CN101356192A - 用于调节止血的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了因子Xa变异体和其使用方法。
Description
相关参考
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求在2005年11月15日提交的美国临时申请第60/736,680号的优先权，该申请的全部内容以引用的方式结合在本文中，其程度如同在本文中全文列出。
依照35U.S.C，§202(c)，承认美国政府享有本文所述的本发明的某些权利，美国国家卫生研究院的资助对本发明的完成做出了部分贡献，资助项目号PO1HL-74124-01。
技术领域
本发明涉及医学和血液学的领域。更具体而言，本发明提供一种新型凝血因子X/Xa药物和使用该药物来调节需要该治疗的患者中凝血级联的方法。
背景技术
说明书通篇引用了若干出版物和专利文献以便描述本发明所属的领域的状态。这些引用文献中的每个引用文献以引用的方式结合在本文中，如同其在本文中全文列出。
凝血的酶为胰蛋白酶样酶，胰蛋白酶样酶属于具有糜蛋白酶样折叠的蛋白酶的S1肽酶家族。凝血蛋白酶含有彼此高度同源且与消化的祖丝氨酸蛋白酶高度同源的催化域。结构同源性/一致性如此之大(＞70％)以致凝血酶的催化域中的残基根据胰凝乳蛋白酶原中的相应残基来进行编号。
凝血酶作为无活性前体(酶原)在血液中循环，其需要蛋白水解裂解来激活。与激活后所产生的丝氨酸蛋白酶相比，酶原具有大约10,000倍或更小的蛋白水解活性。在血管损伤位点启动凝血导致一系列的反应，其中酶原通过特异蛋白水解裂解而转化成蛋白酶并且形成用于连续反应的酶。这使血细胞激活，使可溶纤维蛋白原转化为不可溶的纤维蛋白，从而形成凝块。通过与用作“自杀”底物的循环蛋白酶抑制剂或那些识别活性酶的蛋白酶抑制剂起反应来移除过量蛋白酶。因此，凝血酶原的蛋白水解激活是凝血级联的关键调节特点。
虽然凝血酶原中的某些在它们各自的激活反应中在两个或两个以上的位点裂解，但形成蛋白酶需要在单个位点裂解。在这个位点的裂解和其结构结果(structural consequence)被认为使用基于胰凝乳蛋白酶原的同源编号系统和利用胰蛋白酶原和胰蛋白酶所进行的广泛结构工作是最容易做到的方式。酶原到丝氨酸蛋白酶的转化需要在Arg15(通常为Arg15与lie16之间的键)后面的裂解，这通常移除激活肽并暴露始于Ile16的催化域中的新的N末端。一个实例为因子X到因子Xa(参看图1和图2)的转化。在胰蛋白酶和因子Xa中，新的N末端序列始于16-Val17-Gly18-Gly19。对于其它凝结酶，新的N末端序列是在同一主题上的变化。然后N末端序列折回到催化域内且以序列特异性方式插入到N末端结合裂缝内，这被称作“分子性欲(molecularsexuality)”。参看图2。因此，具有交替N末端序列的变异体不太可能以相当的方式经历分子性欲。N末端插入导致在催化域的内部在Ile16的α-NH2基与Asp194之间形成盐桥。盐桥的形成与催化域结构中的许多变化相关联，这些变化包括：所谓的激活域的重新排列(在图3中显示出)；形成催化作用所需的氧阴离子孔和形成底物结合位点。这些变化导致活性丝氨酸蛋白酶的成熟。新N末端通过分子性欲和盐桥形成对活性蛋白酶成熟的序列特异性相互作用的关键贡献通过以下事实显而易见：不需要裂解而激活的细菌蛋白酶利用催化域内的另一侧链来与Asp194形成盐桥；胰蛋白酶原可被激活成蛋白酶样构象，无需裂解但是要在非常高的插入到该裂缝内的Ile-Val二肽浓度的情况下，尽管效率非常低；Val-Ile二肽和其它变异体的效率更低；此外，存在这样的细菌蛋白质的两个实例，这些细菌蛋白质经由提供插入到该N末端结合裂缝内的它们自身的N末端而破坏激活机制从而在不存在裂解的情况下激活凝血酶原。
上文所概述的结构变化为前体酶原转化为活性丝氨酸蛋白酶提供了分子解释。然而，与在Arg15裂解后完全激活的胰蛋白酶不同，许多凝血酶对它们的蛋白质底物的作用非常差。虽然它们通常具有完全起作用的活性位点且可裂解小肽基底物，但生物底物的有效裂解常常需要辅因子蛋白质(图2)。在这些情况下，辅因子蛋白质增加蛋白质底物裂解速率数千倍。虽然尚不清楚辅因子蛋白质起作用的机制，但它们不太可能通过使蛋白酶更类似酶且因此更加有效来起作用。关键点在于(有一个例外)辅因子选择性地结合蛋白酶而不是相应的酶原。举例说来，因子Xa以高亲和力与膜结合FVa结合，而酶原因子X并不结合FVa。
取决于患者的状态，可能需要研发改变的凝血级联蛋白质，其具有增强的或减弱的凝血功能。本发明的目的在于提供这种蛋白质用作治疗药。
发明概要
根据本发明，提供影响FX酶原→蛋白酶转变途径中的调节位点从而驱动更加“酶原样”FXa种类产生的组合物和方法。本发明的组合物和方法有效地调节需要该治疗的患者的止血。
在一个实施方案中，提供调节止血的变异因子X/因子Xa酶原/蛋白酶。优选地，该变异酶原蛋白酶由SEQ ID NO：2编码，其中SEQID NO：2的核苷酸1684-1695可为任何氨基酸，限制条件为核苷酸1684-1686不编码Val或Ala。更优选地，变异酶原/蛋白酶在SEQ IDNO：1中含有选自下列各修饰的至少一种修饰：a)在位置16的Ile为Leu、Phe、Asp或Gly；b)在位置17的Val为Leu、Ala或Gly；以及c)在位置194的Asp为Asn或Glu。还公开了编码本发明的变异酶原/蛋白质的核酸以及其使用方法。这些核苷酸可任选编码细胞内PACE/弗琳蛋白酶裂解位点。
在又一实施方案中，核酸具有序列SEQ ID NO：2，其中在位置1684-1695的核苷酸编码选自Leu-Val-Gly、Gly-Val-Gly、Ile-Ala-Gly、Phe-Val-Gly和Ile-Gly-Gly的氨基酸，所述核酸任选包含在位置2233-2235的核苷酸，其编码选自Asn和Glu的氨基酸。
还提供了在生物相容载体中包含本发明的因子Xa变异体的药用组合物。本发明的另一优选方面包括治疗需要该治疗的患者的与止血相关的疾病的方法，该方法包括给予本文所述的治疗上有效量的含有变异因子X/Xa酶原/蛋白酶的药用组合物。这些方法应在治疗需要前凝血剂的疾病上具有功效，且这些疾病包括，但不限于，血友病A和B，与抑制剂抗体相关联的血友病A和B，凝血因子缺乏症，维生素K环氧化物还原酶CI缺乏症，γ羧化酶缺乏症，与外伤、损伤、血栓形成、血小板减少、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)相关联的出血，过度抗凝血治疗疾病，伯-苏综合征，Glanzman血小板无力症(Glanzman thromblastemia)以及贮存池缺损(storage pooldeficiency)。
某些酶原/蛋白酶变异体可适用于治疗需要抗凝血的疾病。这些疾病包括(但不限于)血栓形成、血小板减少、中风以及凝血病。
本发明的另一方面包括表达本发明的变异酶原/蛋白酶的宿主细胞以便产生大量的本发明的变异酶原/蛋白酶。还公开了分离的和纯化酶原蛋白酶变异体的方法。
附图简述
图1。因子X的加工。合成因子X，其带有在其分泌前被除去的信号序列和前肽。因子X是酶原且不具有酶活性。在Arg15-Ile16键裂解释放激活肽(AP)后FX被转化成因子Xa。
图2。酶原转化为蛋白酶。因子X的酶原转化为蛋白酶和因子Xa组装进凝血酶原酶(FXa、FVa、磷脂以及钙离子)。这种酶将凝血酶原(II)转化成凝血酶(IIa)。
图3。FXa的X射线结构。标准取向的FXa的催化域。对结构区以及重要残基加注释。取自Brandstetter等人(1996)J.Biol.Chem.271：29988-29992。
