DE60038312T2 - Faktor x-analog mit einer verbesserten fähigkeit, aktiviert zu werden - Google Patents

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    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Faktor X-Analoge bzw. Analogamit einer verstärkten Fähigkeit, mit Hilfe einer Substitution im Bereich des Aktivierungspeptids aktiviert zu werden, eine Zusammensetzung, welche die erfindungsgemäßen Faktor X-Analoge enthält, und ein Verfahren für die Herstellung von einzelkettigen und doppelkettigen Faktor X-Analogen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Sobald der Blutgerinnungsprozess ausgelöst wurde, durchläuft die Gerinnungskaskade die Stadien des aufeinander folgenden Aktivierens verschiedener Proenzyme (Zymogene) im Blut in ihre aktiven Formen, die Serinproteasen. Dies schließt unter anderen Faktor XII/XIIa, Faktor XI/XIa, Faktor IX/IXa, Faktor X/Xa, Faktor VII/VIIa und Prothrombin/Thrombin ein. Die meisten dieser Enzyme sind im physiologischen Zustand nur aktiv, wenn sie in einem Komplex auf einer Membranoberfläche assoziiert sind. Ca-Ionen sind an vielen dieser Prozesse beteiligt. Die Blutgerinnung folgt entweder dem intrinsischen Weg, in welchem Fall alle Proteinkomponenten im Blut vorliegen, oder dem extrinsischen Weg, in welchem der Zellmembran-Gewebefaktor eine entscheidende Rolle spielt. Der Verschluss der Wunde findet schließlich als Ergebnis der Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin durch die Wirkung von Thrombin statt.
  • Der Prothrombinasekomplex ist verantwortlich für das Aktivieren von Prothrombin, um Thrombin zu bilden. Thrombin ist ein wichtiges Enzym, welches sowohl als Prokoagulans, als auch als ein Antikoagulans wirken kann. Der Prothrombinasekomplex, an welchem unter anderem Faktor Va (als ein Kofaktor) und Faktor Xa (als Serinprotease) beteiligt sind, setzt sich in einer Ca-abhängigen Assoziation auf der Oberfläche von Phospholipiden zusammen. Es wird angenommen, dass die katalytische Komponente des Prothrombinasekomplexes Faktor Xa ist.
  • Faktor X (ebenfalls Stuart-Prower-Faktor oder Prower-Faktor genannt) ist ein Vitamin K abhängiges Gerinnungsglykoprotein, welches an der intrinsischen und extrinsischen Blutgerinnungskaskade beteiligt ist. Das primäre Translationsprodukt von Faktor X (prä-pro-FX) enthält 488 Aminosäuren und wird durch die Leber oder durch humane Hepatomzellen zuerst als ein einzelkettiges 75 kD Vorläuferprotein synthetisiert. Im Plasma liegt Faktor X hauptsächlich als ein doppelkettiges Molekül vor (Fair et al., Blood 64 (1984), S. 194–204).
  • Während der Biosynthese, nach der Spaltung der Präsequenz durch eine Signalpeptidase (zwischen Ser23 und Leu24) und des Propeptids (zwischen Arg40 und Ala41), wird des einzelkettige Faktor X-Molekül durch Prozessieren und Deletion des Tripeptids Arg180-Lys181-Arg182 in die doppelkettige Form gespalten, welche eine ungefähr 22 kD leichte Kette und eine ungefähr 50 kD schwere Kette umfasst, wobei die zwei Ketten durch eine Disulfidbrücke verbunden sind (1). Faktor X zirkuliert daher als ein doppelkettiges Molekül im Plasma.
  • Während des Blutgerinnungsprozesses wird Faktor X aus dem inaktiven Zymogen in den aktiven Protease-Faktor Xa durch eine begrenzte proteolytische Wirkung umgewandelt, in deren Verlauf die Aktivierung von Faktor X, um Faktor Xa zu bilden, in einem von zwei membrangebundenen Komplexen stattfinden kann: dem extrinsischen Faktor VIIa/Gewebefaktor-Komplex oder dem intrinsischen Faktor VIIIa/Faktor IXa-Phospholipid-Ca-Komplex, dem sogenannten "Tenase-Komplex" (Mertens et al., Biochem. J. 185 (1980), S. 647–658). Eine proteolytische Spaltung zwischen den Aminosäuren Arg234 und Ile235 führt zur Freisetzung eines 52 Aminosäuren langen Aktivierungspeptids aus dem N-Terminus der schweren Kette und daher zur Bildung des aktiven Enzyms Faktor Xa. Das katalytische Zentrum von Faktor Xa liegt auf der schweren Kette.
  • Die Aktivierung über den (extrinsischen) Faktor VIIa-TF-Komplex führt zur Bildung von Faktor Xaα (35 kD) und Faktor Xaβ (31 kD), und wenn die Konzentrationen von Faktor VIIa im Komplex niedrig sind, ist außerdem ein Polypeptid von 42 kD anwesend.
  • Die Bildung von Faktor Xaα findet über eine Spaltung an Arg234/Ile235 der schweren Kette statt und stellt die Aktivierung von Faktor X, um Faktor Xa zu bilden, dar. Die Anwesenheit von Faktor Xaβ ergibt sich vermutlich aus einer autokatalytischen Spaltung an Arg469/Gly470 im C-Terminus der schweren Kette von Faktor Xaα und der Spaltung eines 4,5 kD Peptids. Wie Faktor Xaα weist Faktor Xaβ ebenfalls eine katalytische Aktivität auf. Es wurde jedoch gezeigt, dass sich während der Spaltung von Faktor Xaα, um Xaβ zu bilden, eine Plasminogenrezeptor-Bindungsstelle bildet, und dass Faktor Xaβ ebenfalls eine fibrinolytische Aktivität aufweisen kann und als ein Kofaktor an der Fibrinolyse beteiligt sein kann. Die Umwandlung von Faktor Xaα in Faktor Xaβ verläuft jedoch langsamer als die Bildung von Thrombin, wodurch als Ergebnis die Auslösung der Fibrinolyse vor der Bildung eines Blutgerinnsels verhindert wird (Pryzdial et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), S. 16614–16620; Pryzdial et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), S. 16621–16626).
  • Das 42 kD Polypeptid ergibt sich aus einer Prozessierung am C-Terminus der schweren Kette zwischen Arg426 und Gly470 ohne vorherige Prozessierung zwischen Arg234 und Ile235. Wie ein Faktor Xaγ-Fragment weist dieses Zwischenprodukt, welches sich als Ergebnis der Proteolyse an Lys370 bildet, ebenfalls keine katalytische Aktivität auf (Mertens et al., Biochem. J. 185 (1980), S. 647–658; Pryzdial et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), S. 16614–16620).
  • Die Aktivierung von Faktor X im intrinsischen Weg wird durch den Faktor IXa-Faktor VIIIa-Komplex katalysiert. Während der Aktivierung werden dieselben Prozessierungsprodukte erhalten, aber das Faktor Xaβ-Produkt wird mit einer größe ren Ausbeute erhalten, als andere Faktor X Prozessierungsprodukte (Jesty et al., J. Biol. Chem. 249 (1974), S. 5614).
  • In vitro kann Faktor X zum Beispiel mit Hilfe von Russell-Viper-Gift (RVV für engl.: Russell's Viper Venom) oder Trypsin (Bajaj et al., J. Biol. Chem. 248, (1973), S. 7729–7741) oder durch gereinigte physiologische Aktivierungsmittel, wie FVIIa/TF-Komplex oder Faktor IXa/Faktor VIIIa-Komplex (Mertens et al., Biochem. J. 185 (1980), S. 647–658), aktiviert werden.
  • In den meisten Fällen enthalten kommerziell verfügbare Faktor X-Produkte aus Plasma ein Gemisch aus Faktor Xaα und Faktor Xaβ, da sich nach der Aktivierung von Faktor X, um Faktor Xa zu bilden, hauptsächlich Faktor Xaα bildet, welcher wiederum in einem autokatalytischen Prozess gespalten wird, um Faktor Xaβ zu bilden.
  • Um ein einheitliches Faktor Xa-Produkt mit einer hohen molekularen Integrität herzustellen, schlug die EP 0 651 054 vor, dass Faktor X über einen relativ langen Zeitraum mit RVV aktiviert wird, mit dem Ergebnis, dass das sich ergebende Endprodukt hauptsächlich Faktor Xaβ enthielt. Beide Nebenprodukte, zum Beispiel Faktor Xaα und die Protease wurden nachfolgend in mehreren chromatographischen Schritten entfernt.
  • Die cDNA für Faktor X wurde isoliert und charakterisiert (Leytus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1984), S. 3699–3702; Fung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), S. 3591–3595). Humaner Faktor X wurde in vitro in verschiedenen Zelltypen, wie humanen embryonalen Nierenzellen oder CHO-Zellen exprimiert (Wolf et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), S. 13726–13730). Es wurde jedoch gefunden, dass bei der rekombinanten Expression von humanem Faktor X im Gegensatz zur in vivo Situation die Prozessierung an Position Arg40/Ala41 unwirksam ist, und dass sich verschiedene N-Termini auf der leichten Kette von Faktor X bilden (Wolf et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), S. 13726–13730). In vitro wurde rekombinanter Faktor X (rFX) mit Hilfe von RVV aktiviert, um rekombinanten Faktor Xa (rFXa) zu bilden, oder rFXa wurde direkt exprimiert, wobei das Aktivierungspeptid von Amnosäure 183 bis Aminosäure 234 deletiert und mit einem Tripeptid ersetzt wurde, um ein Prozessieren in eine doppelkettige rFXa-Form direkt zu ermöglichen. Ungefähr 70% des gereinigten rFX wurden prozessiert, um eine leichte und eine schwere Kette zu bilden, und die übrigen 30% bildeten einzelkettigen rFX mit 75 kD. Obwohl die direkte Expression von rFXa zur Bildung von aktivem Faktor Xa führte, führte sie ebenfalls zu inaktiven Zwischenprodukten. Zusätzlich beobachteten Wolf et al. (J. Biol. Chem. 266 (1991), S. 13726–13730) ebenfalls eine verminderte Aktivität von rekombinantem Faktor X, welche sie der schlechteren Aktivierungsfähigkeit von rFX durch RVV und der inaktiven Population von Proteinen und Polypeptiden des einzelkettigen Vorläufermoleküls zuschrieben. Insbesondere fanden sie, dass rFXa sehr instabil ist, wenn er durch rekombinante Zellen exprimiert wird, was sie der hohen autoproteolytischen Geschwindigkeit zuschrieben.
  • Die WO 98/38317 beschreibt Faktor X-Analoge, in welchen die Aminosäuren zwischen Glu228 und Arg234 modifiziert werden können, wodurch diese Konstrukte als Ergebnis zum Beispiel durch Proteasen, wie Furin, aktiviert werden können.
  • Um die Funktion des C-terminalen Peptids von Faktor Xaα zu untersuchen, führten Eby et al. (Blond 80 (Suppl. 1) (1992), S. 1214 A) ein Stopcodon an Position Gly430 der Faktor X-Sequenz ein. Sie fanden jedoch keinen Unterschied zwischen der Aktivierungsgeschwindigkeit von Faktor Xa (FXaα) mit einem β-Peptid und einer Deletionsmutante ohne β-Peptid (FXaβ).
