CN101705240B - 巴曲酶基因的合成及其表达产物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是有关采用DNA重组技术生产的一种源于巴西矛头蝮蛇毒液中的巴曲酶(Batroxobin)蛋白。该巴曲酶蛋白的编码基因，具有下述的核苷酸序列之一：1)序列表中序列3；2)序列表中序列4，具编码的巴曲酶氨基酸序列相对于天然的巴曲酶氨基酸序列，第41位的His和第178位的Ser突变为Glu。利用本发明优化后的发酵与纯化方法，以分泌表达的方式成功地表达出高生物活性的巴曲酶蛋白。重组表达的巴曲酶可以作为止血药的主要成份。

Description

巴曲酶基因的合成及其表达产物的制备方法

技术领域：

本发明是有关采用DNA重组技术生产的一种源于巴西矛头蝮蛇毒液中的巴曲酶(Batroxobin)蛋白，其关键是巴曲酶基因的合成、克隆、表达、定向改造以及产物的发酵表达与分离纯化。重组表达的巴曲酶可以作为止血药的主要成份。 

背景技术：

巴曲酶(Batroxobin)最先是由奥地利维也纳学者Von Klobusitzky于1936年从巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒中分离、精制而得。它是一种单链糖蛋白，由17种氨基酸组成，总氨基酸数为231个，分子量39000～43000。至今，研究者从蝮蛇属毒蛇的毒液中分离和纯化出二十多种类凝血酶活性的丝氨酸蛋白酶类成份。这些丝氨酸蛋白酶类物质特异切割哺乳动物血浆中的纤维蛋白原，使之降解生成纤维蛋白I单体，进而交联聚合成难溶性纤维蛋白，促进在出血部位的血栓形成和止血。 

在克氏分离出巴曲酶后，研究者对其的理化性质以及临床应用进行了深入的研究。巴曲酶使纤维蛋白原(Fg)在Aα链上的Arg16-Gly17键处降解，释出纤维蛋白肽A(FPA)而生成可溶性的纤维蛋白I单体(FIm)，在此酶的持续作用下，FIm在血管破损口处聚合成纤维蛋白I多聚体(FIp)，FIp能促进血管破损处的血小板聚集、加速血小板止血栓的形成，从而促进血管破损处的初期止血效应。FIp在正常血管内不会使血小板聚集，却易被纤溶酶降解成不凝的纤维蛋白降解产物(FDP)，FDP可迅速被体内单核巨噬细胞系统吞噬、代谢，因而巴曲酶的止血作用仅发生于血管破损的出血部位。瑞士素高公司开发的立芷雪(注册商品名Reptilase)，其主要成份为巴曲酶，经过数十年的研究和临床应用，证明该药具有很好的止血功效，适用于防治各种原因引起的出血，如外科手术出血，上消化道、肺、肾、癌肿、肝病出血，鼻出血，视网膜出血，妇科出血，新生儿出血等均可使用，疗效优于传统止血药。 

另外，在使用较大剂量的时候，巴曲酶通过降低血液中纤维蛋白原的浓度，改变血液流变学的降低血粘度、抑制红细胞聚集、抑制红细胞沉降、增强红细胞的血管通透性及变形能力，使血液流动性增强，防止血栓形成。由日本开发的巴曲酶(东菱克栓酶)，在临床降纤应用方面显示了较好的疗效。 

由深圳市健安医药公司总代理，瑞士素高公司生产的立芷雪(曾用名：立止血，注册商品名Reptilase)，该药为巴曲酶与少量凝血因子X激活物的混合物，其主要成份巴曲酶从巴西矛头蛇毒液中提取，1992年被批准进入我国，1995年以INN名“巴曲酶Batroxobin”列入我国基本药物名录第2版。 

国内巴曲酶产品主要有蓬莱诺康药业有限公司生产的“巴曲亭”(注射用血凝酶)，与“立芷雪”的结构和来源相同，于2001年上市销售。目前，“巴曲亭”市场份额已占据国内巴曲酶产 品的头把交椅。 

