KR101901150B1

KR101901150B1 - 재조합 배트록소빈 혼합 조성물 및 이를 포함하는 지혈 분말 또는 지혈 패드

Info

Publication number: KR101901150B1
Application number: KR1020160170753A
Authority: KR
Inventors: 김종탁; 서문영; 김진우; 강상우; 우용제; 고은혜
Original assignee: 주식회사 앤씨비아이티
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2016-12-14
Publication date: 2018-09-27
Also published as: CN108738322A; US20180265857A1; CN108738322B; KR20170070842A; US10920210B2; WO2017105094A1

Abstract

본 발명은 신규한 재조합 배트록소빈 혼합물 및 이를 포함하는 지혈용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 지혈용 조성물은 재출혈을 억제하여 지혈 효과가 뛰어나고, 고체 형태로 제조되더라도 활성을 유지하는바 국소 지혈제로 적용되어 쉽게 이용 가능한 이점이 있다.

Description

재조합 배트록소빈 혼합 조성물 및 이를 포함하는 지혈 분말 또는 지혈 패드{A Composition Containing Mixture of Recombinant Batroxobins and Hemostatic Powder or Pad Comprising The Same}

본 발명은 산성 조건에서도 지혈 활성을 유지하는 재조합 배트록소빈 혼합 조성물 및 이를 포함하는 지혈패드에 관한 것이다.

뱀독이 사람을 포함한 포유류의 혈액 응고계 및 혈전 용해계에 미치는 영향은 오래 전부터 많이 연구되어 왔으며, 다수의 유효 성분들이 분리되고 그 활성이 규명되었다. 뱀독을 구성하는 여러 가지 성분들은 피브린 응고(fibrin clotting) 또는 혈소판 응집 등에 직간접적으로 영향을 주어 응고 촉진제(pro-coagulant)로서 혹은 항응고제(anticoagulant)로서의 기능들을 가지고 있음이 알려져 있다(Meaume, J. Toxicon, 4:2558(1966); Matsui et al., Biochim . Biophys . Acta ., 1477: 146-156(2000)). 이들 중 일부 성분들은 혈전증의 진단 및 치료에 광범위하게 사용되고 있다. 그 중 피브리노-펩타이드를 절단하여 피르리노겐을 피브린으로 전환시키는 트롬빈 유사 효소(thrombin-like enzyme)들이 현재까지 20여종 이상 보고 되었고 일부는 cDNA 서열까지 규명되었다.

트롬빈 유사 효소의 작용은 포유류 본래의 혈액 응고 단백질인 트롬빈과 달리 초기에는 피브리노겐 분자의 피브리노펩타이드 A를 가수분해하여 des-A-피브린이라는 불안정한 피브린 응괴(fibrin clot)를 형성하지만, 시간이 지나면서 이 불안정한 피브린 응괴는 생체내의 혈전용해계(fibrinolysis system)가 작동되면서 빠르게 분해되어 결과적으로 혈중의 피브리노겐 농도를 감소시킨다(Pirkle, H., and Stocker, K. Thromb. Haemost. 65:444-450(1991); Marsh, N.A., Blood Coagul. Fibrinolysis, 5:339-410(1994)).

실제 임상에서는 이러한 양면적인 효소 특성을 이용하여 지혈제로도 사용하기도하고 혈전의 예방 및 치료제로도 응용하고 있다. 또한, 이 효소는 혈액 내의 다른 응고 인자 등에는 영향을 주지 않을 뿐만 아니라 혈소판의 활성화에도 영향을 미치지 않는 장점이 있어, 수술 1-2 시간 전에 소량(2 NIH unit/60 kg)을 근육 및 정맥 주사하면 효과적인 지혈 활성을 나타낸다. 반면에 효소의 투여량과 투여 시간을 조절함에 따라 혈중 내 피브리노겐 농도를 혈전 용해 효소를 사용할 때 생길 수 있는 출혈과 같은 부작용이 없이 낮출 수 있고, 이과정에서 형성된 des-A-피브린과 FDP(fibrinogen degradation products)의 방출로 혈관 내피 세포를 자극하여 플라스미노겐 활성자의 생성을 유도하며, 트롬빈의 활성을 억제하여 혈전증의 예방과 치료에도 사용되고 있다(Schumacher et al., Thromb. Res. 81:187-194(1996); 및 Bell W. R. Jr., Drugs, 54:18-30(1997)).

최근에는 이러한 트롬빈 유사 효소의 피브리노겐 감소 효과를 이용하여 헤파린 투여로 발생하는 헤파린 유도성 혈소판감소증(heparin-induced thrombocytopenia)이나 급성 허혈성 뇌졸중(acute ischemic stroke)의 치료(Dempfle et al. Blood, 96, 2793 2802, 2000)에도 효과적이라는 보고가 있다.

임상에 실제로 사용되고 있는 트롬빈 유사 효소들은 모두 뱀독에서 분리 정제한 천연형의 단백질들로서 가장 대표적인 것이 중남미 독사인 Bothrops atrox moojeni의 독으로부터 분리한 배트록소빈이다. 스위스 Pentapharm 사에서 독점 판매하고 있으며, reptilase(지혈용), defibrase(혈전 용해용), reptilase-reagent (진단 시약용) 등의 상품명으로도 시판되고 있다. 또한 중남미 독사인 Bothrops jararaca의 독에서 정제한 botropase(지혈용, 이탈리아 Ravizza 사), Malayan pit viper와 Calloselasma rhodostoma의 독에서 분리한 ancrod(미국 Knoll Pharmacetical 사) 등도 판매되고 있다.

또한 최근에는 수술시의 출혈방지 및 봉합목적의 자가 피브린 접합제(autologous fibrin sealant)에 배트록소빈을 이용한 Vivostat System(덴마크, Vivosolution사) 등이 각광을 받고 있다.

하지만 천연형 배트록소빈은 살아있는 뱀독으로부터 추출, 정제하므로 기존 뱀독에 있는 다른 독 성분의 오염을 제거하기 어렵고, 수요에 따른 공급이 쉽지 않은 단점이 있다. 또한, 외부환경에 의하여 뱀독성분의 변화가 심하여 정제 표준화가 어렵다.

이와 같이 뱀으로부터 정제 추출되는 천연형 배트록소빈은 대량생산의 한계로 많은 연구진들에 의해 재조합 단백질 생산방법이 연구되어 왔다. 대장균과 같은 미생물에서 진핵생물 유래의 단백질을 발현할 경우, 진핵생물 유래 유전자의 전사 후 번역과정 중에 원핵세포인 대장균의 번역효율이 낮은 유전자 코돈으로 인해 단백질 발현이 낮은 현상이 발생하는데, 이를 해결하기 위하여 대장균에서 낮은 빈도의 아미노산 코드를 인식할 수 있는 외래 진핵생물의 tRNA 유전자를 갖는 재조합 대장균 균주를 이용하여 단백질의 번역을 향상시키는 방법 등이 상용화 되어 있다. 그럼에도 불구하고 대장균에서 발현 시에 단백질의 리폴딩 과정에서 비활성의 단백질로 만들어지는 현상이 나타낸다(참조: Yang et al., Biotechnol. Lett., 25:101-104(2003); Fanetal., Biochem. Mol. Biol. Int. 47:217-225(1999); Maeda et al., J. Biochem., 109:632-637(1991)). 이에 본 발명자들은 발현 수율이 높고, 천연형 효소 보다 활성이 우수한 재조합 배트록소빈을 제조하는 방법을 개발하였으며, 이는 WO2009/084841에 상세히 기재되어 있다.

