CN101225110B - 人白细胞介素-22突变体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了白细胞介素-22的受体结合位点，为白细胞介素-22的利用提供了基础；并提供了一种第67和71位Asp变为Ala的结合活性升高的突变体蛋白，可以发挥比白细胞介素-22本身更大的作用；本发明还提供了白细胞介素-22突变体的构建方法，该方法产量高、成本低，适于大规模的生产和应用。
Description
技术领域
本发明涉及人白细胞介素-22，具体地说涉及人白细胞介素-22突变体及其构建方法和应用。
背景技术
白细胞介素22(英文名称为Interleukin 22，简写为：IL22)是于2000年发现的一种细胞因子，属于白细胞介素10家族成员，它由活化的T细胞，NK细胞分泌(Dumoutier L等，J Immunol 2000；164：1814～9.)，但其受体却位于皮肤，肾脏，消化系统，呼吸系统的实质细胞上，而对免疫系统却不产生作用(WolkK等，Immunity 2004；21：241-54.)，生物学研究表明hIL22可以诱导上皮组织如肺脏、肠道、皮肤抗微生物多肽的表达，增强这些细胞对抗病原微生物的侵袭，抑制上皮细胞的分化，增强其增殖和迁移，因而IL22被认为在病原体防御，创伤愈合及组织重构中起重要作用(Boniface K等，J Immunol 2005；174：3695～702)。在肝脏和胰腺中人白细胞介素22(英文名称：human Interleukin 22，简写为：hIL22)可以诱导急性期反应蛋白以及PAP1的产生，保护这些组织并且增强其再生作用(Aggarwal S等，J Interferon Cytokine Res 2001；21：1047-53.Dumoutier L等，Proc Natl Acad Sci USA 2000；97：10144～9)。
hIL22是一种分泌型蛋白，由179个氨基酸组成，切除信号肽后以146个氨基酸的形式分泌(Xie，M.H.等，J.Biol.Chem.275，31335～31339.)，氨基酸序列对比发现hIL22与hIL10有22.8％的同源性与鼠IL22有80.8％的同源性，IL22的模型是一个不对称的二聚体，包括单体A，142个氨基酸(Ser38-lle179)和单体B，141个氨基酸(his39-lle179)以及189个水分子，hIL22的每一个单体由6个α螺旋组成，形成一个紧密的团束。根据初级结构的预测，hIL22有两个糖基化位点(Asn-Xaa-Thr/Ser)定位于helixA(Asn54-Arg55-Thr56)，loopAB(Asn68-Asn69-Thr70，helixC(Asn97-Phe98-Thr99)。hIL22双聚体是一种不对称的亚单位，通过同源模建将IL22与hIFN-γ/hIFN-γRα以及hL10/hL10R1复合物进行比对，发现IL22可能的受体结合位点由helixA，loopAB，helixF组成(Ronaldo Alves Pinto Nagem，1，2 Didier Colau，CrystalStructure of Recombinant Human Interleukin-22 Structure，Vol.10，1051-1062，August，2002)，然而还不能精确推断哪个结合位点与CRF2-9结合，哪个位点与CRF2-4结合。
如果能确定其真正的受体结合位点，那么就可以对IL22蛋白进行有目的的改造，以便能在制备治疗疾病的药物上发挥更大的作用。
发明内容
本发明在已知IL22晶体结构基础上(Ronaldo Alves Pinto Nagem，1，2Didier Colau.Crystal Structure of Recombinant Human Interleukin-22Structure，Vol.10，1051-1062，August，2002)，借助计算机分析，利用Homology程序(InsightII2000软件包，Octane2图形工作站)从理论上模拟IL22胞外段三维结构，通过表观静电分布、可及性表面积分析，结合细胞因子结构特征，对IL22参与结合受体区域进行了分析，并将受体结合区定位于loopAB的N末端，随后通过对受体结合位点实行点突变，构建了一系列突变体，然后通过对系列突变体生物活性变化的分析，准确地确定了受体结合位点，并且构建了高活性的hIL22突变体，以此发现为基础构成了本发明。
本发明的目的之一是提供一种人白细胞介素-22突变体。
本发明的另一目的是提供人白细胞介素-22突变体的用途。
本发明的还一目的是提供人白细胞介素-22突变体蛋白的制备方法。
实现本发明的技术方案为：
本发明一种人白细胞介素-22突变体，就是通过对SEQ NO：1的氨基酸序列中第67～72位氨基酸的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和添加突变所产生的多肽，且该多肽与人白细胞介素-22具有相同或相似的功能。
上述人白细胞介素-22的第67～72位氨基酸序列为
Asp-Asn-Asn-Thr-Asp-Val。
上述人白细胞介素-22突变体，具有SEQ NO：2、SEQ NO：3、SEQ NO：4或SEQNO：5的氨基酸序列。
上述人白细胞介素-22突变体，具有SEQ NO：5的氨基酸序列。
上述人白细胞介素-22突变体多肽对应的抗体或者拮抗剂等
上述人白细胞介素-22突变体多肽在制备治疗肝病、肾病、胰腺等疾病药物上的应用。
本发明人白细胞介素-22突变体的制备方法，包括如下步骤：
上述人白细胞介素-22突变体的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)将人新鲜外周血液用含2mmol/L EDTA的PBS稀释2倍，然后铺于等体积淋巴细胞分离液上，在700～1000rpm条件下离心，吸出离心所产生的灰白层细胞，再用Hanks液洗涤灰白层细胞2～3次，并将灰白层细胞悬浮于1640培育基中，然后在37℃、5％CO2培养箱中培养24h；再向培养基中加入ConA(2mg/ml)；和anti-CD3(4mg/ml)共刺激细胞；然后在37℃、5％CO2培养箱中培养24h，用总RNA提取试剂盒提取总RNA；
