CZ286016B6 - Derivát lidské bílkoviny C, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje - Google Patents

Derivát lidské bílkoviny C, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje Download PDF

Info

Publication number
CZ286016B6
CZ286016B6 CZ93948A CZ94893A CZ286016B6 CZ 286016 B6 CZ286016 B6 CZ 286016B6 CZ 93948 A CZ93948 A CZ 93948A CZ 94893 A CZ94893 A CZ 94893A CZ 286016 B6 CZ286016 B6 CZ 286016B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
human protein
protein
molecule
residue
replaced
Prior art date
Application number
CZ93948A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ94893A3 (en
Inventor
Bruce Edward Gerlitz
Brian William Grinnell
Original Assignee
Eli Lilly And Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly And Company filed Critical Eli Lilly And Company
Publication of CZ94893A3 publication Critical patent/CZ94893A3/cs
Publication of CZ286016B6 publication Critical patent/CZ286016B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Deriváty lidské bílkoviny C s vysokou účinností a se sníženou závislosti na aktivaci thrombinem se liší od nativních forem lidské bílkoviny C zvýšenou aktivační mírou, funkčními účinnostmi a uhlohydrátovou strukturou. Těchto derivátů se proto může používat jakožto antithrombických činidel, nevykazujících antikoaguační účinnost s výjimkou přítomnosti výrazné generace thrombinu.ŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká derivátu lidské bílkoviny C, voleného ze souboru zahrnujícího tři deriváty lidské bílkoviny C, kde asparaginový zbytek v poloze 313 a alespoň ještě jeden jiný zbytek molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen zbytkem specifikovaným dále. Vynález se především týká oblasti lidské medicíny, zvláště ošetřování poruch koagulace krve.
Dosavadní stav techniky
Nativní lidská bílkovina C, jejíž aminokyselinová sekvence je na obr. 1, je na vitaminu K závislá bílkovina plazmy, která cirkuluje hlavně jakožto neaktivní disulfidicky vázaný heterodimer, sestávající z lehkého řetězce přibližně o molekulové hmotnosti 25 000 a z těžkého řetězce o molekulové hmotnosti přibližně 41 000. Těžký řetězec obsahuje serinovou proteázovou oblast s jejím N-koncovým aktivačním peptidem, zatím co lehký řetězec obsahuje oblast zbytků τkarboxyglutamové kyseliny, kterých je zapotřebí pro membránovou vazbu závislou na vápníku a pro funkční aktivitu. Nereaktivní lidský bílkovinový C zymogen se převádí na aktivovanou bílkovinu C působením komplexu thrombin/thrombomodulin, který štěpí aktivační peptid (zbytky 158 až 169 cirkulujícího zymogenu nebo zbytky 200 až 211 preprozymogenu) k vytvoření aktivované bílkoviny C.
Úloha bílkoviny C jakožto terapeutického činidla je dobře známá například US patentového spisu číslo 4 775 624 (Bang a kol.), kde se popisuje způsob přípravy aktivované lidské bílkoviny C.
Nativní lidskou bílkovinu C blíže objasňuje obr. 1, kde ♦ = glykosylační místa, * = katalytická triáda, β = β-hydroxyasparagová kyselina, δ = τ-karboxyglutamová kyselina, sekvence 156-157 odstraněná při procesu, T20 (aktivační peptid) se odstraní k převedení hPC zymogenu na aktivovaný enzym (aPC).
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je derivát lidské bílkoviny C, volený ze souboru zahrnujícího derivát lidské bílkoviny C, ve kterém asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem, derivát lidské bílkoviny C, ve kterém zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen fenylalaninem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen asparaginovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem a derivát lidské bílkoviny C, ve kterém zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen fenylalaninem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen asparaginovým zbytkem, asparaginový zbytek
-1 CZ 286016 B6 v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
Tyto deriváty lidské bílkoviny C se mnohem snadněji aktivují thrombinem a jsou také funkčně účinnější ve srovnání s molekulou divokého typu lidské bílkoviny C podle obr. 1 nebo ve srovnání s jinými deriváty lidské bílkoviny C.
Vynález rovněž souvisí s deriváty rekombinantními DNA konstrukcemi, vektory a transformanty užitečnými při produkci nových derivátů lidské bílkoviny C. Vynález se také týká farmaceutických prostředků obsahujících účinné množství derivátů lidské bílkoviny C podle vynálezu spolu s alespoň jedním farmaceuticky vhodným excipientem, které jsou vhodné pro ošetřování a prevenci chorobných stavů.
Pro účely vynálezu se zde používá následujících zkratek:
Q313 - derivát lidské bílkoviny C, kde je asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen glutaminovým zbytkem.
Q329 - derivát lidské bílkoviny C, kde je asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen glutaminovým zbytkem.