  • Faktor Xa stellt eine wichtige Komponente des Prothrombinasekomplexes dar und wird daher für das schnelle Stillen von Blutungen, sowie in Patienten mit Blutgerinnungsstörungen, wie Hämophilie, verwendet. Insbesondere bei der Behandlung von Patienten, welche an Hämophilie leiden, welche durch einen Faktor VIII- oder einen Faktor IX-Mangel gekennzeichnet ist, mit Faktor-Konzentraten, welche aus Plasma hergestellt wurden, ist eine Komplikation, welche häufig auftritt, dass inhibitorische Antikörper gegen diese Faktoren gebildet werden. Daher wurde eine Anzahl von Alternativen entwickelt, um Patienten, welche an Hämophilie leiden, mit Faktoren mit einer Umgehungsaktivität zu behandeln. So wurde zum Beispiel die Verwendung von Prothrombin-Komplex-Konzentrat, teilweise aktiviertem Prothrombinase-Komplex (APPC), Faktor VIIa oder FEIBA vorgeschlagen. Kommerzielle Zusammensetzungen mit einer Aktivität zur Umgehung der Faktor VIII-Inhibition schließen zum Beispiel FEIBA® oder Autoplex® ein. FEIBA enthält zum Beispiel vergleichbare Einheiten von Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X und FEIBA, kleine Mengen von Faktor VIII und Faktor V und Spuren von aktivierten Gerinnungsfaktoren, wie Thrombin und Faktor Xa und/oder einem Faktor mit Faktor Xa-ähnlicher Aktivität (Elsinger, Activated Prothrombin Complex Concentrates. Hersg. Mariani, Russo, Mandelli (1982), S. 77–87). Elsinger hebt insbesondere die Wichtigkeit einer "Faktor Xa-ähnlichen" Aktivität in FEIBA hervor. Die Aktivität zur Umgehung der Faktor VIII-Inhibition wurde von Giles et al. (British J. Hematology 9 (1988), S. 491–497) im Tiermodell insbesondere für eine Kombination von gereinigtem Faktor Xa und Phospholipiden gezeigt.
  • Daher gibt es einen beachtlichen Bedarf und eine Anzahl von verschiedenen Gebieten der Anwendung für Faktor X/Xa oder Faktor X/Xa-ähnliche Proteine, entweder durch sie selber oder als eine Komponente eines Gerinnungskomplexes in einer hämostatischen Therapie. Verglichen mit der Halbwertszeit des Zymogens ist die Halbwertszeit von Faktor Xa sowohl in vivo, als auch in vitro erheblich reduziert. Daher kann zum Beispiel Faktor X in Glycerin für 18 Monate stabil gelagert werden, während Faktor Xa unter den gleichen Bedingungen nur für 5 Monate stabil ist (Bajaj et al., J. Biol. Chem. 248 (1973), S. 7729–7741), oder er zeigt, wenn er in Glycerin bei 4°C für 8 Monate gelagert wird, eine Reduktion der Aktivität um mehr als 60% (Teng et al., Thrombosis Res. 22 (1981), S. 213–220). Im Serum beträgt die Halbwertszeit von Faktor Xa nur 30 Sekunden.
  • Aufgrund der Instabilität von Faktor Xa wurde vorgeschlagen, Faktor X-Zusammensetzungen zu verabreichen ( U.S. 4,501,731 ). In Fällen von lebensbedrohlichen Blutungen, insbesondere bei Patienten, welche an Hämophilie leiden, weist eine Verabreichung von Faktor X jedoch keine Wirkung auf, da es aufgrund des Fehlens des funktionsfähigen "Tenase-Komplexes" nicht möglich ist, dass ei ne wirksame Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa im intrinsischen Blutgerinnungsweg stattfindet, und da eine Aktivierung durch den extrinsischen Weg häufig zu langsam stattfindet, um eine schnelle Wirkung aufzuweisen. Weiterhin weisen Patienten, welche an Hämophilie leiden, eine ausreichende Versorgung mit Faktor X auf, verglichen mit Faktor Xa weist Faktor X jedoch eine Prothrombinaseaktivität auf, welche 1000-fach niedriger ist. In Fällen von diesem Typ muss aktivierter Xa direkt verabreicht werden, möglicherweise in Kombination mit Phospholipiden, wie von Giles et al. (British J. Haematology 9 (1988), S. 491–497) beschrieben, oder mit anderen Gerinnungsfaktoren, zum Beispiel mit einer Aktivität zur Umgehung der Faktor VIII-Inhibition.
  • Himmelspach et al., Thrombosis and Haemostasis, 1999, Seite 758 beschreiben eine Vielzahl von rekombinanten Faktor X-Derivaten, in welchen Reste, die der Aktivierungsspaltstelle direkt voranstehen, ersetzt werden, und welche die Aktivierbarkeit durch Faktor VII/TF beibehalten haben, aber eine Empfindlichkeit für eine Faktor XIa-Spaltung erhalten haben (vgl. die Zusammenfassung). Weiterhin beschreibt die WO 98/38317 Faktor X-Analoge, welche eine Modifikation im Bereich der natürlich vorkommenden Faktor Xa-aktivierenden Spaltstelle aufweisen, wobei die Modifikation eine Prozessierungsstelle einer Protease darstellt, welche nicht natürlich in diesem Bereich der Faktor X-Sequenz spaltet (vgl. die Zusammenfassung).
  • In der Herstellung von Faktor Xa aus Faktor X wurde die Aktivierung bislang hauptsächlich mit Hilfe von nicht physiologischen Aktivierungsmitteln tierischen Ursprungs ausgelöst, wie RVV oder Trypsin, aber dies bedeutet, dass aufgepasst werden muss, um mit absoluter Gewissheit sicherzustellen, dass das Endprodukt vollständig frei von diesen Proteasen ist. Wie bereits oben erwähnt, wird während der Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa eine große Anzahl von inaktiven Zwischenprodukten gebildet (Bajaj et al., J. Biol. Chem. 248 (1973), S. 7729–7741, Mertens et al., Biochem. J. 185, (1980), S. 647–658). Die Anwesenheit von solchen Zwischenprodukten führt zu einer Abnahme der spezifischen Aktivität des Produkts und möglicherweise sogar zu dem Typ der Zwischenprodukte, welche als Antagonisten der aktiven Serinprotease dienen könnten. Daher werden, um ein einheitliches, reines Produkt mit einer hohen spezifischen Aktivität mit Hilfe von gängigen Verfahren herzustellen, zeitaufwändige und komplizierte Verfahren zur Aktivierung und chromatographischen Reinigung benötigt.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, welche ein Polypeptid mit Faktor X/Xa-Aktivität enthält, welche, verglichen mit dem Stand der Technik, einfacher durch Faktor XIa oder ein Derivat davon aktiviert werden kann, welche eine hohe Stabilität aufweist, und welche mit Hilfe von Faktor XIa oder einem Derivat davon aktiviert werden kann, ohne eine der Proteasen verwenden zu müssen, welche im Stand der Technik verwendet werden, um den natürlichen Faktor X zu aktivieren, insbesondere eine tierischen Ursprungs, wie RVV oder Trypsin. Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Aktivität zur Umgehung der Faktor VIII-Inhibition verfügbar zu machen.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 stellt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von Faktor X dar (SEQ ID NR. 1 und 2).
  • 2 stellt eine schematische Darstellung des Faktor X-Analogs mit einer modifizierten Protease-Schnittstelle im Bereich des Aktivierungspeptids dar.
  • 3 zeigt eine Western Blot-Analyse von rekombinantem Faktor X, welcher in CHO-Zellen exprimiert wurde.
  • 4 zeigt eine Western Blot-Analyse nach der in vitro Aktivierung des Faktor X-Analogs mit Faktor XIa.
  • 5 zeigt die Reinigung von rFX/rFXIa (Q-R/I) durch eine Anionen-Austauschchromatographie.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Faktor X-Analog mit einer Modifikation im Bereich der Aminosäurereste 226–235 bezogen auf die in 1 gezeigte Sequenz dar, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Faktor X-Sequenz mit Glu226-R8-R7-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1 enthält, wobei
    • a) R1 Ile ist,
    • b) R2 Thr ist,
    • c) R3 Phe ist,
    • d) R4 Asp ist,
    • e) R5 Asn ist,
    • f) R6 Phe ist,
    • g) R7 Ser ist, und
    • h) R8 Gln ist.
  • Der Begriff "Modifikation" betrifft hier eine Mutation, eine Deletion, eine Insertion oder eine Substitution eines Aminosäurerestes innerhalb der bezeichneten Sequenz. Der Begriff "Substitution" betrifft das Ersetzen eines Aminosäurerestes mit einem unterschiedlichen Aminosäurerest innerhalb des Polypeptids. Der Begriff "Deletion" betrifft die Abwesenheit von mindestens einem der Aminosäurereste innerhalb des Polypeptids, ohne Ersetzen durch einen anderen Aminosäurerest. Der Begriff "Insertion" betrifft das Einsetzen eines zusätzlichen Aminosäurerestes innerhalb des Polypeptids. Der Begriff "Mutation" betrifft irgendeine Änderung in der Sequenz des bezeichneten Polynukleotids oder Polypeptids, wobei die Änderung eine Deletion, eine Insertion oder eine Substitution von einer oder mehreren Nukleinsäure/n oder Aminosäure/n innerhalb der bezeichneten Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz sein könnte. Vorzugsweise stellt die Modifikation in der vorliegenden Erfindung eine Substitution von mindestens einer Aminosäure dar.
  • Die Aminosäuremodifikation in diesem Bereich erzeugt eine neue Erkennungs- und Prozessierungsstelle für Faktor XIa oder ein Derivat davon, wobei die Stelle nicht natürlich an dieser Position im Polypeptid vorkommt. Faktor XIa oder ein Derivat davon spaltet Fx normalerweise nicht im Bereich Glu-Arg-Gly-Asp-Asn-Asp-Phe-Thr-Arg/Ile der Aminosäuren 226–234. Überraschenderweise weist das erfindungsgemäße Faktor X-Analog eine mindestens 2-fach, vorzugsweise eine mindestens 5-fach und insbesondere eine mindestens 10-fach erhöhte Fähigkeit auf, durch Faktor XIa aktiviert zu werden, verglichen mit dem Faktor X-Analog gemäß der WO 98/38317 .
  • Zusätzlich war es eine Überraschung zu entdecken, dass das erfindungsgemäße Faktor X-Analog bei einer Antigenkonzentration von 4–8 μg/ml in der Lage ist, die Gerinnungszeit von Faktor IX- oder FVIII-Mangelplasma wirksamer als > 200 mU, vorzugsweise > 500 mU, insbesondere > 1000 mU von Plasma Faktor IX oder FVIII zu reduzieren.
  • Die Modifikation ist ausgewählt, um sicherzustellen, dass die Prozessierung mit Hilfe von Faktor XIa zu einem Polypeptid führt, welches dem nativen Faktor Xa entspricht, und welches im Wesentlichen der natürlich vorkommenden Faktor Xa-Sequenz ähnelt und ebenfalls eine Faktor Xa-Aktivität aufweist.
  • Vorzugsweise sollte die NH2-terminale Aminosäure Isoleucin der schweren Kette nach der Aktivierung erhalten bleiben, da diese Aminosäure eine wichtige Rolle bei der Bildung der Substrat bindenden Tasche spielt (Watzke et al. (1995), Molecular Basis of Thrombosis and Hemostatis, Hrsg., Katherine High und Harold Roberts). Verglichen mit der nativen Faktor X-Sequenz, sind die erfindungsgemäßen Faktor X-Analoge strukturell unterschiedlich, insbesondere auf der Aminosäureebene, aber ihre Fähigkeit, aktiviert zu werden, ist vergleichbar mit der natürlich vorkommenden Faktor X-, und nach einer Aktivierung, der Faktor Xa-Aktivität.
  • Die Erfindung stellt Faktor X-Analoge bereit, welche am Aktivierungspeptid bezogen auf die natürlich vorkommende Faktor X-Sequenz modifiziert sind, und welche eine veränderte Proteasespezifität aufweisen. Aminosäuremodifikationen können an Position Ile235 (R1), Arg234, Thr233 (R2), Leu232 (R3), Asn231 (R4), Asn230 (R5), Asp229 (R6), Gly228 (R7) und Arg229 (R8) stattfinden, während Arg234 jedoch vorzugsweise unverändert bleibt.
  • Erfindungsgemäße Faktor X-Analoge weisen eine Faktor X-Sequenz mit Glu226-R8-R7-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1 auf, wobei
    • a) R1 eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Ile ist,
    • b) R2 Thr ist,
    • c) R3 Phe ist,
    • d) R4 Asp ist,
    • e) R5 Asn ist,
    • f) R6 Phe ist,
    • g) R7 Ser ist, und
    • h) R8 Gln ist.
  • Vorzugsweise sind die Aminosäuresequenzen von der Art, welche den Aminosäuresequenzen des Aktivierungspeptids von Faktor IX entspricht. Diese Sequenzen können humanen, aber auch tierischen (z. B. Mäuse, Schweine, etc.) Faktor IX-Aktivierungspeptid-Bereichen entsprechen.
