JP2003514545A - プロテインｃ誘導体 - Google Patents

プロテインｃ誘導体

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JP2003514545A JP2001538951A JP2001538951A JP2003514545A JP 2003514545 A JP2003514545 A JP 2003514545A JP 2001538951 A JP2001538951 A JP 2001538951A JP 2001538951 A JP2001538951 A JP 2001538951A JP 2003514545 A JP2003514545 A JP 2003514545A
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Abstract

(57)【要約】 新規なヒトプロテインｃ誘導体を記載する。これらの誘導体は、野生型プロテインＣと比較して上昇した抗凝固活性を有し、そして野生型ヒトプロテインＣの生物学的活性を保持する。これらの誘導体は、急性冠動脈症候群、血管閉塞障害、凝固性亢進状態、血栓性障害および血栓症にかかりやすい疾患状態の処置において、野生型ヒトプロテインＣよりも頻度の少ない投与および／または少ない投薬量のいずれかを要求する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、新規なポリヌクレオチド、それらによりコードされるポリペプチド
、ならびにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用に関する。よ
り具体的には、本発明は、野生型活性型プロテインＣ、それらの生成物およびこ
れらのヒトプロテインＣ誘導体を含む医薬組成物と比較して上昇した抗凝固活性
を有するヒトプロテインＣ誘導体に関する。
【０００２】 発明の背景 プロテインＣはセリンプロテアーゼであり、これは凝血カスケードにおいて、
第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子を不活化することにより止血の調節に重要な
役割を果たしている天然の抗凝固剤である。ヒトプロテインＣは、４６１アミノ
酸の単独のポリペプチドとしてインビボで作製される。このポリペプチドは、以
下を含む複数の翻訳後修飾を受ける：１）４２アミノ酸シグナル配列の切断；２
）リジンおよびアルギニン残基の切断（１５６位および１５７位）による２鎖型
不活性型前駆体およびチモーゲンの作製（ジスルフィド結合を介して２６２アミ
ノ酸残基の重鎖に結合した１５５アミノ酸残基軽鎖）；３）アミノ末端４５残基
内に位置する９個のグルタミン酸残基（ｇｌａドメイン）のビタミンＫ依存性カ
ルボキシル化；ならびに４）４ヵ所での炭水化物の結合（軽鎖中に１個および重
鎖中に３個）。最終的に、２鎖型チモーゲンは、重鎖のＮ末端でドデカペプチド
の除去により活性化されて、２鎖型チモーゲンよりもより強い酵素活性を有する
活性型プロテインＣ（ａＰＣ）を生じ得る。
【０００３】 血液凝固は、凝固促進（ｐｒｏ−ｃｏａｇｕｌａｎｔ）機構と抗凝固機構との
間のバランスにより調節される非常に複雑なプロセスである。このバランスは、
正常な止血、あるいは、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ；例えば、不安定狭心症、心
筋梗塞）を導く冠状動脈血栓症のような異常な病理的な血栓の生成および進行の
、いずれの状態をも決定する。２個の主な因子（フィブリンの生成、ならびに血
小板の活性化および続いての凝集）がこのバランスを制御しており、両方のプロ
セスは、引き続いての凝血カスケードの活性化を生じる酵素トロンビンの生成に
より制御される。また、トロンビンは、プロテインＣチモーゲンをａＰＣへと活
性化（これは次にトロンビンの生成を阻害する）するので、トロンボモジュリン
（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）に結合した場合に強力な抗凝固剤として機能
する。それゆえ、第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子の阻害を介したトロンビン
生成のフィードバック調節を通じて、おそらくａＰＣは血栓症に対する保護を生
じる血液凝固の最も重要なダウンレギュレーターとして機能している。抗凝固に
加えて、ａＰＣは抗炎症効果を有しており、そして血栓溶解を容易にする繊維素
溶解促進（ｐｒｏｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ）特性を及ぼす。
【０００４】 動脈性血栓症は、内皮損傷（代表的には、脂質豊富プラーク（ｌｉｐｉｄ−ｒ
ｉｃｈ ｐｌａｑｕｅ）の破壊の結果）に反応してＡＣＳ中で生じる。この反応
の初期段階（ｉｎｉｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）は、損傷部位および活性型血小板表
面への血小板接着、活性化および種々の凝固促進因子（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎ
ｔｓ）のアセンブリに関する。トロンビン生成の結果生じる同化作用は、血栓症
の進行に重要な役割を果たす：フィブリン沈着および血小板活性化の両方により
、凝固システムの活性化を強化する。ＡＣＳに対する伝統的な（例えば、非分別
型ヘパリン［ＵＦＨ］）および現行の（例えば、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）
）抗凝固剤療法は、トロンビンおよび／または第Ｘａ因子の阻害に頼るものであ
る（例えば、ヘパリンは、抗トロンビン−ＩＩＩでトロンビンおよび第Ｘａ因子
の相互作用を劇的に刺激することによりそれらを不活化する）。しかしながら、
立体的束縛に起因して、これらの因子は血餅結合型第Ｘａ因子またはトロンビン
の阻害に際しては有効ではない。ａＰＣの血餅接合型Ｘａ／Ｖａ複合体を標的化
し、および不可逆的に不活性化する能力は、局所でのトロンビン生成および血栓
症の進行を減弱させる。従って、トロンビン生成減少の効果はａＰＣ濃度が減衰
した後も持続するので、ａＰＣは、現行のトロンビンまたはＸａのインヒビター
と比較して有利である。
【０００５】 また、止血を制御する場合におけるａＰＣの重要な役割は、異型接合性欠損症
プロテインＣ耐性における増加した血栓症の割合（例えば、共通の第Ｖ因子Ｌｅ
ｉｄｅｎ変異に起因する）ならびに未治療の同型接合性プロテインＣ欠損症の致
命的結末により例示される。血漿由来および組換え的に作製したａＰＣは、静脈
および動脈血栓症の両方の種々の動物モデルにおいて有効かつ安全な抗血栓剤で
あることが示されてきた。
【０００６】 また、以下の疾患および状態ではプロテインＣレベルが異常に低いことが示さ
れている：播種性血管内凝固（ＤＩＣ）［Ｆｏｕｒｒｉｅｒら、Ｃｈｅｓｔ １
０１：８１６−８２３、１９９２］、敗血症［Ｇｅｒｓｏｎら、Ｐｅｄｉａｔｒ
ｉｃｓ ９１：４１８−４２２、１９９３］、重大な外傷／重大な外科手術［Ｔ
ｈｏｍａｓら、Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ．１５８：４９１−４９４、１９８９］、火
傷［Ｌｏら、Ｂｕｒｎｓ ２０：１８６−１８７（１９９４）］、成人型呼吸窮
迫症候群（ＡＲＤＳ）［Ｈａｓｅｇａｗａら、Ｃｈｅｓｔ １０５（１）：２６
８−２７７、１９９４］および移植［Ｇｏｒｄｏｎら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ
Ｔｒａｎｓ．１１：６１−６５（１９９３）］。さらに、以下のように、処置
の際にａＰＣが有用であり得る血栓性異常または合併症を伴う多数の疾患が存在
する：ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）［Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ａｎｎａ
ｌｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２８：４３−４５、１９９４］
、鎌状赤血球病または地中海貧血［Ｋａｒａｙａｌｃｉｎら、Ｔｈｅ Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ
／Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１（３）：３２０−３２３、１９８９］、ウィルス性出
血熱［Ｌａｃｙら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １２：２１−５３、１９９７］、血栓性血小板
減少性紫斑病（ＴＴＰ）および溶血性尿毒症性症候群（ＨＵＳ）［Ｍｏａｋｅ、
Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３４（２）：８３−８９、１
９９７］。さらに、細菌透過率上昇タンパク質（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｅｒｍ
ｅａｂｉｌｉｔｙ Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＰＩ））と組合
わせたａＰＣが敗血症の処置の際に有用であり得る［Ｆｉｓｈｅｒら、Ｃｒｉｔ
．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２２（４）：５５３−５５８、１９９４］。
【０００７】 血小板阻害が血栓性疾患の予防および処置の両方に有効であることは非常によ
く確立されている。しかしながら、抗血小板剤（例えば、アスピリン）の使用は
出血の危険性を上昇させ、これは薬剤の投与量および処置期間を制限する。ａＰ
Ｃおよび抗血小板剤の組合わせは、ａＰＣおよび抗血小板剤の両方の投薬量の減
少を可能にする相乗効果を生じる。次に、併用療法における薬剤の投与量の減少
は、併用抗凝固／抗血小板療法の際にしばしば観察される出血の増加のような副
作用を減少させる。
【０００８】 血漿からプロテインＣを入手するための種々の方法、および組換えＤＮＡ技術
を介してプロテインＣ、ａＰＣおよびプロテインＣ／ａＰＣポリペプチドを作製
するための種々の方法が当該分野において公知であり、記載されている。例えば
、米国特許第４，７７５，６２４号および同第５，３５８，９３２号を参照のこ
と。組換えＤＮＡ技術を介してａＰＣを作製する方法における改善にも拘わらず
、ａＰＣおよびそのポリペプチドを作製することは困難であり、費用がかかる。
それゆえ、ａＰＣの他の生物学的活性（例えば、繊維素溶解および抗炎症活性）
を維持すると同時に上昇した抗凝固活性を示すａＰＣ誘導体は、治療適用のため
に実質的に減少した投薬レベルが必要な、親化合物よりもより強力な効果を有す
る化合物を提供する。
【０００９】 ｇｌａ−ドメインの部位特異的変異誘発によるヒトプロテインＣのカルシウム
および膜結合活性の上昇は、種々の調査により報告されている（例えば、Ｓｈｅ
ｎら（Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３（４７）３１０８６−９１、１９９８
）およびＳｈｅｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６（５１）１６０２５−３
１、１９９７）。継続的な科学実験、分析および調査を通じて、本発明者らはａ
ＰＣ分子のｇｌａドメイン中の特定の部位および修飾標的アミノ酸残基を同定し
た。驚くべきことに、本発明者らは特定の部位特異的な変異誘発を行った場合に
ａＰＣ誘導体の抗凝集活性が上昇することを見出した。特に、配列番号１の１０
位（Ｈｉｓ）、１１位（Ｓｅｒ）および１２位（Ｓｅｒ）のアミノ酸での部位特
異的変異誘発は、単独またはそれらの組合わせで、野生型ａＰＣと比較して上昇
