ES2481420T3 - Variantes de proteína C activada con actividad citoprotectora pero con actividad anticoagulante reducida - Google Patents

Abstract

Una variante de proteína C activada recombinante, que comprende la mutación RR229/230AA y KKK191- 193AAA.

Description

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DESCRIPCIÓN

Variantes de proteína C activada con actividad citoprotectora pero con actividad anticoagulante reducida

Esta invención se llevó a cabo con el soporte del gobierno de los Estados Unidos según el Contrato Nº HL52246 de los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno de Estados Unidos tiene derechos sobre esta invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a variantes (mutantes) de proteína C y proteína C activada recombinante, una enzima que normalmente tiene actividades anti-trombótica, antiinflamatoria, y anti-apoptótica. Los mutantes de proteína C activada recombinante de la invención tienen una actividad anticoagulante marcadamente reducida, pero retienen una actividad anti-apoptótica (citoprotectora) casi normal, de forma que la relación de la actividad antiapoptótica a la actividad anticoagulante es mayor en las variantes que lo es en la proteína C activada de tipo natural

o endógena. Esta invención se refiere también a métodos de uso de estas variantes. Las variantes de proteína C activada de la invención son útiles como inhibidores de la apoptosis o muerte celular y/o como factores de supervivencia celular, especialmente para las células o tejidos del sistema nervioso y de los vasos sanguíneos, que están estresados o lesionados. La invención se refiere además al uso terapéutico de las variantes de esta invención en sujetos con riesgo de daños celulares causados al menos en parte por la apoptosis, y a composiciones terapéuticas que comprenden dichas proteínas mutantes, cuyas composiciones proporcionarán los beneficios citoprotectores deseados a la vez que aportan un menor riesgo de hemorragia, un efecto secundario de la terapia con proteína C activada.

Antecedentes de la invención

La proteína C es un miembro de la clase de los factores de coagulación serina-proteasas dependientes de la vitamina K. La proteína C fue originalmente identificada por sus actividades anticoagulante y profibrinolítica. La proteína C que circula en la sangre es un zimógeno inactivo que necesita la activación proteolítica para regular la coagulación sanguínea a través de un mecanismo complejo de retroalimentación natural. La proteína C humana se produce principalmente en el hígado como un único polipéptido de 461 aminoácidos. Esta molécula precursora se modifica después post-traducionalmente por (i) escisión de una secuencia señal de 42 aminoácidos, (ii) separación proteolítica desde el zimógeno de una cadena del residuo de lisina en la posición 155 y del residuo de arginina en la posición 156 para producir la forma de dos cadenas (esto es, cadena ligera de 155 residuos de aminoácidos unida por enlace disulfuro a la cadena pesada de 262 residuos de aminoácidos que contiene la serina proteasa), (iii) carboxilación de los residuos de ácido glutámico agrupados en los 42 primeros aminoácidos de la cadena ligera dando como resultado nueve residuos de ácido gamma-carboxiglutámico (GIa), y (iv) glucosilación en cuatro sitios (uno en la cadena ligera y tres en la cadena pesada). La cadena pesada contiene la tríada de serina proteasas de Asp257, His211 y Ser360.

De modo similar a la mayor parte de otros zimógenos de proteasas extracelulares y a los factores de coagulación, la proteína C tiene una estructura central de la familia de quimiotripsinas, que tiene inserciones y una extensión de Nterminal que hacen posible la regulación del zimógeno y de la enzima. Son de interés dos dominios con secuencias de aminoácidos similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF). Se conoce al menos una porción de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la proteína C del ser humano, mono, ratón, rata, hámster, conejo, perro, gato, cabra, cerdo, caballo, y vaca, así como las mutaciones y polimorfismos de la proteína C humana (véase GenBank acceso P04070). Se conocen otras variantes de proteína C humana que afectan a diferentes actividades biológicas.

La activación de la proteína C está mediada por la trombina, que actúa en el sitio entre el residuo de arginina en la posición número 15 de la cadena pesada y el residuo de leucina en la posición 16 (numeración de quimiotripsina) (Véase Kisiel, J. Clin. Invest., 64:761-769, 1976; Marlar et al., Blood, 59:1067-1072, 1982; Fisher et al. Protein Science, 3:588-599, 1994). Se ha demostrado también que otras proteínas incluyendo el Factor Xa (Haley et al., J. Biol. Chem., 264:16303-16310, 1989), veneno de víbora de Russell, y tripsina (Esmon et al., J. Biol. Chem., 251:2770-2776, 1976), escinden enzimáticamente y convierten la proteína C inactiva en su forma activada.

La trombina se une a la trombomodulina, un receptor de trombina unido a la membrana sobre la superficie luminal de las células endoteliales, bloqueando de este modo la actividad procoagulante de la trombina a través de su exositio I, y mejorando sus propiedades anticoagulantes, esto es, activando la proteína C. Como anticoagulante, la proteína C activada (APC, por sus siglas en inglés), ayudada por su cofactor proteína S, escinde los cofactores activados factor Va y factor VIIIa, que son necesarios en la ruta de coagulación intrínseca para mantener la formación de trombina (Esmon et al., Biochim. Biophys. Acta., 1477:349-360, 2000a), para obtener los cofactores inactivados factor Vi y factor VIIIi.

La activación de la proteína C mediada por el complejo trombina/trombomodulina se facilita cuando la proteína C se une al receptor de la proteína C endotelial (EPCR), que localiza la proteína C en la superficie de la membrana de la célula endotelial. Cuando se forma complejo con el EPCR, se inhibe la actividad anticoagulante de la APC; la APC expresa su actividad anticoagulante cuando se disocia del EPCR, especialmente cuando se une a fosfolípidos cargados negativamente sobre las membranas activadas de plaquetas o de células endoteliales.

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Los componentes de la ruta de la proteína C contribuyen no solamente a la actividad anticoagulante, sino también a las funciones anti-inflamatorias (Griffin et al., Sem. Hematology, 39:197-205, 2002). Los efectos anti-inflamatorios de la trombomodulina, atribuidos recientemente a su dominio tipo lectina, pueden proteger a los ratones frente al daño de los tejidos mediado por los neutrófilos (Conway et al., J. Exp. Med. 196:565-577, 2002). La proteína centrosomial murina CCD41 o centrociclina, implicada en la regulación del ciclo celular es idéntica al EPCR murino que carece de los primeros 31 aminoácidos del N-terminal (Rothbarth et al., FEBS Lett., 458:77-80, 1999; Fukodome and Esmon, J. Biol. Chem., 270:5571 -5577, 1995). El EPCR es estructuralmente homólogo a la familia de proteínas CD1 de la clase 1 de MHC, la mayoría de las cuales están implicadas en los procesos inflamatorios. Esta homología sugiere que la función del EPCR puede no estar limitada a su capacidad para localizar la APC o la proteína C en la membrana endotelial (Oganesyan et al., J. Biol. Chem., 277:24851-24854, 2002). La proteína C activada proporciona protección dependiente del EPCR frente a los efectos letales de la perfusión de E. coli en babuinos (Taylor et al., Blood, 95:1680-1686, 2000) y puede regular por reducción la producción de citocina proinflamatoria y alterar favorablemente la expresión del factor tisular o la presión sanguínea en diferentes modelos (Shu et al., FEBS Lett. 477:208-212, 2000; lsobe et al., Circulation, 104:1 171-1 175, 2001; Esmon, Ann. Med., 34:598-605, 2002).

La inflamación es la reacción del cuerpo a la lesión y la infección. En la inflamación están implicados tres sucesos principales: (1) aumento del suministro de sangre al área dañada o infectada; (2) aumento de la permeabilidad capilar posibilitada por la retracción de las células endoteliales; y (3) migración de los leucocitos fuera de los capilares y hacia el tejido circundante (de aquí en adelante denominada infiltración celular) (Roitt et al., Immunology, Grower Medical Publishing, New York, 1989).

Muchas enfermedades graves incluyen procesos inflamatorios subyacentes en los seres humanos. Por ejemplo, la esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central. En la esclerosis múltiple, los leucocitos circulantes infiltran el endotelio cerebral inflamado y dañan la mielina, dando como resultado trastornos en la conducción nerviosa y parálisis (Yednock et al., Nature 366:63-66 (1992)). El lupus eritematoso sistémico (SLE) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la presencia de daño en los tejidos causado por anticuerpos propios dirigidos a los antígenos. Los auto-anticuerpos unidos a los antígenos en diversos órganos llevan al daño de los tejidos mediado por el complemento y por las células inflamatorias (Theofilopoulos, A. N., Encyclopedia of Immunology, pp. 1414-1417 (1992)).

La APC no tiene solamente actividades anticoagulante y anti-inflamatoria sino también actividad anti-apoptótica. Se ha encontrado que el EPCR es un cofactor necesario para la actividad anti-apoptótica de la APC en ciertas células, ya que la activación por la APC del receptor 1 activado por proteasas (PAR-1) es dependiente del EPCR (Riewald et al., Science, 2296:1880-1882, 2002; Cheng et al., Nat. Med., 9:338-342, 2003; Mosnier and Griffin, Biochem. J., 373:65-70, 2003). La actividad anticoagulante de la APC implica la inactivación de los factores Va y VIIIa mientras que la citoprotección por APC implica dos receptores, EPCR y PAR-1. Se han encontrado niveles significativos de EPCR, por ejemplo, en las células madres hematopoyéticas de los huesos (Balazs, Blood 107:2317-21, 2006).

Se ha demostrado también que la APC inhibe potencialmente la apoptosis inducida por la estaurosporina en las células endoteliales in vitro mediante la modulación de la expresión de subunidades NFкB (Joyce et al., J. Biol. Chem., 276:11199-11203, 2001). La apoptosis inducida por estaurosporina en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y la lesión de las HUVEC mediada por el factor-α de necrosis tumoral, basadas en el perfil transcripcional, dan a entender que la inhibición de las señales NFкB de la APC causa una regulación por reducción de las moléculas de adhesión (Joyce et al., supra, 2001). La inducción de genes anti-apoptóticos por la APC (p.ej., proteína A1 relacionada con Bcl2 o Bcl2A1, inhibidor de apoptosis 1 o clAP1, óxido nítrico sintasa endotelial o eNOS) se ha interpretado como un posible mecanismo ligado a los efectos anti-apoptóticos de la APC en un modelo de apoptosis por estaurosporina.

Como se usa aquí, el término septicemia se define como una infección sospechada o probada más un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (por ejemplo, fiebre, taquicardia, taquipnea, o leucocitosis); como se usa aquí, la frase septicemia severa se define como septicemia con disfunción orgánica (por ejemplo, hipotensión, hipoxemia, oliguria, acidosis metabólica, trombocitopenia, u obnubilación) (Russell, New Engl. J. Med 355(16) 1699-713, 2006). De modo importante, en muchos casos de septicemia, no es posible establecer la causa de una infección.

La proteína C activada tiene una notable capacidad para reducir todas las causas de mortalidad a los 28 días en un 19 % de los pacientes con septicemia severa (Bernard et al., New Engl J Med 344 699-709, 2001a), mientras que, agentes anticoagulantes potentes tales como antitrombina III y TFPI recombinante han fallado en ensayos clínicos similares de fase III (Warren et al., JAMA, 286 1869-1878, 2001, Abraham et al., Crit Care Med , 29 2081-2089). La explicación de esta diferencia puede estar en la actividad anti-apoptótica recientemente descrita de la APC, así como en su actividad antiinflamatoria. Los resultados clínicos satisfactorios de la APC en el tratamiento de la septicemia pueden estar relacionados con sus efectos celulares directos que median en su actividad anti-apoptótica

o anti-inflamatoria.

A pesar de los numerosos estudios in vivo que documentan los efectos beneficiosos de la APC, hay información limitada acerca de los mecanismos moleculares responsables de los efectos anti-apoptóticos y anti-inflamatorios directos de la APC sobre las células. La APC puede modular directamente la expresión génica en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) con efectos notables sobre los genes anti-inflamatorios y de

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supervivencia celular (Joyce et al., supra, 2001, Riewald et al., supra, 2002). Riewald et al. han demostrado que este efecto directo de la APC sobre ciertas células requiere PAR-1 y EPCR (Riewald et al., supra, 2002), aunque no proporcionan datos que relacionen la actividad funcional de la APC con la señalización de PAR-1.

La proteína C activada recombinante (rAPC), similar a Xig[pi]s (EIi Lilly & Co ), está aprobada para el tratamiento de la septicemia severa (Hotchkiss and Karl, NEJM, 348 138-150, 2003, Russell, New Engl J Med 355(16) 1699-713, 2006) y puede tener eventualmente otras aplicaciones beneficiosas. Sin embargo, estudios clínicos han demostrado que el tratamiento con APC está asociado con un aumento del riesgo de hemorragias graves. Este aumento del riesgo de hemorragia representa una limitación importante de la terapia con APC. Si los efectos de la APC en la septicemia se pueden atribuir a sus actividades anti-inflamatoria y de supervivencia celular, es deseable un compuesto que mantenga la actividad anti-apoptótica o citoprotectora beneficiosa pero que tenga una menor actividad anticoagulante.

Compendio de la invención

Es un objetivo de esta invención proporcionar variantes (mutantes) de APC recombinante como compuestos terapéuticos o herramientas de investigación para uso en el alivio o prevención del daño celular asociado al menos en parte con la apoptosis. Otro objetivo de esta invención es proporcionar un medio para cribar los mutantes candidatos para uso de acuerdo con la invención.

La invención se dirige a variantes de la APC recombinante que proporciona una actividad anticoagulante reducida con respecto a la actividad anti-apoptótica en comparación con el tipo natural, y que, por lo tanto, tienen utilidad como agentes citoprotectores. La mutación de interés es RR229/230AA más KKK191-193AAA-APC (combinación de mutaciones de las argininas 229 y 230 en alaninas y de las lisinas 191, 192 y 193 en alaninas (de aquí en adelante '5A-APC”)). Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención proporciona una variante de proteína C activada recombinante que comprende la mutación RR229/230AA y KKK191-19. Como se demuestra en esta memoria, la variante de APC, dada a modo de ejemplo, mantiene la propiedad deseable de una actividad anti-apoptótica, citoprotectora normal pero tiene un riesgo significativamente reducido de hemorragia, dada su actividad anticoagulante reducida. Las variantes de APC de la invención proporcionan una relación de actividad antiapoptótica a actividad anticoagulante mayor que la de APC de tipo natural (esto es, >1,0).

