MX2008006313A - Metodos y composiciones para modular la hemostasia. - Google Patents

Abstract

Se presentan variantes del factor Xa y métodos para su uso.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA MODULAR LA HEMOSTASIA DESCRIPCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con los campos de la medicina y de la hematología. Más específicamente, la invención muestra novedosos agentes del Factor X/Xa de coagulación y métodos que permiten usarlos para modular la cascada de coagulación en aquellos pacientes que lo necesiten.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A lo largo de la especificación, se citan distintas publicaciones y documentos patentados con el fin de describir la vanguardia en la cual se ubica esta invención. Todas las citas se incorporan como referencia al presente como si se expusieran íntegramente. Las enzimas de la coagulación son enzimas similares a la tripsina que pertenecen a la familia SI de las peptidasas de proteasas que poseen un pliegue similar al de la quimotripsina. Las proteasas de la coagulación contienen dominios catalíticos altamente homólogos entre sí y con las serina proteasas ancestrales de la digestión. La identidad y homología estructural es tan grande (>70%) que los residuos en los dominios catalíticos de las enzimas de coagulación se numeran de acuerdo con los residuos correspondientes en el quimotripsinógeno. Las enzimas de la coagulación circulan en la sangre como precursores inactivos (zimógenos) que requieren la escisión proteolítica para su activación. Los zimógenos poseen -10.000 veces o menos de actividad proteolítica en comparación con las serina proteasas que se producen luego de la activación. El inicio de la coagulación en el lugar del daño vascular genera una serie de reacciones en las que un zimógeno se convierte en proteasa mediante una escisión proteolítica específica y forma la enzima para la reacción siguiente. Esto causa una activación de las células sanguíneas y la conversión del fibrinógeno soluble en fibrina insoluble, lo cual deriva en la formación de coágulos. El exceso de proteasas se elimina mediante una reacción con inhibidores de la proteasa circulante, los cuales actúan como sustratos "suicidas" o con aquéllos que reconocen a las enzimas activas. Por lo tanto, la activación proteolítica de los zimógenos de la coagulación es una función reguladora clave en la cascada de coagulación. Si bien algunos zimógenos de la coagulación se escinden en dos o más lugares en sus respectivas reacciones de activación, la formación de la proteasa requiere la escisión en un solo lugar. La forma más simplista de considerar la escisión en este lugar y sus consecuencias estructurales es usar el sistema de numeración homólogo basado en el quimotripsinógeno y en el gran trabajo estructural realizado con el tripsinógeno y la tripsina. La conversión del zimógeno en serina proteasa requiere la escisión luego de Arg15 (generalmente el enlace entre Arg15 y lie16), que por lo general elimina un péptido de activación y expone un nuevo N-término en el dominio catalítico que comienza con lie16. Un ejemplo es la conversión del factor X en factor Xa (ver figuras 1 y 2). En la tripsina y en el factor Xa, la nueva secuencia N-terminal comienza con Ilel 6-Val17-Gly18-Gly19. En otras enzimas coagulantes, la nueva secuencia N-terminal es una variación en el mismo tema. La secuencia N-terminal vuelve a plegarse dentro del dominio catalítico y se inserta en la hendidura de unión N-terminal de un modo específico a la secuencia denominado "sexualidad molecular". Ver figura 2. En consecuencia, las variantes con secuencias N-terminal alternas no tienen probabilidades de experimentar sexualidad molecular de manera equiparable. La inserción N-terminal lleva a la formación de un puente salino entre el grupo a-NH2 de lie16 y Asp194 en el interior del dominio catalítico. La formación del puente salino se asocia a numerosos cambios en la estructura del dominio catalítico, entre ellos: reordenamientos de los llamados dominios de activación (que se muestran en la figura 3), formación del agujero de oxianión necesario para la catálisis, y formación de un lugar de enlace de sustratos. Estos cambios conducen a la maduración de la serina proteasa activa. El aporte clave de las interacciones específicas a la secuencia del nuevo N-término desde la sexualidad molecular y la formación del puente salino hasta la maduración de la proteasa activa se evidencia en los siguientes hechos: las proteasas bacterianas que no requieren escisión para la activación utilizan otra cadena lateral dentro del dominio catalítico hasta el puente salino con Asp194; el tripsinógeno se puede activar para obtener una conformación similar a la proteinasa sin escisión pero con concentraciones sumamente altas de un dipéptido lie-Val que se inserta en la hendidura, si bien de manera muy ineficiente; el dipéptido Val-Ile y otras variantes son mucho menos eficaces; además, existen dos ejemplos de proteínas bacterianas que activan los zimógenos de la coagulación en ausencia de escisión al subvertir el mecanismo de activación mediante el suministro de un N-término propio que se inserta en la hendidura de unión N-terminal. Los cambios estructurales que se describieron anteriormente brindan una explicación molecular de la conversión de un zimógeno precursor en una serina proteasa activa. Sin embargo, a diferencia de la tripsina, que se mantiene totalmente activa luego de la escisión en Arg15, muchas de las enzimas de coagulación tienen una actividad muy escasa sobre sus sustratos proteínicos. Aunque generalmente poseen lugares activos totalmente funcionales y pueden escindir sustratos de peptidilo pequeños, la escisión eficaz del sustrato biológico suele requerir de una proteína portadora de un cofactor (figura 2). En estos casos, las proteínas portadoras de un cofactor aumentan el índice de escisión del sustrato de proteína en varios miles de veces. Si bien queda por resolver el mecanismo de funcionamiento de las proteínas portadoras de un cofactor, es poco probable que éstas funcionen haciendo que la proteasa sea más parecida a una enzima y por lo tanto, más eficaz. Un punto clave es que, excepto en un caso, los cofactores se unen selectivamente a la proteasa y no al zimógeno correspondiente. Por ejemplo, el factor Xa se une con gran afinidad al FVa unido a membrana, mientras que el zimógeno factor X no se une al FVa. Según el estado del paciente, puede recomendarse desarrollar proteínas modificadas en la cascada de coagulación que posean una mayor o menor función coaguladora. Un objetivo de la invención es utilizar dichas proteínas en forma terapéutica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención, se suministran métodos y composiciones para influir en los lugares reguladores de la vía de transición entre el zimógeno FX y la proteasa, para generar así la producción de una especie FXa más "similar al zimógeno". Los métodos y las composiciones de la invención son eficaces para modular la hemostasia en pacientes que lo necesitan. En una realización, se proporciona una variante del zimógeno/proteasa Factor X/Factor Xa que modula la hemostasia. Preferentemente, la variante de zimógeno proteasa se codifica con la secuencia SEQ ID N.°: 2, donde los nucleótidos 1684-1695 de SEQ ID N.°: 2 pueden ser cualquier aminoácido con la condición de que los nucleótidos 1684-1886 no codifiquen los aminoácidos Val o Ala. De mayor preferencia, la variante de zimógeno/proteasa contiene al menos una modificación en la SEQ ID N.°: 1 seleccionada a partir del grupo compuesto por a) lie en posición 16 es Leu, Phe, Asp o Gly; b) Val en posición 17 es Leu , Ala o Gly y c) Asp en posición 194 es Asn o Glu. También se revelan los ácidos nucleicos que codifican la variante de zimógeno/proteasas de la invención ya que son métodos usados en ésta. Opcionalmente, dichos nucleótidos también pueden codificar un lugar de escisión de las enzimas intracelulares PACE y furina. En otra realización, un ácido nucleico tiene la secuencia SEQ ID N.°: 2, donde los nucleótidos en las posiciones 1684-1695 codifican los aminoácidos seleccionados a partir del grupo compuesto por Leu-Val-Gly, Gly-Val-Gly, Ile-Ala-Gly, Phe-Val-Gly y Ile-Gly-Gly, y dicho ácido nucleico está compuesto opcionalmente por nucleótidos en la posición 2233-2235 que codifican un aminoácido seleccionado a partir del grupo formado por Asn o Glu. También se suministra un composición farmacéutica que incluye la variante del Factor Xa de la invención en un portador biológicamente compatible. Otro aspecto preferido de la invención incluye métodos para el tratamiento de un trastorno relacionado con la hemostasia en un paciente que lo necesita. El tratamiento comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la variante del zimógeno/proteasa Factor X/Xa que contenga las composiciones farmacéuticas descritas en el presente. Dichos métodos deberían ser eficaces en el tratamiento de trastornos que requieren un procoagulante y que incluyen, entre otros, hemofilia A y B, hemofilia A y B asociada con anticuerpos inhibidores, deficiencia del factor de coagulación, deficiencia de la epóxido-reductasa Cl de la vitamina K, deficiencia de gamma-carboxilasa, hemorragia asociada con traumatismo, lesión, trombosis, trombocitopenia, derrame cerebral, coagulopatía, coagulación intravascular diseminada (DIC), trastornos por exceso de tratamientos anticoagulantes, síndrome de Bernard Soulier, trombastenia de Glanzman y deficiencia de agregación. Algunas variantes del zimógeno/proteasa pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos para los que se recomienda la anticoagulación. Dichos trastornos incluyen, entre otros, trombosis, trombocitopenia, derrame cerebral y coagulopatía. Otro aspecto de la invención incluye células huésped que expresan la variante de zimógeno/proteasas de la invención para producir grandes cantidades de ésta. También se presentan métodos para aislar y purificar las variantes de zimógeno proteasa.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS GRÁFICOS Figura 1. Procesamiento del Factor X. El factor X se sintetiza con una secuencia señal y un propéptido, los cuales se eliminan antes de la secreción. El factor X es un zimógeno que carece de actividad enzimática. El FX se convierte en factor Xa luego de la escisión en el enlace Argl 5-Ilel 6 y libera un péptido de activación (AP). Figura 2. Conversión de zimógeno en proteasa. Transición de zimógeno a proteasa para el factor X y ensamblaje del factor Xa con el complejo protrombinasa (FXa, FVa, fosfolípido e iones de calcio). Esta enzima convierte la protrombina (II) en trombina (Ha). Figura 3. Estructura radiográfica del FXa. Dominio catalítico del FXa en la orientación estándar. Se advierten regiones estructurales junto con residuos importantes. Extraído de Brandstetter et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 :29988-29992.