(2)以总RNA为模板，以f1和r1为引物
f1：5′GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3′；
r1：5′ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3′
进行RT-PCR，扩增得到野生型hIL22；反应体系为：总RNA，5ul；RNase抑制剂，0.5ul；Oligo(dT)，0.5ul；DEPC处理水，6.5ul；总计12ul；70℃5min至4℃；RT：在上述体系加入：5×buffer，4ul；2.5mMdNTP，2ul；AMV，1ul；RNase抑制剂，1ul；42℃1h，85℃ 5min至4℃；
以反转录产生的第一链cDNA为模板，以f1和r1为引物进行PCR反应，所述的PCR反应体系如下：10PCR反应×buffer 2.0ul，2.0mmol/L dNTP 2.0ul，5pmol/ul f1 2.0ul，5pmol/ul r1 2.0ul，反转录产物4.0ul，TaqDNA聚合酶0.5ul，ddH2O 7.5ul，共20ul；PCR反应条件为94℃预变性3min；94℃30S，50℃30S，72℃30S，30个循环；72℃延伸7min；PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶分离；
(3)利用限制性内切酶EcoRI和BamHI将RT-PCR产物与质粒pBV220在37℃水浴中酶切3.5h；然后将两者按10～4∶1比例混合，加入T4连接酶，在16℃进行连接反应12h，再用电转化或CaCl2法将连接产物转化宿主细胞(见《分子克隆实验指南》第三版96～99)，利用氨苄青霉素抗性筛选重组克隆，提取相应质粒，酶切鉴定，测序，得重组质粒pBV220/hIL22；
(4)以重组质粒pBV220/hIL22为模板，进行重叠PCR扩增，其中重叠PCR方法所用的引物需要四种，第一对引物扩增含突变位点及其上游序列的DNA片段，正向引物(FM)含有野生型模板DNA的突变位点；反向引物含有(R2)含有野生型序列；第二对引物用来扩增含希望引入突变位点及其下游序列的DNA片段，反向引物(RM)含有希望引入模板的DNA的突变位点；正向引物F2含有野生型序列；得含有突变位点的hIL22的DNA序列；
(5)用电转化或CaCl2法将重组质粒转化宿主细胞；转化菌落30℃过夜活化，次日以1～2％体积百分比接种于LB培养基，在30℃培养2～3h；然后置于在42℃水浴摇床上、180～220rpm条件下培养4hr，再在4℃、12,000rpm条件下离心15min，去上清，将沉淀物以质量体积比1∶8～10重悬于PB溶液中，用超声波破碎菌体，用2mol/L尿素洗涤经超声处理后得到的包涵体2～4次，再用8mol/L尿素变性溶解包涵体；接着以Sephacryl-200(S-200)为柱填料，对溶解上清进行凝胶过滤层析，将纯化产物置于复性缓冲液中，在4℃稀释复性72hr，然后以PEG 6000缓慢浓缩得本发明多肽。
上述PB溶液为终浓度为100mmol/L Na2HPO4，100mmol/L NaH2PO4的混合液。见《分子克隆实验指南》第三版1568页。
上述淋巴细胞分离液可从市场上直接购买，如可从上海华精生物公司购买。
上述Hanks液可从市场上直接购买，如可从天润善达公司购买。
上述1640培养基可从市场上直接购买，如可从天润善达试剂公司购买。
上述总RNA提取试剂盒可从市场上直接购买，如可从Promega公司购买。
上述宿主细胞是E.coli DH5α、HB101或JM109等。
上述步骤(4)引物设计方法见《分子克隆实验指南》第三版第十三章1109页
上述步骤(4)所述的引物可以是下述引物组：
(1)第一对引物：
反向R2：5′GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3′
正向FM：5′AGCTGCAGCTGCAGCTGCAGCCAAGCTAGCCTCCTT3′
第二对引物：
反向RM：5′GCAGCTGCAGCTGCAGCTCGTCTCATTGGGGAGAAA3′
正向F2：5′ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3′；
或(2)
第一对引物：
反向R2：5′GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3′
正向FM：5′GTCTGTAGCTGCATCAGCCAAGCTAGCCTC3′
第二对引物：
反向RM：5′GCTGATGCAGCTACAGACGTTCGTCTCATT3′
正向F2：5′ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3′；
或(3)
第一对引物：
反向R2：5′GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3′
正向FM：5′AACGTCTGTATCAGCCAAGCTAGCCTC3′
第二对引物：
反向RM：5′TTGGCTGATACAGACGTTCGTCTCATT3′
正向F2：5′ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3′；
或(4)
第一对引物：
反向R2：5′GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3′
正向FM：5′AGCTGTGTTGTTTGCAGCCAAGCTAGCCTCCTT3′
第二对引物：
反向RM：5′GCAAACAACACAGCTGTTCGTCTCATTGGGGAG3′
