓释给药。重组蛋白的微囊缓释给药技术已成功应用于重组人生长激素（rhGH）、重组人干扰素（rhIFN）、白介素-2和MNrgp120（Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther 27:1221-1223 (1993); WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; U.S. Pat. No.5654010。

本发明的GLP1类似物的缓释制剂可用具有良好生物兼容性和宽泛生物可降解性的乳酸羟基乙酸高聚物（PLGA）制备。PLGA的降解产物，乳酸和羟基乙酸可被人体很快清除。而且，该高聚物的降解能力可随其分子量和组成的不同，从几个月延长到几年（Lewis, “Controlled release of bioactive agents form lactide/glycolide polymer,” in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41）)。

本发明的GLP1类似物还可用各种活化的分子量为5,000－100,000的聚乙二醇（PEG）修饰以使之高分子化，延长其半衰期。具体操作可参见 Greenwald et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 2465; Caliceti et al., IL Farmaco, 1993, 48,919; Zalipsky and Lee,《聚乙二醇化学：生物技术与生物医学应用》，J.M. Harris 编，Plenum Press, N. Y., 1992。优选使用多臂树杈型活性PEG（CN ZL02101672.0, WO9932139, PCT/US95/0755, PCT/US94/13013，US Pat: 4,640,835，4,496,689，4,301,144，4,670,417，4,791,192，4,179,337）。

本发明的GLP1类似物还可以做成嵌合分子（Chimeric Molecule）或融合蛋白（Fusion Protein）从而增强其生物学活性或延长其体内的生物半衰期。比如与人的整个和部分免疫球蛋白基因（Fc）或人血清白蛋白相连进行表达。GLP1类似物的部分可以用GLP1类似物 cDNA序列。生产表达Fc融合蛋白可见US Pat: 5,428,130。GLP1类似物基因可以放在Fc的N-末端，也可以放在Fc的C-末端进行表达。

共价修饰的GLP1类似物也包括在本发明内。化学共价修饰包括改变N-末端或C-末端或其他氨基酸加上一个化学分子。改变GLP1类似物本身的糖基化状态（Glycosalytion），包括增加糖基化或减少糖基化，或者直接通过化学反应改变糖基化状态，比如专利WO 87/05330。

其他制剂技术如纳米制剂（US60/544,693）、喷雾剂（CN00114318.2, PCT/CN02/00342）、吸入剂等同样包括在本发明的保护范围之内。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、GLP1类似物具有明显的治疗制备治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖症、高血压、X综合症、血脂障碍、认知障碍、心肌梗赛、冠心病和其它心血管疾病、中风、消化不良和胃溃疡的药物的作用。

2、GLP1类似物具有明显的制备延缓或预防2型糖尿病发展的药物。

3、GLP1类似物用于制备减少食物摄取、减少β-细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性的药物。

下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

1、结合树脂的多肽的合成

使用固相合成法，在肽合成仪上根据Fmoc策略合成0.25mmol量级的经保护的肽酰树脂，，所述方法采用NMP（N-甲基吡咯烷酮）中的HBTU介导的偶联，并且监控Fmoc保护基团的去保护。用于合成GLP-1肽酰胺的初始树脂是Rink-Amide 树脂并且将Wang树脂用于羧基C-末端的GLP-1肽。除了非天然的氨基酸Fmoc-Aib-OH以外，使用的经过保护的衍生物是在适合用于ABI4331合成仪的预称量筒中提供的标准氨基酸。N端氨基酸在a位置用Boc保护。位于37或38的赖氨酸的E氨基用Mtt Mmt Dde ivDde Boc保护，这取决于连接结合的蛋白的部分和间隔的方式。肽的合成在一些情况中可以通过利用在酰胺键上用酸性条件下能够切割的基团保护的二肽来改善。

除去ivDde或Dde保护的方法

将树脂（0.25mmol）放于一个手动振荡器重并用N-甲基吡咯烷酮中的2%肼(20ml,2*12分钟)处理以除去Dde或ivDde基团并用N-甲基吡咯烷酮(4*20ml)洗涤。

