ES2234807T3 - Derivados de proteina c. - Google Patents

Abstract

Un derivado de la proteína C que comprende la SEQ.ID.Nº 1 teniendo al menos 2 sustituciones de aminoácidos seleccionadas de los grupos constituidos por: a) His en la posición 10 sustituida por Gln; Ser en la posición 11 sustituida por Gly; Ser en la posición 12 sustituida por Lys; Gln en la posición 32 sustituida por Glu; Asn en la posición 33 sustituida por Asp o Phe; y b) el aminoácido de la posición 194, 195, 228, 249, 254, 302 ó 316 sustituido por un aminoácido seleccionado de entre Ser, Ala, Thr, His, Lys, Leu, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly y Gln, donde al menos están presentes una sustitución del grupo a) y una sustitución del grupo b)

Description

Derivados de proteína C.

Esta invención se refiere a nuevos polinucleótidos, polipéptidos codificados por ellos y a la utilización de tales polinucleótidos y polipéptidos. Más específicamente, la invención se refiere a los derivados de la proteína C humana con resistencia a la inactivación por serpinas y al incremento de la actividad anticoagulante comparada con la actividad de la proteína C de cepa natural, a su producción y a las composiciones farmacéuticas que contienen estos derivados de la proteína C humana.

La proteína C es una serina proteasa y un anticoagulante natural que realiza una función en la regulación de la hemostasis desactivando los factores V_{a} y VIII_{a} en la cadena de coagulación. La proteína C humana se forma en vivo como un polipéptido sencillo de 461 aminoácidos. Este polipéptido sufre múltiples modificaciones postranslacionales incluyendo: 1) ruptura de la secuencia señal del aminoácido 42; 2) ruptura de residuos de lisina y arginina (posiciones 156 y 157) para formar un precursor inactivo de 2 cadenas o zimógeno (un residuo de cadena ligera de 155 aminoácidos unido por medio de su puente disulfuro a un residuo de cadena pesada de 262 aminoácidos); 3) carboxilación
K-dependiente de vitaminas de nueve residuos de ácido glutámico localizados en los residuos 45 del amino terminal (dominio gla); y, 4) acoplamientos de hidratos de carbono en cuatro lugares (uno en la cadena ligera y tres en la cadena pesada). Finalmente, el zimógeno de 2 cadenas se puede activar eliminando un dodecapéptido en el N-terminal de la cadena pesada produciendo proteína C activada (PCa) que tiene una mayor actividad enzimática que el zimógeno de 2 cadenas.

La coagulación de la sangre es un proceso muy complejo regulado por el balance entre mecanismos procoagulantes y anticoagulantes. Este balance determina una condición que bien es una hemostasis normal o bien es la generación de un trombo patológico anormal que, por ejemplo, podría desencadenar una trombosis coronaria que originaría síndromes coronarios agudos (SCA; por ejemplo anginas inestables o infartos de miocardio). Este balance lo controlan dos factores principales; la generación de fibrina y la activación y agregación subsiguiente de plaquetas, ambos procesos controlados por la generación de la enzima trombina, lo cual ocurre después de que se active la cadena de coagulación. La trombina, formando un complejo con la trombomodulina, también funciona como un potente anticoagulante, ya que activa el zimógeno de la proteína C convirtiéndolo en PCa, que a su vez inhibe la generación de trombina. De este modo, por medio de la regulación de la generación de trombina a través de la inactivación de los factores V_{a} y VIII_{a}, la PCa funciona como el quizá más importante regulador descendente (down-regulator) de la coagulación de la sangre, lo que tiene como consecuencia la protección contra la trombosis. Además de anticoagulante, la PCa tiene efectos antiinflamatorios y propiedades profibrinolíticas que facilitan la lisis de los coágulos.

La trombosis arterial ocurre en SCA como respuesta a las lesiones endoteliales, típicamente como resultado de una perturbación del desarrollo de una placa rica en lípidos. Las fases iniciales de esta respuesta incluyen la adhesión, activación y ensamblaje de plaquetas y de varios procoagulantes en el lugar de la lesión y en las superficies de las plaquetas activadas. La elaboración resultante de la generación de trombina juega un papel crítico en la progresión de la formación del trombo: por la sedimentación de la fibrina y por la activación de las plaquetas, ya que de este modo se potencia la activación del sistema de coagulación. Las terapias anticoagulantes tradicionales (por ejemplo heparina no fraccionada [HNF]) y actuales (por ejemplo, heparina de bajo peso molecular [HBPM]) para los SCA se basan en la inhibición de la trombina y/o del factor Xa (por ejemplo, las heparinas inactivan la trombina y el Xa estimulando su interacción con la antitrombina III). De todas formas, debido a limitaciones estéricas, estos agentes no son efectivos inhibiendo el coágulo Xa o trombina. La habilidad de la PCa para dirigirse y desactivar irreversiblemente el complejo coágulo Xa/Va atenúa la generación local de trombina y progresión de la trombosis. De este modo, la PCa tiene una ventaja en comparación a los inhibidores actuales de trombina o Xa, esta consiste en que el efecto de disminuir la generación de trombina continuará después de que se hayan reducido las concentraciones de PCa.

El papel crítico de la PCa en el control de la hemostasis también se ilustra por el incremento de la tasa de trombosis en la deficiencia heterocigótica, la resistencia de la proteína C (debida a la mutación común del factor V de Leiden) y al resultado fatal de la falta de tratamiento de la deficiencia de proteína C homocigótica. Los derivados del plasma y de la PCa obtenida por recombinación han demostrado ser agentes antitrombóticos efectivos y seguros respecto a la trombosis arterial y venosa en una variedad de modelos animales.

Los niveles de proteína C también parecen ser anormalmente bajos cuando se dan las siguientes enfermedades y condiciones: coagulación intravascular diseminada (CID) [Fourrier, et al., Chest 101:816-823, 1992], sepsis
[Gerson, et al., Pediatrics 91:418-422, 1993], traumatismo mayor/cirugía mayor [Thomas, et al., Am J Surg. 158:491-494, 1989], quemaduras [Lo, et al., Burns 20:186-187 (1994)], síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA) [Hasegawa, et al., Chest 105(1):268-277, 1994], y transplantes [Gordon, et al., Bone Marrow Trans. 11:61-65 (1993)]. Adicionalmente, hay numerosas enfermedades con anormalidades o complicaciones trombóticas en las que la PCa puede ser útil en su tratamiento, como por ejemplo: trombocitopenia inducida por heparina (TIH) [Phillips, et al., Annals of Pharmacotherapy 28: 43-45, 1994], enfermedad de las células en hoz o talasemia [Karayalcin, et al., The American Journal of Pediatric Hematology/Oncology (3):320-323, 1989], fiebre hemorrágica viral [Lacy, et al., Advances in Pediatric Infectious Diseases 12:21-53, 1997], púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) y síndrome urémico hemolítico (SUH) [Moake, Seminars in Hematology 34(2):83-89, 1997]. Adicionalmente, la combinación de la PCa con proteína incrementadota de la permeabilidad bactericida (BPI) puede tener utilidad en el tratamiento de la septicemia [Fisher, et al., Crit. Care Med. 22(4):553-558, 1994].

Se ha establecido claramente que la inhibición plaquetaria es eficaz en la prevención y el tratamiento de la trombosis. De todas formas, la utilización de agentes antiplaquetarios, tales como la aspirina, incrementa el riesgo de hemorragias, lo cual limita la dosis del agente y la duración del tratamiento. La combinación de PCa y agentes antiplaquetarios resulta en una sinergia que permite la reducción de las dosis de la PCa y de los agentes antiplaquetarios. La reducción de las dosis de los agentes en la terapia de combinación resulta a su vez en la reducción de los efectos secundarios tales como el aumento de hemorragias que se observa muchas veces en la terapia de combinación anticoagulante/antiplaquetario.

Se han descrito y son conocidos varios procedimientos para obtener y producir proteína C a partir del plasma y, por medio de la tecnología de recombinación del ADN, PCa y polipéptidos de proteína C/PCa. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 4.775.624 y 5.358.932. A pesar de las mejoras de los procedimientos para producir PCa por medio de la tecnología de recombinación del ADN, la PCa y los polipéptidos son difíciles y costosos de producir.

