JP2005506086A - トロンビン切断性キメラタンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、トロンビンによる切断についての人工配列を含むキメラタンパク質に関し、ここで、活性化ペプチドが、フィブリノペプチドＡである。好ましくは、このキメラタンパク質は、セリンプロテアーゼのチモーゲン（例えば、ＰＣまたはＦＸ）の活性化ペプチドをフィブリノペプチドＡ、またはこのフィブリノペプチドの少なくともアミノ酸配列Ｐ_１０〜Ｐ_１を含む、その一部で置換することにより、このチモーゲンから誘導される。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンビン切断性キメラタンパク質、特に、ヒトプロテインＣおよびヒト第Ｘ因子由来のタンパク質、ならびにその治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインＣ（以下、ＰＣとして示す）は、「抗凝固経路」と名付けられた凝固を調節する主要な機構に必須の因子である。活性型ＰＣ（活性化プロテインＣ、以下、ＰＣａとして示す）は、別のコファクター（プロテインＳ）と会合した場合、トロンビンの大量産生に必須の凝固カスケードの２つの因子（第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子）を分解する、セリンプロテアーゼである。これらの因子の破壊は、形成されるトロンビンの量をネガティブに調節し、抗凝固効果を生じる。第Ｘ因子（以下に、ＦＸとして示す）は、凝固カスケードの必須の因子である。活性化型のＦＸ（活性化第Ｘ因子、以下、ＦＸａとして示す）は、そのコファクター（凝固因子Ｖａ）と結合してプロトロンビンをトロンビンに活性化できる唯一のセリンプロテアーゼである。
【０００３】
ＰＣは、肝臓において合成される６２０００Ｄａの糖タンパク質である。それが、血漿へと分泌される前に、そのポリペプチド鎖は、いくつかの翻訳後成熟を受けて、機能的プロ酵素になる。これらの成熟は、プレペプチドおよびプロペプチドの切断、アミノ末端領域の最初の９個のグルタミン酸のγ−カルボキシル化、７１位のアスパラギン酸のβ−ヒドロキシル化、その配列に沿って分布する４残基のグリコシル化およびＬｙｓ^１５６−Ａｒｇ^１５７ダブレットの切り出しを含み、これにより、その（アミノ末端）軽鎖および（カルボキシ末端）重鎖を分離し、そしてＰＣの成熟形態を生じる。肝細胞による成熟の間のＬｙｓ^１５６−Ａｒｇ^１５７ダブレットの不完全な切り出しに起因して、血漿ＰＣの１０〜２０％が、一本鎖形態のままである。しかし、主要な血漿形態は、ジスルフィド架橋により連結された２本のポリペプチド鎖から構成される。２１０００Ｄａの軽鎖は、１５５アミノ酸からなり、これは、γ−カルボキシグルタミン酸を保有する小ドメインを含み、この後に、２つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）型ドメインが続く。４１０００Ｄａの重鎖は、２６２アミノ酸から構成され、セリンプロテアーゼファミリーのＳＡクラスに分類される将来の触媒ドメインを表す（ＳＨＥＮおよびＤＡＨＬＢＡＣＫ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ： Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．、Ｒａｗｌｉｎｇｓ，Ｎ．Ｄ．、Ｗｏｅｓｓｎｅｒ Ｊ．Ｆ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ．１９９８）。
【０００４】
ＦＸは、肝臓において合成される５９０００Ｄａの糖タンパク質である。それが血漿に分泌される前に、そのポリペプチド鎖は、いくつかの翻訳後成熟を受けて、機能的プロ酵素になる。これらの成熟は、プレペプチドおよびプロペプチドの切断、アミノ末端領域の最初の１１個のグルタミン酸のγ−カルボキシル化、１０３位のアスパラギン酸のβ−ヒドロキシル化、少なくとも５残基（活性化ペプチド上の４つを含む）のグリコシル化およびＡｒｇ_１８０−Ｌｙｓ_１８１−Ａｒｇ_１８２トリペプチドの切り出しを含む。ＰＣとは異なり、血漿中で循環する、実質的に全ての成熟ＦＸが、二本鎖形態であり、これらの鎖は、ジスルフィド架橋により連結されている。１６９００Ｄａの軽鎖は、１３９アミノ酸から構成され、γ−カルボキシグルタミン酸を保有する小ドメインを含み、その後に、２つのＥＧＦドメインが続く。４２１００Ｄａの重鎖は、３０６アミノ酸から構成され、セリンプロテアーゼファミリーのＳＡクラスに分類される将来の触媒ドメインを表す（ＳＴＥＮＦＬＯ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ： Ｆａｃｔｏｒ Ｘ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．、Ｒａｗｌｉｎｇｓ，Ｎ．Ｄ．、Ｗｏｅｓｓｎｅｒ Ｊ．Ｆ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ．１９９８）。
【０００５】
ほとんどのセリンプロテアーゼ前駆体のように、ＰＣおよびＦＸは、触媒活性を欠損するチモーゲンである。その活性化は、これらの重鎖のタンパク質分解性切断の結果である。ＰＣにおいて、この切断は、重鎖のＮ末端で生じ、１２アミノ酸「活性化」ペプチドを放出する。ＦＸにおいて、この切断は、Ａｒｇ_２３４残基とＩｌｅ２３５残基との間で生じ、また、５２アミノ酸の「活性化」ペプチドを放出する。
【０００６】
成熟形態のＰＣの重鎖および軽鎖のポリペプチド配列は、配列番号１の下で、図１および添付の配列表に表される。ＰＣの主要な領域が、図１の配列上に示される。重鎖には、下線が付されている。Ｌｙｓ^１５６−Ａｒｇ^１５７ダブレットが、太字で表される。活性化ペプチドが、ボックスで囲まれている。
【０００７】
成熟形態のＦＸの重鎖および軽鎖のポリペプチド配列が、図２および配列番号２３の下で添付の配列表に表される。ＦＸの主要な領域が、図２の配列上に示される。重鎖に下線が付される。Ａｒｇ^１８０−Ｌｙｓ^１８１−Ａｒｇ^１８２トリプレットが、太字で表される。活性化ペプチドが、ボックスで囲まれている。
【０００８】
ＰＣの配列に対してアミノ酸配列を位置付けるために、種々のナンバリングシステム、特に、以下のものが用いられ得る：
ＰＣのｃＤＮＡから推定される配列を参照したナンバリングシステム（ＢＥＣＫＭＡＮら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１３、５２３３−５２４７、１９９５）；このナンバリングは、図１において、そのペプチド配列の下に示されている；
キモトリプシンの触媒ドメインの残基のナンバリングを参照した、ＰＣの重鎖の残基のナンバリングシステム（ＭＡＴＨＥＲＳら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１５、６８２２−６８３１、１９９６）。このナンバリング（一般的に、セリンプロテアーゼについて用いられる）は、これらの酵素の間に存在する、トポロジーの類似性に基づき、これは、これらの酵素の比較を非常に容易にする。このナンバリングは、ｃＤＮＡ配列を参照したナンバリングの下に、図１に斜体で表される。
【０００９】
ＦＸの配列に対してアミノ酸残基を位置付けるために、これらの種々のナンバリングシステム、特に以下のもの、もまた用いられ得る：
ＦＸのｃＤＮＡから推定される配列を参照したナンバリングシステム（ＭＥＳＳＩＥＲら、Ｇｅｎｅ、９９、２９１−２９４、１９９１）；このナンバリングは、図２において、ペプチドの配列の下に表される；
キモトリプシンの触媒ドメインの残基のナンバリングを参照した、ＦＸの重鎖の残基のナンバリングシステム（ＰＡＤＭＡＮＡＢＨＡＮら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３２、１−２０、１９９３）。このナンバリングは、ｃＤＮＡ配列を参照したナンバリングの下に、図２に斜体で表される。
【００１０】
例えば、ナンバリングが成熟形態のＰＣを参照してなされる場合、ＰＣａに生じるタンパク質分解性切断部位の境をなすＡｒｇ残基およびＬｅｕ残基は、Ａｒｇ^１６９位およびＬｅｕ^１７０位により同定され；このナンバリングが、キモトリプシンの触媒ドメインを参照してなされる場合、これらの同じ残基は、Ａｒｇ^１５位およびＬｅｕ^１６位により同定される。同様に、このナンバリングが、成熟形態のＦＸを参照してなされる場合、ＦＸａに生じるタンパク質分解性切断部位の境をなすＡｒｇ残基およびＩｌｅ残基が、Ａｒｇ^２３４位およびＩｌｅ^２３５位により同定され；このナンバリングがキモトリプシンの触媒ドメインを参照してなされる場合、これらの同じ残基は、Ａｒｇ^１５位およびＩｌｅ^１６位により同定される。
【００１１】
別の一般的なナンバリングシステムもまた、このタンパク質分解性切断部位を言及するために用いられる。アミノ酸の位置が、その切断部位から増加する順番で与えられる。この部位の上流の位置が、Ｐにより同定され、そしてこの部位の下流の位置がＰ’により同定される。したがって、ＰＣの場合、Ｐ_１２は、活性化ペプチドのＮ末端アミノ酸（切断部位からもっとも遠い）を表し、そしてＰ_１は、活性化ペプチドのＣ末端アミノ酸を表し；Ｐ_１’は、ＰＣａのＮ末端アミノ酸を表す。
【００１２】
ＰＣの活性化は、それが血管内皮に存在する膜結合コファクター（トロンボモジュリン）と複合体化したトロンビンにより切断されることの結果である。トロンボモジュリンの非存在下で、トロンビンによるＰＣの活性化は、約１０００倍遅く、そして無視できる量のＰＣａしか産生しない。
【００１３】
血管の断面を考慮すると、容量当りに灌注するトロンボモジュリン分子の量は、微小循環系において、大口径の血管よりも多い。この結果、トロンビンの存在下で、ＰＣａの産生は、微小循環系において迅速であるが、大口径の血管において遅い。従って、抗凝固経路の生理学的役割は、微小循環系に限定される。
【００１４】
抗凝固経路の重要性は、この系に関与するタンパク質における遺伝的または後天性の欠乏症の重篤さにより裏付けられ；ＰＣもしくはプロテインＳにおける欠乏またはＰＣａによる不活化に対する第Ｖａ因子の耐性が、血栓性アクシデントの３０％より多くにおいて同定されている（ＡＩＡＣＨら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、３４、２０５−２１７、１９９７）。ＰＣ遺伝子が不活化されているか（ＪＡＬＢＥＲＴら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２（８）、１４８１−１４８８、１９９８）またはトロンボモジュリン遺伝子が機能しない（ＷＥＩＬＥＲ−ＧＵＥＴＴＬＥＲら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０１、１９８３−１９９１、１９９８）トランスジェニックマウスは、種々の器官において、特に、フィブリン沈着出現により特に具現化される、凝固の異常を示す。
【００１５】
種々の研究は、ＰＣが多面性の生物学的活性：抗トロンビン活性（ＴＡＹＬＯＲら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７９、９１８−９２５、１９８７；ＧＲＵＢＥＲら、Ｂｌｏｏｄ、７３、６３９−６４２、１９８９；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８２、５７８−５８５、１９９０；ＣＨＥＳＥＢＲＯら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８６、ＩＩＩ１００−１１０、１９９２；ＨＡＮＳＯＮら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２、２００３−２０１２、１９９３；ＡＲＮＬＪＯＴＳら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、７２、４１５−４２０、１９９４；ＳＡＫＡＭＯＴＯら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９０、４２７−４３２、１９９４；ＪＡＮＧら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９２、３０４１−３０５０、１９９５；ＫＵＲＺら、Ｂｌｏｏｄ、８９、５３４−５４０、１９９７；ＧＲＥＳＥＬＥら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０１、６６７−６７６、１９９８；ＭＩＺＵＴＡＮＩら、Ｂｌｏｏｄ、９５、３７８１−３７８７、２０００；ＢＥＲＮＡＲＤら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４４、６９９−７０９、２００１）だけでなく、抗炎症活性（ＥＳＭＯＮ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１４７７、３４９−３６０、２０００）、抗アポトーシス活性（ＪＯＹＣＥら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６、１１１９９−１１２０３、２００１）、およびプロフィブリノリティック活性（ｐｒｏ−ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（ＣＯＭＰ ＆ ＥＳＭＯＮ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、６８、１２２１−１２２８、１９８１；ＲＥＺＡＩＥ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６、１５５６７−１５５７０、２００１）を有することを示している。この生理病理学において、この血栓プロセスに関連した炎症反応および、時々細胞死が存在するので、この薬理学的スペクトルは、それを血栓症疾患の処置のための優秀な候補物にする。
【００１６】
さらに、ＰＣ活性化の誘導性機構は、それを自己調節抗血栓剤にし、その作用が、血栓に標的化され、従って、従来の抗血栓剤に固有の出血の危険性を制限する。
【００１７】
ＰＣ濃縮物の投与が、同型接合性遺伝的ＰＣ欠乏症および後天性欠乏症（例えば、ｐｕｒｐｕｒａ ｆｕｌｍｉｎａｎｓに関連する髄膜炎菌感染）の処置において有用であることを証明している（ＧＥＲＳＯＮら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、９１、４１８−４２２、１９９３；ＯＫＡＪＩＭＡら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、３３、２７７−２７８、１９９０；ＤＲＥＹＦＵＳら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２５、１５６５−１５６８、１９９１；ＭＡＮＣＯ−ＪＯＨＮＳＯＮ ＆ ＮＵＳＳ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、４０、６９−７０、１９９２；ＲＩＮＴＡＬＡら、Ｌａｎｃｅｔ、３４７、１７６７、１９９６；ＳＭＩＴＨら、Ｌａｎｃｅｔ、３５０、１５９０−１５９３、１９９７；ＷＨＩＴＥら、Ｂｌｏｏｄ、９６、３７１９−３７２４、２０００）。この置換治療は、循環するＰＣのストックを再構築することにより、これらの欠乏症に関連する障害を矯正することを可能にする。
【００１８】
しかし、大血管の、動脈または静脈の血栓の場合における抗血栓処置としてのＰＣ濃縮物の使用は認識され得ない。上述のように、利用可能なトロンボモジュリンの量は、限定要因を構成し、ＰＣの飽和濃度を用いてさえも、その活性化は、適切な治療効果を得るのには、遅すぎるままである。
【００１９】
血管領域全体に対するＰＣの抗凝固経路の生物学的活性を拡大するために、ＰＣａの直接的な使用が提唱されている。この解決法が効果的であることは証明されているが（ＢＥＲＮＡＲＤら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４４、６９９−７０９、２００１）、その使用は、循環中におけるＰＣａの非常に短い半減期（約３０分）により制限されている。実際、ほとんどの活性化セリンプロテアーゼと同様に、ＰＣａは、血漿中に存在するインヒビター（セルピン）により迅速に中和される。従って、この治療効果は、連続的注入を用いてのみ得ることが出来る。
【００２０】
この制限を克服するために認識される解決法の１つは、血漿インヒビターに対するＰＣａの耐性を増加させるようにＰＣａを改変することからなる。しかし、ＰＣａの使用がＰＣの主要な利点（すなわち、トロンビンの存在により誘導される活性化）から利益を得ることを可能にしないという事実によって、別の問題が提示される。インヒビターに対して耐性であり、その形成が調節され得ないＰＣａは、従来の抗血栓剤の欠点（すなわち、血栓領域に限定されない抗凝固作用、およびその後に引き続く潜在的な出血の危険性）を有する。
【００２１】
提唱されている別のアプローチは、血管内皮の直近のみでなく血栓を通してのＰＣａの形成を可能にすることを目的として、トロンボモジュリンの非存在下でトロンビンにより直接活性化させるように、ＰＣを改変することを探求することを包含する。
【００２２】
