CN106536566A

CN106536566A - 用于出血治疗的促止血蛋白

Info

Publication number: CN106536566A
Application number: CN201580039023.6A
Authority: CN
Inventors: 丹尼尔·韦尔赫夫; 彼得·H·雷特斯马; 梅蒂·H·A·博斯
Original assignee: OctoPlus Technologies BV
Current assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC; OctoPlus Technologies BV
Priority date: 2014-05-26
Filing date: 2015-05-26
Publication date: 2017-03-22
Also published as: ZA201608017B; RS60706B1; PL3149163T3; WO2015183085A1; US10537618B2; AU2021203838B2; JP2017522900A; US11357836B2; SG11201609811TA; EA201692161A1; KR20170020332A; NZ764611A; EP3149163B1; ES2813440T3; LT3149163T; AU2021203838A1; NZ727444A; US20200138916A1; CA2949349A1; MX2020013410A

Abstract

本发明涉及可以用作解毒剂的重组FXa多肽，其完全或部分逆转受试者中凝血抑制剂，优选地直接因子Xa抑制剂的抗凝血作用。本文公开了重组因子Xa蛋白以及完全或部分逆转受试者中凝血抑制剂的抗凝血作用的方法。

Description

用于出血治疗的促止血蛋白

技术领域

本发明属于医疗领域。具体地，本发明属于治疗、预防或改善由调节止血反应所引起的出血并发症的领域。

背景技术

全世界有数百万的患者需要抗凝血药来预防性控制心房颤动中的中风或者预防和治疗静脉血栓形成。预防通常以香豆素-类口服抗凝血维生素K拮抗剂(VKA's)如华法林(Warfarin)、醋硝香豆醇(Acenocoumarol)和苯丙香豆素(Phenprocoumon)为中心，其阻断维生素K-依赖性血液凝固因子的合成。此外，抗凝血药包括靶标特异性抗凝血剂，如达比加群(dabigatran)，其抑制凝血酶，凝血酶是将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白丝的丝氨酸蛋白酶。使用所谓的解毒剂对抗凝血作用的有效逆转是安全药物使用的必要条件。考虑到仅在荷兰，每年有超过10,000位抗凝血剂治疗的患者遭受不利的严重出血事件，包括多达2,000例死亡，这是特别重要的(Adriaansen H.等人,“Samenvatting MedischeJaarverslagen van de Federatie van Nederlandse Trombosediensten”,2011；1-44)。

预防过度抗凝血的现有抗凝血剂-解毒剂对为肝素-鱼精蛋白和华法林-维生素K。已表明了含有维生素K-依赖性凝血因子II、IX、X(3-因子PCC)或者II、VII、IX、X(4-因子PCC)和不同量的蛋白C和S的凝血酶原复合物浓缩物(PCC)对华法林-相关作用的逆转(参见，例如，Frumkin,Ann Emerg Med,2013,62:616-626)。新鲜冰冻血浆和重组因子VIIa(rfVIIa)也在低分子量肝素治疗且经受重大创伤或严重出血的患者中用作非特异性解毒剂(Lauritzen等人,2005.Blood 106:Abstract 2149,607A-608A)。还报道了鱼精蛋白片段(美国专利号6,624,141)和小合成肽(美国专利号6,200,955)作为肝素或低分子量肝素解毒剂；和凝血酶突变蛋白(美国专利号6,060,300)作为凝血抑制剂的解毒剂。已报道了凝血酶原中间体和衍生物作为水蛭素及其它凝血抑制剂的解毒剂(美国专利号5,817,309和6,086,871)。尽管没有可靠的临床数据，但是优选地，用非特异性逆转剂激活的凝血酶原复合物浓缩物(APCC)治疗达比加群-相关的严重出血(Siegal等人,2014.Blood 123:1152-1158)。

新近开发的直接因子Xa(FXa)抑制剂(DFXI)，如利伐沙班，阿哌沙班和依度沙班是抗凝血剂并且由于它们快速的治疗有效性，易于剂量给予以及由于较少药物和食品相互作用和可预测的药物动力学而不需要监控，在不久的将来它们很大程度上可以替代经典的VKA。DFXI是小化合物抑制剂，其被特异性设计为紧密结合并终止凝血FXa的活性。凝血FXa是必需的丝氨酸蛋白酶，其通常作为～60kDa的无活性前体(酶原)凝血因子X(FX)在血液中循环，但是一旦血管受损，则在统称为凝血级联系统的一系列复杂的蛋白质激活步骤中转化为其活性蛋白酶的形式。该系统的中心是被称为凝血酶原酶复合物的辅因子-蛋白酶复合物的形成，其由与辅因子Va(FVa)结合的凝血FXa组成，它只在带负电荷的磷脂膜上组装并且将无活性的凝血酶原转化为活性丝氨酸蛋白酶凝血酶。

使用DFXI的主要缺点在于没有特异性以及适当的逆转策略来预防和终止与其抗凝血疗法有关的潜在的危急生命的出血并发症。

由于DFXI抑制游离和凝血酶原酶结合的凝血FXa两者(European MedicinesAgency,2008.CHMP assessment report for Xarelto,Procedure No.EMEA/H/C/000944.Doc.Ref.:EMEA/543519/2008)，因此，正常止血的有效修复将需要循环的凝血FXa的完全替换或从血液中有效除去抑制化合物。

目前，没有特异性逆转策略来预防和终止与可用的DFXI疗法有关的潜在的危急生命的出血并发症。在生命支持和手术疗法之后，可以基于有限证据考虑使用3-和4-因子PCC的非特异性逆转疗法(Siegal等人,2014.Blood 123:1152-1158；Levi等人,2014.JThrombosis Haemostatis,在线公开8May 2014；doi:10.1111/jth.12599)。正在开发对DFXI-相关出血特异的逆转策略，其基于通过结合并因此捕获循环DFXI，从而使内源凝血FXa正常参与凝血的用于DFXI的诱骗剂的重组FXa(andexanet alpha)的无催化活性形式(Lu等人,2013.Nature Medicine 19:446)。该方法不利之处在于需要给予高剂量的andexanet alpha，这是因为需要达到抑制的化学计量浓度(临床III期试验中，400mg IV丸剂；Portola News Release March 19,2014)。此外，由于DFXI的半衰期部分取决于肾清除率，因此在肾衰竭的情况下，捕获所有循环抑制分子所需的诱骗FXa的量甚至可能更高。该逆转策略不提供快速且直接的促凝血反应，这是因为该反应取决于游离、内源凝血FXa的产生。

目前，仍没有预防和终止与DFXI抗凝血疗法有关的潜在的危急生命的出血并发症的直接、适当的逆转策略。

发明内容

本发明通过提供作为防止和终止潜在危急生命的与DFXI抗凝血疗法有关的出血并发症的合适的逆转策略的重组蛋白质解决了该问题，重组蛋白质包括或由以下物质组成：哺乳类动物，优选地灵长类，更优选地人凝血FXa多肽，所述多肽在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间，优选地SEQ ID NO：1的Glu-297和Asp-320之间，更优选地SEQ IDNO：1的Val-305和Asp-320之间并且最优选地SEQ ID NO：1的His-311和Asp-320之间或His-311和Tyr-319之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中具有改变，其中改变为至少一个氨基酸残基的插入和/或替换和/或缺失，优选地，至少一个氨基酸残基的插入。出于清楚的目的，氨基酸残基编号基于如SEQ ID NO：1中所提供的人凝血FX氨基酸序列。

已发现在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320的Gly和Asp之间的区域处具有改变的氨基酸组成的催化活性的人凝血FXa作为促凝剂参与凝血级联系统，其中与不具有所述改变的氨基酸组成的凝血FXa相比，所述因子对DFXI的抑制具有降低的敏感性。因此，本发明提供了不依赖于游离、内源凝血FXa产生的促凝血解毒剂，并且提供了预防和终止与DFXI抗凝血疗法有关的并发症的快速且直接的逆转策略。

SEQ ID NO：1中提供了人凝血FX的氨基酸序列，并且氨基酸序列可以在<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/aAAH46125.1>以“AAH46125.1”在中找到。该序列中的氨基酸残基编号基于人凝血FX序列。具有SEQ ID NO：1中所列序列的凝血FX是前体，其含有前原前导序列(prepro-leader sequence)(SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-40)，然后是对应于凝血FX轻链的序列(SEQ ID NO：1的氨基酸残基41-179)，在凝血FX分泌期间除去的RKR三联体(SEQ ID NO：1的氨基酸残基180-182)和含有激活肽(AP)(SEQ ID NO：1的氨基酸残基183-234)和催化丝氨酸蛋白酶域(SEQ ID NO：1的氨基酸残基235-488)的凝血FX重链(SEQ ID NO：1的氨基酸残基183-488)。

人凝血FX的成熟尤其涉及蛋白水解切割以及高尔基体中的翻译后修饰。成熟FX蛋白为双链分子，其由通过二硫键连接的轻链和重链组成(Uprichard等人,2002.BloodReviews 16:97-110)。通过SEQ ID NO：1的Arg-234和Ile-235之间重链上肽键的切割激活成熟人凝血FX，从而从凝血FX的重链释放52-残基激活肽。所得二硫键-连接的轻链和截短重链构成激活的FXa多肽。

SEQ ID NO：2中提供了人凝血FXa的轻链的氨基酸序列。SEQ ID NO：3中提供了人凝血FXa的重链的氨基酸序列。

如本文所使用的术语“重组”是指使用本领域技术人员已知的重组DNA技术产生的蛋白质。重组凝血FX或FXa多肽还表示为rFX或rFXa。重组蛋白质优选地不同于天然蛋白质，例如，由于氨基酸组成不同和/或由于翻译后修饰中的差异，如糖基化作用。

如本文所使用的术语“改变”是指至少一个氨基酸残基的插入和/或替换和/或缺失。所述改变优选地为至少一个氨基酸的插入。

如本文所使用的短语“包含凝血FXa多肽的重组蛋白质”表示涵盖了包含优选地哺乳动物，更优选地灵长类，并且最优选地人源的重组凝血FXa多肽的蛋白质。短语包括(例如)重组哺乳动物前体蛋白质，如人凝血FX，其被处理和/或激活成哺乳动物凝血rFXa多肽。因此，本发明的蛋白质优选地为重组哺乳动物，优选地灵长类，更优选地人凝血FX，其在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间，优选地SEQ ID NO：1的Glu-297和Asp-320之间，更优选地SEQ ID NO：1的Val-305和Asp-320之间并且最优选地SEQ ID NO：1的His-311和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中具有至少一个氨基酸残基的插入和/或替换和/或缺失，优选地插入。另外，所述短语包括在凝血rFXa多肽之外包含一个或多个其它氨基酸序列，例如，构成标签的氨基酸序列，例如，如EP0150126中描述的FLAG标签和/或一个或多个其它鉴别肽的蛋白质。