그러나 현재까지 보고된 바로는 지혈 패드에 적용하여 우수한 활성을 나타내거나, 재출혈(rebleeding) 감소 효과를 나타내는 재조합 배트록소빈 혼합 조성물을 분리한 예는 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 재조합 배트록소빈을 국소 출혈에도 쉽게 적용가능하도록 하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명의 재조합 배트록소빈 혼합물이 산성 조건에서도 활성이 유지되고, 지혈 패드에 적용한 경우에도 우수한 활성을 나타내며, 재출혈(rebleeding)을 억제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 재조합 배트록소빈 혼합 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 재조합 배트록소빈 혼합 조성물을 포함하는 지혈용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 일반식 1로 표시되는 당쇄화(glycosylation)된 재조합 배트록소빈을 적어도 2종 이상 포함하는 재조합 배트록소빈 혼합 조성물을 제공한다:

[일반식 1]

M_a-G_b-B,

상기 일반식 1에 있어서, 상기 M은 만노오스, 상기 G는 N-아세틸글루코사민, 상기 B는 재조합 배트록소빈을 나타내고, 상기 a는 11 내지 13의 정수, 상기 b는 1 내지 3의 정수를 나타내며, 상기 M_a는 직쇄 또는 분지쇄형 만노오스 올리고머이고, 상기 G_b는 단일 N-아세틸글루코사민 또는 직쇄형 N-아세틸글루코사민 올리고머이며, 상기 M_a 및 G_b는 결합되어 글리코실화 구조체(glycosylation structure)를 형성하고, 상기 글리코실화 구조체는 상기 재조합 배트록소빈에 결합되어 있음.

본 발명자들은 배트록소빈을 국소 출혈에도 쉽게 적용가능하도록 하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명의 배트록소빈 혼합 조성물이 산성 조건에서도 활성이 유지되고, 지혈 패드에 적용한 경우에도 우수한 활성을 나타내며, 재출혈(rebleeding)을 억제할 수 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 배트록소빈"은 천연형 배트록소빈의 cDNA 서열을 변형시켜 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)에서 제조한 배트록소빈을 의미하며, 이의 제조방법은 공개특허 WO2009/084841에 상세히 개시되어 있으며, 상기 공개특허 문헌은 본 발명에 참조로서 삽입된다.

본 명세서 상의 일반식 1에 포함된 용어 "M_a"는 상술한 바와 같이 a가 11 내지 13 중 어느 하나의 정수인 "직쇄 또는 분지쇄형 만노오스 올리고머"를 의미하며, 상기 "만노오스 올리고머"는 비교적 짧은 만노오스 체인으로서, 본 발명에서는 상술한 바와 같이 11 내지 13개의 만노오스로 이루어진 만노오스 체인을 의미한다. 본 발명의 만노오스 올리고머는 "직쇄 또는 분지쇄형"으로 결합을 형성할 수 있으며, 직쇄형 만노오스 올리고머의 경우, 말단 만노오스를 제외한 모든 만노오스는 인접한 만노오스들과 2개의 결합을 형성하고, 분지쇄형 만노오스 올리고머의 경우, 가지를 형성하는 위치의 만노오스는 3개의 만노오스와 결합을 형성한다. 본 명세서 상의 용어 "G_b"는 상술한 바와 같이 b가 1인 단일 N-아세틸글루코사민 또는 b가 2 또는 3인 직쇄형 N-아세틸글루코사민 올리고머를 의미한다. Ma 및 Gb는 결합, 보다 구체적으로 공유 결합을 형성하고, 이는 "M_a-G_b"와 같이 표시되며, 본 명세서 상에서 "글리코실화 구조체(glycosylation structure)"로 기재된다. 본 발명의 글리코실화 구조체는 말단 N-아세틸글루코사민을 통해 본 발명의 재조합 배트록소빈과 결합되어 일반식 1로 표시되는 "당쇄화된 재조합 배트록소빈"을 형성한다. 본 발명의 재조합 배트록소빈 혼합 조성물은 서로 다른 글리코실화 구조체를 포함하는 2종 이상의 재조합 배트록소빈을 포함하는 특징이 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 b는 2이다. 2개의 N-아세틸글루코사민이 결합되어 이량체를 형성하고, 하나의 N-아세틸글루코사민은 만노오스 올리고머와 결합을 형성하고, 다른 하나의 N-아세틸글루코사민은 재조합 배트록소빈과 결합을 형성한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 재조합 배트록소빈은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 2종 이상의 재조합 배트록소빈은 각각 상이한 a 값을 갖는다. 본 발명의 일 구현예에서의 재조합 배트록소빈 혼합 조성물은 상이한 개수의 만노오스를 포함하는 글리코실화 구조체를 포함하는 재조합 배트록소빈을 함께 포함하는 특징이 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 재조합 배트록소빈 혼합물은 a 값이 각각 11, 12 또는 13인 3종의 재조합 배트록소빈을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서 "a 값이 각각 11, 12 또는 13인 3종의 재조합 배트록소빈을 포함한다"는 것의 의미는 a 값이 각각 11, 12 또는 13인 3종의 재조합 배트록소빈을 필수적으로 포함한다는 것을 의미할 뿐, 10개 이하 또는 14개 이상의 만노오스를 포함하는 글리코실화 구조체가 결합되어 있는 재조합 배트록소빈이 포함될 가능성을 배제하는 것을 의미하지는 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 글리코실화 구조체는 서열목록 제1서열의 146번째 및 225번째 아미노산 잔기의 N-말단에 결합된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 재조합 배트록소빈 혼합물에 포함된 재조합 배트록소빈 분자들의 평균 분자량이 28-31 kDa이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면 상술한 평균 분자량은 29.5-29.6 kDa이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 a가 11인 경우, 본 발명의 글리코실화 구조체(glycosylation structure)는 하기 일반식 2로 표시되는 구조를 갖는다:

[일반식 2]

본 발명의 일반식 2에 있어서, 본 발명의 M은 만노오스이고, 본 발명의 G는 N-아세틸글루코사민이다. 본 명세서 전반에 걸쳐 만노오스 간 결합을 나타내기 위해 사용된 기호 "{"는, 기호 "{"를 중심으로 좌측에 위치한 단일 만노오스 또는 만노오스 올리고머가 기호"{"의 우측에 위치한 글리코실화 구조체의 말단 만노오스 중 어느 하나에 제한없이 결합함을 나타내는 의미로 사용된다. 본 일 구현예에서 사용된 용어 "말단 만노오스"는 본 발명의 만노오스 올리고머의 본쇄(main chain) 또는 가지쇄(branched chain)의 말단에 위치하여, 인접한 다른 만노오스와 하나의 결합만을 형성하는, 기호 "{"의 우측에 위치한 만노오스 들 중 어느 하나를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 a가 12인 경우, 본 발명의 글리코실화 구조체(glycosylation structure)는 하기 일반식 3, 4 또는 5로 표시되는 구조를 갖는다:

[일반식 3]

[일반식 4]

[일반식 5]

본 발명의 일반식 3 내지 5에 있어서, 본 발명의 M은 만노오스이고, 본 발명의 G는 N-아세틸글루코사민이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 a가 13인 경우, 본 발명의 글리코실화 구조체(glycosylation structure)는 하기 일반식 6, 7 또는 8로 표시되는 구조를 갖는다:

[일반식 6]

[일반식 7]

[일반식 8]

