AT410216B - Faktor x-analogon mit verbesserter aktivierbarkeit - Google Patents
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Description
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Die Erfindung betrifft Faktor X-Analoge mit verbesserter Aktivierbarkeit mit einer Substitution im Bereich des Aktivierungspeptids, eine Praparation enthaltend die erfindungsgemässen Faktor X- Analogen sowie ein Verfahren zur Herstellung von einzelkettigen und zweikettigen Faktor X- Analogen.
Nach Initiierung des Blutgerinnungsprozesses verläuft die Gerinnungskaskade durch die sequentielle Aktivierung von verschiedenen Proenzymen (Zymogenen) im Blut in ihre aktive For- men, den Sennproteasen. Dazu gehören u.a. Faktor XII/Xlla, Faktor XI/Xla, Faktor IX/IXa, Faktor X/Xa, Faktor VII/Vlla und Prothrombin/Thrombin Die meisten dieser Enzyme sind im physiologi- schen Zustand nur aktiv, wenn sie in einem Komplex an einer Membranoberflache assoziiert sind.
Ca-Ionen sind in viele dieser Prozesse involviert. Die Blutgerinnung folgt entweder dem intrinsi- schen Weg, bei dem alle Proteinkomponenten im Blut vorhanden sind, oder dem extrinsischen Weg, bei dem der Zellmembran-Gewebefaktor eine kritische Rolle spielt Der Wundverschluss erfolgt schliesslich durch die Spaltung von Fibnnogen zu Fibrin durch Thrombin.
Der Prothrombinase-Komplex ist verantwortlich für die Aktivierung von Prothrombin zu Throm- bin. Thrombin ist ein wichtiges Enzym, das sowohl als Prokoagulant als auch als Antikoagulant wirken kann. Der Prothrombinase-Komplex, an dem u. a. Faktor Va (als Cofaktor) und Faktor Xa (als Serinprotease) beteiligt sind, assembliert in einer Ca-abhängigen Assoziation an der Oberfla- che von Phospholipiden. Es wird diskutiert, dass dabei die katalytische Komponente des Prothrom- binase-Komplexes Faktor Xa ist.
Faktor X (Stuart/Prower-Faktor) ist ein Vitamin K-abhängiges Koagulationsglykoprotein, das in der intrinsischen und extrinsischen Blutgerinnungskaskade beteiligt ist. Das primäre Translati- onsprodukt von Faktor X (pre-pro-FX) besitzt 488 Aminosauren und wird von der Leber oder huma- nen Hepatoma-Zellen zunächst als einzelkettiges 75 kD Vorläuferprotein synthetisiert Im Plasma liegt Faktor X weitgehend als zweikettiges Molekül vor (Fair et al. 1984 Blood 64- 194-204)
Wahrend der Biosynthese wird nach Abspaltung der pre-Sequenz durch eine Signalpeptidase (zwischen Ser23/Leu24) und des Propeptides (zwischen Arg40/Ala41) das einzelkettige Faktor X- Molekul durch Prozessierung und Deletion des Tripeptides Arg180-Lys181-Arg-182 in die zweiket- tige Form, bestehend aus der ca 22 kD leichten Kette und der ca.
50 kD schweren Kette, die miteinander uber eine Disulfid-Brücke verbunden sind, gespalten (Figur 1) Faktor X zirkuliert im Plasma daher als zweikettiges Molekül
Während des Blutgerinnungsprozesses wird Faktor X vom inaktiven Zymogen zur aktiven Pro- tease Faktor Xa durch limitierte Proteolyse konvertiert, wobei die Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa in einem von 2 membrangebundenen Komplexen erfolgen kann. dem extrinsischen Faktor Vlla/Gewebefaktor-Komplex oder dem intrinsischen Faktor Villa-Faktor IXa-Phospholipid- Ca-Komplex oder "Tenase-Komplex" (Mertens et al 1980. Biochem.
J. 185.647-658) Eine proteo- lytische Spaltung zwischen Aminosäuren Arg 234/lle 235 fuhrt zur Freisetzung eines 52 Aminosäu- ren langen Aktivierungspeptids vom N-Terminus der schweren Kette und damit zur Bildung des aktiven Enzyms, Faktor Xa Das katalytische Zentrum des Faktor Xa ist auf der schweren Kette lokalisiert
Die Aktivierung über den Faktor Vlla-TF(extrinsischen)-Komplex führt zur Bildung von Faktor Xaa (35 kD) und Faktor Xass (31 kD), wobei bei geringen Konzentrationen von Faktor Vlla im Komplex auch ein Polypeptid von 42 (kD) auftntt.
Die Bildung von Faktor Xaa erfolgt über eine Spaltung bei Arg234/Ile 235 der schweren Kette und repräsentiert die Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa Das Auftreten von Faktor Xass resul- tiert vermutlich aus einer autokatalytischen Spaltung bei Arg469/Gly470 im C-Terminus der schwe- ren Kette von Faktor Xaa und der Abspaltung eines 4. 5 kD-Peptides. Faktor Xass besitzt ebenfalls wie Faktor Xaa katalytische Aktivität.
Es wurde jedoch gezeigt, dass durch die Spaltung von Faktor Xaa zu Faktor Xass eine Plasminogen-Rezeptorbindungsstelle entsteht und Faktor Xass gegebenen- falls fibrinolytische Aktivität aufweist bzw an Fibrinolyse als Cofaktor beteiligt ist Die Umwandlung von Faktor Xaa zu Faktor Xass ist jedoch langsamer als die Bildung von Thrombin, wodurch eine Initiierung der Fibrinolyse vor Ausbildung eines Blutklots verhindert wird (Pryzdial et al. 1996 J Biol. Chem 271, 16614-16620, Pryzdial et al 1996. J. Biol. Chem 271 16621-16626)
Das 42 kD-Polypeptid resultiert aus einer Prozessierung im C-Terminus der schweren Kette zwischen Arg469/Gly470 ohne vorherige Prozessierung zwischen Arg234/Ile 235.
Dieses Interme- diat besitzt ebenso wie ein Faktor Xay-Fragment, das durch Proteolyse bei Lys370 entsteht, keine
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katalytische Aktivität (Mertens et al. 1980 Biochem. J. 185: 647-658 ; Pryzdial et al. 1996 J Biol Chem. 271 16614-16620).
Die Aktivierung von Faktor X im intrinsischen Weg wird katalysiert durch den Faktor IXa-Faktor Villa-Komplex. Während der Aktivierung werden die gleichen Prozessierungsprodukte erhalten, jedoch wird das Faktor Xass-Produkt in einem hoheren Ausmass erhalten als andere Faktor X- Prozessierungsprodukte (Jesty et al 1974. J Biol. Chem. 249: 5614).
In vitro kann Faktor X beispielsweise durch Russell's Viper Venom (RVV) oder Trypsin (Bajaj et al 1973 J Biol. Chem 248: 7729-7741) oder gereinigte physiologische Aktivatoren, wie FVlla/TF- Komplex oder Faktor IXa/Faktor Villa-Komplex aktiviert werden (Mertens et al. 1980 Biochem J.
185- 647-658).
Kommerziell erhältliche Faktor X-Produkte aus Plasma enthalten zumeist eine Mischung aus Faktor Xaa und Faktor Xass, da nach Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa in erster Linie Faktor Xaa entsteht, der in einem autokatalytischen Prozess wiederum zu Faktor Xass gespalten wird
Um ein einheitliches Faktor Xa-Produkt mit hoher molekularer Integrität herzustellen, wurde in der EP 0 651 054 vorgeschlagen, Faktor X mit RVV über einen längeren Zeitraum zu aktivieren, sodass das resultierende Endprodukt im wesentlichen Faktor Xass enthielt. Sowohl die Nebenpro- dukte, beispielsweise Faktor Xaa, als auch die Protease wurden anschliessend durch mehrere chromatographische Schritte entfernt
Die cDNA für Faktor X wurde isoliert und charakterisiert (Leytus et al. 1984. Proc. Natl. Acad.
Sc1 USA 82. 3699-3702; Fung et al. 1985 Proc Natl. Acad Sei. USA 82 : Humaner Faktor X wurde in vitro in verschiedenen Zelltypen, wie humanen embryonalen Nierenzellen oder CHO-Zellen expnmiert (Wolf et al. 1991. J. Biol Chem 266' 13726-13730). Es wurde jedoch festgestellt, dass bei der rekombinanten Expression von humanem Faktor X die Prozessierung an Position Arg40/Ala41 im Gegensatz zur in vivo Situation ineffizient erfolgt und unterschiedliche N-Termini an der leichten Kette von Faktor X entstehen (Wolf et al. 1991. J.
Biol.Chem. 266: 13726-13730). Rekombinanter Faktor X (rFX) wurde durch RW in vitro zu rFaktor Xa (rFXa) aktiviert oder rFXa direkt exprimiert, wobei das Aktivierungspeptid von Aminosäure 183 bis Aminosäure 234 deletiert und durch ein Tripeptid ersetzt wurde, um eine Prozessierung unmit- telbar in eine zweikettige rFXa Form zu ermöglichen Gereinigter rFX wurde zu etwa 70% in leichte und schwere Kette prozessiert, während die verbleibenden 30% einzelkettigen rFX mit 75 kD darstellten Direkte Expression von rFXa führte zwar zur Bildung von aktivem Faktor Xa, jedoch auch zu inaktiven Intermediaten. Wolf et al (1991.
J Biol.Chem. 266 : 13726-13730) stellten weiterhin eine verringerte Aktivität von rekombinantem Faktor X fest, die sie auf die schlechtere Aktivierbarkeit des rFX durch RW sowie auf die inaktive Population an Proteinen und Polypeptiden des einzelkettigen Vorlaufermolekuls zuruckführten Insbesondere fanden sie ein hohe Instabilitat von rFXa bei Expression durch rekombinante Zellen, was sie auf die hohe Autoproteolyserate zurückführten
In der WO 98/38317 werden Faktor X-Analoge beschrieben, bei denen die Aminosauren im Bereich zwischen Glu228 und Arg234 modifiziert sein können, wodurch diese Konstrukte beispiels- weise durch Proteasen wie Funn aktiviert werden konnen
Um die Funktion des C-terminalen Peptides von Faktor Xaa zu untersuchen, führten Eby et al (1992.
Blood 80 (Suppl 1) 1214 A) ein Stopcodon an Position Gly430 der Faktor X-Sequenz ein.
Sie fanden jedoch keinen Unterschied zwischen der Aktivierungsrate von Faktor Xa (FXaa) mit #- Peptid oder einer Deletionsmutante ohne #-Peptid (FXass)
Faktor Xa ist ein wichtiger Bestandteil des Prothrombinase-Komplexes und findet daher Ein- satz bei der schnellen Stillung von Blutungen und bei Patienten mit Störungen der Blutgerinnung, beispielsweise bei Hamophilie. Insbesondere die Behandlung von Hämophilie-Patienten mit Faktor VIII- oder Faktor IX-Defizienz mit Faktoren-Konzentraten, hergestellt aus Plasma, wird bei längeren Therapiezeiten oft dadurch kompliziert, dass inhibitorische Antikorper gegen diese Faktoren gebildet werden.