従って、米国特許第５ ４５３ ３７３号は、以下の種々のＰＣ誘導体を記載する：
Ｆ１６７と呼ばれる誘導体は、成熟形態のＰＣの１６７位（活性化ペプチドのＰ_３位）のＡｓｐ残基をＰｈｅ残基で置換することから生じ；この誘導体は、トロンボモジュリンの非存在下で、トロンビンによって、ネイティブのＰＣより１２倍速い速度で活性化される；
ＬＩＮと呼ばれる誘導体は、成熟形態のＰＣの１７２位（タンパク質分解性切断部位に対するＰ_３’位）のＡｓｐ残基をＡｓｎ残基で置換することにより生じ；この誘導体は、トロンボモジュリンの非存在下で、トロンビンによって、ネイティブのＰＣより４倍速い速度で活性化される；
ＦＬＩＮと呼ばれる誘導体は、成熟形態のＰＣの１６７位のＡｓｐ残基をＰｈｅ残基で置換し、そして成熟形態のＰＣの１７２位のＡｓｐ残基をＡｓｎ残基で置換することにより生じ；この誘導体は、トロンボモジュリンの非存在下で、トロンビンによって、ネイティブのＰＣより３０倍の速度で活性化される；
Ｑ３１３およびＱ３２９と呼ばれる誘導体は、それぞれ、成熟形態のＰＣの３１３位のＡｓｎ残基または３２９位のＡｓｎ残基をＧｌｎ残基で置換することにより生じ；これらの改変は、これらのＡｓｎ残基でのグリコシル化部位を欠損させて、ＰＣａの抗凝固活性を増加させるために実施された。誘導体Ｑ３１３は、トロンビンによって、ネイティブのＰＣより２倍速い速度で活性化され；その抗凝固活性は、ＰＣａのそれより１．８倍高く；誘導体Ｑ３２９は、トロンビンによって、ネイティブのＰＣより迅速でなく活性化される；
Ｑ３Ｑ９と呼ばれる誘導体は、成熟形態のＰＣの３１３位のＡｓｎ残基および３２９位のＡｓｎ残基を、Ｇｌｎ残基で置換することにより生じ；この誘導体は、トロンボモジュリンの非存在下で、トロンビンによって、ネイティブのＰＣより３．３倍の速度で活性化される。
【００２３】
ＦＬＩＮ−Ｑ３１３およびＦＬＩＮ−Ｑ３Ｑ９と呼ばれる誘導体は、これらの種々の改変を組み合わせている；これらは、トロンビン単独によって、それぞれ、ネイティブのＰＣより６１倍、および８４倍高く活性化される。これらの活性化速度は、トロンボモジュリンの存在下において、ネイティブＰＣのそれより非常に低い。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、トロンボモジュリンに依存せず、トロンビンによって、その活性化速度をより有意に増加させることを可能にする、ＰＣの他の改変を調査した。
【００２５】
従って、本発明者らは、（生理学的条件下で、かつトロンボモジュリンの非存在下での）トロンビンによるＰＣ活性化の促進を増進する２つの型の改変を実証した。さらに、これらの改変を組み合わせることは、改変ＰＣを得ることを可能にし、トロンボモジュリンの非存在下でのその活性化は、同じ条件下で、ネイティブＰＣの活性化より５００倍まで迅速であり、そして改変ＰＣａを産生し、その血漿中半減期は、ネイティブＰＣａより長い。
【００２６】
第一カテゴリーの改変は、活性化ペプチドに関する：本発明者らは、このペプチドをフィブリノーゲンのフィブリノペプチドＡ（ＦｐＡ）のアミノ酸Ｐ_１０〜Ｐ_１（タンパク質分解性切断部位を参照してナンバリングされている）で置換することにより、正常の（ｎｏｒｍａｌ）ＰＣが同じ条件下で発現および特徴付けた活性化速度より４０倍速い活性化速度を得ることが可能になることを見出した（比較として、活性化ペプチドのｐ_３位にＡｓｐ→Ｐｈｅ置換を保有する、米国特許第５ ４５３ ３７３号に記載される誘導体Ｆ１６７は、トロンビンによって、ネイティブのＰＣよりたった１２倍迅速に活性化される）。
【００２７】
血液凝固は、酵素反応のカスケードから生じ、その最終的な段階は、トロンビンの産生であり、これは、血管開口部を密封し得る凝塊の形成を誘導する。これらの反応のほとんどが、活性セリンプロテアーゼへの不活性チモーゲンのタンパク質分解性活性化を含む。この反応カスケードは、従来、ＦＸの活性化が第ＩＸａ因子または第ＶＩＩａ因子で切断されて生じるのかに依存して、「内因性経路」および「組織因子経路」、または「外因性経路」と呼ばれる２つの経路へと分類される。従って、これらの経路は、ＦＸからＦＸａへの活性化に収束させる。ＦＸａは、重要な凝固酵素の１つであり、なぜならそのコファクター（第Ｖａ因子）へのその結合が、プロトロンビンをトロンビンに活性化するプロトロンビナーゼ複合体を形成するからである。
【００２８】
凝固に関与するタンパク質のうちの１つにおける質的または量的な欠陥は、しばしば、重篤な血栓または出血の発現を導き、可能性として、生存予後を脅かす。この文脈において、特に、夫々、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の欠乏から生じる血友病ＡおよびＢが言及される。
【００２９】
現時点で提唱される血友病の処置は、置換型の処置または欠乏段階をバイパスする１つ以上の分子の使用に基づく処置のいずれかである（ＨＥＤＮＥＲ、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、８２、５３１−５３９、１９９９）。
【００３０】
置換的処置の主要な欠点は、レシピエントの免疫系により異質であるとみなされ得る、注射される分子の潜在的な抗原性にある。用いられる因子に向けられる中和性同種異系抗体の発生は、置換的処置の重篤な合併症であり、これは、その処置を少しずつ効果のないものにする。現在利用可能または試験中の「バイパス」処置の主要な欠点は、自己調節の不存在（特に、トロンビン産生の局在化および／または自己増幅の不存在）である。これらは、以下の、まれであるが重篤な副作用を導き得る：アナフィラキシーショックおよび血栓性アクシデント（心筋梗塞、汎発性血管内凝固症候群）。
【００３１】
従って、これらの欠点を有さない利用可能な処置を有することが所望されるようである。この目的のために、本発明者らは、凝固カスケードの欠乏段階をバイパスするだけでなく、トロンビン産生の自己増幅を再構築することを可能にするトロンビン活性化可能なＦＸ誘導体を調査した。活性化形態のこのＦＸ誘導体（ＦＸａ^＊）は、実際、（第Ｖａ因子と組み合わせて）、機能的プロトロンビナーゼ複合体の形成を可能にし、従って、プロトロンビンをトロンビンに活性化する能力を有する。次いで、トロンビンは、さらにＦＸ誘導体分子を活性化する。
【００３２】
従って、本発明者らは、ＰＣについて上で言及した型と同じ型のＦＸ改変に導いた。本発明者らは、ＦＸの活性化ペプチドをフィブリノペプチドＡのアミノ酸Ｐ_１０〜Ｐ_１で置換することにより、正常のＦＸと異なり、トロンビンにより活性化可能である改変ＦＸを得ることが出来ることを見出した。
【００３３】
従って、トロンビン活性化チモーゲンのネイティブ活性化ペプチドをＦｐＡ、またはその少なくともアミノ酸Ｐ_１０〜Ｐ_１を含むペプチドで置換することが、このチモーゲンの活性化速度を増加することを可能にするようである。さらに、これらのＮ末端にフィブリノペプチドＡの少なくともアミノ酸Ｐ_１０〜Ｐ_１を含むペプチドに引き続き、トロンビンの切断部位の少なくともアミノ酸Ｐ_１’、Ｐ_２’およびＰ_３’を配置することによって、別のセリンプロテアーゼにより活性化可能なチモーゲンから、または任意のポリペプチドからさえ、トロンビン切断タンパク質を構築することが可能であるようである。トロンビンによる切断部位を構築するためにＰ_１’位、Ｐ_２’位、およびＰ_３’位で使用され得るアミノ酸自体が、知られており、これらは、例えば、米国特許第５ ６８８ ６６４号におけるＤＡＷＳＯＮら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、１５９８９−１５９９２、１９９４）またはＬＥ ＢＯＮＮＩＥＣら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５、７１１４−７１２２、１９９６）に記載されている。
【００３４】
他方、先行技術において、切断部位のＰ_２位でのプロリン残基の存在が、トロンビンによる最適な切断に必要であると考えられてきたが（特に、上に引用されるＤＡＷＳＯＮら、および米国特許第５ ６８８ ６６４号を参照のこと）、本発明は、Ｐ_２位の残基がバリンであるトロンビン切断可能タンパク質を提供する。この残基、およびＦｐＡのＰ_９位のフェニルアラニンおよびＰ_６位のグルタミン酸が、正常のＰＣの切断のためには用いられない、トロンビンに対するさらなる結合部位の使用を可能にすると推定されている。
【００３５】
本発明の目的は、そのＮ末端に活性化ペプチドと、引き続くトロンビン切断部位のアミノ酸Ｐ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’を含むトロンビン切断キメラタンパク質であり、この活性化ペプチドが、フィブリノペプチドＡ、またはこのフィブリノペプチドＡの少なくともアミノ酸Ｐ_１０〜Ｐ_１を含む、その一部である点において特徴付けられる（Ｐ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’が配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇであるキメラタンパク質は除く）。
【００３６】
本発明の主題は、トロンビン切断配列Ｐ_１０Ｐ_９Ｐ_８Ｐ_７Ｐ_６Ｐ_５Ｐ_４Ｐ_３Ｐ_２Ｐ_１Ｐ_１’Ｐ_２’Ｐ_３’を含むキメラタンパク質であり、前記配列がフィブリノペプチドＡのアミノ酸Ｐ_１０〜Ｐ_１およびトロンビン切断部位のアミノ酸Ｐ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’（フィブリノーゲンのα鎖の配列を除く）を含む人工配列である点において特徴付けられる。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態に従って、このキメラタンパク質は、セリンプロテアーゼのチモーゲンの活性化ペプチドを、フィブリノペプチドＡ、または前記フィブリノペプチドＡの少なくともアミノ酸Ｐ_１０〜Ｐ_１を含むその一部を用いて置換することにより、前記チモーゲンから誘導される。有利には、このチモーゲンは、ＰＣまたはＦＸである。
【００３８】
本発明のキメラタンパク質を得るために、任意の動物種のＦｐＡ（またはその少なくともアミノ酸Ｐ_１０−Ｐ_１）の使用を認識することが可能であり、ここで、このＦｐＡの配列は、特に、Ｐ_９位のフェニルアラニン、Ｐ_６位のグルタミン酸、およびＰ_２位のバリンに関して、種の間で十分に保存されている。しかし、ヒトの医薬において使用されることが意図された、例えば、ＰＣ誘導体またはＦＸ誘導体のキメラタンパク質を産生するために、好ましくは、ヒトＦｐＡ、またはヒトＦｐＡのアミノ酸Ｐ_１０〜Ｐ_１に対応するペプチド配列ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号２）が利用される。これらのペプチドが天然で、循環するフィブリノーゲンに曝されているので、実際、これらのペプチドは、潜在的に比較的非免疫原性であるという利点を有する。
【００３９】
上に示すように、トロンビンによる切断を可能にする多くのＰ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’配列自体が公知であり；これらは、特に、トロンビン活性化チモーゲンの形態で天然に存在するタンパク質のトロンビン切断部位のＰ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’配列である。フィブリノーゲンのα鎖のトロンビン切断部位のＰ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’配列に対応する、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを除くこれらの配列が、本発明の文脈において用いられ得る。
【００４０】
例えば、本発明に従うキメラタンパク質の産生に関して、ＰＣに由来する、Ｐ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’配列は、配列Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐであり得、これは、ＰＣのネイティブのＰ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’配列に対応する。同様に、ＦＸ由来の本発明に従うキメラタンパク質の産生に関して、このＰ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’配列は、配列Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙであり得、これは、ＦＸのネイティブのＰ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’配列に対応する。
【００４１】
有利には、１つ以上のＰ_１’残基、Ｐ_２’残基またはＰ_３’残基が、トロンビンによる活性化の速度をさらに改善するように改変され得る。トロンビンによる活性化に影響する種々の改変が、例えば、上に引用される、ＬＥ ＢＯＮＮＩＥＣら（１９９６）による刊行物に記載される。
【００４２】
残基Ｐ_１’〜Ｐ_３’（キモトリプシンナンバリングによる１６〜１８）は、セリンプロテアーゼにおいて、切断から生じる活性酵素の触媒ドメインのアミノ末端を構成する。
【００４３】
これらは、セリンプロテアーゼ中で十分に保存されている：コンセンサス配列は、Ｉｌｅ^１６−Ｖａｌ^１７−Ｇｌｙ^１８である。特に、Ｐ_１’位およびＰ_２’位が、ほとんど全体において、脂肪族側鎖を有する疎水性残基により占められており、これらの残基は、活性化セリンプロテアーゼの触媒部位の形成および安定化において重要な役割を果たす疎水性相互作用を発生させる。
【００４４】
ＰＣａの場合、残基１６（Ｐ_１’）は、ロイシンであり、残基１７（Ｐ_２’）は、イソロイシンであり、そして残基１８（Ｐ_３’）は、アスパラギン酸である。ＦＸの場合、残基１６（Ｐ_１’）は、イソロイシンであり、残基１７（Ｐ_２’）は、バリンであり、そして残基１８（Ｐ_３’）は、グリシンである。
【００４５】
しかし、これらの残基でのトロンビンによる切断についての最適配列は、（それぞれＰ_１’位、Ｐ_２’位、およびＰ_３’位での）Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ、すなわち、特に、Ｐ_１’位の親水性残基（セリン）の存在に起因して、セリンプロテアーゼのコンセンサス配列とＰＣまたはＦＸの特定の配列の両方から十分に離れた配列である。
【００４６】
これらの条件下で、特に、ＰＣおよびＦＸの場合、リスクのある活性化速度を増加させるトロンビンについての親和性の増加は、触媒ドメインの安定性、従って、ＰＣａおよびＦＸａの活性の損害が増大する可能性があるようである。
【００４７】
しかし、本発明者らは、活性化切断部位の上流にＦｐＡ配列を保有することに加えて、ＰＣのロイシンもしくはＦＸのイソロイシンに対する置換基として切断部位のＰ_１’位にアラニンもしくはセリンを導入し、そして／またはＰＣのイソロイシンもしくはＦＸのバリンに対する置換基としてＰ_２’位にフェニルアラニンを導入し、そして／またはＰＣのアスパラギン酸に対する置換基としてＰ_３’位にグリシンを導入するように改変されたＰＣ誘導体およびＦＸ誘導体を構築した。
【００４８】
従って、これらの変異がトロンビンによるＰＣおよびＦＸの活性化切断を促進し、そしてさらに、これらから生じるＰＣａ誘導体およびＦＸａ誘導体が、触媒活性を保存し、この触媒活性は、減少しているが、正常な生理学的機能に適合し；さらに触媒活性におけるこの減少が、ＰＣａおよびＦＸａの変異されてないホモログと比較した半減期の増加（１０倍まで）により補償されることに注目した。この半減期の増加は、これらの変異により与えられる、血漿中でのセリンプロテアーゼインヒビターに対する、より良好な耐性の結果である。
【００４９】
本発明に従うセリンプロテアーゼチモーゲン誘導体、特に、ＰＣ誘導体またはＦＸ誘導体の好ましい実施形態に従って、このチモーゲンのネイティブのＰ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’配列もまた、Ｐ_１’位のアミノ酸をアラニンまたはセリンで置換することによって改変される。
【００５０】
ネイティブのＰ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’配列の他の有利な改変としては、例えば、以下が挙げられる：
フェニルアラニンによるＰ_２’位のアミノ酸の置換；
グリシンによるＰ_３’位のアミノ酸の置換。
【００５１】
特に好ましい誘導体は、Ｐ_１’位のアミノ酸が、アラニンで置換されているものである。
【００５２】
本発明の主題はまた、切断部位の残基Ｐ_１’、残基Ｐ_２’または残基Ｐ_３’のうち１つ以上が上で示されるように改変されている、本発明に従うチモーゲン誘導体のトロンビン切断により得ることが出来る、任意のセリンプロテアーゼ誘導体、特にＰＣａ誘導体またはＦＸａ誘導体である。
【００５３】
本発明に従うセリンプロテアーゼ誘導体は、血漿セルピンに対して、対応するネイティブのセリンプロテアーゼより耐性であり、従って、より長い半減期を有するという利点を有する。
【００５４】
従って、本発明の実施は、以下のことを可能にする：