본 발명의 일반식 6 내지 8에 있어서, 본 발명의 M은 만노오스이고, 본 발명의 G는 N-아세틸글루코사민이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 배트록소빈 혼합물은 (a) 14개의 만노오스 및 2개의 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 글리코실화 구조를 갖는 재조합 배트록소빈; (b) 15개의 만노오스 및 2개의 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 글리코실화 구조를 갖는 재조합 배트록소빈; 및 (c) 16개의 만노오스 및 2개의 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 글리코실화 구조를 갖는 재조합 배트록소빈으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 재조합 배트록소빈을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 다른 양태인 재조합 배트록소빈 혼합 조성물을 포함하는 지혈용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 지혈용 조성물은 재조합 배트록소빈 혼합물을 0.5-20 BU 포함한다. 본 명세서의 용어 "BU"는 배트록소빈 단위(Batroxobin unit)을 의미하며, 2 BU는 혈장을 19 ± 0.2 초에 굳히는 양을 의미한다. BU는 천연형 배트록소빈(NIBSC)의 역가 스탠다드 그래프를 통하여 역가 계산이 가능하다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 지혈용 조성물은 재조합 배트록소빈 혼합물을 0.5-15, 0.5-12, 0.5-10, 0.5-6, 0.5-7, 0.5-5.5, 0.5-5, 0.8-20, 0.8-15, 0.8-12, 0.8-10, 0.8-6, 0.8-7, 0.8-5.5, 0.8-5, 1-20, 1-15, 1-12, 1-10, 1-6, 1-7, 1-5.5, 1-5, 2-20, 2-15, 2-12, 2-10, 2-6, 2-7, 2-5.5, 2-5, 2.5-20, 2.5-15, 2.5-12, 2.5-10, 2.5-6, 2.5-7, 2.5-5.5, 2.5-5, 3-20, 3-15, 3-12, 3-10, 3-6, 3-7, 3-5.5, 3-5, 4-20, 4-15, 4-12, 4-10, 4-6, 4-7, 4-5.5, 4-5, 4.5-20, 4.5-15, 4.5-12, 4.5-10, 4.5-6, 4.5-7, 4.5-5.5, 4.5-5 BU 포함한다. 본 발명의 재조합 배트록소빈 혼합물을 포함하는 지혈용 조성물의 부피는 500-600, 500-550 또는 530 μl이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 지혈용 조성물은 생체적합성 중합체를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 생체적합성 중합체 농도는 0.5-5 mg/ml이다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 중합체 농도는 0.5-3, 0.5-2, 0.5-1.5, 0.5-1.2, 0.5-1, 0.8-3, 0.8-2, 0.8-1.5, 0.8-1.2 또는 1 mg/ml이다. 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 중합체는 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 알부민, 헤모글로빈, 피브리노겐, 피브린, 카제인, 피브로넥틴, 엘라스틴, 케라틴 및 라미닌 및 그의 유도체 및 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 중합체는 콜라겐, 키토산 또는 이의 조합이다. 본 발명의 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 중합체는 키토산이다.

하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 재조합 배트록소빈 혼합물 및 생체적합성 중합체(예컨대, 키토산, 콜라겐 또는 이의 조합)가 포함되어 있는 지혈 패드는 생체적합성 중합체만이 포함되어 있는 패드와 비교하여 혈전 형성능이 높아 혈액 응고 효과가 현저히 높다(도 2a 및 2b).

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 지혈용 조성물은 재출혈(rebleeding)을 억제한다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 재조합 배트록소빈 혼합물 및 생체적합성 중합체(예컨대, 키토산, 콜라겐 또는 이의 조합)가 포함되어 있는 지혈 패드는 생체적합성 중합체만이 포함되어 있는 패드와 비교하여 총 출혈양을 감소시키고, 재출혈 시점을 늦추며, 재출혈양을 현저하게 감소시키는바 재출혈을 억제한다(도 3 및 도 4).

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 지혈용 조성물은 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 유화액, 산제, 분말제, 과립제, 스펀지, 패드, 패치 또는 필름 형태가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 지혈용 조성물은 겔, 현탁액 또는 용액의 동결건조에 의하여 제조될 수 있는데, 상기 겔, 현탁액 또는 용액은 본 발명의 생체적합성 중합체를 산성 용매(예컨대, 아세트산 용액)에 용해시켜 제조해야 한다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이 본원발명의 재조합 배트록소빈 혼합물이 pH 3.0 및 pH 5.0에서 활성이 거의 유지되는 반면, 천연형 배트록소빈은 상기 조건에서 활성이 저하되는바, 지혈용 조성물을 고체 형태로 제조하는 경우 본 발명의 지혈용 조성물만이 활성을 유지할 수 있게 된다. 본 발명의 어떠한 구현예에 있어서, 본 발명의 지혈용 조성물은 지혈용 패드(pad)이다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 다른 일양태인 재조합 배트록소빈을 산성 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 재조합 배트록소빈 지혈용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 산성 용액의 pH는 1-6이다. 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 산성 용액의 pH는 1-5.5, 1-5, 2-6, 2-5.5, 2-5, 2.5-6, 2.5-5.5, 2.5-5, 3-6, 3-5.5, 3-5, 3.5-6, 3.5-5.5, 3.5-5, 4-6, 4-5.5, 4-5, 4.5-6, 4.5-5.5, 4.5-5 또는 5이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 산성 용액은 생체적합성 중합체를 포함한다.

본 발명의 지혈용 조성물 제조방법은 상술한 지혈용 조성물과 재조합 배트록소빈 및 생체적합성 중합체 등을 공통으로 하기 때문에, 상기 지혈용 조성물과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 재조합 배트록소빈 혼합 조성물, 이를 포함하는 지혈용 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다.

(b) 본 발명의 지혈용 조성물은 재출혈을 억제하여 지혈 효과가 뛰어나고, 고체 형태로 제조되더라도 활성을 유지하는바 국소 지혈제로 적용되어 쉽게 이용 가능한 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 재조합 배트록소빈의 구조 및 구조 분석 결과를 나타낸다. 도 1a는 MALDI-TOF MS 분석 결과, 도 1b 두 번째 도는 LCMS 분석 결과, 도 1b 첫 번째 및 세 번째 도는 IEF 분석 결과를 나타낸다. GT(Glycosylation target): 글리코실화 타겟; CBB(coomassie blue staining): 쿠마시 블루 염색; Zgram(zymogram): 자이모그램, rBat의 활성을 보여줌; WB(Western blot): 웨스턴 블롯.
도 2a는 재조합 배트록소빈과 천연형 배트록소빈의 혈전 형성 효과 비교 실험(whole blood clot assay) 결과를 나타낸다. 각각의 실험군에 대한 혈전 형성 %비율 측정 결과를 나타내었다.
조 2b는 재조합 배트록소빈과 천연형 배트록소빈의 혈전 형성 효과 비교 실험(Fibrinogen assay) 결과를 나타낸다. 각각의 실험군에 대한 혈전 형성에 따른 405 nm에서의 흡광도 측정 결과를 나타내었다.
도 3a는 콜라겐, 키토산, 재조합 배트록소빈 혼합 조성물의 단독 또는 조합 사용에 따른 혈전 형성 상태를 나타낸다.
도 3b는 콜라겐, 키토산, 재조합 배트록소빈 혼합 조성물의 단독 또는 조합 사용에 따른 혈전 형성의 %비율에 관한 그래프를 나타낸다.
도 4a는 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 시간에 따른 지혈 효과 실험 과정을 나타낸다.
도 4b는 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 콜라겐 단독 사용시의 지혈 효과 및 재출혈 측정 결과를 나타낸다. 실험 결과는 시간 경과에 따른 출혈량에 대한 그래프로 나타내었다.
도 4c는 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 콜라겐과 재조합 배트록소빈 혼합 조성물 3 BU의 조합 사용시의 지혈 효과 및 재출혈 측정 결과를 나타낸다. 실험 결과는 시간 경과에 따른 출혈량에 대한 그래프로 나타내었다.
도 4d는 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 콜라겐과 재조합 배트록소빈 혼합 조성물 5 BU 조합 사용시의 지혈 효과 및 재출혈 측정 결과를 나타낸다. 실험 결과는 시간 경과에 따른 출혈량에 대한 그래프로 나타내었다.
도 4e는 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 키토산 단독 사용시의 지혈 효과 및 재출혈 측정 결과를 나타낸다. 실험 결과는 시간 경과에 따른 출혈량에 대한 그래프로 나타내었다.
도 4f는 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 키토산과 재조합 배트록소빈 혼합 조성물 3 BU 조합 사용시의 지혈 효과 및 재출혈 측정 결과를 나타낸다. 실험 결과는 시간 경과에 따른 출혈량에 대한 그래프로 나타내었다.
도 4g는 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 키토산과 재조합 배트록소빈 혼합 조성물 5 BU 조합 사용시의 지혈 효과 및 재출혈 측정 결과를 나타낸다. 실험 결과는 시간 경과에 따른 출혈량에 대한 그래프로 나타내었다.
도 4h는 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 콜라겐과 키토산의 조합 사용시의 지혈 효과 및 재출혈 측정 결과를 나타낸다. 실험 결과는 시간 경과에 따른 출혈량에 대한 그래프로 나타내었다.
도 4i는 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 콜라겐, 키토산 및 재조합 배트록소빈 혼합 조성물 3 BU 조합 사용시의 지혈 효과 및 재출혈 측정 결과를 나타낸다. 실험 결과는 시간 경과에 따른 출혈량에 대한 그래프로 나타내었다.
도 4j는 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 콜라겐, 키토산 및 재조합 배트록소빈 혼합 조성물 5 BU 조합 사용시의 지혈 효과 및 재출혈 측정 결과를 나타낸다. 실험 결과는 시간 경과에 따른 출혈량에 대한 그래프로 나타내었다.
도 5a는 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 총 출혈량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5b는 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 초기 출혈량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5c는 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 재출혈량을 측정한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 재조합 배트록소빈 발현벡터 구축