图4。FX/Xa变异体的SDS-PAGE分析。4％-12％SDS-PAGE凝胶在非还原态或还原态下进行电泳试验，然后用考马斯亮蓝染色。
图5。因子Xa的氨基酸(SEQ ID NO：1)和核酸(SEQ ID NO：2)序列。以粗体显示出SEQ ID NO：1中所需修饰的位点和氨基酸位置。
图6。血友病B血浆中因子Xa活性。野生型FXa或FXaI16L(2nM)被添加到血友病B血浆且在选定时间间隔稀释样品(0.1nM)并在aPTT凝结测定中进行测定。
图7。aPTT的校正。因子Xa-I16L(200μg/kg；n＝7小鼠)或PBS(n＝4小鼠)经尾静脉注射到血友病B小鼠(C57BL)内。在注射后5分钟和30分钟，收集血液并且执行aPTT测定。红色点线表示正常C57B1/6动物的aPTT值。
图8。在血友病B小鼠中进行尾截割测定后的止血评价。损伤后利用A525用生理盐水溶液的血红蛋白含量来测量血液损失。小鼠(Balb c)的数目为：野生型(n＝7)；HB-PBS(n＝6)；以及HB-FXaIl 6L(n＝7)。
发明详述
蛋白水解是凝血的重要方面且是调节正常止血的机制中的许多机制的基础。前辅因子(Procofactor)和酶原不能在很大程度上参与它们的相应大分子酶复合物。这表明蛋白水解激活必须导致适当的结构变化，这种结构变化导致某些位点的表达，这些位点的表达赋予酶、底物和辅因子结合能力。虽然已经深入地研究了前辅因子和酶原激活，但是尚未完全理解蛋白水解与赋予功能的结合位点的表达之间的关系。本发明提供模型组合物和系统，其阐明大分子结合相互作用表达的基础的分子机制，大分子结合相互作用的表达伴随着从酶原状态的转变。
因子X(FX)1是维生素K依赖性双链糖蛋白，其在凝血中起着重要作用(图1)。这种丝氨酸蛋白酶酶原是用于外在(组织因子/FVIIa)和内在(FVIIIa/FIXa)tenase酶复合物的底物，其裂解在FX中的Arg15-Ile16剪切键释放产生Fxa的52-氨基酸激活肽。因子Xa是负责凝血酶原至凝血酶转化的蛋白酶(图2)。虽然因子Xa是完全有能力的蛋白酶且具有催化机制(catalytic machinery)用于凝血酶原的裂解，但它是这个反应很差的催化剂。它在膜表面上与辅因子、因子Va的紧密结合相互作用在很大程度上增加凝血酶形成速率而不会在实质上影响因子Xa所催化的其它反应。预期对Arg15裂解位点后面的N-末端序列(Ile-Val-Gly)的变化(其导致次优分子性欲)得到“酶原样”Xa衍生物，这种“酶原样”Xa衍生物具有减弱的蛋白水解活性或甚至不具有蛋白水解活性。预期这些衍生物不易于受到血浆蛋白酶抑制剂(诸如抗凝血酶III)的抑制且预期不会在脉管损伤后干扰凝血的启动，这是因为它们预期不会与TFPI良好地结合。因子Xa紧密地结合因子Va而酶原因子X并不结合。因此，预期因子Xa的酶原样形式更弱地结合Va，但是在足够高的辅因子浓度被完全复活(rescue)且有效地催化凝血酶形成。预期具有这些性质的因子Xa的酶原样形式用作循环中的长寿命蛋白酶，它们原本会失去活性但却在与因子Va结合时保留催化凝血酶形成的能力。它们具有用作治疗用前凝血剂的潜力，治疗用前凝血剂回避级联中其它凝结因子的缺乏而不会有与输注全功能野生型FXa相关联的有害效应。
I.定义
在上文中且贯穿说明书和权利要求书使用涉及本发明的生物分子的各种术语。
短语“变异酶原/蛋白酶”是指有修饰的FX酶原或FXa蛋白酶，其被进行基因改变使得它的蛋白酶活性，在转化成FXa时，在不存在特定辅因子的情况下减小或为“酶原样”(例如，对活性位点的结合亲和力小于在野生型分子中所观察到的亲和力)。显然，在存在适当辅因子的情况下会恢复这种亲和力/活性，辅因子包括(但不限于)因子Va。在母体FX分子中的氨基酸改变的优选位点包括位置16的异亮氨酸取代，在位置17的缬氨酸取代和在位置194的天冬氨酸取代，限制条件为在位置16的氨基酸不是缬氨酸或丙氨酸。
短语“与止血相关的疾病”是指出血性疾病，诸如血友病A和B，具有抑制抗体的血友病A和B患者，凝血因子VII、IX和X、XI、V、XII、II缺乏症，血管性血友病因子，组合FV/FVIII缺乏症，维生素K环氧化物还原酶Cl缺乏症，γ羧化酶缺乏症；与外伤、损伤、血栓形成、血小板减少、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)相关联的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、法华林、小分子抗血栓药(即，Fxa抑制剂)相关联的过度抗凝血；以及血小板疾病，诸如伯-苏综合征、Glanzman血小板无力症(Glanzman thromblastemia)以及贮存池缺损。与止血相关的疾病还可包括与血栓性疾病有关的出血，血栓性疾病诸如深静脉血栓形成、与心血管疾病状态或恶性肿瘤相关联的血栓形成、留置导管或其它创外科手术所导致的血栓形成和与诸如狼疮的自身免疫疾病相关联的血栓形成。酶原/蛋白酶变异体也可对具有由多种疾病状态所引起的弥散性血管内凝血或消耗性凝血病的患者提供必要的止血。
关于本发明的核酸，有时候使用“分离的核酸”。这个术语在用于DNA时是指与一些序列分离的DNA分子，在该DNA分子所起源的生物体的天然基因组中该DNA分子与这些序列紧邻(在5′和3′的方向)。举例说来，“分离的核酸”可包括插入到载体(诸如质粒或病毒载体)内或整合到原核生物或真核生物的DNA内的DNA或cDNA分子。
关于本发明的RNA分子，术语“分离的核酸”主要是指用上文所定义的分离的DNA分子所编码的RNA分子。或者，该术语可指与其自然状态中(即，在细胞中或在组织中)相关联的RNA分子充分地分离的RNA分子，使得其以“实质上纯”(术语“实质上纯”在下文中定义)的形式存在。
关于蛋白质，在本文中有时使用术语“分离的蛋白质”或“分离的且纯化的蛋白质”。这个术语主要是指通过本发明的分离的核酸分子的表达所产生的蛋白质。或者，这个术语可指与其自然地相关联的其它蛋白质充分分离以便以“实质上纯”的形式存在的蛋白质。
术语“启动子区”是指基因的转录调节区，其可在编码区的5′侧或3′侧，或在编码区内、或在内含子内。
术语“载体”是指小载体DNA分子，DNA序列可插入到这个小载体DNA分子内用于引入到宿主细胞内，在宿主细胞内其将被复制。“表达载体”是专门载体，其含有在宿主细胞中表达所需的必要调节区的基因或核酸序列。
术语“可操作地连接(operably linked)”表示将编码序列的表达所必需的调节序列置于DNA分子中相对于该编码序列的适当位置以便实现编码序列的表达。这个相同的定义有时会用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如，启动子、增强子和终止元件)的排列。这个定义有时也用于第一核酸分子和第二核酸分子的核酸序列的排列，其中产生杂交的核酸分子。
术语“实质上纯”是指包含按重量计至少50％至60％相关化合物(例如，核酸、寡核苷酸、蛋白质等)的制剂。更优选地，制剂包括按重量计至少75％的相关化合物，且最优选地包括按重量计90％至99％的相关化合物。通过对于相关化合物适当的方法来测量纯度(例如，色谱方法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)。
其中短语“基本上由...组成”当提及特定核苷酸序列或氨基酸序列时表示具有给定SEQ ID NO：的性质的序列。举例而言，当提及氨基酸序列使用该短语时，该短语包括该序列本身和不影响序列的基本特征和新型特征的分子修饰。