この酵素への天然基質を構成しないタンパク質のトロンビン切断を得ること、または天然ではトロンビンにより徐々に切断されるのみであるタンパク質の切断を促進すること；従って、特に、入手が容易で安価な酵素であるトロンビンを用いる単純な切断によって、チモーゲンから活性タンパク質を、容易かつ比較的安価に得ることが可能である；
さらに、切断部位の残基Ｐ_１’、残基Ｐ_２’、または残基Ｐ_３’のうち１つ以上の、上で示されるような改変体が産生される際、インヒビターに対して耐性であり、従って、より長い血漿中半減期を有するセリンプロテアーゼ誘導体を得ること。
【００５５】
従って、例として、ＰＣの場合、本発明の実施は、トロンボモジュリンの非存在下でのトロンビンによる活性化の速度が、従来技術のＰＣ誘導体のものより非常に速いＰＣ誘導体を得ることを可能にする。さらに、それは、非常に高価であるヘビ毒から抽出されるアクチベーターがネイティブＰＣからＰＣａを調製するために従来用いられているが、トロンビンを用いて、これらの誘導体から活性化ＰＣを調製することを可能にする。本発明に従い得ることができるＰＣａ誘導体に関して、これらの比較的低い活性が、第一に活性化の速度によって、そして第二にこれらの血漿セルピンに対する相当な耐性によって、補償される。この結果は従来技術のＰＣａまたはＰＣ誘導体より良好に標的化されかつより容易に制御される治療効果である。
【００５６】
また、例として、本発明の実施は、トロンビン活性化可能なＦＸ誘導体を得ることを可能にする。さらに、非常に高価であるヘビ毒から抽出されるアクチベーターがネイティブＦＸからＦＸａを調製するために従来用いられているが、それは、トロンビンを用いて、これらの誘導体からＦＸａを調製することを可能にする。本発明に従い得ることができるＦＸａ誘導体に関して、これらの可能な低い活性が、第一にトロンビンに対するこれらの感受性によって、そして第二にこれらの血漿セルピンに対して比較的耐性であることによって、補償される。この結果は、従来技術において等価なもののない、注目すべき潜在的な治療効果である。
【００５７】
必要に応じて、本発明の誘導体に特異的な改変を、選択されるタンパク質の異なるドメインに関しかつその特性のいくつかを改善することを可能にし得る他の改変と組み合わせることが可能である。従って、本発明のＰＣ誘導体またはＰＣａ誘導体の場合、例えば、わずかに高い抗凝固活性を有するＰＣａ誘導体を得ることが所望される場合に、米国特許第５ ４５３ ３７３号に記載されるように、（成熟形態のＰＣを参照して）３１３位および３２９位のＡｓｎ残基を置換することが可能である。本発明のＦＸ誘導体またはＦＸａ誘導体の場合、成熟γ−カルボキシル化タンパク質のより高い収率を得ることが所望される場合、ＣＡＭＩＲＥら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９、１４３２２−１４３２９、２０００）に記載されるように、ネイティブのＦＸのプロペプチドをプロトロンビンのプロペプチドで置換することが可能である。
【００５８】
本発明の主題はまた、キメラタンパク質、特にＰＣ誘導体またはＦＸ誘導体、または本発明に従う他のセリンプロテアーゼ誘導体をコードする核酸分子である。
【００５９】
これらの核酸分子を、当業者に周知の従来法、特に、トロンビンによる切断を可能にするかまたは促進することが所望されるネイティブタンパク質をコードする遺伝子の位置指定突然変異誘発によって得ることが出来る。
【００６０】
本発明はまた、位置指定突然変異誘発により本発明に従うＰＣ誘導体をコードする核酸分子を得るために用いられ得るヌクレオチドプライマー対、特に、以下のプライマー対を包含する：
配列番号５および配列番号６により規定されるオリゴヌクレオチド対、
配列番号７および配列番号８により規定されるオリゴヌクレオチド対、
配列番号９および配列番号１０により規定されるオリゴヌクレオチド対、
配列番号１１および配列番号１２により規定されるオリゴヌクレオチド対、
配列番号１３および配列番号１４により規定されるオリゴヌクレオチド対。
【００６１】
本発明はまた、部位指定突然変異誘発により本発明に従うＦＸ誘導体をコードする核酸分子を得るために用いられ得るヌクレオチドプライマー対、特に、以下のプライマー対を包含する：
配列番号１５および配列番号１６により規定されるオリゴヌクレオチド対、
配列番号１７および配列番号１８により規定されるオリゴヌクレオチド対、
配列番号１９および配列番号２０により規定されるオリゴヌクレオチド対、
配列番号２１および配列番号２２により規定されるオリゴヌクレオチド対。
【００６２】
本発明はまた、本発明の核酸分子が、転写（特に、プロモーターおよび必要に応じてターミネーター）および必要に応じて翻訳を制御に適するエレメントと結合した発現カセット、ならびに本発明に従う核酸分子が挿入された組換えベクターを包含する。これらの組換えベクターは、例えば、クローニングベクター、または発現ベクターであり得る。
【００６３】
本発明はまた、インビボまたはエキソビボ(ex vivo)での遺伝子治療において用いられ得る本発明の核酸分子を含む遺伝子送達系を包含する。これは、例えば、ウイルストランスファーベクター（ｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ）（例えば、遺伝子治療において従来用いられている、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス由来のもの）を包含する。これはまた、本発明の核酸分子および非ウイルス遺伝子送達ビヒクルを含む遺伝子送達系を包含する。非ウイルス遺伝子送達ビヒクルの例としては、リポソームおよびポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、シクロデキストリン、ヒスチジン／リジン（ＨＫ）ポリマーなど）が挙げられる。
【００６４】
本発明の主題はまた、少なくとも１つの本発明に従う核酸分子を用いて遺伝的に形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞である。好ましくは、キメラタンパク質、特に、本発明に従うＰＣまたはＦＸ誘導体を発現および産生するために、真核生物細胞、特に哺乳動物細胞が選択される。
【００６５】
本発明はまた、少なくとも本発明の発現カセットを含むトランスジーンを保有する（ｈｏｓｔｉｎｇ）トランスジェニック動物、特にトランスジェニック非ヒト哺乳動物を包含する。これらのトランスジェニック動物が、例えば、ＢＲＩＮＫら、（Ｔｈｅｒｉｏｌｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、５３、１３９−１４８、２０００）により既に記載されているように、本発明のキメラタンパク質を産生するために用いられ得る。
【００６６】
本発明に従う発現ベクターの構築、宿主細胞の形質転換、およびトランスジェニック動物の産生が、従来の分子生物学的技術を用いて実施され得る。
【００６７】
本発明のキメラタンパク質、特にＰＣもしくはＦＸ誘導体、またはセリンプロテアーゼ誘導体を、例えば、本発明に従い遺伝的に形質転換された細胞を培養する工程、およびこの細胞により発現される誘導体を培養物から回収する工程により得ることが出来る。次いで、これらは、必要な場合、当業者に公知の従来の手順よって（例えば、分別沈降（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）（特に硫酸アンモニウム沈降）、電気泳動、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなどによって）精製され得る。
【００６８】
特に、組換えタンパク質を調製および精製するための従来の方法が、本発明に従うタンパク質を産生するために用いられ得る。例えば、本発明に従うＰＣ誘導体を産生するために、米国特許第４ ９９２ ３７３号または米国特許第４ ９８１ ９５２号に記載される方法が用いられ得る。
【００６９】
本発明の主題はまた、医薬品を産生するための、本発明に従う、少なくとも１種のキメラタンパク質、またはそのトロンビン切断産物、特に、本発明に従う、ＰＣ、ＰＣａ、ＦＸ、もしくはＦＸａ誘導体、またはこれらの誘導体をコードする核酸分子の使用である。これらの医薬品もまた本発明の一部である。これらとしては、例えば、以下が挙げられる：
適切な賦形剤と組み合わせた、本発明に従う、少なくとも１つのキメラタンパク質、またはそのトロンビン切断産物、特に、本発明に従う、ＰＣ、ＰＣａ、ＦＸもしくはＦＸａ誘導体の少なくとも１つを含む薬学的組成物、
ウイルス性または非ウイルス性の遺伝子送達ビヒクルと結合させた本発明の核酸分子を含む薬学的組成物。これらの薬学的組成物は、インビボまたはエキソビボでの遺伝子治療に、有利に用いられ得る。遺伝子治療において従来用いられているベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス型またはレトロウイルス型のベクター）、リポソームなど）が、本発明に従う医薬品を産生するために用いられ得る。
【００７０】
例えば、本発明に従うＰＣまたはＰＣａ誘導体から得られる医薬品が、ＰＣまたはＰＣａの全ての通常の適用において、特に、凝固性亢進に関与する病理学の予防または処置の文脈において、抗血栓剤、抗炎症剤および抗アポトーシス剤ならびに血栓溶解剤(profibrinolytics)として、用いられ得る。例として、静脈または動脈の血栓、特に、大口径の血管に影響する血栓、心筋梗塞、血栓性疾患、肺塞栓、血管形成後の冠状動脈の再閉塞の予防または血栓溶解が言及され、そしてまた、ＰＣの遺伝子またはトロンボモジュリンの遺伝子に影響する遺伝的異常に罹患する患者における凝固異常の処置または予防も言及される。
【００７１】
本発明に従うＦＸまたはＦＸａ誘導体から得られる医薬品が、凝血促進剤として用いられ得る。例として、特に、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、または第ＸＩ因子欠乏に続く出血型の凝固性病理の予防または処置が言及される。これらは、特に、Ａ型血友病またはＢ型血友病であり得、これらは、インヒビター（処置のために従来用いられる第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対して指向される中和同種異系抗体）の存在により併発しても併発しなくてもよく；これらはまた、別の病理（自己免疫疾患、癌、リンパ組織増殖性症候群、突発性障害など）に関連する自己抗体の存在から生じる後天性の血友病であり得る。
【００７２】
本発明は、以下のさらなる記載から、より明確に理解され、この記載は、本発明に従うＰＣ誘導体およびＦＸ誘導体の調製および特徴付けの非限定の例を記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７３】
実施例１：ＰＣ変異型の発現のためのベクターの構築
ＰＣ変異型の発現のために意図されるベクターを、出発物質としてベクターｐＣＩ−ｎｅｏ−ＰＣ（これは、哺乳動物細胞へのトランスフェクション後に正常のヒトプロテインＣを発現する）を用いて構築した。
【００７４】
ＰＣｃＤＮＡを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ヒト肝細胞から単離した；ｃＤＮＡをベクターｐＣＩ−Ｎｅｏ（ＰＲＯＭＥＧＡ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）にクローニングするために用いられる方法は、文献に記載される方法に従う（ＳＡＭＢＲＯＯＫら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；ＷＨＩＴＥ、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｌｋｅｒ Ｊ．Ｈ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９３）。
【００７５】
ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ−ＰＣの位置指定突然変異誘発
ＰＣアナログの発現のために意図されるベクターを調製するために、ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ−ＰＣの位置指定突然変異誘発を、ＪＯＮＥＳらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、３４４、７９３−７９４、１９９０）から導いた方法を用いて実施した。活性化ペプチドの代わりにＦｐＡ配列を導入することを可能にするＰＣ ｃＤＮＡの改変体を、マトリクスとしてベクターｐＣＩ−ｎｅｏ−ＰＣを、そしてプライマーとして表Ｉに示されるオリゴヌクレオチド対を用いて、単一のＰＣＲ工程から得た。
【００７６】
【表１】

この表において、第一の欄は、活性化ペプチドへと導入された改変を示し：ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲは、調製された誘導体において、活性化ペプチドがフィブリノペプチドＡ配列を用いて置換されたことを示す；Δ_{ＤＴＥＤＱＥＤ}は、調製された誘導体において、正常の活性化ペプチドの最初の７残基が欠失したことを示す。各突然変異誘発について、用いられるオリゴヌクレオチド対の配列（センスおよびアンチセンス）を、右側の欄に示す。表の中央の欄は、活性化部位のＰ_１’、Ｐ_２’およびＰ_３’のアミノ酸配列を示す。
【００７７】
ＰＣＲを、製造者により推奨される緩衝液中の２．５単位のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ；Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｚｕｉｄｏｏｓｔ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、各ｄＮＴＰの等モル混合物（０．５ｍＭ）、１２５ｎｇの各プライマー（センスおよびアンチセンス、表Ｉを参照のこと）および５０ｎｇのマトリクスを含む５０μｌ容量で実施する。ＰＣＲを、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ｔｙｐｅ ４８０（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ、Ｒｏｉｓｓｙ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて実施する。各反応は、９５℃で５分間の最初の変性の工程と、引き続く、１５回の同一のサイクルを含み、該サイクルは、各々が、９５℃で３０秒間、５５℃または６０℃で６０秒間、そして６８℃で２０分間の３つの連続するフェーズ（変性、ハイブリダイゼーション、および伸長）からなる。
【００７８】
残基Ｐ_１’−Ｐ_３’（すなわち、天然の残基）に対してＬＩＤを有するＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ変異体を調製するための、プライマーハイブリダイゼーション温度は、６０℃である。
【００７９】
この変異体をコードするｃＤＮＡを、Ｐ_１’−Ｐ_３’配列が、ＬＩＤと異なる他の変異体を調製するために用い；ハイブリダイゼーション温度は、５５℃である。
【００８０】
これらの１５サイクルの最後に、マトリクスとして用いたベクターを、１０単位のＤｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ（ＯＺＹＭＥ、Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ ｅｎ Ｙｖｅｌｉｎｃｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、３７℃で６０分間、分解する。
【００８１】
Δ_{ＤＴＥＤＱＥＤ}変異体の調製を、ＰＣＲマトリクスとして、正常のＰＣをコードする配列を含む、ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ−ＰＣを用いて同様の様式で実施する。ハイブリダイゼーション温度は、５５℃である。
【００８２】
活性化ペプチドの代わりにＦｐＡを保有するＰＣ誘導体の活性化部位のＰ_１’−Ｐ_３’における変異体を、マトリクスとしてベクターｐＣＩ−ｎｅｏ−ＰＣ−ＦｐＡ（ＦｐＡ配列を保有する）を、そして表Ｉに示されるような対応するオリゴヌクレオチド対を用いて、同様の様式で得た。
【００８３】
ｐＣＩ−ｎｅｏ−ＰＣ由来のベクターの調製