因此，在一个实施方式中，包含根据本发明的凝血FXa多肽的重组蛋白质是凝血因子X多肽，所述多肽在对应于Gly-289和Asp-320之间，优选地SEQ ID NO：1的His-311和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中具有改变；其中改变是至少一个氨基酸残基的插入。

如本文所使用的术语“凝血FX”是指非活性凝血FX前体蛋白质。技术人员已知凝血FX也称为前原蛋白FX。如本文所使用的，凝血FX包含凝血FXa多肽。

如本文所使用的术语“成熟凝血FX”是指由通过二硫键连接的轻链和重链组成的非活性凝血FX蛋白。该FX蛋白也称为前蛋白FX或酶原FX。如本文所使用的，成熟凝血FX包含凝血FXa多肽。

本发明的蛋白质优选地包含或者为哺乳动物，优选地灵长类，更优选地人或人源化凝血FXa多肽，其在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中具有至少一个氨基酸残基的插入和/或替换和/或缺失，优选地插入。

如本文所使用的术语“人源化”是指一个物种的蛋白的(优选地)外部氨基酸残基替换或人源化为存在于该蛋白的人同源物中的氨基酸残基，从而当应用于人时，第一物种的蛋白将不会成为免疫原性的或是较低免疫原性的。外部残基的替换优选地对内部域或轻链和重链之间接触的域间具有较低影响或无影响。将非人源，优选地哺乳动物源，更优选地灵长类源的本发明的蛋白优选地人源化以降低所述蛋白在人中的免疫原性。

本发明的非人蛋白优选地包含人源化哺乳动物，更优选地人源化灵长类凝血FXa多肽，这是因为一旦在人体中给予，与包含非人源化凝血FXa多肽的本发明的蛋白质相比，预期抗原性反应风险较低。

在人源化蛋白的背景中，可以关注适用于抗体的人源化方法。该方法利用了Kabat等人(1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,Bethesda,Md.,National Institutes of Health，更新至该数据库以及其它可访问的美国和外国数据库(核酸和蛋白质两者)汇编的人抗体可变域的可用序列数据。用于产生人源化抗体的这些方法的非限制性实例包括EP519596；美国专利第6,797,492；以及在Padlan等人,1991.MolImmunol 28:489-498中的描述。进一步举例说明了非人蛋白质的人源化的方法，Sarkar等人,2012,Journal of Lipids,Article ID 610937,p.1-13描述了通过改变该酶表面以反映人序列，成功地将对氧磷酶-1(Paraoxonase-1)人源化。

术语“凝血FXa多肽”是指凝血FX的催化活性形式。通过从成熟凝血FX的重链切割激活肽获得所述凝血FXa多肽。凝血FXa多肽激活凝血酶原并因此促进凝血。在本发明的背景中，如果它是促凝血丝氨酸蛋白酶并且如果所述蛋白质的全长氨基酸序列包含对应于在不同物种的凝血FX因子之间保守的氨基酸残基延伸或单个氨基酸残基的氨基酸残基延伸或单个氨基酸残基，如图8中所示，则该蛋白是凝血FXa多肽。例如，包含含有对应于SEQ IDNO：1的氨基酸残基Cys-246至Ala-250、Phe-260至Leu-266和/或Asp-413至His-423的氨基酸残基延伸的多肽的促凝血丝氨酸蛋白酶假定为凝血FXa多肽。优选地，通过根据本发明的重组蛋白质的局部和/或部分施加获得所述凝血FXa多肽。确定蛋白质是否是丝氨酸蛋白酶的方法在本领域中是已知的并且包括序列比较以及例如，Sigma-Aldrich的蛋白酶检测试剂盒的使用。

如本文所使用的术语“哺乳动物凝血FXa多肽”是指内源存在于哺乳动物，优选地灵长类，更优选地人中的凝血FXa多肽。

如本文所使用的术语“凝血抑制剂”是指抗凝血试剂。术语“凝血抑制剂”包括但不限于(i)刺激抗凝血酶活性的试剂，如肝素，(ii)香豆素-类口服抗凝血维生素K拮抗剂，如华法林、醋硝香豆醇和苯丙香豆素以及(iii)DFXI。

如本文所使用的术语“DFXI”是指直接FXa抑制剂，例如，口服直接FXa抑制剂。DFXI是小化合物抑制剂，其结合并终止凝血FXa的活性。DFXI的组包括但不限于利伐沙班(5-氯-N-[[(5S)-2-氧-3-[4-(3-氧-4-吗啉基)苯基]-5-噁唑烷基]甲基]-2-噻吩甲酰胺)、阿哌沙班(1-(4甲氧基苯基)-7-氧-6-[4-(2-氧代哌啶-1-基)苯基]-4,5,6,7-四氢-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-3-甲酰胺)、依度沙班(N'-(5-氯吡啶-2-基)-N-[(1S,2R,4S)-4-(二甲基氨基甲酰基)-2-[(5-甲基-6,7-二氢-4H-[1,3]噻唑并[5,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]环己基]草酰胺；4-甲基苯磺酸)、贝曲西班(N-(5-氯吡啶-2-基)-2-[[4-(N,N-二甲基甲脒基))苯甲酰基]氨基]-5-甲氧基苯甲酰胺)、达瑞沙班(N-[2-[[4-(六氢化-4-甲基-1H-1,4-二氮杂卓-1-基)苯甲酰基]氨基]-3-羟苯基]-4-甲氧基苯甲酰胺)、奥米沙班(甲基(2R,3R)-2-[(3-甲脒基苯基)甲基]-3-[[4-(1-氧化吡啶-1-鎓-4-基)苯甲酰基]氨基]丁酸酯)、伊利巴西班((2R,4R)-1-N-(4-氯苯基)-2-N-[2-氟-4-(2-氧化吡啶-1-基)苯基]-4-甲氧基吡咯烷-1,2-二甲酰胺)、来他沙班(letaxaban)(1-[1-[(2S)-3-(6-氯代萘-2-基)磺酰基-2-羟基丙酰基]哌啶-4-基]-1,3-二嗪磷-2-酮、LY517717(N-[2-[4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪-1-基]-2-氧-1-苯乙基]-1H-吲哚-6-甲酰胺)和813893(N-环己基-N-[2-[(4-甲基-1,3-噻唑-2-基)氨基]-2-氧乙基]呋喃-2-甲酰胺)。术语“DOAC”(直接口服抗凝血剂)和“DFXI”在本文中可互换使用。

如本文所使用的术语“同源的”是指两条氨基酸序列之间氨基酸序列的同一性，其表示为两条氨基酸序列总长度的百分比。通过将氨基酸序列的单个氨基酸残基的同一性与另一条氨基酸序列中相应氨基酸残基相比较来确定序列同一性。

如本文所使用的术语“区域”是指通过两个氨基酸残基界定的氨基酸残基的延伸。如本文所应用的氨基酸残基的编号基于SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

如本文所使用的术语“插入”或“插入的”是指在天然凝血FXa多肽的特定区域中的氨基酸残基的添加，从而与天然凝血因子FXa多肽区域中的氨基酸残基的数目相比，提高了所述区域中氨基酸残基的数目。

如本文所使用的术语“替换”或“替换的”是指在凝血因子Xa多肽的特定区域或特定位点中的一个或多个氨基酸残基的取代，从而改变了氨基酸序列，但不改变所述区域中氨基酸残基的数目。替换是氨基酸残基的缺失，随后在相同位置插入不同的氨基酸残基的后果。

如本文所使用的术语“缺失”或“缺失的”是指在凝血因子Xa多肽的特定区域或特定位点的一个或多个氨基酸残基的缺失，从而降低了所述多肽的所述区域中氨基酸残基的数目。

如本文所使用的术语“天然凝血FXa多肽”是指内源凝血FXa多肽，其天然存在于动物，优选地哺乳动物，更优选地灵长类，更优选地人中。

如本文所使用的术语“氨基酸组成”是指氨基酸序列和氨基酸残基的延伸长度，其中通过该延伸中氨基酸残基的数目确定长度。

可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术进行一个或多个氨基酸残基的插入、替换和/或缺失，优选地插入。例如，本领域技术人员可以使用合成DNA，PCR技术和分子克隆来获得具有编码本发明的蛋白质的DNA序列的重组DNA构建体。在Green andSambrook,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,CSHL Press,2012中描述了适合的方法和方式。

短语“对应于之间的氨基酸残基区域”，例如，相对于“对应于SEQ ID NO：1的His-311和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域”，在本文中用于表示对应于SEQID NO：1的His-311和Asp-320的另一个凝血FXa的保守His和Asp残基的残基数目可以不同于归于SEQ ID NO：1中所述His和Asp残基的残基数目(参见图8)。氨基酸残基数目的差异可以例如由对氨基酸残基编号的方法的不同所造成。另外，氨基酸残基数目的差异可以由与图8中所示的人凝血FXa多肽的长度相比，凝血FXa多肽长度的差异造成。类似地，SEQ IDNO：1的氨基酸残基Gly-289、Glu-297、Val-305和Tyr-319在不同物种的凝血FXa多肽之间保守(参见图1和8)。因此，有可能鉴别对应于另一个凝血FXa多肽中的所述氨基酸残基的氨基酸残基。从而，本领域技术人员将理解对于本发明，如本文所应用的氨基酸残基的编号不是限制性的，而仅是出于清楚的目的应用。

技术人员将知道如何鉴别对应于界定如本文描述的区域的SEQ ID NO：1的所述保守氨基酸残基之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域。当将SEQ ID NO：1的氨基酸残基289-322与不同物种的凝血FXa多肽中相应氨基酸残基比对时，推断在不同物种，特别是在哺乳动物中的凝血FXa多肽中，尽管不相同，但是SEQ ID NO：1的位置289、297、305、311、313、314、318、319、320和322处的氨基酸残基是保守的，其中SEQ ID NO：1的Asp-322是高度保守的催化残基(糜蛋白酶原编号中的Asp-102；Bode等人,1989.EMBO Journal 8:3467-3475；Messier等人,1996.Blood Coagulation and Fibrinolysis 7:5-14和图1和8)。

由于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320中和周围或者非人凝血FXa中相应的Gly和Asp残基中或周围的氨基酸残基区域的高度保守性，本领域技术人员能够鉴别对应于SEQID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域。相同的一般原理适用于界定如本文描述的区域的其它氨基酸残基。换言之，特定氨基酸残基的保守性将为技术人员给出构成区域的氨基酸残基的清楚的指示。