  • Die Modifikationen können zum Beispiel durch stellenspezifische in vitro Mutagenese oder durch PCR oder durch irgendwelche anderen, im Stand der Technik bekannten gentechnischen Verfahren durchgeführt werden, welche geeignet sind, um spezifisch eine DNA-Sequenz zu verändern, um spezifische Aminosäurenaustausche durchzuführen.
  • Erfindungsgemäß wird die Aktivierung des erfindungsgemäßen Faktor X-Analogs, um einen nativen Faktor Xa oder ein Faktor Xa-Analog zu bilden, mit Hilfe von Faktor XIa oder einem Derivat davon durchgeführt.
  • Eine der Schwierigkeiten, welche bei der Herstellung von aktivem Faktor Xa auftreten, stellt seine Instabilität dar, da zusätzlich zu Faktor Xaα, Faktor Xaβ und andere Zwischenprodukte, einige möglicherweise inaktiv, als Ergebnis der Autokatalyse gebildet werden.
  • Um im Wesentlichen intakte/n aktiven Faktor X/Xa und/oder Faktor X/Xa-ähnliche Moleküle herzustellen, würde es daher wünschenswert sein, nur Proteine zu erhalten, welche zu stabilen Endprodukten führen.
  • Es ist bekannt, dass eine bevorzugte Spaltstelle für die Prozessierung von Faktor Xaα (FXaα), um Faktor Xaβ (FXaβ) zu bilden, zwischen Arg469 und Gly470 liegt. Gemäß von Untersuchungen von Eby et al. (Blond, Band 80, Suppl. 1 (1992), S. 1214) wird zusätzlich zu einem auffälligen carboxylterminalen Peptid (Aminosäurereste 476–487) von Faktor X ein zusätzliches kürzeres Peptid (Aminosäurereste 447 bis 477) gefunden, welches sich als Ergebnis der Autokatalyse von Faktor Xaα bildet. Um sich auf die spezifische Prozessierung von intaktem Faktor X, um aktiven Faktor Xa zu bilden, zu konzentrieren, ohne inaktive Prozessierungszwischenprodukte zu erhalten, weisen die erfindungsgemäßen Faktor X-Analoge andere Modifikationen auf.
  • Daher wird gemäß einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung das erfindungsgemäße Faktor X-Analog weiterhin im C-terminalen Bereich der Faktor X-Aminosäuresequenz modifiziert.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist ein Faktor X-Analog des oben beschriebenen Typs ein intaktes β-Peptid (FXa) auf. Der Begriff "β-Peptid" betrifft hier ein 4 kD Glykopeptid, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist. Die erste Spaltstelle für die Entfernung des β-Peptids durch Plasmin liegt an Arg469 gemäß der Aminosäuresequenz aus 1, was zur Entfernung des vollständigen C-Terminus, d. h. des β-Peptids, führt (Pryzdial E. und Kessler G., J. Biol. Chem., 1996, S. 16614–16620). Insbesondere weist das erfindungsgemäße Faktor X-Analog eine Modifikation im Bereich der C-terminalen β-Peptid- Spaltstelle auf, welche sicherstellt, dass eine Spaltung des β-Peptids von Faktor X verhindert wird, nachdem Faktor X aktiviert wurde, um Faktor Xa zu bilden. Dieses führt zu einem Faktor Xa-Molekül, von welchem bis zu 100% in Form eines intakten Faktor Xaα-Moleküls isoliert werden können.
  • Die Modifikation kann eine Mutation, Deletion oder Insertion im Bereich der Faktor X-Aminosäuresequenz zwischen den Aminosäurepositionen Arg469 und Ser476 und möglicherweise von Lys370 darstellen. Eine bevorzugte Aminosäuremodifikation stellt jedoch eine dar, in welcher es nicht möglich ist, dass eine Faltung des Polypeptids, welche die Struktur und daher möglicherweise die Funktion und die Aktivität des Proteins beeinflussen würde, als Ergebnis des Aminosäureaustausches auftritt.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die erfindungsgemäßen Faktor X-Analoge einen Austausch von einer der Aminosäuren an Position Arg469 und/oder Gly470, wobei Arg469 vorzugsweise durch Lys, His oder Ile ersetzt wird, und wobei Gly470 vorzugsweise durch Ser, Ala, Val oder Thr ersetzt wird.
  • Zusätzlich zu einer Mutation an Position Arg469 und/oder Gly470 können die erfindungsgemäßen Faktor X-Analoge eine zusätzliche Mutation an Position Lys370 und/oder Lys475 und/oder Ser476 aufweisen.
  • Als ein Ergebnis einer Aminosäuremodifikation in einer dieser Positionen wird ein Prozessieren von Faktor Xaα zu Faktor Xaβ oder Faktor Xaγ verhindert, da die natürlich vorkommende/n Prozessierungssequenz/en modifiziert ist/sind, um sicherzustellen, dass es nicht länger möglich ist, dass eine mögliche autokatalytische Spaltung des carboxylterminalen Peptids stattfindet.
  • Gemäß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das erfindungsgemäße Faktor X-Analog eine Deletion des carboxylterminalen β-Peptids (FXβ) auf. Ein solches Faktor X-Analog kann durch Exprimieren einer cDNA hergestellt werden, welche ein Faktor X-Analog in einem rekombinanten Expressionssystem kodiert, wobei nur jene Sequenzen kloniert werden, welche die Aminosäuren Met1 bis Arg469 kodieren.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das erfindungsgemäße Faktor X-Analog ein Translations-Stopsignal im C-terminalen Bereich der Faktor X-Sequenz auf. Dieses Translations-Stopsignal liegt vorzugsweise an einer Position, welche einer C-terminalen Aminosäure folgt, welche nach der natürlichen Prozessierung gebildet wird. Das Translations-Stopsignal liegt daher vorzugsweise an der Position von Aminosäure 470 der Faktor X-Sequenz, so dass das terminale Arg469 des Faktor Xaβ beibehalten wird. Um dies sicherzustellen, wird das Codon GGC, welches die Aminosäure Gly470 kodiert, durch TAA, TAG oder TGA ausgetauscht.
  • Ein anderes Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft Faktor X-Analoge, welche durch Behandeln derselben in vivo und in vitro mit Faktor XIa oder einem Derivat davon aktiviert werden, um nativen Faktor Xa oder ein Faktor Xa-Analog zu erhalten, d. h. die aktivierten Faktor X-Analoge. Abhängig vom Faktor X-Analog, welches verwendet und aktiviert wird, erhält man ein Polypeptid, welches dem nativen Faktor Xa oder einem Polypeptid entspricht und im Wesentlichen identisch zu diesem ist, welches, obwohl es eine Faktor Xa-Aktivität aufweist, Modifikationen bezüglich der nativen Faktor Xa-Sequenz aufweist, welche jedoch die biologische Aktivität nicht beeinträchtigen. Wenn die erfindungsgemäßen Faktor X-Analoge, welche im Bereich des Aktivierungspeptids in der Sequenz des Aktivierungspeptids modifiziert sind, aktiviert werden, werden nur Polypeptide erhalten, welche dem nativen Faktor Xa-Molekül entsprechen. Wenn ein solches Faktor X-Analog ebenfalls ein zusätzliches Translations-Stopsignal im C-terminalen Bereich des β-Peptids aufweist, werden Moleküle erhalten, welche homolog zu Faktor Xaβ sind. Wenn andererseits ein Faktor X-Analog verwendet wird, welches eine Modifikation oder Modifikationen innerhalb der β-Peptid-Sequenz aufweist, welche die Wirkung hat oder haben, dass das β-Peptid nicht abgespalten wird, wird ein Faktor Xaα-Analog mit einem Aminosäureaustausch am C-Terminus des Moleküls erhalten.
  • Die erfindungsgemäßen Faktor X-Analoge weisen nur Modifikationen auf, welche die Spezifität für die Aktivierungsfähigkeit verändern, und welche keine negative Wirkung auf die Aktivität aufweisen. Daher werden in allen Fällen biologisch und funktionsfähig aktive Faktor Xa-Moleküle und Faktor Xa-Analoge erhalten.
  • Die Aktivierung in vivo und in vitro kann mit Hilfe von Faktor XIa oder einem Derivat davon durchgeführt werden. In diesem Zusammenhang kann ein Faktor XIa-Derivat ein von Faktor XIa abgeleitetes Polypeptid oder Protein sein, welches sich vom nativen Faktor XIa zum Beispiel in Bezug auf seine Länge (z. B. verkürzte Formen) unterscheidet, oder welches durch eine Aminosäuremodifikation erhalten wurde. In allen Fällen ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Faktor XIa-Derivat ebenfalls die spezifische Proteaseaktivität aufweist, welche charakteristisch für Faktor XIa ist.
  • Gemäß einer besonderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Faktor X-Analoge zur Verfügung, welche vorzugsweise in gereinigter Form als einzelkettige Moleküle vorliegen. Das einzelkettige Faktor X-Molekül ist durch eine hohe Stabilität und molekulare Integrität gekennzeichnet. Bislang war es nicht möglich, ein einzelkettiges Faktor X-Molekül in gereinigter Form zu isolieren, da es sehr schnell in die doppelkettige Form prozessiert wird (Fair et al., Blood 64 (1984), S. 194–204). Die rekombinanten einzelkettigen Faktor X-Analoge können durch spezifische Prozessierung prozessiert werden, um die doppelkettige Faktor X-Form zu bilden, und können nachfolgend zu Faktor Xa oder das Faktor Xa-Analog aktiviert werden. Dies kann erreicht werden, indem das einzelkettige Faktor X-Analog mit Furin in Kontakt gebracht wird, indem es prozessiert wird und indem es nachfolgend mit Hilfe von Faktor XIa oder einem Derivat davon aktiviert wird.
  • Das doppelkettige Faktor X-Analog kann aktiviert werden, um Faktor Xa oder ein Faktor Xa-Analog zu bilden. Dies kann zum Beispiel durch Verwenden eines Faktor X-Analogs erreicht werden, welches als Ergebnis der erfindungsgemäßen Modifikation im Bereich des Aktivierungspeptids eine Faktor XIa-Spaltstelle aufweist, welches in einer rekombinanten Zelle als ein einzelkettiges Molekül exprimiert und isoliert wird, und welches nachfolgend prozessiert wird, indem es mit Furin in Kontakt gebracht wird und anschließend mit Hilfe von Faktor XIa oder einem Derivat davon gespalten wird, um ein aktiviertes Faktor Xa-Molekül zu bilden.
  • Ein Faktor X-Analog, welches als ein doppelkettiges Molekül aus einer Zellkultur isoliert wurde, kann direkt mit Faktor XIa oder einem Derivat davon behandelt werden.
  • Aufgrund der selektiven und stellenspezifischen Prozessierungsreaktion weist ein Faktor Xa oder ein Faktor Xa-Analog, welches auf diese Weise erhalten wurde, eine hohe Stabilität und strukturelle Integrität auf und ist insbesondere frei von inaktiven Faktor X/Xa-Analog-Zwischenprodukten und autoproteolytischen Abbauprodukten. Zusätzlich kann das erfindungsgemäße Faktor X-Analog insbesondere einfach mit Hilfe von Faktor XIa oder einem Derivat davon aktiviert werden, wobei die Fähigkeit, aktiviert zu werden, mindestens 2-fach, vorzugsweise mindestens 5-fach und insbesondere mindestens 10-fach gesteigert ist, wenn sie mit Faktor X-Analogen verglichen wird, welche in der WO 98/38317 beschrieben werden. Überraschenderweise wurde entdeckt, dass die erfindungsgemäßen Konstrukte als Ergebnis der Tatsache, dass ein Minimum von 4, vorzugsweise ein Minimum von 6 der Aminosäuren 226–235 Aminosäuren darstellen, welche sich von jenen des natürlichen Faktor X-Moleküls unterscheiden, und dass vorzugsweise mindestens 3 der ausgetauschten Aminosäuren unmittelbar aufeinanderfolgen, einfacher aktiviert werden können.