Deriváty bílkoviny C Q313 aQ329jsou popsány v evropské přihlášce vynálezu číslo EP-A0 443 874 (Gerlitz a kol.) a v časopise J. Biol. Chem., 1991, 226, str. 9778 až 9785 (Grinnell a kol.).
Q3Q9-derivát lidské bílkoviny C, kde je asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen glutaminovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
F167 - deriváty lidské bílkoviny C, kde je zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen fenylalaninem.
Derivát bílkoviny F167je popsán v evropské přihlášce vynálezu číslo EP-A-0 323 149(Bang a kol.) a v časopise 1990, EMBO J. str. 2367 až 2373 (Ehrlich a kol.).
LIN - derivát lidské bílkoviny C, kde je zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen asparaginovým zbytkem.
FLIN-derivát lidské bílkoviny C, kde je zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen fenylalaninovým zbytkem asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen asparaginovým zbytkem.
Derivát bílkoviny C LIN a FLIN jsou popsány v evropské přihlášce vynálezu číslo EP-A0 443 875 (Grinnell a kol.) a v publikaci Protein C and Related Anticoagulants (Bílkovina C a příbuzné antikoagulanty) (vyd. Bruley, D. & Drohan, W.) str. 13 až 46 (Gulf Publishing Co., Houston, 1990).
FLIN-Q313-derivát lidské bílkoviny C, kde je zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen fenylalaninovým zbytkem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen asparaginovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
-2CZ 286016 B6
FLIN-Q3Q9 - derivát lidské bílkoviny C, kde je zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen fenylalaninovým zbytkem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C nahrazen asparaginovým zbytkem, asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
GBMT transkripční jednotka - modifikovaná transkripční řídicí jednotka obsahující zesilovač transkripce P2 BK viru umístěného těsně ve směru regulátorového prvku adenoviru většího pozdního promotoru (MLTF) adenoviru-2 většího pozdního promotoru, póly GT prvku umístěného ke stimulaci tohoto promotoru a DNA sekvence obsahují střihovou tripartitní vedoucí sekvenci adenoviru.
Nascentní bílkovina - polypeptid produkovaný po translaci mRNA transkriptů před jakýmkoliv posttranslačními modifikacemi. Avšak posttranslační modifikace jako je gama-karboxylace zbytků kyseliny glutamové a hydroxylace zbytků kyseliny asparagové se mohou začít vyskytovat dříve než dojde k plné translaci bílkoviny z mRNA transkriptů.
Aktivita bílkoviny C-jakákoliv vlastnost lidské bílkoviny C zodpovědná za proteolytickou, aminolytickou, esterolytickou a biologickou (antikoagulační nebo profíbrinolytickou) účinnost. Způsoby zkoušení antikoagulačního působení bílkoviny jsou v oboru dobře známy a jsou popsány například v časopise 1987, Bio/Technology, 5, str. 1189 až 1192 (Grinnell a kol).
Zymogen - enzymaticky účinný prekurzor proteolytického enzymu. Výrazem bílkovinový C zymogen se zde míní skrytá, neaktivní forma buď jednoho nebo dvou řetězců bílkoviny C.
Všechny používané zkratky pro aminokyseliny jsou schváleny organizací United States Patent and Trademark Office podle ustanovení 37 C.F.R. § 1.822 (b) (2) (1990).
Vynález se týká derivátů lidské bílkoviny C, které mají obměněný glykosylační obrazec a které mají obměněné oblasti účinnosti. Obzvláště tyto deriváty zahrnují Q3Q9, FLIN-Q313 aFLINQ3Q9. Derivát Q3Q9 obsahuje glutaminové zbytky v polohách 313 a 329 molekuly bílkoviny C (místo asparaginových zbytků, které jsou normálně v těchto polohách). Derivát FLINQ313 obsahuje fenylalaninový zbytek v poloze 167 molekuly bílkoviny C a asparaginový zbytek v poloze 172 molekuly bílkoviny C (místo zbytků kyseliny asparagové, které jsou normálně v těchto polohách) a glutaminový zbytek v poloze 313 (místo asparaginového zbytku, který je normálně v této poloze). V derivátu FLIN-Q3Q9 je v poloze 167 kyselina asparagová vyměněna za fenylalanin, zbytek v poloze 172 je zaměněn z kyseliny asparagové na asparagin, zbytek v poloze 313 je zaměněn zasparaginu na glutasmin a zbytek v poloze 329 je zaměněn z asparaginu na glutamin.
