BRPI0618654B1 - Variante de fator xa, composição farmacêutica que a contém, bem como uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

variante de zimogênio/protease de fator x/fator xa, ácido nucléico, composição farmacêutica que os contém, vetor, bem como uso dos mesmos. a presente invenção refere-se a variante de fator xa e métodos de uso das mesmas.

Description

[0001] Este pedido de patente reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) para o Pedido Provisório US N° 60/736.680 depositado em 15 de novembro de 2005, os conteúdos inteiros sendo aqui incorporados por referência como se expostos por completo.

[0002] De acordo com 35 U.S.C. §202(c), é reconhecido que o Governo dos Estados Unidos tem certos direitos na invenção descrita aqui, que foi feita em parte com fundos dos National Institutes of Health, Números de Concessão P01 BL-74124-01.

Campo da Invenção

[0003] A presente invenção refere-se aos campos de medicina e hematologia. Mais especificamente, a invenção fornece novos agentes de Fator de X/Xa de coagulação e métodos de usar os mesmos para modular a cascata de coagulação em pacientes em necessidade dos mesmos.

Antecedentes da Invenção

[0004] Várias publicações e documentos de patente são citados ao longo do relatório descritivo para descrever o estado da técnica ao qual essa invenção pertence. Cada uma destas citações é incorporada aqui por referência como se expostas por completo.

[0005] As enzimas de coagulação são enzimas semelhantes à tripsina que pertencem à família de proteases S1 peptidase que carregam um dobramento semelhante à quimiotripsina. As proteases de coagulação contêm domínios catalíticos que são altamente homólogos uns aos outros e às serina proteases ancestrais de digestão. A homologia/identidade estrutural é tão grande (> 70 %) que os resíduos nos domínios catalíticos das enzimas de coagulação são numerados de acordo com os resíduos correspondentes em quimiotripsinogênio.

[0006] As enzimas de coagulação circulam no sangue como precursores inativos, zimogênios, que requerem clivagem proteolítica para ativação. Os zimogênios possuem ~10.000 vezes ou menos atividade proteolítica quando comparados às serina proteases produzidas seguindo ativação. O início da coagulação no sítio do dano vascular leva a uma série de reações em que um zimogênio é convertido em uma protease através de clivagem proteolítica específica e forma a enzima para a reação sucessiva. Isto culmina na ativação das células sanguíneas e na conversão do fibrinogênio solúvel em fibrina insolúvel e consequentemente a formação do coágulo. Proteases em excesso são removidas através de reação com inibidores de protease circulantes que atuam como substratos "suicidas" ou aqueles que reconhecem as enzimas ativas. Desse modo, ativação proteolítica dos zimogênios de coagulação é uma característica reguladora fundamental da cascata de coagulação.

[0007] Embora alguns dos zimogênios de coagulação sejam clivados em dois ou mais sítios em suas respectivas reações de ativação, a formação da protease requer clivagem em um sítio só. Clivagem neste sítio e suas consequências estruturais são consideradas no modo mais fácil usando o sistema de numeração homólogo com base em quimiotripsinogênio e o trabalho estrutural extensivo feito com tripsinogênio e tripsina. A conversão do zimogênio para serina protease requer clivagem seguindo Arg15(tipicamente a ligação entre Arg15e Ile16) que tipicamente remove um peptídeo de ativação e expõe um novo término N no domínio catalítico começando com Ile16. Um exemplo é a conversão do fator X para Fator Xa (vide figuras 1 e 2). Em tripsina e Fator Xa, a sequência N-terminal nova começa com Ile16-Val17-Gly18-Gly19. Para outras enzimas de coagulação, a sequência N-terminal nova é uma variação no mesmo tema. A sequência N-terminal depois dobra-se de volta no domínio catalítico e insere-se na ligação N-terminal clivada de uma maneira sequência-específica que é referida como "sexualidade molecular". Vide Figura 2. Consequentemente, variantes com sequências N-terminais alternadas não são prováveis de sofrer sexualidade molecular de um modo comparável. Inserção N-terminal leva à formação de uma ponte de sal entre o grupo de α-NH2 de Ile16e Asp194no interior do domínio catalítico. Formação da ponte de sal está associada a numerosas alterações na estrutura do domínio catalítico incluindo: rearranjo dos assim chamados domínios de ativação, mostrados na Figura 3; formação do orifício de oxiânion requerido para catálise e a formação de um sítio de ligação de substrato. Estas alterações levam à maturação da serina protease ativa. A contribuição fundamental das interações sequência-específicas do novo término N através de sexualidade molecular e formação da ponte de sal para a maturação da protease ativa é evidente dos fatos a seguir: proteases bacterianas que não requerem clivagem para ativação utilizam outra cadeia lateral dentro do domínio catalítico para a ponte de sal com Asp194; tripsinogênio pode ser ativado para uma conformação semelhante à proteinase sem clivagem mas com concentrações extremamente altas de um dipeptídeo de Val-Ile que se insere na fenda, embora muito ineficientemente; o dipeptídeo de Val-Ile e outras variantes são bem menos eficazes; adicionalmente, há dois exemplos de proteínas bacterianas que ativam zimogênios de coagulação na ausência de clivagem subvertendo o mecanismo de ativação por meio de provisão de seu próprio término N que se insere na fenda da ligação N-terminal.

[0008] As alterações estruturais esboçadas acima proveem uma explanação molecular para a conversão de um zimogênio de precursor para uma serina protease ativa. Porém, diferente de tripsina que é completamente ativa seguindo clivagem em Arg15, muitas das enzimas de coagulação atuam muito fracamente em seus substratos de proteína. Embora elas em geral possuam sítios ativos completamente funcionais e possam clivar substratos de peptidila pequenos, clivagem eficiente do substrato biológico frequentemente requer uma proteína de co-fator (Figura 2). Nestes casos, as proteínas de co-fator aumentam a taxa de clivagem do substrato de proteína através de vários mil dobramentos. Embora o mecanismo pelo qual as proteínas de co-fator funcionam permaneça a ser solucionado, elas são improváveis de funcionar tornando a protease mais semelhante à enzima e, portanto, mais eficiente. Um ponto chave é que, com uma exceção, os co-fatores seletivamente ligam-se à protease e não ao zimogênio correspondente. Por exemplo, Fator Xa liga com afinidade alta a FVa ligado à membrana, enquanto que o zimogênio de fator X não liga a FVa.

[0009] Dependendo do estado do paciente pode ser desejável desenvolver proteínas de cascata de coagulação alteradas que possuem função de coagulação intensificada ou reduzida. É um objetivo da invenção prover tais proteínas para o uso como terapêuticas.

Sumário da Invenção

[00010] De acordo com a presente invenção, composições e métodos são providos para influenciar sítios reguladores na via de transição de zimogênio para ^ protease de ZX assim dirigindo a produção de uma espécie de FXa mais "semelhante a zimogênio". As composições e métodos da invenção são eficazes para modular homeostase em pacientes em necessidade dos mesmos.

[00011] Em uma modalidade, uma variante de zimogênio/protease de Fator X/Xa que modula homeostase é fornecida. Preferivelmente, a variante de zimogênio protease é codificada pela SEQ ID NO: 2, em que os nucleotídeos 1684-1695 da SEQ ID NO: 2 podem ser qualquer aminoácido, com a condição que os nucleotídeos 1684-1686 não codifiquem Val ou Ala. Mais preferivelmente, a variante de zimogênio/protease contém pelo menos uma modificação na SEQ ID NO: 1 selecionada do grupo que consiste em a) Ile na posição 16 é Leu, Phe, Asp ou Gly; b) Val na posição 17 é Leu, Ala, ou Gly e c) Asp na posição 194 é Asn ou Glu. Ácidos nucléicos que codificam a variante de zimogênio/proteases da invenção são também revelados como também os métodos de uso dos mesmos. Tais nucleotídeos podem opcionalmente codificar um sítio de clivagem intracelular de PACE/furina.

[00012] Em ainda outra modalidade, um ácido nucléico tendo a sequência da SEQ ID NO: 2, em que os nucleotídeos nas posições 1684-1695 codificam os aminoácidos selecionados do grupo que consiste em Leu-Val-Gly, Gly-Val-Gly, Ile-Ala-Gly, Phe-Val-Gly e Ile-Gly- Gly, o dito ácido nucléico opcionalmente compreendendo nucleotídeos nas posições 2233-2235 que codifica um aminoácido selecionado do grupo que consiste em Asn ou Glu.

[00013] Uma composição farmacêutica compreendendo a variante de Fator Xa da invenção em um veículo biologicamente compatível é também fornecida. Outro aspecto preferido da invenção inclui métodos para o tratamento de um distúrbio relacionado à homeostase em um paciente em necessidade dos mesmos compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da variante de zimogênio/protease de Fator X/Xa contendo as composições farmacêuticas descritas aqui. Tais métodos deveriam ter eficácia no tratamento de distúrbios onde um pró-coagulante é necessário e inclui, sem limitação, hemofilia A e B, hemofilia A e B associada a anticorpos inibidores, deficiência de fator de coagulação, deficiência de vitamina K- epóxido redutase C1, deficiência de gama-carboxilase, hemorragia associada a trauma, lesão; trombose, trombocitopenia, acidente vascular cerebral, coagulopatia, coagulação intravascular disseminada (DIC); distúrbios de tratamento de sobre-coagulação, síndrome de Bernard Soulier, tromblastemia de Glanzman, e deficiência de fundo geral de armazenamento.