正向F2：5′ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3′
上述步骤(5)所述的宿主细胞是E.coli DH5α、HB101或JM109等。
上述步骤(5)所述的复性缓冲液组成成分及比例为100mmol/L Na2HPO4、100mmol/L NaH2PO4、0.1 mmol/L GSSG、1mmol/L GSH、0.1％PEG。
本发明中确定人白介素-22受体结合位点的过程：
(1)借助已有的hIL22晶体结构，利用Homology程序(InsightII2000软件包，Octane2图形工作站)从理论上模拟hIL22胞外段三维结构(见图1)；
(2)通过PDB二级结构分析，对其空间构象进行预测(见图2)；
(3)利用表观静电分布、可及性表面积分析，结合细胞因子结构特征，对hIL22参与结合受体区域进行了预测，结果表明LoopAB为暴露在表面静电分布合适的区域(见图3)；
(4)进一步分析，确定LoopAB的N-端为受体结合区域(见图4，图5)
(5)受体结合位点的氨基酸序列为67～72位氨基酸，氨基酸序列为：Asp-Asn-Asn-Thr-Asp-Val。
本发明的优点：(1)确定了IL22的受体结合位点，为IL22的利用提供了基础；(2)本发明提供一种结合活性升高的突变体蛋白，通过白介素22突变体可以更好地发挥IL22所具有的作用；(3)本发明提供了IL22突变体蛋白的制备方法，该方法产量高，成本低，适于大规模的生产和应用。
附图说明
图1模拟hIL22胞外段三维结构图。
图2预测hIL22空间构象图。
图3LoopAB为暴露在表面静电分布合适的区域。
图4LoopAB的N-端为受体结合区域图。
图5LoopAB的N-端为受体结合区域图。
图6hIL22总RNA的电泳图。
图7六个氨基酸全部突变为丙氨酸(Ala)的DNA电泳图。
图8第68.69位Asn变为Ala的突变体2NM的DNA的电泳图。
图9第68和69位Asn缺失的突变体2ND的DNA的电泳图。
图10第67和71位Asp变为Ala的突变体2DM的DNA电泳图
图11hIL22及其突变体蛋白促进LO2细胞的增殖活性曲线图。
具体实施方式
实施例1：野生型hIL22基因的钓取和重组表达载体的构建
1.1总RNA的提取
用含2mmol/L EDTA的PBS将1ml新鲜外周血稀释2倍，然后铺于等体积淋巴细胞分离液(购于上海华精生物公司)上，800r/min离心使之分层，然后用毛细血管吸出灰白层细胞。用Hanks液洗涤3次后，用1640培育基(购于天润善达试剂公司)悬浮细胞在37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，用ConA(2mg/ml，购于夏斯生物公司)；和anti-CD3(4mg/ml购于上海我武生物科技有限公司)共刺激细胞然后在37℃，5％CO2培养箱中继续培养24h后，用Promega公司的总RNA提取试剂盒提取总RNA，操作按说明书进行，电泳检测提取结果(见图6)说明得到总RNA；
1.2引物
EcoRI f1：5′GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3′
BamHI r1：5′ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3′
以总RNA为模板，利用上述引物进行RT-PCR，扩增得到野生型hIL22。
反应体系为：RNA，5uL；RNase抑制剂；0.5uL；Oligo(dT)，0.5uL；DEPC处理水，6.5ul；总计12ul；70℃ 5min至4℃；RT：在上述体系加入：5×buffer，4ul；2.5mMdNTP，2ul；AMV，1ul；RNase抑制剂，1ul；42℃ 1h，85℃ 5min至4℃；
以反转录产生的第一链cDNA为模板进行PCR反应，PCR反应体系如下：
10PCR反应×buffer 2.0ul
2.0mmol/L dNTP 2.0ul
5pmol/uL f1 2.0ul
5pmol/uL r1 2.0uL
反转录产物 4.0ul
TaqDNA聚合酶 0.5ul
ddH2O 7.5ul
共 20ul
PCR反应条件为94℃预变性3min；94℃ 30S，50℃ 30S，72℃ 30S，30个循环；72℃延伸7min。PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶分离。
1.3重组质粒的构建
RT-PCR产物用限制性内切酶EcoRI和BamHI(购自Promega公司)消化，与经过同样处理的质粒pBV220连接，转化E.coli DH5α，利用氨苄青霉素抗性筛选重组克隆；提取阳性克隆的质粒DNA，进行EcoRI和BamHI双酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳分析；将初步鉴定正确的重组子克隆送交大连宝生物公司进行序列分析。其中质粒DNA的提取、酶切反应、连接反应、感受态的制备及转化等操作均参照《分子克隆实验指南》。其氨基酸序列见SEQ NO：1.
实施例2：系列hIL22突变体的构建
构建将受体结合位点六个氨基酸(DNNTDV)全部突变为丙氨酸(Ala)的突变体6M
第一对引物：
反向R2：5′GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3′
正向FM：5′AGCTGCAGCTGCAGCTGCAGCCAAGCTAGCCTCCTT3′
第二对引物：
反向RM：5′GCAGCTGCAGCTGCAGCTCGTCTCATTGGGGAGAAA3′
正向F2：5′ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3′
PCR反应体系如下：
pBV220-hIL22 1ul
正向引物R2(或RM)10umol/l 2ul
反向引物FM(或F2)10umol/l 2ul
10×buffer 5ul
2.5mmol dNTP 4ul