細菌である、ＤＨ５α株（Ｄａｍ＋）を、４℃で１００ｍＭのＣａＣｌ_２中で洗浄することによりコンピテントにし、そして１５％のグリセロールを含む１００ｍＭのＣａＣｌ_２溶液中に−８０℃で貯蔵した。コンピテント細菌のアリコート（１００μｌ中に約１０^６）を、ＤｐｎＩで消化した５〜１０μｌのＰＣＲ産物を用いて形質転換する。この混合物を、４℃で３０分間インキュベートし、次いで、４２℃で２分間の熱ショックに供し、引き続き４℃で２分間、さらにインキュベートする。次いで、この細菌を、ＬＢ（ＬＵＴＨＩＡ ＢＥＲＴＯＮＩ ＢＲＯＴＨ、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）培地中で、３７℃で６０分間、激しく攪拌しながらインキュベートする。２０００ｒｐｍで５分間の遠心分離の後、このＬＢ培地を、デカンテーションし、そしてこの細菌を、寒天上（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中、１．５％のＡＧＡＲ−ＳＥＬＥＣＴ）にプレートする。ペトリ皿を、３７℃のインキュベーター中で３６時間インキュベートする。６〜１２個のコロニーを単離し、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で、激しく攪拌しながら、一晩、増幅させる。アンピシリン耐性の原因であるベクターを、「煮沸溶解」法（上で引用するＳＡＭＢＲＯＯＫら）により精製する。あるいは、より多い量のプラスミドを調製するために、「ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＩＤＹ ＫＩＴ」（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を、製造者の指示書に従って用いた。
【００８４】
ＰＣ変異体のｃＤＮＡの配列決定
ｐＣＩ−ｎｅｏ−ＰＣの誘導体により保有されるｃＤＮＡの配列を、「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７」シークエンサー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ）を用い、ＳＡＮＧＥＲらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３−５４６７、１９７７）から導いた方法を用いて制御した。「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」を、製造者の指示書に従って使用した。ＰＣ誘導体の全てのｃＤＮＡを、ＰＣ ｃＤＮＡ配列に沿って分配される６つのプライマーを用いて配列決定した。
【００８５】
実施例２：ＰＣ変異体を発現する哺乳動物細胞のトランスフェクションおよび選択
ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション
トランクトフェクトされた細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからのヒト腎臓上皮細胞株であるＨＥＫ２９３（ＣＲＬ−１５７３）である。これらの細胞を、リン酸カルシウム共沈殿法（上に引用されるＳＡＭＢＲＯＯＫら）によってｐＣＩ−ｎｅｏ−ＰＣから誘導したベクターを用いてトランスフェクトした。
【００８６】
ＨＥＫ２９３細胞を、完全培地（１０％の胎児ウシ血清、２ｍＭのグルタメート、５Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（全てＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮにより提供される）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））において、５％のＣＯ_２に富んだ大気の中で、ペトリ皿（直径８０ｍｍ）中、３７℃で培養する。細胞が８０％のコンフルエンシーに達したとき、５〜４０μｇのトランスフェクトされるベクターを、２２０μｌのＨ_２Ｏで希釈し、そして２８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４および１２ｍＭのデキストロースを含む２５０μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．０５）（ＨＢＳ、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水）を添加した。３１μｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ_２を、滴下してゆっくり攪拌すること、引き続く周囲温度での３０分間のインキュベーションにより、ＤＮＡの共沈殿を得た。これらの細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中で２回リンスし、次いで、新しい完全培地に戻す。次いで、ＤＮＡ沈殿物を添加し、そして、３７℃で４時間、ＨＥＫ２９３細胞と接触させる。このインキュベーションの最後に、該細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そして新しい完全培地に戻して２４時間培養する。次いで、１．５ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）の溶液の存在下、３７℃での５分間のインキュベーションによって、これらの細胞を、ペトリ皿から脱着する。次いで、該細胞を３つのペトリ皿に分配し、そして１ｍｇ／ｍｌのジェネチシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を含む完全培地中で選択する。コロニーが得られるまで、この培養培地を２〜３週間、２日間毎に新しくする。約２０個のコロニーを単離し、２４ウェル培養プレートのウェル（２ｃｍ^２）へと移し、そして選択薬剤を含む完全培地に戻して、コンフルエンシーまで培養する。次いで、各々の上清を、ＥＬＩＳＡ（以下を参照のこと）によりアッセイし、ＰＣ誘導体の存在を検出する。ＰＣ誘導体の最大の発現を示すクローンを増幅し、そして液体窒素中で（各々のバイアルは、１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯと混合された１ｍｌのウシ血清中に約１０^６細胞を含む）冷凍することにより保護（ｍａｋｅ ｓｅｃｕｒｅ）した。
【００８７】
ＰＣ変異体を発現するクローンの同定
ＰＣ誘導体を発現するクローンの同定および分泌される量の評価を、ＥＬＩＳＡにより実施した。ＭＩＬＥＴＩＣＨおよびＢＲＯＺＥにより記載され（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、１１３９７−１１４０４、１９９０）そしてＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨにより販売されるモノクローナル抗体であるＰ７０５８を用いる。この抗体を、５０ｍＭのＮａ_２ＨＣＯ_３緩衝液（ｐＨ９．６）中に希釈し、そして「ＭＡＸＩＳＯＲＰ」滴定プレート（ＮＵＮＣ、ＰＯＬＹＬＡＢＯ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）上に４℃で一晩、吸着させる。該ウェルを、ＴＴＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．５％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ ２０を含む、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）中で３回洗浄し、次いで、周囲温度で１時間、ＴＴＢＳ中のウシ血清アルブミン（５％（ｗ／ｖ）；１ウェル当り１００μｌ）で飽和させる。試験される各々の上清のアリコート（５ｍＭのＥＤＴＡを含むＤＭＥＭ培地中に１／５に希釈されている、１００μｌ）を、飽和したマイクロ滴定プレートのウェルの１つに添加し、そして周囲温度で１時間放置してインキュベートする。該ウェルを、ＴＴＢＳ中で３回洗浄し、そしてＰＣに向けられ、ウサギにおいて調製され、そしてペルオキシダーゼに結合された抗体（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ＴＴＢＳ中１／１０００までの希釈の後に添加する（１ウェル当り１００μｌ）。周囲温度での１時間のインキュベーション後、該ウェルを、ＴＴＢＳ緩衝液中で３回、再び洗浄する。１００μｌのＯＰＤ溶液（０．５％のＨ_２Ｏ_２（ｖ／ｖ）および１ｍｇ／ｍｌのオルトフェニレンジアミンを含む、０．１Ｍのクエン酸、０．１ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ５．０）を添加することにより、一次抗体に結合したＰＣの存在が、二次抗体に保有されるペルオキシダーゼ活性を介して明らかになる。５〜１５分後、１００μｌの０．１５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することにより反応を停止し、そしてペルオキシダーゼ触媒反応の産物を、４９０ｎｍでの吸光度を測定することにより定量する。
【００８８】
実施例３：ＰＣ変異体の発現および精製
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、完全培地中で、５％のＣＯ_２を含む制御された雰囲気下、３７℃でのインキュベーター中で単層培養する。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から誘導され、かつＰＣ変異体を分泌するクローンを、（３００ｃｍ^２まで）増加する表面積のフラスコ中で連続継代することによって増幅する。次いで、各々の３００ｃｍ^２のフラスコを、８５０ｃｍ^２の表面積を有する２つの回転瓶に接種するために用いる。２〜６日後（細胞密度に依存する）に回収した上清を、５０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して細胞片を除去する。この培養培地中におそらく存在するプロテアーゼを５ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのベンズアミジンを添加することによって阻害し、そしてこの培地を、組換えタンパク質を精製する前に−２０℃で貯蔵する。
【００８９】
３回のクロマトグラフィー工程によって、ＰＣ変異体を、培養上清から精製する。最初に、２リットルの培養上清を、陰イオン交換樹脂上への吸着により濃縮する。これらの２リットルの培養上清を、５ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのベンズアミジンを含む、４リットルの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中にあらかじめ希釈して、イオン強度を減少させ；次いで、４．５ｇのＳＥＰＨＡＤＥＸ ＱＡＥＡ５０（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を添加し、そしてこの混合物を、周囲温度で、１時間、ゆっくりと攪拌する。クロマトグラフィーカラム中へのＳＥＰＨＡＤＥＸビーズの沈降の後、保持されたタンパク質（ＰＣを含む）を、５ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのベンズアミジンを含む、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中の０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて溶出する。次いで、活性化ペプチドのＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ配列を認識するモノクローナル抗体（ｍａｂ２）またはＨＰＣ４（ＲＯＣＨＥ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）がグラフトされた樹脂を用いるイムノアフィニティクロマトグラフィーによって、ＰＣを精製する。これらのモノクローナル抗体を、供給者（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ）の推奨に従ってＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ４Ｂ（ゲル１ｍｌ当り約１ｍｇの抗体）に結合させた。正常の組換えＰＣおよび活性化ペプチドが短縮されたそのアナログを、抗体ＨＰＣ４に結合された樹脂を用いて精製した。
【００９０】
アフィニティーカラムに、ＱＡＥ樹脂からの溶出液を、Ｃａ^２＋を５ｍＭの濃度にした後にロードした。次いで、このカラムを、０．５ＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＣａ^２＋を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中で洗浄した。組換えＰＣを、０．１５ＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＥＤＴＡを含む、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５を用いて溶出する。
【００９１】
Ｐ_３−Ｐ_３’配列がもはやＤＰＲＬＩＤでないＰＣアナログを、抗体ｍａｂ２に結合された樹脂を用いて精製した。この場合、アフィニティーカラムにＱＡＥ樹脂からの溶出液をロードし、そして０．５ＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中で洗浄した後に、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．７）中で酸性化することにより組換えＰＣを溶出する。２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ１０）を添加することによって、溶出画分のｐＨを直ぐに７．５まで戻す。最後の精製工程は、さらなるイオン交換クロマトグラフィーであり、この目的は、アフィニティークロマトグラフィーからの溶出液を再濃縮および透析することである。この溶出液を、５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中に１／３まで希釈し、次いで、ＦＡＳＴ Ｑゲル（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ）上に吸着させる。希釈緩衝液（カラム容量の１０倍）中で洗浄してグリシンおよびＥＤＴＡの全ての痕跡を除去した後、ＰＣを、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液中の０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて溶出する。ＰＣ濃度を、１．４５のモル吸光係数（Ｅ^０．１％）を用いて、２８０ｎｍでのその吸光度から評価する。５％のβ−メルカプトエタノールの存在下でのインキュベーションによる変性およびジスルフィド架橋の還元及び変性の後、各々のＰＣアナログの純度を、ポリアクリルアミドゲル（１２％、０．１％のＳＤＳを含む）上で評価する。この分析の結果を、図３に例示する。
【００９２】
図３の説明：
レーン１：分子量マーカー。レーン２〜７：夫々、２μｇの変異体Ｆｐａ−ＬＩＤ、Δ_{ＤＴＥＤＱＥＤ}、Ｆｐａ−ＬＦＧ、Ｆｐａ−ＳＩＧ、Ｆｐａ−ＡＩＧおよびＦｐａ−ＬＩＧ。見かけの分子量（ｋＤａ）を、ゲルの左に示す。正常のＰＣの一本鎖形態の位置、および正常のＰＣの重鎖および軽鎖の位置を、ゲルの右側に示す。
【００９３】
得られた全てのＰＣ調製物はＳＤＳゲルにより純粋であるようであるが、２つの形態が存在する。二本鎖形態が、主要な成分（７０〜９０％）であり、見かけの分子量は、重鎖および軽鎖から推定される分子量（夫々、４１ ０００Ｄａおよび２１ ０００Ｄａ）に匹敵する。残りの１０〜３０％は、６２ ０００Ｄａの見かけの分子量を有する一本鎖形態で得られる。一本鎖形態のパーセンテージは、考えられるアナログに依存しないようであるが、変異の性質に関わらず、調製物の由来する培養物上清のプールに依存するようである。
【００９４】
しかし、この精製プロトコルの最後に、ＰＣ調製物の一部が活性化形態で得られる（５０％まで）ことに注目すべきである。活性化形態がＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析によりチモーゲンから区別され得ないので、このパーセンテージを、調製物のアミド分解活性により評価する（以下を参照のこと）。活性化形態のパーセンテージは、考えられるＰＣアナログおよび考えられる調製物バッチの両方に依存するようである。それは、活性化部位のＰ_１’位での正常のロイシンの代わりにセリンまたはアラニンを有するＰＣアナログについて特に高い。
【００９５】
ＰＣ変異体の調製物中に存在する活性化形態の中和
各々のＰＣ改変体のトロンビンによる活性化速度を正確に測定するために、この調製物中におそらく存在するＰＣａの全ての痕跡をあらかじめ中和することが必要不可欠である。この中和を、ＰＣａの活性化部位の不可逆性阻害により実施する。用いられる共有結合インヒビターは、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ_３Ｃｌ（ＰＰＡＣＫ、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ、Ｓｔ Ｃｌｏｕｄ、Ｆｒａｎｃｅ）であり、これは、電荷安定化系（ｃｈａｒｇｅ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）のＨｉｓ^５７に結合する。実際には、５ｍＭのＰＰＡＣＫを、ＰＣ調製物に添加し、そしてその混合物を周囲温度で１時間インキュベートする。このインキュベーションを、２回繰り返し、同量の（新しい）ＰＰＡＣＫを添加する。次いで、反応しなかったＰＰＡＣＫを、イオン交換クロマトグラフィーにより除去する。５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中への希釈（１／１０、ｖ／ｖ）の後、ＰＣおよび阻害されたＰＣａが、ＲＥＳＳＯＵＲＣＥ Ｑカラム（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ）上に吸着される（遊離のＰＰＡＣＫではない）。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中の１Ｍ ＮａＣｌを用いる溶出の前に、このカラムを、その容量の２０倍の希釈緩衝液を用いて洗浄する。処理後、活性形態のパーセンテージは、ほとんどのＰＣ調製物について０．１％未満であるが、Ｐ_１’位の残基がセリンであるＰＣアナログについては、０．４％を超えない。中和されたＰＣａの存在は、チモーゲン画分のトロンビン活性化を妨害しない。