본 발명에서 이용한 재조합 배트록소빈은 단백질 번역 효율을 증대시키기 위하여 천연형 배트록소빈 cDNA(서열목록 제3서열)에서 변이유발(mutagenesis)을 실시한 배트록소빈으로, 코돈 염기서열은 서열목록 제1서열(BatSMX)에 기재하였다. 상세한 변이유발 방식은 국제공개특허 WO 2009/084841에 개시되어 있다. 또한, 상기 재조합 배트록소빈을 발현시켜 세포배양액으로 분비시키는 효율을 증가시키기 위하여 피키아 패스토리스의 발현 벡터인 pPIC9의 사카로마이세스-유래 α-인자 분비 리더 유전자 코돈을 대체하여 피키아 패스토리스 최적화된 합성 분비 리더 유전자 코돈(SMF)을 합성하였으며, 이의 염기서열은 서열목록 제5서열에 기재하였다.

상기 SMF의 C-말단에 원하는 재조합 단백질을 융합시킬 수 있도록 상기 SMF를 pUC118HincII/BAP(Takara Bio Inc., 일본)의 멀티클로닝 위치에 삽입하고 이를 pSMF라 명명하였다. 이는 기존에 상용화 되어 있는 천연형의 α-인자 분비 리더 서열의 C-말단부의 클로닝 부위로 이용되는 XhoI(CTC GAG) 서열이 코딩하는 Leu 코돈이 특히 전사효율이 낮은 코돈(ctc)인 것을 해소하기 위하여, Val80-Ser81-Leu82-Glu83의 염기서열인 GTA-TCT-CTC-GAG를 GTT-TCT-TTG-GAA로 바꾸면서 배트록소빈 N-말단과 중첩이 되는 C-말단 프라이머인 SMF-R(5' -TAACTCTTTTTTCCAAAGAAACACCTTCTTCCTTTGCTGC-3')과 재조합 SMF 유전자 카세트의 N-말단에 BamHI 서열을 만들 수 있는 SMF-F(5'-GGATCCAAACGATGAGATTTCCAT-3')를 이용하여 SMF를 주형으로 PCR을 수행하였다.

다음 BatSMX의 N-말단 코딩 염기서열들을 앞서 SMF의 C-말단에 변형된 코돈과 일치하는 중첩서열(아미노산 서열: L E K R / V I G G D E 해당)에 해당하는 프라이머들을 설계하였다. BatSMX의 N-말단 연장 프라이머는 SMX-F(5'-CTTTGGAAAAAAGAGTTATTGGTGGTGATGAA-3')를, C-말단은 SMX-R(5'-GCGGCCGCTTATGGACAAGT-3')을 이용하여 BatSMX를 주형으로 PCR 반응을 수행하였다.

이로서 얻어진 SMF와 배트록소빈 유전자의 PCR 산물을 섞은 후, SMF 변형에 이용된 N-말단 프라이머들과 배트록소빈 변형에 이용된 C-말단 프라이머들을 각각 섞어 assembly PCR을 수행하고, 이를 pTOP Blunt vector(엔지노믹스, 대한민국)에 클로닝하여 SMF유전자의 α-인자 분비 리더 서열과 배트록소빈 유전자의 코돈이 최적화된 유전자 카세트인 SMFBatSMX를 완성하였다. 이들 유전자를 BamHI-NotI 제한 효소 처리한 후 BamHI-NotI 절편(970bp)을 회수하고 피키아 발현벡터 pPIC9에 서브클로닝하여 발현벡터인 pSMFBatSMX을 구축하였다.

실시예 2. 재조합 배트록소빈 분리

피키아 패스토리스(Pichia pastoris, GS115, Invitrogen) 균주에 엘렉트로포레이터(Electroporator, Bio-Rad Gene Pulser, U.S.A.)를 사용하여 1.5 kV의 전압조건 하에 형질전환을 수행한 다음, 히스티딘 결손 YNB(yeast nitrogen base) 고체배지에서 선별하였다. 이를 통해 얻어진 단일 콜로니를 BMG(Buffered Minimal Glycerol)액상 배지(100 mM 소듐 포스페이트 pH 6.0, 효모 질소 베이스 1.34％,바이오틴 4 x 10-5％, 글라이세롤 1％) 1 L에 접종한 다음, 30℃에서 진탕 배양을 실시한 다음, 세포밀도가 600 nm 에서 약 1.0 흡광도에 도달하는 시점에서 최종 0.1%의 메틸알코올을 약 24시간 간격으로 첨가하여 AOX1(Alcohol Oxidase 1) 프로모터에 의한 재조합 단백질 발현을 유도 배양하였다. 상기 배양물을 5000 x g에서 원심분리하여 배양액을 수득하고, 이를 2.5 M 암모늄 설페이트 용액으로 평형화시킨 페닐-세파로스(Phenyl-sepharose, GE Healthcare, USA)가 충진된 컬럼(1.3 x 20 cm)에 주입한 다음, 2.5-0 M의 암모늄 설페이트 용액농도 선형구배를 0.5 ml/min의 유속으로 용출시켜 재조합 배트록소빈 효소활성 분획을 수득함으로써 재조합 배트록소빈을 분리하였다.

실시예 3. 분리한 재조합 배트록소빈 혼합물의 구조 분석

3-1. MALDI-TOF MS를 이용한 재조합 배트록소빈의 글리코실화 패턴 분석

TCA 침전을 위하여 50 ㎍ 재조합 배트록소빈에 50% TCA 용액을 넣어 최종 배트록소빈 농도를 10%로 만들고 얼음에서 30분 보관하였다. 이후, 4℃, 12000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 후, 단백질 침전물을 제외한 나머지 용액을 모두 제거하였다. 500 ㎕ 차가운 아세톤 용액을 넣고 약 3분간 볼텍싱한 후, 4℃, 12000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 이후, 단백질 침전물을 제외한 나머지 용액을 제거 후 상온에서 완전히 건조하였다. 이후, 10 ㎕ 5 M Urea 용액을 단백질 침전물에 넣고 흔들면서 상온에서 10분 동안 보관한 후, 40 ㎕ 0.1 M ABC 완충액을 넣고 섞어 MALDI-TOF MS 분석을 위한 시료를 제조하였다.

TCA 침전법에 의하여 제조한 시료에 2 IU PNGase-F를 넣고 37 ℃에서 16시간 보관한 후, PGC 컬럼에 상기 시료를 로딩한 후 40% ACN/0.05% TFA 완충액으로 300 ㎕ 용출하였다. 용출된 용액은 SpeedVac(BioTron, 대한민국)으로 건조한 후, 건조된 시료를 10 ㎕의 증류수에 녹였다. 이후, DOWEX-50W(Sigma, 미국) 이온 교환 수지를 첨가하여 1시간 동안 볼택싱한 후, DOWEX-50W 이온 교환 수지를 제거한 뒤 SpeedVac으로 건조하였다. 건조된 시료에 10 ㎕ DMSO(DimethylSulfoxide)와 10 ㎕ 아이오딘화 메틸(methyl iodide)을 첨가하여 상온에서 12시간 보관한 후, SpeedVac으로 건조하였다. 그 다음, 30 ㎕ GT 용액(1 mg/mL의 1% 아세트산/99% 메탄올[v/v]) 넣고 상온에서 4시간 보관하고, SpeedVac으로 건조하였다. 이후, 건조된 시료를 2 ㎕ 2,5-DHB 용액(30 ㎎/mL의 70% 아세토니트릴/ 30% 물[v/v])과 섞고, 상기 혼합액 1 ㎕를 스탠리스 스틸 MALDI 플레이트에 올려서 실온에서 건조시키고 MALDI-TOF로 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 재조합 배트록소빈은 3개의 주요 글리코실화 패턴을 보이고, 추가적으로 마이너한 3개의 글리코실화 패턴을 보임을 확인하였다(도 1a). 당쇄 결합에 사용되는 당은 주로 만노오스이며, 각각의 패턴은 만노오스의 추가 결합에 의해서 결정됨을 확인하였고, N-아세틸글루코사민도 사용됨을 확인하였다.