[00014] Certas variantes de zimogênio/protease podem ser úteis no tratamento de distúrbios onde anti coagulação é desejada. Tais distúrbios incluem, sem limitação, trombose, trombocitopenia, acidente vascular cerebral, e coagulopatia.

[00015] Outro aspecto da invenção inclui células hospedeiras que expressam a variante de zimogênio/proteases da invenção para produzir quantidades grandes da mesma. Métodos para isolar e purificar as variantes de zimogênio protease são também revelados.

Breve Descrição dos Desenhos

[00016] Figura 1. Processamento de Fator X. Fator X é sintetizado com uma sequência sinal e propeptídeo que são removidos antes de sua secreção. Fator X é um zimogênio e não tem nenhuma atividade enzimática. FX é convertido em Fator Xa seguindo clivagem na ligação de Arg15-Ile16 que libera um peptídeo de ativação (AP).

[00017] Figura 2. Zimogênio para conversão de protease. O zimogênio para transição de protease para Fator X e ajuntamento do Fator Xa em protrombinase (FXa, FVa, fosfolipídeo e íons de cálcio). Esta enzima converte protrombina (II) para trombina (IIa).

[00018] Figura 3. A estrutura de Raio X de FXa. O domínio catalítico de FXa na orientação padrão. Regiões estruturais são observadas juntamente com resíduos importantes. Tirado de Brandstetter et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:29988-29992.

[00019] Figura 4. Análise de SDS-PAGE de variantes de FX/Xa. 4-12 % de géis de SDS-PAGE foram operados sob condições não-redutoras ou redutoras e depois tingidos com Coomassie Blue.

[00020] Figura 5. Sequências de aminoácido (SEQ ID NO: 1) e ácido nucléico (SEQ ID NO: 2) de Fator Xa. Os sítios e posições dos aminoácidos para modificações desejadas na SEQ ID NO: 1 são mostrados em negrito.

[00021] Figura 6. Atividade de Fator Xa em plasma de hemofilia B. FXa do tipo selvagem ou FXaI16L (2 nM) foram adicionados ao plasma de hemofilia B e em intervalos de tempo selecionados as amostras foram diluídas (0,1 nM) e ensaiadas em um ensaio de coagulação de aPTT.

[00022] Figura 7. Correção do aPTT. Fator Xa-I16L (200 μg/kg; n = 7 camundongos) ou PBS (n = 4 camundongos) foi injetado em camundongos com hemofilia B (C57BL/6) por meio da veia da cauda. Em 5 e 30 min pós-injeção, o sangue foi colhido e um ensaio de aPTT foi executado. A linha pontilhada vermelha representa o valor de aPTT dos animais de C57B1/6 normais.

[00023] Figura 8. Avaliação hemostática seguindo ensaio de grampo na cauda em camundongos com hemofilia B. Perda de sangue é medida pelo teor de hemoglobina da solução salina através de A525 pós-lesão. O número de camundongos (Balb c) é: do tipo selvagem (n = 7); HB- PBS (n = 6); e HB-FXaI16L (n = 7).

Descrição Detalhada da Invenção

[00024] Proteólise é um aspecto essencial de coagulação do sangue e dá suporte a muitos dos mecanismos que regulam homeostase normal. Pró-cofatores e zimogênios não podem participar em qualquer grau significativo em seus respectivos complexos enzimáticos macromoleculares. Isto indica que a ativação proteolítica tem que resultar em alterações estruturais apropriadas que levam à expressão dos sítios que dão capacidades de ligação da enzima, substrato e co- fator. Embora ativação de pró-cofator e de zimogênio tenha sido intensivamente estudada, a relação entre proteólise e a expressão de sítios de ligação que transmitem a função é incompletamente entendida. A presente invenção fornece composições e sistemas modelos que elucidam os mecanismos moleculares que estão por de trás da expressão das interações de ligações macromoleculares que acompanham as transições do estado de zimogênio.

[00025] Fator X (FX)1é uma glicoproteína de duas cadeias dependentes de vitamina k que desempenha um papel central na coagulação do sangue (Figura 1). Este zimogênio de serina protease é um substrato para os complexos de enzima de tenase extrínsecos (fator de tecido/FVIIa) e intrínsecos (FVIIIa/FIXa) que cliva a ligação de Arg15- Ile16fendível em FX resgatando um peptídeo de ativação de 52 aminoácidos gerando FXa. Fator Xa é a protease responsável pela conversão de protrombina em trombina (Figura 2). Embora o Fator Xa seja uma protease completamente competente e possua a maquinaria catalítica para a clivagem de protrombina, é um catalisador profundamente fraco para esta reação. Sua interação de ligação firme com o co-fator, fator Va, em uma superfície de membrana profundamente aumenta a taxa de formação de trombina sem substancialmente afetar as outras reações catalisadas por Fator Xa. Alterações para a sequência N-terminal (Ile-Val-Gly) seguindo o sítio de clivagem de Arg15 que leva à sexualidade molecular subótima são esperadas render um derivado "semelhante a zimogênio"de Xa que tem atividade proteolítica prejudicada, ou até mesmo nada. Estes derivados não são esperados ser suscetíveis à inibição através de inibidores de protease do plasma tais como Antitrombina III e não são esperados interferir com a iniciação de coagulação seguindo dano vascular porque eles não são esperados ligar a TFPI muito bem. Fator Xa liga ao fator Va firmemente enquanto o fator de zimogênio X não. Desse modo, formas de Fator Xa semelhantes a zimogênio são esperadas ligar a Va mais fracamente mas serem completamente resgatadas em concentrações de co-fator suficientemente altas e eficientemente catalisam a formação de trombina. Formas semelhantes a zimogênio de Fator Xa com estas propriedades são esperadas atuar como proteases duradouras na circulação que estão do contrário mortas mas retêm a habilidade para catalisar a formação de trombina ao ligar ao fator Va. Elas têm o potencial para servir como pró-coagulantes terapêuticos que evita as deficiências em outros fatores de coagulação na cascata, sem os efeitos deletérios associados à infusão do FXa do tipo selvagem completamente funcional.

I. Definições:

[00026] Vários termos relativos às moléculas biológicas da presente invenção são usados mais acima e também ao longo do relatório descritivo e reivindicações.

[00027] A frase "variante de zimogênio/protease"refere-se a um zimogênio de FX ou protease de FXa modificados que foram alterados geneticamente de modo que sua atividade de protease quando convertida em FXa é reduzida ou "semelhante a zimogênio"na ausência de co-fatores específicos (por exemplo, a afinidade de ligação ao sítio ativo é inferior que à observada na molécula do tipo selvagem. Notavelmente, esta afinidade/atividade é restabelecida na presença dos co-fatores apropriados que incluem, sem limitação, fator Va. Sítios preferidos para alterações de aminoácido na molécula FX de origem incluem substituição da isoleucina na posição 16, substituição da valina na posição 17 e substituição do ácido aspártico na posição 194, com a condição que o aminoácido na posição 16 não seja valina ou alanina.

[00028] A frase "distúrbio relacionado à homeostase" refere-se aos distúrbios de hemorragia tais como hemofilia A e B, pacientes com hemofilia A e B com anticorpos inibidores, deficiências em Fatores de coagulação, VII, IX e X, XI, V, XII, II, fator de von Willebrand, deficiência de FV/FVIII combinados, deficiência de vitamina K-epóxido redutase C1, deficiência de gama-carboxilase; hemorragia associada a trauma, lesão, trombose, trombocitopenia, acidente vascular cerebral, coagulopatia, coagulação intravascular disseminada (DIC); super- anticoagulação associada à heparina, heparina de peso molecular baixo, pentassacarídeo, warfarina, antitrombóticos de molécula pequena (isto é, inibidores de FXa); e distúrbios de plaquetas tais como, síndrome de Bernard Soulier, tromblastemia de Glanzman, e deficiência de fundo geral de armazenamento. Um distúrbio relacionado à homeostase pode também incluir hemorragia relacionada a distúrbios trombóticos tais como trombose venosa profunda, trombose associada a estados ou malignidades de doença cardiovascular, trombose resultante de permanência interna ou outros procedimentos cirúrgicos invasivos e trombose associada a doenças autoimunes tais como lúpus. As variantes de zimogênio/protease poderiam também prover homeostase necessária para pacientes com coagulação intravascular disseminada ou coagulopatias consumptivas surgindo de uma variedade de estados de doença.

[00029] Com referência aos ácidos nucléicos da invenção, o termo "ácido nucléico isolado"às vezes é usado. Este termo, quando aplicado a DNA, refere-se a uma molécula de DNA que está separada das sequências com as quais é imediatamente contígua (nas direções 5' e 3') no genoma de ocorrência natural do organismo do qual origina. Por exemplo, "ácido nucléico isolado" pode compreender uma molécula de DNA ou cDNA inserida em um vetor, tal como um vetor de plasmídeo ou de vírus, ou integrada no DNA de um procarioto ou eucarioto.

[00030] Com respeito às moléculas de RNA da invenção, o termo "ácido nucléico isolado" primariamente refere-se a uma molécula de RNA codificada por uma molécula de DNA isolada como definida acima. Alternativamente, o termo pode referir-se a uma molécula de RNA que foi suficientemente separada das moléculas de RNA com as quais estaria associada em seu estado natural (isto é, em células ou tecidos), de modo que ela existe em uma forma "substancialmente pura" (o termo "substancialmente puro"é definido abaixo).