Figura 4. Análisis SDS-PAGE de las variantes del FX/Xa. Se aplicaron geles para SDS-PAGE al 4% a 12% bajo condiciones reductoras y no reductoras, y luego se tiñeron con azul de Coomassie. Figura 5. Secuencias de aminoácido (SEQ ID N.°: 1) y ácido nucleico (SEQ ID N.°: 2) del factor Xa. Los lugares y las posiciones del aminoácido para las modificaciones recomendadas en la secuencia SEQ ID N.°: 1 aparecen en negrita. Figura 6. Actividad del factor Xa en plasma de hemofilia B. Se agregó FXa o FXal l óL (2 nM) en estado natural al plasma de hemofilia B, y las muestras se diluyeron (0,1 nM) a intervalos específicos y se evaluaron en un ensayo de coagulación TTPa. Figura 7. Corrección del TTPa. El factor Xa-I 16L (200 µg/kg; n = 7 ratones) o la solución salina tamponada con fosfato (PBS) (n = 4 ratones) se inyectaron en ratones con hemofilia B (C57BL/6) por la vena de la cola. A los 5 y 30 minutos posteriores a la inyección, se extrajo sangre y se realizó un ensayo TTPa. La línea roja de puntos representa el valor de TTPa en animales C57B1/6 normales. Figura 8. Evaluación hemostática posterior al ensayo con corte en la punta de la cola en ratones con hemofilia B. La pérdida de sangre se mide en función del contenido de hemoglobina de la solución salina en A525 luego de la lesión. La cantidad de ratones (Balb c) son: en estado natural (n = 7), HB-PBS (n = 6) y HB-FXaI 16L (n = 7)· DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La proteolisis es un aspecto importante de la coagulación sanguínea y está presente en muchos de los mecanismos que regulan la hemostasia normal. Los procofactores y zimógenos no pueden participar de modo significativo en sus respectivos complejos enzimáticos macromoleculares. Esto indica que la activación proteolítica debe generar cambios estructurales adecuados que lleven a la expresión de lugares que confieran la capacidad de unión de cofactores, sustratos y enzimas. Si bien se ha estudiado mucho la activación de procofactores y zimógenos, no se conoce totalmente la relación entre la proteolisis y la expresión de lugares de unión que confieran funciones. La presente invención proporciona sistemas y composiciones modelo que dilucidan los mecanismos moleculares que subyacen a la expresión de interacciones de unión macromolecular que acompañan las transiciones a partir del estado del zimógeno. El factor X (FX)1 es una glicoproteína de doble cadena dependiente de la vitamina K que cumple una función central en la coagulación sanguínea (figura 1 ). Este zimógeno de la serina proteasa es un sustrato tanto para los complejos enzimáticos tenasa extrínsecos (factor tisular/FVIIa) como para los intrínsecos (FVIIIa/FIXa) que escinden el enlace escindible Argl 5-Ile16 en el FX y liberan un péptido de activación de 52 aminoácidos para generar el FXa. El factor Xa es una proteasa responsable de convertir la protrombina en trombina (figura 2). Si bien el factor Xa es una proteasa totalmente competente y posee el mecanismo catalítico para la escisión de la protrombina, es un catalizador sumamente ineficaz para esta reacción. Su interacción de unión fuerte con el cofactor factor Va en la superficie de una membrana aumenta enormemente el índice de formación de trombina, sin afectar de forma sustancial otras reacciones catalizadas por el factor Xa. Se prevé que los cambios en la secuencia N-terminal (Ile-Val-Gly) después del lugar de escisión de Argl 5 que llevan a una sexualidad molecular subóptima generen un derivado de Xa "similar al zimógeno" con una actividad proteolítica deficiente o incluso nula. No se espera que estos derivados sean susceptibles a la inhibición por inhibidores de la proteasa plasmática como la antitrombina III, ni que interfieran en el inicio de la coagulación posterior al daño vascular, dado que no se prevé que se unan bien al inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI). El factor Xa se une fuertemente al factor Va, mientras que el factor X del zimógeno no lo hace. Por lo tanto, se prevé que las formas del factor Xa similares al zimógeno se unan al Va en forma más débil, pero se rescaten completamente en concentraciones del cofactor lo suficientemente altas y que catalicen la formación de trombina de forma eficaz. Se prevé que las formas del factor Xa similares al zimógeno con estas propiedades actúen en circulación como proteasas de larga vida que de otra manera estarían muertas, pero que conservan la capacidad de catalizar la formación de trombina luego de unirse al factor Va. Estas tienen el potencial de actuar como procoagulantes terapéuticos que evitan las deficiencias de otros factores de coagulación de la cascada, sin los efectos perjudiciales asociados a la infusión del FXa en estado natural totalmente funcional.

I. Definiciones: Tanto en lo mencionado anteriormente como en la especificación y en las reivindicaciones se utilizan diferentes términos relacionados con las moléculas biológicas de la presente invención. La frase "variante de zimógeno/proteasa" se refiere a un zimógeno FX modificado o a una proteasa FXa que ha sido genéticamente modificada de tal modo que su actividad proteásica al convertirse en FXa se reduzca o sea "similar al zimógeno" en ausencia de cofactores específicos (p. ej., la afinidad de unión del lugar activo es menor que la observada en la molécula en estado natural). Notablemente, esta afinidad o actividad se recupera en presencia de los cofactores adecuados que incluyen, entre otros, el factor Va. Los lugares de preferencia para las alteraciones del aminoácido en la molécula FXparental incluyen la sustitución de la isoleucina en la posición 16, la sustitución de la valina en la posición 17 y la sustitución del ácido aspártico en la posición 194, con la condición de que el aminoácido en la posición 16 no sea valina ni al aniña. La frase "trastorno relacionado con la hemostasia" se refiere a trastornos hemorrágicos como hemofilia A y B, pacientes con hemofilia A y B con anticuerpos inhibidores, deficiencias en los factores de coagulación VII, IX y X, XI, V, XII, II, factor von Willebrand, deficiencia combinada de FV/FVIII, deficiencia de la epóxido-reductasa Cl de la vitamina K, deficiencia de gamma-carboxilasa; hemorragia asociada con traumatismo, lesión, trombosis, trombocitopenia, derrame cerebral, coagulopatía, coagulación intravascular diseminada (DIC); exceso de anticoagulación asociada con heparina, heparina de bajo peso molecular, pentasacárido, warfarina, antitrombóticos de moléculas pequeñas (es decir, inhibidores del FXa); y trastornos plaquetarios como síndrome de Bernard Soulier, trombastenia de Glanzman y deficiencia de agregación. Un trastorno relacionado con la hemostasia también puede incluir hemorragia relacionada con trastornos trombóticos como trombosis venosa profunda, trombosis asociada a tumores malignos o enfermedades cardiovasculares, trombosis causada por sondas permanentes u otros procedimientos quirúrgicos invasivos, y trombosis asociada a enfermedades autoinmunes, como el lupus. Las variantes de zimógeno/proteasa también pueden suministrar la hemostasia necesaria para pacientes con coagulación intravascular diseminada o coagulopatías consuntivas generadas por diversas enfermedades. Con respecto a los ácidos nucleicos de la invención, a veces se utiliza el término "ácido nucleico aislado". Este término, cuando se aplica al ADN, se refiere a una molécula de ADN que se separa de las secuencias a las que es inmediatamente contigua (en las direcciones 5' y 3') en el genoma presente de forma natural del organismo del que se origina. Por ejemplo, el "ácido nucleico aislado" puede incluir una molécula de ADN o de ADNc inserta en un vector, como un vector de virus o plásmido, o integrada al ADN de un procariota o eucariota. Con respecto a las moléculas de ARN de la invención, el término "ácido nucleico aislado" se refiere principalmente a la molécula de ARN codificada por una molécula de ADN aislada, como se define arriba. El término también puede hacer referencia a una molécula de ARN que se ha separado bastante de las moléculas de ARN con las que se asociaría en su estado natural (es decir, en células o tejidos), de modo tal que existe en forma "sustancialmente pura" (el término "sustancialmente pura" se define más abajo).

Con respecto a la proteína, en el presente se utiliza a veces el término "proteína aislada" o "proteína aislada y purificada". Este término se refiere principalmente a una proteína generada por la expresión de una molécula de ácido nucleico aislada de la invención. Este término también puede hacer referencia a una proteína que se ha separado bastante de otras proteínas con las que se asociaría de forma natural, para existir en forma "sustancialmente pura". El término "región promotora" se refiere a las regiones reguladoras transcripcionales de un gen, que se pueden encontrar en el lado 5' o 3' de la región codificadora, dentro de la región codificadora o dentro de intrones. El término "vector" se refiere a una pequeña molécula de ADN portadora en la que se puede insertar una secuencia de ADN para su introducción en una célula huésped en la que se replicará. Un "vector de expresión" es un vector especializado que contiene un gen o una secuencia de ácido nucleico con las regiones reguladoras necesarias para la expresión en una célula huésped.