如本文所用的“寡核苷酸”是指本发明的引物和探针，且被定义为包括两个或两个以上(优选地，超过三个)核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的核酸分子。寡核苷酸的确切大小将取决于各种因素和寡核苷酸的特定应用。
如本文所用的术语“探针”是指寡核苷酸、聚核苷酸或核酸，可以是RNA也可以是DNA，可以是在纯化的限制酶消化中自然发生的也可以是通过合成产生，其能够与具有与探针互补的序列的核酸退火或特异地杂交。探针可为单链或双链。探针的确切长度将取决于多种因素，包括温度、探针的来源和使用方法。举例说来，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸探针通常含有15至25个或更多的核苷酸，但是其也可含有更少的核苷酸。
在这里选择探针以“实质上”与特定靶核酸序列的不同链互补。这表示探针必须充分地互补以便能够在一组预定条件下与它们各自的靶链“特异杂交”或退火。因此，探针序列无需反映靶的确切互补序列。举例说来，非互补核苷酸片段可附接到探针的5′端或3′端，且探针序列的其余部分与靶链互补。或者，倘若探针序列与其特异地退火的靶核酸的序列具有充分的互补性，非互补碱基或更长的序列可散布于探针内。
术语“特异地杂交”是指充分互补序列的两个单链核酸分子之间的允许在本领域的一般使用的预定条件下进行这种杂交(有时被称作“实质上互补”)的结合性。特定而言，该术语是指寡核苷酸与含于本发明的单链DNA或RNA分子内的实质上互补序列的杂交，基本上排除寡核苷酸与非互补序列的单链核酸的杂交。
如本文所用的术语“引物”用于指寡核苷酸(或为RNA或为DNA，或为单链或双链，或者源自生物系统，由限制酶消化产生，或者当置于适当环境下时通过合成产生)能够在功能上用作模板依赖性核酸合成的引发剂。当被提供适当核酸模板、核酸的适当核苷三磷酸前体、聚合酶、适当辅因子和诸如适当温度和pH的条件时，可通过聚合酶或类似活性的作用在引物的3′末端添加核苷酸以延伸引物从而得到引物延伸产物。
引物的长度可基于特定条件和应用要求而不同。举例说来，在诊断应用中，寡核苷酸引物的长度通常为15至25个或更多的核苷酸。引物必须与所需模板具有充分的互补性以引导所需延伸产物的合成，即，能够以适当方式与所需模板链退火，这种退火方式足以提供适当并置的引物的3′羟基部分以用于由聚合酶或类似酶启动合成。不需要引物序列代表所需模板的精确互补物。举例说来，非互补核苷酸序列可附接到在互补情况与其不同的互补引物的5′端部。或者，倘若引物序列与所需模板链的序列具有充分的互补性以在功能上提供用于延伸产物合成的模板引物复合物，非互补碱基可散布于寡核苷酸引物序列内。
关于核酸或氨基酸序列之间的比较，在本文中使用术语“百分比一致性”。常常使用计算机程序来比较核酸和氨基酸序列，该程序将核酸或氨基酸序列加以比对从而限定这二者之间的不同。出于本发明的目的，使用GCG Wisconsin Package版本(GCG Wisconsin Packageversion)9.1(其可从Genetics Computer Group in Madison，Wisconsin购买到)来执行核酸序列的比较。为了方便起见，预期使用该程序所规定的默认参数(空位形成罚分(gap creation penalty)＝12，空位延伸罚分(gap extension penalty)＝14)来比较序列一致性。或者，利用默认参数使用空位比对(gapped alignment)使用National Center forBiotechnology Information所提供的Blastn 2.0程序(参看万维网(worldwide web)ncbi.nlm.nih.gov/blast/；Altschul等人，1990，J MoI Biol215：403-410)来确定核酸序列与氨基酸序列之间的一致性和相似性。
II.编码变异酶原-蛋白酶的核酸分子和多肽的制备
A.核酸分子
可通过使用重组DNA技术方法来制备编码本发明的变异酶原/蛋白酶的核酸分子。核酸序列信息的可及性(availability)允许通过多种手段来制备本发明的分离的核酸分子。举例说来，编码酶原/蛋白酶多肽的核酸序列可使用本领域已知的标准方案从适当生物来源分离出来。
本发明的核酸可以DNA形式维持在任何适宜克隆载体中。在优选实施方案中，克隆体维持在质粒克隆体/表达载体中，诸如pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)，其在适合的大肠埃希氏菌宿主细胞中繁殖。或者，核酸可维持于适合于在哺乳动物细胞中表达的载体中。在翻译后修饰影响酶原/蛋白酶功能(例如，因子Xa)的情况下，优选地在哺乳动物细胞中表达该分子。
在一个实施方案中，可经由细胞内蛋白水解裂解位点的插入来进一步修饰编码因子X酶原变异体的核酸。为了在哺乳动物细胞中表达“激活的”酶原样FXa变异体，细胞内蛋白水解裂解位点可插入于变异体FX酶原中位置Arg15与16之间。这些裂解位点包括：Arg-Lys-Arg或Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg。这些裂解位点被细胞中的蛋白酶(PACE/类弗林蛋白酶样酶)有效地识别出并且被移除。这得到经过加工的变异体FX(a)，其中分子上重链开始的部位现在位置16开始。在所述位置引入这个裂解位点将允许FX到FXa的细胞内转化。
在另一实施方案中，可移除整个52氨基酸激活肽且细胞内蛋白酶裂解位点可被引入到其产生变异体FXa的位置。
最后，这些类型的修饰允许变异体FX的“活性”加工形式从表达有修饰的变异体FX的细胞分泌。裂解的因子(cleaved factor)的分泌排除了在血液凝结期间或蛋白质分离后对于蛋白水解裂解的需要。
本发明的编码变异酶原/蛋白酶的核酸分子包括cDNA、基因组DNA、RNA和可为单链或双链的它的片段。因此，本发明提供寡核苷酸(DNA或RNA的有义链或反义链)，其具有能够与本发明的核酸分子的至少一个序列杂交的序列。这样的寡核苷酸适用作检测酶原/蛋白酶表达的探针。
B.蛋白质
根据已知方法，可以多种方式来制备本发明的全长或变异酶原/蛋白酶多肽。可通过免疫亲和纯化法纯化来自适当来源(例如，表达酶原/蛋白酶的转化细菌或动物培养细胞或组织)纯化蛋白质。然而由于在任何时候在给定细胞类型中可能存在的蛋白质的低含量，这并不是优选的方法。
编码变异酶原/蛋白酶多肽的核酸分子的可及性允许使用本领域中已知的体外表达方法来产生酶原/蛋白酶。举例而言，cDNA或基因可被克隆到适当体外转录载体(诸如pSP64或pSP65)内进行体外转录，之后为在适合的无细胞翻译系统(诸如在小麦胚芽或兔网织红细胞溶解产物)中进行无细胞翻译。体外转录和翻译系统可从(例如)Promega Biotech，Madison，Wisconsin或BRL，Rockville，Maryland购买到。
或者，根据优选实施方案，可通过在适合的原核或真核表达系统中表达而产生较大量的“酶原/蛋白酶”。举例说来，编码变异因子Xa的DNA分子的部分或全部可(例如)插入到适于在细菌细胞(诸如大肠埃希氏菌)或哺乳动物细胞(诸如CHO或海拉细胞)中表达的质粒载体内。或者，在优选实施方案中，可产生包含酶原/蛋白酶的标记融合蛋白质(tagged fusion protein)。这样的酶原/蛋白酶-标记融合蛋白质被DNA分子的部分或全部进行编码，在校正密码子阅读框中连接(ligate)至编码所需多肽标记的一部分或全部的核苷酸序列，所需多肽标记的一部分或全部被插入到适于在细菌细胞(诸如大肠埃希氏菌)或真核细胞(诸如，但不限于酵母和哺乳动物细胞)中表达的质粒载体内。诸如上文所述的那些的载体包括在宿主细胞中表达DNA所必需的调节元件，其被定位以便允许该DNA在宿主细胞中的表达。表达所需要的该等调节元件包括(但不限于)启动子序列、转录启动序列以及增强子序列。
