KR20140005383A

KR20140005383A - 지혈을 조절하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20140005383A
Application number: KR1020137033906A
Authority: KR
Inventors: 로드니 엠 캐미어
Original assignee: 더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아
Priority date: 2005-11-15
Filing date: 2006-11-15
Publication date: 2014-01-14
Also published as: JP5823088B2; ECSP088452A; HK1128699A1; AU2006315175B2; ES2549929T3; US9410137B2; EP2431390A1; US20140120155A1; EP1948690A4; PT1948690E; EP2423224B1; ES2496567T3; KR101574042B1; SI1948690T1; US8383386B2; EP2423224A1; JP2009515559A; MX2008006313A; NZ568108A; WO2007059513A3

Abstract

본 발명은 인자 Xa 변이체 및 이의 사용 방법을 기재하고 있다.

Description

지혈을 조절하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING HEMOSTASIS}

본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 미국 가출원 제60/736,680호(2005년 11월 15일 출원)에 대해 우선권을 주장하며, 상기 가출원의 전체 내용은 그 전체가 개시된 것과 같이 본원에 참고로 포함된다.

35 U.S.C. §202(c)에 따라, 일부가 국립보건원의 지원금(승인 번호 PO1 HL-74124-01)으로 이루어진 본원에 기재된 발명에 대해 미국 정부가 소정의 권리가 있음을 승인하는 바이다.

기술 분야

본 발명은 의학 및 혈액학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 응고 작용의 단계적 반응(coagulation cascade)의 조절이 필요한 환자에게서 응고 작용의 단계적 반응을 조절하기 위한 신규한 응고 인자 X/Xa 작용제 및 이의 사용 방법을 제공한다.

본 발명이 속하는 종래 기술을 설명하기 위해 명세서 전반에 걸쳐 몇몇 간행물 및 특허 문헌들을 인용하였다. 이들 인용문헌의 각각은 그 전체가 개시된 것과 같이 참고로 본원에 포함된다.

응고 효소는 키모트립신 유사(chymotrypsin-like) 접힘 구조를 보유하는 프로테아제 중 S1 펩티다제 계열에 속하는 트립신 유사 효소이다. 응고 프로테아제는 서로에 대해, 그리고 소화 효소인 원형(ancestral) 세린 프로테아제에 대해 상동성이 높은 촉매 도메인을 포함한다. 응고 효소의 촉매 도메인 내의 잔기를 키모트립시노겐 내의 상응하는 잔기에 따라 번호를 매길 수 있을 정도로 구조적 상동성/동일성이 높다(>70%).

응고 효소는 활성화를 위해 단백질 가수분해 절단을 요구하는 비활성 전구체인 자이모겐으로서 혈액을 순환한다. 활성화 후 생성된 세린 프로테아제와 비교할 때 자이모겐은 약 10,000배 미만의 단백질 가수분해 활성을 보유한다. 혈관 손상의 부위에서 응고의 개시는 일련의 반응을 일으키는데, 이때 자이모겐이 특이적 단백질 가수분해 절단을 통해 프로테아제로 전환되고, 연속적인 반응을 위한 효소를 형성한다. 이것은 혈액 세포 활성화 및 불용성 피브린으로의 가용성 피브리노겐의 전환에서 최고조에 달하고, 이로 인해 응혈이 형성된다. 과량의 프로테아제는 "자살" 기질로서 작용하는 순환하는 프로테아제 억제제 또는 활성 효소를 인지하는 것들과 반응하여 제거된다. 따라서, 응고 자이모겐의 단백질 가수분해 활성화는 응고 작용의 단계적 반응의 핵심 조절 물질이다.

응고 자이모겐 중 몇몇은 이들의 개별적인 활성화 반응에서 2 이상의 부위에서 절단되지만, 프로테아제의 형성에는 단일 부위에서의 절단을 요구한다. 이 부위에서의 절단 및 이의 구조적 중요성은 키모트립시노겐을 기준으로 하는 상동성 넘버링 시스템(numbering system)과, 트립시노겐 및 트립신에 대해 행해진 구조에 관한 광범위한 연구 결과를 이용할 때 가장 용이하게 고려된다. 세린 프로테아제로의 자이모겐의 전환은 전형적으로 활성화 펩티드를 제거하고, Ile¹⁶으로 시작하는 촉매 도메인에서 새로운 N-말단을 노출하는 Arg¹⁵(전형적으로 Arg¹⁵ 및 Ile¹⁶ 사이의 결합) 다음의 절단을 필요로 한다. 일 예는 인자 X의 인자 Xa로의 전환이다(도 1 및 2 참조). 트립신 및 인자 Xa에서, 새로운 N-말단 서열은 Ile¹⁶-Val¹⁷-Gly¹⁸-Gly¹⁹로 시작한다. 다른 응고 효소의 경우, 새로운 N-말단 서열은 동일한 기본 구조상의 변이이다. 그 다음 N-말단 서열이 촉매 도메인으로 다시 접히고, "분자 성별(molecular sexuality)"로 언급되는 서열 특이적 방식으로 N-말단 결합 홈부 안으로 삽입된다. 도 2를 참조. 따라서, 교번하는 N-말단 서열을 가진 변이체는 유사한 방식으로 분자 성별을 겪을 가능성이 적다. N-말단 삽입은 촉매 도메인의 내부의 Ile¹⁶ 및 Asp¹⁹⁴의 α-NH₂ 기 사이에 염 다리의 형성을 초래한다. 염 다리 형성은, 도 3에 나타낸 소위 활성화 도메인의 재배열; 촉매 작용에 요구되는 옥시음이온 구멍의 형성 및 기질 결합 부위의 형성을 비롯한 촉매 도메인 구조의 다수의 변화와 관련이 있다. 이러한 변화는 활성 세린 프로테아제의 성숙을 유도한다. 활성 프로테아제의 성숙에 대한 분자 성별 및 염 다리 형성을 통한 새로운 N-말단의 서열 특이적 상호작용의 주된 기여는 다음과 같은 사실들: 활성화를 위해 절단을 요구하지 않는 박테리아 프로테아제는 Asp¹⁹⁴와의 염 다리 형성에 대한 촉매 도메인 내의 다른 측쇄를 이용한다는 사실; 매우 비효율적이지만, 트립시노겐을 절단하지 않고 홈부로 삽입하는 매우 높은 농도의 Ile-Val 디펩티드에 의해 프로테이나제 유사한 입체 구조(conformation)로 활성화할 수 있다는 사실; Val-Ile 디펩티드 및 다른 변이체는 매우 덜 효과적이라는 사실; 또한, N-말단 결합 홈부 안으로 삽입하는 이들 자체 N-말단의 공급을 통해 활성화 메커니즘을 파괴함으로써 절단하지 않고 응고 자이모겐을 활성화하는 박테리아 단백질의 예가 2가지 있다는 사실로부터 명백하다.

앞서 약술한 구조적 변화는 활성 세린 프로테아제로의 전구체 자이모겐의 전환에 대한 분자 설명을 제공한다. 하지만, Arg¹⁵에서의 절단 후에 완전한 활성을 나타내는 트립신과 달리, 대부분의 응고 효소는 이들의 단백질 기질에 대해 매우 불완전하게 작용한다. 그것들이 일반적으로 완전한 작용성 활성 부위를 가져 작은 펩티딜 기질을 제거할 수 있을지라도, 생물학적 기질의 효과적인 절단은 종종 보조 인자 단백질을 필요로 한다(도 2). 이 경우에, 보조 인자 단백질은 수천 배로 단백질 기질 절단율을 증가시킨다. 보조 인자 단백질의 기능에 관한 메커니즘이 규명될 문제로 남아있지만, 프로테아제를 더욱 효소형으로 만들어 더욱 효과적으로 함으로써 작용할 가능성이 작다. 하나의 예외를 가진 주된 요점은, 보조 인자가 선택적으로 프로테아제에 결합하고, 상응하는 자이모겐에 결합하지 않는다는 것이다. 예를 들어, 인자 Xa는 막결합 FVa에 높은 친화도로 결합하는 한편, 자이모겐 인자 X는 FVa에 결합하지 않는다.

환자의 상태에 따라, 향상되거나 또는 감소된 응고 작용을 가지는 변경된 응고 작용의 단계적 반응 단백질을 개발하는 것이 바람직할 수 있다. 치료제로서의 용도를 위해 그러한 단백질을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

발명의 개요

본 발명에 따르면, FX 자이모겐->프로테아제 전이 경로에서 조절 부위에 영향을 줌으로써 더 많은 "자이모겐 유사" FXa 종들의 생성을 유도하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 이를 필요로 하는 환자에게서 지혈을 조절하는 데 효과적이다.

일 구체예에서, 지혈을 조절하는 변이체 인자 X/인자 Xa 자이모겐/프로테아제를 제공한다. 바람직하게는, 변이체 자이모겐 프로테아제는 서열 번호 2에 의해 암호화되는데, 단, 서열 번호 2의 뉴클레오티드 1684∼1686은 Val 또는 Ala을 암호화하지 않는다면 서열 번호 2의 뉴클레오티드 1684∼1695는 임의의 아미노산일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 변이체 자이모겐/프로테아제는 a) 16번 위치의 Ile이 Leu, Phe, Asp 또는 Gly인 것; b) 17번 위치의 Val이 Leu, Ala, 또는 Gly인 것 및 c) 194번 위치의 Asp가 Asn 또는 Glu인 것으로 이루어진 군에서 선택된 서열 번호 1에서 1 이상의 변형을 포함한다. 본 발명의 변이체 자이모겐/프로테아제를 암호화하는 핵산은 또한 이의 용도로서 기재되어 있다. 이러한 뉴클레오티드는 경우에 따라 세포내 PACE/푸린 제거 부위를 암호화한다.

또 다른 구체예에서, 핵산은 서열 번호 2의 서열을 가지며, 이때 1684∼1695번 위치의 뉴클레오티드는 Leu-Val-Gly, Gly-Val-Gly, Ile-Ala-Gly, Phe-Val-Gly 및 Ile-Gly-Gly으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 암호화하고, 상기 핵산은 경우에 따라 Asn 또는 Glu으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 암호화하는 2233∼2235번 위치의 뉴클레오티드를 포함한다.

생물학적 적합성 담체 중에 본 발명의 인자 Xa 변이체를 포함하는 약학 조성물을 또한 제공한다. 본 발명의 다른 바람직한 면은 본원에 기재된 약학 조성물을 함유하는 변이체 인자 X/Xa 자이모겐/프로테아제를 치료상 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 요하는 환자에게서 지혈 관련 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 응고를 필요로 하는 질병의 치료에서 효능을 가져야 하며, 질병으로는 A형 및 B형 혈우병, 억제 항체와 관련된 A형 및 B형 혈우병, 응고 인자 결핍증, 비타민 K 에폭시드 환원효소 C1 결핍증, 감마-카복실라제 결핍증, 외상과 관련된 출혈, 손상, 혈전증, 혈소판 감소증, 발작, 응고장애, 파종성 혈관내 응고(DIC), 과도한 항응고 치료 장애, 베르나르 술리에 증후군, 글란즈만 혈소판 무력증 및 혈소판 저장 풀 결핍증(storage pool deficiency)이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

소정의 자이모겐/프로테아제 변이체는 항응고를 목적으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 이러한 장애는 혈전증, 혈소판 감소증, 발작 및 응고장애를 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일면에서, 대량 생성을 위하여 본 발명의 변이체 자이모겐/프로테아제를 발현하는 숙주 세포를 포함한다. 자이모겐 프로테아제 변이체의 단리 및 정제 방법 또한 개시하고 있다.