成熟的巴曲酶分子是由231个氨基酸残基组成的单链蛋白，理论计算出其分子量为25.5KD，等电点为7.39，国外从Bothrops atrox毒液中提取的巴曲酶，其实际分子量为42KD，这种分子量的偏差是由于糖基化修饰的缘故。巴曲酶蛋白质的一级结构中，有两个N-糖基化位点：Asn¹⁴⁶-Asn¹⁴⁷-Thr¹⁴⁸和Asn²²⁵-Lys²²⁶-Thr²²⁸。此外，巴曲酶分子中含有12个半胱氨酸，根据已知的丝氨酸蛋白酶类分子的研究结果，日本学者Itoh N等推测这12个半胱氨酸可能形成：Cys⁷-cys¹³⁹、Cys²⁶-Cys⁴²、Cys⁷⁴-Cys²³⁰、Cys¹¹⁸-Cys¹⁸⁴、Cys¹⁵⁰-Cys¹⁶⁸、Cys¹⁷⁴-Cys¹⁹⁹六个分子内二硫键。 

目前，已上市的巴曲酶产品均是从蛇毒液中提取，受到蝮蛇蛇毒液来源的限制，存在蛇毒病原微生物和神经毒剂污染的可能性，同时存在价格过高的缺点，因此我们设想采用基因工程的方法大量生产重组巴曲酶，以满足临床应用的需要，为患者减轻经济负担。 

从克氏分离出巴曲酶至今，研究者对其有了比较深入的了解，但对其生物学方面的研究进展缓慢。日本学者Itoh N等分别在1987和1988年完成了对巴曲酶(Batroxobin)cDNA和基因组DNA测序工作(Itoh N et al J Biol Chem.1987Mar 5；262(7)：3132-5；J Biol Chem.1988Jun5；263(16)：7628-31)。1991年，日本科学家Maeda等首次利用重组DNA技术，在大肠杆菌中以融合表达的方式，获得重组巴曲酶的包涵体形式(Maeda M et al.J Biochem.1991Apr；109(4)：632-7.)。上海万兴公司在对巴曲酶蛋白的实际研究中发现，无论采用融合(同GST，Trx或Nus融合)或是非融合表达(N端多一个蛋氨酸)巴曲酶蛋白，所得到的都是不溶性、无活性的包涵体，虽然表达量可以达到比较高的水平(约占菌体总蛋白的20-30％)。将表达载体转入Novagen公司新推出的适合表达多二硫键蛋白的宿主菌AD494和Origami中也无济于事。这种包涵体经变性-复性过程后，得到的可溶性蛋白并没有检测到任何活性(上海万兴生物制药公司，授权公开号：CN 100335622C)。 

2002年，杨青等报道长白山白眉蝮蛇类凝血酶Gussruobin和Gloshedobin在毕赤酵母中获得表达(杨青等.生物化学与生物物理学报.2002，34(1)：6-10)。2004年，You W K等人采用毕赤酵母表达B.atrox.moojuni来源的巴曲酶，具有与天然巴曲酶相同的生物学活性，纯化后产量达到6.95μg/ml(You W K et al.FEBS Lett.2004Jul 30；571(1-3)：67-73.)。2004年，上海万兴公司黄秀东等(授权公开号：CN 100335622C)采用毕赤酵母表达B.atrox.moojuni来源的巴曲酶，纯化后产量达到20KU/ml。2007年，李招发等采用毕赤酵母表达巴曲酶，产量可达10mg/L(李招发等.生物工程学报，2007；23(3)：483-486)。 

采用基因工程的手段来生产富含多对二硫键和糖基化修饰的蛋白一直是一个技术难题，尤其是生产像巴曲酶这种含有六对二硫键的丝氨酸蛋白酶类分子。这是因为二硫键错配率较高，在原核表达系统中得到的大多是包涵体形式，活性较低或几乎没有活性，不具备实际生产意义。真核表达系统(酵母、CHO细胞等)能保证较高的二硫键配对正确，对表达蛋白进行翻译后修饰，保证表达产物的生物活性。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种定向突变的巴曲酶与专用编码基因，它能够通过分泌表达的方式进行大量生产，且具有较高的生物学活性。 

包括以下几个步骤： 

(1)巴曲酶基因的合成：根据Genebank中公开的巴西矛头蝮蛇毒液中的巴曲酶的核酸序列(X12747)(序列表序列1，简称SEQ-1)和氨基酸序列(序列表序列2，简称SEQ-2)，选择毕赤酵母偏好的密码子，人工合成巴曲酶的基因序列3(序列表序列3，简称SEQ-3)；同时，将SEQ-3中编码的第41位的His和第178位的Ser突变为Glu，人工合成巴曲酶基因序列4(简称SEQ-4)，编码的氨基酸序列为序列表中序列5(简称SEQ-5)。 