La invención se refiere al uso de una variante de proteína C activada recombinante que comprende la mutación RR229/230AA y KKK191-193AAA, en un método de prevención o de alivio de un daño asociado al menos en parte con la apoptosis. Se refiere también al uso de una variante de proteína C activada recombinante que comprende la mutación RR229/230AA y KKK191-193AAA, en un método de tratamiento de sujetos con riesgo de daño celular asociado al menos en parte con la apoptosis. Estos sujetos incluyen pacientes con riesgo de daño para los vasos sanguíneos o para tejidos de diferentes órganos causados al menos en parte, por la apoptosis. Los pacientes en riesgo incluyen, por ejemplo, los que sufren septicemia (severa), lesiones por isquemia/reperfusión, ictus isquémico, infarto de miocardio agudo, enfermedades neurodegenerativas agudas o crónicas, o aquellos que sufren trasplante de órganos o quimioterapia, entre otras condiciones. Las variantes de APC de la invención deberían ser útiles para tratar a sujetos que se beneficiarán de las actividades protectoras de la APC que son independientes de la actividad anticoagulante de la APC. Las formas profármacos de estas variantes pueden incluir variantes de proteína C recombinante que, después de la conversión de la proteína C en APC, presentan una actividad anticoagulante reducida a la vez que retienen actividades protectoras celulares normales o casi normales. Por ejemplo, las variantes de proteína C, cuando están activadas, tendrán la relación deseada de actividad anti-apoptótica a actividad anticoagulante mayor que 1,0.

En otro aspecto de la invención, los mutantes de APC se pueden proporcionar como compuestos terapéuticos o en composiciones terapéuticas, que ofrecen efectos citoprotectores beneficiosos en las células, a la vez que tienen mucho menos riesgo de hemorragia. En una realización, la invención proporciona una composición terapéutica que comprende una cantidad eficaz de una variante de proteína C activada recombinante, en donde dicha variante incluye la mutación RR229/230AA y KKK191-193AAA. En otra realización, la invención proporciona una composición de al menos una variante de proteína C activada recombinante que comprende la mutación RR229/230AA y KKK191-193AAA, para uso en un método de tratamiento de un sujeto que sufre de hemoperfusión reducida, hipoxia, isquemia, ictus isquémico, radiación, oxidantes, lesión o traumatismo por reperfusión, comprendiendo dicho método el tratamiento del estrés o lesión celular en uno o más tipos de células del sujeto. En otro aspecto más de la invención, se proporcionan métodos de cribado de las variantes de APC recombinante candidatos que tienen actividad anticoagulante reducida pero que mantienen las actividades protectoras de las células y anti-inflamatorias beneficiosas. En una realización, la invención proporciona un método in vitro para seleccionar las variantes citoprotectoras potencialmente terapéuticas de proteína C activada recombinante o de proteína C recombinante, teniendo dicha proteína C activada o proteína C un dominio de proteasa, que comprende (a) mutar la proteína C activada recombinante en un bucle de superficie de dicho dominio de proteasa para producir una variante de proteína C activada; medir la actividad anticoagulante de dicha variante de proteína C activada; medir la actividad anti-apoptótica de dicha variante de proteína C activada; calcular la relación de la actividad anti-apoptótica a la actividad anticoagulante; e identificar la variante de proteína C activada como potencialmente terapéutica si dicha relación es mayor que 1,0; en donde la mutación es RR229/230AA y KKK191-193AAA; o (b) mutar la proteína C recombinante en un bucle de superficie de dicho dominio de proteasa para producir una variante de proteína C;

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convertir dicha variante de proteína C en una variante de proteína C activada; medir la actividad anticoagulante de dicha variante de proteína C activada; medir la actividad anti-apoptótica de dicha variante de proteína C activada; calcular la relación de la actividad anti-apoptótica a la actividad anticoagulante, e identificar la variante de proteína C como potencialmente terapéutica si dicha relación es mayor que 1,0; en donde la mutación es RR229/230AA y KKK191-193AAA. En otra realización, la invención proporciona un método in vitro para seleccionar las variantes citoprotectoras potencialmente terapéuticas de proteína C activada recombinante, que comprende (a) proporcionar un banco de agentes candidatos que son variantes de proteína C o variantes de proteína C activada, en donde dicha proteína C o proteína C activada tiene un dominio de proteasa, en donde dichas variantes comprenden al menos una mutación en un residuo en un bucle de superficie de dicho dominio de proteasa, y en donde dichas variantes de proteína C son capaces de ser convertidas en variantes de proteína C activada; (b) convertir dichos agentes candidatos que son variantes de proteína C en variantes de proteína C activada; (c) determinar la actividad antiapoptótica de dichas variantes de proteína C activada de (a) o (b) en una o más células estresadas o lesionadas mediante exposición de dichas células a una concentración de estaurosporina que induce la apoptosis en presencia de una cantidad de un agente candidato; (d) determinar la actividad anticoagulante de dichos agentes candidatos que se ensayan en (c) realizando un ensayo de coagulación de tiempo de protrombina diluida, (e) calcular la relación de la actividad anti-apoptótica determinada en (c) con respecto a la actividad anticoagulante de (d); y (f) seleccionar los agentes candidatos que tienen una relación de actividad anti-apoptótica:anticoagulante mayor que 1,0; en donde dicha mutación es RR229/230AA y KKK191-193AAA. También se proporciona por la invención un agente seleccionado por un método de cualquier aspecto.

Dado el riesgo de hemorragia asociado con la terapia de proteína C activada de tipo natural, los mutantes de APC de esta invención ofrecen ventajas sobre las APC recombinantes de tipo natural actualmente disponibles. Por lo tanto, se espera que los mutantes de APC de la invención proporcionen una terapia superior, ya sea solos o junto con otros agentes, siempre que la APC pueda ser utilizada por sus actividades anti-inflamatoria o anti-apoptótica o de supervivencia celular, en lugar de únicamente por su actividad anticoagulante.

Descripción de los dibujos

Figuras 1a-1b: Inhibición de la apoptosis inducida por estaurosporina (STS) en células endoteliales Eahy926 por APC recombinante de tipo natural (rwt-APC) y variantes de APC recombinante. En esta figura y otras figuras, 3K3A-APC designa KKK191-193AAA-APC, 229/230-APC designa RR229/230AA-APC y 306-314-APC designa R306A/K311A/R312A/R314A-APC. Figura 1a: reducción dosis-dependiente de la apoptosis inducida por STS expresada como porcentaje de células apoptóticas. Figura 1b: reducción dosis-dependiente de la apoptosis inducida por STS con datos normalizados como porcentaje de células apoptóticas con respecto a STS control (sin APC).

Figura 2: Relación de la actividad anti-apoptótica (citoprotectora) a la actividad anticoagulante para la APC de tipo natural y variantes de APC recombinante.

Figuras 3a-3b: Actividad amidolítica y anticoagulante de APC recombinante de tipo natural (rwt-APC) y variantes de APC. En esta figura y otras figuras, S360A-APC designa el mutante Ser360Ala-APC en el que el residuo de serina del sitio activo es reemplazado por alanina. a, Actividad amidolítica de APC recombinante de tipo natural y de variantes de APC frente al sustrato de cromógeno pequeño, S-2366. b, Actividad anticoagulante de APC recombinante de tipo natural y de variantes de APC determinada utilizando ensayos de tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT). Cada punto representa la media ± SEM (error estándar de la media) de al menos tres experimentos independientes. Los símbolos indican □ rwt-APC, , RR229/230AA-APC, ◊, KKK191-193AAA-APC, ■, S360A-APC.

Figuras 4a-4c: Actividad anti-apoptótica de APC recombinante de tipo natural (rwt-APC) y variantes de APC con anticoagulación afectada. a, Inhibición de la apoptosis inducida por estaurosporina (STS) por la APC (véase Métodos). El porcentaje de células endoteliales apoptóticas observadas en ausencia de APC añadida (18 % de todas las células) se tomó como 100 %. Cada punto representa la media ± S. E. M. de al menos tres experimentos independientes. Los símbolos utilizados indican: □ rwt-APC; , RR229/230AA-APC; ◊, KKK191-193AAA-APC; ■, S360A-APC; ●, sin estaurosporina. b, c, Reducción de células caspasa-3 activada positivas mediante rwt-APC y variantes de APC (25 µM, 5 h) después de la inducción de apoptosis por estaurosporina (2 μM, 4 h). b, Células caspasa-3 activada positivas expresadas como porcentaje del número total de células presente. Como se indica por la línea fina "sin STS", aproximadamente el 2 % de las células endoteliales fueron caspasa-3 activada positivas en ausencia de estaurosporina. Cada barra representa la media ± SEM (error estándar de la media) de dos a cuatro experimentos independientes. c, Análisis de inmunofluorescencia de células caspasa-3 activada positivas utilizando un anticuerpo específico de la caspasa-3 activada (rojo) y tinción nuclear con DAPI (azul). Las columnas representan campos idénticos. El aumento original fue de 200x.

Figura 5: La inhibición de la apoptosis por la rwt-APC y las variantes de APC requiere PAR-1 y EPCR. Se estudió la dependencia de PAR-1 y EPCR para la inhibición de la apoptosis de las células endoteliales inducida por estaurosporina por la rwt-APC y las variantes de APC con anticoagulación afectada utilizando anticuerpos de bloqueo frente a PAR-1 (barras abiertas) (combinación de WEDE-15 a 20 μg/mL y ATAP-2 a 15 μg/mL) o frente a EPCR (barras sombreadas) (anti-EPCR de conejo a 20 μg/mL). Las barras sólidas representan "sin anticuerpos añadidos". Se incubaron las células con rwt-APC o con variantes de APC (5 nM) 5 h antes de la inducción de la

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apoptosis por la estaurosporina (10 μM, 1 h). Se analizó la apoptosis mediante la absorción del colorante Apopercentage y se expresó como un porcentaje con respecto al porcentaje de células apoptóticas observadas en ausencia de APC añadida (20 % de todas las células), que se fijó como el 100 %. La barra con "líneas verticales" representa la apoptosis relativa en ausencia de APC y de estaurosporina. Cada barra representa la media ± SEM (error estándar de la media) de al menos tres experimentos independientes.

Figura 6: Escisión del péptido TR33-62 del N-terminal de PAR-1 en Arg41 mediante la rwt-APC y variantes de APC. Se utilizó la HPLC para monitorizar la escisión de TR33-62 por la APC a lo largo del tiempo como la desaparición del pico del sustrato de péptido TR33-62 (símbolos abiertos) y como la aparición del pico del producto péptido TR42-62 (símbolos sólidos). Los símbolos indican: ■,□: rwt-APC; ●,: RR229/230AA-APC; ♦,◊: KKK191-193AAA-APC y X,X: S360A-APC. Los datos individuales reunidos de 3-5 experimentos independientes se muestran para la rwt-APC y las dos variantes de APC anti-apoptóticas. No se observó ninguna escisión para la S360A-APC que carece del sitio activo Ser (X). Las barras de error indican ± SEM (error estándar de la media)

Figura 7: Actividad amidolítica de la rwt-APC, 5A-APC y S360A-APC.

Figura 8: Actividad anticoagulante de la rwt-APC, 5A-APC y S360A-APC.

Figura 9: Inhibición de la liberación de TNFα inducida por LPS a partir de los monocitos mediante rwt-APC y 5A-APC.

Figura 10: Inhibición de la liberación de IL-6 inducida por LPS a partir de los monocitos mediante rwt-APC y 5A-APC.

Figura 11: Inhibición de la apoptosis de las células endoteliales inducida por estaurosporina mediante rwt-APC y 5A-APC.

Figuras 12a-12b: Semivida de las especies de APC en plasma humano (los datos convertidos a porcentaje de actividad con respecto al tiempo = 0). Figura 12a: Porcentaje de actividad amidolítica frente al tiempo (semilogarítmico); Figura 12b: Porcentaje de actividad amidolítica frente al tiempo

Descripción detallada de la invención

La proteína C activada (APC) ha sido considerada tradicionalmente como una enzima anticoagulante en la cascada de la coagulación, que inhibe la formación de trombina y la subsiguiente formación de coágulos de fibrina mediante la inactivación de los cofactores factor Va y factor VIIIa (Esmon, supra, 2000a). Sin embargo, la proteína C activada tiene también la notable capacidad de reducir la mortalidad en la septicemia severa (Bernard et al., supra, 2001a; Bernard et al., Crit. Care Med., 29:2051-59, 2001b; Hinds, Brit. Med. J., 323:881-82, 2001; Kanji et al., Pharmacother., 21 :1389-1402, 2001), mientras que otros anticoagulantes tales como antitrombina III y el inhibidor de la ruta del factor tisular han fallado en esta capacidad (Warren et al., supra, 2001; Abraham et al., supra, 2001). Esta propiedad de la APC ha captado el interés de los investigadores en las actividades directas anti-inflamatoria y anti-apoptótica, estudiadas menos extensamente, atribuidas a la APC (véase, p.ej., Cheng et al. Nat. Med., 9:33842, 2003; Domotor et al., Blood, 101 :4797-4801, 2003; Fernandez et al., Blood Cells MoI. Dis., 30:271-276, 2003; Esmon, J. Autoimmun., 15:113-116, 2000b). La APC tiene también potencial para proteger al cerebro del daño causado por el ictus isquémico (Cheng et al., supra, 2003; Esmon Thrombos Haemostas, 83:639-643, 2000c).

Una preocupación principal para el uso de la APC como un compuesto terapéutico es el aumento del riesgo de complicaciones hemorrágicas (Bernard et al., supra, 2001a, Bernard et al., supra, 2001b) debido a la actividad anticoagulante de la APC. Las variantes de APC de esta invención resuelven este problema por tener una actividad anticoagulante reducida con respecto a la APC endógena o la APC recombinante de tipo natural, a la vez que retienen la actividad anti-apoptótica beneficiosa. La diferenciación de la actividad anticoagulante de la actividad antiapoptótica fue el primer paso para resolver este problema. Los autores de esta invención se han centrado en parte sobre el papel del EPCR en la regulación de estas actividades.