El término "operablemente unido" significa que las secuencias reguladoras necesarias para la expresión de una secuencia codificadora se colocan en la molécula de ADN en las posiciones adecuadas relativas a la secuencia codificadora, de modo tal que expresen dicha secuencia. Esta misma definición suele aplicarse al ordenamiento de las secuencias codificadoras y de los elementos de control transcripcional (p. ej., promotores, potenciadores y elementos de terminación) en un vector de expresión. Esta definición también suele aplicarse al ordenamiento de las secuencias de ácido nucleico de una primera y una segunda molécula de ácido nucleico en el que se genera una molécula de ácido nucleico híbrida. El término "sustancialmente pura" se refiere a una preparación formada en al menos un 50% a 60% en peso por el compuesto de interés (p. ej., ácido nucleico, oligonucleótido, proteína, etc.). De preferencia, el compuesto de interés compone la preparación en al menos un 75% en peso, y de mayor preferencia, en un 90% a 99% en peso. La pureza se mide con métodos adecuados al compuesto de interés (p. ej., métodos cromatográficos, electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, análisis HPLC y otros). La frase "consta esencialmente de" en relación con una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos en particular hace referencia a una secuencia que tiene las propiedades de una secuencia SEQ ID N.°: dada. Por ejemplo, cuando se usa en referencia a una secuencia de aminoácidos, la frase incluye la secuencia en sí y las modificaciones moleculares que no afectarían a las características básicas ni nuevas de dicha secuencia. El término "oligonucleótido" que se utiliza en el presente se refiere a los iniciadores y a las sondas de la presente invención, y se define como una molécula de ácido nucleico compuesta por dos o más ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos, de preferencia más de tres. El tamaño exacto del oligonucleótido dependerá de distintos factores y de la aplicación particular en la que se lo use. El término "sonda" se utiliza en el presente para referirse a un oligonucleótido, a un polinucleótido o a un ácido nucleico, ya sea AR o ADN, presente en forma natural como en un hidrolizado purificado de enzimas de restricción o producido sintéticamente, capaz de aparearse o hibridarse específicamente con un ácido nucleico con secuencias complementarias a la sonda. La sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. La longitud exacta de la sonda depende de muchos factores, incluidos la temperatura, el origen de la sonda y el método de uso. Por ejemplo, en aplicaciones de diagnóstico, según la complejidad de la secuencia objetivo, la sonda de oligonucleótidos generalmente contiene entre 15 y 25 nucleótidos o más, aunque puede contener menos.

Las sondas del presente se seleccionan para ser "sustancialmente" complementarias a diferentes cadenas de una secuencia objetivo particular de ácido nucleico. Esto significa que las sondas deben ser lo suficientemente complementarias como para poder "hibridarse específicamente" o aparearse con sus respectivas cadenas objetivo bajo una serie de condiciones predeterminadas. Por lo tanto, la secuencia de la sonda no necesita reflejar la secuencia complementaria exacta del objetivo. Por ejemplo, un fragmento de nucleótido no complementario se puede unir al extremo 5' o 3' de la sonda, mientras que el resto de la secuencia de la sonda es complementaria a la cadena objetivo. Las secuencias más largas o las bases no complementarias también se pueden intercalar en la sonda, siempre que la secuencia de la sonda sea lo suficientemente complementaria a la secuencia del ácido nucleico objetivo para aparearse específicamente con ésta. El término "hibridarse específicamente" se refiere a la asociación entre dos moléculas de ácido nucleico monocatenario de una secuencia lo suficientemente complementaria para permitir la hibridación bajo condiciones predeterminadas de uso general en este campo (también recibe el nombre de "sustancialmente complementaria"). En particular, el término se refiere a la hibridación de un oligonucleótido con una secuencia sustancialmente complementaria presente dentro de una molécula de ADN o ARN monocatenario de la invención, a la exclusión sustancial de la hibridación del oligonucleótido con ácidos nucleicos monocatenarios de una secuencia no complementaria. El término "iniciador" se utiliza en el presente para referirse a un oligonucleótido, ya sea ARN o ADN, monocatenario o bicatenario, derivado de un sistema biológico, generado mediante hidrolizado de enzimas de restricción o producido sintéticamente y que, cuando se lo coloca en el ambiente adecuado, es capaz de actuar funcionalmente como iniciador de la síntesis de ácido nucleico dependiente de una plantilla. En presencia de una plantilla de ácido nucleico adecuada, de precursores nucleósido-trifosfatos adecuados de ácidos nucleicos, de una enzima polimerasa, de cofactores y condiciones adecuados, como temperatura y pH, el iniciador se puede extender en su término 3' con el agregado de nucleótidos mediante la acción de una polimerasa o una actividad similar para generar un producto de extensión del iniciador.

La longitud del iniciador puede variar según las condiciones particulares y los requisitos de la aplicación. Por ejemplo, en aplicaciones de diagnóstico, el iniciador de oligonucleótidos tiene un tamaño de entre 15 y 25 nucleótidos o más. El iniciador debe ser lo suficientemente complementario a la plantilla deseada para iniciar la síntesis del producto de extensión que se desee, es decir, para poder aparearse con la cadena plantilla deseada de modo tal que provea el grupo hidroxilo 3' del iniciador en la yuxtaposición adecuada para usar en el inicio de la síntesis con una polimerasa o enzima similar. No se requiere que la secuencia del iniciador represente un complemento exacto de la plantilla deseada. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos no complementaria se puede unir al extremo 5' de un iniciador complementario. Asimismo, las bases no complementarias se pueden intercalar dentro de la secuencia del iniciador de nucleótidos, siempre que la secuencia del iniciador sea lo suficientemente complementaria a la secuencia de la cadena plantilla deseada para proveer funcionalmente un complejo de iniciador plantilla para la síntesis del producto de extensión. El término "porcentaje de identidad" se utiliza en el presente para referirse a comparaciones entre secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos se suelen comparar mediante programas informáticos que alinean las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos para establecer las diferencias entre ambas. A los fines de esta invención, las comparaciones de las secuencias de ácido nucleico se realizan con el programa GCG Wisconsin Package versión 9.1 , disponible a través de Genetics Computer Group en Madison, Wisconsin. Por cuestiones prácticas, en el presente se utilizan los parámetros predeterminados (penalización por creación de gap = 12, penalización por extensión de gap = 4) especificados por el programa para comparar la identidad de secuencias. También se puede utilizar el programa Blastn 2.0 del National Center for Biotechnology Information (disponible en Internet en ncbi.nlm.nih.gov blast/; Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:403-410) que utiliza una alineación gap con parámetros predeterminados para establecer el grado de identidad y similitud entre secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos. II. Preparación de moléculas de ácido nucleico y de polipéptidos que codifican la variante de zimógeno-proteasa A. Moléculas de ácido nucleico Las moléculas de ácido nucleico que codifican la variante de zimógeno/proteasa de la invención se pueden preparar utilizando métodos tecnológicos de ADN recombinante. La información disponible sobre secuencias de nucleótidos permite preparar las moléculas de ácido nucleico aislado de la invención de diferentes formas. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de zimógeno/proteasa se pueden aislar del origen biológico correspondiente mediante protocolos estándares muy conocidos en este campo. Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden mantener como ADN en cualquier vector de clonación que resulte práctico. En una realización de preferencia, los clones se mantienen en un vector plásmido de expresión/clonación, como pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), el cual se propaga en una célula huésped E. coli apropiada. Los ácidos nucleicos también se pueden mantener en un vector adecuado para la expresión en células de mamíferos. En los casos en que la modificación postraduccional afecte a la función del zimógeno/proteasa (p. ej., el factor Xa), se prefiere expresar la molécula en células de mamíferos. En una realización, los ácidos nucleicos que codifican las variantes del zimógeno factor X se pueden modificar aún más al insertar un lugar de escisión proteolítica intracelular. Para expresar las variantes "activadas" del FXa similares al zimógeno en células de mamíferos, se puede insertar un lugar de escisión proteolítica intracelular entre las posiciones Argl 5 y 16 en la variante del zimógeno FX. Estos lugares de escisión incluyen: Arg-Lys-Arg o Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg. Dichos lugares son reconocidos eficazmente por las proteasas (enzimas similares a PACE y furina) de la célula y luego son eliminados. Esto genera una variante del FX(a) procesada en la que la cadena pesada de la molécula comienza en la posición 16. Al introducir este lugar de escisión en dicha posición se logra convertir en forma intracelular el FX en FXa. En otra realización, se puede eliminar el péptido de activación de 52 aminoácidos en su totalidad e introducir allí el lugar de escisión de proteasa intracelular para generar una variante del FXa. Finalmente, estos tipos de modificaciones permiten la secreción de la forma procesada "activa" de la variante del FX a partir de una célula que expresa la variante modificada del FX. La secreción del factor escindido evita la necesidad de realizar una escisión proteolítica durante la coagulación sanguínea o luego de aislar la proteína. Las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican la variante de zimógeno/proteasa incluyen ADNc, ADN genómico, ARN y fragmentos de éstos que pueden ser monocatenarios o bicatenarios. En consecuencia, esta invención proporciona oligonucleótidos (cadenas sentido y antisentido de ADN o ARN) con secuencias capaces de hibridarse con al menos una secuencia de una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Tales oligonucleótidos son útiles como sondas para detectar la expresión de zimógenos/proteasas.

B. Proteínas Un polipéptido zimógeno/proteasa completo o de la variante de zimógeno/proteasa de la presente invención puede prepararse de diversas formas de acuerdo con métodos conocidos. La proteína se puede purificar a partir de fuentes apropiadas, p. ej., tejidos o células cultivadas animales o bacterianas que expresen zimógenos/proteasas, mediante purificación por inmunoafinidad. Sin embargo, este método no se prefiere debido a la baja cantidad de pro teína que probablemente esté presente en cualquier momento en un determinado tipo de célula.