本领域技术人员将理解本发明涉及对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间，最优选地His-311和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域的氨基酸组成。因此，本领域技术人员将理解在蛋白质保持或者激活为对DFXI的降低的敏感性促凝血FXa多肽的条件下，本发明的所述蛋白质的其余氨基酸序列可以改变。因此，本发明的蛋白质的所述其余序列可以改变，如(例如)它在不同物种的凝血FX多肽或凝血FXa多肽之间改变。

在不同物种的凝血FX蛋白之间，特别是在属于哺乳动物组或灵长类组的物种之间，在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间，优选地His-311和Asp-320之间的区域的区域中的氨基酸残基的数目是保守的。该区域也存在于酶原FX蛋白质和FXa多肽中。因此，在酶原FX蛋白质和FXa多肽中以及在酶原FX蛋白质和FXa多肽的相应区域中，氨基酸残基的数目也是保守的。在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的区域的氨基酸残基区域中，不包括Gly-289和Asp-320，所述保守的氨基酸残基数目为30。在对应于SEQ IDNO：1的His-311和Asp-320之间的区域的氨基酸残基区域中，不包括His-311和Asp-320，所述保守的氨基酸残基数目为8。

已发现在本发明的蛋白质中，对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间，优选地His-311和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中至少一个氨基酸残基的插入和/或替换和/或缺失，优选地插入获得了对DFXI抑制的具有降低敏感性的催化活性的凝血FXa。

已证明人FXa的Tyr-319是DFXI-配位残基(Roehrig等人,2005.J Med Chem 48:5900-5908；Pinto等人,2007.J Med Chem 50:5339-5356)，而SEQ ID NO：1的Asp-322存在于丝氨酸蛋白酶的催化位点中(Messier等人,1996.Blood Coagulation andFibrinolysis 7:5-14)。不受理论束缚，有可能在Gly-289和Asp-320之间的区域中改变的氨基酸残基，如至少一个氨基酸残基的插入与SEQ ID NO：1的DFXI-配位残基Tyr-319-或者相应酪氨酸-的紧密靠近-和/或与催化域的紧密靠近导致了对DFXI的降低的敏感性。已发现在本发明的蛋白质中，对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域可以在氨基酸残基数目和氨基酸序列中发生改变，从而产生具有对DFXI的降低的敏感性的催化活性的凝血FXa。

所述改变选自SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间区域中插入、替换和/或缺失，并且优选地插入，更优选地，插入与至少一个氨基酸的改变的组合。

特别优选的是其中插入为1-50，优选地1-20个氨基酸残基的本发明的蛋白质。在本发明的蛋白质中，对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间，优选地His-311和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中的插入包含1-50，优选地，1-20个氨基酸残基或由其组成。插入优选地包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基或由其组成，从而分别导致在His-311和Asp-320之间产生总计9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20、21、22、23、24、25、26、27或28个氨基酸。特别优选的是至少5个氨基酸残基的插入，如9、12或13个氨基酸残基的插入。本领域技术人员将理解可以在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中的任何位置处插入氨基酸残基。适合于插入的氨基酸残基选自表1所列的20种氨基酸残基的组。本领域技术人员将理解所述插入的氨基酸残基可以经历体内或体外的翻译后化学改变。如上文的描述，本领域技术人员可以使用合成DNA、PCR技术和分子克隆来获得重组DNA构建体，构建体具有编码本发明的蛋白质的DNA序列，其在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的区域的氨基酸残基区域中具有1-50个氨基酸残基之间的插入。

在本发明的蛋白质中对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中的插入优选地在SEQ ID NO：1的Thr-315和Lys-316之间，Lys-316和Glu-317之间，Glu-317和Thr-318之间和/或Thr-318和Tyr-319之间或者对应于非人凝血FXa多肽中这些氨基酸残基的两个氨基酸残基之间。

特别优选地是其中替换为1-30，优选地1-8，更优选地6或7个氨基酸残基的本发明的蛋白质。在本发明的蛋白质中对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中氨基酸残基的替换优选地包含对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间氨基酸残基区域的区域中的1-30个氨基酸残基或由其组成。所述替换优选地包含1、2、3、4、5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基。优选地，不替换如SEQ ID No：1中所示的保守氨基酸残基，如(例如)Glu-297、Val-305和/或His-311。特别优选地是6或7个氨基酸残基的替换。

存在于对应于本发明的蛋白质的SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的氨基酸残基区域的区域中的氨基酸残基优选地被表1所列的任一种氨基酸残基替换，优选地，被如表1中的列“侧链极性”和“侧链电荷”中所示的同组的氨基酸所替换。优选地，SEQ ID NO：1的Asn-312、Arg-313、Phe-314、Thr-315、Lys-316、Glu-317、Thr-318和Tyr-319或它们在本发明的非人蛋白中相应的氨基酸残基中的一个或多个被如表1所示的任一个氨基酸残基所取代。优选地，用Thr或Lys残基取代SEQ ID NO：1的Asn-312。优选地，用具有碱性极性和带正电荷侧链(参见表1)的氨基酸残基，更优选地，用Lys残基替换Arg-313。优选地，用具有中性侧链的极性氨基酸残基或者用具有中性侧链的非极性氨基酸残基，更优选地，用Val残基替换氨基酸残基Thr-315。优选地，用Pro残基替换SEQ ID NO：1的Lys-316。优选地，用Val残基替换SEQ ID NO：1的Glu-317。优选地，用具有中性侧链的极性氨基酸残基或者用具有中性侧链的非极性氨基酸残基，更优选地，用Ser或Ala残基替换Thr-318。

在本发明的蛋白质中对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中的氨基酸残基的替换优选地包含至少两个氨基酸残基或由其组成。在本发明中设想了至少两个氨基酸残基的任意组合，例如，分别用Pro残基和Ala残基替换SEQ ID NO：1的Asn-312和SEQ ID NO：1的Lys-316，或用表1所列的任一种氨基酸残基替换SEQ ID NO：1的Asn-312、Arg-313、Thr-315、Lys-316、Glu-317、Thr-318和Tyr-319。特别优选的是具有下列替换的本发明的蛋白质：分别用(i)Thr或Pro残基，(ii)Lys残基，(iii)Val残基，(iv)Pro残基，(v)Val残基和(vi)Ser或Ala残基替换SEQ ID NO：1的(i)Asn-312、(ii)Arg-313、(iii)Thr-315、(iv)Lys-316、(v)Glu-317和(vi)Thr-318。

本领域技术人员将理解当在对应于本发明的非人蛋白质的SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的区域的氨基酸残基区域中替换氨基酸残基时，仅尚不存在于本发明的优选蛋白质中的那些氨基酸残基被替换。本领域技术人员将知道以上仅在举例说明特定氨基酸残基区域中氨基酸残基替换的背景中提及SEQ ID NO：1。因此，技术人员将具有以下指示：他可以用哪些一种其它氨基酸残基或多种其他氨基酸残基替换非人凝血FXa中的一个或多个氨基酸残基。

本发明的蛋白质还可以在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中包含至少一个氨基酸残基的缺失。特别优选的是具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或30个氨基酸残基缺失的本发明的蛋白质。

本发明优选的蛋白质包含插入和替换的组合，或者插入、替换和/或缺失的组合。插入和缺失可以彼此独立地发生，并因此以下是有可能的，例如，在不影响凝血FX中氨基酸残基的总数的情况下，5个氨基酸残基的插入和5个氨基酸的缺失存在于对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中的不同氨基酸位置。技术人员将理解插入或缺失改变了蛋白质中氨基酸残基的编号。对于改变的位置以及改变的构成的方便评价而言，技术人员可以对如图8所示的不同凝血FX蛋白的氨基酸序列进行多次比对。技术人员可以根据该比对得出改变的氨基酸残基。技术人员可以使用保守氨基酸残基，例如，Glu-297、Val-305和/或His-311作为标志物以评价发生改变的氨基酸残基的编号。

特别优选的是其中插入为1-50，优选地1-20个氨基酸残基并且其中替换为1-7，优选地6个氨基酸残基的本发明的蛋白质。所述优选的蛋白质在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中具有1-50，优选地1-20个氨基酸残基之间的插入，并结合了1-8，优选地6或7个氨基酸残基的替换。

本发明更优选的蛋白在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基的插入和至少1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的替换，这表示至少1-20个氨基酸残基的插入与至少1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的替换相结合。本发明涉及上述插入和替换的所有可能的组合。特别优选的是在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中具有12-13个氨基酸残基的插入和6个氨基酸残基的替换的蛋白质。

本发明的蛋白质最优选地在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基His-311和Asp-320的氨基酸残基之间包含具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQID NO：11的氨基酸序列的氨基酸残基区域。

此外，SEQ ID NO：1的Arg-366、Glu-369、Phe-396、Asp-413、Ala-414、Cys-415、Gln-416、Ser-419、Val-437、Ser-438、Trp-439、Gly-440、Glu-441、Gly-442、Cys-443、Gly-450、Ile-451和Tyr-452的改变可能产生了对DFXI脱敏的蛋白质。不受理论束缚，SEQ IDNO：1的Arg-366、Glu-369、Phe-396、Asp-413、Ala-414、Cys-415、Gln-416、Ser-419、Val-437、Ser-438、Trp-439、Gly-440、Glu-441、Gly-442、Cys-443、Gly-450、Ile-451和Tyr-452可能是DFXI-配位残基。由于显示这些残基中的至少一些涉及与DFXI的结合，因此文献间接支持了该观点(Roehrig等人,2005.J Med Chem 48:5900–5908；Pinto等人,2007.J MedChem 50:5339–5356)。本发明的蛋白质优选地替换或缺失了对应于SEQ ID NO：1的Arg-366、Glu-369、Phe-396、Asp-413、Ala-414、Cys-415、Gln-416、Ser-419、Val-437、Ser-438、Trp-439、Gly-440、Glu-441、Gly-442、Cys-443、Gly-450、Ile-451和Tyr-452的氨基酸残基。优选地，用如表1所列的任一个氨基酸残基替换SEQ ID NO：1的SEQ ID NO：1的氨基酸残基Arg-366、Glu-369、Phe-396、Asp-413、Ala-414、Cys-415、Gln-416、Ser-419、Val-437、Ser-438、Trp-439、Gly-440、Glu-441、Gly-442、Cys-443、Gly-450、Ile-451和/或Tyr-452或者相关蛋白中相应的氨基酸残基。另外，本发明的蛋白质优选地在对应于位于从Arg-366、Glu-369、Phe-396、Asp-413、Ala-414、Cys-415、Gln-416、Ser-419、Val-437、Ser-438、Trp-439、Gly-440、Glu-441、Gly-442、Cys-443、Gly-450、Ile-451和/或Tyr-452的N末端15个氨基酸残基处和C末端15个氨基酸残基处的氨基酸残基之间的区域的氨基酸残基区域中具有至少一个氨基酸残基的插入，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸残基。SEQ ID NO：1的Phe-396、Arg-366、Glu-369、Asp-413、Ala-414、Cys-415、Gln-416、Ser-419、Val-437、Ser-438、Trp-439、Gly-440、Glu-441、Gly-442、Cys-443、Gly-450、Ile-451和/或Tyr-452的所述改变。在如本段所指明的区域中的所述插入优选地与如上所定义的SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的区域中的改变组合。

