ES2893616T3 - Factores de coagulación de acción prolongada y métodos para la producción de los mismos - Google Patents

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Abstract

Una formulación farmacéutica que comprende un tampón, un agente de tonicidad y un polipéptido modificado con péptido carboxi terminal (CTP) de gonadotropina coriónica que consiste de un factor de coagulación de Factor VII y tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxi terminal de dicho factor de coagulación, en donde dicho polipéptido no incluye un péptido señal, y en donde dicha formulación tiene un pH de 6,4 a 6,5, dicho tampón es citrato 20 mM y glicina 13,3 mM, y dicho agente de tonicidad es cloruro de sodio 150 mM.

Description

DESCRIPCIÓN
Factores de coagulación de acción prolongada y métodos para la producción de los mismos
Campo de la descripción
La solicitud se refiere a formulaciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos que comprenden al menos un péptido carboxi terminal (CTP) de gonadotropina coriónica unido al extremo carboxi terminal de un factor de coagulación.
Antecedentes
El desarrollo de la terapia de reemplazo de factores de coagulación ha transformado la vida de muchos individuos con hemofilia. La hemofilia es un grupo de trastornos genéticos hereditarios que afectan la capacidad del cuerpo para controlar la coagulación de la sangre. Los pacientes con hemofilia no producen cantidades adecuadas de las proteínas del Factor VIII o del Factor IX, que son necesarias para una coagulación de la sangre efectiva. En los hemofílicos graves, incluso una lesión menor puede dar como resultado una pérdida de sangre que continúa durante días o semanas, y es posible que no se produzca una curación completa, lo que conduce a la posibilidad de daños permanentes debilitantes en las articulaciones y otros órganos y la muerte prematura.
La hemofilia es un trastorno hemorrágico hereditario ligado al cromosoma X provocado por defectos o la ausencia de factores fundamentales en la cascada de la coagulación. En los pacientes con hemofilia, la generación de trombina y la formación de coágulos de fibrina se ven gravemente comprometidas, lo que conduce a episodios de hemorragia espontánea con mayor frecuencia en las articulaciones y órganos internos, y sangrado excesivo durante y después de una cirugía o un traumatismo. El sangrado frecuente también puede provocar inflamación articular, daño articular, deformidad grave, infecciones frecuentes y movilidad reducida en pacientes con hemofilia (Mayo Clinic). La hemofilia A es provocada por defectos o falta de expresión del Factor VIII, mientras que la hemofilia B es provocada por defectos o falta de expresión del Factor IX.
La hemofilia B da como resultado una deficiencia de la actividad procoagulante del FIX. Los pacientes con hemofilia B tienen hemorragias espontáneas de los tejidos blandos y hemartrosis recurrentes que a menudo conducen a una artropatía paralizante. El tratamiento actual para estos pacientes incluye una administración intravenosa de FIX recombinante. Sin embargo, los problemas de costo y la eliminación relativamente rápida del FIX de la circulación hacen que el desarrollo de un FIX de acción prolongada sea una tarea desafiante. La disponibilidad comercial de FVIII y FIX ha conducido a un mejor control de los episodios de sangrado potencialmente mortales. Muchos pacientes reciben terapia profiláctica, que reduce el riesgo de sangrado y las complicaciones asociadas. Sin embargo, una proporción significativa de pacientes (10-30 %) desarrolla anticuerpos inhibidores al FVIII y FIX administrados de forma exógena. La administración de FVIIa, que es un producto de derivación, puede inducir la homeostasis y proporcionar un tratamiento efectivo para los pacientes con Ab inhibidores.
El FVIIa recombinante (NovoSeven®) está disponible comercialmente y fue aprobado en 1996 para el tratamiento de episodios de sangrado en pacientes con hemofilia con inhibidores. Sin embargo, el rFVIIa se elimina rápidamente con una semivida terminal de 2,5 horas. Como resultado, los pacientes generalmente requieren infusiones múltiples y frecuentes (2-3 dosis administradas en intervalos de 2-3 horas) para lograr una homeostasis adecuada después de un sangrado leve a moderado. En consecuencia, existe mucho interés en desarrollar una forma de acción prolongada de FVIIa que prolongue la duración de la actividad hemostática después de una dosis única y permita una dosificación mucho menos frecuente. Un FVIIa de acción prolongada también aumentaría la viabilidad de la terapia profiláctica a largo plazo.
Están en desarrollo diversas tecnologías para prolongar la semivida del FVIIa. Sin embargo, aún existe la necesidad de lograr una semivida prolongada de esta proteína a la vez que se conserve su actividad biológica y se asegure que las modificaciones no induzcan una inmunogenicidad significativa. La presente invención aborda esta necesidad al unir péptidos carboxi terminales de gonadotropina (CTP) al FVIIa, lo que lo modifica de esta manera para prolongar su semivida y actividad biológica.
Las publicaciones de patente de Estados Unidos núms. 2012/0208759 y 2015/0079063 describen cada una polipéptidos que comprenden al menos un péptido carboxi-terminal (CTP) de gonadotropina coriónica unido al extremo carboxi terminal pero no al extremo amino terminal de un factor de coagulación. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden FVII-CTP3, lo que incluye tampones que comprenden citrato 20 mM, glicina 13,3 mM y NaCl 240 mM, a un pH de 6,9.
Resumen de la descripción
La presente invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende un tampón, un agente de tonicidad y un polipéptido modificado con péptido carboxi terminal de gonadotropina coriónica (CTP) que consiste de un factor de coagulación de Factor VII y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica (CTP) unidos al extremo carboxi terminal de dicho factor de coagulación, en donde dicho polipéptido no incluye un péptido señal, y en donde dicha formulación tiene un pH de 6,4 a 6,5, dicho tampón es citrato 20 mM y glicina 13,3 mM, y dicho agente de tonicidad es cloruro de sodio 150 mM.
En una modalidad, la formulación es una formulación líquida.
En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de al menos un CTP se expone en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
En una modalidad, al menos uno de dichos CTP está truncado.
En una modalidad, al menos uno de dichos CTP está glicosilado.
En una modalidad, al menos un CTP está unido a dicho factor de coagulación mediante un enlazador, por ejemplo, en donde el enlazador es un enlace peptídico.
En una modalidad, la secuencia de dicho polipéptido modificado con CTP se expone en la SEQ ID NO: 46.
En una modalidad, el factor de coagulación del Factor VII comprende un factor de coagulación del Factor VII activado.
En una modalidad, el polipéptido modificado con CTP activado comprende una cadena ligera y una cadena pesada unidas por un enlace disulfuro.
En una modalidad, la separación de dicha cadena ligera y dicha cadena pesada en un gel SDS-PAGE se produce en condiciones desnaturalizantes, en donde dicha cadena ligera migra a un peso molecular de 25 kDa y dicha cadena pesada migra a un peso molecular de 60 kDa.
En una modalidad, el enlace disulfuro se produce entre el residuo de cisteína 135 y el residuo de cisteína 262 de la SEQ ID NO: 46.
En una modalidad, la cadena ligera comprende los aminoácidos 1-152 de la SEQ ID: 46 y la cadena pesada comprende los aminoácidos 153-490 de la SEQ ID NO: 46.
La presente invención también proporciona la formulación farmacéutica de la invención para su uso en la prevención o el tratamiento de un trastorno de la coagulación de la sangre en un sujeto.
En una modalidad, el trastorno es la hemofilia.
En una modalidad, la hemofilia comprende hemofilia A o hemofilia B con inhibidores.
En una modalidad, el sujeto es un adulto humano o un niño humano.
En una modalidad, la formulación farmacéutica se administra por vía subcutánea o intravenosa.
En una modalidad, el polipéptido se administra diariamente, cada dos días, cada tres días, una vez a la semana, dos veces a la semana o una vez cada dos semanas, o cualquiera de sus combinaciones.
En una modalidad, la formulación farmacéutica se administra a aproximadamente 50 pg/kg a 400 pg/kg de dicho polipéptido modificado con CTP.
Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, ejemplos y figuras.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1A. Muestra un gráfico de barras que muestra cosechas limitadas, diluidas, transfectadas y seleccionadas de células con variantes FIX-CTP y FIX-CTP-CTP en presencia de 5 mg/ml de vitamina K3. El nivel de FIX se cuantificó mediante el uso del kit de ELISA Human FIX (Affinity Biologicals; núm. cat. FIX-AG RUO), y la concentración de proteína calculada (mg/ml) es el promedio de dos corridas independientes. Figura 1B. Muestra micrografías en gel SDS-PAGE de reconocimiento de Ab de FIX y representa el reconocimiento del anticuerpo anti-FIX en transferencia Western; el carril 1 en las Figuras 1B se cargó con una muestra que contenía FIX recombinante; el carril 2 de las Figuras 1B se cargó con una muestra que contenía cosechas de FIX-CTP. El carril 3 en las Figuras 1B se cargó con una muestra que contenía una cosecha de FIX-(CTP)2.
Figura 1C. Muestra micrografías en gel SDS-PAGE del reconocimiento de Ab de FIX. La Figura 1C representa el reconocimiento del anticuerpo anti-carboxilación y en transferencia Western. El carril 1 en la Figura 1C se cargó con una muestra que contenía FIX recombinante. El carril 2 en la Figura 1C se cargó con una muestra que contenía cosechas de FIX-CTP. El carril 3 en la Figura 1C se cargó con una muestra que contenía una cosecha de FIX-(CTP)2.
Figura 2. Muestra un gráfico que muestra actividad cromogénica comparativa de cosechas de FIX-CTP y FIX-(CTP)2 (medida por la concentración EC50) en comparación con rhFIX (American Diagnostics).
Figura 3. Muestra un gráfico que muestra el perfil PK de rhFIX, cosecha de FIX-CTP-CTP y cosecha de FIX-CTP.
Figura 4. Muestra un gráfico de barras que muestra las cosechas de FIX-CTP y cosechas de FIX-CTP-CTP y el nivel de antígeno FIX de proteína purificada FIX-CTP-CTP según se determina mediante el uso del kit Human FIX ELISA (Affinity Biologicals; núm. cat. FIX-AG RUO). La concentración de proteína calculada (mg/ml) es el promedio de dos corridas independientes.
Figura 5A. Muestra micrografías en gel SDS-PAGE del reconocimiento de Ab de FIX y representa una tinción con azul de coomassie. El carril 1 se cargó con una muestra que contenía FIX-(CTP)2. El carril 2 se cargó con una muestra que contenía FIX-(CTP)2 no unido. El carril 3 se cargó con una muestra que contenía una elución concentrada de FIX-(CTP)2.
Figura 5B. Muestra micrografías en gel SDS-PAGE del reconocimiento de Ab de FIX y representa el reconocimiento del anticuerpo anti-FIX en transferencia Western. El carril 1 se cargó con una muestra que contenía FIX-(CTP)2. El carril 2 se cargó con una muestra que contenía FIX-(CTP)2 no unido. El carril 3 se cargó con una muestra que contenía una elución concentrada de FIX-(CTP)2.
Figura 5C. Muestra micrografías en gel SDS-PAGE del reconocimiento de Ab de FIX y representa el reconocimiento del anticuerpo anti-carboxilación y en transferencia Western. El carril 1 se cargó con una muestra que contenía FIX-(CTP)2. El carril 2 se cargó con una muestra que contenía FIX-(CTP)2 no unido. El carril 3 se cargó con una muestra que contenía una elución concentrada de FIX-(CTP)2.
Figura 6. Muestra un gráfico que muestra la actividad cromogénica de FIX-(CTP)2 (concentración de la muestra/DO) en comparación con el plasma humano normal combinado y rhFIX (American Diagnostics). Figura 7. Muestra un gráfico que muestra el perfil PK de FIX-CTP-CTP purificado, rhFIX, cosecha de FIX-CTP-CTP y cosecha de FIX-CTP.
Figura 8A. Muestra transferencias de Western de anticuerpos anti-CTP y anti-carboxilación gamma de FIX fusionados con tres, cuatro o cinco CTP. Las cosechas de FIX-CTP3 , FIX-CTP4 y FIX-CTP5 se cargaron en gel de Tris-Glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de doble color Precision plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western mediante el uso de Ab policlonal anti-CTP (Adar Biotech Production).
Figura 8B. Muestra transferencias de Western de anticuerpos anti-CTP y anti-carboxilación gamma de FIX fusionados con tres, cuatro o cinco CTP. Las cosechas de FIX-CTP3 , FIX-CTP4 y FIX-CTP5 se cargaron en gel de Tris-Glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de doble color Precision plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western mediante el uso de Ab anti-Gla (American Diagnostica).
Figura 9. Muestra una detección por azul de Coomassie de FIX-CTP3, FIX-CTP4 y FIX-CTP5. Después de un proceso de purificación mediante el uso de una columna de jacalina (purificación por inmunoafinidad de proteínas glicosiladas), FIX-CTP3 , FIX-CTP4 y FIX-CTP5 se cargaron en gel de Tris-Glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteínas de doble color Precision plus (Bio-Rad). El SDS-PAGE se tiñó mediante colorante azul de Coomassie para la detección de muestras.
Figura 10. Muestra la actividad cromogénica de FIX. Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de FIX-CTP3 , FIX-CTP4 y FIX-CTP5 completamente purificados (columna HA) frente a plasma humano normal combinado se realizó mediante el uso de un kit de prueba de actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Todas las muestras se diluyeron en serie y se evaluó la potencia al comparar una curva de respuesta a la dosis con una preparación de referencia que consistía de plasma humano normal.
Figura 11. Muestra el perfil farmacocinético (PK) comparativo de FIX-CTP3 FIX-CTP4 y FIX-CTP5. La concentración de FIX en muestras de plasma se cuantificó mediante el uso de kits Elisa de FIX humano (Affinity Biologicals). Se calculó el perfil farmacocinético y es la media de 3 animales en cada punto temporal. Las semividas terminales se calcularon mediante el uso del software PK Solutions 2.0.
Figura 12A. Muestra el análisis por SDS-PAGE de FIX-CTP3 - SDS-PAGE Coomassie. Se cargaron proteína enriquecida Y-carboxilada FIX-CTP3 , rhFIX y rFIXa (FIX activado) en gel de Tris-Glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteínas de doble color Precision Plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE Coomassie se realizó al teñir el gel con reactivo azul de Coomassie (800 ng de proteína).
Figura 12B. Muestra el análisis por SDS-PAGE de FIX-CTP3 - SDS-PAGE Coomassie. Se cargaron proteína enriquecida Y-carboxilada FIX-CTP3 , rhFIX y rFIXa (FIX activado) en gel de Tris-Glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteínas de doble color Precision Plus (Bio-Rad). Se realizó una inmunotransferencia Western mediante el uso de 100 ng de proteína con Ab policlonal anti-FIX humano.
Figura 12C. Muestra el análisis por SDS-PAGE de FIX-CTP3 - SDS-PAGE Coomassie. Se cargaron proteína enriquecida Y-carboxilada FIX-CTP3 , rhFIX y rFIXa (FIX activado) en gel de Tris-Glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteínas de doble color Precision Plus (Bio-Rad). Se realizó una inmunotransferencia Western mediante el uso de 100 ng de proteína con anticuerpo monoclonal anti-carboxilación gamma humana (American Diagnostics núm. cat 499, 3570).
Figura 12D. Muestra el análisis por SDS-PAGE de FIX-CTP3 - SDS-PAGE Coomassie. Se cargaron proteína enriquecida Y-carboxilada FIX-CTP3 , rhFIX y rFIXa (FIX activado) en gel de Tris-Glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteínas de doble color Precision Plus (Bio-Rad). Se realizó una inmunotransferencia Western mediante el uso de 100 ng de proteína con Ab policlonal de pro-péptido anti-FIX (Figura 12D).
Figura 12E. Muestra el análisis por SDS-PAGE de FIX-CTP3 - SDS-PAGE Coomassie. Se cargaron proteína enriquecida Y-carboxilada FIX-CTP3 , rhFIX y rFIXa (FIX activado) en gel de Tris-Glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteínas de doble color Precision Plus (Bio-Rad). Se realizó una inmunotransferencia Western mediante el uso de 100 ng de proteína con Ab policlonal anti-CTP.
Figura 13. Muestra la actividad cromogénica de FIX-CTP3. Se realizó una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la cosecha de FIX-CTP3 y proteína enriquecida Y-carboxilada FIX-CTP3 frente a plasma humano normal combinado, mediante el uso de un kit de prueba de actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). La cosecha de FIX-CTP3 y la proteína se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó al comparar una curva de respuesta a la dosis con una preparación de referencia que consistía de plasma humano normal.
Figura 14. Muestra el tiempo de coagulación comparativo. Se realizó un aPTT in vitro (ensayo de tiempo de trombina activada parcial) al comparar la actividad de coagulación de FIX-CTP3 con respecto a BeneFIX. Las proteínas se diluyeron en serie y se añadieron a plasma humano agotado de FIX y se evaluó el tiempo de coagulación.
Figura 15. Muestra perfil PK comparativo de FIX-CTP3. La concentración de FIX se cuantificó mediante el uso de kits ELISA de FIX humano (Affinity Biologicals; núm. cat. FIX-AG RUO). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína y es la media de 3 animales en cada punto temporal.
Figura 16A. Paralelamente al muestreo de PK, los animales con deficiencia de FIX administrados con FIX-CTP3 , muestras de plasma con citrato, se evaluaron para determinar su actividad de coagulación mediante un ensayo de aPTT, que se tradujo en % de actividad. El % de actividad en cada punto de recolección se calculó como el tiempo de coagulación actual/tiempo de coagulación de plasma combinado de ratones normal*100. Figura 16B. En paralelo al muestreo de PK, se evaluó la actividad de coagulación de los animales con deficiencia de FIX administrados con BeneFIX®, muestras de plasma con citrato, mediante el ensayo aPTT, que se tradujo en % de actividad. El % de actividad en cada punto de recolección se calculó como el tiempo de coagulación actual/tiempo de coagulación de plasma combinado de ratones normal*100.
Figura 17A. Muestra los parámetros de sangrado en un primer desafío. A los ratones deficientes en FIX se les administró una única inyección intravenosa de 100 UI/kg de BeneFIX® o rFIX-CTP3. La vena de la cola se recortó ligeramente 48 horas después de la administración y se evaluó el tiempo de sangrado por la vena de la cola (TVBT). Se realizó un segundo desafío de sangrado 15 minutos después de alcanzar la homeostasis y se midieron los mismos parámetros.
Figura 17B. Muestra los parámetros de sangrado en un primer desafío. A los ratones deficientes en FIX se les administró una única inyección intravenosa de 100 UI/kg de BeneFIX® o rFIX-CTP3. La vena de la cola se recortó ligeramente 48 horas después de la administración y se evaluó el tiempo de sangrado por la vena de la cola (TVBT). Se realizó un segundo desafío de sangrado 15 minutos después de alcanzar la homeostasis y se midieron los mismos parámetros.
Figura 17C. Muestra los parámetros de sangrado en un primer desafío. A los ratones deficientes en FIX se les administró una única inyección intravenosa de 100 UI/kg de BeneFIX® o rFIX-CTP3. La vena de la cola se recortó ligeramente 48 horas después de la administración y se evaluó la intensidad del sangrado (DO de la hemoglobina). Se realizó un segundo desafío de sangrado 15 minutos después de alcanzar la homeostasis y se midieron los mismos parámetros.
Figura 17D. Muestra los parámetros de sangrado en un primer desafío. A los ratones deficientes en FIX se les administró una única inyección intravenosa de 100 UI/kg de BeneFIX® o rFIX-CTP3. La vena de la cola se recortó ligeramente 48 horas después de la administración y se evaluó la intensidad del sangrado (DO de la hemoglobina). Se realizó un segundo desafío de sangrado 15 minutos después de alcanzar la homeostasis y se midieron los mismos parámetros.
Figura 18A. Muestra los parámetros de sangrado de un segundo desafío. Una vez que el primer sangrado descrito en la leyenda de la Figura 19 se detuvo de forma espontánea o manualmente, se realizó una segunda prueba de sangrado 15 minutos después de la primera y se volvió a medir el tiempo.
Figura 18B. Muestra los parámetros de sangrado de un segundo desafío. Una vez que el primer sangrado descrito en la leyenda de la Figura 19 se detuvo de forma espontánea o manualmente, se realizó una segunda prueba de sangrado 15 minutos después de la primera y se volvió a medir el tiempo.
Figura 18C. Muestra los parámetros de sangrado de un segundo desafío. Una vez que el primer sangrado descrito en la leyenda de la Figura 19 se detuvo de forma espontánea o manualmente, se realizó una segunda prueba de sangrado 15 minutos después de la primera y se volvió a medir la intensidad del sangrado.
Figura 18D. Muestra los parámetros de sangrado de un segundo desafío. Una vez que el primer sangrado descrito en la leyenda de la Figura 19 se detuvo de forma espontánea o manualmente, se realizó una segunda prueba de sangrado 15 minutos después de la primera y se volvió a medir la intensidad del sangrado.
Figura 19A. Muestra un diagrama que ilustra el constructo rFVII-CTP.
Figura 19B. Muestra un diagrama que ilustra el constructo rFVII-CTP-CTP.
Figura 19C. Muestra un diagrama que ilustra el constructo rFIX-CTP.
Figura 19D. Muestra un diagrama que ilustra el constructo rFIX-CTP-CTP.
Figura 20A. Muestra un gráfico de barras que muestra cosechas de células seleccionadas y transfectadas de clones por dilución limitada con variantes de FVII-CTP en presencia de 5 mg/ml de vitamina K3. El nivel de FVII se cuantificó mediante el uso de ELISA de FVII (AssayPro).
Figura 20B. Muestra un gráfico de barras que muestra cosechas de células seleccionadas y transfectadas diluidas limitadas con variantes de FVII-CTP en presencia de 5 mg de actividad de vitamina K3. La actividad de FVII se cuantificó mediante el uso de un ensayo de actividad cromogénica de FVII (AssayPro).
Figura 20C. Muestra un gráfico de barras que muestra cosechas de células seleccionadas y transfectadas diluidas limitadas con variantes de FVII-CTP en presencia de 5 mg de vitamina K3. La actividad específica de FVII se calculó para cada versión al dividir el valor de la actividad por la concentración de cosecha de FVII. Figura 20D. Muestra un gráfico que muestra el perfil PK de las cosechas de FVII, FVII-CTP-CTP y FVII-CTP. Figura 21A. Muestra transferencias de Western de FVII fusionadas a tres, cuatro y cinco CTP, detectadas mediante el uso de anticuerpos anti-FVII, anti-CTP y anti-carboxilación gamma. Las cosechas de FVII-CTP3 , FVII-CTP4y FVII-CTP5 se cargaron en gel de Tris-glicina al 12 % (expedeon) mediante el uso de marcador de proteínas de doble color Precision plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western mediante el uso de anti-FVII.
Figura 21B. Muestra transferencias de Western de FVII fusionadas a tres, cuatro y cinco CTP, detectadas mediante el uso de anticuerpos anti-FVII, anti-CTP y anti-carboxilación gamma. Las cosechas de FVII-CTP3 , FVII-CTP4y FVII-CTP5 se cargaron en gel de Tris-glicina al 12 % (expedeon) mediante el uso de marcador de proteínas de doble color Precision plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western mediante el uso de Ab policlonal anti-CTP (Adar Biotech Production).
Figura 21C. Muestra transferencias de Western de FVII fusionadas a tres, cuatro y cinco CTP, detectadas mediante el uso de anticuerpos anti-FVII, anti-CTP y anti-carboxilación gamma. Las cosechas de FVII-CTP3 , FVII-CTP4y FVII-CTP5 se cargaron en gel de Tris-glicina al 12 % (expedeon) mediante el uso de marcador de proteínas de doble color Precision plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western mediante el uso de anti-Gla Ab (American Diagnostica).
Figura 22. Muestra la actividad de FVII: actividad cromogénica. Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de FVII-CTP3 , FVII-CTP4 y FVII-CTP5 purificados por HA (fracción altamente gamma carboxilada) frente a plasma humano normal combinado se realizó mediante el uso de un kit de prueba de actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). Todas las muestras se diluyeron en serie y se evaluó la potencia al comparar una curva de respuesta a la dosis con una preparación de referencia que consistía de plasma humano normal.
Figura 23. Muestra un primer perfil farmacocinético (PK) comparativo-FVII 3, 4 y 5 CTP. FVII-CTP3 , FVII-CTP4 y FVII-CTP5 (Grupo A, B y C, respectivamente) se administraron en una única inyección intravenosa a ratas Sprague Dawley (seis ratas por tratamiento) en una dosis de 250 pg/kg de peso corporal. Se extrajeron muestras de sangre retroorbitalmente de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,5 2, 5, 8, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosificación. Se preparó plasma con citrato (0,38 %) inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta el análisis. FVII-CTP5 demostró un perfil superior en comparación con las otras dos versiones.
Figura 24. Muestra un segundo perfil PK comparativo-FVII 3, 4 y 5 CTP. FVII-CTP3 , FVII-CTP4y FVII-CTP5 tras la selección de FVII y el proceso de purificación con HA (Grupo A, B y C, respectivamente) se administraron en una única inyección intravenosa a ratas Sprague Dawley (tres ratas por sustancia) en una dosis de 29,45 pg/kg de peso corporal. Se extrajeron muestras de sangre retroorbitalmente a las 0,083, 0,52, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. Se preparó plasma con citrato (0,38 %) inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta el análisis.
Figura 25A. Muestra un diagrama esquemático del proceso de purificación de FVII-CTP3. El lote 31 se produjo para el estudio de PK/PD.
Figura 25B. Muestra un diagrama esquemático del proceso de purificación de FVII-CTP3. El lote 38 se produjo para el estudio de supervivencia.
Figura 26A. Muestra un SDS-PAGE y una transferencia Western de FVII final y FVIIa. Se cargaron 10 mg (lote 31) o 5 mg (lote 38) en cada carril de SDS-PAGE teñido con Coomassie. 1. polipéptido FVII-CTP3 ; 2. Cadena pesada, incluye 3x CTP; 3. Cadena ligera. Los tres anticuerpos detectaron el FVII.
Figura 26B. Muestra una SDS-PAGE y transferencia Western de FVII y FVIIa finales. Se cargaron 10 mg (lote 31) o 5 mg (lote 38) en cada carril de SDS-PAGE 1 teñido con Coomassie. polipéptido FVII-CTP3 ; 2. Cadena pesada, incluye 3x CTP; 3. Cadena ligera.
Figura 26C. Muestra una SDS-PAGE y transferencia Western de FVII y FVIIa finales. Se cargaron 10 mg (lote 31) o 5 mg (lote 38) en cada carril de SDS-PAGE 1 teñido con Coomassie. polipéptido FVII-CTP3 ; 2. Cadena pesada, incluye 3x CTP; 3. Cadena ligera.
Figura 26D. Muestra una SDS-PAGE y transferencia Western de FVII y FVIIa finales. Se cargaron 10 mg (lote 31) o 5 mg (lote 38) en cada carril de SDS-PAGE 1 teñido con Coomassie. polipéptido FVII-CTP3 ; 2. Cadena pesada, incluye 3x CTP; 3. Cadena ligera.
Figura 26E. Muestra una SDS-PAGE y transferencia Western de FVII y FVIIa finales. Se cargaron 10 mg (lote 31) o 5 mg (lote 38) en cada carril de SDS-PAGE 1 teñido con Coomassie. polipéptido FVII-CTP3 ; 2. Cadena pesada, incluye 3x CTP; 3. Cadena ligera.
Figura 26F. Muestra una SDS-PAGE y transferencia Western de FVII y FVIIa finales. Se cargó 1 mg de proteína en cada carril de transferencia Western. 1. polipéptido FVII-CTP3 ; 2. Cadena pesada, incluye 3x CTP; 3. Cadena ligera. Los tres anticuerpos detectaron el FVII. La cadena ligera de FVIIa se detecta con ambos a-FVII.
Figura 26G. Muestra una SDS-PAGE y transferencia Western de FVII y FVIIa finales. Se cargó 1 mg de proteína en cada carril de transferencia Western. 1. polipéptido FVII-CTP3 ; 2. Cadena pesada, incluye 3x CTP; 3. Cadena ligera. Los tres anticuerpos detectaron el FVII. La cadena pesada de FVIIa se detectó mediante a-CTP.
Figura 26H. Muestra una SDS-PAGE y transferencia Western de FVII y FVIIa finales. Se cargó 1 mg de proteína en cada carril de transferencia Western. 1. polipéptido FVII-CTP3 ; 2. Cadena pesada, incluye 3x CTP; 3. Cadena ligera. Los tres anticuerpos detectaron el FVII. La cadena pesada de FVIIa se detectó mediante a-Gla.
Figura 27. Muestra que la actividad cromogénica de FVII-CTP3 aumenta como resultado de la purificación en una columna cerámica de hidroxiapatita (HA). Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la cosecha de FVII-CTP3, fracciones en proceso y FVII-CTP3 purificado frente a plasma humano normal combinado se realizó mediante el uso de un kit de prueba de actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). La cosecha de FVII-CTP3 y la proteína se diluyeron en serie y la potencia se evaluó al comparar una curva de respuesta a la dosis con una preparación de referencia de plasma humano normal.
Figura 28. Muestra el perfil PK de FVIIa-CTP3 frente a NovoSeven® en ratones deficientes en FVIII. FVIIa-CTP3 se produjo mediante selección de FVII, proceso de purificación con HA y activación. FVIIa-CTP3 o NovoSeven@ se administró en una única inyección intravenosa a ratones hemofílicos FVIII -/-. Se extrajeron muestras de sangre retroorbitalmente a las 0,083, 0,52, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. Se preparó plasma con citrato (0,38 %) inmediatamente después de la toma de muestras y se almacenó a -20 °C hasta el análisis, y se estableció un perfil farmacocinético basado en la actividad de coagulación de FVIIa mediante el uso de un kit comercial sTa CLOT.