Pyrobest高保真酶 0.5ul
水 加至50ul
第一轮PCR反应得到R2-FM与RM-F2两个片段，随后以这两片断为模板进行第二轮PCR
R2-FM 1ul
RM-F2 1ul
正向引物R2 10umol/l 2ul
反向引物F2 10umol/l 2ul
10×buffer 5ul
2.5mmol dNTP 4ul
Pyrobest高保真酶 0.5ul
水 加至50ul
第一轮PCR反应体系均为：
94℃ 5min，
72℃ 7min
第二轮PCR反应体系为：
95℃ 5min，70℃ 5min；
72℃ 7min
扩增结果见图7，最终所得氨基酸序列见SEQ NO：2。
实施例3
构建将68和69位Asn变为Ala的突变体2NM
第一对引物：
反向R2：5′GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3′
正向FM：5′GTCTGTAGCTGCATCAGCCAAGCTAGCCTC3′
第二对引物：
反向RM：5′GCTGATGCAGCTACAGACGTTCGTCTCATT3′
正向F2：5′ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3′
反应体系及参数同前扩增结果见图8，其氨基酸序列见SEQ NO：3。
实施例4
构建将将68和69位Asn缺失的突变体2ND
第一对引物：
反向R2：5′GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3′
正向FM：5′AACGTCTGTATCAGCCAAGCTAGCCTC3′
第二对引物：
反向RM：5′TTGGCTGATACAGACGTTCGTCTCATT3′
正向F2：5′ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3′
反应体系及参数同前，扩增结果见图9，其氨基酸序列见SEQ NO：4。
实施例5
将67和71位Asp变为Ala的突变体2DM
第一对引物：
反向R2：5′GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3′
正向FM：5′AGCTGTGTTGTTTGCAGCCAAGCTAGCCTCCTT3′
第二对引物：
反向RM：5′GCAAACAACACAGCTGTTCGTCTCATTGGGGAG3′
正向F2：5′ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT3′
反应体系及参数同前，扩增结果图10，其氨基酸序列见SEQ NO：5。
实施例6
hIL22及其系列突变体在大肠杆菌中的表达与纯化
按CaCl2转化法将表达载体pBV220/hIL22，pBV220/6M，pBV220/2NM，pBV220/2ND，pBV220/2DM转化E.coli DH5α。转化菌落经30℃过夜活化，次日以2％比例接种于LB培养基，30℃培养至对数生长期(OD600＝0.4～0.6)，立即转入42℃水浴摇床，200rpm培养4hr，诱导目的蛋白在E.coli DH5α中表达。诱导表达培养物于4℃，12,000rpm离心15min，将沉淀按1/8质量体积比重悬于PB(100mmol/L Na2HPO4，100mmol/L NaH2PO4)中，以超声波破碎菌体，超声处理后得到的包涵体经2mol/L尿素洗涤2次，8mol/L尿素变性溶解，以Sephacryl-200(S-200)为柱填料，对溶解上清进行凝胶过滤层析。纯化的样品在复性缓冲液(100mmol/L Na2HPO4，100mmol/L NaH2PO4，0.1mmol/L GSSG，1mmol/L GSH，0.1％PEG)中4℃稀释复性72hr，之后以PEG 6000缓慢浓缩得到一定浓度的蛋白样品。
实施例7
hIL22及其突变体对LO2细胞的促增殖作用
LO2细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液培养至细胞至生长状态良好，收集细胞，以1×105个细胞/mL接种于96孔细胞培养板中，50μl/孔；再依次加入一定量的重组hIL22及其突变体蛋白溶液，每种蛋白的终浓度分别为0.1、1、2.5、10、50、100、1000、2000、4000和8000ng/ml，以无细胞的空白对照及有细胞但不加重组蛋白的阴性对照，在37℃、5％CO培养箱中培养72hr，之后采用MTT法测细胞密度。
采用Bradford法测得五种蛋白浓度分别为hIL22(57mg/L)，6M(105mg/L)，2NM(239mg/L)，2ND(98mg/L)，2DM(156mg/L)，将其分别稀释成所需浓度。
应用MTT法检测重组hIL22及其突变体蛋白对LO2细胞的增殖活性。结果(见图11)同标准品hIL22相比，6M，2NM，2ND重组蛋白对LO2细胞促增殖活性明显下降，而突变体2DM对LO2细胞促增殖活性要高于标准品hIL22蛋白，说明将可能的受体结合位点全部突变为丙氨酸后，突变体蛋白对LO2细胞的促增殖活性明显下降，这些结果说明了这一区段对人白介素22与其受体的结合乃至活性的维持至关重要。
序列表
SEQ NO：1
<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
<120>人白细胞介素-22突变体及其构建方法和应用
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>147
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Met Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser
20 25 30
Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe
35 40 45