A diferencia del zimógeno de la proteína C, la proteína C activada tiene una vida media extremadamente corta. La principal razón para esta vida media corta es que los niveles de la PCa en la sangre lo regulan moléculas conocidas como serpinas (inhibidores de la serina proteasa), que por medio de un enlace covalente con la PCa forman un complejo inactivo serpina/PCa. Los complejos serpina/PCa se forman cuando la PCa se enlaza y rompe proteolíticamente un bucle de un lugar reactivo en la serpina; tras la ruptura, la serpina sufre un cambio conformacional irreversible que inactiva la PCa. Entonces, el complejo serpina/PCa se elimina de la sangre por medio de receptores hepáticos del complejo serpina/PCa. Como resultado de esto, la PCa tiene una vida media relativamente corta comparada con la del zimógeno: la PCa tiene una vida media de aproximadamente 20 minutos comparada con las 10 horas de vida media del zimógeno de proteína C humana (Okajima, et al., Thromb Haemost 63(1):48-53, 1990).

Por lo tanto, un derivado de la PCa que tenga resistencia a la inactivación por serpinas, mientras mantenga las actividades biológicas deseadas de la PCa (por ejemplo, actividades anticoagulantes, fibrinolíticas y antiinflamatorias), proporciona un componente que incrementa la vida media del plasma y es más potente que el compuesto padre, requiriendo menores niveles de dosificación para sus aplicaciones terapéuticas. Las ventajas potenciales son importantes, especialmente en estados de enfermedades en los que los niveles de serpina son elevados.

Por medio de experimentación, análisis e innovación científica, los presentes inventores identificaron puntos específicos de enlace entre la serpina y la proteína C esenciales para la formación de los complejos serpina/PCa. En la molécula de PCa se modificaron ciertos residuos de aminoácidos y sorprendentemente se inhibió la formación del complejo serpina/PCa (el complejo que irreversiblemente inactiva la PCa) mientras que al mismo tiempo se retiene la especificidad de los derivados de la PCa para sustratos naturales de PCa (por ejemplo los factores Va y VIIIa). Adicionalmente, se ha encontrado que el enlace de inhibición del complejo serpina/derivado de la PCa humana ocurre por sustitución de uno o más de los siguientes aminoácidos: 194 (Leu), 195 (Ala), 228 (Leu), 249 (Tyr), 254 (Thr), 302 (Tyr), y 316 (Phe) de SEQ.ID.Nº 1 con aminoácidos seleccionados de Ser, Ala, Thr, His, Lys, Arg, Leu, Asn, Asp, Glu, Gly, y Cln, siempre que la posición 194 no se encuentre sustituida con Leu y la posición 254 no se encuentre sustituida con Thr.

Adicionalmente, un derivado de la PCa que exhiba un incremento de la actividad anticoagulante, siempre que mantenga las otras actividades biológicas de la PCa (por ejemplo, las actividades fibrinolíticas y antiinflamatorias), proporciona un compuesto que es efectivamente más potente que el compuesto padre y requiere niveles de dosis sustancialmente menores para sus aplicaciones terapéuticas.

Varios investigadores han encontrado mejoras de la actividad enlazante del calcio y la membrana de la proteína C humana por mutagénesis específica puntual del dominio gla, por ejemplo, Shen et al. (J Biol. Chem., 273(47) 31086-91, 1998) y Shen et al. (Biochemistry, 36(51) 16025-31, 1997). Algunas de las mutaciones presentes muestran también actividad ligera de la PCa en ensayos de coagulación estándar, comparados con la PCa de cepa natural. W09109960 y JP3072877 revelan mutaciones de la proteína C humana que muestran mayor resistencia a la inactivación por parte del plasma humano e incrementan su vida media. Por medio de experimentación, análisis e innovación científica los presentes inventores identificaron puntos específicos y modificaron ciertos residuos de aminoácidos identificados en el dominio gla de la molécula de PCa. Sorprendentemente, se observó un incremento de la actividad anticoagulante del derivado de la PCa cuando se llevaron a cabo mutaciones específicas puntuales. Particularmente sustituciones en las posiciones de aminoácidos: 10 (His), 11 (Ser), 12 (Ser), 32 (Gln) y 33 (Asn) de SEQ.ID.Nº 1, solo o en combinaciones en las que aumentó la actividad anticoagulante en comparación con toda la gama de la PCa.

Según lo anterior, la presente invención describe nuevos derivados de la proteína C humana. Estos derivados de la proteína C humana mantienen la actividad biológica importante de la proteína C de cepa natural, tienen una gran actividad anticoagulante y tienen vidas medias mayores en la sangre humana que la PCa de cepa natural. Por lo tanto, estos compuestos proporcionan varias ventajas, por ejemplo, administración menos frecuente y/o en menores dosis, lo que lleva a una reducción del coste general de su producción y terapia. Además, estos compuestos tienen una ventaja sobre las terapias anticoagulantes tradicionales en estados de enfermedad como los SCAs. Es importante reseñar que el incremento de la actividad de los anticoagulantes derivados de la proteína C humana y la resistencia a la inactivación por serpinas se puede lograr preferentemente por medio de sustituciones de dos a seis aminoácidos, lo que es menos probable es que sea inmunogénico en comparación con las moléculas que contienen más de 6 sustituciones de aminoácidos (patente de Estados Unidos número 5.358.932; Holly, et al., Biochemistry 33:1876-1880, 1994).

La figura 1 es una representación esquemática de la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas de la molécula de proteína C, incluyendo la secuencia del pre-pro líder (señal).

La presente invención proporciona un derivado de la proteína C humana, incluyendo la SEQ.ID.Nº 1, que tiene al menos dos sustituciones de aminoácidos seleccionados de los siguientes grupos, que consisten en:

A) La His en la posición 10 se sustituye con Gln; la Ser en la posición 11 se sustituye con Gly; la Ser en la posición 12 se sustituye con Lys; la Gln en la posición 32 se sustituye con Glu; la Asn en la posición 33 se sustituye con Asp o Phe; y B) el aminoácido en la posición 194, 195, 228, 249, 254, 302 ó 316 se sustituye con un aminoácido seleccionado de entre estos: Ser, Ala, Thr, His, Lys, Leu, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly y Gln, donde están presentes al menos una sustitución del grupo A y otra del grupo B.

La presente invención también proporciona recombinaciones de moléculas de ADN que codifican los derivados de la proteína C humana de la presente invención, particularmente aquellos que comprenden las SEQ.ID.Nº 3, 4, 5 y 6 y las formas activadas de estos derivados de proteína C humana.

La presente invención también proporciona sustancias y composiciones útiles en el tratamiento de desórdenes oclusivos vasculares y estados de hipercoagulación, que incluyen: sepsis, coagulación intravascular diseminada, púrpura fulminante, trauma mayor, cirugía mayor, quemaduras, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, transplantes, trombosis intravenosa, trombocitopenia inducida por heparina, enfermedad de las células en hoz, talasemia, fiebre hemorrágica viral, púrpura trombocitopénica trombótica y síndrome urémico hemolítico.

La invención además proporciona la utilización de los derivados de la proteína C humana de la presente invención en la fabricación de fármacos para tratar las anteriormente mencionadas enfermedades y condiciones.

Otra realización de la presente invención es la utilización de los derivados de la proteína C humana de la presente invención en la fabricación de fármacos para tratar a pacientes humanos con desórdenes protrombóticos predispuestos genéticamente. Ejemplos de desórdenes protrombóticos predispuestos genéticamente son la deficiencia de proteína C, la mutación del factor V de Leiden y la mutación del gen G20210A de la protrombina.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que incluye un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable y un derivado de la proteína C humana.

La presente invención también proporciona la utilización de derivados de la proteína C activada humana de esta invención para la fabricación de un fármaco para el tratamiento de las indicaciones anteriormente mencionadas.

Los procedimientos y aspectos para proporcionar los derivados de la nueva proteína humana también son un aspecto de esta invención.

Para los objetos de la presente invención, como se exponen y se reivindican aquí, se definen a continuación los siguientes términos.

Agente antiplaquetario - uno o más agentes, solo o combinado, que reduce la habilidad de las plaquetas para unirse. Se entiende que los agentes incluyen aquellos mencionados en, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, decimonovena edición, volumen II, páginas 924-25, Mack Publishing Co. Tales agentes incluyen pero no se encuentran limitados a la aspirina (AAS), clopidogrel, ReoPro® (abciximab), dipiridamole, ticlopiridina y antagonistas IIb/IIIa.