した抗凝固活性を有することを見出した。
【００１０】 従って、本発明は新規なヒトプロテインＣ誘導体を記載する。これらのヒトプ
ロテインＣ誘導体は野生型プロテインＣの重要な生物学的活性を保持し、野生型
ａＰＣよりも実質的に高い抗凝固活性を有する。それゆえ、これらの化合物は種
々の利点、例えば、より少ない頻度での投与、および／またはより少ない投与量
、それによる全体的な作製費用および治療費用の減少を提供する。さらに、これ
らの化合物は、ＡＣＳのような疾患状態において伝統的な抗凝固療法を超える利
点を示す。重要なことは、ヒトプロテインＣ誘導体抗凝固活性の上昇が１〜３個
のアミノ酸置換を介して達成され得るということであり、おそらく、３個以上の
アミノ酸置換を有する分子と比較して免疫原性が少ない（米国特許第５，３５８
，９３２号；Ｈｏｌｌｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１８７６−１８
８０，１９９４）。
【００１１】 発明の要旨 本発明は、配列中、１０、１１又は１２位のアミノ酸の１つ以上がＡｌａ、Ａ
ｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌ
ｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒおよ
びＶａｌから選択されるアミノ酸で置換されている配列番号１および配列番号２
中の対応するアミノ酸を含むヒトプロテインＣ誘導体（ただし、１０位のアミノ
酸はＨｉｓではなく、１１位のアミノ酸はＳｅｒではなく、１２位のアミノ酸は
Ｓｅｒではない）を提供する。本発明はさらに、上記のヒトプロテインＣ誘導体
の活性型を提供する。
【００１２】 また、本発明は、先のパラグラフ中のヒトプロテインＣ誘導体、特に配列番号
１３、１４、１５、１７および１８を含むヒトプロテインＣ誘導体をコードする
組換えＤＮＡ分子を提供する。
【００１３】 本発明の別の局面は、これら同じヒトプロテインＣ誘導体、特に配列番号４、
５、６、８および９を含むヒトプロテインＣ誘導体ならびにこれらのヒトプロテ
インＣ誘導体の活性型のタンパク質配列を提供する。
【００１４】 本発明は、心筋梗塞および不安定狭心症のような急性冠動脈症候群の処置方法
に関する。
【００１５】 本発明はさらに、血栓性障害を処置する方法を含有する。このような障害とし
ては、これらに限定されるわけではないが、卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、血管形成術
またはステント配置に続いての突然の閉塞、あるいは末梢血管外科手術の結果と
しての血栓症が挙げられる。
【００１６】 本発明はさらに、血管閉塞障害および血液凝固亢進障害を処置する方法を包含
し、このような障害としては、これらに限定されるわけではないが、敗血症、播
種性血管内凝固、劇症性紫斑病（ｐｕｒｐｕｒａ ｆｕｌｍｉｎａｎｓ）、重大
な外傷、重大な外科手術、火傷、成人型呼吸窮迫症候群、移植、深在静脈血栓症
、ヘパリン誘発性血小板減少症、鎌状赤血球病、地中海貧血、ウィルス性出血熱
、血栓性血小板減少性紫斑病および溶血性尿毒症性症候群の処置方法が挙げられ
る。
【００１７】 本発明はさらに、配列番号１および配列番号２中の対応するアミノ酸を含むヒ
トプロテインＣ誘導体から選択されるヒトプロテインＣ誘導体（配列式中、１０
位、１１位または１２位のアミノ酸のうち１つ以上が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ
、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ
、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌで置
換されている。ただし、１０位のアミノ酸がＨｉｓではなく、１１位のアミノ酸
はＳｅｒではなく、そして１２位のアミノ酸はＳｅｒではない。）を、薬学的に
有効な量で、その処置を必要とする患者に投与することによる上記の疾患および
状態の処置を提供する。本発明はさらに、上記のヒトプロテインＣ誘導体の活性
型を使用する、これら同じ疾患および状態の処置を提供する。好ましいヒトプロ
テインＣ誘導体としては、Ｓ１２Ｋ、Ｓ１２Ｎ、Ｓ１２Ｈ、Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ
、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２ＫおよびＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎが挙げら
れる。
【００１８】 本発明の別の実施態様は敗血症の処置方法であり、これは本発明のヒトプロテ
インＣ誘導体を、薬学的に有効な量で、細菌透過率上昇タンパク質と組合わせて
、その処置を必要とする患者に投与することを含む。好ましいヒトプロテインＣ
誘導体としては、Ｓ１２Ｋ、Ｓ１２Ｎ、Ｓ１２Ｈ、Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ、Ｈ１０
Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２ＫおよびＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎが挙げられる。
【００１９】 本発明の別の実施態様は、本発明のヒトプロテインＣ誘導体を、薬学的に有効
な量で、抗血小板剤と組合わせて、その処置を必要とする患者に投与することを
含む工程を包含する血栓性障害の処置方法である。好ましいヒトプロテインＣ誘
導体としては、Ｓ１２Ｋ、Ｓ１２Ｎ、Ｓ１２Ｈ、Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ、Ｈ１０Ｑ
：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２ＫおよびＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎが挙げられる。
【００２０】 本発明の別の実施態様は、急性動脈血栓症閉塞、血栓閉栓症あるいは、冠動脈
、大脳もしくは末梢動脈中または血管移植片中の狭窄を処置する方法であり、こ
の方法は、野生型活性型ヒトプロテインＣ誘導体と比較して上昇した抗凝固活性
を有する活性型ヒトプロテインＣ誘導体を、薬学的に有効な量で、血栓症薬剤と
組合わせて、上記の処置を必要とする患者に投与することを含む。好ましいヒト
プロテインＣ誘導体としては、Ｓ１２Ｋ、Ｓ１２Ｎ、Ｓ１２Ｈ、Ｓ１１Ｇ：Ｓ１
２Ｋ、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２ＫおよびＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎが挙
げられる。
【００２１】 本発明のさらに別の実施態様は、遺伝性易罹患性プロトロンビン性障害（ｇｅ
ｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｄ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ
ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を有するヒト患者を処置する方法であり、この方法は、上記
の患者に、野生型活性型ヒトプロテインＣと比較して上昇した抗凝固活性を有す
るプロテインＣ誘導体をコードする組換ＤＮＡ分子を投与する遺伝子治療の工程
を包含する。好ましいヒトプロテインＣ誘導体としては、Ｓ１２Ｋ、Ｓ１２Ｎ、
Ｓ１２Ｈ、Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２ＫおよびＨ１０Ｑ
：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎが挙げられる。
【００２２】 本発明の別の局面は、本明細書中に定義するプロテインＣ欠損症により引き起
こされる、またはそれにより生じる疾患および状態を処置することを含む。本発
明のこの局面は、野生型ａＰＣと比較して上昇した抗凝固活性を生じる任意のａ
ＰＣ分子に対する任意の、および全ての修飾を意図する。
【００２３】 本発明の別の実施態様は、配列番号１の１２位のセリン残基および配列番号２
の対応するアミノ酸のリン酸化が阻害されるプロセスにより生じるヒトプロテイ
ンＣ誘導体である。
【００２４】 本発明はまた、製薬上許容可能なキャリアまたは希釈剤、および本発明のヒト
プロテインＣ誘導体（好ましくは、Ｓ１２Ｋ、Ｓ１２Ｎ、Ｓ１２Ｈ、Ｓ１１Ｇ：
Ｓ１２Ｋ、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２ＫおよびＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎ
から選択される）を含有する組成物を提供する。
【００２５】 新規なヒトプロテインＣ誘導体の製造に係る方法および局面もまた、本発明の
局面である。
【００２６】 また、本発明は、野生型活性型ヒトプロテインＣと比較して上昇した抗凝固活
性を有する凍結乾燥ヒト活性型プロテインＣ誘導体を含むパッケージ材料および
バイアルを含有するヒト医薬用途の製造物品を提供し、ここで該パッケージ材料
は、活性型プロテインＣが約０．０１μｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約５０μｇ／ｋｇ／ｈ
ｒの投与量で連続注入により投与されることを指示するラベルを備えている。
【００２７】 発明の詳細な説明 本明細書中に開示し、特許請求する本発明の目的に照らして、下記の用語を以
下に定義する。
【００２８】 抗血小板剤−血小板の凝固能力を減少させる、１つ以上の薬剤単独またはその
組合わせ。当該分野において理解されるおよび意図される薬剤には、例えば、Ｒ
ｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版、第ＩＩ巻、９２４〜２５頁、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（これは本明細書中に参照することにより組込む）に記
載されているものが挙げられる。そのような薬剤としては、これらに限定される
わけではないが、アスピリン（ＡＳＡ）、クロピドグレル（clopidogrel）、Reo
Pro（登録商標）（アブシキマブ）（abciximab）、ジピリダモール、チクロピジ
ンおよびＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストが挙げられる。
【００２９】 ａＰＣまたは活性型プロテインＣは、組換えａＰＣを意味する。ａＰＣとして
は組換えヒトａＰＣが挙げられ、好ましくはヒトａＰＣである。しかし、ａＰＣ
は、プロテインＣタンパク質分解性、アミド分解性、エステル分解性および生物
学的（抗凝固、抗炎症または繊維素溶解促進）活性を有する他の種をも包含し得
る。
【００３０】 ヒトプロテインＣ誘導体とは、野生型ヒトプロテインＣとは異なるが、活性化
されると本質的な特性（すなわち、タンパク質分解性、アミド分解性、エステル
分解性および生物学的（抗凝固、抗炎症または繊維素溶解促進）活性）を維持し
ている、組換え的に作製された本発明の誘導体を意味する。また、本明細書中で
使用するヒトプロテインＣ誘導体の定義は、上記のヒトプロテインＣ誘導体の活
性型形態を含む。
【００３１】 処置とは、疾患、状態または障害を排除するか、または疾患、状態または障害
の徴候または合併症の発症を予防的に防ぐかのいずれにせよ、疾患、状態または
障害と戦う目的で患者の管理および世話を意味する。
【００３２】 連続注入−特定の期間の間の、溶液または懸濁物の静脈内への連続的な実質的
に中断されない導入。