[00031] Com respeito à proteína, o termo "proteína isolada" ou "proteína isolada e purificada"às vezes é aqui usado. Este termo refere- se primariamente a uma proteína produzida por expressão de uma molécula de ácido nucléico isolada da invenção. Alternativamente, este termo pode referir a uma proteína que foi suficientemente separada das outras proteínas com as quais seria naturalmente associada, para existir na forma "substancialmente pura".

[00032] O termo "região de promotor" refere-se às regiões reguladoras transcricionais de um gene que pode ser encontrado no lado de 5' ou 3' da região de codificação, ou dentro da região de codificação, ou dentro dos íntrons.

[00033] O termo "vetor" refere-se a uma molécula de DNA veículo pequena ao qual uma sequência de DNA pode ser inserida para introdução em uma célula hospedeira onde será replicada. Um "vetor de expressão" é um vetor especializado que contém um gene ou sequência de ácido nucléico com as regiões reguladoras necessárias requeridas para expressão em uma célula hospedeira.

[00034] O termo "operavelmente ligado" significa que as sequências reguladoras necessárias para expressão de uma sequência de codificação são colocadas na molécula de DNA nas posições apropriadas com relação à sequência de codificação para realizar expressão da sequência de codificação. Esta mesma definição às vezes é aplicada ao arranjo de sequências de codificação e aos elementos de controle de transcrição (por exemplo promotores, intensificadores, e elementos de terminação) em um vetor de expressão. Esta definição é também às vezes aplicada ao arranjo de sequências de ácido nucléico de uma primeira e uma segunda molécula de ácido nucléico em que uma molécula de ácido nucléico híbrida é gerada.

[00035] O termo "substancialmente puro" refere-se a uma preparação compreendendo pelo menos 50-60 % em peso do composto de interesse (por exemplo, ácido nucléico, oligonucleotídeo, proteína, etc.). Mais preferivelmente, a preparação compreende pelo menos 75 % em peso, e mais preferivelmente 90-99 % em peso, do composto de interesse. Pureza é medida através de métodos apropriados para o composto de interesse (por exemplo métodos cromatográficos, agarose ou eletroforese em gel de poliacrilamida, análise de HPLC, e similares).

[00036] A frase "consistindo essencialmente" quando referindo a uma sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido particular significa uma sequência tendo as propriedades de uma SEQ ID NO: dada. Por exemplo, quando usado em referência a uma sequência de aminoácido, a frase inclui a sequência per se e as modificações moleculares que não afetariam as características básicas e novas da sequência.

[00037] O termo "oligonucleotídeo", como aqui usado, refere-se aos iniciadores e sondas da presente invenção; e é definido como uma molécula de ácido nucléico compreendida de dois ou mais ribo- ou deoxirribonucleotídeos, preferivelmente mais que três. O tamanho exato do oligonucleotídeo dependerá de vários fatores e da aplicação particular para a qual o oligonucleotídeo é usado.

[00038] O termo "sonda" como aqui usado refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucléico, RNA ou DNA, quer de ocorrência natural como em uma digestão da enzima de restrição purificada quer produzido sinteticamente, que é capaz de anelar ou especificamente hibridizar com um ácido nucléico com as sequências complementares à sonda. Uma sonda pode ser de fita simples ou de fita dupla. O comprimento exato da sonda dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, fonte da sonda e método de uso. Por exemplo, para aplicações de diagnóstico, dependendo da complexidade da sequência alvo, a sonda de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-25 nucleotídeos ou mais, embora possa conter menos nucleotídeos.

[00039] As sondas aqui são selecionadas para ser "substancialmente" complementares a diferentes filamentos de uma sequência de ácido nucléico alvo particular. Isto significa que as sondas devem ser suficientemente complementares para serem capazes de "hibridizar especificamente" ou anelar com seus respectivos filamentos alvos sob um conjunto de condições predeterminadas. Portanto, a sequência de sonda não necessita refletir a sequência complementar exata do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não- complementar pode ser ligado à terminação 5' ou 3' da sonda, com o restante da sequência da sonda sendo complementar ao filamento alvo. Alternativamente, bases não-complementares ou sequências mais longas podem ser entremeadas na sonda, contanto que a sequência de sonda tenha complementaridade suficiente com a sequência do ácido nucléico alvo para especificamente anelarem-se entre si.

[00040] O termo "hibridiza especificamente" refere-se à associação entre duas moléculas de ácido nucléico de fita simples de sequência suficientemente complementar para permitir tal hibridização sob condições predeterminadas em geral usadas na técnica (às vezes denominadas "substancialmente complementares"). Em particular, o termo refere-se à hibridização de um oligonucleotídeo com uma sequência substancialmente complementar contida dentro de uma molécula DNA ou RNA de fita simples da invenção, para a exclusão substancial da hibridização do oligonucleotídeo com ácidos nucléicos de fita simples de sequência não-complementar.

[00041] O termo "iniciador" como aqui usado refere-se a um oligonucleotídeo, RNA ou DNA, de fita simples ou de fita dupla, quer derivado de um sistema biológico, gerado por digestão da enzima de restrição, quer produzido sinteticamente que, quando colocado no ambiente apropriado, é capaz de atuar funcionalmente como um iniciador da síntese de ácido nucléico dependente do modelo. Quando presentes com um modelo de ácido nucléico apropriado, precursores de trifosfato de nucleosídeo adequados de ácidos nucléicos, uma enzima de polimerase, co-fatores adequados e condições tais como uma temperatura e pH adequados, o iniciador pode ser estendido em seu término 3' pela adição de nucleotídeos mediante ação de uma polimerase ou atividade similar para render um produto de extensão de iniciador.

[00042] O iniciador pode variar em comprimento dependendo das condições particulares e requerimentos da aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnóstico, o iniciador de oligonucleotídeo é tipicamente 15-25 ou mais nucleotídeos em comprimento. O iniciador deve ser de complementaridade suficiente para o modelo desejado preparar a síntese do produto de extensão desejado, isto é, para ser capaz de anelar com o filamento de modelo desejado de uma maneira suficiente para fornecer a metade de hidroxila de 3' do iniciador em justaposição apropriada para o uso na iniciação da síntese por uma polimerase ou enzima similar. Não é requerido que a sequência de iniciador represente um complemento exato do modelo desejado. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeo não-complementar pode ser ligada à terminação 5' de um iniciador do contrário complementar. Alternativamente, bases não-complementares podem ser entremeadas dentro da sequência de iniciador de oligonucleotídeo, contanto que a sequência de iniciador tenha complementaridade suficiente com a sequência do filamento de modelo desejado para funcionalmente prover um complexo de modelo-iniciador para a síntese do produto de extensão.

[00043] O termo "por cento idêntica" é aqui usado com referência às comparações entre sequências de ácido nucléico ou de aminoácido. Sequências de ácido nucléico e de aminoácido são frequentemente comparadas usando programas de computação que alinham as sequências de ácidos nucléicos ou aminoácidos desse modo definindo as diferenças entre as duas. Para propósitos desta invenção, comparações de sequências de ácido nucléico são executadas usando o Pacote de GCG Wisconsin versão 9.1, disponível do Genetics Computer Group em Madison, Wisconsin. Por conveniência, os parâmetros predefinidos (penalidade de criação de intervalo = 12, penalidade de extensão de intervalo = 4) especificados por aquele programa são intencionados para o uso aqui para comparar identidade de sequência. Alternadamente, o programa de Blastn 2.0 provido pelo National Center for Biotechnology Information (encontrado na rede mundial em ncbi.nlm.nih.gov/blast/; Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:403-410) usando um alinhamento intervalado com parâmetros predefinidos, pode ser usado para determinar o nível de identidade e similaridade entre sequências de ácido nucléico e sequências de aminoácido.

II. Preparação de Moléculas de Ácido Nucléico e Polipeptídeos Codificando Variante de Zimogênio-Protease A. Moléculas de Ácido Nucléico

[00044] Moléculas de ácido nucléico que codificam a variante de zimogênio/proteases da invenção podem ser preparadas usando métodos de tecnologia de DNA recombinante. A disponibilidade de informação da sequência de nucleotídeo permite a preparação de moléculas de ácido nucléico isoladas da invenção por uma variedade de meios. Por exemplo, as sequências de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo de zimogênio/protease podem ser isoladas de fontes biológicas apropriadas usando protocolos padrões bem conhecidos na técnica.

[00045] Ácidos nucléicos da presente invenção podem ser mantidos como DNA em qualquer vetor de clonagem conveniente. Em uma modalidade preferida, clones são mantidos em um vetor de clonagem/expressão de plasmídeo, tal como pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) que é propagado em uma célula hospedeira de E. coli adequada. Alternativamente, os ácidos nucléicos podem ser mantidos em vetor adequado para expressão em células mamíferas. Em casos onde modificação pós-translacional afeta a função de zimogênio/protease (por exemplo, Fator Xa), é preferível expressar a molécula em células mamíferas.