Figura 29A. Muestra que FVIIa-CTP3 se produjo mediante selección de FVII, proceso de purificación con HA y activación. FVIIa-CTP3 o NovoSeven® se administró en una única inyección intravenosa a ratones hemofílicos FVIII -/-. Se extrajeron muestras de sangre retroorbitalmente a las 0,083, 0,5 2, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. Se preparó plasma con citrato (0,38 %) inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta el análisis. Los parámetros de generación de trombina se evaluaron durante el experimento de PK, y se evaluaron los parámetros incluido la cantidad máxima hasta el pico. Figura 29B. Muestra que FVIIa-CTP3 se produjo mediante selección de FVII, proceso de purificación con HA y activación. FVIIa-CTP3 o NovoSeven® se administró en una única inyección intravenosa a ratones hemofílicos FVIII -/-. Se extrajeron muestras de sangre retroorbitalmente a las 0,083, 0,5 2, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. Se preparó plasma con citrato (0,38 %) inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta el análisis. Los parámetros de generación de trombina se evaluaron durante el experimento de PK, y se evaluaron los parámetros que incluían la cantidad de trombina hasta el punto temporal.
Figura 29C. Muestra que FVIIa-CTP3 se produjo mediante selección de FVII, proceso de purificación con HA y activación. FVIIa-CTP3 o NovoSeven® se administró en una única inyección intravenosa a ratones hemofílicos FVIII -/-. Se extrajeron muestras de sangre retroorbitalmente a las 0,083, 0,5 2, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. Se preparó plasma con citrato (0,38 %) inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta el análisis. Los parámetros de generación de trombina se evaluaron durante el experimento de PK y se evaluaron los parámetros incluido la velocidad de generación de trombina. Figura 30A. Muestra las curvas de supervivencia de ratones hemofílicos después de la transección de la vena de la cola (TVT). La TVT se realizó 15 min después de la administración. La supervivencia de los ratones se observó durante 24 horas después de la TVT y se registró cada hora durante las primeras 12 horas y después de 24 horas. Los datos del grupo de control (vehículo) son la suma de los 3 experimentos con 5 ratones/experimento.
Figura 30B. Muestra las curvas de supervivencia de ratones hemofílicos después de la transección de la vena de la cola (TVT). La TVT se realizó 24 horas después de la administración. La supervivencia de los ratones se observó durante 24 horas después de la TVT y se registró cada hora durante las primeras 12 horas y después de 24 horas. Los datos del grupo de control (vehículo) son la suma de los 3 experimentos con 5 ratones/experimento.
Figura 30C. Muestra las curvas de supervivencia de ratones hemofílicos después de la transección de la vena de la cola (TVT). La TVT se realizó 48 horas después de la administración. La supervivencia de los ratones se observó durante 24 horas después de la TVT y se registró cada hora durante las primeras 12 horas y después de 24 horas. Los datos del grupo de control (vehículo) son la suma de los 3 experimentos con 5 ratones/experimento.
Figura 30D. Resume la supervivencia de los ratones según se registró 24 horas después de la TVT.
Figura 31A. Muestra inmunotransferencias de FVII - 3- CTP y FVII- 5 CTP, transferidas para GLA.
Figura 31B. Muestra inmunotransferencias de FVII - 3- CTP y FVII- 5 CTP, transferidas para FVII.
Figura 31C. Muestra inmunotransferencias de FVII - 3- CTP y FVII- 5 CTP, transferidas para CTP.
Figura 32. Muestra un perfil PK comparativo-FVII 3 y 5 CTP- desde selección y purificación por columna de HA (FVIIS frente a FVII HA).
Figura 33. Muestra un perfil PK comparativo-FVII 3 y 5 CTP-El segundo estudio (IV frente a SC).
Figura 34. Muestra las curvas de supervivencia de ratones hemofílicos después de la transección de la vena de la cola (TVT) después de la administración SC. La TVT se realizó 12 horas después de la administración. La supervivencia de los ratones se observó durante 24 horas después de la TVT y se registró cada hora durante las primeras 12 horas y después de 24 horas.
Figura 35A. Muestra el perfil farmacocinético de MOD-5014 frente a NovoSeven® después de la administración IV.
Figura 35B. Muestra el perfil farmacocinético de MOD-5014 frente a NovoSeven® después de la administración SC.
Figura 36. Muestra el perfil PK de MOD-5014 (Clon 61 #75, #81) frente a NovoSeven® después de una única administración SC.
Figura 37. Muestra que la warfarina aumenta los valores de PT y aPTT. Las ratas SD recibieron 10 pg/kg de warfarina por vía oral y se tomaron muestras de sangre en el punto temporal designado. Se preparó el plasma y se determinaron los valores de PT y aPTT.
Figura 38. Efecto agudo de la inyección IV de MOD-5014 y NovoSeven@ en ratas tratadas con warfarina.
Figura 39. Muestra la respuesta de ratas tratadas con warfarina a un amplio intervalo de dosis de MOD-5014 y NovoSeven@, 24 horas después de la inyección.
Figura 40. Muestra que MOD-5014 restauró los valores de PT a la normalidad hasta 48 horas después de la dosificación, mientras que el efecto de NovoSeven@ ya no existe después de 24 horas.
Figura 41. Muestra que la inyección IV de MOD-5014 reduce el tiempo de sangrado en ratas tratadas con warfarina en comparación con Novo-Seven@ 24 y 48 horas después de la inyección.
Figura 42. Muestra que MOD-5014 puede restaurar los valores de TP a la normalidad hasta 48 horas después de la dosificación, mientras que el efecto de NovoSeven@ ya no existe después de 24 horas Figura. 43. Demuestra superioridad sobre NovoSeven@ al mantener la pérdida de sangre a un nivel bajo durante 48 horas después de la administración.
Figura 44. Muestra que el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) inhibe MOD-5014 y NovoSeven® de una manera dependiente de la dosis similar.
Figura 45. Muestra que la anti-trombina III inhibió MOD-5014 y NovoSeven® de manera similar.
Figura 46. Muestra los resultados de la activación del Factor X por MOD-5014 y NovoSeven®, que fueron casi idénticos.
Figura 47. Muestra la activación del Factor X en presencia del TFPI (20 mg/ml a 0,002 ng/ml) por MOD-5014 y NovoSeven®, presente a 0,6 ng/ml.
Figura 48. Muestra la activación del Factor X en presencia del TFPI (20 mg/ml a 0,002 ng/ml) por MOD-5014 y NovoSeven®, presente a 4,0 ng/ml.
Figura 49. Muestra la activación del factor X en presencia del TFPI y heparina, en donde MOD-5014 y NovoSeven@ exhibieron una activación similar.
Figura 50. Muestra la activación del factor X en presencia de antitrombina III, en donde MOD-5014 y NovoSeven@ exhibieron una activación similar.
Figura 51. Muestra la activación del Factor X por MOD-5014 y NovoSeven® en presencia de heparina, en donde se observó una inhibición moderada similar.
Figura 52. Muestra una activación similar del Factor X por MOD-5014 y NovoSeven® en presencia de antitrombina y heparina.
Figura 53. Muestra un perfil de generación de trombina por MOD-5014 en comparación con NovoSeven® disponible comercialmente a una concentración alta de fosfolípidos (PL).
Figura 54. Muestra un perfil de generación de trombina máximo por MOD-5014 en comparación con NovoSeven® disponible comercialmente a una concentración baja de fosfolípidos (PL).
Figuras 55A y B. Muestran los resultados de la tromboelastografía para MOD-5014 y NovoSeven®, en donde ambos disminuyeron el tiempo de coagulación y aumentaron la velocidad de formación de coágulos.
Figura 56. Muestra los resultados de la generación de trombina (TG) por NovoSeven@ después de la recalcificación. (Corrida #1)
Figura 57. Muestra los resultados de la generación de trombina (TG) por MOD-5014 después de la recalcificación. (Corrida #1)
Figura 58 A-E. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven® (NS) frente a los resultados de MOD-5014 (PRO) a concentraciones similares. (A) proporciona los resultados a 1,25 mg/ml. (B) proporciona los resultados a 5 mg/ml. (C) proporciona los resultados a 15 mg/ml. (D) proporciona los resultados a 2,5 mg/ml. (E) proporciona los resultados a 10 mg/ml. (Corrida #1)
Figura 59 A-D. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven® (NS) frente a los resultados de MOD-5014 (PRO) a diferentes concentraciones. (A) muestra los resultados de NS a 1,25 mg/ml y PRO a 2,5 mg/ml. (B) muestra los resultados de NS a 5 mg/ml y PRO a 10 mg/ml (C) muestra los resultados de NS a 2,5 mg/ml y PRO a 5 mg/ml. (D) muestra los resultados de NS a 10 mg/ml y PRO a 15 mg/ml. (Corrida #1)
Figura 60. Muestra los resultados de la generación de trombina (TG) de NovoSeven® (NS) después de la recalcificación para NS a diferentes concentraciones. (Corrida #2)
Figura 61. Muestra los resultados de la generación de trombina (TG) por MOD-5014 (PRO) después de la recalcificación para PRO a diferentes concentraciones. (Corrida #2)
Figura 62 A-E. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven® (NS) frente a los resultados de MOD-5014 (PRO) a concentraciones similares. (A) proporciona los resultados a 1,25 mg/ml. (B) proporciona los resultados a 5 mg/ml. (C) proporciona los resultados a 15 mg/ml. (D) proporciona los resultados a 2,5 mg/ml. (E) proporciona los resultados a 10 mg/ml. (Corrida #2)
Figura 63 A-D. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven® (NS) frente a los resultados de MOD-5014 (PRO) a diferentes concentraciones. (A) muestra los resultados de NS a 1,25 mg/ml y PRO a 2,5 mg/ml. (B) muestra los resultados de NS a 5 mg/ml y PRO a 10 mg/ml. (C) muestra los resultados de NS a 2,5 mg/ml y PRO a 5 mg/ml. (D) muestra los resultados de NS a 10 mg/ml y PRO a 15 mg/ml. (Corrida #2)
Figura 64. Muestra los datos para TG por NovoSeven @ después de la recalcificación a baja concentración de TF. (Corrida #1)
Figura 65. Muestra los datos para TG por MOD-5014 después de la recalcificación a baja concentración de TF. (Corrida #1)
Figura 66 A-E. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de NovoSeven® (NS) frente a los resultados de MOD-5014 (PRO) a concentraciones similares, después de la recalcificación a TF bajo. (A) proporciona los resultados a 1,25 mg/ml. (B) proporciona los resultados a 5 mg/ml. (C) proporciona los resultados a 15 mg/ml. (D) proporciona los resultados a 2,5 mg/ml. (E) proporciona los resultados a 10 mg/ml. (Corrida #1)
Figura 67. Muestra los datos para TG por NovoSeven @ después de la recalcificación a baja concentración de TF. (Corrida #2)
Figura 68. Muestra los datos para TG por MOD-5014 después de la recalcificación a baja concentración de TF. (Corrida #2)
Figura 69 A-E. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de NovoSeven® (NS) frente a los resultados de MOD-5014 (PRO) a concentraciones similares, después de la recalcificación a TF bajo. (A) proporciona los resultados a 1,25 mg/ml. (B) proporciona los resultados a 5 mg/ml. (C) proporciona los resultados a 15 mg/ml. (D) proporciona los resultados a 2,5 mg/ml. (E) proporciona los resultados a 10 mg/ml. (Corrida #2)
Figura 70 A-C. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de NovoSeven® (NS) frente a los resultados de MOD-5014 (PRO) a diferentes concentraciones, después de la recalcificación a TF bajo. (A) muestra los resultados de NS a 1,25 mg/ml y PRO a 5 mg/ml. (B) muestra los resultados de NS a 5 mg/ml y PRO a 15 mg/ml. (C) muestra los resultados de NS a 2,5 mg/ml y PRO a 10 mg/ml. (Corrida #2)
Figura 71. Muestra la generación de trombina completa por FVIII, como una comparación de los resultados con NovoSeven @ y MOD-5014 en presencia y ausencia de TF bajo.
Figura 72. Proporciona un análisis de superposición de la generación de trombina por FVIII en presencia y ausencia de tF bajo.
Figura 73. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven@ (NS; 1,25 pg/kg) frente a los resultados de TG de MOD-5014 (PRO; 1,25 pg/kg) a concentraciones crecientes de TF. (Corrida #1)
Figura 74 A-E. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven@ (NS; 1,25 pg/kg) frente a los resultados de TG de MOD-5014 (PRO; 1,25 pg/kg) a concentraciones crecientes de TF. (A) proporciona los resultados a TF 0 pM. (B) proporciona los resultados a TF 1 pM. (C) proporciona los resultados a TF 5 pM. (D) proporciona los resultados a TF 0,5 pM. (E) proporciona los resultados a Tf 2,5 pM. (Corrida #1) Figura 75. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven@ (NS; 2,5 pg/kg) frente a los resultados de TG de MOD-5014 (PRO; 2,5 pg/kg) a concentraciones crecientes de TF. (Corrida #1)
Figura 76 A-E. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven® (NS; 2,5 pg/kg) frente a los resultados de MOD-5014 (PRO; 2,5 pg/kg) a concentraciones crecientes de TF. (A) proporciona los resultados a TF 0 pM. (B) proporciona los resultados a TF 1 pM. (C) proporciona los resultados a TF 5 pM. (D) proporciona los resultados a TF 0,5 pM. (E) proporciona los resultados a TF 2,5 pM. (Corrida #1)
Figura 77. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven@ (NS; 5 pg/kg) frente a los resultados de MOD-5014 (PRO; 5 pg/kg) a concentraciones crecientes de TF. (Corrida #1) Figura 78 A-E. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven@ (NS; 5 pg/kg) frente a los resultados de TG de MOD-5014 (PRO; 5 pg/kg) a concentraciones crecientes de TF. (A) proporciona los resultados a TF 0 pM. (B) proporciona los resultados a TF 1 pM. (C) proporciona los resultados a TF 5 pM. (D) proporciona los resultados a TF 0,5 pM. (E) proporciona los resultados a TF 2,5 pM. (Corrida #1)
Figura 79 A-C. Muestra una respuesta de TG dependiente de la dosis en presencia de NovoSeven® (NS) a concentraciones crecientes de TF. (A) proporciona los resultados a NS 1,25 pg/kg. (B) proporciona los resultados a NS 5 pg/kg. (C) proporciona los resultados a NS 2,5 pg/kg. (Corrida #1)
Figura 80 A-C. Muestra una respuesta de TG dependiente de la dosis en presencia de MOD-5014 (PRO) a concentraciones crecientes de TF. (A) proporciona los resultados a PRO 1,25 pg/kg. (B) proporciona los resultados a PRO 5 pg/kg. (C) proporciona los resultados a PRO 2,5 pg/kg. (Corrida #1)
Figura 81. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven® (NS; 10 pg/kg) frente a los resultados de TG de MOD-5014 (PRO; 10 pg/kg) a concentraciones crecientes de TF. (Corrida #2)
Figura 82. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven@ (NS; 2,5 pg/kg) frente a los resultados de TG de MOD-5014 (PRO; 2,5 pg/kg) a concentraciones crecientes de TF. (Corrida #2)
Figura 83. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven@ (NS; 5 pg/kg) frente a los resultados de MOD-5014 (PRO; 5 pg/kg) a concentraciones crecientes de TF. (Corrida #2) Figura 84 A-C. Muestra una respuesta de TG dependiente de la dosis en presencia de NovoSeven® (NS) a concentraciones crecientes de TF. (A) proporciona los resultados a NS 2,5 mg/ml. (B) proporciona los resultados a NS 10 mg/ml. (C) proporciona los resultados a NS 5 mg/ml. (Corrida #2)
Figura 85 A-C. Muestra una respuesta de TG dependiente de la dosis en presencia de MOD-5014 (PRO) a concentraciones crecientes de TF. (A) proporciona los resultados a PRO 2,5 mg/ml. (B) proporciona los resultados a PRO 10 mg/ml. (C) proporciona los resultados a PRO 5 mg/ml. (Corrida #2)
Figura 86 A-E. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven® (NS; 10 pg/kg) frente a los resultados de TG de MOD-5014 (PRO; 10 pg/kg) a concentraciones crecientes de TF. (A) proporciona los resultados a TF 0 pM. (B) proporciona los resultados a TF 1 pM. (C) proporciona los resultados a TF 5 pM. (D) proporciona los resultados a TF 0,5 pM. (E) proporciona los resultados a TF 2.5 pM. (Corrida #2)
Figura 87. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven® (NS; 2,5 pg/kg) frente a los resultados de TG de MOD-5014 (PRO; 2,5 pg/kg) a concentraciones crecientes de Tf (A) proporciona los resultados a TF 0 pM. (B) proporciona los resultados a TF 1 pM. (C) proporciona los resultados a TF 5 pM. (D) proporciona los resultados a TF 0,5 pM. (E) proporciona los resultados a TF 2.5 pM. (Corrida #2)
Figura 88. Proporciona un análisis de superposición de los resultados de TG de NovoSeven@ (NS; 5 pg/kg) frente a los resultados de TG de MOD-5014 (PRO; 5 pg/kg) a concentraciones crecientes de TF. (A) proporciona los resultados a TF 0 pM. (B) proporciona los resultados a TF 1 pM. (C) proporciona los resultados a TF 5 pM. (D) proporciona los resultados a TF 0,5 pM. (E) proporciona los resultados a TF 2.5 pM. (Corrida #2)
Figura 89. Muestra gráficos de WBCT después de adicionar MOD-5014 a sangre de caninos.
Figura 90. Muestra un dibujo esquemático del modelo farmacocinético de dos compartimientos.
Figura 91. Proporciona un gráfico de las concentraciones plasmáticas medias de MOD-5014 frente al tiempo posterior a la infusión IV en perros.
Figura 92. Proporciona un gráfico de la actividad plasmática media de MOD-5014 frente al tiempo después de la infusión IV en perros.
Figuras 93A-B. Muestra los datos comparativos de la concentración plasmática y actividad de MOD-5014 después de la infusión IV de 50 pg/kg en perros. Figura 93(A) muestra los resultados para el perro P14 y la Figura 93(B) muestra los resultados para el perro N06.
Figuras 94 A-D. Muestra los datos comparativos de la concentración plasmática y actividad de MOD-5014 después de la infusión IV de 200 pg/kg en perros. La Figura 94(A) muestra los resultados para el perro Blondie; la Figura 94(B) para el perro Josie; la Figura 94(C) para el perro N06; y la Figura 94(D) para el perro P14.
Figuras 95A-B. Muestra los datos comparativos de la concentración plasmática y actividad de MOD-5014 después de la infusión IV de 400 pg/kg en perros. La Figura 95(A) muestra los resultados para el perro Blondie y la Figura 95(B) muestra los resultados para el perro Josie.
Figuras 96A-B. Muestra los datos comparativos de la concentración plasmática y actividad de MOD-5014 después de la infusión IV de 600 pg/kg en perros. La Figura 96(A) muestra los resultados para el perro N05 y la Figura 96(B) muestra los resultados para el perro Joanie.
Figuras 97A-J. Muestra gráficas de las concentraciones plasmáticas de MOD-5014 frente al tiempo. Los puntos representan las concentraciones plasmáticas observadas y la línea representa la pendiente terminal usada para calcular T1/2. La Figura 97(A) muestra los resultados para el perro N06 después de más de 30 horas; la Figura 97(B) para el perro P14 después de más de 30 horas; la Figura 97(C) para el perro Blondie después de aproximadamente 50 horas; la Figura 97(D) para el perro Josie después de aproximadamente 50 horas; la Figura 97(E) para el perro N06 después de casi 100 horas; la Figura 97(F) para el perro P14 después de casi 100 horas; la Figura 97(G) para el perro Blondie después de casi 100 horas; la Figura 97(H) para el perro Josie después de casi 100 horas; la Figura 97(I) para el perro Joanie después de casi 100 horas y la Figura 97(J) para el perro N05 después de casi 100 horas.
Figuras 98A-J. Muestra gráficas de la actividad MOD-5014 en plasma frente al tiempo. Los puntos representan las concentraciones plasmáticas observadas y la línea representa la pendiente terminal usada para calcular T1/2. La Figura 98(A) muestra los resultados para el perro N06 después de más de 30 horas; la Figura 98(B) para el perro P14 después de más de 30 horas; la Figura 98(C) para el perro Blondie después de casi 50 horas; la Figura 98(D) para el perro Josie después de casi 50 horas; la Figura 98(E) para el perro N06 después de casi 50 horas; la Figura 98(F) para el perro P14 después de casi 50 horas; la Figura 98(G) para el perro Blondie después de casi 50 horas; la Figura 98(H) para el perro Josie después de casi 50 horas; la Figura 98(I) para el perro Joanie después de casi 50 horas y la Figura 98(J) para el perro N05 después de casi 50 horas.
Figuras 99A-J. Muestra los resultados del modelado - Concentraciones plasmáticas. Los puntos representan las concentraciones plasmáticas observadas y la línea continua representa las concentraciones predichas mediante el modelo. La Figura 99(A) muestra los resultados observados y predichos para el perro N06; la Figura 99(B) para el perro P14; la Figura 99(C) para el perro Blondie; la Figura 99(D) para el perro Josie; la Figura 99(E) para el perro N06 después de casi 100 horas; la Figura 99(F) para el perro P14 después de casi 100 horas; la Figura 99(G) para el perro Blondie después de casi 100 horas; la Figura 99(H) para el perro Josie después de casi 100 horas; la Figura 99(I) para el perro Joanie después de casi 100 horas y la Figura 99(J) para el perro N05 después de casi 100 horas.
Figuras 100A-J. Muestra los resultados del modelado - Actividad. Los puntos representan la actividad plasmática observada y la línea continua representa la actividad predicha mediante el modelo. La Figura 100(A) muestra los resultados observados y predichos para el perro N06 después de al menos 32 horas; la Figura 100(B) para el perro P14 después de al menos 32 horas; la Figura 100(C) para el perro Blondie después de al menos 48 horas; la Figura 100(D) para el perro Josie después de al menos 48 horas; la Figura 100(E) para el perro N06 después de al menos 48 horas; la Figura 100(F) para el perro P14 después de al menos 48 horas; la Figura 100(G) para el perro Blondie después de al menos 48 horas; la Figura 100(H) para el perro Josie después de al menos 48 horas; la Figura 100(I) para el perro Joanie después de al menos 48 horas y la Figura 100(J) para el perro N05 después de al menos 48 horas.
Figura 101A-D. Muestra el cambio dependiente de la dosis en la cinética por TEG iniciada por caolín después de la administración de 50, 200 o 400 pg/kg de MOD-5014 en el perro NO6. (A) muestra el tiempo R (tiempo de reacción); (B) muestra el tiempo K (tiempo desde el final de R hasta que el coágulo alcanza 20 mm, la velocidad de formación del coágulo); (C) muestra el ángulo (la tangente de la curva que se hace a medida que se alcanza K); y (D) muestra la MA (amplitud máxima).
Figura 102A-D. Muestra el cambio dependiente de la dosis en la cinética por TEG iniciada por caolín después de la administración de 50 y 200 pg/kg de MOD-5014 en el perro P-14. (A) muestra el tiempo R (tiempo de reacción; (B) muestra el tiempo K (tiempo desde el final de R hasta que el coágulo alcanza 20 mm, la velocidad de formación del coágulo); (C) muestra el ángulo (la tangente de la curva que se hace a medida que se alcanza K); y (D) muestra la MA (amplitud máxima).
Figura 103A-D. Muestra el cambio dependiente de la dosis en la cinética por TEG iniciada por caolín después de la administración de 200 y 400 pg/kg de MOD-5014 en el perro Blondie. (A) muestra el tiempo R (tiempo de reacción); (B) muestra el tiempo K (tiempo desde el final de R hasta que el coágulo alcanza 20 mm, la velocidad de formación del coágulo); (C) muestra el ángulo (la tangente de la curva que se hace a medida que se alcanza K); y (D) muestra la MA (amplitud máxima).
Figura 104A-D. Muestra el cambio dependiente de la dosis en la cinética por TEG iniciada por caolín después de la administración de 200 y 400 pg/kg de MOD-5014 en el perro Josie. (A) muestra el tiempo R (tiempo de reacción); (B) muestra el tiempo K (tiempo desde el final de R hasta que el coágulo alcanza 20 mm, la velocidad de formación del coágulo); (C) muestra el ángulo (la tangente de la curva que se hace a medida que se alcanza K); y (D) muestra la MA (amplitud máxima).
Figura 105A-D. Muestra el cambio dependiente de la dosis en la cinética por TEG iniciada por caolín después de la administración de 50, 200 o 400 pg/kg de MOD-5014 en el perro Joanie. (A) muestra el tiempo R (tiempo de reacción); (B) muestra el tiempo K (tiempo desde el final de R hasta que el coágulo alcanza 20 mm, la velocidad de formación del coágulo); (C) muestra el ángulo (la tangente de la curva que se hace a medida que se alcanza K); y (D) muestra la MA (amplitud máxima).
Figura 106A-D. Muestra la cinética por TEG a lo largo del tiempo después de la administración de MOD-5014 en el perro NO5. (A) muestra el tiempo R (tiempo de reacción); (B) muestra el tiempo K (tiempo desde el final de RT hasta que el coágulo alcanza 20 mm, la velocidad de formación del coágulo); (C) muestra el ángulo (la tangente de la curva que se hace a medida que se alcanza K); y (D) muestra la MA (amplitud máxima).
Figura 107 A-D. Muestra el cambio en el desempeño por TEG después de la administración de 270 pg/kg de rhFVIIa (A) muestra el tiempo R (tiempo de reacción). (B) muestra el ángulo (la tangente de la curva que se hace a medida que se alcanza K). (C) muestra el tiempo K (tiempo desde el final de RT hasta que el coágulo alcanza 20 mm, la velocidad de formación del coágulo). (D) muestra la MA (amplitud máxima).
Figura 108A-D. Muestra el efecto por TEG extendido de MOD-5014, datos representativos de un animal individual (Blondie). (A) muestra el tiempo R (tiempo de reacción). (B) muestra el tiempo K (tiempo desde el final de RT hasta que el coágulo alcanza 20 mm, la velocidad de formación del coágulo). (C) muestra el ángulo (la tangente de la curva que se hace a medida que se alcanza K). (D) muestra la MA (amplitud máxima). Flechas en (B), (C) y (D) apuntan a los valores de TEG para MOD-5014 4 horas después de la dosificación.
Figura 109. Muestra el mapa del plásmido pCI-dhfr-MOD-5014.
Figura 110. Muestra el perfil PK-PD representativo combinado de estudios de toxicología en ratas, en donde la velocidad de cambio de la concentración plasmática (ng/ml) a lo largo del tiempo se designa mediante los cuadrados en blanco y la velocidad de cambio de actividad (mU/ml) a lo largo del tiempo se designa mediante los círculos en blanco.
Figura 111. Muestra el perfil PK-PD representativo combinado de estudios de toxicología en monos, en donde la velocidad de cambio de la concentración plasmática (ng/ml) a lo largo del tiempo se designa mediante círculos en blanco y la velocidad de cambio de actividad (mU/ml) a lo largo del tiempo se designa con cuadrados en blanco.
Figura 112. Concentración media de MOD-5014 en plasma frente al tiempo después de la administración por bolo IV en monos cynomolgus machos.
Figura 113. Actividad de coagulación media de MOD-5014 frente al tiempo después de la administración por bolo IV en monos cynomolgus machos.
Figura 114. Comparación de la concentración plasmática de MOD-5014 y la actividad de coagulación después de la inyección por bolo IV de 1 pg/kg en monos cynomolgus machos.
Figura 115. Comparación de la concentración plasmática de MOD-5014 y la actividad de coagulación después de la inyección por bolo IV de 7,5 pg/kg en monos cynomolgus machos.
Figura 116. Comparación de la concentración plasmática de MOD-5014 y la actividad de coagulación después de la inyección por bolo IV de 15 pg/kg en monos cynomolgus machos.
Figuras 117A-117R. Concentraciones plasmáticas individuales de MOD-5014 y actividad de coagulación frente al tiempo.
Figura 118. Intensidad media de fluorescencia de plaquetas tratadas con MOD-5014 o FVIIa.
Figura 119. Generación de trombina en plaquetas tratadas con MOD-5014 o FVIIa.
Figura 120. Muestra una comparación de la actividad de escisión del sustrato (Pefachrome FVIIa) entre FVIIa (NovoSeven) y Factor VIIa modificado con CTP (MOD-5014).
Figura 121. Muestra una comparación de la actividad del sustrato (Pefachrome FVIIa) entre FVIIa (NovoSeven) y el Factor VIIa modificado con CTP (MOD-5014) cuando se une al factor tisular.
Figuras 122. Muestra una comparación de la generación de Factor X activado por FVIIa (NovoSeven) o FVIIa modificado con CTP (MOD-5014), en vista de la concentración de Factor VIIa.
Figura 123. Muestra una comparación de la generación de Factor X activado por FVIIa (NovoSeven) o FVIIa modificado con CTP (MOD-5014), en vista de la concentración de Factor X.
Figuras 124A y 124B. Muestra una comparación de la velocidad de generación de Factor X activado por FVIIa (NovoSeven) o FVIIa modificado con CTP (MOD-5014), en ausencia de factor tisular y en vista de la concentración de lípidos (124A). Muestra una comparación de la generación de Factor X activado por FVIIa (NovoSeven) o FVIIa modificado con CTP (MOD-5014), en ausencia de factor tisular y en vista de la concentración de lípidos (124B).
Figura 125. Muestra una comparación de la generación de Factor X activado entre FVIIa (NovoSeven) y MOD- 5014, en ausencia de factor tisular y en vista de la concentración de Factor X.
Figura 126. Muestra una comparación de la inhibición de la escisión del sustrato (Pefachrome FVIIa) por FVIIa (NovoSeven) y FVIIa modificado con CTP (MOD-5014) en vista de polibreno.
Figuras 127A-127C. Muestra una comparación de la inhibición de la escisión del sustrato (FXa de Pefachrome) por FVIIa (NovoSeven) y FVIIa modificado con CTP (MOD-5014) en vista de la concentración de TFPI (FIGURA 127A) y la duración de la exposición a TFPI para FVIIa (FIGURA 127B) y MOD-5014 (127C).