【００３３】 ボーラス注入−約１２０分までの期間にわたる、規定量（ボーラスと称する）
の薬物の注入。
【００３４】 投与に適した−治療薬剤として投与されるに適している、凍結乾燥製剤または
溶液。
【００３５】 単位投薬形態−ヒト被験体に対し単一の投薬として適した物理的に分離された
単位を意味し、各単位は、所望の治療効果を生じるように計算されている、予め
決定された量の活性物質を、適切な製薬賦形剤と共に含有する。
【００３６】 凝固性亢進状態−播種性血管内凝固、プレトロンビン性状態、凝固活性化、ま
たはａＰＣのような凝固因子の先天性もしくは後天性欠損に関連した過度の凝固
能。
【００３７】 チモーゲン−本明細書中で使用するプロテインＣチモーゲンとは、１本鎖また
は２本鎖にかかわらず、分泌型不活性形態のプロテインＣを意味する。
【００３８】 プロテインＣ欠損症−本明細書中で使用するプロテインＣ欠損症は、先天性ま
たは後天性であり得る。いずれのタイプについても、循環中のプロテインＣレベ
ルは正常範囲の下限未満である。当業者であれば、プロテインＣレベルを決定す
るためのＦＤＡにより認可された装置および診断用キットを用いる標準プロトコ
ルにより、正常範囲が確立されることを認識する。
【００３９】 薬学的に有効な量−治療的に効能のある量の医薬化合物。本発明に従って投与
される、特定の投薬量の化合物は、当然のことながら、かかり付けの医師が症例
を取り巻く特定の環境（投与される化合物、処置される特定の状態、患者の特性
および類似する考慮を含む）を評価することにより決定される。
【００４０】 急性冠動脈症候群−冠動脈プラーク破壊により悪化した冠動脈性アテローム性
動脈硬化症（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）、重複冠動脈血
栓症（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）
、ならびに冠動脈虚血および／または心筋梗塞を生じる危険にさらされた冠動脈
血流（ｊｅｏｐａｒｄｉｚｅｄ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ）の
臨床症状。急性冠動脈症候群のスペクトルとしては、不安定狭心症、Ｑ波なし（
すなわち、ＳＴセグメント上昇なし）の心筋梗塞、およびＱ波（すなわち、ＳＴ
セグメント上昇）ありの心筋梗塞（Ｑ−ｗａｖｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎ
ｆａｒｃｔｉｏｎ）が挙げられる。
【００４１】 血栓性障害−血管内の血餅の形成または存在に関連した、またはその影響を受
ける障害。このような障害としては、これらに限定されるわけではないが、発作
、血管形成術またはステント配置に続く突然の閉塞および末梢血管手術の結果と
しての血栓症が挙げられる。
【００４２】 劇症性紫斑病−斑状出血皮膚病片、発熱、細菌性敗血症、ウィルス性、細菌性
または原性動物性感染に伴う低血圧。播種性血管内凝固が通常存在する。
【００４３】 野生型プロテインＣ−天然または実験室的な、プロテインＣの変異型ポリペプ
チド形態に対し、ヒトの天然の集団において優勢なプロテインＣのタイプ。
【００４４】 遺伝子治療−そこで治療用タンパク質が産生される罹患細胞に対して直接的に
、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを投与することを含む、
治療レジメ。遺伝子送達のための標的組織としては、例えば、骨格筋、血管平滑
筋および肝臓が挙げられる。ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、リ
ポソーム、タンパク質−ＤＮＡ結合体およびアデノウィルスまたはヘルペスウィ
ルスベースのベクターが挙げられる。遺伝子治療は、例えば、Ｋｅｓｓｌｅｒら
、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、９３：１４０８２−８７、１９９６により記載されている
。
【００４５】 細菌透過率上昇（増大性）タンパク質には、天然に存在する、または組換え的
に作製された細菌透過率上昇（ＢＰＩ）タンパク質；天然の、合成のおよび組換
え性の、ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性なポリペプチドフラグメント；ＢＰ
Ｉタンパク質またはそのフラグメントの生物的に活性な改変型アナログ（ハイブ
リッド融合タンパク質およびダイマーを含む）；ＢＰＩタンパク質またはそのフ
ラグメントもしくは改変型（システイン置換アナログを含む）の生物学的に活性
な改変型アナログ；ならびにＢＰＩ由来ペプチドが挙げられる。ヒトＢＰＩの完
全なアミノ酸配列、ならびにＢＰＩをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は、
Ｇｒａｙら、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６４：９５０５により説明
されている。ＢＰＩタンパク質（ＢＰＩのホロプロテイン（ｈｏｌｏｐｒｏｔｅ
ｉｎ）およびＢＰＩのフラグメントを含む）をコードする組換え遺伝子およびそ
の発現方法は、米国特許第５，１９８，５４１号に開示されている（参照するこ
とにより本明細書中に組込む）。
【００４６】 アミノ酸略語は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２（ｄ）（１）（１９９８）に記
載のように米国特許商標庁により受け入れられている。
【００４７】 本発明は、野生型プロテインＣに比較して上昇した抗凝固活性を有するヒトプ
ロテインＣ誘導体（その活性型形態を含む）を提供する。ａＰＣの活性型形態ま
たはヒト活性型プロテインＣ誘導体は、組換えヒトプロテインＣチモーゲンもし
くは組換えヒトプロテインＣ誘導体チモーゲンをインビトロで活性化することに
より、またはプロテインＣの活性型形態の直接分泌により、作製され得る。活性
化を起こす手段は重要ではなく、本発明のプロセスの局面には任意かつすべての
活性化手段が含まれる。ヒトプロテインＣ誘導体は、真核生物細胞中、トランス
ジェニック動物中、またはトランスジェニック植物中で作製され（例えば、ヒト
腎臓２９３細胞またはＡＶ１２細胞からのチモーゲンとしての分泌を含む）、次
いで当業者に公知の技術により精製および活性化される。好ましいヒトプロテイ
ンＣ誘導体としては、Ｓ１２Ｋ、Ｓ１２Ｎ、Ｓ１２Ｈ、Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ、Ｈ
１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ、およびＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎならびにそ
れらの活性型形態が挙げられる。
【００４８】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１２Ｋは、好ましくは、通常１２位に見出されるセ
リン残基ではなくこの位置にリジン残基を含有する；ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ
１２Ｎは、好ましくは、通常１２位に見出されるセリン残基ではなくこの位置に
アスパラギン残基を含有する；そして、ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１２Ｈは、好
ましくは、通常１２位に見出されるセリン残基ではなくこの位置にヒスチジン残
基を含有する。ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１２ＮおよびＳ１２Ｈの活性型形態は
、野生型ａＰＣに比較して上昇した抗凝固活性を示す（図１）。リジンおよびア
スパラギンに加えて１２位での他のアミノ酸置換が、得られた誘導体分子に上昇
した抗凝固活性を与えているかもしれないことは、当業者に明らかである。この
ようなアミノ酸置換の例としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、
Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、
Ｔｈｒ、ＴｙｒおよびＶａｌが挙げられる。
【００４９】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋは、通常１１位に見出されるセリ
ン残基の代わりにグリシン残基を含有し、通常１２位に見出されるセリン残基の
代わりにリジン残基を含有する。グリシンに加えて１１位およびリジンに加えて
１２位での他のアミノ酸置換が、得られた誘導体分子に上昇した抗凝固活性を与
えているかもしれないことは、当業者に明らかである。このようなアミノ酸置換
の例としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈ
ｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒおよ
びＶａｌが挙げられるが、１０位のアミン酸はＨｉｓではなく、１２位のアミノ
酸はＳｅｒではない。
【００５０】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋは、通常１０位に見出
されるヒスチジン残基の代わりにこの位置にグルタミン残基を含有し、通常１１
位に見出されるセリン残基の代わりにこの位置にグリシン残基を含有し、そして
通常１２位に見出されるセリン残基の代わりにこの位置にリジン残基を含有する
。ヒトプロテインＣ誘導体Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋの活性型形態は、野生
型ａＰＣに比較して上昇した抗凝固活性を示す（図２）。グリシンに加えて１０
位、グリシンに加えて１１位、およびリジンに加えて１２位での他のアミノ酸置
換が、得られた誘導体分子に上昇した抗凝固活性を与えているかもしれないこと
は、当業者に明らかである。このようなアミノ酸置換の例としては、Ａｌａ、Ａ
ｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｇ
ｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒおよ
びＶａｌが挙げられるが、ただし、１０位のアミン酸はＨｉｓではなく、１１位
のアミノ酸はＳｅｒではなく、１２位のアミノ酸はＳｅｒではない。
【００５１】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎは、通常１０位に見出
されるヒスチジン残基の代わりにこの位置にグルタミン残基を含有し、通常１１
位に見出されるセリン残基の代わりにこの位置にグリシン残基を含有し、そして
通常１２位に見出されるセリン残基の代わりにこの位置にアスパラギン残基を含
有する。ヒトプロテインＣ誘導体Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎの活性型形態は
、野生型ａＰＣに比較して上昇した抗凝固活性を示す（図２）。グリシンに加え
ての１０位、グリシンに加えての１１位、およびアスパラギンに加えての１２位
での他のアミノ酸置換が、得られた誘導体分子に上昇した抗凝固活性を与えてい
るかもしれないことは、当業者に明らかである。このようなアミノ酸置換の例と
しては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、
Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、
ＴｙｒおよびＶａｌが挙げられるが、ただし、１０位のアミン酸はＨｉｓではな
く、１１位のアミノ酸はＳｅｒではなく、１２位のアミノ酸はＳｅｒではない。
【００５２】 本発明のさらなる実施態様としては、ヒトプロテインＣ誘導体：Ｓ１１Ｇ：Ｓ