可根据本领域中已知的方法来纯化在重组原核或真核系统中基因表达所产生的变异酶原/蛋白酶蛋白质。在优选的实施方案中，可使用市场上可购买到的表达/分泌系统，由此重组蛋白质被表达且之后从宿主细胞分泌出来以从周围介质容易地纯化。如果不使用表达/分泌载体，那么替代方法涉及通过亲和力分离来纯化重组蛋白质，诸如通过与特异地结合到重组蛋白质或镍柱的抗体的免疫学相互作用来分离在它们的N-末端或C末端标记有6-8个组氨酸残基的重组蛋白质。替代标记可包括FLAG表位、GST或血凝素表位。这些方法通常被熟练技术人员使用。
可根据标准程序来分析通过上述方法所制备的酶原/蛋白酶蛋白质。举例说来，这些蛋白质可根据已知的方法经受氨基酸序列分析。
如上文所讨论的那样，产生根据本发明的多肽的简便方式是通过在表达系统中使用核酸来表达编码它的核酸。用于本发明的方法的多种表达系统是本领域技术人员所熟知的。
因此，本发明还涵盖用于形成多肽的方法(如所公开的那样)，该方法包括从编码该多肽(一般为核酸)的核酸表达。这可能通过在造成或允许多肽产生的适当条件下培养含有这种载体的宿主细胞而实现。也可在体外系统中(诸如在网织红细胞溶解产物中)产生多肽。
III.酶原/蛋白酶蛋白质和编码酶原/蛋白酶的核酸的使用
根据本发明可使用编码具有改变的蛋白酶活性的多肽的变异酶原/蛋白酶核酸(例如)作为治疗剂和/或预防剂(蛋白质或核酸)，其调节凝血级联。本发明人已发现因子X/Xa酶原/蛋白酶分子可增强凝血且提供有效的止血。
A.变异酶原/蛋白酶多肽
在本发明的优选实施方案中，可经由输注(优选地经由静脉内注射)来向患者给予在生物相容性载体中的变异酶原/蛋白酶多肽。本发明的变异酶原/蛋白酶可任选囊封于脂质体内或与其它磷脂或胶束混合以增强分子稳定性。酶原/蛋白酶可单独地给予或与已知能调节止血的其它药物(例如，因子V、因子Va或它的衍生物)组合地给药。可由医师考虑多种生理变量(包括但不限于，患者的条件和血液动力学状态)来确定其中要传递酶原/蛋白酶多肽的适当组合物。非常适合于不同应用的多种组合物和给药途径是本领域中熟知的且将在下文中展开描述。
含有纯化的因子X/Xa类似物的制剂含有生理学上可接受的基质且优选地被配制为药用制剂。可使用实质上已知的先前技术方法来配制该制剂，其可与含有盐(诸如NaCl、CaCl2)和氨基酸(诸如甘氨酸和/或赖氨酸)且pH范围为6至8的缓冲液混合。在需要之前，含有因子X/Xa类似物的纯化的制剂可以成品溶液(finished solution)或冻干或深低温冷冻形式贮存。优选地，该制剂以冻干形式贮存且使用适当的重建溶液溶解成目检透明的溶液。
或者，根据本发明的制剂也可作为液体制剂或深低温冷冻的液体提供。
根据本发明的制剂特别地稳定，即，其可在应用之前保持为溶解的形式持续较长的时间。
根据本发明的制剂含有与因子XIa或其衍生物(其能够将因子X类似物激活成因子Xa或因子Xa类似物)组合的因子X类似物，该制剂可以组合制剂的形式提供，该组合制剂包括保持固定在基质上的因子XIa的容器(可能为小型柱或补充有蛋白酶的注射器)和含有具有因子X类似物的药用制剂的容器。为了激活因子X类似物，含有因子X类似物的溶液(例如)可被压在固定的蛋白酶上。在制剂的贮存期间，含有因子X类似物的溶液优选地在空间上与蛋白酶分开。根据本发明的制剂可与蛋白酶贮存于同一容器中但这些组分通过不可渗透的分隔物在空间上分开，不可渗透的分隔物可在制剂给药之前容易地移除。溶液也可贮存于单独的容器中且在临给药前使它们彼此接触。
因子X类似物可被在临使用前(即，在向患者给药前)被激活成因子Xa。可通过使因子X类似物与固定的蛋白酶接触或通过混合含有蛋白酶的溶液(一方面)与因子X类似物(另一方面)来进行激活。因此，可能单独地在溶液中维持两种组分且通过适当输注装置来将它们混合，其中，这些组分在它们通过该装置时彼此接触且因此被激活成因子Xa或因子Xa类似物，因此患者可以接受因子Xa和另外地负责激活的丝氨酸蛋白酶的混合物。在这种情况下，尤其重要的是要注意剂量，因为丝氨酸蛋白酶的附加给药也激活内源因子X，其可能会缩短凝血时间。
根据本发明的制剂可被提供为以单组分制剂形式的具有因子Xa活性的药用制剂或以多组分制剂形式的与其它因子组合的药用制剂。
在将纯化的蛋白质加工成药用制剂之前，纯化的蛋白质经受常规质量控制并被制成治疗用表现形式(therapeutic form of presentation)。特别地，在重组制造期间，测试纯化的制剂是否存在细胞核酸以及源自表达载体的核酸，优选地使用诸如在EP 0714987中所描述的方法。
本发明的另一特点涉及提供一种制剂，该制剂含有具有高稳定性和结构完整性的因子Xa类似物且该制剂特别地不含无活性因子X/Xa类似物中间体和自我蛋白酶解降解产物且该制剂可通过使上文所述类型的因子X类似物激活且将其配制成适当制剂而产生。
该药用制剂可含有在10-1000μg/kg之间的剂量，更优选地在大约10-250μg/kg之间且最优选地在10与75μg/kg之间的剂量，其中40μg/kg的变异因子X多肽是特别优选的剂量。患者可在临床上出现流血时立即被治疗。或者，患者可在每一小时至三小时接受静脉快速输注，或如果观察到显著的改善，每日一次输注本文所述的变异因子Xa。
B.编码酶原/蛋白酶的核酸
根据本发明，编码酶原/蛋白酶的核酸可用于多种目的。在本发明的优选实施方案中，提供用于调节凝血的核酸传递载体(即，表达载体)，其中表达载体包括如本文所述的编码变异酶原/蛋白酶多肽或它的功能片段的核酸序列。将编码酶原/蛋白酶的表达载体给予患者导致酶原/蛋白酶多肽的表达，酶原/蛋白酶多肽用于改变凝血级联。根据本发明，编码酶原/蛋白酶的核酸序列可如本文所述编码酶原/蛋白酶多肽，酶原/蛋白酶多肽的表达增强止血。在优选实施方案中，酶原/蛋白酶核酸序列编码人因子Xa多肽变异体。
包含变异体X/Xa酶原/蛋白酶核酸序列的表达载体可单独地给药或与适用于调节止血的其它分子组合地给药。根据本发明，表达载体或治疗剂的组合可单独地给予患者或以药学上可接受的生物相容组合物给予患者。
在本发明的优选实施方案中，包含编码变异酶原/蛋白酶变异体的核酸序列的表达载体是病毒载体。可在本发明中使用的病毒载体包括(但不限于)腺病毒载体(具有或不具有组织特异性启动子/增强子)、多种血清型(例如，AAV-2、AAV-5、AAV-7和AAV-8)的腺相关病毒(AAV)载体和杂交AAV载体、慢病毒载体和假型慢病毒载体[例如，埃博拉病毒、水泡性口炎病毒(VSV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)]、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体和逆转录病毒载体。
在本发明的优选实施方案中，提供用于包含编码变异酶原/蛋白酶的核酸序列或它的功能片段的病毒载体的给药的方法。在本发明的方法中使用的腺病毒载体优选地包括腺病毒载体DNA的至少基本部分。如本文所述的那样，在这些腺病毒载体给药后的变异酶原/蛋白酶多肽的表达用于调节止血。在本文所述的变异因子Xa的情形下，该给药增强蛋白酶的促凝活性。
发现重组腺病毒载体广泛地用于多种基因治疗应用。它们对于这些应用的效用在很大程度上是由于在多种器官情况下所实现的高效率的体内基因转移。
腺病毒颗粒可有利地用作充分基因传递的载体。这些病毒粒子具有这些应用所需要的多种特点，包括：与为双链DNA无包被病毒相关的结构特点和诸如对于人呼吸系统和胃肠道的向性(tropism)的生物特点。而且，已知腺病毒感染通过受体介导胞吞作用而感染很多种细胞类型。腺病毒的感染导致人包括轻度感冒状症状的最小疾病状态证明了腺病毒载体的整体安全性。
