ES2233925T3 - Derivados de la proteina c. - Google Patents
Derivados de la proteina c.Info
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Abstract
SE PRESENTAN DERIVADOS DE LA PROTEINA C HUMANA CON UNA ALTA ACTIVIDAD Y UNA DEPENDENCIA REDUCIDA DE LA ACTIVACION DE LA TROMBINA. LOS DERIVADOS SE DIFERENCIAN DE LAS FORMAS NATIVAS DE LA PROTEINA C HUMANA EN SU VELOCIDAD DE ACTIVACION INCREMENTADA, SU ACTIVIDAD FUNCIONAL Y SUS ESTRUCTURAS DE CARBOHIDRATO. TAMBIEN SE DESCRIBEN COMPUESTOS DE DNA, VECTORES DE TRANSFERENCIA, VECTORES DE EXPRESION Y TRANSFORMANTES UTILES EN LA PRODUCCION DE ESTOS DERIVADOS.
Description
Derivados de la proteína C.
La presente invención está en el campo de la
medicina humana, en particular, en el tratamiento de los trastornos
de la coagulación de la sangre. De manera más específica, la
invención se refiere a un derivado de la molécula de proteína C
humana, procedimientos para usar este derivado y composiciones
farmacéuticas que comprenden este derivado de la proteína C.
La proteína C es una proteína del plasma que
depende de la vitamina K, que circula principalmente en forma de un
heterodímero unido con puentes disulfuros inactivos, que consiste en
una cadena ligera de aproximadamente 25 kilodaltons y una cadena
pesada de aproximadamente 41 kilodaltons. La cadena pesada contiene
el dominio de serina-proteasa con su péptido de
activación N terminal, mientras que la cadena ligera contiene la
región de residuos de ácido gamma-carboxiglutámico
que se necesita para la actividad funcional y de unión a la membrana
que depende del calcio. El zimógeno de la proteína C humana inactiva
se convierte en proteína C activada por la acción del complejo de
trombina / trombomodulina, que escinde el péptido de activación
(residuos 158 a 169 del zimógeno circulante, o residuos 200 a 211
del preprozimógeno) para formar la proteína C activada.
Se conoce bien la función de la proteína C como
agente terapéutico (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos
nº 4.775.624 de Bang y col., que describe la secuencia de ADN que
codifica el zimógeno de la proteína C humana y la patente de Estados
Unidos nº 4.992.373 de Bang y col., que describe un procedimiento
para producir la proteína C humana activada). En la Patente Europea
EP0443875, Gerlitz y col. describieron un derivado de la proteína C
humana designado FLIN. Este derivado FLIN contiene un residuo Phe,
en lugar de un residuo Asp, en la posición 167 del Péptido de
Activación (posición 206 del preprozimógeno) y un residuo Asn, en
lugar de un residuo Asp, en la posición 172, en la cadena pesada
(posición 214 del preprozimógeno). El derivado FLIN se activa de
forma más fácil con trombina que el zimógeno de la proteína C humana
de tipo salvaje. En la Patente Europea EP0443874, Gerlitz y col.
describieron otros derivados de la proteína C humana, designados
Q313 y Q329. El derivado Q313 contiene un residuo Gln, en lugar de
un residuo Asn, en la posición 313 del zimógeno de tipo salvaje,
mientras que el derivado Q329 contiene un residuo Gln, en lugar de
un residuo Asn, en la posición 329 del zimógeno de tipo salvaje.
Estos derivados Q313 y Q329 carecen de las estructuras de
carbohidrato que normalmente están asociadas al residuo Asn en estos
lugares en la molécula de tipo salvaje y, por tanto, manifiestan un
aumento de las actividades amidolíticas y funcionales.
La presente invención se refiere a un derivado de
la proteína C humana que se modifica al cambiar el aminoácido 313 de
la molécula de la proteína C humana nativa de asparagina a glutamina
y al cambiar el aminoácido 167 de la molécula de la proteína C
humana nativa de ácido aspártico a fenilalanina y al cambiar el
aminoácido 172 de la molécula de la proteína C humana nativa de
ácido aspártico a asparagina. Dicho derivado de la proteína C humana
se activa de forma más fácil con trombina y también es
funcionalmente más activo que la molécula de la proteína C humana de
tipo salvaje o cualquier otro derivado de la proteína C humana.