Zimógeno - zimógeno de la proteína C, tal como se utiliza aquí, se refiere a formas segregadas, inactivas, bien de una o de dos cadenas de proteína C o de sus derivados. Los residuos de escisiones de lisina y arginina (posiciones 156 y 157) generan un zimógeno inactivo de dos cadenas (pesada y ligera).

Proteína C activada se refiere a la forma activada del zimógeno de proteína C, que se produce tras la eliminación de un dodecapéptido por el aminoácido N- terminal de una cadena pesada produciendo proteína C activada.

La proteína C activada o PCa se refiere a la PCa recombinada. La PCa incluye y se recombina preferentemente con la PCa humana aunque la PCa también puede incluir otras especies que tengan proteína C con actividad proteolítica, amidolítica, estereolítica y biológica (anticoagulante, antiinflamatoria o profibrinolítica).

Los derivados de la proteína C humana se refieren a los derivados producidos por recombinación de esta invención, que difieren de la proteína C humana de cepa natural pero que cuando se activan mantienen las propiedades esenciales, por ejemplo, la actividad proteolítica, amidolítica, estereolítica y biológica (anticoagulante, antiinflamatoria o profibrinolítica). La definición de los derivados de la proteína C humana, como se utiliza aquí, incluye también la forma activada de los anteriormente identificados derivados de la proteína C humana.

Tratamiento - describe la gestión y el cuidado de un paciente con el fin de combatir una enfermedad, condición o desorden, bien eliminando la enfermedad, condición o desorden, o bien profilácticamente previniendo la aparición de síntomas o complicaciones de la enfermedad, condición o desorden.

Inyección continua - introducción de una solución o suspensión en una vena durante un periodo de tiempo determinado sustancialmente de forma ininterrumpida y continua.

Inyección en bolus - la inyección de un fármaco en una cantidad definida (llamada bolus) durante un periodo de tiempo hasta aproximadamente 120 minutos.

Adecuado para administración - una formulación o solución liofilizada apropiada para que se suministre como agente terapéutico.

Forma de unidad de dosificación - se refiere a una unidad físicamente diferenciada y adecuada como dosificación unitaria para sujetos humanos, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado y está asociada con un excipiente farmacéuticamente adecuado.

Estados hipercoagulables - coagulabilidad excesiva asociada con la coagulación intravascular diseminada, condiciones pretrombóticas, activación de la coagulación o deficiencia congénita o adquirida de factores de coagulación tales como la PCa.

Deficiencia de proteína C - la deficiencia de proteína C, tal como se utiliza aquí, puede ser congénita o adquirida. Para cada tipo, el nivel de proteína C en circulación es menor que el límite mínimo del rango normal. Los expertos en la materia reconocen que el rango normal se establece por un protocolo estándar, utilizando equipos homologados FDA y equipos de diagnóstico para determinar los niveles de proteína C.

Cantidad farmacéuticamente efectiva - una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto farmacéutico. La dosis particular del compuesto administrado, según esta invención, se determinará según la evaluación física de las circunstancias particulares que rodean el caso, incluyendo el compuesto administrado, la condición particular que se esté tratando, las características del paciente y otras consideraciones similares.

Síndromes coronarios agudos - manifestaciones clínicas de arterosclerosis coronaria complicada por la ruptura de la placa coronaria, trombosis coronaria y flujo de sangre coronario puesto en peligro y que resulta en isquemia coronaria y/o infarto de miocardio. El espectro de síndromes coronarios agudos incluye angina inestable, infarto de miocardio sin onda Q (es decir, sin elevación del segmento ST) e infarto de miocardio con onda Q (es decir, con elevación del segmento ST).

Terapia genética - un régimen terapéutico que incluye la administración de un vector, que contiene ADN que codifica una proteína terapéutica, directamente a las células afectadas en las que se producirá la proteína terapéutica. El tejido objetivo para la entrega del gen incluye, por ejemplo, músculo óseo, músculo liso vascular e hígado. Los vectores incluyen, por ejemplo, ADN plasmídico, liposomas, conjugados de proteína-ADN y vectores basados en un adenovirus o el virus de la herpes. La terapia genética la ha descrito, por ejemplo, Kessler et al., PNAS, USA, 93:14082-87, 1996.

Desórdenes trombóticos - un desorden relacionado con, o que se ve afectado por la formación o presencia de un coagulo de sangre en un vaso sanguíneo. Estos desórdenes incluyen, aunque no están limitados a, ataque, cierre abrupto seguido de angioplastia o colocación de un stent, y trombosis como resultado de cirugía vascular periférica.

Púrpura fulminante - lesiones equimóticas de piel, fiebre, hipotensión asociada con sepsis bacteriana, infecciones virales, bacterianas o protozoicas. Normalmente se encuentra presente la coagulación intravascular diseminada.

Inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) - se refiere a las formas del TFPI naturales o recombinadas. Esta proteína se cree que bloquea los coágulos por medio de tejidos en los vasos sanguíneos pequeños, lo que puede conducir a la lesión de un órgano y a la muerte.

Serpina - cualquiera de las proteínas de un grupo de proteínas relacionadas estructuralmente y que típicamente son inhibidores de la serina proteasa y cuya actividad inhibidora se confiere a un lugar reactivo en un bucle de péptido altamente variable y móvil que incluye, aunque no está limitado a, un inhibidor de la proteína C (IPC) y \alpha_{1}-antitripsina (\alpha_{1}-AT).

Secuencia de reconocimiento del inhibidor S2: el 2º residuo N-terminal para la ruptura puntual del IPC o \alpha_{1}-AT.

Secuencia de reconocimiento del inhibidor S3': el 3er residuo C-terminal para la ruptura puntual del IPC o \alpha_{1}-AT.

Secuencia de reconocimiento del inhibidor S4': el 4º residuo C-terminal para la ruptura puntual del IPC o \alpha_{1}-AT.

Proteína C de cepa natural - el tipo de proteína C que predomina en la población natural humana, en contraste con las formas de polipéptidos de proteína C mutadas de forma natural o en el laboratorio.

Proteína incrementadota de la permeabilidad bacteriana - incluye el incremento de la permeabilidad bacteriana (IPB) en la proteína, que se produce de forma natural y por recombinación; fragmentos de polipéptidos biológicamente activos naturales, sintéticos y recombinados del IPB en la proteína; variantes de polipéptidos biológicamente activos del IPB en la proteína o en fragmentos, incluyendo las proteínas de fusión híbridas y dímeros; análogos de variantes biológicamente activas de la proteína IPB o sus fragmentos o sus variantes, incluyendo análogos de cisteína sustituida; y péptidos derivados del IPB. La secuencia de aminoácidos completa del IPB humano, así como la secuencia nucleótida del ADN que tiene codificado al IPB, la elucidó Gray, et al., 1989, J.Biol. Chem 264:9505. La codificación de los genes recombinados y los procedimientos para la expresión del IPB en las proteínas, incluyendo el IPB de la holoproteína y fragmentos del IPB se describen en la patente de Estados Unidos número 5.198.541.

Las abreviaturas de los aminoácidos están aceptadas por la Oficina de patentes y marcas de Estados Unidos como se establece en 37 C.F.R. 1.822 (d) (1) (1998).

La presente invención proporciona derivados de la vitamina C, incluyendo sus formas activadas, que tienen actividad anticoagulante y resistencia a la inactivación por parte de las serpinas en comparación con la proteína C de cepa natural. La forma activa de los derivados de la PCa y PCa humana se puede generar in vitro por la activación del zimógeno recombinado de la proteína C humana o por la secreción directa de la forma activa de la proteína C. Los medios por los que ocurre esta activación no son críticos y los aspectos del proceso de esta invención incluyen algunos o todos estos medios de activación. Los derivados de proteína C humana se puede producir en células eucarióticas, animales transgénicos o plantas transgénicas, incluyendo, por ejemplo, la secreción en forma de zimógeno de las células AV12 o de las células 293 del riñón humano, y después purificándolos y activándolos por técnicas conocidas por los expertos en esta materia.