本发明还涵盖了与本发明的蛋白质基本同源且生物学相当的蛋白质。本发明的蛋白质优选地具有与SEQ ID NO：1或与其激活形式大于60％，优选地大于70％，更优选地大于80％并且最优选地大于90％同源的氨基酸序列，其中所述蛋白质是催化活性的(促凝血的)，或在处理/激活后是催化活性的，并且具有对DFXI的降低的敏感性，优选地DFXI选自利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班和贝曲西班组成的组。本领域技术人员知道如何将凝血FX的前原蛋白或前蛋白加工成其催化活性形式。UniProt数据库以登记号P00742提供了人凝血FX向激活的人凝血FXa加工的综述。因此，技术人员将能够确定哪些氨基酸残基在凝血FXa中是存在的或不存在的。

如在本发明的背景中所使用的，术语“对DFXI的降低的敏感性”是指产生最大抑制的50％所需的DFXI的浓度(Ki)，对于本发明的多肽，其高于天然凝血FXa，其中所述天然凝血FXa优选地来源于血浆或是重组产生的。优选地，通过将本发明的蛋白质与0.001至100μM的DFXI的预培育，然后进行其中用肽基底物转化测定对Spectrozyme Xa(SekisuiDiagnostics；Stamford,CT,USA)的催化活性的实验来确定DFXI的Ki。在不存在对应于SEQID NO：1的Gly-298和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中无至少一个氨基酸残基的改变的情况下，与所述天然凝血FXa的Ki相比，本发明的蛋白质的Ki优选地提高大于2×，更优选地提高50×至100×之间，并且最优选地提高大于100×。

意外发现与天然凝血FXa对凝血FVa的结合亲合力相比，本发明的蛋白质对凝血FVa(凝血酶原酶复合物中凝血FXa的结合伴侣)具有提高的结合亲合力。本发明的人或人源化蛋白质对FVa的结合亲合力是天然人FXa对FVa的结合亲合力的至少高2倍大。

确定结合亲合力的测定在本领域中是已知的，例如，通过使用具有放射性同位素标记的结合伴侣(如FVa或FXa)。一旦结合，所发射的辐射量可以用于计算结合亲合力。另外，非放射性方法(如表面等离子共振和双偏振干涉法)可以用于由基于浓度的测定，还可以由结合和分解的动力学定量结合亲合力，并且在后一种方法中，一旦结合则引起构象变化。最近，发展了微尺度热泳(MST)，它是无固定化的方法，其允许确定两个蛋白质之间的结合亲合力(Wienken等人,2010.Nature Communications 1:100)。优选地，通过凝血酶原或凝血酶原衍生物(前凝血酶-1、前凝血酶-2)转化的动力学(Bos等人,2009.Blood 114:686-692)、荧光强度/各向异性测量(Bos等人,2012.J Biol Chem 287:26342-51)；或者等温滴定量热法(ITC)确定凝血FVa-FXa复合物的结合亲合力。

本发明还提供了包含编码本发明的蛋白质的DNA序列的核酸分子。本领域技术人员将理解使用一般已知的重组DNA技术如何产生编码本发明的蛋白质的氨基酸序列的DNA序列和如何生产和分离具有所述DNA序列的核酸分子。优选地密码子优化核酸分子的序列以用于在本发明的宿主细胞中表达。以这种方式，使用对特定宿主细胞中高水平表达有利的密码子。

本发明还提供了包含本发明的核酸分子的表达载体。

优选地，使用本领域技术人员已知的重组DNA技术在表达载体中插入核酸分子。在本发明的背景中，表达载体指导本发明的蛋白质在宿主细胞中的表达。优选地，这些表达载体在宿主细胞中作为附加体或作为染色体DNA的一部分是可复制的。此外，表达载体优选地包含(i)强启动子/增强子，如CMV或SV40启动子，(ii)最适翻译起始序列，如核糖体结合位点和起始密码子，优选地KOZAK共有序列和(iii)转录终止序列，包括当蛋白在真核细胞中表达时的poly(A)信号。适合的表达载体包括质粒和病毒载体，如腺病毒、腺病毒相关病毒和逆转录病毒。本领域技术人员将理解要使用的表达载体取决于用于重组蛋白质的表达的宿主细胞。本发明的表达载体优选地适合于本发明的核酸分子在原核细胞，包括细菌细胞，或更优选地在真核宿主细胞，如酵母细胞和哺乳动物细胞中的表达。特别优地是选哺乳动物表达载体pCMV4。

作为可选地，本发明的核酸分子可以插入到宿主细胞的基因组中。所述插入优选地位于确保本发明的核酸分子在宿主细胞中表达的位点或区域内。

本发明还提供了包含本发明的核酸分子的宿主细胞。本发明优选地提供了表达本发明的核酸分子从而产生本发明的蛋白质的宿主细胞。所述蛋白质是在宿主细胞内产生的，或者优选地从宿主细胞分泌出。

在本发明中使用的适合的宿主细胞包括原核和真核细胞，如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、小鼠细胞(murine cell)、大鼠细胞(rat cell)、绵羊细胞、猿细胞和人细胞。适合的真核宿主细胞的实例包括但不限于HEK 293细胞、仓鼠细胞系CHO和BHK-21；小鼠宿主细胞NIH3T3、NSO和C127；猿宿主细胞COS和Vero；和人宿主细胞HeLa、PER.C6、U-937和Hep G2。适合的细胞可得自公共来源，如ATCC和Life Technologies。一些转染技术在本领域中是已知的，参见，例如，Graham等人,1973.Virology 52:456；Green等人,2012.“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,CSHL Press；Davis等人,“Basic Methods in Molecular Biology”,1986,Elsevier；和Chu等人,1981.Gene 13:197。本领域技术人员优选地使用这些参考文献中描述的技术以将一个或多个外源核酸分子引入到适合的宿主细胞中。

用于本发明的蛋白质的生产的特别优选的宿主细胞为HEK 293细胞。

本发明还提供了包含本发明的蛋白质或其药物可接受的盐和药物可接受的载体或赋形剂的药物组合物。本发明的药物组合物优选地包含一种或多种稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂及其它本领域中已知的材料。如技术人员已知的，载体的特征将取决于给予途径。为了降低给予丝氨酸蛋白酶FXa的潜在血栓形成风险，本发明的药物组合物优选地包含在向受试者给予后激活的本发明的蛋白质。

术语“受试者”是指哺乳动物的组，优选地人。

在本发明的背景中，术语“药物组合物”是指本发明的蛋白质与惰性或活性载体的组合，从而使组合物适合于体内或离体治疗性使用。

如本文所使用的术语“药物可接受的”是指与本发明的蛋白质的物理和化学特性相容并且不干扰所述蛋白质的生物活性有效性的无毒材料。

本发明的药物组合物可以适合于组合物的肠内给予，其中组合物通过消化道吸收，例如，口服摄取或直肠给予。所述组合物优选地被例如脂质体包封以防止蛋白水解降解。

本发明的药物组合物优选地局部应用于，例如伤口处或伤口中或者向受伤区域提供血液的血管，优选地动脉。所述局部给予是部分给予，例如，以乳膏剂、泡沫剂、凝胶剂、洗剂或软膏剂的形式，或者肠胃外给予，例如，通过注射或输注以产生局部或全身治疗效果。本发明的蛋白质用于局部作用的部分给予降低了潜在全身血栓形成事故的风险。

优选地，通过肠胃外给予来(优选地)全身给予本发明的药物组合物，组合物优选地包含凝血FX或成熟凝血FX，其包含改变的凝血因子Xa多肽。非活性前原蛋白或非活性前蛋白的全身给予将导致活性凝血酶原酶复合物的形成，复合物由与带负电荷的磷脂膜上的FVa结合的凝血FXa组成，在膜上将非活性凝血酶原转化为活性丝氨酸蛋白酶凝血酶。

本发明的药物组合物优选地适合于肠胃外给予，其中组合物通过静脉内、动脉内、皮下和/或肌内引入。肠胃外给予包括将本发明的药物组合物注射或输注到身体组织或体液中，从而优选地使用注射器、针头或导管。作为可选地，可以将无针高压给予用作肠胃外给予的方式。

对于可注射用组合物(例如，静脉内组合物)，载体可以是水或油溶液、分散体系、乳液和/或混悬液(suspension)。优选地，载体是水溶液，优选地，蒸馏无菌水、盐水、缓冲盐水或用于注射的另一种药物可接受的赋形剂。

优选地，在多种治疗应用中使用本发明的药物组合物。例如，可以在其中正常血液凝固受损的病症，如甲型和乙型血友病，包括甲型和乙型血友病(hemophilia A and B)抑制剂患者组或在凝血因子X缺乏症的治疗或改善中将药物组合物用作旁路剂(bypassingagent)。

本发明还提供了根据本发明的蛋白质或根据本发明的药物组合物在完全或部分逆转受试者中凝血抑制剂的抗凝血作用的方法中的用途。

术语“抗凝血作用”是指作为凝血抑制剂作用结果的治疗效果，如血液凝固的预防。

本发明还提供了本发明的蛋白质在用于生产完全或部分逆转受试者中凝血抑制剂的抗凝血作用的药物中的用途。

凝血抑制剂优选地为直接FXa抑制剂(DFXI)，更优选地直接FXa抑制剂，其选自利伐沙班(5-氯-N-[[(5S)-2-氧-3-[4-(3-氧-4-吗啉基)苯基]-5-噁唑烷基]甲基]-2-噻吩甲酰胺)、阿哌沙班(1-(4甲氧基苯基)-7-氧-6-[4-(2-氧代哌啶-1-基)苯基]-4,5,6,7-四氢-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-3-甲酰胺)、依度沙班(N'-(5-氯吡啶-2-基)-N-[(1S,2R,4S)-4-(二甲基氨基甲酰基)-2-[(5-甲基-6,7-二氢-4H-[1,3]噻唑并[5,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]环己基]草酰胺；4-甲基苯磺酸)和/或贝曲西班(N-(5-氯吡啶-2-基)-2-[[4-(N,N-二甲基甲脒基)苯甲酰基]氨基]-5-甲氧基苯甲酰胺)。