(2)表达载体的构建：在巴曲酶基因序列SEQ-3和SEQ-4的5’端加入Xho I位点，在Xho I位点和巴曲酶基因序列间加入KEX2蛋白酶酶切位点Lys-Arg对应的密码子AAAAGA，确保巴曲酶蛋白分泌到发酵液中时能够切除α-信号肽，在3’端加入TGA终止密码子以及Xba I位点，将DNA片段和pPICZαA载体经Xho I与Xba I双酶切、电泳回收、连接，构建表达载体pPICZαA-bat(插入序列对应SEQ-3)和pPICZαA-bat-m(插入序列对应SEQ-4)。 

(3)巴曲酶表达菌株：用Sac I或BstX I线性化pPICZαA-bat和pPICZαA-bat-m，电转至X-33或GS115感受态中，根据Invitrogen手册进行单克隆的鉴定和高表达菌株的筛选。 

(4)巴曲酶工程菌的发酵：所述编码基因电转至毕赤酵母菌发酵表达的优选方法为：16L发酵罐体系中，30℃，pH4.0-6.0，在基础培养基中用葡萄糖代替甘油发酵16-18h后，按0.6ml/min流加20％甘油约100ml，饥饿0.5-1h，加入10g玉米蛋白粉或荞麦蛋白，按1ml/min加入含有1％体积PTM1的甲醇诱导90-96h；所述基础培养基为：葡萄糖45g/L，K₂SO₄17.5g/L，MgSO₄14g/L，KOH 3.2g/L，CaSO₄0.8g/L，PTM1 3ml/L。 

(5)巴曲酶蛋白的表达纯化：发酵上清经PALL CentramateTM超滤系统，膜包选择为5K，超滤系统进口压力、出口压力分别为：10psi、5psi，流速为180ml/min。对发酵上清液采用等体积超滤，即超滤至原来体积1/4-1/5时，补加0.1-0.3M NaCl缓冲液，pH5.0。预处理的巴曲酶上清液，先进行阳离子交换层析(Capto S)，再经过阴离子交换层析(Capto Q)，最后再进行凝胶过滤层析(Sephacryl S-100)制备出巴曲酶纯品。 

本发明选择毕赤酵母偏好密码子，人工合成了巴曲酶全长基因序列，将该基因构建到毕赤酵母表达载体pPICZαA上进行分泌表达，成功的表达出具有较高生物学活性的巴西矛头蝮 蛇巴曲酶。通过优化发酵过程中的一系列条件，如先期基础培养基中加入葡萄糖作为碳源，再补加甘油进行饥饿，同时加入一定量的玉米或荞麦蛋白，充当酶解底物，减少巴曲酶在发酵上清中的降解。通过优化纯化参数与选择最适的介质材料，纯化后巴曲酶产量达到18mg/ml，超过了其他已发表和报道的表达水平，适合规模化生产。突变后的基因表达量未见提高，但比活性由1800KU/mg上升到2700KU/mg，比活提高了50％。 

巴曲酶的三维结构模型未见报道，在丝氨酸蛋白酶属种研究者通过X晶体衍射得到了蛇毒纤溶酶原激活剂(TSV-PA)的三维结构，其功能与巴曲酶类似，一级结构与巴曲酶相似性达到75％。在对巴曲酶氨基酸序列进行突变改造的过程中，我们用蛋白质同源模建在线程序SWISS-MODEL和同源模建软件Modeller 9V6，以TSV-PA的X衍射结构作为巴曲酶的三维结构模型的模板，预测巴曲酶的三维结构。在巴曲酶同源建模所得三维结构的基础上，依据巴曲酶底物-纤维蛋白原的空间结构，寻找底物结合可能的活性口袋，用计算机模拟其与底物纤维蛋白原的对接，预测巴曲酶在催化反应过程的关键氨基酸残基为第41位的His和第178位的Ser，与Itoh N等报道一致(ItohN et al J Biol Chem.1987Mar 5；262(7)：3132-5)。酶的活性部位是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子相当小的一部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。活性部位通常在酶的表面空隙或裂缝处，形成促进底物结合的优越的非极性环境。在活性部位，底物被多重的弱的作用力结合(静电相互作用、氢键、范德华力、疏水相互作用)，将第41位的His和第178位的Ser突变为Glu，增强活性中心的负电势区域的负电势，进而增强巴曲酶与底物纤维蛋白原结合时的静电相互作用，提高巴曲酶与底物的亲和力，从而提高巴曲酶的酶活。 