Descripción detallada de la presente invención
La presente invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende un tampón, un agente de tonicidad y un polipéptido modificado con péptido carboxi terminal de gonadotropina coriónica (CTP) que consiste de un factor de coagulación Factor VII y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica (CTP) unidos al extremo carboxi terminal de dicho factor de coagulación, en donde dicho polipéptido no incluye un péptido señal, y en donde dicha formulación tiene un pH de 6,4 a 6,5, dicho tampón es citrato 20 mM y glicina 13,3 mM, y dicho agente de tonicidad es cloruro de sodio 150 mM.
Como se describe en la presente descripción, en una modalidad, el CTP actúa como protector contra la degradación del factor de coagulación Factor VII. En otra modalidad, CTP extiende la Cmáx del factor de coagulación Factor VII. En otra modalidad, CTP extiende el Tmáx del factor de coagulación Factor VII. En otra modalidad, CTP extiende la semivida circulatoria del factor de coagulación Factor VII. En algunas modalidades, CTP mejora la potencia del factor de coagulación Factor VII.
Como se describe en la presente descripción, la unión de los CTP al extremo carboxi terminal del factor de coagulación extiende la semivida biológica del factor de coagulación.
En una modalidad, la formulación es para una administración una vez a la semana a un sujeto que tiene hemofilia A o B. En otra modalidad, el sujeto tiene una deficiencia de factor de coagulación. En otra modalidad, el sujeto tiene hemofilia adquirida.
En otra modalidad, la descripción se refiere a un proceso para producir una formulación farmacéutica para una administración una vez a la semana a un sujeto que tiene una deficiencia del factor de coagulación, o tiene una hemofilia, el proceso comprende las etapas de:
a) modificar un factor de coagulación Factor VII al unir tres CTP de gonadotropina coriónica al extremo carboxi terminal de dicho factor de coagulación;
b) mezclar el factor de coagulación modificado en la etapa a. con dicho tampón, y dicho agente de tonicidad a un pH de aproximadamente 6,4; y,
c) llenar previamente una jeringa con dicha formulación.
En una modalidad, la descripción se refiere a un proceso para llenar una jeringa con una formulación proporcionada en la presente descripción que comprende las etapas de:
a) formular una forma de dosificación de una vez a la semana de dicho factor de coagulación Factor VII modificado con CTP que tiene una cantidad predeterminada de factor de coagulación modificado con CTP; y b) llenar la jeringa con dicha formulación.
En una modalidad, una "composición farmacéutica" o una "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en la presente descripción con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes fisiológicamente aceptables. El propósito de una composición farmacéutica o una "formulación farmacéutica" es facilitar la administración de un compuesto a un organismo. En ciertas modalidades, una "composición farmacéutica" o una "formulación farmacéutica" proporciona la forma de dosificación farmacéutica de un fármaco. "Composiciones farmacéuticas" o "formulaciones farmacéuticas" en ciertas modalidades incluyen tecnologías de liberación lenta, parches transdérmicos o cualquier forma de dosificación conocida en la técnica.
El factor de coagulación VII (FVII) es una glicoproteína de 444 aminoácidos (50 KDa) secretada por los hepatocitos hacia el torrente sanguíneo como una proenzima inactiva. Tras la lesión tisular y la exposición a la sangre circulante, el FVII forma un complejo con el factor tisular (TF), que es una proteína receptora verdadera del FVII y se expresa por diversas células localizadas en las capas más profundas de la pared del vaso. La formación de este complejo FVII-TF conduce a la activación de FVII. El FVII activado (FVIIa) inicia la vía de coagulación extrínseca al activar el Factor IX y el Factor X.
El FVII pertenece a un grupo de glicoproteínas dependientes de la vitamina K asociadas con el sistema de coagulación. Además de FVII, este grupo consiste de Factor IX, Factor X, Proteína C y protrombina. Estas proteínas tienen organizaciones de dominio similares y se sintetizan como precursores con un propéptido N-terminal seguido por una secuencia de aminoácidos madura. El propéptido contiene un sitio de acoplamiento para la gammacarboxilasa que convierte los ácidos glutámicos (Glu) en ácidos gamma carboxiglutámicos (Gla). Este dominio es seguido de dos dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF), una región de conexión (CR) y un dominio de serina proteasa C-terminal. Antes de la secreción, el propéptido de FVII se escinde lo que forma un zimógeno de cadena sencilla de 406 aminoácidos glicoproteína FVII. Después de la secreción, la proteína puede activarse hacia un heterodímero de dos cadenas unido por disulfuro, FVIIa, mediante escisión en la CR. La concentración plasmática de FVII es 10 nM y aproximadamente el 1 % circula en la forma activa en individuos sanos. En otras modalidades, un FVII modificado con CTP comprende la ocupación de al menos un sitio de glicosilación ligado a O. En otras modalidades, un FVIIa modificado con CTP comprende la ocupación de al menos un sitio de glicosilación ligado a O.
En otra modalidad, la presente descripción se refiere a un método para extender la semivida biológica de un polipéptido de Factor VIIa (FVIIa), que comprende la etapa de unir tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica (CTP) al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVIIa, o que extiende de esta manera la semivida biológica de dicho polipéptido de FVIIa.
En otra modalidad, la presente descripción se refiere a un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) de un polipéptido del Factor VIIa (FVIIa), que comprende la etapa de unir tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica (CTP) al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVIIa, lo que mejora de esta manera el AUC de dicho polipéptido FVIIa.
En una modalidad, el factor de coagulación es el Factor VIIa (FVIIa). En otra modalidad, el factor de coagulación es el Factor VII (FVII). En otra modalidad, el factor de coagulación es un FVII recombinante. En otra modalidad, el factor de coagulación es un FVIIa recombinante. En otra modalidad, el factor de coagulación recombinante no comprende un péptido señal. En otra modalidad, el factor de coagulación activado no comprende un péptido señal.
En otra modalidad, la formulación farmacéutica comprende un polipéptido de Factor VIIa (FVIIa) modificado con CTP que consiste de un polipéptido de FVIIa y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina (CTP) unidos al extremo carboxi terminal de dicho FVIIa.
En otra modalidad, el factor de coagulación se sintetiza como un precursor con un propéptido N-terminal. En otra modalidad, el factor de coagulación como se usa en la presente está en una forma de proenzima inactiva. En otra modalidad, el factor de coagulación se produce en los hepatocitos. En otra modalidad, el factor de coagulación comprende un sitio de acoplamiento para la gammacarboxilasa que convierte los ácidos glutámicos (Glu) en ácidos gamma carboxiglutámicos (Gla). En otra modalidad, el factor de coagulación como se usa en la presente es un factor de coagulación disponible comercialmente.
En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor VII comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:
Cicgágg&caiggtictccc&ggccctcagg'ctcctctgcütictgcttgggtttcágggctgüciggcigcagtcticgtaactcagga gg aagc C c acggc g le ctgcac c ggcg c c ggc gcgccaacgc g IL cct ggaggagctgc g gee g ggc l c g iig aggg agt gcaaggaggagcaglgclccücg3ggaggcccgggíigalc*tcaaggacg)cgg3gaggacg¡ia^cígt±clggattlclÉacagtg aiggggaaa^tgigffiteaagicciitguagiulgggggctcctgcaiiggiAcagctfcagtcctiiitiitetgíttetgúdüKtgcc ttcgagggccggaactglgag^cactiaggalgflcaigctgajtctgflgtgaHCgpgaac&gcggctgféagicagltiíjlgciigtga ccjicácgggcacctiagcgctcctgtcggtgccacgággggtacktctgclggcagacggggtglíí.'tgcacaccíacjigttgflíLtó trrat^^aaa;ii;irfniHi'tí>gaaaaiiagiaatgcfjgi;aMfl:aaiggeegMtg1ggg^ggcaag^tgtgCfl3aiaagg gg agtg I ce atggc aggt ce tgttgttgg tgaat£ga gcí c agttgl g tgggggg accctgatcaac aecaíctggg Igg I etee gcgg cccjctgUtcgacaaaatcaagaactggaggajcctgatcgcgglj'ictgggcgagcacgBcctcagcgagcacgacggggalga gdagagccggcgggtggtgcaggtfiiicaiiCccíagcajcgtíLcgtcccgggcajCíaccaaccatgacÉiicgcgcigciiCcgcctg c ac c agcccg tggtr lI e a c tgac caígtggtgee c etetg c c Lgc c c g □ acgg acgttcíe 1 g agaggacgc tggccUcgí gege ü ctcaligglcagcggctggggccagcígctggaccgtggcgcciicggocctggagclcatgg^cclcaacgtgpcccggctgatga'c ccjggactgcctgcagcag tcacggaag gtgggag ae tce ce u a aíat c a cgg agía c atgt tetg tgc cggc i a c ícgg a íggcag caag gac (ce tgc a aggg ggac a gtggag gcccac algccac ce ac i accggggc acgtggtac e ígaegggc u ícg i c age tgg ggct-'ugggctgcgcaajKgtgggdcactiÉgggg^giacajdíagggtcidíicagiacaiiCgggtggctgdiaaaagctcatgicgcica gagccacgcocaggígticctcoigcgflgcaxatttccotgaggatgicggccgc iSFQ )D NO; 11 y
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor VII comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
MVSQAERLLCLLLGLQGC1AAVFVTQEEAHGVI HRRRRANAFlJ^RLRPGSI HRECK REQCSFRR AREIFKD AERTKLFWISY5DGDQC ASS POQNGGSCKDQLQSY1CFCLPAFF GRNCFTHK DDQUCVNENGGCEQYCSDHTGTIGISCRCHEGYS LLADGVSCTFTVE Y PCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECFWQVJ J ,1 ,VNGAQLCGGrT l JNTIW W S AAHCFDKIKNWRNUA VLGEHDLSEHDGDEQSRR VAQVITPSTY VPGTTNH DIALLRL
] IQPVV LTDHV VPLCLPERTFS ERTLAFVRFSL VSGWGQLLDRGAT ALELMVLN VPRL MTQ DCLQQlS R K V G DS PNÍTEYMFC AG Y5DG5KD5CKGDSGGPHATHYRGTW YLTGI YSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMR5EPRPGVLLRAPFP (SRQ ÍE> NO: 9).
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor VII comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: M VSQ A r ,R LI r m JGI -QGCI - A A VF VTQEF A HG V LH R lí lí R A N A FI.EF LRPCiS I .F-R RCK ] -:FQCSEl :k A R t ■: J EK D AER T KI .EWIS YSDGDQCAS SPCQK GGSCKDQLQS YICFCLP AFR GR NCF,TH KDDQIJCVNENGGCEQ YCSDHTGTKRSCRCHEG YSLLADG VSCTPTVEY PCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWWS AAHCFDKIKNWRNL1AVLGEHDLSEHDGDEQ5RRVAQVHPSTYVPGTTNHDIALLRL HQPWLTF>H V VPLCr .PERTFSERTI-AFVRFSL VSGWGQLLDRGATAERLM VLN VPR]. MTQ DCLQQSRK VGDSPNr FEYM FC AG YSDGS KDSCKGD5GGFHAIHYRGTWYI .TGT VSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSLFRPG VLL R A Pl ’P+CCÜ R (SLQ M NO: 10).
Como se describe en la presente descripción, una secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor VII-CTP (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 12. Una secuencia de aminoácidos del Factor VII-CTP (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor VII-CTP-CTP (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14. Una secuencia de aminoácidos del Factor VII-CTP-CTP (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15.
En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico del Factor VII-CTP-CTP-CTP (unida al extremo carboxi terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:
ctcg aggac atgg tete c c aggc c c tc-ag ge tccte tg c c t ic igc tigggc i icüggg^i gccíggctgc^g ttftcg laacccagga g g s iag eecaeg g cg icc [ge n tc g g c g c c g g ^ g c ^ c c a a c g c g l t u c tg g a g g a g e ig c g g e e g g g c L eec ig g ag ag g g ag i g ca a g g a g ¡ta g c a g íg e lc e 11 eg ag E .ag gtc -cg gg aga lc fl caa ggaL-geggagagg.ae g a a g d j '.r Let gga l [ l el l ac ag lg a lg g g g a c c a g t g tgcc-lcaag tcca l g .ccagaalggg£gc-lcc l ge aagg. accagc tc c a g lc c ta l atcl ge 11 cdgcct cccl gee llcgu gggecggLi ue l g tg a g a c g c a c a a g g a l g aee L L g d .g a te lg lg tg aacg ag aacg g cg g c l.g lg ag cag (.ac lg cag tg a ue Lieaegggu l l c l aagcgu t e d g tcg gtg u u a e g a g g g g la c l c le tg c lg g u li í ; a c g g g g lg l c c lg c a c a c e c a c a g llg a a ta lecadglggaaaaad ac c la l Ic la g a a a a ^ a g a a y lg c .'e a g c a a a c c c c iia g g c c g a a tlg lg g g g g g c a a g g lg l g ccc ca aa g g g g a g tg lc e a lg g e a g g tc e lg lig U g g lg L i a lg gagu le a g l tg lg lg g g g g g a c c c tg a t u u ue aeea l u tg g g íg g l e le c g c g g ee ea c lg L1 teg aeaaaalcaagauetggaggaLLee L gategegglgc tg g g c g a g e a e g a c c Leagcgagc a u g a e g g g g a lg a g c tg a g e c g g c g g g Lg gegu a g g lc a te a i c t c c uge a cg ta cg lcc tig g g ca ixa ccw ca cg uca1 cgcgctgc Lccgcc Lg e a c e a g e e e g lg g le e le a e lg a e c a ig tg g tg c c e e tc lg c e lg e e e g a a e g g a e g tl t le tg a g a g g u c g c lg g c e ltc g l g c g c lt c Leal Ig g tea g e g g e l ggg gccügc tged ggac cg Lggcgu ca cg g cec Lggagel c u lgg tee tca acg Lg c ce cg g e tg u lg ae cc ngguetg ce Lgeag e ugi c Lieggaaggtgggagac te e ee aaa l a le a c g g a g la c a i g l Lclgtg ccgg c L ue i c g g a tg g e a g O A A ggactcctgcaag g g g g ac ag tg g a g g c c c a c a tg c c a c c c ac t a ccgg ggc a c gt g g ta c c t gacc g g cat c g l g a g c l g g g g e c a g g g e Lgegeea e c g lg g g c e a c ltc g g c g Lgta cao c u g g g lg tc ce agí ue ul t g a g tg g ttg c ugaaac Lgalgagaag e g a g o e c u g a e e c g g c g tg e lg c lg a g a g c c c c e llc e c c a g e a g c a .g e le e a ü g g ü e e e lc o e c e ta g e c tg c e e a g c ü L -ta g c a g a e lg c e tg g g c c c ag lg a c uecccl a le e lg c e l c a g tü c a g e tü c a g ta a g g e e e c a c c c e c 1 a g ec tg c c l LCtcdtCl eg g etg ce ig g c c c c a g c g a ta c tc c a á t celg coccaglc c [c e a g e a g la tig g c U e c e c l ce a lc tc l geca i ceeecageag j c i g eeag g ece lte lg iL ta ca ec ü a tee lL ec aca g lg a lg ag g L itc eg cg g ü c g c tL a a ltaa -C.SF.Q ID NO: 2-L).
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor VII-CTP-CTP-CTP (unida al extremo carboxi terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVL-HRRRRANAFLEELRPGSLERECK EEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICF-CLPAFE GRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEY PCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVS
AAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRL HQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRL MTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGI VSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPS PSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGP SDTPILPQ (SEQ ID NO: 25). En otra modalidad, los aminoácidos 1-38 de SEQ ID NO: 25 comprenden una secuencia señal.
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor VII-CTP-CTP-CTP (unida al extremo carboxi terminal) que carece de un péptido señal, comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: ANAFLEELRP GSLERECKEE QCSFEEAREI FKDAERTKLF WISYSDGDQC ASSPCQNGGS CKDQLQSYIC FCLPAFEGRN CETHKDDQLI CVNENGGCEQ YCSDHTGTKR SCRCHEGYSL LADGVSCTPT VEYPCGKIPI LEKRNASKPQ GRIVGGKVCP KGECPWQVLL LVNGAQLCGG TLINTIWVVS AAHCFDKIKN WRNLIAVLGE HDLSEHDGDE QSRRVAQVII PSTYVPGTTN HDIALLRLHQ PVVLTDHVVP LCLPERTFSE RTLAFVRFSL VSGWGQLLDR GATALELMVL NVPRLMTQDC LQQSRKVGDS PNITEYMFCA GYSDGSKDSC KGDSGGPHAT HYRGTWYLTG IVSWGQGCAT VGHFGVYTRV SQYIEWLQKL MRSEPRPGVL LRAPFPSSSS KAPPPSLPSP SRLPGPSDTP ILPQSSSSKA PPPSLPSPSR LPGPSDTPIL PQSSSSKAPP PSLPSPSRLP GPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 46).
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor VII-CTP-CTP-CTP activado (unida al extremo carboxi terminal) (FVIIa-CTP3) carece de un péptido señal y comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 46. En otra modalidad, FVIIa-CTP3 carece de un péptido señal y comprende un homólogo de SEQ ID NO: 46. En otra modalidad, FVIIa-CTP3 carece de un péptido señal y comprende una variante de SEQ ID NO: 46. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos de FVIIa-CTP3 está escindida entre arginina (R) en el residuo 152 e isoleucina (I) en el residuo 153. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos de FVIIa-CTP3 está presente estructuralmente como un heterodímero de dos cadenas unido por disulfuro que comprende un puente S-S disulfuro entre los residuos de cisteína presentes en cada una de las cadenas. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos de FVIIa-CTP3 está presente estructuralmente como un heterodímero que comprende una cadena ligera y una cadena pesada unidas por un enlace -S-S- disulfuro entre un residuo de cisteína presente en la cadena ligera y un residuo de cisteína presente en la cadena pesada. En otra modalidad, la cadena ligera comprende un fragmento N-terminal de la secuencia de aminoácidos de FVIIa-CTP3 y la cadena pesada comprende un fragmento C-terminal de la secuencia de aminoácidos de FVIIa-CTP3. En otra modalidad, los residuos de cisteína pueden ser cualquier residuo de cisteína en cualquier cadena. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos de FVIIa-CTP3 está presente estructuralmente como un heterodímero de dos cadenas unidas por disulfuro que comprende un puente S-S entre el residuo de cisteína 135 y el residuo de cisteína 262 de SEQ ID NO: 46, en donde dichas dos cadenas comprenden una cadena ligera que comprende los aminoácidos 1-152 y una cadena pesada que comprende los aminoácidos 153-490.
En otra modalidad, una cadena ligera migra a aproximadamente 25 kDA en un SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes. En otra modalidad, una cadena pesada migra a aproximadamente 50 kDA en un SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes. En otra modalidad, una cadena pesada migra a aproximadamente 60 kDA en un SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes.
Como se describe en la presente descripción, una secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor VII-(CTP)4 (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 26. Una secuencia de aminoácidos del Factor VII-(CTP)4 (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor VII-(CTP)5 (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 28. Una secuencia de aminoácidos del Factor VII-(CTP)5 (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 29.
Como se describe en la presente descripción, una secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor IX comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 16. Una secuencia de aminoácidos del Factor IX comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor IX-CTP (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 18. Una secuencia de aminoácidos del Factor IX-CTP (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 19. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor IX-CTP-CTP (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 20. Una secuencia de aminoácidos del Factor IX-CTP-CTP (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor IX-(CTP)3 (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 30. Una secuencia de aminoácidos del Factor IX-(CTP)3 (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 31. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor IX-(CTP)4 (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 32. Una secuencia de aminoácidos del Factor IX-(CTP)4 (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 33. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor IX-(CTP)5 (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 34. Una secuencia de aminoácidos del Factor IX-(CTP)5 (unida al extremo carboxi terminal) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 35.
En otra modalidad, se adiciona furina a una célula que expresa el factor de coagulación-CTP de la descripción. En otra modalidad, la furina aumenta la eficiencia de producción de un factor de coagulación-CTP de la descripción en una célula. En otra modalidad, la furina se transfecta conjuntamente con el vector que comprende la secuencia codificante del factor de coagulación-CTP de la descripción. En otra modalidad, la furina está codificada por un vector separado. En otra modalidad, la furina y un factor de coagulación-CTP están codificados por un vector. En otra modalidad, la secuencia codificante de furina se inserta en pCI-DHFR. En otra modalidad, la secuencia codificante de furina se modifica por ingeniería genética en el pCI-dhfr/smaI+NotI, Furin/AsisI F.I.+NotI.
En otra modalidad, la secuencia del ácido nucleico que codifica la furina comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 22). En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos de la furina comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 23.
En una modalidad, el término factor de coagulación incluye además un homólogo del factor de coagulación, que tiene actividad coagulante. En algunas modalidades, homología abarca deleción, inserción o variantes por sustitución, lo que incluye una sustitución de aminoácidos, de estos y fragmentos de polipéptidos biológicamente activos de estos. En una modalidad, la variante comprende sustituciones conservadoras, o deleciones, inserciones o sustituciones que no alteran significativamente la estructura tridimensional del factor de coagulación. En otra modalidad, la deleción, inserción o sustitución no altera la función de interés del factor de coagulación, que en una modalidad, se une a una pareja de unión particular.
En otra modalidad, homólogos, por ejemplo, polipéptidos que son al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 87 %, al menos 89 %, al menos 91 %, al menos 93 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % homólogos a un factor de coagulación según lo determinado mediante el uso del software BlastP del National Center of Biotechnology Information (NCBI) mediante el uso de parámetros predeterminados.
En otra modalidad, la descripción incluye homólogos de furina. En otra modalidad, la descripción incluye homólogos de furina que mantienen una función de interés, que en una modalidad es la escisión de una proteína precursora. En otra modalidad, homólogos, por ejemplo, polipéptidos que son al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 87 %, al menos 89 %, al menos 91 %, al menos 93 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % homólogos a una furina según lo determinado mediante el uso del software BlastP del National Center of Biotechnology Information (NCBI) mediante el uso de parámetros predeterminados.
Debe entenderse que las formulaciones de la presente invención que comprenden los elementos como se describió en la presente descripción pueden, en otra modalidad, consistir de esos elementos, o en otra modalidad, consistir esencialmente de esos elementos. En algunas modalidades, el término "comprende" se refiere a la inclusión del agente activo indicado, tal como el factor de coagulación modificado con CTP, así como también a la inclusión de otros agentes activos y portadores, excipientes, emolientes, estabilizadores, etc. farmacéuticamente aceptables, como se conocen en la industria farmacéutica. En algunas modalidades, el término "que consiste esencialmente en" se refiere a una composición, cuyo único ingrediente activo es el ingrediente activo indicado, sin embargo, pueden incluirse otros compuestos que son para estabilizar, conservar, etc. la formulación, pero que no están involucrados directamente en el efecto terapéutico del ingrediente activo indicado. En algunas modalidades, el término "que consiste esencialmente en" puede referirse a componentes que facilitan la liberación del ingrediente activo. En algunas modalidades, el término "consistente" se refiere a una composición que contiene el ingrediente activo y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En esta invención, el factor de coagulación no tiene CTP en su extremo amino terminal.
En otra modalidad, la presente solicitud describe un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste de un polipéptido del Factor VIIa (FVIIa) y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina (CTP) unidos al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVIIa. En otra modalidad, la presente solicitud describe una composición que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido del Factor VIIa (FVIIa) y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina (CTP) unidos al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVIIa. En una modalidad, el FVIIa modificado con CTP incluye un péptido señal. En otra modalidad, el FVIIa modificado con CTP no incluye un péptido señal.
En una modalidad, los CTP que están unidos al extremo carboxi terminal del factor de coagulación se unen en tándem al extremo carboxi terminal.
En una modalidad, un factor de coagulación modificado por ingeniería genética como se describe en la presente descripción tiene una actividad biológica equivalente o mejorada en comparación con el factor de coagulación no modificado con CTP. En otra modalidad, un factor de coagulación modificado por ingeniería genética como se describe en la presente descripción tiene medidas farmacológicas equivalentes o mejoradas en comparación con el factor de coagulación no modificado con CTP. En otra modalidad, un factor de coagulación modificado por ingeniería genética como se describe en la presente descripción tiene una farmacocinética equivalente o mejorada en comparación con el factor de coagulación no modificado con CTP. En otra modalidad, un factor de coagulación modificado por ingeniería genética como se describe en la presente descripción tiene una farmacodinámica equivalente o mejorada en comparación con el factor de coagulación no modificado con CTP.
En una modalidad, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de un trastorno de la coagulación. En otra modalidad, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de la hemofilia en un sujeto. En otra modalidad, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica para su uso en la prevención y el tratamiento de la hemofilia en un sujeto. En otra modalidad, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica para su uso en el tratamiento de la hemofilia en un sujeto.
En una modalidad, la hemofilia es hemofilia A. En otra modalidad, la hemofilia es hemofilia B. En otra modalidad, la formulación farmacéutica de esta invención es para su uso en la prevención y el tratamiento de pacientes con hemofilia adquirida (hemofilia sin inhibidores). En otra modalidad, la formulación farmacéutica de esta invención es para su uso en la prevención o el tratamiento de un trastorno de la coagulación para prevenir o tratar la hemofilia A o B sin inhibidores. En otra modalidad, la hemofilia es hemofilia grave. En otra modalidad, la hemofilia es hemofilia moderada. En otra modalidad, la hemofilia es hemofilia de moderada a grave con o sin inhibidores. Un experto en la técnica apreciará que el término "hemofilia moderada a grave" se refiere a un sujeto que tiene menos de o igual al 3 % de FVIII o FIX.
Por lo tanto, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica que comprende un polipéptido del Factor VII (FVII) modificado con CTP que comprende un polipéptido de FVII y tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVII para su uso en la prevención o el tratamiento de un trastorno de la coagulación en dicho sujeto.
En otra modalidad, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica que comprende un polipéptido de Factor VIIa modificado con CTP (FVIIa) que comprende un polipéptido de FVIIa y tres gonadotropina carboxi coriónica péptidos terminales (CTP) unidos al terminal carboxi de dicho polipéptido de FVIIa para su uso en la prevención o el tratamiento de la hemofilia en dicho sujeto.
En otra modalidad, la presente invención proporciona el tratamiento de la hemofilia en un sujeto mediante la administración de más de un factor de coagulación modificado con CTP como se describe en la presente descripción a dicho sujeto. Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido de Factor IX modificado con CTP (FIX) que comprende un polipéptido FIX y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica (CTP) unidos al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FIX y la formulación farmacéutica que comprende un polipéptido de Factor VIIa (FVIIa) modificado con CTP que comprende un polipéptido de FVIIa y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica (CTP) unidos al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido de FVIIa para su uso en el tratamiento de la hemofilia en dicho sujeto. En una modalidad, el FIX modificado con CTP y el FVIIa modificado con CTP se administran en la misma composición al mismo tiempo. En otra modalidad, el FIX modificado con CTP y el FVIIa modificado con CTP se administran en composiciones separadas al mismo tiempo. En otra modalidad, el FIX modificado con CTP y el FVIIa modificado con CTP se administran en composiciones separadas en momentos separados.
En otra modalidad, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de la hemofilia en un sujeto mediante la administración subcutánea o intravenosa de la formulación farmacéutica que comprende un polipéptido del Factor VII modificado con CTP y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica (CTP) unidos al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVII a dicho sujeto, lo que previene o trata de esta manera la hemofilia en dicho sujeto. En otra modalidad, un Factor IX modificado con CTP (FIX) y un polipéptido de Factor VII modificado con CTP que comprenden un polipéptido FIX y FVII y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica (CTP) unidos al extremo carboxi terminal de dicho FIX y dicho polipéptido FVII se administran por vía subcutánea o intravenosa a dicho sujeto, lo que previene o trata de esta manera la hemofilia en dicho sujeto.
En otra modalidad, dicho factor de coagulación modificado con CTP consiste de la SEQ ID NO: 46.
En otra modalidad, la presente solicitud describe una célula que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste en un polipéptido del Factor VII (FVII) y tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina unidos al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVII.
En otra modalidad, la presente solicitud describe una composición que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste de un polipéptido del Factor VII (FVII) y tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina unidos al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVII.
En otra modalidad, la presente solicitud describe que la unión de tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica (CTP) al extremo carboxi terminal de un polipéptido de FVII extiende de esta manera la semivida biológica de dicho polipéptido de FVII.
En otra modalidad, la presente solicitud describe que la unión de tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica (CTP) al extremo carboxi terminal de un polipéptido de FVII mejora de esta manera el AUC de dicho polipéptido de FVII.
En otra modalidad, la presente solicitud describe que la unión de tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina coriónica al extremo carboxi terminal de un polipéptido de FVII reduce de esta manera la frecuencia de dosificación de dicho polipéptido de FVII.
En otra modalidad, la presente solicitud describe que la unión de tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica (CTP) al extremo carboxi terminal de un polipéptido de FVII reduce de esta manera la velocidad de aclaramiento de dicho polipéptido de FVII.
En otra modalidad, la solicitud de la presente invención describe un método para producir un polipéptido de Factor VII modificado con CTP (FVII), que comprende la etapa de unir tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina coriónica al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVII, lo que produce de esta manera un polipéptido FVII modificado con CTP.
En otra modalidad, la presente solicitud describe un método para tratar la hemofilia en un sujeto que comprende administrar un polipéptido del Factor VII modificado con CTP (FVII) que comprende un polipéptido de FVII y tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido a FVII a dicho sujeto, lo que trata de esta manera la hemofilia en dicho sujeto.
En otras modalidades, el factor de coagulación modificado por ingeniería genética es para el tratamiento de pacientes con hemofilia B. En otras modalidades, el factor de coagulación modificado por ingeniería genética puede reducir el número de infusiones necesarias para un paciente, reducir las dosis necesarias para un paciente o una combinación de estas.
En otra modalidad, la administración SC da como resultado una mayor biodisponibilidad de FVII modificado con CTP en comparación con el FVII recombinante. En otra modalidad, la semivida es más larga y la biodisponibilidad (AUC SC/AUC IV) es mayor después de la administración de FVIIa-CTP3 y CTP5 SC en comparación con la administración SC de NovoSeven®. En otra modalidad, MOD-5014 y MOD-5019 inyectados por vía subcutánea muestran una supervivencia mejorada de los ratones en comparación con el FVII recombinante (NovoSeven®) (ver el Ejemplo 8 más abajo).