Deriváty FLIN-Q313 a FLIN-Q3Q9 vykazují mimořádně vysoký stupeň aktivace samotným thrombinem. Kromě toho oba tyto deriváty FLIN-Q313 a FLIN-Q3Q9 mohou být na rozdíl od divokého typu lidské bílkoviny C aktivovány thrombinem generovaným ve srážející se lidské plazmě, což vede k inhibici dalšího vytváření shluků. Tento srážení aktivující proenzym má podstatně vyšší specifickou účinnost a delší poločas než aktivovaná forma přírodní bílkoviny C. Těchto derivátů podle vynálezu se proto může používat jakožto místně aktivovaných antithrombických činidel, nevykazujících antikoagulační účinnost a výjimkou přítomnosti výrazné generace thrombinu.
Vynález se rovněž týká DNA sloučenin, použitelných pro přípravu derivátů bílkoviny C. Tyto DNA sloučeniny obsahují kódující sekvenci pro lehlý řetězec lidské bílkoviny C, umístěný bezprostředně vedle ve směru a v translačním čtecím rámci s prepropeptidovou sekvencí
-3CZ 286016 B6 divokého typu zymogenu bílkoviny C. DNA sekvence zakódovává Lys-Arg dipeptid, který se zpracovává v průběhu zrání molekuly bílkoviny C, aktivace peptidu a těžkého řetězce molekuly bílkoviny C. Změny aminokyselinových zbytků v polohách 167, 172 a 313 mění aktivaci molekuly zatímco změny v aminokyselinových zbytcích v polohách 313 a 329 mění uhlohydrátový obsah molekuly.
Pracovníkům v oboru je zřejmé, že v důsledku degenerace genetického kódu mohou varianty DNA sloučeniny zakódovávat shora popsané polypeptidy. V americkém patentovém spise číslo 4 775 624 (Bang a kol.) se popisuje v DNA sekvence kódující divoký typ formy molekuly lidské bílkoviny C. Pracovník v oboru může tedy snadno stanovit, kterých obměn DNA sekvence se může použít pro konstrukci jiných DNA sekvencí, které mohou zakódovávat přesné polypeptidy, jak zde uvedeno, přičemž však vynález není omezen na specifické DNA sekvence. Proto dále popsané konstrukce a v příkladech doložené výhodné DNA sloučeniny, vektory a transformanty vynález toliko blíže objasňují avšak nijak jeho rozsah neomezují. Kromě toho substituce GLn místo Asn v polohách 313 a 329 je ilustrativní a neomezuje rozsah vynálezu jako jiné substituce, kterých se může použít s výjimkou Cys nebo Pro.
Všechny DNA sloučeniny podle vynálezu se připravují místně řízenou mutagenezí genu lidské bílkoviny C. Mutované zymogenové kódující molekuly se pak včleňují do eukaryotických expresních vektorů, takže exprese zymogenových genů může probíhat působením transkripční jednotky GBMT. Tyto vektory se transformují do Escherichia coli K12 AG1 buněk a ukládají se a jsou trvalou zásobní kulturou sbírky organizace Northem Regional Research Laboratories vPeoria, Illinois 61604 od 14. Ledna 1992. Specifické kultury a jejich identifikační čísla jsou v tabulce I.
Tabulka I
Kultura
Identifikační číslo
E. coli K12 AGl/pGT-h-Q3Q9
E. coli K12 AGl/pGT-h-FLIN-Q313
E. coli K12 AGl/pGT-h-FLIN-Q3Q9
NRRLB-18938
NRRLB-18939
NRRLB-18940
Kultury se získají a plazmidy se izolují o sobě známými způsoby a pak se mohou přímo převádět do eukaryotických hostujících buněk pro produkci derivátů lidské bílkoviny C. Je výhodné převádět plazmidy do hostujících buněk, které vykazují expresi adenoviru El A bezprostředně před genovým produktem, takže zesilovač BK, zjištěný v GBMT transkripční řídicí jednotce, podporuje expresi účinněji v přítomnosti E1A. GBMT transkripční řídicí jednotka je úplněji popsána v evropské přihlášce vynálezu číslo 91301451.0 (Berg a kol.). Pracovníkům v oboru je jasné, že četné hostující buňky vykazují expresi nebo mohou vykazovat expresi bezprostředně dřívějšího genového produktu velkého DNA viru. Nejvýhodnější buněčnou řadou („cell line“) pro expresi derivátů lidské bílkoviny C podle vynálezu je buněčná řada 293 lidské ledviny, která je popsána v americkém patentovém spise číslo 4 992373 (Bang a kol.). Po expresi v buněčné řadě se deriváty čistí od buněčné kultury supematantu za použití způsobu popsaného v americkém patentovém spise číslo 4 981952 (Yan).
DNA sekvence podle vynálezu se mohou syntetizovat chemicky nebo kombinací restrikčních fragmentů nebo kombinací o sobě známých způsobů v tomto oboru. DNA syntetizující zařízení jsou dostupná a může se jich používat ke konstruování DNA sloučenin podle vynálezu.