１２Ｈ、Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２ＮおよびＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｈならびにその
活性型形態が挙げられ、これらは、野生型活性型プロテインＣに比較して上昇し
た抗凝固活性を有する。
【００５３】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｈは、通常１１位に見出されるセリ
ン残基の代わりにこの位置にグリシン残基を含有し、そして通常１２位に見出さ
れるセリン残基の代わりにこの位置にヒスチジン残基を含有する。ヒトプロテイ
ンＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｈの活性型形態は、野生型ａＰＣに比較して上昇し
た抗凝固活性を示す（図３）。グリシンに加えて１１位、およびヒスチジンに加
えて１２位での他のアミノ酸置換が、得られた誘導体分子に上昇した抗凝固活性
を与えているかもしれないことは、当業者に明らかである。このようなアミノ酸
置換の例としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ
、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＶａｌが挙げられるが、ただし、１０位のアミ
ン酸はＨｉｓではなく、１２位のアミノ酸はＳｅｒではない。
【００５４】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎは、通常１１位に見出されるセリ
ン残基の代わりにこの位置にグリシン残基を含有し、そして通常１２位に見出さ
れるセリン残基の代わりにこの位置にアスパラギン残基を含有する。ヒトプロテ
インＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎの活性型形態は、野生型ａＰＣに比較して上昇
した抗凝固活性を示す（図３）。グリシンに加えて１１位、およびアスパラギン
に加えて１２位での他のアミノ酸置換が、得られた誘導体分子に上昇した抗凝固
活性を与えているかもしれないことは、当業者に明らかである。このようなアミ
ノ酸置換の例としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ
ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐ
ｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、ＴｙｒおよびＶａｌが挙げられる。
【００５５】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｈは、通常１０位に見出
されるヒスチジン残基の代わりにこの位置にグルタミン残基を含有し、通常１１
位に見出されるセリン残基の代わりにこの位置にグリシン残基を含有し、そして
通常１２位に見出されるセリン残基の代わりにこの位置にヒスチジン残基を含有
する。グリシンに加えて１０位、グリシンに加えて１１位、およびヒスチジンに
加えて１２位での他のアミノ酸置換が、得られた誘導体分子に上昇した抗凝固活
性を与えているかもしれないことは、当業者に明らかである。このようなアミノ
酸置換の例としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｈｉ
ｓ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒ
ｏ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌが挙げられるが、ただし、１０位のア
ミン酸はＨｉｓではなく、１１位のアミノ酸はＳｅｒではなく、１２位のアミノ
酸はＳｅｒではない。
【００５６】 さらに、ヒトプロテインＣ誘導体は機能的に等価な遺伝子産物を表すタンパク
質を含み得る。このような等価なヒトプロテインＣ誘導体は、上記のプロテイン
Ｃ誘導体遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列内にアミノ酸残基の欠失、
付加または置換を含みうるが、これらはサイレントな変化を生じるものであり、
それゆえ機能的に等価なヒトプロテインＣ誘導体遺伝子産物を産生する。アミノ
酸置換は、関連する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または
両親媒性の性質における類似性に基づいて作製され得る。
【００５７】 それゆえ、本発明の誘導体としては、配列番号３、４、５、６、７および８と
少なくとも同一であるアミノ酸配列を有する誘導体、あるいは配列番号３、４、
５、６、７および８の対応するフラグメントと少なくとも９０％の同一性を有す
るフラグメントが挙げられる。好ましくは、これらの誘導体は全てヒトａＰＣの
生物学的活性を保持する。好ましい誘導体は、保存的置換（すなわち、ある残基
を類似の特性の別のもので置換すること）により配列番号３、４、５、６、７お
よび８から変化するものである。典型的な置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕおよ
びＩｌｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕ間；Ａ
ｓｎおよびＧｌｎ間；ならびに塩基性残基であるＬｙｓおよびＡｒｇ間；または
芳香族残基であるＰｈｅおよびＴｙｒ間のものである。特に好ましいものは、い
くつかの、５−１０、１−５または１−２個のアミノ酸が、任意の組合わせで置
換され、欠失されまたは付加されている誘導体である。
【００５８】 本発明はまた、ヒトプロテインＣ誘導体の作製に際して使用するために、ＤＮ
Ａ化合物を提供する。これらのＤＮＡ化合物は、ヒトプロテインＣチモーゲンま
たはヒトプロテインＣ誘導体チモーゲンのプレプロペプチド配列に対し、すぐ隣
接して、その下流に、およびその翻訳リーディングフレーム内に位置する、ヒト
プロテインＣチモーゲンまたはヒトプロテインＣ誘導体チモーゲンの軽鎖のコー
ド配列を含む。好ましくは、ＤＮＡ配列は、プロテインＣ分子、活性化ペプチド
およびヒトプロテインＣ誘導体の重鎖の成熟化の間にプロセシングされるＬｙｓ
−Ａｒｇジペプチドをコードする。それゆえ、本発明のヒトプロテインＣ誘導体
は配列番号１（プレプロペプチド配列を含まない）として同定されている野生型
プロテインＣ配列または配列番号２（プレプロペプチド配列を含む）中の対応す
る野生型アミノ酸とは異なる１つ以上のアミノ酸を含有する改変型または変異型
ポリペプチドである。
【００５９】 当業者であれば、遺伝子コードの縮重に起因して、種々のＤＮＡ化合物が上記
の誘導体をコードし得ることを認識する。米国特許第４，７７５，６２４号（こ
の全教示を参照することにより本明細書中に組込む）は、野生型形態のヒトプロ
テインＣ分子を開示する。当業者であれば、ＤＮＡ配列中のどの変化が本明細書
中に開示される正確な誘導体をコードし得るかを容易に決定することができる。
本発明は、開示されている具体的なＤＮＡ配列に限定されるものではない。結果
として、以下に記載する、および好ましいＤＮＡ化合物に関する添付の実施例中
の構築物は単なる例示であり、本発明の範囲を限定しない。
【００６０】 本発明のＤＮＡ化合物は、全て、ヒトプロテインＣチモーゲン内の特定の位置
を変化させるための部位特異的変異誘発を使用して製造した。部位特異的変異誘
発によりヌクレオチド配列を修飾するための技術は、当業者に周知である。例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９
８９）を参照のこと。
【００６１】 ヒトプロテインＣ誘導体は、真核細胞株、トランスジェニック動物またはトラ
ンスジェニック植物を利用する、当該分野において周知の技術により作製するこ
とができる。当業者であれば、適切な宿主真核細胞株には、以下に限定されるわ
けではないが、ＨｅｐＧ２、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＣＨＯ−Ｋ１、２９３またはＡＶ
１２細胞（これらの例は、米国特許第５，６８１，９３２号に記載されており、
これらの文献を参照することにより本明細書中に組込む）が挙げられることを容
易に理解する。さらに、組換えタンパク質のトランスジェニック産物の例は、米
国特許第５，５８９，６０４号および同第５，６５０，５０３号（参照により本
明細書中に組込む）に記載されている。
【００６２】 当業者であれば、種々のベクターが真核生物宿主細胞中での目的のＤＮＡ配列
の発現に有用であることを認識する。哺乳動物細胞中での発現に適してるベクタ
ーとしては、以下に限定されるわけではないが、ｐＧＴ−ｈ、ｐＧＴ−ｄ；ｐＣ
ＤＮＡ３．０、ｐＣＤＮＡ３．１、ｐＣＤＮＡ３．１＋ＺｅｏおよびｐＣＤＮＡ
３．１＋Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ならびにｐＩＲＥＳ／Ｈｙｇｒ
ｏおよびｐＩＲＥＳ／ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）が挙げられる。本発明の好
ましいベクターは、実施例２に記載するｐＩＧ３である。
【００６３】 また、宿主細胞の増殖に関連しているタンパク質配列の発現の調節を可能とす
る他の配列も望ましい。このような調節配列は当業者に公知であり、例としては
、化学的刺激または物理的刺激（調節化合物の存在を含む）に反応してスイッチ
がオンまたはオフになる遺伝子の発現を引き起こすものが挙げられる。また、他
のタイプの調節エレメント（例えば、エンハンサー配列）がベクター中に存在し
得る。
【００６４】 制御配列および他の調節配列が、ベクター（例えば、上記のクローニングベク
ター）への挿入前にコード配列へと連結され得る。あるいは、コード配列は、す
でに制御配列および適切な制限部位を含有する発現ベクターへと直接クローニン
グされ得る。
【００６５】 ある場合には、適切な配向で制御配列へと結合させ得るように（すなわち、適
切なリーディングフレームを維持するため）コード配列を修飾することが必要か
もしれない。
【００６６】 本発明の方法の条件において充分活性かつ作動可能であるために、これらの方
法のいずれかにより作製されるヒトプロテインＣ誘導体は翻訳後修飾（例えば、
９個のγ−カルボキシ−グルタメートの付加、１個のエリスロ−β−ヒドロキシ
−Ａｓｐの付加（β−ヒドロキシル化）、４個のＡｓｎ−結合型オリゴサッカラ
イドの付加（グリコシル化）およびリーダー配列（４２アミノ酸残基）の除去）
を受けなければならない。このような翻訳後修飾がない場合、プロテインＣ誘導
体は十分機能的ではないか、または機能的ではない。
【００６７】 組換えタンパク質（例えば、本発明のヒトプロテインＣ誘導体）の翻訳後修飾
が、組換えタンパク質の発現に関して使用される宿主細胞株に依存して変化し得
ることは、当該分野において公知である。例えば、本発明のヒトプロテインＣ誘
導体の抗凝固活性に関して必須である翻訳後修飾のγ−カルボキシル化は、使用
する宿主細胞株に依存して、プラスミド由来の野生型プロテインＣγカルボキシ
ル化よりも高いか、わずかに低いか、または非常に低くあり得る（Ｙａｎら、Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８（７）：６５５−６６１、１９９０）。γ−カ
ルボキシル化におけるこのような差異は、ヒトプロテインＣ分子内の特定の位置
を変化させる部位特異的変異誘発（これは抗凝固活性の上昇を生じる）の使用に
おける基礎を提供する。
【００６８】 本発明の実施態様は、実施例１に記載するように、１２位のセリン残基のリン
酸化の阻害により上昇した抗凝固活性を有する、上昇した産生レベルおよび上昇