La disponibilidad de moléculas de ácido nucleico que codifiquen un polipéptido de la variante de zimógeno/proteasa permite la producción de zimógenos/proteasas mediante métodos de expresión in vitro conocidos en el área. Por ejemplo, se puede clonar un gen o ADNc en un vector de transcripción in vitro apropiado, como pSP64 o pSP65 para la transcripción in vitro, seguido de la traducción libre de células en un sistema de traducción libre de células adecuado, como germen de trigo o lisados de reticulocitos de conejo. En el mercado se encuentran a la venta sistemas de transcripción y traducción in vitro, p. ej. de Promega Biotech, Madison, Wisconsin o de BRL, Rockville, Maryland. Como alternativa, según una realización preferida, se pueden producir cantidades mayores de zimógenos/proteasas mediante expresión en un sistema de expresión eucariota o procariota adecuado. For example, part or all of a DNA molecule encoding variant Factor Xa for example, may be inserted into a plasmid vector adapted for expression in a bacterial cell, such as E. coli or a mammalian cell such as CHO or Hela cells. Como alternativa, en una realización preferida, se pueden generar proteínas de fusión marcadas que contengan zimógenos/proteasas. Tales proteínas de fusión marcadas "zimógeno/proteasa" son codificadas por parte o por la totalidad de una molécula de ADN, ligada en el marco de lectura del codón correcto a una secuencia de nucleótidos que codifica una parte o la totalidad de la etiqueta de un polipéptido deseado que se inserta en un vector plásmido adaptado para la expresión en una célula bacteriana, como la E. coli, o una célula eucariota, como la levadura y las células de mamíferos, coli or a eukaryotic cell, such as, but not limited to, yeast and mammalian cells. Los vectores, tales como aquéllos descritos anteriormente, comprenden los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en la célula huésped, ubicados de manera tal que permitan la expresión del ADN en la célula huésped. Los elementos reguladores necesarios para la expresión incluyen, entre otros, secuencias promotoras, secuencias de iniciación de la transcripción y secuencias potenci adoras. De acuerdo con métodos conocidos en el área, se pueden purificar variantes de las proteínas zimógenos/proteasas producidas por expresión génica en un sistema recombinante procariota o eucariota. En una realización preferida, se puede utilizar un sistema de secreción/expresión de venta en el mercado, por medio del cual se exprese la proteína recombinante y luego se la secrete de la célula huésped, para que se la purifique fácilmente desde el medio circundante. Si no se utilizan vectores de expresión/secreción, un método alternativo implica purificar la proteína recombinante mediante separación por afinidad, tal como por interacción inmunológica con anticuerpos que se unan específicamente a la proteína recombinante o a las columnas de níquel para aislar las proteínas recombinantes marcadas con 6 a 8 residuos de histidina en su N-término o C-término. Otras etiquetas pueden abarcar el epítope FLAG, GST o el epítope de hemaglutinina. Tales métodos son usados con frecuencia por profesionales experimentados. Las proteínas zimógenos/proteasas, preparadas mediante los métodos antes mencionados, se pueden analizar de acuerdo con procedimientos estándares. Por ejemplo, tales proteínas pueden someterse a un análisis de secuencia de aminoácidos, de acuerdo con métodos conocidos. Como se analizó anteriormente, una forma conveniente de producir un polipéptido según la presente invención es expresar el ácido nucleico que lo codifica mediante el uso del ácido nucleico en un sistema de expresión. Los expertos del área conocen profundamente una variedad de sistemas de expresión útiles para los métodos de la presente invención.

En consecuencia, la presente invención también abarca un método para producir un polipéptido (como se mostró), el cual incluye la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido (generalmente ácido nucleico). Esto se puede lograr convenientemente si se cultiva una célula huésped que contenga un vector de ese tipo, en condiciones apropiadas que originen o permitan la producción del polipéptido. Los polipéptidos también se pueden producir en sistemas in vitro, como lisados de reticulocitos.

III. Usos de las proteínas zimógenos/proteasas y de los ácidos nucleicos que codifican zimógenos/proteasas De acuerdo con esta invención, los ácidos nucleicos de la variante de zimógeno/proteasa que codifican polipéptidos con actividades de proteasas alteradas pueden utilizarse, por ejemplo, como agentes terapéuticos o profilácticos (ácido nucleico o proteína) que modulen la cascada de coagulación sanguínea. Los actuales inventores han descubierto que las moléculas zimógenos/proteasas del factor X/Xa pueden incrementar la coagulación y permitir una hemostasia eficaz. A. Polipéptidos de la variante de zimógeno/proteasa En una realización preferida de la presente invención, los polipéptidos de la variante de zimógeno/proteasa se pueden administrar a los pacientes mediante infusión en un portador biológicamente compatible, preferentemente a través de una inyección intravenosa. Opcionalmente, la variante de zimógeno/proteasa de la invención se puede encapsular en liposomas o mezclar con otros fosfolípidos o micelas para aumentar la estabilidad de la molécula. Los zimógenos/proteasas se pueden administrar solos o en combinación con otros agentes que modulen la hemostasia (p. ej., factor V, factor Va o derivados de ellos). La composición apropiada en la cual administrar polipéptidos de la variante de zimógeno/proteasa puede ser determinada por el médico luego de considerar una diversidad de variables fisiológicas que incluyan, entre otras, el estado de salud del paciente y su estado hemodinámico. En el área se conoce una variedad de composiciones apropiadas para diferentes aplicaciones y de vías de administración, las cuales se describen a continuación. La preparación que contiene el análogo del factor X/Xa purificado contiene una matriz aceptable desde el punto de vista fisiológico y se formula preferentemente como preparación farmacéutica. La preparación se puede formular con métodos bien conocidos, se puede mezclar con un tampón que contenga sales, como NaCl, CaCl2, y aminoácidos, como glicina o licina, y en un intervalo de pH de 6 a 8. Hasta que se lo necesite, la preparación purificada que contiene el análogo del factor X/Xa se puede conservar como solución terminada o en forma liofilizada o ultracongelada. Preferentemente, la preparación se conserva en forma liofilizada y se disuelve en una solución visualmente incolora utilizando una solución reconstituyente apropiada. Como alternativa, la preparación según esta invención también se puede poner a disposición como preparación líquida o como líquido ultracongelado. La preparación según el presente es especialmente estable, es decir, se la puede dejar reposar en forma disuelta durante un tiempo prolongado antes de la aplicación. La preparación según la presente invención, que contiene un análogo del factor X en combinación con el factor Xla, o un derivado de éste capaz de activar el análogo del factor X en factor Xa o en el análogo del factor Xa, se puede poner a disposición en forma de preparación combinada que conste de un envase que contenga el factor Xla inmovilizado en una matriz (potencialmente en forma de columna en miniatura o de jeringa con un complemento de proteasa), y de un envase que contenga la preparación farmacéutica con el análogo del factor X. Para activar el análogo del factor X se puede, por ejemplo, presionar la solución que contiene el análogo del factor X sobre la proteasa inmovilizada. Durante el almacenamiento de la preparación, la solución que contiene el análogo del factor X se separa espacialmente de la proteasa de manera preferencial. La preparación según la presente invención se puede conservar en el mismo envase que la proteasa, pero los componentes están espacialmente separados por una partición impermeable que puede quitarse con facilidad antes de su administración. Las soluciones también se pueden conservar en envases separados y ponerse en contacto entre sí brevemente antes de la administración. El análogo del factor X se puede activar en factor Xa brevemente antes de su uso inmediato, es decir, antes de administrarlo al paciente. Para realizar la activación, se pueden poner en contacto un análogo del factor X con una proteasa inmovilizada, o se puede mezclar las soluciones que contienen una proteasa por un lado, y el análogo del factor X, por el otro. De ese modo, es posible mantener en forma separada los dos componentes en solución y mezclarlos mediante un dispositivo de infusión adecuado en el cual los componentes entren en contacto entre sí mientras atraviesan el dispositivo y provocan así una activación al factor Xa o al análogo del factor Xa. Así, el paciente recibe una mezcla de factor Xa y, además, una serina proteasa responsable de la activación. En este contexto, es especialmente importante prestar mucha atención a la dosis, ya que la administración adicional de una serina proteasa también activa el factor X endógeno, el cual puede acortar el tiempo de coagulación. La preparación, según la presente invención, puede ponerse a disposición como preparación farmacéutica con actividad de factor Xa de un único componente, o en combinación con otros factores en forma de preparación de múltiples componentes. Antes de transformar la proteína purificada en una preparación farmacéutica, se la somete a los controles de calidad convencionales y se la adapta a una forma de presentación terapéutica. Especialmente durante la producción de recombinantes, se analiza que la preparación purificada no contenga ácidos nucleicos celulares ni ácidos nucleicos derivados del vector de expresión. El análisis se realiza preferentemente utilizando un método, como se describe en la EP 0 714 987. Otra característica de esta invención se refiere a poner a disposición una preparación que contenga un análogo del factor Xa con gran estabilidad e integridad estructural que, en particular, no contenga intermediarios análogos inactivos del factor X/Xa ni productos de degradación autoproteolítica. Esta preparación podrá producirse activando un análogo del factor X del tipo descrito anteriormente y formulándola en una preparación adecuada. La preparación farmacéutica puede contener dosis de entre 10 y 1000 µg/kg; de preferencia, entre aproximadamente 10 y 250 µg/kg; y ávn mas preferentemente entre 10 y 75 µg/kg, en las que se prefiere de manera particular que haya 40 µg/kg del polipiptido de la variante del factor X. Se puede tratar a los pacientes tan pronto ingresan en la clínica con una hemorragia. Como alternativa, los pacientes pueden recibir una infusión de bolo cada una, dos o tres horas o, si se observa una mejoría suficiente, una infusión diaria de la variante del factor Xa descrita en el presente documento.