除去Mtt或Mmt保护的方法

将树脂（0.25mmol）放于一个手动振荡器重并用DCM中的2%TFA和2-3%的TIS处理（20ml,5-10 分钟，重复6-12次）以除去Mtt或Mmt基团，并用DCM（2*20m） DCM中的10%MeOH和5%DIPEA(2*20ml)和N-甲基吡咯烷酮(4*20ml)洗涤。

将侧连接到赖氨酸残基的方法

白蛋白或人体抗体Fc片段结合残基可以通过使用标准酰化剂酰化至结合树脂的肽上或在溶液中酰化至未受保护的肽上而连接至GLP-1。

方法1

将活化的白蛋白或人体抗体Fc片段结合残基溶解于NMP(25ml)中，在室温下加入至树脂并摇动过夜。过滤反应混合物并用NMP，二氯甲烷 2-丙酮，甲醇和二乙醚仔细洗涤树脂。

方法2

将白蛋白或人体抗体Fc片段结合残基溶解于N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷（1:1 10ml）中，加入活化剂HOBt和DIC（相对于树脂4摩尔的当量）并搅拌溶液15分钟。将该溶液加入至树脂并加入DIPEA（相对于树脂4摩尔的当量）。个树脂在温室下摇动2-24小时。用N-甲基吡咯烷酮(4*20ml)，二氯甲烷(4*20ml)洗涤树脂。

除去Fmoc-保护的方法：将树脂（0.25mmol）置于手动振荡摇动器的滤瓶中并用N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷（1:1 2*20ml）和N-甲基吡咯烷酮(4*20ml)，N-甲基吡咯烷酮中的20%哌啶溶液（3*20ml，每次10分钟）处理。用N-甲基吡咯烷酮/二氯甲烷（1:1 2*20ml）和N-甲基吡咯烷酮(4*20ml)洗涤树脂。

用于将肽从树脂上裂解的方法：

通过用三氟乙酸，水和TIS的混合物在温室下搅拌180分钟将肽从树脂裂解。过滤裂解混合物并将滤除的液通过氮气流浓缩为油装产物。用45ml乙醚从油装产物中沉淀出肽的粗提物并用45ml乙醚洗涤1至3次。

纯化

将肽的粗产物装在填有5u的C-18的硅石的20nm*250nm柱上通过办制备的 HPL纯化。根据该肽的使用一个或两个纯化系统。

TFA 干燥后，将所述的肽的粗品产物溶解于5毫升的50%的乙酸水溶液中，并用水稀释到20毫升并将其注射到柱子上，随后将该柱子在40度下于50分钟内用0.1%TFA中的40-60%乙腈梯度以10ml/分钟洗脱，收集含有肽的级份。用水稀释洗脱物后冻干纯化的多肽。

硫酸铵

该柱用弄硫酸调节至 pH2.5的0.05M硫酸铵中的40%乙腈平衡。干燥后，将肽粗产物溶解于5ml 50%的乙酸水溶液中，并用水稀释到20毫升并注射到柱子上，随后在40度夏于50分钟内江该柱子用0.05M 硫酸铵中的40-60%的乙腈梯度以10ml/分钟洗脱。收集含有肽的级分并用3倍体积的水稀释，并且使用通过已经用0.1%TFA平衡的C18筒，随后用含有0.1%TFA的70%乙腈将其洗脱，并用水稀释洗脱物后通过冷冻干燥来分离经纯化的肽。

获得的最终产物通过分析RP-HPLC和LCMS鉴定

RP-HPLC分析用214nm下的UV检测和在42℃下以1毫升每分钟洗脱得波士顿 4.6mm*250mm 5u C18分析柱进行。使用两种不同的洗脱条件。

A 在由0.1M硫酸铵组成的缓冲溶液中平衡该柱，并通过相同缓冲液0-60%的乙腈梯度洗脱50分钟，其中所述的硫酸铵溶液用浓硫酸调节至pH2.5。

B 用0.1%TFA/水平衡该柱并用0%乙腈/0.1%TFA/水至60%乙腈/0.1%TFA/水的梯度洗脱50分钟。

LC-MS

在由Sciex API 100 Single quadropole 质谱仪，Perkin Elmer 系列200Quard泵，Perkin Elmer系列200自动采样器，Applieed Biosystems 785A UV检测器，Sedex75蒸发光散射检测器组成的装置上进行HPLC泵连接至两个洗脱储存液器，储存液含有：A 水中0.1%三氟乙酸，B 乙腈中0.1%的三氟乙酸。