Ilustrativní vektory podle vynálezu zahrnují GBMT transkripční jednotku umístěnou k stimulaci transkripce kódujících sekvencí adenovirovým pozdním promotorem. Pracovníkům v oboru je jasné, že v oboru je znám velký počet eukariotických promotorů, zesilovačů a expresních vektorů
-4CZ 286016 B6 a že se jich může použít k expresi DNA sekvencí pro produkci derivátů bílkoviny C podle vynálezu. Pracovníkům v oboru je rovněž známo, že eukaryotický expresní vektor může fungovat bez zesilovacího prvku. Klíčové hledisko podle vynálezu není založeno na určitém zesilovači nebo promotoru, použitém k expresi derivátů, ale spíše na nových DNA sekvencích a odpovídajících bílkovinách pocházejících z takových sekvencí.
Vektory podle vynálezu se mohou transformovat do nejrůznějších eukaryotických, zvláště savčích hostujících buněk a mohou vykazovat expresi v takových buňkách. Všechny tyto vektory, uložené v NRRL, obsahují gen nesoucí hygromycinovou odolnost. Avšak vektory, které neobsahují žádný selektovatelný signální znak, se mohou snadno konstruovat a může se jich používat k provádění dočasných zkoušek nebo se mohou kontratransformovat do buněčných řad spolu šjinými vektory, které obsahují selektovatelné signální znaky. Tyto vektory podle vynálezu mohou zahrnovat sekvence, které umožňují replikaci E. coli, jelikož je zpravidla mnohem účinnější příprava plazmidů DNA v E. coli než v jiných hostujících organismech.
Jsou možné četné modifikace a variace ilustrativních DNA sekvencí a plazmidů. Například degenerace genetického kódu bere v úvahu substituci neukleotidů polypeptidovými kódujícími oblastmi, jakož také v translačním terminačním signálu bez změny zakódované polypeptidové kódující sekvence. Takové subtituovatelné sekvence se mohou odvozovat od známé aminokyseliny nebo DNA sekvence lidské bílkoviny C a mohou se konstruovat běžnými syntetickými postupy nebo běžnou místně řízenou mutagenezí. Syntetické postupy se mohou provádět v podstatě způsobem, který popsal Itakura a kol., 1977, Science 198, str. 1056 a Crea a kol., 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 75, str. 5765. Proto se vynález nijak neomezuje na DNA sekvence a plazmidy specificky doložené v příkladové části.
Způsoby aktivace zymogenových forem lidské bílkoviny C na aktivované deriváty lidské bílkoviny C jsou již dávno dobře známy. Bílkovina C se může aktivovat samotným thrombinem, komplexem throbin/thrombomodulin, Russell Viperovým jedem nebo nejrůznějšími jinými prostředky. Aktivita derivátů lidské bílkoviny se může měřit podle thrombinové aktivace buď totálními amidolytickými zkouškami, nebo antikoagulačními zkouškami. Aktivace thrombinu a zkoušky bílkoviny C (amidolytické a antikoagulační) se provádějí způsobem, který popsal Grinnell a kol., 1987 Bio/Technology 5, str. 1187 až 1192.
Rekombinantní deriváty lidské bílkoviny C podle vynálezu jsou užitečné pro prevenci a ošetřování nejrůznějších chorobných stavů zahrnujících intravaskulámí koagulaci včetně trombózy hloubkových žil, pulmonámího embolismu, periferální arteriální trombózy, embolie pocházející od srdečních nebo periferálních arterií, akutní mykardiální infarkce, thrombotických potíží, nestabilní angíny, periferální vaskulámí chirurgie, transplantace orgánů a rozptýlené intravaskulámí koagulace. Tyto deriváty bílkoviny C se také mohou účinně používat při ošetření značného počtu nemocných s heterozygosní nedostatečností bílkoviny C znamenající opakující se trombózu hloubkových žil a případů nemocných sdeficiencí homozygosní bílkoviny C s purpura fulminans. Ještě další terapeutickou indikací aktivovaných derivátů bílkoviny C je prevence trombózy hloubkových žil a pulmonámího embolismu běžně ošetřovaného nízkými dávkami heparinu.
Deriváty a aktivované protějšky podle vynálezu se formulují o sobě známými způsoby pro přípravu farmaceutických prostředků, přičemž se derivát lidské bílkoviny C nebo aktivovaný derivát lidské bílkoviny C podle vynálezu zpracovává ve směsi s farmaceuticky vhodným nosičovým pojidlem. Vhodná nosičová pojidla a jejich formulace včetně jiných lidských bílkovin, například lidského serumalbuminu, jsou popsány například v publikaci Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, 1980, Mack Publishing Co., Osol a kol. Takové prostředky mají obsahovat účinné množství derivátu bílkoviny C nebo aktivovaného protějšku spolu se vhodným množstvím pojivového nosiče pro přípravu farmaceuticky vhodných prostředků pro
-5CZ 286016 B6 účinné podání ošetřovanému jedinci. Prostředky s derivátem bílkoviny C se mohou podávat parenterálně nebo jinými způsoby k zajištění uvolňování do krevního oběhu v účinné formě.