도 1은 인자 X의 프로세싱. 인자 X는 신호 서열 및 분비 전에 제거되는 프로펩티드를 갖도록 합성된다. 인자 X는 자이모겐이고, 어떠한 촉매 활성도 가지지 않는다. FX는 활성화 펩티드(AP)를 방출하는 Arg15-Ile16 결합에서의 절단 후에 인자 Xa로 전환된다.
도 2는 자이모겐의 프로테아제로의 전환. 인자 X에 대한 자이모겐->프로테아제 전이 및 인자 Xa의 프로트롬비나제로의 조립(FXa, FVa, 인지질 및 칼슘 이온). 이 효소는 프로트롬빈(II)을 트롬빈(IIa)으로 전환한다.
도 3은 FXa의 X-선 구조. 표준 배향으로 FXa의 촉매 도메인. 구조 영역은 중요한 잔기를 따라 표시된다. 문헌[Brandstetter et al. (1996) J. Biol. Chem.271:29988∼29992]에서 발췌.
도 4는 FX/Xa 변이체의 SDS-PAGE 분석. 4∼12% SDS-PAGE 겔을 비환원 또는 환원 조건하에 전개시키고, 코마시 블루로 염색하였다.
도 5는 인자 Xa의 아미노산(서열 번호 1) 및 핵산(서열 번호 2) 서열. 서열 번호 1에서 목적하는 변형을 위한 부위 및 아미노산 위치는 진하게 나타낸다.
도 6은 B형 혈우병 혈장에서 인자 Xa 활성. 야생형 FXa 또는 FXaI16L(2 nM)을 B형 혈우병 혈장에 투여하고, 선택된 시간 간격으로 샘플을 희석시키고(0.1 nM) aPTT 응고 검사로 평가하였다.
도 7은 aPTT의 보정. 인자 Xa-I16L(200 ㎍/kg; n = 7 마우스) 또는 PBS(n = 4 마우스)를 B형 혈우병 마우스(C57BL/6)에게 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 투입 후 5분 및 30분에, 채혈하여 aPTT 검사를 수행하였다. 붉은 점선은 정상적인 C57B1/6 동물의 aPTT 값을 나타낸다.
도 8은 B형 혈우병 마우스에서의 꼬리-클립 검사 후의 지혈 평가. 손상 후 A525 혈액 손실은 염수 중 헤모글로빈 함량으로 측정한다. 마우스의 수(Balb c)는 야생형(n = 7); HB-PBS(n = 6); 및 HB-FXaI16L(n = 7)이다.

단백질 가수분해는 혈액 응고의 필수적인 측면으로서, 정상적인 지혈을 조절하는 대부분의 메커니즘의 기초가 된다. 전구 보조 인자(procofactor) 및 자이모겐은 이들 각자의 거대분자 효소 복합체에서 임의의 유의적인 정도로 참여할 수 없다. 이것은 단백질 가수분해 활성화가 효소, 기질 및 보조 인자 결합 능력을 부여하는 부위의 발현을 유도하는 적당한 구조적 변화를 초래해야만 하는 것을 가리킨다. 전구 보조 인자 및 자이모겐 활성화에 대해서는 집중적으로 연구하고 있는 반면, 단백질 가수분해 및 기능을 부여하는 결합 부위의 발현 사이의 관계에 대한 이해는 불완전하다. 본 발명은 자이모겐 상태로부터의 전이를 수반하는 거대분자 결합 상호작용의 발현의 기초를 이루는 분자 메커니즘을 규명하는 모델 조성물 및 시스템을 제공한다.

인자 X(FX)¹은 혈액 응고에서 중심 역할을 하는 비타민 K-의존성 2개의 사슬 당단백질이다(도 1). 이 세린 프로테아제 자이모겐은 FXa를 산출하는 FX 방출 52개의 아미노산 활성화 펩티드에서 Arg¹⁵-Ile¹⁶을 자를 수 있는 결합을 절단하는 외인성(조직 인자/FVIIa) 및 내인성(FVIIIa/FIXa) 테나제 효소 복합체 둘 다에 대한 기질이다. 인자 Xa는 트롬빈으로의 프로트롬빈 전환을 책임지는 프로테아제이다(도 2). 인자 Xa가 완전히 유능한 프로테아제이고 프로트롬빈의 절단을 위한 촉매 장치를 보유함에도 불구하고, 그것은 이 반응에 대해 매우 부족한 촉매이다. 막 표면 상에서 보조 인자, 인자 Va와 이의 단단한 상호작용은 인자 Xa에 의해 촉진되는 다른 반응에 실질적으로 영향을 미치지 않고 트롬빈 형성률을 매우 증가시킨다. 차선의 분자 성별을 유도하는 Arg15 절단 부위를 수반하는 N-말단 서열(Ile-Val-Gly)에 대한 변화는 손상되거나 심지어 단백질 가수분해 활성이 0인 "자이모겐 유사" Xa 유도체를 산출할 것으로 기대된다. 이들 유도체는 항트롬빈 III과 같은 플라즈마 프로테아제 억제제에 의한 저해에 적절할 것으로 기대되지 않고, 그것들이 TFPI에 매우 잘 결합할 것을 예상되지 않기 때문에 혈관 손상을 수반하는 응고의 개시를 방해할 것으로 기대되지 않는다. 인자 Xa는 인자 Va에 단단하게 결합하는 반면 자이모겐 인자 X는 그렇지 않다. 따라서, 인자 Xa의 자이모겐 유사 형태는 Va를 더욱 약하게 결합하지만 충분히 높은 보조 인자 농도에서 완전히 구출되어 트롬빈 형성을 효과적으로 촉진할 것으로 기대된다. 이러한 특성들을 가지는 인자 Xa의 자이모겐 유사 형태는 다른 방법으로는 잠잠하나, 인자 Va에 대한 결합에 따라 트롬빈 형성을 촉진하는 능력을 보유하는 순환에서 수명이 긴 프로테아제로서 작용할 것으로 기대된다. 그것들은 완전한 작용성 야생형 FXa의 유입과 관련된 악영향 없이, 단계적 반응에서 다른 응고 인자의 결핍증을 우회하는 치료 응고제로서 제공할 잠재성을 가진다.

I. 정의:

본 발명의 생물학적 분자에 관계된 여러 가지 용어를 상기에서 사용하였고, 또한 명세서 및 청구항을 통해 사용한다.

어구 "변이체 자이모겐/프로테아제"는, FXa로 전환될 때 그것의 프로테아제 활성이 감소하거나, 또는 특정 보조 인자의 부재 시 "자이모겐 유사"는 보조 인자(예를 들어, 활성 부위에 대한 결합 친화도가 야생형 분자에서 관찰한 것보다 낮게 하는 유전적으로 변형된 개질 FX 자이모겐 또는 FXa 프로테아제를 가리킨다. 뚜렷하게, 이 친화도/활성은 이에 국한되는 것은 아니지만, 인자 Va를 비롯한 적당한 보조 인자의 존재하에 복구된다. 모체 FX 분자에서 아미노산 변경에 바람직한 부위는, 단 16번 위치의 아미노산이 발린 또는 알라닌이 아니라면, 위치 16번에서 이소루신의 치환, 17번 위치에서 발린의 치환 및 194번 위치에서 아스파르트산의 치환을 포함한다.

어구 "지혈 관련 질병"은 출혈성 장애, 예컨대 A형 및 B형 혈우병, 억제 항체가 있는 A형 및 B형 혈우병 환자, 응고 인자 VII, IX 및 X, XI, V, XII, II, 폰 빌레브란트 인자의 결핍증, 혼합된 FV/FVIII 결핍증, 비타민 K 에폭시드 환원효소 C1 결핍증, 감마-카복실라제 결핍증; 외상, 손상, 혈전증, 혈소판 감소증, 발작, 응고장애, 파종성 혈관내 응고(DIC)와 관련된 출혈; 헤파린, 저분자량 헤파린, 오당류, 와파린, 소분자 항혈전제(즉, FXa 억제제)와 관련된 과도한 항응고; 및 베르나르 술리에 증후군, 글란즈만 혈소판 무력증, 및 혈소판 저장 풀 결핍증과 같은 혈소판 장애를 가리킨다. 지혈 관련 질병은 또한 심정맥의 혈전증, 심장 혈관 질환 상태 또는 악성 종양과 관련된 혈전증, 유치도관(in-dwelling catheters) 또는 다른 침습적 수술 절차로부터 기인된 혈전증 및 루푸스와 같은 자가면역 질환과 관련된 혈전증과 같은 혈전성 장애와 관련된 출혈을 포함할 수 있다. 자이모겐/프로테아제 변이체는 또한 다양한 질환 상태로부터 발생하는 파종성 혈관내 응고 또는 소모성 응혈이상증을 가진 환자에게 필요한 지혈을 제공할 수 있다.

본 발명의 핵산과 관련하여, 용어 "단리 핵산"이 때때로 사용된다. DNA에 적용할 때, 이 용어는 유래된 유기체의 자연 발생 유전자에서 즉시 인접하는(5' 및 3'-방향) 서열로부터 분리되는 DNA 분자를 가리킨다. 예를 들어, "단리 핵산" 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 삽입되거나, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 DNA에 포함된 DNA 또는 cDNA 분자를 포함할 수 있다.

본 발명의 RNA 분자와 관련하여, 용어 "단리 핵산"은 위에서 정의한 바와 같이 주로 단리 DNA 분자에 의해 암호화된 RNA 분자를 가리킨다. 대안으로, 용어는 본 상태로(즉, 세포 또는 조직) 결합될 RNA 분자로부터 충분히 분리하여 그것이 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하도록 하는 RNA 분자를 가리킬 수 있다(용어 "실질적으로 순수한"은 하기에서 정의한다).

단백질과 관련하여, 용어 "단리 단백질" 또는 "단리 및 정제된 단백질"은 본원에서 때때로 사용된다. 이 용어는 주로 본 발명의 단리 핵산 분자의 발현에 의해 제조되는 단백질을 가리킨다. 대안으로, 이 용어는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하기 위하여, 단백질이 자연적으로 결합될 다른 단백질로부터 충분히 분리하는 단백질을 가리킬 수 있다.

용어 "프로모터 영역"은 유전자의 전사 조절 범위를 가리키는 것으로서, 암호화 영역의 5' 또는 3'-방향에서, 또는 암호화 영역 내에서, 또는 인트론 내에서 발견될 수 있다.