した比活性を有する、正確にγ−カルボキシル化されたプロテインＣおよび／ま
たはプロテインＣである。この、リン酸化の阻害は、１２位のセリン残基を、部
位特異的変異誘発法によりリン酸化可能ではないアミノ酸（すなわち、Ｓｅｒ、
ＴｙｒまたはＴｈｒ以外のアミノ酸）で置換することにより、あるいは宿主細胞
株を増殖させるために用いる組織培養培地中に非毒性のキナーゼインヒビターを
含ませることによって、１２位のセリン残基のリン酸化に係るキナーゼを阻害す
ることにより、達成され得る。特定の細胞型（すなわち、ＣＨＯ−Ｋ１）につい
てはγ−カルボキシル化が制限され、それゆえ、そのような細胞により産生され
る機能的なプロテインＣの量が制限されることが公知である。この、カルボキシ
ル化の欠乏は、１２位のセリン残基のリン酸化に起因するかもしれない。
【００６９】 それゆえ、本発明の別の実施態様は、以下の工程を含む方法により生産される
野生型活性型プロテインＣに比較して上昇した抗凝固活性を有する、上昇した産
生レベルおよび比活性を示すヒトプロテインＣ誘導体である：ヒトプロテインＣ
誘導体をコードする核酸を含有するベクターで宿主細胞を形質転換する工程；こ
の宿主細胞を、配列番号１の１２位のセリン残基および配列番号２の対応するア
ミノ酸のリン酸化が阻害されるヒトプロテインＣ誘導体の発現に適した培地中で
培養する工程；このヒトプロテインＣ誘導体を培養培地から単離する工程；なら
びにこのヒトプロテイン誘導体を活性化する工程。
【００７０】 ヒトプロテインＣおよびヒトプロテインＣ誘導体のチモーゲン形態を、活性型
ヒトプロテインＣおよび活性型ヒトプロテインＣ誘導体へと活性化する方法は昔
からのものであり、当該分野において周知である。ヒトプロテインＣはトロンビ
ン単独、トロンビン／トロンボモジュリン複合体、ＲＶＶ−Ｘ（ラッセルクサリ
ヘビ毒由来のプロテアーゼ）、膵臓由来トリプシンまたは他のタンパク質分解性
酵素により、活性化され得る。
【００７１】 加えて、さらに本発明は、心筋梗塞を含む急性冠動脈症候群および不安定狭心
症の、野生型ａＰＣと比較して上昇した抗凝固活性を有するａＰＣ誘導体での処
置に関する。
【００７２】 また、本発明の組換えヒトプロテインＣ誘導体は、卒中、血管形成術またはス
テント配置に続いての突然の閉塞、あるいは末梢血管外科手術の結果としての血
栓症のような血栓性障害の処置に有用である。
【００７３】 本発明の組換えヒトプロテインＣ誘導体は、敗血症、播種性血管内凝固、重大
な外傷、重大な外科手術、火傷、成人型呼吸窮迫症候群、移植、深在静脈血栓症
、ヘパリン誘発性血小板減少症、鎌状赤血球病、地中海貧血、ウィルス性出血熱
、血栓性血小板減少性紫斑病および溶血性尿毒症性症候群に伴う血管閉塞障害ま
たは凝固性亢進状態の処置に有用である。別の実施態様において、本発明の組換
えヒトプロテインＣ誘導体は、細菌透過率上昇タンパク質と組合わせての敗血症
の処置に有用である。本発明のさらに別の局面において、本発明の活性型ヒトプ
ロテインＣ誘導体は、種々の血栓性障害を処置または予防するための抗血小板剤
と併用される。
【００７４】 本発明の組換えヒトプロテインＣ誘導体は、急性動脈血栓症閉塞、血栓閉栓症
あるいは、冠動脈、大脳もしくは末梢動脈中または血管移植片中の狭窄の処置に
、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼおよび関連する化
合物またはそれらのアナログのような血栓溶解剤と併用して有用である。
【００７５】 本発明のさらなる局面は、本明細書中に定義するように、プロテインＣ欠損症
により引き起こされるまたはそれにより生じる疾患及び状態を処置することを包
含する。本発明のこの局面は、任意のａＰＣ分子に対して野生型ａＰＣと比較し
て上昇した抗凝固活性を生じる任意かつ全ての修飾を意図する。
【００７６】 本発明のさらに別の局面は、本発明のプロテインＣ誘導体をコードする組換え
ＤＮＡ分子での遺伝子治療による、遺伝性易罹患性プロトロンビン性障害（例え
ば、プロテインＣ欠損症および第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ変異）を処置することを含
む。
【００７７】 ヒトプロテインＣ誘導体は、活性薬剤としてａＰＣ誘導体、および製薬上許容
される固体またはキャリアを含有する医薬組成物を調製するための公知の方法に
従って処方され得る。例えば、所望の製剤は、バルク剤（例えば、ショ糖、トレ
ハロースまたはラフィノース）、塩（例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウ
ム）、約５．５〜６．５のｐＨでの緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、Ｔｒ
ｉｓ酢酸またはリン酸ナトリウム）ならびに活性型ヒトプロテインＣ誘導体を含
有する高純度の安定な凍結乾燥製品である。好ましい安定な凍結乾燥製剤は、１
部の活性型ヒトプロテインＣ誘導体、７〜８部の塩ならびに約５〜７部のバルク
剤を、この重量比で含有する。安定な凍結乾燥製剤の例としては、活性型プロテ
インＣ誘導体（５．０ｍｇ／ｍｌ）、スクロース（３０ｍｇ／ｍｌ）、ＮａＣｌ
（３８ｍｇ／ｍｌ）およびクエン酸塩（７．５６ｍｇ／バイアル）、ｐＨ６．０
；ならびに活性型プロテインＣ誘導体（２０ｍｇ／バイアル）、スクロース（１
２０ｍｇ／ｍｌ）、ＮａＣｌ（１５２ｍｇ／バイアル）、クエン酸塩（３０．２
ｍｇ／バイアル）、ｐＨ６．０が挙げられる。
【００７８】 投与されるヒトａＰＣ誘導体の量は、約０．０１μｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約５０μ
ｇ／ｋｇ／ｈｒである。より好ましくは、投与されるヒトａＰＣ誘導体の量は、
約０．１μｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約２５μｇ／ｋｇ／ｈｒである。さらにより好まし
くは、投与されるヒトａＰＣ誘導体の量は約１μｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約１５μｇ／
ｋｇ／ｈｒである。投与されるヒトａＰＣ誘導体の最も好ましい量は、約５μｇ
／ｋｇ／ｈｒまたは約１０μｇ／ｋｇ／ｈｒである。
【００７９】 好ましくは、ヒトａＰＣ誘導体は、１〜２４０時間の間、連続注入として約０
．０１μｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約５０μｇ／ｋｇ／ｈｒの投薬量を注射することによ
り有効な形態での血流中へ確実に送達するために非経口的に投与される。より好
ましくは、ヒトａＰＣ誘導体は、１〜１９６時間の間、連続注入として投与され
る。さらにより好ましくは、ヒトａＰＣ誘導体は１〜１４４時間の間、連続注入
として投与される。さらになおより好ましくは、ａＰＣ誘導体は１〜９６時間の
間、連続注入として投与される。
【００８０】 投与されたａＰＣ量から生じる血漿範囲は、０．０２ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ
／ｍｌ未満である。好ましい血漿範囲は、約０．２ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ
である。最も好ましい血漿範囲は、約２ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌであり、
さらにより好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌである。
【００８１】 あるいは、ヒトａＰＣ誘導体は、ボーラス注射として約５分〜約１２０分の間
にわたり、経時的に１時間当たりに適切な投薬量の一部（１／３〜１／２）を注
射により投与され、続いて２４０時間までの間、適切な投薬量の連続注入により
投与される。
【００８２】 別の代替法において、ヒトａＰＣ誘導体は１〜１０日間の間、０．０１ｍｇ／
ｋｇ／日〜約１．０ｍｇ／ｋｇ／日（Ｂ．Ｉ．Ｄ．）（１日２回）の投与量で投
与される。より好ましくは、ヒトａＰＣ誘導体は３日間の間、Ｂ．Ｉ．Ｄ．で投
与される。
【００８３】 さらに別の代替法では、ヒトａＰＣ誘導体は、よりゆっくりと血流へと確実に
放出するために、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１．０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で
皮下投与される。皮下用調製物のための処方は、このような医薬組成物を調製す
ための公知の方法を使用して行われる。
【００８４】 本発明の別の局面は、野生型ａＰＣと比較して上昇した抗凝固活性を有する凍
結乾燥ヒト活性型プロテインＣ誘導体を含むパッケージ材料およびバイアルを含
有するヒト医薬用途の製造物品であり、ここで該パッケージ材料は、活性型プロ
テインＣが約０．０１μｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約５０μｇ／ｋｇ／ｈｒの投与量で１
〜２４０時間の間、連続注入として投与されることを指示するラベルを備えてい
る。さらに、本発明のこの局面は、ボーラス＋連続注入（Ｂ．Ｉ．Ｄ．）または
皮下注射のような他の投与経路を含む。
【００８５】 本明細書中で使用する語句「〜と組合わせて（〜と併用して）」は、追加の薬
剤をａＰＣと共に、同時に、連続的にまたはこれらを組合わせて投与することを
意味する。追加の薬剤の例としては、抗血小板剤およびＢＰＩタンパク質が挙げ
られる。
【００８６】 本発明に記載のヒトａＰＣ誘導体は、本質的に野生型ヒトａＰＣと同じ型の生
物学的活性を、実質的に上昇した抗凝固活性で有する。それゆえ、これらの化合
物は、より頻度の少ない投与および／またはより少ない投薬量を必要とする。最
終的に、ヒトａＰＣ誘導体抗凝固活性におけるより優れた上昇は１〜３個のアミ
ノ酸置換を介して達成され得、これは、おそらく、３個より多くのアミノ酸置換
を有するａＰＣ誘導体よりも免疫原性が少ない。
【００８７】 以下の実施例は、単に、本発明をさらに例示するために提供されている。本発
明の範囲は、単に以下の実施例から構成されるものと解釈されるべきではない。
【００８８】 実施例１ 部位特異的突然変異に対する特定の標的残基の同定 ゴールデンハムスターＡＶ１２細胞中で発現されるヒトプロテインＣ（ｈＰＣ
）を、ＨＰＬＣ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳおよびＮ−末端配列決定により分析した。ｈ
ＰＣを還元し、アルキル化し、およびＮ−グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシ
ル化するか、またはトリプシンを用いて消化した。還元し、アルキル化し、そし
て脱グリコシル化したサンプルについてのＨＰＬＣ／ＭＳ分析は、重鎖の分子量
がアミノ酸配列から推定される分子量と一致することを示した。しかしながら、
軽鎖の内のほんの約７０％のみが予測分子量を有していた。残りの約３０％は期
待値未満の分子量、３１６ダルトンを有していた。この、減少した分子量の軽鎖
の画分を回収し、トリプシンで処理し、次いでＨＰＬＣ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳおよ
びＮ−末端配列決定により分析した。結果は、軽鎖の１２位のセリン残基がリン
酸化されていることを示し、さらにこの物質が予測されていたγ−カルボキシグ
ルタミン酸残基を全く含有していなかった。このように、リン酸化された１２位
のセリン残基を有する軽鎖を有するｈＰＣは、γ−カルボキシグルタミン酸残基
を欠損しているので、抗凝固活性が低下しているか、または全く活性を有してい
ない。
【００８９】 この知見は、リン酸化不可能な残基でのセリンの置換、ならびに１２位のセリ
ン近傍での配列中の変化は、リン酸化を低下するか妨害し、それゆえ適切にγ−
