JP2003093063A - 改変型ヒトプロテインｃインヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 野生型ヒトプロテインＣインヒビターを基本
骨格とし、これに比して強い抗ＤＩＣ作用を有し、活性
型プロテインＣに対する阻害活性は減弱している改変型
ヒトプロテインＣインヒビターを提供すること。 【解決手段】 野生型ヒトプロテインＣインヒビターの
Ａｓｎ型糖鎖結合部位である第２３０位にＡｓｎ型糖鎖
が結合しないように該野生型ヒトプロテインＣインヒビ
ターの第２３０位のアスパラギン残基の属するＡｓｎ型
糖鎖結合領域のアミノ酸残基を置換し、且つ、第３５３
位のフェニルアラニンをグリシンに置換してなるアミノ
酸配列を有することを特徴とする、野生型ヒトプロテイ
ンＣインヒビターと比較して強いトロンビン阻害活性及
び血漿カリクレイン阻害活性を有するが活性型プロテイ
ンＣ阻害活性は減弱されている、改変型ヒトプロテイン
Ｃインヒビター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、播種性血管内凝固
（Disseminated Intravascular Coagulation：ＤＩＣ）
で見られる血液凝固系の持続的亢進及びこれに伴って起
こる炎症反応に対し、高い特異性を有する治療薬となり
得る改変型ヒトプロテインＣインヒビター及びこれを含
有する薬剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】播種性血管内凝固（ＤＩＣ）は、感染症
や悪性腫瘍その他が誘因となって血液凝固系が持続的に
亢進するため全身の細小血管内に血栓が多発する症候群
であり、一般的に血栓傾向を呈する。しかしまた、ＤＩ
Ｃでは、凝固系の持続亢進による細小血管内での血栓形
成と線溶系の亢進による血栓溶解が繰り返し起こるた
め、最終的には、凝固因子及び血小板が消費される結
果、血栓傾向とは逆に出血傾向を呈する。更には、炎症
細胞の活性化により臓器障害（多臓器不全）を併発する
こともある。ＤＩＣは感染症や悪性腫瘍その他が誘因と
なって起こる症候群であるため、誘因となる基礎疾患を
治療しない限り本質的に治癒しないが、誘因を取除くま
での間ＤＩＣの進行を抑制しなければ、患者はＤＩＣで
死亡する場合が多い。

【０００３】現在、臨床ではＤＩＣ患者に対し、主とし
て抗凝固療法（未分画若しくは低分子量ヘパリン等の抗
凝固薬を使用）を施し、その間にＤＩＣの誘因となって
いる基礎疾患を治療している。ヘパリンはアンチトロン
ビンIII依存的に、（血液凝固系を亢進する働きを有す
る）トロンビンを阻害することにより、凝固系の亢進を
抑制する。しかしながらＤＩＣでは、血液凝固系の持続
的亢進により、アンチトロンビンIIIが消費されて不足
傾向にある場合がある。このため、アンチトロンビンII
Iの補充が必要となるケースも多いが、アンチトロンビ
ンIII製剤は高価であることから、その使用が健康保険
上の制限を受けており、患者への十分量の投与は望み難
いという問題がある。

【０００４】ＤＩＣでは、血液凝固系、線溶系及び炎症
反応の異常亢進が複雑に絡み合っているため病態も一様
でなく、抗凝固療法だけでは思うように治療効果が得ら
れないケースも多く、予後は極めて不良であり、1992年
度厚生省血液凝固異常症調査研究班報告によれば、ＤＩ
Ｃ患者の半数が死亡している。

【０００５】プロテインＣインヒビターは、セリンプロ
テアーゼインヒビターファミリーに分類される糖タンパ
ク質であり、抗凝固作用を有する活性型プロテインＣを
阻害するだけでなく、血液凝固系の亢進に関与している
血漿カリクレイン及びトロンビンをも阻害する（各酵素
の阻害反応における二次反応速度定数はほぼ等しい）。
活性型プロテインＣは、血管内皮細胞上に発現している
トロンボモジュリンと複合体を形成したトロンビンが、
プロテインＣを活性化することによって生じる。ＤＩＣ
では、殆どの場合、トロンボモジュリンの発現量が著し
く低下しているため、活性型プロテインＣの産生量も著
しく低下している。その反面、ＤＩＣでは凝固系が亢進
しているため、血液凝固系で中心的役割を担っているト
ロンビン及び血漿カリクレインが上昇している。これら
の酵素は炎症性細胞を活性化して炎症反応をも亢進させ
る。従って、ＤＩＣでは、一般に、プロテインＣインヒ
ビターは、活性化プロテインＣ阻害因子としてではな
く、実質上抗凝固因子及び炎症反応抑制因子として、作
用している。

【０００６】このような背景において、本発明者等は先
に、ＤＩＣで見られる血液凝固系の異常亢進、二次線溶
の亢進及び炎症反応を改善するヒト生体由来のプロテイ
ンＣインヒビターを見出している〔Fujita, M. et al.,
Thrombosis and Haemostasis, 84: 54-58 (2000)、Izu
tani, W. et al., Biological & Pharmaceutical Bulle
tin, 23: 1046-1050 (2000)、及び特開平11-60500〕。

【０００７】更に本発明等は、ヒトプロテインＣインヒ
ビターにおいては、活性を抑制する方向にＡｓｎ型糖鎖
が作用しており、Ａｓｎ型糖鎖結合部位のうち１ヶ所又
は複数ヶ所のＡｓｎ型糖鎖結合部位において糖鎖の結合
をなくすことによってプロテインＣインヒビターが有す
るトロンビン阻害活性及び血漿カリクレイン阻害活性を
高められること、及び、そのための一方法として、第２
３０位のアスパラギン残基の属するＡｓｎ型糖鎖結合領
域のアミノ酸配列である−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−に
おいて、（１）アスパラギン残基を他のアミノ酸残基で
置換する、（２）該配列中央のＬｅｕ又はＨｉｓを、Ｐ
ｒｏで置換する、又は（３）該配列末尾のＳｅｒをトレ
オニン以外の他のアミノ酸残基で置換する、という操作
のうち少なくと一つを行なえばよいこと、及び、該アス
パラギン残基を置換するのに好ましいアミノ酸残基がセ
リン、グリシン、アスパラギン酸、ロイシン又はプロリ
ンであり、そのうちセリンが特に好ましいことを見出
し、それに基づき、野生型のヒトプロテインＣインヒビ
ターの持つＤＩＣ改善作用（抗ＤＩＣ）を強めた改変型
ヒトプロテインＣインヒビターを得ている（特願2000-1
95490）。

【０００８】しかしながら、先に述べたように、ＤＩＣ
では血液凝固系、線溶系及び炎症反応の異常亢進が複雑
に絡み合っているため、その病態は一様でなく、活性型
プロテインＣの産生量が余り低下していない症例も見ら
れる。そのような症例に対してヒトプロテインＣインヒ
ビターが用いられる場合を考慮すると、トロンビン及び
血漿カリクレインに対し十分な阻害活性を有する一方、
活性型プロテインＣに対する阻害活性の弱いヒトプロテ
インＣインヒビターが、一層望ましい。

【０００９】すなわち、ヒトプロテインＣインヒビター
が有する活性型プロテインＣに対する阻害活性を減弱さ
せることができれば、それだけ活性型プロテインＣへの
影響を危惧することなく使用できる安全性の高い抗ＤＩ
Ｃ薬を提供できることになる。更に、プロテインＣイン
ヒビターのトロンビン阻害活性及び血漿カリクレイン阻
害活性を、野生型のそれより増強させることができれ
ば、ＤＩＣで見られる血液凝固系及び炎症反応の異常亢
進に対して効果の一層高い治療薬を提供できることにな
る。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明はこの点に着目
したものであり、野生型ヒトプロテインＣインヒビター
を基本骨格として利用し、これに比して強い抗ＤＩＣ作
用を有し、活性型プロテインＣに対する阻害活性は減弱
している改変型ヒトプロテインＣインヒビターを提供す
ることを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、配列表の
配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する野生型ヒト
プロテインＣインヒビターのＡｓｎ型糖鎖結合部位であ
る第２３０位にＡｓｎ型糖鎖が結合しないように改変し
たヒトプロテインＣインヒビター（特願2000-195490）
のうち、最も強いトロンビン阻害活性及び血漿カリクレ
イン阻害活性を有するものであるＡｓｎ230Ｓｅｒ型ヒ
トプロテインＣインヒビター（230位のアスパラギンが
セリンに置換されている）において、更に、活性型プロ
テインＣに対する反応部位を構成するアミノ酸残基（Ｐ
ｈｅ353−Ａｒｇ354−Ｓｅｒ355）のうち、第353位のフ
ェニルアラニンをグリシンに置換したところ、野生型に
比して強いトロンビン阻害作用及び血漿カリクレイン阻
害作用を有する反面、活性型プロテインＣに対する阻害
作用が顕著に減弱した改変型ヒトプロテインＣインヒビ
ターが得られることを見出した。

【００１２】すなわち本発明は、配列表の配列番号２に
示されたアミノ酸配列を有する野生型ヒトプロテインＣ
インヒビターのＡｓｎ型糖鎖結合部位である第２３０位
にＡｓｎ型糖鎖が結合しないように該野生型ヒトプロテ
インＣインヒビターの第２３０位のアスパラギン残基の
属するＡｓｎ型糖鎖結合領域のアミノ酸残基を置換し、
且つ、第３５３位のフェニルアラニンをグリシンに置換
してなるアミノ酸配列を有することを特徴とする、野生
型ヒトプロテインＣインヒビターと比較して強いトロン
ビン阻害活性及び血漿カリクレイン阻害活性を有するが
活性型プロテインＣ阻害活性は減弱されている、改変型
ヒトプロテインＣインヒビター質を提供する。

【００１３】本発明において、野生型ヒトプロテインＣ
インヒビターのＡｓｎ型糖鎖結合部位である第２３０位
にＡｓｎ型糖鎖が結合しないようするために行なうＡｓ
ｎ型糖鎖結合領域のアミノ酸残基の置換は、第２３０位
のアスパラギン残基の属するＡｓｎ型糖鎖結合領域であ
るアミノ酸配列−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−（ここに、Ｘ
は、Ｌｅｕ又はＨｉｓを表す。）における、（１）他の
アミノ酸残基によるアスパラギン残基の置換、（２）プ
ロリン残基によるＸの置換、及び（３）トレオニン以外
の他のアミノ酸残基によるセリン残基の置換のうち、少
なくとも何れかであることが好ましい。ここにおいて、
該アスパラギン残基の置換は、セリン、グリシン、アス
パラギン酸、ロイシン又はプロリンによるものであるこ
とが更に好ましい。