Es wurden daher eine Reihe von Alternativen entwickelt, um Hämophilie-Patienten mit Faktoren mit einer By-pass-Aktivitat zu behandeln So wurde die Verwendung von Prothrombin- Komplex-Konzentrat, partiell aktiviertem Prothrombinase-Komplex (APPC), Faktor Vlla oder FEIBA
EMI2.1
se FEIBA oder Autoplex. FEIBA etwa enthalt vergleichbare Einheiten an Faktor 11. Faktor VII, Faktor IX, Faktor X und FEIBA, geringe Mengen an Faktor VIII und Faktor V, sowie Spuren von
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aktivierten Koagulansfaktoren, wie Thrombin und Faktor Xa bzw einen Faktor mit Faktor X-ähnli- cher Aktivität (Eisinger 1982. Activated Prothrombin Complex Concentrates Ed.
Mariani, Russo, Mandelli, p 77-87) Elsinger weist insbesondere auf die Bedeutung einer "Faktor Xa-like"-Aktivit#t in FEIBA hin Faktor VIII-Bypass-Aktivitat wurde von Giies et al (1988. British J Haematology 9: 491- 497) fur eine Kombination von gereinigtem Faktor Xa und Phospholipiden im Tiermodell gezeigt
Es besteht daher ein grosser Bedarf und eine Reihe von verschiedenen Anwendungsgebieten für Faktor X/Xa oder Faktor X/Xa-ahnlichen Proteinen entweder allein oder als Bestandteil eines Koagulationskomplexes in der Blutstillungstherapie. Die Halbwertszeit von Faktor Xa ist gegenüber dem Zymogen sowohl in vivo als auch in vitro stark herabgesetzt So kann etwa Faktor X in Glyce- nn 18 Monate stabil aufbewahrt werden, während Faktor Xa unter gleichen Bedingungen nur 5 Monate stabil ist (Bajaj et al. 1973. J.
Biol Chem 248. 7729-2241) bzw in Glycerin bei 4 C nach 8 Monaten eine Reduktion der Aktivität um mehr als 60% zeigt (Teng et al. 1981. Thrombosis Res 22 213-220). Die Halbwertszeit von Faktor Xa betragt lediglich 30 Sekunden im Serum
Aufgrund der Instabilitat von Faktor Xa wurde vorgeschlagen, Faktor X-Praparate zu verabrei- chen (US 4,501,731).
Bei lebensbedrohenden Blutungen, insbesondere bei Hämophilie-Patienten, ist jedoch ein Verabreichung von Faktor X wirkungslos, da durch das Fehlen des funktionellen "Tenase-Komplexes" im intnnsischen Blutgerinnungsweg keine ausreichende Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa erfolgen kann und die Aktivierung über den extrinsischen Weg oftmals zu
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chend Faktor X vorhanden, der jedoch im Vergleich zu Faktor Xa eine 1000fach geringere Prothrombinase-Aktivität besitzt In solchen Fallen ist es erforderlich aktivierten Faktor Xa direkt, gegebenenfalls zusammen mit Phospholipiden, wie bei Giles et al (1988 Bntish J Haematology 9 491-497) beschrieben oder mit anderen Koagulationsfaktoren etwa mit Faktor VIII By-pass- Aktivität, zu verabreichen.
Bei der Herstellung von Faktor Xa aus Faktor X erfolgte die Aktivierung bisher zumeist über unphysiologische Aktivatoren tierischen Ursprungs, wie RVV oder Trypsin, wobei jedoch absolut sichergestellt sein musste, dass das Endprodukt vollstandig frei von diesen Proteasen ist Wie oben schon erwahnt, werden bei der Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa eine Vielzahl teilweise auch inaktiver Intermediate gebildet (Bajaj et al 1973 J Bio. Chem. 248 7729-7741, Mertens et al 1980 Biochem. J 185 647-658).
Die Anwesenheit solcher Intermediate führt zu einer Erniedri- gung der spezifischen Aktivität des Produktes und gegebenenfalls auch zu solchen Intermediaten, die als Antagonisten der aktiven Sennprotease fungieren können Zur Herstellung eines einheitli- chen, reinen Produktes mit hoher spezifischer Aktivität sind daher bei konventionellen Methoden aufwendige Verfahren zur Aktivierung sowie zur chromatographischen Reinigung erforderlich.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher eine Präparation zur Verfügung zu stellen, die ein Polypeptid mit Faktor X/Xa-Aktivitat enthalt, das eine gegenüber dem Stand der Technik ver- besserte Aktivierbarkeit durch Faktor Xla oder einem Derivat davon aufweist, das eine hohe Stabili- tat aufweist und das durch Faktor Xla oder einem Derivat davon, ohne die Verwendung einer der im Stand der Technik zur Aktivierung des natürlichen Faktor X bekannten Proteasen, insbesondere tierischen Ursprungs, wie beispielsweise RW oder Trypsin zu Faktor Xa aktiviert werden kann Ein weiteres Ziel ist es, eine pharmazeutische Präparation mit Faktor VIII-Bypass-Aktivitat bereitzustel- len
Diese Aufgaben werden erfindungsgemass dadurch gelost,
dass ein Faktor X-Analogon mit zumindest einer Aminosäuren-Substitution im Bereich des Aktivierungspeptids zur Verfugung gestellt wird, das eine Substitution an der Stelle Arg227 und/oder Gly228 aufweist, und gegebe- nenfalls zumindest eine der Aminosäuren zwischen Gly228 und Arg234, und gegebenenfalls lle235, bezogen auf die Aminosauresequenz gemass Fig 1, substituiert ist Die Position der Amino- sauren ist dabei auf die Nummenerung gemass der in Fig 1 dargestellten Sequenz bezogen, und zwar beginnend mit Met1 und endend mit Lys488.
Die Aminosäure-Substitution in diesem Bereich ist eine neue, nicht-natürlicherweise an dieser Position im Polypeptid vorkommende Erkennungs- bzw Prozessierungsstelle für Faktor Xla oder einem Denvat davon, ausgenommen eine Sequenz Glu-Arg-Gly-Asp-Asn-Asp-Phe-Thr-Arg/Ile der Aminosäuren 226-234, der normalerweise FX nicht spaltet Überraschenderweise zeigt das erfindungsgemässe Faktor X Analogen eine mindestens 2-fach, bevorzugterweise mindestens 5-fach, besonders bevorzugt eine mindestens 10-fach ge- steigerte Aktivierbarkeit durch Faktor Xla gegenuber dem Faktor X-Analogon gemäss der
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WO 98/38317 aufweist
Weiters hat sich überraschenderweise gezeigt,
dass das Faktor X-Analogon gemäss vorliegen- der Erfindung bei einer Antigen-Konzentration von 4 bis 8 ug/ml die Gennnungszeit von Faktor IX oder FVIII-defizientem Plasma effizienter reduzieren kann als > 200mU, bevorzugt > 500mU, beson- ders bevorzugt > 1000mU Plasma Faktor IX oder FVIII.
Vorzugsweise ist zusatzlich zumindest eine der Aminosäuren zwischen 228 und 234, gegebe- nenfalls 235, substituiert. Besonders bevorzugt ist, wenn möglichst viele der Aminosäuren im Bereich 228-235 einer Spaltstelle für Faktor Xla oder einem Derivat davon entsprechen. Die Ein- führung einer spezifischen Faktor Xla-Spaltsequenz, die zumindest 4, vorteilhafter Weise zumin- dest 6, Aminosauren umfasst, hat sich erfindungsgemäss besonders bewährt
Die Substitution ist vorzugsweise so ausgewahlt, dass die Prozessierung durch Faktor Xla zu einem dem nativen Faktor Xa entsprechenden Polypeptid führt, das im Wesentlichen der natürlich vorkommenden Faktor Xa-Sequenz gleicht und ebenfalls Faktor Xa-Aktivität aufweist.
Um eine optimale Prozessierung zu erreichen, kann es in einzelnen Fällen notwendig sein, zusätzlich die Aminosäure lle235 auszutauschen Vorzugsweise sollte die NH2-terminale Amino- säure Isoleucin der schweren Kette jedoch nach Aktivierung erhalten bleiben, da dieser Aminosäu- re bei der Bildung der Substratbindungstasche eine wesentliche Funktion zukommt (Watzke et al., 1995. Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis ed. Katherine High & Harold Roberts). Die erfindungsgemassen Faktor X-Analoge zeigen einen strukturellen Unterschied, insbesondere auf Aminosäure-Ebene im Vergleich zur nativen Faktor X-Sequenz, besitzen jedoch eine vergleichbare Aktivierbarkeit, wie natürlich vorkommender Faktor X bzw. nach Aktivierung, Faktor Xa-Aktivität.
Die Erfindung stellt dabei Faktor X-Analoge zur Verfügung, die eine Substitution im Aktivie- rungspeptid in bezug auf die naturlich vorkommende Faktor X-Sequenz und eine veränderte Pro- tease-spezifität aufweisen. Aminosauresubstitutionen konnen dabei sein an Position lle235 (R1), Arg234, Thr233 (R2), Leu232 (R3), Asn231 (R4), Asn230 (R5), Asp229 (R6), Gly228 (R7) und Arg229 (R8) wobei jedoch vorzugsweise Arg234 unverandert bleibt.
Die erfindungsgemässen Faktor X-Analoga enthalten vorzugsweise eine Faktor X-Sequenz mit Glu226-R8-R7-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1, wobei a) R1 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe lle, Val, oder Ala b) R2 eine Aminosäure ausgewahlt aus der Gruppe Thr, Ser oder Asn, c) R3 eine Aminosäure ausgewahlt aus der Gruppe Phe, Leu, Arg oder Ile, d) R4 eine Aminosäure ausgewahlt aus der Gruppe Asp, Lys, Thr oder Glu, e) R5 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Asn, Ser, Lys, Met, Thr oder Asp; f) R6 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Phe, Thr, Ser, Pro, Leu oder Ile g) R7 eine Aminosäure ausgewahlt aus der Gruppe Ser, Gin, lle, Thr, Asn oder Pro, R8 eine Aminosäure ausgewahlt aus der Gruppe Gin, Ser, His, Tyr oder Glu ist.
Erfindungsgemass unterscheiden sich bevorzugterweise die Aminosäuren 226-234 um minde- stens 4 Aminosäuren von der natürlichen Faktor X-Sequenz, wobei zumindest 3 der Aminosaure- substitutionen vorzugsweise unmittelbar aufeinanderfolgend sind.
Bevorzugterweise handelt es sich dabei um Aminosauresequenzen, die den Aminosaure- sequenzen des Aktivierungspeptids von Faktor IX entsprechen. Diese Sequenzen können huma- nen, aber auch tierischen (z B munnen, porcinen etc ) Faktor IX Aktivierungspeptid-Bereichen entsprechen.
Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemässen Faktor X- Analoge sind dabei FX- Analoge, die eine Substitution aufweisen mit: a) R1= Val, R2= Thr, R3= Leu, R4= Asp, R5= Asn, R6= Asp, R7= Ser und R8= Gin und durch
Faktor Xla oder einem Derivat davon prozessiert wird b) R1= lie, R2= Thr, R3= Leu, R4= Asp, R5= Asn, R6= Asp, R7= Ser und R8= Gin und durch
Faktor Xla oder einem Derivat davon prozessiert wird (Fig. 2). c) R1= Val, R2= Thr, R3= Leu, R4= Lys, R5= Ser, R6= Thr, R7= Gin und R8= Ser und durch
Faktor Xla oder einem Derivat davon prozessiert wird.
d) R1= lle, R2 = Thr, R3= Leu, R4= Lys, R5= Ser, R6= Thr, R7= Gin und R8= Ser und durch
Faktor Xla oder einem Derivat davon prozessiert wird
Vorzugsweise enthält das Faktor X-Analogon die folgende Aminosauresequenz GIn227- Ser228-Phe229-Asn230-Asp231-Phe232-Thr233, bzw Ser227-GIn228-Thr229-Ser230-Lys231-
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Leu232-Thr233
Weitere bevorzugte Varianten können sich aus dem Austausch von einer oder zwei weiteren Aminosäuren der obigen Moleküle a) -d) ergeben, für die die Spaltbarkeit mittels Faktor Xla mit den erfindungsgemass zur Verfugung gestellten Assays belegt worden ist
Die Modifikationen konnen dabei beispielsweise durch gerichtete in vitro-Mutagenese oder PCR oder andere aus dem Stand der Technik bekannten gentechnischen Methoden durchgefuhrt werden, die dazu geeignet sind,
spezifisch eine DNA-Sequenz zu verandern, um gezielt Aminosau- renaustausche auszuführen.
Die Aktivierung des erfindungsgemassen Faktor X-Analogon zu einem nativen Faktor Xa bzw einem Faktor Xa-Analogon erfolgt gemäss der vorliegenden Erfindung durch Faktor Xla oder einem Derivat davon
Eine der Schwierigkeiten bei der Herstellung von aktivem Faktor Xa ist seine Instabilitat, da durch Autokatalyse neben Faktor Xaa auch Faktor Xass und andere, gegebenenfalls inaktive, Intermediate entstehen
Zur Herstellung von im Wesentlichen intakten, aktiven Faktor X/Xa bzw. Faktor X/Xa-ähnlichen Molekulen wäre es daher wunschenswert, nur solche Proteine zu erhalten, die zu stabilen Endpro- dukten führen.
Es ist bekannt, dass eine bevorzugte Spaltstelle für die Prozessierung von Faktor Xaa (Fxaa) zu Faktor Xass (Fxass) zwischen Arg469/Gly470 liegt Aufgrund von Untersuchungen von Eby et al.
(1992. Blood. Vol 80, Suppl. 1,1214) wird neben einem prominenten carboxyterminalen Peptid (Aminosaurereste 476-487) von Faktor X ein weiteres kurzeres Peptid (Aminosäurereste 474 bis 477) gefunden, das durch Autokatalyse von Faktor Xaa entsteht. Um eine gezielte Prozessierung von intaktem Faktor X zu im Wesentlichen aktivem Faktor Xa zu fokussieren, ohne dabei inaktive Prozessierungs-Intermediate zu erhalten, weisen die erfindungsgemässen Faktor X-Analoge weite- re Modifikationen auf
Das erfindungsgemässe Faktor X-Analogon weist daher gemäss einer besonderen Ausführungs- form eine weitere Modifikation im C-terminalen Bereich der Faktor X-Aminosäuresequenz auf.
Gemäss einer Ausfuhrungsform weist ein Faktor X-Analogon der oben beschriebenen Art ein intaktes #-Peptid (Fxa) auf Das erfindungsgemässe Faktor X-Analogon besitzt dabei insbesondere eine Modifikation im Bereich der C-terminalen #-Peptidspaltstelle, die verhindert, dass nach Aktivie- rung von Faktor X zu Faktor Xa eine Abspaltung des #
-Peptids von Faktor X erfolgt Dadurch wird ein Faktor Xa-Molekül erhalten, das bis zu 100% als intaktes Faktor Xaa-Molekül isoliert werden kann
Die Modifikation kann eine Mutation, Deletion oder Insertion im Bereich der Faktor X-Amino- sauresequenz zwischen Aminosaureposition Arg469 und Ser476 und gegebenenfalls von Lys 370 sein Bevorzugt ist jedoch eine Aminosauresubstitution, bei der durch den Aminosaureaustausch eine die Struktur und damit gegebenenfalls die Funktion und Aktivität des Proteins beeinflussende Faltung des Polypeptides nicht erfolgen kann
Gemäss einer Ausfuhrungsform weisen die erfindungsgemässen Faktor X-Analoge einen Aus- tausch einer der Aminosäuren an Position Arg469 und/oder Gly470, wobei Arg469 vorzugsweise gegen Lys, His oder lle und Gly470 vorzugsweise gegen Ser, Ala, Val oder Thr ausgetauscht ist.
Die erfindungsgemässen Faktor X-Analoge konnen neben einer Mutation an Position Arg469 und/oder Gly470 eine weitere Mutation an Position Lys370 und/oder Lys475 und/oder Ser476 aufweisen.
Durch eine Aminosauresubstitution an einer dieser Positionen wird eine Prozessierung von Faktor Xaa zu Faktor Xass bzw Faktor Xay vermieden, da die natürlicherweise vorkommende (n) Prozessierungssequenz(en) derart modifiziert ist (sind), dass eine gegebenenfalls autokatalytische Abspaltung des Carboxy-termmalen Peptids nicht mehr erfolgen kann
Gemäss einer anderen Ausführungsform weist das erfindungsgemässe Faktor X-Analogon eine Deletion des carboxyterminalen #-Peptids (FX#
) auf Ein solches Faktor X-Analogon kann herge- stellt werden, indem eine cDNA kodierend fur ein Faktor X-Analogon in einem rekombinantem Expressionssystem exprimiert wird, wobei nur die Sequenzen kloniert werden, die fur die Amino- säuren Met1 bis Arg469 kodieren
Gemäss einer weiteren Ausfuhrungsform weist das erfmdungsgemasse Faktor X-Analogon ein Translationsstopsignal im C-terminalen Bereich der Faktor X-Sequenz auf Das Translationsstop-
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signal ist dabei vorzugsweise an einer Position, die einer nach natürlicher Prozessierung entste- henden C-terminalen Aminosäure folgt.
Das Translationsstopsignal ist daher vorzugsweise an Position der Aminosäure 470 der Faktor X-Sequenz, damit das endstandige Arg469 des Faktor Xass erhalten bleibt Dazu wird das fur die Aminosäure Gly470 kodierende Kodon GGC gegen TAA, TAG oder TGA substituiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Faktor X-Analoge, die durch Behand- lung mit Faktor Xla oder einem Derivat davon in vivo und in vitro zu nativem Faktor Xa bzw. einem Faktor Xa-Analogon aktiviert werden, also die aktivierten Faktor X-Analoge Abhangig vom Faktor X-Analogon, das eingesetzt und aktiviert wird, wird ein dem nativem Faktor Xa entprechendes und im wesentlichen identes Polypeptid erhalten bzw. ein Polypeptid, das zwar Faktor Xa-Aktivität aufweist, jedoch in bezug auf die native Faktor Xa-Sequenz Modifikationen aufweist, die jedoch nicht die biologische Aktivität beeinträchtigen.
Bei Aktivierung der erfindungsgemässen Faktor X- Analogen, die die Substitution im Bereich des Aktivierungspeptides in der Sequenz des Aktivie- rungspeptids aufweisen, werden ausschliesslich dem nativem Faktor Xa-Molekül entsprechende Polypeptide erhalten Weist ein solches Faktor X-Analogon gegebenenfalls zusatzlich ein Transla- tionsstopsignal im C-terminalen Bereich des #-Peptids auf, so werden Faktor Xass homologe Mole- kule gewonnen. Wird jedoch ein Faktor X-Analogon eingesetzt, das Modifikation(en) innerhalb der #-Peptidsequenz aufweist, die dazu führt (en), das #-Peptid nicht abgespalten wird, so wird ein Faktor Xaa-Analogon mit einem Aminosaureaustausch im C-Terminus des Moleküls erhalten.
Die erfindungsgemässen Faktor X-Analoge weisen ausschliesslich Modifikationen auf, die die Spezifität für die Aktivierbarkeit andern und nicht die Aktivität nachteilig beeinflussen. Es werden daher in jedem Fall biologisch und funktionell aktive Faktor Xa-Moleküle bzw Faktor Xa-Analoge gewonnen
Die Aktivierung in vivo und in vitro kann durch Faktor Xla oder einem Derivat davon erfolgen.
Ein Faktor Xla-Denvat kann dabei ein von Faktor Xla abgeleitetes Polypeptid oder Protein sein, dass sich vom nativen Faktor Xla etwa in seiner Lange unterscheidet (z. B. trunkierte Formen) oder aber durch Aminosäure-Substitution erhalten ist. Wesentlich ist stets, dass auch das Faktor Xla- Derivat stets die für Faktor Xla charaktenstische spezifische Proteaseaktivität aufweist
Gemäss einer besonderen Ausführungsform werden Faktor X-Analoge bereitgestellt, die vor- zugsweise in gereinigter Form als einzelkettige Moleküle vorliegen. Das einzelkettige Faktor X- Molekül zeichnet sich durch seine hohe Stabilität und molekulare Integrität aus Bisher konnte ein einzelkettiges Faktor X-Molekül nicht in gereinigter Form isoliert werden, da es sehr rasch in die zweikettige Form prozessiert wird (Fair et al. 1984 Blood 64.194-204).
Die rekombinanten einzel- kettigen Faktor X-Analoge können durch spezifische Prozessierung in die zweikettige Faktor X- Form prozessiert und anschliessend zu Faktor Xa bzw Faktor Xa-Analogon aktiviert werden. Dies kann dadurch erfolgen, dass das einzelkettige Faktor X-Analoge mit Furin in Kontakt gebracht und prozessiert wird und anschliessend durch Faktor Xla oder einem Denvat aktiviert wird
Zweikettiges Faktor X-Analogon kann zu Faktor Xa bzw Faktor Xa-Analogon aktiviert werden Dies kann bespielsweise dadurch erfolgen, dass ein Faktor X-Analogon, das durch die erfmdungs- gemasse Substitution in Bereich des Aktivierungspeptids eine Faktor Xla Spaltstelle aufweist,
in einer rekombinanten Zelle als einzelkettiges Molekül expnmiert und isoliert und anschliessend durch in Kontakt bringen mit Funn prozessiert wird und dann durch Faktor Xla oder einem Derivat davon in ein aktiviertes Faktor Xa-Molekül gespalten wird
Ein als zweikettiges Molekül aus einer Zellkultur isoliertes Faktor X-Analogon kann direkt mit Faktor Xla oder einem Derivat davon behandelt werden
Ein derart erhaltener Faktor Xa bzw.