Los derivados preferenciales de la proteína humana de la presente invención incluyen S11G:Q32E:N33D:L194S, S11G:Q32E:N33D:L194S:T254S, H10Q:S11G:Q32E:N33D:L194S, H10Q:S11G:Q32E:N33D:L194S:T254S y sus formas activadas.

El derivado de la proteína C humana S11G:Q32E:N33D:L194S contiene un residuo de glicina en la posición 11 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de ácido glutámico en la posición 32 en lugar del residuo de glutamina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de ácido aspártico en la posición 33 en lugar del residuo de asparagina que normalmente se encuentra en esta posición y una serina en la posición 194 en lugar de la leucina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en la posición 194 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

El derivado de la proteína C humana S11G:Q32E:N33D:L194S:T254S contiene un residuo de glicina en la posición 11 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de ácido glutámico en la posición 32 en lugar del residuo de glutamina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de ácido aspártico en la posición 33 en lugar del residuo de asparagina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 254 en lugar del residuo de treonina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en las posiciones 194 y 254 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His, siempre que la posición 11 no sea Ser, la posición 32 no sea Gln y la 33 no sea Asn, la 194 no sea Leu y la 254 no sea Thr.

El derivado de la proteína C humana H10Q:S11G:Q32E:N33D:L194S contiene un residuo de glutamina en la posición 10 en lugar del residuo de histidina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de glicina en la posición 11 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de ácido glutámico en la posición 32 en lugar del residuo de glutamina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de ácido aspártico en la posición 33 en lugar del residuo de asparagina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición. Con las enseñanzas de la presente invención, los expertos en esta materia pueden apreciar que otras sustituciones de aminoácidos en estas posiciones conferirían mayor actividad anticoagulante y resistencia a la inactivación por parte de las serpinas en la molécula derivada resultante. Ejemplos de estas sustituciones de aminoácidos incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

El derivado de la proteína C humana H10Q:S11G:Q32E:N33D:L194S:T254S contiene un residuo de glutamina en la posición 10 en lugar del residuo de histidina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de glicina en la posición 11 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de ácido glutámico en la posición 32 en lugar del residuo de glutamina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de ácido aspártico en la posición 33 en lugar del residuo de asparagina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 254 en lugar del residuo de treonina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en las posiciones 194 y 254 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

Otras realizaciones de la presente invención que incluyen derivados de la proteína C humana son: S12K:L194S, S12K:L194S:T254S, H10Q:S11G:S12K:L194S, H10Q:S11G:S12K:L194S:T254S, S11G:L194S, H10Q:S11G:
L194S, S11G:L194S:T254S, H10Q:S11G:L194S, S11G:L194S:T254S, y sus formas activadas que tienen incrementada su actividad anticoagulante y resistencia a la inactivación por serpinas en comparación con la proteína C activada de cepa natural.

El derivado de la proteína C humana S12K:L194S contiene un residuo de lisina en la posición 12 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en la posición 194 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

El derivado de la proteína C humana S12K:L194S:T254S contiene un residuo de lisina en la posición 12 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 254 en lugar del residuo de treonina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en las posiciones 194 y 254 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

El derivado de la proteína C humana H10Q:S11G:S12K:L194S contiene un residuo de glutamina en la posición 10 en lugar del residuo de histidina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de glicina en la posición 11 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de lisina en la posición 12 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en la posición 194 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

El derivado de la proteína C humana H10Q:S11G:S12K:L194S:T254S contiene un residuo de glutamina en la posición 10 en lugar del residuo de histidina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de glicina en la posición 11 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de lisina en la posición 12 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 254 en lugar del residuo de treonina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en las posiciones 194 y 254 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

El derivado de la proteína C humana S11G:L194S contiene un residuo de glicina en la posición 11 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en la posición 194 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

El derivado de la proteína C humana H10Q:S11G:L194S contiene un residuo de glutamina en la posición 10 en lugar del residuo de histidina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de glicina en la posición 11 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en la posición 194 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

El derivado de la proteína C humana S11G:L194S:T254S contiene un residuo de glicina en la posición 11 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 254 en lugar del residuo de treonina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en las posiciones 194 y 254 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

Otras realizaciones preferenciales de la presente invención incluyen los derivados de la proteína C: S11G:Q32E:
L194S, S11G:Q32E:L194S:T254S, S11G:Q32E:N33F:L194S y S11G:Q32E:N33F:L194S:T254S y sus formas activadas que tienen incrementada su actividad anticoagulante y resistencia a la inactivación por serpinas en comparación con la proteína C activada de cepa natural.

El derivado de la proteína C humana S11G:Q32E:L194S contiene un residuo de glicina en la posición 11 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de ácido glutámico en la posición 32 en lugar del residuo de glutamina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en la posición 194 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

El derivado de la proteína C humana S11G:Q32E:L194S:T254S contiene un residuo de glicina en la posición 11 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de ácido glutámico en la posición 32 en lugar del residuo de glutamina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 254 en lugar del residuo de treonina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en las posiciones 194 y 254 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

El derivado de la proteína C humana S11G:Q32E:N33F:L194S contiene un residuo de glicina en la posición 11 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de ácido glutámico en la posición 32 en lugar del residuo de glutamina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de fenilalanina en la posición 33 en lugar del residuo de asparagina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en la posición 194 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

El derivado de la proteína C humana S11G:Q32E:N33F:L194S:T254S contiene un residuo de glicina en la posición 11 en lugar del residuo de serina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de ácido glutámico en la posición 32 en lugar del residuo de glutamina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de fenilalanina en la posición 33 en lugar del residuo de asparagina que normalmente se encuentra en esta posición, un residuo de serina en la posición 194 en lugar del residuo de leucina que normalmente se encuentra en esta posición y un residuo de serina en la posición 254 en lugar del residuo de treonina que normalmente se encuentra en esta posición. Otras sustituciones preferenciales de aminoácidos en las posiciones 194 y 254 incluyen Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, Ser, Lys, Gln, Leu, Thr y His.

Adicionalmente, los derivados de la proteína C humana de la presente invención incluyen supresiones, adiciones o sustituciones adicionales de los residuos de aminoácidos de los derivados de la proteína C descritos anteriormente que resultan en cambios que no afectan las características básicas de esta invención. Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos basándose en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. De esta forma, los derivados de la presente invención incluyen derivados que tienen una secuencia de aminoácidos que varían de las SEQ.ID.Nº 3, 4, 5 y 6 por sustituciones conservadoras, es decir, las que sustituyen un residuo por otro de características similares. Las sustituciones típicas se dan entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos de los ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos de Lys y Arg; o los residuos aromáticos de Phe y Tyr. Otros derivados son aquellos en los que se sustituyen, se suprimen o se añaden varios aminoácidos: 5-10, 1-5 ó 1-2 en cualquier combinación. Otra realización preferencial se basa en que la SEQ.ID.Nº 1 incluye la adición de la secuencia del péptido con la señal en el aminoácido 42 (pre-pro líder) como se ilustra en la figura 1 y que se muestra en la SEQ.ID.Nº 2.

Preferentemente, los derivados de la proteína C humana de la presente invención no sufren otras sustituciones o modificaciones. Es decir, las sustituciones se encuentran limitadas a los derivados de la presente invención.

Esta invención también proporciona compuestos de ADN para su utilización en la formación de derivados de la proteína C humana. Estos compuestos de ADN incluyen la secuencia del código de la cadena ligera del zimógeno de la proteína C o del zimógeno derivado de la proteína C humana que se encuentra adyacente, hacia abajo, y en lectura translacional con la secuencia pre-pro-peptídica del zimógeno de proteína C humana o del zimógeno derivado de la proteína C humana. Las secuencias de ADN tienen en su código preferentemente dipéptidos de Lys-Arg que se procesan durante la maduración de la molécula de proteína C, el péptido de activación y la cadena pesada del derivado de proteína C humana. De esta forma, los derivados de proteína C de la presente invención son polipéptidos con variantes o mutantes que contienen al menos 2, preferentemente de 2 a 6 aminoácidos, que difieren de la secuencia de la proteína C de cepa natural en la SEQ.ID.Nº 1 (que no contiene la secuencia señal del aminoácido 42) o el correspondiente aminoácido de cepa natural en la SEQ.ID.Nº 2 (que contiene la secuencia señal del aminoácido 42). De esta forma, un experto en esta materia reconoce que un derivado de la proteína C humana, que difiere de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de la proteína C de cepa natural identificada como SEQ.ID.Nº 1, se corresponde intrínsecamente con la secuencia de proteína C de cepa natural identificada como SEQ.ID.Nº 2 en la posición del aminoácido determinado después de eliminar la secuencia señal del aminoácido 42. Además, un experto en esta materia sabe que antes de la activación se escinden los residuos de lisina y arginina (posiciones 156 y
157).