本发明还提供了完全或部分逆转受试者中凝血抑制剂的抗凝血作用的方法，所述方法包含向所述受试者给予治疗有效量的本发明的蛋白质或本发明的药物组合物。优选地，将本发明的方法应用于预防或改善与抗凝血疗法有关的出血并发症。

如本文所使用的术语“治疗有效量”是指包含在要给予的药物组合物中的活性成分的量是足以实现预期目的量，如在这种情况下，完全或部分逆转凝血抑制剂的抗凝作用。在根据本发明的药物组合物中，活性成分(即本发明的蛋白质)的量优选地在约50mg至约600mg的范围内。优选地，将根据本发明的药物组合物向需要完全或部分逆转凝血抑制剂的抗凝作用的受试者给予仅1次、2次或3次，优选地，仅给予仅1次。

出于清楚且简洁描述的目的，在本文中作为相同或单独实施方式的一部分描述了特征，然而，将理解本发明的范围可以包括具有所有或一些特征的组合的实施方式。

SEQ ID NO：1(人凝血因子X蛋白质)

SEQ ID NO：2(人凝血因子Xa的轻链)

SEQ ID NO：3(人凝血因子Xa的重链)

SEQ ID NO：4

1 tkfvppnyyyvhqnfdrvay

SEQ ID NO：5

1 kkfvppkksqefyekfdlvsy

SEQ ID NO：6(人凝血FX基因；1-1473bp)

atggcgcacgtccgaggcttgcagctgcctggctgcctggccctggctgccctgtgtagccttgtgcacagccagcatgtgttcctggctcctcagcaagcacggtcgctgctccagcgggtccggcgagccaattcctttcttgaagagatgaagaaaggacacctcgaaagagagtgcatggaagagacctgctcatacgaagaggcccgcgaggtctttgaggacagcgacaagacgaatgaattctggaataaatacaaagatggcgaccagtgtgagaccagtccttgccagaaccagggcaaatgtaaagacggcctcggggaatacacctgcacctgtttagaaggattcgaaggcaaaaactgtgaattattcacacggaagctctgcagcctggacaacggggactgtgaccagttctgccacgaggaacagaactctgtggtgtgctcctgcgcccgcgggtacaccctggctgacaacggcaaggcctgcattcccacagggccctacccctgtgggaaacagaccctggaacgcaggaagaggtcagtggcccaggccaccagcagcagcggggaggcccctgacagcatcacatggaagccatatgatgcagccgacctggaccccaccgagaaccccttcgacctgcttgacttcaaccagacgcagcctgagaggggcgacaacaacctcacgcgtatcgtgggaggccaggaatgcaaggacggggagtgtccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcctaacggcagcccactgtctctaccaagccaagagattcaaggtgagggtaggtgaccggaacacggagcaggaggagggcggtgaggcggtgcacgaggtggaggtggtcatcaagcacaaccggttcacaaaggagacctatgacttcgacatcgccgtgctccggctcaagacccccatcaccttccgcatgaacgtggcgcctgcctgcctccccgagcgtgactgggccgagtccacgctgatgacgcagaagacggggattgtgagcggcttcgggcgcacccacgagaagggccggcagtccaccaggctcaagatgctggaggtgccctacgtggaccgcaacagctgcaagctgtccagcagcttcatcatcacccagaacatgttctgtgccggctacgacaccaagcaggaggatgcctgccagggggacagcgggggcccgcacgtcacccgcttcaaggacacctacttcgtgacaggcatcgtcagctggggagagggctgtgcccgtaaggggaagtacgggatctacaccaaggtcaccgccttcctcaagtggatcgacaggtccatgaaaaccaggggcttgcccaaggccaagagccatgccccggaggtcataacgtcctctccattgaaa

SEQ ID NO：7(修饰的人FX的DNA序列-A型；1-1509bp)

Atggcgcacgtccgaggcttgcagctgcctggctgcctggccctggctgccctgtgtagccttgtgcacagccagcatgtgttcctggctcctcagcaagcacggtcgctgctccagcgggtccggcgagccaattcctttcttgaagagatgaagaaaggacacctcgaaagagagtgcatggaagagacctgctcatacgaagaggcccgcgaggtctttgaggacagcgacaagacgaatgaattctggaataaatacaaagatggcgaccagtgtgagaccagtccttgccagaaccagggcaaatgtaaagacggcctcggggaatacacctgcacctgtttagaaggattcgaaggcaaaaactgtgaa.ttattcacacggaagctctgcagcctggacaacggggactgtgaccagttctgccacgaggaacagaactctgtggtgtgctcctgcgcccgcgggtacaccctggctgacaacggcaaggcctgcattcccacagggccctacccctgtgggaaacagaccctggaacgcaggaagaggtcagtggcccaggccaccagcagcagcggggaggcccctgacagcatcacatggaagccatatgatgcagccgacctggaccccaccgagaaccccttcgacctgcttgacttcaaccagacgcagcctgagaggggcgacaacaacctcacgcgtatcgtgggaggccaggaatgcaaggacggggagtgtccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcctaacggcagcccactgtctctaccaagccaagagattcaaggtgagggtaggtgaccggaacacggagcaggaggagggcggtgaggcggtgcacgaggtggaggtggtcatcaagcac tatgacttcgacatcgccgtgctccggctcaagacccccatcaccttccgcatgaacgtggcgcctgcctgcctccccgagcgtgactgggccgagtccacgctgatgacgcagaagacggggattgtgagcggcttcgggcgcacccacgagaagggccggcagtccaccaggctcaagatgctggaggtgccctacgtggaccgcaacagctgcaagctgtccagcagcttcatcatcacccagaacatgttctgtgccggctacgacaccaagcaggaggatgcctgccagggggacagcgggggcccgcacgtcacccgcttcaaggacacctacttcgtgacaggcatcgtcagctggggagagggctgtgcccgtaaggggaagtacgggatctacaccaaggtcaccgccttcctcaagtggatcgacaggtccatgaaaaccaggggcttgcccaaggccaagagccatgccccggaggtcataacgtcctctccattgaaa

SEQ ID NO：8(修饰的人FX的DNA序列-B型；1-1512bp)

atggcgcacgtccgaggcttgcagctgcctggctgcctggccctggctgccctgtgtagccttgtgcacagccagcatgtgttcctggctcctcagcaagcacggtcgctgctccagcgggtccggcgagccaattcctttcttgaagagatgaagaaaggacacctcgaaagagagtgcatggaagagacctgctcatacgaagaggcccgcgaggtctttgaggacagcgacaagacgaatgaattctggaataaatacaaagatggcgaccagtgtgagaccagtccttgccagaaccagggcaaatgtaaagacggcctcggggaatacacctgcacctgtttagaaggattcgaaggcaaaaactgtgaattattcacacggaagctctgcagcctggacaacggggactgtgaccagttctgccacgaggaacagaactctgtggtgtgctcctgcgcccgcgggtacaccctggctgacaacggcaaggcctgcattcccacagggccctacccctgtgggaaacagaccctggaacgcaggaagaggtcagtggcccaggccaccagcagcagcggggaggcccctgacagcatcacatggaagccatatgatgcagccgacctggaccccaccgagaaccccttcgacctgcttgacttcaaccagacgcagcctgagaggggcgacaacaacctcacgcgtatcgtgggaggccaggaatgcaaggacggggagtgtccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcctaacggcagcccactgtctctaccaagccaagagattcaaggtgagggtaggtgaccggaacacggagcaggaggagggcggtgaggcggtgcacgaggtggaggtggtcatcaagcac tatgacttcgacatcgccgtgctccggctcaagacccccatcaccttccgcatgaacgtggcgcctgcctgcctccccgagcgtgactgggccgagtccacgctgatgacgcagaagacggggattgtgagcggcttcgggcgcacccacgagaagggccggcagtccaccaggctcaagatgctggaggtgccctacgtggaccgcaacagctgcaagctgtccagcagcttcatcatcacccagaacatgttctgtgccggctacgacaccaagcaggaggatgcctgccagggggacagcgggggcccgcacgtcacccgcttcaaggacacctacttcgtgacaggcatcgtcagctggggagagggctgtgcccgtaaggggaagtacgggatctacaccaaggtcaccgccttcctcaagtggatcgacaggtccatgaaaaccaggggcttgcccaaggccaagagccatgccccggaggtcataacgtcctctccattgaaa

SEQ ID NO：9

1 kkfvppkksqefyekfdlaay

SEQ ID NO：10

1 kkfvppnyyyvhqnfdlaay

SEQ ID NO：11

1 kkfvppqkaykfdlaay

附图说明

图1.凝血FXa的结构。A：凝血FXa的γ-羧基谷氨酸(“GLA”)、EGF-1和-2(“EGF”)和丝氨酸蛋白酶域(“SP”)的结构简图。B：人FXa丝氨酸蛋白酶的晶体结构(pdb2W26)。指明了催化三元组His-276、Asp-322、Ser-419，利伐沙班/阿哌沙班接触残基Try-319和Phe-396，残基316-317的位置(用球形表示)和残基Gly-289、Glu-297、Val-305和His-311。C：多种血浆FX种中区域311-322与所指明的保守残基(高亮显示)、接触残基Tyr-319和催化残基Asp-322的比对。*表示在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的区域的区域中具有插入的毒液凝血FX(venom coagulation FX)。

图2.通过直接FXa抑制剂对发色FXa活性的抑制。A：在存在提高浓度(1nM-10μM)的利伐沙班(“riva”，实心符号)或阿哌沙班(“api”，空心符号)的情况下，通过重组人凝血FXa(hFXa，2nM，圆形)或澳洲棕蛇(P.textilis)毒素凝血FXa(vptFXa，10nM，三角形)的肽基底物转化(SpecFXa，250μM)。将底物转化作为在不存在抑制剂的情况下培育的％作图。B，C：在不存在(灰线/灰柱)或存在0.4μM利伐沙班(“riva”，黑线/黑柱)或2μM阿哌沙班(“api”，虚线/白柱)的情况下，用0.5nM hFXa(部分B)或vptFXa(部分C)引起凝血FX-缺乏症血浆中凝血酶的产生。使用荧光底物评价凝血酶形成并在插图中显示出多个培育的凝血酶峰值浓度。