El EPCR fue descubierto originalmente como un receptor capaz de unirse a la proteína C y a la proteína C activada con iguales afinidades (Fukodome and Esmon, supra, 1995), y se demostró que el EPCR mejora la activación de la proteína C mediante el complejo de trombina-trombomodulina (Steams-Kurosawa, et al., Proc Natl Acad Sci , USA, 93 10212-10216, 1996), aparentemente por la optimización de la localización espacial de la proteína C para una activación eficaz mediante trombina unida a trombomodulina. Es de suponer que el EPCR une la APC a la superficie endotelial y posiciona el sitio activo de la APC cerca del sitio de escisión de PAR-1 en Arg41. Paradójicamente, aunque la función del EPCR podría ser anticoagulante por estimular la activación de la proteína C (Steams-Kurosawa, et al., supra, 1996), la actividad anticoagulante de la APC se inhibe en realidad cuando la APC se une al EPCR soluble (Regan et al., J Biol Chem , 271 17499-17503, 1996). Puesto que la unión de la APC al EPCR es esencial para la actividad anti-apoptótica de APC, se ha llegado a la conclusión de que la actividad anti-apoptótica de la APC es independiente de su actividad anticoagulante. Los autores de esta invención plantean como hipótesis que se podrían generar ciertos mutantes de APC que carecen de actividad anticoagulante pero que retienen la actividad anti-apoptótica. Dichos mutantes podrían ser terapéuticamente útiles si proporcionaran a los pacientes actividad directa de supervivencia celular sin aumentar los riesgos de hemorragia.

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Se han determinado en esta invención los elementos estructurales de APC requeridos para su actividad antiapoptótica, mediante el ensayo de diferentes formas de APC para su actividad anti-apoptótica. La apoptosis inducida por estaurosporina se bloqueó por pretratamiento de la APC con un anticuerpo monoclonal anti-APC o por desnaturalización por calor de la APC, estableciendo de este modo la especificidad de la actividad anti-apoptótica de la APC (Mosnier and Griffin, supra, 2003). Se ha encontrado que la inhibición mediada por la APC de la apoptosis inducida por estaurosporina requiere el sitio activo de APC, puesto que el zimógeno de proteína C inactivo, así como un mutante de APC inactivo, en el cual el sitio activo Ser fue reemplazado por Ala, S360A-APC (Gale et al., Protein Sci, 6 132-140, 1997), carecían de actividad anti-apoptótica (Mosnier and Griffin, supra, 2003). Esto implica que la actividad anti-apoptótica de APC está mediada por la proteolisis.

No se conocía si la inhibición mediada por APC de la apoptosis inducida por estaurosporina (Joyce et al., supra, 2001) era dependiente de PAR-1 y EPCR, hasta que los autores de esta invención demostraron que la inhibición por la APC de la apoptosis inducida por estaurosporina era dependiente de PAR-1 y EPCR utilizando un modelo modificado de apoptosis inducida por estaurosporina con células endoteliales EAhy926 (Mosnier and Griffin, supra, 2003). Se ha demostrado también que la inhibición de la apoptosis inducida por hipoxia en las células endoteliales del cerebro humano requiere el PAR-1 (Cheng et al., supra, 2003). Por lo tanto, consecuentemente con la implicación de que se requiere el sitio proteolítico activo de APC para la inhibición de la apoptosis, la preincubación de células con anticuerpos bloqueantes frente a PAR-1, pero no frente a PAR-2, suprimió la inhibición mediada por APC de la apoptosis inducida por estaurosporina (Mosnier and Griffin, supra, 2003). Además, la actividad antiapoptótica de APC fue abolida por un anticuerpo anti-EPCR que bloquea la unión de APC a EPCR (Mosnier and Griffin, supra, 2003), y los controles demostraron que este efecto del anticuerpo anti-EPCR fue neutralizado por la preincubación del anticuerpo con su inmunógeno peptídico (Mosnier and Griffin, supra, 2003). Por lo tanto, basándose en los estudios de bloqueo por anticuerpo, se necesitan PAR-1 y EPCR para que la proteína C activada inhiba la apoptosis de células endoteliales, inducida por estaurosporina.

Este requerimiento de PAR-1 y EPCR para la inhibición de la apoptosis inducida por estaurosporina de las células endoteliales EAhy926 también es concordante con el hallazgo de que estos receptores son importantes para la actividad anti-apoptótica de la APC en la fijación de las células endoteliales microvasculares del cerebro hipóxico (Cheng et al., supra, 2003).

La proteína C activada (APC) puede escindir un polipéptido PAR-1 de N-terminal extracelular sintético en Arg41, el sitio de escisión de la trombina (Kuliopulos et al., Biochemistry, 38 4572-4585, 1999). La escisión de este polipéptido PAR-1 sintético por APC es 5.000 veces más lenta que por la trombina (Kuliopulos et al., supra, 1999). Cuando la trombina escinde el PAR-1 en Arg41, se podrían iniciar rutas potentes de señalización celular. Es probable que la escisión por APC de PAR-1 en Arg41 inicie las señales celulares, incluyendo la fosforilación de MAP cinasa (Riewald et al., supra, 2002). En las células endoteliales del cerebro sometidas a hipoxia, un resultado precoz de señalización de APC es la inhibición de incrementos en los niveles de p53 (Cheng et al., supra, 2003). Los estudios previos sugieren que la APC altera directamente los perfiles de expresión génica de las HUVEC de modo que se regulan por incremento varios genes anti-apoptóticos (Joyce et al., supra, 2001, Riewald et al., supra, 2002) y que la APC regula específicamente por reducción los niveles del factor pro-apoptótico, Bax, a la vez que regula por incremento los niveles del factor anti-apoptótico, Bcl-2, en las células endoteliales del cerebro (Cheng et al., supra, 2003). La alteración específica de la relación crítica de Bax/Bcl-2 probablemente es de importancia clave para la apoptosis. Aparte de estos sucesos, poco se puede indicar acerca de los mecanismos para la señalización de APC dependiente de PAR-1. Es interesante observar que el péptido agonista de PAR-1, TFLLRNPNDK, no presentó ninguna protección frente a la apoptosis inducida por estaurosporina de las células EAhy926 mientras que este agonista proporcionó un rescate parcial de las células endoteliales del cerebro a partir de la apoptosis inducida por hipoxia, lo que da a entender que hay ligeras, pero significativas, diferencias entre las actividades anti-apoptóticas de APC dependientes de PAR-1 en estos dos modelos.

Los datos in vivo son concordantes con una importante distinción entre las actividades anticoagulantes y actividades protectoras de las células de la APC. Se observaron efectos neuroprotectores inducidos por APC en un modelo murino de lesión por isquemia/reperfusión a dosis bajas de APC que no tenían ningún efecto sobre el depósito de fibrina ni sobre la recuperación del flujo sanguíneo, lo que indica que los efectos neuroprotectores de la APC, al menos en parte, eran independientes de la actividad anticoagulante de la APC (Cheng et al., supra, 2003).

No se observó inhibición de la apoptosis de células EAhy926 inducida por estaurosporina ni con péptidos agonistas de PAR-1 ni con péptidos agonistas de PAR-2 en ausencia de APC. Además, la trombina, el activador arquetipo de PAR-1, no inhibió la apoptosis inducida por estaurosporina (Mosnier and Griffin, supra, 2003). El fallo de estos otros activadores de PAR-1 para proporcionar actividad de supervivencia celular indica que los efectos anti-apoptóticos de la APC dependientes de PAR-1 para la apoptosis inducida por estaurosporina son específicos para la APC. Sin estar limitados a un mecanismo de acción, se puede especular que cuando la APC unida a EPCR escinde y activa el PAR-1, ocurre una modulación significativa de la señalización intracelular de PAR-1, en comparación con las señales provocadas por la trombina o el péptido agonista de PAR-1. Otra fuente potencial de complejidad puede surgir de la capacidad referida del EPCR para mediar en la translocación nuclear de la APC (Esmon, supra, 2000c). Las señales y rutas intracelulares que causan la inhibición de la apoptosis por APC en diversos sistemas de modelos celulares todavía tienen que ser elucidados.

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La relevancia fisiológica de la señalización de APC dependiente de EPCR via PAR-1 se demuestra además por los efectos neuroprotectores inducidos por la APC en un modelo murino de lesión por isquemia/reperfusión que requiere PAR-1 y EPCR (Cheng et al., supra, 2003). La APC puede actuar a través de EPCR y PAR-1 sobre las células endoteliales del cerebro estresadas, o el PAR-1 y el receptor-3 de proteasa activado (PAR-3) sobre las neuronas estresadas, para activar las rutas anti-apoptóticas y/o las rutas pro-supervivencia en estas células cerebrales estresadas y/o lesionadas. En el endotelio del cerebro humano in vitro y en animales in vivo (modelos de ictus isquémico y NMDA), la APC puede inhibir la ruta pro-apoptótica de señalización de p53 en células cerebrales estresadas o lesionadas (Solicitud de patente internacional Nº PCT/US03/38764).

Ejemplos

Las relaciones de estructura-actividad de la proteína C y de la proteína C activada se pueden estudiar utilizando polipéptidos variantes producidos con una construcción de expresión transfectada en una célula hospedante con o sin expresión de proteína C endógena. Por lo tanto, las mutaciones en dominios diferenciados de proteína C o proteína C activada se pueden asociar con actividad decreciente o incluso creciente en la función de la proteína.

Para generar las variantes de APC de esta invención, que proporcionan un riesgo reducido de hemorragia, esto es, actividad anticoagulante reducida, pero que mantienen una o más actividades citoprotectoras útiles, los autores de la invención han diseccionado la actividad anticoagulante de la actividad anti-apoptótica de APC mediante mutagénesis dirigida al sitio. Se identificaron varios aminoácidos en diferentes bucles de superficie del dominio de proteasa de la APC que, cuando se mutaron a alanina, redujeron gravemente la actividad anticoagulante pero no afectaron a la actividad anti-apoptótica. Estos resultados inesperados indican que las estrategias dirigidas a reducir la actividad anticoagulante a la vez que se preserva la actividad anti-apoptótica de APC son posibles y merecen la pena, porque lo más probable es que reduzcan las complicaciones de hemorragia asociadas con los usos clínicos actuales y futuros de las variantes de APC recombinante que mantienen las actividades citoprotectoras.

La base estructural de la actividad anticoagulante de APC ha sido centrada principalmente en la interacción de la APC con el factor Va. Los sitios de escisión de APC dentro del factor Va están localizados en los residuos Arg306, Arg506 y Arg679 y la escisión de los dos primeros está correlacionada con la pérdida de actividad del cofactor (Rosing and Tans, Thromb Haemost, 78 427-433, 1997, Kalafatis and Mann, J Biol Chem , 268 27246-57, 1993). La escisión del factor Va en Arg506 ocurre rápidamente y usualmente precede a la escisión en Arg306. Se considera por tanto el sitio predominante para la inactivación inicial de la molécula del factor Va (Norstrom et al., J Biol Chem , 278 249041133, 2003, Nicolaes, et al., J Biol Chem , 270 21 158-66, 1995). La interacción de APC con el sitio de escisión Arg506 en el factor Va ha sido extensamente caracterizada y como resultado se ha definido un sitio de unión del factor Va sobre la superficie cargada positivamente del dominio de proteasa de la APC (Gale et al., Blood, 96 585593, 2000, Gale et al., J Biol Chem 277 28836-28840, 2002, Friedrich et al., J Biol Chem, 276 23105-08, 2001a, Knobe et al., Proteins, 35 L218-234, 1999; Shen et al., Thromb Haemost, 82 72-79, 1999). Este exositio positivo para la unión del factor Va sobre la APC está generalmente localizado en la misma área que el exositio I de trombina de unión al anión y está compuesto de los residuos del bucle 37, que contiene los residuos 190-193 de la proteína C (equivalentes a los residuos 36-39 de quimiotripsina (CHT)), el bucle de unión al ion calcio que contiene los residuos 225-235 (CHT 70-80) y el bucle de autolisis que contiene los residuos 301-316 (CHT 142-153) (Mather et al., EMBO J., 15 6822-31, 1996). En adición, las mutaciones del bucle 60, que contiene los residuos 214-222 de proteína C (CHT 60-68) tienen poco efecto sobre la inactivación del factor Va por la APC aunque este bucle está implicado en las interacciones con trombomodulina y heparina (Gale et al., supra, 2002, Friedrich et al.,, supra, 2001a, Knobe et al., supra, 1999; Shen et al., supra, 1999, Friedrich et al., J Biol Chem , 276 24122-28, 2001b)

Gale et al. (supra, 2002) han demostrado que las mutaciones en los bucles de superficie de la APC afectan a su actividad anticoagulante. Se ha demostrado que los mutantes de APC KKK191-193AAA-APC (bucle 37), RR229/230AA-APC (bucle de calcio), RR306/312AA-APC (bucle de autolisis), RKRR306-314AAAA-APC (bucle de autolisis) tienen 10 %, 5 %, 17 %, y menos de 2 % de la actividad anticoagulante de la APC nativa, respectivamente. Posteriormente, los autores de esta invención han encontrado que estos mutantes de APC con actividad anticoagulante reducida KKK191-193AAA-APC, RR229/230AA-APC, y 5A-APC (véase, p. ej., Mosnier et al. (Blood 104 1740-1744, 2004)), y RR306/312AA-APC (Mosnier & Griffin, observaciones no publicadas)) mantienen la actividad anti-apoptótica de la APC en el modelo de apoptosis con estaurosporina.