由于它们的较大的大小(大约36千碱基)，腺病毒基因组非常适合于用作基因治疗载体，因为它们可在移除复制所必需的腺病毒基因和非必需区域后容纳外来DNA的插入。这样的取代致使病毒载体的复制功能和感染性减弱。值得注意的是，腺病毒已被用作用于基因治疗和用于外源基因表达的载体。
关于用于基因治疗的腺病毒载体的使用的更详细的讨论，参见Berkner，1988，Biotechniques 6：616-629和Trapnell，1993，AdvancedDrug Delivery Reviews12：185-199。
需要引入载体，载体可提供(例如)所需基因的多个拷贝和因此更大量的该基因的产物。改进的腺病毒载体和产生这些载体的方法在许多参考文献、专利和专利申请中更详细地描述，包括：Mitani和Kubo(2002，Curr Gene Ther.2(2)：135-44)；Olmsted-Davis等人(2002，HumGene Ther13(11)：1337-47)；Reynolds等人(2001，Nat Biotechnol.19(9)：838-42)；美国专利第5,998,205号(其中提供包含多个DNA拷贝的肿瘤特异性复制载体)；第6,228,646号(其中描述了无辅助病毒的完全缺陷的腺病毒载体)；第6,093,699号(其中提供用于基因治疗的载体和方法)；第6,100,242号(其中，转基因插入复制缺陷病毒载体有效地用于外周血管疾病和心脏病的体内基因治疗)；以及国际专利申请第WO 94/17810号和第WO 94/23744号。
对于某些应用，表达载体还可包括调节元件，调节元件用于驱动在特定细胞或组织类型中的表达。这些调节元件是本领域技术人员已知的且被Sambrook等人(1989)和Ausubel等人(1992)深入地讨论。在本发明的表达构建体中加入组织特异性调节元件提供对于变异酶原/蛋白酶的或其功能片段表达的至少部分组织向性。举例而言，在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下包括编码变异酶原/蛋白酶的核酸序列的E1删除型5腺病毒载体可有利地用于本发明的方法中。
产生腺病毒载体的示范性方法
已在人胚肾细胞系293(Graham等人，1977，J.Gen.Virol.36：59-72)中产生了用于重组基因表达的腺病毒载体。这种细胞系允许腺病毒2(Ad2)和在E1功能方面存在缺陷的腺病毒5突变体(因为其包括腺病毒5基因组的左端)生长且因此表达E1蛋白质。整合到293细胞的细胞基因组内的E1基因在多个水平表达，这些表达水平便于将这些细胞用作表达系统，在表达系统中，为了扩增病毒载体，从病毒载体删除了这些基因。293细胞已广泛地用于E1突变体的分离和繁殖，用于不依赖辅助病毒的克隆和用于腺病毒载体的表达。因此，诸如293细胞系的表达系统在反式提供基本的病毒功能且因此能够繁殖病毒载体，其中，外源核酸序列取代E1基因。参看Young等人，腺病毒，Ginsberg编，Plenum Press，New York and London(1984)，第125-172页.。
非常适合于腺病毒载体繁殖的其它表达系统是本领域技术人员已知的(例如，海拉细胞)且已在其它地方评述。
本发明还包括用于调节止血的方法，包括向个体的细胞提供编码变异酶原/蛋白酶多肽的核酸传递载体且允许细胞在表达酶原/蛋白酶多肽的条件下生长。
通过前面的讨论，可以看出酶原/蛋白酶多肽和表达酶原/蛋白酶多肽的核酸载体可用于治疗与异常凝血相关的疾病。
C.药用组合物
本发明的表达载体可加入到药用组合物内，药用组合物可被传递到受试者以便允许产生具有生物活性的蛋白质(例如，变异酶原/蛋白酶多肽/或其功能片段或衍生物)。在本发明的特定实施方案中，包含足够的遗传物质以使得受体能够产生治疗上有效量的变异酶原/蛋白质多肽的药用组合物可影响受试者的止血。或者，如上文所讨论的那样，有效量的变异因子X多肽可被直接输注到需要该治疗的患者内。组合物可单独给药或者与至少一个其它试剂(诸如为稳定化化合物)组合地给药，其可在任何无菌生物相容药用载体中给药，生物相容性药用载体包括(但不限于)生理盐水、缓冲生理盐水、葡萄糖和水。组合物可单独地给予患者或与影响止血的其它试剂(例如，辅因子)组合地给予患者。
在优选实施方案中，药用组合物还含有药学上可接受的赋形剂。这些赋形剂包括自身并不诱发针对接受该组合物的个体的有害的免疫反应且可不产生异常毒性地给药的任何药剂。药学上可接受的赋形剂包括(但不限于)液体，诸如水、生理盐水、甘油、糖和乙醇。药学上可接受的盐也可包括于其内，例如无机盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，诸如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、安息香酸盐等。此外，在该等载体中可存在助剂，诸如润湿或乳化剂、pH缓冲物质等。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，第18版，Easton，Pa.[1990])中提供药学上可接受的赋形剂的全面讨论。
适合于胃肠外给药的药用制剂可在水溶液中配制，优选地在生理学上相容的缓冲液中，诸如Hanks溶液、Ringer溶液或生理学上缓冲的生理盐水。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素纳、山梨醇或葡聚糖。此外，可将活性化合物的悬浮液适当地配制为油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯或脂质体。任选，悬浮液也可含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许高浓度溶液的制剂的试剂。
药用组合物可被提供为盐且可由多种酸形成，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐在水溶剂或其它质子溶剂中的溶解度倾向于高于相应的自由碱基形式。在其它情况下，优选制剂可为冻干粉，其可含有下列物质中的任一种或全部：1-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖和2-7％甘露醇，pH范围4.5至5.5，其在使用之前与缓冲液组合。
在制备药用组合物后，它们可被置放于适当容器中且被贴上标签用于治疗。对于含有酶原/蛋白酶的载体或多肽的给药，这些标签可包括给药的量、频率和方法。
适用于本发明的药用组合物包括组合物，其中含有有效量的活性成份来实现预期的治疗目的。熟练的医生能够使用本发明中所提供的技术和指导来确定治疗上有效的剂量。治疗剂量将取决于(除了其它因素之外)受试者的年龄和一般条件，异常凝血显型的严重性以及调节变异酶原/蛋白酶多肽的表达水平的控制序列的强度。因此，对于人来说治疗上有效量将属于相对较宽的范围，这个范围可由医师基于个别患者对于基于载体的酶原/蛋白酶治疗的反应来确定。
D.给药
变异因子X多肽(单独地或与其它试剂组合地)可如上文所述在适当生物载体中输注到患者内。包含编码变异酶原/蛋白酶或其接合片段的核酸序列的本发明的表达载体可通过多种方式(参看下文)给予患者以实现并维持预防上和/或治疗上有效的酶原/蛋白酶多肽水平。本领域技术人员可容易地确定具体方案来将本发明的酶原/蛋白酶编码表达载体用于特定患者的治疗用药。用于产生腺病毒载体和向患者给药的方案在美国专利第5,998,205号、第6,228,646号、第6,093,699号、第6,100,242号和国际专利申请第WO 94/17810号和第WO94/23744号中描述，这些专利和专利申请以其全文引用的方式结合到本文中。