【００１４】更に好ましくは、本発明において、野生型
ヒトプロテインＣインヒビターのＡｓｎ型糖鎖結合部位
である第２３０位にＡｓｎ型糖鎖が結合しないようする
ために行なうＡｓｎ型糖鎖結合領域のアミノ酸残基の置
換は、第２３０位のアスパラギン残基の、セリン、グリ
シン、アスパラギン酸、ロイシン又はプロリンによる置
換である。セリンによる置換により得られる、配列表の
配列番号１２に示したアミノ酸配列を有する改変型ヒト
プロテインＣインヒビターは、特に好ましい一例であ
る。

【００１５】本発明はまた、上記の改変型ヒトプロテイ
ンＣインヒビターを有効成分として含有することを特徴
とする、血液凝固異常亢進抑制剤及び炎症反応抑制剤を
も提供する。ここにおいて、該血液凝固異常亢進及び該
炎症反応は、特に好ましくは、ＤＩＣにおけるものであ
る。

【００１６】更に本発明は、上記の何れかの改変型ヒト
プロテインＣインヒビターをコードするＤＮＡをも提供
する。

【００１７】更に本発明は、配列表の配列番号２で示さ
れたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
において：（１）該アミノ酸配列の第２３０位のアスパ
ラギン残基をコードする３塩基において、それらが他の
アミノ酸残基をコードする３塩基となるように塩基の置
換をし、且つ（２）該アミノ酸配列の第３５３位のフェ
ニルアラニン残基をコードする３塩基において、それら
がグリシン残基をコードする３塩基となるように塩基を
置換することにより得ることのできる、改変型ヒトプロ
テインＣインヒビターをコードするＤＮＡをも提供す
る。ここにおいて、該他のアミノ酸は、好ましくはセリ
ン、グリシン、アスパラギン酸、ロイシン及びプロリン
よりなる群より選ばれるアミノ酸である。

【００１８】更に本発明は、配列表の配列番号１２に示
したアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
をも提供する。該塩基配列の好ましい一例は、配列表の
配列番号１１で示された塩基配列中第５８〜１２１８位
の塩基よりなる配列を有するものである。

【００１９】更に本発明は、配列表の配列番号１１で示
された塩基配列を有するＤＮＡをも提供する。該ＤＮＡ
は、5'末端側にシグナル配列をコードする塩基配列（塩
基１〜57）を、及び3'末端に終止コドンである３塩基
を、それぞれ含む。

【００２０】

【発明の実施の形態】タンパク質に結合するＡｓｎ型糖
鎖は、アスパラギン結合型糖鎖又はＮ結合型糖鎖とも呼
ばれ、ポリペプチド鎖中のＡｓｎ型糖鎖結合領域〔−Ａ
ｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−若しくは−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−：
ここに、Ａｓｎ＝アスパラギン、Ｔｈｒ＝トレオニン、
Ｓｅｒ＝セリン、Ｘ＝Ｐｒｏ（プロリン）以外のアミノ
酸残基〕のアスパラギン残基の酸アミド基に糖鎖の還元
末端のＮ−アセチルグルコサミンがＮ−グリコシド結合
した糖鎖群である。これは、タンパク質の機能を修飾す
る役割を果たしている（特願2000-195490）。

【００２１】野生型ヒトプロテインＣインヒビターのア
ミノ酸配列を、配列表において配列番号２に示す。また
配列表において配列番号１で示した塩基配列は、併記さ
れたアミノ酸配列においてアミノ酸番号１ないし３８７
よりなる野生型ヒトプロテインＣインヒビターのアミノ
酸配列、及びこれに先行する、アミノ酸番号−１９ない
し−１よりなるシグナル配列をコードする塩基配列であ
る。

【００２２】本発明の改変型ヒトプロテインＣインヒビ
ターは、その遺伝子を常法により適宜の動物細胞宿主に
組み込んで培養し、培養上清から回収・精製することに
より得ることができる。本発明の改変型ヒトプロテイン
Ｃインヒビターは、野生型ヒトプロテインＣインヒビタ
ーに比して、トロンビン阻害活性及び血漿カリクレイン
阻害活性が強く、特にトロンビン阻害活性については顕
著に強いことから、両阻害活性を併せると抗ＤＩＣ作用
は野生型ヒトプロテインＣインヒビターより格段に優れ
ている。一方、活性型ヒトプロテインＣに対する阻害活
性については、本発明の改変型ヒトプロテインＣインヒ
ビターは、野生型ヒトプロテインＣインヒビターに比し
て遥かに弱い。また本発明の改変型ヒトプロテインＣイ
ンヒビターは、先の改変型ヒトプロテインＣインヒビタ
ーの一つであるＡｓｎ230Ｓｅｒ型ヒトプロテインＣイ
ンヒビターと比較しても、トロンビン阻害活性が顕著に
高い一方、活性型ヒトプロテインＣに対する阻害活性は
更に顕著に低い。活性型ヒトプロテインＣに対する阻害
活性に対する、トロンビン阻害活性及び血漿カリクレイ
ン阻害活性の比をとって比較すると、本発明の改変型ヒ
トプロテインＣインヒビターのそれは、野生型及びＡｓ
ｎ230Ｓｅｒ型ヒトプロテインＣインヒビターの何れに
対しても、顕著に大きい。

【００２３】本発明の改変型ヒトプロテインＣインヒビ
ターのトロンビン阻害活性及び血漿カリクレイン阻害活
性が野生型プロテインＣインヒビターよりも強く、Ａｓ
ｎ230Ｓｅｒ型ヒトプロテインＣインヒビターと比較し
ても遜色がないことは、ＤＩＣにおける血液凝固系の持
続的亢進及びこれに伴って起こる炎症反応に対する改善
効果が一層期待できることを意味する。このことは、ト
ロンビン及び血漿カリクレインが主要な血液凝固因子及
び炎症細胞活性化因子であること〔Journal ofClinical
Investigation, 69:1199-1202(1982)、Journal of Cli
nical Investigation, 72:1672-1677 (1982), The Jour
nal of Biological Chemistry, 269:3436-3440(1994),
Pathophysiology of Shock, Sepsis, 及び Organ Failu
re, Schlag G, Redl H, eds, Spring-Verlag 1993, pp4
6-60 等〕、ヒト尿由来のプロテインＣインヒビターが
トロンビン及び血漿カリクレインを阻害することでＤＩ
Ｃにおける病態を改善すること〔Fujita, M. et al.,Th
rombosis and Haemostasis, 84:54-58(2000)、及びIzut
ani, W. et al., Biological & Pharmaceutical Bullet
in, 23:1046-1050(2000)、ともに本発明者の掲載論文〕
によって支持される。更には、本発明の改変型ヒトプロ
テインＣインヒビターの活性型プロテインＣ阻害活性
が、野生型ヒトプロテインＣインヒビター及びＡｓｎ23
0Ｓｅｒ型ヒトプロテインＣインヒビターに比べ顕著に
低下していることは、抗凝固因子である活性型プロテイ
ンＣへの影響を危惧することなく使用できることを意味
する。

【００２４】本発明の改変型ヒトプロテインＣインヒビ
ターは、先に知られている野生型ヒトプロテインＣイン
ヒビターと同様にして、生理的に許容し得る塩類溶液等
に加えて点滴静注等により循環血中に直接投与する形
で、ＤＩＣに対して使用することとができる。使用に当
たっては、患者の循環血のフィブリノーゲン濃度、フィ
ブリン分解物濃度、プロトロンビン時間等、血液凝固系
の諸パラメータを定期的にモニターし、その結果に応じ
て投与量を加減すればよい。

【００２５】

【実施例】以下、代表的な一実施例を挙げて本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明が該実施例に限定される
ことは意図しない。

【００２６】＜実施例１＞ １．改変型ヒトプロテインＣインヒビターの発現 ａ）発現用ベクターの構築 ヒト肝臓由来のポリ（Ａ）ＲＮＡ（Clontech社製）１μ
gよりｃＤＮＡ合成モジュール（cDNA Synthesis Modul
e：Amersham社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、これを
鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により野生
型ヒトプロテインＣインヒビター遺伝子を増幅した。こ
のとき用いたフォーワードプライマー（プライマー１）
の塩基配列を配列表の配列番号３で、リバースプライマ
ー（プライマー２）を配列表の配列番号４で、それぞれ
示す。該フォーワードプライマー（プライマー１）は、
配列表の配列番号１に示した野生型ヒトプロテインＣイ
ンヒビターの塩基配列のうち塩基番号1〜36に相当する
塩基配列及びその5'末端に連結した塩基配列cgcggatcc
（このうち、ggatccはBamHI部位である）よりなる。リ
バースプライマー（プライマー２）は、配列表の配列番
号１に示した塩基配列のうち塩基番号1197〜1221に相補
的な塩基配列及びその5'末端に連結した塩基配列cgcgga
tcc（このうち、ggatccはBamHI部位である）よりなる。

【００２７】ＰＣＲ産物を、制限酵素BamHIを用いて消
化した後、アガロースゲル電気泳動を行った。目的のＤ
ＮＡバンドを精製した後、クローニングベクターpBlues
cript SK(-)のBamHI部位に組み込んだ。得られた野生型
ヒトプロテインＣインヒビター（以下、「野生型ＰＣ
Ｉ」と略す。）の遺伝子は、塩基配列を確認後、BamHI
消化により切り出してバキュロウイルス構築用ドナーベ
クターpFastBac-1（GIBCO BRL社製）のBamHI部位に組み
換えた。方向が合っているクローンを選び出し、これを
野生型ＰＣＩ発現用のBacmid作製に用いた。