  • Eine zusätzliche Eigenschaft der vorliegenden Erfindung betrifft die rekombinante DNA, welche die erfindungsgemäßen Faktor X-Analoge kodiert. Nach seiner Expression führt die rekombinante DNA in einer geeigneten Wirtszelle zu einem Faktor X-Analog mit einer Aminosäuresequenz, welche dem humanen Faktor X entspricht, außer dass sie eine Aminosäuremodifikation aufweist, welche die Prozessierungsspezifität und die Prozessierungsprodukte beeinflusst. Die biologische Gerinnungsaktivität wird jedoch in keiner Weise negativ beeinflusst, stattdessen ergibt sich überraschenderweise häufig sogar ein Anstieg der Aktivität.
  • Gemäß noch einer anderen Eigenschaft der vorliegenden Erfindung werden ebenfalls transformierte Zellen bereitgestellt, welche die rekombinante DNA enthalten.
  • Eine zusätzliche Eigenschaft der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, welche ein gereinigtes Faktor X-Analog oder ein Vorläuferprotein davon enthält, welches die erfindungsgemäße Aminosäuremodifikation im Bereich der natürlich vorkommenden Faktor Xa-Aktivierungsstelle aufweist. Die Modifikation im Bereich der Aktivierungs-Spaltstelle stellt eine neue Erkennungs- und Prozessierungs-Spaltstelle – welche natürlicherweise an dieser Position in dem Polypeptid nicht vorkommt – für Faktor XIa oder einem Derivat davon dar, welche das Polypeptid an dieser Position normalerweise nicht prozessiert. Die Zusammensetzung kann eine gereinigte Zusammensetzung aus Faktor X-Analogen darstellen, wobei die Polypeptide aus einem Zellkultursystem entweder nach einer Isolierung aus dem Überstand der Zellkultur oder aus einem Extrakt der Zellkultur erhalten werden. Ein vorgereinigtes rekombinantes Faktor X-Analog aus einem Zellkultursystem kann weiter unter Verwendung von Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, gereinigt werden. In diesem Zusammenhang sind insbesondere chromatographische Verfahren, wie Gelfiltration, Ionenaustausch- oder Affinitäts-Chromatographie für eine Verwendung geeignet.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung vorzugsweise das Faktor X-Analog als ein einzelkettiges Molekül in isolierter Form. Eine solche Zusammensetzung wird durch Isolieren eines Faktor X-Analogs hergestellt, welches durch rekombinante Herstellung als ein einzelkettiges Molekül aus einem Zellsystem erhalten wurde, vorzugsweise aus einer Zellkultur von endoproteasearmen Zellen.
  • Eine besondere Eigenschaft der vorliegenden Erfindung betrifft die Tatsache, dass die Zusammensetzung ein einzelkettiges Faktor X-Analog mit einer Modifikation enthält, welche nach dem Prozessieren mit Hilfe von Furin eine in vitro Aktivierung zu Faktor Xa mit Hilfe von Faktor XIa oder einem Derivat davon erlaubt. Die Aktivierung wird erreicht, indem das Faktor X-Analog in Kontakt mit den Proteasen gebracht wird, was zu einer Spaltung in die reife Faktor X-Form führt, und als Ergebnis der Modifikation zu einer Spaltung des Aktivierungspeptids und zur Bildung von Faktor Xa und dem Faktor Xa-Analog.
  • In der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann das Faktor X-Analog entweder als Faktor Xα (FXα) oder mit einer Deletion des β-Peptids vorliegen.
  • Die Zusammensetzung enthält insbesondere ein Faktor X-Analog in einer enzymatisch inaktiven Form mit einer Reinheit von einem Minimum von 80%, vorzugsweise 90% und insbesondere 95% und enthält keine inaktiven proteolytischen Zwischenprodukte des Faktors X/Xa-Analogs.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung das Faktor X-Analog vorzugsweise als ein doppelkettiges Molekül in isolierter Form. Um dies zu erreichen wird zum Beispiel ein Faktor X-Analog, welches mit Hilfe von rekombinanter Herstellung als ein einzelkettiges Molekül aus einem Zellsystem erhalten wurde, in vitro gespalten, d. h. außerhalb der Zelle mit Hilfe von Furin, um die doppelkettige Form zu erhalten. Dies kann durch Mischen der Protease direkt mit dem Überstand der Kultur der Klone erreicht werden, welche das Faktor X-Analog exprimieren, entweder durch Mischen der gereinigten Protease oder eines Zellkulturüberstands einer Zellkultur, welche die Protease in rekombinanter Form exprimiert, oder mit Hilfe von gemeinsamer Kultivierung von Faktor X-Analog und Protease exprimierenden Klonen.
  • Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Zusammensetzung, welche das gereinigte, einzelkettige oder doppelkettige Faktor X-Analog enthält, eine physiologisch verträgliche Matrix und ist möglicherweise als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert. Die Zusammensetzung kann unter Verwendung von im Wesentlichen im Stand der Technik bekannten Verfah ren formuliert werden, sie kann mit einem Puffer gemischt werden, welcher Salze, wie NaCl, CaCl2 und Aminosäuren, wie Glycin und/oder Lysin, enthält in einem pH-Wertbereich von 6 bis 8 gemischt werden, und sie kann als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert werden. Bis sie gebraucht wird, kann die gereinigte Zusammensetzung, welche das Faktor X-Analog enthält, in Form einer fertiggestellten Lösung oder in lyophilisierter oder tiefgefrorener Form gelagert werden. Vorzugweise wird die Zusammensetzung in lyophilisierter Form gelagert und wird unter Verwendung einer geeigneten Rekonstituierungslösung zu einer optisch klaren Lösung gelöst.
  • Aber die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann ebenfalls als eine flüssige Zusammensetzung oder als eine Flüssigkeit, welche tiefgefroren ist, bereitgestellt werden.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist insbesondere stabil, d. h. sie kann in gelöster Form für einen ausgedehnten Zeitraum vor der Anwendung gelagert werden. Es wurde gefunden, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung für mehrere Stunden und sogar Tage ohne Verlust der Aktivität gelagert werden kann.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in ein geeignetes Hilfsmittel gebracht werden, vorzugsweise ein Verabreichungshilfsmittel, zusammen mit Faktor XIa oder einem Derivat davon.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung, welche ein Faktor X-Analog in Kombination mit Faktor XIa oder einem Derivat davon enthält, welches in der Lage ist, das Faktor X-Analog zu Faktor Xa oder zum Faktor Xa-Analog zu aktivieren, kann in Form einer Kombinationszusammensetzung bereitgestellt werden, welche einen Behälter, welcher Faktor XIa enthält, welcher auf einer Matrix, möglicherweise in Form einer mit einer Protease ergänzten Miniatursäule oder einer Spritze immobilisiert ist, und einen Behälter, welcher die pharmazeutische Zusammensetzung mit dem Faktor X-Analog enthält, umfasst. Um das Faktor X-Analog zu aktivieren, kann die Faktor X-Analog enthaltende Lösung zum Beispiel über die immobilisierte Protease gedrückt werden. Während der Lagerung der Zusammensetzung wird die Faktor X-Analog enthaltende Lösung vorzugsweise räumlich von der Protease getrennt. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in demselben Behälter wie die Protease gelagert werden, aber die Komponenten sind räumlich durch eine inpermeable Abtrennung getrennt, welche einfach vor der Verabreichung der Zusammensetzung entfernt werden kann. Die Lösungen können ebenfalls in getrennten Behältern gelagert werden und nur kurz vor der Verabreichung miteinander in Kontakt gebracht werden.
  • Das Faktor X-Analog kann zu Faktor Xa kurz vor der unmittelbaren Verwendung, d. h. vor der Verabreichung an den Patienten, aktiviert werden. Die Aktivierung kann durchgeführt werden, indem ein Faktor X-Analog mit einer immobilisierten Protease in Kontakt gebracht wird oder indem Lösungen, welche einerseits eine Protease und andererseits das Faktor X-Analog enthalten, gemischt werden. Es ist daher möglich, die zwei Komponenten in der Lösung getrennt zu halten und sie mit Hilfe eines geeigneten Infusionshilfsmittels zu mischen, in welchem die Komponenten in Kontakt miteinander kommen, wenn sie das Hilfsmittel passieren und dadurch eine Aktivierung zu Faktor Xa oder zu dem Faktor Xa-Analog zu verursachen.
  • Der Patient erhält so ein Gemisch aus Faktor Xa und zusätzlich eine Serinprotease, welche für die Aktivierung verantwortlich ist. In diesem Zusammenhang ist es insbesondere wichtig, große Aufmerksamkeit auf die Dosierung zu richten, da die zusätzliche Verabreichung einer Serinprotease ebenfalls den endogenen Faktor X aktiviert, welcher die Gerinnungszeit verkürzen kann.
  • Gemäß einer geeigneten Ausführungsform der Erfindung wird die pharmazeutische Zusammensetzung in einem geeigneten Hilfsmittel, vorzugsweise einem Verabreichungshilfsmittel bereitgestellt, entweder in Form einer gefrorenen Flüssigkeit oder in gefriergetrockneter Form. Ein geeignetes Verabreichungshilfsmittel stellt zum Beispiel eine Doppelkammerspritze des in der AT 366 916 oder der AT 382 783 beschriebenen Typs dar.
  • Eine insbesondere geeignete Eigenschaft dieser Erfindung ist, dass die Zusammensetzung ein Faktor X-Analog mit einer Modifikation enthalten kann, welche eine in vivo Aktivierung des Faktor X-Analogs zu Faktor Xa möglich macht. Insbesondere weisen die Faktor X-Analoge der erfindungsgemäßen Zusammensetzung eine Modifikation auf, welche eine Erkennungs- und Spaltsstelle für Faktor XIa oder ein Derivat davon darstellt, was es ihnen möglich macht, durch diese Protease in vivo gespalten zu werden, um nativen Faktor Xa oder das Faktor Xa-Analog zu bilden. Als Ergebnis kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung verwendet werden, um Blutungen sowohl bei Patienten mit einem Mangel an Faktor IX und Faktor VIII, als auch bei Patienten mit einem Faktor VIII-Inhibitor zu stillen.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann als eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Faktor Xa-Aktivität in Form einer Einkomponentenzusammensetzung oder in Kombination mit anderen Faktoren in Form einer Mehrkomponentenzusammensetzung bereitgestellt werden.
  • Vor der Prozessierung des gereinigten Proteins in eine pharmazeutische Zusammensetzung wird das gereinigte Protein den gängigen Qualitätskontrollen unterzogen und in eine therapeutische Darreichungsform gebracht. Insbesondere wird die gereinigte Zusammensetzung während der rekombinanten Herstellung auf die Abwesenheit von zellulären Nukleinsäuren, sowie Nukleinsäuren, welche von dem Expressionsvektor abgeleitet sind, getestet, vorzugsweise unter Verwendung eines Verfahrens, wie es in der EP 0 714 987 beschrieben ist.
  • Da irgendein biologisches Material mit infektiösen Mikroorganismen kontaminiert sein kann, kann es sein, dass die Zusammensetzung besonders behandelt werden muss, um Viren zu inaktivieren oder zu vermindern, um sicherzustellen, dass eine sichere Zusammensetzung erhalten wird.
  • Eine andere Eigenschaft dieser Erfindung betrifft das Bereitstellen einer Zusammensetzung, welche ein Faktor Xa-Analog mit einer hohen Stabilität und struktu rellen Integrität enthält, und welche insbesondere frei von inaktiven Faktor X/Xa-Analog-Zwischenprodukten und autoproteolytischen Abbauprodukten ist, und welche durch Aktivieren eines Faktor X-Analogs des oben beschriebenen Typs und durch sein Formulieren in eine geeignete Zusammensetzung hergestellt werden kann.
  • Eine zusätzliche Eigenschaft der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung des oben beschriebenen Typs, um ein Arzneimittel herzustellen. Ein Arzneimittel, welches ein erfindungsgemäßes Faktor X-Analog und/oder ein Faktor Xa-Analog enthält, ist insbesondere für die Behandlung von Patienten mit Blutgerinnungsstörungen, wie Patienten, welche an Hämophilie leiden oder Bluter mit inhibitorischen Antikörpern geeignet, und insbesondere als eine Zusammensetzung mit einer Aktivität zur Umgehung der Faktor VIII-Inhibition.
