BRPI0618654A2 - composições e métodos para modular hemóstase - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES E MéTODOS PARA MODULAR HEMóSTASE. A presente invenção refere-se a variantes de Fator Xa e métodos de uso das mesmas sendo descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES E MÉTODOS PARA MODULAR HEMÓSTASE".

Este pedido de patente reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) para o Pedido Provisório US N- 60/736.680 depositado em 15 de no- vembro de 2005, os conteúdos inteiros sendo aqui incorporados por referên- cia como se expostos por completo.

De acordo com 35 U.S.C. §202(c), é reconhecido que o Governo dos Estados Unidos tem certos direitos na invenção descrita aqui, que foi feita em parte com fundos dos National Institutes of Health, Números de Concessão P01 BL-74124-01. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se aos campos de medicina e hema- tologia. Mais especificamente, a invenção fornece novos agentes de Fator de X/Xa de coagulação e métodos de usar os mesmos para modular a cas- cata de coagulação em pacientes em necessidade dos mesmos. Antecedentes da Invenção

Várias publicações e documentos de patente são citados ao lon- go do relatório descritivo para descrever o estado da técnica ao qual esta invenção pertence. Cada uma destas citações é incorporada aqui por refe- rência como se expostas por completo.

As enzimas de coagulação são enzimas semelhantes à tripsina que pertencem à família de proteases S1 peptidase que carregam um do- bramento semelhante à quimiotripsina. As proteases de coagulação contêm domínios catalíticos que são altamente homólogos uns aos outros e às seri- na proteases ancestrais de digestão. A homologia/identidade estrutural é tão grande (> 70 %) que os resíduos nos domínios catalíticos das enzimas de coagulação são numerados de acordo com os resíduos correspondentes em quimiotripsinogênio.

As enzimas de coagulação circulam no sangue como precurso- res inativos, zimogênios, que requerem clivagem proteolítica para ativação. Os zimogênios possuem -10.000 vezes ou menos atividade proteolítica quando comparados às serina proteases produzidas seguindo ativação. Ini- ciação da coagulação no sítio do dano vascular leva a uma série de reações em que um zimogênio é convertido em uma protease através de clivagem proteolítica específica e forma a enzima para a reação sucessiva. Isto culmi- na na ativação das células sangüíneas e na conversão do fibrinogênio solú- vel em fibrina insolúvel e conseqüentemente a formação do coágulo. Protea- ses em excesso são removidas através de reação com inibidores de protea- se circulantes que atuam como substratos "suicidas" ou aqueles que reco- nhecem as enzimas ativas. Desse modo, ativação proteolítica dos zimogê- nios de coagulação é uma característica reguladora fundamental da cascata de coagulação.

Embora alguns dos zimogênios de coagulação sejam clivados em dois ou mais sítios em suas respectivas reações de ativação, a formação da protease requer clivagem em um sítio só. Clivagem neste sítio e suas conseqüências estruturais são consideradas no modo mais fácil usando o sistema de numeração homólogo com base em quimiotripsinogênio e o tra- balho estrutural extensivo feito com tripsinogênio e tripsina. A conversão do zimogênio para serina protease requer clivagem seguindo Arg15 (tipicamente a ligação entre Arg15 e Ile16) que tipicamente remove um peptídeo de ativa- ção e expõe um novo término N no domínio catalítico começando com Ile16.

Um exemplo é a conversão do fator X para Fator Xa (vide figuras 1 e 2). Em tripsina e Fator Xa, a seqüência N-terminal nova começa com Ile16-Val17- Gly18-Gly19. Para outras enzimas de coagulação, a seqüência N-terminal no- va é uma variação no mesmo tema. A seqüência N-terminal depois dobra-se de volta no domínio catalítico e insere-se na ligação N-terminal clivada de uma maneira seqüência-específica que é referida como "sexualidade mole- cular". Vide Figura 2. Conseqüentemente, variantes com seqüências N- terminais alternadas não são prováveis de sofrer sexualidade molecular de um modo comparável. Inserção N-terminal leva à formação de uma ponte de sal entre o grupo de a-NH2 de Ile16 e Asp194 no interior do domínio catalítico. Formação da ponte de sal está associada a numerosas alterações na estru- tura do domínio catalítico incluindo: rearranjo dos assim chamados domínios de ativação, mostrados na Figura 3; formação do orifício de oxiânion reque- rido para catálise e a formação de um sítio de ligação de substrato. Estas alterações levam à maturação da serina protease ativa. A contribuição fun- damental das interações seqüência-específicas do novo término N através de sexualidade molecular e formação da ponte de sal para a maturação da protease ativa é evidente dos fatos a seguir: proteases bacterianas que não requerem clivagem para ativação utilizam outra cadeia lateral dentro do do- mínio catalítico para a ponte de sal com Asp194; tripsinogênio pode ser ativa- do para uma conformação semelhante à proteinase sem clivagem mas com concentrações extremamente altas de um dipeptídeo de Val-Ile que se inse- re na fenda, embora muito ineficientemente; o dipeptídeo de Val-Ile e outras variantes são bem menos eficazes; adicionalmente, há dois exemplos de proteínas bacterianas que ativam zimogênios de coagulação na ausência de clivagem subvertendo o mecanismo de ativação por meio de provisão de seu próprio término N que se insere na fenda da ligação N-terminal.

As alterações estruturais esboçadas acima provêem uma expla- nação molecular para a conversão de um zimogênio de precursor para uma serina protease ativa. Porém, diferente de tripsina que é completamente ati- va seguindo clivagem em Arg15, muitas das enzimas de coagulação atuam muito fracamente em seus substratos de proteína. Embora elas em geral possuam sítios ativos completamente funcionais e possam clivar substratos de peptidila pequenos, clivagem eficiente do substrato biológico freqüente- mente requer uma proteína de co-fator (Figura 2). Nestes casos, as proteí- nas de co-fator aumentam a taxa de clivagem do substrato de proteína atra- vés de vários mil dobramentos. Embora o mecanismo pelo qual as proteínas de co-fator funcionam permaneça a ser solucionado, elas são improváveis de funcionar tornando a protease mais semelhante à enzima e portanto mais eficiente. Um ponto chave é que, com uma exceção, os co-fatores seletiva- mente ligam-se à protease e não ao zimogênio correspondente. Por exemplo, Fator Xa liga com afinidade alta a FVa ligado à membrana, enquanto que o zimogênio de fator X não liga a FVa.

Dependendo do estado do paciente pode ser desejável desen- volver proteínas de cascata de coagulação alteradas que possuem função de coagulação intensificada ou reduzida. É um objetivo da invenção prover tais proteínas para o uso como terapêuticas. Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção, composições e métodos são providos para influenciar sítios reguladores na via de transição de zimo- gênio para protease de ZX assim dirigindo a produção de uma espécie de FXa mais "semelhante a zimogênio". As composições e métodos da inven- ção são eficazes para modular hemóstase em pacientes em necessidade dos mesmos.

Em uma modalidade, uma variante de zimogênio/protease de Fator X/Xa que modula hemóstase é fornecida. Preferivelmente, a variante de zimogênio protease é codificada pela SEQ ID NO: 2, em que os nucleotí- deos 1684-1695 da SEQ ID NO: 2 podem ser qualquer aminoácido, com a condição que os nucleotídeos 1684-1686 não codifiquem Val ou Ala. Mais preferivelmente, a variante de zimogênio/protease contém pelo menos uma modificação na SEQ ID NO: 1 selecionada do grupo que consiste em a) Ile na posição 16 é Leu, Phe, Asp ou Gly; b) Val na posição 17 é Leu, Ala, ou Gly e c) Asp na posição 194 é Asn ou Glu. Ácidos nucléicos que codificam a variante de zimogênio/proteases da invenção são também revelados como também os métodos de uso dos mesmos. Tais nucleotídeos podem opcio- nalmente codificar um sítio de clivagem intracelular de PACE/furina.

Em ainda outra modalidade, um ácido nucléico tendo a seqüên- cia da SEQ ID NO: 2, em que os nucleotídeos nas posições 1684-1695 codi- ficam os aminoácidos selecionados do grupo que consiste em Leu-Val-Gly, Gly-Val-Gly, Ile-Ala-Gly, Phe-Val-Gly e Ile-Gly-Gly, o dito ácido nucléico op- cionalmente compreendendo nucleotídeos nas posições 2233-2235 que co- difica um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Asn ou Glu.

Uma composição farmacêutica compreendendo a variante de Fator Xa da invenção em um veículo biologicamente compatível é também fornecida. Outro aspecto preferido da invenção inclui métodos para o trata- mento de um distúrbio relacionado à hemóstase em um paciente em neces- sidade dos mesmos compreendendo administração de uma quantidade te- rapeuticamente eficaz da variante de zimogênio/protease de Fator X/Xa con- tendo as composições farmacêuticas descritas aqui. Tais métodos deveriam ter eficácia no tratamento de distúrbios onde um pró-coagulante é necessá- rio e inclui, sem limitação, hemofilia A e B1 hemofilia AeB associada a anti- corpos inibidores, deficiência de fator de coagulação, deficiência de vitamina K-epóxido reductase C1, deficiência de gama-carboxilase, hemorragia asso- ciada a trauma, lesão; trombose, trombocitopenia, acidente vascular cerebral, coagulopatia, coagulação intravascular disseminada (DIC); distúrbios de tra- tamento de sobre-coagulação, síndrome de Bernard Soulier, tromblastemia de Glanzman, e deficiência de fundo geral de armazenamento.

Certas variantes de zimogênio/protease podem ser úteis no tra- tamento de distúrbios onde anti coagulação é desejada. Tais distúrbios in- cluem, sem limitação, trombose, trombocitopenia, acidente vascular cerebral, e coagulopatia.

Outro aspecto da invenção inclui células hospedeiras que ex- pressam a variante de zimogênio/proteases da invenção para produzir quan- tidades grandes da mesma. Métodos para isolar e purificar as variantes de zimogênio protease são também revelados. Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1. Processamento de Fator X. Fator X é sintetizado com uma seqüência sinal e propeptídeo que são removidos antes de sua secre- ção. Fator X é um zimogênio e não tem nenhuma atividade enzimática. FX é convertido em Fator Xa seguindo clivagem na ligação de Arg15-lle16 que libera um peptídeo de ativação (AP).

Figura 2. Zimogênio para conversão de protease. O zimogênio para transição de protease para Fator X e ajuntamento do Fator Xa em pro- trombinase (FXa, FVa, fosfolipídeo e íons de cálcio). Esta enzima converte protrombina (II) para trombina (lia).