可通过任何已知的方式向患者给予本发明的变异酶原/蛋白酶编码腺病毒载体。一般可使用常规注射器经由注射在体内直接传递药用组合物，但也可以构想到其它传递方法，诸如对流增强型传递(参看，例如专利第5,720,720号)。就此而言，组合物可在皮下、表皮、皮内、鞘内、框内、黏膜内、腹腔内、静脉内、动脉内、经口、肝内或肌肉内传递。其它给药方式包括口服和肺部给药、栓剂和透皮应用。专门研究凝血障碍的患者治疗的临床医生可基于多种标准确定包含酶原/蛋白酶核酸序列的腺病毒载体的最佳给药途径，包括(但不限于)患者的条件和治疗的目的(例如，增强凝血或减轻凝血)。
本发明还涵盖包含编码变异酶原/蛋白酶多肽的核酸序列的AAV载体。
本发明还提供包括编码变异酶原/蛋白酶多肽的核酸序列的慢病毒或假型慢病毒载体。
本发明还涵盖包含编码变异酶原/蛋白酶多肽的核酸序列的裸质粒或表达载体。
实施例1
变异因子XA酶原/蛋白酶
为了实现激活而对前体血浆蛋白质的蛋白水解加工是凝血的标志(hallmark)。用于这种类型的激活机制的范式(paradigm)是在糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族中酶原到蛋白酶转变。在高度保守位点的键裂解(Arg15-Ile16；糜蛋白酶编号系统)显露出(unmask)用作Asp194的分子内配体的新N末端(图2)。这种新盐桥导致下列情形或与下列情形相关：所谓“激活域”，由SI特异性口袋、氧阴离子洞、自我催化水解环和钠结合位点组成的表面环的构象变化和排序(图3)。关于胰蛋白酶系统有文献确切记录(well documented)Ile16-Asp194内盐桥形成是变构地键合至SI特异性位点；即，在一个位点的变化影响另一位点，反之亦然。
有文献确切记录对于丝氨酸蛋白酶，特别是对于糜蛋白酶和胰蛋白酶，酶原到活性酶在结构水平转变的基本原理且这些实例用作丝氨酸蛋白酶家族的范式。一般方面可被总结成如下(参看图2)：1)酶原的结构(大约80％至85％)相对地类似于蛋白酶；2)在高度保守的N末端(例如，Ile16-Val-Gly-Gly19)释放后引发该转变；3)新的自由α-氨基(Ile16)埋入到疏水环境中且它的α-氨基氮与Asp194形成内部盐桥；4)在酶原激活时Asp194的位置显著地改变，旋转大约170°；以及5)这个内部盐桥导致以下情形或与以下情形相关：所谓“激活域”，由残基16-19、142-153、184-194和216-223组成且部分地包含S1特异性位点(nomenclature of Schechter and Berger(1967)Bochem.Biophys.Res.Comm.43：694-702)和氧离子洞的表面外露环的构象变化。各种研究表明酶原和成熟酶以平衡形式存在，且Keq＝～108，有利于酶原。Bode和他的同事已经详尽地验证胰蛋白酶原在强配体结合到S1特异性口袋或对Ile16裂缝具有强亲和力的合适配体时可采取活性胰蛋白酶样结构。这种不裂解Arg/Lys15-Ile16键的诱导的额外实例包括链激酶与纤溶酶原的结合，葡萄糖菌凝固酶与凝血酶原的结合和近来描述的自身抗体与凝血酶原的结合(Madoiwa等人(2001)Blood 97：3783-3789)。总体上这些研究表明丝氨酸蛋白酶，即使以其酶原形式，可根据各种环境条件(即，与酶原的强配体结合)采取蛋白酶样功能。
众所周知，FX的激活导致丝氨酸蛋白酶域中较大的构象变化，这种构象变化伴随着蛋白酶以更大亲和力结合S1导向探针和膜结合FVa(1-6)。控制丝氨酸蛋白酶转变的总分子机制一般被假定为遵循胰蛋白酶系统的分子机制。然而，并非是总是这种情况。单链tPA采用不同的分子策略来维持其酶原样状态(8-11)。对凝血所涉及的酶原/蛋白酶对(特别是FVII/FVIIa)所做的分析表明与胰蛋白酶系统(12)相比，在这种转变中存在若干不同之处。虽然FXa上的若干结构决定子是所谓激活域的一部分，但目前尚不清楚这些位点的形成是否与酶原到蛋白酶转变直接相关。然而，近来描述的酶原FX的模型暗示这些元件中的若干元件在酶原(13)中可能是无序的(disordered)。酶原模型与活性酶的比较显示出组成Ca2+(Asp70-Glu80)、Na+(Ala183-Asp194；Gly219-Gly226)和自我催化水解环(Thr144-Arg150)的残基在酶原到蛋白酶的转变时在其骨架位置经历较大的变化。由于已有文献记录，至少对于胰蛋白酶原/胰蛋白酶，S1特异性位点和Ile16-Asp194的形成变构地相关，因此合理地假设激活域的其它元件也与酶原到蛋白酶转变相关。在本实施例中，设计了实验来测试以下假设：通过对位置16、17或194做出变化使Ile16-Asp194内部盐桥失稳来改变活性位点裂缝，造成所得变异体为“酶原样”的。还假设这些变化将变构地调节FVa结合。
材料和方法
因子Xa的表达
虽然关于的rFX的表达在文献中已有若干报道，但大多数依赖截短版本(truncated version)或并未提供足够的表征(15-20)。我们在HEK 293细胞中表达rFX的初步尝试得到条件培养基的1-2mg rFX/L范围的表达水平；然而，发现所产生物质的仅10％至40％被完全γ-羧化(21)。其余物质显示未γ-羧化。利用维生素K依赖性前肽对于羧化酶的不同结合亲和力且假设由于凝血酶原前肽展示对于羧化酶的最低的亲和力，交换FX的前肽(最高亲和力)与凝血酶原的前肽可通过允许更大的底物周转(turnover)而增加γ-羧化(22、23)。使用这种新的载体，选择HEK 293细胞的稳定转染体，将其扩增，且通过免疫亲和力色谱来纯化rFX。自羟基磷灰石的磷酸盐洗脱液用于将羧化物质与非羧化物质分开。与使用天然FX前肽的10％至40％相比，现从超过30个稳定细胞系所获得的结果表明平均大约80％至90％的rFX被完全γ-羧化。这些结果近来被发表且这种策略随后被至少一个其它实验室采用(24，25)。因此，使用这种新的表达系统，现能产生毫克量(来自大约10L条件培养基的15-25mg完全γ-羧化rFX)的蛋白质用于详细结构/功能研究。
酶测定
利用对硝基苯基对胍基安息香酸酯(IIa)或荧光素单-对胍基安息香酸酯(FXa)通过活性位点滴定来确定酶浓度(26、27)。如先前所述的样，从Spectrozyme FXa、S-2222或S-2765的初始水解速率来测量在存在或不存在各种抑制剂情况下的FXa显色底物活性。将通过初始速率数据与适当方程式的最小二乘拟合来确定动力学参数。
FXa变异体的产生
使用定点突变试剂盒(Quick-change site-directed mutagenesiskit)(Stratagene)来产生FX突变体且整个FX cDNA被测序以验证产物的身份(identity)。使用Lipofectamine-2000将各种质粒瞬时转染至HEK 293细胞内。转染后48小时，收集培养基且使用FX特异ELISA来确定FX抗原水平并且在用RVV-X或用组织因子-FVIIa激活前通过显色测定来评价FXa活性。
结果
在表1中概述了沿着酶原-蛋白酶转变途径分布的FXa种类的产生。瞬时转染结果表明产生了一系列FXa变异体，这些FXa变异体具有可变的活性量，范围在约25％至＜1％。假设这些活性差异可能反映FX变异体，FX变异体沿着酶原至蛋白酶转变而转化为不同的程度。换言之，取决于在位置16、17或194的氨基酸，Ile16-Asp194内部盐桥稳定为不同的程度。选择这些变异体中的三个(rFXaI16L、FXal16G和FXaV17A)来进一步表征。