附图说明

图1：巴曲酶基因重叠PCR-酶切合成示意图 

图2：基础培养基及部分条件优化前后，牛纤维蛋白原凝结速率(1/凝结所需时间)对比。 

图3：巴曲酶蛋白的SDS-PAGE电泳图 

M.蛋白Marker(Invitrogen)；1.转化的空载体诱导；2.转入巴曲酶基因阳性克隆诱导。 

具体实施方式：

一、重组巴曲酶表达载体pPICZαA-bat和pPICZαA-bat-m的构建 

1.重组巴曲酶基因的人工合成 

根据Genebank中公开的巴西矛头蝮蛇毒液中的巴曲酶的核酸序列(X12747)和氨基酸序列，选择毕赤酵母偏好的密码子，人工合成巴曲酶的全长基因序列(序列表中SEQ-3的核苷酸序列)，用蛋白质同源模建在线程序SWISS-MODEL和同源模建软件Modeller 9V6，以TSV-PA的X衍射结构作为巴曲酶的三维结构模型的模板，预测巴曲酶的三维结构。在巴曲酶同源建模所得三维结构的基础上，依据巴曲酶底物-纤维蛋白原的空间结构，寻找底物结合可能的活性口袋，用计算机模拟其与底物纤维蛋白原的对接，预测巴曲酶酶与催化反应过程的 关键氨基酸残基为第41位的His和第178位的Ser，并将二者突变为Glu，基因序列为SEQ-4。 

基因序列的全合成采用重叠PCR的方法。利用DNAMAN分析序列SEQ-3和SEQ-4的酶切位点，找到2个天然的酶切位点AclI(AA/CGTT)、DraIII(CACNNN/GTG)将其分割为3段，即BS1(254bp)、BS2(187bp)、BS3(287bp)。各大段再设计为数个60-68bp的寡核苷酸片段进行合成，每段寡核苷酸片段相互有18-20bp的重叠碱基。对BS1、BS2、BS3分别设计一对接头引物(引物两端分别带有上述的天然的酶切位点和保护碱基)。BS1与BS2用AclI酶切后连接，再用DraIII酶切与BS3连接得全长基因片段(见图1)。巴曲酶基因序列的5’端带有Xho I位点和KEX2蛋白酶酶切位点Lys-Arg对应的密码子AAAAGA，3’端引物加入TGA终止密码子以及Xba I位点。 

在巴曲酶基因序列SEQ-3和SEQ-4的5’端添加限制性内切酶Xho I位点，在Xho I位点和巴曲酶基因序列间加入KEX2蛋白酶酶切位点Lys-Arg对应的密码子AAAAGA，确保巴曲酶蛋白分泌到发酵液中时能够切除α-信号肽，同时使工程菌表达的巴曲酶具有同蛇毒中提取的巴曲酶蛋白具有一样的N-端氨基酸序列。在3’端加入TGA终止密码子以及Xba I位点，将DNA片段和pPICZαA载体经Xho I与Xba I双酶切、电泳回收、连接，构建表达载体pPICZαA-bat和pPICZαA-bat-m。优化的重组巴曲酶序列与Genebank Accession Number为X12747和其他合成的巴曲酶基因核苷酸序列均超过10％的差异。 

将表达载体pPICZαA-bat和pPICZαA-bat-m分别转化至大肠杆菌TOP10F’中，在含有25ng/μl的LLB平板上进行培养约16h，挑取单菌落，在含有25ng/μl的LLB液体培养基中培养，利用5’AOX1与3’AOX1引物进行PCR鉴定，再提取质粒，经Xho I与Xba I双酶切出含有目的基因大小的片段，鉴定单菌落中为阳性克隆，测序结果与目的基因序列一致。 

二、毕赤酵母GS115 Stab或X-33生产重组巴曲酶 

1.pPICZαA-bat和pPICZαA-bat-m高表达菌株的筛选 

将pPICZαA-bat和pPICZαA-bat-m用Sac I或BstX I线性化，按照Invitrogen公司EasySelect Pichia Expression Kit中的方法制备酵母宿主菌感受态，并电转至毕赤酵母宿主菌GS115 Stab或者X-33中，涂布于含有100ng/μl Zeocin抗生素的YPDS平板上，30℃下放置3-4天长出单菌落。挑选大而饱满的单菌落，用5’AOX1与3’AOX1引物进行PCR鉴定。20μlPCR反应体系为：5’AOX1(10μM)与3’AOX1(10μM)引物各0.5μl，dNTP(各2.5Mm)2μl，10*Taq buffer 2μl，Taq DNA polymerase(2.5U/μl)0.5μl，ddH2O 14.5μl。PCR反应程序为：95℃，8min；95℃、1min，55℃、1min，72℃、1min，30个循环；72℃10min。根据Invitrogen手册中，pPICZαA等载体整合到酵母基因组的原理，如果pPICZαA-bat和pPICZαA-bat-m插入到野生型GS115 Stab或者X-33自身醇氧化酶基因5’AOX1或3’AOX1中，会形成Mut+，即甲醇利用正常表型；如果pPICZαA-bat和pPICZαA-bat-m替代野生型GS115 Stab或者X-33自身醇氧化酶基因，会形成Muts，即甲醇利用慢表型。2200bp 条带为野生型GS115 Stab或者X-33自身醇氧化酶基因的PCR产物，1300bp左右条带为插入的载体的PCR产物，即Mut+有2200bp和1300bp左右的条带，Muts仅有1300bp左右的条带。 