Figura 3. A estrutura de Raio X de FXa. O domínio catalítico de FXa na orientação padrão. Regiões estruturais são observadas juntamente com resíduos importantes. Tirado de Brandstetter et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:29988-29992. Figura 4. Análise de SDS-PAGE de variantes de FX/Xa. 4-12 % de géis de SDS-PAGE foram operados sob condições não-redutoras ou re- dutoras e depois tingidos com Coomassie Blue.

Figura 5. Seqüências de aminoácido (SEQ ID NO: 1) e ácido nucléico (SEQ ID NO: 2) de Fator Xa. Os sítios e posições dos aminoácidos para modificações desejadas na SEQ ID NO: 1 são mostrados em negrito.

Figura 6. Atividade de Fator Xa em plasma de hemofilia B. FXa do tipo selvagem ou FXaI 16L (2 nM) foram adicionados ao plasma de hemo- filia B e em intervalos de tempo selecionados as amostras foram diluídas (0,1 nM) e ensaiadas em um ensaio de coagulação de aPTT.

Figura 7. Correção do aPTT. Fator Xa-116L (200 pg/kg; η = 7 camundongos) ou PBS (n = 4 camundongos) foi injetado em camundongos com hemofilia B (C57BL/6) por meio da veia da cauda. Em 5 e 30 min pós- injeção, o sangue foi colhido e um ensaio de aPTT foi executado. A linha pontilhada vermelha representa o valor de aPTT dos animais de C57B1/6 normais.

Figura 8. Avaliação hemostática seguindo ensaio de grampo na cauda em camundongos com hemofilia B. Perda de sangue é medida pelo teor de hemoglobina da solução salina através de A525 pós-lesão. O núme- ro de camundongos (Balb c) é: do tipo selvagem (n = 7); HB-PBS (n = 6); e

HB-FXaM 6L (n = 7).

Descrição Detalhada da Invenção

Proteólise é um aspecto essencial de coagulação do sangue e dá suporte a muitos dos mecanismos que regulam hemóstase normal. Pró- cofatores e zimogênios não podem participar em qualquer grau significativo em seus respectivos complexos enzimáticos macromoleculares. Isto indica que a ativação proteolítica tem que resultar em alterações estruturais apro- priadas que levam à expressão dos sítios que dão capacidades de ligação da enzima, substrato e co-fator. Embora ativação de pró-cofator e de zimo- gênio tenha sido intensivamente estudada, a relação entre proteólise e a expressão de sítios de ligação que transmitem a função é incompletamente entendida. A presente invenção fornece composições e sistemas modelos que elucidam os mecanismos moleculares que estão por de trás da expres- são das interações de ligações macromoleculares que acompanham as transições do estado de zimogênio.

Fator X (FX)1 é uma glicoproteína de duas cadeias dependentes de vitamina k que desempenha um papel central na coagulação do sangue (Figura 1). Este zimogênio de serina protease é um substrato para os com- plexos de enzima de tenase extrínsecos (fator de tecido/FVIIa) e intrínsecos (FVIIIa/FIXa) que cliva a ligação de Arg15-Ile16 fendível em FX resgatando um peptídeo de ativação de 52 aminoácidos gerando FXa. Fator Xa é a pro- tease responsável pela conversão de protrombina em trombina (Figura 2). Embora o Fator Xa seja uma protease completamente competente e possua a maquinaria catalítica para a clivagem de protrombina, é um catalisador profundamente fraco para esta reação. Sua interação de ligação firme com o co-fator, fator Va, em uma superfície de membrana profundamente aumenta a taxa de formação de trombina sem substancialmente afetar as outras rea- ções catalisadas por Fator Xa. Alterações para a seqüência N-terminal (lle- Val-Gly) seguindo o sítio de clivagem de Arg15 que leva à sexualidade mo- lecular subótima são esperadas render um derivado "semelhante a zimogê- nio" de Xa que tem atividade proteolítica prejudicada, ou até mesmo nada.

Estes derivados não são esperados ser suscetíveis à inibição através de inibidores de protease do plasma tais como Antitrombina Ill e não são espe- rados interferir com a iniciação de coagulação seguindo dano vascular por- que eles não são esperados ligar a TFPI muito bem. Fator Xa liga ao fator Va firmemente enquanto o fator de zimogênio X não. Desse modo, formas de Fator Xa semelhantes a zimogênio são esperadas ligar a Va mais fraca- mente mas serem completamente resgatadas em concentrações de co-fator suficientemente altas e eficientemente catalisam a formação de trombina. Formas semelhantes a zimogênio de Fator Xa com estas propriedades são esperadas atuar como proteases duradouras na circulação que estão do contrário mortas mas retêm a habilidade para catalisar a formação de trom- bina ao ligar ao fator Va. Elas têm o potencial para servir como pró- coagulantes terapêuticos que evita as deficiências em outros fatores de coa- gulação na cascata, sem os efeitos deletérios associados à infusão do FXa do tipo selvagem completamente funcional.

I. Definições:

Vários termos relativos às moléculas biológicas da presente in- venção são usados mais acima e também ao longo do relatório descritivo e reivindicações.

A frase "variante de zimogênio/protease" refere-se a um zimo- gênio de FX ou protease de FXa modificados que foram alterados genetica- mente de modo que sua atividade de protease quando convertida em FXa é reduzida ou "semelhante a zimogênio" na ausência de co-fatores específicos (por exemplo, a afinidade de ligação ao sítio ativo é inferior que à observada na molécula do tipo selvagem. Notavelmente, esta afinidade/atividade é res- tabelecida na presença dos co-fatores apropriados que incluem, sem limita- ção, fator Va. Sítios preferidos para alterações de aminoácido na molécula FX de origem incluem substituição da isoleucina na posição 16, substituição da valina na posição 17 e substituição do ácido aspártico na posição 194, com a condição que o aminoácido na posição 16 não seja valina ou alanina.

A frase "distúrbio relacionado à hemóstase" refere-se aos distúr- bios de hemorragia tais como hemofilia AeB, pacientes com hemofilia AeB com anticorpos inibidores, deficiências em Fatores de coagulação, VII, IX e Χ, XI, V, XII, II, fator de von Willebrand, deficiência de FV/FVIII combinados, deficiência de vitamina K-epóxido reductase C1, deficiência de gama- carboxilase; hemorragia associada a trauma, lesão, trombose, trombocitope- nia, acidente vascular cerebral, coagulopatia, coagulação intravascular dis- seminada (DIC); sobre-anticoagulação associada à heparina, heparina de peso molecular baixo, pentassacarídeo, warfarina, antitrombóticos de molé- cula pequena (isto é, inibidores de FXa); e distúrbios de plaquetas tais como, síndrome de Bernard Soulier, tromblastemia de Glanzman, e deficiência de fundo geral de armazenamento. Um distúrbio relacionado à homeóstase po- de também incluir hemorragia relacionada a distúrbios trombóticos tais como trombose venosa profunda, trombose associada a estados ou malignidades de doença cardiovascular, trombose resultante de permanência interna ou outros procedimentos cirúrgicos invasivos e trombose associada a doenças auto-imunes tais como lúpus. As variantes de zimogênio/protease poderiam também prover hemóstase necessária para pacientes com coagulação intra- vascular disseminada ou coagulopatias consumptivas surgindo de uma vari- edade de estados de doença.

Com referência aos ácidos nucléicos da invenção, o termo "áci- do nucléico isolado" às vezes é usado. Este termo, quando aplicado a DNA, refere-se a uma molécula de DNA que está separada das seqüências com as quais é imediatamente contígua (nas direções 5' e 3') no genoma de ocor- rência natural do organismo do qual origina. Por exemplo, "ácido nucléico isolado" pode compreender uma molécula de DNA ou cDNA inserida em um vetor, tal como um vetor de plasmídeo ou de vírus, ou integrada no DNA de um procarioto ou eucarioto.

Com respeito às moléculas de RNA da invenção, o termo "ácido nucléico isolado" primariamente refere-se a uma molécula de RNA codifica- da por uma molécula de DNA isolada como definida acima. Alternativamente, o termo pode referir-se a uma molécula de RNA que foi suficientemente se- parada das moléculas de RNA com as quais estaria associada em seu esta- do natural (isto é, em células ou tecidos), de modo que ela existe em uma forma "substancialmente pura" (o termo "substancialmente puro" é definido abaixo).

Com respeito à proteína, o termo "proteína isolada" ou "proteína isolada e purificada" às vezes é aqui usado. Este termo refere-se primaria- mente a uma proteína produzida por expressão de uma molécula de ácido nucléico isolada da invenção. Alternativamente, este termo pode referir a uma proteína que foi suficientemente separada das outras proteínas com as quais seria naturalmente associada, para existir na forma "substancialmente pura".

O termo "região de promotor" refere-se às regiões reguladoras transcricionais de um gene que pode ser encontrado no lado de 5' ou 3' da região de codificação, ou dentro da região de codificação, ou dentro dos ín- trons. O termo "vetor" refere-se a uma molécula de DNA veículo pe- quena ao qual uma seqüência de DNA pode ser inserida para introdução em uma célula hospedeira onde será replicada. Um "vetor de expressão" é um vetor especializado que contém um gene ou seqüência de ácido nucléico com as regiões reguladoras necessárias requeridas para expressão em uma célula hospedeira.

O termo "operavelmente ligado" significa que as seqüências re- guladoras necessárias para expressão de uma seqüência de codificação são colocadas na molécula de DNA nas posições apropriadas com relação à se- qüência de codificação para realizar expressão da seqüência de codificação. Esta mesma definição às vezes é aplicada ao arranjo de seqüências de codi- ficação e aos elementos de controle de transcrição (por exemplo promotores, intensificadores, e elementos de terminação) em um vetor de expressão. Esta definição é também às vezes aplicada ao arranjo de seqüências de áci- do nucléico de uma primeira e uma segunda molécula de ácido nucléico em que uma molécula de ácido nucléico híbrida é gerada.

O termo "substancialmente puro" refere-se a uma preparação compreendendo pelo menos 50-60 % em peso do composto de interesse (por exemplo, ácido nucléico, oligonucleotídeo, proteína, etc.). Mais preferi- velmente, a preparação compreende pelo menos 75 % em peso, e mais pre- ferivelmente 90-99 % em peso, do composto de interesse. Pureza é medida através de métodos apropriados para o composto de interesse (por exemplo métodos cromatográficos, agarose ou eletroforese em gel de poliacrilamida, análise de HPLC, e similares).

A frase "consistindo essencialmente" quando referindo a uma seqüência de nucleotídeo ou seqüência de aminoácido particular significa uma seqüência tendo as propriedades de uma SEQ ID NO: dada. Por exem- plo, quando usado em referência a uma seqüência de aminoácido, a frase inclui a seqüência per se e as modificações moleculares que não afetariam as características básicas e novas da seqüência.