B. Ácidos nucleicos que codifican la variante de zimógeno/proteasa Los ácidos nucleicos que codifican la variante de zimógeno/proteasa pueden utilizarse para diversos fines según la presente invención. En una realización preferida de la invención, se proporciona un vehículo para la transferencia de ácidos nucleicos (es decir, un vector de expresión) para modular la coagulación sanguínea, donde el vector de expresión incluya una codificación de una secuencia de ácido nucleico para un polipéptido de la variante de zimógeno/proteasa, o un fragmento funcional de ésta, como se describe en el presente. La administración a un paciente de vectores de expresión que codifican la variante de zimógeno/proteasa produce la expresión del polipéptido de la variante de zimógeno/proteasa que sirve para modificar la cascada de coagulación. De acuerdo con la presente invención, una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de zimógeno/proteasa puede codificar un polipéptido de la variante de zimógeno/proteasa, como se describe en el presente, cuya expresión aumenta la hemostasia. En una realización preferida, una secuencia de ácido nucleico de la variante de zimógeno/proteasa codifica una variante del polipéptido del Factor Xa humano. Los vectores de expresión que incluyen secuencias de ácido nucleico de la variante zimógeno/proteasa X/Xa pueden administrarse solos o en combinación con otras moléculas útiles para modular la hemostasia. Según la presente invención, los vectores de expresión o la combinación de agentes terapéuticos pueden administrarse al paciente solos o en composiciones farmacéuticamente aceptables o biológicamente compatibles. En una realización preferida de la invención, el vector de expresión que incluye las secuencias de ácido nucleico que codifican las variantes de zimógeno/proteasa es un vector viral. Los vectores virales que pueden utilizarse en la presente invención incluyen, entre otros, vectores adenovirales (con o sin promotores/potenciadores específicos de tejido), vectores de virus adenoasociados (AAV) de varios serotipos (p. ej.: AAV-2, AAV-5, AAV-7 y AAV-8) y vectores AAV híbridos, vectores lentivirales y pseudovectores lentivirales (p.ej.: virus Ebola, virus de la estomatitis vesicular [VEV] y virus de la inmunodeficiencia felina [VIF]), vectores del virus del herpes simple, vectores del virus vaccinia y vectores retrovirales. En una realización preferida de la presente invención, se suministran métodos para la administración de un vector viral que incluye secuencias de ácido nucleico codificadoras de una variante de zimógeno/proteasa, o un fragmento funcional de ésta. Los vectores adenovirales de utilidad en los métodos de la presente invención incluyen, preferentemente, al menos las partes esenciales del ADN del vector adenoviral. Como se describe en el presente, la expresión de un polipéptido de la variante de zimógeno/proteasa luego de la administración de dicho vector adenoviral sirve para modular la hemostasia. En el contexto de la variante del Factor Xa descrito en el presente, tal administración mejora la actividad de procoagulación de la proteasa. Los vectores adenovirales recombinantes han demostrado tener una gran utilidad para una variedad de aplicaciones de terapia génica. Su utilidad para dichas aplicaciones se debe en gran medida a la gran eficacia de la transferencia genética in vivo que se logra en diferentes contextos de órganos. Las partículas adenovirales se pueden utilizar para avanzar como vehículos para una transferencia genética apropiada. Estos viriones poseen un número de características deseables para tales aplicaciones, que incluyen: características estructurales relacionadas con la cualidad de ser un virus sin envoltura con ADN bicatenario, y características biológicas como un tropismo por el sistema respiratorio y el tracto gastrointestinal humanos. Además, se sabe que los adenovirus infectan varios tipos de células in vivo e in vitro mediante endocitosis mediada por receptor. La infección con adenovirus produce un estado de enfermedad mínima en los humanos con síntomas similares a los de una gripe suave, lo que da fe de la seguridad general de los vectores adenovirales. Debido a su gran tamaño (-36 kilobases), los genomas adenovirales se pueden utilizar como vehículos de terapia génica, ya que pueden acomodar la inserción de ADN foráneo después de la extracción de genes adenovirales esenciales para la replicación y las regiones no esenciales. Dichas sustituciones afectan el funcionamiento del vector viral respecto de las funciones replicativas y la infectividad. Debe tenerse en cuenta que los adenovirus han sido utilizados como vectores para terapia génica y para la expresión de genes heterólogos. Para obtener una explicación más detallada del uso de vectores adenovirales en terapia génica, ver Berkner, 1988, Biotechniques 6:616-629 y Trapnell, 1993, Advanced Drug Delivery Reviews 12: 185-199. Es conveniente introducir un vector que pueda proporcionar, por ejemplo, múltiples copias de un gen deseado y, consecuentemente, mayores cantidades del producto de ese gen. En un gran número de referencias, patentes y solicitudes de patentes, se han explicado en detalle los vectores adenovirales mejorados y los métodos para producirlos. Entre estas fuentes se encuentran: Mitani and Kubo (2002, Curr Gene Ther. 2(2): 135-44); Olmsted-Davis et al. (2002, Hum Gene Ther. 13(1 1): 1337-47); Reynolds et al. (2001 , Nat Biotechnol. 19(9):838-42); Patentes de los EE. UU. nros. 5,998,205 (donde se proporcionan vectores de replicación específicos de tumor que incluyen múltiples copias de ADN); 6,228,646 (donde se describen vectores adenovirales totalmente defectuosos sin virus auxiliar); 6,093,699 (donde se proporcionan vectores y métodos para terapia génica); 6,100,242 (donde un vector adenoviral con transgén inserto, incapaz de replicarse, fue utilizado con eficacia en terapia génica in vivo de enfermedad vascular periférica y cardiopatía); y solicitudes de patente internacional nros. WO 94/17810 y WO 94/23744. Para algunas aplicaciones, un constructo de expresión puede también incluir elementos reguladores que sirvan para provocar la expresión en un tipo determinado de célula o tejido. Dichos elementos reguladores son conocidos por los expertos en el área y se explican en profundidad en Sambrook et al. (1989) y Ausubel et al. (1992). La incorporación de elementos reguladores específicos de tejido en los constructos de expresión de la presente invención asegura al menos un tropismo de tejido parcial para la expresión de la variante de zimógeno/proteasa o de fragmentos funcionales de ésta. Por ejemplo, para avanzar en los métodos de la presente invención, puede utilizarse un vector adenoviral tipo 5 con El suprimido que incluye las secuencias de ácido nucleico codificadoras de las variantes de zimógeno/proteasa bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV).

Métodos ejemplares para producir vectores adenovirales Los vectores adenovirales para la expresión génica recombinante se han producido en la línea celular embrionaria de riñon humano 293 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59-72). Esta línea celular permite el crecimiento de los adenovirus tipo 2 (Ad2) y tipo 5 mutantes defectuosos en las funciones El , porque incluye el extremo izquierdo del genoma del adenovirus tipo 5 y, por lo tanto, expresa las proteínas El . Los genes El integrados al genoma celular de las células 293 se expresan en niveles que facilitan el uso de estas células como un sistema de expresión en el que se pueden amplificar vectores virales a los cuales se les han extraído estos genes. Las células 293 han sido ampliamente utilizadas para el aislamiento y la propagación de mutantes de El , para la clonación sin célula auxiliar y para la expresión de vectores adenovirales. Por lo tanto, los sistemas de expresión como la línea celular 293 proporcionan funciones virales esenciales en trans, y de ese modo permiten la propagación de vectores virales cuyas secuencias de ácido nucleico exógeno han sido sustituidas por genes El . Ver Young et al. en The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York and London (1984), pp. 125-172.

Los expertos en el área conocen otros sistemas de expresión apropiados para la propagación de vectores adenovirales (p.ej.: células HeLa), los cuales han sido revisados en otras partes. También se incluye en la presente invención un método para modular la hemostasia que consiste en suministrar a las células de un individuo un vehículo para la transferencia de ácidos nucleicos que codifique un polipéptido de la variante de zimógeno/proteasa y permita que las células se desarrollen en condiciones donde se exprese el polipéptido de la variante de zimógeno/proteasa. De la explicación anterior se puede deducir que los polipéptidos de la variante de zimógeno/proteasa y el polipéptido de la variante de zimógeno/proteasa que expresa vectores de ácido nucleico pueden utilizarse para el tratamiento de trastornos asociados con una coagulación sanguínea anormal.

C. Composiciones farmacéuticas Los vectores de expresión de la presente invención pueden incorporarse a composiciones farmacéuticas que pueden proporcionarse a un sujeto para permitir la producción de una proteína biológicamente activa (p.ej.: un polipéptido de la variante de zimógeno/proteasa o un fragmento funcional o derivado de ésta). En una realización particular de la presente invención, la hemostasia del sujeto puede verse influida por las composiciones farmacéuticas que contienen material genético suficiente para permitir que un receptor produzca una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la variante de zimógeno/proteasa. En forma alternativa, como se mencionó anteriormente, una cantidad efectiva del polipéptido de la variante del Factor X puede inyectarse directamente a un paciente que lo necesite. Las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con al menos un agente más, como un compuesto estabilizante, el cual puede administrarse en cualquier portador farmacéutico biocompatible estéril, incluidos, entre otros, solución salina, solución tampón, dextrosa y agua. Las composiciones pueden administrarse al paciente solas o combinadas con otros agentes (p. ej. cofactores) que influyen en la hemostasia. En realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas también contienen un excipiente farmacéuticamente aceptable. Estos excipientes incluyen cualquier agente farmacéutico que no induzca por sí mismo una respuesta inmune dañina en el individuo que recibe la composición, y que pueda ser administrado sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, líquidos como el agua, solución salina, glicerol, azúcares y etanol. Las sales farmacéuticamente aceptables también pueden incluirse entre ellos; por ejemplo, sales minerales ácidas tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfates y otras similares; y sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Además, las sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias reguladoras del pH y similares, pueden estar presentes en estos vehículos. Se incluye una discusión profunda sobre excipientes farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., 18th Edition, Easton, Pa.

[1990]). Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden formularse en soluciones acuosas, de preferencia en tampones fisiológicamente compatibles, como solución de Hanks, solución de Ringer o solución salina fisiológica tamponada. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones oleosas apropiadas para inyección. Los solventes o vehículos lipofílicos apropiados incluyen aceites grasos, como aceite de sésamo, o esteres sintéticos de ácidos grasos, como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. En forma opcional, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes apropiados que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones de alta concentración.

La composición farmacéutica puede proporcionarse en forma de sal y puede formarse con muchos ácidos, que incluyen, entre otros, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en solventes acuosos u otros solventes protónicos, que son las formas correspondientes de base libre. En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado que puede contener algunos de los siguientes componentes o todos ellos : 1 -50 mM de histidina, 0.1%-2% de sacarosa y 2%-7% de manitol, a un rango de pH de 4.5 a 5.5 que se combina con un tampón antes del uso. Luego de que las composiciones farmacéuticas se hayan preparado, pueden colocarse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento. Para la administración de vectores o polipéptidos que contienen zimógeno/proteasa, esta etiqueta debe incluir la cantidad, la frecuencia y la forma de administración. Las composiciones farmacéuticas apropiadas para ser usadas en la invención incluyen aquellas en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el objetivo terapéutico propuesto. La determinación de una dosis terapéuticamente efectiva depende de la aptitud de un médico capacitado para utilizar las técnicas y la orientación provistas en la presente invención. Las dosis terapéuticas dependerán, entre otros factores, de la edad y el estado en general del sujeto, la severidad del fenotipo aberrante de coagulación sanguínea, y la potencia de las secuencias de control que regulan los niveles de expresión del polipéptido de la variante de zimógeno/proteasa. Por lo tanto, una cantidad terapéuticamente efectiva en humanos se ubicará en un rango relativamente amplio, el cual podrá ser determinado por médico según la respuesta de un paciente en particular al tratamiento zimógeno/proteasa basado en vector.