图3.(A)在与RVV-X激活剂培育之前(泳道1、2、3)或之后(泳道5、6、7)，得自稳定表达重组人FX(r-hFX，泳道1、5)、修饰的人FX-A(mod A，泳道2、6)或修饰的人FX-B(mod B，泳道3、7)的HEK293细胞系的重组FX(200ng)的荧光免疫印迹。内源血浆-来源的人FXa的重链迁移至～29kDa(泳道9)。表明了蛋白标志物的相对重量(kDa)(泳道4，8)。(B)使用FX-特异性ELISA定量了在条件培养基中来自稳定表达重组人FX(黑柱)、修饰的人FX-A(白柱)或修饰的人FX-B(灰柱)的HEK293细胞系的重组FX。每个单独的柱表示具有每个FX变体最高可达到的表达的单个稳定细胞系。

图4.大分子底物激活。在存在50μM PCPS、20nM FV(FV810，重组B-域截短的FV)和0.1nM修饰的人凝血FXa A型(m-hFXa A)、B型(m-hFXa B)、重组(r-hFXa)或血浆来源的(pd-hFXa)FXa的情况下，凝血酶原的转化(1.4μM)。以nM/min/nM酶，对底物转化作图，并且数据为两个独立实验的平均值±S.D.。

图5.DFXI对FXa嵌合体A型的抑制。与重组人凝血FXa(r-hFXa，3nM)、血浆来源的人凝血FXa(pd-FXa，2nM)和澳洲棕蛇(P.textilis)毒液(vptFXa，1nM)FXa相比，RVV-X激活的修饰的人凝血FXa A型(m-hFXa A，1nM)的肽基底物转化(SpecFXa，250μM)。在存在0.001-100μM利伐沙班(部分A)或阿哌沙班(部分B)的情况下确定的转化率。除r-hFXa外(n＝1)，数据表示为两个独立实验的平均值。

图6.DFXI对修饰的人FX-A和修饰的人FX-B的抑制。与RVV-X激活的重组人凝血FXa(r-hFXa，6nM)相比，RVV-X激活的修饰的人FX-A(m-hFXa A，1nM)和修饰的人FX-B(m-hFXaB，7nM)的肽基底物转化(SpecFXa，250μM)。在存在0.001-100μM利伐沙班(部分A)和阿哌沙班(部分B)的情况下，确定转化率。数据为两个独立实验的平均值。

图7.在存在辅因子Va和磷脂的情况下，DFXI对修饰的人FX-A或修饰的人FX-B的抑制。在存在50μM PCPS和30nM FV(FV810，重组B-域截短的)的情况下，与RVV-X激活的重组人凝血FXa(r-hFXa，3nM)相比，RVV-X激活的修饰的人FX-A(m-hFXa A，2nM)和激活的修饰的人FX-B(m-hFXa B，4nM)的肽基底物转化(SpecFXa，250μM)。在存在0.001-100μM利伐沙班(部分A)和阿哌沙班(部分B)的情况下，确定转化率。数据为两个独立实验的平均值。

图8.不同物种的凝血FX蛋白的多次比对。将人凝血FX的氨基酸序列(Genbank登记号：AAH46125.1)(HUM)与小家鼠(M.musculus)凝血FX(Genbank登记号：AAC36345.1)(MUS)、热带爪蟾(X.tropicalis)凝血FX(Genbank登记号：NP_001015728)(Xtr)、斑马鱼(D.rerio)凝血FX(Genbank登记号：AAM88343.1)(Dre)、红鳍东方豚(T.rubripes)凝血FX(Genbank登记号：NP_001027783.1)(Tru)、澳洲棕蛇(P.textilis)凝血FX同种型1(UniprotKB登记号：Q1L659)(Pte1)、澳洲棕蛇(P.textilis)凝血FX同种型2(UniprotKB登记号：Q1L658)(Pte2)、澳洲棕蛇(P.textilis)凝血FX(pseutarin C催化亚单位前体；Genbank登记号：AAP86642.1)(Pte3)和澳大利亚虎蛇(N.scutatus)凝血FX(UniProtKB登记号：P82807.2)(Nsc)的氨基酸序列相比较。在本图中，用加粗和加下划线标明了SEQ ID NO：1的Gly-289、Asp-320、Tyr-319、Glu-297、Val-305和His-311。该图显示在不同物种的凝血FX蛋白之间，在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间的区域的氨基酸残基区域中，存在改变。在共有序列中标明了在所有物种中保守的氨基酸残基。

图9.内源hFX和嵌合FX变体的氨基酸组成。与嵌合FX A型(c-FX A，中间；His 311和Asp 320之间的序列对应于SEQ ID NO：9)、B型(c-FX B；His 311和Asp 320之间的序列对应于SEQ ID NO：10)和C型(c-FX C；His 311和Asp 320之间的序列对应于SEQ ID NO：11)比对的内源人(hFX)的丝氨酸蛋白酶域残基组氨酸91和酪氨酸99(糜蛋白酶编号；分别对应于如SEQ ID NO：1所示的FX的His 311和酪氨酸319)。

图10.FXa的表征：A：4-12％Bis-Tris凝胶上5μg FXa变体的考马斯染色。从左至右：血浆-来源的因子Xa(pd-FXa)、r-hFXa、嵌合因子Xa A型、B型和C型(-A、-B、-C)。B：在存在50μM PCPS(75％磷脂酰胆碱，25％磷脂酰丝氨酸)和20nM FV(FV810，重组B-域截短的FV)和0.1nM pd-FXa、r-hFXa、c-FXa-A、c-FXa-B和c-FXa-C的情况下，凝血酶原的转化(1.4μM)。数据点为两个独立实验的平均值。

图11.DOAC对FXa变体的抑制。在存在0.001-100μM阿哌沙班(左侧，实心符号)和依度沙班(右侧，空心符号)的情况下，评价了1nM pd-FXa(三角形)、r-hFXa(圆形)、嵌合FXa-A(正方形)、-B(菱形)和-C(十字形)的归一化凝血酶原转化。阿哌沙班的抑制常数(使用Graphpad Prism6软件套确定)，对pd-FXa：2nM，r-hFXa：4nM，c-FXa-A：130nM，-B：760nM，-C：1270nM，依度沙班的抑制常数(使用Graphpad Prism 6软件套确定)，对r-hFXa：0.5nM，c-FXa-A：3nM，-B：140nM，-C：270nM。

图12.对于FXa变体，FXa-引起的凝血酶产生(TG)谱。不存在(A)和存在(B)DOAC阿哌沙班(2μM)的情况下的血浆TG。FX-耗尽的血浆中，pd-FXa、r-hFXa、c-FXa-A、c-FXa-B和c-FXa-C对TG的起始。曲线为至少3次独立实验的平均值。

图13.对于r-hFX和c-FX-C，组织因子(TF)-引起的TG谱。A：在不存在和存在2μMDOAC阿哌沙班(Apixa)时，通过1单位r-hFX，r-hFX加阿哌沙班，c-FXa-C或c-FXa-C加阿哌沙班，在低TF(2pM)时的血浆TG。通过使用正常人血浆作为参比的基于前凝血酶时间凝结测定定义1单位的r-hFX(7μg/ml)或c-FXa-C(16μg/ml)。曲线代表至少3次独立实验的平均值。B：高TF(20pM)时的血浆TG。

图14.对于r-hFX和c-FX-C，TF-引起的TG谱。(上部图)：在不存在(虚线)和存在200nM(浅灰)、600nM(深灰)和2000nM(黑色)DOAC依度沙班时，通过1单位r-hFX(7μg/ml)，在低TF(2pM)时的血浆TG。(下部图)：使用类似浓度的依度沙班，通过1单位c-FXa-C(16μg/ml)，在低TF(2pM)时的血浆TG。曲线代表2次独立实验的平均值。

表1

具体实施方式

实施例1

材料和方法

利伐沙班和阿哌沙班得自Alsachim(Illkirch,France)并溶于DMSO(～30mg/ml)。肽基底物甲氧基羰基环己基甘氨酰基甘氨酰基精氨酸-p-硝基苯胺(Spec-Xa)得自SekisuiDiagnostics(Stamford,CT,USA)。除了胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)来自于Roche(Basel,Switzerland)之外，其它所有组织培养试剂均来自Life Technologies(Carlsbad,CA)。制备了由75％(w/w)蛋L-磷脂酰胆碱和25％(w/w)猪脑L-磷脂酰丝氨酸(Avanti PolarLipids,Alabaster,AL)组成的小单层磷脂囊泡(PCPS)，并如上文的描述进行表征(Higgins等人,1983.J Biol Chem 258:6503–6508)。FX-耗尽的人血浆得自Diagnostica Stago(Paris,France)。在添加了5mM CaCl2和0.1％聚乙二醇8000的HEPES缓冲盐水(20mMHepes，0.15M NaCl，pH 7.5)(测定缓冲液)中进行所有功能测定。具有重组人FX(r-hFX)的哺乳动物表达载体pCMV4(Andersson等人,1989.J Biol Chem.264:8222-8229)由RodneyM.Camire慷慨赠送(Camire等人.2000.Biochemistry 39:14322-14329)。pcDNA3载体得自Invitrogen，并且PACE cDNA是Genetics Institute,Boston,MA的慷慨赠送。已描述了具有弗林蛋白酶前蛋白转化酶(Furin proprotein convertase)的载体(美国专利号5,460,950)。

如前文的描述制备、纯化并表征了人重组因子V(FV)(Bos等人,2009.Blood 114:686-692)。如前文的描述制备、纯化并表征了重组澳洲棕蛇(P.textilis)毒液FXa(vpt-FXa)(Verhoef等人,Toxin Reviews(2013)(doi:10.3109/15569543.2013.844712)。血浆来源的人因子Xa(pd-hFXa)、DAPA、人凝血酶原和抗人因子X单克隆小鼠IgG(AHX-5050)来自于Haematologic Technologies(Essex Junction,VT,USA)。用于ELISA的FX抗原配对抗体得自Cedarlane(Burlington,Canada)。RVV-X激活剂得自Diagnostica Stago(Paris,France)或Haematologic Technologies。限制性核酸内切酶Apa1得自New England Biolabs(Ipswich,MA,USA)。T4-DNA连接酶得自Roche(Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA)。