表1：用RVV-X和TF-FVIIa的各种rFX变异体激活
a 抗原水平从FX特异性ELISA计算且被表达为nM FX
b FX活性水平是基于用给定FX变异体的RVV-X或TF-FVIIa激活后肽基底物水解速率且将初始水解速率与FXa标准曲线相比较
c ％wt值是基于与wt-FXa活性水平的比较。这些值被调整用于抗原水平。
形成HEK293细胞中稳定细胞系且从10L的条件培养基纯化这些酶原中的每个酶原(14、24)。利用RVV-X来激活这些变异体且随后用凝胶过滤色谱来纯化(14、24)。在图4中示出激活前和激活后(还原和未还原)的变异体的SDS-PAGE。
首先集中注意力于评估使用靶向FXa的这个区域的特异性探针对这些变异体中每个变异体的活性位点环境做出的改变。使用肽基底物和活性位点导向探针所进行的动力学研究表明FXal16L和FXaV17A具有减弱的结合这些探针的能力(Km或Ki增加15至25倍)而与野生型FXa(血浆来源的和重组的)相比，催化作用的速率(kcat)减小3倍(表2和表3)。因子Xa I16G并不受到所检查的这些探针中的任一个探针的抑制且其显色活性严重减弱(500至1000倍)，排除动力学参数的计算。这些数据符合内部盐桥形成(Ile16-Asp194)的失稳影响在S1特异性位点结合的构思。与这些结果相反，FXaI16L和FXaV17A组装到凝血酶原酶中几乎完全恢复肽基底物的Km而Kcat仍减小3倍，表明FVa结合可挽救在活性位点的结合(表2和表3)。令人意外地，当组装到凝血酶原酶中时甚至I16G的Km值也几乎完全恢复(与野生型FXa相比3倍增加)；然而，发现kcat减小60倍。
表2：显色底物裂解的动力学常数
对于其中使用自由因子Xa的实验，利用增加浓度的SpectrozymeFXa来培育2.0nM野生型或6.0nM突变体因子Xa且对于其中采用凝血酶原酶的实验用30nM因子Va、50μM PCPS和增加浓度的底物(10至500μM)来培育5.0nM的野生型或突变体因子。通过监视在405nm随着时间的吸光率来评价显色活性。拟合常数误差表示95％的置信限度。
与这些资料一致，使用凝血酶原所进行的动力学研究显示出对于这些组装进凝血酶原酶中的每一个变异体所获得的Km值基本上等效于野生型酶，而Kcat值减小到与显色底物相同的程度(表4)。总之，我们的这些结果表明对于FX，酶原到蛋白酶转变仅影响S1位点的形成，但也很大程度上有助于FVa结合位点的形成。由于这些FXa变异体至FVa的直接结合挽救了在S1位点的结合，变构键合可能存在于这些位点之间。总起来说，这些研究说明了将酶原修饰为蛋白酶的转变途径的独特方式且显示出了发展酶原样形式酶的一种可能方式，酶原样形式酶在强配体结合诸如辅因子蛋白质后被“激活”。
表3：FXa和凝血酶原酶抑制的动力学常数
表4：凝血酶原裂解的动力学常数
Km±SD Vmax/Et±SD Vmax/Et·Km
酶种类
(μM) (nM lla/min/nM E) (μM-1·s-1)
pdFXa 0.42±0.02 2424±54 96
rFXa 0.35±0.01 1937±26 92
FXaV17A 0.47±0.03 887±26 3X 31
FXaI16L 0.31±0.02 619±14 33
利用显色底物和活性位点导向抑制剂所获得的结果表明酶原样的FXa变异体以减弱的亲和力结合到活性位点探针。然而，这些变异体组装到凝血酶原酶中显著地改进了活性位点探针的亲和力，暗示出FVa结合可挽救在活性位点的结合。下面研究反过程是否也可行，对酶原样活性位点的占据影响与FVa的结合。为了评估这种假设，测量FVa与FXaI 16L与FXaV 17A的结合常数。为了达成这个目的，在存在合成磷脂小囊和Ca2+离子的情况下利用无活性wtFXa的荧光衍生物来培育FVa。复合物的形成导致荧光信号仅相对于荧光FXa增加。然后添加逐渐增加浓度的非荧光FX，如果其可结合FVa，那么置换荧光FXa，导致荧光信号的减少。作为对照，添加S195 A FXa作为竞争剂。这个突变体是无活性的，因为其缺少催化三联体的Ser，但是对于FVa具有较高的亲和力(表5)。相反，与FXaS 195A相比，添加FXaI16L或FXaV17A，这些酶原样变异体对于FXa的亲和力显著地减小(表5)。下面检查FXaI16L的活性位点的共价占据是否能够恢复与FVa的结合。为此，利用不可逆的抑制剂(EGR-氯甲基酮)修饰野生型FXa和FXaI16L的活性位点，然后重复实验。数据显示出活性位点阻断的FXaI16L 以与野生型活性位点阻断的FXa相同的亲和力结合FVa膜。这表明酶原样FXa活性位点的占据对与FVa的结合具有直接影响。
表5：凝血酶原酶组装的平衡结合常数
基于酶原样FXa衍生物在不存在FVa的情况下与活性位点导向探针和抑制剂具有较差的反应性，但当变异体组装到凝血酶原酶中时显然接近正常活性的观察，下面评价FxaI16L在血浆环境中的活性。血友病A(未显示出数据)或B血浆中掺入(spike)野生型FXa以校正这些血浆的凝结时间(aPTT)；0.1nM wtFXa给出大约32秒的凝结时间。添加相同浓度的FxaI16L给出大约42秒的凝结时间，其为相对于wtFXa的大约50％至大约70％的活性，暗示出酶原样变异体在血浆中具有几乎正常的凝结活性。之后监视野生型FXa和FXaI16L在血友病B血浆中的半衰期。向HB血浆添加蛋白质且在不同的时间点，提取混合物的等分试样且在基于aPTT的测定中进行测定。HB血浆的结果显示出野生型FXa的相对残余活性被很快地(＜22分钟)抑制。相反，FxaI16L的活性持续更久的时间，且具有＞2小时的估计半衰期。对于血友病A血浆发现类似的结果。这些结果暗示出可能调节酶的特征使得其在血浆中具有较长的半衰期且可校正血友病血浆的凝结时间。
下面评价酶原样FXaI16L在血友病的鼠模型中调节止血的能力(Schlachterman等人，J.Thromb.Haemost.，3，2730-2737)。血友病B小鼠的aPTT值(C57BL/6)大约为50至55秒。因子XaI16L(200μg/kg；n＝7)或PBS(n＝4)经由血友病B小鼠的尾静脉注射。在选定的时间点(5和30分钟)收集血液且对所有样品执行aPTT。如图7所示，FXaI16L的输注导致将aPTT完全校正为正常动物中可见的水平。这种效应维持至少30分钟，表明分子具有相对较长的体内半衰期。PBS的输注仅具有边际效应。这些数据与上文的体外血浆实验一致且表明FXaI16L和可能其它酶原样FXa变异体确实可以有效地调节体内止血。
为了进一步测试FXaI16L在体内的有效性，检查这种分子在血友病B小鼠尾部受伤后能否校正血友病B小鼠的出血时间(Schlachterman等人，2005，J.Thromb.Haemost.，3，2730-2737)。在切割尾部的远端部分后10分钟的时段期间测量失血量。在这种类型的测定中，在尾部受伤后，在正常野生型Balb-c小鼠(n＝7)的血液损失最小，PBS注射的(n＝6)血友病B小鼠(BaIb c)中的血液损失量相当大(quite substantial)(图8)。相反，在尾部受伤后，450μg/kg的FXaI16L的注射显著地减小失血总量(n＝7)。总之，这些数据提供FXaI 16L具有改进血友病A或B患者中止血的能力的证据。
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虽然在上文中描述且具体地例示了本发明的优选实施方案中的某些实施方案，但是本发明并不限于这些实施方案。在不偏离如下文的权利要求书所述的本发明的范畴和精神的情况下可以对本发明做出各种修改。
序列表
<110>Camire，Rodney M.