Faktor Xa-Analogon weist aufgrund der selektiven und ge- richteten Prozessierungsreaktion eine hohe Stabilität und strukturelle Integrität auf und ist insbe- sondere frei von inaktiven Faktor X/Xa-Analogen-Intermediaten und autoproteolytischen Abbau- produkten Weiters ist das erfindungsgemasse Faktor X-Analogon besonders gut durch Faktor Xla oder einem Derivat davon aktivierbar, gegenüber den Faktor X-Analogen aus der WO 98/38317 ist die Aktivierbarkeit mindestens 2-fach, bevorzugt mindestens 5-fach, besonders bevorzugt minde- stens 10-fach gesteigert Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die erfindungsgemässen Konstrukte die verbesserte Aktivierbarkeit vor allem dadurch erhalten, dass zumindest 4,
vorzugs- weise mindestens 6 der Aminosäuren 226-235 verschieden von den im natürlichen Faktor X-Mole- kül vorkommenden Aminosäuren smd und vorteilhafter Weise zumindest 3 der ausgetauschten
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Aminosauren aufeinander abfolgen
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die rekombinante DNA kodierend für die erfindungsgemässen Faktor X-Analoge.
Die rekombinante DNA resultiert nach deren Expression in einer geeigneten Wirtszelle in einem Faktor X-Analogon mit einer Aminosauresequenz entspre- chend dem humanen Faktor X, ausser dass es eine Aminosäure-Substitution aufweist, die die Pro- zessierungsspezifität und Prozessierungsprodukte beeinflusst
Die biologische Koagulans-Aktivität wird aber in nicht negativ beeinflusst, überraschenderweise kommt es häufig sogar zu einer Steigerung der Aktivität
Gemäss einem weiteren Aspekt werden auch transformierte Zellen enthaltend die rekombinante DNA zur Verfugung gestellt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betnfft eine Präparation enthaltend ein gereinigtes Faktor X- Analogon oder ein Vorlauferprotein davon, das die erfindungsgemässe Aminosäure-Substitution im Bereich der natürlicherweise vorkommenden Faktor Xa-Aktivierungsstelle aufweist. Die Substituti- on im Bereich der Aktivierungsspaltstelle ist eine neue, nicht-natürlicherweise an dieser Position im Polypeptid vorkommende Erkennungs- bzw. Spaltstelle fur Faktor Xla bzw. einem Derivat davon, der das Polypeptid normalerweise nicht an dieser Stelle prozessiert Die Präparation kann dabei eine gereinigte Präparation von Faktor X-Analogen sein, wobei die Polypeptide aus einem Zellkul- tursystem entweder nach Isolierung aus dem Zellkulturuberstand oder aus einem Extrakt einer Zellkultur erhalten werden.
Ein aus einem Zellkultursystem vorgereinigtes rekombinantes Faktor X- Analogon kann über aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren weiter gereinigt werden.
Dazu eignen sich insbesondere chromatographische Verfahren, wie Gelfiltration, lonenaustau- scher- oder Affinitatschromatographie.
Gemäss einer Ausführungsform enthält die erfindungsgemässe Praparation das Faktor X-Analo- gon vorzugsweise als einzelkettiges Molekül in isolierter Form. Eine derartige Praparation wird dadurch herstellt, dass ein durch rekombinante Herstellung gewonnenes Faktor X-Analogon als einzelkettiges Molekul aus einem Zellsystem, vorzugsweise einer Zellkultur von aus Endoprotease- defizienten Zellen, isoliert wird
Gemäss einem besonderen Aspekt enthalt die Praparation einzelkettiges Faktor X-Analogon mit einer Modifikation, die nach Prozessierung durch Funn eine Aktivierung zu Faktor Xa durch Faktor Xla oder einem Derivat davon in vitro erlaubt Die Aktivierung erfolgt dabei durch In-Kontakt- bnngen des Faktor X-Analogons mit den Proteasen,
wobei eine Spaltung in die reife Faktor X-Form und durch die Modifikation eine Abspaltung des Aktivierungspeptids erfolgt und Faktor Xa bzw Faktor Xa-Analogon entsteht.
In der erfindungsgemässen Präparation kann das Faktor X-Analogon entweder als Faktor Xa (FXa) oder mit einer Deletion des #-Peptids vorliegen.
Die Praparation enthalt insbesondere Faktor X-Analogon in enzymatisch inaktiver Form mit ei- ner Reinheit von mindestens 80%, vorzugsweise 90%, besonders bevorzugt von 95% und enthalt keine inaktiven, proteolytischen Intermediate von Faktor X/Xa-Analogon
Gemäss einer weiteren Ausführungsform enthält die erfindungsgemasse Praparation das Faktor X-Analogon vorzugsweise als zweikettiges Molekul in isolierter Form Dazu wird beispielsweise ein durch rekombinante Herstellung als einzelkettiges Molekül aus einem Zellsystem gewonnenes Faktor X-Analogon in vitro, also ausserhalb der Zelle, durch Funn, in die zweikettige Form gespal- ten.
Dies kann dadurch erfolgen, dass die Protease direkt mit dem Kulturuberstand der Faktor X- Analogon exprimierenden Klone gemischt wird, entweder durch Mischen der gereinigten Protease oder eines Zellkulturüberstandes einer die Protease in rekombinanter Form expnmierenden Zellkul- tur, oder durch Co-Kultivierung von Faktor X-Analogon und Protease-exprimierenden Klonen
Gemäss einer besonderen Ausführung enthält die Präparation enthaltend das gereinigte, ein- zelkettige oder zweikettige Faktor X-Analogon einen physiologisch akzeptablen Träger und ist gegebenenfalls als pharmazeutisches Präparat formuliert Die Formulierung kann in an sich übli- cher Weise erfolgen und mit einem Puffer enthaltend Salze, wie NaCI, CaCI2, und Aminosäuren, wie Glycin und/oder Lysin,
bei einem pH im Bereich von 6 bis 8 gemischt und als pharmazeuti- sches Präparat formuliert sein. Die gereinigte Praparation enthaltend Faktor X-Analogon kann als fertige Losung, Lyophilisat oder tiefgefroren bis zum Endgebrauch als lagerfähiges Produkt bereit- gestellt werden. Vorzugsweise erfolgt die Lagerung der Präparation in lyophiliserter Form und wird mit einer entsprechenden Rekonstitutionslösung in eine optisch klare Losung gelöst
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Die Präparation gemäss der vorliegende Erfindung kann jedoch auch als Flüssigpräparat bzw. in flüssig-tiefgefrorener Form zur Verfügung gestellt werden.
Die erfindungsgemässe Präparation ist besonders stabil, d. h sie kann auch in geloster Form über längere Zeit vor der Applikation stehen gelassen werden. Es hat sich gezeigt, dass die erfin- dungsgemässe Präparation für mehrere Stunden bis Tage keinerlei Aktivitätsverlust zeigt.
Die erfindungsgemässe Präparation kann in einer geeigneten Vorrichtung, vorzugsweise einer Applikationsvorrichtung, in Kombination mit Faktor Xla oder einem Derivat davon, vorliegen.
Die erfmdungsgemasse Präparation, enthaltend ein Faktor X-Analogon in Kombination mit Fak- tor Xla oder einem Derivat davon, der in der Lage ist, das Faktor X-Analogon zu Faktor Xa bzw.
Faktor Xa-Analogon zu aktivieren, kann als Kombinationspräparat bereitgestellt werden, bestehend aus einem Behälter enthaltend an einen Träger immobilisierten Faktor Xla, gegebenenfalls in Form einer Mini-Saule oder einer mit einer Protease bestückten Spritze und einem Behalter enthaltend die pharmazeutische Präparation mit Faktor X-Analogon. Zur Aktivierung des Faktor X-Analogons wird die Faktor X-Analogon-haltige Lösung beispielsweise über die immobilisierte Protease ge- drückt. Die Faktor X-Analogon haltige Lösung ist dabei wahrend der Lagerung des Präparates vorzugsweise von der Protease raumlich getrennt.
Die erfindungsgemässe Praparation kann im gleichen Behalter wie die Protease sein, wobei die Komponenten jedoch durch eine impermeable Trennwand, die bei etwaigem Gebrauch leicht zu entfernen ist, räumlich getrennt sind Die Lösun- gen können auch in eigenen Behältern aufbewahrt werden und erst kurz vor Anwendung miteinan- der in Kontakt gebracht werden.
Die Aktivierung von Faktor X-Analogon zu Faktor Xa kann kurz vor dem direkten Gebrauch, also vor der Applikation am Patienten erfolgen. Die Aktivierung kann durch in Kontakt-bringen mit einer immobilisierten Protease oder durch Mischen von Lösungen enthaltend, einerseits eine Protease und Faktor X-Analogon andererseits erfolgen. Es ist daher möglich, die beiden Kompo- nenten getrennt voneinander in Losung zu halten und durch eine geeignete Infusionsvorrichtung, bei der die Komponenten wahrend des Durchlaufs in Kontakt kommen, zu mischen und so zu Faktor Xa bzw. Faktor Xa-Analogon zu aktivieren.
Dem Patienten wird so ein Gemisch von Faktor Xa und einer weiteren Sennprotease, die die Aktivierung bewirkt hat, verabreicht Hierbei ist insbe- sondere auf die Dosierung zu achten, da durch die zusätzliche Gabe einer Serinprotease auch endogener Faktor X aktiviert wird und damit die Gerinnungszeit verkürzt sein kann
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird die pharmazeutische Präparation in einer ge- eigneten Vorrichtung, vorzugsweise einer Applikationsvorrichtung, entweder in flüssig-gefrorener oder lyophilisierter Form zur Verfügung gestellt Eine geeignete Applikationsvorrichtung kann dabei ein gemäss der AT 366 916 oder der AT 382 783 beschriebener Doppelkammerspritzenkörper sein.
Gemäss einem besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung enthalt die Praparation ein Faktor X-Analogon mit einer Modifikation, die die Aktivierung von Faktor X-Analogon zu einem Faktor Xa in vivo erlaubt Die Faktor X-Analoge der erfindungsgemassen Praparation weisen insbesondere eine Modifikation auf, die eine Erkennungsstelle/Spaltstelle für Faktor Xla oder ein Derivat davon darstellt und werden durch diese Protease in vivo zu nativem Faktor Xa bzw. Faktor Xa-Analogon gespalten. Dadurch kann die erfmdungsgemasse Präparation bei der Blutstillung sowohl bei Patien- ten mit Defizienzen des Faktor IX als auch des Faktor VIII eingesetzt werden, als auch bei Faktor VIII-Inhibitor-Patienten.
Die erfindungsgemässe Präparation kann als pharmazeutische Praparation mit Faktor Xa-Aktivi- tät als Einkomponenten-Präparat oder in Kombination mit anderen Faktoren als Mehrkomponen- ten-Praparat zur Verfugung gestellt werden
Vor der Aufbereitung in eine pharmazeutische Präparation wird das gereinigte Protein den übli- chen Qualitatskontrollen unterzogen und in eine therapeutisch verabreichbare Form gebracht.