Následující příklady praktického provedení vynález toliko objasňují, nijak ho však neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Produkce derivátů lidské bílkoviny C
Expresní vektory podle vynálezu se izolují z buněk E. coli, pak se transformují na 293 buňky, transformanty se selektují při teplotě 37 °C, kultivují se pro získání derivátů lidské bílkoviny C způsobem podle amerického patentového spisu číslo 4 992373 (Bang a kol.). Deriváty se čištěním oddělí od supematantové buněčné kultury způsobem podle amerického patentového spisu číslo 4 981952 (Yan).
Příklad 2
Antikoagulační účinnost
Plně aktivovaná bílkovina C se získá působením aktivačního materiálu s 10 nM thrombinu v komplexu s rozpustným rekombinantním lidským thrombomodulinem TMD-75, jak popisuje Parkinson a kol., 1990, J. Biol. Chem. 265, str. 12602 až 12610. Antikoagulační účinnost aktivovaných molekul se měří aktivovanou parciální thromboplastinovou zkouškou doby srážení. Výsledky jsou uvedeny v tabulce II.
Tabulka II
Bílkovina C divoký typ
Q313
LIN
F167
FLIN
FLIN-Q313
Antikoagulační účinnost (jednotka/mg)
325 +/- 65
577+/- 17
289+/- 13
283 +/ - 27
313+/-65
552+/-37
Relativní účinnost
1,0
1,8
0,9
0,9
1,0
1,7
Příklad 3
Rychlosti aktivace
Rychlosti aktivace se stanoví za použití lidského thrombinu (10 nM) v reakční směsi obsahující 20 mM Tris, hodnota pH 7,4,0,15 M chloridu sodného, 0,1 mg/ml BSA a 3 mM chloridu vápenatého. Čištěná bílkovina jak divoký typ tak deriváty je v aktivační reakci v koncentraci 0,81 až 1,61 μΜ. Aktivační rychlosti se stanoví odebíráním podílů z aktivační reakční směsi v různé době do destičky s 96 důlky a přidáním chromogenního substrátu (S-2366) do konečné
-6CZ 286016 B6 koncentrace 0,75 mM, přičemž se měří amidolytická účinnost jakožto změna absorbančních jednotek za minutu při 405 nM v ThermoMax kinetickém mikrotitrovém destičkovém odečítači (Molecular Devices). Rychlosti se stanovují převedením změny v OD/min na množství generované aktivované bílkoviny C za použití specifických aktivit, stanovených pro každou bílkovinu a vynesením proti aktivační době. Množství aktivované bílkoviny C bylo menší než 10 % celkové výchozí látky ve všech zkouškách. Výsledky jsou uvedeny v tabulce III.
Tabulka III
Bílkovina C Míra aktivace thrombinem (ng/min) Relativní rychlost aktivace
divoký typ 0,53+/-0,1 1,0
Q329 0,23a 0,4
Q313 1,10+/-0,2 2,0
Q3Q9 l,62a 3,3
LIN 2,20+/-0,4 4,0
F167 6,30+/-1,0 12,0
FLIN 15,90+/-4,0 30,0
FLIN-Q313 32,30 +/ - 6,4 61,0
FLIN-Q3Q9 45,00a 84,0
a rychlostí bez směrodatné odchylky jsou ze studií, kde n = 2
Relativní rychlosti aktivace se rovněž stanoví stejným systémem zkoušek za použití thrombinu a thrombomodulinu. Thrombomodulinovou použitou molekulou je rozpustný lidský thrombomodulin podle Parkinsona a kol. (jak shora uvedeno). Výsledky jsou uvedeny v tabulce IV.
Tabulka IV
Bílkovina C Relativní rychlosti aktivace thrombinem a thrombomodulinem
divoký typ
Q313
LIN
F167
FLIN
FLIN-Q313 la
2,6 +/ - 0,6
2,1 +/-0,2
3,5+/-0,8 2,7a
9,2+/-1,0 a rychlosti bez směrodatné odchylky jsou ze studií, kde n = 2
Příklad 4
Antikoagulační účinnost při srážení lidské plazmy
Divoký typ lidské bílkoviny C a derivát FLIN-Q313 se vnese do lidské plazmy v koncentraci 20 nM spolu s Helena standardním APTT činidlem a inkubující se po dobu 5 minut při teplotě 37 °C. Srážení plazmy se iniciuje přidáním chloridu vápenatého do konečné koncentrace 8 mM a měří se doba srážení. V současně prováděných pokusech se přidá monoclonální protilátka
-7CZ 286016 B6 schopná neutralizovat účinnost aktivované bílkoviny C do kontrolní plazmy a plazmy obsahující zymogenový divoký typ bílkoviny C nebo FLIN-Q313. Výsledky jsou uvedeny v tabulce V.