在温室下，通过注射适宜的样品至经乙腈梯度洗脱的柱子上进行分析。

使用的HPLC条件，检测器设置和质谱仪设置在下表给出的。

柱波士顿 MS C-18 X 3 mm id 5um

梯度在7.5分钟以内1.5ml/分钟进行的5-90%的乙腈线性梯度

检测 210nm

ELS 40℃

MS 离子化模式API-ES

实施例2

GLP-1的衍生物的药物活性研究

在本发明的一个方面，GLP-1衍生物的药物活性实验使用了GLP1 受体 (glucagon-like peptide 1 receptor (GLP1R) ) 的稳定转染细胞系。GLP1受体位于人的chromosome 6, 属于高血糖素受体的里的一种，同时也是一个典型的G-蛋白偶联的受体。GLP1受体在胰腺的beta细胞上大量表达，被激活的GLP1受体可以促进腺苷酸环化酶通路，从而增加胰岛素的合成与分泌。因此，GLP1受体被当做一个潜在的治疗糖尿病的靶点。

G-蛋白偶联受体是药物筛选中的一个重要靶点，根据Gα蛋白的不同， G-蛋白偶联受体被分成几种亚型，Gs-型的G-蛋白偶联受体可以激活腺苷酸环化酶并且提高细胞水平上的cAMP. 因此在本发明中，构建了一个对cAMP敏感的DNA序列和其下游的报告基因, luciferase(荧光素酶)，并且建立了一个稳定转染细胞系用来测量cAMP的水平，进而评估GLP1受体被激活的水平。

实验材料：

1. Luciferase Assay Kit (荧光素酶试剂盒): Allele, Cat#ABP-PA-ABLA011

2. GLP1(7-37): 自己制备

3. 96-Well cell culture plate (Corning Cat # 3599)

4. White Optiplate-96 plate (PerkinElmer, Cat # 6005290)

PBS (for preparation of 1000 ml)

1) NaH2PO4: 0.2965 g

3) NaCl: 8.766 g

4) Na2HPO4.12H2O: 2.9014 g

取磷酸二氢钠（NaH2PO4﹒2H2O）0.2965克，磷酸氢二钠（Na2HPO4﹒12H2O）2.9014克，氯化钠（NaCl）8.766克溶于800ml去离子水，混匀、溶解。用1M的氢氧化钠和6M的盐酸调PH至7.4±0.1后，补足1000ml。0.22um滤膜过滤，分装成50ml/管，4℃保存。

图2显示的是用于测量GLP1化合物的96孔板布局。

实验步骤：

1) 在96孔板里种5x104的细胞，在细胞培养箱 (37oC in a 5% CO2) 里培养24小时候进行试验。

2) 把样品加入96孔板中(三个副孔)，终浓度为50nM. 在细胞培养箱里孵育5个小时。

3) 加入25uL 的Luciferase Assay Kit (荧光素酶试剂盒，Allele, Cat#ABP-PA-ABLA011), 并转移到Optiplate的96控板上。

4) 用下面表格的设置读取96孔板的数据，并计算出样品活性。

用于测量GLP1化合物的多功能酶标仪的设置见图3。GLP1化合物1-3的生物学活性见

图5 GLP1化合物5-12的生物学活性见图5。

对比阳性对照GLP-1 (7-37)，本发明中涉及的GLP1衍生物#1，#5，#7，#8，#10，#11，#12都具有与对照品相似的活性。因此衍生物的活性并未因氨基酸的修饰而降低，而且其体内的药物动力学特征有显著提高，从而使得GLP1衍生物更适合作为治疗糖尿病的候选药物。

GLP-1的衍生物在SD大鼠中的药物动力学研究

在本发明的一个方面，GLP-1衍生物在由皮下注射30nmol/kg单次剂量给SD大鼠 (200-300g)。每组6-8只SD大鼠。在施用剂量前，注射后1、2、4、8、12、24、48、72、96和120小时，抽取每只动物的血样。不含抗凝剂的1.5mL离心管（EP管）用于收集血样，血样收集后至少在冰上放置15min，然后3500 rpm，2-8 ℃，离心10min。血样收集置离心应在60min内完成。离心收集的血清分装至新的EP管中，约100μL/管，盖紧EP管盖子后，-70℃以下保存。从血样收集至血清保存，应在4h内完成。剩余的血清，分装成大约100μL/管，-70℃以下保存。