【００２８】野生型ヒトプロテインＣインヒビターのア
ミノ酸配列（配列表の配列番号２）のＮ末端側から数え
て230番目のアスパラギン（「Ａｓｎ230」と略す。）を
セリンに、又は353番目のフェニルアラニン（「Ｐｈｅ3
53」と略す。）をグリシンに置換した改変型ヒトプロテ
インＣインヒビター（以下それぞれ、「Ａｓｎ230Ｓｅ
ｒ」、「Ｐｈｅ353Ｇｌｙ」と略す。）の遺伝子を、そ
れぞれ以下のようにして構築した。すなわち、先ずそれ
ぞれのアミノ酸置換部位を含む領域に、Ａｓｎ230Ｓｅ
ｒの作製用には配列表の配列番号５で示した塩基配列を
有するプライマー（プライマー３）を、そしてＰｈｅ35
3Ｇｌｙの作製用には配列表の配列番号６で示した塩基
配列を有するプライマー（プライマー４）を設計した。

【００２９】プライマー３（配列番号５）の塩基配列
は、配列番号１（野生型ヒトプロテインＣインヒビター
塩基配列）に示した塩基配列のうち塩基733〜765よりな
る塩基配列に相当するが、但し、Ａｓｎをコードしてい
た元の塩基745〜747（AAC）が、Ｓｅｒをコードする塩
基TCCに置き換えられている。プライマー４（配列番号
６）の塩基配列は、配列番号１（野生型ヒトプロテイン
Ｃインヒビター塩基配列）に示した塩基番号1096〜1131
の塩基よりなる塩基配列に相当するが、但しＰｈｅをコ
ードしていた元の塩基1114-1116（TTC）が、Ｇｌｙをコ
ードする塩基GGCに置き換えられている。

【００３０】プライマー３及び４をフォーワードプライ
マーとし、プライマー２をリバースプライマーとして用
い、野生型ヒトプロテインＣインヒビター遺伝子を鋳型
としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電
気泳動に供し、増幅されたそれぞれのＤＮＡ断片を精製
した。次いで、プライマー１をフォーワードプライマー
とし、精製した各ＤＮＡ断片をリバースプライマーとし
て用いて前記のプロテインＣインヒビター遺伝子を鋳型
としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をBamHIにて消化
後、アガロースゲル電気泳動を行って、目的のＤＮＡバ
ンドを精製し、pBluescript SK(-)のBamHI部位に組み込
んだ。得られた各改変型プロテインＣインヒビター遺伝
子につき、目的の塩基置換が行われている事を確認し
た。

【００３１】得られたＡｓｎ230Ｓｅｒ遺伝子の塩基配
列（シグナル配列を含む）及びＡｓｎ230Ｓｅｒのアミ
ノ酸配列を、配列表の配列番号７及び８にそれぞれ示
す。配列番号７に示した塩基配列は、配列番号１（野生
型ヒトプロテインＣインヒビター塩基配列）に示した塩
基配列に相当するが、但し、野生型における塩基745-74
7のAAC（Ａｓｎをコードする）がTCC（Ｓｅｒをコード
する）に置き換えられている。

【００３２】またＰｈｅ353Ｇｌｙ遺伝子の塩基配列
（シグナル配列を含む）及びＰｈｅ353Ｇｌｙのアミノ
酸配列を、配列表の配列番号９及び１０にそれぞれ示
す。配列番号９に示した塩基配列は、配列番号１（野生
型ヒトプロテインＣインヒビター塩基配列）に示した塩
基配列に相当するが、但し、野生型における塩基1114-1
116のTTC（Ｐｈｅをコードする）がGGC（Ｇｌｙをコー
ドする）に置き換えられている。

【００３３】次に、Ａｓｎ230をセリンに、且つＰｈｅ3
53をグリシンに置換した改変型ヒトプロテインＣインヒ
ビター（以下、「Ａｓｎ230Ｓｅｒ／Ｐｈｅ353Ｇｌｙ」
と略す。）の遺伝子を作製するため、上記プライマー４
をフォーワードプライマー、プライマー２をリバースプ
ライマーとして用い、Ａｓｎ230Ｓｅｒ遺伝子を鋳型と
してＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動
に供し、増幅されたＤＮＡ断片を精製した。プライマー
１をフォーワードプライマー、精製したＤＮＡ断片をリ
バースプライマーとして用いて、Ａｓｎ230Ｓｅｒ遺伝
子を鋳型としてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ産物をBamHI
にて消化後、アガロースゲル電気泳動を行なって目的の
ＤＮＡバンドを精製し、これをpBluescript SK(-)のBam
HI部位に組み込んだ。得られたＡｓｎ230Ｓｅｒ／Ｐｈ
ｅ353Ｇｌｙ遺伝子につき、目的の塩基置換が行なわれ
ていることを確認した。

【００３４】こうして得られたＡｓｎ230Ｓｅｒ／Ｐｈ
ｅ353Ｇｌｙ遺伝子の塩基配列（シグナル配列を含む）
及びＡｓｎ230Ｓｅｒ／Ｐｈｅ353Ｇｌｙのアミノ酸配列
を、配列表の配列番号１１及び１２に、それぞれ示す。
配列番号１１に示した塩基配列は、配列番号１（野生型
ヒトプロテインＣインヒビター塩基配列）に示した塩基
配列に相当するが、但し、野生型における塩基745-747
のAAC（Ａｓｎをコードする）及び1114-1116 のTTC（Ｐ
ｈｅをコードする）が、TCC（Ｓｅｒをコードする）及
びGGC（Ｇｌｙをコードする）に、それぞれ置換されて
いる。

【００３５】精製したＡｓｎ230Ｓｅｒ、Ｐｈｅ353Ｇｌ
ｙ及びＡｓｎ230Ｓｅｒ／Ｐｈｅ353Ｇｌｙ遺伝子を、そ
れぞれBamHI消化により切り出して、バキュロウイルス
構築用ドナーベクターpFastBac-1のBamHI部位に組み換
えた。次に、方向が合っているクローンを選び出し、そ
れらを各改変型ヒトプロテインＣインヒビター発現用の
Bacmid作製に用いた。

【００３６】ｂ）発現用Bacmidの作製 野生型及び各改変型ヒトプロテインＣインヒビター発現
用のドナープラスミド１μｌにBacmid構築用大腸菌DH10
Bacのコンピテント細胞（GIBCO BRL社製）20μｌを加え
て混和し、氷上にて30分間静置した。次に、42℃で45秒
間のヒートショックを与えた後、直ちに氷中に移して２
分間冷却した。予め37℃に温めておいたＬＢ培地0.5ｍ
ｌを加えて混和し、37℃にて５時間震盪培養した。目的
遺伝子のBacmidへのトランスポジションを選別するため
に培養液をＬＢ培地にて2,000倍希釈し、その0.2ｍｌを
選別用ＬＢプレート（カナマイシン50μｇ／ｍｌ、ゲン
タマイシン７μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン10μｇ／ｍ
ｌ、ＩＰＴＧ／Ｘ-galコート）に播いた。37℃にて２日
間培養後、大きくて白いコロニーを選択しそれを２ｍｌ
ＬＢ培地（カナマイシン50μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン
７μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン10μｇ／ｍｌ）にて一
晩培養した。培養液１ｍｌから大腸菌を回収し、アルカ
リ溶解法にて野生型及び各改変型ヒトプロテインＣイン
ヒビター発現用Bacmidをそれぞれ回収した。

【００３７】ｃ） 組換えバキュロウイルスの作製 10％ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地（Grace's In
sect Cell Culture Medium 500ｍｌ、50倍希釈したYeas
tolate Solution 10ｍｌ、及び50倍希釈したLactoalbum
in Hydrolysate Solution 10ｍｌ；何れもGIBCO BRL社
製）で懸濁したＳｆ９細胞（昆虫細胞、Invitrogen社
製）を細胞培養用の６ウェルプレートにウェル当たり4.
5×10⁵個／２ｍｌ播いた後、27℃にて１時間静置してプ
レートに固着させた。次に、培地を除き、ＴＮＭ−ＦＨ
培地２ｍｌにて細胞を濯いだ後、同培地を２ｍｌ加えて
27℃にて10分間静置した。Cell Fctin（GIBCO BRL社
製）５μｌにＴＮＭ−ＦＨ培地100μｌを加えたものと
野生型ＰＣＩ発現用Bacmid５μｌにＴＮＭ−ＦＨ培地10
0μｌを加えたものを混和し、室温で30分間静置した。
その後、ＴＮＭ−ＦＨ培地を800μｌ加えて混和した。1
0分間静置していたＳｆ９細胞から培地を除去し、これ
に先のBacmid-lipid混合液を加えて27℃で静置した。５
時間後、10％ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地２ｍ
ｌにて細胞を濯いだ後、同培地を２ｍｌ加えて27℃にて
培養した。３日後、培養上清を回収し、遠心分離（2,00
0ｒｐｍ、５分間）して細胞残渣を除いたものを野生型
ＰＣＩ発現用種ウイルス液とした。同様に各改変型プロ
テインＣインヒビター発現用Bacmidを用いて各改変型プ
ロテインＣインヒビター発現用の種ウイルス液を作製し
た。この様にして作製した種ウイルス液は、使用するま
で４℃にて保存した。

【００３８】ｄ） ウイルス感染及びヒトプロテインＣ
インヒビターの発現チェック Ex-CELL400（JRH Bioscience社製）培地に懸濁させたHi
gh-Five細胞（昆虫細胞、Invitrogen社製）を25ｃｍ²培
養フラスコに２×10⁶個／５ｍｌ播いた後、27℃にて１
時間静置してフラスコに固着させた。次いで、培養上清
を除去し、10％ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地80
0μｌに野生型ＰＣＩ発現用種ウイルス液200μｌを混和
したものを加え、室温でシーソーにてゆっくりと揺らし
てウイルスを感染させた。１時間後、ウイルス液を除
き、Ex-CELL400培地２ｍｌにて細胞を濯いだ後、同培地
を５ｍ加えて27℃にて３日間培養後、培養上清を回収し
て遠心分離（2,000ｒｐｍ、５分間）により細胞残渣を
除いた。こうして得られた培養上清２ｍｌを、分子量1
0,000カットの遠心濃縮装置（ミリポア社製）を用いて2
00μｌまで濃縮した。各改変型プロテインＣインヒビタ
ー発現用種ウイルス液を用いて同様の操作を行い、培養
上清を得た。これらを12.5％ゲル濃度のＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動に供し、クマシー染色及び抗ヒ
トプロテインＣインヒビター抗体（Nordic Immunology
社製）を用いたウエスタンブロッティングを行い、野生
型及び改変型プロテインＣインヒビターの発現を確認し
た。