  • Eine andere Eigenschaft dieser Erfindung betrifft die Verwendung einer Nukleinsäure, welche die kodierenden Sequenzen des erfindungsgemäßen Faktor X-Analogs für die Herstellung eines Arzneimittels enthält. In diesem Zusammenhang kann die Nukleinsäure, soweit sie geeignete Expressions-Kontrollsequenzen enthält, in Form einer nackten Nukleinsäure verabreicht werden, sie kann in einen rekombinanten Expressionsvektor integriert werden, oder sie kann an eine Matrix gebunden werden, wie entweder ein Phospholipid oder ein Viruspartikel. Die Nukleinsäure kann verwendet werden, um ein Arzneimittel herzustellen, welches insbesondere für die Verwendung bei der Behandlung von Patienten mit Blutgerinnungsstörungen, wie Hämophilie-Patienten oder Bluter mit inhibitorischen Antikörpern, geeignet ist. Eine andere mögliche Anwendung stellt die Verwendung der Nukleinsäure in einer Gentherapie dar.
  • Eine andere Eigenschaft der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung des erfindungsgemäßen Faktor X-Analogs und eine Zusammensetzung, welche ein erfindungsgemäßes Faktor X-Analog enthält. Um dies zu erreichen, wird eine Sequenz, welche ein Faktor X-Analog kodiert, in ein geeignetes Expressionssystem eingeführt, und die entsprechenden Zellen, vorzugsweise permanente Zelllinien, werden mit der rekombinanten DNA transfiziert. Die Zellen werden unter optimalen Bedingungen für eine Genexpression kultiviert, und die Faktor X-Analoge werden entweder aus dem Extrakt einer Zellkultur oder aus dem Überstand der Zellkultur isoliert. Die Reinigung des rekombinanten Moleküls kann weiterhin unter Verwendung aller gängigerweise bekannten chromatographischen Verfahren durchgeführt werden, wie Anionen- oder Kationen-Austausch-Chromatographie, Affinitäts- oder Immunaffinitäts-Chromatographie oder eine Kombination davon.
  • Um die erfindungsgemäßen Faktor X-Analoge herzustellen, wird die vollständige cDNA, welche Faktor X kodiert, in einen Expressionsvektor kloniert. Dies wird mit Hilfe der allgemein bekannten Klonierungstechniken durchgeführt. Die Nukleotidsequenz, welche Faktor X kodiert, wird nachfolgend modifiziert, um sicherzustellen, dass die kodierende Sequenz in dem Bereich des Aktivierungspeptids und möglicherweise in dem Bereich des C-terminalen β-Peptids verändert ist, um sicherzustellen, dass ein Faktor X-Molekül des oben beschriebenen Typs hergestellt werden kann. Um dies zu erreichen, werden gentechnische Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, verwendet, zum Beispiel Stellen spezifische in vitro Mutagenese oder Deletion von Sequenzen, zum Beispiel mit Hilfe einer Spaltung durch Restriktion mit Endonukleasen und Insertion von unterschiedlichen, veränderten Sequenzen, oder durch eine PCR. Die so hergestellten Faktor X-Mutanten werden anschließend in ein Expressionssystem inseriert, welches für die rekombinante Expression geeignet ist, und anschließend exprimiert.
  • Die erfindungsgemäßen Faktor X-Analoge können ebenfalls mit Hilfe einer chemischen Synthese hergestellt werden.
  • Die Faktor X-Analoge werden vorzugsweise mit Hilfe einer rekombinanten Expression hergestellt. Die Herstellung mit Hilfe von gentechnischen Verfahren kann mit allen bekannten Expressionssystemen durchgeführt werden, z. B. permanenten Zelllinien oder viralen Expressionssystemen. Die permanenten Zelllinien werden durch stabile Integration von exogener DNA in das Wirtszellchromosom hergestellt, z. B. von Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hep1, insbesondere Leber- und Nierenzellen oder durch einen episomalen Vektor, welcher z. B. vom Papillomavirus abgeleitet wurde. Virale Expressionssysteme, wie Vaccinia-Virus, Baculovirus oder retorvirale Systeme können ebenfalls verwendet werden. Die normalerweise verwendeten Zelllinien sind Vero, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hep1, Drüsen-, Leber- und Nierenzellen. Eukaryotische Expressionssysteme, welche verwendet werden können, schließen Hefen, endogene Drüsen (z. B. Drüsen von transgenen Tieren) und andere Zelltypen ein. Es ist natürlich ebenfalls möglich, transgene Tiere zu verwenden, um die erfindungsgemäßen Polypeptide oder Derivate davon zu exprimieren. Um die rekombinanten Proteine zu exprimieren, wurde gezeigt, dass insbesondere CHO-DHFR-Zellen geeignet sind (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, (1980), S. 4216–4220).
  • Für die rekombinante Herstellung der erfindungsgemäßen Faktor X-Analoge ist es ebenfalls möglich, prokaryotische Expressionssysteme zu verwenden. Insbesondere sind Systeme, welche eine Expression in E. coli oder B. subtilis erlauben, geeignet.
  • Die Faktor X-Analoge werden in den geeigneten Expressionssystemen unter Verwendung eines geeigneten Promotors exprimiert. Für die Expression in Eurkaryoten können alle bekannten Promotoren, wie SV40, CMV, RSV, HSV, EBV, β-Aktin, hGH oder induzierbare Promotoren, wie hsp oder der Metallothionein-Promotor verwendet werden. Die Faktor X-Analoge werden vorzugsweise unter Verwendung des β-Aktin-Promotors in CHO-DHFR-Zellen exprimiert.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung die folgenden Schritte: Herstellen einer DNA, welche ein Faktor X-Analog kodiert, Transformation einer Zelle mit der rekombinanten DNA, Expression des Faktor X-Analogs, möglicherweise in der Anwesenheit einer Protease, Isolierung des Faktor X-Analogs und möglicherweise Reinigung mit Hilfe eines chromatographischen Verfahrens.
  • Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens wird das Faktor X-Analog als ein doppelkettiges Molekül isoliert.
  • Für diesen Zweck wird das Faktor X-Analog in einer Zelle exprimiert, welche ein Prozessieren der Profaktor X-Analoge in doppelkettige Faktor X-Analoge erlaubt.
  • Das so erhaltene doppelkettige Faktor X-Analog kann nachfolgend isoliert, gereinigt und wie oben beschrieben, bis zur weiteren Verwendung stabil gelagert werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung wird die Aktivierung durch einen chromatographischen Schritt ausgelöst, in welchem die Protease auf einer Matrix immobilisiert ist. Das gereinigte doppelkettige Faktor X-Analog wird über eine Matrix geleitet, an welche die Protease gebunden ist, und aus dem Eluat wird gereinigter Faktor Xa isoliert.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die Komponenten gemischt, und die Protease wird selektiv aus dem Gemisch entfernt.
  • Zusätzlich ist es natürlich ebenfalls möglich, ein einzelkettiges Profaktor X-Analog in die doppelkettige Faktor X-Analog-Form zu prozessieren und es in einem einzigen Verfahren zu Faktor Xa zu aktivieren.
  • Die Reaktionsbedingungen der Prozessierungsreaktion/en und der Aktivierung können vom Fachmann einfach optimiert werden, abhängig vom Versuchsaufbau irgendeiner gegebenen Situation. In diesem Zusammenhang sollte erwähnt werden, dass die Durchflussgeschwindigkeit der verwendeten Reaktionspartner von besonderer Wichtigkeit für die Länge der Kontaktzeit ist. Diese Durchflussgeschwindigkeit sollte in einem Bereich von 0,01 ml/min bis 1 ml/min liegen. Andere wichtige Parameter stellen die Temperatur, der pH-Wert und die Elutionsbedingungen dar. Am Ende der Durchflusszeit kann der aktivierte Faktor Xa gegebe nenfalls weiter mit Hilfe einer selektiven Chromatographie gereinigt werden. Das Durchführen des Verfahrens mit einer Protease, welche an eine Matrix gebunden ist, bietet einen besonderen Vorteil, da es der Versuchaufbau, als ein Ergebnis der Verwendung einer Matrix, vorzugsweise von chromatographischen Säulen, möglich macht, einen zusätzlichen Reinigungsschritt einzuschließen.
  • Eine zusätzliche Eigenschaft der Herstellung eines erfindungsgemäßen Faktor X-Analogs ist, dass das Faktor X-Analog als ein einzelkettiges Molekül isoliert wird. Für diesen Zweck wird das Faktor X-Analog in einer Zelle exprimiert, in welcher die Spaltung der leichten und schweren Kette von Faktor X und/oder einem Faktor X-Analog nicht stattfinden kann. Furin gehört zu den wichtigen Proteasen, welche für die Spaltung von Faktor X in eine leichte und eine schwere Kette verantwortlich sind. Aus einer solchen mutierten Endoprotease-Mangelzelle ist es möglich, das Faktor X-Analog in Form eines einzelkettigen Moleküls zu isolieren. Ein Faktor X-Analog, welches auf diese Weise isoliert und möglicherweise ebenfalls gereinigt wurde, wird nachfolgend mit Furin unter Bedingungen in Kontakt gebracht, unter welchen das einzelkettige Faktor X-Analog in die doppelkettige Faktor X-Form gespalten wird. Erfindungsgemäße Faktor X-Analoge, welche eine Modifikation im Bereich des Aktivierungspeptids aufweisen, die eine Spaltung durch Faktor XIa möglich macht, können nachfolgend durch dieses Verfahren aktiviert werden, möglicherweise indem sie direkt in Kontakt mit Faktor XIa oder einem Derivat davon gebracht werden, um Faktor Xa oder das Faktor Xa-Analog zu bilden.
  • Gemäß einer anderen Eigenschaft dieser Erfindung wird unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Zusammensetzung erhalten, welche den aktiven Faktor Xa oder ein aktives Faktor Xa-Analog enthält, indem ein Faktor X-Analog, welches wie oben beschrieben erhalten wurde, einem Aktivierungsschritt unterzogen wird, und indem das aktivierte Polypeptid zu einer gereinigten Zusammensetzung prozessiert wird, welche möglicherweise als eine pharmazeutische Verbindung formuliert wird.
  • Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Faktor X-Analoge, welche durch ein oben beschriebenes Verfahren zu Faktor Xa aktiviert wurden, wird ein gereinigter Faktor Xa und/oder ein Faktor Xa-Analog mit einer hohen Stabilität und strukturellen Integrität erhalten, welcher/s insbesondere frei von inaktiven Faktor X/Xa-Zwischenprodukten ist.
  • Diese Erfindung wird detaillierter auf der Grundlage der folgenden Beispiele und der in den Zeichnungen gezeigten Figuren erklärt werden, ohne jedoch dadurch die Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
  • Beispiele:
  • Beispiel 1:
  • Konstruktion und Expression von rekombinantem Faktor X-Wildtyp (rFX) und Faktor X/FXIa (Q-R/I)-Analogen
  • a: Herstellung des rFX-Expressionsvektors phAct-rFX
  • Die cDNA von FX wurde aus einer humanen Leber-Lambda-cDNA-Bank, wie von Messier et al. (Gene 99 (1991), S. 291–294) beschrieben, isoliert. Mit Hilfe einer PCR unter Verwendung von Oligonukleotid #2911 (5'-ATTACTCGAGAAGCTTACCATGGGGCGCCCACTG-3') (SEQ ID NR. 3) als 5'-Primer und von Oligonukleotid #2912 (5'-ATTACAATTGCTGCAGGGATCCAC-3') (SEQ ID NR. 4) als 3'-Primer wurde ein DNA-Fragment aus einem positiven Klon amplifiziert, wobei das DNA-Fragment die 1,457 kB FX-kodierende Sequenz und 39 bp der 3'-gelegenen nicht translatierten Region, flankiert von einer XhoI-Schnittstelle am 5'-Ende und einer MfeI-Schnittstelle am 3'-Ende enthält. Zusätzlich wurde mit Hilfe von Primer #2911 die Sequenz ACC vor dem ATG von FX inseriert, wodurch sichergestellt wurde, dass sich eine optimale Kozak-Translationsinitiations-Sequenz bildete. Nachfolgend wurde dieses PCR-Fragment als XhoI/MfeI-Fragment in den Expressionsvektor phAct kloniert, welcher mit SalI und EcoRI geschnitten wurde. Der Expressionsvektor phAct umfasst ungefähr 3,3 kb des Promotors, 78 bp von 5'-UTR und das ungefähr 1 kb messende Intron des humanen Beta-Aktin-Gens (Fischer et al., FEBS Lett. 351 (1994), S. 345–348), eine multiple Klonierungsschnittstelle und die SV40-Polyadenylierungsstelle. Das sich ergebende Expressionsplasmid wurde phAct-rFX genannt.