His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu
50 55 60
Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln
65 70 75 80
Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg
85 90 95
Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn
100 105 110
Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu
115 120 125
Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn
130 135 140
Ala Cys Ile
145
SEQ NO：2
<210>2
<211>147
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>第67-72位点的六个氨基酸全部突变为丙氨酸(Ala)的突变体
<400>2
Met Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser
20 25 30
Leu Ala Met Met Met Met Met Met Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe
35 40 45
His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu
50 55 60
Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln
65 70 75 80
Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg
85 90 95
Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn
100 105 110
Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu
115 120 125
Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn
130 135 140
Ala Cys Ile
145
SEQ NO：3
<210>3
<211>147
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>第68和69位Asn变为Ala的突变体
<400>3
Met Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser
20 25 30
Leu Ala Asp Met Met Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe
35 40 45
His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu
50 55 60
Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln
65 70 75 80
Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg
85 90 95
Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn
100 105 110
Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu
115 120 125
Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn
130 135 140
Ala Cys Ile
145
SEQ NO：4
<210>4
<211>145
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>第68和69位Asn缺失的突变体
<400>4
Met Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser
20 25 30
Leu Ala Asp Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His Gly
35 40 45
Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn Phe
50 55 60
Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro Tyr
65 70 75 80
Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu Ser
85 90 95
Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val Gln
100 105 110
Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile Lys
115 120 125
Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala Cys
130 135 140
Ile
145
SEQ NO：5
<210>5
<211>147
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>第67和71位Asp变为Ala的突变体
<400>5