En una modalidad, MOD-5014 es FVIIa-CTP3 (que tiene tres péptidos CTP unidos en el extremo C-terminal). En una modalidad, MOD-5014 proporciona un factor de coagulación de acción prolongada. En una modalidad, MOD-5014 proporciona una respuesta de coagulación sanguínea más sostenida y prolongada en comparación con el FVIIa humano recombinante. (Ver, por ejemplo, el Ejemplo 14). Un experto en la técnica apreciará que los términos MOD-5014 o FVIIa-CTP3 pueden usarse indistintamente y tienen todas las mismas cualidades y significados, y se refieren en una modalidad, a una estructura heterodimérica de dos cadenas unidas por disulfuro que comprende el aminoácido SEQ ID NO: 46. Además, un experto en la técnica apreciaría que al describir los factores de coagulación modificados con CTP, por ejemplo, FVII-CTP3, el término FVII-CTP3 puede, en ciertos casos, referirse a la forma inactiva de FVII-CTP3. El experto en la técnica reconocerá sin duda a qué forma se hace referencia basado en los detalles asociados, tales como la actividad. De manera similar, mientras que el término MOD-5014 es intercambiable con el término FVIIa-CTP3, es decir, representa la forma activa del factor de coagulación modificado con CTP, en ciertos casos el término MOD-5014 puede usarse para indicar una forma activa de FVII o una secuencia de nucleótidos que codifica un FVII-CTP3 , que después se expresará y secretará de una célula, y se purificará y activará in vitro, lo que da como resultado que la forma activa de FVIIa esté presente en una molécula MOD- 5014.
En una modalidad, la desactivación de MOD-5014 por el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) depende de la dosis. En una modalidad, la desactivación de MOD-5014 por TFPI muestra un patrón de desactivación dependiente de la dosis similar al de FVIIa recombinante (NovoSeven®) por TFPI. En una modalidad, MOD-5014 se inhibe por la anti-trombina III. En una modalidad, la inhibición de MOD-5014 por la anti-trombina III aumenta en presencia de heparina. En una modalidad, la inhibición de MOD-5014 por la antitrombina III muestra un patrón de inhibición similar al del FVIIa recombinante (NovoSeven®), en presencia o ausencia de heparina. (ver el Ejemplo 11 más abajo)
En una modalidad, MOD-5014 genera trombina en una manera dependiente de la dosis. En una modalidad, MOD-5014 disminuye la fase de retardo de la generación de trombina. En una modalidad, MOD-5014 disminuye el tiempo de coagulación de la sangre. En una modalidad, MOD-5014 aumenta la eficiencia de la formación de coágulos sanguíneos. En una modalidad, la administración de MOD-5014 reduce el tiempo de coagulación de la sangre en un sujeto. En una modalidad, la administración de MOD-5014 aumenta la eficiencia de la formación de coágulos de sangre en un sujeto. En una modalidad, la generación de trombina por MOD-5014 es similar a la producida por el FVIIa recombinante (NovoSeven®). En una modalidad, la disminución de la fase de retardo de la generación de trombina por MOD-5014 es similar a la producida por el FVIIa recombinante (NovoSeven®). En una modalidad, la disminución del tiempo de coagulación de la sangre por MOD-5014 es similar a la producida por el FVIIa recombinante (NovoSeven®). En una modalidad, el aumento de la eficiencia de la formación de coágulos de sangre por MOD-5014 es similar a la producida por el FVIIa recombinante (NovoSeven®) (ver el Ejemplo 12 más abajo).
Como se proporciona en la presente descripción, las uniones de CTP a factores de coagulación de la sangre, por ejemplo, los factores FVII y FVIIA, aumentan la semivida del factor de coagulación de la sangre. Los Ejemplos 11, 12 y 13 muestran que las uniones de CTP, por ejemplo, tres CTP unidos a FVIIA, no parecen afectar las actividades de coagulación de la sangre. En una modalidad, las uniones de CTP a FVII no interfieren con la formación de coágulos de sangre. En una modalidad, las uniones de CTP a FVII no interfieren con el aumento de la eficiencia de la formación de coágulos de sangre. En una modalidad, las uniones de CTP a FVII no interfieren con la disminución del tiempo de coagulación de la sangre. En una modalidad, la unión de fosfolípidos a FVII se mantiene después de la unión de CTP al factor de coagulación de la sangre. En una modalidad, las uniones de CTP a FVIIA no interfieren con la formación de coágulos de sangre. En una modalidad, las uniones de CTP a FVIIA no interfieren con el aumento de la eficiencia de la formación de coágulos de sangre. En una modalidad, las uniones de CTP a FVIIA no interfieren con la disminución de la formación de coágulos de sangre. En una modalidad, la unión de fosfolípidos a FVIIA se mantiene después de la unión de CTP al factor de coagulación de la sangre.
El Ejemplo 14 muestra los resultados de administrar MOD-5014 a un mamífero grande (perros). La administración de MOD-5014 proporcionó un FVIIa de acción prolongada efectivo y seguro para la coagulación de la sangre. El tratamiento mediante el uso de MOD-5014 puede ser profiláctico o bajo demanda. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar la hemofilia en un sujeto que comprende administrar MOD-5014 a dicho sujeto, lo que trata de esta manera la hemofilia en dicho sujeto. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para prevenir el sangrado excesivo en un sujeto que comprende administrar MOD-5014 a dicho sujeto, lo que evita de esta manera el sangrado excesivo en dicho sujeto. En una modalidad, la presente invención proporciona un método de tratamiento profiláctico de la hemofilia en un sujeto que comprende administrar MOD-5014 a dicho sujeto, lo que trata de esta manera profilácticamente la hemofilia en dicho sujeto.
En una modalidad, el tratamiento de la hemofilia en un sujeto con MOD-5014 comprende una frecuencia de administración reducida de MOD-5014, en comparación con el FVIIa recombinante (NovoSeven®). En una modalidad, el tratamiento profiláctico de la hemofilia en un sujeto con MOD-5014 comprende una frecuencia reducida de administración de MOD-5014, en comparación con el FVIIa recombinante (NovoSeven®). En una modalidad, prevenir el sangrado excesivo en un sujeto con MOD-5014 comprende una frecuencia reducida de administración de MOD-5014, en comparación con el FVIIa recombinante (NovoSeven®).
En una modalidad, el Factor de coagulación VII que comprende 3 CTP en tándem en su extremo carboxi terminal exhibe un perfil PK mejorado a la vez que mantiene su actividad de coagulación frente a NovoSeven® (ver Tabla 59 y FIGURA 36).
En otra modalidad, los términos "péptido CTP", "péptido carboxi terminal" y "secuencia de CTP" se usan indistintamente en la presente descripción. En otra modalidad, el péptido carboxi terminal es un CTP de longitud completa.
En otra modalidad, un péptido señal está unido al extremo amino del CTP, como se describió en el documento US 7,553,940. En otra modalidad, ningún péptido señal está unido al extremo amino terminal del CTP.
En otras modalidades, el término factor de coagulación modificado por ingeniería genética se refiere a la secuencia de aminoácidos de un factor de coagulación madurado. En otras modalidades, el término factor de coagulación modificado por ingeniería genética se refiere a la secuencia de aminoácidos del factor de coagulación que incluye su secuencia señal o péptido señal.
En otra modalidad, "secuencia señal" y "péptido señal" se usan indistintamente en la presente descripción y tiene todas las mismas cualidades y significados. En otra modalidad, "secuencia” cuando se usa en referencia a una molécula de polinucleótido puede referirse a una porción codificante. En otra modalidad, un factor de coagulación modificado por ingeniería genética que comprende al menos un CTP como se describe en la presente descripción tiene una actividad biológica in vivo potenciada en comparación con el mismo factor de coagulación sin al menos un CTP. En una modalidad, la actividad biológica mejorada se deriva de la semivida más larga del factor de coagulación modificado por ingeniería genética a la vez que mantiene al menos algo de actividad biológica. En otra modalidad, la actividad biológica potenciada se deriva de la actividad biológica potenciada resultante de la modificación con CTP. En otra modalidad, la actividad biológica potenciada proviene tanto de una semivida más larga como de la funcionalidad potenciada del factor de coagulación modificado con CTP.
En algunas modalidades, al menos una secuencia de CTP en el extremo carboxi terminal del factor de coagulación proporciona una protección potenciada contra la degradación de un factor de coagulación. En algunas modalidades, al menos una secuencia de CTP en el extremo carboxi terminal del factor de coagulación proporciona una protección potenciada contra el aclaramiento. En algunas modalidades, al menos una secuencia de CTP en el extremo carboxi terminal del factor de coagulación proporciona un tiempo de aclaramiento prolongado. En algunas modalidades, al menos una secuencia de CTP en el extremo carboxi terminal del factor de coagulación potencia su Cmáx. En algunas modalidades, al menos una secuencia de CTP en el extremo carboxi terminal del factor de coagulación potencia su Tmáx. En algunas modalidades, al menos una secuencia de CTP en el extremo carboxi terminal del factor de coagulación prolonga su T1.
En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado de esta invención se usa de la misma manera que un factor de coagulación conjugado no modificado. En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado de esta invención tiene un aumento en el tiempo de semivida en circulación y el tiempo de residencia en plasma, disminución de la eliminación, y aumento de la actividad clínica in vivo. En otra modalidad, debido a las propiedades mejoradas del factor de coagulación conjugado como se describe en la presente descripción, este conjugado se administra con menos frecuencia que la forma no modificada del mismo factor de coagulación.
En otra modalidad, la frecuencia de administración disminuida dará como resultado una estrategia de tratamiento mejorada, que, en una modalidad, conducirá a un cumplimiento mejorado del paciente que conduce a resultados de tratamiento mejorados, así como también a una calidad de vida mejorada del paciente. En otra modalidad, en comparación con los conjugados convencionales de factores de coagulación, se ha descubierto que los conjugados que tienen el peso molecular y la estructura del enlazador de los conjugados de esta invención tienen una potencia mejorada, estabilidad mejorada, niveles elevados de AUC y mayor semivida en circulación.
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica o una formulación farmacéutica que comprende un polipéptido de Factor VIIa modificado con CTP (FVIIa) que consiste de un polipéptido de FVIIa y tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina unidos al extremo carboxi terminal de dicho FVIIa.
En otra modalidad, se proporciona en la presente descripción una composición farmacéutica que comprende el factor de coagulación conjugado como se describe en la presente descripción. En otra modalidad, se proporciona en la presente descripción una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del factor de coagulación conjugado como se describe en la presente descripción. En una modalidad, una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de coagulación conjugado se determina de acuerdo con factores tales como el tipo exacto de afección que se trata, el estado del paciente que se trata, así como también los otros ingredientes en la composición.
En esta invención, la formulación farmacéutica comprende un polipéptido que consiste de un factor de coagulación y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxi terminal del factor de coagulación, y comprende además un tampón y un agente de tonicidad. El tampón es citrato 20 mM y glicina 13,3 mM, y el agente de tonicidad es NaCl 150 mM, y la formulación tiene un pH de aproximadamente 6,4. En otra modalidad, el tampón es citrato 20 mM y glicina 13,3 mM, y el agente de tonicidad es NaCl 150 mM, y el pH es 6,4. En otra modalidad, la formulación es una formulación líquida. En otra modalidad, la formulación es una formulación liofilizada. En otra modalidad, la formulación líquida puede formarse mediante el uso de un factor de coagulación modificado con CTP liofilizado. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP es FVII-CTP-CTP-CTP. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP es FVIIa-CTP-CTP-CTP.
En otra modalidad, se proporciona en la presente descripción una forma de dosificación semanal que comprende la formulación farmacéutica proporcionada en la presente descripción. En otra modalidad, se proporciona en la presente descripción una forma de dosificación una vez al día que comprende la formulación farmacéutica proporcionada en la presente descripción. En otra modalidad, se proporciona en la presente descripción una forma de dosificación en días alternos que comprende la formulación farmacéutica proporcionada en la presente descripción. En otra modalidad, se proporciona en la presente descripción una forma de dosificación cada tres días que comprende la formulación farmacéutica proporcionada en la presente descripción. En otra modalidad, se proporciona en la presente descripción una forma de dosificación dos veces por semana que comprende la formulación farmacéutica proporcionada en la presente descripción. En otra modalidad, se proporciona en la presente descripción una forma de dosificación dos veces por semana que comprende la formulación farmacéutica proporcionada en la presente descripción. En otra modalidad, se proporciona en la presente descripción una forma de dosificación semanal que comprende la formulación farmacéutica proporcionada en la presente descripción. En otra modalidad, se proporciona en la presente descripción una forma de dosificación quincenal (cada dos semanas) que comprende la formulación farmacéutica proporcionada en la presente descripción.
En otra modalidad, la formulación tiene una mayor estabilidad. En una modalidad, la formulación es estable durante al menos un año. En otra modalidad, la formulación es estable durante al menos dos años.
En otra modalidad, la formulación farmacéutica se formula en una forma de dosificación intranasal. En otra modalidad, la formulación farmacéutica se formula en una forma de dosificación inyectable.
Se describe que el uso de la formulación farmacéutica aumenta el cumplimiento en el uso de la terapia con factor de coagulación.
En otra modalidad, se administra un factor de coagulación modificado por CTP a un sujeto una vez al día. En otra modalidad, se administra un polipéptido que comprende un factor de coagulación modificado por CTP a un sujeto una vez cada dos días. En otra modalidad, se administra un factor de coagulación modificado por CTP a un sujeto una vez cada tres días. En otra modalidad, se administra un factor de coagulación modificado por CTP a un sujeto una vez cada cuatro días. En otra modalidad, se administra un factor de coagulación modificado por CTP a un sujeto una vez cada cinco días. En otra modalidad, se administra un factor de coagulación modificado por CTP a un sujeto una vez cada seis días. En otra modalidad, un factor de coagulación modificado por CTP se administra a un sujeto una vez por semana. En otra modalidad, se administra un factor de coagulación modificado por CTP a un sujeto una vez cada 7-14 días. En otra modalidad, se administra un factor de coagulación modificado por CTP a un sujeto una vez cada 10-20 días. En otra modalidad, se administra un factor de coagulación modificado por CTP a un sujeto una vez cada 5-15 días. En otra modalidad, se administra un factor de coagulación modificado por CTP a un sujeto una vez cada 15-30 días.
En una modalidad, la preparación de la presente invención se formula en formulaciones líquidas para inyección mediante una jeringa o dispositivo tipo pluma.
En una modalidad, las formulaciones proporcionadas en la presente descripción comprenden, además, conservantes, tales como cloruro de benzalconio y tiomersal y similares; agentes quelantes, tales como edetato de sodio y otros; tampones tales como fosfato, citrato y acetato; agentes de tonicidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol y otros; antioxidantes tales como ácido ascórbico, acetilcistina, metabisulfito de sodio y otros; agentes aromáticos; agentes para el ajuste de la viscosidad, tales como polímeros, lo que incluye celulosa y sus derivados; y alcohol polivinílico y ácidos y bases para ajustar el pH de estas composiciones acuosas según sea necesario. Las composiciones comprenden, además, anestésicos locales u otros agentes activos. Las composiciones pueden usarse como atomizadores, nebulizadores, gotas y similares.
En una modalidad, un factor de coagulación como se describe en la presente descripción es un factor de coagulación humano.
En otra modalidad, una formulación farmacéutica que comprende un factor de coagulación conjugado como se describe en la presente descripción es útil en el tratamiento de sujetos afectados por un trastorno de la formación de coágulos o de la coagulación. En otra modalidad, el trastorno de la coagulación o de la coagulación es la hemofilia. En otra modalidad, la formulación farmacéutica es útil en la terapia profiláctica de la hemofilia lo que reduce por lo tanto el riesgo de sangrado y complicaciones asociadas. En otra modalidad, la reducción del riesgo de sangrado y las complicaciones asociadas reduce el riesgo de sangrado espontáneo. En otra modalidad, la reducción del riesgo de sangrado y las complicaciones asociadas reduce el riesgo de sangrado excesivo. En otra modalidad, la formulación farmacéutica es útil en el tratamiento de sujetos afectados por hemofilia a la vez que reduce el riesgo de desarrollar anticuerpos inhibidores de factores de coagulación administrados exógenamente. En otra modalidad, la formulación farmacéutica es útil en el tratamiento de sujetos afectados por hemofilia lo que induce por lo tanto la homeostasis.
En una modalidad, una formulación farmacéutica que comprende un factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención tiene usos terapéuticos. En otra modalidad, una formulación farmacéutica que comprende un factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención tiene usos profilácticos.
En otra modalidad, una formulación farmacéutica que comprende un factor de coagulación conjugado como se describe en la presente descripción es útil en el tratamiento de sujetos que experimentan sangrado o hematomas excesivos o que tienen un tiempo de protrombina (PT) o tiempo de tromboplastina parcial (PTT) prolongado. En otra modalidad, una formulación farmacéutica que comprende un factor de coagulación conjugado como se describe en la presente descripción es útil en el tratamiento de sujetos que tienen una afección adquirida que provoca sangrado, tal como deficiencia de vitamina K o enfermedad hepática. En otra modalidad, una formulación farmacéutica que comprende un factor de coagulación conjugado como se describe en la presente descripción es útil en el tratamiento de sujetos que tienen deficiencias en factores de coagulación que son adquiridos (debido a otras enfermedades) o heredados, leves o severos, permanentes o temporales. En otra modalidad, una formulación farmacéutica que comprende un factor de coagulación conjugado como se describe en la presente descripción es útil en el tratamiento de sujetos afectados por hemofilia A. En otra modalidad, una formulación farmacéutica que comprende un factor de coagulación conjugado como se describe en la presente descripción es útil en el tratamiento de sujetos afectados con hemofilia B. En otra modalidad, una formulación farmacéutica que comprende un factor de coagulación conjugado como se describe en la presente descripción es útil en el tratamiento de sujetos que tienen deficiencias adquiridas debido a enfermedades crónicas, tales como enfermedad hepática o cáncer; a una afección aguda tal como la coagulación intravascular diseminada (DIC), que consume factores de coagulación a un ritmo rápido; o a una deficiencia de vitamina K o al tratamiento con un antagonista de la vitamina K como la warfarina (la producción de los factores II, VII, IX y X requiere vitamina K). En otra modalidad, una formulación farmacéutica que comprende un factor de coagulación conjugado como se describe en la presente descripción es útil en el tratamiento de sujetos afectados por una enfermedad que provoca desequilibrios de coagulación tales como, pero no limitados a: una enfermedad hepática, uremia, cáncer, un trastorno de la médula ósea, una exposición al veneno de serpiente, una deficiencia de vitamina K, una terapia de anticoagulación, una ingestión accidental del anticoagulante warfarina, múltiples transfusiones de sangre (las unidades de sangre almacenadas pierden algunos de sus factores de coagulación) o una combinación de estos. En otra modalidad, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica para su uso en el tratamiento de la trombosis venosa profunda en un sujeto. En otra modalidad, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica para su uso en la prevención de sangrados incontrolados en un sujeto con hemofilia. En otra modalidad, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica para su uso en la prevención de episodios de sangrado en un sujeto con hemofilia. En otra modalidad, la presente invención proporciona la formulación farmacéutica para su uso en el control de episodios de sangrado en un sujeto con hemofilia B (deficiencia congénita del factor IX).
En una modalidad, una composición de esta invención comprende una formulación como se describe en la presente descripción.
En otra modalidad, las formulaciones de la presente invención se usan para el tratamiento de episodios de sangrado en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores de FVIII o FIX y en pacientes con hemofilia adquirida; prevención de sangrado en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores de FVIII o FIX y en pacientes con hemofilia adquirida; tratamiento de episodios de sangrado en pacientes con deficiencia congénita de FVII y prevención de sangrado en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en pacientes con deficiencia congénita de FVII. La hemofilia adquirida es un trastorno autoinmune espontáneo en el que los pacientes con hemostasia previamente normal desarrollan autoanticuerpos contra factores de coagulación, con mayor frecuencia FVIII. El desarrollo de autoanticuerpos contra el FVIII conduce a una deficiencia de FVIII, que da como resultado una generación insuficiente de trombina por el factor IXa y el complejo de Factor VIIIa a través de la vía intrínseca de la cascada de la coagulación. Las siguientes afecciones pueden asociarse con la hemofilia A adquirida: idiopática, embarazo, trastornos autoinmunitarios, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerativa trastornos dermatológicos (por ejemplo, psoriasis, pénfigo), enfermedades respiratorias (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica), reacciones alérgicas a fármacos, diabetes, infección por hepatitis B aguda, infección por hepatitis C aguda, neoplasias malignas: tumores sólidos (próstata, pulmón, colon, páncreas, estómago, vías biliares, cabeza y cuello, cuello uterino, mama, melanoma, riñón), neoplasias hematológicas. El experto en la técnica apreciará que los trastornos autoinmunitarios pueden incluir artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, arteritis temporal, síndrome de sjogren, anemia hemolítica autoinmune, síndrome de Goodpasture, miastenia gravis, enfermedad de Graves, hipotiroidismo autoinmune. El experto en la técnica apreciará que pueden producirse reacciones alérgicas a un sujeto al que se le administra penicilina y sus derivados, sulfamidas, fenitoína, cloranfenicol, metildopa, tioxanteno de depósito, interferón alfa, fludarabina, vacunación con bacilo de calmette-guérin (BCG), desvenlafaxina. El experto en la técnica apreciará que las neoplasias malignas hematológicas pueden incluir leucemia linfocítica crónica, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, síndrome mielodisplásico, mielofibrosis y eritroleucemia. Por lo tanto, y en una modalidad, en la presente descripción se describe una formulación farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de la hemofilia adquirida en un sujeto.
En otra modalidad, las formulaciones de la presente invención son para su uso en el tratamiento o prevención de sangrados musculares. En otra modalidad, las formulaciones de la presente invención son para su uso en el tratamiento o prevención de sangrados articulares. En otra modalidad, las formulaciones de la presente invención proporcionan tratamiento terapéutico o profiláctico de la epistaxis y sangrado de encías, sangrado de membranas mucosas, sangrado en el sistema nervioso central. En otra modalidad, las formulaciones de la presente invención proporcionan un tratamiento terapéutico o profiláctico de sangrado gastrointestinal o cerebral. En otra modalidad, las formulaciones de la presente invención proporcionan un tratamiento terapéutico o profiláctico de sangrados leves de baja frecuencia. En otra modalidad, las formulaciones de la presente invención proporcionan un tratamiento terapéutico o profiláctico de sangrados moderados de baja frecuencia. En otra modalidad, las formulaciones de la presente invención proporcionan un tratamiento terapéutico o profiláctico de sangrados leves de alta frecuencia. En otra modalidad, las formulaciones de la presente invención proporcionan un tratamiento terapéutico o profiláctico de sangrados moderados de alta frecuencia.
En una modalidad, las formulaciones de la presente invención proporcionan un tratamiento terapéutico o profiláctico de la hemofilia asintomática. En otra modalidad, las formulaciones de la presente invención proporcionan un tratamiento terapéutico o profiláctico de la hemofilia leve a moderada. En otra modalidad, las formulaciones de la presente invención proporcionan un tratamiento terapéutico o profiláctico de la hemofilia grave.
En una modalidad, las formulaciones de la presente invención proporcionan un tratamiento terapéutico o profiláctico de la hemorragia, que en una modalidad, es una hemorragia incontrolable y, en otra modalidad, una hemorragia intracerebral. En otra modalidad, las formulaciones de la presente invención proporcionan tratamiento terapéutico o profiláctico de coagulopatías neonatales; enfermedad hepática grave; procedimientos quirúrgicos de alto riesgo; pérdida de sangre traumática; trasplante de médula ósea; trombocitopenias y trastornos de la función plaquetaria; reversión urgente de la anticoagulación oral; deficiencias congénitas de los factores V, VII, X y XI; o enfermedad de von Willebrand, en una modalidad, enfermedad de von Willebrand con inhibidores del factor von Willebrand.
En una modalidad, una formulación farmacéutica que comprende un factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención es para su uso en el tratamiento de la hemofilia o una enfermedad relacionada como se describe en la presente descripción en un sujeto. En una modalidad, el sujeto es un humano. En otra modalidad, el sujeto es un niño humano. En otra modalidad, el sujeto es un animal domesticado. En otra modalidad, el sujeto es un mamífero. En otra modalidad, el sujeto es un animal de granja. En otra modalidad, el sujeto es un mono. En otra modalidad, el sujeto es un caballo. En otra modalidad, el sujeto es una vaca. En otra modalidad, el sujeto es un ratón. En otra modalidad, el sujeto es una rata. En otra modalidad, el sujeto es canino. En otra modalidad, el sujeto es felino. En otra modalidad, el sujeto es bovino, ovino, porcino, equino, murino o cervino. En una modalidad, el sujeto es masculino. En otra modalidad, el sujeto es femenino. En una modalidad, el sujeto es un niño, en otra modalidad, un adolescente, en otra modalidad, un adulto o, en otra modalidad, un sujeto anciano. En otra modalidad, el sujeto es un sujeto pediátrico, en otra modalidad, un sujeto geriátrico.
En otra modalidad, un [(CTP) n>1-factor de coagulación] como se describe en la presente descripción comprende un factor de coagulación de longitud completa o un fragmento activo de este conectado mediante un enlace peptídico en su extremo carboxi terminal a al menos una unidad CTP sin ningún CTP en su extremo amino terminal. En otra modalidad, un [(CTP) n>1-factor de coagulación] como se describe en la presente descripción comprende un factor de coagulación o un fragmento activo de este conectado mediante un enlace peptídico a al menos una unidad de CTP que se conecta a una unidad de CTP adicional mediante un enlace peptídico sin ningún CTP en su extremo amino terminal. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico codifica un factor de coagulación modificado por ingeniería genética que comprende al menos un CTP unido a su extremo C terminal y ningún CTP en su extremo amino terminal.
En otra modalidad, el CTP se une al factor de coagulación mediante un enlazador. En otra modalidad, el enlazador que conecta la secuencia de CTP al factor de coagulación es un enlace covalente. En otra modalidad, el enlazador que conecta la secuencia de CTP al factor de coagulación es un enlace peptídico. En otra modalidad, el enlazador que conecta la secuencia de CTP al factor de coagulación es un enlace peptídico sustituido. En otra modalidad, la secuencia de CTP comprende: DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (SEQ ID NO: 1). En otra modalidad, la secuencia de CTP comprende: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 2). En otra modalidad, la secuencia del CTP comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias que se establece en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.
En otra modalidad, el péptido carboxi terminal (CTP) comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 112 a la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana, como se expone en la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, la secuencia del CTP comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 118 a la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana, como se expone en la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la secuencia de CTP también comienza desde cualquier posición entre las posiciones 112-118 y termina en la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana. En algunas modalidades, el péptido con secuencia de CTP tiene 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34 aminoácidos de longitud y comienza en la posición 112, 113, 114, 115, 116, 117 o 118 de la secuencia de aminoácidos de CTP.
En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 1-5 sustituciones de aminoácidos conservadoras como se describe en la patente de Estados Unidos núm. 5,712,122. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 1 sustitución de aminoácidos conservadora. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 2 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 3 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 4 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 5 sustituciones de aminoácidos conservadoras.
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP es al menos 70 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido de esta. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP es al menos 80 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido de esta. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP es al menos 90 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido de esta. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP es al menos 95 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido de esta. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP es al menos 98 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido de esta.
En otra modalidad, el polinucleótido que codifica el péptido CTP de la presente invención es al menos 70 % homóloga a la secuencia de ADN del CTP humano nativo o un péptido de este. En otra modalidad, el polinucleótido que codifica el péptido CTP es al menos 80 % homóloga a la secuencia de ADN del CTP humano nativo o un péptido de este. En otra modalidad, el polinucleótido que codifica el péptido CTP es al menos 90 % homóloga a la secuencia de ADN del CTP nativo o un péptido de este. En otra modalidad, el polinucleótido que codifica el péptido CTP es al menos 95 % homóloga a la secuencia de ADN del CTP nativo o un péptido de este. En otra modalidad, el polinucleótido que codifica el péptido CTP es al menos 98 % homóloga a la secuencia de ADN del CTP nativo o un péptido de este.
En una modalidad, al menos una de las secuencias de aminoácidos de CTP de la gonadotropina coriónica está truncada. En otra modalidad, 2 de las secuencias de aminoácidos de CTP de la gonadotropina coriónica están truncadas. En otra modalidad, las 3 secuencias de aminoácidos de CTP de la gonadotropina coriónica están truncadas. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 10 aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, la SEQ ID NO: 3 comprende la siguiente secuencia de aminoácidos (AA): SSSSKAPPPSLP.
En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 10 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la SEQ ID NO: 2 comprende la siguiente secuencia de aminoácidos (AA): SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.
En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 11 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 12 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 3. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 13 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 14 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 6 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 3. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 5 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 3.
En una modalidad, al menos una de las secuencias de aminoácidos de CTP de la gonadotropina coriónica está glicosilada. En otra modalidad, 2 de las secuencias de aminoácidos de CTP de la gonadotropina coriónica están glicosiladas. En otra modalidad, las 3 secuencias de aminoácidos de CTP de gonadotropina coriónica están glicosiladas.
En una modalidad, la secuencia de CTP comprende al menos un sitio de glicosilación. En una modalidad, la secuencia de CTP comprende 2 sitios de glicosilación. En una modalidad, la secuencia de CTP comprende 3 sitios de glicosilación. En una modalidad, la secuencia de CTP comprende 4 sitios de glicosilación. En una modalidad, una o más de las secuencias de aminoácidos de CTP de la gonadotropina coriónica está completamente glicosilada. En otra modalidad, una o más de las secuencias de aminoácidos de CTP de la gonadotropina coriónica está parcialmente glicosilada. En una modalidad, parcialmente glicosilado indica que uno de los sitios de glicosilación de CTP está glicosilado. En otra modalidad, dos de los sitios de glicosilación de CTP están glicosilados. En otra modalidad, tres de los sitios de glicosilación de CTP están glicosilados.