También se describen y se reivindican
construcciones de ADN recombinantes, vectores y transformantes que
son útiles para producir el nuevo derivado de la proteína C humana.
Además, se describen y se reivindican composiciones farmacéuticas
que contienen una cantidad efectiva del derivado de la proteína C
humana de la invención, en combinación con uno o más excipientes
farmacéuticamente aceptables, así como procedimientos para usar el
derivado en el tratamiento y prevención de estados patológicos.
A efectos de la presente invención, como se
describe y se reivindica en el presente documento, los siguientes
términos y abreviaturas son como se definen a continuación.
Q313 - un derivado de la proteína C humana, en el
que el residuo de asparagina, en la posición 313 de la molécula de
la proteína C humana nativa se ha cambiado a un residuo de
glutamina.
El derivado Q313 de la proteína C se describe en
la Solicitud de Patente Europea Serie nº 91301446.0 de Gerlitz col.
y en J. Biol. Chem. 226: 9778 - 9785 de Grinnell y col.,
1991.
F167 - un derivado de la proteína C humana, en el
que el residuo de ácido aspártico, en la posición 167 de la molécula
de la proteína C humana nativa, se ha cambiado a una fenilalanina.
El derivado F167 de la proteína C se describe en la Patente Europea
EP 0323149 de Bang y col. y en EMBO J. 9: 2367 - 2373 de
Ehrlich y col., 1990.
LIN - un derivado de la proteína C humana, en el
que el residuo de ácido aspártico, en la posición 172 de la molécula
de la proteína C humana nativa, se ha cambiado a un residuo de
asparagina.
FLIN - un derivado de la proteína C humana, en el
que el residuo de ácido aspártico, en la posición 167 de la molécula
de la proteína C humana nativa, se ha cambiado a una fenilalanina y
el residuo de ácido aspártico, en la posición 172 de la molécula de
la proteína C nativa, se ha cambiado a un residuo de asparagina. Los
derivados LIN y FLIN de la proteína C se describen en la Patente
Europea EP 0443875 de Gerlitz y col. y en Protein C and Related
Anticoagulants (eds. Bruley, D. & Drohan, W.)
13-46 (Gulf Publishing Co., Houston, 1990) de
Grinnell y col.
FLIN-Q313 - un derivado de la
proteína C humana, en el que el residuo de ácido aspártico, en la
posición 167 de la molécula de la proteína C humana nativa, se ha
cambiado a una fenilalanina, el residuo de ácido aspártico, en la
posición 172 de la molécula de la proteína C nativa, se ha cambiado
a un residuo de asparagina y el residuo de asparagina, en la
posición 313 de la molécula de la proteína C nativa, se ha cambiado
a un residuo de glutamina.
Unidad de trascripción GBMT - una unidad de
control de trascripción modificada que comprende el potenciador P2
del virus BK separado estrechamente del elemento regulador cadena
arriba del promotor tardío principal de adenovirus (MLTF), el
promotor tardío principal de adenovirus-2, un
elemento poli GT, situado para estimular dicho promotor, y una
secuencia de ADN que contiene la secuencia guía tripartita de ayuste
de adenovirus.
Proteína naciente - el polipéptido producido tras
la traducción de una trascripción de ARNm, anterior a cualquier
modificación postraducional. Sin embargo, las modificaciones
postraduccionales, tales como la gamma-carboxilación
de los residuos de ácido glutámico y la hidroxilación de los
residuos de ácido aspártico, pueden empezar a suceder antes de que
se traduzca una proteína en su totalidad a partir de una
trascripción de ARNm.
Actividad de la proteína C - cualquier propiedad
de la proteína C humana responsable de las actividades
proteolíticas, amidolíticas, esterolíticas y biológicas
(anticoagulantes o profibrinolíticas). En la técnica, se conocen
bien los procedimientos para analizar la actividad anticoagulante de
la proteína, es decir, véase Bio/Technology 5:1189 - 1192 de
Grinnell y col. (1987).
Zimógeno - un precursor enzimáticamente inactivo
de una enzima proteolítica. El zimógeno de la proteína C, como se
usa en el presente documento, se refiere a formas secretadas e
inactivas, de una cadena o dos cadenas, de proteína C.