Para demostrar que se podría distinguir entre las características estructurales de la APC necesarias para la actividad anticoagulante frente a la actividad protectora de las células, los autores de esta invención han estudiado formas variantes recombinantes de APC que habían reducido severamente la actividad anticoagulante. Utilizando combinaciones dobles, triples, cuádruples y quíntuples de mutaciones dirigidas al sitio en el sitio de APC de unión al factor Va, se han construido un conjunto de variantes de APC con actividad anticoagulante severamente reducida pero con una actividad enzimática esencialmente inalterada para los sustratos de péptidos pequeños (cromogénicos) (Gale et al., supra, 2000, Gale et al., supra, 2002). Se determinó la actividad anticoagulante en un ensayo de coagulación de protrombina diluida (Gale et al., supra, 2002). La actividad citoprotectora (anti-apoptótica) de los mutantes de APC se analizó en un modelo de apoptosis inducida por estaurosporina con células endoteliales EAhy926, con las modificaciones descritas por Mosnier and Griffin (supra, 2003). Se descubrió que la inhibición, mediada por la APC, de la apoptosis inducida por estaurosporina requería el sitio activo de la APC, puesto que el mutante de APC inactivo en el que el sitio activo de serιne360 estaba reemplazado por alanina (S360A-APC, véase

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la Tabla 1) (Gale et al., supra, 1997), estaba privado de actividad anti-apoptótica (Mosnier and Griffin, supra, 2003) (Figuras 1a y 1b). Se determinó la inhibición por la APC recombinante de la apoptosis inducida por estaurosporina en las células endoteliales Eahy926 mediante tinción por Apopercentage. La inhibición de la apoptosis por APC recombinante tipo natural (rwt-APC) era dosis-dependiente (Figura 1a). La inhibición semi-máxima de la apoptosis inducida por estaurosporina se alcanzó con rwt-APC 0,24 nM, utilizando una preincubación de 5 horas de la APC con las células antes de la adición de estaurosporina. Nótese la ausencia de actividad apoptótica en el mutante S360A-APC (Figura 1b). Las mutaciones descritas en los ejemplos 1-3 y sus actividades en % con relación al tipo natural se indican en la Tabla 1. También se indica en la Tabla 1 la relación de la actividad anti-apoptótica (citoprotectora) frente a la actividad anticoagulante para cada una de APC tipo natural y APC mutante de los ejemplos 1-3, como se describe en el ejemplo 4.

Tabla 1. Revisión de mutantes de APC (actividad anticoagulante determinada por el tiempo de protrombina diluida (PT))

mutante

secuencia de APC tipo natural (el subrayado está mutado a alanina) actividad citoprotectora (% de APC tipo natural) actividad anticoagulante (% de APC tipo natural)1 Relación citoprotectoraanticoagulante FVa inactivo Arg506 (Arg306) (% de APC tipo natural) actividad amidolítica1 (% de APC tipo natural) T1/2 (min)

rwt-APC

n/a 100 % 100 % 1,0 100 % (100 %) 100 % 21,4

229/230-APC

225-EYDLRRWEKWE235 89 % 6,6 % 13,5 25% (110%) 115 % 27,8

3K3A-APC

189-DSKKKL-194 120 % 15 % 8,0 11 % (67 %) 134 % 20,7

306-314-APC

305-SREKEAKRNRT315 <1 % 1,6 %2 0,6 1,4 % (16%) 75,6 % 46, 2

1de referencias (Gale et al. 1997, Gale et al. 2000, Gale et al. 2002) Véase texto y Métodos para más información 2 determinada por APTT en lugar de PT diluido n/a no aplicable, rwt-APC APC recombinante tipo natural, 229/230-APC, RR229/230AA-APC, 3K3A-APC, KKK191-193AAA-APC, 306-314-APC, RKRR306/311/312/314AAAA-APC

Ejemplo comparativo 1

El reemplazo de los dos residuos de arginina, Arg229 y Arg230, en el bucle de unión al calcio de la APC con residuos de alanina dio como resultado una forma de APC RR229/230AA-APC (229/230-APC), véase la Tabla 1) con un 6,6 % solamente de actividad anticoagulante residual. Esta reducción en la actividad anticoagulante de RR229/230AA-APC fue debida principalmente a la reducción de la inactivación del factor Va (FVa) en Arg506 mientras que la escisión del factor Va en Arg306 fue mucho menos afectada.

La dependencia de la dosis para la inhibición de la apoptosis por RR229/230AA-APC (Figuras 1a y 1b) fue similar a la de la APC recombinante de tipo natural (rwt-APC). La inhibición semi-máxima de la apoptosis inducida por estaurosporina por RR229/230AA-APC se alcanzó a 0,27 nM. Este ejemplo demuestra que la actividad anticoagulante de APC no es necesaria para la actividad citoprotectora (anti-apoptótica) de APC.

Ejemplo comparativo 2

En este ejemplo, un mutante de APC en el que tres residuos consecutivos de lisina en el bucle 37 fueron reemplazados con tres alaninas KKK191-193AAA-APC (3K3A-APC, véase la Tabla 1) presentó solamente un 15 % de actividad anticoagulante residual determinada en un ensayo de coagulación de protrombina diluida (Gale et al., supra, 2002). La reducción en la actividad anticoagulante de KKK191-193AAA-APC fue debida a la escisión severamente reducida del factor Va en Arg506 (11 % de la APC recombinante tipo natural), mientras que la inactivación del factor Va en Arg306 fue sólo moderadamente afectada (67 % de la APC recombinante tipo natural) (Tabla 1). Sorprendentemente, como se ve en las figuras 1a y 1b, la actividad anti-apoptótica de KKK191-193AAA-APC fue similar a la de la APC recombinante tipo natural con una inhibición semi-máxima de la apoptosis inducida por estaurosporina a 0,20 nM.

Ejemplo comparativo 3

En este ejemplo, cuatro de los cinco aminoácidos básicos en el llamado bucle de autolisis de APC fueron reemplazados por residuos de alanina, dando como resultado una forma de APC RKRR306/311/312/314AAAA-APC (306-314-APC, véase la Tabla 1) que tiene solamente el 1,6 % de actividad anticoagulante residual, determinada por

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el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) [765]. La reducción en la actividad anticoagulante de RKRR306/311/312/314AAAA-APC fue debida a la reducción severa de la escisión del factor Va en Arg506 (1,4 % de APC recombinante tipo natural) mientras que la inactivación del factor Va en Arg306 se vio menos afectada (16 % de APC recombinante tipo natural). El mutante RKRR306/311/312/314AAAA-APC fue severamente deficiente en actividad citoprotectora (anti-apoptótica) (Figuras 1a y 1b), necesitando la inhibición de la apoptosis inducida por estaurosporina concentraciones mucho más altas de esta APC mutante en comparación con la APC recombinante tipo natural o con los otros dos mutantes de APC, RR229/230AA-APC y KKK191-193AAA-APC.

Ejemplo comparativo 4

Se calculó la relación de la actividad anti-apoptótica a la actividad anticoagulante para la APC recombinante tipo natural y para cada mutante de APC de los ejemplos 1-3 (véase la Tabla 1), basada en los datos de la actividad antiapoptótica de la Figura 1 y las actividades anticoagulantes publicadas (Gale et al., supra, 2000, Gale et al., supra, 2002). La relación de actividades para la APC recombinante tipo natural (rwt-APC) se define como 1,0. Estas relaciones, como se muestra en la Figura 2, indican que los mutantes de APC con mutaciones en ciertos residuos en ciertos bucles de superficie en el dominio de proteasa pueden presentar una actividad anti-apoptótica de 8 veces a 14 veces mayor con respecto a la actividad anticoagulante. Se debería esperar que los dos mutantes, KKK191-193AAA-APC y RR229/230AA-APC, presenten una actividad anti-apoptótica o citoprotectora comparable a la APC recombinante tipo natural a la vez que tienen un riesgo de hemorragia reducido de 8 veces a 14 veces debido a la reducción de la actividad anticoagulante.

La relación de la actividad anti-apoptótica a la actividad anticoagulante de un mutante de APC recombinante se puede utilizar para identificar variantes de APC recombinante de esta invención que tienen potencial terapéutico. Una relación > 1,0 es indicativa de un mutante de APC recombinante terapéutico que tiene beneficios citoprotectores y riesgos de hemorragia reducidos para un sujeto que necesite un tratamiento agudo o profiláctico para el daño celular, de acuerdo con esta invención. Preferiblemente, una variante terapéutica de APC recombinante debería tener una relación de actividad anti-apoptótica a actividad anticoagulante mayor que aproximadamente 2. Más preferiblemente, dicha relación debería ser mayor que aproximadamente 4. Lo más preferiblemente, dicha relación debería ser mayor que aproximadamente 8.

Las formas profármacos de las variantes pueden incluir variantes de proteína C recombinante que, después de conversión de la proteína C en APC ya sea in vitro o in vivo, presentan actividad anticoagulante reducida a la vez que mantienen actividades protectoras de las células normales o casi normales, esto es, tienen una relación de actividad anti-apoptótica:anticoagulante mayor que 1,0. Preferiblemente, los profármacos se pueden convertir en variantes de APC que tienen una relación de actividad anti-apoptótica a actividad anticoagulante que es mayor que aproximadamente 2, más preferiblemente la relación es mayor que aproximadamente 4 o lo más preferiblemente la relación es mayor que aproximadamente 8.

Ejemplo 5

En este ejemplo, se creó una variante de APC con 5 sustituciones de alanina. En este mutante de APC, los dos residuos de arginina (Arg229 y Arg230) en el bucle de unión a calcio de APC fueron reemplazados con dos residuos de alanina, y tres residuos consecutivos de lisina (Lys191, Lys192, y Lys193) en el bucle 37 fueron reemplazados con tres residuos de alanina. La variante de APC resultante combina las sustituciones de alanina del Ejemplo comparativo 1 (RR229/230AA-APC) con las sustituciones de alanina del Ejemplo comparativo 2 (KKK191-193AAA-APC) para producir RR229/230AA más KKK191-193AAA-APC (designada 5A-APC).

Para distinguir la actividad citoprotectora de la actividad anticoagulante de la APC, los autores de esta invención prepararon una APC recombinante humana de tipo natural y un mutante con dominio de proteasa, 5A-APC (RR229/230AA + KKK191-193AAA), un mutante con dominio GIa, PTGIa-APC (APC con residuos de protrombina 146) (Smimov et al. JBC 1998) y un mutante con sitio activo, S360A-APC. La titulación del sitio activo y los ensayos cromogénicos demostraron que la APC de tipo natural, la 5A-APC y la PTGIa-APC tenían la actividad enzimática completa mientras que la S360A-APC no tenía ninguna. La 5A-APC casi no tenía actividad anticoagulante (< 3 %) mientras que PTGIa-APC tenía el 300 % de la actividad anticoagulante de APC de tipo natural. Se ensayó la unión de APC al EPCR como la unión al EPCR soluble inmovilizado y a las células K293 transfectadas con EPCR de tipo natural. Los autores de esta invención verificaron que la APC de tipo natural y la 5A-APC se podrían unir cada una al EPCR con afinidad similar (Kd aproximadamente = 37 nM y 29 nM, respectivamente) mientras que, en contraste, la PTGIa-APC se unió muy débilmente a EPCR (Kd aproximadamente > 300 nM). Compararon después las actividades anti-inflamatoria y anti-apoptótica de la 5A-APC hipo-anticoagulante y de la PTGIa-APC hiper-anticoagulante con las de APC de tipo natural. Para valorar la actividad anti-inflamatoria de APC, se determinó la inhibición mediada por APC de la secreción del factor alfa de necrosis tumoral (TNFα) inducida por LPS a partir de células monocíticas U937. La capacidad de 5A-APC para inhibir la secreción de TNFα inducida por LPS fue indistinguible de la capacidad de la APC tipo natural con inhibición semi-máxima a 5,4 nM y 6,5 nM, respectivamente. Ni la S360A-APC enzimáticamente inactiva ni el zimógeno de proteína C inhibieron la secreción de TNFα inducida por LPS, lo que indica que era necesario un sitio activo en la APC funcional. Los anticuerpos anti-EPCR que bloquean la unión de APC evitaron la actividad anti-inflamatoria de la APC de tipo natural, lo que indica que era necesaria la unión de APC al EPCR en las células U937.

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La actividad anti-apoptótica de cada especie de APC se determinó en ensayos de apoptosis de células endoteliales inducida por estaurosporina. La inhibición dosis-dependiente de la apoptosis por 5A-APC fue indistinguible de la inhibición por APC de tipo natural con una inhibición semi-máxima a 0,70 y 2,0 nM, respectivamente. En contraste con esta potente actividad anti-apoptótica de APC tipo natural y 5A-APC, la PTGIa-APC hiper-anticoagulante necesitó una concentración 24 veces más alta para la inhibición semi-máxima de la apoptosis endotelial. Como era de esperar, la S360A-APC no presentó ninguna inhibición significativa de la apoptosis endotelial. Por lo tanto, la variante 5A-APC con < 3 % de actividad anticoagulante presentó actividades anti-inflamatoria y anti-apoptótica normales in vitro sobre células monocíticas y endoteliales. Estas variantes de APC pueden ser útiles para la evaluación in vivo de la importancia relativa de la actividad anticoagulante de la APC frente a la actividad citoprotectora. En resumen, estos datos ponen de relieve importantes distinciones entre los requerimientos estructurales para las funciones anticoagulantes de la APC en comparación con sus actividades antiinflamatoria y anti-apoptótica. Estos contenidos estructurales pueden llevar a variantes de APC terapéuticas más seguras que retienen uno o más efectos citoprotectores beneficiosos de APC pero que tienen un riesgo reducido de hemorragia debido a la reducción de la actividad anticoagulante.

La invención comprende varias realizaciones que se describen a continuación.

En una realización, las variantes de APC de la invención pueden ser para uso en dosis eficaces para proporcionar citoprotección a células en riesgo de sufrir muerte celular apoptótica o lesiones inducidas por estrés ya sea in vivo o in vitro. En un aspecto de esta realización las variantes de APC pueden ser para administración en dosis terapéuticas a sujetos que podrían beneficiarse de las actividades citoprotectoras de la APC que son independientes de la actividad anticoagulante. Dichos sujetos comprenden pacientes con riesgo de daño en los vasos sanguíneos o en otros órganos tisulares, cuyo daño es causado al menos en parte por la apoptosis. El riesgo de daño celular puede ser el resultado de una cualquiera o más entre septicemia, lesiones por isquemia/reperfusión, ictus, ictus isquémico, infarto de miocardio agudo, enfermedad neurodegenerativa aguda, enfermedad neurodegenerativa crónica, trasplante de órganos, quimioterapia, o lesión por radiación, incluyendo lesión por radiación en el cerebro. Las dosis eficaces o dosis terapéuticas serán aquellas que se ha encontrado que son eficaces para prevenir o aliviar el daño celular causado al menos en parte por la apoptosis. En otro aspecto de esta realización, las variantes de la invención pueden ser para aplicación a células o tejidos in vitro o in situ in vivo.