Los expertos en la materia reconocerán que, debido a la degeneración del código genético, una variedad de compuestos de ADN pueden codificar los derivados descritos anteriormente. La patente de Estados Unidos número 4.775.624 describe la forma de la cepa natural de la molécula de proteína C humana. Los expertos en la materia podrían determinar fácilmente que cambios en las secuencias de ADN podrían codificar los derivados exactos que se exponen aquí. La invención no se limita a las secuencias de ADN expuestas. Consecuentemente, la construcción descrita anteriormente y los ejemplos que la acompañan para los compuestos preferenciales de ADN son meramente ilustrativos y no limitan el alcance de esta invención.

Todos los compuestos de ADN de la presente invención se prepararon por medio de mutagénesis puntual directa para modificar posiciones determinadas del zimógeno de proteína C humana. Los expertos en esta materia conocen bien la técnica de modificación de secuencias de nucleótidos por mutagénesis directa. Véase por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989).

Los derivados de la proteína C humana se pueden obtener por técnicas bien conocidas utilizando células eucarióticas, animales transgénicos o plantas transgénicas. Los expertos en la materia entienden inmediatamente que las células eucarióticas huéspedes incluyen, pero no están limitadas a, células HepG2, LLC-MK_{2}, CHO-K1, 293 o AV12. En la patente de Estados Unidos número 5.681.932 se describen ejemplos de estos tipos de células. Por otra parte, en las patentes de Estados Unidos con números 5.589.604 y 5.650.503 se encuentran ejemplos de la producción de transgénicos a partir de proteínas recombinadas.

Los expertos en la materia reconocen que una variedad de vectores son útiles en la expresión de una secuencia de ADN con interés en una célula eucariótica huésped. Los vectores adecuados para la expresión en las células de los mamíferos incluyen, aunque no están limitados a éstos: pGT-h, pGT-d; pCDNA 3.0, pCDNA 3.1, pCDNA 3.1+Zeo y pCDNA 3.1+Hygro (Invitrogen); y, pIRES/Hygro y pIRES/neo (Clonetech). El vector preferencial de la presente invención es pIG3 como se describe en el ejemplo 2.

Hay otras secuencias que pueden ser deseables y que permiten la regulación de la expresión de las secuencias de proteínas relativas al crecimiento de las células huéspedes. Los expertos en la materia conocen estas secuencias reguladoras y se pueden citar ejemplos que incluyen aquellas que ocasionan que la expresión de un gen se active o desactive como respuesta a un estímulo físico o químico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. En el vector se pueden encontrar otros tipos de elementos reguladores, como por ejemplo, secuencias aumentadas.

Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras se pueden unir a la secuencia de código previa a la inserción en el vector, como los vectores clónicos descritos anteriormente. Alternativamente, la secuencia de código se puede clonar directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias de control y una restricción adecuada puntual.

En algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia de código de tal forma que se pueda adjuntar a las secuencias de control con la orientación apropiada; es decir, manteniendo la estructura de lectura apropiada.

Los derivados de la proteína C sintetizados por alguno de estos procedimientos pueden sufrir modificaciones post-transaccionales, como la adición de decenas de gamma-carboxi-glutamatos, la adición de un eritro-beta-hidroxi-Asp (hidroxilación beta), la adición de cuatro oligosacáridos enlazados-Asn (glicoxilación) y la eliminación de una secuencia líder (residuos del aminoácido 42). Tales modificaciones post- transaccionales son necesarias para la producción y secreción eficiente de los derivados de la proteína C de las células de los mamíferos.

Se sabe que las modificaciones post-transaccionales de las proteínas recombinantes, como los derivados de la proteína C humana de la presente invención, pueden variar dependiendo de la célula huésped que se utilice para la expresión de la proteína recombinante. Por ejemplo, la modificación post-transaccional de la gamma carboxilación, que es esencial para la actividad anticoagulante de los derivados de la proteína C humana de la presente invención, puede ser mayor, algo menor o mucho menor que la gamma carboxilación de la proteína C de cepa natural derivada del plasma, dependiendo de la célula huésped utilizada (Yan et al., Bio/Technology 8(7):655-661, 1990). Tales diferencias en la gamma carboxilación proporcionan una base para la utilización de la mutagénesis específica puntual para cambiar posiciones determinadas en la molécula de proteína C humana que resultarán en un incremento de la actividad anticoagulante.

Una realización de la presente invención es el aumento de los niveles de producción y el incremento de la actividad específica de la proteína C gamma-carboxilada y/o de la proteína C con mayor actividad anticoagulante y resistencia a la inactivación por las serpinas, que se obtiene por la inhibición de la fosforilación del residuo de serina en la posición 12 tal como se describe en el ejemplo 1. Esta inhibición de la fosforilación se puede llevar a cabo reemplazando el residuo de serina de la posición 12 por un residuo de aminoácido no fosforilable por mutagénesis puntual directa, es decir, por un aminoácido que no sea Ser, Tyr o Thr, o por la inhibición de la quinasa responsable de la fosforilación del residuo de serina en la posición 12, por ejemplo, incluyendo un inhibidor de quinasa no tóxico en el cultivo del tejido medio utilizado para cultivar las células huéspedes.

De esta forma, una realización de la presente invención es un derivado de la proteína C humana con mayor actividad anticoagulante y mayor resistencia a la inactivación por serpinas comparado con la proteína C activada de cepa natural. Éste se produce en un proceso que incluye lo siguiente: la transformación de una célula huésped con un vector que contiene un ácido nucleico que codifica un derivado de la proteína C humana, el cultivo de las células huéspedes en un medio adecuado para la expansión del derivado de la proteína C humana, el aislamiento del derivado de la proteína C humana del cultivo medio, y la activación del derivado de la proteína C humana. Los procedimientos para la activación de las formas zimógeno de los derivados de la proteína C humana y de la proteína C humana a derivado de proteína C humana activada y proteína C humana activada son bien conocidos desde hace mucho tiempo. La proteína C humana se puede activar con trombina sola, con un complejo de trombina/trombomodulina, con RVV-X, con una proteasa del veneno de la víbora de Russell, con tripsina pancreática o con otras enzimas proteolíticas.

Adicionalmente, la presente invención también se refiere a la utilización de los derivados de la PCa con actividad anticoagulante incrementada y resistencia a la inactivación por serpinas, en comparación con la PCa de cepa natural, para la fabricación de un fármaco para el tratamiento de síndromes coronarios agudos que incluyen el infarto de miocardio y la angina inestable.

Los derivados de la proteína C humana recombinados de la presente invención son útiles también para el tratamiento de desórdenes trombóticos como ataques, cierre abrupto seguido de angioplastía o colocación de un stent, y trombosis como resultado de la cirugía vascular periférica.

Adicionalmente, los derivados de la proteína C humana recombinada de la presente invención son útiles para el tratamiento de desórdenes oclusivos vasculares o estados hipercoagulables asociados con sepsis, coagulación intravascular diseminada, trauma mayor, cirugía mayor, quemaduras, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, transplantes, trombosis de vena profunda, trombocitopenia inducida por heparina, enfermedad de las células en hoz, talasemia, fiebre hemorrágica viral, púrpura trombocitopénica trombótica y síndrome urémico hemolítico. En otra realización, los derivados de la proteína C humana recombinada de la presente invención son útiles para el tratamiento de la sepsis, en combinación con proteína incrementadota de la permeabilidad bactericida. Otro aspecto de esta invención consiste en que los derivados de la proteína C humana activados de la presente invención se combinan con agentes antiplaquetarios para tratar o prevenir varios desórdenes trombóticos.

Los derivados de la proteína C humana recombinada de la presente invención son útiles para el tratamiento de la oclusión trombótica arterial aguda, tromboembolia o estenosis de las arterias coronarias, cerebrales o periféricas o en injertos vasculares, en combinación con un agente trombolítico, como el activador de tejido plasminógeno, estreptoquinasa y compuestos relacionados o análogos.