样品是由ELISA方法测定, 使用的抗体为6K11/biotin-6K11,测定的血浆中的浓度-时间曲线通过非房室模型分析来进行药物动力学分析，分析软件为DAS2.0，得到的动力学参数为：Tmax, Cmax, AUC, T1/2, CL/F和MRT。

此ELISA方法采用的是经典的夹心法，将分析物夹在捕获抗体与检测抗体之间，使用吸收光(OD450 reading)作为信号，使用的多功能读板仪为 Versa Max Microplate Reader (Molecular Devices)。实验所施用的抗体既不识别内源性的GLP-1 (7-37) 也不识别经DPPIV裂解的GLP-1 (9-37)。对照血浆是从非实验组的SD大鼠中获得并混匀。

缓冲液:

包被缓冲液：

将PBS用作包被缓冲液：调节至pH7.0的1mM磷酸二氢钠、10mM磷酸氢二钠和150mM的氯化钠。

洗涤缓冲液

含有0.05% (v/v)吐温20的PBS

测定缓冲液

含有0.05% (v/v)吐温20、10g/L BSA的PBS

底物

即用型底物TMB Substrate Cell Signaling Technology #7004

标准品

标准品是自己制备的25uM的储液。将其系列稀释至参照血浆中产生具有 15-30-60-120-240-480-960-1920 pM的终浓度标准品。分装至EP管中，并保存在-70oC.

测定法步骤

在4oC下用PBS稀释多克隆抗体6K11至10ug/mL的终浓度，并以100uL每孔包被96孔板(Costar#2596)过夜。

在自动化洗板机(BioTek #ELx 50)中用洗涤缓冲液冲洗96孔板5次并让其保持至少30分钟，用洗涤缓冲液封闭剩余的点位。

将100uL的样品或标准品加入每个孔中(一式两份),在37oC培养箱中孵育2个小时，然后在自动化洗板机(BioTek #ELx 50)中用洗涤缓冲液冲洗96孔板5次并让其保持至少30分钟，冲洗掉非特异性结合的样品或标准品。随即立即加入将100uL的包含1ug/mL生物素化的6K11检测缓冲液，在37oC培养箱中孵育1个小时，随后如前描述的进行5此洗涤循环。

加入100uL的亲和素-辣根过氧化物酶至每孔中并在室温下于平板振荡器上孵育30分钟，随后如前描述的进行5此洗涤循环。然后加入100uL的TMB Substrate (Cell Signaling Technology #7004),10分钟后用100uL的H3PO4终止。把96孔板放在Versa Max Microplate Reader (Molecular Devices)中测量，得出标准曲线并计算出样品浓度。

Claims

1.GLP-1 类似物，所述的类似物在相对于序列 GLP-1(7-37) 的位置9上具有氨基酸替代修饰，将位置9修饰为Asp。

2.根本权利要求1的GLP-1 类似物，其中在位置37或38连接的部分包含亲水性连接物。

3.根本权利要求2的GLP-1 类似物，其中所述的亲水性连接物包含至少5个非氢原子，其中30-50%的这些非氢原子是N或O。

4.根据上述权利要求1-3的GLP-1 类似物，其中所述的GLP-1 类似物包含将位置34修饰为Arg。

5.根据上述权利要求1-3 的GLP-1 类似物，其中所述的GLP-1 类似物包含将位置8修饰为2-methyl-Ala。

6.根据上述权利要求1-4 的GLP-1 类似物，其中所述的GLP-1 类似物包含将位置8修饰为2-methyl-Ala。

7.根据上述权利要求1-4 的GLP-1 类似物，其中所述的GLP-1 类似物包含将位置8修饰为Gly。

8.根据上述权利要求1-3 的GLP-1 类似物，其中所述的GLP-1 类似物包含将位置8修饰为Gly，将位置36修饰为2-methyl-Ala。

9.根据上述权利要求1-8 的GLP-1 类似物，其中所述的GLP-1 类似物结构为如下的一种或若干种：

H-His-XX₂-XX₁-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-XX₃-XX₄-Arg-XX₅-NH₂