对单克隆菌株进行蛋白表达酶活鉴定，是筛选高表达菌株最直接有效地方式。将PCR验证含有pPICZαA-bat或pPICZαA-bat-m的阳性克隆菌株分别在BMGY(1％Yeast extract，2％peptone，100mM potassium phosphate，pH 6.0，1.34％YNB，4x 10-5％biotin，4x 10-5％biotin)30℃过夜培养，接种至含有50ml BMMY培养基的500ml锥形瓶中，OD600约为1-1.2，30℃培养，每隔24小时，补加0.75％体积的甲醇诱导90小时。巴曲酶上清的测活，参照从蛇毒液中提取的巴曲酶的测活方法，用加入了抗凝剂枸橼酸钠的人标准血浆对发酵上清中表达出的酶活性(表达量)进行定性。因为巴曲酶的作用底物为纤维蛋白原，可以用0.4％的牛纤维蛋白原(Tris-HCl pH7.4，0.15M NaCl)进行巴曲酶活性(表达量)的相对定量。具体方法为：37℃下，将100μl发酵上清加入到300μl含0.4％的牛纤维蛋白原(Tris-HCl pH7.4，0.15MNaCl)溶液中，混匀后，观察凝结所需要的时间。分别筛选了500个pPICZαA-bat或pPICZαA-bat-m，巴曲酶活性(表达量)分别为5mins-25mins，3mins-20mins。 

2.巴曲酶的发酵生产 

因巴曲酶一级结构中有多个碱性蛋白聚集区，毕赤酵母分泌的重组巴曲酶在发酵液上清中易发生降解。我们通过优化了发酵基础培养基的成份，前期以葡萄糖代替甘油，使菌株快速生长约16-18h，再用甘油进行饥饿1h，以及在发酵过程中添加一些蛋白胨如玉米和荞麦蛋白，但不局限于这些蛋白，充当酶解底物，减少巴曲酶蛋白的降解。同时，在流加甲醇的过程中补加1％体积PTM1的甲醇诱导。与未优化条件前相比，巴曲酶的产量有了较明显的上升。 

具体方法为：以筛选到的含有pPICZαA-bat-m酶活为3mins的阳性克隆为例，上16L发酵罐进行发酵。种子液接种量为6％-10％，转接至装有10L基础培养基(葡萄糖45g/L，K₂SO₄17.5g/L，MgSO₄14g/L，KOH 3.2g/L，CaSO₄0.8g/L，PTM1 3ml/L)的16L发酵罐中，30℃，pH为5.0，发酵16-18h，待溶氧从接近0％上升到70-80％，按2ml/min加入20％甘油约100ml，饥饿30-60mins，流加含1％体积PTM1的甲醇1ml/min诱导培养96h，中间加入约10g玉米蛋白粉或荞麦蛋白，充当酶解底物，每隔12h取发酵液测湿重和发酵上清，用0.4％的牛纤维蛋白原(Tris-HCl pH7.4，0.15M NaCl)进行巴曲酶活性(表达量)的相对定量。具体方法为，37℃下，将100μl发酵上清加入到300μl含0.4％的牛纤维蛋白原(Tris-HCl pH7.4，0.15M NaCl)溶液中，混匀后，观察凝结所需要的时间。 