D. Administración Los polipéptidos de la variante del factor X, solos o en combinación con otros agentes, pueden inyectarse directamente a un paciente en un portador biológico apropiado, según se describió anteriormente. Los vectores de expresión de la presente invención, que contienen secuencias de ácido nucleico codificadoras de la variante de zimógeno/proteasa, o fragmentos funcionales de ésta, pueden administrarse a un paciente por varios medios (ver más abajo) para alcanzar y mantener un nivel profiláctico o terapéutico efectivo del polipéptido de zimógeno/proteasa. Una persona con experiencia en el área puede determinar fácilmente los protocolos específicos correspondientes para el tratamiento terapéutico de un paciente en particular con los vectores de expresión codificadores de la variante zimógeno/proteasa de la presente invención. Los protocolos sobre la generación de vectores adenovirales y su administración a pacientes se han descrito en las patentes de los EE. UU. nros. 5,998,205; 6,228,646; 6,093,699; 6,100,242; y las solicitudes de patente internacional nros. WO 94/17810 y WO 94/23744., que se incorporan en su totalidad como referencia en este documento. Los vectores adenovirales que codifican la variante de zimógeno/proteasa de la presente invención pueden administrarse a un paciente a través de cualquiera de los medios conocidos. La administración directa de las composiciones farmacéuticas in vivo generalmente puede lograrse mediante una inyección con una jeringa convencional; aunque se estima que se desarrollarán otros métodos, como la administración potenciada por convección (Ver p. ej. la patente de los EE. UU. N.° 5,720,720). Con respecto a este tema, las composiciones pueden administrarse por vía subcutánea, epidérmica, intradérmica, intratecal, intraorbitaria, intramucosa, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, oral, intrahepática o intramuscular. Otros modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar, los supositorios y las aplicaciones transdérmicas. Un médico especializado en el tratamiento de pacientes con trastornos de coagulación sanguínea puede determinar la vía óptima para la administración de los vectores adenovirales que contienen secuencias de ácido nucleico de zimógeno/proteasa. Esta decisión se hará sobre la base de distintos criterios que incluyen, entre otros: el estado del paciente y el propósito del tratamiento (p. ej. mejoramiento o reducción de la coagulación sanguínea). La presente invención también abarca vectores AAV que contienen una secuencia de ácido nucleico codificadora de un polipéptido de la variante de zimógeno/proteasa. También se proporcionan vectores lentivirales o lentivirales de pseudotipo que contienen una secuencia de ácido nucleico codificadora de un polipéptido de la variante de zimógeno/proteasa. También se incluyen vectores de expresión o plásmidos desnudos que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la variante de zi mógeno/proteasa.

EJEMPLO 1 VARIANTE DEL ZIMÓGENO/PROTEASA FACTOR XA Una característica distintiva de la coagulación sanguínea es el procesamiento proteolítico de proteínas plasmáticas precursoras para afectar la activación. El paradigma para este mecanismo de activación es la transición de zimógeno a proteasa en la familia de serina proteasa similar a la quimotripsina. La escisión del enlace en un lugar muy protegido (Argl 5-Ilel 6; sistema de numeración de quimotripsina) revela un nuevo N-término que actúa como ligando intramolecular para Aspl94 (Figura 2). Este nuevo puente salino genera o está relacionado con un cambio y un orden conformacional del denominado "dominio de activación". Los bucles de superficie constan de: bolsillo de especificidad SI , agujero de oxianión, bucle de autolisis y lugar de unión de sodio (Figura 3). Se ha demostrado ampliamente en el sistema de tripsina que la formación del puente salino interno Ilel 6-Aspl94 está unida alostéricamente al sitio de especificidad S I ; es decir que los cambios en un lugar influyen en el otro lugar y viceversa. Los principios básicos de la transición de zimógeno a enzima activa para las serina proteasas en el nivel estructural - están ampliamente documentados, particularmente para la quimotripsina y la tripsina, y estos ejemplos sirven como paradigma para la familia de serina proteasa. Los aspectos generales pueden resumirse de la siguiente manera (ver Figura 2): 1) la estructura (~80%-85%) del zimógeno es relativamente similar a la de la proteasa; 2) la transición se inicia luego de la liberación de un N-término altamente protegido (por ejemplo, Ilel6-Val-Gly-Glyl 9); 3) el nuevo grupo a-amino libre (Hel ó) se entierra en un entorno hidrofóbico y su nitrógeno a-amino forma un puente salino interno con Aspl94; 4) la posición de Aspl 94 cambia significativamente con la activación del zimógeno, rotando -170°; y 5) este puente salino interno genera o está relacionado con un cambio conformacional en el llamado "dominio de activación"; los bucles expuestos a la superficie constan de residuos 16-19, 142-153, 184-194 y 216-223, y contienen parcialmente el sitio de especificidad S I (nomenclatura de Schechter and Berger (1967) Bochem. Biophys. Res. Comm. 43:694-702) y agujero de oxianión. Varios estudios indican que el zimógeno y la enzima madura existen en equilibrio, con Keq = -10 a favor del zimógeno. Bode y colegas han demostrado eficazmente que el tripsinógeno puede adoptar una estructura activa similar a la tripsina ante una fuerte unión del ligando para el bolsillo de especificidad SI o ante ligandos adecuados con alta afinidad para la hendidura Ilel 6. Ejemplos adicionales de esta inducción sin escisión del enlace Arg/Lysl5-Ilel6 incluyen la unión de la estreptocinasa con el plasminógeno, de la estafilocoagulasa con la protrombina, y de un recientemente descrito autoanticuerpo con la protrombina (Madoiwa et al. (2001) Blood 97:3783-3789). Estos estudios en conjunto indican que las serina proteasas, incluso en sus formas de zimógeno, pueden adoptar funciones similares a las de la proteasa según distintas condiciones ambientales, es decir, una fuerte unión del ligando al zimógeno. Se sabe con certeza que la activación del FX produce importantes cambios conformacionales en el dominio de la serina proteasa que son acompañados por la capacidad de la proteasa de unirse con una mayor afinidad a las sondas dirigidas al SI y al FVa unido a membrana (1-6). Se presume generalmente que el mecanismo molecular general que rige la transición de las serina proteasas imita al del sistema de tripsinas. Sin embargo, es posible que éste no sea el caso de manera uniforme. El APt de cadena simple emplea una estrategia molecular diferente para mantener su estado similar al zimógeno (8-1 1). El análisis de los pares de zimógenos/proteasas involucrados en la coagulación sanguínea, especialmente FVII/FVIIa, indica que existen numerosas diferencias en esta transición, en comparación con el sistema de tripsinas (12). Si bien diversos determinantes estructurales del FXa son parte del llamado dominio de activación, aún no está claro si la información sobre estos lugares está directamente relacionada con la transición de zimógeno a proteasa. Sin embargo, un modelo recientemente descrito del zimógeno FX sugiere que es posible que varios de estos elementos estén desordenados en el zimógeno (13). La comparación entre el modelo del zimógeno y la enzima activa revela que los residuos que componen Ca2+ (Asp70-Glu80), Na+ (Alai 83-Asp 194; GH219-GH226) y los bucles de autolisis (Trl44-Argl 50) sufren cambios importantes en sus posiciones principales luego de la transición de zimógeno a proteasa. Dado que ya está bien documentado, al menos para tripsinógeno/tripsina, que el sitio de especificidad S I y la formación de Ilel6-Aspl 94 están relacionados alostéricamente, es razonable plantear como hipótesis que otros elementos del dominio de activación también están relacionados con la transición de zimógeno a proteasa. En el ejemplo actual, hemos diseñado experimentos para probar la hipótesis de que la desestabilización del puente salino interno Ilel 6-Aspl 94 mediante cambios en las posiciones 16, 17 ó 194 altera la hendidura del sitio activo, lo que provoca que la variante resultante sea "similar al zimógeno". Además, planteamos la hipótesis de que estos cambios modularán alostéricamente la unión al FVa.

Materiales y métodos Expresión del factor Xa Si bien existen varias publicaciones sobre la expresión del rFX, la mayoría se basa en versiones truncadas o no ha podido proporcionar la caracterización adecuada (15-20). Nuestros intentos iniciales de expresar el rFX en la línea celular embrionaria de riñon humano (HEK) 293 dieron como resultado niveles de expresión de 1 -2 mg rFX/L de medio condicionado. Sin embargo, se comprobó que solo entre el 10% y el 40% del material producido estaba totalmente carboxilado en posición gamma (21). El resto del material no revelo carboxilacion en posición gamma. Aprovechamos las diversas afinidades de unían de los propiptidos dependientes de la vitamina K para la carboxilasa, y planteamos la hipótesis de que debido a que el propiptido de protrombina demuestra la menor afinidad para la carboxilasa, el intercambio del propiptido del FX (mayor afinidad) con el de la protrombina puede fortalecer la carboxilacion en posición gamma, ya que permite una mayor regeneración de sustratos (22, 23). Mediante este nuevo vector, se seleccionaron y expandieron los transfectantes estables de las células HEK 293, y el rFX se purificó mediante cromatografía de inmunoafinidad. La elución del fosfato del hidroxiapatito se utilizó para separar el material carboxilado del material no carboxilado. Nuestros resultados, obtenidos a partir de mas de 30 lvneas celulares estables, indican que, en promedio, ~80%-90% del rFX esta totalmente carboxilado en posición gamma, en comparación con el 10% a 40% obtenido con propiptido del FX nativo. Estos resultados se publicaron recientemente y esta estrategia se empleó posteriormente en al menos un laboratorio diferente (24, 25). De este modo, utilizamos este nuevo sistema de expresión y producimos cantidades en miligramos de protevna para estudios de estructura / función detallados (15-25 mg del rFX totalmente carboxilado en posición gamma de ~10 L de medio condicionado).