XX₁=Glu或Asp

XX₂=Ala、D-Ala、Val、2-methyl-Ala、Gly、Leu、Ile、Lys

XX₃=Arg、Lys或Glu

XX₄=Gly或2-methyl-Ala

XX₅=Gly、NH₂或不存在。

10.用于增加GLP-1 类似物在患者中的作用时间的方法，所述方法的特征是在所述GLP-1 类似物位置9的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Asp来替代。

11.用于增加GLP-1 类似物在患者中的作用时间的方法，所述方法的特征是在所述GLP-1 类似物位置9的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Asp来替代，将位置34的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的Arg来替代。

12.用于增加GLP-1 类似物在患者中的作用时间的方法，所述方法的特征是在所述GLP-1 类似物位置9的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Asp来替代，将位置8的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的2-methyl-Ala来替代。

13.用于增加GLP-1 类似物在患者中的作用时间的方法，所述方法的特征是在所述GLP-1 类似物位置9的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Asp来替代，将位置34的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的Arg来替代，将位置8的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的2-methyl-Ala来替代。

14.用于增加GLP-1 类似物在患者中的作用时间的方法，所述方法的特征是在所述GLP-1 类似物位置9的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Asp来替代，将位置8的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Gly来替代，将位置34的氨基酸残基上用如在上述权利要求中公开的Arg来替代。

15.用于增加GLP-1 类似物在患者中的作用时间的方法，所述方法的特征是在所述GLP-1 类似物位置9的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的Asp来替代，将位置8的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的Gly来替代，将位置36的氨基酸残基用如在上述权利要求中公开的2-methyl-Ala来替代。

16.药物组合物，所述的药物组合物包含根据权利要求1-9任意一项的化合物和可药用赋形剂。

17.根据权利要求1-9的药物组合物，所述的药物组合物适合肠胃外施用。

18.根据权利要求1-9任意一项的化合物用于制备药物的用途。

19.根据权利要求1-9任意一项的化合物的用途，所述的化合物用于制备治疗或预防高血糖症、2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、肥胖症、高血压、X综合症、血脂障碍、认知障碍、心肌梗赛、冠心病和其它心血管疾病、中风、消化不良和胃溃疡的药物。

20.根据权利要求1-9任意一项的化合物的用途，所述的化合物用于制备延缓或预防2型糖尿病发展的药物。

21.根据权利要求1-9任意一项的化合物的用途，所述的化合物用于制备减少食物摄取、减少β-细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性的药物。

22.如权利要求1-9任意一项的化合物所述的用途，其特征在于，所述的组合物包括药物组合物或保健品组合物。

23.如权利要求1-9任意一项的化合物所述的用途，其特征在于，所述的GLP1类似物包括化学合成的GLP1类似物、大肠杆菌重组表达或哺乳动物细胞重组表达的GLP1类似物、GLP1类似物与异种蛋白质或多肽所形成的嵌合分子（Chimeric Molecule）或融合蛋白（Fusion Protein）比如与人的整个和部分免疫球蛋白基因（Fc）或人血清白蛋白从而增强其生物学活性或延长其体内的生物半衰期。

24.如权利要求1-9任意一项的化合物所述的用途，其特征在于，所述的组合物包括选自下组的额外组分：具有减低血脂或降血糖的提取物或化合物,炎症性细胞因子的抑制剂和抗体药物,增加糖和脂肪代谢的激素,调节代谢的蛋白因子,或其混合。

25.如权利要求24所述的用途，其特征在于，所述的具有减低血脂或降血糖的物质(提取物或化合物)包括胰岛素、exenatide（艾塞那肽）、胰岛素增敏类药物、茶叶提取物、他汀类化合物（如辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀）、抗氧化类药物、血管紧张素转移酶抑制剂、和/或免疫调节功能类药物；所述的调节代谢的蛋白因子包括胰岛素,胰高糖素(glucagon),瘦素(leptin),和/或脂联素(adiponectin)等。

26.如权利要求1-9任意一项的化合物所述的用途，其特征在于，所述的组合物选自：粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液或片剂。