En otra realización, las variantes de APC de la invención se pueden usar para formular composiciones farmacéuticas con una o más de las utilidades descritas aquí. Las composiciones terapéuticas pueden ser para administración in vitro a células en cultivo, in vivo a células del cuerpo, o ex vivo a células fuera de un sujeto, que pueden ser después devueltas al cuerpo del mismo sujeto o de otro. Las células se pueden separar del sujeto, trasplantar al sujeto, o estar presentes en el sujeto (p.ej., modificación genética de células endoteliales in vitro y después retorno de estas células al endotelio cerebral). Se podría esperar que las formas profármacos de las variantes sean capaces de convertirse en APC in situ. Se pueden cribar también agentes candidatos in vitro o in vivo para seleccionar aquellos con propiedades deseables. La célula puede ser del endotelio (p.ej., una célula endotelial o de músculo liso o del endotelio de un vaso cerebral).

Las composiciones terapéuticas que comprenden la variante de APC de la invención se pueden proporcionar en una forma farmacéutica. En un aspecto de esta realización, las composiciones terapéuticas de la invención pueden comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable y también pueden comprender además componentes útiles para administrar la composición al cerebro de un sujeto. Dichos excipientes farmacéuticos y componentes de administración son conocidos en la técnica. La adición de dichos excipientes y otros componentes a la composición de la invención está dentro del nivel de experiencia en esta técnica. Por ejemplo, un material permeable puede liberar sus contenidos al área local o un tubo puede dirigir los contenidos de un reservorio a una localización distante del cerebro.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser para administración como una formulación, que está adaptada para aplicación directa al sistema nervioso central, o que es adecuada para el paso a través del intestino o circulación sanguínea. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas se pueden añadir al medio de cultivo. En adición al compuesto activo, dichas composiciones pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables y otros ingredientes conocidos para facilitar la administración y/o mejorar la absorción. Ellas pueden ser para administración en una dosis única o en dosis múltiples, que se administran a diferentes tiempos. Una dosis unitaria de la composición es una cantidad de mutantes de APC que proporciona citoprotección, inhibe la apoptosis o muerte celular, y/o promueve la supervivencia celular pero no proporciona un efecto anticoagulante clínicamente significativo, ni un nivel terapéutico de dicha actividad, o tiene al menos una actividad anticoagulante reducida en comparación con las dosis previamente descritas de proteína C activada. Las medidas de dichos valores están dentro de los conocimientos de la técnica: los laboratorios clínicos determinan rutinariamente estos valores con ensayos estándar y los hematólogos los clasifican como normales o anormales dependiendo de la situación. Más adelante se describen ejemplos de cómo medir dichos valores.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser para administración por cualquier vía conocida. A modo de ejemplo, la composición puede ser para administración por vía mucosal, pulmonar, tópica, u otra vía localizada o sistémica (p.ej., enteral y parenteral). En particular, puede ser deseable alcanzar una cantidad eficaz de proteína C activada, profármaco o variante funcional en el sistema nervioso central. Esto puede incluir una inyección

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depot en el cerebro o un implante quirúrgico dentro del cerebro. "Parenteral" incluye subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intratecal, y otras técnicas de inyección o perfusión, sin limitación.

Se pueden realizar elecciones adecuadas de cantidades y tiempos de dosis, formulación, y vías de administración con el objetivo de alcanzar una respuesta favorable en el sujeto (esto es, eficacia o respuesta terapéutica), y evitar una toxicidad indebida u otro daño al mismo (esto es, seguridad). La administración puede ser administración en bolo o por perfusión continua. Administración en bolo se refiere a la administración de un fármaco (p.ej., por inyección) en una cantidad definida (llamada un bolo) durante un periodo de tiempo. La perfusión continua se refiere a la introducción sustancialmente ininterrumpida de una solución en un vaso sanguíneo durante un periodo de tiempo especificado. Un bolo de la formulación administrado solamente una vez a un sujeto es un programa posológico conveniente, aunque en el caso de alcanzar una concentración eficaz de proteína C activada en el cerebro puede ser necesaria una administración más frecuente. El tratamiento puede incluir una perfusión continua (p.ej., durante 3 horas después de un ictus) o una perfusión lenta (p.ej., durante 24 h a 72 h cuando se administra antes de las 6 horas después de un ictus). Alternativamente, se puede administrar diariamente, en días alternos, una vez a la semana, o una vez al mes. Los niveles de dosificación de los ingredientes activos en una composición farmacéutica se pueden variar también de modo que se alcance una concentración pasajera o sostenida del compuesto o derivado del mismo en un sujeto y se obtenga la respuesta terapéutica deseada.

Por lo tanto, "terapéutico" se refiere a aquellas elecciones que incluyen la manipulación rutinaria de condiciones para alcanzar un efecto deseado (p.ej., inhibición de la apoptosis o muerte celular, promoción de la supervivencia celular, citoprotección, neuroprotección, o combinaciones de las mismas). La cantidad de proteína C mutante o de proteína C activada mutante administrada a sujetos puede ser más alta que la dosis de proteína C recombinante o proteína C activada recombinante, si es necesario para la máxima citoprotección, debido al reducido riesgo de hemorragia. De esta manera, "cantidad terapéutica" se refiere a la cantidad total de la variante de proteína C activada o variante de proteína C que alcanza el efecto citoprotector deseado, pero con riesgo reducido de hemorragia debido a la actividad anticoagulante reducida (para administración en bolo, p.ej., 2 mg/kg o menos, 1 mg/kg o menos, 0,5 mg/kg o menos, 0,04 mg/kg o menos, 0,03 mg/kg o menos, 0,02 mg/kg o menos, 0,01 mg/kg o menos, 0,005 mg/kg o menos, dependiendo de la especie de sujeto o enfermedad a tratar).

La cantidad terapéutica puede ser de aproximadamente 0,01 mg/kg/h a aproximadamente 1,1 mg/kg/h, por ejemplo, administrada por perfusión continua a lo largo de 4 horas a 96 horas, hasta tan pequeña como de aproximadamente 0,01 mg/kg/h a aproximadamente 0,10 mg/kg/h durante aproximadamente 24 horas. Preferiblemente, la dosis terapéutica se debe administrar por perfusión continua durante aproximadamente 4 a aproximadamente 72 horas. Más preferiblemente, por perfusión continua durante aproximadamente 4 a aproximadamente 48 horas. Más preferiblemente, por perfusión continua durante aproximadamente 12 a aproximadamente 48 horas. Más preferiblemente, por perfusión continua durante aproximadamente 12 a aproximadamente 36 horas. Más preferiblemente, por perfusión continua durante aproximadamente 4 a aproximadamente 36 horas. Más preferiblemente, por perfusión continua durante aproximadamente 12 a aproximadamente 24 horas. Lo más preferiblemente, por perfusión continua durante aproximadamente 24 horas.

La cantidad terapéutica se puede basar en la valoración hasta un nivel cuantitativo sanguíneo de APC de aproximadamente 0,01 μg/mL a aproximadamente 1,6 μg/mL, preferiblemente de aproximadamente 0,01 μg/mL a aproximadamente 0,5 μg/mL. Está también dentro de los conocimientos de la técnica empezar la dosificación a niveles más bajos de los requeridos para alcanzar el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se alcance el efecto deseado. Está asimismo dentro de los conocimientos de la técnica determinar las concentraciones óptimas de variantes para alcanzar los efectos deseados en las preparaciones in vitro y ex vivo de la invención, p.ej., aproximadamente 1-100 nM.

En otra realización más, se proporciona un método in vitro de cribado de agentes candidatos para identificar otras variantes de APC recombinante que tengan potencial terapéutico de acuerdo con la invención. Un aspecto de esta realización comprende mutar la APC o la proteína C recombinante en un bucle de superficie del dominio de proteasa y determinar las actividades anticoagulante y citoprotectora de la variante de APC en ensayos como se ha descrito. La mutación es RR229/230AA y KKK191-193AAA. El método de la realización comprende además medir la actividad anticoagulante de dicha proteína C activada recombinante mutada, medir la actividad anti-apoptótica de dicha proteína C activada recombinante mutada; calcular la relación de la actividad anti-apoptótica a la actividad anticoagulante; identificar la proteína C activada recombinante como potencialmente terapéutica si dicha relación es mayor que 1,0. Preferiblemente, la relación es mayor que aproximadamente 2, más preferiblemente la relación es mayor que aproximadamente 4, lo más preferiblemente la relación es mayor que aproximadamente 8. Cuando el agente candidato es un profármaco, el profármaco puede comprender una variante de proteína C, que es capaz de ser convertida en una variante de proteína C activada ya sea in vivo o in vitro. Para cribar la variante de proteína C candidato para las propiedades deseadas de acuerdo con la invención, la variante de proteína C deberá ser convertida en la forma activada (APC) antes de medir las actividades.

En otro aspecto de esta realización, se selecciona un banco de agentes candidatos que son variantes de APC o proteína C recombinante que tienen al menos una mutación en un residuo en un dominio de proteasa de un bucle de superficie. La mutación es RR229/230AA y KKK191-193AAA. El método comprende convertir la variante de proteína C en la variante de proteína C activada, determinar la actividad anti-apoptótica de dichos agentes candidatos en una

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o más células estresadas o lesionadas mediante la exposición de dichas células a una concentración de estaurosporina que induce la apoptosis en presencia de una cantidad de un agente candidato; determinar la actividad anticoagulante de dichos agentes candidatos en una o más células estresadas o lesionadas mediante la exposición de las células a la misma cantidad del mismo agente candidato que en (b), y realizar un ensayo de coagulación de tiempo de protrombina diluida; calcular la relación de la actividad anti-apoptótica determinada en (a) con respecto a la actividad anticoagulante de (b); y seleccionar los agentes candidatos que tienen una relación de actividad anti-apoptótica:anticoagulante mayor que 1,0. Preferiblemente, la relación es mayor que aproximadamente 2, más preferiblemente la relación es mayor que aproximadamente 4, lo más preferiblemente la relación es mayor que aproximadamente 8.

Métodos

Activación de la proteína C

Las formas recombinantes de proteína C se pueden producir con una estructura química seleccionada (p.ej., nativa, mutante, o polimórfica). Como ilustración, una proteína C humana que codifica un gen está descrita en la patente de Estados Unidos 4.775.624 y se puede usar para producir una proteína C humana recombinante como se describe en la patente de Estados Unidos 4.981.952. La proteína C humana puede ser producida recombinantemente en cultivo de tejidos y activada como se describe en la patente de Estados Unidos 6.037.322. La proteína C humana natural se puede purificar a partir del plasma, se puede activar, y se puede ensayar como se describe en la patente de Estados Unidos 5.084.274. La secuencia de nucleótidos y aminoácidos descrita en estas patentes se puede usar como referencia para la proteína C.

En los ejemplos anteriores, las APC recombinantes tipo natural (rwt-APC), RR229/230AA-APC (229/230-APC), KKK191/192/193AAA-APC (3K3A-APC), RKRR306/311/312/314AAAA-APC (306-314-APC), RR229/230AA más KKK191/192/193AAA-APC (5A-APC) y S360A-APC se prepararon como está descrito (Gale et al., supra, 1997, Gale et al., supra, 2000, Gale et al., supra, 2002). La proteína C fue activada mediante trombina (3281 U/mg, Enzyme Research Labs, South Bend, IN). Se incubó la proteína C en HBS (solución salina tamponada con HEPES, HEPES 50 mM, NaCI 150 mM) con EDTA 2 mM y seroalbúmina bovina (BSA) al 0,5 %, pH 7,4, a una concentración de 600 μg/mL durante 2,5 horas con 12 μg/mL de trombina a 37 ºC, seguido por la adición de 1,1 unidades de hirudina (Sigma, St Louis, MO) por unidad de trombina para inactivar la trombina. Se hicieron controles en los ensayos amidolíticos, ensayos de coagulación de APTT y ensayos de inactivación con FVa para verificar que la trombina y la hirudina utilizadas no tenían ningún efecto sobre los ensayos posteriores.

Una "mutación" se refiere a uno o más cambios en la secuencia de polinucleótidos y polipéptidos en comparación con la proteína C activada nativa, y tiene al menos una función que es más activa o menos activa, una función existente que está cambiada o ausente, una función nueva que no está naturalmente presente, o combinaciones de las mismas.

Titulación de APC en el sitio activo

Todos los mutantes de APC se cuantificaron utilizando una titulación de sitio activo adaptada de Chase and Shaw (Biochem. Biophys. Res. Commun., 29:508-514, 1967) utilizando APC a aproximadamente 8 μM en HBS y benzoato de p-nitrofenol-guanidina a 0,1 mM con un coeficiente de extinción para p-nitrofenol de 11400 M"1 cm"1 calculado para pH 7,4.

Análisis cinético de APC

Se determinaron las constantes de Michaelis (Km) y las constantes de velocidad catalítica (kcat) para el sustrato cromogénico, Pefachrome PCa (Pentapharm, Basel, Switzerland), variando la concentración de sustrato de 1,43 mM a 0,0446 mM en HBS, BSA al 0,5 %, CaCI2 5 mM, pH 7,4 con APC a 5,7 nM. Se derivaron las constantes de Michaelis utilizando diagramas de Eadie-Hofstee. Alternativamente, se reemplazó el CaCl2 5 mM con EDTA 5 mM para determinaciones similares. Se midió el desarrollo de color con un lector de microplacas Optimax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) (Mesters et al., J. Biol. Chem.., 266:24514-19, 1991).