【００３９】ｅ） バキュロウイルスの大量培養 野生型及び改変型ヒトプロテインＣインヒビター大量発
現用のウイルス液を得るために、以下の操作を行った。
10％ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地で懸濁したＳ
ｆ９細胞を150ｃｍ²培養フラスコに1.2×10⁷個／10ｍｌ
播いた後、27℃にて１時間静置してフラスコに固着させ
た。次に、培養上清を除き、10％ウシ胎仔血清を含むＴ
ＮＭ−ＦＨ培地５ｍｌと野生型ＰＣＩ発現用種ウイルス
液100μｌを混和した液を加え、室温でシーソーにより
ゆっくりと揺らしてウイルスを感染させた。１時間後、
ウイルス液を除き、10％ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−Ｆ
Ｈ培地を30ｍｌ加えた。27℃にて４日間培養した後、培
養上清を回収し、遠心分離にて細胞残渣を除いたものを
野生型ＰＣＩ大量発現用のウイルス液としてストックし
た。同様に、改変型プロテインＣインヒビター発現用種
ウイルス液を用いて各改変型ヒトプロテインＣインヒビ
ター大量発現用ウイルス液を作製した。

【００４０】ｆ）各ヒトプロテインＣインヒビターの大
量発現 150ｃｍ²培養フラスコ５枚（培養液量30ｍｌ）にコンフ
ルエントに用意したHigh-Five細胞をピペッティングに
より剥がして得た細胞懸濁液を10ｍｌずつ新しい150ｃ
ｍ²培養フラスコに播いた後、27℃にて１時間静置して
細胞をフラスコに固着させた（合計15枚）。次いで、培
養上清を除いた後、15枚のフラスコそれぞれに10％ウシ
胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地４ｍｌと野生型ＰＣＩ
大量発現用のウイルス液１ｍｌを混和したものを加え、
室温にてシーソーでゆっくりと揺らしてウイルスを感染
させた。１時間後、ウイルス液を除き、Ex-CELL400培地
５ｍｌにて細胞を濯いだ後、同培地を30ｍｌ加えた。27
℃にて３日間培養後、遠心分離（2,000ｒｐｍ、５分
間）にて細胞残渣を除去し、野生型ＰＣＩを含む培養上
清を得た。同様に、各改変型ヒトプロテインＣインヒビ
ター大量発現用のウイルス液を用いて、各改変型ヒトプ
ロテインＣインヒビターを含む培養上清を得た。

【００４１】２．発現させた改変型ヒトプロテインＣイ
ンヒビターの精製 上記１．で得た野生型ヒトプロテインＣインヒビターを
含む培養上清500ｍｌを分子量10,000カットの限外濾過
膜（PM-10, Amicon社製）を用いて150ｍｌまで濃縮した
後、50ｍＭ塩化ナトリウムを含む20ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ7.4）に対して透析し、液内の緩衝液を交換し
た。次いで、内液を同緩衝液で平衡化させたHiTrap Hep
arinカラム（カラム容積５ｍｌ、アマシャム ファルマ
シア バイオテク社製）に供し、同緩衝液でカラムを洗
浄後、同緩衝液に溶解させた塩化ナトリウムの直線濃度
勾配（50ｍＭから2.0Ｍ）により溶出させた。この溶出
画分を４〜20％マルチゲル（第一化学薬品社製）を用い
てＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、抗
ヒトプロテインＣインヒビター抗体を用いたウエスタン
ブロッティングで分析し、野生型ＰＣＩを含む画分を集
めた。各改変型ヒトプロテインＣインヒビターを含む培
養上清についても同様に精製、分析し、各改変型ヒトプ
ロテインＣインヒビターを含む画分を集めた。これらを
４〜20％マルチゲルを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に付し、銀染色及び抗ヒトプロテインＣ
インヒビター抗体を用いたウエスタンブロッティングで
分析し、得られた各ヒトプロテインＣインヒビターが高
純度のものであることを確認した。

【００４２】３．トロンビン、血漿カリクレイン及び活
性型プロテインＣに対する阻害反応の速度論的研究 上記１.及び２.に述べたようにして発現させ精製した野
生型及び改変型の各ヒトプロテインＣインヒビター（野
生型ＰＣＩ、Ａｓｎ230Ｓｅｒ、Ｐｈｅ353Ｇｌｙ及びＡ
ｓｎ230Ｓｅｒ／Ｐｈｅ353Ｇｌｙ）とヒト尿由来プロテ
インＣインヒビター〔Thrombosis and Haemostasis, 8
3: 54-58 (2000)に記載の方法で精製〕につき、トロン
ビン、血漿カリクレイン及び活性型プロテインＣに対す
る阻害作用を速度論的に比較した。0.15Ｍ塩化ナトリウ
ム及び0.05％ウシ血清アルブミンを含む50ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）中でトロンビン（最終濃度10ｎ
Ｍ）、血漿カリクレイン（最終濃度10ｎＭ）及び活性型
プロテインＣ（最終濃度10ｎＭ）と、上記各ヒトプロテ
インＣインヒビター（最終濃度25〜3500ｎＭ）を37℃で
５、10及び20分間反応させた。これらの反応液それぞれ
に合成基質（最終濃度１ｍＭ、S-2238：トロンビン活性
測定用、S-2302：血漿カリクレイン測定用、S-2366：活
性型プロテインＣ測定用：何れも第一化学薬品社製）を
加え、405ｎｍにおける吸光度の時間変化量をTHERMOmax
Kinetic Microplate Reader (Molecular Devices社製)
でモニターして各酵素の残存活性（α）を算出し、二次
反応速度定数（ｋ₂、Ｍ^-1min^-1）を求めた。すなわち、
阻害反応の結果に基づき、縦軸にｌｎ(１／α)を、横軸
に時間（ｔ）をプロットしたところ、何れの場合も（各
インヒビターで何れの濃度でも）原点を通る直線が得ら
れ、各酵素と各ヒトプロテインＣインヒビターの反応は
一次反応式ｌｎ(１／α)＝kapp・ｔ（kapp：一次反応速
度定数）に適合した。そこで縦軸にkappを、横軸にプロ
テインＣインヒビター濃度（［Ｉ₀］）をプロットする
と、各プロテインＣインヒビターの何れの場合も原点を
通る直線（二次反応式：kapp＝ｋ₂・［Ｉ₀］）が得られ
た。この直線の傾きよりｋ₂を求めた（表１）。得られ
た結果から、各改変型ヒトプロテインＣインヒビターの
うちヒトトロンビン阻害活性が最も強く且つ活性型ヒト
プロテインＣ阻害活性が最も弱い改変型ヒトプロテイン
ＣインヒビターがＡｓｎ230Ｓｅｒ／Ｐｈｅ353Ｇｌｙで
あることが判明した。

【００４３】

【表１】

【００４４】凝固系と炎症反応の異常亢進に対する各ヒ
トプロテインＣインヒビターの特異性を比較するため
に、トロンビン（Ｔｂ）及び血漿カリクレイン（ＰＫ）
についての各ヒトプロテインＣインヒビターのｋ₂（Ｍ
^-1min^-1）と、活性型ヒトプロテインＣ（ＡＰＣ）につ
いての各ヒトプロテインＣインヒビターのｋ₂（Ｍ^-1min
^-1）との比（Ｔｂ／ＡＰＣ及びＰＫ／ＡＰＣ）を算出し
た（表１）。その結果、ヒト尿由来及び野生型ヒトプロ
テインＣインヒビターのＴｂ／ＡＰＣに比して、改変型
ヒトプロテインＣインヒビターであるＡｓｎ230Ｓｅｒ
及びＡｓｎ230Ｓｅｒ／Ｐｈｅ353ＧｌｙのＴｂ／ＡＰＣ
は明らかに高い値を示した。特にＡｓｎ230Ｓｅｒ／Ｐ
ｈｅ353Ｇｌｙの値は、ヒト尿由来プロテインＣインヒ
ビターの22倍以上、野生型ヒトプロテインＣインヒビタ
ーの10倍以上であり、またＡｓｎ230Ｓｅｒと比較して
も５倍以上となる高値であった。一方、ＰＫ／ＡＰＣの
値についても、ヒト尿由来及び野生型ヒトプロテインＣ
インヒビターに比して、Ａｓｎ230Ｓｅｒ及びＡｓｎ230
Ｓｅｒ／Ｐｈｅ353Ｇｌｙは明らかに高い値を示し、Ａ
ｓｎ230Ｓｅｒ／Ｐｈｅ353Ｇｌｙの値はヒト尿由来プロ
テインＣインヒビターの７倍以上、野生型ヒトプロテイ
ンＣインヒビターの約３倍であり、Ａｓｎ230Ｓｅｒと
比較しても1.4倍以上となる高値であった。

【００４５】以上の結果から、Ａｓｎ230Ｓｅｒ／Ｐｈ
ｅ353Ｇｌｙは、野生型ヒトプロテインＣインヒビター
に比して、トロンビンに対する阻害活性及び血漿カリク
レインに対する阻害活性が高い反面、活性型プロテイン
Ｃに対する阻害活性が低く、活性型プロテインＣに対す
る阻害活性に比してトロンビン及び血漿カリクレインに
対する阻害活性が増強されていることが判る。またＡｓ
ｎ230Ｓｅｒ／Ｐｈｅ353Ｇｌｙは、Ａｓｎ230Ｓｅｒと
比較しても、トロンビンに対する阻害活性が高い反面プ
ロテインＣに対する阻害活性が顕著に低く、活性型プロ
テインＣに対する阻害活性に比してトロンビン及び血漿
カリクレインに対する阻害活性がやはり増強されている
ことが判る。

【００４６】

【発明の効果】本発明によれば、ＤＩＣにおける血液凝
固系の異常亢進及びそれに伴う炎症反応の亢進等の病態
に対し、野生型ヒトプロテインＣインヒビター及びＡｓ
ｎ230Ｓｅｒよりも、治療上特異性の高い改変型ヒトプ
ロテインＣインヒビターが得られる。