[00046] Em uma modalidade, os ácidos nucléicos que codificam as variantes de zimogênio de fator X podem ser também modificados por meio de inserção de um sítio de clivagem proteolítico intracelular. Para expressar variantes de FXa semelhantes a zimogênio "ativadas" em células mamíferas, um sítio de clivagem proteolítico intracelular pode ser inserido entre as posições Arg15 e 16 na variante de zimogênio de FX. Tais sítios de clivagem incluem: Arg-Lys-Arg ou Arg-Lys-Arg-Arg- Lys-Arg. Estes sítios de clivagem são reconhecidos eficientemente através de proteases (enzimas semelhantes a PACE/furina) dentro da célula e são removidos. Isto resulta em uma variante de FX(a) processada em que a cadeia pesada na molécula começa agora na posição 16. Introdução deste sítio de clivagem na dita posição permitirá a conversão intracelular de FX em FXa.

[00047] Em outra modalidade, o peptídeo de ativação de 52 aminoácidos inteiro pode ser removido e o sítio de clivagem de protease intracelular pode ser introduzido em seu lugar que resultará na variante de FXa.

[00048] Por fim estes tipos de modificações permitem secreção da forma processada "ativa" de variante de FX de uma célula que expressa a variante de FX modificada. Secreção do fator clivado obvia uma necessidade por clivagem proteolítica durante o coágulo sanguíneo ou seguindo o isolamento da proteína.

[00049] Moléculas de ácido nucléico de codificação de variante de zimogênio/protease da invenção incluem cDNA, DNA, RNA genômico, e fragmentos dos mesmos, que podem ser de fita simples ou dupla. Desse modo, esta invenção fornece oligonucleotídeos (fitas senso e antissenso de DNA ou RNA) tendo sequências capazes de hibridizar com pelo menos uma sequência de uma molécula de ácido nucléico da presente invenção. Tais oligonucleotídeos são úteis como sondas para detectar expressão de zimogênio/protease.

B. Proteínas

[00050] Um polipeptídeo de zimogênio/protease de comprimento total ou variante da presente invenção pode ser preparado em uma variedade de modos, de acordo com os métodos conhecidos. A proteína pode ser purificada de fontes apropriadas, por exemplo, células ou tecidos cultivados bacterianos ou animais transformados que expressam zimogênio/protease, através de purificação de imunoafinidade. Porém, este não é um método preferido devido à baixa quantidade de proteína, provável estar presente em um tipo de célula dado a qualquer momento.

[00051] A disponibilidade das moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease permite a produção de zimogênio/protease usando métodos de expressão in vitro conhecidos na técnica. Por exemplo, um cDNA ou gene pode ser clonado em um vetor de transcrição in vitro apropriado, tal como pSP64 ou pSP65 para transcrição in vitro, seguido por tradução livre de célula em um sistema de tradução livre de célula adequado, tal como lisados de reticulócito de germe de trigo ou de coelho. Sistemas detranscrição e de tradução in vitroestão comercialmente disponíveis, por exemplo, de Promega Biotech, Madison, Wisconsin ou BRL, Rockville, Maryland.

[00052] Alternativamente, de acordo com uma modalidade preferida, quantidades maiores de zimogênio/protease podem ser produzidas através de expressão em um sistema de expressão procariótico ou eucariótico adequado. Por exemplo, parte ou toda de uma molécula de DNA que codifica variante de Fator Xa por exemplo, pode ser inserida em um vetor de plasmídeo adaptado para expressão em uma célula bacteriana, tal como E. coli ou uma célula mamífera tal como células CHO ou Hela. Alternativamente, em uma modalidade preferida, proteínas de fusão marcadas compreendendo zimogênio/protease podem ser geradas. Tais proteínas de fusão marcadas com zimogênio/protease são codificadas por parte ou toda de uma molécula de DNA, ligada na estrutura de leitura de códon correta em uma sequência de nucleotídeo que codifica uma porção ou todo um marcador de polipeptídeo desejado que é inserido em um vetor de plasmídeo adaptado para expressão em uma célula bacteriana, tal como E. coli ou uma célula eucariótica, tal como, mas não limitada a células de levedura e mamíferas. Vetores tais como aqueles descritos acima compreendem os elementos reguladores necessários para expressão do DNA na célula hospedeira posicionada em uma tal maneira a permitir expressão do DNA na célula hospedeira. Tais elementos reguladores requeridos para expressão incluem, mas não são limitados a sequências de promotor, sequências de iniciação de transcrição, e sequências de intensificador.

[00053] Proteínas de variante de zimogênio/proteases, produzidas através de expressão de gene em um sistema procariótico ou eucariótico recombinante, podem ser purificadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade preferida, um sistema de expressão/secreção comercialmente disponível pode ser usado, por meio do qual a proteína recombinante é expressada e depois disso segregada da célula hospedeira, para ser facilmente purificada do meio circunvizinho. Se os vetores de expressão/secreção não forem usados, um método alternativo envolve purificar a proteína recombinante através de separação de afinidade, tal como por interação imunológica com anticorpos que especificamente ligam à proteína recombinante ou colunas de níquel para isolamento das proteínas recombinantes marcadas com 6-8 resíduos de histidina em seu término N ou término C. Marcadores alternativos podem compreender o epítopo FLAG, GST ou o epítopo de hemaglutinina. Tais métodos são comumente usados por médicos versados.

[00054] As proteínas de zimogênio/protease, preparadas pelos métodos acima mencionados, podem ser analisadas de acordo com os procedimentos padrões. Por exemplo, tais proteínas podem ser submetidas à análise de sequência de aminoácido, de acordo com os métodos conhecidos.

[00055] Como debatido acima, um modo conveniente de produzir um polipeptídeo de acordo com a presente invenção é expressar ácido nucléico que o codifica, mediante uso do ácido nucléico em um sistema de expressão. Uma variedade de sistemas de expressão de utilidade para os métodos da presente invenção é bem conhecida àqueles versados na técnica.

[00056] Consequentemente, a presente invenção também abrange um método de fazer um polipeptídeo (como revelado), o método incluindo expressão de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo (em geral ácido nucléico). Isto pode ser convenientemente alcançado cultivando uma célula hospedeira, contendo um tal vetor, sob condições apropriadas que causam ou permitem produção do polipeptídeo. Polipeptídeos podem também ser produzidos em sistemas in vitro, tais como em lisados de reticulócitos.

III. Usos de Proteínas de Zimogênio/Protease e Ácidos Nucléicos Codificando Zimogênio/Protease

[00057] Ácidos nucléicos de variante de zimogênio/proteases que codificam polipeptídeos tendo atividades de protease alteradas podem ser usados de acordo com esta invenção, por exemplo, como agentes terapêuticos e/ou profiláticos (proteína ou ácido nucléico) que modulam a cascata de coagulação sanguínea. Os presentes inventores descobriram que moléculas de zimogênio/protease de fator X/Xa podem aumentar a coagulação e fornecer homeostase eficaz.

A. Polipeptídeos de Variantes de Zimogênio/Protease

[00058] Em uma modalidade preferida da presente invenção, polipeptídeos de variante de zimogênio/proteases podem ser administrados a um paciente por meio de infusão em um veículo biologicamente compatível, preferivelmente por meio de injeção intravenosa. A variante de zimogênio/proteases da invenção pode opcionalmente ser encapsulada em lipossomas ou misturada com outros fosfolipídeos ou micelas para aumentar a estabilidade da molécula. Zimogênio/protease pode ser administrado sozinho ou em combinação com outros agentes conhecidos modular homeostase (por exemplo, Fator V, Fator Va ou derivados dos mesmos). Uma composição apropriada para resgatar os polipeptídeos de zimogênio/protease pode ser determinada por um médico em consideração de uma variedade de variáveis fisiológicas, incluindo, mas não limitadas a condição e estado hemodinâmico do paciente. Uma variedade de composições bem adaptadas para diferentes aplicações e vias de administração é bem conhecida na técnica e é descrita mais abaixo.

[00059] A preparação contendo o análogo de fator X/Xa purificado contém uma matriz fisiologicamente aceitável e é preferivelmente formulada como uma preparação farmacêutica. A preparação pode ser formulada usando métodos da técnica anterior substancialmente conhecidos, misturada com um tampão contendo sais, tais como NaCl, CaCl2, e aminoácidos, tais como glicina e/ou lisina, e em uma faixa de pH de 6 a 8. Até necessário, a preparação purificada contendo o análogo de fator X/Xa pode ser armazenada na forma de uma solução acabada ou na forma liofilizada ou extremamente congelada.

[00060] Preferivelmente a preparação é armazenada na forma liofilizada e é dissolvida em uma solução visualmente clara usando uma solução de reconstituição apropriada. Alternativamente, a preparação de acordo com a presente invenção pode também ser disponibilizada como uma preparação líquida ou como um líquido que é congelado profundamente.

[00061] A preparação de acordo com a presente invenção é especialmente estável, isto é, pode ser deixada repousar em forma dissolvida um tempo prolongado antes da aplicação.

[00062] A preparação de acordo com a presente invenção que contém um análogo de fator X em combinação com fator XIa ou um derivado do mesmo é capaz de ativar o análogo de fator X em Fator Xa ou o análogo de Fator Xa pode "ser disponibilizado na forma de uma preparação de combinação compreendendo um recipiente que retém o fator XIa que é imobilizado em uma matriz, potencialmente na forma de uma coluna miniatura ou uma seringa enchida com uma protease, e um recipiente contendo a preparação farmacêutica com o análogo de fator X. Para ativar o análogo de fator X, a solução contendo o análogo de fator X, por exemplo, pode ser pressionada na protease imobilizada. Durante o armazenamento da preparação, a solução contendo o análogo de fator X é preferivelmente de forma espacial separada da protease. A preparação de acordo com a presente invenção pode ser armazenada no mesmo recipiente que a protease, mas os componentes são espacialmente separados por uma partição impermeável que pode ser facilmente removida antes da administração da preparação. As soluções podem também ser armazenadas em recipientes separados e ser colocadas em contato entre si apenas brevemente antes da administração.