  • b. Herstellung des phAct-rFX/FXIa (Q-R/I)-Expressionsplasmids
  • Um rekombinante FX/FXIa (Q-R/I)-Analoge herzustellen, wurde die Aminosäuresequenz von Position 227 bis 234 (Arg-Gly-Asp-Asn-Asn-Leu-Thr-Arg/Ile), welche dazu dient, FX zu FXa zu aktivieren, durch den intrinsischen Tenase-Komplex FIXa/FVIIIa oder durch den extrinsischen FVIIa/TF-Komplex, durch die Sequenz Gln-Ser-Phe-Asn-Asp-Phe-Thr-Arg/Ile (nachfolgend als (Q-R/I) bezeichnet) ersetzt, welche spezifisch mit Hilfe des Gerinnungsfaktors XIa aktiviert wird (2). Q-R wurde in Übereinstimmung mit der zweiten FXIa-Schnittstelle hergestellt, wie sie im "natürlichen" Substrat FIX vorliegt. Das Expressionsplasmid für dieses rFX-Analog ist vom Plasmid phAct/rFX abgeleitet. Für Klonierungszwecke wurde das HindIII-NaeI-DNA-Fragment aus dem phAct-rFX-Expressionsplasmid, welches die FX-kodierende Region von Position +1 bis +1116 umfasst, in die HindIII-SmaI-Restriktionsschnittstellen des Plasmids pUC19 inseriert. Das sich ergebende Plasmid wurde pUC/FX genannt. Dies machte es möglich, dass die FX-Sequenz von Nukleotid 508 bis 705, welche den Aminosäuren 160 bis 235 entspricht, aus dem pUC/FX-Plasmid über Bsp120I und BstXI-Restriktionsschnitte entfernt und durch ein mutiertes FX-DNA-Fragment ersetzt werden konnte. Das mutierte DNA-Fragment enthält die exogene Spaltstelle von FX für FXIa anstelle der FIXa/FVIIIa- und FVIIa/TF-Stelle, und wird mit Hilfe einer PCR hergestellt. Das Plasmid phAct/rFX dient als ein Modell für die PCR. Um die Gln-Ser-Phe-Asn-Asp-Phe-Thr-Arg/Ile (Q-R/I)-Spaltstelle herzustellen, wird das Oligonukleotid #4211 (5'-GGCAAGGCCTGCATTCCCACA-3') (SEQ ID NR: 5) als 5'-Primer verwendet und das Oligonukleotid #5039 (5'-GCGCTCCCACGATCCTGGTGAAGTCATTAAAGCTTTGCTCAGGCTGCGTCTGGTT-3') (SEQ ID NR. 6) wird als 3'-Primer verwendet. Daher werden die Aminosäuren Arg, Gly, Asp, Asn und Leu an den Positio nen 227, 228, 229, 231 und 232 durch Gln, Ser, Phe, Asp und Phe ersetzt. Das PCR-Produkt wird erneut mit Bsp120I und BstXI geschnitten und in das pUC-FX-Plasmid inseriert, welches mit Bsp120I/BstXI geöffnet wurde. Nachfolgend wird das DNA-Fragment, welches die neue Spaltstelle enthält, erneut über HindIII/Agel in phAct-FX inseriert, welches mit denselben Restriktionsenzymen geschnitten wurde. Das sich ergebende Plasmid wird phAct-FX/FIXa (Q-R/I) genannt.
  • c. Expression von rFX und vom rFX/FXIa (Q-R/I)-Analog in CHO-Zellen
  • Um stabile rFX/FXIa-exprimierende Zelllinien zu etablieren, werden das Expressionsplasmid phAct-rFX und phAct-rFX/FXa (Q-R/I) zusammen mit dem Selektionsmarker pSV-dhfr in dhfr defiziente CHO-Zellen transifiziert (Fischer et al., FEBS Lett. 351 (1994), S. 345–348). Für alle anderen Expressions- und Funktionsanalysen werden die Zellkulturen nach einem vollständigen Medienwechsel mit einem serumfreien Selektionsmedium in der Anwesenheit von 10 μg/ml Vitamin K für 24 h inkubiert. Die Expression von rFX in den sich ergebenden Zellklonen wird auf der Grundlage der Menge von Antigen gezeigt (ELISA, Asserachrom, Boehringer Mannheim), und das rekombinante Protein wird nachfolgend mit einer SDS-PAGE charakterisiert (3). Wie ebenfalls im Western Blot gesehen werden kann, sind sowohl die rFX-Wildtyp-, als auch die rFX/FXIa (Q-R/I)-Moleküle in Form einer leichten Kette (LC, für engl. light chain) von ungefähr 22 kD und einer schweren Kette (HC, für engl. heavy chain) von ungefähr 50 kD anwesend, was den plasmatischen Faktor X-Formen entspricht. Zusätzlich kann eine 75 kD Proteinbande gesehen werden. Das 75 kD Protein entspricht dem einzelkettigen (SC, für engl. single chain) FX-Molekül, dessen Anwesenheit bereits in den Überständen von FX transifizierten CHO-Zellen (Wolf et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), S. 13729–13730) und in humanem Plasma (Fair et al., Blood 64 (1984), S. 194–204) beschrieben wurde.
  • Beispiel 2:
  • In vitro Aktivierung der rFX/FXIa (Q-R/I)-Moleküle mit Hilfe von Faktor XIa
  • Um die Spaltbarkeit der neu inserierten Aktivierungsstellen mit Hilfe von Faktor XIa zu zeigen, werden die Überstände der Zellkultur mit gereinigtem Faktor XIa in der Anwesenheit von 5 mM CaCl2 gemischt. Aliquotmengen der Reaktionschargen werden auf eine Spaltung sowohl vor der Inkubation, als auch nach verschiedenen Inkubationszeiten bei 37°C mit Hilfe der Western Blot-Analyse getestet (4). Die Identifizierung der rFX-Moleküle wird mit Hilfe eines polyklonalen antihumanen FX-Antikörpers durchgeführt. Die verwendete Positivkontrolle ist gereinigter Plasmafaktor IX (Stago), welcher das natürliche Substrat für FXIa darstellt. Um unter einheitlichen Bedingungen zu arbeiten, wird FIX vor der Verwendung in Überständen der Zellkultur von nicht transfizierten CHO-Zellen verdünnt. Die Umwandlung von FIX in die aktivierten Formen (FIXa und FIXb) zeigt, dass FXIa in der Lage ist, seine homologen Schnittstellen in FIX in Überständen der Zellkultur zu spalten. Die Reaktionscharge mit rFX-Wildtyp dient als Negativkontrolle, da dieses Molekül nicht irgendeine FXIa-Spaltstelle enthält und daher nicht spezifisch durch FXIa erkannt und gespalten werden sollte. Wie erwartet, ist verglichen mit rFX in der Abwesenheit von FXIa keine Änderung bei rFX im Proteinmuster nach einer Inkubation mit FXIa sichtbar.
  • Im Gegensatz dazu zeigt die Reaktionscharge von FXIa nach einer Inkubationszeit von 1 h bei 37°C in der Anwesenheit von CaCl2 mit rFX/FXIa (Q-R/I) als Substrat Proteinbanden von ungefähr 36 kD und 32 kD, welche den aktivierten Alpha- und Beta-Formen (aHCa und bHCa) der schweren Kette von FX ähneln. In der Abwesenheit von FXIa sind diese gespaltenen Moleküle nicht anwesend. Die Anwesenheit einer Form, welche ähnlich zu bHCa ist, und welche sich als ein Ergebnis der autokatalytischen Spaltung der C-terminalen Aminosäuren der schweren Kette von aHCa bildet, weist auf die Funktionsfähigkeit der erzeugten aktivierten rFXa-Moleküle hin. Diese Ergebnisse zeigen, dass es durch Ersetzen der natürlich vorkommenden Aktivierungssequenz in FX durch eine Aktivierungs-Spaltstelle für FXIa möglich ist, rFX-Analog-Moleküle zu erzeugen, welche mit FXIa aktiviert werden können, und welche nachfolgend in Moleküle umgewandelt werden können, die FXa ähneln.
  • Das beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um alle anderen Faktor X-Analoge auf die erfindungsgemäßen Eigenschaften zu testen.
  • Beispiel 3:
  • a. Aktivität des rFX/FXIa (Q-R/I)-Analogs, verglichen mit rFX-Wildtyp in FIX defizientem Plasma
  • Um die Funktionsfähigkeit des rFX-Analogs zu testen, wird FIX defizientes Plasma mit dem Überstand der CHO-rFX/FXIa (Q-R/I)-Zellkultur gemischt, und die Gerinnungszeitkaskade wird gemessen, nachdem die intrinsische Gerinnungskaskade aktiviert wurde (Tabelle 1). Für diesen Zweck wurden 50 μl des Überstands, welcher teilweise durch Ultrafiltration konzentriert wurde, 50 μl FIX defizientes Plasma und 50 μl DAPPTIN (Baxter AG) gemischt. Nach einer Inkubationszeit von 4 min bei 37°C wird die Reaktion mit 50 μl 25 mM CaCl2 initiiert, welches zuvor auf 37°C erhitzt wurde. Die Gerinnungszeit wird im Koagulometer gemessen (Amelung, KC10A). Die Aktivität in mU FIX wird unter Verwendung einer Kalibrierungsgeraden bestimmt, welche mit plasmatischem FIX erzeugt wird. Die mit den rFX-Analogen erhaltenen Gerinnungszeiten werden entsprechend als mU FIX-Äquivalente angegeben. Die Überstände der Zellkultur von rFX-Wildtyp exprimierenden CHO-Zellen (CHO-rFX) und die Überstände der Zellkultur von nicht transfizierten CHO-Zellen (CHO neg.) dienen als Kontrolle. Um nicht spezifische Wirkungen auszuschließen und experimentelle Variationen zu berücksichtigen, welche auf den Bedingungen der Zellkultur basieren, wurden 7 bis 10 verschiedene Zellkulturüberstände von Zellen, welche dieselben Wachstumsstadien und ähnliche Expressionsgeschwindigkeiten aufwiesen, für jedes Konstrukt getestet.
  • Die Überstände der Zellkulturen von CHO-rFX und CHO neg. führen zu Koagulationszeiten, welche ähnlich zu jenen des Verdünnungspuffers sind, in welchem die Standards und die Proben verdünnt werden, und werden daher als "< 1,56" mU FIX-Äquivalent angegeben (der kleinste überprüfbare Wert in den Gerinnungstests aufgrund der Kalibrierungsgeraden).
  • Verglichen mit den Gerinnungszeiten, welche mit 200 mU plasmatischem FIX bestimmt wurden, waren die Gerinnungszeiten für die Überstände von CHO-rFX/FXIa (Q-R/I)-Zellen, welche mit Konzentrationen des Analogs in einem Bereich von 4,1 bis 7,7 μg/ml bestimmt wurden, jedoch erheblich kürzer und werden daher als "> 200" mU FIX-Äquivalent angegeben.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass durch Ersetzen der 8 C-terminalen Aminosäuren des FX-Aktivierungspeptids mit den 8 C-terminalen Aminosäuren des Aktivierungspeptids von Faktor IX ein rFX-Analog-Molekül erzeugt wurde, welches nach einer Aktivierung der intrinsischen Gerinnungskaskade zu einer erheblichen Gerinnung von Faktor IX defizientem Plasma führt.
  • b. Bestimmung der funktionellen Aktivität des rFX/FXIa (Q-R/I)-Analogs in FIX und FVIII defizienten Plasmen nach einer Vorbehandlung der Überstände der Zellkultur mit Serinprotease-Inhibitoren.