En otra realización de la invención, los derivados de la proteína C humana recombinada de la presente invención se utilizan para el tratamiento de la sepsis junto con el inhibidor de la vía del factor tisular.

Otro aspecto de la invención incluye la utilización de los derivados de la proteína C humana de la presente invención en la fabricación de un fármaco para tratar las enfermedades y condiciones que se originan por la falta de proteína C, como ya se ha expuesto aquí. Este aspecto de la invención incluye alguna y todas las modificaciones de cualquier molécula de PCa que resulte en el incremento de la actividad anticoagulante y la resistencia a la inactivación por serpinas, en comparación con la PCa de cepa natural.

Los derivados de la proteína C humana se pueden formular según procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticas que incluyan como agente activo un derivado de la PCa y un agente de relleno farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, una formulación deseada sería una que fuera un producto liofilizado estable de gran pureza y que incluyera como agente de relleno sacarosa, trehalosa o rafinosa; una sal como cloruro sódico o potásico; un regulador como citrato sódico, tris-acetato o fosfato sódico, a un pH de entre 5,5 y 6,5 y un derivado activado de la proteína C humana.

Los derivados de la proteína C humana de la presente invención se pueden administrar a un nivel de dosis adecuada entendida, administrada y evaluada por el médico que evalúa las circunstancias particulares de cada caso. Preferentemente, la cantidad de derivado de PCa humana que se administre será aproximadamente de 0,01 \mug/kg/hr hasta aproximadamente 50 \mug/kg/hr. Más preferentemente, la cantidad de derivado de la Pca humana que se administre será aproximadamente de 0,01 \mug/kg/hr hasta aproximadamente 25 \mug/kg/hr. Incluso todavía más preferentemente, la cantidad de derivado de la PCa humana que se administre será aproximadamente de 0,01 \mug/kg/hr hasta aproximadamente 15 \mug/kg/hr. Incluso más preferentemente, la cantidad de derivado de la PCa humana que se administre será aproximadamente de 1 \mug/kg/hr hasta aproximadamente 15 \mug/kg/hr. Las cantidades preferentes de derivado de la PCa humana que se administren serán aproximadamente de 5 \mug/kg/hr hasta aproximadamente 10 \mug/kg/hr.

Preferentemente, los derivados de la PCa humana se administrarán parenteralmente para asegurarse que van directamente al fluyo sanguíneo de forma efectiva, inyectando una dosis de 0,01 mg/kg/día hasta aproximadamente 1,0 mg/kg/día, de una a seis veces al día y de uno a diez días. Más preferentemente, los derivados de la PCa humana se administrarán por dosis inyectables (2 veces al día) durante 3 días.

Alternativamente, los derivados de la PCa humana se administrarán por dosis de aproximadamente 0,01 \mug/kg/hr hasta aproximadamente 50 \mug/kg/hr mediante infusión continua de 1 a 240 horas.

Los rangos de plasma preferentes que se obtengan de la cantidad de derivado de la proteína C humana administrado serán de 0,02 ng/ml hasta menos de 100 ng/ml.

Otra alternativa consiste en que el derivado de la PCa humana se administrará inyectando una porción (1/3 a 1/2) por hora de la dosis apropiada, como una inyección en bolus por un tiempo de aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 120 minutos, seguido de infusiones continuas de las dosis apropiada hasta 240 horas.

Otra alternativa consiste en que el derivado de la PCa humana se administrará por medio de un catéter intracoronario como complemento a una angioplastía de alto riesgo (con y sin aplicación de stent y con o sin terapia de combinación con agentes antiplaquetarios). La cantidad de derivado de PCa humana que se administre irá desde aproximadamente 0,01 mg/kg/día hasta aproximadamente 1,0 mg/kg/día por infusión continua, inyección en bolus o una combinación de ambas.

Otra alternativa consiste en que los derivados de la PCa humana se administraran de forma subcutánea en una dosis de 0,01 mg/kg/día hasta aproximadamente 1,0 mg/kg/día, para asegurarse que su paso al flujo sanguíneo es lento. La fórmula para preparaciones subcutáneas se realizará utilizando procedimientos conocidos para preparar tales composiciones farmacéuticas.

La frase "combinado con" utilizada aquí, se refiere a la administración de agentes junto con PCa de forma simultánea, de forma secuencial o como combinación de estas formas. Son ejemplos de agentes adicionales los agentes antiplaquetarios, agentes trombolíticos y la proteína BPI.

Los derivados de la PCa humana descritos en esta invención han incrementado sustancialmente la actividad anticoagulante y la vida media del plasma en comparación con la PCa humana de cepa natural. Por lo tanto, estos compuestos requerirán bien una administración menos frecuente y/o una dosis menor. Finalmente, el aumento de la actividad anticoagulante de los derivados de la PCa humana y la resistencia a la inactivación por las serpinas se puede lograr por medio de las sustituciones de dos a seis aminoácidos, los cuales tienen menor probabilidad de ser inmunogénicos que los derivados de la PCa con más de tres aminoácidos sustituidos.

Ejemplo 1 Construcción y producción de un derivado de la proteína C

Los derivados de la proteína C humana se realizaron utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) y siguiendo procedimientos estándar. La fuente de la secuencia del código de la cepa natural fue pLPC plásmido (Bio/Technology 5:1189-1192, 1987). Se utilizó RCP universal incluyendo: PC001b; 5'-GCGATGTCTAGAccaccATG
TGGCAGCTCACAAGCCTCCTGC-3', que tiene codificada una zona de restricción XbaI (subrayada) utilizada para subclonar, una secuencia de consenso de Kozak (en minúsculas) (Kozak, J Cell Bilol 108(2):229-41, 1989), y la terminación 5' de la región codificada para la proteína C: PC002E; 5'-CAGGCATGATCACTAAGGTGCCCAGCTCTTCT
GG-3', que tiene codificada la terminación 3' de la región de codificación de la proteína C humana, e incluye una restricción puntual Bc1I (subrayada) para subclonarse. Todas las mutagénesis de dirección puntual se llevaron a cabo por la metodología RCP establecida, utilizando oligonucleótidos complementarios que contenían los cambios de secuencia deseados. La primera utilización del RCP se utilizó para amplificar dos fragmentos del gen de la proteína C; el fragmento 5' se generó utilizando PC001b y el cebador mutagénico antisentido, y el fragmento 3' se generó utilizando PC002e y el cebador mutagénico sentido. Los productos amplificados resultantes se purificaron por procedimientos estándar. Estos fragmentos se combinaron y luego se utilizaron como modelo para la segunda utilización del RCP utilizando como cebadores PC001b y PC002e. El producto RCP final se digirió como XbaI y Bc1I y se subclonó en un vector de expresión pIG3 digerido de forma similar. De forma similar se generó una construcción de cepa natural con RCP, utilizando los dos cebadores universales y el pLPC plásmico como modelo, seguido de una subclonación en pIG3. Las mutaciones se confirmaron secuenciando el ADN de las ramificaciones codificadas y no codificadas. El vector pIG3 se generó por la inserción de una "zona de entrada al ribosoma" (IRES) (Jackson, et al., Trends Biochem Sci 15(12):447-83, 1990) y un gen de proteína verde fluorescente (GFP) (Cormack, et al., Gene 173:33-38, 1996) en el vector de expresión de los mamíferos pGTD (Gerlitz, et al., Biochem J 295(Pt 1):131-40, 1993). Cuando un ADNc de interés se clona en múltiples zonas de clonación del pIG3, el promotor GBMT (Berg, et al., Nucleic Acids Res 20(20):5485-6, 1992) guía la expresión del ARNm bicistrónico (5' - ADNc - IRES - GFP - 3'). La translación eficiente del primer cistrón se inicia por ensamblaje clásico de subunidades de ribosomas en la estructura 5'-metilada del ARNm; mientras que la secuencia de la IRES desarticula la translación ineficiente normal de un segundo cistrón permitiendo que los ribosomas internos generen el ARNm. El acoplamiento del ADNc y la información transmitida a un único ARNm, traducido a proteínas independientes, permite ocultar los clones, mayormente producidos sobre la base de la intensidad de la fluorescencia. El vector de expresión también contiene un casete resistente a la ampicilina, para el mantenimiento del plásmido en E. Coli, y un gen DHFR de murina con las secuencias de expresión apropiadas para los objetos de selección y amplificación en la expresión de los tejidos de los mamíferos.