3-2. LC-MS를 이용한 질량 분석

실시예 3-1과 같이 TCA 침천 처리하여 LCMS 분석을 위한 시료를 제조하였다.

상기 시료 10 ㎕를 LCMS 분석 장비에 주입하여 역상(reversephase) LC/ESIMS를 이용하여 분석하였다. 전체 분석시간은 40분이었다.

재조합 배트록소빈 단백질은 ZORBAX 300SBC18(1×150 ㎜, 3.5 ㎛, Agilent, 미국) 상에서 분리하였다. 이때, 이동상 용매 A[0.2 %(v/v) 포름산(FA: formic acid) 수용액]와 이동상 용매 B[100% 아세토니트릴(ACN)/0.2 %(v/v) 포름산 수용액]를 35 ㎕/min 유속으로 사용하여 분리하였다. HPLC에서 분리된 단백질은 QTOF MS의 ESI source에 연결시켜 단백질 이온들의 질량값을 측정하였다.

그 결과, 재조합 배트록소빈은 평균적으로 29.548 kDa의 질량을 가지고 있으며, 당제거 후에는 약 25.5 kDa의 질량을 가지고 있음을 확인하였다.

3-3. IEF(isoelectric focusing)를 이용한 분석

실시예 2에서 분리한 재조합 배트록소빈 시료를 IEF 시료 완충액(2×, 고마, 대한민국)에 넣고 잘 섞었다. IEF Cathode 완충액(10×, 고마, 대한민국)은 1:9의 비율로 탈 이온수에 희석시킨 후 IEF 상위챔버에 넣고, IEF Anode 완충액(50×, 고마, 대한민국)은 1:49의 비율로 탈 이온수에 희석시킨 후 IEF 하위챔버에 부었다. 상기 IEF 시료 완충액과 섞은 시료 2 ㎍를 IEF Cathode 완충액이 채워진 웰에 로딩하였다. 시료를 이동시키고, 이후 젤을 카세트(cassette)에서 제거하고 고정액(12% TCA)에서 30분간 고정시켰다. 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)를 이용하여 IEF 젤을 염색한 후, 탈색 용액(Destain solution)을 이용하여 IEF를 탈색하였다.

그 결과, 재조합 배트록소빈은 pI 7.8 이상에서 3개의 밴드(도 1a의 주요 글리코실화 패턴에 대한 밴드)와 pI 7.4 근처에서 옅은 1개의 밴드(도 1b의 마이너한 글리코실화 패턴에 대한 밴드)를 가지고 있음을 확인하였다(도 1b). 천연형 배트록소빈의 pI는 약 6.6이며, 하나의 밴드만을 가지는 것과 차이가 있다.

실시예 4. 분리한 재조합 배트록소빈 혼합물의 pH에 따른 활성 분석

트롬빈 기질인 S-2238(Biophen, 미국)을 구입하여 10 mM 농도로 녹였다. 배트록소빈 활성 측정 시, 최종 농도를 0.1 mM로 측정하였고 희석을 위해 50 mM Tris-cl, pH 7.5를 첨가하였다.

분석용 시료는 재조합 배트록소빈 및 천연형 배트록소빈(NIBSC, 영국)을 각각 10 BU/ml 농도로 만들어서 pH 별(pH 3, 5, 7 및 9) 완충액과 희석하여 5.0 BU/ml 농도로 만들었다.

5.0 BU/ml 로 만든 시료는 각각 분류하여 4℃, 37℃에 보관 후 96웰 플레이트에 표준 시료와 측정 시료를 20 μl씩 넣고 50 mM Tris-cl, pH 7.5를 첨가한 트롬빈 기질을 180 ul 씩 넣은 후, ELISA를 사용하여 37℃에서 20분간 405 nm에서 흡광도 측정하였다.

	인큐베이션 시간	24 시간
	온도	4℃		37℃
	배트록소빈	rBat	nBat	rBat	nBat
완충액	KPi pH 3.0	83.1	41.4	80.7	40.2
	Glycine pH 3.0	80.7	40.2	80.7	39.0
	KPi pH 5.0	95.1	80.8	95.1	72.4
	Acetic acid pH 5.0	104.7	74.8	104.7	72.4
	NaPi pH 7.0	104.7	96.3	99.9	95.2
	Tris pH 7.0	102.3	105.9	97.5	92.8
	Glycine pH 9.0	97.5	86.8	95.1	82.0
	Tris pH 9.0	90.3	77.2	90.3	62.9

실시예 5. 배트록소빈이 포함된 지혈 패드 제작

소에서 추출한 아텔로 콜라겐 파이버(Sigma, 미국) 5 mg과 새우껍질에서 추출한 키토산 파우더(Sigma, 미국) 5 mg을 각각 0.5 M 아세트산 용액 500 μl에 4℃에서 약 24시간 동안 녹였다. 1 %(w/v) 콜라겐(콜라겐 5 mg/0.5 M 아세트산 용액 500 μl), 1 %(w/v) 키토산(키토산 5 mg/0.5 M 아세트산 용액 500 μl), 그리고 1 %(w/v) 콜라겐(콜라겐 2.5 mg/0.5 M 아세트산 용액 250 μl)과 1 %(w/v) 키토산(키토산 2.5 mg/0.5 M 아세트산 용액 250 μl)에 배트록소빈을 포함하는 군은 23시간 째에 실시예 1에서 분리한 재조합 배트록소빈 용액을 1, 2, 3 및 5 BU 농도로 추가하여 녹였다. 각 용액은 녹이는 과정에서 생긴 거품을 제거하기 위하여 3000 rpm, 4℃에서 10분 간 원심분리하는 가스 제거(degassing) 과정을 거쳤다. 이후, 깨끗하게 남은 용액은 저온을 유지하기 위해 아이스팩 위에서 24웰 플레이트에 500 μL씩 넣어 준 후 -80℃ 급속 냉동고에서 48시간 동안 얼렸다. 이 때, 바닥 면을 편평하게 유지하여 용액이 한쪽으로 쏠리지 않게 한다. 얼려진 용액은 -50℃ 동결건조기(Freeze dryer ALPHA 1-2 LD plus, CHRIST, 독일) 에서 48시간 동안 동결건조시켜 패드(직경 15 mm, 두께 3 mm의 원형 패드)를 제조하였다.

제조된 패드는 하기 표 2과 같다.

	콜라겐 패드	키토산 패드	콜라겐 및 키토산 패드
비교군	1% 콜라겐	1% 키토산	1% 콜라겐+1% 키토산
실험군 1	1% 콜라겐 +1 BU 배트록소빈	1% 키토산 +1 BU 배트록소빈	1% 콜라겐+1% 키토산 +1 BU 배트록소빈
실험군 2	1% 콜라겐 +2 BU 배트록소빈	1% 키토산 +2 BU 배트록소빈	1% 콜라겐+1% 키토산 +2 BU 배트록소빈
실험군 3	1% 콜라겐 +3 BU 배트록소빈	1% 키토산 +3 BU 배트록소빈	1% 콜라겐+1% 키토산 +3 BU 배트록소빈
실험군 4	1% 콜라겐 +5 BU 배트록소빈	1% 키토산 +5 BU 배트록소빈	1% 콜라겐+1% 키토산 +5 BU 배트록소빈

실시예 6. 천연형과 재조합 배트록소빈이 포함된 지혈 패드의 비교

천연형 배트록소빈과 재조합 배트록소빈을 각각 3BU를 포함하고, 키토산을 1% 포함한 지혈 패드를 제작한 후 효력을 비교하였다. 제조한 지혈패드는 모든 군에서 1%의 키토산을 포함하며, 아무것도 처리하지 않은 군을 대조군으로 하여 천연형 배트록소빈과 재조합 배트록소빈을 각각 3 BU 포함한 군을 실험군으로 하였다. 실험결과는 혈전 형성 시험과 패드 피브린 형성 시험으로 나타내었다.