Todas las abreviaturas de aminoácidos usadas en
esta descripción son las aceptadas por parte de la Oficina de
Patentes y Marcas de Estados Unidos, como se expone en 37 C.F.R.
\NAK1.822 (b) (2) (1990).
La presente invención proporciona un derivado de
la proteína C humana que ha modificado los patrones de glicosilación
y que también ha modificado las regiones de activación. De forma
específica, este derivado es FLIN-Q313. El derivado
FLIN-Q313 contiene un residuo de fenilalanina en la
posición 167 de la molécula y un residuo de asparagina en la
posición 172 de la molécula (en lugar de los residuos de ácido
aspártico que se encuentran normalmente en estas posiciones), así
como un residuo de glutamina en la posición 313 (en lugar del
residuo de asparagina que normalmente se encuentra en esta
posición).
El derivado FLIN-Q313 manifiesta,
de forma excepcional velocidades elevadas de activación por medio de
la trombina solamente. Además, el derivado
FLIN-Q313, a diferencia de la proteína C humana de
tipo salvaje, se puede activar por medio de la trombina generada en
la coagulación del plasma humano, dando como resultado una
inhibición de la formación de otro coágulo. Esta proenzima activada
en el coágulo tiene una actividad específica sustancialmente mayor y
una semivida más larga que la forma activada de la proteína C
natural. Por tanto, el derivado de la presente invención puede
usarse como agente antitrombótico activado en el sitio, sin ninguna
actividad anticoagulante, salvo la presencia de generación
significativa de trombina.
La invención también proporciona un compuesto de
ADN para usar en la elaboración del derivado de la proteína C. Este
compuesto de ADN comprende la secuencia de codificación para la
cadena ligera de la proteína C humana, colocada inmediatamente
adyacente a, cadena abajo de, y en una fase de lectura de la
traducción con la secuencia prepropeptídica de la proteína C del
zimógeno de tipo salvaje. Las secuencias de ADN también codifican el
dipéptido Lys-Arg, que se procesa durante la
maduración de la molécula de la proteína C, el péptido de activación
y la cadena pesada de la molécula de la proteína C. Los cambios en
los residuos de aminoácidos en las posiciones 167, 172 y 313
modifican la activación de la molécula, mientras que el cambio en el
residuo de aminoácido, en la posición 313, modifica el contenido en
carbohidratos de la molécula.
Los expertos en la técnica reconocerán que,
debido a la degeneración del código genético, una diversidad de
compuestos de ADN pueden codificar los polipéptidos anteriormente
descritos. La Patente de Estados Unidos nº 4.775.624 de Bang y col.,
describe y reivindica la secuencia de ADN que codifica la forma de
tipo salvaje de la molécula de la proteína C humana. La invención,
en la que los expertos en la técnica podrían determinar fácilmente
qué cambios podrían usarse en la secuencia de ADN para construir las
otras secuencias de ADN que podrían codificar los polipéptidos
exactos descritos en el presente documento, no se limita a la
secuencia de ADN específica descrita por depósito. Por consiguiente,
las construcciones que se describen a continuación y en los ejemplos
adjuntos para los compuestos de ADN preferidos, vectores y
transformantes de la invención son meramente ilustrativas y no
limitan el alcance de la invención. Además, la sustitución de Gln en
lugar de Asn en la posición 313 es ilustrativa y no limita el
alcance de la invención, ya que se podrían usar otras sustituciones,
con la excepción de Cys o Pro.
El compuesto de ADN de la presente invención se
preparó por medio de mutagénesis dirigida al sitio del gen de la
proteína C humana. Después, se introdujo la molécula que codifica el
zimógeno mutado en un vector de expresión eucariótico, de tal forma
que la expresión del gen del zimógeno se puede dirigir a través de
la unidad de trascripción GBMT. Este vector se transformo en células
de Escherichia coli K12 AG1 y se depositó y formó parte de la
recogida de cultivo madre permanente del Northern Regional Research
Laboratories, en Peoria, Illinois 61604, el 14 de enero de 1992. El
cultivo específico y el número de adquisición se encuentran en la
Tabla I.
| Cultivo | Número de acceso | |
| E. coli K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q313 | NRRL B-18939 |
Se obtiene el cultivo y se aísla el plásmido
usando técnicas convencionales, y después se pueden transfectar
directamente en células hospedadoras eucarióticas para la producción
del derivado de la proteína C humana. Es preferible transfectar el
plásmido en células hospedadoras que expresen el producto del gen
temprano inmediato del adenovirus E1A, en el que el potenciador BK
encontrado en la unidad de control de trascripción GBMT funciona
para potenciar la expresión de forma más eficiente en presencia de
E1A. La unidad de control de trascripción GBMT se describe de
manera más detallada en la patente europea EP 0445939 de Berg y col.