Insbesondere wird bei der rekombinanten Herstellung das gereinigte Präparat auf Abwesenheit von zellulären und vom Expressionsvektor stammenden Nukleinsäuren getestet, vorzugsweise gemäss einem Verfahren wie es in der EP 0 714 987 beschrieben ist.
Da prinzipiell jedes biologische Material mit infektiosen Keimen kontaminiert sein kann, wird zur Herstellung eines sicheren Präparates die Praparation gegebenenfalls zur Inaktivierung bzw Abreicherung von Viren behandelt
Gemäss einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Praparation, enthaltend Faktor Xa-Analogon mit hoher Stabilitat und struktureller Integrität, zur Verfugung gestellt, die
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insbesondere frei ist von inaktiven Faktor X/Xa-Analogon-Intermediaten und autoproteolytischen Abbauprodukten und dadurch erhältlich ist, dass ein Faktor X-Analogon der oben beschriebenen Art aktiviert und zu einer entsprechenden Präparation zubereitet wird
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung einer Praparation der oben beschrie- benen Art zur Herstellung eines Arzneimittels.
Ein Arzneimittel, enthaltend ein erfindungsgemässes Faktor X-Analogon bzw. Faktor Xa-Analogon, eignet sich insbesondere zur Behandlung von Pati- enten mit Störungen der Blutgerinnung, wie etwa Hämophilie-Patienten oder Hämophilie-Inhibitor- Patienten, und insbesondere als Präparat mit Faktor VIII-Bypass-Aktivität.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung einer Nukleinsäure enthaltend die kodierenden Sequenzen der erfindungsgemässen Faktor X-Analogen zur Herstellung eines Arznei- mittels. Dabei kann die Nukleinsäure, sofern sie geeignete Expressionskontrollsequenzen enthält, als nackte Nukleinsäure appliziert werden, in einem rekombinanten Expressionsvektor integriert sein oder an einen Träger, entweder ein Phospholipid oder ein virales Partikel gebunden sein Die Nukleinsaure kann dabei zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden, das sich insbe- sondere zur Behandlung von Patienten mit Störungen der Blutgerinnung, wie etwa Hamophilie- Patienten oder Hämophilie-Inhibitor-Patienten eignet. Ein Einsatz der Nukleinsaure in der Genthe- rapie ist ebenfalls denkbar.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Faktor X-Analogen und eine Präparation enthaltend ein erfindungsgemässes Faktor X-Analogon Dazu wird eine für ein Faktor X-Analogon kodierende Sequenz in ein geeignetes Expressionssy- stem eingebracht und entsprechende Zellen, vorzugsweise permanente Zeitigen, mit der rekom- binanten DNA transfiziert. Die Zellen werden unter optimalen Bedingungen für die Genexpression kultiviert und Faktor X-Analoge entweder aus dem Extrakt einer Zellkultur oder dem Zellkulturüber- stand isoliert. Die Reinigung des rekombinanten Moleküls kann durch alle bekannten chroma- tographischen Verfahren, wie Anionen- oder Kationenaustauscher-, Affimtäts- oder immunaffini- tätschromatographie, oder einer Kombination davon, weiter gereinigt werden.
Zur Herstellung der erfindungsgemässen Faktor X-Analogen wird die komplette für Faktor X kodierende cDNA in einen Expressionsvektor kloniert. Dies erfolgt entsprechend den allgemein bekannten Klonierungstechniken. Die für Faktor X kodierende Nukleotidsequenz wird anschliessend derart modifiziert, dass die kodierende Sequenz im Bereich des Aktivierungspeptids und gegebe- nenfalls auch im Bereich des C-terminalen #-Peptids derart verändert wird, dass ein Faktor X- Molekül der oben beschrieben Art hergestellt werden kann.
Dies erfolgt durch aus dem Stand der Technik bekannte gentechnische Methoden, wie spezifische gerichtete in vitro-Mutagenese, oder Deletion von Sequenzen, beispielsweise durch Restriktionsverdau durch Endonukleasen und Insertion anderer, veränderter Sequenzen, oder durch PCR Die so hergestellten Faktor X-Mutan- ten werden dann in ein für die rekombinante Expression geeignetes Expressionssytem inseriert und expnmiert
Die erfindungsgemässen Faktor X-Analoge können ebenfalls durch chemische Synthese herge- stellt werden.
Die Faktor X-Analoge werden vorzugsweise durch rekombinante Expression hergestellt. Die gentechnische Herstellung kann mit allen gängigen Expressionssytemen, wie z B. permanenten Zeitigen oder viralen Expressionssystemen, erfolgen Die permanenten Zelllinien werden herge- stellt durch stabile Integration der Fremd DNA in das Wirtszellchromosom von z.B. Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hep1, insbesondere Leber- und Nierenzellen, oder durch einen episomalen Vektor, abgeleitet von z.B. Papilloma Virus. Virale Expressionssysteme, wie beispielsweise Vacci- nia Virus, Baculovirus oder retrovirale Systeme können ebenfalls eingesetzt werden. Als Zellinien werden allgemein Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hep1, Drüsen-, Leber- und Nierenzellen eingesetzt Als eukaryontische Expressionssysteme können auch Hefen, endogene Drüsen (z.B.
Drüsen transgener Tiere) und andere Zelltypen verwendet werden Natürlich können auch trans- gene Tiere zur Expression der erfindungsgemässen Polypeptide oder Derivaten davon verwendet werden. Zur Expression der rekombinanten Proteine haben sich im speziellen CHO-DHFR- Zellen bewährt (Urlaub et al. 1980. Proc. Natl. Acad Sci. USA 77 : Zur rekombinanten Herstellung der erfindungsgemässen Faktor X-Analoge konnen auch proka- ryontische Expressionssysteme eingesetzt werden Hierzu eignen sich insbesondere Systeme, die eine Expression in E. coli oder B. subtilis erlauben.
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Die Faktor X-Analoge werden in den entsprechenden Expressionssystemen unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors exprimiert Im Fall der Expression in Eukaryonten eignen sich dazu alle bekannten Promotoren, wie SV40-, CMV-, RSV-, HSV-, EBV-, #-Actin-, hGH oder induzierbare Promotoren wie z. B. hsp- oder Metallothionein-Promotor Vorzugsweise werden die Faktor X- Analoge unter Kontrolle des #-Actm-Promotors in CHO-DHFR-Zellen expnmiert.
Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zur Herstellung der erfin- dungsgemassen Praparation die Schritte, Bereitstellen einer fur ein Faktor X-Analogon kodierende DNA, Transformation einer Zelle mit der rekombinanten DNA, Expression des Faktor X-Analogons, gegebenenfalls in Gegenwart einer Protease, Isolieren des Faktor X-Analogon und gegebenenfalls Reinigung uber ein chromatographisches Verfahren.
Gemäss einer Ausführungsform des Verfahrens wird das Faktor X-Analogon als zweikettiges Molekül isoliert
Dazu wird Faktor X-Analogon in einer Zelle exprimiert, die eine Prozessierung von pro-Faktor X-Analogon in zweikettigen Faktor X-Analogon erlaubt.
Das so erhaltene zweikettige Faktor X-Analogon kann anschliessend isoliert, gereinigt und bis zur weiteren Verwendung, wie oben beschrieben, stabil gelagert werden
Gemäss einer Ausfuhrungsform erfolgt die Aktivierung durch einen chromatographischen Schritt, bei dem die Protease an einen Träger immobilisiert ist. Gereinigtes zweikettiges Faktor X- Analogon wird dazu über eine Matrix, an die die Protease gebunden ist, geleitet und aus dem Eluat, gereinigter Faktor Xa isoliert.
Gemass einer anderen Ausführungsform werden die Komponenten gemischt und die Protease selektiv aus dem Gemisch entfernt
Es ist natürlich auch eine Kombination von Prozessierung von einzelkettigem pro-Faktor X- Analogon in die zweikettige Faktor X-Analogon-Form und Aktivierung zu Faktor Xa in einem einzi- gen Verfahren moglich.
Die Reaktionsbedingungen für Prozessierungsreaktion(en) und die Aktivierung können ohne weiteres vom Fachmann je nach Versuchsanordnung der gegebenen Rahmenbedingungen opti- miert werden Dabei ist für die Kontaktdauer die Fliessgeschwindigkeit der vorliegenden Reaktan- den von besonderer Bedeutung. Diese sollte zwischen 0,01 ml/min und 1 ml/min liegen. Als weite- re Parameter sind Temperatur, pH-Wert und Elutionsbedingungen von Bedeutung. Nach dem Durchlauf kann aktivierter Faktor Xa gegebenenfalls über selektive Chromatographie weiter gerei- nigt werden.
Die Durchführung des Verfahrens mit jeweils an einen Träger gebundener Protease ist deshalb von besonderem Vorteil, da die Reaktionsanordnung durch Verwendung eines Trägers, vorzugsweise von Chromatographiesaulen, einen zusätzlichen Reinigungsschritt ermöglicht
Gemäss einem weiteren Aspekt zur Herstellung eines Faktor X-Analogon wird Faktor X-Analo- gon als einzelkettiges Molekül isoliert Dazu wird das Faktor X-Analogon in einer Zelle exprimiert, in der die Spaltung der leichten und schweren Kette von Faktor X bzw eines Faktor X-Analogons nicht erfolgen kann Eine der wesentlichen für die Spaltung von Faktor X in leichte und schwere Kette verantwortlichen Proteasen ist Furin.
Aus einer solchen Endoprotease-defizienten-Mutanten- zelle kann Faktor X-Analogon als einzelkettiges Molekul isoliert weren Ein derart isoliertes und gegebenenfalls gereinigtes Faktor X-Analogon wird anschliessend mit Furin in Kontakt gebracht, unter Bedingungen unter denen einzelkettiges Faktor X-Analogon in die zweikettige Faktor X-Form gespalten wird. Erfindungsgemässe Faktor X-Analoge, die eine Substitution im Bereich des Aktivie- rungspeptids aufweisen, die eine Spaltung durch Faktor Xla ermöglicht, konnen anschliessend durch dieses Verfahren gegebenenfalls direkt durch in Kontakt-Bnngen mit Faktor Xla oder einem Derivat davon zu Faktor Xa bzw. Faktor Xa-Analogon aktiviert werden.
Gemäss einem Aspekt der Erfindung wird durch das Verfahren eine Präparation enthaltend akti- ven Faktor Xa bzw. ein aktives Faktor Xa-Analogon dadurch erhalten, dass, ein wie oben beschrie- ben hergestelltes, Faktor X-Analogon einem Aktivierungsschritt unterzogen wird und das aktivierte Polypeptid zu einer gereinigten Präparation, die gegebenenfalls als pharmazeutische Zusammen- setzung formuliert ist, weiterverarbeitet wird
Mit den erfindungsgemassen Faktor X-Analogen, die durch einen oben beschriebenen Prozess zu Faktor Xa aktiviert werden, wird gereinigter Faktor Xa bzw Faktor Xa-Analogon mit hoher Stabilität und struktureller Integrität und insbesondere frei von inaktiven Faktor X/Xa-Intermediaten, gewonnen
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Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und der Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht beschrankt sein soll,
naher erlautert
Es zeigen:
Fig.