カルボキシル化されたプロテインＣの量を上昇させることを示唆する。部位特異
的変異誘発を使用して、ヒトプロテインＣ誘導体の抗凝固活性に対する１０位、
１１位および１２位での残基の変化（個別で、および組合わせてでの両方）の効
果を調査した。
【００９０】 アミノ酸残基Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒが容易にリン酸化されることは周知
である。それゆえ、１２位のセリン残基をＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃ
ｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐ
ｈｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐまたはＶａｌで置換することにより、この部位の残基はリ
ン酸化不可能となる。さらに、非毒性のキナーゼインヒビターを組織培養培地に
組み込むことにより、１２位のセリン残基のリン酸化に対するキナーゼ応答能を
阻害して１２位のセリンのリン酸化を防止し、それにより正確にγ−カルボキシ
ル化されたプロテインＣの収率が上昇する。
【００９１】 このように、１０位、１１位または１２位でのアミノ酸残基を変化させるため
の部位特異的変異誘発、または組織培養培地中への非毒性キナーゼインヒビター
の組込みのいずれかにより、１２位のセリン残基のリン酸化が妨害される。次い
で、これは野生型ａＰＣと比較して上昇した抗凝固活性を有する、正確にγ−カ
ルボキシル化されたプロテインＣの収率を上昇させる。
【００９２】 実施例２ プロテインＣ誘導体の構築および産生 標準的な方法にしたがいポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してヒトプロ
テインＣ誘導体を構築した。野生型コード配列の供給源はプラスミドｐＬＰＣで
あった（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１１８９−１１９２、１９８７）
。用いたユニバーサルＰＣＲプライマーとしては、 ＰＣ００１ｂ：
【化１】 ［これはサブクローニングに使用するＸｂａＩ制限部位（下線部）、Ｋｏｚａｋ
コンセンサス配列（小文字）（Ｋｏｚａｋ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０８（
２）：２２９−４１、１９８９）およびプロテインＣのコード領域の５’末端を
コードする］、 ＰＣ００２Ｅ：
【化２】 ［これはヒトプロテインＣのコード領域の３’末端をコードし、サブクローニン
グのためのＢｃｌＩ制限部位（下線部）を含む］ が挙げられる。確立したＰＣＲ方法により、所望の配列変化を含む相補的オリゴ
ヌクレオチドを使用して全ての部位特異的変異誘発を達成した。１回目のＰＣＲ
を使用してプロテインＣ遺伝子の２個のフラグメントを増幅した。ＰＣ００１ｂ
およびアンチセンス変異原性プライマーを使用して５’フラグメントを作製し、
ＰＣ００２ｅおよびセンス変異原性プライマーを使用して３’フラグメントを作
製した。得られた増幅産物を標準的手段により精製した。これらのフラグメント
を合わせ、次いで、プライマー、ＰＣ００１ｂおよびＰＣ００２ｅを用いる２回
目のＰＣＲのための鋳型として使用した。最終的なＰＣＲ産物をＸｂａＩおよび
ＢｃｌＩを用いて消化し、同様に消化した発現ベクターｐＩＧ３にサブクローニ
ングした。野生型構築物を、２個のユニバーサルプライマーおよび鋳型としてプ
ラスミドｐＬＰＣを用いるＰＣＲにより、同様に作製し、続いてｐＩＧ３にサブ
クローニングした。コード鎖および非コード鎖の両方のＤＮＡ配列決定により、
変異を確認した。ｐＩＧ３ベクターは、「内部リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒ
ｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）」（ＩＲＥＳ）（Ｊａｃｋ
ｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４４７−８
３、１９９０）およびグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｏｒｍａｃｋら、
Ｇｅｎｅ １７３：３３−３８、１９９６）遺伝子の哺乳動物発現ベクターであ
るｐＧＴＤ（Ｇｅｒｌｉｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９５（Ｐｔ１）：１３
１−４０、１９９３）への挿入により作製した。目的のｃＤＮＡをｐＩＧ３のマ
ルチクローニングサイトにクローニングすると、ＧＢＭＴプロモータ（Ｂｅｒｇ
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０（２０）：５４８５−６、１９
９２）は２シストロン性ｍＲＮＡ（５’−ｃＤＮＡ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−３’）
の発現を指示する。第１シストロンの効率良い翻訳は、ｍＲＮＡの５’−メチル
化キャップ構造上でのリボソームサブユニットの伝統的なアセンブリにより開始
され、同時に、第２シストロンの通常不充分な翻訳は、ｍＲＮＡに対する内部リ
ボソームアセンブリを可能にするＩＲＥＳ配列により克服される。個別のタンパ
ク質として翻訳された、１つのｍＲＮＡ上でのｃＤＮＡおよびレポーターのカッ
プリングにより、蛍光強度に基づいて最も高い産生クローンに関してスクリーニ
ングすることができる。また、発現ベクターはプラスミドを大腸菌内に維持する
ためのアンピシリン耐性カセット、ならびに哺乳動物の組織発現における選択お
よび増幅目的のための適切な発現配列を有するマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する
。
【００９３】 アデノウィルス形質転換型ゴールデンハムスターＡＶ１２−６６４細胞株を、
１０％ウシ胎仔血清、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、２００μｇ／ｍＬジェネ
テシン（Ｇ４１８）および１０μｇ／ｍＬビタミンＫ１を補充したダルベッコ改
変イーグル培地中で増殖させた。トランスフェクションの１日前に、細胞を約１
０５細胞／２５ｃｍ２の密度でプレーティングした。ＦｓｐＩ線状化プラスミド
を、リン酸カルシウム法（ＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ−Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＦｕＧｅｎｅ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のいずれかを使用して、製造業者の指示にしたがいトラ
ンスフェクトした。トランスフェクションのおよそ４８時間後、培地を、選択の
ために２５０ｎＭメトトレキサートを含有する培地で交換した。薬剤選択を適用
して２〜３週間後にメトトレキサートに対して耐性のコロニーをプールし、増殖
させた。このプールを、ＧＦＰ蛍光強度にもとづいて蛍光標示式細胞分取器に供
し（Ｃｏｒｍａｃｋ、１９９６）、蛍光細胞のうち最も強い５％を保持し、増殖
させた。精製のための材料を入手するために、組換え細胞を、１μｇ／ｍＬヒト
インシュリン、１μｇ／ｍＬヒトトランスフェリンおよび１０μｇ／ｍＬビタミ
ンＫ１を含むダルベッコ改変イーグル培地およびＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（１
：３）の改変型混合物中で増殖させた。順化培地を回収し、最終濃度をベンズア
ミジンを５ｍＭおよびＥＤＴＡを５ｍＭに調節し（ｐＨ８．０）、プロテインＣ
を、上記のようにアニオン交換クロマトグラフィーを介して精製した（Ｙａｎら
、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：６５５−６６１、１９９０）。精製した
タンパク質を、Ｂｕｆｆｅｒ Ａ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）を用いるＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ３０，０００ＮＭＷ
Ｌろ過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で脱塩／濃縮し、標準物質としてウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いるＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイにより定量し
た。
【００９４】 実施例３ 組換えプロテインＣの活性化 プロテインＣおよびプロテインＣ誘導体のチモーゲン形態の完全な活性化は、
トロンビン−セファロースとのインキュベーションにより達成される。トロンビ
ン−セファロースをＢｕｆｆｅｒ Ａで徹底的に洗浄した。パックしたトロンビ
ン−セファロース５０μＬを、プロテインＣ（２５０μｇ）と、同じ緩衝液（１
ｍＬ）中で混合し、３７℃で４時間、攪拌プラットホーム上で穏やかに攪拌しな
がら混合した。インキュベーションの経過の間、トロンビン−セファロースを簡
単にペレット化し、上清の少量のアリコートを色素原性基質であるＳ−２３６６
（ＤｉａＰｈａｒｍａ）を用いるａＰＣ活性についてアッセイすることにより、
プロテインＣ活性化の程度をモニターした。完全な活性化に続いて、トロンビン
−セファロースをペレット化し、上清を回収した。ａＰＣ濃度をＰｉｅｒｃｅＢ
ＣＡアッセイにより変化させ、ａＰＣを直接アッセイするか、または−８０℃で
アリコートで凍結させた。全ての誘導体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりクマシーブ
ルー染色またはウェスタンブロット分析のいずれかを用いて分析して完全な活性
化を確認した（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５、１９
７０）。
【００９５】 実施例４ 機能的な特徴付け 組換えヒトａＰＣ誘導体のアミド分解活性を、トリペプチド基質であるＳ−２
３６６（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド）、Ｓ−２２３８（Ｐｉ
ｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド）およびＳ−２２８８（Ｉｌｅ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド）の加水分解により測定した。抗凝固活性は、
５００ｎｇｍＬ−１ａＰＣでのａＰＴＴ中で測定した凝固時間として示す。アミ
ド分解活性は、色素原性基質であるＳ−２３６６を用いて測定した。
【００９６】 １ｍｇ ｍＬ−１ＢＳＡ、３ｍＭ ＣａＣｌ２および０．５ｎＭ ａＰＣを含
有するＢｕｆｆｅｒ Ａ中２５℃で、アッセイを行った。反応（２００μＬ／ウ
ェル）を９６ウェルマイクロタイタープレート中で行い、アミド分解活性をＴｈ
ｅｒｍｏｍａｘキネティックマイクロタイタープレートリーダーでモニターした
場合の４０５ｎｍでの吸光度（ユニット／分）の変化として測定した。反応動力
学定数は、種々の基質濃度（１６μＭ〜２ｍＭ）での速度データをミカエリス−
メンテンの式に当てはめることにより導き出した。０．５３ｃｍの経路長（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ４−１）、および遊離ｐ−ニトロアニリドの吸光係数
（９６２０Ｍ−１ｃｍ−１）（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ １９：５１４−５２１、１９７０）を用いてＡ４０５での変化を生成