약 350 g 랫트(Sprague-Dawley(SD) rat, 오리엔탈바이오, 대한민국)를 조레틸(zoletil, Boehringer Ingelheim Agrovent, 덴마크) 30 mg/kg과 럼푼(Rompun, Bayer, 캐나다) 10 mg/kg을 이용하여 마취한 후, 복강 절개하여 복부대정맥에서 0.109 M 구연산나트륨이 들어 있는 주사기를 이용하여 혈액을 1:4(구연산나트륨:랫트 혈액) 비율로 채취하였다.

제작된 패드에 400 μL의 혈액을 추가한 후 37℃ 인큐베이터에서 교반하며 10분 간 반응시켰다. 이 후 응고가 되지 않은 혈액을 녹여 내기 위하여 PBS(Phosphate buffer saline, Wellgene, 대한민국)를 400 μL 추가 한 후, Drabkin's 시약을 이용하여 헤모글로빈 농도를 측정하기 위해, 분광광도계(Spectramax microplate reader, Molecular devices, 미국)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 2a).

제작된 패드에 pH 7.5인 20 mM Tris-HCl 버퍼를 넣어주고 37℃ 인큐베이터에서 교반하며 10분 간 반응시켰다. 패드에서 유리된 배트록소빈을 미리 준비한 10 mg/ml 피브리노겐을 함유한 따듯하게 데워진 0.9% saline 버퍼에 넣어준 후 37℃ 인큐베이터에서 교반하며 10분 간 반응시켰다. 실험 결과를 얻기위해, 분광광도계를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 2b).

실시예 7. 지혈 패드의 혈전 형성 분석

약 350 g 랫트(Sprague-Dawley(SD) rat, 오리엔탈바이오, 대한민국)를 조레틸(zoletil, Boehringer Ingelheim Agrovent, 덴마크) 30 mg/kg과 럼푼(Rompun, Bayer, 캐나다) 10 mg/kg을 이용하여 마취한 후, 복강 절개하여 복부대정맥에서 0.109 M 구연산나트륨이 들어 있는 주사기를 이용하여 혈액을 1:4(구연산나트륨:랫트 혈액) 비율로 채취하였다. 제작된 패드에 400 μL의 혈액을 추가한 후 37℃ 인큐베이터에서 교반하며 10분 간 반응시켰다. 이 후 응고가 되지 않은 혈액을 녹여 내기 위하여 PBS(Phosphate buffer saline, Wellgene, 대한민국)를 400 μL 추가 한 후 Drabkin's 시약을 이용하여 헤모글로빈 농도를 분광광도계(Spectramax microplate reader, Molecular devices, 미국)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

지혈패드는 아무것도 처리하지 않은 군을 대조군으로 하여 1% 콜라겐 군, 1% 키토산 군, 1% 콜라겐+1% 키토산 군을 3개의 비교군으로 두고, 실험군으로 1% 콜라겐에 각각 배트록소빈이 1, 2 및 3 BU 포함된 군, 1% 키토산에 각각 배트록소빈이 1, 2 및 3 BU 포함된 군, 1% 콜라겐+1% 키토산에 각각 배트록소빈이 1, 2 및 3 BU 포함된 군까지 대조군 제외 총 12군으로 진행하였다.

먼저 육안으로 혈액 응고 정도를 관찰하였을 때, 아무것도 처리하지 않은 군에 비하여 모든 군에서 혈액 응고 정도가 높아졌음을 확인할 수 있었다. 웰 플레이트를 15° 정도 기울여서 혈전 형성 정도를 육안으로 관찰하였을 때 비교군에서는 혈액량의 절반 정도가 응고된 것으로 보여졌다. 그리고 각각의 비교군에서 배트록소빈의 농도가 1 BU에서 3 BU까지 높아짐에 따라서 혈액 응고 형성 정도가 훨씬 높아진다는 것을 알 수 있었다. 특히 3 BU의 배트록소빈이 함유된 콜라겐, 3 BU의 배트록소빈이 함유된 키토산, 2 및 3 BU의 배트록소빈이 함유된 콜라겐+키토산의 7개의 군에서 혈액이 거의 완전히 굳어져 흐르지 않을 뿐만 아니라 색에서도 혈전이 어둡게 덩어리 진 상태로 굳어져 있음을 육안으로도 확인할 수 있었다(도 3a).

그리고 응고되지 않은 혈액이 많을수록 혈액 내 헤모글로빈 농도가 높게 측정됨을 바탕으로 혈액 내에 들어 있는 헤모글로빈 농도를 Drabkin's 시약을 통해 측정하고 그것을 역으로 계산한 후 %(퍼센트)로 전환하여 혈전 형성 정도를 평가하였다. 그 결과를 그래프를 통해서 확인해보면, 콜라겐 군은 약 50%, 키토산 군은 약 60%, 콜라겐+키토산 군은 약 65%정도의 혈전이 형성됨을 알 수 있었다. 각각의 비교군들은 배트록소빈의 농도가 높아짐에 따라서 혈전 형성 정도가 높아지는데, 이 때 배트록소빈이 2 BU가 포함 된 군들에서 혈전의 형성 정도가 약 90% 이상으로 월등하게 높아지고 3 BU가 포함된 군 들에서는 거의 100% 혈전이 형성되었음을 확인할 수 있었다(도 3b).

이 실험에서의 결과들을 통해서 콜라겐 또는 키토산 만으로 이루어진 지혈 패드와 비교하였을 때, 각각에 배트록소빈을 포함함으로써 좀 더 빠르게 혈전을 형성하고 피를 멎게 할 수 있음을 확인할 수 있었고, 실시예 5에 의할 때 배트록소빈 3 BU 만으로도 충분하게 지혈 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 8: 대퇴골 동맥 창상 모델에서의 지혈 효과

약 200-250 g의 랫트(Sprague-Dawley(SD) rat)를 조레틸 30 mg/kg과 럼푼 10 mg/kg을 이용하여 마취한 후, 스티로폼 보드에 랫트의 사지를 고정시킨 후 약 45° 기울였다. 그리고 왼쪽 넓적다리 부분을 절개하고 근막을 잘라낸 후 대퇴골 동맥을 노출시켰다. 이후, 수술용 칼을 이용하여 혈관을 절개하고 지혈패드를 상처 부위에 직접 대고 그 바로 아래 흐르는 피를 필터 페이퍼(Whatman, diameter 4.25 mm)를 10초 간격으로 대어 바로 그 무게를 측정하였다. 이 때 피가 묻어 있는 필터 페이퍼에서 필터 페이퍼만의 무게를 뺀 것으로 출혈량을 측정하였고, 필터 페이퍼에 피가 더 이상 묻어나지 않는 시점을 지혈이 이루어졌다고 판단하고 그 시간을 확인하였다(도 4a).

지혈패드는 아무것도 처리하지 않은 군을 대조군으로 하여 1% 콜라겐 군, 1% 키토산 군, 1% 콜라겐+1% 키토산군을 3개의 비교군으로 두고, 1% 콜라겐에 각각 배트록소빈이 3, 5 BU 포함된 군, 1% 키토산에 각각 배트록소빈이 3 및 5 BU 포함된 군, 1% 콜라겐+1% 키토산에 각각 배트록소빈이 3 및 5 BU 포함된 군까지 대조군 제외 총 9군으로 진행하였다.

그 결과, 출혈시간을 측정한 그래프에서 모든 군에서 초기 지혈이 일어난 후 다시 재출혈(rebleeding)이 일어났음을 확인할 수 있었다. 초기 지혈이 일어난 시점은 비교군들에 비해서 배트록소빈의 농도가 높아짐에 따라서 약 30초 정도 지혈시점이 짧아짐을 알 수 있었고 이 때 아무것도 처리하지 않은 군에 비해서 모든 군에서 초기 30초 내의 출혈량이 절반 가까이 줄어듦을 확인할 수 있었다. 이는 모든 실험군에서 약 50% 정도로 거의 비슷한 비율로 줄어듦을 알 수 있는데, 그 중에서도 콜라겐, 키토산, 콜라겐+키토산에 5 BU의 배트록소빈이 포함된 군들에서 가장 적은 양의 초기 출혈을 보였다. 그리고 재출혈이 일어나는 시점 또한 배트록소빈의 농도가 0에서 3 및 5 BU로 높아 짐에 따라서 그 시점이 평균적으로 3분정도 더 늦어짐을 알 수 있었고 재출혈이 일어나는 시간 또한 월등하게 짧아졌음을 그래프를 통해서 확인할 수 있었다(도 4b 내지 도 4j).