【００９６】
実施例４：ＰＣ変異体の特徴付け
活性化速度の測定
ＰＣ変異体のトロンビン活性化の速度定数を、偽一次条件下で測定した。実際には、ＰＣ（１μＭ）を、速度論緩衝液（ｋｉｎｅｔｉｃ ｂｕｆｆｅｒ）（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．２％ ＰＥＧ ８０００（ｗ／ｖ）、０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）中でトロンビン（ＰＣ変異体に依存して、１０〜５０ｎＭ）の存在下でインキュベートする。種々のインキュベーション時間の後、（反応を停止し、トロンビンを中和するために）ヒルジン（２００単位／ｍｌ）を反応混合物の５μｌアリコートに添加する。
【００９７】
次いで、産生されたＰＣａの量を、２００μＭのピロＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ２３６６、ＢＩＯＧＥＮＩＣ、Ｌａｔｔｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）の加水分解の初速度を測定することによって評価する。４０５ｎｍでの吸光度のバリエーションを、マイクロプレートリーダーＭＲ５０００（ＤＹＮＥＸ、Ｇｕｙａｎｃｏｕｒｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて時間の関数として記録し、そしてＰＣａ濃度を、標準曲線を参照して推定する。
【００９８】
次いで、この反応についての速度定数を、以下の一次の指数関数的増加を示す等式を用いる、時間の関数としての、ＰＣａ濃度のバリエーションの非線形回帰により評価する：ＰＣａ_（ｔ）＝ＰＣ（１−ｅｘｐ^{（−ｋｔ）}）＋Ｃｔｅ；ここで、ＰＣａ_（ｔ）は、時間ｔでのＰＣａの濃度を表し；ＰＣは、（活性化し得る）ＰＣの総濃度を表し、そしてｋは、一次速度定数を表し；Ｃｔｅは、アクチベーターを添加する前の初期条件で存在する可能性のある（小さい）アミド分解活性（バックグラウンドノイズ）を考慮にいれるために加えられる定数である。ｋ_ｏｎ（特異性定数）の値を、アクチベーター（トロンビン）の濃度に対するｋの比率を形成することにより算出する。得られた値（Ｍ^−１ｓ^−１）を、表ＩＩにまとめる。
【００９９】
【表２】

フィブリノペプチドＡを用いるＰＣの活性化ペプチドの置換（変異体Ｆｐａ−ＬＩＤ）は、ｋ_ｏｎの値を４０倍増加させる。この変異体における、アスパラギン酸Ｐ_３’のグリシンでの更なる置換（Ｆｐａ−ＬＩＧ）は、ｋ_ｏｎをわずかに増加させるのみであるが、さらに、Ｐ_２’のイソロイシンが、フェニルアラニンで置換された場合（Ｆｐａ−ＬＦＧ）、ｋ_ｏｎの値は、正常のＰＣのｋ_ｏｎの値より９６倍高くなる。最後に、Ｐ_１’のロイシンがアラニン（Ｆｐａ−ＡＩＧ）またはセリン（Ｆｐａ−ＳＩＧ）で置換された場合、ｋ_ｏｎの値は、夫々、正常のＰＣのｋ_ｏｎの値より１００倍および５００倍高くなる（この値は、トロンボモジュリンの存在下での正常のＰＣ（ＰＣ＋ＴＭ）の活性のｋ_ｏｎとはあまり変わらない）。
【０１００】
ＰＣ変異体の予備的活性化
機能的研究のために、ＰＣおよびその誘導体を、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ由来のヘビ毒から単離されたアクチベーター（ＰＲＯＴＡＣ、ＫＯＲＤＩＡ ＬＥＩＤＥＮ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）を用いて予備的な量で活性化させた。９単位のＰＲＯＴＡＣを、製造者の推奨に従い、１ｍｌの活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ−ＮＨＳ（ＨＩ−ＴＲＡＰ、ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ）にカップリングした。
【０１０１】
活性化緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧを含む、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）中の１ｍｌのＰＣのアリコート（１μＭ）を、ＰＲＯＴＡＣとグラフトしたカラム中に注入し、そして同じ緩衝液で平衡化する。カラムを、両方の端部で閉じ、そしてインキュベーションを、周囲温度に８時間維持する。２容量の活性化緩衝液を注入することにより、活性化ＰＣをカラムから溶出する。
【０１０２】
あるいは、特に、トロンビンにより迅速に活性化され得るＰＣ誘導体について、活性化を、精製したヒトトロンビン（１ｍｇ／ｍｌのゲル）とグラフトしたＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラム上で実施する。このゲルを調製し、そしてＰＲＯＴＡＣとグラフトしたカラムについての上記の条件と同じ条件で使用する。次いで、ＰＣａを、ＭＯＮＯ Ｑカラム（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ）でのイオン交換クロマトグラフィーによって再濃縮する。ＨＩＴＲＡＰカラムからの溶出液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に希釈し（１／１０；ｖ／ｖ）、そしてＭＯＮＯ Ｑカラムにロードし、そしてＰＣａを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中の０．５Ｍ ＮａＣｌを用いて溶出する。
【０１０３】
ＰＣａ変異体の滴定
活性化ＰＣａ誘導体の活性部位濃度を、ＰＣａと等モル共有結合複合体を形成するＰＰＡＣＫを用いる滴定により測定する。
【０１０４】
１ｎＭ〜２５μＭの間の種々の濃度のＰＰＡＣＫを、速度論緩衝液中で滴定されるべき一定量のＰＣａと共にインキュベートする。この混合物を、反応が完了するまで周囲温度でインキュベートする。必要とされるインキュベーション時間は、考えられるＰＣａ誘導体に依存し、そしてインキュベーションを延長することにより更なるＰＣａ分子の阻害を導かないことを確保することが必要である：３時間のインキュベーションは、正常のＰＣａに対して十分であるが、１６位にセリンまたはアラニンを有するＰＣａ誘導体に対して、そしてまた１７位にフェニルアラニンを有する誘導体については１８時間が好ましい。
【０１０５】
このインキュベーションの最後に、ＰＣａの残余濃度を、２００μＭのＳ２３６６の加水分解の初速度を測定することにより評価する。時間の関数としての４０５ｎｍでの吸光度のバリエーション（ｖ_ｓ）を、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを用いて記録する。最初に存在するＰＣａの有効濃度（Ｅ_ｔ）を、以下の「タイト−結合阻害（ｔｉｇｈｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」式（ＣＨＡ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２４、２１７７−２１８５、１９７５；ＷＩＬＬＩＡＭＳおよびＭＯＲＲＩＳＯＮ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６３、４３７−４６７、１９７９）を用いて、添加されるＰＰＡＣＫの濃度の関数としてのｖ_ｓの依存の非線形回帰によって評価する：
ｖ_ｓ＝（ｖ_０／２［Ｅ_ｔ］）｛［（Ｋ_ｉ＋［ＰＰＡＣＫ］−［Ｅ_ｔ］）^２＋４Ｋ_ｉ［Ｅ_ｔ］］^１／２−（Ｋ_ｉ＋［ＰＰＡＣＫ］−Ｅ_ｔ）｝
ここで、ｖ_０は、インヒビターの非存在下でのＳ２３６６の加水分解の初速度であり、そしてＫ_ｉは、酵素−インヒビター複合体についての見かけの阻害定数である。
【０１０６】
ＰＣａ変異体のアミド分解活性
ＰＣａ改変体の活性化部位を特徴付けるために、定数ｋ_ｃａｔおよびＫ_Ｍを、２つの色素産生基質（Ｓ２３６６およびＤ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ２２３８、ＢＩＯＧＥＮＩＣ））の加水分解について測定した。加水分解を、周囲温度で、５ｍＭのＣａＣｌ_２または５ｍＭのＥＤＴＡのいずれかを含む速度論緩衝液中で実施する。５０〜３０００μＭの間の種々の濃度の基質を、一定量のＰＣａ（変異体に依存して、１０ｎＭ〜５０ｎＭ）と共にインキュベートする。時間の関数としての４０５ｎｍでの吸光度のバリエーションを、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを用いて、記録し、そして加水分解の初速度を最大で１０％までの加水分解に対応する吸光度の線形回帰によって評価する。次いで、定数ｋ_ｃａｔおよびＫ_Ｍを、ミカエリス−メンテン式を用いて、基質の濃度の関数として、この初速度のバリエーションの非線形回帰によって評価する。
【０１０７】
得られた結果を表ＩＩＩにまとめる。
【０１０８】
【表３】

Ｐ_１’の残基がアラニン（Ｆｐａ−ＡＩＧ）またはセリン（Ｆｐａ−ＳＩＧ）である活性型のＰＣ誘導体、およびＰ_２’にフェニルアラニンを保有する誘導体（Ｆｐａ−ＬＦＧ）は、これらのアミド分解活性の減少を示す。ＮＤ：検出せず。基質Ｓ２３６６について、Ｃａ^２＋の存在下で、Ｐ_２’位でのイソロイシンのフェニルアラニンへの変異は、Ｋ_Ｍの８倍より高い増加、およびｋ_ｃａｔの１．７倍の減少を示す。Ｐ_１’のロイシンのアラニンまたはセリンでの置換は、夫々、Ｋ_Ｍの７倍および８倍の増加を導く。この変異体がＰ_１’位にセリンを保有する場合、ｋ_ｃａｔは、３倍減少するが、一方で、アラニンを保有する変異体について、ｋ_ｃａｔは、ＰＣａを用いて決定されるｋ_ｃａｔと同等である。これら２つの基質の加水分解に関してＰＣａのＣａ^２＋依存性は、種々のＰＣ変異体について保存される：ＥＤＴＡの存在下で、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍは、わずかに減少する。
【０１０９】
活性化形態の変異体Ｆｐａ−ＳＩＧは、基質Ｓ２２３８およびＳ２３６６の加水分解についての特異性定数が最も減少するものである。
【０１１０】
ＰＣａ変異体の血漿中半減期の決定
ＰＣａ変異体の半減期を、正常のＰＣａ（同じ条件下で調製した組換えＰＣａまたはヒト血漿から精製したＰＣａ）の半減期と比較した。
【０１１１】
この半減期を評価するために、種々のＰＣａの残余活性を、ヒルジンを添加することにより凝固しなくなった正常の血漿において、種々の期間のインキュベーション後に測定する。この反応混合物は、８０％（ｖ／ｖ）のクエン酸添加正常血漿のプールおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび８０Ｕ／ｍｌのヒルジンを含む、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中のＰＣａ（変異体に依存して５０〜２００ｎＭ）から構成される。インキュベーションの後に、血漿／ＰＣａ／ヒルジン混合物（４０μｌ）のアリコートを１６０μｌの２５０μＭ Ｓ２３６６に添加し、基質の加水分解の初速度をＭＲ５０００マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度の増加を記録することによって測定する。
【０１１２】
次いで、各々の変異体の半減期を、以下の一次の指数関数的減少を表す式を用いる、時間の関数としての残余活性のバリエーションの非線形回帰によって評価する：
Ａ_（ｔ）＝Ａ_０ｅｘｐ^{（−ｋ，ｔ）}＋Ｃｔｅ；
ここで、Ａ_（ｔ）は、時間ｔでのＰＣａの残余活性を表し、Ａ_０は、その初期条件での活性を表し、そしてｋは、一次の速度定数を表す。定数Ｃｔｅは、ＰＣａ変異体の活性から独立した、可能性のある活性（バックグラウンドノイズ）を考慮に入れるために加えられる。
【０１１３】
次いで、血漿中半減期を、ｌｎ（２）をｋで除することによって算出する。
【０１１４】
得られた値（分^−１）を、表ＩＶにまとめる。
【０１１５】
【表４】

半減期を、時間の関数としてのＰＣａ活性の減少を測定することによってクエン酸添加血漿中で決定した。Ｐ_１’の残基がセリンでありそしてＰ_３’の残基がグリシンであるＰＣａ変異体（Ｆｐａ−ＳＩＧ）についての半減期は、１０倍長い。
【０１１６】
活性化形態の変異体Ｆｐａ−ＳＩＧの血漿中半減期は、正常のＰＣａと比較して１０倍増加する。
【０１１７】
凝固試験
種々の濃度のＰＣａまたはその誘導体の１つの存在下で、再石灰化した(recalcified)クエン酸添加した正常血漿のプールのアクチベーターを用いるセファリン時間（ｃｅｐｈａｌｉｎ ｔｉｍｅ）の延長を測定することによって、ＰＣａおよびその誘導体の抗凝固活性を決定した（ＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮら、Ｎａｔｕｒｅ、３６０、２６１−２６４、１９９２）。
【０１１８】
これらの試験を、ＳＴ４マシーン（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ ＳＴＡＧＯ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ Ｆｒａｎｃｅ）で、二連で行う。活性化形態のＰＣａを、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中に希釈する。各々の試験について、ＰＣａの５０μＬの希釈物、５０μｌの「ＡＰＴＴ」試薬（ＯＲＧＡＮＯＮ ＴＥＣＨＮＩＫＡ、Ｆｒｅｓｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）および５０μｌのクエン酸添加した血漿のプールを混合し、そして３７℃で３分間インキュベートする。２５ｍＭのＣａＣｌ_２を含む５０μｌの希釈緩衝液を添加することにより凝固を誘発する。
【０１１９】
表Ｖは、１ｎＭの正常のＰＣａの抗凝固活性のパーセンテージとして表される、ＰＣａ誘導体の抗凝固活性を表す。
【０１２０】
【表５】

抗凝固活性のパーセンテージは、参照としての役割を果たす正常のＰＣａに対して表される（１００％は、１ｎＭのＰＣａの抗凝固活性に対応する）。各々の変異体について、１ｎＭのＰＣａと等価な抗凝固活性を得るために必要とされる濃度を評価した。例えば、変異体Ｆｐａ−ＡＩＧの抗凝固活性は、正常のＰＣａの抗凝固活性の２０％である（１ｎＭの正常のＰＣａと同じ活性を得るために、５ｎＭの変異体が必要とされる）。
【０１２１】
変異体Ｆｐａ−ＳＩＧの抗凝固活性は、正常のＰＣａの抗凝固活性の６％を表す。
【０１２２】
活性変異体Ｆｐａ−ＡＩＧおよびＦｐａ−ＳＩＧとα _１ −アンチトリプシンとの複合体の形成の分析
活性化形態の変異体Ｆｐａ−ＡＩＧおよびＦｐａ−ＳＩＧがα_１−アンチトリプシン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）と安定した複合体を形成する能力を、活性化ＰＣ変異体（５μＭ）を４０μＭのα_１−アンチトリプシンと共に速度論緩衝液中、３７℃で５時間インキュベートすることによって決定した。
【０１２３】
反応生成物を、変性条件下で、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。これらの結果を図４に示す。
【０１２４】
図４の説明：
レーン１：α_１−アンチトリプシンの存在下、３７℃で５時間インキュベートしたＦｐａ−ＡＩＧ、レーン２：Ｆｐａ−ＡＩＧ単独（２μｇ）。レーン３：α_１−アンチトリプシンの存在下でインキュベートしたＦｐａ−ＳＩＧ、レーン４：Ｆｐａ−ＳＩＧ単独。レーン５：α_１−アンチトリプシンの存在下でインキュベートした正常のＰＣａ、レーン６：正常のＰＣａ単独。レーン７：α_１−アンチトリプシン単独。全てのＰＣａ変異体は、α_１−アンチトリプシンと共有結合複合体を形成する。
【０１２５】
ＰＣａとα_１−アンチトリプシンとの間の安定した複合体の形成は、高分子量のバンド形成を生じる。このゲルは、触媒ドメインが１６位にアラニンまたはセリンを有するＰＣａ変異体が、セルピンの正常な生理学的濃度で、α_１−アンチトリプシンと安定した複合体を形成できることを示す。
【０１２６】
結論
ＰＣの活性化ペプチドを改変する効果