物（ｍｍｏｌ）に変換した。
【００９７】 活性型部分的トロンボプラスチンタイム凝固アッセイ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ
ｐａｒｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ ｃｌｏｔｔｉｎｇ
ａｓｓａｙ）での凝固時間の延長を測定することにより、抗凝固活性を評価し
た（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)。凝固反応はＴｈｅｒｍｏｍａ
ｘキネティックマイクロタイタープレートリーダーでモニターし、これは濁度の
変化におけるＶｍａｘまでの時間を測定する。ｇｌａ−ドメイン変異型ヒトプロ
テインＣ誘導体の相対的な抗凝固活性を表１に示す。値は、野生型ａＰＣと比較
して、ＡＰＴＴ時間を倍化するために必要とされる濃度に基づく。 表１．ｇｌａ−ドメイン変異体の相対的抗凝固活性
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＡＰＴＴアッセイにおける凝固時間の延長を測定することにより
評価した場合の、１変異型ヒトａＰＣ誘導体の抗凝固活性を例示する。エラーバ
ーは３連の実験での標準誤差を示す。データは、野生型プロテインＣ（ＷＴ、三
角）、Ｓ１２Ｎ（丸）およびＳ１２Ｈ（四角）について示す。
【図２】 ＡＰＴＴアッセイにおける凝固時間の延長を測定することにより
評価した場合の、３変異型ヒトａＰＣ誘導体の抗凝固活性を例示する。エラーバ
ーは３連での実験の標準誤差を示す。データは、野生型プロテインＣ（ＷＴ、三
角）、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎ（丸）およびＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２
Ｋ（菱形）について示す。
【図３】 ＡＰＴＴアッセイにおける凝固時間の延長を測定することにより
評価した場合の、２変異型ヒトａＰＣ誘導体の抗凝固活性を例示する。エラーバ
ーは３連の実験での標準誤差を示す。データは、野生型プロテインＣ（ＷＴ、三
角）、Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎ（丸）およびＳ１１Ｇ：Ｓ１２Ｈ（四角）について示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/06 Ａ６１Ｐ 9/10 9/00 11/00 9/10 17/02 11/00 31/04 17/02 31/12 31/04 41/00 31/12 Ｂ６５Ｄ 23/00 Ｈ 41/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｂ６５Ｄ 23/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/50 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ 9/50 Ｂ Ａ６１Ｋ 37/547 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブライアン・ウィリアム・グリネル アメリカ合衆国46220インディアナ州イン ディアナポリス、イースト・71ストリート 3625番 (72)発明者 フアン・リフア アメリカ合衆国46033インディアナ州カー メル、ペンイーグル・ドライブ13138番 (72)発明者 ブライアン・エドワード・ジョーンズ アメリカ合衆国46032インディアナ州カー メル、ビーコン・パーク・ドライブ14772 番 Ｆターム(参考） 3E062 AA09 AB01 AC06 DA02 DA07 4B024 AA01 BA14 CA04 DA03 EA04 GA11 HA01 4B050 CC01 CC04 DD11 LL01 4B065 AA91X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA33 CA44 4C084 AA02 AA07 AA19 BA44 CA18 CA53 DC03 MA02 MA44 MA66 NA14 ZA361 ZA362 ZA511 ZA512 ZA541 ZA542 ZA551 ZA552 ZA591 ZA592 ZA891 ZA892 ZB331 ZB332 ZB351 ZB352 ZC021 ZC022

Claims (76)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列中、１２位のＳｅｒが、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓ
    ｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅ
    ｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、ＴｙｒおよびＶａｌからなる群から選択
    されるアミノ酸で置換されている、配列番号１および配列番号２中の対応するア
    ミノ酸を含むヒトプロテインＣ誘導体。
  2. 【請求項２】 前記誘導体が、野生型活性型ヒトプロテインＣと比較して上
    昇した抗凝固活性を生じる、請求項１に記載のヒトプロテインＣ誘導体をコード
    する組換えＤＮＡ分子。
  3. 【請求項３】 前記ヒトプロテインＣ誘導体が活性型形態である、請求項１
    に記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  4. 【請求項４】 前記１２位のＳｅｒが、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｎで置換
    されている、請求項１に記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  5. 【請求項５】 前記１２位のＳｅｒが、Ｈｉｓで置換されている、請求項４
    に記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  6. 【請求項６】 前記１２位のＳｅｒが、Ｌｙｓで置換されている、請求項４
    に記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  7. 【請求項７】 前記１２位のＳｅｒが、Ａｓｎで置換されている、請求項４
    に記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  8. 【請求項８】 前記誘導体がＳ１２Ｈ（配列番号１１）である、請求項５に
    記載のヒトプロテインＣ誘導体をコードする組換えＤＮＡ分子。
  9. 【請求項９】 前記誘導体がＳ１２Ｋ（配列番号１２）である、請求項６に
    記載のヒトプロテインＣ誘導体をコードする組換えＤＮＡ分子。
  10. 【請求項１０】 前記誘導体がＳ１２Ｎ（配列番号１３）である、請求項７
    に記載のヒトプロテインＣ誘導体をコードする組換えＤＮＡ分子。
  11. 【請求項１１】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１２Ｈ（配列番号３）のタンパ
    ク質配列。
  12. 【請求項１２】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１２Ｋ（配列番号４）のタンパ
    ク質配列。
  13. 【請求項１３】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１２Ｎ（配列番号５）のタンパ
    ク質配列。
  14. 【請求項１４】 配列中、１１位のアミノ酸がＧｌｙで置換されており、１
    ２位のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
    、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ
    、Ｔｈｒ、ＴｙｒおよびＶａｌから選択されるアミノ酸で置換されている、配列
    番号１および配列番号２の対応するアミノ酸を含むヒトプロテインＣ誘導体。
  15. 【請求項１５】 前記誘導体が、野生型活性型ヒトプロテインＣと比較して
    上昇した抗凝固活性を生じる、請求項１４に記載のヒトプロテインＣ誘導体をコ
    ードする組換えＤＮＡ分子。
  16. 【請求項１６】 前記ヒトプロテインＣ誘導体が活性型形態である、請求項
    １４に記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  17. 【請求項１７】 前記１２位のＳｅｒがＨｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｎからな
    る群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項１４に記載のヒトプロテ
    インＣ誘導体。
  18. 【請求項１８】 前記１２位のＳｅｒがＬｙｓで置換されている、請求項１
    ４に記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  19. 【請求項１９】 前記誘導体がＳ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ（配列番号１４）である
    、請求項１８に記載のヒトプロテインＣ誘導体をコードする組換えＤＮＡ分子。
  20. 【請求項２０】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ（配列番号６
    ）のタンパク質配列。
  21. 【請求項２１】 配列中、１０位のアミノ酸がＧｌｎで置換されており、１
    １位のアミノ酸がＧｌｙで置換されており、１２位のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒ
    ｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅ
    ｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、ＴｙｒおよびＶａｌか
    らなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、配列番号１および配列番号
    ２の対応するアミノ酸を含むヒトプロテインＣ誘導体。
  22. 【請求項２２】 前記誘導体が、野生型活性型ヒトプロテインＣと比較して
    上昇した抗凝固活性を生じる、請求項２１に記載のヒトプロテインＣ誘導体をコ
    ードする組換えＤＮＡ分子。
  23. 【請求項２３】 前記ヒトプロテインＣ誘導体が活性型形態である、請求項
    ２１に記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  24. 【請求項２４】 前記１２位のＳｅｒがＨｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｎからな
    る群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項２１に記載のヒトプロテ
    インＣ誘導体。
  25. 【請求項２５】 前記１２位のＳｅｒがＬｙｓで置換されている、請求項２
    １に記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  26. 【請求項２６】 前記１２位のＳｅｒがＡｓｎで置換されている、請求項２