计算牛纤维蛋白原凝结速率(1/凝结所需时间)，实验结果如图2所示：基础培养基中更换碳源，补加甘油进行饥饿，流加甲醇的过程中补加1％体积PTM1的甲醇诱导，以及在发酵过程中添加一些蛋白胨如玉米和荞麦蛋白，在这种优化条件下牛纤维蛋白原凝结速率最高。PTM1微量元素的流加使酵母的代谢较为旺盛，表达的巴曲酶在量和活性方面均有所提高， 同时，补加的蛋白胨充当了酶解底物，减少了巴曲酶蛋白的降解。以筛选到的含有pPICZαA-bat-m酶活为3mins的阳性克隆为例，上16L发酵罐进行发酵。种子液接种量为6％-10％，转接至装有10L基础培养基(葡萄糖40g/L，K2SO4 18g/L，MgSO4 15g/L，KOH4.13g/L，CaSO4 0.9g/L，PTM1 30ml)的16L发酵罐中，30℃，pH为5.0，发酵16-18h，待溶氧从接近0％上升到70-80％，按2ml/min加入20％甘油约100ml，饥饿30-60mins，流加含1％体积PTM1的甲醇1ml/min诱导培养96h，中间加入约10g玉米蛋白粉或荞麦蛋白，OD600约为400，按所述方法测得的酶活(表达量)为20secs。 

三、巴曲酶的纯化与活性鉴定 

OD600约为400发酵上清经PALL CentramateTM超滤系统，膜包选择为5K，超滤系统进口压力、出口压力分别为：10psi、5psi，流速为180ml/min。对发酵上清液采用等体积超滤，即超滤至原来体积1/4-1/5时，补加0.1-0.3M Nacl缓冲液，pH5.0。预处理的巴曲酶上清液，先经过10mM PBS(pH5.0)平衡过的阳离子交换层析(Capto S)，用含0.5-1.0M的NaCl 10mMPBS(pH5.0)梯度洗脱，收集蛋白峰。将上步收集到的活性峰稀释调节为50mM的Tris-HCl缓冲，pH为9.0，再上经过50mM的Tris-HCl(pH9.0)缓冲平衡过的阴离子交换层析(CaptoQ)，采用Tris-HCl pH9.0-4.0梯度洗脱的方式，最后使目的蛋白在10mMTris-HCl pH 4.5缓冲液中，收集活性峰，最后再进行凝胶过滤层析(Sephacryl S-100)，脱盐，收集活性峰，得到的纯度达98％以上。结果表明重组巴曲酶的产量达到18mg/L。冻干，-70℃保存。巴曲酶蛋白的SDS-PAGE电泳图见图3：M.蛋白Marker(Invitrogen)；1.转化的空载体诱导；2.转入巴曲酶基因阳性克隆诱导。 

用含抗凝剂枸橼酸钠的人标准血浆进行巴曲酶活性检测，具体方法为：37℃下，将100μl的发酵上清加入到300μl的含抗凝剂枸橼酸钠的人标准血浆中，混匀后，观察凝结所需的时间与相同条件下巴曲酶标准品相比较。1克氏单位(KU，1个克氏单位指在37℃的试管内，使1ml标准人血浆在60±20秒内凝固的立止血数量)＝0.04NIH凝血酶单位＝1/4巴曲酶单位(BU)＝0.3国际单位(IU)的凝血酶。1巴曲酶单位(BU)＝0.17NIH凝血酶单位(NIH Unit，1NIH凝血酶单位定为：在28±1.0℃条件下，15±0.5秒内凝结1ml人标准纤维蛋白原溶液的凝血酶量)。 

用牛纤维蛋白原进行巴曲酶活性的检测，具体方法为，37℃下，将100μl发酵上清加入到300μl含0.4％的牛纤维蛋白原(Tris-HCl pH7.4，0.15M NaCl)溶液中，混匀后，观察凝结所需要的时间。 

用盐酸苯酰-L-精氨酰-P-硝基苯胺(L-BAPA)进行巴曲酶定性检测，具体方法为：取发酵上清液0.2ml，加人盐酸苯酰-L-精氨酰-P-硝基苯胺(L-BAPA)溶液0.2ml，37℃加热30分钟，溶液呈黄色。 

四、氨基酸突变对巴曲酶活性的影响 

重组巴曲酶表达载体pPICZαA-bat和pPICZαA-bat-m的构建见具体实施一，区别在于pPICZαA-bat插入的目的基因序列编码的第41位的为His和第178位的为Ser，pPICZαA-bat-m插入的目的基因序列编码的第41位第178位均为Glu。两者具体的发酵生产、纯化与活性鉴定均见具体实施方式。 

采用从蛇毒中提取巴曲酶活性检测方法进行重组巴曲酶体外凝血试验，具体实验方法为：称取巴曲酶标准品(英国国家生物制品检定所，NIBSC)、未突变氨基酸的基因工程巴曲酶(rBat)、突变氨基酸的基因工程巴曲酶(rBat-m)各0.1mg，溶于20ml水中，37℃下，将100μl上述配制的巴曲酶溶液加入到300μl的含抗凝剂枸橼酸钠的人标准血浆中，每种巴曲酶溶液测定3管，混匀后，于1min后观察凝结所需的时间，每种巴曲酶溶液的3管初凝时间误差应小于20秒。若初凝时间小于40秒，则适当稀释发酵液上清，减少因凝结快速而带来的误差过高，与相同条件下巴曲酶标准品相比较。 