Cultivo de células

Se obtuvieron células endoteliales EAhy926 del Dr. C. J. S. Edgell (University of North Carolina, Chapel Hill NC) y se mantuvieron en DMEM con alta glucosa (Gibco, Grand Island, NY) con suero fetal bovino al 10 % (Omega Scientific, Tarzana, CA), 100 U/mL de penicilina G sódica (Gibco), 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina (Gibco) y glutamina 2 mM (Gibco) a 37 ºC en una atmósfera húmeda que contenía 5 % de CO2 en el aire como está descrito (Edgell et al., Proc. Nat'l Acad. ScL, USA, 80:3734-3737, 1983).

Ensayo de la apoptosis

Se inició la apoptosis de células endoteliales inducida por estaurosporina utilizando las modificaciones de los autores de esta invención (Mosnier and Griffin, supra, 2003) del ensayo previamente descrito (Joyce et al., supra, 2001). Las modificaciones incluyeron cultivar las células sobre cubreobjetos recubiertos de gelatina, cambiando la

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concentración de estaurosporina y optimizando las veces de preincubación de APC antes de la adición de estaurosporina como se describe más adelante. La estaurosporina, un análogo de ATP e inhibidor de la proteína cinasa C (PKC), es un inductor de la apoptosis potente y bien conocido. El colorante Apopercentage es una medida de la expresión de fosfatidilserina en la superficie externa de la membrana celular y es por lo tanto similar a la que se mide por el tradicional marcado con anexina-V. La transferencia de fosfatidilserina a la superficie externa de la membrana celular permite el transporte unidireccional del colorante Apopercentage dentro de la célula donde es retenido y acumulado. El colorante acumulado tiene un color púrpura rojizo y es visible con un microscopio convencional (Joyce et al., supra, 2001; Mosnier and Griffin, supra, 2003). Los autores de esta invención utilizaron este colorante para monitorizar la apoptosis. Alternativamente, se pueden incubar las células con el colorante específico de apoptosis, YO-PRO-1 (10 μM, 5 min) (Molecular Probes, Eugene, OR) como está descrito (Idziorek et al., J. Immunol. Methods, 185:249-258, 1995) o durante 20 min con el sustrato sintético para enzimas tipo caspasa 3, DEVD-amc (Calbiochem, San Diego, CA). La estaurosporina indujo una apoptosis dependiente del tiempo y dependiente de la concentración en las células endoteliales EAhy926, que se determinó por tinción de Apopercentage (no se muestran datos).

En resumen, se lavaron con ácido cubreobjetos redondos de 12 mm (Fisherbrand, Pittsburgh, PA), se enjuagaron con agua destilada y etanol al 95 %, se sumergieron 10x en gelatina (gelatina al 0,5 % que contenía el colorante Apopercentage) hasta que se formó una capa homogénea y se secó al aire. Se cultivaron células EAhy926 hasta confluencia en cubreobjetos recubiertos de gelatina en placas de 24 pocillos y se incubaron con APC durante 5 horas antes de la inducción de la apoptosis. Después de la pre incubación con las diferentes proteínas, se indujo la apoptosis por adición de estaurosporina (Calbiochem, San Diego, CA) hasta una concentración final de 10 μM en presencia del colorante Apopercentage (Biocolor, Belfast, N. Ireland) diluido hasta una concentración final de 1/20 de la solución stock disponible, según instrucciones del fabricante.

Después de 1 hora de incubación a 37 ºC en una atmósfera húmeda que contenía 5 % de CO2 en el aire, se lavaron las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se añadieron a las células 500 μL de DMEM con alta glucosa sin rojo fenol (Gibco, Grand Island, NY) con suero fetal bovino al 5 % (Omega Scientific, Tarzana, CA), 100 U/mL de penicilina G sódica (Gibco), 100 mg/mL de sulfato de estreptomicina (Gibco) y glutamina 2 mM (Gibco).

Se fotografiaron las células inmediatamente después del lavado, utilizando un microscopio invertido Zeiss IM conectado a una cámara digital Spot QE. Se fotografiaron una media de 4 campos por cubreobjeto con un aumento 100x y se contaron los números de células apoptóticas utilizando el software de análisis de imágenes Cell Counter (escrito por el Dr. L. O. Mosnier, The Scripps Research Institute). Para cada experimento se fotografiaron campos representativos de las células utilizando contraste de fases y se contó el número total de células presentes. El porcentaje de apoptosis se expresa como el número de células apoptóticas con respecto al número total de células. Se realizaron experimentos de control repetidos (ensayo basado en MTT, ensayo de proliferación de células no radioactivas en Celltiter 96 Aqueous, Promega, Madison, WI) para comprobar que las células no se habían separado. En adición, en los casos en que se observó rotura de la capa de células confluentes, se excluyó el dato del análisis posterior y se repitió.

Ensayos de coagulación

Se realizaron ensayos de coagulación de tiempo de protrombina diluida, como sigue. Se incubó plasma (50 μL) con 50 μL de APC en HBS con BSA al 0,5 % a concentraciones de APC de 8 a 32 nM (concentración final 2,7- 11 nM) durante 3 min a 37 ºC. Después se inició la coagulación añadiendo 50 μL de innovina (Dade Behring lnc , Newark, DE) diluida 1/60 en HBS, BSA al 0,5 %, CaCI2 25 mM. Se midió el tiempo de coagulación utilizando un coagulómetro ST4 (Diagnostica Stago, Asnieres, France). Para los ensayos de coagulación de APTT, se mezclaron 50 μL de plasma con 50 μL de reactivo APTT (Platehn LS, Organon Technika Corp, Durham , NC) y se preincubaron a 37 ºC durante 3 minutos. Se añadieron entonces 2 μL de APC seguidos por 50 μL de HBS, BSA al 0,5 %, CaCI2 5 mM. Se registró el tiempo de coagulación utilizando un coagulómetro ST4 (Diagnostica Stago, Asnieres, France)

Inactivación de APC

Se midió la inactivación de APC por las serpinas presentes en el plasma esencialmente según el protocolo de Heeb et al. (J Biol Chem , 265 2365-2369, 1990). En resumen, se preincubó el plasma humano o una mezcla de inhibidores de serpina pura (PCI y/o α1-antitripsina) a 37 ºC, y después se añadió la APC. Se separaron alícuotas a tiempos seleccionados y se ensayaron en cuanto a actividad de APC con un sustrato cromogénico específico de APC.

Inactivación del Factor Va

Se midió la inactivación de FVa como sigue. Se preparó una mezcla de FVa 1 nM con vesículas de fosfolípido 25 μM en HEPES 50 mM, pH 7 4, NaCI 100 mM, BSA al 0,5 %, CaCI2 5 mM, MnCI2 0,1 mM. Se inició la inactivación por la adición de APC. Se separaron alícuotas de un microlitro a tiempos seleccionados y se añadieron a 40 μL que contenían factor Xa 1,25 nM (FXa) con vesículas de fosfolípido 31 μM, seguido por la adición de 10 μL de protrombina 3 μM (concentraciones finales Fxa 1 nM, FVa 20 pM, vesículas de fosfolípido 25 μM y protrombina 0,6 μM). Después de 2,5 min, se sofocó una alícuota de 15 μL de esta mezcla por adición a 55 μL de HBS que contenía

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EDTA 10 mM, BSA al 0,5 %, pH 8,2. Se añadió sustrato cromogénico de CBS 34-47 (Diagnostica Stago, Asnieres, France) y se evaluó la velocidad de formación de trombina midiendo el cambio en la absorbancia a 405 nm. La curva de ajuste de estas variaciones de pseudo-primer orden, de la inactivación de FVa con el tiempo, se calculó de acuerdo con Nicolaes et al. (supra, 1995) utilizando la ecuación 1:

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Ecuación 1

Los expertos en la técnica reconocerán otras enfermedades y/o síntomas, que podrían ser tratados y/o aliviados por la presente invención. Por ejemplo, la presente invención puede ser usada para tratar el infarto de miocardio, otras enfermedades cardíacas y sus síntomas clínicos, lesión endotelial, síndrome de distrés respiratorio del adulto (ARDS), e insuficiencia hepática, renal, o del sistema nervioso central (CNS). Hay otras muchas enfermedades que se benefician de las metodologías de la presente invención tales como, por ejemplo, oclusión de las arterias coronarias, arritmias cardíacas, insuficiencia cardíaca congestiva, cardiomiopatía, bronquitis, neurotraumatismos, rechazo de injertos/trasplantes, miocarditis, neuropatía diabética, e ictus. Los daños de tejidos locales y remotos que ponen en peligro la vida ocurren durante las operaciones quirúrgicas, traumatismos, e ictus cuando los principales lechos vasculares se ven privados durante un tiempo de oxigenación (isquemia) recuperándose después con la circulación normal (reperfusión). La muerte celular y el daño de los tejidos pueden llevar a un fallo del órgano o a una disminución de la función del órgano. Las composiciones y metodologías de la presente invención son útiles en el tratamiento de tales lesiones o en la prevención de las mismas.

En resumen, se proporciona un ejemplo de las variantes de mutantes de APC recombinantes de esta invención, concretamente RR229/230AA más KKK191-193AAA-APC (5A-APC), que tiene una reducción sustancial en la actividad anticoagulante pero que mantiene un nivel normal o casi normal de actividad anti-apoptótica. La invención engloba las variantes de APC que comprenden las mutaciones RR229/230AA más KKK191-193AAA, tales como ésta, que tienen la propiedad altamente deseable de una alta relación de la actividad anti-apoptótica a la actividad anticoagulante. La invención engloba además variantes que tienen relaciones de actividad anti-apoptótica a anticoagulante más modestas pero todavía beneficiosas, y se podría esperar también que dichas variantes sean citoprotectoras a la vez que tienen un riesgo de hemorragia significativamente reducido. La invención se refiere también a mutantes de proteína C que son capaces de producir los mutantes de APC deseables que comprenden las mutaciones RR229/230AA más KKK191-193AAA, esto es, aquellas que deberían tener las mismas relaciones deseables de actividad. Por lo tanto, se espera que las variantes de APC de la invención sean útiles para el tratamiento de sujetos que se beneficiarán de las actividades protectoras de APC que son independientes de la actividad anticoagulante de APC. Los sujetos incluyen pacientes con riesgo de daños por apoptosis para los vasos sanguíneos o tejidos de diferentes órganos. Más específicamente, pero no exclusivamente, estos sujetos incluirán, por ejemplo, los que padecen septicemia severa, lesiones por isquemia/reperfusión, ictus isquémico, infarto de miocardio agudo, enfermedades neurodegenerativas agudas o crónicas y trasplante de órganos, entre otras condiciones.

Ejemplo comparativo 6

Métodos

Este ejemplo incluye datos refinados de la Tabla 1 que incorporan experimentos adicionales de los que se ha incluido la media y el análisis mejorado de los datos junto con datos para la variante S360A-APC. Además, los datos anticoagulantes se recogieron utilizando el ensayo de APTT en lugar del ensayo PT (como se menciona en la Tabla 2). Por lo tanto, estos datos refinados se presentan como Tabla 2. Este ejemplo incluye también análisis más detallado de las actividades amidolítica, anticoagulante y anti-apoptótica de las variantes de APC (Figuras 3-6). Para este ejemplo, se emplearon los siguientes métodos.

La alfa-trombina humana se compró de Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN). El plasma humano normal anticoagulado con citrato fue de George King Bio-Medical, lnc. (Overland Park, KS). El sustrato cromogénico de hidrocloruro de L-piroglutamil-L-prolil-L-argιnιna-p-nιtroanιlιna (S-2366) se obtuvo de Chromogenix (Franklin, OH).

Preparación de proteína C activada recombinante

Se construyeron vectores de expresión de proteína C mutante y se purificaron los mutantes de proteína C recombinante procedentes de medios acondicionados como está descrito (Gale et al., supra, 2002, Gale et al., supra, 1997). La proteína C purificada fue activada por trombina (Gale et al., supra, 2002, Gale et al., supra, 1997). En resumen, se incubó la proteína C en HBS (HEPES 50 mM, NaCI 150 mM) con EDTA 2 mM y BSA al 0,5 %, pH 7,4, a una concentración de 600 μg/mL durante 2,5 h con 12 μg/mL de trombina a 37 ºC seguido por la adición de 1,1 unidades de hirudina por unidad de trombina para inactivar la trombina. Seguidamente, se separó la trombina por cromatografía de intercambio iónico con elución con gradiente de NaCI (Yan et al., Biotechnology, 8:655-661, 1990).

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La trombina residual, como se determina por coagulación de fibrina, representó menos del 0,00025 % (moles de trombina/moles de APC) de la proteína. Se determinaron las concentraciones de la APC recombinante tipo natural y de los mutantes de APC mediante titulación del sitio activo adaptada de Chase and Shaw (Chase and Shaw, supra, 1967) utilizando APC a ~8 μM en HBS y benzoato de p-nitrofenol-guanidina a 0,1 mM y utilizando un coeficiente de extinción para p-nitrofenol de 11.400 M~1cm-1 (a pH 7,4) como está descrito (Gale et al., supra, 2002). La concentración de S360A-APC se determinó por ELISA de proteína C Asserachrom de American Bioproducts (Parsippany, NJ) (Gale et al., supra, 1997).

Ensayos de actividad de APC

Los ensayos amidolíticos (S-2366) se realizaron como está descrito (Gale et al., supra, 2000; Gale et al., supra, 1997). Los ensayos de tiempo de coagulación APTT se realizaron según el siguiente procedimiento. Se incubó el plasma (50 μL) durante 1 min con cefalina y caolín (50 μL) (CK. Prest 2, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) a 37 ºC, y después se añadieron 25 μL de APC en HBS con BSA al 0,5 % a concentraciones finales de APC de 0,5 nM - 32 nM y se incubó durante 3 min adicionales. Se inició entonces la coagulación añadiendo 50 μL de CaCl2 50 mM en HBS y se registró el tiempo de coagulación utilizando un microcoagulómetro Amelung KC 4a (Sigma Diagnostics, St Louis, MO).