용어 "벡터"는 복제될 숙주 세포 안으로의 도입을 위해 그 안에 DNA 서열이 삽입될 수 있는 작은 담체 DNA 분자를 가리킨다. "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현에 필요한 필수 조절 범위를 가진 유전자 또는 핵산 서열을 함유하는 특성화된 벡터이다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 암호화 서열의 발현에 필요한 조절 서열이 암호화 서열이 발현될 수 있도록 암호화 서열에 대해 적당한 위치에 DNA 분자 내에 위치한다는 것을 의미한다. 이 동일한 정의는 때때로 발현 벡터에서 암호화 서열의 배치 및 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 및 종결 요소)에 적용된다. 이 정의는 또한 때때로 혼성 핵산 분자가 발생하는 제1 및 제2 핵산 분자의 핵산 서열의 배열에 적용된다.

용어 "실질적으로 순수한"은 50∼60 중량% 이상의 대상 화합물(예를 들어, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 단백질 등)을 포함하는 조제품을 가리킨다. 더욱 바람직하게는, 상기 조제물은 75 중량% 이상, 가장 바람직하게는 90∼99 중량%의 대상 화합물을 포함한다. 순도는 대상 화합물에 적당한 방법(예를 들어, 크로마토법, 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 분석 등)으로 측정한다.

특정 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 언급할 때 어구 "필수적으로 이루어진"은 주어진 서열 번호의 특성을 가진 서열을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 서열과 관련하여 사용하는 경우, 상기 어구는 서열 그 자체 및 서열의 기본적이고 신규한 특징에 영향을 미치지 않을 분자 변형을 포함한다.

본원에서 사용한 용어 "올리고뉴클레이티드"는 본 발명의 프라이머 및 프로브를 가리키고, 2 이상의 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 바람직하게는 3개 이상으로 구성된 핵산 분자로 정의된다. 올리고뉴클레오티드의 정확한 크기는 다양한 요인 및 올리고뉴클레오티드가 사용된 특정 분야에 따라 달라질 것이다.

본원에서 사용한 용어 "프로브"는 정제된 제한 효소 소화에서와 같이 자연적으로 발생하거나 또는 합성하여 제조된 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산, RNA 또는 DNA 중 하나를 가리키며, 프로브에 상보적인 서열을 가진 핵산과 어닐링하거나 또는 특이적으로 혼성될 수 있다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥 중 하나일 수 있다. 프로브의 정확한 길이는 온도, 프로브의 공급원 및 사용 방법을 비롯한 여러 가지 인자에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 진단상 적용에 있어서, 표적 서열의 복잡성에 따라, 올리고뉴클레오티드 프로브는 그것이 뉴클레오티드를 거의 함유할 수 없음에도 불구하고, 전형적으로 15∼25개 이상의 뉴클레오티드를 함유한다.

본원에서 프로브는 특정 표적 핵산 서열의 상이한 가닥에 "실질적으로" 상보적이 되도록 선택된다. 이것은 프로브가 미리 정해진 조건의 설정하에 이들 각각의 표적 가닥과 "특이적으로 혼성화"할 수 있거나 또는 어닐링할 수 있도록 충분히 상보적이어야 함을 의미한다. 그러므로, 프로브 서열 요구는 표적의 정확한 상보적인 서열을 반영하지는 않는다. 예를 들어, 비상보적인 뉴클레오티드 단편은 표적 가닥에 상보적인 프로브 서열의 나머지를 가지는 프로브의 5' 또는 3' 말단에 부착할 수 있다. 대안으로, 프로브 서열이 표적 핵산의 서열과 충분한 상보성을 가져서 그것과 특이적으로 어닐링한다면 비상보적인 염기 또는 더 긴 서열은 프로브 안으로 산재될 수 있다.

용어 "특이적으로 혼성되다"는 당분야에서 일반적으로 사용된 미리 정해진 조건하에 이러한 혼성화를 허용하는 충분히 상보적인 서열의 2개의 단일 가닥의 핵산 분자 사이의 결합을 가리킨다(때때로 "실질적으로 상보적인"이라고 함). 특히, 상기 용어는 본 발명의 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자 내에 함유된 실질적으로 상보적인 서열과 올리고뉴클레오티드의 혼성화, 비상보적인 서열의 단일 가닥 핵산과 올리고뉴클레오티드의 혼성화의 실질적인 배제를 가리킨다.

본원에서 사용한 용어 "프라이머"는 생물학적 시스템으로부터 유도되거나, 제한 효소 소화에 의해 발생하거나, 또는 합성하여 제조된 올리고뉴클레오티드, RNA 또는 DNA 중 하나, 단일 가닥 또는 이중 가닥 중 하나를 가리키는 것으로서, 적절한 환경에 놓일 때, 주형 의존성 핵산 합성의 개시제로서 기능적으로 작용할 수 있다. 적당한 핵산 주형과 함께 존재할 때, 핵산의 적절한 뉴클레오티드 삼인산염 전구체, 중합 효소, 적절한 보조 인자 및 적절한 온도 및 pH와 같은 조건, 프라이머는 폴리머라제의 활성 또는 유사한 활성에 의해 뉴클레오티드를 첨가하여 이의 3' 말단에서 연장시켜 프라이머 연장 생성물을 산출할 수 있다.

프라이머는 특정 조건 및 이용 요건에 따라 길이가 다양해질 수 있다. 예를 들어, 진단상 적용에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 길이가 전형적으로 15∼25개 이상의 뉴클레오티드이다. 프라이머는 목적하는 연장 생성물의 합성을 준비시키기 위한 목적하는 주형에 충분히 상보적이어야 한다, 즉, 폴리머라제 또는 유사한 효소에 의한 합성 개시에서 사용하기 위해 적당한 병렬로 프라이머의 3' 히드록실 부분을 제공하기에 충분한 방식으로 목적하는 주형 가닥과 어닐링할 수 있어야 한다. 프라이머 서열이 목적하는 주형의 정확한 보체를 나타낼 필요는 없다. 예를 들어, 비상보적인 뉴클레오티드 서열은 다른 상보적인 프라이머의 5' 말단에 부착할 수 있다. 대안으로, 연장 생성물의 합성을 위해 주형-프라이머 복합체를 기능적으로 제공하기 위해 프라이머 서열이 목적하는 가닥의 서열과 충분한 상보성을 가진다면, 비상보적인 염기는 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 내에서 산재될 수 있다.

용어 "동일성 퍼센트"는 핵산 또는 아미노산 서열 중의 비교와 관련하여 사용된다. 핵산 및 아미노산 서열은 종종 핵산 또는 아미노산의 상동 서열이 둘 사이의 차이점을 정의하는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 비교한다. 본 발명의 목적을 위해, 핵산 서열의 비교는 위스콘신주 메디슨의 유전학 컴퓨터 그룹으로부터 입수가능한 GCG Wisconsin Package Version 9.1을 사용하여 수행한다. 편의를 위해, 프로그램에 의해 명시된 디폴트 변수들(갭 생성 페널티 = 12, 갭 연장 페널티 = 4)을 본원에서 서열 동일성을 비교하기 위해 사용하고자 한다. 대안으로, 디폴트 변수들을 가진 틈이 많은 정렬을 이용하는, 국립생명공학센터에서 제공하는 Blastn 2.0 프로그램(ncbi.nlm.nih.gov/blast/에서 검색; [Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:403∼410)]을 핵산 서열과 아미노산 서열 사이의 동일성 및 유사성의 수준을 결정하는 데 사용할 수 있다.

II. 핵산 분자 및 폴리펩티드를 암호화하는 변이체 자이모겐-프로테아제의 제조

A. 핵산 분자

본 발명의 변이체 자이모겐/프로테아제를 암호화하는 핵산 분자는 재조합 DNA 기술 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 뉴클레오티드 서열 정보의 유효성은 다양한 수단에 의해 본 발명의 단리 핵산 분자의 제조를 가능하게 한다. 예를 들어, 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 당 분야에서 잘 알려진 표준 프로토콜을 이용하여 적당한 생물학적 공급원으로부터 단리될 수 있다.

본 발명의 핵산은 임의의 편리한 클로닝 벡터에서 DNA로서 유지될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 클론은 pBluescript(Stratagene, La Jolla, CA)와 같은 플라스미드 클로닝/발현 벡터에서 유지되고, 적절한 E. coli 숙주 세포에서 증식된다. 대안으로, 핵산은 포유류 세포에서 발현하기에 적절한 벡터에서 유지될 수 있다. 해독 후 변형이 자이모겐/프로테아제 활성(예를 들어, 인자 Xa)에 영향을 미치는 경우에, 포유류 세포에서 분자를 발현하는 것이 바람직하다.

일 구체예에서, 인자 X 자이모겐 변이체를 암호화하는 핵산은 세포내 단백질 가수분해 절단 부위의 삽입을 통해 더 변형될 수 있다. 포유류 세포에서 "활성화" 자이모겐 유사 FXa 변이체를 발현하기 위해, 세포내 단백질 가수분해 절단 부위는 변이체 FX 자이모겐 중 Arg15 및 16번 위치 사이에 삽입될 수 있다. 이러한 절단 부위는 Arg-Lys-Arg 또는 Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg을 포함한다. 이들 절단 부위는 세포 내에서 프로테아제(PACE/푸린 유사 효소)에 의해 효율적으로 인지되고, 절단된다. 이것은 분자 상의 중쇄가 이제 16번 위치에서 시작하는 처리된 변이체 FX(a)를 유발한다. 상기 위치에서 이 절단 부위의 도입은 FX∼FXa의 세포내 전환을 고려할 것이다.

다른 구체예에서, 완전한 52개의 아미노산 활성화 펩티드는 제거될 수 있고, 세포내 프로테아제 제거 부위는 변이체 FXa가 유발될 그것의 위치에서 도입될 수 있다.

마침내 이들 유형의 변형은 변형된 변이체 FX를 발현하는 세포로부터 변이체 FX의 "활성" 처리된 형태의 분비를 고려한다. 절단된 인자의 분비는 혈액 응고 또는 이어지는 단백질의 단리 동안 단백질 가수분해 절단에 대한 요구를 제거한다.

본 발명의 변이체 자이모겐/프로테아제 암호화 핵산 분자는 cDNA, 유전체 DNA, RNA, 및 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 이의 단편을 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자의 1 이상의 서열과 혼성시킬 수 있는 서열을 가진 올리고뉴클레오티드(DNA 또는 RNA의 센스 또는 안티센스 가닥)를 제공한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 자이모겐/프로테아제 발현을 검출하기 위한 프로브로서 유용하다.

B. 단백질

본 발명의 완전한 길이 또는 변이체 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드는 공지된 방법에 따라, 다양하게 제조할 수 있다. 단백질은 적당한 공급원, 예를 들어, 자이모겐/프로테아제를 발현하는 변형된 박테리아 또는 동물 배양된 세포 또는 조직으로부터 면역친화성 정제에 의해 정제할 수 있다. 하지만, 이것은 임의의 시간에 주어진 세포 유형에 존재하기 쉬운 소량의 단백질 때문에 바람직한 방법이 아니다.