[00063] O análogo de fator X pode ser ativado no Fator Xa logo antes do uso imediato, isto é, antes da administração ao paciente. A ativação pode ser realizada colocando um análogo de fator X em contato com uma protease imobilizada ou misturando as soluções que contêm uma protease, por um lado, e o análogo de fator X, por outro lado. Desse modo, é possível manter os dois componentes separadamente em solução e os misturar por meio de um dispositivo de infusão adequado em que os componentes entram em contato entre si à medida que eles atravessam o dispositivo e assim causam uma ativação no Fator Xa ou no análogo de Fator Xa. O paciente desse modo recebe uma mistura de Fator Xa e, além disso, uma serina protease que é responsável pela ativação. Neste contexto, é especialmente importante para prestar muita atenção na dosagem uma vez que a administração adicional de uma serina protease também ativa fator X endógeno que pode encurtar o tempo de coagulação.

[00064] A preparação de acordo com a presente invenção pode ser disponibilizada como uma preparação farmacêutica com atividade de Fator Xa na forma de uma preparação de um componente só ou em combinação com outros fatores na forma de uma preparação de multicomponentes.

[00065] Antes de processar a proteína purificada em uma preparação farmacêutica, a proteína purificada é submetida aos controles de qualidade convencionais e formada em uma forma de apresentação terapêutica. Em particular, durante a fabricação recombinante, a preparação purificada é testada quanto à ausência de ácidos nucléicos celulares como também ácidos nucléicos que são derivados do vetor de expressão, preferivelmente usando um método, tal como é descrito na EP 0 714 987.

[00066] Outra característica desta invenção refere-se em tornar disponível uma preparação que contém um análogo de Fator X com uma estabilidade alta e integridade estrutural e que, em particular, é livre de intermediários de análogo de fator X/Xa inativos e produtos de degradação autoproteolíticos e que podem ser produzidos ativando um análogo de fator X do tipo descrito acima e formulando-o em uma preparação apropriada.

[00067] A preparação farmacêutica pode conter dosagens de entre 10-1000 μg/kg, mais preferivelmente entre cerca de 10-250 μg/kg e o mais preferivelmente entre 10 e 75 μg/kg, com 40 μg/kg do polipeptídeo de variante de fator X sendo particularmente preferido. Os pacientes podem ser tratados imediatamente sob apresentação na clínica com uma hemorragia. Alternativamente, os pacientes podem receber uma infusão de bolo uma a cada três horas, ou se melhoria suficiente for observada, uma infusão uma vez ao dia da variante de Fator Xa descrita aqui.

B. Ácidos Nucléicos Codificando Zimogênio/Protease

[00068] Ácidos nucléicos codificando zimogênio/protease podem ser usados para uma variedade de propósitos de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade preferida da invenção, um veículo de liberação de ácido nucléico (isto é, um vetor de expressão) para modular coagulação sanguínea é fornecido em que o vetor de expressão compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica para um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease, ou um fragmento funcional do mesmo como descrito aqui. Administração de vetores de expressão codificando zimogênio/protease a um paciente resulta na expressão do polipeptídeo de zimogênio/protease que serve para alterar a cascata de coagulação. De acordo com a presente invenção, uma sequência de ácido nucléico de codificação de zimogênio/protease pode codificar um polipeptídeo de zimogênio/protease como descrito aqui cuja expressão aumenta a homeostase. Em uma modalidade preferida, uma sequência de ácido nucléico de zimogênio/protease codifica uma variante de polipeptídeo de Fator Xa humana.

[00069] Os vetores de expressão que compreendem sequências de ácido nucléico de variantes de zimogênio/protease de X/Xa podem ser administrados sozinhos, ou em combinação com outras moléculas úteis para modular homeostase. De acordo com a presente invenção, os vetores de expressão ou combinação de agentes terapêuticos podem ser administrados sozinhos ao paciente ou em umas composições farmaceuticamente aceitáveis ou biologicamente compatíveis.

[00070] Em uma modalidade preferida da invenção, o vetor de expressão compreendendo sequências de ácido nucléico que codificam as variantes de variante de zimogênio/proteases é um vetor viral.

[00071] Vetores virais que podem ser usados na presente invenção incluem, mas não são limitados a, vetores adenovirais (com ou sem promotores/intensificadores tecido-específicos), vetores adenovírus- associados (AAV) de sorotipos múltiplos (por exemplo, AAV-2, AAV-5, AAV-7, e AAV-8) e vetores de AAV híbrido, vetores de lentivírus e vetores de lentivírus de pseudo-tipo [por exemplo, vírus de Ebola, vírus de estomatite vesicular (VSV), e vírus de imunodeficiência felina (FIV)], vetores de vírus do herpes simples, vetores de vírus vaccínia, e vetores retrovirais.

[00072] Em uma modalidade preferida da presente invenção, métodos para a administração de um vetor viral compreendendo as sequências de ácido nucléico que codificam uma variante de zimogênio/protease, ou um fragmento funcional das mesmas, são providos. Vetores adenovirais de utilidade nos métodos da presente invenção preferivelmente incluem pelo menos as partes essenciais do DNA do vetor adenoviral. Como descrito aqui, expressão de um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease seguindo administração de tal um vetor adenoviral serve para modular homeostase. No contexto da variante de Fator Xa descrito aqui, tal administração intensifica a atividade de pró-coagulação da protease.

[00073] Vetores adenovirais recombinantes encontraram utilidade vasta para uma variedade de aplicações de terapia de gene. Sua utilidade para tais aplicações é em grande parte devido à eficiência alta de transferência de gene in vivo alcançada em uma variedade de contextos de órgão.

[00074] Partículas adenovirais podem ser usadas para tirar vantagem como veículos para liberação de gene adequada. Tais vírions possuem várias características desejáveis para tais aplicações, incluindo: características estruturais relacionadas em ser um vírus não- envelopado de DNA de fita dupla e características biológicas tais como um tropismo para o sistema respiratório humano e trato gastrintestinal. Além disso, adenovírus são conhecidos infetar uma ampla variedade de tipos de célula in vivo e in vitroatravés de endocitose mediada por receptor. Atestando à segurança geral dos vetores adenovirais, infecção com adenovírus leva a um estado de doença mínimo em humanos compreendendo sintomas moderados semelhantes à influenza.

[00075] Devido a seu tamanho grande (~36 quilobases), genomas adenovirais são bem adaptados para o uso como veículos de terapia de gene porque eles podem acomodar a inserção de DNA estranho seguindo a remoção de genes adenovirais essenciais para regiões de replicação e não-essenciais. Tais substituições tornam o vetor viral prejudicado com respeito às funções replicativas e de infecciosidade. De nota, os adenovírus foram usados como vetores para terapia de gene e para expressão de genes heterólogos.

[00076] Para um debate mais detalhado do uso de vetores de adenovírus utilizado para terapia de gene, vide Berkner, 1988, Biotechniques 6:616-629 e Trapnell, 1993, Advanced Drug Delivery Reviews 12:185-199.

[00077] É desejável introduzir um vetor que possa fornecer, por exemplo, cópias múltiplas de um gene desejado e consequentemente maiores quantidades do produto daquele gene. Vetores adenovirais melhorados e métodos para produzir estes vetores foram descritos em detalhes em várias referências, patentes, e pedidos de patente, incluindo: Mitani e Kubo (2002, Curr Gene Ther. 2(2): 135-44); Olmsted- Davis et al. (2002, Hum Gene Ther. 13(ll):1337-47); Reynolds et al. (2001, Nat Biotechnol. 19(9):838-42); patentes U. S. N°s 5.998.205 (em que são fornecidos vetores replicativos tumor-específicos compreendendo cópias de DNA múltiplas); 6.228.646 (em que são descritos vetores de adenovírus livres de ajudante, totalmente defeituosos); 6.093.699 (em que são fornecidos vetores e métodos para terapia de gene); 6.100.242 (em que um vetor de adenovírus defeituoso de replicação inserido em transgene foi eficazmente usado em terapia de gene in vivo de doença vascular periférica e doença cardíaca); e Pedidos de Patente Internacionais N°s WO 94/17810 e WO 94/23744.

[00078] Para algumas aplicações, uma construção de expressão pode também compreender elementos reguladores que servem para dirigir a expressão em um tipo de célula ou de tecido particular. Tais elementos reguladores são conhecidos àqueles versados na técnica e debatidos a fundo em Sambrook et al. (1989) e Ausubel et al. (1992). A incorporação de elementos reguladores tecido-específicos nas construções de expressão da presente invenção fornece pelo menos tropismo de tecido parcial à expressão da variante de zimogênio/proteases ou fragmentos funcionais da mesma. Por exemplo, um vetor adenoviral do tipo 5 deletado em E1 compreendendo as sequências de ácido nucléico que codificam a variante de zimogênio/protease sob o controle de um promotor de citomegalovírus (CMV) pode ser usado para tirar vantagem dos métodos da presente invenção.