作为SEQ ID NO：7提供了编码修饰的人FX-A的DNA序列。作为SEQ ID NO：8提供了编码修饰的人FX-B的DNA序列。通过Genscript(Piscataway,NJ,USA)合成了侧接ApaI限制酶切位点的编码SEQ ID NO：4(以产生修饰的人FX-A)或者SEQ ID NO：5(以产生修饰的人FX-B)序列的核苷酸，使用Apa1和T4-DNA连接酶将其亚克隆至pCMV4哺乳动物表达载体并测序检查一致性。修饰的人FX-A和修饰的人FX-B也分别称为mod-hFX-A和mod-hFX-B。如前文的描述获得了表达r-hFX或修饰的hFX的稳定HEK293细胞系(Larson等人,1998.Biochemistry 37,5029-5038)。根据生产商的说明，使用Lipofectamine2000，用pCMV4和pcDNA-PACE载体共转染HEK293细胞。使用FX-耗尽的人血浆，通过改良的一步凝血测定评价转染子的FX表达。将最高表达水平的转染子扩大至T175培养瓶并在表达培养基(DMEM-F12营养混合物，不含酚红，添加了青霉素/链霉素/两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺，10μg/ml ITS，100μg/ml遗传霉素-418硫酸盐和6μg/ml维生素K)上适应24小时。收集条件培养基，以10.000g离心以除去细胞碎片，在10-kDa的截留过滤器(Millipore,Darmstadt,Germany)中浓缩，用HEPES-缓冲盐水清洗并在-20℃下保存在50％的甘油中。假定血浆FX浓度为10μg/ml，根据生产商的说明，使用人混合血浆作为参比，通过夹心ELISA评价甘油母液的FX抗原水平。

将表达培养基对表达r-hFX，修饰的人FX-A或修饰的人FX-B的稳定细胞系适应24小时。将等份的条件培养基与RVV-X(10ng/μl；Haematologic Technologies)在37℃培育120分钟。激活后，修饰的人FX-A或修饰的人FX-B也分别称为m-hFXa A或m-hFXa B。假设对所有FXa变体，底物亲合力类似，则随后使用已知浓度的pd-hFXa作为参比，通过肽基底物转化(Spec-Xa,250μM)，我们确定了培养基中FXa的浓度。如描述的，在25℃下非连续地确定了大分子底物切割的稳态初始速度(Camire,2002.J Biol Chem 277:37863-70)。简要地，通过培育PCPS(50μM)、DAPA(10μM)和凝血酶原(1.4μM)与人重组FV-810(B-域截短，组成型活性)获得了凝血酶原激活的进展曲线，并用0.1nM pd-hFXa、r-hFXa、m-hFXa B或0.033nM m-hFXa A起始反应。如描述的，测量凝血酶原转化速率(Krishnaswamy等人,1997.Biochemistry 36,3319–3330)。

通过RVV-X(0.5U/ml)，在37℃下将重组FX和修饰的人FX-A和修饰的人FX-B(200ng)激活60分钟，并在还原(30mM二硫苏糖醇)条件下，使用预制4-12％梯度凝胶和MES缓冲系统(Life Technologies)进行电泳，并使用Trans-Blot Turbo转移系统(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)转移至硝化纤维素膜。用抗重链FX抗体检验印迹，并使用Dyelight-800抗小鼠荧光抗体(Thermo Scientific,Rockford,IL USA)使蛋白条带显像。将血浆-来源的hFXa(200ng)用作参比。

根据先前描述的规程调整凝血酶产生(Hemker等人,2003.Pathophysiol HaemostThromb,33:4-15)。简要地，将FX-耗尽的血浆与Corn胰蛋白酶抑制剂(Corn TrypsinInhibitor)(70μg/ml)、缓冲液(25mM HEPES，175mM NaCl，5mg/ml BSA，pH 7.5)和PCPS(20μM)混合并在37℃下在96孔微孔板中培育10分钟。通过加入与利伐沙班(0.4μM)或阿哌沙班(0.2μM)预培育并且添加了FluCa的pd-hFXa(0.5nM)或vpt-FXa(0.5nM)起始凝血酶形成，并立即转移至血浆混合物。最终反应体积为120μl，其中64μl为FX-耗尽的血浆。每20s确定凝血酶形成，进行30分钟，并使用软件套(Thrombinoscope,5.0版)对校准物进行修正。由至少2个单独实验计算平均内源凝血酶潜能(thrombin potential)(凝血酶产生曲线下面积)。校准物和荧光底物(FluCa)购自Thrombinoscope(Maastricht,The Netherlands)。

在环境温度，在不存在或存在直接FXa抑制剂利伐沙班和阿哌沙班(最终浓度0,001μM-100μM)的情况下，进行每种FXa变体的肽基底物转化(Spec-Xa，最终浓度250μM)。将pd-hFXa(最终浓度2nM)或vpt-FXa(最终浓度10nM)的无钙母液在测定缓冲液中稀释并在存在测定缓冲液或抑制剂的情况下在96-孔微孔板中培育2分钟。用Spec-Xa起始底物转化，并在配备有Softmax Pro软件套(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)的SpectraMax M2e酶标仪中在405nM监控吸收10分钟。为了测定每种重组FX变体的DFXI敏感性，将r-hFX、修饰的人FX-A和修饰的人FX-B的甘油母液(5-40μL)在测定缓冲液中稀释并在37℃下与RVV-X(0.5U/ml)培育60分钟。随后，将激活的母液在测定缓冲液中稀释，在存在测定缓冲液或抑制剂的情况下在96-孔微孔板中培育2分钟，并如描述的测定底物转化。使用已知浓度的pd-hFXa作为参比，在不存在抑制剂的情况下，由底物转化率评价rhFX、m-hFXa A和m-hFXa B的相对浓度。

结果

毒液-来源的澳洲棕蛇(P.textilis)(Vpt)-FXa耐受DFXI的抑制。

纯化的重组毒液-来源的澳洲棕蛇(P.textilis)FXa(vptFXa)的生物化学表征显示出不同于目前已知的任何其它FXa物质，该蛋白酶耐受设计用于可逆地阻断FXa的活性位点的直接抗凝血剂利伐沙班和阿哌沙班的抑制。与先前观察结果一致，用于人FXa(hFXa)抑制的Ki为约1nM(Perzborn,2005.J Thromb Haemost,3,514-521)，而vptFXa抑制降低了至少1000倍(图2A)。在模拟体内纤维蛋白产生的血浆系统中证实了这些发现，从而表明FXa抑制剂的生理学浓度几乎不影响vptFXa-引起的凝血酶形成，而通过hFXa的存在观察到显著降低(图2B、C)。

人-毒液澳洲棕蛇(P.textilis)FXa嵌合体。

不限于vptFXa，还存在于来自澳大利亚蛇澳大利亚虎蛇(Notechis scutatus)的毒液FX中的显著结构元素是接近于hFXa活性位点的位置处的改变的氨基酸组成(图1C)。考虑其位置，我们假设这种独特的螺旋不仅可以调节与利伐沙班和/或阿哌沙班的相互作用，而且还可以调节与FVa的相互作用，这是因为FVa结合位点位于该螺旋的C末端(Lee等人,2011.J Thromb Haemost 9:2123-2126)。为了测试该假设，我们制备了在SEQ ID NO：7和8中列出的两个蛋白质编码DNA构建体。如SEQ ID NO：7所提供的mod-hFX-A嵌合体包含澳大利亚虎蛇(N.scutatus)DNA序列的相关部分(加粗和加下划线表示)，并且如SEQ ID NO：8所提供的mod-hFX-B嵌合体包含澳洲棕蛇(P.textilis)序列的相关部分(加粗和加下划线表示)。

使用这些DNA构建体，我们产生了稳定产生两种嵌合蛋白的HEK293细胞系，并随后通过将细胞在表达培养基上适应24小时评价了修饰的人FX从HEK293细胞的表达水平。免疫印迹分析显示对于两种嵌合变体，全长FX的表达类似于野生型FX(图3A)。与来自鲁塞尔蝰蛇毒液的激活剂(RVV-X)的培育导致了约30％的酶原FX蛋白水解激活为FXa，如～29kDa重链条带的出现所示。两种修饰的人FXa-A和修饰的人FXa-B的重链迁移至稍高的分子量，这与相比于人FXa，分别长12个或13个残基的蛇序列插入一致。条件培养基中FX抗原水平的分析表明尽管mod-hFX-A的表达降低了约～7倍，但是mod-hFX-B的表达类似于野生型人FX(图3B)。mod-hFX-A的低FX抗原水平与我们使用改良的凝血测定所观察到的类似的低FX活性水平相关。这表明尽管与另一种FX变体相比，mod-hFX-A的蛋白表达是次优的，但其FX功能不受影响。

为了测试FX的酶原激活，我们使用来自鲁塞尔蝰蛇毒液的FX激活剂(RVV-X)将rFX和修饰的人FX-A和修饰的人FX-B转化为FXa。一旦RVV-X激活，修饰的人FXa-A和修饰的人FXa-B两者显示出蛋白酶活性，如通过FXa-特异性小肽基底物SpectroZyme Xa的转化所评价的。另外，在存在人辅因子FVa的情况下，两种嵌合体的凝血酶原转化率类似于人FXa(pd-hFXa和r-hFXa两者)(图4)。总体而言，这些观察结果表明蛇序列插入不会严重阻碍人FX的酶促性质。

通过DFXI的FXa嵌合体的抑制

为了评估利伐沙班和阿哌沙班对于RVV-X激活的修饰的人FX-A的抑制常数(Ki)，将激活的重组蛋白与0.001至100μM抑制剂预培育，并随后测定其对于SpectroZyme Xa的催化活性。尽管与0.5μM利伐沙班的培育导致了r-hFXa和pd-hFXa的完全抑制，但是在这些条件下，mod-hFXa-A保持完全活性(图5A)。此外，在与100μM利伐沙班培育后，嵌合变体仍显示部分发色活性，这与澳洲棕蛇(P.textilis)毒液FXa类似。这些数据表明与人FXa相比，mod-hFXa-A的抑制的Ki至少升高100倍。对于通过阿哌沙班的抑制，我们观察到类似降低的敏感性(图5B)。

对通过利伐沙班和阿哌沙班的mod-hFXa-B的抑制的评价导致了与对于mod-hFXa-A所观察到的类似的Ki(图6A和6B)。因此，对于通过阿哌沙班和利伐沙班的抑制，显示了降低的敏感性。最终，在存在辅因子FVa和带负电荷的磷脂囊泡的情况下，嵌合FXa变体的DFXI-抑制未改变，这表明游离蛋白酶以及组装成FVa-FXa-脂质-结合的复合物的蛋白酶的两者同样耐受通过利伐沙班和阿哌沙班的抑制(图7A、B)。

实施例2

材料和方法

除非另外说明，否则如本实施例中所使用的材料和方法与实施例1中所表明的材料和方法相同或类似。

重组FX的构建和表达：在Genscript(Piscataway,NJ,USA)合成编码嵌合FX-A(c-FX A)、嵌合FX-B(c-FX B)和嵌合FX-C(c-FX C)的DNA，使用Apa1和T4-DNA连接酶将其亚克隆至pCMV4哺乳动物表达载体，并测序检查一致性。如前文的描述，获得了表达重组人或重组嵌合FX的稳定HEK293细胞系(Larson等人,1998.Biochemistry 37,5029-5038)。根据生产商的说明，通过Lipofectamine2000，用pCMV4和pcDNA-PACE载体共转染HEK293细胞。