Claims (37)
1. Nukleotid- und Aminosäuresequenz des Faktor X, Fig.
2 Schematische Darstellung des Faktor X Analogons mit modifizierter Protease-Schnittstelle im Bereich des Aktivierungspeptids; Fig.
3' Westernblot-Analyse des rFaktor X exprimiert in CHO Zellen; und Fig 4 WesternblotAnalyse nach in vitro Aktivierung des Faktor X-Analogons mit Faktor Xla
Beispiele:
Beispiel 1:
Konstruktion und Expression von rekombinantem Faktor X Wildtyp (rFX) und Faktor
X/FXal(Q-R/1) Analogen a. Herstellung des rFX Expressionsvektors phAct-rFX
Die cDNA von FX wurde aus einer humanen Leber Lambda-cDNA-Bank, wie von Messier et al beschrieben (1991, Gene 99:291-294), isoliert.
Aus einem positiven Klon wurde mittels PCR mit dem Oligonukleotid #2911 (5#-ATTACTCGAGAAGCTTACCATGGGGCGCCCACTG-3') als 5'Pnmer und dem Oligonukleotid #2912 (5'-ATTACAATTGCTGCAGGGATCCAC-3') als 3'-Pnmer ein DNA-Fragment amplifiziert, das die 1,467kB FX-kodierende Sequenz sowie 39bp der 3' nicht translatierten Region, flankiert von einer Xhol-Schnittstelle am 5'-Ende und einer Mfel-Schnittstelle am 3'-Ende enthalt.
Zusätzlich wurde durch den Pnmer #2911die Sequenz ACC vor ATG des FX eingebaut, so dass eine optimale Kozak-Translationsinitiations-Sequenz entsteht Anschliessend wurde dieses PCR-Fragment als Xhol/Mfel-Fragment in den mit Sall und EcoRI geschnittenen Expressionsvektor phAct kloniert Der Expressionsvektor phAct umfasst etwa 3,3kb des Promoters, 78bp 5'UTR sowie das etwa 1 kb grosse Intron des humanen beta-Actm-Gens (Fischer et al FEBS Lett. 351:345-348, 1994), eine multiple Klonierungsschnittstelle und die SV40-Polyadenylierungsstelle.
Das resultierende Expressionsplasmid wurde mit phAct-rFX bezeichnet
EMI11.1
Zur Herstellung von rekombinanten FX/FXIa (Q-RII)-Analogen wurde die Aminosäure Sequenz von Position 227 bis 234 (Arg-Gly-Asp-Asn-Asn-Leu-Thr-Arg/lle), die der Aktivierung des FX in FXa dient, durch den intrinsischen Tenase Komplex FIXa/FVllla bzw durch den extrinsische FVlla/TF, durch die Sequenz Gln-Ser-Phe-Asn-Asp-Phe-Thr-Arg/lle (in Folge als (Q-R/l) bezeichnet), spezi- fisch durch den Gerinnungsfaktor Xla aktiviert, ersetzt (Figur 2) Q-R wurde in Anlehnung an die zweite FXla Schnittstelle, wie sie in dessen 'natürlichem' Substrat FIX vorkommt,
erstellt Das Expressionsplasmid für dieses rFX-Analogon ist vom Plasmid phAct/rFX abgeleitet Fur Klonie- rungszwecke wurde das Hindlll-Nael-DNA-Fragment aus dem phAct-rFX Expressionsplasmid, das
EMI11.2
schnittstellen von Plasmid pUC19 inseriert Das resultierende Plasmid wurde mit pUC/FX bezeich- net Dadurch konnte die FX-Sequenz von Nukleotid 508 bis 705, die den Aminosäuren 160 bis 235 entspricht,
aus dem pUC/FX-Plasmid uber Bsp1201 und BstXl Restriktionsschnitte entfernt und durch ein mutiertes FX-DNA-Fragment ersetzt werden Das mutierte DNA-Fragment enthält statt der FIXa/FVllla- und FVIIa/TF-Stelle die FX-fremde Spaltstelle fur FXla und wird mittels PCR hergestellt Als Vorlage fur die PCR dient das Plasmid phAct/rFX Zur Herstellung der Gln-Ser-Phe- Asn-Asp-Phe-Thr-Arg/Ile (Q-R/l) Spaltstelle werden als 5'-Pnmer das Oligonukleotid #4211 (5'- GGCAAGGCCTGCATTCCCACA-3') und als 3'-Pnmer das Oligonukleotid #
5039 benutzt (5'- GCGCTCCCACGATCCTGGTGAAGTCATTAAAGCTTTGCTCAGGCTGCGTCTGGTT-3') benutzt Daher werden die Aminosäuren Arg, Gly, Asp, Asn, und Leu an Position 227,228, 229,231 und 232 in Gin, Ser, Phe, Asp und Phe ausgetauscht Das PCR-Produkt wird mit Bsp1201 und BstXI nachgeschnitten und in das mit Bsp1201/BstXl geoffnete pUC-fX-Plasmid eingesetzt Anschliessend wird uber Hindlll/Agel das DNA-Fragment, das die neue Spaltstelle enthalt, zurück in den mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnittenen phAct-FX eingefugt Das resultierende Plasmid wird
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
Zur Etablierung stabiler rFX/FXIa-expnmierender Zelllinien werden in dhfr-defizienten CHO- Zellen das Expressionsplasmid phAct-rfX bzw. phAct-rfX/fXla(Q-R/I) mit dem Selektionsmarker pSV-dhfr co-transfiziert (Fischer et al FEBs Lett. 351:345-348, 1994) Fur alle weiteren Expressi- ons- und Funktionsanalysen werden die Zellkulturen nach vollstandigem Medienwechsel mit serumfreiem Selektionsmedium in Anwesenheit von 10ug/ml Vitamin K 24 Stunden lang inkubiert Die Expression von rfX in den resultierenden Zellklonen wird anhand der Antigenmenge (ELISA, Asserachrom, Boehnnger Mannheim) nachgewiesen und das rekombinante Protein anschliessend mit SDS-PAGE charakterisiert (Figur 3).
Wie im Western Blot erkennbar, liegen sowohl die rFX-
EMI12.2
und einer schweren Kette (HC) von ca 50kD vor, die den plasmatischen Faktor X-Formen entsprechen. Zusätzlich ist eine 75kD grosse Proteinbande zu erkennen. Das 75kD Protein entspricht dem einzelkettigen (SC) FX-Molekül, dessen Präsenz bereits in den Uberstanden FX-transfizierter CHO-Zellen (Wolf et al., J.Biol. Chem 266-13729-13730, 1991) sowie in humanem Plasma (Fair et al., Blood 64 :194-204, 1984) beschrieben wurde
Beispiel 2 :
EMI12.3
Um die Spaltbarkeit der neu eingefügten Aktivierungsstellen mittels Faktor Xla nachzuweisen, werden die Zellkulturüberstände, in Anwesenheit von 5mM CaCI2, mit gereinigtem Faktor Xla versetzt.
Aliquots der Reaktionsansätze werden sowohl vor Inkubation, als auch nach verschiede- nen Inkubationszeiten bei 37 C, mittels Western Blot-Analyse auf Spaltung getestet (Figur 4). Der Nachweis der rFX-Moleküle erfolgt mittels eines polyklonalen anti-humanen FX-Antikörpers Als positive Kontrolle dient gereinigter Plasma Faktor IX (Stago), der das natürliche Substrat für FXla darstellt. Um in einander entsprechenden Bedingungen zu arbeiten, wird der FIX vor Verwendung in Zellkulturüberständen nicht transfizierter CHO-Zellen verdünnt. Die Umsetzung des FIX in die aktivierten Formen (FIXa und FIXb) zeigt, dass FXla seine homologue Schnittstelle in FIX in Zellkul- turuberstanden spalten kann.
Der Reaktionsansatz mit rFX-Wildtyp dient als negative Kontrolle, da dieses Molekül keine FXIa-Spaltstelle enthalt und daher nicht spezifisch durch FXla erkannt und gespalten werden sollte. Nach Inkubation mit FXla wird für rFX, im Vergleich mit rFX in Abwesen- heit von FXla, wie erwartet keine Anderung im Proteinmuster sichtbar.
Im Gegensatz dazu treten im Reaktionsansatz von FXla mit RFX/FXla(Q-R/1) als Substrat nach 1 Stunde Inkubation bei 37 C in Anwesenheit von CaCI2, Proteinbanden von ca 36kD und 32kD auf, die den aktivierten alpha und beta Formen (aHCa und bHCa) der schweren Kette des FX ähnlich sind In Abwesenheit von FXla treten diese gespaltenen Moleküle nicht auf. Die Anwesen- heit einer bHCa-ahnlichen Form, die durch die autokatalytische Abspaltung C-terminaler Amino- säuren der schweren Kette von aHCa entsteht, lässt auf die Funktionalitat der genenerten aktivier- ten rFXa-Moleküle schliessen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass durch den Austausch der natürlich vorkommenden Aktivierungssequenz in FX in eine Aktivierungsspaltstelle für FXla, rFX-Analogon Moleküle erstellt werden können die durch FXla aktiviert und in FXa ähnliche Molekule umgesetzt werden konnen.
Die beschriebene Methode kann fur alle weiteren Faktor X-Analoge herangezogen werden, um sie hinsichtlich der erfindungsgemässen Eigenschaften zu testen
Beispiel 3 :
EMI12.4
Plasma.
Um die Funktionalität des rFX-Analogon zu testen, wird FIX-defizientes Plasma mit CHOrFX/FXla(Q-R/1) Zellkulturüberstand, versetzt und die Gerinnungszeit nach Aktivierung der intnnsi- schen Gerinnungskaskade gemessen (Tabelle 1). Dafür werden 50 ul durch Ultrafiltration ankon-
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zentrierter Überstand, 50 ul FIX-defizientes Plasma und 50 ul DAPPTIN (Baxter AG) gemischt.
Nach einer Inkubation von 4 Minuten bei 37 C wird die Reaktion mit 50 ul, auf 37 C vorgewärm- tem, 25mM CaCI2 gestartet. Die Gennnungszeit wird im Koagulometer gemessen (Amelung, KC10A). Die Aktivität in mU FIX wird mittels einer Eichgeraden, die mit plasmatischen FIX erstellt wird, ermittelt. Die mit den rFX-Analogen erreichten Gerinnungszeiten werden entsprechend als mU FIX-Aquivalente angegeben. Als Kontrolle dienen Zellkulturüberstande von rFX-Wildtyp expri- mierenden CHO-Zellen (CHO-rFX) sowie Zellkulturüberstände nicht transfizierter CHO-Zellen (CHO neg ).
Um unspezifische Effekte auszuschliessen, und auf Zellkulturbedingungen beruhende experimentelle Variationen zu berucksichtigen, werden für jedes Konstrukt 7 bis 10 verschiedene Zellkulturüberstande von Zellen, für die gleiche Wachstumsstadien und ahnliche Expressionsraten vorliegen, getestet.