Tabulka V
Bílkovina C žádná (kontrolní) divoký typ FLIN-Q313
Doba srážení (sekundy) +Ab -Ab
30+/-4
36+/-4
36+/-4
32+/-3
33+/-5
75+/-5
Míra srážení, navozená ve srážející se plazmě, se stanovuje jakožto funkce koncentrace divokého typu lidské bílkoviny C a derivátu FLIN-Q313 a hodnoty se vyjadřují jakožto prodloužená doba srážení. Základní doba srážení při zkoušce je 27 až 33 sekund. Výsledky jsou uvedeny v tabulce VI.
Tabulka VI
Prodloužení doby srážení (sekundy)
Bílkovina C
Dávka (nM)
divoký typ 8 0+/-3
FLIN-Q313 8 20+/-6
divoký typ 16 0+/-5
FLIN-Q313 16 37+/-6
divoký typ 32 0+/-5
FLIN-Q313 32 77+/-6
divoký typ 64 0+/ -5
FLIN-Q313 64 235 +/- 6
Příklad 5
Stanovení reaktivního poločasu
Inhibice lidské bílkoviny C v plazmě se stanovuje inkubací normální lidské plazmy (citrátované) 100 nM aktivované lidské bílkoviny C, aktivovaného FLIN-Q313 nebo zymogenového (neaktivovaného) FLIN-Q313. Koncentrace plazmy je 90% (objem/objem) v konečné reakční směsi se zbývajícím objemem sestávajícím z pufru obsahujícího 3 mM chloridu vápenatého, 150 mM chloridu sodného, 20 mM Tris, hodnota pH 7,4 a 1 mg/ml BSA. Ve vybraných intervalech se odebírají podíly a stanovuje se aktivita aktivované bílkoviny C podle amidolytické účinnosti za použití s-2366 v konečné koncentraci 1 mM nebo podle aktivované parciální thromboplastinové doby. Míra sraženinou aktivované účinnosti FLIN-Q313 se stanovuje způsobem podle příkladu 4. Aktivovaná bílkovina C a aktivovaný FLIN-Q313 oba vykazují větší než 50% ztrátu účinnosti po přibližně 25 minutách, zatímco zymogenový FLIN Q313 zachovává alespoň 80 % účinnosti po 45 minutách.
-8CZ 286016 B6
Průmyslová využitelnost
Deriváty lidské bílkoviny C s vysokou účinností a se sníženou závislosti na aktivaci thrombinem se liší od nativních forem lidské bílkoviny C zvýšenou aktivační mírou, funkčními účinnostmi a uhlohydrátovou strukturou. Těchto derivátů se proto může používat jakožto místně aktivovaných antithrombických činidel, nevykazujících antikoagulační účinnost s výjimkou přítomnosti výrazné generace thrombinu.

Claims (4)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Derivát lidské bílkoviny C, volený ze souboru zahrnujícího derivát lidské bílkoviny C, ve kterém asparaginový zbytek v poloze 313 molekul nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem, derivát lidské bílkoviny C, ve kterém zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen fenylalaninem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen asparaginovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem a derivát lidské bílkoviny C, ve kterém zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazena fenylalaninem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen asparaginovým zbytkem, asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazena glutaminovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
  2. 2. Derivát lidské bílkoviny C podle nároku 1, ve kterém asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
  3. 3. Derivát lidské bílkoviny C podle nároku 1, ve kterém zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen fenylalaninem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen asparaginovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
  4. 4. Derivát lidské bílkoviny C podle nároku 1, ve kterém zbytek asparagové kyseliny v poloze 167 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen fenylalaninem, zbytek asparagové kyseliny v poloze 172 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen asparaginovým zbytkem, asparaginový zbytek v poloze 313 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem a asparaginový zbytek v poloze 329 molekuly nativní lidské bílkoviny C je nahrazen glutaminovým zbytkem.