嵌合FX(a)的纯化：除了用POROS HQ20-sepharose柱上的FX的钙梯度纯化替代免疫亲和纯化外，如前文的描述，制备、纯化和鉴定了重组嵌合FX产物A、B和C(Camire等人,2000)。完全γ-羧酸化的重组FX的典型产率为0.9毫克/升的条件培养基。用RVV-X(0.1U/mgFX)激活纯化的重组嵌合FX，通过尺寸排阻色谱法在Sephacryl S200HR柱(Vt 460ml)上分离，并在-20℃下保存在含有50％vol/vol甘油的HBS中。通过考马斯染色使纯化产物显象。

大分子底物的激活：如描述的，在25℃下不连续地确定了大分子底物切割的稳态初始速度(Camire,2002)。简要地，通过培育PCPS(50μM)、DAPA(10μM)和凝血酶原(1.4μM)与人重组FV-810(20nM，B-域截短，组成型活性FV)获得了凝血酶原激活的进展曲线，并用0.1nM的pd-hFXa、r-hFXa、c-FXa A、c-FXa B或c-FXa C起始反应。如描述的，测量凝血酶原转化速率(Krishnaswamy等人，1997)。在不存在或存在直接FXa抑制剂依度沙班(CAS注册号912273-65-5；由Daiichi Sankyo生产，作为Savaysa上市)和阿哌沙班(最终0,001μM-100μM)的情况下，测定凝血酶原转化以确定每个重组FXa变体的DOAC敏感性。

凝血酶产生测定：根据先前描述的规程调整凝血酶产生(Hemker等人，2003)。简要地，通过向FX-耗尽的血浆添加组织因子(TF，最终2或20pM)、Corn胰蛋白酶抑制剂(70μg/ml)、PCPS(20μM)和1单位(前凝血酶时间特异性凝血活性)的r-hFX(7μg/ml)或嵌合FX-C(16μg/ml)获得了凝血酶产生曲线。通过将底物缓冲液(Fluca)加入到血浆中来起始凝血酶形成。通过向FX-耗尽的血浆添加Corn胰蛋白酶抑制剂(70μg/ml)、测定缓冲液和PCPS(20μM)获得了FXa凝血酶产生曲线。通过加入与利伐沙班或阿哌沙班、不含钙并添加有Fluca的测定缓冲液预混的FXa来起始凝血酶形成。最终反应体积为120μL，其中64μL为FX-耗尽的血浆。每20s确定凝血酶形成，进行30分钟，并使用Thrombinoscope软件对校准物进行修正。根据至少3次单独实验计算延迟时间、平均内源凝血酶潜能(凝血酶产生曲线下面积)、峰值时间以及凝血酶产生峰值。

结果

澳洲棕蛇(P.textilis)毒液、澳洲棕蛇(P.textilis)同种型以及澳大利亚虎蛇(N.scutatis)毒液FXa的丝氨酸蛋白酶域中9-13个残基插入促使我们构建了了人和蛇FX的嵌合体。我们制备了三种蛋白质编码DNA构建体，它们在人FXa中引入了这些插入中的每一个。(图9)。使用这些DNA构建体，我们生成了稳定产生重组正常人FX(r-hFX)或三种类型的嵌合FX(c-FX A、c-FX B和c-FX C)的HEK293细胞系。通过将细胞在表达培养基上培养24小时，然后通过改良的一步PT凝血测定在FX-耗尽的血浆中评价条件培养基的凝血活性来确定来自HEK293细胞的重组人和嵌合FX的表达水平。通过连续离子交换层析步骤，从条件培养基纯化重组γ-羧酸化FX。随后，用来自鲁塞尔蝰蛇毒液的FX激活剂激活一部分FX混合物(FX pool)，通过尺寸排阻色谱法分离并通过SDS-PAGE表征。纯化的血浆来源的因子Xa的重链作为FXa-α和FXa-β的50/50混合物迁移至～34-31kDa。尽管FXa-α的C末端部分(残基436-447)的自蛋白酶解切除获得了FXa的β形式，但是相对于凝血酶原酶组装、凝血酶原激活、抗凝血酶识别和肽基底物转化来说，两种同种型在功能上是类似的(Pryzdial and Kessler，1996)。

r-hFXa和嵌合FXa-B和-C的纯化产物主要作为FXa-β迁移，而嵌合FXa-A作为α和βFXa的50/50混合物迁移。(图10A)。在存在辅因子FVa的情况下，通过带负电荷的磷脂囊泡(PCPS)上r-hFXa和嵌合FXa(A/B/C)的大分子底物激活动力学显示出所有嵌合变体组装成凝血酶原酶复合物。然而，与重组人FXa相比，嵌合FXa变体-A、-B和-C的催化速率分别降低了8.2、6.8和2.3倍。此外，重组制备的人FXa显示出与血浆-来源的FXa相比，催化效率适度降低。(图10B)。

为了确定DOAC(阿哌沙班、依度沙班)对于嵌合FXa(A/B/C)的抑制常数(Ki)，我们测定了在存在0.001至100μM DOAC的情况下凝血酶原激活的动力学。尽管接近等摩尔浓度的DOAC完全抑制血浆-来源的FXa和重组人FXa，但是所有嵌合FXa变体能够在显著更高的FXa-抑制剂浓度下(Ki阿哌沙班：130-1270nM，Ki依度沙班：3-270nM)保持凝血酶原转化。(图11)。考虑到嵌合FXa变体包含具有不同氨基酸长度和组成的类似位置的插入，我们推测这些插入与DOAC-配位残基Tyr99和/或活性位点的紧密临近的直接后果是对DOAC敏感性的降低。

为了评价DOAC加标血浆中嵌合FXa恢复凝血酶产生的潜能，我们进行了凝血酶产生(TG)测定。在FX-耗尽的人血浆中FXa-起始(5nM)的凝血酶产生表明了对于c-FXa变体C，正常的TG谱，和对于c-FXa变体A和B，接近正常的谱。(图12A)。尽管阿哌沙班(2μM)在pd-FXa-和r-hFXa-起始的TG中显著延长延迟时间并减低凝血酶产生峰值，但是这些参数未受本发明的嵌合FXa变体的影响。(图12B)。(表2)。这些结果表明嵌合FXa变体能够在DOAC抑制的血浆中恢复止血。另外，嵌合FX-C的酶原形式还能够在FX-耗尽的血浆中维持凝血酶产生。与r-hFX的TG不同，对于不受阿哌沙班影响的嵌合FX-C，通过低组织因子(TF，2pM)浓度的凝血起始产生了稳健的TG曲线(图13)。在低TF浓度下，嵌合FX-C在TG发生和峰值时间中显示出短延迟，另外，嵌合FX-C具有较大的内源凝血酶潜能(ETP)和较高的峰值凝血酶产生(表3)。然而，这些值在高TF(20pM)浓度下恢复正常(图13)(表3)。基于FXa-起始的TG测定中的观察结果，我们预期在DOAC加标的血浆中嵌合FX变体A和B的酶原形式还维持了TF-起始的TG。图14结合表4还提供了DOAC抑制的血浆中嵌合FXa变体对恢复止血的影响的证据。总的来说，这些结果显示嵌合FX(a)能够在DOAC抑制的血浆中以酶原和蛋白酶形式两者恢复止血。

表2.阿哌沙班对FXa-起始的TG参数的影响。值代表对在不存在阿哌沙班的情况下获得的TG值修正的在存在阿哌沙班的情况下获得的实验TG值。

表3.低和高TF-起始的TG实验的总结。

表4.对于r-hFX和c-FX-C，依度沙班对TF-引起的TG参数的影响。值代表在存在提高浓度的依度沙班的情况下获得的实验TG值。

Claims

1.一种包含凝血因子Xa多肽的重组蛋白质，所述多肽在对应于SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间，优选地His-311和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中具有改变；其中所述改变是至少一个氨基酸残基的插入。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述插入为1-50，优选地1-20个氨基酸残基。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的蛋白质，其中所述插入为1-50，优选地1-20个氨基酸残基。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的蛋白质，其中所述插入在对应于SEQ ID NO：1的Lys-316和Glu-317的两个氨基酸残基之间。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的蛋白质，其中所述至少一个氨基酸残基的插入与SEQ ID NO：1的Gly-289和Asp-320之间，优选地His-311和Asp-320之间的氨基酸残基区域中的1-8个氨基酸残基之间的替换相结合。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的蛋白质，其中对应于SEQ ID NO：1的His-311和Asp-320之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

7.一种包含编码根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白质的DNA序列的核酸分子。

8.一种包含根据权利要求7所述的核酸分子的表达载体。

9.一种包含根据权利要求7所述的核酸分子或根据权利要求8所述的表达载体的宿主细胞。

10.一种包含根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白质或其药物可接受的盐和药物可接受的载体的药物组合物。

11.根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白质或根据权利要求10所述的药物组合物，作为药剂的用途。

12.根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白质或根据权利要求10所述的药物组合物，在完全或部分逆转受试者中凝血抑制剂的抗凝血作用的方法中的用途。

13.一种完全或部分逆转受试者中凝血抑制剂的抗凝血作用的方法，所述方法包含向所述受试者给予治疗有效量的根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白质或者根据权利要求10所述的药物组合物。

14.根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白质用于制备完全或部分逆转受试者中凝血抑制剂的抗凝血作用的药物的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述凝血抑制剂为直接因子Xa抑制剂，优选地，利伐沙班(5-氯-N-[[(5S)-2-氧-3-[4-(3-氧-4-吗啉基)苯基]-5-噁唑烷基]甲基]-2-噻吩甲酰胺)、阿哌沙班(1-(4甲氧基苯基)-7-氧-6-[4-(2-氧代哌啶-1-基)苯基]-4,5,6,7-四氢-1H-吡唑并[3,4-c]吡啶-3-甲酰胺)、依度沙班(N'-(5-氯吡啶-2-基)-N-[(1S,2R,4S)-4-(二甲基氨基甲酰基)-2-[(5-甲基-6,7-二氢-4H-[1,3]噻唑并[5,4-c]吡啶-2-羰基)氨基]环己基]草酰胺；4-甲基苯磺酸)或贝曲西班(N-(5-氯吡啶-2-基)-2-[[4-(N,N-二甲基甲脒基)苯甲酰基]氨基]-5-甲氧基苯甲酰胺)。