  • Um in der Lage zu sein, die Möglichkeit auszuschließen, dass die mit den rFX/FXIa (Q-R/I)-Analogen erhaltenen Gerinnungszeiten nicht das Ergebnis der Anwesenheit von Spuren bereits aktivierter rFX-Moleküle in den Überständen der Zellkultur sind, sondern stattdessen das Ergebnis der Umwandlung der rFX-Analoge in rFXa nach der Aktivierung der intrinsischen Koagulationskaskade durch DAPPTIN, werden vor der Verwendung alle Überstände mit einem Serinprotease-Inhibitor (1 mM Pefabloc, Boehringer Mannheim) gemischt, welcher dauerhaft aktivierte Serinproteasen inaktiviert. Überschüssiger Inhibitor, welcher die Gerinnung nach der DAPPTIN-Aktivierung inhibieren würde, wird nachfolgend mit Hilfe einer Dialyse gegen Tris, pH-Wert 7,4, NaCl 50 mM, Tween 0,01% entfernt. Die so behandelten Überstände werden nachfolgend im Gerinnungstest verwendet.
  • Die Serinprotease-Inhibitorkonzentration wurde ausgewählt, um sicherzustellen, dass die FXa-Mengen, welche zu einer Gerinnung führen, die ähnlich zu der der unbehandelten rFX/FXIa (Q-R/I)-Zellkultur-Überstände ist, vollständig inhibiert waren (Tabelle 2). Die Ergebnisse dieser vorläufigen Experimente zeigen, dass eine Inhibitorkonzentration von 1 mM in der Lage ist, FXa-Mengen vollständig zu inaktivieren, welche erheblich kürzere Gerinnungszeiten in FIX defizientem Plasma aufweisen, als jene, welche mit den rFX/FXIa (Q-R/I)-Analogen erhalten wurden (Vergleich mit Tabelle 1).
  • Die Funktionsfähigkeit der so vorbehandelten Überstände wird sowohl in dem FIX-, als auch in dem FVIII-Gerinnungstest gemessen (Tabelle 3). Der FVIII-Gerinnungstest wird in derselben Weise wie der FIX-Gerinnungstest durchgeführt, außer dass anstelle von FIX defizientem Plasma FVIII defizientes Plasma verwendet wird, dass die Inkubation vor der Initiation mit CaCl2 3 min dauert, und dass die Kalibrierungskurve mit plasmatischem FVIII aufgetragen wird.
  • Die Überstände von CHO-rFX-Zellen liegen unter der Nachweisgrenze (1,56 mU), sowohl in FIX, als auch in FVIII defizientem Plasma. Ähnlich führt der CHO neg.-Überstand nicht zu einer kürzeren Gerinnungszeit, selbst wenn dieser Überstand mit 1 mU FXa vor der Behandlung mit dem Inhibitor behandelt wurde. Diese Kontrollen zeigen, dass selbst wenn bereits voraktivierter FX durch den Inhibitor in dem Zellkulturüberstand inaktiviert werden würde ..., und dass die Gerinnung nicht durch möglicherweise vorkommende CHO spezifische Proteasen vermittelt wird.
  • Der vorbehandelte plasmatische FIX (FIX) weist im Vergleich mit FIX, welcher nicht vorbehandelt wurde (FIX ohne Inhibitor und Dialyse) eine niedrigere Gerinnungsaktivität in FIX defizientem Plasma auf, was darauf hinweist, dass entweder ein Anteil der Serinproteasen, selbst in der inaktivierten Form, durch den Inhibitor inhibiert wird oder als Ergebnis des Verfahrens (der Dialyse) verloren geht.
  • Trotz der Vorbehandlung des Inhibitors werden in FIX- und in FVIII-Gerinnungstests keine erheblichen Änderungen in den gemessenen Werten in den CHO-rFX/FXIa (Q-R/I)-Überständen beobachtet, wenn sie mit unbehandelten Überständen verglichen werden. Diese Experimente zeigen, dass nach einer Aktivierung der intrinsischen Gerinnungskaskade rekombinante FX-Analog-Moleküle, welche eine FIX-Aktivierungs-Spaltstelle für FXIa aufweisen, zu einer erheblichen Gerinnung von FIX und FVIII defizienten Plasmen führen. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass diese rekombinanten FX/FXIa (Q-R/I)-Analog-Moleküle Eigenschaften aufweisen, welche darauf hinweisen, dass die Moleküle sich als erfolgreiche Kandidaten für die Herstellung von therapeutischen Zusammensetzungen erweisen können, welche für die Behandlung von Patienten geeignet sein könnten, welche an Hämophilie oder an Hämophilie mit inhibitorischen Antikörpern leiden. Tabelle 1: Funktionelle Aktivität der rFX/FXIa (Q-R/I)-Moleküle in FIX defizientem Plasma.
    Probe Antigen μg/ml mU FIX-Äquivalent Gerinnungszeit in Sekunden
    rFX/FXIa (Q-R/I)
    sup1 6,3 > 200 46,5
    sup2 4,4 > 200 47,7
    sup3 6,6 > 200 46,4
    sup4 4,8 > 200 43,2
    sup5 4,1 > 200 45,2
    sup6 6,4 > 200 43,1
    sup7 6,6 > 200 43,1
    sup8 4,3 > 200 45,2
    sup9 5,7 > 200 39,4
    sup10 7,7 > 200 44,2
    rFXwt
    sup1 2,1 < 1,56 107,8
    sup2 3,1 < 1,56 97,8
    sup3 1,6 3 84,7
    sup4 2,4 < 1,56 90,4
    sup5 3,2 < 1,56 92,4
    sup6 4,4 < 1,56 96,2
    sup7 6,7 < 1,56 92,7
    CHO neg. < 1,56 179,7
    Plasma FIX 1* 50,7
    Plasma FIX 0,5* 54,5
    Plasma FIX 0,125* 65,6
    Plasma FIX 0,0625* 72,2
    Plasma FIX 0,078* 89,1
    Puffer 0 109,7
  • Es wurden 200, 100, 25, 12,5 und 1,56 mU plasmatischer FIX verwendet. Um diese Werte in μg/ml umzuwandeln, wurde angenommen, dass 1 Einheit FIX ungefähr 5 μg FIX/ml entspricht. Tabelle 2. Bestimmung der Inaktivierung von FXa mit Hilfe einer vorläufigen Behandlung mit Pefabloc und nachfolgenden Dialyse im FIX-Gerinnungstest
    Probe verwendete mU Gerinungszeit in mU FIX-Äquivalent
    Sekunden
    FXa 5 19,9 > 200
    FXa 1 32,5 > 200
    FXa 0,5 45 > 200
    FXa 0,1 76,1 10
    FXa + Inh. 5 93,4 1,94
    FXa + Inh. 1 115,9 < 1,56
    FXa + Inh. 0,5 113,5 < 1,56
    FXa + Inh. 0,1 115,3 < 1,56
    Plasma 200 52,9
    Plasma 1,56 95,7
    Puffer 114,7
    Tabelle 3: Funktionelle Aktivität von CHO-rFX/FXIa (Q-R/I)-Überständen einer Zellkultur nach einer vorläufigen Behandlung mit Pefabloc und einer Dialyse in FIX und FVIII defizienten Gerinnungstests.
    Probe Antigen μg/ml mU FIX-Äquivalent mU FVIII-Äquivalent
    rFX/FXIa (Q-R/I)
    sup1 6,3 > 200 > 200
    sup2 4,4 100 > 200
    sup3 6,6 > 200 > 200
    sup4 4,8 167 > 200
    sup5 4,1 > 200 > 200
    sup6 6,4 > 200 > 200
    sup7 6,6 > 200 > 200
    sup8 4,3 > 200 > 200
    sup9 5,7 > 200 > 200
    sup10 7,7 > 200 > 200
    rFXwt
    sup1 2,1 < 1,56 < 1,56
    sup2 3,1 < 1,56 < 1,56
    sup3 1,6 < 1,56 < 1,56
    sup4 2,4 < 1,56 < 1,56
    sup5 3,2 < 1,56 < 1,56
    sup6 4,4 < 1,56 < 1,56
    sup7 6,7 < 1,56 < 1,56
    CHO neg. < 1,56 < 1,56
    CHO neg. + FXa < 1,56 < 1,56
    Plasma FIX 25 mU 25
    (-Inh. -Dial.)*
    Plasma FIX 25 mU 4
    Plasma FVIII 50 mU 48
    (-Inh. -Dial.)*
    Plasma FVIII 3,125 mU 3
    (-Inh. -Dial.)*
  • Diese Proben wurden in den Tests verwendet, ohne behandelt zu werden (ohne das Hinzufügen von Serinprotease-Inhibitor und Dialyse).
  • Beispiel 4:
  • Aktivität der gereinigten rFX/FXIa (Q-R/I)-Moleküle in vitro und in vivo
  • rFX/FXIa (Q-R/I)-Moleküle wurden aus Zellkulturüberständen stabiler CHO-rFX/rXIa (Q-R/I)-Zellklone (wie in Beispiel 1.c beschrieben etabliert) durch eine Anionenaustausch-Chromatographie gereinigt. Aufgrund der Anwesenheit von teilweise proteolytisch unvollständig gereiften Vorläufer-rFX-Molekülen im Überstand der rekombinanten Zelllinien, welche für die Reinigung verwendet wurden (5, Spur 8), wurde der Überstand zuerst für 4 Stunden bei 37°C mit konditioniertem Medium aus CHO-Zellklonen, welche eine sezernierte Form der Endoprotease Furin exprimieren, präinkubiert. Furin ist eine Serinprotease, welche die Umwandlung der FX-Einzelkette zu der schweren/leichten Kette, sowie die Propeptidentfernung in vitro durchführt. Durch diese Behandlung wird das Prozessieren von unreifen FX-Molekülen in vitro abgeschlossen (5, Spur 2 im Vergleich zu 8), wobei die gemeinsame Aufreinigung von inaktiven unreifen FX-Molekülen verhindert wird. Nach dem Hinzufügen von 10 mM EDTA, 0,1% Tween 80, 0,1 mM Pefabloc und dem Einstellen des pH-Werts auf 7,4 wurde der Über stand auf eine Fractogel EMD TMAE 650 (M) Säule, welche mit Puffer A äquilibriert war (20 mM Tris, 120 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% Tween 80, pH-Wert 7,4) geladen. Diese Säule wurde mit 20 mM Tris, 180 mM NaCl, 0,1% Tween 80, pH-Wert 7,4 gewaschen. Die rFX-Moleküle wurden mit Puffer C (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0,1% Tween, pH-Wert 7,4) eluiert. Die Western Blot-Analyse der verschiedenen Reinigungsfraktionen (5) zeigt, dass fast alle rFX/FXI (Q-R/I)-Moleküle der Elutionsfraktion in Form der reifen Doppelkette anwesend sind (HC, LC, Spur 6), ähnlich zu gereinigtem Plasma-FX (Spur 7). Um möglicherweise vorhandene restliche Mengen rFXa zu inhibieren, welche sich während der Zellkultur oder dem Aufreinigungsverfahren gebildet haben könnten, wurde die Elutionsfraktion nachfolgend mit 10 μM ERGck (Hematological Technologic Inc.) behandelt, einem spezifischen FXa-Inhibitor. Ein Überschuss dieses Inhibitors wurde durch den nachfolgenden Diafiltrationsschritt mit 10 mM Tris, 8 g/l NaCl, 4 g/l NaCitrat, 0,01% Tween 80, pH-Wert 7, entfernt. Die Zusammensetzung wurde bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Dasselbe Reinigungsverfahren wurde für die Zusammensetzung von rFX-Wildtyp verwendet, welcher als Kontrolle in den folgenden Experimenten eingesetzt wurde.