변이체 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 유효성은 당업계에 알려진 발현 방법으로 이용하여 생체 밖에서 자이모겐/프로테아제의 생성을 가능하게 한다. 예를 들어, cDNA 또는 유전자는 생체 밖 전사를 위한 pSP64 또는 pSP65와 같은 적당한 생체 밖 전사 벡터로 클론될 수 있고, 맥아 또는 토끼 망상 적혈구 용해물과 같은 적절한 세포 유리 해독 시스템에서 세포 유리 해독을 수반한다. 생체 밖 전사 및 해독 시스템은 Promega Biotech, Madison, Wisconsin 또는 BRL, Rockville, Maryland로부터 시중에서 입수가능하다.

대안으로, 바람직한 구체예에 따라, 더 많은 양의 자이모겐/프로테아제를 적절한 원핵생물 또는 진핵생물 발현 시스템에서 발현에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 변이체 인자 Xa를 암호화하는 DNA 분자의 부분 또는 모두는 E. coli와 같은 박테리아 세포 또는 CHO 또는 Hela 세포와 같은 포유류 세포에서 발현을 위해 개조된 플라스미드 벡터에 삽입한다. 대안으로, 바람직한 구체예에서, 자이모겐/프로테아제를 포함하는 표지 융해 단백질을 생성할 수 있다. 이러한 자이모겐/프로테아제 표지 융해 단백질은 올바른 코돈 해독 틀에 결찰된 DNA 분자의 부분 또는 모두에 의해, E. coli와 같은 박테리아 세포 또는 이에 국한되지는 않지만 효모 및 포유류 세포와 같은 진핵생물 세포에서 발현을 위해 개조된 플라스미드 벡터로 삽입되는 목적하는 폴리펩티드 표지의 부분 또는 모두를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 암호화한다. 전술한 바와 같은 벡터들은 숙주 세포에서 DNA의 발현을 허용하도록 하는 방식으로 위치된 숙주 세포에서 DNA의 발현에 필요한 조절 요소를 포함한다. 발현에 요구되는 이러한 조절 요소는, 이에 국한되는 것은 아니지만, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 및 인핸서 서열을 포함한다.

재조합 원핵생물 또는 진핵생물 시스템에서 유전자 발현에 의해 제조된 변이체 자이모겐/프로테아제 단백질은 당업계에 알려진 방법에 따라 정제할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 시중에서 입수가능한 발현/분비 시스템을 사용할 수 있고, 이로 인해 재조합 단백질이 발현되고 그 후에 주변 배지로부터 용이하게 정제될 숙주 세포로부터 분비된다. 발현/분비 벡터를 사용하는 경우, 대안적인 접근은 그들의 N-말단 또는 C-말단에서 6∼8개의 히스티딘 잔기로 표지된 재조합 단백질의 단리를 위해 항체 재조합 단백질 또는 니켈 칼럼에 특이하게 결합하는 항체와의 면역학적 상호작용과 같은 친화성 분리에 의해 재조합 단백질을 정제하는 것을 포함한다. 대안적인 표지는 FLAG 에피토프, GST 또는 헤모글로빈 에피토프를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 능숙한 당업자가 일반적으로 사용한다.

전술한 방법으로 제조된 자이모겐/프로테아제 단백질은 표준 절차에 따라 분석할 수 있다. 예를 들어, 이러한 단백질은 알려진 방법에 따라 아미노산 서열 분석을 할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따라 폴리펩티드를 제조하는 편리한 방법은 발현 시스템에서 핵산의 이용에 의해 그것을 암호화하는 핵산을 발현하는 것이다. 본 발명의 방법을 이용하는 다양한 발현 시스템은 당업자들에게 잘 알려져 있다.

따라서, 본 발명은 또한 폴리펩티드(개시된 바와 같음)의 제조 방법, 폴리펩티드(일반적으로, 핵산)를 암호화하는 핵산으로부터의 발현을 비롯한 방법을 포함한다. 이것은 이러한 벡터를 함유하는 숙주 세포를 폴리펩티드의 생성을 유발하거나 허용하는 적당한 조건하에서 배양하여 편리하게 달성할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 망상 적혈구 용해물과 같은 생체 밖 시스템에서 제조할 수 있다.

III. 자이모겐/프로테아제 단백질 및 자이모겐/프로테아제 암호화 핵산의 용도

변형된 프로테아제 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 변이체 자이모겐/프로테아제 핵산을 본 발명에 따라, 예를 들어 혈액 응고 작용의 단계적 반응을 조절하는 치료제 및/또는 예방제(단백질 또는 핵산)로서 사용할 수 있다. 본 발명자들은 인자 X/Xa 자이모겐/프로테아제 분자가 응고를 증가시키고 효과적인 지혈을 제공할 수 있음을 발견했다.

A. 변이체 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드

본 발명의 바람직한 구체예에서, 변이체 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드는 생물학적 적합 운반체로의 주입을 통해, 바람직하게는 정맥내 투여를 통해 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 변이체 자이모겐/프로테아제는 경우에 따라 리포솜 안으로 포위되거나, 또는 다른 인지질 또는 마이셀과 혼합하여 분자의 안정성을 증가시킬 수 있다. 자이모겐/프로테아제는 단독으로 또는 지혈을 조절한다고 알려진 다른 제제(예를 들어, 인자 V, 인자 Va 또는 이들의 유도체)와 병용하여 투여할 수 있다. 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드를 전달하기에 적당한 조성물은, 이에 국한되는 것은 아니지만, 환자의 컨디션 및 혈액순환 상태를 비롯한 여러 가지 생리학적 변수들을 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 다른 적용 및 투여 경로에 잘 적응된 다양한 조성물은 당업계에 공지되어 있고, 이하에서 기술한다.

정제된 인자 X/Xa 유사체를 함유하는 조제품은 생리학적 허용 매트릭스를 함유하고, 바람직하게는 약학적 조제품으로서 조제한다. 조제품은 실질적으로 알려진 종래 기술 방법을 이용하여 조제할 수 있고, 그것은 NaCl, CaCl₂와 같은 염, 및 글리신 및/또는 리신과 같은 아미노산을 함유하고 pH 범위가 6∼8인 완충제와 혼합할 수 있다. 필요할 때까지, 인자 X/Xa 유사체를 함유하는 정제된 조제품은 완성 용액의 형태 또는 동결건조 또는 고냉동 형태로 저장할 수 있다. 바람직하게는, 상기 조제품은 동결건조된 형태로 저장하고, 적당한 재구성 용액을 이용하여 눈에 보이게 맑은 용액으로 용해시킬 수 있다.

대안으로, 본 발명에 따른 조제품은 또한 액체 조제품 또는 고냉동된 액체로서 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 조제품은 특히 안정하며, 즉 적용 전에 장시간 동안 용해된 형태로 존재할 수 있다.

인자 XIa, 또는 인자 X 유사체를 인자 Xa 또는 인자 Xa 유사체로 활성화할 수 있는 이의 유도체와 함께 인자 X 유사체를 함유하는 본 발명에 따른 조제품은 잠재적으로 소형화 칼럼 또는 프로테아제로 보완된 시린지의 형태로 매트릭스 상에 고정된 인 인자 XIa를 잡고 있는 용기, 및 인자 X 유사체를 가진 약학적 조제품을 함유하는 용기를 포함하는 혼합 조제품의 형태로 이용할 수 있다. 인자 X 유사체를 활성화하기 위해, 예를 들어 인자 X 유사체 함유 용액을 고정된 프로테아제에 대해 누를 수 있다. 조제품의 저장 동안, 인자 X 유사체 함유 용액을 바람직하게는 프로테아제로부터 공간적으로 분리한다. 본 발명에 따른 조제품을 프로테아제로서 동일한 용기에 저장할 수 있으나, 성분들은 조제품의 투여 전에 쉽게 제거할 수 있는 불침투성 부분에 의해 공간적으로 분리된다. 용액을 또한 분리된 용기에 저장하여, 투여 이전에 각각 다른 것과 단지 짧게 접촉시킬 수 있다.

인자 X 유사체는 직접적인 사용 직전에, 즉, 환자에게 투여하기 이전에 인자 Xa로 활성화할 수 있다. 활성화는 인자 X 유사체를 고정된 프로테아제와 접촉하도록 하거나, 또는 한편으로는, 프로테아제 및 인자 X 유사체를 함유하는 용액을 혼합함으로써 수행할 수 있다. 따라서, 용액에서 두 가지 성분을 개별적으로 유지하고, 성분들이 장치를 통과함으로써 서로서로 접촉하는 적절한 주입 장치 안에 그것들을 혼합하여 인자 Xa 또는 인자 Xa 유사체로 활성화를 유발하는 것이 가능하다. 따라서 환자는 인자 Xa와, 또한, 활성화를 책임지는 세린 프로테아제의 혼합물을 받는다. 본원에서, 세린 프로테아제의 별도의 투여가 또한 응고 시간을 단축할 수 있는 내인성 인자 X를 활성화하기 때문에 투여량에 세심한 주의를 기울이는 것이 특히 중요하다.

본 발명에 따른 조제품은 1 성분 조제품의 형태로 인자 Xa 활성을 가지거나 또는 복합성분 조제품의 형태로 다른 인자와 혼합한 약학적 조제품으로서 이용할 수 있다.

정제된 단백질을 약학적 조제품으로 가공하기 이전에, 정제된 단백질은 통상적인 품질 조절을 거치고, 발표된 치료제 형태로 형성한다. 특히, 재조합 제조 동안, 바람직하게는 EP 0 714 987에 기재된 방법을 이용하여 발현 벡터로부터 유도된 핵산뿐 아니라 세포성 핵산의 부재에 대하여 정제된 조제품을 테스트한다.

본 발명의 다른 특성은 안정성이 높고, 구조적으로 완전한 인자 Xa 유사체를 함유하고, 특히, 비활성 인자 X/Xa 유사체 중간체 및 자가단백질 가수분해 생성물이 없고, 전술한 유형의 인자 X 유사체를 활성화함으로써, 그리고 그것을 적당한 조제품으로 조제함으로써 제조할 수 있는 조제품을 이용하는 것에 관한 것이다.

약학적 조제품은 10∼1000 ㎍/kg, 더욱 바람직하게는 약 10∼250 ㎍/kg, 가장 바람직하게는 10∼75 ㎍/kg의 투여량을 함유할 수 있으며, 변이체 인자 X 폴리펩티드 40 ㎍/kg가 특히 바람직하다. 환자는 클리닉에서 출혈을 보이자마자 즉시 치료할 수 있다. 대안으로, 환자에게 1∼3시간마다 큰 환약을 유입하거나, 또는 충분한 개선이 관찰되면, 하루에 한번 본원에 기재된 변이체 인자 Xa를 유입할 수 있다.