活性化ペプチドの１２残基のうち７つ（Ｐ_１２〜Ｐ_６、すなわち、配列ＤＴＥＤＱＥＤ）を欠損するＰＣ誘導体の場合、活性化速度は（生理学的条件下かつトロンボモジュリンの非存在下で）、同じ条件で発現および特徴付けられる正常のＰＣの活性化速度と比較して二倍である。従って、これは、活性化ペプチドが、トロンビンがＰＣを切断する能力を限定することを示し：トロンボモジュリンの非存在下でのその活性化を限定する障害の１つの構成すると考えられる。
【０１２７】
活性化ペプチドの１２残基（Ｐ_１２〜Ｐ_１、すなわち、配列ＤＴＥＤＱＥＤＱＶＤＰＲ）が除去され、そしてヒトＦｐＡの配列（Ｐ_１０〜Ｐ_１、すなわち、配列ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ）と置換されているＰＣ誘導体の場合、活性化速度は（生理学的条件下かつトロンボモジュリンの非存在下で）、同じ条件下で発現および特徴付けられる正常のＰＣの活性化速度と比較して４０倍高い。概して、ＰＣの活性化ペプチドの改変は、２×１０^４Ｍ^−１ｓ^−１の活性化速度定数を達成することを可能にする。
【０１２８】
ＰＣの活性化部位の残基Ｐ_１’、残基Ｐ_２’、および残基Ｐ_３’の最適化
本発明者らは、活性化切断部位の上流にＦｐＡ配列を保有することに加えて、１６位、１７位、および／または１８位で改変されているＰＣ変異体を発現および特徴付けた。１６位で、ロイシンを、セリンまたはアラニンで置換し；１７位で、イソロイシンを、フェニルアラニンで置換し；そして１８位で、アスパラギン酸をグリシンで置換した。全てのこれらの変異は、トロンビンの最適な切断配列に近いＰＣの活性化部位を多少もたらし、そしてこれらの全ては、アクチベーターに対する各変異体の感受性を有効に増加させる。この差異は、特に１６位にセリンおよび１８位にグリシンを保有する変異体で著しい。なぜなら、得られる活性化定数の値（１．６×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１）は、トロンボモジュリンの存在下で正常のＰＣについて得られる活性化定数の値（５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、表ＩＩ）と同じ桁であるからである。
【０１２９】
切断部位の上流にＦｐＡを保有するのみのＰＣ誘導体に対するこの変異体での増加は、１０倍より高い。この増加は、特に、Ｌ１６Ｓ変異からなり、なぜなら、Ｄ１８Ｇ変異の寄与は、わずか１．６倍であるからである（表ＩＩ）。
【０１３０】
残基１６がアラニンである場合、この増加は、（ＦｐＡを保有し、かつＤ１８Ｇの変異をしている変異体に対して）約２倍であり；これは、１７位のイソロイシンをフェニルアラニンで置換した場合に得られるものと類似する。
【０１３１】
しかし、Ｄ１８Ｇ突然変異を除いて、これらの改変は、（種々の程度までの）ＰＣａの触媒活性に対する有害な結果を有する。残基１６がセリンである場合、抗凝固活性は、正常のＰＣａより２０倍低く、残基１６がアラニンである場合、抗凝固活性は、５倍低く、残基１７がフェニルアラニンである場合、それは、１３倍低い。
【０１３２】
この活性の（相対的な）損失は、おそらく、触媒機構自体の欠陥を反映する。なぜなら色素産生基質（例えば、Ｓ２３６６またはＳ２２３８）についての特異性定数の値（ｋ_{ｃ ａｔ}／Ｋ_Ｍ）が、同様の割合で減少する（セリンが１６位である場合２７倍、それがアラニンである場合５倍、そして残基１７がフェニルアラニンである場合１２倍）。セリン、そしてより少ない程度であるがアラニンは、触媒機構の最大活性化に必要とされる全ての接触を形成することを可能にしないことは想像可能である；アラニンの疎水性は、他の脂肪族残基であるバリン、ロイシン、またはイソロイシンより低く、一方、セリン残基は、性質として、親水性である。他方、疎水性は、おそらく、１７位での突然変異から生じる活性の損失の原因ではない。なぜなら、フェニルアラニンの疎水性が、ロイシンの疎水性に匹敵するからである。不安定化効果は、立体障害から生じ得、フェニルアラニンの側鎖は、ロイシンのそれ（１２４Ａ^３）より大きい容量（１９０Ａ^３）を保有し；あるいは、Ａｓｐ^１８９の電荷とフェニルアラニンの芳香環の部分的な電荷との間に反発が形成され得る。
【０１３３】
活性化変異体の触媒欠損は、明らかに、迅速に、変異に引き続く全体的な有効性増加の問題を提供する。一見、この増加は、好ましくない。なぜなら活性化速度の増加は、全体的には活性の欠損による損失のようであるからである：触媒活性の損失に対する活性化速度の増加の比率は、１未満である（１６位でのセリンおよびアラニンについて１０／２０および２／５、１７位でのフェニルアラニンについて２／１３）。
【０１３４】
しかし、この活性の欠損は、血漿インヒビターに対する相対的な耐性を伴い、結果として、その作用を延長する。従って、正常のＰＣａと比較して、１６位にセリンを保有する変異体の血漿中半減期は、１０倍増加し、アラニンを保有する変異体の血漿中半減期は、５〜６倍増加し、そして１７位にフェニルアラニンを保有する変異体の血漿中半減期は、７倍増加する。これらの条件下で、全体的に有効性の増加は、１７位にフェニルアラニンを有する変異体について１未満のままであり、そしてＬ１６Ｓ変異体については、０付近のままであり、１６位にアラニンを保有する変異体が非常に好ましいことになる。概して、減少した触媒活性にも関わらず、活性化速度および血漿中半減期の増加は、Ｌ１６Ａ変異体を、現在記載される他の全てのＰＣ誘導体よりも非常に有利なものにする。
【０１３５】
実施例５：ＦＸ変異体の発現のためのベクターの構築
哺乳動物細胞中へのトランスフェクション後に正常のヒトＦＸを発現するベクターｐＮＵＴ−ＦＸを出発物質として用いて、ＦＸ変異体の発現のために意図されるベクターを、構築した（ＢＩＡＮＣＨＩＮＩら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、２０５７７−２０５３４、２００２）。
【０１３６】
ベクターｐＮＵＴ−ＦＸの位置指定突然変異誘発
ＦＸアナログの発現のために意図されるベクターを調製するために、ベクターｐＮＵＴ−ＦＸの位置指定突然変異誘発を、ＪＯＮＥＳら（上で引用される）の方法から導かれる方法により実施した。活性化ペプチドの代わりにＦｐＡ配列を導入するためのＦＸ ｃＤＮＡの改変を、マトリクスとしてベクターｐＮＵＴ−ＦＸ、そしてプライマーとして表ＶＩに示すオリゴヌクレオチド対を用いて、単一のＰＣＲ工程で得た。
【０１３７】
ネイティブのＦＸにおいて、切断部位の境界をなす残基Ｐ_３−Ｐ_２−Ｐ_１−Ｐ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’の配列（切断は、Ｐ_１とＰ_１’との間で生じる）は、ＬＴＲ−ＩＶＧである。４つのＦＸアナログを調製した：ＦｐＡ−ＩＶＧ、ＦｐＡ−ＩＦＧ、ＦｐＡ−ＡＶＧおよびＦｐＡ−ＡＦＧは、配列Ｐ_３−Ｐ_２−Ｐ_１−Ｐ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’に関して、夫々、ＧＶＲ−ＩＶＧ、ＧＶＲ−ＩＦＧ、ＧＶＲ−ＡＶＧおよびＧＶＲ−ＡＦＧを有する。
【０１３８】
これらのＦＸアナログを発現するベクターを、位置指定突然変異誘発によって調製した。ベクターｐＮＵＴ−ＦＸの突然変異誘発のために用いたプライマーの配列を、表ＶＩに示す。
【０１３９】
【表６】

この表において、最初のカラムは、活性化ペプチドに導入された改変を示す：ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲは、調製された誘導体において、ＦＸの活性化ペプチド全体がフィブリノペプチドＡで置換されたことを示す。各々の突然変異誘発について、用いられるオリゴヌクレオチド対の配列（センスおよびアンチセンス）を、右側のカラムに示す。表の中央のカラムは、活性化部位のＰ_１’、Ｐ_２’、およびＰ_３’のアミノ酸配列を示す。
【０１４０】
ＰＣＲを、製造者に推奨される緩衝液中に２．５単位のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ；Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｚｕｉｄｏｏｓｔ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、各ｄＮＴＰ（０．５ｍＭ）の等モル混合物、１２５ｎｇの各プライマー（センスおよびアンチセンス、表ＶＩを参照のこと）、および５０ｎｇのマトリクスを含む５０μｌ体積中で実施する。誘導体ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ−ＩＶＧおよびＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ−ＩＦＧを調製するために用いられるマトリクスは、ｐＮＵＴ−ＦＸであり；ハイブリダイゼーション温度は、５５℃である。誘導体ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ−ＡＶＧおよびＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ−ＡＦＧを調製するために用いられるマトリクスは、ｐＮＵＴ−ＦＸ、あらかじめ誘導されたＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ−ＩＶＧであり；ハイブリダイゼーション温度は、５０℃である。ＰＣＲを、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ｔｙｐｅ ４８０（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ）を用いて実施する。各々の反応は、９５℃で５分間の最初の変性の工程と、引き続く１６回の同一のサイクルを包含し、このサイクルは、各々、９５℃で４５秒間、５５℃（または５０℃）で６０秒間、そして６８℃で２６分間の３つのフェーズ（変性、ハイブリダイゼーション、および伸長）からなる。これらの１６サイクルの最後に、マトリクスとしての役割を果たしたベクターを、１０単位のＤｐｎＩ（ＯＺＹＭＥ）を用いて、３７℃で１時間分解する。
【０１４１】
ｐＮＵＴ−ＦＸ由来のベクターの調製
細菌である、ＤＨ５α株（Ｄａｍ＋）を、４℃で１００ｍＭのＣａＣｌ_２中で洗浄することによりコンピテントにし、そして１５％のグリセロールを含む１００ｍＭのＣａＣｌ_２溶液中に−８０℃で貯蔵した。コンピテント細菌のアリコート（１００μｌ中に約１０^６）を、ＤｐｎＩで消化した５〜１０μｌのＰＣＲ産物を用いて形質転換する。この混合物を、４℃で３０分間インキュベートし、次いで、４２℃で２分間の熱ショックに供し、引き続き４℃で２分間、さらにインキュベートする。次いで、この細菌を、ＬＢ（ＬＵＴＨＩＡ ＢＥＲＴＯＮＩ ＢＲＯＴＨ、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）培地中で、３７℃で６０分間、激しく攪拌しながらインキュベートする。２０００ｒｐｍで５分間の遠心分離の後、このＬＢ培地を、デカンテーションし、そしてこの細菌を、寒天上（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中、１．５％のＡＧＡＲ−ＳＥＬＥＣＴ）にプレートする。ペトリ皿を、３７℃のインキュベーター中で３６時間インキュベートする。６〜１２個のコロニーを単離し、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で、激しく攪拌しながら、一晩、増幅させる。アンピシリン耐性の原因となるベクターを、「煮沸溶解」法（上で引用するＳＡＭＢＲＯＯＫら）により精製する。あるいは、より多い量のプラスミドを調製するために、「ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＩＤＹ ＫＩＴ」（ＱＩＡＧＥＮ）を、製造者の指示書に従って用いた。
【０１４２】
ＦＸ変異体のｃＤＮＡの配列決定
ｐＮＵＴ−ＦＸの誘導体により保有されるｃＤＮＡの配列を、「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７」シークエンサー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ）を用い、ＳＡＮＧＥＲらの方法（上で引用される）から導いた方法により制御した。「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」を、製造者の指示書に従って使用した。ｐＮＵＴ−ＦＸの誘導体に含まれるＦＸ ｃＤＮＡ全体の配列を、ＦＸ ｃＤＮＡの配列に沿って分配される最小限の６つのプライマーを用いて配列決定した。
【０１４３】
実施例６：ＦＸ変異体を発現する哺乳動物細胞のトランスフェクションおよび選択
ＢＨＫ−２１細胞のトランスフェクション
組換えタンパク質を、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｓｏｆｉａ−ａｎｔｉｐｏｌｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）により提供される新生ハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）細胞中で発現させた。これらの細胞を、リン酸カルシウム共沈殿法（上に引用されるＳＡＭＢＲＯＯＫら）によって、ｐＮＵＴ−ＦＸから誘導したベクターを用いてトランスフェクトした。
【０１４４】
ＢＨＫ−２１細胞を、１０％の胎児ウシ血清（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）、１００単位／ｍｌのペニシリン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を補充した完全ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル１５培地；（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ））において、５％のＣＯ_２の雰囲気下で、３７℃のインキュベーター中のペトリ皿（直径８０ｍｍ）中で培養する。これらの細胞が約８０％のコンフルエンシーに達したとき、これらの細胞を、ＰＢＳ緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中で２回リンスし、次いで、４ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中、３７℃で１時間インキュベートする。
【０１４５】
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌおよび１２ｍＭ デキストロースから構成される、正確に７．０５のｐＨでの２５０μｌの溶液に４０ｎＭのベクターｐＮＵＴ−ＦＸまたはその誘導体の１つ（蒸留水で調整した、２２０μｌの容量中４０μｇ）を添加することによってトランスフェクションを実施する。３１μｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ_２を滴下し、そして一定に攪拌することによってＤＮＡの共沈殿を得る。周囲温度での３０分間のインキュベーション後、沈殿物を、細胞を覆う培地に添加し、そして３７℃で３時間沈降させる。該細胞を、（ほとんどの沈殿物を除去するために）ＰＢＳを用いて洗浄し、そして完全ＤＭＥＭ培地中に戻して３７℃で２４時間培養する。０．５ｍｇ／ｍｌのトリプシンを含む、２ｍｌのＥＤＴＡ（５４ｍＭ、ｐＨ８．０）の溶液を用いて該細胞をペトリ皿から脱着し、選択培地（５０ｍｇ／Ｌのメトトレキセート（ＴＥＶＡ、Ｃｏｕｒｂｅｖｏｉｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を含む完全ＤＭＥＭ）中に再懸濁し、そして２つの新しいペトリ皿に再播種する。コロニーが得られるまでこの培養培地を、２〜３週間２日間毎に新しくし、このコロニーを、単離しそして培養プレートのウェル（２ｃｍ^２）へと移す。ここで、これらの細胞は、選択培地中でコンフルエンシーまで増やされる。
【０１４６】
ＦＸ誘導体を産生するクローンの同定
ＦＸ誘導体を安定して発現するクローンを、イムノブロッティングにより検出する。少なくとも４８時間トランスフェクト細胞と接触したままにされた、ＢＨＫ−２１細胞培養物の上清のアリコート（３０μｌ）を、４０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、８％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、０．０４％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルーおよび２０％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノールを含む、１０μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）に添加する。サンプル中のタンパク質を、９５℃で５分間変性し、そして０．１Ｍのグリシンおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む、２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中の１２％ポリアクリルアミドゲル（架橋２９／１）上で分離する。