O termo "oligonucleotídeo", como aqui usado, refere-se aos ini- ciadores e sondas da presente invenção; e é definido como uma molécula de ácido nucléico compreendida de dois ou mais ribo- ou deoxirribonucleotí- deos, preferivelmente mais que três. O tamanho exato do oligonucleotídeo dependerá de vários fatores e da aplicação particular para a qual o oligonu- cleotídeo é usado.

O termo "sonda" como aqui usado refere-se a um oligonucleotí- deo, polinucleotídeo ou ácido nucléico, RNA ou DNA, quer de ocorrência natural como em uma digestão da enzima de restrição purificada quer pro- duzido sinteticamente, que é capaz de anelar ou especificamente hibridar com um ácido nucléico com as seqüências complementares à sonda. Uma sonda pode ser unifilamentar ou bifilamentar. O comprimento exato da sonda dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, fonte da sonda e méto- do de uso. Por exemplo, para aplicações de diagnóstico, dependendo da complexidade da seqüência alvo, a sonda de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-25 nucleotídeos ou mais, embora possa conter menos nucleotí- deos.

As sondas aqui são selecionadas para ser "substancialmente" complementares a diferentes filamentos de uma seqüência de ácido nucléico alvo particular. Isto significa que as sondas devem ser suficientemente com- plementares para serem capazes de "especificamente hibridar" ou anelar com seus respectivos filamentos alvos sob um conjunto de condições prede- terminadas. Portanto, a seqüência de sonda não necessita refletir a seqüên- cia complementar exata do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não-complementar pode ser ligado à terminação 5' ou 3' da sonda, com o restante da seqüência da sonda sendo complementar ao filamento alvo. Al- ternativamente, bases não-complementares ou seqüências mais longas po- dem ser entremeadas na sonda, contanto que a seqüência de sonda tenha complementaridade suficiente com a seqüência do ácido nucléico alvo para especificamente anelarem-se entre si.

O termo "especificamente hibrida" refere-se à associação entre duas moléculas de ácido nucléico unifilamentares de seqüência suficiente- mente complementar para permitir tal hibridação sob condições predetermi- nadas em geral usadas na técnica (às vezes denominadas "substancialmen- te complementares"). Em particular, o termo refere-se à hibridação de um oligonucleotídeo com uma seqüência substancialmente complementar conti- da dentro de uma molécula DNA ou RNA unifilamentar da invenção, para a exclusão substancial da hibridação do oligonucleotídeo com ácidos nucléicos unifilamentares de seqüência não-complementar.

O termo "iniciador" como aqui usado refere-se a um oligonucleo- tídeo, RNA ou DNA, unifilamentar ou bifilamentar, quer derivado de um sis- tema biológico, gerado por digestão da enzima de restrição, quer produzido sinteticamente que, quando colocado no ambiente apropriado, é capaz de atuar funcionalmente como um iniciador da síntese de ácido nucléico depen- dente do modelo. Quando presentes com um modelo de ácido nucléico a- propriado, precursores de trifosfato de nucleosídeo adequados de ácidos nucléicos, uma enzima de polimerase, co-fatores adequados e condições tais como uma temperatura e pH adequados, o iniciador pode ser estendido em seu término 3' pela adição de nucleotídeos mediante ação de uma poli- merase ou atividade similar para render um produto de extensão de iniciador.

O iniciador pode variar em comprimento dependendo das condi- ções particulares e requerimentos da aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnóstico, o iniciador de oligonucleotídeo é tipicamente 15-25 ou mais nucleotídeos em comprimento. O iniciador deve ser de complementaridade suficiente para o modelo desejado preparar a síntese do produto de exten- são desejado, isto é, para ser capaz de anelar com o filamento de modelo desejado de uma maneira suficiente para fornecer a metade de hidroxila de 3' do iniciador em justaposição apropriada para o uso na iniciação da síntese por uma polimerase ou enzima similar. Não é requerido que a seqüência de iniciador represente um complemento exato do modelo desejado. Por exem- plo, uma seqüência de nucleotídeo não-complementar pode ser ligada à terminação 5' de um iniciador do contrário complementar. Alternativamente, bases não-complementares podem ser entremeadas dentro da seqüência de iniciador de oligonucleotídeo, contanto que a seqüência de iniciador tenha complementaridade suficiente com a seqüência do filamento de modelo de- sejado para funcionalmente prover um complexo de modelo-iniciador para a síntese do produto de extensão.

O termo "por cento idêntica" é aqui usado com referência às comparações entre seqüências de ácido nucléico ou de aminoácido. Se- qüências de ácido nucléico e de aminoácido são freqüentemente compara- das usando programas de computação que alinham as seqüências de áci- dos nucléicos ou aminoácidos desse modo definindo as diferenças entre as duas. Para propósitos desta invenção, comparações de seqüências de ácido nucléico são executadas usando o Pacote de GCG Wisconsin versão 9.1, disponível do Genetics Computer Group em Madison1 Wisconsin. Por con- veniência, os parâmetros predefinidos (penalidade de criação de intervalo = 12, penalidade de extensão de intervalo = 4) especificados por aquele pro- grama são intencionados para o uso aqui para comparar identidade de se- qüência. Alternadamente, o programa de Blastn 2.0 provido pelo National Center for Biotechnology Information (encontrado na rede mundial em nc- bi.nlm.nih.gov/blast/; Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:403-410) usando um alinhamento intervalado com parâmetros predefinidos, pode ser usado para determinar o nível de identidade e similaridade entre seqüências de ácido nucléico e seqüências de aminoácido.

II. Preparação de Moléculas de Ácido Nucléico e Polipeptídeos Codificando

Variante de Zimogênio-Protease

A. Moléculas de Ácido Nucléico

Moléculas de ácido nucléico que codificam a variante de zimo- gênio/proteases da invenção podem ser preparadas usando métodos de tecnologia de DNA recombinante. A disponibilidade de informação da se- qüência de nucleotídeo permite a preparação de moléculas de ácido nucléi- co isoladas da invenção por uma variedade de meios. Por exemplo, as se- qüências de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo de zimogê- nio/protease podem ser isoladas de fontes biológicas apropriadas usando protocolos padrões bem conhecidos na técnica.

Ácidos nucléicos da presente invenção podem ser mantidos co- mo DNA em qualquer vetor de clonagem conveniente. Em uma modalidade preferida, clones são mantidos em um vetor de clonagem/expressão de plasmídeo, tal como pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) que é propagado em uma célula hospedeira de E. coli adequada. Alternativamente, os ácidos nucléicos podem ser mantidos em vetor adequado para expressão em célu- las mamíferas. Em casos onde modificação pós-translacional afeta a função de zimogênio/protease (por exemplo, Fator Xa), é preferível expressar a mo- lécula em células mamíferas.

Em uma modalidade, os ácidos nucléicos que codificam as vari- antes de zimogênio de fator X podem ser também modificados por meio de inserção de um sítio de clivagem proteolítico intracelular. Para expressar variantes de FXa semelhantes a zimogênio "ativadas" em células mamíferas, um sítio de clivagem proteolítico intracelular pode ser inserido entre as posi- ções Arg15 e 16 na variante de zimogênio de FX. Tais sítios de clivagem incluem: Arg-Lys-Arg ou Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg. Estes sítios de clivagem são reconhecidos eficientemente através de proteases (enzimas semelhan- tes a PACE/furina) dentro da célula e são removidos. Isto resulta em uma variante de FX(a) processada em que a cadeia pesada na molécula começa agora na posição 16. Introdução deste sítio de clivagem na dita posição permitirá a conversão intracelular de FX em FXa.

Em outra modalidade, o peptídeo de ativação de 52 aminoácidos inteiro pode ser removido e o sítio de clivagem de protease intracelular pode ser introduzido em seu lugar que resultará na variante de FXa.

Por fim estes tipos de modificações permitem secreção da forma processada "ativa" de variante de FX de uma célula que expressa a variante de FX modificada. Secreção do fator clivado obvia uma necessidade por cli- vagem proteolítica durante o coágulo sangüíneo ou seguindo o isolamento da proteína.

Moléculas de ácido nucléico de codificação de variante de zimo- gênio/protease da invenção incluem cDNA, DNA, RNA genômico, e fragmen- tos dos mesmos, que podem ser uni ou bifilamentares. Desse modo, esta invenção fornece oligonucleotídeos (filamentos senses e anti-senses de DNA ou RNA) tendo seqüências capazes de hibridar com pelo menos uma seqüência de uma molécula de ácido nucléico da presente invenção. Tais oligonucleotídeos são úteis como sondas para detectar expressão de zimo- gênio/protease.

B. Proteínas

Um polipeptídeo de zimogênio/protease de comprimento total ou variante da presente invenção pode ser preparado em uma variedade de modos, de acordo com os métodos conhecidos. A proteína pode ser purifi- cada de fontes apropriadas, por exemplo, células ou tecidos cultivados bac- terianos ou animais transformados que expressam zimogênio/protease, atra- vés de purificação de imunoafinidade. Porém, este não é um método preferi- do devido a baixa quantidade de proteína, provável estar presente em um tipo de célula dado a qualquer momento.

A disponibilidade das moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease permite a produção de zimogênio/protease usando métodos de expressão in vitro conhecidos na técnica. Por exemplo, um cDNA ou gene pode ser clonado em um vetor de transcrição in vitro apropriado, tal como pSP64 ou pSP65 para transcrição in vitro, seguido por translação livre de célula em um sistema de translação livre de célula adequado, tal como Iisados de reticulócito de germe de trigo ou de coelho. Sistemas de transcrição e de translação in vitro estão comer- cialmente disponíveis, por exemplo, de Promega Biotech, Madison, Wiscon- sin ou BRL, Rockville, Maryland.

Alternativamente, de acordo com uma modalidade preferida, quantidades maiores de zimogênio/protease podem ser produzidas através de expressão em um sistema de expressão procariótico ou eucariótico ade- quado. Por exemplo, parte ou toda de uma molécula de DNA que codifica variante de Fator Xa por exemplo, pode ser inserida em um vetor de plasmí- deo adaptado para expressão em uma célula bacteriana, tal como E. coli ou uma célula mamífera tal como células CHO ou Hela. Alternativamente, em uma modalidade preferida, proteínas de fusão marcadas compreendendo zimogênio/protease podem ser geradas. Tais proteínas de fusão marcadas com zimogênio/protease são codificadas por parte ou toda de uma molécula de DNA, ligada na estrutura de leitura de códon correta em uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma porção ou todo um marcador de polipeptí- deo desejado que é inserido em um vetor de plasmídeo adaptado para ex- pressão em uma célula bacteriana, tal como E. coli ou uma célula eucariótica, tal como, mas não limitada a, células de levedura e mamíferas. Vetores tais como aqueles descritos acima compreendem os elementos reguladores ne- cessários para expressão do DNA na célula hospedeira posicionada em uma tal maneira a permitir expressão do DNA na célula hospedeira. Tais elemen- tos reguladores requeridos para expressão incluem, mas não são limitados a, seqüências de promotor, seqüências de iniciação de transcrição, e seqüên- cias de intensificador.