출혈량은 총 출혈량, 초기 출혈량, 재출혈량으로 분류하여서 확인하였다. 총 출혈량 결과에서는 대조군에 비해서 모든 군에서 약 50% 정도 낮음을 알 수 있고 각 비교군들에서 배트록소빈의 포함 농도가 높아질수록 출혈량이 낮아짐을 확인할 수 있었다(도 5a). 그리고 초기 출혈량 비교한 그래프에서는 콜라겐, 키토산만 처리한 비교군에 비해서 배트록소빈의 농도가 높아짐에 따라 출혈량 줄어드는 양상은 보이지만 키토산에 5 BU의 배트록소빈이 포함된 군을 제외하고는 유의미한 효과는 크게 알 수 없었다(도 5b). 그러나 재출혈량을 확인한 그래프에서는 비교군에 비해서 모든 실험군에서 적은 양의 출혈을 보였고 이를 통계 분석을 하였을 때에도 모든 실험군에서 유의적인 효과가 있음을 평가 할 수 있었다. 특히 키토산에 5 BU의 배트록소빈이 포함된 군과 콜라겐+키토산에 배트록소빈이 포함된 군에서는 각 비교군과 비교하였을 때 재출혈이 현저하게 억제됨을 확인할 수 있었다(도 5c).

지혈 시점, 재출혈 시간 및 총 출혈량은 하기 표 3에 정리하였다. 지혈 시점은 필터페이퍼에 혈액이 묻어나지 않는 시점이고, 재출혈 시점은 필터페이퍼에 혈액이 묻어나는 시점을 의미한다.

따라서 동물 실험에서의 결과를 통해 본 발명의 배트록소빈 혼합물이 채혈을 통한 인 비트로에서의 효과뿐만 아니라 실제 창상모델에서의 인 비보에서도 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군에 비해서 초기 출혈량 및 재출혈량 및 시간을 현저하게 감소시킴을 확인하였으며, 창상 모델에서는 3 BU보다 5 BU의 배트록소빈에서 더 높은 효과를 보임을 알 수 있었다.

실시예 9. 통계분석

모든 측정값은 평균±표준편차로 표시하였다. 정규 분포 데이터의 평균값들의 차이는 Student t-검정에 의해 평가하였고, P>0.05를 통계적으로 차이가 있는 것으로 간주하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Biobud, Inc. <120> A Mixture of Recombinant Batroxobin and Hemostatic Powder or Pad Comprising The Same <130> PN150409P <150> KR 10-2015-0177952 <151> 2015-12-14 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BatSmx <220> <221> CDS <222> (1)..(693) <400> 1 gtt att ggt ggt gat gaa tgt gat att aat gaa cat cca ttt ttg gca 48 Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asp Ile Asn Glu His Pro Phe Leu Ala 1 5 10 15 ttt atg tac tac tct cca aga tac ttt tgt ggt atg act ttg att aac 96 Phe Met Tyr Tyr Ser Pro Arg Tyr Phe Cys Gly Met Thr Leu Ile Asn 20 25 30 caa gaa tgg gtt ttg act gca gca cat tgt aac aga aga ttt atg aga 144 Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asn Arg Arg Phe Met Arg 35 40 45 att cat ttg ggt aag cat gca ggt tct gtt gca aat tac gat gaa gtt 192 Ile His Leu Gly Lys His Ala Gly Ser Val Ala Asn Tyr Asp Glu Val 50 55 60 gtt aga tac cca aag gaa aag ttt att tgt cca aat aag aag aag aat 240 Val Arg Tyr Pro Lys Glu Lys Phe Ile Cys Pro Asn Lys Lys Lys Asn 65 70 75 80 gtt att act gat aag gat att atg ttg att aga ttg gat aga cca gtt 288 Val Ile Thr Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asp Arg Pro Val 85 90 95 aag aac tct gaa cat att gca cca ttg tct ttg cca tct aac cca cca 336 Lys Asn Ser Glu His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro 100 105 110 tct gtt ggt tct gtt tgt aga att atg ggt tgg ggt gca att act act 384 Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Ala Ile Thr Thr 115 120 125 tct gaa gat act tac cca gat gtt cca cat tgt gca aac att aac ttg 432 Ser Glu Asp Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Leu 130 135 140 ttt aat aat act gtt tgt aga gaa gca tac aat ggt ttg cca gca aag 480 Phe Asn Asn Thr Val Cys Arg Glu Ala Tyr Asn Gly Leu Pro Ala Lys 145 150 155 160 act ttg tgt gca ggt gtt ttg caa ggt ggt att gat act tgt ggt ggt 528 Thr Leu Cys Ala Gly Val Leu Gln Gly Gly Ile Asp Thr Cys Gly Gly 165 170 175 gat tct ggt ggt cca ttg att tgt aat ggt caa ttt caa ggt att ttg 576 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu 180 185 190 tct tgg ggt tct gat cca tgt gca gaa cca aga aag cca gca ttt tac 624 Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys Pro Ala Phe Tyr 195 200 205 act aag gtt ttt gat tac ttg cca tgg att caa tct att att gca ggt 672 Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ala Gly 210 215 220 aat aag act gca act tgt cca taa 696 Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro 225 230 <210> 2 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BatSmx <400> 2 Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asp Ile Asn Glu His Pro Phe Leu Ala 1 5 10 15 Phe Met Tyr Tyr Ser Pro Arg Tyr Phe Cys Gly Met Thr Leu Ile Asn 20 25 30 Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asn Arg Arg Phe Met Arg 35 40 45 Ile His Leu Gly Lys His Ala Gly Ser Val Ala Asn Tyr Asp Glu Val 50 55 60 Val Arg Tyr Pro Lys Glu Lys Phe Ile Cys Pro Asn Lys Lys Lys Asn 65 70 75 80 Val Ile Thr Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asp Arg Pro Val 85 90 95 Lys Asn Ser Glu His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro 100 105 110 Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Ala Ile Thr Thr 115 120 125 Ser Glu Asp Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Leu 130 135 140 Phe Asn Asn Thr Val Cys Arg Glu Ala Tyr Asn Gly Leu Pro Ala Lys 145 150 155 160 Thr Leu Cys Ala Gly Val Leu Gln Gly Gly Ile Asp Thr Cys Gly Gly 165 170 175 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu 180 185 190 Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys Pro Ala Phe Tyr 195 200 205 Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ala Gly 210 215 220 Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro 225 230 <210> 3 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nBat <220> <221> CDS <222> (1)..(693) <400> 3 gtc att gga ggt gat gaa tgt gac ata aat gaa cat cct ttc ctt gca 48 Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asp Ile Asn Glu His Pro Phe Leu Ala 1 5 10 15 ttc atg tac tac tct ccc cgg tat ttc tgt ggt atg act ttg atc aac 96 Phe Met Tyr Tyr Ser Pro Arg Tyr Phe Cys Gly Met Thr Leu Ile Asn 20 25 30 cag gaa tgg gtg ctg acc gct gca cac tgt aac agg aga ttt atg cgc 144 Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asn Arg Arg Phe Met Arg 35 40 45 ata cac ctt ggt aaa cat gcc gga agt gta gca aat tat gat gag gtg 192 Ile His Leu Gly Lys His Ala Gly Ser Val Ala Asn Tyr Asp Glu Val 50 55 60 gta aga tac cca aag gag aag ttc att tgt ccc aat aag aaa aaa aat 240 Val Arg Tyr Pro Lys Glu Lys Phe Ile Cys Pro Asn Lys Lys Lys Asn 65 70 75 80 gtc ata acg gac aag gac att atg ttg atc agg ctg gac aga cct gtc 288 Val Ile Thr Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asp Arg Pro Val 85 90 95 aaa aac agt gaa cac atc gcg cct ctc agc ttg cct tcc aac cct ccc 336 Lys Asn Ser Glu His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro 100 105 110 agt gtg ggc tca gtt tgc cgt att atg gga tgg ggc gca atc aca act 384 Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Ala Ile Thr Thr 115 120 125 tct gaa gac act tat ccc gat gtc cct cat tgt gct aac att aac ctg 432 Ser Glu Asp Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Leu 130 135 140 ttc aat aat acg gtg tgt cgt gaa gct tac aat ggg ttg ccg gcg aaa 480 Phe Asn Asn Thr Val Cys Arg Glu Ala Tyr Asn Gly Leu Pro Ala Lys 145 150 155 160 aca ttg tgt gca ggt gtc ctg caa gga ggc ata gat aca tgt ggg ggt 528 Thr Leu Cys Ala Gly Val Leu Gln Gly Gly Ile Asp Thr Cys Gly Gly 165 170 175 gac tct ggg gga ccc ctc atc tgt aat gga caa ttc cag ggc att tta 576 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu 180 185 190 tct tgg gga agt gat ccc tgt gcc gaa ccg cgt aag cct gcc ttc tac 624 Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys Pro Ala Phe Tyr 195 200 205 acc aag gtc ttt gat tat ctt ccc tgg atc cag agc att att gca gga 672 Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ala Gly 210 215 220 aat aaa act gcg act tgc ccg tga 696 Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro 225 230 <210> 4 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nBat <400> 4 Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asp Ile Asn Glu His Pro Phe Leu Ala 1 5 10 15 Phe Met Tyr Tyr Ser Pro Arg Tyr Phe Cys Gly Met Thr Leu Ile Asn 20 25 30 Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asn Arg Arg Phe Met Arg 35 40 45 Ile His Leu Gly Lys His Ala Gly Ser Val Ala Asn Tyr Asp Glu Val 50 55 60 Val Arg Tyr Pro Lys Glu Lys Phe Ile Cys Pro Asn Lys Lys Lys Asn 65 70 75 80 Val Ile Thr Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asp Arg Pro Val 85 90 95 Lys Asn Ser Glu His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro 100 105 110 Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Ala Ile Thr Thr 115 120 125 Ser Glu Asp Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Leu 130 135 140 Phe Asn Asn Thr Val Cys Arg Glu Ala Tyr Asn Gly Leu Pro Ala Lys 145 150 155 160 Thr Leu Cys Ala Gly Val Leu Gln Gly Gly Ile Asp Thr Cys Gly Gly 165 170 175 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu 180 185 190 Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys Pro Ala Phe Tyr 195 200 205 Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ala Gly 210 215 220 Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro 225 230 <210> 5 <211> 255 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMF <220> <221> CDS <222> (1)..(255) <400> 5 atg aga ttt cca tct att ttt act gca gtt ttg ttt gca gca tct tct 48 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 gca ttg gca gca cca gtt aac act act act gaa gat gaa act gca caa 96 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 att cca gca gaa gca gtt att ggt tac tct gat ttg gaa ggt gat ttt 144 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 gat gtt gct gtt ttg cca ttt tct aac tct act aat aac ggt ttg ttg 192 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 ttt att aat act act att gca tct att gca gca aag gaa gaa ggt gtt 240 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 tct ttg gaa aaa aga 255 Ser Leu Glu Lys Arg 85 <210> 6 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMF <400> 6 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg 85 <210> 7 <211> 274 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cloning cassette for SMF <400> 7 ggatccaaac gatgagattt ccatctattt ttactgcagt tttgtttgca gcatcttctg 60 cattggcagc accagttaac actactactg aagatgaaac tgcacaaatt ccagcagaag 120 cagttattgg ttactctgat ttggaaggtg attttgatgt tgctgttttg ccattttcta 180 actctactaa taacggtttg ttgtttatta atactactat tgcatctatt gcagcaaagg 240 aagaaggtgt ttctttggaa aaaagagcgg ccgc 274