Zellkulturüberstände von CHO-rfX und CHO neg. ergeben Gerinnungszeiten im Bereich des Verdunnungspuffers, in dem die Standards und Proben verdünnt werden, und werden damit als ' < 1,56' mU FIX-Äquivalent angegeben (kleinster auswertbarer Wert in Gerinnungstest, bedingt durch die Eichgerade).
EMI13.1
Analogons von 4,1 bis 7,7 ug/ml signifikant kürzere Gerinnungszeiten ermittelt als jene, die mit 200mU plasmatischen FIX bestimmt wurden und werden daher als ' > 200' mU FIX-Äquivalent angegeben.
Diese Ergebnisse zeigen, dass durch den Austausch der 8 C-terminalen Aminosäuren des FX- Aktivierungspeptids durch die 8 C-terminalen Aminosäuren des Aktivierungspeptids von Faktor IX ein rfX-Analogon-Molekül geschaffen wurde, das nach Aktivierung der intrinsischen Gerinnungs- kaskade zu signifikanter Gerinnung eines Faktor IX-defizienten Plasma führt
EMI13.2
FVIII- defizienten Plasmen nach Vorbehandlung der Zellkulturüberstände mit Serinprotease- Inhibitoren.
EMI13.3
nungszeiten nicht aufgrund der Anwesenheit von Spuren bereits aktivierter rFX-Moleküle in den Zellkulturüberstande hervorgerufen werden, sondern erst durch die Umsetzung der rFX-Analogen in rFXa nach Aktivierung der intrinsichen Gennnungskaskade durch DAPPTIN erfolgt, werden alle Überstände vor Benutzung mit einem Serinprotease-Inhibitor (1 mM Pefabloc, Boehnnger Mann- hein), der aktivierte Serinproteasen permanent inaktiviert, versetzt. Uberschussiger Inhibitor, der die Gerinnung nach DAPPTIN-Aktivierung hemmen würde, wird anschliessend durch Dialyse gegen Tns pH 7,4, NaCI 50mM, Tween 0,01% entfernt.
So vorbehandelte Überstande werden anschlie- #end im Gennnungstest eingesetzt
Die Konzentration an Serinprotease-Inhibitor wurde so ausgewählt, dass die Mengen an FXa, die zu einer ähnlichen Gerinnung führen wie die unbehandelter rFx/FXla(Q-R/1) Zellkulturüber- stande, vollstandig inhibiert wird (Tabelle 2) Die Ergebnisse dieses Vorexperiments zeigen, dass bei einer Inhibitor Konzentration von 1 mM auch Fxa-Mengen vollständig inaktiviert werden können, die weit kürzere Gerinnungszeiten in FIX-defizientem Plasma aufweisen, als die mit den
EMI13.4
Die Funktionalität der so vorbehandelten Überstände wird sowohl im FIX- als auch im FVIII- Gennnungstest gemessen (Tabelle 3).
Der FVIII-Gennnungstest wird analog zum FIX-Gerinnungs- test durchgeführt mit dem Unterschied, dass FVIII-defizientes statt FIX-defizientes Plasma benützt wird, die Inkubation vor dem Start mit CaCI2 3 Minuten beträgt und die Eichkurve mit plasmatischen FVIIIerstellt wird.
Uberstande von CHO-rFX-Zellen liegen sowohl in FIX- als auch im FVIII-defizientem Plasma unter der Auswertungsgrenze (1,56mU) Ebenso wird keine Verkürzung der Gerinnungszeit mit CHO neg Überstand hervorgerufen, auch wenn dieser vor Inhibitor-Behandlung mit 1 mU FXa versetzt wurde Diese Kontrollen zeigen, dass auch wenn im Falle bereits voraktivierten FX im Zellkulturuberstand dieser durch den Inhibitor inaktiviert würde, sowie dass die Gerinnung nicht von möglicherweise vorhandenen CHO-spezifischen Proteasen vermittelt wird
Der vorbehandelte plasmatische FIX (FIX) im Vergleich zum nicht vorbehandelten FIX (FIX
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-Inh.
-Dial.) weist einen Verlust von Gennnungsaktivitat in FIX-defizientem Plasma auf, was darauf schliessen lasst, dass entweder ein Anteil der Serinproteasen auch in nicht aktivierter Form durch den Inhibitor gehemmt wird oder durch den Prozess (Dialyse) verloren geht
EMI14.1
kant veränderte Messwerte -verglichen mit unbehandelten Überständen- in FIX bzw. in FVIII- Gerin- nungstests beobachtet.
Diese Experimente zeigen, dass rekombinante FX-Analogon-Moleküle, die eine FIX- Aktivierungspaltstelle fur den FXla tragen, nach Aktivierung der intrinsischen Gennnungs- kaskade zu signifikanter Gennnung von FIX- und FVIII-defizienten Plasmen führen.
EMI14.2
Eigenschaften aufweisen, die sie als erfolgsversprechende Kandidaten für die Herstellung therapeutischer Präparate ausweisen, die für die Behandlung von unter Hamophilie oder Hämophilie mit inhibitorischen Antikörper leidenden Patienten eingesetzt werden können
Tabelle 1 :
Funktionelle Aktivität der rFX/FXla(Q-R/1)-Molek#le in FIX-defizientem Plasma
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<tb> Probe <SEP> Antigen <SEP> ug/ml <SEP> mU <SEP> FIX <SEP> Äquiva- <SEP> Gerinnungszeit
<tb>
<tb>
<tb> lent <SEP> in <SEP> Sekunden
<tb>
<tb>
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<tb> rFX/FXIa <SEP> (Q-R/l)
<tb>
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<tb> sup1 <SEP> 6,3 <SEP> > 200 <SEP> 46,5
<tb>
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<tb> sup2 <SEP> 4,4 <SEP> > 200 <SEP> 47,7
<tb>
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<tb>
<tb>
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<tb> sup3 <SEP> 6,6 <SEP> > 200 <SEP> 46,4
<tb>
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<tb> sup4 <SEP> 4,8 <SEP> > 200 <SEP> 43,2
<tb>
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<tb> sup5 <SEP> 4,1 <SEP> > 200 <SEP> 45,2
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<tb> sup6 <SEP> 6,4 <SEP> > 200 <SEP> 43,1
<tb>
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<tb> sup7 <SEP> 6,6 <SEP> > 200 <SEP> 43,1
<tb>
<tb>
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<tb> sup8 <SEP> 4,3 <SEP> > 200 <SEP> 45,
2
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<tb> sup9 <SEP> 5,7 <SEP> > 200 <SEP> 39,4
<tb>
<tb>
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<tb> sup10 <SEP> 7,7 <SEP> > 200 <SEP> 44,2
<tb>
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<tb> rFXwt
<tb>
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<tb> sup1 <SEP> 2,1 <SEP> < 1,56 <SEP> 107,8
<tb>
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<tb>
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<tb> sup2 <SEP> 3,1 <SEP> < 1,56 <SEP> 97,8
<tb>
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<tb> sup3 <SEP> 1,6 <SEP> 3 <SEP> 84,7
<tb>
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<tb> sup4 <SEP> 2,4 <SEP> < 1,56 <SEP> 90,4
<tb>
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<tb>
<tb> sup5 <SEP> 3,2 <SEP> < 1,56 <SEP> 92,4
<tb>
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<tb> sup6 <SEP> 4,4 <SEP> < 1,56 <SEP> 96,2
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb> sup7 <SEP> 6,7 <SEP> < 1,56 <SEP> 92,7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CHO <SEP> neg.
<SEP> < 1,56 <SEP> 179,7
<tb>
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<tb> Plasma <SEP> FIX <SEP> 1* <SEP> 50,7
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<tb> Plasma <SEP> FIX <SEP> 0,5* <SEP> 54,5
<tb>
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<tb> Plasma <SEP> FIX <SEP> 0,125* <SEP> 65,6
<tb>
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<tb>
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<tb> Plasma <SEP> FIX <SEP> 0,0625* <SEP> 72,2
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb> Plasma <SEP> FIX <SEP> 0,0078* <SEP> 89,1
<tb>
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<tb>
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<tb> Puffer <SEP> 0 <SEP> 109,7
<tb>
* Eingesetzt wurden 200, 100, 25, 12,5 bzw 1,56 mU plasmatischer FIX Fur die Umrechnung dieser Werte in g/ml wurde angenommen, dass 1 Unit FIX ca 5 ug FIX/ml entspricht
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Tabelle 2 :
Bestimmung der Inaktivierung von FXa durch Vorbehandlung mit Pefabloc und anschliessende Dialyse, im FIX- Gerinnungstest
EMI15.1
<tb> Probe <SEP> eingesetzte <SEP> Gerinnungszeit <SEP> mU <SEP> FIX <SEP> Äquivalent
<tb>
<tb>
<tb> ¯¯¯¯¯¯ <SEP> mU <SEP> in <SEP> Sek. <SEP> ¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> FXa <SEP> 5 <SEP> 19,9 <SEP> > 200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> FXa <SEP> 1 <SEP> 32,5 <SEP> > 200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> FXa <SEP> 0,5 <SEP> 45 <SEP> > 200
<tb>
<tb>
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<tb> FXa <SEP> 0,1 <SEP> 76,1 <SEP> 10
<tb>
<tb>
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<tb>
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<tb> FXa <SEP> + <SEP> Inh <SEP> 5 <SEP> 93,4 <SEP> 1,94 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> FXa <SEP> + <SEP> Inh <SEP> 1 <SEP> 115,9 <SEP> < 1,56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> FXa <SEP> + <SEP> Inh <SEP> 0,5 <SEP> 113,5 <SEP> < 1,56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> FXa+inh <SEP> 0,1 <SEP> 115,3 <SEP> # <SEP> 1,
56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Plasma <SEP> 200 <SEP> 52,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Plasma <SEP> 1,56 <SEP> 95,7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Puffer <SEP> 114,7
<tb>
Tabelle 3 : Funktionelle Aktivität von CHO-rFX/FXla(Q-R/1) Zellkulturüberständen nach Vorbehandlung mit Pefabloc und Dialyse in FIX- und FVIII-Gerinnungstests.