【００４７】

【配列表】 Sequence Listing <110> JCR Pharmaceuticals Co., Ltd., The Japan Health Sciences Foundatio n <120> Recombinant Human Protein C Inhibitors <130> P137-00 <160> 12 <210> 1 <211> 1221 <212> DNA <213> Homo sapience <220> <221> sig_peptide <222> (1)...(57) <400> 1 atg cag ctc ttc ctc ctc ttg tgc ctg gtg ctt ctc agc cct cag 45 Met Gln Leu Phe Leu Leu Leu Cys Leu Val Leu Leu Ser Pro Gln -19 -15 -10 -5 ggg gcc tcc ctt cac cgc cac cac ccc cgg gag atg aag aag aga 90 Gly Ala Ser Leu His Arg His His Pro Arg Glu Met Lys Lys Arg -1 1 5 10 gtc gag gac ctc cat gta ggt gcc acg gtg gcc ccc agc agc aga 135 Val Glu Asp Leu His Val Gly Ala Thr Val Ala Pro Ser Ser Arg 15 20 25 agg gac ttt acc ttt gac ctc tac agg gcc ttg gct tcc gct gcc 180 Arg Asp Phe Thr Phe Asp Leu Tyr Arg Ala Leu Ala Ser Ala Ala 30 35 40 ccc agc cag aac atc ttc ttc tcc cct gtg agc atc tcc atg agc 225 Pro Ser Gln Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ser Met Ser 45 50 55 ctg gcc atg ctc tcc ctg ggg gct ggg tcc agc aca aag atg cag 270 Leu Ala Met Leu Ser Leu Gly Ala Gly Ser Ser Thr Lys Met Gln 60 65 70 atc ctg gag ggc ctg ggc ctc aac ctc cag aaa agc tca gag aag 315 Ile Leu Glu Gly Leu Gly Leu Asn Leu Gln Lys Ser Ser Glu Lys 75 80 85 gag ctg cac aga ggc ttt cag cag ctc ctt cag gaa ctc aac cag 360 Glu Leu His Arg Gly Phe Gln Gln Leu Leu Gln Glu Leu Asn Gln 90 95 100 ccc aga gat ggc ttc cag ctg agc ctc ggc aat gcc ctt ttc acc 405 Pro Arg Asp Gly Phe Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Leu Phe Thr 105 110 115 gac ctg gtg gta gac ctg cag gac acc ttc gta agt gcc atg aag 450 Asp Leu Val Val Asp Leu Gln Asp Thr Phe Val Ser Ala Met Lys 120 125 130 acg ctg tac ctg gca gac act ttc ccc acc aac ttt agg gac tct 495 Thr Leu Tyr Leu Ala Asp Thr Phe Pro Thr Asn Phe Arg Asp Ser 135 140 145 gca ggg gcc atg aag cag atc aat gat tat gtg gca aag caa acg 540 Ala Gly Ala Met Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Ala Lys Gln Thr 150 155 160 aag ggc aag att gtg gac ttg ctt aag aac ctc gat agc aat gcg 585 Lys Gly Lys Ile Val Asp Leu Leu Lys Asn Leu Asp Ser Asn Ala 165 170 175 gtc gtg atc atg gtg aat tac atc ttc ttt aaa gct aag tgg gag 630 Val Val Ile Met Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu 180 185 190 aca agc ttc aac cac aaa ggc acc caa gag caa gac ttc tac gtg 675 Thr Ser Phe Asn His Lys Gly Thr Gln Glu Gln Asp Phe Tyr Val 195 200 205 acc tcg gag act gtg gtg cgg gta ccc atg atg agc cgc gag gat 720 Thr Ser Glu Thr Val Val Arg Val Pro Met Met Ser Arg Glu Asp 210 215 220 cag tat cac tac ctc ctg gac cgg aac ctc tcc tgc agg gtg gtg 765 Gln Tyr His Tyr Leu Leu Asp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Val 225 230 235 ggg gtc ccc tac caa ggc aat gcc acg gct ttg ttc att ctc ccc 810 Gly Val Pro Tyr Gln Gly Asn Ala Thr Ala Leu Phe Ile Leu Pro 240 245 250 agt gag gga aag atg cag cag gtg gag aat gga ctg agt gag aaa 855 Ser Glu Gly Lys Met Gln Gln Val Glu Asn Gly Leu Ser Glu Lys 255 260 265 acg ctg agg aag tgg ctt aag atg ttc aaa aag agg cag ctc gag 900 Thr Leu Arg Lys Trp Leu Lys Met Phe Lys Lys Arg Gln Leu Glu 270 275 280 ctt tac ctt ccc aaa ttc tcc att gag ggc tcc tat cag ctg gag 945 Leu Tyr Leu Pro Lys Phe Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Gln Leu Glu 285 290 295 aaa gtc ctc ccc agt ctg ggg atc agt aac gtc ttc acc tcc cat 990 Lys Val Leu Pro Ser Leu Gly Ile Ser Asn Val Phe Thr Ser His 300 305 310 gct gat ctg tcc ggc atc agc aac cac tca aat atc cag gtg tct 1035 Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ser Asn His Ser Asn Ile Gln Val Ser 315 320 325 gag atg gtg cac aaa gct gtg gtg gag gtg gac gag tcg gga acc 1080 Glu Met Val His Lys Ala Val Val Glu Val Asp Glu ser Gly Thr 330 335 340 aga gca gcg gca gcc acg ggg aca atc ttc act ttc agg tcg gcc 1125 Arg Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ile Phe Thr Phe Arg Ser Ala 345 350 355 cgc ctg aac tct cag agg cta gtg ttc aac agg ccc ttt ctg atg 1170 Arg Leu Asn Ser Gln Arg Leu Val Phe Asn Arg Pro Phe Leu Met 360 365 370 ttc att gtg gat aac aac atc ctc ttc ctt ggc aaa gtg aac cgc 1215 Phe Ile Val Asp Asn Asn Ile Leu Phe Leu Gly Lys Val Asn Arg 375 380 385 ccc tga 1221 Pro <210> 2 <211> 387 <212> PTN <213> Homo sapience <400> 2 His Arg His His Pro Arg Glu Met Lys Lys Arg Val Glu Asp Leu His 1 5 10 15 Val Gly Ala Thr Val Ala Pro Ser Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asp 20 25 30 Leu Tyr Arg Ala Leu Ala Ser Ala Ala Pro Ser Gln Asn Ile Phe Phe 35 40 45 Ser Pro Val Ser Ile Ser Met Ser Leu Ala Met Leu Ser Leu Gly Ala 50 55 60 Gly Ser Ser Thr Lys Met Gln Ile Leu Glu Gly Leu Gly Leu Asn Leu 65 70 75 80 Gln Lys Ser Ser Glu Lys Glu Leu His Arg Gly Phe Gln Gln Leu Leu 85 90 95 Gln Glu Leu Asn Gln Pro Arg Asp Gly Phe Gln Leu Ser Leu Gly Asn 100 105 110 Ala Leu Phe Thr Asp Leu Val Val Asp Leu Gln Asp Thr Phe Val Ser 115 120 125 Ala Met Lys Thr Leu Tyr Leu Ala Asp Thr Phe Pro Thr Asn Phe Arg 130 135 140 Asp Ser Ala Gly Ala Met Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Ala Lys Gln 145 150 155 160 Thr Lys Gly Lys Ile Val Asp Leu Leu Lys Asn Leu Asp Ser Asn Ala 165 170 175 Val Val Ile Met Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu Thr 180 185 190 Ser Phe Asn His Lys Gly Thr Gln Glu Gln Asp Phe Tyr Val Thr Ser 195 200 205 Glu Thr Val Val Arg Val Pro Met Met Ser Arg Glu Asp Gln Tyr His 210 215 220 Tyr Leu Leu Asp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Val Gly Val Pro Tyr 225 230 235 240 Gln Gly Asn Ala Thr Ala Leu Phe Ile Leu Pro Ser Glu Gly Lys Met 245 250 255 Gln Gln Val Glu Asn Gly Leu Ser Glu Lys Thr Leu Arg Lys Trp Leu 260 265 270 Lys Met Phe Lys Lys Arg Gln Leu Glu Leu Tyr Leu Pro Lys Phe Ser 275 280 285 Ile Glu Gly Ser Tyr Gln Leu Glu Lys Val Leu Pro Ser Leu Gly Ile 290 295 300 Ser Asn Val Phe Thr Ser His Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ser Asn His 305 310 315 320 Ser Asn Ile Gln Val Ser Glu Met Val His Lys Ala Val Val Glu Val 325 330 335 Asp Glu ser Gly Thr Arg Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ile Phe Thr 340 345 350 Phe Arg Ser Ala Arg Leu Asn Ser Gln Arg Leu Val Phe Asn Arg Pro 355 360 365 Phe Leu Met Phe Ile Val Asp Asn Asn Ile Leu Phe Leu Gly Lys Val 370 375 380 Asn Arg Pro 385 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 3 cgcggatcca tgcagctctt cctcctcttg tgcctggtgc ttctc 45 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 4 cgcggatcct caggggcggt tcactttgcc aagg 34 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence identical to nucleotides 733-765 in the SEQ ID NO:1 seque nce except that the original nucleotides 745-747 (AAC) encoding Asn are replaced with TCC encoding Ser <400> 5 ctcctggacc ggtccctctc ctgcagggtg gtg 33 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence identical to nucleotides 1096-1131 in the SEQ ID NO:1 seq uence except that the original nucleotides 1114-1116 (TTC) encoding Phe are replaced with GGC encoding Gly <400> 6 acggggacaa tcttcactgg caggtcggcc cgcctg 36 <210> 7 <211> 1221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> sig_peptide <222> (1)...(57) <220> <223> Sequence identical to the SEQ ID NO:1 sequence except that the nuc leotides 745-747 (AAC) encoding Asn are replaced with TCC encoding Ser <400> 7 atg cag ctc ttc ctc ctc ttg tgc ctg gtg ctt ctc agc cct cag 45 Met Gln Leu Phe Leu Leu Leu Cys Leu Val Leu Leu Ser Pro Gln -19 -15 -10 -5 ggg gcc tcc ctt cac cgc cac cac ccc cgg gag atg aag aag aga 90 Gly Ala Ser Leu His Arg His His Pro Arg Glu Met Lys Lys Arg -1 1 5 10 gtc gag gac ctc cat gta ggt gcc acg gtg gcc ccc agc agc aga 135 Val Glu Asp Leu His Val Gly Ala Thr Val Ala Pro Ser Ser Arg 15 20 25 agg gac ttt acc ttt gac ctc tac agg gcc ttg gct tcc gct gcc 180 Arg Asp Phe Thr Phe Asp Leu Tyr Arg Ala Leu Ala Ser Ala Ala 30 35 40 ccc agc cag aac atc ttc ttc tcc cct gtg agc atc tcc atg agc 225 Pro Ser Gln Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ser Met Ser 45 50 55 ctg gcc atg ctc tcc ctg ggg gct ggg tcc agc aca aag atg cag 270 Leu Ala Met Leu Ser Leu Gly Ala Gly Ser Ser Thr Lys Met Gln 60 65 70 atc ctg gag ggc ctg ggc ctc aac ctc cag aaa agc tca gag aag 315 Ile Leu Glu Gly Leu Gly Leu Asn Leu Gln Lys Ser Ser Glu Lys 75 80 85 gag ctg cac aga ggc ttt cag cag ctc ctt cag gaa ctc aac cag 360 Glu Leu His Arg Gly Phe Gln Gln Leu Leu Gln Glu Leu Asn Gln 90 95 100 ccc aga gat ggc ttc cag ctg agc ctc ggc aat gcc ctt ttc acc 405 Pro Arg Asp Gly Phe Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Leu Phe Thr 105 110 115 gac ctg gtg gta gac ctg cag gac acc ttc gta agt gcc atg aag 450 Asp Leu Val Val Asp Leu Gln Asp Thr Phe Val Ser Ala Met Lys 120 125 130 acg ctg tac ctg gca gac act ttc ccc acc