Proteínas de variante de zimogênio/proteases, produzidas atra- vés de expressão de gene em um sistema procariótico ou eucariótico re- combinante, podem ser purificadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade preferida, um sistema de expres- são/secreção comercialmente disponível pode ser usado, por meio do qual a proteína recombinante é expressada e depois disso segregada da célula hospedeira, para ser facilmente purificada do meio circunvizinho. Se os veto- res de expressão/secreção não forem usados, um método alternativo envol- ve purificar a proteína recombinante através de separação de afinidade, tal como por interação imunológica com anticorpos que especificamente ligam à proteína recombinante ou colunas de níquel para isolamento das proteínas recombinantes marcadas com 6-8 resíduos de histidina em seu término N ou término C. Marcadores alternativos podem compreender o epítopo FLAG, GST ou o epítopo de hemaglutinina. Tais métodos são comumente usados por médicos versados.

As proteínas de zimogênio/protease, preparadas pelos métodos acima mencionados, podem ser analisadas de acordo com os procedimen- tos padrões. Por exemplo, tais proteínas podem ser submetidas à análise de seqüência de aminoácido, de acordo com os métodos conhecidos.

Como debatido acima, um modo conveniente de produzir um polipeptídeo de acordo com a presente invenção é expressar ácido nucléico que o codifica, mediante uso do ácido nucléico em um sistema de expressão. Uma variedade de sistemas de expressão de utilidade para os métodos da presente invenção é bem conhecida àqueles versados na técnica.

Conseqüentemente, a presente invenção também abrange um método de fazer um polipeptídeo (como revelado), o método incluindo ex- pressão de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo (em geral ácido nu- cléico). Isto pode ser convenientemente alcançado cultivando uma célula hospedeira, contendo um tal vetor, sob condições apropriadas que causam ou permitem produção do polipeptídeo. Polipeptídeos podem também ser produzidos em sistemas in vitro, tais como em Iisados de reticulócitos. III. Usos de Proteínas de Zimogênio/Protease e Ácidos Nucléicos Codifican- do Zimogênio/Protease

Ácidos nucléicos de variante de zimogênio/proteases que codifi- cam polipeptídeos tendo atividades de protease alteradas podem ser usados de acordo com esta invenção, por exemplo, como agentes terapêuticos e/ou profiláticos (proteína ou ácido nucléico) que modulam a cascata de coagula- ção sangüínea. Os inventores presentes descobriram que moléculas de zi- mogênio/protease de fator X/Xa podem aumentar a coagulação e fornecer hemóstase eficaz.

A. Polipeptídeos de Variantes de Zimogênio/Protease

Em uma modalidade preferida da presente invenção, polipeptí- deos de variante de zimogênio/proteases podem ser administrados a um paciente por meio de infusão em um veículo biologicamente compatível, pre- ferivelmente por meio de injeção intravenosa. A variante de zimogê- nio/proteases da invenção pode opcionalmente ser encapsulada em Iipos- somas ou misturada com outros fosfolipídeos ou micelas para aumentar a estabilidade da molécula. Zimogênio/protease pode ser administrado sozi- nho ou em combinação com outros agentes conhecidos modular hemóstase (por exemplo, Fator V, Fator Va ou derivados dos mesmos). Uma composi- ção apropriada para resgatar os polipeptídeos de zimogênio/protease pode ser determinada por um médico em consideração de uma variedade de vari- áveis fisiológicas, incluindo, mas não limitadas a, a condição e estado he- modinâmico do paciente. Uma variedade de composições bem adaptadas para diferentes aplicações e vias de administração é bem conhecida na téc- nica e é descrita mais abaixo.

A preparação contendo o análogo de fator X/Xa purificado con- tém uma matriz fisiologicamente aceitável e é preferivelmente formulada como uma preparação farmacêutica. A preparação pode ser formulada u- sando métodos da técnica anterior substancialmente conhecidos, misturada com um tampão contendo sais, tais como NaCI, CaCI2, e aminoácidos, tais como glicina e/ou lisina, e em uma faixa de pH de 6 a 8. Até necessário, a preparação purificada contendo o análogo de fator X/X a pode ser armaze- nada na forma de uma solução acabada ou na forma Iiofilizada ou extrema- mente congelada. Preferivelmente a preparação é armazenada na forma Iiofilizada e é dissolvida em uma solução visualmente clara usando uma so- lução de reconstituição apropriada. Alternativamente, a preparação de acor- do com a presente invenção pode também ser disponibilizada como uma preparação líquida ou como um líquido que é extramente congelado.

A preparação de acordo com a presente invenção é especial- mente estável, isto é, pode ser deixada repousar em forma dissolvida um tempo prolongado antes da aplicação.

A preparação de acordo com a presente invenção que contém um análogo de fator X em combinação com fator Xla ou um derivado do mesmo é capaz de ativar o análogo de fator X em Fator Xa ou o análogo de Fator Xa pode "ser disponibilizado na forma de uma preparação de combi- nação compreendendo um recipiente que retém o fator Xla que é imobilizado em uma matriz, potencialmente na forma de uma coluna miniatura ou uma seringa enchida com uma protease, e um recipiente contendo a preparação farmacêutica com o análogo de fator X. Para ativar o análogo de fator X1 a solução contendo o análogo de fator X, por exemplo, pode ser pressionada na protease imobilizada. Durante o armazenamento da preparação, a solu- ção contendo o análogo de fator X é preferivelmente de forma espacial sepa- rada da protease. A preparação de acordo com a presente invenção pode ser armazenada no mesmo recipiente que a protease, mas os componentes são espacialmente separados por uma partição impermeável que pode ser facilmente removida antes da administração da preparação. As soluções podem também ser armazenadas em recipientes separados e ser colocadas em contato entre si apenas brevemente antes da administração.

O análogo de fator X pode ser ativado no Fator Xa logo antes do uso imediato, isto é, antes da administração ao paciente. A ativação pode ser realizada colocando um análogo de fator X em contato com uma protea- se imobilizada ou misturando as soluções que contêm uma protease, por um lado, e o análogo de fator X, por outro lado. Desse modo, é possível manter os dois componentes separadamente em solução e os misturar por meio de um dispositivo de infusão adequado em que os componentes entram em contato entre si à medida que eles atravessam o dispositivo e assim causam uma ativação no Fator Xa ou no análogo de Fator Xa. O paciente desse mo- do recebe uma mistura de Fator Xa e, além disso, uma serina protease que é responsável pela ativação. Neste contexto, é especialmente importante para prestar muita atenção na dosagem uma vez que a administração adi- cional de uma serina protease também ativa fator X endógeno que pode en- curtar o tempo de coagulação.

A preparação de acordo com a presente invenção pode ser dis- ponibilizada como uma preparação farmacêutica com atividade de Fator Xa na forma de uma preparação de um componente só ou em combinação com outros fatores na forma de uma preparação de multicomponentes.

Antes de processar a proteína purificada em uma preparação farmacêutica, a proteína purificada é submetida aos controles de qualidade convencionais e formada em uma forma de apresentação terapêutica. Em particular, durante a fabricação recombinante, a preparação purificada é tes- tada quanto à ausência de ácidos nucléicos celulares como também ácidos nucléicos que são derivados do vetor de expressão, preferivelmente usando um método, tal como é descrito na EP 0 714 987.

Outra característica desta invenção refere-se em tornar disponí- vel uma preparação que contém um análogo de Fator X com uma estabilida- de alta e integridade estrutural e que, em particular, é livre de intermediários de análogo de fator X/Xa inativos e produtos de degradação autoproteolíti- cos e que podem ser produzidos ativando um análogo de fator X do tipo descrito acima e formulando-o em uma preparação apropriada.

A preparação farmacêutica pode conter dosagens de entre ΙΟ- 1000 Mg/kg, mais preferivelmente entre cerca de 10-250 pg/kg e o mais pre- ferivelmente entre 10 e 75 pg/kg, com 40 pg/kg do polipeptídeo de variante de fator X sendo particularmente preferido. Os pacientes podem ser tratados imediatamente sob apresentação na clínica com uma hemorragia. Alternati- vamente, os pacientes podem receber uma infusão de bolo uma a cada três horas, ou se melhoria suficiente for observada, uma infusão uma vez ao dia do variante de Fator Xa descrita aqui.

B. Ácidos Nucléicos Codificando Zimogênio/Protease

Ácidos nucléicos codificando zimogênio/protease podem ser u- sados para uma variedade de propósitos de acordo com a presente inven- ção. Em uma modalidade preferida da invenção, um veículo de liberação de ácido nucléico (isto é, um vetor de expressão) para modular coagulação sangüínea é fornecido em que o vetor de expressão compreende uma se- qüência de ácido nucléico que codifica para um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease, ou um fragmento funcional do mesmo como descrito aqui. Administração de vetores de expressão codificando zimogê- nio/protease a um paciente resulta na expressão do polipeptídeo de zimogê- nio/protease que serve para alterar a cascata de coagulação. De acordo com a presente invenção, uma seqüência de ácido nucléico de codificação de zimogênio/protease pode codificar um polipeptídeo de zimogênio/protease como descrito aqui cuja expressão aumenta a hemóstase. Em uma modali- dade preferida, uma seqüência de ácido nucléico de zimogênio/protease co- difica uma variante de polipeptídeo de Fator Xa humana.

Os vetores de expressão que compreendem seqüências de áci- do nucléico de variantes de zimogênio/protease de X/Xa podem ser adminis- trados sozinhos, ou em combinação com outras moléculas úteis para modu- lar hemóstase. De acordo com a presente invenção, os vetores de expres- são ou combinação de agentes terapêuticos podem ser administrados sozi- nhos ao paciente ou em umas composições farmaceuticamente aceitáveis ou biologicamente compatíveis.

Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor de expres- são compreendendo seqüências de ácido nucléico que codificam as varian- tes de variante de zimogênio/proteases é um vetor viral.