El adenovirus transformado de las células de hámster sirio AV12-664 creció en un medio Dulbecco's modified Eagle's con un suplemento del 10% de suero bovino fetal, 50 \mug/mL de gentamicina, 200 \mug/mL de Geneticin (G418), y 10 \mug/mL de vitamina K1. Un día antes de la transfección, las células se encontraban con una densidad de aproximadamente 10^{5} células/25 cm^{2}. Los plásmidos FspI-alineados se transfirieron utilizando, bien el método del fosfato cálcico (ProFection, Gibco BRL-Life Technologies) o FuGene-6 (Boehringer Mannheim), siguiendo las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 48 horas después de la transfección, el medio se reemplazó con un medio que contenía 250 nM de metotrexato para la selección. Las colonias resistentes al metotrexato se juntaron 2-3 semanas después de aplicarles una selección de drogas. Los cultivos se sometieron a fluorescencia y las células activadas se clasificaron según la intensidad fluorescente de su GFP (Cormack, 1996), el 5% de las células fluorescente de mayor intensidad se retuvieron y se expandieron. Para obtener el material para la purificación, las células recombinadas se cultivaron en una mezcla modificada de Dulbecco's modified Eagle's y Ham's F-12 con relación (1:3) conteniendo 1 \mug/mL de insulina humana, 1 \mug/mL de transferrina humana y 10 \mug/mL de vitamina K1. La mezcla condicionada se recogió, se ajusto a una concentración final de 5 nM de benzamidina y 5 nM de EDTA, pH 8,0, y la proteína C se purificó por medio de cromatografía de intercambio iónico como se describe en (Yan, et al., Bio/Technology 8:655-661, 1990). La proteína purificada se desaló y se concentró en Ultrafree-CL 30.000 NMWL unidades de filtración (Millipore) utilizando Buffer A (150 mN de NaCl, 20 mN de tris-HCl, pH 7,4) y se cuantificó por el ensayo BCA de Pierce, utilizando albúmina de suero bovino (BSA) como en la forma estándar.

Ejemplo 2 Mutantes resistentes a las serpinas

En este ejemplo se describe la utilización de mutagénesis puntual directa para cambiar determinadas posiciones en la molécula de proteína C humana, que disminuyen la inactivación por serpinas, y consecuentemente resultan en que el plasma tenga una vida media mayor. El reconocimiento de las secuencias de los dos inhibidores primarios de la PCa, \alpha_{1}-AT y PCI, revelan algunas diferencias que se pueden estudiar alterando los residuos de una PCa que interacciona con estas secuencias. La tabla I representa las secuencias reconocidas por la PCa. El punto de ruptura ocurre entre los dos residuos que aparecen en itálica. Los residuos que ocupan lugares específicos, S2, S3' y S4' aparecen subra-
yados.

En general, las zonas reconocidas en el factor Va son diferentes de las zonas del factor VIIIa o de los inhibidores, por lo tanto, es posible ingeniárselas para que la zona activa de la PCa se rompa preferentemente por el factor Va, que es el más crítico coagulante, mientras que al mismo tiempo disminuya la probabilidad de que la PCa quede inhibida por serpinas.

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TABLA I

1

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Particularmente, tres puntos de reconocimiento en la zona activa muestran diferencias características entre las secuencias de reconocimiento del sustrato y las secuencias de reconocimiento del inhibidor: S2 (el 2º residuo
N-terminal al punto de ruptura), S3' y S4'. El punto S2 se encuentra principalmente ocupado por residuos polares en las secuencias del factor Va; esto es diferente de PCI y \alpha_{1}-AT, que tienen residuos hidrofóbicos en esta posición. El punto S3' está ocupado por cadenas laterales polares en todas las secuencias de sustratos, pero es notable una cadena lateral hidrofóbica en la secuencia de \alpha_{1}-AT. El punto S4' se encuentra ocupado por residuos cargados en las tres secuencias del factor Va, pero esta ocupado por residuos hidrofóbicos en las secuencias del factor VIIIa y del inhibi-
dor.

Se crearon dos estructuras de modelos de sustratos de PCa basadas en las estructuras cristalinas de la PCa PPACK-inhibida (Mather, et al., EMBO J. 15(24):6822-6831, 1996) y trombina 3-inhibida Hirulog (Qiu, et al., Biochemistry 31(47):11689-97, 1992), y la energía minimizada utilizando un protocolo CHARMm:

(1) La secuencia representa la secuencia de ruptura del factor Va R506

(2) La secuencia de reconocimiento de \alpha_{1}-AT, con la Met sustituida por Arg (correspondiente a un polipéptido de \alpha_{1}-AT que exhibe una afinidad extremadamente alta por la PCa).

Estos modelos permiten la identificación de residuos que forman contactos críticos en estos tres puntos específicos. En la tabla II se resumen los residuos que pueden formar contactos específicos dentro de la zona activa y las sustituciones que se pueden esperar para proporcionar mejor especificidad y/o actividad. Generalmente, las mutaciones de los residuos que forman contactos dentro de los lugares secundarios específicos de la zona activa se designan para reflejar los cambios en el entorno que conduce a la especificidad de los derivados de la PCa humana, sin el reconocimiento de los dos inhibidores psicológicos primarios, y potencialmente incrementan la actividad proteolítica de los derivados de la PCa humana.

TABLA II Mutaciones construidas por la alteración de la especificidad

2

Ejemplo 3 Activación de la proteína C recombinada

La activación completa de las formas zimógeno de la proteína C y sus derivados se llevó a cabo por incubación con trombina-sefarosa. La trombina sefarosa se lavó con Buffer A. Se mezclaron 200 \muL de trombina-sefarosa empaquetada con 250 \mug de proteína C en 1 mL del mismo regulador y se incubaron a 37ºC durante cuatro horas con agitación suave en una plataforma rotatoria. Durante la incubación, el grado de activación de la proteína C se monitorizó por pequeñas granulaciones de la trombina-sefarosa, y se tomó para esta prueba una pequeña alícuota del sobrenadante para la actividad de la PCa utilizando el sustrato cromógeno S-2366 (DiaPharma). Una vez que la proteína C estuvo totalmente activada, la trombina-sefarosa se granuló, y se recogió el sobrenadante. La concentración de PCa se determinó por el ensayo BCA de Pierce, y la PCa se le realizaron ensayos directamente o se congeló en alícuotas a -80ºC. Todos los derivados se analizaron por SDS-PAGE con coloración por Coomassie-blue o con el análisis de Western Blot para confirmar la activación completa (Laemmli, Nature 227:680-685, 1970).

Ejemplo 4 Caracterización funcional

La actividad amidolítica de los derivados de la PCa humana recombinada se determinó por hidrólisis de los sustratos tripeptídicos S-2366 (Glu-Pro-Arg-p-nitroanilida), S-2238 (Pip-Pro-Arg-p-nitroanilida) y S-2288 (Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida).

Los ensayos se llevaron a cabo a 25ºC, en Buffer A conteniendo 1 mg Ml^{-1} BSA, 3 mM CaCl_{2} y 0,5 nM PCa. Las reacciones (200 \muL/well) se llevaron a cabo en una placa de microtitulación de 96 pocillos, y la actividad amidolítica se midió como el cambio de unidades/minuto de absorbancia a 405 nm tal como se monitorizó en un lector de placa de micrómetro cinético ThermoMax. Las constantes cinéticas se obtuvieron por la ecuación de Michaelis-Menten a partir de los datos de la velocidad adecuados a concentraciones variables de sustrato (16 \muM a 2 mM). Los cambios en A_{405} se convirtieron a moles de productos utilizando una longitud de vía de 0,53 cm (Molecular Devices Technical Applications Bulleting 4-1), y un coeficiente de extinción para la p-nitroanilida liberada de 9620 M^{-1} cm^{-1} (Pfleiderer, Methods Enzymol 19:514-521, 1970). La actividad anticoagulante se calculó midiendo la prolongación del tiempo de coagulación en el ensayo del tiempo de coagulación de la tromboplastina parcialmente activada (Helena Laboratories). Las reacciones de coagulación se monitorizaron en un lector de placa de microtitulación, midiendo el tiempo a Vmax en el cambio de turbidez.