B. 자이모겐/프로테아제 암호화 핵산

자이모겐/프로테아제 암호화 핵산은 본 발명에 따라 다양한 목적으로 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 발현 벡터가 본원에 기재된 변이체 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 작용성 단편을 포함하는, 혈액 응고를 조절하기 위한 핵산 전달 비히클(즉, 발현 벡터)을 제공한다. 환자에게 자이모겐/프로테아제 암호화 발현 벡터의 투여는 응고 작용의 단계적 반응을 바꾸도록 하는 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드의 발현을 유발한다. 본 발명에 따라, 자이모겐/프로테아제 암호화 핵산 서열은 그의 발현이 지혈을 증가시키는 본원에 기재된 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드를 암호화한다. 바람직한 구체예에서, 자이모겐/프로테아제 핵산 서열은 인간의 인자 Xa 폴리펩티드 변이체를 암호화한다.

변이체 X/Xa 자이모겐/프로테아제 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터는 단독으로, 또는 지혈을 조절하기에 유용한 다른 분자와 병용하여 투여할 수 있다. 본 발명에 따라, 발현 벡터 또는 치료제의 조합은 단독으로 또는 약학적 허용 또는 생물학적 적합 조성물로 환자에게 투여할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 변이체 자이모겐/프로테아제 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 바이러스 벡터는, 이에 국한되는 것은 아니지만, 아데노바이러스 벡터(조직 특이적 프로모터/인핸서가 있거나 없는), 복합 혈청형(예를 들어, AAV-2, AAV-5, AAV-7, 및 AAV-8)의 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 및 혼성 AAV 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 모조형(psudo-typed) 렌티바이러스 벡터[예를 들어, 에볼라 바이러스, 수포성 구내염 (VSV), 및 고양잇과의 면역결핍 바이러스(FIV)], 단순 포진 바이러스 벡터, 우두 바이러스 벡터, 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 변이체 자이모겐/프로테아제를 암호화하는 핵산 서열, 또는 이의 작용성 단편을 포함하는 바이러스 벡터의 투여 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서 사용하는 아데노바이러스 벡터는 바람직하게는 적어도 필수적인 부분의 아데노바이러스 벡터 DNA를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 아데노바이러스 벡터의 투여를 수반하는 변이체 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드의 발현은 지혈을 조절하기 위해 제공한다. 본원에 기재된 변이체 인자 Xa에 대해서, 이러한 투여는 프로테아제의 향응고 활성을 강화한다.

재조합 아데노바이러스 벡터는 다양한 유전자 치료 적용에 넓은 유용성을 발견했다. 이러한 적용에 대한 이들의 유용성은 대부분 다양한 기관 환경(organ context)에서 달성된 생체 내 유전자의 높은 효율 때문이다.

아데노바이러스 입자들은 적당한 유전자 전달을 위한 비히클로서 이롭게 이용할 수 있다. 이러한 비리온은 이러한 적용을 위한 다수의 목적하는 특성: 이중 가닥 DNA 외피비보유 바이러스가 되는 것과 관련된 구조적 특성 및 인간 호흡계 및 위장관에 대한 친화성과 같은 생물학적 특성이 있다. 더욱이, 아데노바이러스는 유형 수용체 조절 내포 작용에 의해 생체 내 및 생체 밖에서 매우 다양한 세포를 감염시키는 것으로 알려져 있다. 아데노바이러스의 감염이 인간에게서 약한 감기 비슷한 증상을 비롯한 최소의 질환 상태를 유발하는 것은 아데노바이러스 벡터의 전반적인 안정성의 증거가 된다.

이들의 큰 크기(약 36 킬로베이스)로 인해, 아데노바이러스 게놈은 그것들이 복제에 본질적인 아데노바이러스 유전자 및 비본질적인 영역의 제거를 수반하는 다른 DNA의 삽입을 조정하기 때문에 유전자 치료 비히클로서 사용을 위해 적당하다. 이러한 치환은 바이러스 벡터가 복제 활성 및 감염성과 관련하여 손상되게 한다. 또한, 아데노바이러스는 유전자 치료를 위한 벡터, 및 이종기원의 유전자의 발현을 위한 벡터로서 사용되어 왔다.

유전자 치료를 위해 이용한 아데노바이러스 벡터의 사용에 대한 보다 상세한 사항은 문헌[Berkner, 1988, Biotechniques 6:616∼629 및 Trapnell, 1993, Advanced Drug Delivery Reviews 12:185∼199]을 참조한다.

예를 들어 목적하는 유전자의 다중 복사본, 및 그에 따른 더 많은 양의 유전자 생성물을 제공할 수 있는 벡터를 도입하는 것이 바람직하다. 개선된 아데노바이러스 벡터 및 이러한 벡터의 제조 방법은 문헌[Mitani 및 Kubo (2002, Curr Gene Ther. 2(2): 135∼44); Olmsted-Davis 외 (2002, Hum Gene Ther. 13(ll):1337∼47); Reynolds et al. (2001, Nat Biotechnol. 19(9):838∼42); 미국 특허 제5,998,205호(다중 DNA 복사본을 포함하는 종양 특이적 복제 벡터를 제공함); 제6,228,646호(헬퍼가 없는, 전체적으로 불완전한 아데노바이러스 벡터를 기재함); 제6,093,699호(유전자 치료를 위한 벡터 및 방법을 제공함); 제6,100,242호(전이유전자 삽입된 복제 불완전한 아데노바이러스 벡터는 말초 혈관계 질환 및 심장 질환의 생체 내 유전자 치료에서 효과적으로 사용됨); 및 국제 특허 출원 WO 94/17810 및 WO 94/23744]을 비롯한 다수의 참고문헌, 특허 및 특허 출원에 상세하게 기재되어 있다.

어떠한 적용을 위해, 발현 구조체는 특정 세포 또는 조직 유형에서 발현을 추진하기 위해 제공하는 조절 요소를 더 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소들은 당업자들에게 잘 알려져 있고, 문헌[Sambrook et al. (1989) 및 Ausubel et al. (1992)]에서 상세하게 논의하고 있다. 본 발명의 발현 구조체에서 조직 특이적 조절 요소의 결합은 변이체 자이모겐/프로테아제 또는 이의 작용성 단편의 발현에 적어도 부분적으로 조직 친화성을 제공한다. 예를 들어, 거대세포 바이러스(CMV) 프로모터의 조절하에 변이체 자이모겐/프로테아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 E1 소실된 유형 5 아데노바이러스 벡터는 본 발명의 방법에서 유용하게 사용할 수 있다.

아데노바이러스 벡터를 제조하기 위한 대표적인 방법

재조합 유전자 발현을 위한 아데노바이러스 벡터는 인간 태아의 신장 세포주 293에서 제조되어 왔다(Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59∼72). 이 세포주는 그것이 아데노바이러스 5 게놈의 좌측 말단을 포함하기 때문에 E1 작용이 불완전한 아데노바이러스 2(Ad2) 및 아데노바이러스 5 돌연변이의 성장에 허용되고, 그러므로, E1 단백질을 발현한다. 293 세포주의 세포성 게놈으로 통합된 E1 유전자는 이들 유전자가 소실된 것으로부터 바이러스 벡터를 확대하기 위한 발현 시스템으로서 이들 세포의 사용을 촉진하는 수준으로 발현된다. 293 세포는 E1 돌연변이 단리 및 증식, 헬퍼 독립적 클로닝, 및 아데노바이러스 벡터의 발현에 대해 널리 사용되어 왔다. 그러므로, 293 세포주와 같은 발현 시스템은 트랜스로 필수적인 바이러스 활성을 제공하고, 이로 인해 외인성 핵산 서열이 E1 유전자로 치환되는 바이러스 벡터의 증식을 가능하게 한다. 문헌[Young et al. in The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York and London (1984), pp. 125∼172]을 참조.

아데노바이러스 벡터의 증식에 잘 적응된 다른 발현 시스템은 당업자들에게 잘 알려져 있고(예를 들어, HeLa 세포), 다른 경우에서도 검토되어 왔다.

변이체 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 전달 비히클과 개별적인 세포를 제공하는 단계 및 상기 세포들이 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 성장하도록 하는 단계를 포함하는 지혈 조절방법이 본 발명에 또한 포함된다.

전술한 토론으로부터, 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드, 핵산 벡터를 발현하는 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드는 비정상적인 혈액 응고와 관련된 질병의 치료에서 사용할 수 있음을 알 수 있다.

C. 약학 조성물

본 발명의 발현 벡터를 생물학적 활성 단백질(예를 들어, 변이체 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드 또는 작용성 단편 또는 이의 유도체)의 생성을 허용하기 위해, 대상에게 전달할 수 있는 약학 조성물에 혼합할 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 수령자가 치료상 유효량의 변이체 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드를 제조하기에 충분한 유전적 물질을 포함하는 약학 조성물은 대상의 지혈에 영향을 미칠 수 있다. 대안으로, 전술한 바와 같이, 유효량의 변이체 인자 X 폴리펩티드는 이를 필요로 하는 환자에게 직접 주입할 수 있다. 조성물은 단독으로, 또는 이에 국한되지는 않지만, 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 및 물을 비롯한, 임의의 멸균된 생체적합한 약학적 운반체에 투여할 수 있는 안정화 화합물과 같은 1종 이상의 다른 제제와 병용하여 투여할 수 있다. 조성물은 단독으로, 또는 지혈에 영향을 미칠 수 있는 다른 제제(예를 들어, 보조 인자)와 병용하여 환자에게 투여할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 약학 조성물은 또한 약학적 허용 부형제를 함유한다. 이러한 부형제는 그 자체가 조성물을 받는 개인에게 해로운 면역 반응을 유도하지 않고, 과한 독성 없이 투여할 수 있는 임의의 약학적 제제를 포함한다. 약학적 허용 부형제는, 이에 국한되는 것은 아니지만, 물, 염수, 글리세롤, 당 및 에탄올과 같은 액체를 포함한다. 약학적 허용 염, 예를 들어, 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산 염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산의 염이 또한 이에 포함될 수 있다. 또한, 습윤제 또는 유화제와 같은 보조제 물질, pH 완충 물질 등은 이러한 비히클에 존재할 수 있다. 약학적 허용 부형제에 대한 자세한 논의는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., 18th Edition, Easton, Pa. [1990])]에서 입수가능하다.

비경구 투여에 적절한 약학적 제형은 수용액, 바람직하게는 행크스 용액, 링거 용액, 또는 생리학적 완충 염수와 같은 생리학적 적합 완충제로 조제할 수 있다. 현탁 수용액 주사는 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점성을 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적당한 유성 주사 현탁액으로서 제조할 수 있다. 적절한 친유성 용매 또는 비히클은 참기름과 같은 지방산 오일, 또는 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포솜을 포함한다. 경우에 따라, 현탁액은 또한 고농축 용액의 제조를 위해 허용하는 화합물의 용해도를 증가시키는 적절한 제제 또는 안정제를 함유한다.

약학 조성물은 이에 국한되지는 않지만, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 비롯한 많은 산과 형성될 수 있는 염으로서 제공될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태보다는 수용액 또는 다른 양자성 용매에서 더욱 용해되는 경향이 있다. 다른 경우에, 바람직한 조제품은 사용하기 전에 완충제와 혼합된 4.5∼5.5의 pH 범위에서 하기의 것들: 1∼50 mM 히스티딘, 0.1%∼2% 수크로스, 및 2∼7% 만니톨 중 약간 또는 모두를 함유할 수 있는 동결건조된 분말이다.