aac ttt agg gac tct 495 Thr Leu Tyr Leu Ala Asp Thr Phe Pro Thr Asn Phe Arg Asp Ser 135 140 145 gca ggg gcc atg aag cag atc aat gat tat gtg gca aag caa acg 540 Ala Gly Ala Met Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Ala Lys Gln Thr 150 155 160 aag ggc aag att gtg gac ttg ctt aag aac ctc gat agc aat gcg 585 Lys Gly Lys Ile Val Asp Leu Leu Lys Asn Leu Asp Ser Asn Ala 165 170 175 gtc gtg atc atg gtg aat tac atc ttc ttt aaa gct aag tgg gag 630 Val Val Ile Met Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu 180 185 190 aca agc ttc aac cac aaa ggc acc caa gag caa gac ttc tac gtg 675 Thr Ser Phe Asn His Lys Gly Thr Gln Glu Gln Asp Phe Tyr Val 195 200 205 acc tcg gag act gtg gtg cgg gta ccc atg atg agc cgc gag gat 720 Thr Ser Glu Thr Val Val Arg Val Pro Met Met Ser Arg Glu Asp 210 215 220 cag tat cac tac ctc ctg gac cgg tcc ctc tcc tgc agg gtg gtg 765 Gln Tyr His Tyr Leu Leu Asp Arg Ser Leu Ser Cys Arg Val Val 225 230 235 ggg gtc ccc tac caa ggc aat gcc acg gct ttg ttc att ctc ccc 810 Gly Val Pro Tyr Gln Gly Asn Ala Thr Ala Leu Phe Ile Leu Pro 240 245 250 agt gag gga aag atg cag cag gtg gag aat gga ctg agt gag aaa 855 Ser Glu Gly Lys Met Gln Gln Val Glu Asn Gly Leu Ser Glu Lys 255 260 265 acg ctg agg aag tgg ctt aag atg ttc aaa aag agg cag ctc gag 900 Thr Leu Arg Lys Trp Leu Lys Met Phe Lys Lys Arg Gln Leu Glu 270 275 280 ctt tac ctt ccc aaa ttc tcc att gag ggc tcc tat cag ctg gag 945 Leu Tyr Leu Pro Lys Phe Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Gln Leu Glu 285 290 295 aaa gtc ctc ccc agt ctg ggg atc agt aac gtc ttc acc tcc cat 990 Lys Val Leu Pro Ser Leu Gly Ile Ser Asn Val Phe Thr Ser His 300 305 310 gct gat ctg tcc ggc atc agc aac cac tca aat atc cag gtg tct 1035 Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ser Asn His Ser Asn Ile Gln Val Ser 315 320 325 gag atg gtg cac aaa gct gtg gtg gag gtg gac gag tcg gga acc 1080 Glu Met Val His Lys Ala Val Val Glu Val Asp Glu ser Gly Thr 330 335 340 aga gca gcg gca gcc acg ggg aca atc ttc act ttc agg tcg gcc 1125 Arg Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ile Phe Thr Phe Arg Ser Ala 345 350 355 cgc ctg aac tct cag agg cta gtg ttc aac agg ccc ttt ctg atg 1170 Arg Leu Asn Ser Gln Arg Leu Val Phe Asn Arg Pro Phe Leu Met 360 365 370 ttc att gtg gat aac aac atc ctc ttc ctt ggc aaa gtg aac cgc 1215 Phe Ile Val Asp Asn Asn Ile Leu Phe Leu Gly Lys Val Asn Arg 375 380 385 ccc tga 1221 Pro <210> 8 <211> 387 <212> PTN <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence identical to the SEQ ID NO:2 sequence except that the ori ginal amino acid 230 (Asn) is replaced with Ser <400> 8 His Arg His His Pro Arg Glu Met Lys Lys Arg Val Glu Asp Leu His 1 5 10 15 Val Gly Ala Thr Val Ala Pro Ser Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asp 20 25 30 Leu Tyr Arg Ala Leu Ala Ser Ala Ala Pro Ser Gln Asn Ile Phe Phe 35 40 45 Ser Pro Val Ser Ile Ser Met Ser Leu Ala Met Leu Ser Leu Gly Ala 50 55 60 Gly Ser Ser Thr Lys Met Gln Ile Leu Glu Gly Leu Gly Leu Asn Leu 65 70 75 80 Gln Lys Ser Ser Glu Lys Glu Leu His Arg Gly Phe Gln Gln Leu Leu 85 90 95 Gln Glu Leu Asn Gln Pro Arg Asp Gly Phe Gln Leu Ser Leu Gly Asn 100 105 110 Ala Leu Phe Thr Asp Leu Val Val Asp Leu Gln Asp Thr Phe Val Ser 115 120 125 Ala Met Lys Thr Leu Tyr Leu Ala Asp Thr Phe Pro Thr Asn Phe Arg 130 135 140 Asp Ser Ala Gly Ala Met Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Ala Lys Gln 145 150 155 160 Thr Lys Gly Lys Ile Val Asp Leu Leu Lys Asn Leu Asp Ser Asn Ala 165 170 175 Val Val Ile Met Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu Thr 180 185 190 Ser Phe Asn His Lys Gly Thr Gln Glu Gln Asp Phe Tyr Val Thr Ser 195 200 205 Glu Thr Val Val Arg Val Pro Met Met Ser Arg Glu Asp Gln Tyr His 210 215 220 Tyr Leu Leu Asp Arg Ser Leu Ser Cys Arg Val Val Gly Val Pro Tyr 225 230 235 240 Gln Gly Asn Ala Thr Ala Leu Phe Ile Leu Pro Ser Glu Gly Lys Met 245 250 255 Gln Gln Val Glu Asn Gly Leu Ser Glu Lys Thr Leu Arg Lys Trp Leu 260 265 270 Lys Met Phe Lys Lys Arg Gln Leu Glu Leu Tyr Leu Pro Lys Phe Ser 275 280 285 Ile Glu Gly Ser Tyr Gln Leu Glu Lys Val Leu Pro Ser Leu Gly Ile 290 295 300 Ser Asn Val Phe Thr Ser His Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ser Asn His 305 310 315 320 Ser Asn Ile Gln Val Ser Glu Met Val His Lys Ala Val Val Glu Val 325 330 335 Asp Glu ser Gly Thr Arg Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ile Phe Thr 340 345 350 Phe Arg Ser Ala Arg Leu Asn Ser Gln Arg Leu Val Phe Asn Arg Pro 355 360 365 Phe Leu Met Phe Ile Val Asp Asn Asn Ile Leu Phe Leu Gly Lys Val 370 375 380 Asn Arg Pro 385 <210> 9 <211> 1221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> sig_peptide <222> (1)...(57) <220> <223> Sequence identical to the SEQ ID NO:1 sequence except that the nuc leotides 1114-1116 (TTC) encoding Phe are replaced with GGC encoding Gly <400> 9 atg cag ctc ttc ctc ctc ttg tgc ctg gtg ctt ctc agc cct cag 45 Met Gln Leu Phe Leu Leu Leu Cys Leu Val Leu Leu Ser Pro Gln -19 -15 -10 -5 ggg gcc tcc ctt cac cgc cac cac ccc cgg gag atg aag aag aga 90 Gly Ala Ser Leu His Arg His His Pro Arg Glu Met Lys Lys Arg -1 1 5 10 gtc gag gac ctc cat gta ggt gcc acg gtg gcc ccc agc agc aga 135 Val Glu Asp Leu His Val Gly Ala Thr Val Ala Pro Ser Ser Arg 15 20 25 agg gac ttt acc ttt gac ctc tac agg gcc ttg gct tcc gct gcc 180 Arg Asp Phe Thr Phe Asp Leu Tyr Arg Ala Leu Ala Ser Ala Ala 30 35 40 ccc agc cag aac atc ttc ttc tcc cct gtg agc atc tcc atg agc 225 Pro Ser Gln Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ser Met Ser 45 50 55 ctg gcc atg ctc tcc ctg ggg gct ggg tcc agc aca aag atg cag 270 Leu Ala Met Leu Ser Leu Gly Ala Gly Ser Ser Thr Lys Met Gln 60 65 70 atc ctg gag ggc ctg ggc ctc aac ctc cag aaa agc tca gag aag 315 Ile Leu Glu Gly Leu Gly Leu Asn Leu Gln Lys Ser Ser Glu Lys 75 80 85 gag ctg cac aga ggc ttt cag cag ctc ctt cag gaa ctc aac cag 360 Glu Leu His Arg Gly Phe Gln Gln Leu Leu Gln Glu Leu Asn Gln 90 95 100 ccc aga gat ggc ttc cag ctg agc ctc ggc aat gcc ctt ttc acc 405 Pro Arg Asp Gly Phe Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Leu Phe Thr 105 110 115 gac ctg gtg gta gac ctg cag gac acc ttc gta agt gcc atg aag 450 Asp Leu Val Val Asp Leu Gln Asp Thr Phe Val Ser Ala Met Lys 120 125 130 acg ctg tac ctg gca gac act ttc ccc acc aac ttt agg gac tct 495 Thr Leu Tyr Leu Ala Asp Thr Phe Pro Thr Asn Phe Arg Asp Ser 135 140 145 gca ggg gcc atg aag cag atc aat gat tat gtg gca aag caa acg 540 Ala Gly Ala Met Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Ala Lys Gln Thr 150 155 160 aag ggc aag att gtg gac ttg ctt aag aac ctc gat agc aat gcg 585 Lys Gly Lys Ile Val Asp Leu Leu Lys Asn Leu Asp Ser Asn Ala 165 170 175 gtc gtg atc atg gtg aat tac atc ttc ttt aaa gct aag tgg gag 630 Val Val Ile Met Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu 180 185 190 aca agc ttc aac cac aaa ggc acc caa gag caa gac ttc tac gtg 675 Thr Ser Phe Asn His Lys Gly Thr Gln Glu Gln Asp Phe Tyr Val 195 200 205 acc tcg gag act gtg gtg cgg gta ccc atg atg agc cgc gag gat 720 Thr Ser Glu Thr Val Val Arg Val Pro Met Met Ser Arg Glu Asp 210 215 220 cag tat cac tac ctc ctg gac cgg aac ctc tcc tgc agg gtg gtg 765 Gln Tyr His Tyr Leu Leu Asp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Val 225 230 235 ggg gtc ccc tac caa ggc aat gcc acg gct ttg ttc att ctc ccc 810 Gly Val Pro Tyr Gln Gly Asn Ala Thr Ala Leu Phe Ile Leu Pro 240 245 250 agt gag gga aag atg cag cag gtg gag aat gga ctg agt gag aaa 855 Ser Glu Gly Lys Met Gln Gln Val Glu Asn Gly Leu Ser Glu Lys 255 260 265 acg ctg agg aag tgg ctt aag atg ttc aaa aag agg cag ctc gag 900 Thr Leu Arg Lys Trp Leu Lys Met Phe Lys Lys Arg Gln Leu Glu 270 275 280 ctt tac ctt ccc aaa ttc tcc att gag ggc tcc tat cag ctg gag 945 Leu Tyr Leu Pro Lys Phe Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Gln Leu Glu 285 290 295 aaa gtc ctc ccc agt ctg ggg atc agt aac gtc ttc acc tcc cat 990 Lys Val Leu Pro Ser Leu Gly Ile Ser Asn Val Phe Thr Ser His 300 305 310 gct gat ctg tcc ggc atc agc aac cac tca aat atc cag gtg tct 1035 Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ser Asn His Ser Asn Ile Gln Val Ser 315 320 325 gag atg gtg cac aaa gct gtg gtg gag gtg gac gag tcg gga acc 1080 Glu Met Val His Lys Ala Val Val Glu Val Asp Glu ser Gly Thr 330 335 340 aga gca gcg gca gcc acg ggg aca atc ttc act ggc agg tcg gcc 1125 Arg Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ile Phe Thr Gly Arg Ser Ala 345 350 355 cgc ctg aac tct cag agg cta gtg ttc aac agg ccc ttt ctg atg 1170 Arg Leu Asn Ser Gln Arg Leu Val Phe Asn Arg Pro Phe Leu Met 360 365 370 ttc att gtg gat aac aac atc ctc ttc ctt ggc aaa gtg aac cgc 1215 