CZ93948A 1992-05-21 1993-05-19 Derivát lidské bílkoviny C, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje CZ286016B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US88719192A 1992-05-21 1992-05-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ94893A3 CZ94893A3 (en) 1994-01-19
CZ286016B6 true CZ286016B6 (cs) 1999-12-15

Family

ID=25390640

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ93948A CZ286016B6 (cs) 1992-05-21 1993-05-19 Derivát lidské bílkoviny C, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje

Country Status (23)

Country Link
US (1) US5453373A (cs)
EP (1) EP0575054B1 (cs)
JP (1) JP3564150B2 (cs)
KR (1) KR100291529B1 (cs)
CN (1) CN1080658A (cs)
AT (1) ATE286121T1 (cs)
AU (1) AU661901B2 (cs)
BR (1) BR9301944A (cs)
CA (1) CA2096604C (cs)
CZ (1) CZ286016B6 (cs)
DE (1) DE69333727T2 (cs)
DK (1) DK0575054T3 (cs)
ES (1) ES2233925T3 (cs)
FI (1) FI932282A (cs)
HU (1) HU218408B (cs)
IL (1) IL105757A0 (cs)
MX (1) MX9302917A (cs)
MY (1) MY110664A (cs)
NO (1) NO311299B1 (cs)
NZ (1) NZ247651A (cs)
PH (1) PH29911A (cs)
PT (1) PT575054E (cs)
RU (1) RU2122004C1 (cs)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2067525C (en) * 1991-05-09 1998-09-15 Helmut G. Alt Organometallic fluorenyl compounds, preparation and use
AT402262B (de) * 1991-06-20 1997-03-25 Immuno Ag Arzneimittel enthaltend aktiviertes protein c
WO1993007491A1 (en) * 1991-10-04 1993-04-15 Board Of Regents Of The University Of Nebraska A soluble thrombomodulin-based one-stage assay for vitamin k-dependent coagulation-inhibiting proteins
US5716795A (en) * 1991-10-04 1998-02-10 Matschiner; John T. Thrombomodulin-based coagulometric assay of the protein C system
DE4320294A1 (de) * 1993-06-18 1994-12-22 Immuno Ag Verwendung von humanem Protein C zur Verhinderung und Behandlung von Thrombozytenablagerungen
BR9809304B1 (pt) 1997-04-28 2011-02-08 formulação liofilizada estável, processo para preparação da mesma, bem como forma de dosagem unitária.
US6630137B1 (en) 1997-04-28 2003-10-07 Eli Lilly And Company Activated protein C formulations
CA2293429A1 (en) * 1997-06-05 1998-12-10 Eli Lilly And Company Methods for treating thrombotic disorders
HUP0001237A3 (en) * 1997-10-20 2002-01-28 Lilly Co Eli Methods for treating vascular disorders
AU5131699A (en) * 1998-07-31 2000-02-21 Eli Lilly And Company Cryogranulation of activated protein c
US6815533B1 (en) 1998-07-31 2004-11-09 Eli Lilly And Company Cryogranulation of activated protein C
IL142248A0 (en) 1998-10-22 2002-03-10 Lilly Co Eli Methods for treating sepsis
IL142255A0 (en) 1998-11-13 2002-03-10 Lilly Co Eli Method of treating heparin-induced thrombocytopenia
ES2195655T3 (es) 1998-11-20 2003-12-01 Lilly Co Eli Procedimiento para tratar fiebre hemorragica virica con proteina c.
AU1723200A (en) 1998-11-23 2000-06-13 Eli Lilly And Company Method of treating sickle cell disease and thalassemia
US6998122B1 (en) * 1999-04-30 2006-02-14 Eli Lilly And Company Protein C derivatives
WO2001036462A2 (en) * 1999-11-19 2001-05-25 Eli Lilly And Company Protein c derivatives
WO2001057193A2 (en) * 2000-02-02 2001-08-09 Eli Lilly And Company Protein c derivatives
EP1263943A1 (en) 2000-02-11 2002-12-11 Eli Lilly & Company Protein c derivatives
US7204981B2 (en) * 2000-03-28 2007-04-17 Eli Lilly And Company Methods of treating diseases with activated protein C
CN100392079C (zh) * 2000-10-18 2008-06-04 马克西根公司 蛋白c或活化的蛋白c-样分子
KR20030060915A (ko) * 2000-10-18 2003-07-16 맥시겐 에이피에스 단백질 씨 또는 활성 단백질 씨-유사 분자
US6933367B2 (en) 2000-10-18 2005-08-23 Maxygen Aps Protein C or activated protein C-like molecules
WO2002085117A1 (en) * 2001-04-24 2002-10-31 Eisai Co., Ltd. Methods and compositions for preventing and treating septic shock and endotoxemia
AU2003213146A1 (en) * 2002-03-08 2003-09-22 Eli Lilly And Company Activated protein c formulations
WO2003106666A2 (en) * 2002-06-14 2003-12-24 Maxygen Aps Protein c variants with altered properties
US20070142272A1 (en) * 2003-01-24 2007-06-21 Zlokovic Berislav V Neuroprotective activity of activated protein c independent of its anticoagulant activity
EP1773371A4 (en) * 2004-07-23 2009-12-30 Univ Rochester ACTIVATED PROTEIN C INHIBITS SIDE EFFECTS OF PLASMINOGEN ACTIVATOR IN THE BRAIN