약학 조성물을 제조한 후, 이것들을 적당한 용기에 넣고, 치료를 위해 라벨 표시할 수 있다. 자이모겐/프로테아제 함유 벡터 또는 폴리펩티드의 투여에 있어서, 이러한 라벨 표시는 투여량, 투여 빈도 및 투여 방법을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용하기에 적절한 약학 조성물은, 활성 성분이 의도된 치료상 목적을 달성하기 위해 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다. 치료상 유효한 투여량은 본 발명에서 제공한 지침 및 기술을 이용하여 숙련된 의사의 능력 내에서 잘 결정된다. 치료상 투여량은 다른 인자들 중, 대상의 나이 및 신체 조건, 비정상적인 혈액 응고 표현형의 정도, 및 변이체 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드의 발현 정도를 제어하는 조절 서열의 강도에 따라 달라질 것이다. 따라서, 인간에게서 치료상 유효량은 자이모겐/프로테아제계 벡터 치료에 대한 개별적인 환자의 반응을 기초로 하여 의사에 의해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위일 것이다.

D. 투여

단독으로 또는 다른 제제와 병용하는 변이체 인자 X 폴리펩티드는 전술한 적당한 생물학적 운반체로 환자에게 직접 주입할 수 있다. 변이체 자이모겐/프로테아제를 암호화하는 핵산 서열, 또는 이의 작용성 단편을 포함하는 본 발명의 발현 벡터를 다양한 수단(하기 참조)으로 환자에게 투여하여 예방상 및/또는 치료상 유효한 수준의 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드를 달성 및 유지할 수 있다. 당업자는 특정 환자의 치료상 치료를 위해 본 발명의 자이모겐/프로테아제 암호화 발현 벡터를 사용하는 데 특정 프로토콜을 용이하게 결정할 수 있다. 아데노바이러스 벡터의 생성 및 환자한테 투여하기 위한 프로토콜은 미국 특허 제5,998,205호; 제6,228,646호; 제6,093,699호; 제6,100,242호; 및 국제 특허 출원 WO 94/17810 및 WO 94/23744에 기재되어 있으며, 이것들은 참고로서 그 전체가 본원에 포함된다.

본 발명의 변이체 자이모겐/프로테아제 암호화 아데노바이러스 벡터는 임의의 알려진 방법에 의해 환자에게 투여할 수 있다. 생체 내 약학 조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 통상적인 시린지를 사용한 주입에 의해 수행할 수 있지만, 전달 강화 전달법과 같은 다른 전달 방법을 생각할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,720,720호 참조). 이와 관련하여, 조성물은 피하, 상피, 피내, 외피내(intrathecally), 안와내(intraorbitally), 근육내, 복막내, 정맥내, 동맥내, 경구, 간내 또는 근육내로 전달될 수 있다. 다른 투여 방식은 경구 및 폐 투여, 좌약, 및 경피성 적용을 포함한다. 혈액 응고 장애가 있는 환자의 치료에 전문인 임상학자는, 이에 국한되지는 않으나, 환자의 컨디션 및 치료의 목적(예를 들어 혈액 응고 향상 또는 감소)을 비롯한 다수의 기준을 기초로 하여 자이모겐/프로테아제 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터의 최선의 투여 경로를 결정할 수 있다.

본 발명은 또한 변이체 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 포함한다.

또한 변이체 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 또는 모조형 렌티바이러스 벡터를 제공한다.

또한 변이체 자이모겐/프로테아제 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 그대로의 플라스미드 또는 발현 벡터를 포함한다.

[실시예]

실시예 1

변이체 인자 XA 자이모겐/프로테아제

활성화에 영향을 미치기 위한 전구체 플라즈마 단백질의 단백질 가수분해 처리는 혈액 응고의 특징이다. 이 유형의 활성화 메커니즘에 대한 패러다임은 키모트립신 유사 세린 프로테아제 군에서 자이모겐->프로테아제 전이이다. 높은 보존 부위(Arg15-Ile16; 키모트립신 넘버링 시스템)에서 결합 절단은 Asp194에 대한 분자내 리간드로서 작용하는 신규 N-말단을 드러낸다(도 2). 이 새로운 염다리는 등각 변화 및 소위 "활성화 도메인"이라 불리는, S1 특이성 포켓, 옥시음이온 구멍, 자기분해 루프, 및 소듐 결합 부위로 이루어진 표면 루프의 순서(도 3)를 유발하거나 또는 이와 관련이 있다. Ile16-Asp194 내부의 염다리 형성이 S1 특이성 부위에 알로스테릭하게 연결되고; 한 부위에서 변화가 다른 부위 및 반대로 영향을 준다는 것이 트립신 시스템에서 잘 증명된다.

구조적 수준으로 세린 프로테아제에 대한 자이모겐의 활성 효소로 전이의 기본 원리는 특히 키모트립신 및 트립신에 대하여 잘 증명되고, 이들 예는 세린 프로테아제 군에 대한 패러다임으로서 제공한다. 일반적인 측면은 하기의 것들로 요약할 수 있다(도 2 참조): 1) 자이모겐의 구조(약 80∼85%)는 프로테아제와 비교적 유사하다; 2) 전이는 높게 보존된 N-말단(예를 들어, Ile16-Val-Gly-Gly19)의 유리를 수반하며 개시된다; 3) 새로운 유리 α-아미노기(Ile 16)는 소수성 환경에 매장되고, 이의 α-아미노 질소는 Asp194와 내부의 염 다리를 형성한다; 4) Asp194의 위치는 약 170°회전하는 자이모겐 활성화에 따라 확연하게 변화한다; 5) 이 내부의 염 다리는 "활성화 도메인", 잔기 16∼19, 142∼153, 184∼194, 및 216∼223로 이루어지고; S1 특이성 부위(nomenclature of Schechter and Berger (1967) Bochem. Biophys. Res. Comm. 43:694∼702) 및 옥시음이온 구멍을 부분적으로 포함하는 표면 노출된 루프에서의 등각 변화를 유발하거나 또는 이와 관련이 있다. 다양한 연구들은 자이모겐 및 성숙한 효소는 자이모겐 편에서 Keq = 약 10⁸와 평형으로 존재한다는 것을 보여준다. Bode와 동료들은 트립시노겐은 S1 특이성 포켓에 결합하는 강한 리간드 또는 Ile16 홈부에 대한 높은 친화도를 가진 적절한 리간드에 따라 활성 트립신 유사 구조를 채택할 수 있다는 것을 명쾌하게 논증하였다. Arg/Lys15-Ile16 결합의 절단 없는 이 유도의 부가적인 예는 플라스미노겐에 대한 스트렙토키나제의 결합, 프로트롬빈에 대한 스테필로코아굴라제의 결합을 포함하고, 최근에 프로트롬빈에 대한 자가항체의 결합을 기재하였다(Madoiwa et al. (2001) 혈액 97:3783∼3789). 집합적으로 이들 연구들은 세린 프로테아제, 심지어 이들의 자이모겐 형성에서도, 다양한 환경적 조건, 즉 자이모겐에 대한 강한 리간드 결합에 따라 프로테아제 유사 활성을 채택할 수 있다는 것을 가리킨다.

FX의 활성화는, 더 큰 친화도로 S1 지정 프로브 및 막 결합 FVa에 결합하기 위해 프로테아제의 능력을 수반하는 세린 프로테아제 도메인에서 주된 등각 변화를 유발한다고 알려져 있다(1∼6). 세린 프로테아제의 전이를 제어하는 전반적인 분자 메커니즘(들)은 일반적으로 트립신 시스템의 메커니즘을 따르는 것으로 추정된다. 하지만, 이것은 일정하게 그 경우는 아니다. 단일 사슬 tPA는 이의 자이모겐 유사 상태를 유지하기 위해 상이한 분자 전략을 사용한다(8∼11). 혈액 응고에 관여하는 자이모겐/프로테아제 한 쌍, 특히 FVII/FVIIa의 분석은 트립신 시스템에 비해 이 전이에 몇 가지 차이점이 존재한다는 것을 가리킨다(12). FXa 상의 몇 가지 구조적 결정자는 소위 활성화 도메인의 일부인 한편, 이들 부위의 형성이 자이모겐->프로테아제 전이에 직접 연결되는지가 현재 불명료하다. 하지만, 자이모겐 FX의 최근에 기재한 모델은, 이들 요소들 중 몇 가지가 자이모겐에서 혼란이 될 수 있다는 것을 제시한다(13). 활성 효소와 자이모겐 모델의 비교는 Ca² ⁺(Asp70-Glu80), Na⁺(Ala183-Aspl94; Gly219-Gly226) 및 자가분해 루프(Thr144-Arg150)로 구성되는 잔기가 자이모겐->프로테아제 전이에 따라 이들의 골격 위치에서 주된 변화를 겪는다는 것을 밝혀낸다. 이미 적어도 트립시노겐/트립신에 대해, S1 특이성 부위 및 Ile16-Asp194의 형성이 알로스테릭하게 연결되어 있다는 것이 잘 증명되었기 때문에, 활성화 도메인의 다른 요소들이 또한 자이모겐->프로테아제 전이에 연결되어 있다는 가설은 논리적이다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 16, 17, 또는 194번 위치에 변화를 주는 것에 의한 Ile16-Asp194 내부 염 다리의 불안정화는 결과적인 변이체 "자이모겐 유사"를 제조하는 활성 부위 홈부를 변경한다는 가설을 테스트하기 위해 실험을 고안하였다. 또한 본 발명자들은 이러한 변화가 FVa 결합을 알로스테릭하게 조절할 것이라고 가정하였다.

재료 및 방법

인자 Xa의 발현

rFX의 발현에 대한 문헌에서 몇 가지 보고가 있지만, 대부분은 불완전한 설명에 의존하거나 또는 명백한 특성화를 제공하지 않는다(15∼20). HEK 293 세포 중 rFX를 발현시키는 우리의 최초의 시도는 1∼2 mg 범위의 발현 정도로 조건 배지의 rFX/L을 유발한다; 하지만, 제조된 재료의 단지 10∼40%가 완전히 γ-카르복실화되는 것을 알아냈다(21). 남아있는 재료는 어떠한 γ-카르복실화도 나타내지 않았다. 우리는 카복실라제에 대한 비타민 K-의존적 프로펩티드의 상이한 결합 친화도를 이용하여, 프로트롬빈 프로펩티드가 카복실라제에 대해 최저의 친화도를 나타내기 때문에, FX의 프로펩티드(최고의 친화도)를 프로트롬빈의 것으로의 교환은 더 큰 기질 회전율을 고려함으로써 γ-카르복실화를 강화할 수 있다는 것을 가정하였다(22, 23). 이 새로운 벡터를 이용하여, HEK 293 세포의 안정한 형질전환체(transfectant)를 선별하고, 팽창시키고, 면역친화도 크로마토그래피에 의해 rFX를 정제하였다. 수산화인회석으로부터 인산염 용리는 카르복실화 재료를 비카르복실화 재료와 구분하는 데 사용하였다. 현재 30개 넘는 안정한 세포주로부터 얻은 우리의 결과는, 본래의 FX 프로펩티드를 사용한 10∼40%에 비해 rFX의 평균 약 80∼90%가 완전히 γ-카르복실화되는 것을 가리킨다. 이러한 결과들을 최근에 발표하였고, 이어서 이 전략을 1 이상의 다른 실험실에서 사용하고 있다(24,25). 따라서, 이 새로운 발현 시스템을 이용하여, 이제 상세한 구조/활성 연구를 위해 밀리그램 양(약 10 L의 조건 배지로부터 완전히 γ-카르복실화된 rFX 15∼25 mg)의 단백질을 제조하고자 한다.