Phe Ile Val Asp Asn Asn Ile Leu Phe Leu Gly Lys Val Asn Arg 375 380 385 ccc tga 1221 Pro <210> 10 <211> 387 <212> PTN <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence identical to the SEQ ID NO:2 sequence except that the ori ginal amino acid 353 (Phe) is replaced with Gly <400> 10 His Arg His His Pro Arg Glu Met Lys Lys Arg Val Glu Asp Leu His 1 5 10 15 Val Gly Ala Thr Val Ala Pro Ser Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asp 20 25 30 Leu Tyr Arg Ala Leu Ala Ser Ala Ala Pro Ser Gln Asn Ile Phe Phe 35 40 45 Ser Pro Val Ser Ile Ser Met Ser Leu Ala Met Leu Ser Leu Gly Ala 50 55 60 Gly Ser Ser Thr Lys Met Gln Ile Leu Glu Gly Leu Gly Leu Asn Leu 65 70 75 80 Gln Lys Ser Ser Glu Lys Glu Leu His Arg Gly Phe Gln Gln Leu Leu 85 90 95 Gln Glu Leu Asn Gln Pro Arg Asp Gly Phe Gln Leu Ser Leu Gly Asn 100 105 110 Ala Leu Phe Thr Asp Leu Val Val Asp Leu Gln Asp Thr Phe Val Ser 115 120 125 Ala Met Lys Thr Leu Tyr Leu Ala Asp Thr Phe Pro Thr Asn Phe Arg 130 135 140 Asp Ser Ala Gly Ala Met Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Ala Lys Gln 145 150 155 160 Thr Lys Gly Lys Ile Val Asp Leu Leu Lys Asn Leu Asp Ser Asn Ala 165 170 175 Val Val Ile Met Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu Thr 180 185 190 Ser Phe Asn His Lys Gly Thr Gln Glu Gln Asp Phe Tyr Val Thr Ser 195 200 205 Glu Thr Val Val Arg Val Pro Met Met Ser Arg Glu Asp Gln Tyr His 210 215 220 Tyr Leu Leu Asp Arg Asn Leu Ser Cys Arg Val Val Gly Val Pro Tyr 225 230 235 240 Gln Gly Asn Ala Thr Ala Leu Phe Ile Leu Pro Ser Glu Gly Lys Met 245 250 255 Gln Gln Val Glu Asn Gly Leu Ser Glu Lys Thr Leu Arg Lys Trp Leu 260 265 270 Lys Met Phe Lys Lys Arg Gln Leu Glu Leu Tyr Leu Pro Lys Phe Ser 275 280 285 Ile Glu Gly Ser Tyr Gln Leu Glu Lys Val Leu Pro Ser Leu Gly Ile 290 295 300 Ser Asn Val Phe Thr Ser His Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ser Asn His 305 310 315 320 Ser Asn Ile Gln Val Ser Glu Met Val His Lys Ala Val Val Glu Val 325 330 335 Asp Glu ser Gly Thr Arg Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ile Phe Thr 340 345 350 Gly Arg Ser Ala Arg Leu Asn Ser Gln Arg Leu Val Phe Asn Arg Pro 355 360 365 Phe Leu Met Phe Ile Val Asp Asn Asn Ile Leu Phe Leu Gly Lys Val 370 375 380 Asn Arg Pro 385 <210> 11 <211> 1221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> sig_peptide <222> (1)...(57) <220> <223> Sequence identical to SEQ ID NO:1 except that the nucleotides 745- 747 (AAC) encoding Asn and the nucleotide 1114-1116 (TTC) encoding Phe a re replaced with TCC encoding Ser and GGC encoding Gly, respectively <400> 11 atg cag ctc ttc ctc ctc ttg tgc ctg gtg ctt ctc agc cct cag 45 Met Gln Leu Phe Leu Leu Leu Cys Leu Val Leu Leu Ser Pro Gln -19 -15 -10 -5 ggg gcc tcc ctt cac cgc cac cac ccc cgg gag atg aag aag aga 90 Gly Ala Ser Leu His Arg His His Pro Arg Glu Met Lys Lys Arg -1 1 5 10 gtc gag gac ctc cat gta ggt gcc acg gtg gcc ccc agc agc aga 135 Val Glu Asp Leu His Val Gly Ala Thr Val Ala Pro Ser Ser Arg 15 20 25 agg gac ttt acc ttt gac ctc tac agg gcc ttg gct tcc gct gcc 180 Arg Asp Phe Thr Phe Asp Leu Tyr Arg Ala Leu Ala Ser Ala Ala 30 35 40 ccc agc cag aac atc ttc ttc tcc cct gtg agc atc tcc atg agc 225 Pro Ser Gln Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ser Met Ser 45 50 55 ctg gcc atg ctc tcc ctg ggg gct ggg tcc agc aca aag atg cag 270 Leu Ala Met Leu Ser Leu Gly Ala Gly Ser Ser Thr Lys Met Gln 60 65 70 atc ctg gag ggc ctg ggc ctc aac ctc cag aaa agc tca gag aag 315 Ile Leu Glu Gly Leu Gly Leu Asn Leu Gln Lys Ser Ser Glu Lys 75 80 85 gag ctg cac aga ggc ttt cag cag ctc ctt cag gaa ctc aac cag 360 Glu Leu His Arg Gly Phe Gln Gln Leu Leu Gln Glu Leu Asn Gln 90 95 100 ccc aga gat ggc ttc cag ctg agc ctc ggc aat gcc ctt ttc acc 405 Pro Arg Asp Gly Phe Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Leu Phe Thr 105 110 115 gac ctg gtg gta gac ctg cag gac acc ttc gta agt gcc atg aag 450 Asp Leu Val Val Asp Leu Gln Asp Thr Phe Val Ser Ala Met Lys 120 125 130 acg ctg tac ctg gca gac act ttc ccc acc aac ttt agg gac tct 495 Thr Leu Tyr Leu Ala Asp Thr Phe Pro Thr Asn Phe Arg Asp Ser 135 140 145 gca ggg gcc atg aag cag atc aat gat tat gtg gca aag caa acg 540 Ala Gly Ala Met Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Ala Lys Gln Thr 150 155 160 aag ggc aag att gtg gac ttg ctt aag aac ctc gat agc aat gcg 585 Lys Gly Lys Ile Val Asp Leu Leu Lys Asn Leu Asp Ser Asn Ala 165 170 175 gtc gtg atc atg gtg aat tac atc ttc ttt aaa gct aag tgg gag 630 Val Val Ile Met Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu 180 185 190 aca agc ttc aac cac aaa ggc acc caa gag caa gac ttc tac gtg 675 Thr Ser Phe Asn His Lys Gly Thr Gln Glu Gln Asp Phe Tyr Val 195 200 205 acc tcg gag act gtg gtg cgg gta ccc atg atg agc cgc gag gat 720 Thr Ser Glu Thr Val Val Arg Val Pro Met Met Ser Arg Glu Asp 210 215 220 cag tat cac tac ctc ctg gac cgg tcc ctc tcc tgc agg gtg gtg 765 Gln Tyr His Tyr Leu Leu Asp Arg Ser Leu Ser Cys Arg Val Val 225 230 235 ggg gtc ccc tac caa ggc aat gcc acg gct ttg ttc att ctc ccc 810 Gly Val Pro Tyr Gln Gly Asn Ala Thr Ala Leu Phe Ile Leu Pro 240 245 250 agt gag gga aag atg cag cag gtg gag aat gga ctg agt gag aaa 855 Ser Glu Gly Lys Met Gln Gln Val Glu Asn Gly Leu Ser Glu Lys 255 260 265 acg ctg agg aag tgg ctt aag atg ttc aaa aag agg cag ctc gag 900 Thr Leu Arg Lys Trp Leu Lys Met Phe Lys Lys Arg Gln Leu Glu 270 275 280 ctt tac ctt ccc aaa ttc tcc att gag ggc tcc tat cag ctg gag 945 Leu Tyr Leu Pro Lys Phe Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Gln Leu Glu 285 290 295 aaa gtc ctc ccc agt ctg ggg atc agt aac gtc ttc acc tcc cat 990 Lys Val Leu Pro Ser Leu Gly Ile Ser Asn Val Phe Thr Ser His 300 305 310 gct gat ctg tcc ggc atc agc aac cac tca aat atc cag gtg tct 1035 Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ser Asn His Ser Asn Ile Gln Val Ser 315 320 325 gag atg gtg cac aaa gct gtg gtg gag gtg gac gag tcg gga acc 1080 Glu Met Val His Lys Ala Val Val Glu Val Asp Glu ser Gly Thr 330 335 340 aga gca gcg gca gcc acg ggg aca atc ttc act ggc agg tcg gcc 1125 Arg Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ile Phe Thr Gly Arg Ser Ala 345 350 355 cgc ctg aac tct cag agg cta gtg ttc aac agg ccc ttt ctg atg 1170 Arg Leu Asn Ser Gln Arg Leu Val Phe Asn Arg Pro Phe Leu Met 360 365 370 ttc att gtg gat aac aac atc ctc ttc ctt ggc aaa gtg aac cgc 1215 Phe Ile Val Asp Asn Asn Ile Leu Phe Leu Gly Lys Val Asn Arg 375 380 385 ccc tga 1221 Pro <210> 12 <211> 387 <212> PTN <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence identical to SEQ ID NO:2 except that the original amino a cids 230 (Asn) and 353 (Phe) are replaced with Ser and Gly, respectively <400> 12 His Arg His His Pro Arg Glu Met Lys Lys Arg Val Glu Asp Leu His 1 5 10 15 Val Gly Ala Thr Val Ala Pro Ser Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asp 20 25 30 Leu Tyr Arg Ala Leu Ala Ser Ala Ala Pro Ser Gln Asn Ile Phe Phe 35 40 45 Ser Pro Val Ser Ile Ser Met Ser Leu Ala Met Leu Ser Leu Gly Ala 50 55 60 Gly Ser Ser Thr Lys Met Gln Ile Leu Glu Gly Leu Gly Leu Asn Leu 65 70 75 80 Gln Lys Ser Ser Glu Lys Glu Leu His Arg Gly Phe Gln Gln Leu Leu 85 90 95 Gln Glu Leu Asn Gln Pro Arg Asp Gly Phe Gln Leu Ser Leu Gly Asn 100 105 110 Ala Leu Phe Thr Asp Leu Val Val Asp Leu Gln Asp Thr Phe Val Ser 115 120 125 Ala Met Lys Thr Leu Tyr Leu Ala Asp Thr Phe Pro Thr Asn Phe Arg 130 135 140 Asp Ser Ala Gly Ala Met Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Ala Lys Gln 145 150 155 160 Thr Lys Gly Lys Ile Val Asp Leu Leu Lys Asn Leu Asp Ser Asn Ala 165 170 175 Val Val Ile Met Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp Glu Thr 180 185 190 Ser Phe Asn His Lys Gly Thr Gln Glu Gln Asp Phe Tyr Val Thr Ser 195 200 205 Glu Thr Val Val Arg Val Pro Met Met Ser Arg Glu Asp Gln Tyr His 210 215 220 Tyr Leu Leu Asp Arg Ser Leu Ser Cys Arg Val Val Gly Val Pro Tyr 225 230 235 240 Gln Gly Asn Ala Thr Ala Leu Phe Ile Leu Pro Ser Glu Gly Lys Met 245 250 255 Gln Gln Val Glu Asn Gly Leu Ser Glu Lys Thr Leu Arg Lys Trp Leu 260 265 270 Lys Met Phe Lys Lys Arg Gln Leu Glu Leu Tyr Leu Pro Lys Phe Ser 275 280 285 Ile Glu Gly Ser Tyr Gln Leu Glu Lys Val Leu Pro Ser Leu Gly Ile 290 295 300 Ser Asn Val Phe Thr Ser His Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ser Asn His 305 310 315 320 Ser Asn Ile Gln Val Ser Glu Met Val His Lys Ala Val Val Glu Val 325 330 335 Asp Glu ser Gly Thr Arg Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ile Phe Thr 340 345 350 Gly Arg Ser Ala Arg Leu Asn Ser Gln Arg Leu Val Phe Asn Arg Pro 355 360 365 Phe Leu Met Phe Ile Val Asp Asn Asn Ile Leu Phe Leu Gly Lys Val 370 375 380 Asn Arg Pro 385