Met Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser
20 25 30
Leu Ala Met Asn Asn Thr Met Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe
35 40 45
His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu
50 55 60
Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln
65 70 75 80
Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg
85 90 95
Leu Ser Thr Cys HisIle Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn
100 105 110
Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu
115 120 125
Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn
130 135 140
Ala Cys Ile
145
Claims (5)
1.一种人白细胞介素-22突变体，其特征在于由SEQ NO：5所示的的氨基酸序列组成。
2.权利要求1所述的突变体在制备治疗肝病药物上的应用。
3.权利要求1所述的突变体的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)将人新鲜外周血液用含2mmol/L EDTA的PBS稀释2倍，然后铺于等体积淋巴细胞分离液上，在700～1000rpm条件下离心，吸出离心所产生的灰白层细胞，再用Hanks液洗涤灰白层细胞2～3次，并将灰白层细胞悬浮于1640培育基中，然后在37℃、5％CO2培养箱中培养24h；再向培养基中加入ConA；和anti-CD3共刺激细胞；然后在37℃、5％CO2培养箱中培养24h，用总RNA提取试剂盒提取总RNA；
(2)以总RNA为模板，以f1和r1为引物
f1：5′GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3′；
r1：5′ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3′
进行RT-PCR，扩增得到野生型hIL22；反应体系为：总RNA，5ul；RNase抑制剂，0.5ul；Oligo(dT)，0.5ul；DEPC处理水，6.5ul；总计12ul；70℃5min至4℃；RT：在上述体系加入：5×buffer，4ul；2.5mMdNTP，2ul；AMV，1ul；RNase抑制剂，1ul；42℃1h，85℃5min至4℃；
以反转录产生的第一链cDNA为模板，以f1和r1为引物进行PCR反应，所述的PCR反应体系如下：10PCR反应×buffer 2.0ul，2.0mmol/L dNTP 2.0ul，5pmol/ul f12.0ul，5pmol/ul r12.0ul，反转录产物4.0ul，TaqDNA聚合酶0.5ul，ddH2O 7.5ul，共20ul；PCR反应条件为94℃预变性3min；94℃30S，50℃30S，72℃30S，30个循环；72℃延伸7min；PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶分离；
(3)利用限制性内切酶EcoRI和BamHI将RT-PCR产物与质粒pBV220在37℃水浴中酶切3.5h；然后将两者按10～4∶1比例混合，加入T4连接酶，在16℃进行连接反应12h，再用电转化或CaCl2法将连接产物转化宿主细胞，利用氨苄青霉素抗性筛选重组克隆，提取相应质粒，酶切鉴定，测序，得重组质粒pBV220/hIL22；
(4)以重组质粒pBV220/hIL22为模板，进行重叠PCR扩增，其中重叠PCR方法所用的引物需要四种，第一对引物扩增含突变位点及其上游序列的DNA片段，正向引物含有野生型模板DNA的突变位点；反向引物含有野生型序列；第二对引物用来扩增含希望引入突变位点及其下游序列的DNA片段，反向引物含有希望引入模板的DNA的突变位点；正向引物含有野生型序列；得含有突变位点的hIL22的DNA序列；
(5)用电转化或CaCl2法将重组质粒转化宿主细胞；转化菌落30℃过夜活化，次日以1～2％体积百分比接种于LB培养基，在30℃培养2～3h；然后置于在42℃水浴摇床上、180～220rpm条件下培养4hr，再在4℃、12,000rpm条件下离心15min，去上清，将沉淀物以质量体积比1∶8～10重悬于PB溶液中，用超声波破碎菌体，用2mol/L尿素洗涤经超声处理后得到的包涵体2～4次，再用8mol/L尿素变性溶解包涵体；接着以Sephacryl-200为柱填料，对溶解上清进行凝胶过滤层析，将纯化产物置于复性缓冲液中，在4℃稀释复性72hr，然后以PEG 6000缓慢浓缩得人白细胞介素-22突变体。
4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(4)所述的引物是下述引物组：
第一对引物：
反向R2：5′GAGAATTCATATGGCACCCATCAGCTCCCA3′
正向FM：5′AGCTGTGTTGTTTGCAGCCAAGCTAGCCTCCTT3′
第二对引物：
反向RM：5′GCAAACAACACAGCTGTTCGTCTCATTGGGGAG3′
正向F2：5′ACGGATCCTCAAATGCAGGCATTTCT 3′。
5.按照权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于所述的宿主细胞是E.coli DH5αH、B101或JM109。
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