효소 분석

효소 농도는 p-니트로페닐 p-구아니디노벤조에이트(IIa) 또는 플루오레세인 모노-p-구아니디노벤조에이트(FXa)로 활성 부위 적정하여 결정될 것이다(26, 27). 여러 가지 억제제의 존재 또는 부재하에, FXa 발색성의 기질 활성은 전술한 바와 같은 스펙트로자임 FXa, S-2222, 또는 S-2765의 가수분해의 초기 비율로부터 측정될 것이다(14). 역학적 변수들은 적당한 평형에 대한 초기 비율 데이터의 최소제곱 접합(least-squares fitting)에 의해 결정될 것이다.

FXa 변이체의 생성

FX 돌연변이체는 퀵-체인지(Quick-change) 부위 지정 돌연변이 생성 키트(Stratagene)를 사용하여 생성하였고, 생성물의 동일성을 증명하기 위해 전체 FX cDNA를 나열하였다. 여러 가지 플라스미드를 리포펙트아민-2000을 사용하여 HEK 293 세포들로 일시적으로 형질전환시켰다. 48 시간 형질전환 후, 배지를 수거하고, FX 항원 농도를 FX-특이적 ELISA를 이용하여 측정하고, 활성화 RVV-X 또는 조직 인자-FVIIa에 의한 활성화 전에 발색성 분석으로 FXa 활성을 평가하였다.

결과

자이모겐->프로테아제 전이 경로를 따라 분포된 FXa 종의 생성을 표 1에서 약술한다. 일시적인 형질전환 결과들은, 본 발명자들이 약 25% 이상 1% 미만의 범위로 변할 수 있는 활성 양을 가진 일련의 FXa 변이체를 생성하였음을 가리킨다. 본 발명자들은, 이러한 활성 차이가 자이모겐->프로테아제 전이를 따라서 다양한 정도로 위치 이동되는 FX 변이체를 쉽게 반영하는 것임을 가정한다. 다르게 말하자면, Ile16-Asp194 내부 염 다리는 16, 17 또는 194번 위치의 아미노산에 따라 다양한 정도로 안정화된다. 본 발명자들은 추가의 특성화를 위해 이들 변이체들 중 세 가지(rFXaI16L, FXal16G 및 FXaV17A)를 선택하였다.

RVV -X 및 TF - FVIIa 를 사용한 여러 가지 rFX 변이체의 활성

			RVV-X를 사용한 FX의 활성화:		TF-FVIIa를 사용한 FX의 활성화:
구조체	^a[FX](nM)	중량%-항원	^bFXa 활성 (nM)	^c중량%	^bFXa 활성 (nM)	^c중량%
rwt-FX	54.07	100.00	10.95	100.00	18.905	100.00
Ile16→Leu	24.88	46.03	0.25	5.00	0.572	6.57
Ile16→Phe	49.48	91.51	0.01	0.08	0.004	0.02
Ile16→Asp	12.04	22.27	0.01	0.22	0.000	0.00
Ile16→Gly	27.88	51.56	0.00	0.05	0.037	0.38
Val17→Leu	28.18	52.12	1.22	21.33	3.003	30.48
Val17→Ala	55.88	103.36	0.34	3.02	1.029	5.27
Val17→Gly	47.76	88.34	0.02	0.21	0.036	0.22
Asp194→Asn	17.32	32.04	0.03	0.79	0.000	0.00
Asp194→Glu	30.97	57.29	0.02	0.27	0.000	0.00
a 항원 농도는 FX-특이적 ELISA로부터 계산하여 nM FX로 나타냄. b FXa 활성 농도는 주어진 FX 변이체의 RVV-X 또는 TF-FVIIa에 의한 활성화를 수반하는 펩티딜 기질 가수분해의 비율을 기초로 하며, 가수분해의 초기 비율을 FXa 표준 곡선과 비교함. c 중량% 값은 wt-Fxa 활성 농도와의 비교를 기초로 함. 그 값은 항원 농도에 대해 조정됨.

HEK293 세포들 중 안정한 세포주를 정하고, 각각의 자이모겐을 1O L의 조건 배지로부터 정제하였다(14, 24). 변이체를 RVV-X로 활성화하고, 이어서 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다(14,24). 활성화 전과 후(환원 및 비환원) 변이체의 SDS-PAGE를 도 4에 나타낸다.

우선, 본 발명자들은 이 영역을 표적으로 하는 FXa의 특이적 프로브를 사용하여 각각 변이체의 활성 부위 환경에 대한 변화를 평가하는데 초점을 두었다. 펩티딜 기질 및 활성 부위 지정 프로브를 사용한 역학적 연구는, FXal16L 및 FXaV17A가 이들 프로브에 결합하기에 손상된 능력을 가지는 한편(Km 또는 Ki에서 15∼25배 증가), 촉매활성의 비율(kcat)은 야생형 FXa(플라즈마 유도체 및 재조합체)에 비해 3배가 감소되는 것을 밝혀냈다(표 2 및 3). 인자 Xa I16G는 조사한 임의의 프로브에 의해 억제되지 않고, 역학적 변수들의 측정을 제외한 이의 발색성 활성은 심하게 손상되었다(500∼1000배). 이러한 데이터는 내부 염다리 형성(Ile16-Asp194)의 불안정화가 S1 특이성 부위에서 결합에 영향을 미친다는 생각과 일치한다. 이러한 결과와 반대로, FXaI16L 및 FXaV17A의 프로트롬비나제로의 조립은 펩티딜 기질에 대한 Km을 거의 완전하게 복구시키는 한편, kcat는 여전히 3배가 감소하는데, 이것은 FVa 결합이 활성 부위에서 결합을 구조할 수 있음을 나타낸다(표 2 및 3). 놀랍게도, 프로트롬비나제에 조립될 때 I16G에 대한 Km 값조차 거의 완전하게 복구된다(야생형 FXa에 비해 3배 증가); 하지만, kcat에서는 60배 감소를 관찰하였다.

발색성 기질 절단을 위한 역학적 상수들

효소 종류	Km(μM)±SD		K_cat(sec^-1)±SD
인자 Xa
rwtFXa	15X	88.8±11.4	3X	215±13.5
rFXaV^17A		1377±332		71.6±13.5
rFXa^l16L		1149±244		57.3±3.1
rFXa^l16G		1608±423		0.28±0.05
프로트롬비나제
rwtFXa	3X	130±11	3X 60X	141±3.7
rFXaV^17A		362±42		68.2±9.7
rFXa^l16L		296±54		32.5±3.1
rFXa^l16G		433±31		1.92±0.05
유리 인자 Xa를 사용한 실험을 위해, 스펙트로자임 FXa의 농도를 증가시키면서 2.0 nM 야생형 또는 6.0 nM 돌연변이체 인자 Xa를 배양하였고, 프로트롬비나제를 사용한 실험을 위해, 5.0 nM 야생형 또는 돌연변이 Xa를 30 nM 인자 Va, 50 μM PCPS를 사용하여 배양하고 기질의 농도를 증가시켰다(10∼500 μM). 시간에 따른 405 nM에서 흡광도 증가를 모니터하여 발색성 활성을 평가하였다. 맞춰진 상수의 오류는 95% 신뢰 한계를 나타낸다.

이러한 데이터와 일치하는, 프로트롬빈을 사용한 역학적 연구는, 프로트롬비나제에 조립된 각각의 이들 변이체에 대해 얻어진 Km 값이 야생형 효소에 반드시 e동일한 값인 한편, kcat 값은 발색성 기질에 대해서와 같이 비슷한 범위로 감소된다는 것을 밝혀냈다(표 4). 함께 고려할 때, 본 발명의 결과들은 FX에 대한 자이모겐->프로테아제 전이가 S1 부위의 형성에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 또한 FVa 결합 부위의 형성에 실질적인 수단으로 기여한다는 것을 가리킨다. FVa에 대한 이들 FXa 변이체의 직접적인 결합이 S1 부위에서 결합을 구조하기 때문에, 알로스테릭 결합이 이 부위들 사이에 쉽게 존재한다. 총괄하여, 이 연구들은 자이모겐->프로테아제 전이 경로를 변경하는 유일한 수단임을 설명하였으며, 보조 인자 단백질과 같은 강한 리간드 결합을 수반하는 "활성화"인 효소의 자이모겐 유사 형태를 개발하는 가능한 수단임을 밝혀냈다.

FXa 및 프로트롬비나제의 저해를 위한 역학적 상수

효소 종류	K_i(μM)±SD				K2(M-1S-1)±SD×10³
인자 Xa	페파블록 tPa/Xa		파아-아미노 벤즈아미딘		안티트롬빈 III
rwtFXa	25X	0.070±0.002	11X	78.1±1.5	19X	1.37±0.02
rFXaV^17A		1.695±0.072		996±37		0.09±0.003
rFXa^l16L		1.701±0.065		726±40		0.06±0.001
프로트롬비나제
rwtFXa	5X	0.070±0.002	3X	48.6±0.6	4X	0.28±0.01
rFXaV^17A		0.070±0.002		191±6.4		0.05±0.001
rFXa^l16L		0.070±0.002		143±9.0		0.09±0.003

프로트롬빈 절단을 위한 역학적 상수

효소 종류	K_m±SD (μM)	V_max/E_t±SD (nM IIa/분/nM E)	3X	V_max/EtㆍKm (μM^-1ㆍs^-1)
pdFXa	0.42±0.02	2424±54		96
rFXa	0.35±0.01	1937±26		92
rFXaV^17A	0.47±0.03	887±26		31
rFXa^l16L	0.31±0.02	619±14		33