En algunas modalidades, la modificación de la secuencia de CTP es ventajosa para permitir el uso de dosis más bajas. En algunas modalidades, la modificación de las secuencias de CTP es ventajosa para permitir el uso de dosis más bajas. En algunas modalidades, la modificación de las secuencias de CTP es ventajosa para permitir un efecto seguro de acción duradera.
En algunas modalidades, “polipéptido”, “factor de coagulación modificado por ingeniería genética” o “proteína” como se usa en la presente, abarca polipéptidos nativos (ya sea productos de degradación, polipéptidos sintetizados sintéticamente o polipéptidos recombinantes) y peptidomiméticos (típicamente, polipéptidos sintetizados sintéticamente), así como también peptoides y semipeptoides que son análogos de polipéptidos, que tienen, en algunas modalidades, modificaciones que hacen que los polipéptidos que comprenden un factor de coagulación sean incluso más estables mientras están en un cuerpo o más capaces de penetrar en las células.
En algunas modalidades, las modificaciones incluyen, pero no se limitan a, modificación del extremo C terminal, modificación del enlace polipeptídico, lo que incluye, pero no se limita a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH o CF=CH, modificaciones de la cadena principal, y modificación de residuos. Los métodos para preparar compuestos peptidomiméticos se conocen bien en la técnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992). A continuación se proporcionan más detalles a este respecto.
En algunas modalidades, se sustituyen enlaces polipeptídicos (-CO-NH-) dentro del polipéptido. En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces N-metilados (-N(CH3)-CO-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces éster (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces de cetometileno (-CO-CH2-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces a-aza (-NH-N(R)-CO-), en donde R es cualquier alquilo, por ejemplo, metilo, enlaces carba (-CH2-NH-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces de hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces de tioamida (-CS-NH-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por dobles enlaces olefínicos (-CH=CH-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces retroamida (-NH-CO-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por derivados de polipéptidos (-N(R)-CH2-CO-), en donde R es la cadena lateral “normal” que se presenta naturalmente en el átomo de carbono. En algunas modalidades, estas modificaciones se producen en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena polipeptídica y en una modalidad en varios (2-3 enlaces) al mismo tiempo.
En algunas modalidades, los aminoácidos aromáticos naturales del polipéptido tales como Trp, Tyr y Phe, se sustituyen por ácidos sintéticos no naturales tales como fenilglicina, TIC, naftilelanina (Nol), derivados de Phe metilados en el anillo, derivados halogenados de Phe u o-metil-Tyr. En algunas modalidades, los polipéptidos en la formulación de la presente invención incluyen uno o más aminoácidos modificados o uno o más monómeros que no son aminoácidos (por ejemplo, ácido graso, carbohidratos complejos, etc.).
En una modalidad, se entiende que “aminoácido” o “secuencia de aminoácidos” incluye los 20 aminoácidos de origen natural; aquellos aminoácidos frecuentemente modificados postraduccionalmente in vivo, lo que incluye, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales lo que incluye, pero que no se limita a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, norvalina, norleucina y ornitina. En una modalidad, “aminoácido” incluye tanto D- como L-aminoácidos.
En algunas modalidades, los polipéptidos se usan en productos terapéuticos que requieren que los polipéptidos que comprenden un factor de coagulación estén en forma soluble. En algunas modalidades, los polipéptidos incluyen uno o más aminoácidos polares naturales o no naturales, que incluyen pero no se limitan a serina y treonina que son capaces de aumentar la solubilidad del polipéptido debido a su cadena lateral que contiene hidroxilo.
En algunas modalidades, el factor de coagulación modificado por ingeniería genética se utiliza en una forma lineal, aunque un experto en la técnica apreciará que en los casos en que la ciclización no interfiere gravemente con las características del factor de coagulación modificado por ingeniería genética, también pueden utilizarse formas cíclicas de los factores de coagulación modificados por ingeniería genética.
En algunas modalidades, los factores de coagulación modificados por ingeniería genética se sintetizan bioquímicamente tal como mediante el uso de técnicas estándar en fase sólida. En algunas modalidades, estos métodos bioquímicos incluyen síntesis en fase sólida exclusiva, síntesis parcial en fase sólida, condensación de fragmentos, o síntesis clásica en solución.
En algunas modalidades, se usan técnicas de proteínas recombinantes para generar los factores de coagulación modificados por ingeniería genética. En algunas modalidades, se usan técnicas de proteína recombinante para la generación de polipéptidos relativamente largos (por ejemplo, más de 18-25 aminoácidos). En algunas modalidades, se usan técnicas de proteína recombinante para la generación de grandes cantidades de los factores de coagulación modificados por ingeniería genética. En algunas modalidades, las técnicas recombinantes se describen por Bitter y otros, (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier y otros. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson y otros. (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu y otros. (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi y otros. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 y Brogli y otros, (1984) Science 224:838-843, Gurley y otros (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 y Weissbach y Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pp. 421­ 463.
En otra modalidad, la descripción proporciona una molécula de polinucleótido que comprende la porción codificante de un gen que codifica un polipéptido que comprende un factor de coagulación y péptidos carboxi terminales de gonadotropina unidos al extremo carboxi terminal del factor de coagulación, como se describió anteriormente. En otra modalidad, la descripción proporciona una molécula de polinucleótido que consiste de la porción codificante de un gen que codifica un polipéptido que comprende un factor de coagulación y péptidos carboxi terminales de gonadotropina unidos al extremo carboxi terminal del factor de coagulación, como se describió anteriormente. En otra modalidad, la descripción proporciona una molécula de polinucleótido que consiste esencialmente de la porción codificante de un gen que codifica un polipéptido que comprende un factor de coagulación y péptidos carboxi terminales de gonadotropina unidos al extremo carboxi terminal del factor de coagulación, como se describió anteriormente.
En otra modalidad, la descripción proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un factor de coagulación y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina unidos al extremo carboxi terminal del factor de coagulación, como se describió anteriormente. En otra modalidad, la descripción proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste de un factor de coagulación y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina unidos al extremo carboxi terminal del factor de coagulación, como se describió anteriormente. En otra modalidad, la descripción proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste esencialmente de un factor de coagulación y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina unidos al extremo carboxi terminal del factor de coagulación, como se describió anteriormente. En una modalidad, el polinucleótido es una secuencia de polinucleótidos. En una modalidad, el polinucleótido es una molécula de polinucleótido.
En otra modalidad, la descripción proporciona un vector de expresión que comprende una molécula de polinucleótido como se describe en la presente descripción. En otra modalidad, la presente solicitud describe un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste de un polipéptido del Factor VIIa (FVIIa) y tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina unidos al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVIIa.
En otra modalidad, la descripción proporciona una célula que comprende el vector de expresión como se describe en la presente descripción. En otra modalidad, la presente solicitud describe una célula que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste de un polipéptido del Factor VIIa (FVIIa) y tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina unidos al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVIIa.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste de un polipéptido del Factor VIIa (FVIIa) y tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina unidos al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVIIa.
En otra modalidad, la descripción proporciona una composición que comprende la célula como se describe en la presente descripción. En otra modalidad, la célula es una célula eucariota. En otra modalidad, la célula es una célula procariota.
En otra modalidad, la presente solicitud describe un método para producir un factor de coagulación modificado con CTP, que comprende la etapa de unir tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina coriónica al extremo carboxi terminal de dicho factor de coagulación, lo que produce de esta manera un factor de coagulación modificado con CTP. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un factor de coagulación modificado con CTP, que comprende la etapa de unir tres secuencias de polinucleótidos que codifican un péptido carboxi terminal (CTP) de gonadotropina coriónica al extremo carboxi terminal de una secuencia de polinucleótidos que codifica dicho factor de coagulación lo que produce de esta manera un factor de coagulación modificado con CTP. En otra modalidad, la solicitud describe un método para producir un polipéptido de Factor VIIa (FVIIa) modificado con CTP, que comprende la etapa de unir tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina coriónica al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVIIa, lo que produce de esta manera un polipéptido FVIIa modificado con CTP.
En otra modalidad, los factores de coagulación modificados por ingeniería genética se sintetizan mediante el uso de una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido. En algunas modalidades, la molécula de polinucleótido que codifica los factores de coagulación modificados por ingeniería genética se liga a un vector de expresión, que comprende un control transcripcional de una secuencia reguladora en cis (por ejemplo, una secuencia promotora). En algunas modalidades, la secuencia reguladora en cis es adecuada para dirigir la expresión constitutiva de un factor de coagulación modificado por ingeniería genética. En algunas modalidades, la secuencia reguladora en cis es adecuada para dirigir la expresión de los factores de coagulación modificados por ingeniería genética. En algunas modalidades, la secuencia reguladora en cis es adecuada para dirigir la expresión inducible de los factores de coagulación modificados por ingeniería genética.
En alguna modalidad, los promotores específicos de tejido adecuados para su uso con la presente invención incluyen secuencias que son funcionales en una o más poblaciones celulares específicas. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, promotores tales como el de albúmina que es específico del hígado [Pinkert y otros (1987) Genes Dev. 1:268-277], promotores específicos de tejidos linfoides [Calame y otros (1988) Adv. Immunol. 43:235-275]; en promotores particulares de receptores de células T [Winoto y otros (1989) EMBO J. 8:729-733] e inmunoglobulinas; [Banerji y otros (1983) Cell 33729-740], promotores específicos de neuronas tales como el promotor de neurofilamentos [Byrne y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 86:5473-5477], promotores específicos de páncreas [Edlunch y otros (1985) Science 230:912-916] o promotores específicos de glándulas mamarias como el promotor del suero de leche (patente de Estados Unidos núm. 4,873,316 y publicación de solicitud europea núm. 264,166). Los promotores inducibles adecuados para su uso con la presente invención incluyen, por ejemplo, el promotor inducible por tetraciclina (Srour, M.A., y otros, 2003. Thromb. Haemost. 90: 398-405).
En una modalidad, la frase “una molécula de polinucleótido” se refiere a una secuencia de ácido nucleico monocatenario o bicatenario que se aísla y se proporciona en forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótidos complementaria (ADNc), una secuencia de polinucleótidos genómica y/o una secuencia de polinucleótidos compuesta (por ejemplo, una combinación de los anteriores).
En una modalidad, una “secuencia de polinucleótidos complementaria” se refiere a una secuencia, que es el resultado de la transcripción inversa de un ARN mensajero mediante el uso de una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. En una modalidad, la secuencia puede amplificarse subsecuentemente in vivo o in vitro mediante el uso de una ADN polimerasa.
En una modalidad, una “secuencia de polinucleótidos genómica” se refiere a una secuencia derivada (aislada) de un cromosoma y por lo tanto representa una porción contigua de un cromosoma.
En una modalidad, una “secuencia de polinucleótidos compuesta” se refiere a una secuencia, que es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genómica. En una modalidad, una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias de exones necesarias para codificar el polipéptido, así como también algunas secuencias intrónicas interpuestas entre ellas. En una modalidad, las secuencias intrónicas pueden ser de cualquier fuente, que incluye otros genes, e incluirán típicamente secuencias señales de empalme conservadas. En una modalidad, las secuencias intrónicas incluyen elementos reguladores de la expresión que actúan en cis.
En una modalidad, después de la expresión y secreción, los péptidos señal se escinden de los factores de coagulación modificados por ingeniería genética precursores lo que da como resultado factores de coagulación modificados por ingeniería genética maduros que carecen de un péptido señal.
En algunas modalidades, los polinucleótidos se preparan mediante el uso de técnicas de PCR o cualquier otro método o procedimiento conocido por un experto en la técnica. En algunas modalidades, el procedimiento involucra la ligación de dos secuencias de ADN diferentes (ver, por ejemplo, “Current Protocols in Molecular Biology”, ed. Ausubel y otros, John Wiley & Sons, 1992).
En una modalidad, los polinucleótidos que codifican los factores de coagulación modificados por ingeniería genética se insertan en vectores de expresión (es decir, un constructo de ácido nucleico) para permitir la expresión del polipéptido recombinante. En una modalidad, el vector de expresión incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación e integración en procariotas. En una modalidad, el vector de expresión incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación e integración en eucariotas. En una modalidad, el vector de expresión incluye un vector lanzadera que hace que este vector sea adecuado para la replicación e integración en procariotas y eucariotas. En algunas modalidades, los vectores de clonación comprenden secuencias de inicio de la transcripción y la traducción (por ejemplo, promotores, potenciadores) y terminadores de la transcripción y la traducción (por ejemplo, señales de poliadenilación).
En una modalidad, una variedad de células procariotas o eucariotas pueden usarse como sistemas de expresión en huésped para expresar los factores de coagulación. En algunas modalidades, estos incluyen, pero sin limitarse a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con un vector de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN de cósmidos que contienen la secuencia codificante del polipéptido; levaduras transformadas con vectores de expresión en levaduras recombinantes que contienen la secuencia codificante del polipéptido; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes, tales como el plásmido Ti, que contiene la secuencia codificante del polipéptido.
En algunas modalidades, se usan sistemas de expresión no bacterianos (por ejemplo, sistemas de expresión en mamíferos tales como las células CHO) para expresar los factores de coagulación. En una modalidad, el vector de expresión usado para expresar polinucleótidos en células de mamíferos es el vector pCI-DHFR que comprende un promotor de CMV y un gen de resistencia a neomicina. La construcción del vector pCI-dhfr se describe, de acuerdo con una modalidad, en el Ejemplo 1.
En algunas modalidades, en sistemas bacterianos, un conjunto de vectores de expresión puede seleccionarse ventajosamente en dependencia del uso previsto para el polipéptido expresado. En una modalidad, se desean grandes cantidades de polipéptido. En una modalidad, se desean vectores que dirigen la expresión de altos niveles del producto proteico, posiblemente como una fusión con una secuencia señal hidrófoba, que dirige el producto expresado al periplasma de las bacterias o al medio de cultivo donde el producto proteico se purifica fácilmente. En una modalidad, ciertas proteínas de fusión se modifican por ingeniería genética con un sitio de escisión específico para ayudar en la recuperación del polipéptido. En una modalidad, los vectores adaptables a tal manipulación incluyen, pero sin limitarse a, la serie de pET de vectores de expresión de E. coli [Studier y otros, Methods in Enzymol. 185:60-89 (1990)].
En una modalidad, se usan sistemas de expresión en levaduras. En una modalidad, una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles pueden usarse en levaduras como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos. Núm: 5,932,447. En otra modalidad, se usan vectores que promueven la integración de secuencias de ADN extrañas en el cromosoma de levadura.
En una modalidad, el vector de expresión puede incluir, además, secuencias de polinucleótidos adicionales que permiten, por ejemplo, la traducción de varias proteínas a partir de un solo ARNm tal como un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) y secuencias para la integración genómica del promotor-polipéptido quimérico.
En algunas modalidades, los vectores de expresión en mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, comercializados por Invitrogen, pCI comercializado por Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV y pBK-CMV comercializados por Stratagene, pTRES comercializado por Clontech, y sus derivados.
En algunas modalidades, en la presente invención se usan vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas tales como retrovirus. Los vectores de SV40 incluyen pSVT7 y pMT2. En algunas modalidades, los vectores derivados del virus del papiloma bovino incluyen pBV-1MTHA, y los vectores derivados del virus de Epstein Bar incluyen pHEBO y p2O5. Otros vectores ilustrativos incluyen pMSG, pAV009/A+, pMT010/A+, pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV-40, promotor tardío de SV-40, promotor de metalotioneína, promotor del virus del tumor mamario murino, promotor del virus de sarcoma de Rous, promotor de polihedrina, u otros promotores que demuestran efectividad para la expresión en células eucariotas.
En algunas modalidades, los vectores virales recombinantes son útiles para la expresión in vivo de los factores de coagulación ya que ofrecen ventajas tales como infección lateral y especificidad de direccionamiento. En una modalidad, la infección lateral es inherente en el ciclo de vida de, por ejemplo, un retrovirus y es el proceso mediante el cual una célula infectada individual produce muchos viriones de progenie que brotan e infectan las células vecinas. En una modalidad, el resultado es que un área grande se infecta rápidamente, la mayoría de la cual no se infectó inicialmente por las partículas virales originales. En una modalidad, se producen vectores virales que no pueden propagarse lateralmente. En una modalidad, esta característica puede ser útil si el propósito deseado es introducir un gen específico en solo un número localizado de células objetivo.
Pueden usarse diversos métodos para introducir el vector de expresión en las células. Tales métodos se describen generalmente en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992), en Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang y otros, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega y otros, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa y otros [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Además, ver las patentes de EE. UU. núms. 5,464,764 y 5,487,992 para los métodos de selección positiva-negativa.
En algunas modalidades, la introducción de ácido nucleico por infección viral ofrece varias ventajas con respecto a otros métodos tales como la lipofección y electroporación, ya que puede obtenerse una mayor eficacia de transfección debido a la naturaleza infecciosa de los virus.
Se apreciará que los factores de coagulación modificados por ingeniería genética pueden expresarse, además, a partir de un constructo de ácido nucleico administrado al individuo mediante el empleo de cualquier modo de administración adecuado, descrito anteriormente (es decir, terapia génica in vivo). En una modalidad, el constructo de ácido nucleico se introduce en una célula adecuada a través de un vehículo/método de suministro de genes adecuado (transfección, transducción, recombinación homóloga, etc.) y un sistema de expresión según sea necesario y después las células modificadas se expanden en cultivo y se regresan al individuo (es decir, terapia génica ex-vivo).
En una modalidad, se usan vectores de expresión vegetal. En una modalidad, la expresión de una secuencia codificante del polipéptido está dirigida por una serie de promotores. En algunas modalidades, se usan promotores virales tales como los promotores ARN 35S y ARN 19S de CaMV [Brisson y otros, Nature 310:511-514 (1984)], o el promotor de la proteína de recubrimiento para TMV [Takamatsu y otros, EMBO J. 6:307-311 (1987)]. En otra modalidad, se usan promotores vegetales tales como, por ejemplo, la pequeña subunidad de RUBISCO [Coruzzi y otros, EMBO J. 3:1671-1680 (1984); y Brogli y otros, Science 224:838-843 (1984)] o promotores de choque térmico, por ejemplo, de soja hsp17.5-E o hsp17.3-B [Gurley y otros, Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)]. En una modalidad, los constructos se introducen en células vegetales mediante el uso de plásmido Ti, plásmido Ri, vectores virales vegetales, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación y otras técnicas conocidas por el experto en la técnica. Ver, por ejemplo, Weissbach y Weissbach [Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pp 421-463 (1988)]. También pueden usarse por la presente invención otros sistemas de expresión tales como sistemas de células huésped de insectos y de mamíferos, que se conocen bien en la técnica.
Se apreciará que además de contener los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada (que codifica el polipéptido), la construcción de expresión puede incluir además secuencias modificadas para optimizar la estabilidad, la producción, la purificación, el rendimiento o la actividad del polipéptido expresado.
En algunas modalidades, las células transformadas se cultivan bajo condiciones efectivas, que permitan la expresión de grandes cantidades de factores de coagulación recombinantes modificados por ingeniería genética. En algunas modalidades, las condiciones de cultivo eficaces incluyen, pero sin limitarse a, medios efectivos, condiciones del biorreactor, temperatura, pH y oxígeno que permitan la producción de proteínas. En una modalidad, un medio efectivo se refiere a cualquier medio en el que una célula se cultiva para producir el polipéptido recombinante. En algunas modalidades, un medio incluye típicamente una solución acuosa que tiene fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables, y sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas. En algunas modalidades, las células pueden cultivarse en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas Petri. En algunas modalidades, el cultivo se lleva a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para una célula recombinante. En algunas modalidades, la determinación de las condiciones de cultivo está dentro de la experiencia de un experto en la técnica.
En algunas modalidades, en dependencia del vector y el sistema de huésped usados para la producción, los factores de coagulación modificados por ingeniería genética resultantes permanecen dentro de la célula recombinante, se secretan hacia el medio de fermentación, se secretan hacia un espacio entre dos membranas celulares, tal como el espacio periplasmático en E. coli; o se retienen en la superficie exterior de una célula o membrana viral.
En una modalidad, después de un tiempo predeterminado en cultivo, se efectúa la recuperación del factor de coagulación modificado por ingeniería genética.
En una modalidad, la frase “recuperación del factor de coagulación recombinante modificado por ingeniería genética” usada en la presente descripción se refiere a recolectar todo el medio de fermentación que contiene el polipéptido y no necesita implicar etapas adicionales de separación o purificación.
En una modalidad, los factores de coagulación modificados por ingeniería genética se purifican mediante el uso de una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, tales como, pero no limitadas a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía con concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial.
En una modalidad, para facilitar la recuperación, la secuencia codificante expresada puede modificarse por ingeniería genética para codificar el factor de coagulación modificado por ingeniería genética y un resto escindible fusionado. En una modalidad, una proteína de fusión puede diseñarse de manera que el polipéptido pueda aislarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad; por ejemplo, mediante inmovilización en una columna específica para el resto escindible. En una modalidad, un sitio de escisión se modifica por ingeniería genética entre el factor de coagulación modificado por ingeniería genética y el resto escindible y el polipéptido puede liberarse de la columna cromatográfica mediante el tratamiento con una enzima o agente adecuado que escinde específicamente la proteína de fusión en este sitio [por ejemplo, ver Booth y otros, Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); y Gardella y otros, J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)].
En una modalidad, el factor de coagulación modificado por ingeniería genética se recupera en forma "sustancialmente pura".
En una modalidad, la frase “sustancialmente pura” se refiere a una pureza que permite el uso efectivo de la proteína en las aplicaciones descritas en la presente descripción.
En una modalidad, el factor de coagulación modificado por ingeniería genética también puede sintetizarse mediante el uso de sistemas de expresión in vitro. En una modalidad, los métodos de síntesis in vitro son bien conocidos en la técnica y los componentes del sistema están disponibles comercialmente.
En algunas modalidades, los factores de coagulación modificados por ingeniería genética recombinantes se sintetizan y purifican; su eficacia terapéutica puede analizarse ya sea in vivo o in vitro. En una modalidad, las actividades de unión de los factores de coagulación modificados por ingeniería genética recombinantes pueden determinarse mediante el uso de diversos ensayos como los conoce un experto en la técnica.
El factor de coagulación modificado por ingeniería genética se proporciona al individuo como parte de una composición farmacéutica en la que se mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.
En otra modalidad, una “composición farmacéutica” se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en la presente descripción con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.
En otra modalidad, el término “ingrediente activo” se refiere a la secuencia polipeptídica de interés, que es responsable del efecto biológico.
En una modalidad, la presente invención proporciona preparaciones combinadas. En una modalidad, “una preparación combinada” define especialmente un “kit de partes” en el sentido de que las parejas de combinación como se definió anteriormente pueden dosificarse independientemente o mediante el uso de diferentes combinaciones fijas con cantidades distinguidas de las parejas de combinación es decir, de manera simultánea, concurrente, separada o secuencialmente. Por tanto en algunas modalidades, las partes del kit de partes pueden, por ejemplo, administrarse simultáneamente o escalonarse cronológicamente, es decir en puntos temporales diferentes y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del kit de partes. La relación de las cantidades totales de las parejas de combinación, en algunas modalidades, puede administrarse en la preparación combinada. En una modalidad, la preparación combinada puede variarse, por ejemplo, para lidiar con las necesidades de una subpoblación de pacientes a tratar o las necesidades del paciente individual cuyas necesidades diferentes pueden deberse a una enfermedad en particular, a la gravedad de una enfermedad, la edad, el sexo o el peso corporal, lo que puede llevarse a cabo fácilmente por un experto en la técnica.
En otra modalidad, las frases “portador fisiológicamente aceptable” y “portador farmacéuticamente aceptable” que se usan indistintamente se refieren a un portador o un diluyente que no provoca irritación significativa en un organismo y no bloquea la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Estas frases incluyen un adyuvante. En una modalidad, uno de los ingredientes incluidos en el portador farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), un polímero biocompatible con un amplio intervalo de solubilidad en medios orgánicos y acuosos (Mutter y otros (1979)).
En otra modalidad, el término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un ingrediente activo. En una modalidad, los excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se encuentran en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
Esta invención contempla diversas modalidades de intervalos de dosificación. La dosificación del factor de coagulación modificado por ingeniería genética en la formulación de la presente invención, en una modalidad, está en el intervalo de 0,005-100 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 0,005-5 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 0,01-50 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 0,1-20 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 0,1-10 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 0,01-5 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 0,001-0,01 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 0,001-0,1 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 0,1-5 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 0,5-50 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 0,215 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 0,8-65 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 1-50 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 5-10 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 8-15 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en un intervalo de 10-20 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 20-40 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en un intervalo de 60-120 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 12-40 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 40-60 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en un intervalo de 50-100 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en un intervalo de 1-60 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 15-25 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 5-10 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en el intervalo de 55-65 mg/día.
En otra modalidad, la dosis está en un intervalo de 50-500 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en un intervalo de 50-150 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en un intervalo de 100-200 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en un intervalo de 150-250 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en un intervalo de 200-300 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en un intervalo de 250-400 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en un intervalo de 300­ 500 mg/día. En otra modalidad, la dosis está en un intervalo de 350-500 mg/día.
En una modalidad, la dosis es 20 mg/día. En una modalidad, la dosis es 30 mg/día. En una modalidad, la dosis es 40 mg/día. En una modalidad, la dosis es 50 mg/día. En una modalidad, la dosis es 0,01 mg/día. En otra modalidad, la dosis es 0,1 mg/día. En otra modalidad, la dosis es 1 mg/día. En otra modalidad, la dosis es 0,530 mg/día. En otra modalidad, la dosis es 0,05 mg/día. En otra modalidad, la dosis es 50 mg/día. En otra modalidad, la dosis es 10 mg/día. En otra modalidad, la dosis es 20-70 mg/día. En otra modalidad, la dosis es 5 mg/día.
En una modalidad, la dosis del factor de coagulación modificado con CTP es 1-5 mg/día. En una modalidad, la dosis del factor de coagulación modificado con CTP es 1-3 mg/día. En otra modalidad, la dosis del factor de coagulación modificado con CTP es 2 mg/día.
En otra modalidad, la dosis es 1-90 mg/día. En otra modalidad, la dosis es 1-90 mg/2 días. En otra modalidad, la dosis es 1-90 mg/3 días. En otra modalidad, la dosis es 1-90 mg/4 días. En otra modalidad, la dosis es 1-90 mg/5 días. En otra modalidad, la dosis es 1-90 mg/6 días. En otra modalidad, la dosis es 1-90 mg/semana. En otra modalidad, la dosis es 1-90 mg/9 días. En otra modalidad, la dosis es 1-90 mg/11 días. En otra modalidad, la dosis es 1-90 mg/14 días.
En otra modalidad, la dosis del factor de coagulación es 10-50 mg/día. En otra modalidad, la dosis es 10-50 mg/2 días. En otra modalidad, la dosis es 10-50 mg/3 días. En otra modalidad, la dosis es 10-50 mg/4 días. En otra modalidad, la dosis es 10-50 microgramos mg/5 días. En otra modalidad, la dosis es 10-50 mg/6 días. En otra modalidad, la dosis es 10-50 mg/semana. En otra modalidad, la dosis es 10-50 mg/9 días. En otra modalidad, la dosis es 10-50 mg/11 días. En otra modalidad, la dosis es 10-50 mg/14 días.
En otra modalidad, se formula un polipéptido que comprende un factor de coagulación del Factor VII y tres unidades de CTP en una forma de dosificación intranasal. En otra modalidad, el polipéptido se formula en una forma de dosificación inyectable. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 0,0001 mg a 0,6 mg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 0,001 mg a 0,005 mg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 0,005 mg a 0,01 mg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 0,01 mg a 0,3 mg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis en una dosis que varía de 0,2 mg a 0,6 mg. En otra modalidad, el factor de coagulación está libre de CTP en su extremo amino terminal.
En otra modalidad, un polipéptido que comprende un factor de coagulación del Factor VII y tres unidades de CTP se administra a un sujeto en una dosis que varía de 1-100 microgramos. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 10-80 microgramos. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 20-60 microgramos. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 10-50 microgramos. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 40-80 microgramos. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 10-30 microgramos. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 30-60 microgramos.
En otra modalidad, un polipéptido que comprende un factor de coagulación del Factor VII y tres unidades de CTP se administra a un sujeto en una dosis que varía de 0,2 mg a 2 mg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 2 mg a 6 mg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 4 mg a 10 mg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía entre 5 mg y 15 mg.
En una modalidad, un factor de coagulación de Factor VII modificado por tres CTP se administra a un sujeto en una dosis que varía de 10 pg/kg-1000 pg/kg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 25 pg/kg-600 pg/kg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis que varía de 50 pg/kg-400 pg/kg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis de aproximadamente 25 pg/kg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis de aproximadamente 50 pg/kg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis de aproximadamente 100 pg/kg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis de aproximadamente 200 pg/kg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis de aproximadamente 300 pg/kg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis de aproximadamente 400 pg/kg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis de aproximadamente 500 pg/kg. En otra modalidad, se administra a un sujeto en una dosis de aproximadamente 600 pg/kg.
En una modalidad, la dosis del FIX modificado con CTP comprende el 50 % de la cantidad de FIX administrada en la dosis recomendada de FIX recombinante (por ejemplo, Benefix®, Wyeth o Mononine®, CSL Behring) a pacientes durante el mismo período de tiempo. En una modalidad, la dosis de Fvila modificado con CTP comprende el 50 % de la cantidad de Fvila administrada en la dosis recomendada de FVIIa recombinante (por ejemplo, NovoSeven®) a pacientes durante el mismo período de tiempo. En una modalidad, la dosis de FVII modificado con CTP comprende el 50 % de la cantidad de FVII administrada en la dosis recomendada de FVII recombinante a pacientes durante el mismo período de tiempo. Por ejemplo, si NovoSeven® se administra a una dosis de 90 mcg/kg cada dos horas a un paciente antes o después de la operación (es decir, 7,65 mg cada dos horas o 45,9 mg en seis dosis durante un período de 12 horas, durante un período de tiempo, para un paciente de 85 kg), puede administrarse un factor de coagulación modificado con CTP en la formulación de la presente invención a una dosis que sea el 50 % de la dosis de 12 horas del paciente de FVIIa recombinante (es decir, a una dosis de 23 mg administrada una vez durante un período de 12 horas).