    １に記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  27. 【請求項２７】 前記誘導体がＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ（配列番号１
    ５）である、請求項２５に記載のヒトプロテインＣ誘導体をコードする組換えＤ
    ＮＡ分子。
  28. 【請求項２８】 前記誘導体がＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎ（配列番号１
    ６）である、請求項２６に記載のヒトプロテインＣ誘導体をコードする組換えＤ
    ＮＡ分子。
  29. 【請求項２９】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ（
    配列番号７）のタンパク質配列。
  30. 【請求項３０】 ヒトプロテインＣ誘導体Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎ（
    配列番号８）のタンパク質配列。
  31. 【請求項３１】 請求項８に記載の組換えＤＮＡ分子を含有するベクター。
  32. 【請求項３２】 請求項３１に記載のベクターにより形質転換されている宿
    主細胞。
  33. 【請求項３３】 請求項９に記載の組換えＤＮＡ分子を含有するベクター。
  34. 【請求項３４】 請求項３３に記載のベクターにより形質転換されている宿
    主細胞。
  35. 【請求項３５】 請求項１０に記載の組換えＤＮＡ分子を含有するベクター
    。
  36. 【請求項３６】 請求項３５に記載のベクターにより形質転換されている宿
    主細胞。
  37. 【請求項３７】 請求項１９に記載の組換えＤＮＡ分子を含有するベクター
    。
  38. 【請求項３８】 請求項３７に記載のベクターにより形質転換されている宿
    主細胞。
  39. 【請求項３９】 請求項２７に記載の組換えＤＮＡ分子を含有するベクター
    。
  40. 【請求項４０】 ３９に記載のベクターにより形質転換されている宿主細胞
    。
  41. 【請求項４１】 請求項２８に記載の組換えＤＮＡ分子を含有するベクター
    。
  42. 【請求項４２】 ４１に記載のベクターにより形質転換されている宿主細胞
    。
  43. 【請求項４３】 急性冠動脈症候群および血栓症にかかりやすくする疾患状
    態の処置のための医薬として使用するためのヒト活性型プロテインＣ誘導体。
  44. 【請求項４４】 急性冠動脈症候群および血栓症にかかりやすくする疾患状
    態が心筋梗塞および不安定狭心症からなる群から選択される、請求項４３に記載
    の使用。
  45. 【請求項４５】 血管閉塞障害および凝固性亢進状態の処置のための医薬と
    して使用するためのヒト活性型プロテインＣ誘導体。
  46. 【請求項４６】 血管閉塞障害および凝固性亢進状態が、敗血症、播種性血
    管内凝固、劇症性紫斑病、重大な外傷、重大な外科手術、火傷、成人型呼吸窮迫
    症候群、移植、深在静脈血栓症、ヘパリン誘発性血小板減少症、鎌状赤血球病、
    地中海貧血、ウィルス性出血熱、血栓性血小板減少性紫斑病および溶血性尿毒症
    性症候群からなる群から選択される、請求項４５に記載の使用。
  47. 【請求項４７】 敗血症の処置のための医薬として使用するための、細菌透
    過率増大性タンパク質と組合わせたヒト活性型プロテインＣ誘導体。
  48. 【請求項４８】 血栓性障害の処置のための医薬として使用するための、抗
    血小板剤と組合わせたヒト活性型プロテインＣ誘導体。
  49. 【請求項４９】 プロテインＣ欠損症の処置のための医薬として使用するた
    めのヒト活性型プロテインＣ誘導体。
  50. 【請求項５０】 血栓性障害の処置のための医薬として使用するためのヒト
    活性型プロテインＣ誘導体。
  51. 【請求項５１】 前記血栓性障害が、卒中、血管形成術またはステント配置
    に続いての突然の閉塞、あるいは末梢血管外科手術の結果としての血栓症からな
    る群から選択される、請求項５０に記載の使用。
  52. 【請求項５２】 急性動脈血栓症閉塞、血栓閉栓症あるいは、冠動脈、大脳
    もしくは末梢動脈中または血管移植片中の狭窄の処置のための医薬として使用す
    るための、血栓溶解剤と組合わせてのヒト活性型プロテインＣ誘導体。
  53. 【請求項５３】 遺伝性易罹患性プロトロンビン性障害を有するヒト患者の
    処置のための医薬として使用するための、ヒト活性型プロテインＣ誘導体。
  54. 【請求項５４】 前記遺伝性易罹患性プロトロンビン性障害が、プロテイン
    Ｃ欠損症および第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ変異からなる群から選択される、請求項５
    ３に記載の使用。
  55. 【請求項５５】 前記誘導体が、野生型活性型ヒトプロテインＣと比較して
    上昇した抗凝固活性を有する、請求項４３、４５、４７、４８、４９、５０、５
    ２または５３に記載のヒト活性型プロテインＣ誘導体。
  56. 【請求項５６】 前記ヒト活性型プロテインＣ誘導体が、Ｓ１２Ｈ、Ｓ１２
    Ｋ、Ｓ１２Ｎ、Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２ＫおよびＨ１
    ０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎからなる群から選択される、請求項４３、４５、４７
    、４８、４９、５０、５２または５３に記載の使用。
  57. 【請求項５７】 前記ヒト活性型ヒトプロテインＣ誘導体の量が約０．０１
    μｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約５０μｇ／ｋｇ／ｈｒである、請求項４３、４５、４９ま
    たは５０に記載の使用。
  58. 【請求項５８】 前記ヒト活性型ヒトプロテインＣ誘導体が、約１〜約２４
    ０時間の間、連続注入により投与される、請求項４３、４５、４９または５０に
    記載の使用。
  59. 【請求項５９】 前記ヒト活性型ヒトプロテインＣ誘導体が、ボーラス注射
    、続いての約１〜約２４０時間の間の連続注入として投与される、請求項４３、
    ４５、４９または５０に記載の使用。
  60. 【請求項６０】 野生型活性型ヒトプロテインＣと比較して上昇した抗凝固
    活性を有するヒトプロテインＣ誘導体を、製薬上許容される希釈剤中で含有する
    、医薬組成物。
  61. 【請求項６１】 前記ヒト活性型プロテインＣ誘導体が、Ｓ１２Ｈ、Ｓ１２
    Ｋ、Ｓ１２Ｎ、Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｋ、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２ＫおよびＨ１
    ０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎからなる群から選択される、請求項６０に記載の医薬
    組成物。
  62. 【請求項６２】 前記ヒトプロテインＣ誘導体が活性型である、請求項６０
    に記載の医薬組成物。
  63. 【請求項６３】 配列番号３、４、５、６、７および８から選択されるタン
    パク質配列のアミノ酸に少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質配列をコ
    ードするヒトプロテインＣポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
  64. 【請求項６４】 配列番号３、４、５、６、７および８から選択されるタン
    パク質配列のアミノ酸に少なくとも９０％の同一性を有するヒトプロテインＣ誘
    導体。
  65. 【請求項６５】 前記ヒトプロテインＣ誘導体が活性型である、請求項６４
    に記載のヒトプロテインＣ誘導体。
  66. 【請求項６６】 （ａ）ヒトプロテインＣ誘導体をコードする核酸を含有す
    るベクターで宿主細胞を形質転換すること、 （ｂ）該宿主細胞をヒトプロテインＣ誘導体の発現に適した培地中で培養する
    こと、 （ｃ）該ヒトプロテインＣ誘導体を培養培地から単離すること、ならびに （ｄ）該ヒトプロテイン誘導体を活性化すること、を含む方法により作製され
    る、野生型活性型プロテインＣに比較して上昇した抗凝固活性を有するヒトプロ
    テインＣ誘導体。
  67. 【請求項６７】 前記核酸が、野生型活性型プロテインＣに比較して上昇し
    た抗凝固活性を有するヒトプロテインＣ誘導体をコードしている、請求項６６に
    記載の誘導体。
  68. 【請求項６８】 前記誘導体が、Ｓ１２Ｈ、Ｓ１２Ｋ、Ｓ１２Ｎ、Ｓ１１Ｇ
    ：Ｓ１２Ｋ、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２ＫおよびＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２
    Ｎからなる群から選択される、請求項６６に記載の誘導体。
  69. 【請求項６９】 前記宿主細胞が、２９３細胞およびＡＶ１２細胞からなる
    群から選択される請求項６６に記載の宿主細胞。
  70. 【請求項７０】 （ａ）ヒトプロテインＣ誘導体をコードする核酸を含有す
    るベクターで宿主細胞を形質転換すること、 （ｂ）該宿主細胞をヒトプロテインＣ誘導体の発現に適した培地であって、配
    列番号１の１２位のセリン残基および配列番号２の対応するアミノ酸のリン酸化
    が起こらない培地中で培養すること、 （ｃ）該ヒトプロテインＣ誘導体を培養培地から単離すること、ならびに （ｄ）該ヒトプロテイン誘導体を活性化すること、を含む方法により作製され
    る、野生型活性型プロテインＣに比較して上昇した抗凝固活性を有するヒトプロ
    テインＣ誘導体。
  71. 【請求項７１】 前記誘導体が１２位にＳｅｒ、ＴｙｒまたはＴｈｒを含有
    しない、請求項７０に記載の方法により作製される、ヒトプロテインＣ誘導体。
  72. 【請求項７２】 前記１２位のセリン残基のリン酸化が前記培養培地中に非
    毒性のキナーゼインヒビターを含有させることにより阻害される、請求項７０に
    記載の方法。
  73. 【請求項７３】 前記方法により、ヒトプロテインＣ誘導体の産生レベルお
    よび比活性の上昇がもたらされる請求項７０に記載の方法。
  74. 【請求項７４】 前記核酸が、Ｓ１２Ｈ、Ｓ１２Ｋ、Ｓ１２Ｎ、Ｓ１１Ｇ：
    Ｓ１２Ｋ、Ｈ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２ＫおよびＨ１０Ｑ：Ｓ１１Ｇ：Ｓ１２Ｎ
    からなる群から選択されるヒトプロテインＣ誘導体をコードする、請求項７０に
    記載のベクター。
  75. 【請求項７５】 野生型活性型ヒトプロテインＣと比較して上昇した抗凝固
    活性を有する凍結乾燥ヒト活性型プロテインＣ誘導体を含むパッケージ材料およ
    びバイアルを含有する、ヒト医薬用途のための製造物品。
  76. 【請求項７６】 前記パッケージ材料が、前記活性型プロテインＣが約０．
    ０１μｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約５０μｇ／ｋｇ／ｈｒの投与量での連続注入により投
    与されることを指示するラベルを備えている、請求項７５に記載のヒト医薬用途
    のための製造物品。
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