Métodos Exemplares para Produzir Vetores Adenovirais

[00079] Vetores adenovirais para expressão de gene recombinante foram produzidos na linhagem celular de rim embrionário humano 293 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59-72), esta linhagem celular é permissiva para crescimento de mutantes de adenovírus 2 (Ad2) e adenovírus 5 defeituosos nas funções de E1 porque compreende a terminação esquerda do genoma de adenovírus 5 e, portanto, expressa proteínas de E1. Genes de E1 integrados no genoma celular das 293 células são expressos em níveis que facilitam o uso destas células como um sistema de expressão em que para amplificar os vetores virais destas, os genes foram deletados. 293 células foram extensivamente usadas para o isolamento e propagação de mutantes de E1, para clonagem independente de ajudante, e para expressão dos vetores de adenovírus. Sistemas de expressão tais como a linhagem celular 293, portanto, fornecem funções virais essenciais em trans e assim permitem propagação dos vetores virais nas quais as sequências de ácido nucléico exógenas foram substituídas por genes de E1. Vide Young et al. em The Adenovirus, Ginsberg, ed., Plenum Press, Nova Iorque e Londres (1984), págs. 125-172.

[00080] Outros sistemas de expressão bem adaptados à propagação de vetores adenovirais são conhecidos àqueles versados na técnica (por exemplo, células HeLa) e foram revisados em outro lugar.

[00081] Também incluso na presente invenção é um método para modular homeostase compreendendo fornecer células de um indivíduo com um veículo de liberação de ácido nucléico codificando um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease e permitindo as células crescerem sob condições em que o polipeptídeo de zimogênio/protease é expressado.

[00082] Do debate anterior, pode ser visto que os polipeptídeos de zimogênio/protease, e o polipeptídeo de zimogênio/protease que expressa vetores de ácido nucléico podem ser usados no tratamento de distúrbios associados à coagulação sanguínea aberrante.

C. Composições Farmacêuticas

[00083] Os vetores de expressão da presente invenção podem ser incorporados nas composições farmacêuticas que podem ser liberadas a um sujeito, para permitir a produção de uma proteína biologicamente ativa (por exemplo, um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease ou fragmento funcional ou derivado do mesmo). Em uma modalidade particular da presente invenção, as composições farmacêuticas que compreendem material genético suficiente para permitir um recipiente produzir uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease podem influenciar homeostase no sujeito. Alternativamente, como debatido acima, uma quantidade eficaz do polipeptídeo de variante de Fator X pode ser infundida diretamente em um paciente em necessidade do mesmo. As composições podem ser administradas sozinhas ou em combinação com pelo menos um outro agente, tal como um composto de estabilização que pode ser administrado em qualquer veículo farmacêutico estéril, biocompatível incluindo, mas não limitado a solução salina, solução salina tamponada, dextrose e água. As composições podem ser administradas sozinhas a um paciente, ou em combinação com outros agentes (por exemplo, co- fatores) que influenciem homeostase.

[00084] Em modalidades preferidas, as composições farmacêuticas também contêm um excipiente farmaceuticamente aceitável. Tais excipientes incluem qualquer agente farmacêutico que não leve a induzir uma resposta imune prejudicial ao indivíduo recebendo a composição, e que possam ser administrados sem toxicidade imprópria. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a líquidos tais como água, solução salina, glicerol, açúcares e etanol. Sais farmaceuticamente aceitáveis podem também ser inclusos neles, por exemplo, sais de ácido minerais tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e similares; e os sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e similares. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes intumescentes ou emulsificantes, substâncias de tamponamento de pH, e outros, podem estar presentes em tais veículos. Um debate completo de excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack. Pub. Co., 18a Edição, Easton, Pa. [1990]).

[00085] Formulações farmacêuticas adequadas para administração parenteral podem ser formuladas em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hanks, solução de Ringer, ou solução salina fisiologicamente tamponada. Suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetil celulose de sódio, sorbitol ou dextrana. Adicionalmente, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintético, tais como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes adequados ou agentes que aumentem a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

[00086] A composição farmacêutica pode ser fornecida como um sal e pode ser formada com muitos ácidos, incluindo mas não limitado a, clorídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Sais tendem a ser mais solúveis em solventes protônicos aquosos ou outros que as formas de base livres correspondentes. Em outros casos, a preparação preferida pode ser um pó liofilizado que pode conter qualquer um ou todos dos seguintes: 1-50 mM de histidina, 0,1 %-2 % de sacarose, e 2-7 % de manitol, em uma faixa de pH de 4,5 a 5,5, que aquele é combinado com tampão antes do uso.

[00087] Após as composições farmacêuticas serem preparadas, elas podem ser colocadas em um recipiente apropriado e marcadas para tratamento. Para administração de vetores ou polipeptídeos contendo zimogênio/protease, tal marcação incluiria quantidade, frequência, e método de administração.

[00088] Composições farmacêuticas adequadas para o uso na invenção incluem composições em que os componentes ativos são contidos em uma quantidade eficaz para alcançar o propósito terapêutico intencionado. Determinar uma dose terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade de um médico versado usando as técnicas e orientação fornecidas na presente invenção. Doses terapêuticas dependerão, entre outros fatores, da idade e condição geral do sujeito, da severidade do fenótipo de coagulação sanguínea aberrante, e da resistência das sequências de controle que regulam os níveis de expressão do polipeptídeo de variante de zimogênio/protease. Desse modo, uma quantidade terapeuticamente eficaz em seres humanos cairá em uma faixa relativamente vasta que pode ser determinada por um médico com base na resposta de um paciente individual para tratamento de zimogênio/protease com base em vetor. D. Administração

[00089] Os polipeptídeos de variante de Fator X, sozinhos ou em combinação com outros agentes, podem ser infundidos diretamente em um paciente em um veículo biológico apropriado como mais acima descrito. Vetores de expressão da presente invenção que compreendem as sequências de ácido nucléico que codificam a variante de zimogênio/protease, ou fragmentos funcionais das mesmas, podem ser administrados a um paciente por uma variedade de meios (vide abaixo) para alcançar e manter um nível profilática e/ou terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de zimogênio/protease. Alguém versado na técnica poderia facilmente determinar os protocolos específicos para usar os vetores de expressão de codificação de zimogênio/protease da presente invenção para o tratamento terapêutico de um paciente particular. Protocolos para a geração de vetores adenovirais e administração em pacientes foram descritos nas patentes U. S. N°s 5.998.205; 6.228.646; 6.093.699; 6.100.242; e Pedidos de Patente Internacionais N°s WO 94/17810 e WO 94/23744, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

[00090] Vetores adenovirais de codificação da variante de zimogênio/protease da presente invenção podem ser administrados a um paciente por quaisquer meios conhecidos. Liberação direta das composições farmacêuticas in vivo pode em geral ser realizada por meio de injeção usando uma seringa convencional, embora outros métodos de liberação tais como liberação de transmissão intensificada sejam visados (Vide por exemplo, Patente U. S. N° 5.720.720). Nesta consideração, as composições podem ser liberadas subcutânea, epidérmica, intradérmica, intratecal, intra-orbital, intramucosal, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, oral, intra-hepática ou intramuscularmente. Outros modos de administração incluem administração oral e pulmonar, supositórios, e aplicações transdérmicas. Um clínico especializado no tratamento de pacientes com distúrbios de coagulação sanguínea pode determinar a via ótima para administração dos vetores adenovirais compreendendo sequências de ácido nucléico de zimogênio/protease com base em vários critérios, incluindo, mas não limitados a: a condição do paciente e o propósito do tratamento (por exemplo, coagulação sanguínea intensificada ou reduzida).

[00091] A presente invenção também abrange vetores de AAV que compreendem uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease.

[00092] Também fornecidos são lentivírus ou vetores de lentivírus de pseudo-tipo que compreendem uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease.

[00093] Também abrangidos são plasmídeo desprotegidos ou vetores de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de variante de zimogênio/protease.

Exemplo 1 - Variante de Zimogênio/Protease de Fator XA

[00094] Processamento proteolítico das proteínas de plasma de precursor para afetar ativação é uma conspicuidade de coagulação sanguínea. O paradigma para este tipo de mecanismo de ativação é a transição de zimogênio para protease na a família de serina protease semelhante à quimiotripsina. Clivagem de ligação em um sítio altamente conservado (Arg15-Ile16; sistema de numeração de quimiotripsina) desmascara um novo término N que atua como um ligando intramolecular para Asp194 (Figura 2). Esta ponte de sal nova resulta ou está associada a uma alteração conformacional e ordenamento do assim chamado "domínio de ativação", alças de superfície que consistem em cavidade de especificidade de S1, orifício de oxiânion, alça de autólise, e sítio de ligação de sódio (Figura 3). Está bem documentado no sistema de tripsina que formação de ponte de sal interna de Ile16-Asp194 é alostericamente ligada ao sítio de especificidade de S1; ou seja, alterações em um sítio influencia o outro sítio e vice-versa.