Los expertos en la técnica observan que una serie de células
hospedadoras expresan, o se puede hacer que expresen, un producto
del gen temprano inmediato de un virus con ADN amplio. La línea
celular más preferida para la expresión del derivado de la proteína
C humana de la presente invención es la línea celular 293 del riñón
humano, que se describe en la patente de Estados Unidos nº 4.992.373
de Bang y col. Después de la expresión en la línea celular, se
purifica el derivado desde el sobrenadante del cultivo celular,
usando el procedimiento de Yan, patente de Estados Unidos nº
4.981.952.
La secuencia de ADN de la invención puede
sintetizarse químicamente, o mediante la combinación de fragmentos
de restricción, o mediante una combinación de tecnologías conocidas
en la técnica. Las máquinas que sintetizan el ADN están disponibles
y pueden usarse para construir los compuestos de ADN de la presente
invención.
El vector ilustrativo de la invención comprende
la unidad de trascripción GBMT colocada para estimular la
trascripción de las secuencias codificadoras a través del promotor
tardío de adenovirus. Los expertos en la técnica reconocen que en la
técnica se conoce gran número de promotores eucarióticos,
potenciadores y vectores de expresión y se pueden usar para expresar
las secuencias de ADN para producir los derivados de la proteína C
de la presente invención. Los expertos en la técnica también
reconocen que un vector de expresión eucariótica puede funcionar sin
un elemento potenciador. El aspecto clave de la presente invención
no reside en el potenciador o promotor particular usado para
expresar los derivados, sino en la secuencia de ADN nueva y la
proteína correspondiente elaborada a partir de esa secuencia.
El vector de la presente invención se puede
transformar y expresar en una amplia variedad de células
hospedadoras eucarióticas, en especial de mamíferos. El vector
depositado en el NRRL contiene el gen que otorga la resistencia a la
higromicina. Sin embargo, los vectores que no contienen ningún
marcador seleccionable se pueden construir fácilmente y usar para
realizar análisis transitorios o se pueden cotransformar en líneas
celulares junto con otros vectores que contienen marcadores
seleccionables. El vector de la invención también puede comprender
secuencias que permitan la replicación en E. Coli, ya que,
por lo general, es más eficiente para preparar ADN de plásmido en
E. Coli, que en otros organismos hospedadores.
Son posibles muchas modificaciones y variaciones
de las secuencias de ADN y plásmidos ilustrativos presentes. Por
ejemplo, la degeneración del código genético permite la sustitución
de nucleótidos en todas las regiones de codificación de
polipéptidos, así como en la señal de terminación de la traducción,
sin modificación de la secuencia que codifica el polipéptido
codificado. Se pueden deducir dichas secuencias sustituibles a
partir del aminoácido conocido o secuencia de ADN de la proteína C
humana y se pueden construir de acuerdo con procedimientos
convencionales de mutagénesis dirigidas al sitio o sintéticas. Los
procedimientos se síntesis se pueden llevar a cabo de conformidad
sustancial con los procedimientos de Itakura y col., 1977,
Science 198:1056 y de Crea y col., 1978, Proc. Natl.
Acad. Sci., Estados Unidos 75: 5765. Por tanto, la presente
invención no se limita de ninguna forma a la secuencia de ADN y
plásmido ejemplificados de manera específica.
En la técnica son antiguos y se conocen bien los
procedimientos para la activación de las formas de zymógenos de la
proteína C humana para los derivados de la proteína C humana
activada. La proteína C puede activarse por medio de la trombina
solamente, por medio de un complejo de trombina / trombomodulina,
por medio del veneno de víbora de Russell o por medio de una
diversidad de otros medios. La actividad de los derivados de la
proteína C humana puede medirse a raíz de la activación de la
trombina a través de análisis amidolíticos totales o a través de
análisis de anticoagulación. Se realizaron análisis de activación de
la trombina y de la proteína C (amidolíticos y anticoagulantes), de
acuerdo con la enseñanza de Grinnell y col., 1987,
Bio/Technology 5:1187 - 1192.