<120>Compositions and Methods for ModulatingHemostasis
<130>CHOP.0267B-PCT
<140>PCT/USO6/O60927
<141>2006-11-15
<150>60/736,680
<151>2005-11-15
<160>2
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>488
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>1
Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gln Ala Asn
20 25 30
Asn Ile Leu Ala Arg Val Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met
35 40 45
Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr
50 55 60
Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe
65 70 75 80
Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln
85 9O 95
Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys
100 105 110
Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu
115 120 125
Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln
130 135 140
Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn
145 150 155 160
Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr
165 170 175
Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly
180 185 190
Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu
195 200 205
Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln
210 215 220
Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu
225 230 235 240
Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu
245 250 255
Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu
260 265 270
Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val
275 280 285
Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu
290 295 300
Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp
305 310 315 320
Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met
325 330 335
Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr
340 345 350
Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His
355 360 365
Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr
370 375 380
Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln
385 390 395 400
Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln
405 410 415
Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe
420 425 430
Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys
435 440 445
Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg
450 455 460
Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu
465 470 475 480
Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys
485
<210>2
<211>1467
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(703)...(711)，(1252)...(1254)
<223>n＝a，t，c，或g
<400>2
atggggcgcc cactgcacct cgtcctgctc agtgcctccc tggctggcct cctgctgctc 60
ggggaaagtc tgttcatccg cagggagcag gccaacaaca tcctggcgag ggtcaggagg 120
gccaattcct ttcttgaaga gatgaagaaa ggacacctcg aaagagagtg catggaagag 180
acctgctcat acgaagaggc ccgcgaggtc tttgaggaca gcgacaagac gaatgaattc 240
tggaataaat acaaagatgg cgaccagtgt gagaccagtc cttgccagaa ccagggcaaa 300
tgtaaagacg gcctcgggga atacacctgc acctgtttag aaggattcga aggcaaaaac 360
tgtgaattat tcacacggaa gctctgcagc ctggacaacg gggactgtga ccagttctgc 420
cacgaggaac agaactctgt ggtgtgctcc tgcgcccgcg ggtacaccct ggctgacaac 480
ggcaaggcct gcattcccac agggccctac ccctgtggga aacagaccct ggaacgcagg 540
aagaggtcag tggcccaggc caccagcagc agcggggagg cccctgacag catcacatgg 600
aagccatatg atgcagccga cctggacccc accgagaacc ccttcgacct gcttgacttc 660
aaccagacgc agcctgagag gggcgacaac aacctcacgc gtnnnnnnnn nggccaggaa 720
tgcaaggacg gggagtgtcc ctggcaggcc ctgctcatca atgaggaaaa cgagggtttc 780
tgtggtggaa ctattctgag cgagttctac atcctaacgg cagcccactg tctctaccaa 840
gccaagagat tcaaggtgag ggtaggtgac cggaacacgg agcaggagga gggcggtgag 900
gcggtgcacg aggtggaggt ggtcatcaag cacaaccggt tcacaaagga gacctatgac 960
ttcgacatcg ccgtgctccg gctcaagacc cccatcacct tccgcatgaa cgtggcgcct 1020
gcctgcctcc ccgagcgtga ctgggccgag tccacgctga tgacgcagaa gacggggatt 1080
gtgagcggct tcgggcgcac ccacgagaag ggccggcagt ccaccaggct caagatgctg 1140
gaggtgccct acgtggaccg caacagctgc aagctgtcca gcagcttcat catcacccag 1200
aacatgttct gtgccggcta cgacaccaag caggaggatg cctgccaggg gnnnagcggg 1260
ggcccgcacg tcacccgctt caaggacacc tacttcgtga caggcatcgt cagctgggga 1320
gagggctgtg cccgtaaggg gaagtacggg atctacacca aggtcaccgc cttcctcaag 1380
tggatcgaca ggtccatgaa aaccaggggc ttgcccaagg ccaagagcca tgccccggag 1440
gtcataacgt cctctccatt aaagtga 1467
Claims (21)
1.一种因子X/因子Xa酶原/蛋白酶变异体，其调节止血。
2.根据权利要求1所述的变异酶原蛋白酶，其中所述变异体为SEQ ED NO：2所编码的因子X/因子Xa变异体，其中SEQ ED NO：2的核苷酸1684-1695可编码任何氨基酸，限制条件为核苷酸1684-1686不编码Val或Ala。
3.根据权利要求1所述的变异酶原/蛋白酶，其在SEQ ID NO：1中含有选自下列修饰中的至少一个修饰：
a)在位置16的Ile为Leu、Phe、Asp或Gly；
b)在位置17的Val为Leu、Ala或Gly；以及，
c)在位置194的Asp为Asn或Glu。
4.一种编码根据权利要求3所述的变异酶原/蛋白酶的核酸，所述核酸任选编码细胞内PACE/弗林蛋白酶裂解位点。
5.根据权利要求3所述的核酸，其具有序列SEQ ID NO：2；其中在位置1684-1695的所述核苷酸编码选自Leu-Val-Gly、Gly-Val-Gly、Ile-Ala-Gly、Phe-Val-Gly和Ile-Gly-Gly的所述氨基酸，所述核酸任选包含在位置2233-2235的核苷酸，其编码选自Asn或Glu的氨基酸。
6.一种根据权利要求5所述的核酸所编码的变异酶原/蛋白酶。
7.一种药用组合物，其在生物相容性载体中包含根据权利要求3所述的因子Xa变异体。
8.根据权利要求4所述的核酸，其被克隆到表达载体内。
9.根据权利要求8所述的载体，其选自：腺病毒载体、腺病毒相关载体、逆转录病毒载体、质粒和慢病毒载体。
10.一种用于治疗需要所述治疗的患者的与止血相关的疾病的方法，包括给予在生物上可接受的载体中的治疗上有效量的根据权利要求3所述的酶原/蛋白酶。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述变异体是前凝血剂且所述疾病选自：血友病A和B，与抑制抗体相关联的血友病A和B，凝血因子缺乏症，维生素K环氧化物还原酶C1缺乏症，γ羧化酶缺乏症，与外伤、损伤、血栓形成、血小板减少、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)相关联的出血，过度抗凝血治疗疾病，伯-苏综合征，Glanzman血小板无力症以及贮存池缺损。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述凝血因子是选自下列因子中至少一个：因子VII、因子IX、因子X、因子XI、因子V、因子XII、因子II和血管性血友病因子。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述过度抗凝血治疗疾病是由于肝素、低分子量肝素、五糖、华法林、小分子抗血栓药和FXa抑制剂的给药造成。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述变异体是抗凝血剂且所述疾病选自血栓形成、血小板减少、中风和凝血病。
15.根据权利要求10所述的方法，其中在SEQ ID NO：2中位置16、17、18的所述氨基酸选自Leu-Val-Gly、Gly-Val-Gly、Ile-Ala-Gly、Phe-Val-Gly和Ile-Gly-Gly且在位置194的氨基酸选自Asn和Glu。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述变异体以大约10-500μg/kg的剂量一天至少静脉内给药一次。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述变异体以大约10-250μg/kg的剂量一天至少静脉内给药一次。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述变异体被囊封于脂质体中或与磷脂或与胶束混合。
19.一种表达根据权利要求3所述的酶原/蛋白酶变异体的宿主细胞。
20.根据权利要求3所述的变异酶原/蛋白酶，其中所述变异体展示对于活性位点较低的结合亲和力，当与适当辅因子结合时可以恢复所述结合亲和力。
21.根据权利要求20所述的变异体，其中所述辅因子是因子Va。
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