【０１４７】
電気泳動に続いて、２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、２０％のメタノールを含む、０．１Ｍグリシン（ｐＨ７．５）中のニトロセルロースメンブラン（ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ、ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｉｖｒｙ ｓｕｒ Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）上に移す。このメンブランを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）（ＴＢＢＳ）５０ｍＭ中のスキムミルク（５％、ｗ／ｖ）の溶液中で、周囲温度で１時間のインキュベーションにより飽和させ、そして同じ緩衝液中１０分間で３回、洗浄する。次いで、このメンブランを、ＴＴＢＳ中の５０ｎｇ／ｍｌのモノクローナル抗体９Ｅ１０（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）の存在下で１〜１２時間インキュベートする。
【０１４８】
（上記のような）３回の洗浄後、メンブランを、ＴＴＢＳ中に１／３０００まで希釈されたアルカリホスファターゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で標識されたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体の存在下で、周囲温度で１時間インキュベートする。このメンブランを色素産生基質（０．５ＭのＭｇＣｌ_２を含む、０．１ＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．５）中に希釈した等量の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、トルイジン塩（ＢＣＩＰＴ）および塩化ニトロテトラゾリウム（ＮＴＣ）の混合物）の存在下でインキュベートすることによって、組換えＦＸの存在が明らかになる。
【０１４９】
実施例７：ＦＸ変異体の発現および精製
細胞培養および産生
ＦＸ誘導体を発現する細胞を、８５０ｃｍ^２の瓶に接種するために用いられる１５０ｃｍ^２のフラスコ中に連続継代によって増やす。（メタロチオネインプロモーターを誘導するための）５０μＭのＺｎＣｌ_２および翻訳後のγ−カルボキシル化を可能にするための５μｇ／ｍｌのビタミンＫ（ＲＯＣＨＥ、Ｎｅｕｉｌｌｙ ｓｕｒ Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を含む選択培地中で５％のＣＯ_２を含む制御した雰囲気下で、３７℃で、この産生を実施する。培養物上清を、（細胞密度に依存して）２〜６日毎に回収し、５０００ｇでの１０分間の遠心分離によって澄まし、そして５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭのベンズアミジンの添加後に−２０℃で貯蔵する。
【０１５０】
ＦＸ誘導体を、３段階で精製する。第一は、培養上清中に含まれるタンパク質を濃縮するためのアニオン交換樹脂への吸着である。該上清を、１０ｍＭのベンズアミジンおよび５ｍＭのＥＤＴＡを含む、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に、１／３まで希釈する。代表的に、２リットルの上清を、４リットルの緩衝液に希釈し、４．５グラムのＱＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ａ５０（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＥＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ）を添加し、そしてその混合物を、（ロータリーパドルスターラーを用いて）周囲温度で、３０分間、ゆっくりと攪拌する。ＳＥＰＨＡＤＥＸビーズを放置して沈降させ、そして上清を廃棄する。ロードした樹脂をカラムに移し、そして吸着したタンパク質を０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて溶出する。第二段階は、ＦＸ誘導体を、ＱＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ溶出液中に含まれる他のタンパク質から分離するためのアフィニティークロマトグラフィーである。溶出液を、モノクローナル抗体９Ｅ１０（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ）でグラフト（ゲル１ｍｌ当り３ｍｇ）させたＡＦＦＩ−ＰＲＥＰ ＨＺゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ）上にロードする。０．５ＭのＮａＣｌを含む、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中での洗浄後、ＦＸ誘導体を０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．７）中で溶出する。３０μｌ／ｍｌの２Ｍ Ｔｒｉｓを添加することによって溶出液のｐＨを７．５に調整し、そしてカラムを、洗浄緩衝液中に再平衡化する。精製の最後の段階は、グリシンを除去し、そしてアフィニティーカラムから溶出した誘導体を濃縮するためのさらなるアニオン交換クロマトグラフィーである。合計１〜１０ｍｇのＦＸ誘導体である複数の溶出液をプールし、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中に１／４まで希釈し、そしてＱ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷカラム（０．８×１０ｃｍ）（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ）上にロードする。希釈緩衝液中で洗浄した後、カラムを、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて溶出する。
【０１５１】
最小限の１ｍｇの各ＦＸ誘導体を調製する；サンプルの変性および還元の後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％、架橋２９／１）およびクマシーブルーでの染色によって、各調製物の純度を制御する。得られる全ての調製物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて純粋なようであるが、以下の２つの形態が組織的に存在する：ＦＸ誘導体の重鎖および軽鎖について推定される分子量に匹敵する見かけの分子量を有する、主要な二本鎖形態（８０〜９０％）、および４６ｋＤａの分子量を有する、少数の一本鎖形態（調製物に依存して、１０〜２０％）。一本鎖形態のパーセンテージは、導入される変異よりも、むしろ調製物が誘導される上清のプールに依存するようである：所定の変異について、一本鎖形態のパーセンテージは、精製の間で変化する。精製された誘導体を、アリコート化し、そして使用するまで−８０℃で貯蔵する。アリコートの濃度を、吸光係数（ｅ％２８０）として１．２５ｇ^−１ｃｍ^−１を用いて、２８０ｎｍでのその吸光度から評価する。
【０１５２】
実施例８：ＦＸ変異体の特徴付け
トロンビンによる活性化速度の決定
ＦＸ変異体のトロンビン活性化についての速度定数を、偽一次条件下で決定した。実際には、ＦＸ誘導体（１または２μＭ）を、速度論緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．２％ ＰＥＧ ８０００（ｗ／ｖ）および５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８）中のトロンビン（１００ｎＭ）の存在下で３７℃でインキュベートする。種々のインキュベーション時間の後で、ヒルジン（１００単位／ｍｌ）を、（トロンビンを中和することにより反応を停止するために）反応混合物の５μｌアリコートに添加する。
【０１５３】
次いで、１００μＭのＮ−α−Ｚ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ２７６５、ＢＩＯＧＥＮＩＣ）の加水分解の初速度を測定することによって、産生されたＦＸａの割合を評価する。４０５ｎｍでの吸光度のバリエーションを、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを用いて、時間の関数として記録する。反応を、活性化プラトーに達する（トロンビンを用いるＦＸ誘導体のより長いインキュベーションを用いてさえ、Ｓ２７６５の加水分解の速度がもはや増加しなくなる時点）まで継続する。
【０１５４】
次いで、反応についての速度定数を、一次の指数関数的増加を表す以下の式を用いて、Ｓ２７６５の加水分解速度のバリエーションの非線形回帰によって、トロンビンを用いるＦＸ誘導体のインキュベーション時間の関数として評価する：ｖ_（ｔ）＝Ｖ_ｍａｘ（１−ｅｘｐ^{（−ｋ ｔ）}＋Ｖ_０；ここで、ｖ_（ｔ）は、時間ｔでのＳ２７６５の加水分解の速度を表し；Ｖ_ｍａｘは、（プラトーでの）加水分解の最大速度を表し、そしてｋは、一次速度定数を表し；Ｖ_０は、アクチベーターを添加する前の初期条件で存在する可能性のある（小さい）アミド分解活性（バックグラウンドノイズ）を考慮して加えられる定数である。ｋ_ｏｎ（特異性定数）の値を、アクチベーター（トロンビン）の濃度に対するｋの比率を形成することにより算出する。得られた値（Ｍ^−１ｓ^−１）を、表ＶＩＩにまとめる。
【０１５５】
【表７】

従って、フィブリノペプチドＡでのＦＸの活性化ペプチドの置換（変異体ＦｐＡ−ＩＶＧ）は、ＦＸ（そのトロンビン活性化は、検出不可能である：ＮＤ）を、トロンビン感受性チモーゲン（ｋ_ｏｎ ４×１０^２Ｍ^−１ｓ^−１）へと変換することを可能にする。この変異体のＰ_２’のバリンのフェニルアラニンでのさらなる置換（ＦｐＡ−ＩＦＧ）は、この速度を７．５倍増加させる。Ｐ_１’のイソロイシンがアラニンで置換される場合（ＦｐＡ−ＡＶＧ）、この速度は、５．５倍増加する。最後に、Ｐ_１’のイソロイシンがアラニンで置換され、そしてＰ_２’のバリンがフェニルアラニンで置換される場合（ＦｐＡ−ＡＦＧ）、ｋ_ｏｎの値は、ＦＸ誘導体ＦｐＡ−ＩＶＧのｋ_ｏｎの値より６２５倍高くなる。ＦｐＡ−ＡＩＧ、ＦｐＡ−ＩＦＧおよび特にＦｐＡ−ＡＦＧから得られる活性化誘導体の触媒活性は、ＦｐＡ−ＩＶＧから得られる活性誘導体と比較して非常に減少する。活性化の間に活性化ペプチドが放出されるので、活性化後に、誘導体ＦｐＡ−ＩＶＧは、あらゆる点で、正常のＦＸａと同一であるＦＸａを生成する。他の誘導体は、多少触媒活性を妨げる、残基Ｐ_１’および／または残基Ｐ_２’が改変されたＦＸａを産生する。
【０１５６】
ＦＸ変異体の予備的活性化
機能的研究のために、Ｆｘおよびその誘導体を予備的な量で活性化した。ＦＸ（トロンビン活性化でない）を、Ｒｕｓｓｅｌｌヘビ毒ー（ＲＶＶ−Ｘ、ＫＯＲＤＩＡ、Ｌｅｉｄｅｎ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から単離したＦＸアクチベータをゲル１ｍｌ当り５ｍｇでグラフトしたＳＥＰＨＡＲＯＳＥ−ＮＨＳ（ＨＩＴＲＡＰ、ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ）のカラムを通して活性化し、そして製造者の推奨に従い調製した。トロンビン活性化可能なＦＸ誘導体をトロンビンを用いてゲル１ｍｌ当り１ｍｇでグラフトしたＳＥＰＨＡＲＯＳＥ−ＮＨＳのカラムを通してＦＸａ誘導体に活性化し、また製造者の推奨に従い調製した。
【０１５７】
速度論緩衝液中の４ミリグラムのＦＸ誘導体を、活性化カラムに導入する。このカラムを、両方の端部で閉じ、そしてインキュベーションを、周囲温度で１６時間維持する。０．５Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いて活性化誘導体を溶出する。溶出液は、活性化形態を含むが、活性化が必ずしも完全ではないので、幾分かの非活性化形態が可能性として残る。非活性化形態から活性化形態を分離するために、溶出液を、（イオン強度を減少させるために）５ｍＭのＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に１／３まで希釈し、ヘパリン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＨＩＴＲＡＰカラム（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ）上にロードし、そして０．５Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭのＣａＣｌ_２を含む、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて溶出する。
【０１５８】
ＦＸ変異体の活性化形態の滴定
活性化ＦＸ誘導体の活性部位濃度を、ＦＸａと等モル共有結合複合体を形成するＤ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｃｈ_３Ｃｌ（ＦＦＲＣＫ；ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭにより販売される）を用いる滴定により測定する。
【０１５９】
２０ｎＭ〜１２μＭの間の種々の濃度のＦＦＲＣＫを、速度論緩衝液中で、滴定される一定量（０．５〜１μＭ）のＦＸａ誘導体と共にインキュベートする。この混合物を、反応が完了するまで周囲温度でインキュベートする。必要とされるインキュベーション時間は、考えられるＦＸａ誘導体に依存し、そしてインキュベーションを延長することにより更なるＦＸａ分子の阻害を導かないことを確保することが必要である：３時間のインキュベーションは、正常のＦＸａおよび誘導体ＦｐＡ−ＩＶＧの活性化形態に対して十分であるが、１６位にアラニンを有し、そして／または１７位にフェニルアラニンを有するＦＸａ誘導体については１８時間は、十分ではなく、これらは、本方法により滴定することが困難である。
【０１６０】
このインキュベーションの最後に、ＦＸａ誘導体の残留濃度を、１００μＭのＳ２７６５の加水分解の初速度を測定することにより評価する。時間の関数としての４０５ｎｍでの吸光度のバリエーション（ｖ_ｓ）を、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを用いて記録する。次いで、初期に存在するＦＸａ誘導体の有効濃度（Ｅｔ）を、以下の「タイト結合阻害（ｔｉｇｈｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」式（上で引用される、ＣＨＡ；ＷＩＬＬＩＡＭＳおよびＭＯＲＲＩＳＯＮ）を用いて、添加されるＦＦＲＣＫの濃度の関数としてのｖ_ｓの依存の非線形回帰によって評価する：
ｖ_ｓ＝（ｖ_０／２［Ｅ_ｔ］）｛［（Ｋ_ｉ＋［ＦＦＲＣＫ］−［Ｅ_ｔ］）^２＋４Ｋ_ｉ［Ｅ_ｔ］］^１／２−（Ｋ_ｉ＋［ＦＦＲＣＫ］−Ｅ_ｔ）｝
ここで、ｖ_０は、インヒビターの非存在下でのＳ２７６５の加水分解の初速度であり、そしてＫ_ｉは、酵素−インヒビター複合体についての見かけの阻害定数である。
【０１６１】
変異体ＦｐＡ−ＩＶＧの活性化形態のアミド分解活性
変異体ＦｐＡ−ＩＶＧの活性化形態の活性部位と正常のＦＸａとを比較するために、以下の２つの色素産生基質の加水分解についての定数ｋ_ｃａｔおよびＫ_Ｍを、決定した：ＢＩＯＧＥＮＩＣから販売されるＳ２７６５およびベンジル−ＣＯ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−（γ−ＯＲ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ２２２２）。加水分解を、周囲温度で、速度論緩衝液中で実施する。６〜８００μＭの間の、種々の濃度の基質を、一定量の活性化ＦＸ誘導体（１０ｎＭ）と共にインキュベートする。時間の関数としての４０５ｎｍでの吸光度のバリエーションを、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを用いて記録し、加水分解の初速度を、多くても１０％までの加水分解に対応する吸光度の線形回帰により評価する。次いで、定数ｋ_ｃａｔおよびＫ_Ｍを、ミカエリス−メンテン式を用いる、基質濃度の関数としての、この初速度のバリエーションの非線形回帰により評価する。
【０１６２】
得られた結果を、表ＶＩＩＩにまとめる。
【０１６３】
【表８】

Ｓ２２２２およびＳ２７６５についての、ｋ_ｃａｔおよびＫ_Ｍの値、ならびにこれらの比率は同一ではないが、これらは、類似する。この結果は、誘導体ＦｐＡ−ＩＶＧのトロンビン活性化により産生されるＦＸａが、実際に、ＦＸのＲＶＶ−Ｘ活性化により産生されるものと同じであることを示唆する。
【０１６４】
ＦＸ変異体の活性化形態の抗トロンビン阻害
抗トロンビンは、ＦＸａの主要な生理学的インヒビターである。従って、血漿中半減期の任意の変化がＦＸ誘導体の血液凝固作用を改変するので、抗トロンビンがＦＸ誘導体の活性化形態と相互作用する能力を決定することが必要不可欠である。