Ensayos con enzimas Las concentraciones de las enzimas se determinaran mediante titulación del lugar activo con p-nitrofenil p-guanidinobenzoato (Ha) o mono-p-guanidinobenzoato de fluorescevna (FXa) (26, 27). La actividad de los sustratos cromogénicos del FXa en presencia o ausencia de diversos inhibidores se medirá a partir de las velocidades iniciales de la hidrólisis de FXa Spectrozyme, S-2222 o S-2765, tal como se describió anteriormente (14). Los parámetros cinéticos se determinarán mediante la adecuación de los mínimos cuadrados de los datos de velocidad inicial a las ecuaciones correspondientes.

Generación de variantes del FXa Los mutantes del FX se generaron utilizando el equipo de mutagénesis de cambio rápido sitio-dirigida (Stratagene) y se secuenció todo el ADNc del FX para verificar la identidad del producto. Las diversos plásmidos se transfectaron temporalmente en células HEK 293 con Lipofectamina-2000. Una vez transcurridas 48 horas de la transfección, se recogió el medio y se determinaron los niveles de antígeno del FX mediante ensayo ELISA específico para FX; además, se valoró la actividad del FXa mediante ensayo cromogénico antes de la activación por RVV-X o FVIIa-factor tisular.

RESULTADOS La generación de especies del FXa distribuidas a lo largo de la vía de transición de zimógeno a proteasa se muestra en la Tabla 1. Los resultados de la transfección temporal indican que generamos una serie de variantes del FXa con cantidades variables de actividad, que abarcan desde -25% a <1%. Planteamos la hipótesis de que es probable que estas diferencias en actividad reflejen las variantes del FX que cambian en diversos grados a lo largo de la transición de zimógeno a proteasa. Expresado de otra manera, el puente salino interno Ilel 6-Aspl 94 se estabiliza en diversos grados según el aminoácido que se encuentre en las posiciones 16, 17 ó 194. Hemos elegido tres de estas variantes (rFXal lóL, FXallóG y FXaV17A) para caracterizarlas más detalladamente.

Table 1 : Activation of Various rFX Variants with RW-X and TF-FVHa Activation of FX with RW-X: Activation of FX with TF-FVIIa: Constructs TFXKn l % wt-Antiaen * FXa Activitv (nM) :% wt "FXa Activitv (nM) c% wt rwt-FX 54.07 100.00 10.95 100.00 18.905 100.00 Me16?Leu 24.88 46.03 0.25 5.00 0.572 6.57 He16?P e 49.48 91.51 0.01 0.08 0.004 0.02 Me16?Asp 12 04 22.27 0.01 0.22 0.000 0.00 lle16?Gly 27.88 51.56 0.00 0.05 0.037 0.38 Val17?Leu 28.18 52.12 1.22 21.33 3.003 30.48 Val17?Ala 55.88 103.36 0.34 3.02 1.029 5.27 Val17?Gly 47.76 88.34 0.02 0.21 0.036 0.22 Asp194->Asn 17.32 32.04 0.03 0.79 0.000 0.00 Asp194?Glu 30.97 57.29 0.02 0.27 0.000 0.00 a Los niveles de antígenos se calculan a partir de un ensayo ELISA específico para FX y se expresan como nM FX b Los niveles de actividad del FXa se basan en la velocidad de la hidrólisis del sustrato de peptidilo después de la activación por RW-X o FT-FVIIa de una determinada vanante del FX, y se comparan las velocidades iniciales de la hidrólisis con una curva estándar del FXa. c % wt valúes are based upon comparison to wt-FXa activity levéis. The valúes have been adjusted for antigen levéis.

Se establecieron líneas celulares estables de las células HEK 293 y se purificaron cada uno de los zimógenos a partir de 10L de medio condicionado (14, 24). Se activaron las variantes con RVV-X y se purificaron posteriormente mediante cromatografía de filtración en gel (14, 24). El análisis SDS-PAGE de las variantes anteriores y posteriores a la activación (reductor y no reductor) se muestra en la Figura 4. Nos concentramos inicialmente en evaluar los cambios del entorno del sitio activo de cada una de las variantes utilizando sondas específicas dirigidas a esta región del FXa. Los estudios cinéticos con sustratos de peptidilo y sondas dirigidas al sitio activo revelaron que el FXallóL y el FXaV17A tienen una capacidad reducida para unirse a estas sondas (valor entre 15 y 25 veces mayor en Km o Ki), mientras que la velocidad de catálisis (kcat) fue 3 veces menor en comparación con el FXa en estado natural (derivado del plasma y recombinante) (Tablas 2 y 3). Ninguna de las sondas examinadas inhibió al factor Xa I16G, y la actividad cromogénica de dicho factor se redujo notablemente (entre 500 y 1000 veces), lo que descarta el cálculo de los parámetros cinéticos. Estos datos coinciden con la idea de que la desestabilización de la formación del puente salino interno (Ilel6-Aspl94) influye en la unión en el sitio de especificidad SI . En contraste con estos resultados, el ensamblaje del FXal l óL y el FXaV17A con el complejo protrombinasa recuperó casi por completo el Km para los sustratos de peptidilo, mientras que la kcat mantuvo un valor 3 veces menor, lo que indica que la unión al FVa puede recuperar la unión en el sitio activo (Tablas 2 y 3). Sorprendentemente, incluso el valor de Km para I 16G se recuperó casi por completo (valor 3 veces mayor en comparación con el FXa en estado natural) cuando se lo ensambló con el complejo protrombinasa. No obstante, se detectó un valor de la kcat 60 veces menor. Table 2: Kinetic constante for chromogenic substrate cleavage Enzyme Specíes Km (µ?) ± SD kcat (seg 1) ± SD Factor Xa rwtFXa 88.8 + 1 1.4 215 ± 13.5 rFXav17A 1377 + 332 71.6 ± 13.5 rFXal16L 15X 1 149 + 244 3X 57.3 ± 3.1 rFXal16G 1608 ± 423 0.28 ± 0.05 Pro thrombinase rwtFXa 130 + 11 141 ± : 3.7 rFXav17A 362 + 42 3X 68.2 ± 9.7 rFXal16L 3X 296 + 54 32.5 ± 3.1 rFXal16G 433 + 31 60X 1.92 ± 0.05 En los experimentos en los que se utilizó el factor Xa libre se incubaron 2,0 nM de factor Xa en estado natural, ó 6,0 nM de factor Xa mutante con concentraciones en aumento de FXa Spectrozyme; en los experimentos en los que se utilizó el complejo protrombinasa se incubaron 5,0 nM de factor Xa en estado natural o mutante con 30 nM de factor Va, 50 µ? de PCPS y concentraciones en aumento de sustrato (entre 10 y 500 µ?). Chromogenic activity was assessed by monitoring the increase in absorbance at 405 nm over time. The errors in the fitted constants represent 95% confidence limits.

En consonancia con estos datos, los estudios cinéticos con protrombina revelaron que los valores de Km obtenidos para cada una de estas variantes ensambladas con el complejo protrombinasa eran prácticamente equivalentes a la enzima en estado natural, mientras que los valores de la kcat se redujeron de manera similar a los sustratos cromogénicos (Tabla 4). Si los consideramos de manera conjunta, nuestros resultados indican que la transición de zimógeno a proteasa para el FX no sólo influye en la formación del sitio SI, sino que también contribuye considerablemente a la formación de un sitio de unión al FVa. Dado que la unión directa de estas variantes del FXa al FVa recupera la unión en el sitio S 1 , es probable que exista un enlace alostérico entre estos sitios. En conjunto, los estudios han mostrado una única manera de modificar la vía de transición de zimógeno a proteasa, y han revelado una vía posible de desarrollo de enzimas similares al zimógeno que se "activen" después de una unión fuerte del ligando, como por ejemplo, las proteínas portadoras de un cofactor. Table 3: Kinetic constante for inhibition of FXa and prothrombinase Enzyme Species K¡ (µ?) ± SD k2 (NT1 s 1) t SD x IO3 Factor Xa Pefabloc tPa Xa Para-amino benzamidine Antithrombin III rwtFXa 0.070 ± 0.002 78.1 ± 1 .5 1.37 ± 0.02 rFXav17A 1.695 ± 0.072 996 ± 37 1 Qy 0.09 ± 0.003 rFXaii6L 25X 11X 1.701 ± 0.065 726 ± 40 ? 3? 0.06 ± 0.001 Prothrombinase rwtFXa 0.050 ± 0.002 48.6 ± 0.6 0.28 ± 0.01 rFXav17A cv 0.295 ± 0.013 191 ± 6.4 4? rFXal16L 5X 3X 0.05 ± 0.001 0.209 ± 0.005 143 ± 9.0 0.09 ± 0.003 Table 4: Kinetic constants for prothrombin cleavaqe Km ± SD Vmáx/Et ± SD Vmáx Et ¦ Km Especies de enzimas (µ?) (nM lla/min/nM E) (µ?'1 · S'1) pdFXa 0.42 ± 0.02 2424 ± 54 96 rFXa 0.35 ± 0.01 1937 ± 26 92 FXav17A 0.47 ± 0.03 887 ± 26 3X 31 FXa,16L 0.31 ± 0.02 619 ± 14 33 Los resultados obtenidos con el sustrato cromogénico y los inhibidores activos sitio-dirigidos indican que las variantes del FXa similares al zimógeno se unen a sondas de sitio activo con afinidad reducida. Sin embargo, el ensamblaje de estas variantes con el complejo de protrombinasa mejora notablemente la afinidad para las sondas de sitio activo, lo que sugiere que la unión al FVa puede recuperar la unión en el sitio activo. Posteriormente, investigamos si ocurría los mismo con el proceso inverso, es decir, si la ocupación del sitio activo similar al zimógeno influye sobre la unión al FVa. Para poder evaluar esta hipótesis, medimos las constantes de unión entre FVa y FXal l óL y FXaV 17A. Para lograr esto, incubamos el FVa con un derivado fluorescente del wtFXa inactivo en presencia de vesículas fosfolípidas sintéticas y iones Ca2+. La formación del complejo produce el aumento de la señal fluorescente con relación al FXa fluorescente solo. A continuación, agregamos concentraciones cada vez más altas de un FXa no fluorescente el cual, si puede unirse al FVa, desplazará al FXa fluorescente y reducirá la señal fluorescente. Agregamos como control el S I 95 A FXa como competidor. Este muíante es inactivo porque le falta el Ser de la tríada catalítica, pero tiene gran afinidad para el FVa (Tabla 5). En contraste, cuando agregamos el FXall óL o el FXaV 1 7A, la afinidad de estas variantes similares al zimógeno para el FXa se redujo notablemente en comparación con el FXaS 195A (Tabla 5). A continuación, examinamos si la ocupación covalente del sitio activo del FXall óL podía recuperar la unión al FVa. Para hacer esto, modificamos el sitio activo del FXa en estado natural y del FXallóL con un inhibidor irreversible (EGR-clorometil cetona) y luego repetimos el experimento. Los datos muestran que el sitio activo bloqueó las membranas del FVa unidas al FXal l óL con la misma afinidad con que el sitio activo en estado natural bloqueó el FXa. Esto indica que la ocupación del sitio activo del FXa similar al zimógeno influye directamente en la unión al FVa.