Los efectos citoprotectores de la APC se determinaron en ensayos de apoptosis de células endoteliales (EA.hy926) inducida por estaurosporina como están descritos (Mosnier and Griffin, supra, 2003). Se incubó la APC (0,16-100 nM) con células durante 5 h antes de la inducción de la apoptosis por estaurosporina (10 μM, 1 h) a menos que se indique otra cosa, y se evaluó la apoptosis mediante el colorante Apopercentage de Biocolor (Belfast, N. Ireland) que mide el desplazamiento de la fosfatidilserina a la superficie externa de la membrana celular. Se utilizaron anticuerpos bloqueantes frente a PAR-1 (WEDE-15 y ATAP-2 amablemente proporcionados por el Dr L. Brass) y frente a EPCR (Zymed) como está descrito (Mosnier and Griffin, supra, 2003). Para la tinción de inmunofluorescencia de la caspasa-3 activada y la tinción nuclear de DAPI (5 μg/mL) de las células endoteliales EA.hy926 tratadas con estaurosporina (2 μM, 4 h) que habían sido incubadas con APC (25 nM, 5 h) antes de la inducción de la apoptosis, se siguieron las instrucciones del fabricante utilizando un anticuerpo de conejo anti-caspasa-3 activada (Promega) y anticuerpo secundario de cabra anti-conejo marcado con Alexa-flúor-568 (Molecular Probes).

Escisión del péptido PAR-1.

Las interacciones de la APC recombinante de tipo natural (rwt-APC) y las variantes de APC (500 nM) con el péptido de cola N-terminal (TR33-62) de PAR-1 fueron estudiadas utilizando un péptido sintético que representa los residuos 33-62 de PAR-1 (Bio Synthesis Inc., Lewisville, TX). La secuencia del péptido era A33TNATLDPR41SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKN62 y fue escindida por la APC entre Arg41 y Ser42. El péptido sustrato y los dos productos peptídicos de escisión por trombina o por APC en Arg41 (TR33-41 y TR42-62) se resolvieron y analizaron por HPLC de fase inversa y se cuantificaron esencialmente como está descrito (Arosio et al., Biochemistry, 39:8095-8101, 2000). Todos los experimentos de escisión de TR33-62 con APC contenían hirudina 5 nM para asegurar que la escisión observada no era debida a contaminación de trombina.

Resultados

En una serie de experimentos que duplicaron parcialmente los resumidos en la Tabla 1, se determinaron las actividades anti-apoptótica, anticoagulante y amidolítica de RR229/230AA-APC y KKK191-193-AAA-APC y se compararon con las actividades de la APC recombinante de tipo natural (rwt-APC) y de un mutante hidrolíticamente inactivo, S360A-APC, que contenía Ala en lugar del residuo del sitio activo, Ser360 (Tabla 2). Las dos variantes de APC del bucle del dominio de proteasa, RR229/230AA-APC y KKK191-193-AAA-APC, tenían la misma actividad enzimática frente a un pequeño sustrato cromogénico, S-2366, que la APC recombinante de tipo natural (rwt-APC) (Figura 3a), lo que indica la conservación estructural y funcional del sitio activo de APC, mientras que estas variantes tenían una actividad anticoagulante marcadamente reducida (Figura 3b) que era debida a la escisión defectuosa en Arg506 del factor Va (véase la Tabla 2).

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Tabla 2. Actividades de APC recombinante tipo natural y mutante* (actividad anticoagulante determinada por APTT)

Mutante

secuencia de APC (mutada a Ala) actividad citoprotectora (% rwt-APC)† actividad anticoagulan te (% rwt-APC)‡ relación citoprotectora a anticoagulante ¢ inactivación de factor Va escisión en Arg506(Arg306) (% rwt-APC) Ø actividad amidolític a (% rwt-APC.) π escisión de péptido de PAR-1 (TR33-62) (% rwt-APC)≠

rwt-APC*

ninguna 100 % 100 % 1,0 100% (100 %) 100 % 100 %

229/230-APC

227-DLRRWE232 94 % 13 % 7,2 25 % (110 %) 102 % 116 %

3K3A-APC

189-DSKKKLA-195 114 % 4,6 % 25 11 % (67 %) 109 % 88 %

S360A-APC

358-GDSGG362 < 1 %** 23 %†† 0 < 1 %** (< 1 %***) < 1 %** < 3 %**

La actividad de la APC recombinante de tipo natural (rwt-APC) se definió como 100 % y los valores para la APC mutante se dan como porcentaje de la actividad de la rwt-APC.

† Derivada de las concentraciones de APC necesarias para la inhibición semi-máxima de la apoptosis inducida por estaurosporina (Fig 2a)

‡ Basada en los datos de dosis-respuesta de APTT determinados para la rwt-APC y las variantes de APC (0,5 nM-32 nM) (Fig 1b)

¢ Derivada de la relación de actividades relativas para las actividades citoprotectora y anticoagulante dadas en las dos columnas anteriores de esta tabla

Ø Basada en las constantes de velocidad de segundo orden aparente determinada previamente (Gale et al., supra, 2002, Gale et al., supra,1997)

π Basada en la actividad amidolítica determinada para la rwt-APC y las variantes de APC (0,5 nM-32 nM) (Fig 1a)

≠ Basada en la eficiencia catalítica derivada de la Fig 4 para escisión del péptido PAR-1 (TR33-62) por la rwt-APC y las variantes de APC (500 nM)

**Actividad no detectable en las condiciones del ensayo

†† La actividad anticoagulante de S360A-APC no es debida a la proteolisis del factor Va y en contraste con la rwt-APC es independiente del tiempo de incubación de la APC con el plasma (Gale et al., supra, 1997)

Aunque la S360A-APC no tenía actividad cromogénica (Figura 3a), la actividad anticoagulante de S360A-APC fue 23 % en las condiciones del ensayo de APTT (Figura 3b). Como se ha descrito previamente, en contraste con la rwt-APC normal, esta actividad anticoagulante es independiente del tiempo de incubación de APC con plasma (Gale et al., supra, 1997) y parece que implica la unión de exositios de APC al factor Va de tal modo que hay una inhibición de la unión del factor Xa y de la protrombina al factor Va.

Para determinar la actividad citoprotectora de estas variantes de APC, se estudió la apoptosis de células endoteliales inducida por estaurosporina (Joyce et al., supra, 2001; Mosnier and Griffin, supra, 2003). La inhibición mediada por APC de la apoptosis inducida por estaurosporina es dependiente del tiempo y dependiente de la dosis y requiere el sitio activo de APC, PAR-1 y EPCR (Mosnier and Griffin, supra, 2003). La inhibición semi-máxima de la apoptosis inducida por estaurosporina mediante la rwt-APC se alcanzó a 0,16 nM en las condiciones empleadas (Figura 4a). La inhibición dosis-dependiente de la apoptosis por RR229/230AA-APC y KKK191-193AAA-APC fue indistinguible de la inhibición de la rwt-APC con una inhibición semi-máxima a 0,17 nM y 0,14 nM, respectivamente (Figura 4a). No se observó inhibición de la apoptosis por un mutante de APC que carece del sitio activo serina, S360A-APC (Gale et al., supra, 1997) (Figuras 4a-c). Se monitorizó histoquímicamente la capacidad de la rwt-APC y variantes de APC para inhibir la generación de caspasa 3 activada en células endoteliales expuestas a estaurosporina. La rwt-APC y las variantes, RR229/230AA-APC y KKK191-193AAA-APC, redujeron cada una de modo similar las células caspasa-3 activada positivas en aproximadamente un 70 %, mientras que el mutante con sitio activo, S360A-APC, no tuvo ningún efecto (Figuras 4b-c). Por lo tanto, ciertos residuos del dominio de proteasa esenciales para la actividad anticoagulante normal de la APC, concretamente Arg229 y Arg230 y Lys191, Lys192 y Lys193, no son necesarios para la actividad anti-apoptótica normal de la APC.

Los efectos anti-apoptóticos de la APC requieren PAR-1 y EPCR (Cheng et a!., supra, 2003; Mosnier and Griffin, supra, 2003). Similarmente, la actividad anti-apoptótica de RR229/230AA-APC y KKK191-193AAA-APC en ensayos de apoptosis de células endoteliales inducida por estaurosporina requirió PAR-1 y EPCR debido a que la actividad citoprotectora de cada variante de APC fue inhibida en un 72 % y 69 % en presencia de anticuerpos frente a EPCR que bloquean la unión de APC al receptor y en un 88 % y 55 % en presencia de anticuerpos de bloqueo anti-PAR-1, respectivamente (Figura 5). Estos resultados indican que las interacciones entre las células y las dos variantes de

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APC, como la APC recombinante tipo natural, requieren PAR-1 y EPCR. Puesto que las células madres hematopoyéticas de los huesos contienen niveles significativos de EPCR (Balazs, Blood 107:2317-21, 2006), el uso de APC y variantes de APC para proporcionar actividades citoprotectoras para los huesos y otras células madres representa un área de aplicación para dichas variantes de APC..

Escisión de los péptidos de la cola N-terminal de PAR-1 sintético por las APC de tipo natural y variantes

La ausencia de actividad anti-apoptótica de S360A-APC y el requerimiento de PAR-1 implican que una etapa mecanicista principal para la actividad anti-apoptótica de APC incluye la activación proteolítica de PAR-1 (Cheng et al., supra, 2003; Mosnier and Griffin, supra, 2003). Para caracterizar los efectos de las mutaciones de APC sobre la activación proteolítica de PAR-1 debido a la escisión en Arg41, se estudió un péptido sintético 30-mero que representa la secuencia N-terminal de PAR-1 (residuos 33-62 (TR33-62)) como sustrato de APC. Este péptido de PAR-1 TR33-62 se escinde en Arg41 por la trombina (Arosio et al., supra, 2000). La APC escinde otro péptido Nterminal sintético de PAR-1 en Arg41, el sitio de escisión por la trombina (Kuliopulos et al., supra, 1999). Utilizando análisis cuantitativo por HPLC, los autores de esta invención encontraron que la APC recombinante tipo natural escindió el péptido TR33-62 en Arg41 y generó fragmentos similares a los de la trombina, TR33-41 y TR42-62, pero con una eficiencia catalítica aproximadamente 25.000 veces inferior basándose en la comparación de kcat/Km para las dos enzimas (no se muestran los datos). Cuando se monitorizó la escisión de TR33-62 a lo largo del tiempo utilizando HPLC para cuantificar la desaparición del pico para el sustrato de TR33-62 y la aparición del producto TR42-62, los resultados demostraron que no hubo diferencias sustanciales en la velocidad de escisión de TR33-62 entre la APC recombinante tipo natural, RR229/230AA-APC y KKK191-193AAA-APC (Figura 6). Similarmente, no se observaron diferencias significativas en el flujo intracelular de Ca++ inducido por APC monitorizado como cambios de fluorescencia de FURA-2-AM, en las células endoteliales EA.hy926 cuando se comparó la APC recombinante tipo natural con las dos variantes anti-apoptóticas de APC, RR229/230AA-APC y KKK191-193AAA-APC (no se muestran los datos). Estos resultados son concordantes con la hipótesis de que la APC escinde el PAR-1 en Arg41 y que las mutaciones de las dos variantes de APC descritas aquí con actividad anticoagulante reducida pero con actividad anti-apoptótica normal no redujeron de modo significativo la capacidad del dominio de proteasa de la APC para escindir el PAR-1 en Arg41.

En resumen, para generar las variantes recombinantes de APC con riesgo reducido de hemorragia debido a la reducción de la actividad anticoagulante, los autores de esta invención diseccionaron la actividad anticoagulante de la APC de su actividad citoprotectora por mutagénesis dirigida al sitio. Utilizando ensayos de apoptosis de células endoteliales inducida por estaurosporina, se demostró aquí que las mutaciones de Ala (RR229/230AA y KKK191193AAA) en dos bucles de superficie de APC que reducen severamente la actividad anticoagulante dan como resultado dos variantes de APC que retienen la actividad anti-apoptótica normal que requiere el receptor-1 activado de la proteasa y el receptor de la proteína C de las células endoteliales. Además, estas dos variantes de APC retienen una capacidad normal para escindir un péptido de N-terminal de PAR-1 en Arg41. Para comparar estas dos variantes de APC con la APC recombinante tipo natural (rwt-APC) en términos de sus actividades relativas antiapoptótica y anticoagulante (determinada por APTT; nótese que en la tabla 1 la actividad anticoagulante se determinó por PT diluido), se asignó a la actividad observada de la rwt-APC un valor de 100 % y se calculó el tanto por ciento de actividad de cada variante de APC a partir de los datos dosis-respuesta (Figuras 3 y 4). Esta normalización da inherentemente una relación "citoprotectora a anticoagulante” para la rwt-APC de 1,0 (Tabla 2). Cuando se calculó la relación de la actividad anti-apoptótica a la actividad anticoagulante para los mutantes de APC (Tabla 2), las dos variantes de APC, 229/230-APC y 3K3A-APC, presentaron una actividad anti-apoptótica relativa a la actividad anticoagulante 7 veces y 25 veces mayor en comparación con la APC recombinante tipo natural, respectivamente. Estas relaciones son similares a los valores vistos en la Tabla 1 calculados utilizando el ensayo de PT diluido para la actividad anticoagulante.

Por lo tanto, estos datos implican que las mutaciones RR229/230AA y KKK191-193AAA de la APC que causan una disminución de la escisión en Arg506 del factor Va no afectan a la escisión de PAR-1 en Arg41.

Ejemplo 7

Métodos

Se construyó el vector de expresión de la proteína C para 5A-APC como está descrito. (Gale et al., J. Biol. Chem. 277:28836-28840, 2002). Se introdujeron mutaciones (R229A+R230A+K191A+K192A+K193A) utilizando la mutagénesis Quickchange (Stratagene, Cedar Creek, TX). El análisis de secuencias confirmó la presencia de las mutaciones.

La variante de proteína C que contiene 5 sustituciones de alanina (R229A+R230A+K191A+K192A+K193A) (5A-APC) se expresó utilizando células K293 como está descrito (Gale et al., J. Biol. Chem. 277:28836-28840, 2002; Gale et al., Blood, 96:585-593, 2000; Gale et al., Protein ScL, 6:132-140, 1997). Se preparó proteína C recombinante 5A purificada como se ha descrito utilizando una columna Q-Sefarosa de caudal rápido (Gale et al., J. Biol. Chem. 277:28836-28840, 2002; Gale et al., Blood, 96:585-593, 2000; Gale et al., Protein ScL, 6:132-140, 1997).