En otra modalidad, la dosis de factor de coagulación modificado con CTP es tal que contiene un 45 % de la cantidad de factor de coagulación que la administrada mediante el uso del factor de coagulación no modificado con CTP. En otra modalidad, la dosis de factor de coagulación modificado con CTP es tal que contiene un 10 % de la cantidad de factor de coagulación que la administrada mediante el uso del factor de coagulación no modificado con CTP. En otra modalidad, la dosis de factor de coagulación modificado con CTP es tal que contiene un 25 % de la cantidad de factor de coagulación que la administrada mediante el uso del factor de coagulación no modificado con CTP. En otra modalidad, la dosis de factor de coagulación modificado con CTP es tal que contiene un 35 % de la cantidad de factor de coagulación que la administrada mediante el uso del factor de coagulación no modificado con CTP. En otra modalidad, la dosis de factor de coagulación modificado con CTP es tal que contiene un 75 % de la cantidad de factor de coagulación que la administrada mediante el uso del factor de coagulación no modificado con CTP. En otra modalidad, la dosis de factor de coagulación modificado con CTP es tal que contiene el 100 % de la cantidad de factor de coagulación que la administrada mediante el uso del factor de coagulación no modificado con CTP. Sin embargo, incluso si la dosis contiene la misma cantidad de factor de coagulación que el factor de coagulación no modificado con CTP, aún es ventajoso para los sujetos porque se administrará con menos frecuencia debido a su semivida aumentada en comparación con los factores de coagulación recombinantes.
En otra modalidad, una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de coagulación conjugado está entre 50-500 UI por kg de peso corporal administrada una vez al día a una vez a la semana para FIX o 10 pg/kg-500 pg/kg para FVIIa. En otra modalidad, una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de coagulación conjugado es 150-250 UI por kg de peso corporal, administrada una vez al día. En otra modalidad, una composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación conjugado se formula con una resistencia efectiva para la administración por diversos medios a un paciente humano.
En una modalidad, el FIX se administra en una cantidad efectiva para llevar la actividad del Factor IX circulante a 20­ 30 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, el FIX se administra en una cantidad efectiva para llevar la actividad del Factor IX circulante a 25-50 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, el FIX se administra en una cantidad efectiva para llevar la actividad del Factor IX circulante a 50-100 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, el FIX se administra en una cantidad efectiva para llevar la actividad del Factor IX circulante a 100-200 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, el FIX se administra en una cantidad efectiva para llevar la actividad del Factor IX circulante a 10-50 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, el FIX se administra en una cantidad efectiva para llevar la actividad del Factor IX circulante a 20­ 100 UI/dl en un sujeto.
En una modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto semanalmente. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto dos veces por semana. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto quincenalmente (una vez cada dos semanas). En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto dos veces al mes. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto una vez al mes. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto diariamente. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto cada dos días.
En otra modalidad, un polipéptido que comprende un factor de coagulación del Factor VII y tres unidades de CTP se administra a un sujeto una vez cada tres días. En otra modalidad, se administra a un sujeto una vez cada cuatro días. En otra modalidad, se administra a un sujeto una vez cada cinco días. En otra modalidad, se administra a un sujeto una vez cada seis días. En otra modalidad, se administra a un sujeto una vez cada 7-14 días. En otra modalidad, se administra a un sujeto una vez cada 10-20 días. En otra modalidad, se administra a un sujeto una vez cada 5-15 días. En otra modalidad, se administra a un sujeto una vez cada 15-30 días.
En otra modalidad, los efectos de la descripción incluyen aumentar el cumplimiento en el uso de la terapia con factor de coagulación.
En otra modalidad, los efectos de la descripción incluyen aumentar el cumplimiento de los pacientes afectados con enfermedades crónicas que necesitan una terapia con factor de coagulación. En otra modalidad, los efectos de la descripción permiten la reducción en la frecuencia de dosificación de un factor de coagulación mediante la modificación del factor de coagulación con CTP como se describe en la presente descripción más arriba.
En otra modalidad, la presente solicitud describe un método para reducir la frecuencia de dosificación de un polipéptido del Factor VIIa (FVIIa), que comprende la etapa de unir tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina coriónica al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVIIa, lo que reduce de esta manera la frecuencia de dosificación de dicho polipéptido de FVIIa.
En otra modalidad, el término cumplimiento comprende adherencia. En otra modalidad, los métodos de la descripción incluyen aumentar el cumplimiento de los pacientes que necesitan una terapia con un factor de coagulación mediante la reducción de la frecuencia de administración del factor de coagulación. En otra modalidad, la reducción en la frecuencia de administración del factor de coagulación se logra debido a las modificaciones de CTP que hacen más estable el factor de coagulación modificado con CTP. En otra modalidad, la reducción en la frecuencia de administración del factor de coagulación se logra como resultado de aumentar la T© del factor de coagulación. En otra modalidad, la reducción en la frecuencia de administración del factor de coagulación se logra como resultado de aumentar el tiempo de aclaramiento o reducir la velocidad de aclaramiento del factor de coagulación.
En otra modalidad, la presente solicitud describe un método para reducir la velocidad de aclaramiento de un polipéptido del Factor VIIa (FVIIa), que comprende la etapa de unir tres péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina coriónica al extremo carboxi terminal de dicho polipéptido FVIIa, lo que reduce de esta manera la velocidad de aclaramiento de dicho polipéptido de FVIIa.
En otra modalidad, la reducción en la frecuencia de administración del factor de coagulación se logra como resultado de aumentar la medición del AUC del factor de coagulación.
En otra modalidad, se describe en la presente descripción un método para reducir la frecuencia de dosificación de un factor de coagulación, que comprende la etapa de unir tres CTP al extremo carboxi terminal del factor de coagulación, lo que reduce de esta manera la frecuencia de dosificación del factor de coagulación.
En otra modalidad, se describe en la presente descripción un método para aumentar el cumplimiento en el uso de la terapia con factor de coagulación, que comprende proporcionar a un sujeto que lo necesita, un polipéptido que comprende un factor de coagulación y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxi terminal de un factor de coagulación, lo que aumenta de esta manera el cumplimiento en el uso de la terapia con factor de coagulación.
En otra modalidad, en la presente descripción se describe un método para prevenir o tratar un trastorno de la coagulación de la sangre en un sujeto, que comprende proporcionar a un sujeto que lo necesita, un polipéptido que comprende un factor de coagulación y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxi terminal de un factor de coagulación, lo que previene o trata de esta manera un trastorno de la coagulación de la sangre en dicho sujeto.
En otra modalidad, se describe en la presente descripción un método para prevenir la hemofilia en un sujeto, que comprende proporcionar a un sujeto que lo necesita, un polipéptido que comprende un factor de coagulación y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxi terminal de un factor de coagulación, lo que previene de esta manera la hemofilia en dicho sujeto.
En otra modalidad, la presente invención muestra que las composiciones proporcionadas en la presente descripción se absorben sorprendentemente más efectivamente en el torrente sanguíneo después de la administración subcutánea (ver los Ejemplos 7-9 en la presente descripción). Poder administrar FVIIa por vía subcutánea constituye una ventaja, ya que puede usarse para aplicaciones profilácticas. Las inyecciones subcutáneas también son mucho más fáciles para que los pacientes se autoinyecten y son una ventaja cuando los pacientes son muy jóvenes y sus venas son pequeñas y difíciles de encontrar.
En otra modalidad, se describe en la presente descripción un método para tratar la hemofilia en un sujeto, que comprende proporcionar a un sujeto que lo necesita, un polipéptido que comprende un factor de coagulación y tres péptidos carboxi terminales de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxi terminal de un factor de coagulación, lo que trata de esta manera la hemofilia en dicho sujeto.
La administración oral, en una modalidad, comprende una forma de dosificación unitaria que comprende tabletas, cápsulas, grajeas, comprimidos masticables, suspensiones, emulsiones y similares. Dichas formas de dosificación unitarias comprenden una cantidad segura y efectiva del factor de coagulación deseado de la descripción, cada una de las cuales es en una modalidad, de aproximadamente 0,7 o 3,5 mg a aproximadamente 280 mg/70 kg, o en otra modalidad, de aproximadamente 0,5 o 10 mg a aproximadamente 210 mg/70 kg. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de formas de dosificación unitarias para la administración oral se conocen bien en la técnica. En algunas modalidades, los comprimidos comprenden típicamente adyuvantes convencionales compatibles farmacéuticamente como diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, manitol, lactosa y celulosa; aglutinantes tales como almidón, gelatina y sacarosa; desintegrantes tales como almidón, ácido algínico y croscarmelosa; lubricantes como estearato de magnesio, ácido esteárico y talco. En una modalidad, los deslizantes como dióxido de silicio pueden usarse para mejorar las características de flujo de la mezcla en polvo. En una modalidad, pueden agregarse agentes colorantes, tales como los colorantes FD&C, para su apariencia. Los endulzantes y agentes saborizantes, tales como aspartamo, sacarina, mentol, menta y sabores de frutas, son adyuvantes útiles para tabletas masticables. Las cápsulas comprenden típicamente uno o más diluyentes sólidos descritos anteriormente. En algunas modalidades, la selección de componentes portadores depende de consideraciones secundarias como sabor, coste y estabilidad durante el almacenamiento, que no son críticos para los propósitos de esta invención, y pueden realizarse fácilmente por un experto en la técnica.
En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende un perfil de liberación predefinido. En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende comprimidos, cápsulas, grajeas o comprimidos masticables de liberación prolongada. En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende comprimidos, cápsulas, grajeas o comprimidos masticables de liberación lenta. En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende comprimidos, cápsulas, grajeas o comprimidos masticables de liberación inmediata. En una modalidad, la forma de dosificación oral se formula de acuerdo con el perfil de liberación deseado del ingrediente farmacéutico activo, como se conoce por un experto en la técnica.
Las composiciones orales, en algunas modalidades, comprenden soluciones líquidas, emulsiones, suspensiones, y similares. En algunas modalidades, los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de tales composiciones se conocen bien en la técnica. En algunas modalidades, las composiciones orales líquidas comprenden de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 0,933 % del compuesto o compuestos deseados, o en otra modalidad, de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 10 %.
En algunas modalidades, las composiciones para su uso en esta invención comprenden soluciones o emulsiones, que en algunas modalidades son soluciones acuosas o emulsiones que comprenden una cantidad segura y efectiva de los compuestos y opcionalmente, otros compuestos, destinados para la administración intranasal tópica. En algunas modalidades, las composiciones comprenden de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 10,0 % p/v de un compuesto en cuestión, con mayor preferencia, de aproximadamente 00,1 % a aproximadamente 2,0, que se usa para el suministro sistémico de los compuestos por la vía intranasal.
En otra modalidad, se inyecta en el músculo (inyección intramuscular) un polipéptido que comprende un factor de coagulación del Factor VII y tres unidades de cTp . En otra modalidad, un polipéptido que comprende un factor de coagulación del Factor VII y tres unidades de CTP se inyectan debajo de la piel (inyección subcutánea). En otra modalidad, se inyecta en la piel. En otra modalidad, un factor de coagulación como se describe en la presente descripción se administra mediante administración sistémica. En otra modalidad, un factor de coagulación como se describe en la presente descripción se administra mediante inyección intravenosa. En otra modalidad, la administración puede ser suministro parenteral, pulmonar, oral, tópica, intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutáneo, intranasal, transnasal, intraocular, oftálmico, epidural, bucal, rectal, transmucosa, intestinal o parenteral, lo que incluye inyecciones intramedulares, así como también administración intratecal o intraventricular directa.
En otra modalidad, la preparación se administra de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante la inyección de la preparación directamente en una región específica del cuerpo del paciente.
En una modalidad, la vía de administración puede ser enteral. En otra modalidad, la ruta puede ser conjuntival, transdérmica, intradérmica, intraarterial, vaginal, rectal, intratumoral, parcanceral, transmucosa, intramuscular, intravascular, intraventricular, intracraneal, intranasal, sublingual o una de sus combinaciones.
En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por inyección intravenosa, intraarterial o intramuscular de una preparación líquida. En algunas modalidades, las formulaciones líquidas incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares. En una modalidad, las formulaciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa, y por lo tanto, se formulan en una forma adecuada para la administración intravenosa. En otra modalidad, las formulaciones farmacéuticas se administran por vía intraarterial, y por lo tanto, se formulan en una forma adecuada para la administración intraarterial. En otra modalidad, las formulaciones farmacéuticas se administran por vía intramuscular, y por lo tanto, se formulan en una forma adecuada para la administración intramuscular.
En otra modalidad, las formulaciones farmacéuticas se administran tópicamente a las superficies del cuerpo, y por lo tanto, se formulan en una forma adecuada para la administración tópica. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen geles, ungüentos, cremas, lociones, gotas y similares. Para la administración tópica, los compuestos se combinan con un agente o agentes terapéuticos adecuados adicionales, preparados y aplicados como soluciones, suspensiones o emulsiones en un diluyente fisiológicamente aceptable con o sin un portador farmacéutico.
En una modalidad, las formulaciones farmacéuticas de la presente invención se fabrican mediante procesos que se conocen bien en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos de mezcla, disolución, granulación, elaboración de pastillas recubiertas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales.
En una modalidad, las formulaciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención se formulan de manera convencional mediante el uso de uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. En una modalidad, la formulación depende de la vía de administración elegida.
En una modalidad, los inyectables de la descripción se formulan en soluciones acuosas. En una modalidad, los inyectables de la descripción se formulan en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o tampón de solución salina fisiológica. En algunas modalidades, para la administración transmucosal, en la formulación se usan penetrantes apropiados a la barrera que se va a penetrar. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica.
En una modalidad, las preparaciones descritas en la presente descripción se formulan para la administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. En algunas modalidades, las formulaciones para inyección se presentan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en contenedores de múltiples dosis, opcionalmente con la adición de un conservante. En algunas modalidades, las composiciones son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y contienen agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las composiciones comprenden, además, en algunas modalidades, conservantes, tales como cloruro de benzalconio y tiomersal y similares; agentes quelantes, tales como edetato de sodio y otros; tampones tales como fosfato, citrato y acetato; agentes de tonicidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol y otros; antioxidantes tales como ácido ascórbico, acetilcistina, metabisulfito de sodio y otros; agentes aromáticos; agentes de ajuste de la viscosidad, tales como polímeros, lo que incluye celulosa y derivados de esta; y alcohol polivinílico y ácidos y bases para ajustar el pH de estas composiciones acuosas según sea necesario. Las composiciones comprenden, además, en algunas modalidades, anestésicos locales u otros agentes activos. Las composiciones pueden usarse como atomizadores, nebulizadores, gotas y similares.
En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los ingredientes activos, en algunas modalidades, se preparan como suspensiones para inyección oleosas o acuosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen, en algunas modalidades, aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección contienen, en algunas modalidades, sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. En otra modalidad, la suspensión contiene además, estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los ingredientes activos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
En otra modalidad, el compuesto activo puede suministrarse en una vesícula, en particular un liposoma (ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat y otros, en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, págs. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., págs. 317-327; J. E. Diederichs y otros, Pharm./nd. 56 (1994) 267- 275).
En otra modalidad, la composición farmacéutica suministrada en un sistema de liberación controlada se formula para infusión intravenosa, bomba osmótica implantable, parche transdérmico, una jeringa, liposomas, u otros modos de administración. En una modalidad, se usa una bomba (ver Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.
14:201 (1987); Buchwald y otros, Surgery 88:507 (1980); Saudek y otros, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). En otra modalidad, pueden usarse materiales poliméricos. En otra modalidad más, puede colocarse un sistema de liberación controlada en las proximidades del objetivo terapéutico, es decir, el cerebro, por lo tanto, sólo requiere una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, págs.
115-138 (1984). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990).
En algunas modalidades, el ingrediente activo está en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, una solución estéril, basada en agua sin pirógenos, antes de su uso. Las composiciones se formulan, en algunas modalidades, para la atomización y la administración por inhalación. En otra modalidad, las composiciones están contenidas en un envase con medios de atomización adjuntos.
En una modalidad, la preparación de la presente invención se formula en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, mediante el uso de, por ejemplo, bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el propósito deseado. En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de ingredientes activos que es efectiva para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que se trata.
En una modalidad, la determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está dentro de la competencia de los expertos en la técnica.
Algunos ejemplos de sustancias que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables o componentes de estos son azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de papa; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etil celulosa y metil celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; lubricantes sólidos, como ácido esteárico y estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales, como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de teobroma; polioles como propilenglicol, glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico; emulsionantes, como los emulsionantes Tween™; agentes humectantes, como lauril sulfato d e sodio; agentes colorantes; agentes saborizantes; agentes para la formación de comprimidos, estabilizadores; antioxidantes; conservantes; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; y soluciones tampón de fosfato. La elección de un portador farmacéuticamente aceptable para usarse junto con el compuesto se determina básicamente por la manera en la que el compuesto se administra. Si el compuesto objetivo se inyecta, en una modalidad, el portador farmacéuticamente aceptable es solución salina fisiológica estéril, con un agente de suspensión compatible con la sangre, cuyo pH se ha ajustado a aproximadamente 7,4.
Además, las composiciones comprenden además aglutinantes (por ejemplo, acacia, almidón de maíz, gelatina, carbómero, etilcelulosa, goma guar, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil metil celulosa, povidona), agentes desintegrantes (por ejemplo, almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico, dióxido de silicio, croscarmelosa de sodio, crospovidona, goma guar, almidón glicolato de sodio), tampones (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato) de diversos pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para evitar la absorción a las superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), inhibidores de proteasas, tensioactivos (por ejemplo lauril sulfato de sodio), potenciadores de la penetración, agentes solubilizantes (por ejemplo, glicerol, polietilen glicerol), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, hidroxianisol butilado), estabilizantes (por ejemplo, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa), agentes que aumentan la viscosidad (por ejemplo, carbómero, dióxido de silicio coloidal, etil celulosa, goma guar), edulcorantes (por ejemplo, aspartamo, ácido cítrico), conservantes (por ejemplo, tiomersal, alcohol bencílico, parabenos), lubricantes (por ejemplo, ácido esteárico, estearato de magnesio, polietilenglicol, lauril sulfato de sodio), auxiliares de flujo (por ejemplo, dióxido de silicio coloidal), plastificantes (por ejemplo, ftalato de dietilo, citrato de trietilo), emulsionantes (por ejemplo, carbómero, hidroxipropil celulosa, lauril sulfato de sodio), recubrimientos de polímeros (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas), agentes formadores de recubrimientos y películas (por ejemplo, etil celulosa, acrilatos, polimetacrilatos) y/o adyuvantes.
Los componentes típicos de portadores para jarabes, elíxires, emulsiones y suspensiones incluyen etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, sacarosa líquida, sorbitol y agua. Para una suspensión, los agentes de suspensión típicos incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, celulosa (por ejemplo Avicel™, RC-591), tragacanto y alginato de sodio; los agentes humectantes típicos incluyen lecitina y óxido de polioxietilen sorbitán (por ejemplo, polisorbato 80). Los conservantes típicos incluyen metilparabeno y benzoato de sodio. En otra modalidad, las composiciones líquidas orales contienen, además, uno o más componentes tales como endulzantes, agentes saborizantes y colorantes descritos anteriormente.
Las composiciones incluyen, además, la incorporación del material activo en o sobre preparaciones de partículas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos, o esferoplastos. Tales composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de eliminación in vivo.
Se abarcan, además, por la descripción composiciones de partículas recubiertas con polímeros (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas) y el compuesto acoplado a anticuerpos dirigidos contra receptores específicos de tejidos, ligandos o antígenos o acoplados a ligandos de receptores específicos de tejidos.
En algunas modalidades, los compuestos se modifican por la unión covalente de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona o poliprolina. En otra modalidad, los compuestos modificados exhiben un tiempo de semivida sustancialmente más largo en sangre después de una inyección intravenosa que los compuestos no modificados correspondientes. En una modalidad, las modificaciones aumentan además la solubilidad del compuesto en solución acuosa, eliminan la agregación, mejoran la estabilidad física y química del compuesto, y reducen en gran medida la inmunogenicidad y la reactividad del compuesto. En otra modalidad, la actividad biológica in vivo deseada se logra mediante la administración de dichos aductos polímero-compuesto con menos frecuencia o en dosis más bajas que con el compuesto no modificado.
En algunas modalidades, la preparación de una cantidad o dosis efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro. En una modalidad, una dosis puede formularse en modelos animales y dicha información puede usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos.
En una modalidad, la toxicidad y la eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en la presente descripción pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar in vitro, en cultivos celulares o animales experimentales. En una modalidad, los datos obtenidos a partir de estos ensayos in vitro y de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. En una modalidad, las dosis varían en dependencia de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. En una modalidad, la formulación, vía de administración y dosificación exactas pueden ser elegidas por el médico del individuo en vista de la afección del paciente. [Ver, por ejemplo, Fingl, y otros (1975) “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Cap. 1 pág. 1].
En una modalidad, en dependencia de la gravedad y la capacidad de respuesta de la afección a tratar, la dosificación puede ser de una o una pluralidad de administraciones, con un curso de tratamiento que dura desde varios días hasta varias semanas o hasta que se efectúa la curación o se logra la disminución de la enfermedad. En una modalidad, la cantidad de una composición a administrarse dependerá, por supuesto, del sujeto que se trata, la gravedad de la afección, la forma de administración, el criterio del médico especialista, etc.
En una modalidad, las composiciones que incluyen la preparación de la presente invención formulada en un portador farmacéutico compatible también se preparan, se colocan en un contenedor apropiado, y se etiquetan para el tratamiento de una afección indicada.
En otra modalidad, un factor de coagulación como se describe en la presente descripción está liofilizado (es decir, secado por congelación) en combinación con excipientes orgánicos complejos y estabilizadores tales como agentes tensioactivos no iónicos (es decir, surfactantes), diversos azúcares, polioles orgánicos y/o albúmina de suero humana. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un factor de coagulación liofilizado modificada como se describe en agua estéril para inyección. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un factor de coagulación liofilizado como se describe en PBS estéril para inyección. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un factor de coagulación liofilizado como se describe en NaCl al 0,9 % estéril para inyección.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción y portadores complejos tales como albúmina de suero humana, polioles, azúcares y agentes estabilizadores aniónicos activos en superficies. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción y ácido lactobiónico y un tampón de acetato/glicina. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción y aminoácidos, tales como arginina o glutamato que aumentan la solubilidad de las composiciones de interferón en agua. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un factor de coagulación liofilizado como se describe en la presente descripción y glicina o albúmina de suero humana (HSA), un tampón (por ejemplo, acetato) y un agente isotónico (por ejemplo, NaCl). En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un factor de coagulación liofilizado como se describe en la presente descripción y tampón fosfato, glicina y HSA.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación está en una solución tamponada que tiene un pH de aproximadamente 6,5. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación está en una solución tamponada que tiene un pH de aproximadamente 6,4. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción se estabiliza con un aminoácido como un agente estabilizante y en algunos casos una sal (si el aminoácido no contiene una cadena lateral cargada).
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción, es una composición líquida que comprende un agente estabilizante entre aproximadamente 0,3 % y 5 % en peso que es un aminoácido.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción proporciona exactitud de la dosificación y seguridad del producto. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción proporciona una formulación líquida biológicamente activa y estable para su uso en aplicaciones inyectables. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción proporciona una formulación líquida que permite el almacenamiento durante un período de tiempo largo en un estado líquido que facilita el almacenamiento y el transporte antes de la administración.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción comprende lípidos sólidos como material matriz. En otra modalidad, la composición farmacéutica inyectable que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción comprende lípidos sólidos como material matriz. En otra modalidad, la producción de micropartículas lipídicas mediante congelación por atomizado se describió por Speiser (Speiser y otros, Pharm. Res. 8 (1991) 47-54) seguido por nanogránulos lípidos para la administración oral (Speiser en el documento EP 0167825 (1990)). En otra modalidad, los lípidos que se usan, son bien tolerados por el cuerpo (por ejemplo, glicéridos compuestos de ácidos grasos que están presentes en las emulsiones para la nutrición parenteral).
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción comprende micropartículas poliméricas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción comprende nanopartículas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción comprende liposomas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción comprende emulsión de lípidos. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción comprende microesferas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción comprende nanopartículas lipídicas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción comprende nanopartículas lipídicas que comprenden lípidos anfifílicos. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente descripción comprende nanopartículas lipídicas que comprenden un fármaco, una matriz lipídica y un tensioactivo. En otra modalidad, la matriz lipídica tiene un contenido de monoglicéridos que es al menos 50 % p/p.
En una modalidad, las composiciones para su uso en la presente invención se presentan en un paquete o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que contiene una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. En una modalidad, el paquete, por ejemplo, comprende metal o lámina de plástico, tal como un empaque tipo burbuja. En una modalidad, el paquete o dispositivo dispensador se acompaña de instrucciones para la administración. En una modalidad, el paquete o dispensador se acompaña de una notificación asociada con el contenedor en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos, dicha notificación refleja la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones o la administración humana o veterinaria. En una modalidad, dicha notificación está etiquetada como aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para medicamentos recetados o es un prospecto del producto aprobado.
En una modalidad, se apreciará que los factores de coagulación en la formulación de la presente invención pueden proporcionarse al individuo con agentes activos adicionales para lograr un efecto terapéutico mejorado en comparación con el tratamiento con cada agente por sí solo. En otra modalidad, las medidas (por ejemplo, dosificación y selección del agente complementario) se toman para evitar los efectos secundarios adversos asociados con las terapias de combinación.
Los objetivos, ventajas y características novedosas adicionales de la presente invención serán evidentes para un experto en la técnica tras el examen de los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes. Además, cada una de las diversas modalidades y aspectos de la presente invención como se delinean anteriormente y como se reivindica en la sección de reivindicaciones más abajo tiene una base experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Generalmente, la nomenclatura usada en la presente descripción y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican exhaustivamente en la literatura. Ver, por ejemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook y otros, (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel y otros, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson y otros, “Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nueva York; Birren y otros, (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como se establece en las patentes de Estados Unidos núms. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Tercera edición; “Current Protocols in Immunology” Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites y otros (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a edición), Appleton y Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen exhaustivamente en la literatura científica y de patentes, ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture", Frenhney R. I., ed. (1986); "Immovilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y otros, “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). En este documento se proporcionan otras referencias generales.
Ejemplo comparativo 1
Generación y utilización del Factor de coagulación IX
Clonación y expresión de la molécula de FIX recombinante:
Se construyeron clones de Factor IX en nuestro vector de expresión eucariota pCI-neo (Promega, núm. catálogo E1841). El clon ORF del factor de coagulación IX de Homo sapiens se solicitó a "OriGene" (RC219065). Los cebadores se solicitaron a Sigma-Genosys.
Construcción de 301-1-pCI-neo-p200-11 (Factor IX-ctp x2):
Cebador 101: 5' GTTTAGTGAACCGTCAGAAT 3' (SEQ ID NO: 36)
Cebador 103r: 5' TTGAGGAAGATGTTCGTGTA 3' (contiene el sitio SspI del factor IX) (SEQ ID NO: 37) Se realizó una reacción de PCR con el cebador 101 y el cebador 103R y ADN plásmido, clon de ADNc del Factor IX (OriGene "RC219065) como plantilla; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ~ 1085 pb (pcr 10) y se purificó a partir del gel (el fragmento que contiene el extremo amino terminal de la secuencia del Factor IX).
Cebador 98: 5' ATTACAGTTGTCGCAGGTGA 3' (SEQ ID NO: 38)
Cebador 99R: 5' GCTGGAGCTAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTT 3' (SEQ ID NO: 39)
Cebador 100: 5' GCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCC 3' (SEQ ID NO: 40)
Cebador 27R: 5' TTTTCACTGCATTCTAGTTGTGG 3' (SEQ ID NO: 41)
Se realizaron tres reacciones de PCR. La primera reacción se llevó a cabo con el cebador 98 y el cebador 99R y ADN plasmídico, clon de ADNc de Factor IX (OriGene", RC219065) como plantilla; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ~ 540 pb.
La segunda reacción se llevó a cabo con el cebador 100 y el cebador 27R y el ADN plasmídico de 402-2-p72-3 (hGHCTP- CTP) como plantilla; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ~ 258 pb. La última reacción (pcr 3) se llevó a cabo con los cebadores 98 y 27R y una mezcla de los productos de las dos reacciones anteriores como plantilla; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ~ 790 pb y se ligó en un vector de clonación TA (Invitrogen, catálogo K2000-01). Se aisló el fragmento Sspl -EcoRI (TA 3-3). Se realizó otra reacción de PCR (pcr 12) con el cebador 101 y el cebador 27R y una mezcla de los productos de pcr 10 y el fragmento SspI-EcoRI del pcr 3 como plantilla; como resultado de la amplificación por pCr , se formó un producto de ~ 1700 pb (Factor IX-ctp-ctp) y se ligó en el vector de clonación TA (Invitrogen, catálogo K2000-01) (lig 180).
Se encontró un error en la secuencia del Factor IX, por lo que los fragmentos se reemplazaron para formar un inserto del Factor IX-ctp-ctp con la secuencia de ADN correcta.
Se digirió TA- pcr 3-3 con Sspl y XbaI y se aisló el fragmento grande (vector). TA 180-4 se digirió con Sspl y XbaI y el fragmento pequeño (inserto) se aisló y se ligó al fragmento grande aislado de TA-pcr-3-3 digerido con Sspl y XbaI. El nuevo plásmido TA-183-2 se sometió a digestión con Sal I y NotI y se aisló el inserto de Factor IXCTP-CTp (-1575 pb). Este fragmento se insertó en el vector de expresión eucariota pCI-neo (digerido con Sal I y Not I) para producir el clon 301 -2-p200-ll.
Construcción de pCI-dhfr -Factor 9- ctpx2 (p223-4): El vector pCI-dhfr (p6-1) se digirió con SmaI y NotI. El Factor IX-CTP-CTP (p200-11) se digirió con ASisI FI y NotI. Se ligaron los dos fragmentos.