발색성 기질 및 활성 부위 지정 억제제를 사용하여 얻은 결과들은, 자이모겐 유사 FXa 변이체가 활성 부위 프로브에 감소된 친화도로 결합하는 것을 가리킨다. 하지만, 프로트롬비나제로의 이들 변이체의 조립은 활성 부위 프로브에 대한 친화도를 확실하게 향상시키며, 이는 FVa 결합이 활성 부위에서의 결합을 구조할 수 있음을 제시한다. 다음에, 본 발명자들은 반대도 또한 사실인지, 즉 자이모겐 유사 활성 부위의 점유가 FVa에 대한 결합에 영향을 미치는지를 조사하였다. 이 가설을 평가하기 위해, 본 발명자들은 FVa 및 FXaI16L 및 FXaV17A 사이의 결합 상수를 측정하였다. 이를 수행하기 위해, 본 발명자들은 합성 인지질 액포(vesicle) 및 Ca2+ 이온의 존재하에 비활성 wtFXa의 형광성 유도체를 가진 FVa를 배양하였다. 복합체의 형성은 형광성 FXa 단독에 비해 형광성 신호의 증가를 유발한다. 그 다음 본 발명자들은, FVa를 결합할 수 있는 경우에, 형광성 신호의 감소를 초래하는 형광성 FXa5를 대신할 비형광성 FXa를 증가 농도로 첨가하였다. 대조구로서, 본 발명자들은 경쟁자로서 S195A FXa를 첨가하였다. 이 돌연변이체는 촉매 3원소(catalytic triad) 중 Ser을 소실했기 때문에 비활성이지만, FVa에 대한 높은 친화도를 가진다(표 5). 반대로, FXaI16L 또는 FXaV17A를 첨가할 때, FXa에 대한 이들 자이모겐 유사 변이체의 친화도는 FXaS195A에 비해 확실하게 감소되었다(표 5). 다음에, 본 발명자들은 FXaI16L 활성 부위의 공유적 점유가 FVa에 대한 결합을 복구할 수 있는지를 조사하였다. 이것을 하기 위해, 본 발명자들은 비가역적 저해제(EGR-클로로메틸 케톤)를 사용하여 야생형 FXa 및 FXaI16L의 활성 부위를 변형시킨 후에 실험을 반복하였다. 데이터는 활성 부위 차단된 FXaI16L이 야생형 활성 부위 차단된 FXa와 동일한 친화도로 FVa-막에 결합했다는 것을 보여준다. 이는 자이모겐 유사 FXa 활성 부위가 FVa에 대한 결합에 대해 직접적인 영향력을 가짐을 가리킨다.

프로트롬비나제 조립을 위한 평형 결합 상수

효소 종류	K_d±SD(nM)
rFXa^S195A	1.34±0.17
rFXa^V17A	7.25±0.65
rFXa^l16L	13.81±1.07
EGR-FXa	1.80±0.42
EGR-FXa^l16L	1.92±0.20

자이모겐 유사 FXa 유도체가 FVa의 부재시 활성 부위 지정 프로브 및 억제제와의 반응성이 낮지만 변이체가 프로트롬비나제에 조립되는 경우 명백하게 정상에 가까운 활성을 보인다는 관찰을 기초로 하여, 본 발명자들은 다음으로 플라즈마 환경에서 FXaI16L의 활성을 평가하였다. 플라즈마의 응고 시간(aPTT)을 보정하기 위해, A형 또는 B형 혈우병 플라즈마를 야생형 FXa와 스파이크하였다(데이터 표시 안함); 0.1 nM wtFXa는 32초 이하의 응고 시간을 보였다. 동일한 농도의 FXaI16L 첨가는 wtFXa에 비해 50∼70%의 활성인 42초 이하의 응고 시간을 보였으며, 이는 자이모겐 유사 변이체가 플라즈마에서 거의 정상적인 응고 시간을 가진다는 것을 제시한다. 다음, 본 발명자들은 B형 혈우병 플라즈마에서 야생형 FXa 및 FXaI16L의 반감기를 모니터하였다. HB 플라즈마에 단백질을 첨가하고, 상이한 시점에서, 혼합물의 부분을 회수하여 aPTT계 분석법으로 평가하였다. HB 플라즈마의 결과들은 야생형 FXa의 상대적인 잔여 활성이 매우 빠르게 저해된다는 것을 나타낸다(2분 미만)(도 6). 반대로, 추정된 반감기가 2시간을 초과하는 FXaI16L의 활성은 훨씬 긴 시간 동안 지속 되었다. 유사한 결과들을 A형 혈우병 플라즈마에서도 관찰하였다. 이 결과들은 효소의 특징을 조절하여 그것이 플라즈마에서 긴 반감기를 가지며, 혈우병 플라즈마의 응고 시간을 보정할 수 있도록 하는 것이 가능함을 제시한다.

다음으로, 본 발명자들은 혈우병에 걸린 쥣과 동물 모델에서 지혈을 조절하는 자이모겐 유사 FXaI16L의 활성을 평가하였다(Schlachterman, et. al., 2005, J. Thromb. Haemost., 3, 2730∼2737). B형 혈우병 마우스(C57BL/6)의 aPTT 값은 대략 50∼55초이다. 인자 XaI16L(200 ㎍/kg; n=7) 또는 PBS(n = 4)는 B형 혈우병 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 선택한 시점(5 및 30분)에서, 혈액을 채혈하고 aPTT를 모든 샘플에서 수행하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, FXal16L의 유입은 정상적인 동물에서 보이는 정도로 aPTT를 완전하게 보정하였다. 이 효과는 30분 이상동안 지속되며, 이는 분자가 생체 내에서 비교적 긴 반감기를 가진다는 것을 가리킨다. PBS의 유입은 단지 한계 효과(marginal effect)를 보였다. 이들 데이터는 상기 생체 밖 플라즈마 실험값과 일치하고, 실제로 FXaI16L 및 가능한 다른 자이모겐 유사 FXa 변이체가 생체 내에서 지혈을 효과적으로 조절할 수 있음을 가리킨다.

생체 내에서 FXal16L의 유효성을 추가로 테스트하기 위해, 본 발명자들은 이 분자가 꼬리에 손상을 입은 B형 혈우병 마우스의 출혈 시간을 보정할 수 있는지를 조사하였다(Schlachterman, et. al., 2005, J. Thromb. Haemost., 3, 2730∼2737). 꼬리의 말초 부분을 절단한 후, 혈액 손실을 10분 동안 측정하였다. 이 유형의 분석에 있어서, 정상적인 야생형 Balb-c 마우스(n = 7)에서 혈액 손실은 최소한이고, 꼬리가 손상된 PBS 주사한 B형 혈우병 마우스(BaIb c)(n = 6)에서 꽤 상당했다(도 8). 반대로, FXaI16L 450 ㎍/kg의 주사는 꼬리 손상(n = 7)으로 인한 혈액 손실의 총량을 확실하게 감소시켰다. 함께 볼 때, 이들 데이터는 FXaI 16L가 A형 및 B형 혈우병 환자에게서 지혈을 향상시키는 활성을 보인다는 근거를 제공한다.

참고 문헌

본 발명에 따른 소정의 바람직한 구체예들을 기술하고 구체적으로 예시하여 설명하였지만, 이는 본 발명을 이러한 구체예로 한정하고자 함이 아니다. 후술될 청구항에 기재된 본 발명의 범주 및 사상에서 벗어나지 않는 한 이에 대해 다양한 변형이 있을 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Camire, Rodney M. <120> Compositions and Methods for Modulating Hemostasis <130> CHOP.0267B-PCT <140> Not Yet Assigned <141> 2006-11-15 <150> 60/736,680 <151> 2005-11-15 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 488 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <220> <221> MOD_RES <222> (235)...(235) <223> Xaa = any amino acid, except Val or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (236)...(236) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (237)...(237) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (418)...(418) <223> Xaa = any amino acid <400> 1 Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gln Ala Asn 20 25 30 Asn Ile Leu Ala Arg Val Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met 35 40 45 Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr 50 55 60 Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 65 70 75 80 Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln 85 90 95 Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys 100 105 110 Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu 115 120 125 Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln 130 135 140 Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn 145 150 155 160 Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr 165 170 175 Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly 180 185 190 Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu 195 200 205 Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln 210 215 220 Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu 225 230 235 240 Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu 245 250 255 Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu 260 265 270 Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val 275 280 285 Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu 290 295 300 Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 305 310 315 320 Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met 325 330 335 Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr 340 345 350 Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His 355 360 365 Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr 370 375 380 Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln 385 390 395 400 Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln 405 410 415 Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe 420 425 430 Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys 435 440 445 Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg 450 455 460 Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu 465 470 475 480 Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 485 <210> 2 <211> 1467 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <220> <221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> n = a, t, c, or g <400> 2 atggggcgcc cactgcacct cgtcctgctc agtgcctccc tggctggcct cctgctgctc 60 ggggaaagtc tgttcatccg cagggagcag gccaacaaca tcctggcgag ggtcaggagg 120 gccaattcct ttcttgaaga gatgaagaaa ggacacctcg aaagagagtg catggaagag 180 acctgctcat acgaagaggc ccgcgaggtc tttgaggaca gcgacaagac gaatgaattc 240 tggaataaat acaaagatgg cgaccagtgt gagaccagtc cttgccagaa ccagggcaaa 300 tgtaaagacg gcctcgggga atacacctgc acctgtttag aaggattcga aggcaaaaac 360 tgtgaattat tcacacggaa gctctgcagc ctggacaacg gggactgtga ccagttctgc 420 cacgaggaac agaactctgt ggtgtgctcc tgcgcccgcg ggtacaccct ggctgacaac 480 ggcaaggcct gcattcccac agggccctac ccctgtggga aacagaccct ggaacgcagg 540 aagaggtcag tggcccaggc caccagcagc agcggggagg cccctgacag catcacatgg 600 aagccatatg atgcagccga cctggacccc accgagaacc ccttcgacct gcttgacttc 660 aaccagacgc agcctgagag gggcgacaac aacctcacgc gtnnnnnnnn nggccaggaa 720 tgcaaggacg gggagtgtcc ctggcaggcc ctgctcatca atgaggaaaa cgagggtttc 780 tgtggtggaa ctattctgag cgagttctac atcctaacgg cagcccactg tctctaccaa 840 gccaagagat tcaaggtgag ggtaggtgac cggaacacgg agcaggagga gggcggtgag 900 gcggtgcacg aggtggaggt ggtcatcaag cacaaccggt tcacaaagga gacctatgac 960 ttcgacatcg ccgtgctccg gctcaagacc cccatcacct tccgcatgaa cgtggcgcct 1020 gcctgcctcc ccgagcgtga ctgggccgag tccacgctga tgacgcagaa gacggggatt 1080 gtgagcggct tcgggcgcac ccacgagaag ggccggcagt ccaccaggct caagatgctg 1140 gaggtgccct acgtggaccg caacagctgc aagctgtcca gcagcttcat catcacccag 1200 aacatgttct gtgccggcta cgacaccaag caggaggatg cctgccaggg gnnnagcggg 1260 ggcccgcacg tcacccgctt caaggacacc tacttcgtga caggcatcgt cagctgggga 1320 gagggctgtg cccgtaaggg gaagtacggg atctacacca aggtcaccgc cttcctcaag 1380 tggatcgaca ggtccatgaa aaccaggggc ttgcccaagg ccaagagcca tgccccggag 1440 gtcataacgt cctctccatt aaagtga 1467

Claims

지혈을 조절하는 인자 X/인자 Xa 자이모겐/프로테아제 변이체.