El derivado de la proteína C humana recombinante
de la presente invención es útil en la prevención y tratamiento de
una amplia diversidad de estados patológicos adquiridos que implican
coagulación intravascular, entre los que se incluye la trombosis
venosa profunda, embolia pulmonar, trombosis arterial periférica,
embolia con origen en el corazón o en las arterias periféricas,
infarto de miocardio agudo, apoplejía trombótica, angina inestable,
cirugía vascular periférica, transplante de órganos y coagulación
intravascular diseminada. Este derivado de la proteína C también se
puede usar de forma eficiente en el tratamiento de una serie
importante de pacientes con carencias heterocigóticas de proteína C
que presentan trombosis venosa profunda reiterada y en el caso de
pacientes homocigóticos con carencias de proteína C con púrpura
fulminante. Sin embargo, otra indicación terapéutica de los
derivados de la proteína C activada es la prevención de trombosis
venosa profunda y embolia pulmonar tratada actualmente con dosis
bajas de heparina.
El derivado, y el homólogo activado, de la
presente invención se puede formular de acuerdo con procedimientos
conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles,
mediante los cuales el derivado de la proteína C humana o el
derivado de la proteína C activada de la presente invención se
combina en mezcla con un vehículo portador farmacéuticamente
aceptable. Por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical
Sciences 16ª ed., 1980, de Mack Publishing Co., editada por Osol
y col., se describen vehículos portadores adecuados y su
formulación, incluidas otras proteínas humanas, como por ejemplo,
albúmina sérica humana. Tales composiciones contendrán una cantidad
efectiva del derivado de la proteína C, o el homólogo activado,
junto con una cantidad adecuada del vehículo portador para preparar
composiciones farmacéuticamente aceptables, adecuadas para la
administración eficaz al huésped. La composición del derivado de la
proteína C se puede administrar por vía parenteral, o a través de
otros procedimientos que aseguren la distribución al flujo sanguíneo
de forma efectiva.
Se proporcionan los siguientes ejemplos a modo de
ilustración de la presente invención y no se considerarán una
limitación de ésta.
El vector de expresión de la presente invención
se aísla de las células de E. coli y después se transforma en
células 293 de riñón humano, se seleccionaron los transformantes a
37ºC, después se cultivaron para producir el derivado de la proteína
C humana, de conformidad sustancial con las enseñanzas de Bang y
col., patente de Estados Unidos nº 4.992.373. El derivado se
purifica fuera del cultivo celular sobrenadante, de conformidad
sustancial con las enseñanzas de Yan, patente de Estados Unidos nº
4.981.952.
Se obtuvo la proteína C totalmente activada
activando material con 10 nM de trombina en complejo con
trombomodulina TMD-75 humana recombinante soluble,
como se describe en J. Biol. Chem. 265:12602 - 12610, 1990,
de Parkinson y col. Se midió la actividad anticoagulante de la
molécula activada con un análisis del tiempo de coagulación parcial
de tromboplastina activada. Los resultados se exponen en la Tabla
II.
| Proteína C | Actividad Anticoagulante | Actividad | |
| (unidades/mg) | Relativa | ||
| Tipo salvaje | 325 +/- 65 | 1 | |
| Q313 | 577 +/- 17 | 1,8 | |
| LIN | 289 +/- 13 | 0,9 | |
| F167 | 283 +/- 27 | 0,9 | |
| FLIN | 313 +/- 65 | 1 | |
| FLIN-Q313 | 552 +/- 37 | 1,7 |
Se determinaron las velocidades de activación
usando trombina humana (10 nM) en una mezcla de reacción que
contenía Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, BSA 0,1 mg/ml y CaCl_{2}
3 mM. La proteína C purificada, tanto de tipo salvaje como derivada,
se encontraba en una concentración de 0,81 a 1,61 uM, en la reacción
de activación. Las velocidades de activación se determinaron
extrayendo alícuotas de la mezcla de reacción de la activación en
varios puntos de tiempo a una placa de 96 pocillos y, después de la
adición del sustrato cromogénico (S-2366) a una
concentración final de 0,75 mM, se midió la actividad amidolítica
según el cambio en absorción unidades/minuto a 405 nM, en un lector
de placas de micro - titulación cinético ThermoMax (Molecular
Devices). Se determinaron las velocidades convirtiendo el cambio en
DO/minuto en la cantidad de proteína C activada generada, usando las
actividades específicas determinadas para cada proteína, y
representando gráficamente frente al tiempo de activación. La
cantidad de proteína C activada generada era inferior al 10% del
material de partida total en todos los experimentos. Los resultados
se exponen en la Tabla III.