Claims

다음 일반식 1로 표시되는 2종 이상의 당쇄화(glycosylation)된 재조합 배트록소빈으로 이루어지는, 재조합 배트록소빈 혼합 조성물로서,
상기 재조합 배트록소빈은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 나타나는, 재조합 배트록소빈 혼합 조성물:
[일반식 1]
M_a-G_b-B,
상기 일반식 1에 있어서, 상기 M은 만노오스, 상기 G는 N-아세틸글루코사민, 상기 B는 재조합 배트록소빈을 나타내고, 상기 a는 11 내지 13의 정수, 상기 b는 1 내지 3의 정수를 나타내며, 상기 M_a는 직쇄 또는 분지쇄형 만노오스 올리고머이고, 상기 G_b는 단일 N-아세틸글루코사민 또는 직쇄형 N-아세틸글루코사민 올리고머이며, 상기 M_a 및 G_b는 결합되어 글리코실화 구조체(glycosylation structure)를 형성하고, 상기 글리코실화 구조체는 상기 재조합 배트록소빈에 결합되어 있음.
제 1 항에 있어서, 상기 b는 2인 것을 특징으로 하는 재조합 배트록소빈 혼합 조성물.
제 1 항에 있어서, 2종 이상의 재조합 배트록소빈은 각각 상이한 a 값을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 배트록소빈 혼합 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 재조합 배트록소빈 혼합물은 a 값이 각각 11, 12 또는 13인 3종의 재조합 배트록소빈을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 배트록소빈 혼합 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 글리코실화 구조체는 서열목록 제1서열의 146번째 및 225번째 아미노산 잔기의 N-말단에 결합되는 것을 특징으로 하는 재조합 배트록소빈 혼합 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 재조합 배트록소빈 혼합물에 포함된 재조합 배트록소빈 분자들의 평균 분자량이 28-31 kDa인 것을 특징으로 하는 재조합 배트록소빈 혼합 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 a가 11인 경우, 상기 글리코실화 구조체(glycosylation structure)는 하기 일반식 2로 표시되는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 배트록소빈 혼합 조성물:
[일반식 2]

상기 일반식 2에 있어서, 상기 M은 만노오스이고, 상기 G는 N-아세틸글루코사민임.
제 1 항에 있어서, 상기 a가 12인 경우, 상기 글리코실화 구조체(glycosylation structure)는 하기 일반식 3, 4 또는 5로 표시되는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 배트록소빈 혼합 조성물:
[일반식 3]

[일반식 4]

[일반식 5]

상기 일반식 3 내지 5에 있어서, 상기 M은 만노오스이고, 상기 G는 N-아세틸글루코사민임.
제 1 항에 있어서, 상기 a가 13인 경우, 상기 글리코실화 구조체(glycosylation structure)는 하기 일반식 6, 7 또는 8로 표시되는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 배트록소빈 혼합 조성물:
[일반식 6]

[일반식 7]

[일반식 8]

상기 일반식 6 내지 8에 있어서, 상기 M은 만노오스이고, 상기 G는 N-아세틸글루코사민임.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 재조합 배트록소빈 혼합 조성물을 포함하는 지혈용 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 지혈용 조성물은 상기 재조합 배트록소빈 혼합 조성물을 1.1㎍ - 44㎍ 포함하는 것을 특징으로 하는 지혈용 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 지혈용 조성물은 생체적합성 중합체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 지혈용 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체 농도는 0.5-5 mg/ml인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체는 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 알부민, 헤모글로빈, 피브리노겐, 피브린, 카제인, 피브로넥틴, 엘라스틴, 케라틴 및 라미닌 및 그의 유도체 및 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 지혈용 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체는 콜라겐, 키토산 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 지혈용 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 지혈용 조성물은 재출혈(rebleeding)을 억제하는 것을 특징으로 하는 지혈용 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 지혈용 조성물은 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 유화액, 산제, 분말제, 과립제, 스펀지, 패드, 패치 또는 필름 형태인 것을 특징으로 하는 지혈용 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 재조합 배트록소빈 혼합 조성물을 산성 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 재조합 배트록소빈 지혈용 조성물의 제조 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 산성 용액은 pH 1-6인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 산성 용액은 생체적합성 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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