[00095] Os princípios básicos da transição de zimogênio para enzima ativa para serina proteases no nível estrutural estão bem documentados, particularmente para quimiotripsina e tripsina e estes exemplos servem como o paradigma para a família de serina protease. Aspectos gerais podem ser resumidos como segue (vide Figura 2): 1) a estrutura (~80-85 %) do zimogênio é relativamente similar à protease; 2) a transição é iniciada seguindo liberação de um término N altamente conservado (por exemplo, Ile16-Val-Gly-Gly19); 3) o novo grupo α- amino (Del 6) é enterrado em um ambiente hidrofóbico e seu nitrogênio de α-amino forma uma ponte de sal interna com Asp194; 4) a posição de Asp194 significativamente altera sob rotação de ativação de zimogênio a ~170°; e 5) esta ponte de sal interna resulta ou está associada a uma alteração conformacional no assim-chamado "domínio de ativação", alças expostas de superfície que consistem em resíduos 16-19, 142-153, 184-194, e 216-223; e parcialmente compreendendo o sítio de especificidade de S1 (nomenclatura de Schechter e Berger (1967) Bochem. Biophys. Res. Comm. 43:694-702) e orifício de oxiânion. Vários estudos indicam que o zimogênio e a enzima madura existem em um equilíbrio, com Keq = ~108a favor do zimogênio. Bode e colaboradores demonstraram elegantemente que tripsinogênio pode adotar uma estrutura ativa semelhante à tripsina sob ligação de ligando forte à cavidade de especificidade de S1 ou ligantes adequados com afinidade alta pela fenda de Ile16. Exemplos adicionais desta indução sem clivagem da ligação de Arg/Lys15-Ile16 incluem a ligação de estreptocinase a plasminogênio, estafilocoagulase a protrombina, e um auto-anticorpo recentemente descrito a protrombina (Madoiwa et al. (2001) Blood 97:3783-3789). Coletivamente estes estudos indicam que serina proteases, até mesmo em sua forma de zimogênio, pode adotar funções semelhantes à protease dependendo de várias condições ambientais, isto é, ligação de ligante forte ao zimogênio.

[00096] É bem conhecido que a ativação de FX resulta em alterações conformacionais principais no domínio de serina protease que é acompanhado pela habilidade da protease ligar com maior afinidade às sondas S1-direcionadas e FVa ligado à membrana (1-6). O(s) mecanismo(s) molecular(es) geral(is) que governa(m) a transição das serina proteases é/são em geral assumido(s) seguir ao do sistema de tripsina. Porém, isto pode não ser uniformemente o caso. TPA de cadeia simples emprega uma estratégia molecular diferente para manter seu estado semelhante a zimogênio (8-11). Análise de pares de zimogênio/protease envolvidos em coagulação sanguínea, particularmente FVII/FVIIa, indica que várias diferenças existem nesta transição comparado ao sistema de tripsina (12). Embora vários determinantes estruturais em FXa sejam parte do assim-chamado domínio de ativação, está correntemente incerto se a formação destes sítios está ligada diretamente ao zimogênio para transição de protease. Um modelo recentemente descrito do Fx de zimogênio sugere, porém que vários destes elementos podem ser desordenados no zimogênio (13). Comparação do modelo de zimogênio com a enzima ativa revela que resíduos que compõem as alças de Ca2+(Asp70-Glu80), Na+ (Ala183-Asp194; Gly219-Gly226) e de autólise (Thr144-Arg150) sofrem alterações principais em suas posições da cadeia principal na transição de zimogênio para protease. Uma vez que já está bem documentado, pelo menos para tripsinogênio/tripsina, que o sítio de especificidade de S1 e a formação de Ile16-Asp194 são alostericamente ligados, é razoável levantar a hipótese que outros elementos do domínio de ativação estão também ligados à transição de zimogênio para protease. No exemplo presente, projetou-se experimentos para testar a hipótese que desestabilização da ponte de sal interna de Ile16-Asp194 fazendo alterações na posição 16, 17, ou 194 altera o sítio ativo clivado fazendo a variante resultante "semelhante a zimogênio". Também foi levantada a hipótese que estas alterações alostericamente modularão o FVa ligante.

Materiais e Métodos Expressão de Fator XA

[00097] Embora haja vários relatórios na literatura na expressão de rFX, a maioria tem contado com versões truncadas ou não tem fornecido caracterização adequada (15-20). Tentativas iniciais para expressar rFX em células de HEK 293 resultaram em níveis de expressão na faixa de 1-2 mg de rFX/L de meios condicionados; porém, apenas foram encontrados 10-40 % do material produzido serem completamente Y- carboxilados (21). O material restante não mostrou nenhuma Y- carboxilação. Tirou-se proveito das afinidades de ligação diferentes dos propeptídeos dependentes de vitamina K para a carboxilase e foi levantada a hipótese que uma vez que o propeptídeo de protrombina exibe a afinidade mais baixa para a carboxilase, trocando o propeptídeo de FX (afinidade mais alta) com que o da protrombina pode intensificar a y-carboxilação permitindo maior giro de substrato (22, 23). Usando este vetor novo, os transfectantes estáveis de células HEK 293 foram selecionados, expandidos, e rFX foi purificado através de cromatografia de imunoafinidade. Elução de fosfato de hidroxiapatita foi usada para separar o material carboxilado do material não-carboxilado. Os resultados, obtidos agora de mais de 30 linhagens celulares estáveis indicam que em ~80-90 % em média do rFX são completamente y- carboxilados comparados a 10-40 % usando o propeptídeo de FX nativo. Estes resultados foram publicados recentemente e esta estratégia tem subsequentemente sido empregada por pelo menos um outro laboratório (24,25). Desse modo, usando este sistema de expressão novo, são agora produzidas quantidades em miligramas (1525 mg de rFX completamente y-carboxilado de ~10 L de meios condicionados) de proteína para estudos detalhados de estrutura/função.

Ensaios de Enzima

[00098] Concentrações de enzima serão determinadas através de titulação de sítio ativo com p-guanidinobenzoato de p-nitrofenila (Ila) ou mono-p-guanidinobenzoato de fluoresceína (FXa) (26, 27). Atividade de substrato cromogênico de FXa, na presença ou ausência de vários inibidores, será medida das taxas iniciais de hidrólise de Spectrozyme FXa, S-2222, ou S-2765 como previamente descrito (14). Parâmetros cinéticos serão determinados por ajuste de quadrados mínimos dos dados de taxa iniciais às equações apropriadas.

Geração de Variantes de FXa

[00099] Os mutantes de FX foram gerados usando o kit de mutagênese loco-dirigida de alteração Quick (Stratagene) e o cDNA de FX inteiro foi sequenciado para verificar a identidade do produto. Os vários plasmídeos foram transientemente transfeccionados em células HEK 293 usando Lipofectamina-2000. 48 h pós-transfecção, meios foram colhidos e os níveis de antígeno de FX foram determinados usando um ELISA FX-específico e atividade de FXa foi avaliada através de ensaio cromogênico antes da ativação por RVV-X ou através de fator de tecido-FVIIa.

Resultados

[000100] Geração de espécies de FXa distribuídas ao longo da via de transição de zimogênio-protease é esboçada na Tabela 1. Resultados da transfecção transiente indicam que geram-se uma série de variantes de FXa com quantidades variáveis de atividade, variando de ~25 % a < 1 %. Levantou-se a hipótese que estas diferenças na atividade provavelmente reflitam variantes de FX que são deslocadas em graus variados ao longo do zimogênio para transição de protease. Declarado diferentemente, a ponte de sal interna de Ile16-Asp194 é estabilizada em graus variados dependendo do aminoácido nas posições 16, 17 ou 194. Foram selecionadas três destas variantes (rFXaI16L, FXaI16G e FXaV17A) para caracterização adicional. Tabela 1: Ativação De Várias Variantes De Rfx Com Rvv-X E TF-FVIIa

aNíveis de antígeno são calculados de um ELISA FX-específico e expressos como nM de FX bNíveis de atividade de FXa são com base na taxa de hidrólise de substrato de peptidila seguindo ativação por RVV-X ou TF-FVIIa de uma variante de FX dada e taxas iniciais de hidrólise são comparadas à curva padrão de FXa cvalores de % em peso são com base na comparação aos níveis de atividade FXa do tipo selvagem. Os valores foram ajustados para os níveis de antígeno.

[000101] Linhagens celulares estáveis em células HEK293 foram estabelecidas e cada um dos zimogênios foram purificados de 10 L de meios condicionados (14, 24). As variantes foram ativadas com RVV-X e subsequentemente purificadas através de cromatografia de filtração em gel (14,24). SDS-PAGE das variantes antes e seguindo ativação (reduzindo e não-reduzindo) é mostrada na Figura 4.

[000102] Focalizou-se primeiro em avaliar alterações no ambiente do sítio ativo de cada uma das variantes usando sondas específicas que alvejam esta região de FXa. Estudos cinéticos usando substratos de peptidila e sondas direcionadas por sítio ativo revelaram que FXaI16L e FXaV17A têm uma habilidade prejudicada para ligar estas sondas (aumento de 15 a 25 vezes na Km ou Ki), enquanto a taxa de catálise (kcat) foi reduzida em 3 vezes, comparada ao FXa do tipo selvagem (derivado de plasma e recombinante) (Tabelas 2 e 3). Fator XaI16G não foi inibido por nenhuma das sondas examinadas e sua atividade cromogênica foi prejudicada severamente (500 a 1000 vezes) impedindo o cálculo dos parâmetros cinéticos. Estes dados são consistentes com a ideia que desestabilização de formação da ponte de sal interna (Ile16-Asp194), influencia ligar no sítio de especificidade de S1. Em contraste com estes resultados, o conjunto de FXaI16L e FXaV17A em protrombinase completamente restabeleceu a Km quase para substratos de peptidila enquanto a kcat ainda era 3 vezes reduzida, indicando que ligação de FVa pode resgatar ligação no sítio ativo (Tabelas 2 e 3). Surpreendentemente até mesmo o valor de Km para I16G quase foi restabelecido completamente (aumento de 3 vezes comparado a FXa do tipo selvagem) quando agrupado em protrombinase; porém uma redução de 60 vezes na kcat foi observada. Tabela 2: Constantes de Cinética para Clivagem de Substrato Cromogênico

[000103] Para experimentos em que o fator Xa livre foi usado, 2,0 nM de fator Xa do tipo selvagem ou 6,0 nM de mutante foram incubados com concentrações crescentes de Spectrozyme FXa e para experimentos em que protrombinase foi empregada 5,0 nM de fator Xa do tipo selvagem ou mutante foram incubados com 30 nM de fator Va, 50 nm de PCPS e concentrações crescentes de substrato (10 a 500 μM). Atividade cromogênica foi avaliada monitorando o aumento na absorbância em 405 nm com o tempo. Os erros nas constantes ajustadas representam 95 % de limites de confidência.