| Proteína C | Velocidad de activación | Velocidades | |
| por Trombina | relativas de | ||
| (ng/min) | activación | ||
| Tipo salvaje | 0,53 +/- 0,1 | 1 | |
| Q313 | 1,1 +/- 0,2 | 2 | |
| LIN | 2,2 +/- 0,4 | 4 | |
| F167 | 6,3 +/- 1,0 | 12 | |
| FLIN | 15,9 +/- 4,0 | 30 | |
| FLIN-Q313 | 32,3 +/- 6,4 | 61 | |
| ^{a} las velocidades sin desviación típica son de los estudios en los que n = 2. |
Las velocidades relativas de activación también
se determinaron con el mismo sistema de análisis, usando trombina y
trombomodulina. La molécula de trombomodulina que se usó fue la
trombomodulina humana soluble de Parkinson y col., supra. Los
resultados se exponen en la Tabla IV.
| Proteína C | Velocidades relativas de activación con | |
| trombina y trombomodulina | ||
| Tipo salvaje | 1ª | |
| Q313 | 2,6 +/- 0,6 | |
| LIN | 2,1 +/- 0,2 | |
| F167 | 3,5 +/- 0,8 | |
| FLIN | 2,7ª | |
| FLIN-Q313 | 9,2 +/- 1,0 | |
| ^{a} las velocidades sin desviación típica son de los estudios en los que n = 2. |
Se añadió proteína C humana de tipo salvaje y
derivado FLIN-Q313 al plasma humano en una
concentración de 20 nM, junto con el reactivo APTT patrón de Helena,
y se incubó durante 5 minutos a 37ºC. Se inició la coagulación del
plasma al añadir CaCl_{2} a una concentración final de 8 mM, y se
midieron los tiempos de coagulación. En experimentos simultáneos, se
añadió un anticuerpo monoclonal capaz de neutralizar la actividad de
la proteína C activada, para controlar el plasma y el plasma que
contiene la proteína C de tipo salvaje del zimógeno o
FLIN-Q313. Los resultados se exponen en la Tabla
V.
| Proteína C | Tiempo de coagulación (segundos) | ||
| +Ab | -Ab | ||
| Ninguna (control) | 30 +/- 4. | 32 +/- 3 | |
| Tipo salvaje | 36 +/- 4. | 33 +/- 5 | |
| FLIN-Q313 | 36 +/- 4. | 75 +/- 5 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó el nivel de actividad de coagulación
inducida en el plasma de coagulación según una función de la
concentración de la proteína C humana de tipo salvaje y el derivado
FLIN-Q313 y los datos se expresaron como la
prolongación del tiempo de coagulación. El tiempo de coagulación
basal en el análisis fue de 27 a 33 segundos. Los resultados se
exponen en la Tabla VI.