Table 5: Equilibrium binding constants for prothrombinase assembly Enzyme species Kd ± SD (nM) 1.34 ± 0.17 7.25 ± 0.65 13.81 ± 1.07 1.80 ± 0.42 1.92 ± 0.20 En virtud de la observación de que los derivados del FXa similares al zimógeno tienen poca reactividad con sondas e inhibidores dirigidos al sitio activo en ausencia del FVa, pero, aparentemente, tienen actividad casi normal cuando las variantes se ensamblan con el complejo pro trombi nasa, evaluamos a continuación la actividad del FXal 16L en un entorno de plasma. El plasma hemofílico A (no se muestran los datos) o B se marcó con FXa en estado natural para corregir el tiempo de coagulación (TTPa) de estos plasmas. 0,1 nM del wtFXa tuvo un tiempo de coagulación de -32 segundos. El agregado de la misma concentración de FXallóL tuvo un tiempo de coagulación de -42 segundos, que representa entre -50% y 70% de la actividad con relación al wtFXa, lo que sugiere que esta variante similar al zimógeno tiene actividad de coagulación en el plasma prácticamente normal. A continuación, monitoreamos la vida media del FXa en estado natural y el FXal l óL en el plasma de hemofilia B. Las proteínas se agregaron al plasma HB en distintos momentos, se extrajo una alícuota de la mezcla y se la evaluó en un ensayo basado en TTPa. Los resultados con el plasma HB muestran que la actividad residual relativa del FXa en estado natural se inhibió rápidamente (<2 min) (Figura 6). Sin embargo, la actividad del FXal l óL continuó durante un período mucho más prolongado, con una vida media estimada de >2 horas. Se detectaron resultados similares con el plasma de hemofilia A. Estos resultados sugieren que es posible modular las características de una enzima de modo tal que tenga una vida media prolongada en el plasma y pueda corregir el tiempo de coagulación de un plasma hemofílico. A continuación evaluamos la capacidad del FXal l óL similar al zimógeno para modular la hemostasia en un modelo murino de hemofilia (Schlachterman, et. al., 2005, J. Thromb. Haemost., 3, 2730-2737). El valor de TTPa de ratones con hemofilia B (C57BL/6) es de aproximadamente entre 50 y 55 segundos. El factor Xall óL (200 g kg; n = 7) o la solución salina tamponada con fosfato (PBS) (n = 4) se inyectaron en ratones con hemofilia B por la vena de la cola. En momentos seleccionados (5 y 30 min), se extrajo sangre y se realizó un TTPa en todas las muestras. Tal como se muestra en la Figura 7, la infusión del FXal 16L originó una corrección total del TTPa hasta los niveles observados en animales normales. Este efecto se mantuvo durante al menos 30 minutos, lo que indica que la molécula tiene una vida media relativamente prolongada in vivo. La infusión de la PBS sólo tuvo un efecto marginal. Estos datos coinciden con los experimentos con plasma in vitro que se mencionaron anteriormente, e indican que el FXall óL, y tal vez otras variantes del FXa similares al zimógeno, pueden realmente modular la hemostasia in vivo de manera efectiva. Para probar aún más la efectividad del FXal l óL in vivo, analizamos si esta molécula podía corregir el tiempo de hemorragia de ratones con hemofilia B luego de una herida en la cola (Schlachterman, et. al., 2005, J. Thromb. Haemost., 3, 2730-2737). La pérdida de sangre se midió durante 10 minutos luego del corte del extremo distal de la cola. En este tipo de ensayo, la pérdida de sangre es mínima en ratones Balb-c de tipo normal y en estado natural (n = 7) y bastante importante en ratones con hemofilia B (Balb c) a los cuales se les inyecta PBS (n = 6) después de la herida en la cola (Figura 8). En contraste con lo anterior, la inyección de 450 µg/kg de FXal l óL redujo notablemente la hemorragia total posterior a la herida en la cola (n = 7). Si los consideramos en conjunto, estos datos prueban que el FXall óL tiene la capacidad de mejorar la hemostasia en pacientes con hemofilia A o B. Si bien algunas de las realizaciones preferidas de la presente invención han sido descritas y específicamente ejemplificadas en lo que precede, no es nuestra intención que la invención se limite a dichas realizaciones. Pueden realizarse diversas modificaciones a dichas realizaciones sin necesidad de apartarse del alcance y el espíritu de la presente invención, tal como se establece en las siguientes reivindicaciones.

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Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una variante de zimógeno/proteasa Factor X/Factor Xa que modula la hemostasia.

2. La variante de zimógeno proteasa, tal como se la reivindica en la reivindicación 1, donde dicha variante es una variante de Factor X / Factor Xa codificado con la secuencia SEQ ID N.°: 2, donde los nucleótidos 1684-1695 de SEQ ID N.°: 2 pueden ser cualquier aminoácido con la condición de que los nucleótidos 1684-1866 no codifiquen los aminoácidos Val o Ala.

3. La variante de zimógeno/proteasa de la reivindicación 1 , que contiene al menos una modificación en la SEQ ID N.°: 1 seleccionada a partir del grupo compuesto por: a) lie en posición 16 es Leu, Phe, Asp o Gly; b) Val en posición 17 es Leu , Ala o Gly y c) Asp en posición 194 es Asn o Glu.

4. Un ácido nucleico que codifica la variante de zimógeno/proteasa de la reivindicación 3; dicho ácido nucleico también podrá codificar un lugar de escisión de las enzimas intracelulares PACE y furina.

5. Un ácido nucleico como el que se reivindica en la reivindicación 3, que tenga la secuencia SEQ ID N.°: 2, donde los nucleótidos en las posiciones 1684-1695 codifican los aminoácidos seleccionados a partir del grupo compuesto por Leu-Val-Gly, Gly-Val-Gly, lle-Ala-Gly, Phe-Val-Gly y Ile-Gly-Gly, y dicho ácido nucleico estará compuesto opcionalmente por nucleótidos en la posición 2233-2235 que codifican un aminoácido seleccionado a partir del grupo formado por Asn o Glu.

6. Una variante de zimógeno/proteasa codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. Una composición farmacéutica que incluye la variante del Factor Xa de la reivindicación 3 en un portador biológicamente compatible.

8. El ácido nucleico de la reivindicación 4 clonado en un vector de expresión.

9. El vector de la reivindicación 8, seleccionado a partir de un grupo compuesto por un vector adenoviral, un vector asociado al adenovirus, un vector retroviral, un plásmido y un vector lentiviral.

10. La variante de zimógeno/proteasa de la reivindicación 3, donde dicha variante presenta una afinidad de unión menor para el lugar activo que puede recuperarse cuando se une por un cofactor adecuado. 1 1. La variante de la reivindicación 20, donde dicho cofactor es el factor Va. 12. La utilización de una variante de zimógeno/proteasa Factor X/Factor Xa que modula la hemostasia y contiene al menos una modificación en la SEQ ID N.°: 1 seleccionada a partir del grupo compuesto por: a) lie en posición 16 es Leu, Phe, Asp o Gly; b) Val en posición 17 es Leu , Ala o Gly y c) Asp en posición 194 es Asn o Glu. en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos relacionados con la hemostasia. 13. La utilización según la reivindicación 12, donde dicha variante es un procoagulante y dicho trastorno se selecciona a partir del grupo compuesto por hemofilia A y B, hemofilia A y B asociada con anticuerpos inhibidores, deficiencia del factor de coagulación, deficiencia de la epóxido-reductasa Cl de la vitamina K, deficiencia de gamma-carboxilasa, hemorragia asociada con traumatismo, lesión, trombosis, trombocitopenia, derrame cerebral, coagulopatía, coagulación intravascular diseminada (DIC); trastornos por exceso de tratamientos anticoagulantes, síndrome de Bernard Soulier, trombastenia de Glanzman y deficiencia de agregación. 14. La utilización según la reivindicación 12, donde dicha variante es un anticoagulante y dicho trastorno se selecciona a partir del grupo formado por trombosis, trombocitopenia, derrame cerebral y coagulopatía. 15. La utilización según la reivindicación 12, donde los mencionados aminoácidos en las posiciones 16, 17 y 18 en SEQ ID N.°: 1 se seleccionan a partir del grupo compuesto por Leu-Val-Gly, Gly-Val-Gly, Ile-Ala-Gly, Phe-Val-Gly y Ile-Gly-Gly y el aminoácido en la posición 194 se selecciona a partir del grupo formado por Asn y Glu. 16. Una variante de zimógeno/proteasa Factor X/Factor Xa que modula la hemostasia y contiene al menos una modificación en la SEQ ID N.°: 1 seleccionada a partir del grupo compuesto por: a) lie en posición 16 es Leu, Phe, Asp o Gly; b) Val en posición 17 es Leu , Ala o Gly y c) Asp en posición 194 es Asn o Glu. para utilizarse en tratamientos de trastornos relacionados con la hemostasia.