结果见表1： 

表1巴曲酶体外凝血活性测定结果 

结果表明，突变氨基酸的基因工程巴曲酶(rBat-m)比未突变氨基酸的基因工程巴曲酶(rBat)活性提高了约50％。 

序列表 

<210>1 

<211>693 

<212>DNA 

<213>天然序列 

<400>1 

gtcattggag gtgatgaatg tgacataaat gaacatcctt tccttgcatt catgtactac     60 

tctccccggt atttctgtgg tatgactttg atcaaccagg aatgggtgct gaccgctgca    120 

cactgtaaca gaagatttat gcgcatacac cttggtaaac atgccggaag tgtagcaaat    180 

tatgatgagg tggtaagata cccaaaggag aagttcattt gtcccaataa gaaaaaaaat    240 

gtcataacgg acaaggacat tatgttgatc aggctggaca gacctgtcaa aaacagtgaa    300 

cacatcgcgc ctctcagctt gccttccaac cctcccagtg tgggctcagt ttgccgtatt    360 

atgggatggg gcgcaatcac aacttctgaa gacacttatc ccgatgtccc tcattgtgct    420 

aacattaacc tgttcaataa tacggtgtgt cgtgaagctt acaatgggtt gccggcgaaa    480 

acattgtgtg caggtgtcct gcaaggaggc atagatacat gtgggggtga ctctggggga    540 

cccctcatct gtaatggaca attccagggc attttatctt ggggaagtga tccctgtgcc    600 

gaaccgcgta agcctgcctt ctacaccaag gtctttgatt atcttccctg gatccagagc    660 

attattgcag gaaataaaac tgcgacttgc ccg                                 693 

<210>2 

<211>231 

<212>PRT 

<213>天然序列 

<400>2 

Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asp Ile Asn Glu His Pro Phe Leu Ala 