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Se generó 5A-APC (R229A+R230A+K191A+K192A+K193A) a partir de proteína C 5A mediante activación con trombina como está descrito (Gale et al., J. Biol. Chem. 277:28836-28840, 2002; Gale et al., Blood, 96:585-593, 2000; Gale et al., Protein ScL, 6:132-140, 1997). Se determinó la concentración de 5A-APC por titulación del sitio activo de acuerdo con Chase and Shaw (Biochem. Biophys. Res. Commun., 29:508-514, 1967).

Ensayos de actividad de APC

Se realizaron ensayos amidolíticos (S-2366) como está descrito (Gale et al., J. Biol. Chem. 277:28836-28840, 2002; Gale et al., Blood, 96:585-593, 2000; Gale et al., Protein ScL, 6:132-140, 1997). Se realizaron ensayos de tiempo de coagulación APTT según el siguiente procedimiento. Se incubó el plasma (50 μL) durante 1 min con cefalina y caolín (50 μL) (CK. Prest, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) a 37 ºC, y después se añadieron 25 μL de APC en HBS con BSA al 0,5 % en concentraciones finales de APC de 0,5 nM - 32 nM y se incubó durante 3 min adicionales. Se inició entonces la coagulación añadiendo 50 μL de CaCI2 50 mM en HBS y se registró el tiempo de coagulación utilizando un microcoagulómetro Amelung KC 4a (Sigma Diagnostics, St Louis, MO).

Actividad anti-apoptótica de APC

Se determinaron los efectos citoprotectores de APC en ensayos de apoptosis de células endoteliales (EA.hy926) inducida por estaurosporina como está descrito (Mosnier and Griffin, Biochem. J., 373:65-70, 2003). Se incubó la APC (0,16-100 nM) con células durante 5 h antes de la inducción de la apoptosis por estaurosporina (10 μM, 1 h) a menos que se indique otra cosa, y se evaluó la apoptosis por absorción del colorante YOPRO-1 (Molecular Probes).

Actividad anti-inflamatoria de APC

Se cultivaron monocitos humanos inmortalizados (U937, ATCC (Manassas, VA)) en medio de cultivo de base RPMI suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10 %, penicilina (1 unidad/mL), estreptomicina (1 μg/mL) y glutamina (292 μg/mL). Las células sometidas a experimentos estaban entre su 4º a 10º pase. Antes de cada experimento, se examinó la viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano y se confirmó que era más del 99 %. Típicamente, se incubaron 240 μL de células U937 (2x106/mL) con 30 μL de diluciones de APC o solución salina y 30 μL de LPS (lipopolisacáridos, 055:B5 Sigma (St. Louis, MO)) a 250 ng/mL o solución salina durante 18 horas en un incubador con CO2. Se recogió entonces el sobrenadante del cultivo celular centrifugando cada mezcla de ensayo a 4 ºC durante 10 min. Los TNFα y IL-6 secretados en los sobrenadantes del cultivo celular se detectaron cuantitativamente por ELISA siguiendo los protocolos del fabricante (Invitrogen (Carlsbad, CA)).

Resultados

Como se ha indicado antes, las variantes 229/230-APC y 3K3A-APC tienen actividad anticoagulante reducida mientras que la actividad anti-apoptótica de estas variantes permanece esencialmente inafectada. (Mosnier et al., Blood. 104:1740-1745, 2004). Aunque la actividad anticoagulante de estas variantes de APC (229/230-APC y 3K3A-APC) se redujo, ellas retuvieron una actividad anticoagulante detectable en los ensayos de coagulación de APTT. Por lo tanto, se preparó la variante de APC en la que se combinaron las mutaciones mencionadas antes (5A-APC con R229A+R230A+K191A+K192A+K193A). Esta 5A-APC tiene la actividad anticoagulante severamente reducida en comparación con la APC recombinante tipo natural (rwt-APC) mientras que al menos alguno de los efectos protectores directos sobre las células no se ven esencialmente afectados y son indistinguibles de la rwt-APC.

En las condiciones empleadas, tanto la APC recombinante tipo natural como la 5A-APC tuvieron actividad amidolítica similar (Figura 7). En contraste, la S360A-APC, una variante de APC con el residuo Ser del sitio activo mutado a Ala, no tuvo actividad amidolítica detectable. Los ensayos de coagulación APTT revelaron que la actividad anticoagulante de 5A-APC estaba severamente reducida (<3 % en comparación con la APC recombinante tipo natural definida como el 100 % en las condiciones empleadas) (Figura 8). Esto indica una significativa reducción en comparación con las 229/230-APC y 3K3A-APC previamente descritas con actividad anticoagulante de 13 y 5 % en condiciones similares, respectivamente.

Para evaluar la actividad de 5A-APC en cuanto a efectos protectores directos sobre las células, se analizaron tanto la actividad anti-inflamatoria de APC sobre los monocitos como la actividad anti-apoptótica de APC sobre las células endoteliales. La actividad anti-inflamatoria de APC se determinó por su capacidad para inhibir la liberación de citocinas inducida por lipopolisacáridos (LPS) a partir de los monocitos (células U937). Tanto la APC recombinante tipo natural como la 5A-APC inhibieron la liberación del factor α de necrosis tumoral (TNFα) inducida por LPS a partir de los monocitos (Figura 9). Las titulaciones por dosis-respuesta de la APC recombinante tipo natural y de la 5A-APC indicaron que la potencia relativa de la APC recombinante tipo natural y la 5A-APC eran indistinguibles. Se obtuvieron resultados similares para el análisis de la inhibición de la liberación de interleucina 6 (IL-6) inducida por LPS a partir de los monocitos. Tanto la APC recombinante tipo natural como la 5A-APC inhibieron de forma dependiente de la dosis la liberación de IL-6 inducida por LPS a partir de los monocitos (Figura 10) No se observaron diferencias entre las concentraciones de APC recombinante tipo natural y de 5A-APC requeridas para alcanzar la inhibición semi-máxima de la liberación de IL-6 inducida por LPS. Estos resultados indican que la 5A-APC tiene actividad anti-inflamatoria normal comparada con la APC recombinante tipo natural

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Se determinó la actividad anti-apoptótica de APC en ensayos de apoptosis de células endoteliales (EA hy926) inducida por estaurosporina como ha sido descrito (Mosnier and Griffin, Biochem J , 373 65-70, 2003, Mosnier et al., Blood 104 1740-1745, 2004). Tanto la APC recombinante tipo natural como la 5A-APC inhiben la apoptosis de células endoteliales inducida por estaurosporina (Figura 11). Las concentraciones de la APC recombinante tipo 5 natural y de la 5A-APC requeridas para alcanzar la inhibición semi-máxima de la apoptosis fueron indistinguibles cuando se determinan por titulaciones dosis-respuesta de la APC recombinante tipo natural y de la 5A-APC. Por lo tanto, la 5A-APC tiene una actividad anti-apoptótica esencialmente normal comparada con la APC recombinante tipo natural, aunque su actividad anticoagulante está severamente reducida. Estos resultados confirman además la prueba demostrativa preliminar de que los residuos de exositios básicos sobre la superficie del dominio de proteasa

10 de APC son necesarios para la actividad anticoagulante de APC pero no para los efectos protectores directos de la APC sobre las células (tal como la actividad anti-inflamatoria de APC o la actividad anti-apoptótica de APC).

La determinación de la especificidad de los exositios de APC para la actividad anticoagulante frente a la actividad citoprotectora permitió la generación de variantes de APC con actividad anticoagulante reducida o muy baja pero con efectos protectores beneficiosos esencialmente normales (comparados con la APC recombinante tipo natural) 15 sobre las células. Las variantes de APC tales como éstas son útiles para el tratamiento de sujetos que se beneficiarán de las actividades protectoras de APC que son independientes de la actividad anticoagulante de APC. Los sujetos que se pueden beneficiar del tratamiento con dichas variantes de APC incluyen sujetos con riesgo de daño en los vasos sanguíneos o tejidos de diversos órganos causados, al menos en parte, por la apoptosis. Estos sujetos incluirán, por ejemplo, animales o seres humanos que sufren septicemia o septicemia severa, lesiones por 20 isquemia/reperfusión, ictus, ictus isquémico, infarto de miocardio agudo, enfermedades neurodegenerativas agudas

o crónicas, daño por radiación o aquellos que sufren trasplante de órganos o quimioterapia, entre otras condiciones patológicas.

Las variantes de APC humana recombinante se añadieron al plasma humano, y la pérdida de actividad enzimática de la APC fue monitorizada utilizando ensayos amidolíticos estándar. Como se ve en las figuras 12a-12b, las

25 semividas en plasma humano, para la APC tipo natural humana recombinante y para las variantes de la APC fueron similares. Esto indica que la causa de la pérdida de actividad anticoagulante de las variantes de APC no es una disminución de su semivida.

Claims (13)

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   REIVINDICACIONES

   1.

   Una variante de proteína C activada recombinante, que comprende la mutación RR229/230AA y KKK191193AAA.

2. 2.

   Una variante de proteína C activada recombinante como se reivindica en la reivindicación 1, para uso en un método de tratamiento de un sujeto que sufre de una o más entre septicemia, lesión por isquemia/reperfusión, ictus, ictus isquémico, infarto de miocardio agudo, enfermedad neurodegenerativa aguda, enfermedad neurodegenerativa crónica, trasplante de órgano, quimioterapia, y lesión por radiación.

3. 3.

   Una variante de proteína C activada recombinante para uso en un método de tratamiento de un sujeto como se reivindica en la reivindicación 2, en donde dicha enfermedad neurodegenerativa crónica es la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, o enfermedad de Parkinson.

4. 4.

   Una variante de proteína C activada recombinante para uso en un método de tratamiento de un sujeto como se reivindica en la reivindicación 2 o en la reivindicación 3, en donde dicho método comprende proteger a las células frente al daño causado al menos en parte por la apoptosis y las células están en uno o más tejidos entre cerebro, corazón, riñón, hígado, o tejidos epiteliales de un sujeto.

5. 5.

   Una variante de proteína C activada recombinante como se reivindica en la reivindicación 1, para uso en un método terapéutico, en donde dicho método comprende administrar dicha variante a un sujeto en una dosis terapéutica entre 0,01 mg/kg/h y 1,1 mg/kg/h, mediante perfusión continua durante aproximadamente 4 horas a aproximadamente 96 horas.

6. 6.

   Una composición terapéutica que comprende una cantidad eficaz de una variante de proteína C activada recombinante, en donde dicha variante incluye la mutación RR229/230AA y KKK191-193AAA.

7. 7.

   Una composición como se reivindica en la reivindicación 6, en donde la composición está adaptada para administración al cerebro.

8. 8.

   Una composición como se reivindica en la reivindicación 6 o en la reivindicación 7, en donde la composición comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. 9.

   Una composición como se reivindica en la reivindicación 8, en donde la composición comprende además otros ingredientes conocidos para facilitar la administración y/o mejorar la absorción.

10. 10.

    Una composición de al menos una variante de proteína C activada recombinante que comprende la mutación RR229/230AA y KKK191-193AAA, para uso en un método de tratamiento de un sujeto que sufre de hemoperfusión reducida, hipoxia, isquemia, ictus isquémico, radiación, oxidantes, lesión por reperfusión o traumatismo, comprendiendo dicho método el tratamiento del estrés o lesión celular en uno o más tipos de células del sujeto.

11. 11.

    Un método in vitro para seleccionar las variantes citoprotectoras potencialmente terapéuticas de proteína C activada recombinante o proteína C recombinante, teniendo dicha proteína C activada o proteína C un dominio de proteasa, que comprende:

    (a)

    mutar la proteína C activada recombinante en un bucle de superficie de dicho dominio de proteasa para producir una variante de proteína C activada; medir la actividad anticoagulante de dicha variante de proteína C activada; medir la actividad anti-apoptótica de dicha variante de proteína C activada; calcular la relación de la actividad antiapoptótica a la actividad anticoagulante; e identificar la variante de proteína C activada como potencialmente terapéutica si dicha relación es mayor que 1,0; en donde la mutación es RR229/230AA y KKK191-193AAA;

    o

    (b)

    mutar la proteína C recombinante en un bucle de superficie de dicho dominio de proteasa para producir una variante de proteína C; convertir dicha variante de proteína C en una variante de proteína C activada; medir la actividad anticoagulante de dicha variante de proteína C activada; medir la actividad anti-apoptótica de dicha variante de proteína C activada; calcular la relación de la actividad anti-apoptótica a la actividad anticoagulante; e identificar la variante de proteína C activada como potencialmente terapéutica si dicha relación es mayor que 1,0; en donde la mutación es RR229/230AA y KKK191-193AAA.

12. 12. Un método in vitro para seleccionar las variantes citoprotectoras potencialmente terapéuticas de proteína C activada recombinante, que comprende:

    (a) proporcionar un banco de agentes candidatos que son variantes de proteína C o variantes de proteína C activada, en donde dicha proteína C o proteína C activada tiene un dominio de proteasa, en donde dichas variantes comprenden al menos una mutación en un residuo en un bucle de superficie de dicho dominio de proteasa, y en donde dichas variantes de proteína C son capaces de ser convertidas en variantes de proteína C activada;

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    E07868617

    15-07-2014

    (b)

    convertir dichos agentes candidatos que son variantes de proteína C en variantes de proteína C activada;

    (c)

    determinar la actividad anti-apoptótica de dichas variantes de proteína C activada de (a) o (b) en una o más células estresadas o lesionadas mediante la exposición de dichas células a una concentración de estaurosporina inductora de la apoptosis en presencia de una cantidad de un agente candidato;

    5 (d) determinar la actividad anticoagulante de dichos agentes candidatos que se ensayan en (c) mediante la realización de un ensayo de coagulación de tiempo de protrombina diluida;

    (e) calcular la relación de la actividad anti-apoptótica determinada en (c) con respecto a la actividad anticoagulante de (d); y

    (f) seleccionar los agentes candidatos que tienen una relación de actividad anti-apoptótica:anticoagulante mayor que 10 1,0;

    en donde dicha mutación es RR229/230AA y KKK191-193AAA.
13. 13. Un agente seleccionado por un método como se reivindica en la reivindicación 11 o 12.

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