Vetores virais que podem ser usados na presente invenção in- cluem, mas não são limitados a, vetores adenovirais (com ou sem promoto- res/intensificadores tecido-específicos), vetores adenovírus- associados (A- AV) de sorotipos múltiplos (por exemplo, AAV-2, AAV-5, AAV-7, e AAV-8) e vetores de AAV híbrido, vetores de lentivírus e vetores de lentivírus de pseu- do-tipo [por exemplo, vírus de Ebola, vírus de estomatite vesicular (VSV), e vírus de imunodeficiência felina (FIV)], vetores de vírus do herpes simples, vetores de vírus de vacínia, e vetores retrovirais.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, métodos para a administração de um vetor viral compreendendo as seqüências de ácido nucléico que codificam uma variante de zimogênio/protease, ou um fragmento funcional das mesmas, são providos. Vetores adenovirais de utili- dade nos métodos da presente invenção preferivelmente incluem pelo me- nos as partes essenciais do DNA do vetor adenoviral. Como descrito aqui, expressão de um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease seguindo administração de tal um vetor adenoviral serve para modular hemóstase. No contexto da variante de Fator Xa descrito aqui, tal administração intensifica a atividade de pró-coagulação da protease.

Vetores adenovirais recombinantes encontraram utilidade vasta para uma variedade de aplicações de terapia de gene. Sua utilidade para tais aplicações é em grande parte devido à eficiência alta de transferência de gene in vivo alcançada em uma variedade de contextos de órgão.

Partículas adenovirais podem ser usadas para tirar vantagem como veículos para liberação de gene adequada. Tais vírions possuem vá- rias características desejáveis para tais aplicações, incluindo: características estruturais relacionadas em ser um vírus não-envelopado de DNA bifilamen- tar e características biológicas tais como um tropismo para o sistema respi- ratório humano e trato gastrintestinal. Além disso, adenovírus são conheci- dos infetar uma ampla variedade de tipos de célula in vivo e in vitro através de endocitose mediada por receptor. Atestando à segurança geral dos veto- res adenovirais, infecção com adenovírus leva a um estado de doença mí- nimo em humanos compreendendo sintomas moderados semelhantes à influenza.

Devido a seu tamanho grande (-36 quilobases), genomas ade- novirais são bem adaptados para o uso como veículos de terapia de gene porque eles podem acomodar a inserção de DNA estranho seguindo a re- moção de genes adenovirais essenciais para regiões de replicação e não- essenciais. Tais substituições tornam o vetor viral prejudicado com respeito às funções replicativas e de infecciosidade. De nota, os adenovírus foram usados como vetores para terapia de gene e para expressão de genes heterólogos.

Para um debate mais detalhado do uso de vetores de adenoví- rus utilizado para terapia de gene, vide Berkner, 1988, Biotechniques 6:616- 629 e Trapnell, 1993, Advanced Drug Delivery Reviews 12:185-199.

É desejável introduzir um vetor que possa fornecer, por exemplo, cópias múltiplas de um gene desejado e conseqüentemente maiores quanti- dades do produto daquele gene. Vetores adenovirais melhorados e métodos para produzir estes vetores foram descritos em detalhes em várias referên- cias, patentes, e pedidos de patente, incluindo: Mitani e Kubo (2002, Curr Gene Ther. 2(2): 135-44); Olmsted-Davis et al. (2002, Hum Gene Ther. 13(11): 1337-47); Reynolds et al. (2001, Nat Biotechnol. 19(9):838-42); paten- tes U. S. Nes 5.998.205 (em que são fornecidos vetores replicativos tumor- específicos compreendendo cópias de DNA múltiplas); 6.228.646 (em que são descritos vetores de adenovírus livres de ajudante, totalmente defeituo- sos); 6.093.699 (em que são fornecidos vetores e métodos para terapia de gene); 6.100.242 (em que um vetor de adenovírus defeituoso de replicação inserido em transgene foi eficazmente usado em terapia de gene in vivo de doença vascular periférica e doença cardíaca); e Pedidos de Patente Inter- nacionais NQs WO 94/17810 e WO 94/23744.

Para algumas aplicações, uma construção de expressão pode também compreender elementos reguladores que servem para dirigir a ex- pressão em um tipo de célula ou de tecido particular. Tais elementos regula- dores são conhecidos àqueles versados na técnica e debatidos a fundo em Sambrook et al. (1989) e Ausubel et al. (1992). A incorporação de elementos reguladores tecido-específicos nas construções de expressão da presente invenção fornece pelo menos tropismo de tecido parcial à expressão da va- riante de zimogênio/proteases ou fragmentos funcionais da mesma. Por e- xemplo, um vetor adenoviral do tipo 5 deletado em E1 compreendendo as seqüências de ácido nucléico que codificam a variante de zimogê- nio/protease sob o controle de um promotor de citomegalovírus (CMV) pode ser usado para tirar vantagem dos métodos da presente invenção. Métodos Exemplares para Produzir Vetores Adenovirais

Vetores adenovirais para expressão de gene recombinante fo- ram produzidos na linhagem celular de rim embrionário humano 293 (Gra- ham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59-72), esta linhagem celular é permissiva para crescimento de mutantes de adenovírus 2 (Ad2) e adenovírus 5 defei- tuosos nas funções de E1 porque compreende a terminação esquerda do genoma de adenovírus 5 e, portanto, expressa proteínas de E1. Genes de E1 integrados no genoma celular das 293 células são expressos em níveis que facilitam o uso destas células como um sistema de expressão em que para amplificar os vetores virais destas, os genes foram deletados. 293 célu- las foram extensivamente usadas para o isolamento e propagação de mu- tantes de E1, para clonagem independente de ajudante, e para expressão dos vetores de adenovírus. Sistemas de expressão tais como a linhagem celular 293, portanto, fornecem funções virais essenciais em trans e assim permitem propagação dos vetores virais nas quais as seqüências de ácido nucléico exógenas foram substituídas por genes de E1. Vide Young et al. em The Adenovírus, Ginsberg, ed., Plenum Press, Nova Iorque e Londres (1984), págs. 125-172.

Outros sistemas de expressão bem adaptados à propagação de vetores adenovirais são conhecidos àqueles versados na técnica (por exem- plo, células HeLa) e foram revisados em outro lugar. Também incluso na presente invenção é um método para modu- lar hemóstase compreendendo fornecer células de um indivíduo com um veículo de liberação de ácido nucléico codificando um polipeptídeo de vari- ante de zimogênio/protease e permitindo as células crescerem sob condi- ções em que o polipeptídeo de zimogênio/protease é expressado.

Do debate anterior, pode ser visto que os polipeptídeos de zimo- gênio/protease, e o polipeptídeo de zimogênio/protease que expressa veto- res de ácido nucléico podem ser usados no tratamento de distúrbios associ- ados à coagulação sangüínea aberrante.

C. Composições Farmacêuticas

Os vetores de expressão da presente invenção podem ser in- corporados nas composições farmacêuticas que podem ser liberadas a um sujeito, para permitir a produção de uma proteína biologicamente ativa (por exemplo, um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease ou fragmento funcional ou derivado do mesmo). Em uma modalidade particular da presen- te invenção, as composições farmacêuticas que compreendem material ge- nético suficiente para permitir um recipiente produzir uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease podem influenciar hemóstase no sujeito. Alternativamente, como debatido acima, uma quantidade eficaz do polipeptídeo de variante de Fator X pode ser infundida diretamente em um paciente em necessidade do mesmo. As composições podem ser administradas sozinhas ou em combinação com pelo menos um outro agente, tal como um composto de estabilização que pode ser administrado em qualquer veículo farmacêutico estéril, biocompatí- vel incluindo, mas não limitado a, solução salina, solução salina tamponada, dextrose, e água. As composições podem ser administradas sozinhas a um paciente, ou em combinação com outros agentes (por exemplo, co-fatores) que influenciem hemóstase.

Em modalidades preferidas, as composições farmacêuticas tam- bém contêm um excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais excipientes incluem qualquer agente farmacêutico que não leve a induzir uma resposta imune prejudicial ao indivíduo recebendo a composição, e que possam ser administrados sem toxicidade imprópria. Excipientes farmaceuticamente a- ceitáveis incluem, mas não são limitados a, líquidos tais como água, solução salina, glicerol, açúcares e etanol. Sais farmaceuticamente aceitáveis podem também ser inclusos neles, por exemplo, sais de ácido minerais tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e similares; e os sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e similares. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes intumescentes ou emulsificantes, substâncias de tamponação de pH, e outros, podem estar presentes em tais veículos. Um debate completo de excipientes farmaceuti- camente aceitáveis está disponível em Remington1S Pharmaceutical Scien- ces (Mack. Pub. Co., 18ê Edição, Easton, Pa. [1990]).

Formulações farmacêuticas adequadas para administração pa- renteral podem ser formuladas em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hanks, solução de Ringer, ou solução salina fisiologicamente tamponada. Suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetil celulose de sódio, sorbitol, ou dextrana. Adicionalmente, as suspensões dos compostos ativos podem ser prepara- das como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Solventes ou veícu- Ios Iipofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintético, tais como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabili- zantes adequados ou agentes que aumentem a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

A composição farmacêutica pode ser fornecida como um sal e pode ser formada com muitos ácidos, incluindo mas não limitado a, clorídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Sais tendem a ser mais solúveis em solventes protônicos aquosos ou outros que as formas de base livres correspondentes. Em outros casos, a preparação preferida pode ser um pó Iiofilizado que pode conter qualquer um ou todos dos seguintes: 1- 50 mM de histidina, 0,1 %-2 % de sacarose, e 2-7 % de manitol, em uma faixa de pH de 4,5 a 5,5, que aquele é combinado com tampão antes do uso. Após as composições farmacêuticas serem preparadas, elas podem ser colocadas em um recipiente apropriado e marcadas para trata- mento. Para administração de vetores ou polipeptídeos contendo zimogê- nio/protease, tal marcação incluiria quantidade, freqüência, e método de ad- ministração.