Ejemplo 5 Inactivación de los derivados de PCa

La velocidad de inactivación de los derivados de PCa se determinó incubando plasma de conejo o plasma humano normal (Helena Labs) con 20 nM de PCa (o sus derivados) a 37ºC. La concentración de plasma fue del 90% (v/v) en la reacción reguladora final que contenía 150 mN de NaCl, 20 mN de tris, pH 7,4 y 1 mg mL^{-1} BSA. Las alícuotas se eliminaron en momentos determinados, y la actividad se midió como actividad amidolítica utilizando S-2366 a la concentración final de 1 mM. Las vidas medias medidas para los derivados de la PCa S11G:Q32E:N33D:L194S (GEDS), S11G:Q32E:N33D:L194S:T254S (GEDSS), H10Q:S11G:Q32E:N33D:L194S (QGEDS) y H10Q:S11G:Q32E:N33D:
L194S:T254S (QGEDSS) se resumen en la tabla III.

TABLA III

3

Ejemplo 6 Farmacocinética in vivo

Los experimentos de farmacocinética in vivo se llevaron a cabo en conejos normales para verificar los efectos observados in vitro en la vida media como resultado de las mutaciones. A un conejo consciente se le canuló una vena marginal de la oreja y una arteria central también de la oreja. Los derivados de la proteína C activada en Buffer A (300 \mug/ml) se utilizaron para administrar una dosis de 100 \mug/Kg o 0,1 mg/Kg de bolus a través de un catéter a la vena de la oreja. Se introdujo una muestra de sangre (0,45 ml) en una jeringuilla que contenía 0,05 ml de citrato al 3,8% con benzamida - se realizaron ajustes para compensar el espacio muerto de la jeringuilla/aguja para lograr una concentración final de 1 parte de citrato/benzamida por 9 partes de sangre. Se tomaron muestras a los 0, 2, 5. 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 300 y 360 minutos después del tratamiento, se centrifugó tan pronto como fue conveniente después de tomar las muestras y se alicuotaron 200 \mul de plasma en placas de 96 pocillos. El nivel de los derivados de la proteína C activada se determinó utilizando un ensayo de captura de enzimas (ECE), como ya estaba previamente descrito (Gruber, et al., Blood 79(9):2340-2348, 1992), y se comparó con los rangos estándar de 1 a 250 ng/mL diluidos en el plasma de conejo que se había extraído. Las vidas medias farmacocinéticas de los derivados de la PCa S11G:Q32E:N33D:L194S (GEDS), S11G:Q32E:N33D:L194S:T254S (GEDSS), H10Q:S11G:Q32E:N33D:L194S (QGEDS) y H10Q:S11G:Q32E:N33D:L194S:T254S (QGEDSS), obtenidas después de la administración del bolus intravenoso en los conejos, aparecen en la tabla IV. El valor medio T_{1/2} indica que todos los derivados de la PCa han incrementado su vida media en comparación con la PCa de cepa natural.

TABLA IV

4

Ejemplo 7 Eficacia antitrombótica en un modelo de trombosis en el conejo

El modelo del shunt arteriovenoso (AV) de la trombosis se utiliza frecuentemente como modelo altamente reproducible de trombosis, ya que imita las condiciones clínicas en las que la sangre circula a través de un aparato artificial, como un marcapasos cardiopulmonar o una máquina de diálisis. En el modelo de la trombosis por shunt AV del conejo anestesiado, la sangre se desvía durante un periodo fijo de una arteria carótida a través de un tubo de plástico, que es un shunt de 3 piezas, a la vena yugular. La sección central del tubo contiene un hilo sobre el que se va depositando el material trombótico. Mientras la fibrina y las plaquetas van formando el trombo, la fibrina predomina. La eficacia antitrombótica se determina por el modelo del shunt AV en el conejo, ya que en el conejo se prolonga la vida media funcional de las variantes con modificaciones en la zona activa.

Se evaluaron los derivados de la proteína C humana con resistencia a la inactivación por serpinas y actividad anticoagulante incrementada por comparación con la proteína C activa de cepa natural. Cada derivado se introdujo en el conejo de forma continua durante 75 minutos a una velocidad de 0,15 mg/Kg/hr. El periodo de trombosis de 15 minutos ocurrió entre 60 y 75 minutos. Se tomaron muestras de sangre para la determinación de las concentraciones de PCa y PTTa. Las mezclas se analizaron para buscar actividad anticoagulante en el total de la sangre, utilizando PTTa, y para buscar la concentración de plasma de la PCa, utilizando actividad amidolítica e inmunocaptura.

En la tabla V se representa el efecto antitrombótico de una dosis i.v. de 0,15 mg/Kg/hr, expresado como la media del peso del trombo para cada derivado y para la PCa de cepa natural (cn). Los resultados demuestran que los derivados de la proteína C humana con resistencia a la inactivación por serpinas y la actividad anticoagulante incrementada fueron mayores que los de la PCa de cepa natural.

TABLA V

5

<110> Gerlitz, Bruce E.

\hskip1cm

Jones, Bryan E.

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<120> DERIVADOS DE LA PROTEÍNA C

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<130> PCT - Global

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\vskip0.400000\baselineskip

<140>

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<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/179, 801

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<151> 2000-02-02

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/189, 197

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-03-14

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 12

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 419

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

6

7

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 461

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

8

9

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 419

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 419

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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12

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 419

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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14

15

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 419

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\vskip1.000000\baselineskip

16

17

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<210 > 7

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<211> 1260

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211>1386

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\vskip1.000000\baselineskip

19

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211>1386

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211>1386

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1386

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211>1386

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

23

Claims (10)

1. Un derivado de la proteína C que comprende la SEQ.ID.Nº 1 teniendo al menos 2 sustituciones de aminoácidos seleccionadas de los grupos constituidos por:

a) His en la posición 10 sustituida por Gln; Ser en la posición 11 sustituida por Gly; Ser en la posición 12 sustituida por Lys; Gln en la posición 32 sustituida por Glu; Asn en la posición 33 sustituida por Asp o Phe; y b) el aminoácido de la posición 194, 195, 228, 249, 254, 302 ó 316 sustituido por un aminoácido seleccionado de entre Ser, Ala, Thr, His, Lys, Leu, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly y Gln, donde al menos están presentes una sustitución del grupo a) y una sustitución del grupo b).

2. El derivado de la proteína C humana de la reivindicación 1 en el que el derivado de la proteína C humana se encuentra en su forma activada.

3. El derivado de la proteína C humana de la reivindicación 2 en el que el derivado se selecciona del grupo constituido por S11G:Q32E:N33D:L194S (SEQ.ID.Nº 3), S11G:Q32E:N33D:L194S:T254S (SEQ.ID.Nº 4), H10Q:S11G:
Q32E:N33D:L194S (SEQ.ID.Nº 5) y H10Q:S11G:Q32E:N33D:L194S:T254S (SEQ.ID.Nº 6).

4. Una molécula de ADN recombinado que codifica el derivado de la proteína C humana de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un derivado de la proteína C humana según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para utilizarlo como fármaco.

6. El uso del derivado de la proteína C humana de la reivindicación 2 para la fabricación de un fármaco para el tratamiento de una afección seleccionada del grupo constituido por: desórdenes oclusivos vasculares y estados hipercoagulables, estados de enfermedad que predisponen a una trombosis, deficiencia de proteína C y síndromes coronarios agudos seleccionados del grupo constituido por infarto de miocardio y angina inestable.

7. Una composición farmacéutica que comprende el derivado de la proteína C humana de una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 en un diluyente farmacéuticamente aceptable.

8. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 4.

9. Una célula huésped transformada por el vector según la reivindicación 7.

10. Un procedimiento para producir el derivado de la proteína C humana de la reivindicación 2 que comprende:

(a)

la transformación de la célula huésped con un vector que contiene un ácido nucleico que codifica el derivado de la proteína C humana de la reivindicación 2;

(b)

el cultivo de la célula huésped en un medio apropiado para la expresión de dicho derivado de la proteína C humana:

(c)

el aislamiento de dicho derivado de la proteína C humana del medio de cultivo; y,

(d)

la activación de dicho derivado de la proteína C humana.