EMI15.2
<tb>
Probe <SEP> Antigen <SEP> mU <SEP> FIX <SEP> Äquivalent <SEP> mU <SEP> FVIII
<tb>
<tb>
<tb> ¯¯¯¯¯¯ <SEP> ug/ml <SEP> Äquivalent
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> RFX/FXla <SEP> (Q-R1/)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup1 <SEP> 6,3 <SEP> > 200 <SEP> > 200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup2 <SEP> 4,4 <SEP> 100 <SEP> > 200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup3 <SEP> 6,6 <SEP> > 200 <SEP> > 200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup4 <SEP> 4,8 <SEP> 167 <SEP> > 200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup5 <SEP> 4,1 <SEP> > 200 <SEP> > 200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup6 <SEP> 6,4 <SEP> > 200 <SEP> > 200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup7 <SEP> 6,6 <SEP> > 200 <SEP> > 200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup8 <SEP> 4,3 <SEP> > 200 <SEP> > 200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup9 <SEP> 5,7 <SEP> > 200 <SEP> > 200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup10 <SEP> 7,
7 <SEP> > 200 <SEP> > 200
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> rFXwt
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup1 <SEP> 2,1 <SEP> < 1,56 <SEP> < 1,56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup2 <SEP> 3,1 <SEP> < 1,56 <SEP> < 1,56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup3 <SEP> 1,6 <SEP> < 1,56 <SEP> < 1,56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup4 <SEP> 2,4 <SEP> < 1,56 <SEP> < 1,56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup5 <SEP> 3,2 <SEP> < 1,56 <SEP> < 1,56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup6 <SEP> 4,4 <SEP> < 1,56 <SEP> < 1,56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sup7 <SEP> 6,7 <SEP> < 1,56 <SEP> < 1,56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CHO <SEP> neg <SEP> < 1,56 <SEP> < 1,56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CHO <SEP> neg <SEP> + <SEP> FXa <SEP> < 1,56 <SEP> < 1,
56
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Plasma <SEP> FIX <SEP> 25mU <SEP> 25
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (-Inh <SEP> -Dial <SEP> *
<tb>
<Desc/Clms Page number 16>
EMI16.1
<tb> Probe <SEP> Antigen <SEP> mU <SEP> FIX <SEP> Aquivalent <SEP> mU <SEP> FVIII
<tb>
<tb> ug/j. <SEP> Äquivalent
<tb>
<tb>
<tb> Plasma <SEP> FIX <SEP> 25mU <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb> Plasma <SEP> FVIII <SEP> 50mU <SEP> 48
<tb>
<tb>
<tb> (-Inh <SEP> -Dial <SEP> ) <SEP> *
<tb>
<tb>
<tb> Plasma <SEP> FVIII <SEP> 3,125mU <SEP> 3
<tb>
<tb>
<tb> (-Inh <SEP> -Dial.)
<tb>
* Diese Proben wurden unbehandelt (Ohne Zugabe von Serinprotease-Inhibitor und Dialyse) in die Tests eingesetzt.
PATENTANSPRÜCHE:
1. Faktor X-Analogon mit zumindest einer Aminosäuren-Substitution im Bereich des Aktivie- rungspeptids, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Substitution an der Stelle Arg227 und/oder Gly228 aufweist, und gegebenenfalls zumindest eine der Aminosäuren zwischen
Gly228 und Arg234, und gegebenenfalls Ile235, bezogen auf die Aminosäuresequenz ge- mass Fig 1, substituiert ist.
2. Faktor X-Analogon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Faktor X-
EMI16.2
a) R1 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Ile, Val, oder Ala b) R2 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Thr, Ser oder Asn; c) R3 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Phe, Leu, Arg oder Ile; d) R4 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Asp, Lys, Thr oder Glu; e) R5 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Asn, Ser, Lys, Met, Thr oder Asp, f) R6 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Phe, Thr, Ser, Pro, Leu oder lle; g) R7 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Ser, Gin, lle, Thr, Asn oder Pro, h) R8 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Gin, Ser, His, Tyr oder Glu ist 3. Faktor X-Analogon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Amino-
EMI16.3
4. Faktor X-Analogon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Amino- sauresequenz enthält. Ser227-GIn228-Thr229-Ser230-Lys231-Leu232-Thr233
5. Faktor X-Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die
Substitution eine Prozessierungsstelle für Faktor Xla oder einem Derivat davon darstellt.
6 Faktor X-Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es eine weitere Modifikation im Bereich der C-terminalen Faktor X-Aminosäuresequenz auf- weist.
7. Faktor X-Analogon nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Modifikation im C-terminalen Bereich der #-Peptidspaltstelle aufweist.
8. Faktor X-Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die
Substitituion im Bereich des Aktivierungspeptids eine Aktivierung des Faktor X-Analogon zu nativem Faktor Xa bzw einem Faktor X-Analogon in vivo erlaubt
9. Faktor X-Analogon nach einem der Anspruche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die
Modifikation eine Aktivierung von Faktor X-Analogon zu nativem Faktor Xa bzw einem
Faktor Xa-Analogon in vitro erlaubt.
10 Faktor X-Analogon nach einem der Anspruche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es als Faktor X-Analogon mit intaktem #-Peptid vorliegt.
11 Faktor X-Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es als zweikettiges Molekül vorliegt.
12. Faktor X-Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es als ein C-terminal verkürztes Faktor-Analogon vorliegt
13 Rekombinante DNA, kodierend für ein Faktor X-Analogon nach einem der Anspruche 1 bis
<Desc/Clms Page number 17>
12, enthalten in einem Vektor zur rekombinanten Expression des kodierten Proteins
14 Präparation, enthaltend ein gereinigtes Faktor X-Analogon oder ein Vorlauferprotein da- von, mit einer Substitution an der Stelle Arg227 und/oder Gly228, und wobei gegebenen- falls zumindest eine der Aminosäuren zwischen Gly228 und Arg234, und gegebenenfalls lle235, bezogen auf die Aminosäuresequenz gemäss Fig. 1, substituiert ist.
15 Präparation nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Substitution eine Spalt- stelle für Faktor Xla oder ein Derivat davon darstellt.
16 Präparation nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das
Faktor X-Analogon als FXa vorliegt
17. Präparation nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Fak- tor X-Analogon als C-terminal verkürztes Faktor X-Analogon vorliegt
18 Praparation nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass sie Fak- tor X-Analogon als zweikettiges Molekül in isolierter Form enthält.
19. Präparation nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein einzelkettiges Faktor X-Analogon in enzymatisch inaktiver Form mit einer Reinheit von mindestens 80%, vorzugsweise 90%, besonders bevorzugt von 95% und keine inaktiven, proteolytischen Intermediate von Faktor X/Xa-Analogon enthält.
20. Praparation nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie Fak- tor X-Analogon als einzelkettiges Molekül in isolierter Form enthält.
21 Präparation nach einem der Anspruche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein
Faktor X-Analogon enthalt, das eine Modifikation aufweist, die eine Aktivierung von Faktor
X-Analogon zu nativem Faktor Xa bzw. einem Faktor Xa-Analogon in vivo erlaubt.
22 Praparation nach einem der Anspruche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein
Faktor X-Analogon enthält, das eine Modifikation aufweist, die eine Aktivierung von Faktor
X-Analogon zu nativem Faktor Xa bzw. einem Faktor Xa-Analogon in vitro erlaubt
23. Präparation nach einem der Ansprüche 14 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie als pharmazeutisches Präparat formuliert ist
24. Praparation enthaltend Faktor Xa-Analogon mit hoher Stabilität und struktureller Integrität, die insbesondere frei ist von inaktiven Faktor X/Xa-Analogon-Intermediaten und autoprote- olytischen Faktor X-Abbauprodukten erhältlich durch Aktivierung eines Faktor X-Analogons gemass einem der Ansprüche 1 bis 23.
25 Praparation nach einem der Ansprüche 14 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen physiologisch akzeptablen Träger enthält und in einer lagerstabilen Form vorliegt.
26. Präparation nach einem der Ansprüche 14 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass sie ge- gebenenfalls als weiteren Bestandteil einen Blutfaktor oder eine aktivierte Form eines Blut- faktors enthält.
27 Präparation nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass sie als weiteren Bestandteil mindestens eine Komponente mit Faktor VIII-Bypass-Aktivität enthält.
28 Präparation nach einem der Ansprüche 14 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass sie als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert und gegebenenfalls als Mehrfachkompo- nentenpräparat vorliegt.
29 Verwendung einer Praparation nach einem der Ansprüche 14 bis 28 zur Herstellung eines
Arzneimittels
30. Verwendung einer rekombinanten DNA nach Anspruch 13 zur Herstellung eines Arzneimit- tels.
31 Verfahren zur Herstellung einer Präparation enthaltend gereinigtes rekombinantes Faktor
X-Analogon mit einer Substitution an der Stelle Arg227 und/oder Gly228, und wobei gege- benenfalls zumindest eine der Aminosäuren zwischen Gly228 und Arg234, und gegebe- nenfalls Ile235, bezogen auf die Aminosäuresequenz gemass Fig. 1, substituiert ist, da- durch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst.
- Bereitstellen einer Nukleinsäure gemass Anspruch 13 - Transformation einer geeigneten Zelle - Expression eines Faktor X-Analogon, - gegebenenfalls Inkubieren des Faktor X-Analogons mit Faktor Xla oder einem Derivat davon
<Desc/Clms Page number 18>
- Isolieren des Faktor X-Analogons und - Reinigung des Faktor X-Analogons uber ein chromatographisches Verfahren.
32 Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Faktor X-Analogon als zweikettiges Molekül isoliert wird
33. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, dass das zweikettige Fak- tor X-Analogon mit Faktor Xla oder einem Derivat davon gespalten wird.
34 Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Faktor X-Analogon als einzelkettiges Molekül isoliert wird
35 Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass ein einzelkettiges, gegebe- nenfalls isoliertes Faktor X-Analogon mit Furin oder einem Denvat davon in Kontakt ge- bracht wird und die Aktivierung zu Faktor X und Faktor Xa erlaubt wird.
36. Verfahren zur Herstellung einer Praparation- enthaltend aktiven Faktor Xa bzw. Faktor Xa-
Analogon, dadurch gekennzeichnet, dass ein gemäss einem Verfahren nach einem der An- sprüche 31 bis 35 hergestelltes Faktor X-Analogon einem Aktivierungsschritt unterzogen wird
37 Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass gereinigtes Faktor Xa-
Analogon oder nativer Faktor Xa mit hoher Stabilität und struktureller Integrität, der insbe- sondere frei ist von inaktiven Faktor X/Xa Intermediaten, gewonnen wird
HIEZU 5 BLATT ZEICHNUNGEN
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| EP1728798A1 (de) * | 2005-06-01 | 2006-12-06 | ZLB Behring GmbH | Blutgerinnungsfaktor X Polypeptide mit veränderten Aktivierungseigenschaften |
| MX2008006313A (es) | 2005-11-15 | 2008-11-06 | Philadelphia Children Hospital | Metodos y composiciones para modular la hemostasia. |
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| EP2235188A2 (de) * | 2007-12-31 | 2010-10-06 | Baxter International Inc. | Expression von humanen blutgerinnungsfaktoren bei transgenen nichthumanen tieren |
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| WO2016028872A2 (en) | 2014-08-19 | 2016-02-25 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating factor ix function |
| FR3050992A1 (fr) * | 2016-05-06 | 2017-11-10 | Lab Francais Du Fractionnement | Mutants du facteur x |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998038317A1 (de) * | 1997-02-27 | 1998-09-03 | Baxter Aktiengesellschaft | Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT366916B (de) | 1980-04-02 | 1982-05-25 | Immuno Ag | Vorrichtung zur applikation eines gewebeklebstoffes auf basis von menschlichen oder tierischenproteinen |
| US4501731A (en) | 1983-06-27 | 1985-02-26 | Tishkoff Garson H | Treatment of disparate bleeding disorders with factor X zymogen |
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-
1999
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-
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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