Composições farmacêuticas adequadas para o uso na invenção incluem composições em que os componentes ativos são contidos em uma quanti- dade eficaz para alcançar o propósito terapêutico intencionado. Determinar uma dose terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade de um médico versado usando as técnicas e orientação fornecidas na presente in- venção. Doses terapêuticas dependerão, entre outros fatores, da idade e condição geral do sujeito, da severidade do fenótipo de coagulação sangüí- nea aberrante, e da resistência das seqüências de controle que regulam os níveis de expressão do polipeptídeo de variante de zimogênio/protease. Desse modo, uma quantidade terapeuticamente eficaz em seres humanos cairá em uma faixa relativamente vasta que pode ser determinada por um médico com base na resposta de um paciente individual para tratamento de zimogênio/protease com base em vetor. D. Administração

Os polipeptídeos de variante de Fator X, sozinhos ou em combi- nação com outros agentes, podem ser infundidos diretamente em um paci- ente em um veículo biológico apropriado como mais acima descrito. Vetores de expressão da presente invenção que compreendem as seqüências de ácido nucléico que codificam a variante de zimogênio/protease, ou fragmen- tos funcionais das mesmas, podem ser administrados a um paciente por uma variedade de meios (vide abaixo) para alcançar e manter um nível profi- lática e/ou terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de zimogênio/protease. Alguém versado na técnica poderia facilmente determinar os protocolos es- pecíficos para usar os vetores de expressão de codificação de zimogê- nio/protease da presente invenção para o tratamento terapêutico de um pa- ciente particular. Protocolos para a geração de vetores adenovirais e admi- nistração em pacientes foram descritos nas patentes U. S. N9S 5.998.205; 6.228.646; 6.093.699; 6.100.242; e Pedidos de Patente Internacionais N9S WO 94/17810 e WO 94/23744, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Vetores adenovirais de codificação da variante de zimogê- nio/protease da presente invenção podem ser administrados a um paciente por quaisquer meios conhecidos. Liberação direta das composições farma- cêuticas in vivo pode em geral ser realizada por meio de injeção usando uma seringa convencional, embora outros métodos de liberação tais como libera- ção de transmissão intensificada sejam visados (Vide por exemplo, Patente U. S. Ne 5.720.720). Nesta consideração, as composições podem ser libera- das subcutânea, epidérmica, intradérmica, intratecal, intra-orbital, intramuco- sal, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, oral, intra-hepática ou intra- muscularmente. Outros modos de administração incluem administração oral e pulmonar, supositórios, e aplicações transdérmicas. Um clínico especiali- zado no tratamento de pacientes com distúrbios de coagulação sangüínea pode determinar a via ótima para administração dos vetores adenovirais compreendendo seqüências de ácido nucléico de zimogênio/protease com base em vários critérios, incluindo, mas não limitados a: a condição do paci- ente e o propósito do tratamento (por exemplo, coagulação sangüínea inten- sificada ou reduzida).

A presente invenção também abrange vetores de AAV que com- preendem uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease.

Também fornecidos são lentivírus ou vetores de lentivírus de pseudo-tipo que compreendem uma seqüência de ácido nucléico que codifi- ca um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease.

Também abrangidos são plasmídeo desprotegidos ou vetores de expressão compreendendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease.

Exemplo 1 - Variante de Zimogênio/Protease de Fator XA

Processamento proteolítico das proteínas de plasma de precur- sor para afetar ativação é uma conspicuidade de coagulação sangüínea. O paradigma para este tipo de mecanismo de ativação é a transição de zimo- gênio para protease na a família de serina protease semelhante à quimio- tripsina. Clivagem de ligação em um sítio altamente conservado (Arg15-lle16; sistema de numeração de quimiotripsina) desmascara um novo término N que atua como um ligando intramolecular para Aspl 94 (Figura 2). Esta ponte de sal nova resulta ou está associada a uma alteração conformacional e or- denamento do assim chamado "domínio de ativação", alças de superfície que consistem em cavidade de especificidade de S1, orifício de oxiânion, alça de autólise, e sítio de ligação de sódio (Figura 3). Está bem documenta- do no sistema de tripsina que formação de ponte de sal interna de Ile16- Asp194 é alostericamente ligada ao sítio de especificidade de S1; ou seja alterações em um sítio influencia o outro sítio e vice-versa.

Os princípios básicos da transição de zimogênio para enzima ativa para serina proteases no nível estrutural estão bem documentados, particularmente para quimiotripsina e tripsina e estes exemplos servem co- mo o paradigma para a família de serina protease. Aspectos gerais podem ser resumidos como segue (vide Figura 2): 1) a estrutura (-80-85 %) do zi- mogênio é relativamente similar à protease; 2) a transição é iniciada seguin- do liberação de um término N altamente conservado (por exemplo, Ile16-Val- Gly-Glyl 9); 3) o novo grupo α-amino (Del 6) é enterrado em um ambiente hidrofóbico e seu nitrogênio de α-amino forma uma ponte de sal interna com Asp194; 4) a posição de Asp194 significativamente altera sob rotação de ativação de zimogênio a -170°; e 5) esta ponte de sal interna resulta ou está associada a uma alteração conformacional no assim-chamado "domínio de ativação", alças expostas de superfície que consistem em resíduos 16-19, 142-153, 184-194, e 216-223; e parcialmente compreendendo o sítio de es- pecificidade de S1 (nomenclatura de Schechter e Berger (1967) Bochem. Biophys. Res. Comm. 43:694-702) e orifício de oxiânion. Vários estudos in- dicam que o zimogênio e a enzima madura existem em um equilíbrio, com Keq = ~108 a favor do zimogênio. Bode e colaboradores demonstraram ele- gantemente que tripsinogênio pode adotar uma estrutura ativa semelhante à tripsina sob ligação de ligando forte à cavidade de especificidade de S1 ou ligantes adequados com afinidade alta pela fenda de Ile16. Exemplos adicio- nais desta indução sem clivagem da ligação de Arg/Lys15-lle16 incluem a ligação de estreptocinase a plasminogênio, estafilocoagulase a protrombina, e um auto-anticorpo recentemente descrito a protrombina (Madoiwa et al. (2001) Blood 97:3783-3789). Coletivamente estes estudos indicam que seri- na proteases, até mesmo em sua forma de zimogênio, pode adotar funções semelhantes à protease dependendo de várias condições ambientais, isto é, ligação de ligante forte ao zimogênio.

É bem conhecido que a ativação de FX resulta em alterações conformacionais principais no domínio de serina protease que é acompa- nhado pela habilidade da protease ligar com maior afinidade às sondas S1- direcionadas e FVa ligado à membrana (1-6). 0(s) mecanismo(s) molecu- lares) geral(is) que governa(m) a transição das serina proteases é/são em geral assumido(s) seguir ao do sistema de tripsina. Porém, isto pode não ser uniformemente o caso. TPA de cadeia simples emprega uma estratégia mo- lecular diferente para manter seu estado semelhante a zimogênio (8-11). Análise de pares de zimogênio/protease envolvidos em coagulação sangüí- nea, particularmente FVII/FVIIa, indica que várias diferenças existem nesta transição comparado ao sistema de tripsina (12). Embora vários determinan- tes estruturais em FXa sejam parte do assim-chamado domínio de ativação, está correntemente incerto se a formação destes sítios está ligada direta- mente ao zimogênio para transição de protease. Um modelo recentemente descrito do Fx de zimogênio sugere porém que vários destes elementos po- dem ser desordenados no zimogênio (13). Comparação do modelo de zimo- gênio com a enzima ativa revela que resíduos que compõem as alças de Ca2+ (Asp70-Glu80), Na+ (Ala183-Asp194; Gly219-Gly226) e de autólise (T- hr144-Arg150) sofrem alterações principais em suas posições da cadeia principal na transição de zimogênio para protease. Uma vez que já está bem documentado, pelo menos para tripsinogênio/tripsina, que o sítio de especifi- cidade de S1 e a formação de Ile16-Asp194 são alostericamente ligados, é razoável levantar a hipótese que outros elementos do domínio de ativação estão também ligados à transição de zimogênio para protease. No exemplo presente, projetou-se experimentos para testar a hipótese que dessestabili- zação da ponte de sal interna de Ile16-Asp194 fazendo alterações na posi- ção 16, 17, ou 194 altera o sítio ativo clivado fazendo a variante resultante "semelhante a zimogênio". Também foi levantada a hipótese que estas alte- rações alostericamente modularão o FVa ligante.

Materiais e Métodos

Expressão de Fator XA

Embora haja vários relatórios na literatura na expressão de rFX, a maioria tem contado com versões truncadas ou não tem fornecido caracte- rização adequada (15-20). Tentativas iniciais para expressar rFX em células de HEK 293 resultaram em níveis de expressão na faixa de 1-2 mg de rFX/L de meios condicionados; porém, apenas foram encontrados 10-40 % do ma- terial produzido serem completamente γ-carboxilados (21). O material res- tante não mostrou nenhuma γ-carboxilação. Tirou-se proveito das afinidades de ligação diferentes dos propeptídeos dependentes de vitamina K para a carboxilase e foi levantada a hipótese que uma vez que o propeptídeo de protrombina exibe a afinidade mais baixa para a carboxilase, trocando o pro- peptídeo de FX (afinidade mais alta) com que o da protrombina pode intensi- ficar a γ-carboxilação permitindo maior giro de substrato (22, 23). Usando este vetor novo, os transfectantes estáveis de células HEK 293 foram sele- cionados, expandidos, e rFX foi purificado através de cromatografia de imu- noafinidade. Elução de fosfato de hidroxiapatita foi usada para separar o ma- terial carboxilado do material não-carboxilado. Os resultados, obtidos agora de mais de 30 linhagens celulares estáveis indicam que em -80-90 % em média do rFX são completamente γ-carboxilados comparados a 10-40 % usando o propeptídeo de FX nativo. Estes resultados foram publicados re- centemente e esta estratégia tem subseqüentemente sido empregada por pelo menos um outro laboratório (24,25). Desse modo, usando este sistema de expressão novo, são agora produzidas quantidades em miligramas (15- 25 mg de rFX completamente γ-carboxilado de -10 L de meios condiciona- dos) de proteína para estudos detalhados de estrutura/função. Ensaios de Enzima

Concentrações de enzima serão determinadas através de titula- ção de sítio ativo com p-guanidinobenzoato de p-nitrofenila (IIa) ou mono-p- guanidinobenzoato de fluoresceína (FXa) (26, 27). Atividade de substrato cromogênico de FXa, na presença ou ausência de vários inibidores, será medida das taxas iniciais de hidrólise de Spectrozyme FXa, S-2222, ou S- 2765 como previamente descrito (14). Parâmetros cinéticos serão determi- nados por ajuste de quadrados mínimos dos dados de taxa iniciais às equa- ções apropriadas.

Geração de Variantes de FXa

Os mutantes de FX foram gerados usando o kit de mutagênese loco-dirigida de alteração Quick (Stratagene) e o cDNA de FX inteiro foi se- qüenciado para verificar a identidade do produto. Os vários plasmídeos fo- ram transientemente transfeccionados em células HEK 293 usando Lipofec- tamina-2000. 48 h pós-transfecção, meios foram colhidos e os níveis de an- tígeno de FX foram determinados usando um ELISA FX-específico e ativida- de de FXa foi avaliada através de ensaio cromogênico antes da ativação por RVV-X ou através de fator de tecido-FVIIa.