  • a. Bestimmung der funktionellen Aktivität von gereinigtem rFX/FXIa (Q/R-I) in humanem und Maus-fVIII und fIX defizientem Plasma
  • Um die funktionelle Aktivität der gereinigten rFX/FXIa (Q-R/I)-Moleküle zu bestätigen, wurde die aPTT (aktivierte partielle Thromboplastinzeit) in fVIII und fIX defizientem Plasma mit menschlichem und Mausursprung in der Anwesenheit der rFX-Moleküle gemessen. 100 μl defizientes Plasma (immunabgereichertes humanes Plasma, Baxter AG, Plasma aus fVIII- oder fIX-Knockout-Mäusen) wurden mit 50 μl einer 10 μg/ml gereinigten FX-Molekül-Zusammensetzung (siehe oben), 150 μl DAPPTIN (Baxter AG) gemischt und für 3 min bei 37°C inkubiert. Die Gerinnungsreaktion wurde durch 150 μl 25 mM CaCl2 initiiert. Die Gerinnungszeit wurde wie in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt. Der prozentuale Anteil der Aktivität wurde unter Verwendung einer Standardkurve Log (% Aktivität) gegenüber Log (Gerinnungszeit) bestimmt. Für die Standardkurve wurden 100 μl 100%, 80%, 50%, 25 % oder 12,5% humanes oder Maus-Referenzplasma mit 50 μl des FX-Puffers und 150 μl DAPPTIN gemischt und für 3 min bei 37°C inkubiert. Die Initiation der Gerinnung und die Bestimmung der Gerinnungszeit wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Referenzplasmen bestehen aus normalem humanen Plasma (Baxter AG) oder einem Plasmapool von normalen Mäusen, welche in verschiedenen Verhältnissen mit den entsprechenden fVIII oder fIX defizienten Plasmen gemischt sind. Die Gerinnungszeit, sowie der prozentuale Anteil der Aktivität, verglichen mit normalem Plasma, sind in Tabelle 4 angegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass eine erhebliche Reduktion der Gerinnungszeit durch gereinigten rFX/FXIa (Q-R/I) in allen getesteten defizienten Plasmen, entweder mit humanem oder Mausursprung, vermittelt wird. Eine Normalisierung der aPTT wird sogar in humanem und Maus-fIX defizientem Plasma und in Maus-fVIII defizientem Plasma beobachtet. Im Gegensatz zu dem rFX-Analog, vermitteln rFX-wt-Moleküle bei den entsprechenden Konzentrationen keine erhebliche Reduktion der Gerinnungszeit in diesen Plasmen. Weiterhin weist die Normalisierung der aPTT in defizientem Mäuseplasma darauf hin, dass die rFX/FXIa (Q-R/I)-Moleküle in der Lage sind, mit den entsprechenden Mäuse-Gerinnungsproteinen zu interagieren, welche die Aktivität der fVIII- und fIX-Umgehung vermitteln, die in vitro in humanem Plasma beobachtet wurde, eine Voraussetzung für das Testen dieser Moleküle in vivo in einem Maus-Tiermodell.
  • b. Funktionelle Aktivität der rFX/FXIa (Q-R/I)-Variante in vivo
  • Die Funktionsfähigkeit von rFX/FXIa (Q-R/I) als ein Molekül, welches eine Aktivität der fVIII-Umgehung aufweist, wurde in vivo durch Verwenden von fVIII-Knockout-Mäusen getestet (Tabelle 5). Die Validität der fVIII-Knockout-Mäuse als ein Tiermodellsystem zum Testen der Aktivität der fVIII-Umgehung wurde unter Verwendung der kommerziell verfügbaren, von Plasma abgeleiteten FEIBA-Zusammensetzung (Baxter AG) kontrolliert. Als eine Negativkontrolle wurde eine Zusammensetzung von gereinigtem rFX-wt verwendet. Um die Wirkung von rFX/FXIa (Q-R/I) und rFX-wt zu vergleichen, wurde die Einheitendefinition für die Dosis, welche zu verabreichen ist, auf der im PT (Prothrombinzeit)-Assay be stimmten FX-Aktivität basiert. Für den PT-Assay wurden 100 μl FX-Molekül-Zusammensetzung und 100 μl FX defizientes Plasma (Baxter AG) für 2 min bei 37°C inkubiert. Die Gerinnung wurde mit 100 μl eines Calcium/Thromboplastin-Gemisches (Baxter AG) initiiert. Die Gerinnungszeit wurde wie in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt. Die FX-Aktivität in Einheiten wurde unter Verwendung einer Standardkurve bestimmt, welche mit einem FX-Referenzstandard (Baxter AG) etabliert wurde. Die Zusammensetzungen wurden intravenös unter Anästhesie mit einer injizierten Dosis in U/kg (Tabelle 5) verabreicht. 30 min nach der Injektion wurde die Blutung durch Abschneiden des Schwanzes in einem Abstand von 1 cm vom Ende induziert. Die Überlebensrate der Tiere nach 48 Stunden dient als Parameter für die Funktionsfähigkeit. Die beobachtete erhebliche Reduktion der Mortalität für die mit FEIBA behandelten Tiere zeigt, dass fVIII-Knockout-Mäuse ein geeignetes Modellsystem darstellen. Keines der mit 300 U rFX-wt/kg behandelten Tiere überlebte, ein Ergebnis, welches aus den in vitro-Ergebnissen zu erwarten war. Die Verabreichung von rFX/FXIa (Q-R/I) mit 300 U/kg führte jedoch zu einer erheblichen Verbesserung der Überlebensrate (60%). Dieses Ergebnis zeigte, dass die rFX-Analogmoleküle eine erhebliche Aktivität zur fVIII-Umgebung in vivo bei der verwendeten Dosierung aufweisen. Tabelle 5: Bestimmung der Überlebensrate von fVIII-Knockout-Mäusen, welche mit der rFX/FXIa (Q-R/I)-Variante und rFX-wt behandelt wurden
    FEIBA 300 U/kg FEIBA 150 U/kg rFX/FXI (Q-R/I) 300 U/kg rFX-wt 300 U/kg
    Überleben 3/3 1/2 6/10 0/3
    % Überleben 100 50 60 0
  • Folglich zeigen die funktionellen Eigenschaften des rFX/FXIa (Q-R/I)-Moleküls, welche in diesen Experimenten beschrieben wurden, dass es einen Hauptkandidaten für die Entwicklung eines alternativen therapeutischen Mittels für die Behandlung von Blutern darstellt, welche inhibitorische Antikörper entwickelt haben.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001

Claims (35)

  1. Faktor X-Analog, welches eine Modifikation zwischen Glu226 und Ile235, bezogen auf die Numerierung der Aminosäuren nach 1, enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Faktor X-Sequenz mit Glu226-R8-R7-R6-R5-R4-R3-R2-Arg234-R1 enthält, wobei a) R1 He ist, b) R2 Thr ist, c) R3 Phe ist, d) R4 Asp ist, e) R5 Asn ist, f) R6 Phe ist, g) R7 Ser ist, und h) R8 Gln ist.
  2. Faktor X-Analog nach Anspruch 1, wobei die Modifikation eine Prozessierungsstelle für Faktor XIa oder ein Derivat davon bildet.
  3. Faktor X-Analog nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine zusätzliche Modifikation im Bereich der C-terminalen Faktor X-Aminosäuresequenz aufweist.
  4. Faktor X-Analog nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Modifikation in der C-terminalen Region der β-Peptid-Spaltstelle aufweist.
  5. Faktor X-Analog nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Modifikation eine in vivo Aktivierung des Faktor X-Analogs in nativen Faktor Xa oder in ein Faktor Xa-Analog erlaubt.
  6. Faktor X-Analog nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Modifikation eine in vitro Aktivierung des Faktor X-Analogs in nativen Faktor Xa oder ein Faktor Xa Analog erlaubt.
  7. Faktor X-Analog nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Analog ein intaktes β-Peptid enthält.
  8. Faktor X-Analog nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Form eines doppelkettigen Moleküls.
  9. Faktor X-Analog nach einem der Ansprüche 1 bis 8, welches einen verkürzten C-terminalen Bereich aufweist.
  10. Rekombinante DNA, welche ein Faktor X-Analog nach einem der Ansprüche 1 bis 9 kodiert, enthalten in einem Vektor für die rekombinante Expression des kodierten Proteins.
  11. Zusammensetzung, enthaltend ein gereinigtes Faktor X-Analog oder ein Vorläuferprotein davon, wobei das Faktor X-Analog eine wie in Anspruch 1 oder 2 definierte Modifikation zwischen Glu226 und Ile235 enthält.
  12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Faktor X-Analog in der Form von FXα vorliegt.
  13. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das Faktor X-Analog eine verkürzte C-terminale Aminosäuresequenz aufweist.
  14. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Faktor X-Analog als ein doppelkettiges Molekül enthält.
  15. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein einzelkettiges Faktor X-Analog in einer enzymatisch inaktiven Form mit einer Reinheit von einem Minimum von 80% enthält, und, daß sie keine inaktiven proteolytischen Zwischenprodukte des Faktor X/Xa-Analogs enthält.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Faktor X-Analog als ein einzelkettiges Molekül enthält.
  17. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Faktor X-Analog enthält, welches eine Modifikation aufweist, die eine in vivo Aktivierung des Faktor X-Analogs in nativen Faktor Xa oder in ein Faktor Xa-Analog erlaubt.
  18. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Faktor X-Analog enthält, welches eine Modifikation aufweist, die eine in vitro Aktivierung des Faktor X-Analogs in nativen Faktor Xa oder in ein Faktor Xa-Analog erlaubt.
  19. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert ist.
  20. Zusammensetzung, enthaltend ein aktiviertes Faktor X-Analog, welches durch die Aktivierung eines Faktor X-Analogs nach einem der Ansprüche 1 bis 9 erhältlich ist, wobei das aktivierte Faktor X-Analog eine hohe Stabilität und strukturelle Integrität aufweist, wobei die Zusammensetzung frei von inaktiven Faktor X/Xa-Analog-Zwischenprodukten und autoproteolytischen Faktor X-Abbauprodukten ist.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine physiologisch verträgliche Matrix enthält und in einer Form vorliegt, welche lagerstabil ist.
  22. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Blutfaktor oder eine aktivierte Form eines Blutfaktors als eine zusätzliche Komponente enthält.
  23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Minimum von mindestens einer Komponente mit einer Aktivität zur Umgehung der Faktor VIII-Inhibition als eine zusätzliche Komponente enthält.
  24. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie als ein pharmazeutisches Präparat formuliert ist und als eine Mehrkomponentenzusammensetzung vorliegt.
  25. Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 11, um ein Arzneimittel herzustellen.
  26. Verwendung der rekombinanten DNA nach Anspruch 10, um ein Arzneimittel herzustellen.
  27. Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Faktor X-Analog, welches durch Mittel der rekombinanten Herstellung erhalten wurde, durch Mittel eines chromatographischen Verfahrens isoliert und gereinigt wird.
  28. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung eines Faktor X-Analogs, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Herstellen einer rekombinanten DNA, welche das Faktor X-Analog nach einem der Ansprüche 1 bis 9 kodiert, enthaltend in einem Vektor für die rekombinante Expression des kodierten Proteins, Transformation einer geeigneten Zelle, Expression des Faktor X-Analogs, Isolierung des Faktor X-Analogs und Reinigung des Faktor X-Analogs mittels eines chromatographischen Verfahrens.
  29. Verfahren, wie in Anspruch 28 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Expression des Faktor X-Analogs es durch Faktor XIa oder einem Derivat davon aktiviert wird.
  30. Verfahren, wie in Anspruch 27 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß das Faktor X-Analog in Form eines doppelkettigen Moleküls isoliert wird.
  31. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das doppelkettige Faktor X-Analog mit Faktor XIa oder einem Derivat davon gespalten wird.
  32. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Faktor X-Analog in Form eines einzelkettigen Moleküls isoliert wird.
  33. Verfahren, wie in Anspruch 31 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß ein einzelkettiges Faktor X-Analog mit Furin oder einem Derivat davon prozessiert wird und daß dies weiter die Aktivierung mit Faktor XIa oder einem Derivat davon in Faktor Xa oder ein Faktor Xa-Analog erlaubt.
  34. Verfahren zur Herstellung eines Zusammensetzung, welche aktivierten Faktor Xa oder ein Faktor Xa-Analog enthält, gekennzeichnet durch die Tatsache, daß ein Faktor X-Analog, welches unter Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 27 hergestellt wurde, einem Aktivierungsschritt unterworfen wird.
  35. Verfahren, wie in Anspruch 27 beansprucht, gekennzeichnet durch die Tatsache, daß ein gereinigtes Faktor Xa-Analog mit einer hohen Stabilität und strukturellen Integrität, welches frei von inaktiven Faktor X/Xa-Zwischenprodukten ist, erhalten wird.
DE60038312T 1999-08-10 2000-08-07 Faktor x-analog mit einer verbesserten fähigkeit, aktiviert zu werden Expired - Lifetime DE60038312T2 (de)

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