Construcción del pCI-dhfr Factor 9-ctp x3 (p225-7): El vector pCI-dhfr OXM-CTP33 (p216-4) se digirió con Xbal y ApaI. El Factor IX-CTP-CTP (223-4) se digirió con XbaI y ApaI. Se ligaron los dos fragmentos.
Construcción del pCI-dhfr Factor 9-ctp x3 T148A (p243-2):El plásmido p225-7 contenía treonina en la posición 148, dado que la versión más común de FIX contiene alanina en esta posición, Thr se reemplazó por Ala mediante el uso del método de mutagénesis dirigida al sitio.
Cebador 75: ctcccagttcaattacagct (SEQ ID NO: 42)
Cebador 122r: ggaaaaactgcctcagcacgggtgagc (SEQ ID NO: 43)
Cebador 123: gtgctgaggcagtttttcctgatgtggactat (SEQ ID NO: 44)
Cebador 124r: caacacagtgggcagcag (SEQ ID NO: 45)
Se realizaron tres reacciones de PCR. La segunda reacción se llevó a cabo con el cebador 75 y el cebador 122r y el ADN plasmídico p225-7 como plantilla; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ~ 692 pb y se purificó a partir del gel. Una segunda reacción se llevó a cabo con el cebador 123 y el cebador 124r y ADN plasmídico p225-7 como plantilla; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de -237 pb y se purificó a partir del gel. La tercera reacción de PCR solapada se llevó a cabo con los cebadores 75 y 124r y una mezcla de los productos de las dos reacciones anteriores como plantilla; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ~ 910 pb. Este producto de PCR superpuesto se digirió con Xbal y Nsil y se volvió a ligar en el plásmido p225-7 (digerido con Xbal y Nsil) para producir el Factor IX-ctpx3 T148A, denominado p243-2.
Construcción de FIX-4CTP (p259-4): El fragmento 3.5CTP se aisló a partir de oxym-4CTP (p254-3) mediante las enzimas de restricción Apal y Xbal. El fragmento FIX+0.5CTP se aisló a partir de FIX-3CTP (p243-2) con las enzimas de restricción Apal y Xbal. Se ligaron los dos fragmentos.
Construcción de FIX-5CTP (p260-18): El fragmento 4.5CTP se aisló a partir de oxym-5CTP (255-1) mediante las enzimas de restricción Apal y Xbal. El fragmento FIX+0.5CTP se aisló de FIX-3CTP (p243-2) mediante el uso de las enzimas Apal y Xbal. Se ligaron los dos fragmentos.
Las células Dg44 se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 100 mm y se cultivaron hasta una confluencia del 50-60 %. Se usó un total de 2 mg (microgramos) de ADNc de FIX para la transfección de una placa de 100 mm mediante el uso del reactivo FuGene (Roche) en medio libre de proteínas (Invitrogene CD Dg44). El medio se retiró 48 horas después de la transfección y se reemplazó con un medio libre de proteínas (Invitrogene CD Dg44) sin nucleósidos y en presencia de 800 mg/ml de G418 (Neomicina). Después de 14 días, la población de células transfectadas se transfirió a matraces de cultivo de tejidos T25 y la selección continuó durante 10-14 días adicionales hasta que las células comenzaron a crecer como clones estables. Se seleccionaron clones de alta expresión. Se usaron aproximadamente 2x107 células para inocular 300 ml de medio de crecimiento en una botella de cultivo rotatoria de 1700 cm2 (Corning, Corning NY) suplementado con 5 ng/ml de vitamina K3 (bisulfato de sodio menadiona; Sigma). El medio de producción (cosecha) se recolectó después de una rápida disminución de la viabilidad celular a aproximadamente 70 %. El medio de producción se aclaró primero y después se concentró aproximadamente 20 veces y se dializó con PBS mediante el uso de un casete de filtración de flujo (MWCO 10KDa; Millipore Corp.).
Determinación del nivel de antígeno FIX:Los niveles de antígeno de cosecha de FIX-CTP se determinaron mediante el uso del kit AssayMax Human FIX ELISA (AssayPro-EF1009-1). La concentración de proteína calculada es el promedio de tres diluciones diferentes en dos corridas independientes (Figura 1A, Tabla 1).
Tabla 1: Concentración de proteína calculada
FIX-CTP FIX-CTP-CTP
Nivel de Ag FIX (pg/ml) 41,9 19,2
SD 8,76 3,67
% CV 20,92 19,15
SDS-PAGE de FIX - inmunotransferencia: Se cargaron cosechas de FIX-CTP o rhFIX purificado (American Diagnostics), 100 ng de proteína, en gel de Tris-Glicina al 12 % mediante el uso de marcador de proteína de doble color Precision Plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western mediante el uso de anticuerpo policlonal anti-FIX humano y anticuerpo monoclonal anti-carboxilación gamma humana (American Diagnostics). Como se informó anteriormente, rhFIX migró a 55 KDa, mientras que el FIX fusionado a dos CTP migró a 75 KDa. Se demostró que ambas variantes de las proteínas FIX-CTP estaban gamma carboxiladas, una modificación posterior a la traducción esencial para la actividad y función del FIX (Figura IB).
Determinación de la actividad cromogénica de FIX:Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de las cosechas de FIX-CTP frente a la proteína rhFIX (American Diagnostics) se realizó mediante el uso del kit de prueba de actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). En presencia de trombina, fosfolípidos, calcio, cantidades excesivas de FXIa activan el FIX muestreado en FIXa. FIXa forma un complejo enzimático con trombina, FVIII:C activado (suministrado en cantidades en exceso), fosfolípidos y calcio y activa el Factor X, presente en el sistema de ensayo, en FXa. La actividad se correlaciona directamente con la cantidad de FIX, que es el factor limitante. El FXa generado se mide después por su actividad específica sobre el sustrato cromogénico de FXa (pNA). La cantidad de pNA generado es directamente proporcional a la actividad de FIXa. Las cosechas de rhFIX y FIX-CTP se diluyeron en serie y la potencia se evaluó al comparar una curva de respuesta a la dosis de las cosechas de FIX con una preparación de referencia que consiste de rhFIX o plasma humano. La EC50 promedio de FIX fue de 21 ng/ml, mientras que la EC50 calculada de la cosecha de FIX-(CTP)2 fue de 382 ng/ml, y la EC50 calculada en la cosecha de FIX-CTP fue de 1644 ng/ml. Se observó una disminución de aproximadamente 15 veces en la actividad enzimática de la cosecha de FIX-(CTP)2 (Figura 2).
Actividad de coagulación de FIX (aPTT): El tiempo de tromboplastina activada parcial (aPTT) es una medida de la integridad de las vías intrínsecas y comunes de la cascada de coagulación. El aPTT es el tiempo, en segundos, para que el plasma se coagule después de la adición de un activador de la vía intrínseca, fosfolípido y calcio. El reactivo aPTT se denomina una tromboplastina parcial porque el factor tisular no está incluido con el fosfolípido como lo está con el reactivo de tiempo de protrombina (PT). El activador inicia el sistema y después las etapas restantes de la vía intrínseca tienen lugar en presencia de fosfolípidos. El intervalo de referencia de aPTT varía de un laboratorio a otro, pero está usualmente en el intervalo de 27-34 segundos.
El principio del ensayo fue cuantificar la capacidad de las cosechas de FIX-CTP para restaurar la actividad de coagulación del plasma humano agotado en FIX mediante la adición de rhFIX. Se mezclaron 300 ml de plasma humano deficiente en FIX con 100 ml de cosechas de rhFIX o FIX-CTP y se diluyeron en serie. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añadieron tromboplastina, CaCl2 y fosfolípidos a la mezcla, y se determinó el tiempo de coagulación en segundos (realizado por American Medical Laboratories). La potencia se evaluó al comparar una curva de respuesta a la dosis de las cosechas de FIX con una preparación de referencia que consistía de rhFIX o plasma humano. Una unidad de actividad de FIX corresponde a la concentración de FIX que equivale a la actividad de un ml de plasma humano normal. Los resultados de aPTT presentados indican que FIX-(CTP)2 exhiben una reducción de 5,7 veces en su actividad de coagulación específica en comparación con rhFIX (Tabla 2). Además, los resultados de aPTT junto con el ensayo de actividad cromogénica in vitro sugiere que la cosecha de FIX-(CTP)2 tiene una actividad enzimática mejorada frente a la cosecha de FIX-CTP (Tabla 2). Puede obtenerse una actividad mejorada de las proteínas FIX-CTp después de la optimización del sistema de expresión (es decir, transfección conjunta con furina y optimización de la concentración en el medio de vitamina K3), que se reforzó después de la supertransfección con furina (datos no mostrados).
Tabla 2: Actividad de coagulación de FIX
rhFIX (AD) PTT (s) FIX-CTP PIT (s) FIX-CTP-CTP (pg/ml) PTT (s)
(pg/ml) (pg/ml)
5 31,3 9 45,2 4 47,5
1,25 35,7 2,25 53,3 1 55,9
0,3125 43 0,5625 64,1 0,25 67
0,078125 52,1 0,140625 76,3 0,0625 77,4
Estudio farmacocinético: Las cosechas de rhFIX (American Diagnostic) y FIX-CTP se administraron en una única inyección intravenosa a ratas Sprague-Dawley (seis ratas por sustancia) a una dosis de 75 pg/kg de peso corporal (Tabla 3).
Tabla 3: Plan de funcionamiento del estudio PK
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Se extrajeron muestras de sangre retroorbitalmente de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,51,5, 4, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. El plasma se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta el análisis. La concentración de FIX se cuantificó mediante un ensayo específico de ELISA para FIX (AssayPro). Se calculó un perfil farmacocinético para cada proteína y representa la media de 3 animales en cada punto temporal (Figura 3). Las semividas terminales se calcularon mediante el uso del software PK solutions 2.0. La Tabla 4 resume las concentraciones de FIX observadas en los diferentes puntos temporales de muestreo.
Tabla 4: Concentraciones de FIX observadas
Tiempo FIX-AD (ng/ml) FIX-CTP (ng/ml) FIX-CTP-CTP (ng/ml) (H)
0,083 1506,7 1477,5 1914,8
0,5 1949,8 1150,1 1830,1
1,5 2189,4 1009,0 1264,3
4 733,90 709,33 1000,00
8 319,80 167,20 1234,67
24 BLQ 54,625 230
48 BLQ BLQ 120,9
El perfil farmacocinético y el resumen de las semividas terminales se resume en la Tabla 5. Las cosechas de FIX-CTP exhiben unos valores de T1/2p mejorados en comparación con rhFIX (aumentos de 2 y 5 veces, respectivamente). Dado que en la colección de dosificación de FIX, las concentraciones de FIX en suero animal a las 24 h estaban más abajo del límite de cuantificación (BLQ), no se calcularon parámetros farmacocinéticos adicionales.
Tabla 5: Resumen de parámetros PK
Figure imgf000045_0001
En este estudio, se describió un enfoque novedoso para prolongar la semivida de FIX a la vez que se conserva la potencia terapéutica. Añadir un péptido CTP a una proteína activa tiene un potencial dañino de interferir con la actividad de la proteína. Por lo tanto, la generación de un FIX-CTP recombinante activo mediante la adición de una secuencia CTP en el extremo C-terminal del FIX es inesperada.
Caracterización de un FIX-CTP-CTP purificado por inmunoafinidad
Purificación de FIX-CTP-CTP
Para evaluar una proteína a un contenido de alto grado con mayor actividad cuyo perfil PK imita y puede extrapolarse a un entorno clínico, FIX-CTP-CTP es un FIX modificado con 2 unidades de CTP en tándem en su extremo carboxi terminal. Se purificó FIX-CTP-CTP mediante el uso de anticuerpo monoclonal unido a matriz contra residuos de carboxiglutamil (Gla) y presentes en la región N-terminal del FIX (American Diagnostics núm. cat. 3570MX). El anticuerpo monoclonal se unió a Sefarosa CL-4B. La cosecha de FIX-CTP-CTP a una concentración de 88 mg/ml se dializó frente a Tris 20 mM, NaCl 150 mM y EDTA 10 mM a pH = 7,4. La velocidad de carga fue de 0,5 ml/min, la elución se realizó mediante el uso de Tris-HCl 20 mM, NaCl 350 mM y CaCl 50 mM, y la fracción no unida se recicló cinco veces. Finalmente, la fracción de elución se dializó con PBS, se extrajo y se concentró.
Determinación del nivel de antígeno de FIX: Se determinaron los niveles de las cosechas de FIX-CTP, cosechas de FIX-(CTP)2 y proteína purificada de FIX-(CTP)2 mediante el uso del kit de ELISA de FIX humano (Affinity Biologicals; núm. cat. FIX-AG RUO). La concentración de proteína calculada (mg/ml) es el promedio de dos corridas independientes (Figura 4, Tabla 6).
Tabla 6: Concentración de proteína calculada
FIX-CTP FIX-CTP-CTP FIX-CTP-CTP (purificado)
Nivel de Ag FIX (pg/ml) 125,78 88,53 172,9
SD 17,28 21,31 2,63
% CV 13,74 24,08 1,52
Adicionalmente, se cuantificó FIX-CTP-CTP mediante el ensayo de Bradford. La concentración calculada fue 202 mg/ml, que es similar a la concentración obtenida por el ELISA de FIX humano.
Transferencias por SDS-PAGE: La cosecha de FIX-CTP-CTP, la fracción no unida y la proteína purificada se cargaron en un gel de Tris-Glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de doble color Precision Plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE Coomassie se realizó al teñir el gel con reactivo azul de Coommasie (800 ng de proteína). Se realizó una inmunotransferencia Western con 100 ng de proteína, anticuerpo policlonal (Ab) anti-FIX humano y Ab monoclonal anti-carboxilación gamma humana (American Diagnostics núm. cat 499 y 3570). El procedimiento de purificación por inmunoafinidad enriqueció significativamente la porción de FIX-CTPCTP a la vez que redujo la impureza (Figura 5).
Secuenciación N-terminal: La proteína purificada de FIX-CTP-CTP se separó mediante SDS-PAGE con Tris-Glicina al 12 % y subsecuentemente se sometió a electrotransferencia a una membrana de PVDF. La banda de interés se cortó y se colocó en un filtro de fibra de vidrio tratado con Biobrene purificado. El análisis de la secuencia N-terminal se llevó a cabo mediante degradación de Edmann mediante el uso de un secuenciador de proteínas líquidas pulsadas equipado con un sistema de micro-gradiente de HPLC 140 C. La secuenciación N-terminal reveló que FIX-CTP-CTP es una mezcla de proteínas escindidas de propéptido incompletas y completas. Se demostró que la escisión inadecuada del propéptido reduce la actividad de coagulación del FIX. Mediante la transfección conjunta con furina, puede mejorarse el proceso de escisión del propéptido.
Determinación de la actividad cromogénica del FIX: Se realizó una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la proteína purificada FIX-CTPCTP frente a rhFIX (American Diagnostics) y se realizó una combinación de plasma humano normal mediante el uso del kit de prueba de actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). En presencia de trombina, fosfolípidos y calcio, cantidades en exceso de FXIa activan FIX hacia FIXa. FIXa forma un complejo enzimático con trombina (suministrada en cantidades en exceso), fosfolípidos y calcio que activa el Factor X, presente en el sistema de ensayo, hacia FXa. La actividad se correlaciona directamente con la cantidad de FIX, que es el factor limitante. El FXa generado se midió por su actividad específica sobre el sustrato cromogénico de FXa (pNA). La cantidad de pNA generado fue directamente proporcional a la actividad de FIXa. Se diluyeron en serie rhFIX, plasma humano y FIX-CTP-CTP y se evaluó la potencia al comparar una curva dosis-respuesta (Figura 6). La EC50 promedio de rhFIX fue de 68,74 ng/ml mientras que la EC50 calculada de FIX-CTP-CTP fue de 505 ng/ml. Se observó una disminución de aproximadamente 7 veces en la actividad enzimática de FIX-CTP-CTP frente al FIX recombinante y una disminución de 16,5 veces frente a plasma humano normal extraído. Esta actividad reducida podría explicarse por la escisión inadecuada del propéptido N-terminal, que se identificó mediante un análisis N-terminal.
Actividad de coagulación de FIX (aPTT): El tiempo de tromboplastina activada parcial (aPTT) es una medida de la integridad de las vías intrínsecas y comunes de la cascada de coagulación. El aPTT es el tiempo (medido en segundos) que tarda el plasma en coagular tras la adición de un activador de la vía intrínseca, fosfolípidos y calcio.
El ensayo cuantificó la capacidad de la proteína FIX-CTP-CTP para restaurar la actividad de coagulación del plasma humano agotado en FIX mediante la adición de rhFIX. Se mezclaron 300 ml de plasma humano deficiente en FIX con 100 ml de rhFIX, FIX-CTP-CTP (FIX-CTP-CTP (los CTP están en tándem en el C-terminal)), o plasma humano normal combinado que se diluyó posteriormente. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añadieron a la mezcla factor tisular (TF), CaCl2 y fosfolípidos. Se determinó el tiempo de coagulación en segundos. La potencia se evaluó al comparar una curva de respuesta a la dosis de FIX-CTP-CTP con una preparación de referencia de rhFIX o plasma humano. Una unidad de FIX se definió como la cantidad de FIX que equivale a la actividad de 1 ml de plasma humano normal.
Los resultados de aPTT indican que la actividad de coagulación de FIX-CTP-CTP es solo 1,4 menor que la del plasma humano normal combinado y similar a rhFIX. Los resultados de aPTT junto con el ensayo de actividad cromogénica in vitro sugiere que la purificación de FIX-CTP-CTP no dañó su actividad.
Actividad farmacocinética de FIX-CTP-CTP: Se administraron FIX-CTP-CTP purificado, rhFIX (American Diagnostic) y cosechas que contenían FIX-CTP-CTP y FIX-CTP en una única inyección intravenosa a ratas Sprague-Dawley (ocho ratas por sustancia) en una dosis de 100 pg/kg de peso corporal (Tabla 7).
Tabla 7: Esquema del estudio PK
Figure imgf000046_0001
Se extrajeron muestras de sangre retroorbitalmente de 4 ratas alternativamente a 0,083, 0,5, 2, 4, 710, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. Se preparó plasma con citrato (0,32 %) inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta el análisis. La concentración de FIX se cuantificó mediante el uso de un kit de ELISA de FIX humano (Affinity Biologicals). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína como la media de 4 animales en cada punto temporal (Figura 7). La semivida terminal se calculó mediante el uso del software PK Solutions 2.0. La Tabla 8 resume las concentraciones de FIX observadas en diferentes puntos temporales de muestreo.
Tabla 8: Concentraciones de FIX observadas
Tiempo Cosecha de Cosecha de rhFIX ng/ml FIX-CTP-CTP
(h) FIX-CTP FIX-(CTP)2 purificado
ng/ml ng/ml ng/ml
0,085 1038,97 1123,62 325,05 886,48
0,5 939,12 956,80 274,58 670,92
1 791,97 843,85 222,90 674,17
2 304,98 673,31 186,00 503,91
4 315,37 525,50 109,69 357,36
7 171,45 384,36 67,62 257,02
10 50,34 250,73 40,20 158,66
24 10,07 78,50 BLQ 52,13
48 BLQ 23,40 BLQ 18,07
En la Tabla 9 se presenta un resumen de los parámetros farmacocinéticos.
Tabla 9: Resumen de parámetros PK
T1/2 (h) AUC ng-h/ml MRT Vd CL
(h) ml/Kg ml/h/Kg
Cosecha de 4,17 3622 4,5 155,1 27,6
FIX-CTP
Cosecha de 10,44 9105,7 12 165,4 10,9
FIX-(CTP)2
rhFIX 3,72 1416,8 5,1 373,8 70,183
FIX-CTP-CTP 11,14 6314,2 12,3 254,5 15,83
purificado
La cosecha de FIX-CTP-CTP demostró un perfil PK mejorado en comparación con la cosecha de FIX-CTP. Además, el FIX-CTP-CTP purificado exhibió un aumento de 3 veces en el valor de T1/2p y un aumento de 4,5 veces en el AUC en comparación con rhFIX.
La cantidad reducida de FIX secretado fusionado a moléculas de CTP en tándem frente a la fusión de un solo CTP parece deberse a la adición de un CTP extra y no a una detección reducida por ELISA, porque la concentración calculada de FIX-CTP-CTP purificado por Bradford fue similar a la concentración calculada por ELISA.
La actividad de coagulación de FIX-CTP-CTP fue similar a la del plasma humano combinado; sin embargo, su actividad cromogénica in vitro fue significativamente menor en comparación con rhFIX o plasma humano combinado. El ensayo de actividad cromogénica se informó como un ensayo muy sensible en comparación con el ensayo de coagulación. El motivo de la actividad reducida de FIX-CTP-CTP puede variar. La adición de CTP puede disminuir la afinidad de FIX por FXIa o reducir las modificaciones postranscripcionales (por ejemplo, 12-10 residuos de GLA y escisión del propéptido). El análisis N-terminal reveló que la escisión proteolítica del propéptido de FIX-CTP-CTP no se completó totalmente antes de la secreción. Dado que esta modificación postranscripcional es fundamental para la actividad enzimática normal de la proteína, la transfección conjunta con el plásmido Furina-PACE es favorable y puede mejorar la actividad de FIX-CTP-CTP.
Finalmente, el estudio de PK comparativa de FIX-CTP-CTP en ratas demostró que la fusión de dos CTP en tándem al C-terminal de FIX generó un FIX con una semivida extendida.
Modelo de ratón agotado de FIX: Para evaluar la actividad in vivo, se obtienen ratones con desactivación de FIX y se establece una colonia de reproducción. Se inyectan 10 mg de hFIX recombinante comercial (BeneFIX®) o rFIX(CTP)2 (FIX-CTPCTP) en la vena de la cola de un ratón con desactivación de FIX anestesiado (22-28 g). La cantidad de proteína inyectada es igual a la concentración requerida de FIX en el plasma normal (5 mg/ml). Se toman muestras de sangre de la cola cortada en tubos capilares heparinizados en puntos temporales específicos. Las muestras de plasma se evalúan para determinar los niveles de FIX mediante ELISA y se mide la eficacia mediante un ensayo de coagulación de aPTT.
Aumento de la eficacia de escisión del propéptido de FIX: El ADNc del péptido CTP se fusionó al extremo 3' del ADNc de FIX humano. Los correspondientes constructos que expresan rFIX y furina se transfectaron conjuntamente en células Dg44; también se transfectó conjuntamente un ADNc de rFIX humano con el plásmido de furina como control. La secreción de un alto nivel de FIX conduce a la secreción de una mezcla de profactor y un factor FIX, debido a la cantidad limitada de la proteasa furina en la célula. La transfección conjunta de un vector que expresa Furin con un vector que expresa pro-factor aumenta la recuperación y da como resultado la secreción de FIX completamente procesado hacia el medio.
Después de la cotransfección de FIX-(CTP)2 y Furina, se generan clones estables y se recolecta la cosecha para la evaluación de la escisión del propéptido. Se cargan 100 ng de proteína en gel de tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de doble color Precision Plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE se realiza mediante inmunotransferencia Western mediante el uso de Ab policlonal anti-FIX humano (American Diagnostics) y anticuerpo policlonal anti-propéptido. Como se informó anteriormente, rhFIX migró a 55 kDa, mientras que FIX fusionado a dos CTP migró a 75 kDa. Se muestra que ambas variantes de proteínas FIX experimentan una escisión completa y adecuada del propéptido.
Para determinar si la escisión adecuada de propéptidos mejora la actividad enzimática de FIX-(CTP)2 , se realiza una evaluación comparativa de la actividad cromogénica y de coagulación de la cosecha de FIX-(CTP)2 transfectada conjuntamente con Furina. Se observa una mejora significativa de la actividad específica de FIX-(CTP)2 que es similar a rhFIX.
En conclusión, los resultados descritos en la presente descripción sugieren que FIX-CTP-CTP puede usarse eficientemente para tratar pacientes con hemofilia B. Los constructos de FIX fusionado con CTP se benefician de un desempeño farmacológico in vivo que supera el inconveniente en ciertas mediciones in vitro. Este tratamiento propuesto es ventajoso sobre los tratamientos anteriores ya que reduce la velocidad de infusiones y la cantidad de dosis requeridas.
Es importante notar que cuando se usó una estrategia de molécula fusionada con albúmina para mejorar la semivida del FIX, el FIX recombinante se volvió inactivo. El presente enfoque novedoso conduce al diseño y purificación de una nueva proteína recombinante fusionada a FIX que presenta una actividad de larga duración mejorada. Dado que las simples modificaciones de tamaño no mejoraron la farmacocinética del FIX inyectado, el hallazgo de que el CTP fusionado con FIX facilita los parámetros farmacocinéticos fue inesperado. La presencia de residuos de péptidoácido siálico altamente glicosilados estabilizó la proteína y la protegió de las interacciones con los receptores vasculares sin anular los determinantes clave de la función de FIX.
FIX-CTP tiene una eficacia terapéutica similar al rFIX en pacientes con hemofilia B y requirió una dosificación menos frecuente. Una sola inyección de FIX-CTP es suficiente para controlar los episodios de sangrado y reducir el número de inyecciones necesarias durante la intervención quirúrgica en pacientes con hemofilia B.
La tecnología de CTP se utilizó para el desarrollo de un FIX de acción prolongada. Específicamente, la extensión de la semivida de la molécula de rFIX recombinante se realizó mediante la fusión de al menos un CTP humano al FIX. El FIX-CTP recombinante se expresó en células de mamífero y se caracterizó in vitro e in vivo.Se demostró que la actividad in vitro de rFIX-CTP fue comparable a la de rFIX. Los estudios de farmacocinética y eficacia en ratas demostraron las propiedades mejoradas del rFIX-CTP. Los resultados de este estudio demuestran que es factible desarrollar una molécula de rFIX con semivida prolongada que tenga propiedades hemostáticas similares a las de la enzima de tipo silvestre.
Ejemplo comparativo 2
Evaluación comparativa de FIX-CTP3 purificado frente a FIX-CTP4 y FIX-CTP5
2.1 Objetivo del estudio
Una evaluación comparativa de los parámetros farmacocinéticos de FIX-CTP4 y FIX-CTP5 frente a FIX-CTP3 mediante un proceso de purificación parcial.
2.2 Producción de cosechas de FIX-CTP4 y FIX-CTP5
El ADNc de FIX (OriGene RC219065) fusionado en el C-terminal a cuatro o cinco secuencias de CTP en tándem se expresó en células Dg44 mediante el uso del sistema de expresión Excellgene en presencia de 10 ng/l de vitamina K3 (Sigma, Mennadion). Las cosechas se recolectaron (300 ml), se filtraron y se congelaron.
2.3 Producción de cosecha de FIX-CTP3
FIX-CTP3 se expresó internamente en células CHO mediante el uso del vector pCI-DHFR, clon 196, BR-9 en presencia de 25 ng/l de vitamina K3 (Sigma). Las cosechas se recolectaron y se filtraron.
Todas las muestras de FIX-CTP (3, 4 y 5 CTP) se purificaron únicamente mediante una columna de jacalina debido a la falta de material.
2.4 Determinación del nivel de antígeno de FIX
El nivel de antígeno de FIX se determinó mediante el uso del kit de ELISA de FIX humano (Affinity Biologicals; núm. cat. FIX-AG RUO). La concentración de proteína calculada es el promedio de cuatro corridas independientes. La concentración de FIX-CTP3 fue ligeramente mayor en comparación con las dos versiones adicionales (Tabla 10).
Tabla 10: Nivel de antígeno de FIX
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2.5 Tinción e inmunotransferencia con Coomassie de FIX-CTP
Las cosechas de FIX-CTP3 , FIX-CTP4 y FIX-CTP5 se cargaron en gel de Tris-Glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteínas de doble color Precision Plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western mediante el uso de Ab policlonal anti-CTP (Adar Biotech Production) o Ab anti-Gla (American Diagnostica).
Como se informó anteriormente, el FIX fusionado a tres CTP migró a 80 kDa mientras que el FIX fusionado a cuatro o cinco CTP migró a 85 KDa o 90 KDa, respectivamente. Como se esperaba, las cosechas de FIX-CTP4 y FIX-CTP5 de Excellgene mostraron niveles muy bajos de carboxilación gamma en comparación con la cosecha de FIX-CTP3 , que se produjo en Prolor (Figura 8).
Después de un proceso de purificación mediante el uso de una columna de jacalina (purificación por inmunoafinidad de proteínas glicosiladas), FIXCTP3 , FIX-CTP4 y FIX-CTP5 se cargaron en gel de Tris-Glicina al 12 % mediante el uso de un marcador de proteínas de doble color Precision Plus (Bio-Rad). La SDS-PAGE se tiñó con colorante de azul Coomassie para la detección de los muestras. Todas las variantes mostraron perfiles de banda mucho más limpios (Figura 9), lo que sugiere una mejora de la pureza.
2.6 Determinación de la actividad cromogénica de FIX
Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de FIX-CTP3 completamente purificado (columna HA), FIX-CTP4 y FIXCTP5 frente a plasma humano normal combinado se realizó mediante el uso de un kit de prueba de actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Todas las muestras se diluyeron en serie y la potencia se evaluó al comparar una curva de respuesta a la dosis con una preparación de referencia de plasma humano normal. La actividad cromogénica reducida de FIXCTP4 y FIX-CTP5 (Figura 10) en comparación con el plasma puede ser una consecuencia de modificaciones postranscripcionales inadecuadas de las proteínas de FIX, por ejemplo, carboxilación gamma inapropiada y escisión del propéptido o, alternativamente, debido a la adición de casetes de CTP. La fluctuación en la actividad de FIX-CTP4 y FIX-CTP5 (Tabla 11) podría estar provocada por capacidades de cuantificación inapropiadas del ELISA de FIX debido al enmascaramiento de CTP del sitio del antígeno.
Tabla 11: Relación EC50 muestra/plasma
Figure imgf000049_0002
2.7 Estudio farmacocinético
FIX-CTP3 , FIX-CTP4 y FIX-CTP5 purificados con jacalina (Grupo A, B y C, respectivamente) se administraron en una única inyección intravenosa a ratas Sprague-Dawley (seis ratas por grupo de tratamiento) a una dosis de 250 pg/kg de peso corporal. Se extrajeron muestras de sangre retroorbitalmente de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,52, 5, 8, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosificación (Tabla 12). Se preparó plasma con citrato (0,38 %) inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta el análisis.