WO2006136033A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 The University Of British Columbia Coagulation factor iii polymorphisms associated with prediction of subject outcome and response to therapy
WO2007140625A1 (en) * 2006-06-09 2007-12-13 The University Of British Columbia Interferon gamma polymorphisms as indicators of subject outcome in critically ill subjects
US20100184672A1 (en) * 2007-06-18 2010-07-22 Mccarty Owen J T Protein c for use in maintaining hemostasis
WO2009089620A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 The Universityof British Columbia Protein c rs2069915 as a response predictor to survival and administration of activated protein c or protein c-like compound
CN102325880B (zh) 2008-12-19 2014-10-01 国家健康与医学研究院 丝氨酸蛋白酶衍生物及其在凝血功能障碍的预防或治疗中的用途
WO2012068519A2 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Sirius Genomics Inc. Markers associated with response to activated protein c administration, and uses thereof
US20150150954A1 (en) 2012-07-04 2015-06-04 The University Of Sydney Treatment of inflammatory skin disorders
AU2014391082B2 (en) 2014-04-16 2020-04-09 Zz Biotech Llc Treatment of abnormal cutaneous scarring
WO2023119230A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 L'oreal Coagulation pathway and nicotinamide-adenine dinucleotide pathway modulating compositions and methods of their use

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4775624A (en) * 1985-02-08 1988-10-04 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of human protein C
US4992373A (en) * 1987-12-04 1991-02-12 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for direct expression of activated human protein C
ZA889497B (en) * 1987-12-28 1990-08-29 Lilly Co Eli Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein c
US4981952A (en) * 1988-10-04 1991-01-01 Eli Lilly And Company Method for the purification of vitamin K-dependent proteins
US5270178A (en) * 1990-02-23 1993-12-14 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C
IL97311A0 (en) * 1990-02-23 1992-05-25 Lilly Co Eli Vectors and compounds for expression of glycosylation mutants of human protein c

Also Published As

Publication number Publication date
HU9301461D0 (en) 1993-09-28
AU3869993A (en) 1993-11-25
NO931840L (no) 1993-11-22
US5453373A (en) 1995-09-26
EP0575054A2 (en) 1993-12-22
EP0575054B1 (en) 2004-12-29
KR930023370A (ko) 1993-12-18
NO931840D0 (no) 1993-05-19
CA2096604C (en) 2003-12-16
IL105757A0 (en) 1993-09-22
NO311299B1 (no) 2001-11-12
KR100291529B1 (ko) 2001-06-01
CZ94893A3 (en) 1994-01-19
CN1080658A (zh) 1994-01-12
DE69333727D1 (de) 2005-02-03
HU218408B (hu) 2000-08-28
FI932282A (fi) 1993-11-22
AU661901B2 (en) 1995-08-10
MX9302917A (es) 1993-11-01
JPH0680698A (ja) 1994-03-22
JP3564150B2 (ja) 2004-09-08
NZ247651A (en) 1995-03-28
ES2233925T3 (es) 2005-06-16
PT575054E (pt) 2005-03-31
HUT69615A (en) 1995-09-28
DE69333727T2 (de) 2005-12-15
PH29911A (en) 1996-09-16
ATE286121T1 (de) 2005-01-15
DK0575054T3 (da) 2005-04-25
RU2122004C1 (ru) 1998-11-20
FI932282A0 (fi) 1993-05-19
CA2096604A1 (en) 1993-11-22
BR9301944A (pt) 1993-11-30
MY110664A (en) 1999-01-30
EP0575054A3 (en) 1995-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ286016B6 (cs) Derivát lidské bílkoviny C, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje
AU740753B2 (en) Improved methods for processing activated protein C
US6630138B2 (en) Protein C derivatives
US20100028910A1 (en) Activated protein c variants with normal cytoprotective activity but reduced anticoagulant activity
US20070042961A1 (en) Activated protein C variants with normal cytoprotective activity but reduced anticoagulant activity
JPH05103678A (ja) チモーゲン型ヒトプロテインｃの発現のためのベクターおよび化合物
JP3004375B2 (ja) ヒトプロテインｃのグリコシル化突然変異体の発現のためのベクターおよび化合物
JP2851287B2 (ja) 酵素前駆体型ヒトプロテインｃの発現のためのベクターおよび化合物
JP2003521919A (ja) プロテインｃ誘導体
KR20010053345A (ko) 단백질 ｃ 유도체
AU733756B2 (en) Methods for treating vascular disorders
JP2003514545A (ja) プロテインｃ誘導体
JPH07206704A (ja) プロテインｃの分解を阻害する方法
US20040038288A1 (en) Human protein C Polypeptide
CZ20004422A3 (cs) Polypeptid lidský protein C
AU2003252774A1 (en) Human Protein C Polypeptide

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20020519