1               5                   10                  15 

Phe Met Tyr Tyr Ser Pro Arg Tyr Phe Cys Gly Met Thr Leu Ile Asn 

            20                  25                  30 

Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asn Arg Arg Phe Met Arg 

        35                  40                  45 

Ile His Leu Gly Lys His Ala Gly Ser Val Ala Asn Tyr Asp Glu Val 

    50                  55                  60 

Val Arg Tyr Pro Lys Glu Lys Phe Ile Cys Pro Asn Lys Lys Lys Asn 

65                  70                  75                  80 

Val Ile Thr Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asp Arg Pro Val 

                85                  90                  95 

Lys Asn Ser Glu His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro 

            100                 105                 110 

Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Ala Ile Thr Thr 

        115                 120                 125 

Ser Glu Asp Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Leu 

    130                 135                 140 

Phe Asn Asn Thr Val Cys Arg Glu Ala Tyr Asn Gly Leu Pro Ala Lys 

145                 150                 155                 160 

Thr Leu Cys Ala Gly Val Leu Gln Gly Gly Ile Asp Thr Cys Gly Gly 

                165                 170                 175 

Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu 

            180                 185                 190 

Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys Pro Ala Phe Tyr 

        195                 200                 205 

Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ala Gly 

    210                 215                 220 

Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro 

225                 230 

<210>3 

<211>693 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>3 

gttattggtg gtgatgagtg tgacattaat gagcatcctt ttttggcttt catgtactac     60 

tctccaagat acttctgtgg tatgactttg attaaccaag aatgggtttt gactgctgct    120 

cattgtaaca gaagatttat gagaattcac ttgggtaaac atgctggttc tgttgctaac    180 

tacgatgagg ttgttagata cccaaaggag aagtttattt gtccaaacaa gaaaaagaac    240 

gttattactg ataaggacat tatgttgatt agattggata gaccagttaa aaactctgag    300 

catattgctc cattgtcttt gccttctaac ccaccttctg ttggttctgt ttgtagaatt    360 

atgggatggg gtgctattac tacttctgag gatacttacc ctgatgttcc acattgtgct    420 

aacattaact tgtttaacaa cactgtttgt agagaggctt acaacggttt gccagctaaa    480 

actttgtgtg ctggtgtttt gcaaggtgga attgatactt gtggtggtga ttctggaggt    540 

ccattgattt gtaatggtca atttcaaggt attttgtctt ggggttctga tccttgtgct    600 

gaacctagaa agccagcttt ttacactaag gtttttgatt acttgccatg gatccaatct    660 

attattgctg gtaacaagac tgctacttgt cca                                 693 

<210>4 

<211>693 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>4 

gttattggtg gtgatgagtg tgacattaat gagcatcctt ttttggcttt catgtactac     60 

tctccaagat acttctgtgg tatgactttg attaaccaag aatgggtttt gactgctgct    120 

gaatgtaaca gaagatttat gagaattcac ttgggtaaac atgctggttc tgttgctaac    180 

tacgatgagg ttgttagata cccaaaggag aagtttattt gtccaaacaa gaaaaagaac    240 

gttattactg ataaggacat tatgttgatt agattggata gaccagttaa aaactctgag    300 

catattgctc cattgtcttt gccttctaac ccaccttctg ttggttctgt ttgtagaatt    360 

atgggatggg gtgctattac tacttctgag gatacttacc ctgatgttcc acattgtgct    420 

aacattaact tgtttaacaa cactgtttgt agagaggctt acaacggttt gccagctaaa    480 

actttgtgtg ctggtgtttt gcaaggtgga attgatactt gtggtggtga tgaaggaggt    540 

ccattgattt gtaatggtca atttcaaggt attttgtctt ggggttctga tccttgtgct    600 

gaacctagaa agccagcttt ttacactaag gtttttgatt acttgccatg gatccaatct    660 

attattgctg gtaacaagac tgctacttgt cca                                 693 

<210>5 

<211>231 

<212>PRT 

<213>人工序列 

<400>5 

Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asp Ile Asn Glu His Pro Phe Leu Ala 

1               5                   10                  15 

Phe Met Tyr Tyr Ser Pro Arg Tyr Phe Cys Gly Met Thr Leu Ile Asn 

            20                  25                  30 

Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala Glu Cys Asn Arg Arg Phe Met Arg 

        35                  40                  45 

Ile His Leu Gly Lys His Ala Gly Ser Val Ala Asn Tyr Asp Glu Val 

    50                  55                  60 

Val Arg Tyr Pro Lys Glu Lys Phe Ile Cys Pro Asn Lys Lys Lys Asn 

65                  70                  75                  80 

Val Ile Thr Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asp Arg Pro Val 

                85                  90                  95 

Lys Asn Ser Glu His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro 

            100                 105                 110 

Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Ala Ile Thr Thr 

        115                 120                 125 

Ser Glu Asp Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Leu 

    130                 135                 140 

Phe Asn Asn Thr Val Cys Arg Glu Ala Tyr Asn Gly Leu Pro Ala Lys 

145                 150                 155                 160 

Thr Leu Cys Ala Gly Val Leu Gln Gly Gly Ile Asp Thr Cys Gly Gly 

                165                 170                 175 

Asp Glu Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu 

            180                 185                 190 

Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys Pro Ala Phe Tyr 

        195                 200                 205 

Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ala Gly 

    210                 215                 220 

Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro 

225                 230 

Claims (4)

1.一种制备巴曲酶的专用基因，其序列为序列表中序列3。

2.一种制备巴曲酶的专用基因，其序列为序列表中序列4。

3.权利要求1或2所述的基因在构建表达菌株中的应用，其特征在于：构建表达载体时在5’端加入Xho I位点，在Xho I位点和巴曲酶基因序列间加入KEX2蛋白酶酶切位点Lys-Arg，对应的密码子为AAAAGA，在3’端加入TGA终止密码子以及Xba I位点，将DNA片段和pPICZαA载体经Xho I与Xba I双酶切、电泳回收、连接、电转至宿主菌，所述宿主菌为毕赤酵母。

4.一种发酵制备巴曲酶的方法，其特征在于：将权利要求1或2所述编码基因按照权利要求3所述应用方法电转至毕赤酵母菌中并发酵表达，发酵表达方法为：16L发酵罐体系中，30℃，pH4.0-6.0，在基础培养基中用葡萄糖代替甘油发酵16-18h后，按0.6ml/min流加20％甘油约100ml，饥饿0.5-1h，加入10g玉米蛋白粉或荞麦蛋白，按1ml/min加入含有1％体积PTM1的甲醇诱导90-96h；所述基础培养基为：葡萄糖45g/L，K₂SO₄ 17.5g/L，MgSO₄ 14g/L，KOH 3.2g/L，CaSO₄ 0.8g/L，PTM1 3ml/L。

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