Resultados

Geração de espécies de FXa distribuídas ao longo da via de transição de zimogênio-protease é esboçada na Tabela 1. Resultados da transfecção transiente indicam que geram-se uma série de variantes de FXa com quantidades variáveis de atividade, variando de -25 % a < 1 %. Levan- tou-se a hipótese que estas diferenças na atividade provavelmente reflitam variantes de FX que são deslocadas em graus variados ao longo do zimogê- nio para transição de protease. Declarado diferentemente, a ponte de sal interna de Ile16-Asp194 é estabilizada em graus variados dependendo do aminoácido nas posições 16, 17 ou 194. Foram selecionadas três destas variantes (rFXal16L, FXaI 16G e FXaVI 7A) para caracterização adicional. Tabela 1: Ativação De Várias Variantes De Rfx Com Rw-X E TF-FVIIa

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a Níveis de antígeno são calculados de um ELISA FX-específico e expressos como nM de FX

b Níveis de atividade de FXa são com base na taxa de hidrólise de substrato de peptidila seguindo ativação por RVV-X ou TF-FVIIa de uma variante de FX dada e taxas iniciais de hidrólise são comparadas à curva padrão de FXa c valores de % em peso são com base na comparação aos níveis de ativida- de FXa do tipo selvagem. Os valores foram ajustados para os níveis de antí- geno.

Linhagens celulares estáveis em células HEK293 foram estabe- lecidas e cada um dos zimogênios foram purificados de 10 L de meios con- dicionados (14, 24). As variantes foram ativadas com RVV-X e subseqüen- temente purificadas através de cromatografia de filtração em gel (14,24). SDS-PAGE das variantes antes e seguindo ativação (reduzindo e não- reduzindo) é mostrada na Figura 4.

Focalizou-se primeiro em avaliar alterações no ambiente do sítio ativo de cada uma das variantes usando sondas específicas que alvejam esta região de FXa. Estudos cinéticos usando substratos de peptidila e son- das direcionadas por sítio ativo revelaram que FXaI16L e FXaV17A têm uma habilidade prejudicada para ligar estas sondas (aumento de 15 a 25 vezes na Km ou Ki), enquanto a taxa de catálise (kcat) foi reduzida em 3 vezes, comparada ao FXa do tipo selvagem (derivado de plasma e recombinante) (Tabelas 2 e 3). Fator Xal 16G não foi inibido por nenhuma das sondas exa- minadas e sua atividade cromogênica foi prejudicada severamente (500 a 1000 vezes) impedindo o cálculo dos parâmetros cinéticos. Estes dados são consistentes com a idéia que dessestabilização de formação da ponte de sal interna (Ile16-Asp194), influencia ligar no sítio de especificidade de S1. Em contraste com estes resultados, o conjunto de FXaI 16L e FXaVI 7A em pro- trombinase completamente restabeleceu a Km quase para substratos de peptidila enquanto a kcat ainda era 3 vezes reduzida, indicando que ligação de FVa pode resgatar ligação no sítio ativo (Tabelas 2 e 3). Surpreendente- mente até mesmo o valor de Km para I16G quase foi restabelecido comple- tamente (aumento de 3 vezes comparado a FXa do tipo selvagem) quando agrupado em protrombinase; porém uma redução de 60 vezes na kcat foi observada.

Tabela 2: Constantes de Cinética para Clivagem de Substrato Cromogênico

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Para experimentos em que o fator Xa livre foi usado, 2,0 nM de fator Xa do tipo selvagem ou 6,0 nM de mutante foram incubados com con- centrações crescentes de Spectrozyme FXa e para experimentos em que protrombinase foi empregada 5,0 nM de fator Xa do tipo selvagem ou mutan- te foram incubados com 30 nM de fator Va1 50 nm de PCPS e concentrações crescentes de substrato (10 a 500 μΜ). Atividade cromogênica foi avaliada monitorando o aumento na absorbância em 405 nm com o tempo. Os erros nas constantes ajustadas representam 95 % de limites de confidência.

Consistentes com estes dados, estudos cinéticos usando pro- trombina revelaram que os valores de Km obtidos para cada uma destas variantes agrupadas na protrombinase foram essencialmente equivalentes à enzima do tipo selvagem, enquanto os valores de kcat onde reduzidos a uma extensão similar como para os substratos cromogênicos (Tabela 4).

Considerados juntos, os resultados indicam que a transição de zimogênio para protease para FX não só influencia a formação do sítio de S1, mas também contribui de um modo substancial para a formação de um sítio de ligação de FVa. Uma vez que ligação direta destas variantes de FXa para FVa resgata ligação no sítio de S1, ligação alostérica provavelmente existe entre estes sítios. Coletivamente estes estudos ilustraram um único modo para modificar a via de transição de zimogênio para protease e revelaram um possível modo para desenvolver formas semelhantes a zimogênio das enzimas que são "ativadas" seguindo ligação de Iigante forte tal como prote- ínas de co-fator.

Tabela 3: Constantes de Cinética para Inibição de FXA e Protrombinase

<table>table see original document page 35</column></row><table> Tabela 4: Constantes de Cinética para Clivagem de Protrombina

<table>table see original document page 36</column></row><table>

Os resultados obtidos com o substrato cromogênico e os inibido- res loco-direcionados ativos indicam que as variantes de FXa semelhantes a zimogênio ligam às sondas de sítio ativas com afinidade reduzida. Porém, agupamento destas variantes em protrombinase melhora significativamente a afinidade para as sondas de sítio ativo, sugerindo que Iigante de FVa pode resgatar ligação no sítio ativo. A seguir investigou-se se o contrário é tam- bém verdadeiro, ou seja, ocupação do sítio ativo semelhante a zimogênio influencia ligação a FVa. Para avaliar esta hipótese mediu-se as constantes de ligação entre FVa e FXaI16L e FXaVI 7A. Para realizar isto incubou-se FVa com um derivado fluorescente de FXa do tipo selvagem inativo na pre- sença de vesículas de fosfolipídeo sintéticas e íons de Ca2+. A formação dos complexos resulta no aumento do sinal fluorescente com relação a FXa fluo- rescente sozinho. Depois adicionou-se concentrações crescentes de um FXa não-fluorescente que, se puder ligar a FVa, deslocará o FXa fluorescente, que resulta em uma diminuição do sinal fluorescente. Como um controle foi adicionado FXa de S195A como um competidor. Este mutante é inativo por- que está faltando o Ser da tríade catalítica, mas tem uma afinidade alta para o FVa (Tabela 5). Em contraste, quando adicionou-se FXaI16L ou FXaVI7A a afinidade destas variantes semelhantes a zimogênio para FXa foi significa- tivamente reduzida comparada a FXaS195A (Tabela 5). A seguir examinuo- se se a ocupação covalente do sítio ativo de FXaI 16L poderia restabelecer ligação a FVa. Para fazer isto foram modificamos o sítio ativo de FXa do tipo selvagem e FXaI16L com um inibidor irreversível (EGR-clorometil cetona) e depois repetiu-se o experimento. Os dados mostram que o sítio ativo blo- queou as membranas de FVa ligadas a FXaI16L com a mesma afinidade que o sítio ativo do tipo selvagem bloqueou FXa. Isto indica que ocupação do sítio ativo de FXa semelhante a zimogênio tem uma influência direta na ligação a FVa.

Tabela 5: Constantes de Ligação de Equilíbrio para Agrupamento de Pro- trombinase

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Com base na observação que os derivados de FXa semelhantes a zimogênio têm reatividade fraca com sondas sítio ativo-direcionadas e ini- bidores na ausência de FVa, mas aparentemente atividade quase normal quando as variantes são agrupadas em protrombinase, a seguir avalia-se a atividade de FXaM 6L em um ambiente de plasma. Plasma hemofílico A (da- dos não mostrados) ou B teve picos com FXa do tipo selvagem para corrigir o tempo de coagulação (aPTT) destes plasmas; 0,1 nM de FXa do tipo sel- vagem deram um tempo de coagulação de -32 seg. A adição da mesma concentração de FXaI 16L deu um tempo de coágulo de -42 seg, que é - 50- 70 % da atividade relativa a FXa do tipo selvagem, sugerindo que esta vari- ante semelhante a zimogênio tem atividade de coagulação quase normal no plasma. A seguir foi monitorada a meia-vida de FXa do tipo selvagem e FXaI 16L em plasma de hemofilia B. As proteínas foram adicionadas ao plasma de HB e em pontos de tempo diferentes, uma alíquota da mistura foi retirada e ensaiada em um ensaio baseado em aPTT. Os resultados com plasma de HB mostram que a atividade residual relativa de FXa do tipo sel- vagem foi inibida muito rapidamente (< 2-min) (Figura 6). Em contraste, a atividade de FXaI 16L persistiu por muito mais tempo com uma meia-vida estimada de >2 horas. Foram encontrados resultados similares com plasma de hemofilia A. Estes resultados sugerem que é possível modular as carac- terísticas de uma enzima de forma que ela tenha uma meia-vida longa no plasma e pode corrigir o tempo de coagulação de um plasma hemofílico.

A seguir foi avaliada a habilidade de FXaI 16L semelhante a zi- mogênio modular hemóstase em um modelo murino de hemofilia (Schlach- terman et. al., 2005, J. Thromb. Haemost., 3, 2730-2737). O valor de aPTT de camundongos com hemofilia B (C57BL/6) é aproximadamente 50-55 seg. Fator Xal 16L (200 pg/kg; η = 7) ou PBS (n = 4) foi injetado por meio da veia de cauda de camundongos com hemofilia B. Em pontos de tempo selecio- nados (5 e 30 min) sangue foi colhido e um aPTT foi executado em todas as amostras. Como mostrado na Figura 7, infusão de FXaI 16L resultou em cor- reção completa do aPTT para níveis vistos em animais normais. Este efeito foi contínuo por pelo menos 30 min indicando que a molécula tem uma meia- vida relativamente longa in vivo. Infusão de PBS teve apenas um efeito mar- ginal. Estes dados são consistentes com os experimentos in vitro em plasma acima e indicam que de fato FXaI 16L e possivelmente outras variantes de FXa semelhantes a zimogênio podem modular hemóstase eficazmente in vivo.

Para também testar a eficácia de FXaI16L in vivo, foi examinado se esta molécula poderia corrigir o tempo de hemorragia de camundongos com hemofilia B seguindo lesão na cauda (Schlachterman, et. al., 2005, J. Thromb. Haemost., 3, 2730-2737). Perda de sangue foi medida durante um período de 10 min seccionando a parte distai da cauda. Neste tipo de ensaio, a perda de sangue é mínima em camundongos Balb-c normais do tipo sel- vagem (n = 7) e bastante substancial em camundongos injetados com PBS (n = 6) com hemofilia B (Balb c) seguindo a lesão da cauda (Figura 8). Em contraste, injeção de 450 pg/kg de FXaI16L significativamente reduziu a quantidade total de perda de sangue seguindo a lesão da cauda (n = 7). Considerados juntos, estes dados fornecem evidência que FXaI 16L tem a habilidade para melhorar hemóstase em pacientes com hemofilia A ou B.