| Prolongación del tiempo | |||
| Proteína C | \hskip-0.5cm Dosis (nM) | de coagulación (segundos) | |
| Tipo salvaje | 8 | 0 +/- 3 | |
| FLIN-Q313 | 8 | 20 +/- 6 | |
| Tipo salvaje | 16 | 0 +/- 5 | |
| FLIN-Q313 | 16 | 37 +/- 6 | |
| Tipo salvaje | 32 | 0 +/- 5 | |
| FLIN-Q313 | 32 | 77 +/- 6 | |
| Tipo salvaje | 64 | 0 +/- 5 | |
| FLIN-Q313 | 64 | 235 +/- 6 |
Se determinó la inhibición de la proteína C
humana en plasma incubando plasma humano normal (citrado) con
100 nM de proteína C humana activada, FLIN-Q313 activado o FLIN-Q313 (no activado) de zimógeno. La concentración de plasma era del 90% (v/v) en la reacción final con el volumen restante que consistía en un tampón con CaCl_{2} 3 mM, NaCl 150 mM, Tris 20 mM, pH 7,4 y 1 mg/ml de BSA. En tiempos seleccionados, se extrajeron alícuotas y se determinó la actividad de la proteína C activada mediante la actividad amidolítica usando S-2366 en una concentración final de 1 mM o mediante el tiempo parcial de tromboplastina activada. Se determinó el nivel de actividad de coagulación activada de FLIN-Q313 como se describe en el Ejemplo 4. La proteína C activada y el FLIN-Q313 activado manifestaron una pérdida de actividad superior al 50%, después de aproximadamente 25 minutos, mientras que el FLIN-Q313 del zimógeno todavía conservaba, al menos, el 80% de actividad después de 45 minutos.
100 nM de proteína C humana activada, FLIN-Q313 activado o FLIN-Q313 (no activado) de zimógeno. La concentración de plasma era del 90% (v/v) en la reacción final con el volumen restante que consistía en un tampón con CaCl_{2} 3 mM, NaCl 150 mM, Tris 20 mM, pH 7,4 y 1 mg/ml de BSA. En tiempos seleccionados, se extrajeron alícuotas y se determinó la actividad de la proteína C activada mediante la actividad amidolítica usando S-2366 en una concentración final de 1 mM o mediante el tiempo parcial de tromboplastina activada. Se determinó el nivel de actividad de coagulación activada de FLIN-Q313 como se describe en el Ejemplo 4. La proteína C activada y el FLIN-Q313 activado manifestaron una pérdida de actividad superior al 50%, después de aproximadamente 25 minutos, mientras que el FLIN-Q313 del zimógeno todavía conservaba, al menos, el 80% de actividad después de 45 minutos.
Claims (13)
1. Un derivado de la proteína C humana en el que
el derivado es D167F:D172N:N313Q.
2. Una molécula de ADN recombinante que codifica
un derivado de la proteína C humana de la reivindicación 1.
3. La molécula de ADN recombinante de la
reivindicación 2 que es un plásmido.
4. La molécula de ADN recombinante de la
reivindicación 3, en la que el plásmido es plásmido
pGT-h-D167F:
D172N:N313Q (NRRL B-18939).
D172N:N313Q (NRRL B-18939).
5. Una célula hospedadora transformada con el
plásmido de ADN recombinante de la reivindicación 3 o reivindicación
4.
6. La célula hospedadora de la reivindicación 5,
que se selecciona a partir de una célula 293 de riñón humano y una
célula de E. coli.
7. La célula hospedadora de la reivindicación 6,
que es 293/pGT-h- D167F:D172N:N313Q de riñón humano
y K12 AG1/pGT-h- D167F:D172N:N313Q (NRRL
B-18939) de E. coli.
8. Una formulación farmacéutica que comprende,
como ingrediente activo, un derivado de la proteína C, en el que el
derivado es D167F:D172N:N313Q, asociado a uno o más vehículos,
excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables del
mismo.
9. Un derivado de la proteína C, según la
reivindicación 1 para usar como medicamento.
10. Un derivado de la proteína C, según la
reivindicación 9 para usar como agente antitrombótico.
11. Uso de un derivado de la proteína C, según la
reivindicación 1 en la fabricación de un agente antitrombótico.
12. Un procedimiento para preparar un derivado de
la proteína C humana, en el que el derivado es D167F:D172N:
N313Q, comprendiendo dicho procedimiento:
N313Q, comprendiendo dicho procedimiento:
- a)
- transformar o transfectar una célula hospedadora eucariótica con un vector de ADN recombinante, comprendiendo dicho vector una secuencia de ADN que codifica dicho derivado de la proteína C humana,
- b)
- cultivar dichas células hospedadoras eucarióticas transfectadas en condiciones adecuadas para la producción de dicho derivado de la proteína C humana, después
- c)
- recuperar dicho derivado de la proteína C humana a partir del sobrenadante de dicho cultivo.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
la que la célula hospedadora eucariótica es una célula 293 de riñón
humano.
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