[000104] Consistentes com estes dados, estudos cinéticos usando protrombina revelaram que os valores de Km obtidos para cada uma destas variantes agrupadas na protrombinase foram essencialmente equivalentes à enzima do tipo selvagem, enquanto os valores de kcat onde reduzidos a uma extensão similar como para os substratos cromogênicos (Tabela 4). Considerados juntos, os resultados indicam que a transição de zimogênio para protease para FX não só influencia a formação do sítio de S1, mas também contribui de um modo substancial para a formação de um sítio de ligação de FVa. Uma vez que ligação direta destas variantes de FXa para FVa resgata ligação no sítio de S1, ligação alostérica provavelmente existe entre estes sítios. Coletivamente estes estudos ilustraram um único modo para modificar a via de transição de zimogênio para protease e revelaram um possível modo para desenvolver formas semelhantes a zimogênio das enzimas que são "ativadas" seguindo ligação de ligante forte tal como proteínas de co-fator. Tabela 3: Constantes de Cinética para Inibição de FXA e Protrombinase

Tabela 4: Constantes de Cinética para Clivagem de Protrombina

[000105] Os resultados obtidos com o substrato cromogênico e os inibidores loco-direcionados ativos indicam que as variantes de FXa semelhantes a zimogênio ligam às sondas de sítio ativas com afinidade reduzida. Porém, o agrupamento destas variantes em protrombinase melhora significativamente a afinidade para as sondas de sítio ativo, sugerindo que ligante de FVa pode resgatar ligação no sítio ativo. A seguir investigou-se se o contrário é também verdadeiro, ou seja, ocupação do sítio ativo semelhante a zimogênio influencia ligação a FVa. Para avaliar esta hipótese mediu-se as constantes de ligação entre FVa e FXaI16L e FXaV17A. Para realizar isto incubou-se FVa com um derivado fluorescente de FXa do tipo selvagem inativo na presença de vesículas de fosfolipídeo sintéticas e íons de Ca2+. A formação dos complexos resulta no aumento do sinal fluorescente com relação a FXa fluorescente sozinho. Depois adicionou-se concentrações crescentes de um FXa não-fluorescente que, se puder ligar a FVa, deslocará o FXa fluorescente, que resulta em uma diminuição do sinal fluorescente. Como um controle foi adicionado FXa de S195A como um competidor. Este mutante é inativo porque está faltando o Ser da tríade catalítica, mas tem uma afinidade alta para o FVa (Tabela 5). Em contraste, quando adicionou-se FXaI16L ou FXaV17A a afinidade destas variantes semelhantes a zimogênio para FXa foi significativamente reduzida comparada a FXaS195A (Tabela 5). A seguir examinou-se se a ocupação covalente do sítio ativo de FXaI16L poderia restabelecer ligação a FVa. Para fazer isto foram modificamos o sítio ativo de FXa do tipo selvagem e FXaI16L com um inibidor irreversível (EGR-clorometil cetona) e depois repetiu-se o experimento. Os dados mostram que o sítio ativo bloqueou as membranas de FVa ligadas a FXaI16L com a mesma afinidade que o sítio ativo do tipo selvagem bloqueou FXa. Isto indica que ocupação do sítio ativo de FXa semelhante a zimogênio tem uma influência direta na ligação a FVa. Tabela 5: Constantes de Ligação de Equilíbrio para Agrupamento de Protrombinase

[000106] Com base na observação que os derivados de FXa semelhantes a zimogênio têm reatividade fraca com sondas sítio ativo- direcionadas e inibidores na ausência de FVa, mas aparentemente atividade quase normal quando as variantes são agrupadas em protrombinase, a seguir avalia-se a atividade de FXaI16L em um ambiente de plasma. Plasma hemofílico A (dados não mostrados) ou B teve picos com FXa do tipo selvagem para corrigir o tempo de coagulação (aPTT) destes plasmas; 0,1 nM de FXa do tipo selvagem deram um tempo de coagulação de ~32 seg. A adição da mesma concentração de FXaI16L deu um tempo de coágulo de ~42 seg, que é ~ 50-70 % da atividade relativa a FXa do tipo selvagem, sugerindo que esta variante semelhante a zimogênio tem atividade de coagulação quase normal no plasma. A seguir foi monitorada a meia-vida de FXa do tipo selvagem e FXaI16L em plasma de hemofilia B. As proteínas foram adicionadas ao plasma de HB e em pontos de tempo diferentes, uma alíquota da mistura foi retirada e ensaiada em um ensaio baseado em aPTT. Os resultados com plasma de HB mostram que a atividade residual relativa de FXa do tipo selvagem foi inibida muito rapidamente (< 2-min) (Figura 6). Em contraste, a atividade de FXaI16L persistiu por muito mais tempo com uma meia-vida estimada de >2 horas. Foram encontrados resultados similares com plasma de hemofilia A. Estes resultados sugerem que é possível modular as características de uma enzima de forma que ela tenha uma meia-vida longa no plasma e pode corrigir o tempo de coagulação de um plasma hemofílico.

[000107] A seguir foi avaliada a habilidade de FXaI16L semelhante a zimogênio modular homeostase em um modelo murino de hemofilia (Schlachterman et. al., 2005, J. Thromb. Haemost., 3, 2730-2737). O valor de aPTT de camundongos com hemofilia B (C57BL/6) é aproximadamente 50-55 seg. Fator XaI16L (200 μg/kg; n = 7) ou PBS (n = 4) foi injetado por meio da veia de cauda de camundongos com hemofilia B. Em pontos de tempo selecionados (5 e 30 min) sangue foi colhido e um aPTT foi executado em todas as amostras. Como mostrado na Figura 7, infusão de FXaI16L resultou em correção completa do aPTT para níveis vistos em animais normais. Este efeito foi contínuo por pelo menos 30 min indicando que a molécula tem uma meia-vida relativamente longa in vivo. Infusão de PBS teve apenas um efeito marginal. Estes dados são consistentes com os experimentos in vitro em plasma acima e indicam que de fato FXaI16L e possivelmente outras variantes de FXa semelhantes a zimogênio podem modular homeostase eficazmente in vivo.

[000108] Para também testar a eficácia de FXaI16L in vivo, foi examinado se esta molécula poderia corrigir o tempo de hemorragia de camundongos com hemofilia B seguindo lesão na cauda (Schlachterman, et al., 2005, J. Thromb. Haemost., 3, 2730-2737). Perda de sangue foi medida durante um período de 10 min seccionando a parte distal da cauda. Neste tipo de ensaio, a perda de sangue é mínima em camundongos Balb-c normais do tipo selvagem (n = 7) e bastante substancial em camundongos injetados com PBS (n = 6) com hemofilia B (Balbc) seguindo a lesão da cauda (Figura 8). Em contraste, injeção de 450 μg/kg de FXaI16L significativamente reduziu a quantidade total de perda de sangue seguindo a lesão da cauda (n = 7). Considerados juntos, estes dados fornecem evidência que FXaI16L tem a habilidade para melhorar homeostase em pacientes com hemofilia A ou B. Listagem de Referência 1. Furie, B. e Furie, B. C. 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[000109] Embora certas das modalidades preferidas da presente invenção tenham sido descritas e especificamente exemplificadas acima, a invenção não é intencionada a ser limitada por tais modalidades. Várias modificações podem ser feitas a esta sem divergir do escopo e espírito da presente invenção, como exposta nas reivindicações a seguir.

Claims (5)

1. Variante de Fator Xa, caracterizada pelo fato de que modula a homeostase, consistindo nos aminoácidos 41-179 e aminoácidos 235-488 da SEQ ID NO: 1, em que a Ile na posição 235 da SEQ ID NO: 1 é substituída por Leu.

2. Variante do Fator Xa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante do Fator Xa tem uma meia- vida plasmática mais longa do que o Fator Xa do tipo selvagem.

3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a variante de Fator Xa como definida na reivindicação 1, em um veículo biologicamente compatível, em que o referido veículo biologicamente compatível é um líquido estéril compreendendo salina, salina tamponada, dextrose ou água.

4. Uso de uma variante de Fator Xa, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio relacionado à homeostase, em que o dito distúrbio é selecionado do grupo que consiste em hemofilia A e B, deficiência de fator de coagulação e hemorragia associada a trauma, lesão, trombose, trombocitopenia, acidente vascular cerebral, coagulopatia e coagulação intravascular disseminada (DIC).

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito distúrbio é selecionado do grupo que consiste em hemofilia A e B.

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