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Embora certas das modalidades preferidas da presente invenção tenham sido descritas e especificamente exemplificadas acima, a invenção não é intencionada a ser limitada por tais modalidades. Várias modificações podem ser feitas a esta sem divergir do escopo e espírito da presente inven- ção, como exposta nas reivindicações a seguir. Seqüência de Listagem

<110> Camire, Rodney M.

<120> Composições e Métodos para Modular Hemóstase

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência Sintética <400> 1

Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gln Ala Asn

20 25 30

Asn Ile Leu Ala Arg Val Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met

35 40 45

Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr

50 55 60

Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 65 70 75 80

Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln

85 90 95

Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys

100 105 110

Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Plie Thjr Arg Lys Leu 115

Cys Ser Leu Asp Asn 130

Asn Ser Val Val Cys 145

Gly Lys Ala Cys Ile 165

Leu Glu Arg Arg Lys 180

Glu Ala Pro Asp Ser 195

Asp Pro Thr Glu Asn 210

Pro Glu Arg Gly Asp 225

Cys Lys Asp Gly Glu 245

Asn Glu Gly Phe Cys 260

Thr Ala Ala His Cys 275

Gly Asp Arg Asn Thr 290

Val Glu Val Val Ile 305

Phe Asp Ile Ala Val 325

Asn Val Ala Pro Ala 340

Leu Met Thr Gln Lys 355

Glu Lys Gly Arg Gln

120

Gly Asp Cys Asp Gln Phe 135

Ser Cys Ala Arg Gly Tyr 150 155

Pro Thr Gly Pro Tyr Pro 170

Arg Ser Val Ala Gln Ala 185

Ile Thr Trp Lys Pro Tyr 200

Pro Phe Asp Leu Leu Asp 215

Asn Asn Leu Thr Arg Ile 230 235

Cys Pro Trp Gln Ala Leu 250

Gly Gly Thr Ile Leu Ser 265

Leu Tyr Gln Ala Lys Arg 280

Glu Gln Glu Glu Gly Gly 295

Lys His Asn Arg Phe Thr 310 315

Leu Arg Leu Lys Thr Pro 330

Cys Leu Pro Glu Arg Asp 345

Thr Gly Ile Val Ser Gly 360

Ser Thr Arg Leu Lys Met

125

Cys His Glu Glu Gln 140

Thr Leu Ala Asp Asn 160

Cys Gly Lys Gln Thr 175

Thr Ser Ser Ser Gly 190

Asp Ala Ala Asp Leu 205

Phe Asn Gln Thr Gln 220

Val Gly Gly Gln Glu 240

Leu Ile Asn Glu Glu 255

Glu Phe Tyr Ile Leu 270

Phe Lys Val Arg Val 285

Glu Ala Val His Glu 300

Lys Glu Thr Tyr Asp 320

Ile Thr Phe Arg Met 335

Trp Ala Glu Ser Thr 350

Phe Gly Arg Thr His 365

Leu Glu Val Pro Tyr 370 375 380

Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln 385 390 395 400

Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln 405 410 415

Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe 420 425 430

Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys 435 440 445

Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg 450 455 460

Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu 465 470 475 480

Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 485

<210> 2 <211> 1467 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Seqüência Sintética <220>

<221> característica mista <222> (703) ... (711), (1252)...(1254) <223> η = a, t, c, ou g <400> 2

atggggcgcc cactgcacct cgtcctgctc agtgcctccc tggctggcct cctgctgctc 60 ggggaaagtc tgttcatccg cagggagcag gccaacaaca tcctggcgag ggtcaggagg 120 gccaattcct ttcttgaaga gatgaagaaa ggacacctcg aaagagagtg catggaagag 180 acctgctcat acgaagaggc ccgcgaggtc tttgaggaca gcgacaagac gaatgaattc 240 tggaataaat acaaagatgg cgaccagtgt gagaccagtc cttgccagaa ccagggcaaa 300 tgtaaagacg gcctcgggga atacacctgc acctgtttag aaggattcga aggcaaaaac 360 tgtgaattat tcacacggaa gctctgcagc cacgaggaac agaactctgt ggtgtgctcc ggcaaggcct gcattcccac agggccctac aagaggtcag tggcccaggc caccagcagc aagccatatg atgcagccga cctggacccc aaccagacgc agcctgagag gggcgacaac tgcaaggacg gggagtgtcc ctggcaggcc tgtggtggaa ctattctgag cgagttctac gccaagagat tcaaggtgag ggtaggtgac gcggtgcacg aggtggaggt ggtcatcaag ttcgacatcg ccgtgctccg gctcaagacc gcctgcctcc ccgagcgtga ctgggccgag gtgagcggct tcgggcgcac ccacgagaag gaggtgccct acgtggaccg caacagctgc aacatgttct gtgccggcta cgacaccaag ggcccgcacg tcacccgctt caaggacacc gagggctgtg cccgtaaggg gaagtacggg tggatcgaca ggtccatgaa aaccaggggc gtcataacgt cctctccatt aaagtga

ctggacaacg gggactgtga ccagttctgc 420 tgcgcccgcg ggtacaccct ggctgacaac 480 ccctgtggga aacagaccct ggaacgcagg 540 agcggggagg cccctgacag catcacatgg 600 accgagaacc ccttcgacct gcttgacttc 660 aacctcacgc gtnnnnnnnn nggccaggaa 720 ctgctcatca atgaggaaaa cgagggtttc 780 atcctaacgg cagcccactg tctctaccaa 840 cggaacacgg agcaggagga gggcggtgag 900 cacaaccggt tcacaaagga gacctatgac 960 cccatcacct tccgcatgaa cgtggcgcct 1020 tccacgctga tgacgcagaa gacggggatt 1080 ggccggcagt ccaccaggct caagatgctg 1140 aagctgtcca gcagcttcat catcacccag 1200 caggaggatg cctgccaggg gnnnagcggg 1260 tacttcgtga caggcatcgt cagctgggga 1320 atctacacca aggtcaccgc cttcctcaag 1380 ttgcccaagg ccaagagcca tgccccggag 1440

Claims (17)

1. Variante de zimogênio/protease de Fator X/Fator Xa1 caracte- rizada pelo fato de que modula a hemostase.

2. Variante de zimogênio protease de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que a dita variante é uma variante de Fator X/Fator Xa codificada pela SEQ ID NO: 2, em que os nucleotídeos 1684- -1695 da SEQ ID NO: 2 podem codificar qualquer aminoácido com a condi- ção que os nucleotídeos 1684-1866 não codifiquem Val ou Ala.

3. Variante de zimogênio/protease de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que contém pelo menos uma modificação na SEQ ID NO: 1 selecionada do grupo que consiste em: a) Ile na posição 16 é Leu1 Phe1 Asp ou Gly; b) Val na posição 17 é Leu, Ala1 ou Gly e c) Asp na posição 194 é Asn ou Glu.

4. Ácido nucléico, caracterizado pelo fato de que codifica a vari- ante de zimogênio/protease como definida na reivindicação 3, em que o dito ácido nucléico codifica opcionalmente um sítio de clivagem intracelular de PACE/Furina.

5. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que possui a seqüência de SEQ ID NO: 2, em que os nucleotí- deos nas posições 1684-1695 codificam os aminoácidos selecionados do grupo que consiste em Leu-Val-Gly1 Gly-Val-Gly, Ile-Ala-Gly1 Phe-Val-Gly e IIe-GIy-GIy1 o dito ácido nucléico opcionalmente compreendendo nucleotí- deos na posição 2233-2235 que codifica um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em Asn ou Glu.

6. Variante de zimogênio/protease, caracterizada pelo fato de que é codificada pelo ácido nucléico como definido na reivindicação 5.

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a variante de Fator Xa como definida na reivindicação 3, em um veículo biologicamente compatível.

8. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é clonado em um vetor de expressão.

9. Vetor como definido na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em um vetor ade- noviral, um vetor adenovirus-associado, um vetor retroviral, um plasmídeo, e um vetor lentiviral.

10. Variante de zimogênio/protease de acordo com a reivindica- ção 3, caracterizada pelo fato de que a dita variante exibe afinidade de liga- ção inferior para o sítio ativo que pode ser restabelecido quando ligado por um co-fator adequado.

11. Variante de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o dito co-fator é fator Va.

12. Uso de uma variante de zimogênio/protease de Fator X/Fator Xa que modula hemostase e que contém pelo menos uma modificação na SEQ ID NO: 1 selecionada do grupo que consiste em: a) Ile na posição 16 é Leu, Phe, Asp ou Gly; b) Val na posição 17 é Leu, Ala, ou Gly; e c) Asp na posição 194 é Asn ou Glu; caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tra- tamento de um distúrbio relacionado à hemostase.

13. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a dita variante é um pró-coagulante e o dito distúrbio é selecio- nado do grupo que consiste em hemofilia AeB, hemofilia AeB associada a anticorpos inibidores, deficiência de fator de coagulação, deficiência de vita- mina K-epóxido reductase C1, deficiência de gama-carboxilase, hemorragia associada a trauma, lesão, trombose, trombocitopenia, acidente vascular cerebral, coagulopatia, coagulação intravascular disseminada (DIC); distúr- bios de tratamento de sobre-anticoagulação, síndrome de Bernard Soulier, tromblastemia de Glanzman, e deficiência de fundo geral de armazenamen- to.

14. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a dita variante é um anticoagulante e o dito distúrbio é selecio- nado do grupo que consiste em trombose, trombocitopenia, acidente vascu- lar cerebral, e coagulopatia.

15. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os ditos aminoácidos nas posições 16,17 e 18 na SEQ ID NO: 1 são selecionados a partir do grupo que consiste em Leu-Val-Gly1 Gly-Val- Gly, Ile-Ala-Gly1 Phe-Val-Gly e Ile-Gly-Gly e o aminoácido na posição 194 é selecionado do grupo que consiste em Asn e Glu.

16.

Variante de zimogênio/protease de Fator X/Fator Xa1 carac- terizada pelo fato de que modula hemostase e que contém pelo menos uma modificação na SEQ ID NO: 1 selecionada do grupo que consiste em: a) Ile na posição 16 é Leu, Phe1 Asp ou Gly; b) Val na posição 17 é Leu, Ala, ou Gly; e c) Asp na posição 194 é Asn ou Glu; para o uso no tratamento de distúrbio relacionado à hemostase.