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/81 Ａ６１Ｋ 37/64 (72)発明者 高橋 健一 兵庫県神戸市垂水区桃山台１番地16号 Ｊ ＣＲ−ＣＯＵＲＴ310号室 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA19 CA01 CA04 CA11 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 CA53 DC32 NA14 ZA542 ZB112 ZC022 ZC202 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA56 EA20 FA72 FA74

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配
   列を有する野生型ヒトプロテインＣインヒビターのＡｓ
   ｎ型糖鎖結合部位である第２３０位にＡｓｎ型糖鎖が結
   合しないように該野生型ヒトプロテインＣインヒビター
   の第２３０位のアスパラギン残基の属するＡｓｎ型糖鎖
   結合領域のアミノ酸残基を置換し、且つ、第３５３位の
   フェニルアラニンをグリシンに置換してなるアミノ酸配
   列を有することを特徴とする、野生型ヒトプロテインＣ
   インヒビターと比較して強いトロンビン阻害活性及び血
   漿カリクレイン阻害活性を有するが活性型プロテインＣ
   阻害活性は減弱されている、改変型ヒトプロテインＣイ
   ンヒビター。
2. 【請求項２】該Ａｓｎ型糖鎖結合領域のアミノ酸残基の
   置換が、第２３０位のアスパラギン残基の属するＡｓｎ
   型糖鎖結合領域であるアミノ酸配列−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅ
   ｒ−（ここに、Ｘは、Ｌｅｕ又はＨｉｓを表す。）にお
   ける、（１）他のアミノ酸残基によるアスパラギン残基
   の置換、（２）プロリン残基によるＸの置換、及び
   （３）トレオニン以外の他のアミノ酸残基によるセリン
   残基の置換のうち、少なくとも何れかであることを特徴
   とする、請求項１の改変型ヒトプロテインＣインヒビタ
   ー。
3. 【請求項３】該アスパラギン残基の置換が、セリン、グ
   リシン、アスパラギン酸、ロイシン及びプロリンよりな
   る群より選ばれるアミノ酸残基による置換である、請求
   項２の改変型ヒトプロテインＣインヒビター。
4. 【請求項４】該Ａｓｎ型糖鎖結合領域のアミノ酸残基の
   置換が、第２３０位のアスパラギン残基の、セリン、グ
   リシン、アスパラギン酸、ロイシン又はプロリンによる
   置換であることを特徴とする、請求項１の改変型ヒトプ
   ロテインＣインヒビター。
5. 【請求項５】配列表の配列番号１２に示したアミノ酸配
   列を有する改変型ヒトプロテインＣインヒビター。
6. 【請求項６】請求項１ないし５の何れかの改変型ヒトプ
   ロテインＣインヒビターを有効成分として含有する血液
   凝固異常亢進抑制剤。
7. 【請求項７】請求項１ないし５の何れかの改変型ヒトプ
   ロテインＣインヒビターを有効成分として含有する炎症
   反応抑制剤。
8. 【請求項８】該血液凝固異常亢進が播種性血管内凝固に
   おけるものである、請求項６の血液凝固異常亢進抑制
   剤。
9. 【請求項９】該炎症反応が播種性血管内凝固に伴うもの
   である、請求項７の炎症反応抑制剤。
10. 【請求項１０】請求項１ないし５の何れかの改変型ヒト
    プロテインＣインヒビターのアミノ酸配列をコードする
    ＤＮＡ。
11. 【請求項１１】配列表の配列番号２で示されたアミノ酸
    配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡにおいて：
    （１）該アミノ酸配列の第２３０位のアスパラギン残基
    をコードする３塩基に対して、それらが他のアミノ酸残
    基をコードする３塩基となるように塩基の置換をし、且
    つ（２）該アミノ酸配列の第３５３位のフェニルアラニ
    ン残基をコードする３塩基対して、それらがグリシン残
    基をコードする３塩基となるように塩基の置換をするこ
    とにより得ることのできる、改変型ヒトプロテインＣイ
    ンヒビターをコードするＤＮＡ。
12. 【請求項１２】該他のアミノ酸が、セリン、グリシン、
    アスパラギン酸、ロイシン及びプロリンよりなる群より
    選ばれるアミノ酸である、請求項１１のＤＮＡ。
13. 【請求項１３】配列表の配列番号１２に示したアミノ酸
    配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
14. 【請求項１４】配列表の配列番号１１で示された塩基配
    列中第５８〜１２１８位の塩基よりなる塩基配列を有す
    るＤＮＡ。
15. 【請求項１５】配列表の配列番号１１で示された塩基配
    列を有するＤＮＡ。