【０１６５】
本発明者らは、抗トロンビンと安定な共有結合複合体を形成するＦＸａの能力と、ＦＸ誘導体ＦｐＡ−ＩＶＧおよびＦｐＡ−ＡＶＧの活性化形態のそれとを比較した。活性化形態のＦＸ誘導体（１μＭ）と抗トロンビン（２μＭ；ＭＣＫＡＹ（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．、２１、３７５−２５ ３８２、１９８１）に記載される技術に従い、ヒト血漿から精製した）との間のこれらの複合体の実証を、２単位／ｍｌのヘパリン（ＫＯＲＤＩＡ）の存在下で実施する。インキュベーションを、周囲温度で、１時間にわたり維持し、そしてサンプルの変性および還元後、その反応混合物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％、架橋２９／１）により分析する。ＦＸ誘導体と抗トロンビンとの間の共有結合複合体の存在は、抗トロンビン（６０ｋＤａ）に対応するバンドの強度の減少、活性化形態のＦＸ誘導体（３１ｋＤａ）に対応するバンドの強度の減少、および共有結合複合体に対応する、より高い分子量（約１００ｋＤａ）を有する新しいバンドの出現を生じる。
【０１６６】
これらの結果を図５に示す。
【０１６７】
レーン１：抗トロンビン単独；レーン２および３：抗トロンビンを伴わないおよび伴う（正常の）ＦＸａ誘導体；レーン４およびレーン５：抗トロンビンを伴わないおよび伴う活性化ＦｐＡ−ＩＶＧ誘導体。複合体の形成は、高分子量のバンドの出現を生じ（レーン３、５）、これは抗トロンビンを単独で用いるかまたは１つの活性化形態のＦＸ誘導体を単独で用いる場合生じない（レーン２、４）。電気泳動の後、タンパク質を、クマシーブルーを用いて染色する。
【０１６８】
活性化形態のＦＸ変異体ＦｐＡ−ＩＶＧの血漿半減期の決定
活性化形態の変異体ＦｐＡ−ＩＶＧの半減期を、正常のＦＸａのそれと比較した。
【０１６９】
この半減期を評価するために、ヒルジンの添加により凝固しないようにした正常の血漿中での種々の時間にわたるインキュベーションの後に、この変異体の残留活性を測定する。反応混合物は、８０％（ｖ／ｖ）のクエン酸添加した正常の血漿および１５０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＣａＣｌ_２、０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、４００Ｕ／ｍｌのヒルジンおよび５０ｎＭの（正常のまたは変異体ＦｐＡ−ＩＶＧから調製した）ＦＸａを含む２０％の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）から構成される。インキュベーションの後、血漿／ＦＸａ／ヒルジン混合物のアリコート（４０μｌ）を、１６０μｌの１００μＭ Ｓ２７６５に添加し、そして基質の加水分解の初速度を、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍでの吸光度の増加を記録することによって測定する。
【０１７０】
各変異体の半減期を、一次の指数関数的減少を表す以下の式を用いる、時間の関数としての残留活性のバリエーションの非線形回帰によって評価する：Ａ_（ｔ）＝Ａ_０ｅｘｐ^{（−ｋ ｔ）}＋Ｃｔｅ；ここで、Ａ_（ｔ）は、時間ｔでのＦＸａの残留活性を表し、Ａ_０は、その初期活性を表し、そしてｋは、一次速度定数を表す。定数Ｃｔｅを、ＦＸａの活性から独立した、可能性のある活性を考慮に入れて加えた（バックグラウンドノイズ）。次いで、血漿中半減期を、ｌｎ（２）をｋで除することによって算出する。
【０１７１】
得られた半減期の値（秒）を表ＩＸにまとめる
【０１７２】
【表９】

従って、活性化形態の変異体Ｆｐａ−ＩＶＧの血漿半減期は、正常のＦＸａの血漿中半減期と同等であり、このことは、再び、これらの２つの分子が、類似であるか、または同一でさえあることを示唆する。
【０１７３】
ＦＸ誘導体ＦｐＡ−ＩＶＧの抗血友病活性
産生されるトロンビンの量を経時的に測定することによって、ＦＸ誘導体ＦｐＡ−ＩＶＧの抗血友病活性を試験した：一般的に「トロンビン産生時間」と呼ばれる試験。この測定を、再構築した正常の血漿（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ ＳＴＡＧＯ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）または重篤な血友病Ａを刺激するためのＦＶＩＩＩを枯渇した血漿（これもまたＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ ＳＴＡＧＯ）中で行う。凝固カスケードを、再石灰化および組織因子の添加により誘発する。種々の時間でアリコートを除去し得るように、ＬＡＵＤＡＮＯら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９、１０１３−１０１９、１９８０）に記載されるように２．５ｍＭのペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（ＧＰＲＰ；ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ）を添加することによって、フィブリン凝塊の形成を阻害する。凝固カスケードの誘発の後、所定の時点で存在するトロンビンの量を、色素産生基質（Ｓ２２３８）を用いて測定する。
【０１７４】
実際には、１５０μｌの再構成した血漿を、２．５ｍｌのＧＰＲＰペプチドおよび必要に応じて５０ｎＭのＦＸ誘導体ＦｐＡ−ＩＶＧまたは１Ｕ／ｍｌの組換え第ＶＩＩＩ因子（ＨＥＭＯＦＩＬ Ｍ、ＢＡＸＴＥＲ、Ｍａｕｒｅｐａｓ、Ｆｒａｎｃｅ、血友病に対する従来の処置に対応する）を含む１５０μｌの速度論緩衝液と混合する。この混合物を、３７℃で３分間プレインキュベートする。次いで、速度論緩衝液中に１／１００まで希釈した３００μｌのＮｅｏｐｌａｓｔｉｎｅ（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ ＳＴＡＧＯ）の溶液を添加することによって、凝固カスケードを誘発する。種々の時間で２０μｌのアリコートを採取し、そして直ぐに、停止溶液（１００ｍＭのベンズアミジンおよび１０ｍＭのＥＤＴＡを含む、速度論緩衝液）中に１／５まで希釈する。１８０μｌの２００μＭ Ｓ２２３８に２０μｌの各々の希釈したアリコートを添加することによって、トロンビンの量を評価する。ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを用いて、時間の関数としての４０５ｎｍでの吸光度のバリエーションを記録し、そして対応する量のトロンビンを、標準曲線を参照して推定する。トロンビン濃度は、組織因子の添加後、最初の２分間の間、迅速に増加し、最大値に達し、次いで、抗トロンビンによるその非可逆的阻害の後に、徐々に減少する。到達される最大値、この最大値に達するために必要な時間、およびその曲線の下の面積は、「トロンビン産生時間」を表す。
【０１７５】
再構築された正常の血漿、第ＶＩＩＩ因子枯渇血漿、第ＶＩＩＩ因子を１Ｕ／ｍｌで補充した第ＶＩＩＩ因子枯渇血漿および５０ｎＭのＦＸ誘導体ＦｐＡ−ＩＶＧを補充した第ＶＩＩＩ因子枯渇血漿を用いて得られた「トロンビン産生時間」を、図６に示す。
【０１７６】
１Ｕ／ｍｌの第ＶＩＩＩ因子（通常の治療的用量）の添加では、「トロンビン産生」を部分的に回復するのみであるが、５０ｎＭのＦＸ誘導体ＦｐＡ−ＩＶＧの添加は、正常の血漿で観察されるものに類似するトロンビン産生曲線を回復することを可能にする。
【０１７７】
結論
ＦＸの活性化ペプチドの改変の効果
ＦＸにおいて、活性化ペプチド全体（５２残基）が、ヒトＦｐＡ（Ｐ_１０〜Ｐ_１、すなわち、配列ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ）で置換される場合、この誘導体は、その正常のホモログと異なり、トロンビン活性化可能になる（これは、生理学的条件である）。
【０１７８】
この誘導体が、トロンビンにより活性化される場合、得られた生成物は、正常のＦＸａに非常に類似するか、または同一でさえある（その共有結合アミノ酸構造は、同一である）。触媒活性、血漿中半減期、および抗トロンビンによるその阻害は、同等である。概して、ＦＸの活性化ペプチドの改変は、第ＶＩＩＩ因子枯渇血漿におけるトロンビン産生時間を修正することができるトロンビン活性化可能誘導体を得ることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１−１】成熟形態のＰＣの重鎖および軽鎖のポリペプチド配列
【図１−２】成熟形態のＰＣの重鎖および軽鎖のポリペプチド配列
【図２−１】成熟形態のＦＸの重鎖および軽鎖のポリペプチド配列
【図２−２】成熟形態のＦＸの重鎖および軽鎖のポリペプチド配列
【図３】レーン１：分子量マーカー。レーン２〜７：夫々、２μｇの変異体Ｆｐａ−ＬＩＤ、Δ_{ＤＴＥＤＱＥＤ}、Ｆｐａ−ＬＦＧ、Ｆｐａ−ＳＩＧ、Ｆｐａ−ＡＩＧおよびＦｐａ−ＬＩＧ。見かけの分子量（ｋＤａ）を、ゲルの左に示す。正常のＰＣの一本鎖形態の位置、および正常のＰＣの重鎖および軽鎖の位置を、ゲルの右側に示す。
【図４】レーン１：α_１−アンチトリプシンの存在下、３７℃で５時間インキュベートしたＦｐａ−ＡＩＧ、レーン２：Ｆｐａ−ＡＩＧ単独（２μｇ）。レーン３：α_１−アンチトリプシンの存在下でインキュベートしたＦｐａ−ＳＩＧ、レーン４：Ｆｐａ−ＳＩＧ単独。レーン５：α_１−アンチトリプシンの存在下でインキュベートした正常のＰＣａ、レーン６：正常のＰＣａ単独。レーン７：α_１−アンチトリプシン単独。全てのＰＣａ変異体は、α_１−アンチトリプシンと共有結合複合体を形成する。
【図５】レーン１：抗トロンビン単独；レーン２および３：抗トロンビンを伴わないおよび伴う（正常の）ＦＸａ誘導体；レーン４およびレーン５：抗トロンビンを伴わないおよび伴う活性化ＦｐＡ−ＩＶＧ誘導体。複合体の形成は、高分子量のバンドの出現を生じ（レーン３、５）、これは抗トロンビンを単独で用いるかまたは１つの活性化形態のＦＸ誘導体を単独で用いる場合生じない（レーン２、４）。電気泳動の後、タンパク質を、クマシーブルーを用いて染色する。
【図６】再構築された正常の血漿、第ＶＩＩＩ因子枯渇血漿、第ＶＩＩＩ因子を１Ｕ／ｍｌで補充した第ＶＩＩＩ因子枯渇血漿および５０ｎＭのＦＸ誘導体ＦｐＡ−ＩＶＧを補充した第ＶＩＩＩ因子枯渇血漿を用いて得られた「トロンビン産生時間」を、図６に示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１８０】
配列番号３は、ＰＣＲプライマーである。
【０１８１】
配列番号４は、ＰＣＲプライマーである。
【０１８２】
配列番号５は、ＰＣＲプライマーである。
【０１８３】
配列番号６は、ＰＣＲプライマーである。
【０１８４】
配列番号７は、ＰＣＲプライマーである。
【０１８５】
配列番号８は、ＰＣＲプライマーである。
【０１８６】
配列番号９は、ＰＣＲプライマーである。
【０１８７】
配列番号１０は、ＰＣＲプライマーである。
【０１８８】
配列番号１１は、ＰＣＲプライマーである。
【０１８９】
配列番号１２は、ＰＣＲプライマーである。
【０１９０】
配列番号１３は、ＰＣＲプライマーである。
【０１９１】
配列番号１４は、ＰＣＲプライマーである。
【０１９２】
配列番号１５は、ＰＣＲプライマーである。
【０１９３】
配列番号１６は、ＰＣＲプライマーである。
【０１９４】
配列番号１７は、ＰＣＲプライマーである。
【０１９５】
配列番号１８は、ＰＣＲプライマーである。
【０１９６】
配列番号１９は、ＰＣＲプライマーである。
【０１９７】
配列番号２０は、ＰＣＲプライマーである。
【０１９８】
配列番号２１は、ＰＣＲプライマーである。
【０１９９】
配列番号２２は、ＰＣＲプライマーである。

Claims (21)

1. トロンビン切断配列Ｐ_１０Ｐ_９Ｐ_８Ｐ_７Ｐ_６Ｐ_５Ｐ_４Ｐ_３Ｐ_２Ｐ_１’Ｐ_２’Ｐ_３’を含むキメラタンパク質であって、該配列が、フィブリノペプチドＡのアミノ酸Ｐ_１０〜Ｐ_１およびトロンビン切断部位のアミノ酸Ｐ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’（フィブリノーゲンのα鎖のトロンビン切断部位のアミノ酸を除く）を含む人工配列である、キメラタンパク質。
2. セリンプロテアーゼのチモーゲンの活性化ペプチドを、フィブリノペプチドＡまたはその一部で置換することにより該セリンプロテアーゼのチモーゲンから誘導されることを特徴とする、前記フィブリノペプチドの少なくともアミノ酸Ｐ_１０〜Ｐ_１を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質。
3. 前記チモーゲンがプロテインＣまたは第Ｘ因子である、請求項２に記載のキメラタンパク質。
4. 前記チモーゲンのネイティブＰ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’配列が、Ｐ_１’位のアミノ酸をアラニンまたはセリンで置換することによって改変されている、請求項２または３に記載のキメラタンパク質。
5. 前記チモーゲンのネイティブＰ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’配列が、Ｐ_２’位のアミノ酸をフェニルアラニンで置換することによって改変されている、請求項２〜４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
6. 前記チモーゲンのネイティブＰ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’配列が、Ｐ_３’位のアミノ酸をグリシンで置換することによって改変されている、請求項２〜５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
7. 請求項４〜６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質のトロンビン切断により得ることができるセリンプロテアーゼ誘導体。
8. 活性化プロテインＣ（ＰＣａ）誘導体または活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）誘導体の中から選択される、請求項７に記載のセリンプロテアーゼ誘導体。
9. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質または請求項７もしくは８のいずれかに記載のセリンプロテアーゼ誘導体をコードする核酸分子。
10. 以下：
    配列番号３および配列番号４により規定されるオリゴヌクレオチド対、
    配列番号５および配列番号６により規定されるオリゴヌクレオチド対、
    配列番号７および配列番号８により規定されるオリゴヌクレオチド対、
    配列番号９および配列番号１０により規定されるオリゴヌクレオチド対、
    配列番号１１および配列番号１２により規定されるオリゴヌクレオチド対、
    配列番号１３および配列番号１４により規定されるオリゴヌクレオチド対、
    配列番号１５および配列番号１６により規定されるオリゴヌクレオチド対、
    配列番号１７および配列番号１８により規定されるオリゴヌクレオチド対、
    配列番号１９および配列番号２０により規定されるオリゴヌクレオチド対、
    配列番号２１および配列番号２２により規定されるオリゴヌクレオチド対、
    から選択される、増幅プライマー対。
11. 請求項９に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、組換えベクター。
12. 請求項９に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、遺伝子送達系。
13. 請求項９に記載の核酸分子を用いて遺伝的に形質転換された宿主細胞。
14. 医薬品を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質または請求項９に記載の核酸分子の使用。
15. 医薬品を製造するための、請求項７に記載のセリンプロテアーゼ誘導体の使用。
16. 請求項２〜６のいずれか一項に記載のキメラＰＣ、または該キメラＰＣをコードする核酸分子が、抗血栓性医薬品を製造するために用いられる、請求項１４に記載の使用。
17. 請求項２〜６のいずれか一項に記載のキメラＦＸ、または該キメラＦＸをコードする核酸分子が、凝血促進性医薬品を製造するために用いられる、請求項１４に記載の使用。
18. 請求項８に記載のＰＣａ誘導体が、抗血栓性医薬品の製造のために用いられる、請求項１５に記載の使用。
19. 請求項８に記載のＦＸａ誘導体が、凝血促進性医薬品の製造のために用いられる、請求項１５に記載の使用。
20. 適切な賦形剤と組み合わせて、請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つのキメラタンパク質、または請求項７もしくは８のいずれかに記載のセリンプロテアーゼ誘導体を含む、薬学的組成物。
21. 請求項１２に記載の遺伝子送達系を含む、薬学的組成物。

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