Tabla 12: Plan de funcionamiento del estudio PK
Figure imgf000050_0002
La concentración de FIX en muestras de plasma se cuantificó mediante el uso de kits de ELISA de FIX humano (Affinity Biologicals). Se calculó el perfil farmacocinético y es la media de 3 animales en cada punto temporal. Las semividas terminales se calcularon mediante el uso del software PK Solutions 2.0. La Tabla 13 más abajo resume las concentraciones de FIX calculadas en los diferentes puntos temporales de muestreo.
Tabla 13: Concentraciones de FIX calculadas
Figure imgf000050_0001
El perfil PK y un resumen de los parámetros de PK se presentan en la Tabla 14 más abajo y en la Figura 11. Un perfil completo de análisis de PK en todos los puntos temporales sugirió que la adición de 4 o 5 casetes de CTP a FIX no aumentó su semivida en comparación con FIX-CTP3. El AUC después de la administración de FIX-CTP5 aumentó de 1,4 a 1,6 veces frente a FIX-CTP3 , que no fue estadísticamente significativo.
Tabla 14: Perfil PK y un resumen de los parámetros de PK
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Dado que se demostró que las muestras a las 96 horas posteriores a la dosificación tenían concentraciones de FIX muy bajas, que estaban en el límite inferior de cuantificación del ensayo, se recalculó la semivida terminal lo que proporcionó un cálculo más preciso y científicamente apropiado (Tabla 15). De acuerdo con este cálculo, se obtuvieron diferencias aún menores entre la semivida de FIX-CTP3 , FIX-CTP4 y FIX-CTP5.
Tabla 15: Vida media terminal recalculada
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2.8 Conclusiones:
En este estudio, se evaluaron los parámetros farmacocinéticos y la posible actividad de coagulación de FIX-CTP3 , FIX-CTP4 y FIXCTP5. La fusión de 4 y 5 CTP a FIX no proporcionó una extensión de la semivida superior o mejorada, en comparación con FIX-CTP3 y se observó una actividad cromogénica reducida. La Tabla 16 más abajo resume el por ciento de mejora de la semivida para las diferentes variantes fusionadas de FIX-CTP (1 a 5 CTP). La fusión de CTP al FIX mejoró su comportamiento farmacocinético, pero, de manera impredecible, esta mejora fue limitada. Sorprendentemente, después de la fusión de 3, 4 o 5 CTP en tándem al FIX, se calculó un valor de semivida similar.
Tabla 16: Resumen del por ciento de mejora de la semivida
Figure imgf000051_0003
Estos datos sugieren que la fusión de 3 CTP al FIX produce una mejora máxima en la semivida de la proteína, lo que confirma que FIX-CTP3 es la variante óptima en términos de semivida, estructura y actividad de coagulación potencial para un posterior desarrollo clínico.
Ejemplo comparativo 3
Tratamiento con fix-ctp3 de modelo de ratón hemofílico fix-/
Como se describió anteriormente, se llevó a cabo un estudio que prueba el perfil de PK de cosechas de FIX-CTP, FIX-CTP2 y FIX-CTP3 y la actividad de coagulación frente a rhFIX. FIX-CTP3 exhibió un perfil de PK mejorado a la vez que mantenía su actividad de coagulación frente a cosechas de FIX-CTP1 y FIX-CTP2 o rhFIX. Para evaluar más a fondo este resultado, se purificó la proteína Y-carboxiglutamato FIX-CTP3. FIX-CTP3 exhibe un aumento de 3 veces en la semivida y un AUC 4,5 veces mayor en comparación con rhFIX en ratas normales después de una única administración intravenosa. FIX-CTP3 demostró una reducción en la actividad cromogénica y de coagulación in vitro, muy probablemente debido a la escisión insuficiente del propéptido N-terminal y en modificaciones postranscripcionales (PTM) apropiadas, tales como la carboxilación gamma apropiada.
En el presente estudio, se probaron las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del FIX recombinante humano fusionado con tres CTP en tándem en ratones deficientes en FIX.
Propósito del estudio:
Determinar los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos de rFIX-(CTP)3 frente a rhFIX comercial (BeneFIX®) en ratones deficientes en FIX después de una única administración intravenosa de FIX-(CTP)3 a una actividad y dosis específicas similares (actividad específica similar para la PD y constante FIX similar para la PK). Producción de cosecha de FIX-CTP3 :
El ADNc de FIX (OriGene RC219065-Thr 148) fusionado en el C-terminal a tres secuencias CTP en tándem se expresó en células Dg44 mediante el uso del sistema de expresión Excellgene en presencia de 25 ng/ml de vitamina K3 (Sigma, Mennadion). Se cultivaron cinco lotes separados que contenían 5 litros de suspensión celular (un total de veinticinco litros) y se cosecharon después de una disminución de la viabilidad al 60-70 %. La cosecha se filtró y se congeló a -70 °C.
Determinación del nivel de antígeno de la cosecha de FIX:
El nivel de antígeno de la cosecha de FIX se determinó mediante el uso de un kit de ELISA de FIX humano (Affinity Biologicals; núm. cat. FIX-AG RUO). El nivel de antígeno se calculó para cada lote. La concentración de FIX se mantuvo a través de los diferentes lotes (Tabla 17).
Tabla 17: Nivel de antígeno de FIX
Nivel de antígeno de FIX
Lote #1 Lote #2 Lote #3
Prom (pg/ml) 28,81 32,74 42,9
DE 2,5 2,69 4,0
% CV 8,84 8,32.2 9,4
Proceso de purificación de FIX-CTP3 :
Después de un breve estudio de purificación, se realizó un proceso de purificación mediante el uso de las siguientes 3 columnas: Sefarosa DEAE, Sefarosa Heparina e Hidroxiapatita Cerámica tipo 1 HA Bio Rad (40 mm), FIX-CTP3. Se purificó la proteína enriquecida Y-carboxilada. Brevemente: Se descongelaron cinco litros de cosecha clarificada a 4 °C durante un período de 4 días. Para cada lote de purificación, la cosecha clarificada (2 litros) se concentró 4 veces y se dializó contra Tris-HCl 20 mM pH 8,2 mediante el uso de un cartucho de fibra hueca desechable con un tamaño de corte de peso molecular nominal de 10 KDa. Este proceso (UFDF1) se realizó dos veces, y se cargó un litro de UFDF1 en una columna de Sefarosa DEAE, y el Factor IX se eluyó con Tris-HCl 20 mM, NaCl 200 mM, CaCl2 10 mM pH 8,2. El producto se diluyó 1:1 con Tris-HCl 20 mM, CaCl2 10 mM pH 7,5 y el pH se ajustó a 7,5 antes de cargarlo en una columna de sefarosa heparina. La elución se realizó con Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM y CaCl2 10 mM pH 7,5. El producto eluido se concentró y se dializó contra fosfato 10 mM pH 6,8 mediante el uso de una membrana de corte de 10 KDa de casete Pellicon XL (UFDF2). El producto se cargó en una columna de HA y la fracción activada de Factor IX se eluyó con fosfato 150 mM pH 6,8. El producto de purificación se concentró hasta una concentración objetivo de 2 mg/ml y se dializó contra TBS pH 7,45, se dividió en alícuotas y se almacenó a -70 °C.
El proceso de purificación se repitió cinco veces, semanalmente, para purificar el volumen total (25 litros). Los procesos de purificación se denominaron HA# 6-10. Cada producto de purificación se evaluó por separado (Ap # 1­ 5). Al final del proceso de purificación, los diferentes lotes se combinaron y se concentraron adicionalmente hasta una concentración objetivo de 4 mg/ml.
Propiedades analíticas de FIX-CTP3 :
Determinación del nivel de antígeno de FIX
El nivel de antígeno de proteína enriquecida Y-carboxilada FIX-CTP3 se determinó mediante el uso de un kit de ELISA de FIX humano (Affinity Biologicals; núm. cat. FIX-AG RUO). La concentración de proteína calculada es el promedio de dos corridas independientes (Tabla 18).
Tabla 18: Nivel de antígeno de FIX-CTP3
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Figure imgf000053_0002
Transferencias de SDS-PAGE:
Se cargaron proteína enriquecida Y-carboxilada FIX-CTP3 , rhFIX y rFIXa (FIX activado) en gel de Tris-Glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteínas de doble color Precision Plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE Coomassie se realizó al teñir el gel con reactivo azul de Coomassie (800 ng de proteína) (Figura 12). Se realizó una inmunotransferencia Western mediante el uso de 100 ng de proteína con Ab policlonal anti-FX humano (Figura 12B), anticuerpo monoclonal anti-carboxilación gamma humana (American Diagnostics núm. cat 499, 3570) (Figura 1 2 C), Ab policlonal anti-propéptido FIX (Figura 12D) y Ab policlonal anti-CTP (Figura 12E). Como se informó anteriormente, FIX-CTP3 migró a 75 KDa.
El procedimiento de purificación enriqueció significativamente la porción FIX-CTP3 a la vez que redujo las impurezas. El rendimiento del proceso de purificación fue muy bajo, que varió alrededor del 2-3 % (datos no mostrados) debido al requisito de recolectar solo las fracciones de FIX-CTP3 Y-carboxiladas, como se demuestra en la inmunotransferencia anti-Gla (Figura 12B). Basado en Coomassie y en inmunotransferencia de FIX, la porción FIX-CTP3 es solo alrededor del 60-70 %, y también se detectaron bandas adicionales de peso molecular más bajo, presumiblemente con formas de glicosilación más bajas.
Actividad de coagulación de FIX-CTP3 :
Actividad cromogénica de FIX-CTP3:
Se realizó una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la cosecha de FIX-CTP3 y proteína enriquecida y-carboxilada FIX-CTP3 , frente a plasma humano normal combinado, mediante el uso de un kit de prueba de actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). La cosecha de FIX-CTP3 y la proteína se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó al comparar una curva de respuesta a la dosis con una preparación de referencia que consistía de plasma humano normal. Como se demostró anteriormente, la cosecha de FIX-CTP3 fue 50 veces menos activa que el plasma humano combinado (Tabla 19, Figura 13). Después de la purificación de FIX-CTP3 , la actividad cromogénica mejoró significativamente y fue sólo 4,72 veces menos activo que el plasma humano combinado (Tabla 19, Figura 13). La reducción de la actividad cromogénica de la cosecha puede ser una consecuencia de modificaciones postranscripcionales inadecuadas de variantes de la proteína FIX, por ejemplo, gamma carboxilación inapropiada y escisión de propéptido. Después de la purificación y enriquecimiento de la fracción Y-carboxilada de FIX-CTP3 , se mejoró la actividad, lo que demuestra la importante contribución de la y-carboxilación a la actividad de FIX.
Tabla 19: Actividad cromogénica de FIX-CTP3
Muestra EC50 Relación EC50
(ng/ml) muestra
/plasma
Cosecha 741,3 54,4
FIX-CTP3
Pur. FIX- 64,6 4,72
CTP3
Plasma 13,63 1
Ensayo de coagulación en una etapa (aPTT):
El tiempo de tromboplastina activada parcial (aPTT) es una medida de la integridad de las vías intrínsecas y comunes de la cascada de coagulación. El aPTT es el tiempo, en segundos, para que el plasma se coagule después de la adición de un activador de la vía intrínseca, fosfolípido y calcio. El principio del ensayo fue cuantificar la capacidad de FIX-CTP3 para restaurar la actividad de coagulación del plasma humano agotado en FIX mediante la adición de rhFIX. Se mezclaron 200 ml de plasma humano deficiente en FIX con 25 mg/ml de FIX-CTP3 y se diluyeron posteriormente en TBS. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añadieron a la mezcla 50 ml de activador de PTT (Actina FS) y 50 ml de calcio 25 mM, y se determinó el tiempo de coagulación en segundos mediante el uso de un coagulador Sysmex® CA 1500 (realizado por Sheba Hospital, National Coagulation Center mediante el uso de un ensayo aPTT validado). La potencia se evaluó mediante la comparación de FIX-CTP3 con respecto a la curva dosis-respuesta de una preparación de referencia de plasma humano normal combinado. Los resultados se expresan en por ciento de actividad interpolado a partir de la curva estándar que cubre los niveles de FIX de <1-110 %. FIX-CTP3 mostró una reducción de 15-20 veces en su actividad de coagulación frente al plasma humano normal combinado ya que la actividad a 5 mg/ml, que es el valor normal de FIX en el cuerpo, resultó ser del 6,5 % (Tabla 20).
Tabla 20: Actividad de coagulación de FIX-CTP3
Figure imgf000055_0001
FIX-CTP3 también mostró un mayor tiempo de coagulación en comparación con BeneFIX® (Tabla 21 y Figura 14).
Tabla 21: Tiempo de coagulación comparativo (aPTT)
Tiempo de
coagulación
FIX-CTP3 BeneFIX®
30 ug/ml 77,6
19 ug/ml 83,4
7,6 ug/ml 93,2 50,6
3,8 ug/ml 104,8 57,6
1,9 ug/ml 112,2 63,7
0,95 ug/ml 122,6 71,5
0,475 ug/ml 83,7
| 0,238 ug/ml 94,3
El Dr. Paul Monahan de la Universidad de Carolina del Norte realizó independientemente un ensayo de coagulación adicional en ratones deficientes en FIX antes del inicio del estudio de PK-PD. Los resultados de aPTT sugirieron que la actividad de coagulación de FIX-CTP3 es 40 veces menor que la del plasma humano normal combinado, como lo demuestra el período más largo (medido en segundos) y la concentración más alta que se requieren para una actividad de coagulación adecuada (Tabla 22).
Tabla 22: Actividad de coagulación comparativa
Actividad de FIX (Unidades)
FIX-CTP3 BeneFIX®
38 ug/ml 13,9
19 ug/ml 8,8
7,6 ug/ml 4 116,8
3,8 ug/ml 1,6 67,4
1,9 ug/ml 0,9 41,7
0,95 ug/ml 0,4 22,4
0,475 ug/ml 8,5
| 0,238 ug/ml 3,7
La actividad específica (u/ml), que se basó en el nivel de antígeno de FIX calculado por ELISA para FIX-CTP3 y BeneFIX®, fue de 4,46 y 198,9, respectivamente.
La inconsistencia en la actividad de FIX-CTP3 calculada demostrada en los ensayos cromogénicos frente a aPTT puede explicarse por la sensibilidad superior del ensayo aPTT y la relevancia in vivo. En el ensayo de actividad cromogénica, hay una cantidad en exceso de reactivos y enzimas que pueden activar versiones de FIX menos potentes. La diferencia en los valores de actividad específica de FIX-CTP puede explicarse por el uso de diferentes reactivos y máquinas automatizadas. El valor de actividad calculado en la Universidad de Carolina del Norte se usó para el diseño del estudio de PK-PD.
Detección de proteína FlXa:
Para confirmar que después del proceso de purificación, no se produjo la activación de FIX (FIXa), se realizó un ensayo de detección de FIXa mediante el uso del ensayo cromogénico FIXa Biophen (núm. cat. Ref. 221812). El ensayo mide la cantidad de FIXa presente en una muestra específica mediante el uso de la cascada de actividad cromogénica, como se describió anteriormente. FIX-CTP3 y rhFIX se diluyeron y se evaluaron los niveles de FIXa. FIX-CTP3 no se activó durante la purificación o almacenamiento (Tabla 23).
Tabla 23: Detección de FIXa
Muestra FIX- CTP3 rhFIX
Con. Inicial
(mg/ml) 1000 5,7
rFIXa BLQ 0,00487 (mg/ml)
% FIXa en la
muestra BLQ 0,085
Estudio PK-PD de FIX-CTP3 : FIX-CTP3 y rhFIX (BeneFIX®) se administraron en una única inyección intravenosa a ratones C57BI deficientes en FIX en una dosis de 625 pg/kg de peso corporal que contenía 100 UI de FIX/kg de peso corporal. Se extrajeron muestras de sangre retroorbitalmente de 3 ratones alternativamente a las 0,25, 4, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosificación. Se preparó plasma con citrato (0,32 %) inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta el análisis. Se evaluó el nivel de antígeno de hFIX y se realizó un análisis PK detallado. Para evaluar la capacidad de FIX-CTP3 para alargar la actividad de coagulación de animales deficientes en FIX en comparación con BeneFIX®, se calculó la actividad de FIX en muestras de plasma con citrato, recolectadas de los ratones tratados FIX-/- mediante el uso de un ensayo de actividad de FIX automatizado (Tabla 24).
Tabla 24: Esquema del estudio
Figure imgf000056_0001
Perfil farmacocinético de FIX-CTP3 en ratones FIX' / -La concentración de FIX se cuantificó mediante el uso de kits de ELISA de FIX humano (Affinity Biologicals; núm. cat. FIX-AG RUO). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína y es la media de tres animales en cada punto temporal. La Tabla 25 más abajo y la Figura 15 resumen las concentraciones de FIX calculadas en los diferentes puntos temporales de muestreo para las cohortes 1 y 3. El perfil PK y un resumen de los parámetros de PK se presentan más abajo (Tablas 26 y 27). También se realizó un análisis PK para la Cohorte # 2 con el fin de verificar la exposición (datos no mostrados).
Tabla 25: Concentraciones de FIX
Punto FIX-CTP3 ng/ml BeneFIX®
tem oral n /ml
Figure imgf000057_0001
Se usó un módulo de dos compartimientos (software WinLin) para determinar AUC0-inf, Tterminal y aclaramiento (CL). Los parámetros de PK se describen más abajo en la Tabla 26.
Tabla 26: Propiedades PK
Versión de T1/2a T1/2P AUC CL MRT (h) Vss
FIX (1/h) (1/h) ng/ml*h ml/kg/h (ml/kg)
BaneFIX® 3,4 12,7 224,28 29 11,5 320,8
FIX-CTP3 4 28,7 31770 19 22 425,2
La adición de los tres "casetes" de CTP a rhFIX alargó la semivida del FIX in vivo en al menos 2,5 veces. El AUC después de la administración in vivo de FIX-CTP3 aumentó 2 veces frente a rhFIX. Los ratones inyectados con FIX-CTP3 demostraron un perfil PK mejorado en comparación con los ratones inyectados con BeneFIX®.
Perfil farmacodinámico de FIX-CTP3 en ratones deficientes en FIX:
Paralelamente al muestreo de PK, los animales con deficiencia de FIX administrados con BeneFIX® o FIX-CTP3 , muestras de plasma con citrato, se evaluaron para determinar su actividad de coagulación mediante un ensayo de aPTT, que se tradujo en % de actividad. El % de actividad en cada punto de recolección se calculó como el tiempo de coagulación actual/tiempo de coagulación de plasma combinado de ratones normal*100. La Tabla 27 resume los valores de actividad después de la administración de BeneFIX® o FIX-CTP3.
Después de la administración de FIX-CTP3 , se detectó una actividad de coagulación significativa una hora después de la administración, que alcanzó una actividad del 96 % cuatro horas después de la dosificación, mientras que el valor de actividad más alto de BeneFIX® fue del 40 % (Tabla 27, Figura 16). La actividad de coagulación de FIXCTP3 se mantuvo durante un período de tiempo más largo, lo que demuestra una actividad alargada. La actividad de coagulación de los ratones tratados con BeneFIX® fue indetectable en puntos temporales posteriores a las 36 horas, mientras que los ratones tratados con FIX-CTP3 aún conservaron una actividad medible 72 horas después de la dosificación (Tabla 27, Figura 16). El análisis del % de coagulación del perfil farmacocinético sugiere que la actividad de coagulación FIX-CTP3 se mantiene durante un periodo significativamente más largo y su semivida es casi 2 veces mayor que la de Benefix® (Tabla 28).
Tabla 27: % de actividad de FIX
H después de la BeneFIX@ FIX-CTP3
dosificación % de actividad % de actividad
0,25 39,9 1 , 0
1 33,4 15,5
4 24,9 93,6
8 18,8 65,2
16 10,3 39,9
24 1,7 11,9
36 1,4 11,0
48 <1 4,6
72 <1 1,4
Tabla 28: Actividad de coagulación
Versión T1/2a T1/2P
de FIX (1/h) (1/h)
BeneFIX® 5,7
FIX-CTP3 7,3 16
9.3 Prueba de sangrado de ratones con deficiencia de FIX
A ratones deficientes en FIX se les administró una única inyección intravenosa de 100 UI/kg de BeneFIX® o rFIX-CTP3. La vena de la cola se recortó ligeramente 48 horas después de la administración y se evaluaron el tiempo de sangrado de la vena de la cola (TVBT) y la intensidad del sangrado (DO de la hemoglobina). Se realizó un segundo desafío de sangrado 15 minutos después de alcanzar la homeostasis y se midieron los mismos parámetros. Después del primer desafío de sangrado, el sangrado de los animales administrados con FIX-CTP3 fue significativamente menos intenso que el sangrado con BeneFIX®, como lo demuestran los valores de DO de la hemoglobina (Figura 17).
Dado que se informó anteriormente que durante la primera prueba de sangrado en ratones hemofílicos, el tiempo de sangrado no se correlaciona necesariamente con la eficacia del tratamiento, se recomienda evaluar la homeostasis después de un sangrado adicional. Una vez que el primer sangrado se detuvo de forma espontánea o manualmente, se realizó una segunda prueba de sangrado 15 minutos después del primero, y se volvió a medir el tiempo y la intensidad del sangrado. Durante el segundo episodio de sangrado los animales administrados con FIX-CTP3 tenían el tiempo y la intensidad del sangrado reducidos, lo que demuestra que FIX-CTP3 fue potente en puntos temporales posteriores (Figura 18).
Finalmente, los animales se observaron adicionalmente durante las 12 horas siguientes al segundo desafío de sangrado y se documentaron todos los episodios de sangrado recurrentes. Los animales administrados con FIX-CTP3 pudieron mantener la homeostasis de la sangre durante las siguientes 12 horas sin que se repitieran los episodios de sangrado. Por el contrario, el 50 % de los ratones tratados con BeneFIX® tuvieron episodios de sangrado espontáneo por la cola (Tabla 29).
Tabla 29: Resultado 12 horas después de la transección de la cola
Figure imgf000058_0001
Se desarrolló un FIX-CTP3 recombinante, una proteína de fusión compuesta por una sola molécula de FIX fusionada a tres "casetes" de CTP en tándem para abordar la corta semivida de los productos de FIX actualmente disponibles que se usan para tratar pacientes con hemofilia B. Los resultados en la presente descripción demostraron que la semivida de eliminación de rFIX-CTP3 fue consistentemente 2,5 a 4 veces más larga que rFIX en ratas (como se informó anteriormente) y en ratones deficientes en FIX.
Sin querer limitarse por la teoría, la proteína de fusión reduce el aclaramiento de FIX y protege a FIX de la actividad de proteasa, degradación por enmascaramiento y reduce la afinidad de FIX por los receptores hepáticos. En conjunto, estas características del dominio CTP extienden la semivida del FIX.
Además del análisis farmacocinético de rFIX-CTP3, examinamos las propiedades farmacodinámicas de FIXCTP3 en ratones deficientes en FIX. rFIX-CTP3 y rFIX se administraron a dosis comparables (en unidades) para compensar los niveles de deficiencia de coagulación en ratones deficientes en FIX. Sin embargo, el efecto de rFIX-CTP3 en ratones deficientes en FIX se prolongó significativamente hasta al menos 76 horas después de la dosificación, al alcanzar un pico de actividad más alto. La actividad de coagulación de FIX-CTP3 comenzó después de un retraso de 1 hora en comparación con BeneFIX®. Podría requerirse la activación de FIX ya que la adición de tres CTP en tándem podría, en teoría, enmascarar el sitio de activación y retrasar el inicio de la cascada. Después de la administración de FIX-CTP3 , se observó un pico de actividad del 100 %, mientras que la actividad de BeneFIX® fue sólo del 40 %. La actividad inicial superior es un parámetro muy importante y demuestra que la adición de 3 CTP tiene el potencial de mejorar la recuperación.
La terapia de reemplazo de FIX profiláctica para pacientes con hemofilia B tiene como objetivo mantener niveles plasmáticos de 1-2 % de actividad de coagulación normal. El ensayo de sangrado en la vena de la cola es una prueba in vivo que mide la capacidad de mantener la homeostasis del sangrado a valores de actividad bajos lo que imita el modelo de homeostasis del sangrado humano. En respuesta al desafío de sangrado de la vena de la cola 48 horas después de la dosificación, los animales administrados con rFIX-CTP3 mantuvieron la homeostasis de la sangre con episodios de sangrado más cortos y menos graves, lo que demuestra una actividad de coagulación sostenida.
FIX es una proteína compleja que contiene varios dominios funcionales que experimentan amplias modificaciones postraduccionales. Una de las modificaciones postraduccionales esenciales para la actividad de FIX es la gammacarboxilación de los primeros 12 ácidos glutámicos en el dominio Gla por la y-glutamil carboxilasa dependiente de vitamina K. Esta modificación facilita la unión del FIX a las membranas de fosfolípidos y, por tanto, es fundamental para su función. El FIX que no está gamma-carboxilado no es funcional y, por lo tanto, la gamma-carboxilación es una etapa limitante de la velocidad.
Este estudio PK-PD se realizó mediante el uso de células transfectadas de forma transitoria. Se realiza una evaluación analítica exhaustiva de las modificaciones postraduccionales en la proteína FIX-CTP3 estable producida y secretada a partir de un clon optimizado estable.
Basado en los datos presentados, el factor de coagulación FIX-CTP3 tiene el potencial de reducir la frecuencia de inyecciones en pacientes que reciben dosis profilácticas de rutina de terapia de reemplazo de FIX. Se prevé que rFIX-CTP3 puede conferir protección prolongada contra sangrados después de cada dosis de factor, disminuir las unidades generales de factor necesarias para tratar episodios de sangrado y/o mantener una hemostasia adecuada durante los procedimientos quirúrgicos con menos inyecciones.
Ejemplo 4
Generación y utilización del factor de coagulación FVII
Una versión de acción prolongada del factor de coagulación Factor VII activado (FVIIa) será útil para el tratamiento de pacientes con hemofilia A y B. La proteína recombinante FVIIa-CTP3 tiene el potencial clínico de mejorar el tratamiento de los pacientes con hemofilia al reducir la frecuencia de las infusiones e incluso al reducir la carga del fármaco, lo que permite un enfoque de tratamiento profiláctico que puede mejorar significativamente la calidad de vida del paciente, evitar episodios de sangrado espontáneos y el daño acumulado a las articulaciones y otros órganos.
En la presente descripción se describe la generación de una molécula de FVIIa-CTP recombinante con una semivida extendida basada en la fusión del FVII con un CTP humano. El FVIIa-CTP recombinante se expresó en células de mamífero y se caracterizó in vitro e in vivo. Se demostró que la actividad de rFVIIa-CTP era comparable a la de rFVIIa. Los estudios farmacocinéticos y de eficacia en ratas demostraron las propiedades mejoradas de rFVIIa-CTP. Los resultados de este estudio demostraron que es factible desarrollar una molécula de rFVIIa con semivida extendida con propiedades hemostáticas muy similares a las de la enzima de tipo silvestre.
Clonación y expresión de la molécula de FVII recombinante: Se construyeron varios clones de Factor VII en nuestro vector de expresión eucariota (pCI-dhfrr) (Figura 19). El clon de ADNc de FL verificado por MGC humano (IRCM) que contiene la secuencia del factor de coagulación VII de homo sapiens se solicitó a "Open Biosystems" (OB-MHS4426). Los siguientes cebadores se sintetizaron por Sigma-Genosys en la siguiente secuencia: Cebador 67: 5'CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCC3' (contiene el extremo 5' del ADN del Factor VII y el sitio de restricción de XhoI) (SEQ ID NO: 5); Cebador 68R: 5' TCTAGAATAGGTATTTTTCCACATG3' (contiene el sitio de restricción de XbaI) (SEQ ID NO: 6); Cebador 69: 5' TCTAGAAAAAAGAAATGCCAGC3' (contiene el sitio de restricción de Xbal) (SEQ ID NO: 7); y cebador 70R: 5'GCGGCCGCATCCTCAGGGAAATGGGGCTCGCA3' (contiene el extremo 3' del ADN del Factor VII y el sitio de restricción de NotI) (SEQ ID NO: 8).
La clonación se realizó en dos conjuntos de reacciones de PCR. La primera reacción se realizó con el cebador 67 y el cebador 68R mediante el uso de un plásmido de ADNc con la secuencia del Factor VII (OB-MHS4426) como plantilla; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de -534 pb, se aisló y se ligó en un vector de clonación TA (Invitrogen, núm. cat.: K2000-01). Se aisló un fragmento XhoI -XbaI que contenía el extremo amino terminal de la secuencia del Factor VII. La segunda reacción se realizó con el cebador 69 y el cebador 70R y de nuevo, se usó como plantilla un plásmido de ADNc con la secuencia del Factor VII (OB-MHS4426). Como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de -813 pb y se ligó en el vector de clonación TA (Invitrogen, núm. cat.: K2000-01). Se aisló un fragmento XbaI-NotI que contenía el extremo carboxi terminal de la secuencia del Factor VII. Los dos fragmentos se insertaron en nuestro vector de expresión eucariota pCI-dhfr (triple ligación) para obtener el clon 501 -0-p136-1.
El plásmido 501-p136-1 (Factor VII en el vector pCI-dhfr) se digirió con las enzimas de restricción XhoI y KpnI. Se aisló un fragmento de -1186 pb. Un clon de Factor VII parcial (1180 pb-1322 pb) seguido de una secuencia CTP, secuencia de terminación y secuencia NotI que se sintetizó por GeneArt (0721543) se digirió con las enzimas de restricción KpnI y NotI. Se aisló un fragmento de -253 pb. Los dos fragmentos se insertaron en nuestro vector de expresión eucariota pCI-dhfr (triple ligación) para producir el clon 501 -1 -p137-2. pCI-dhfr-701-2-p24-2 se digirió con las enzimas de restricción XhoI y ApaI, y se aisló el fragmento grande (vector).
pCI-dhfr-501-2-p137-2 (Factor VII-ctp x1) se digirió con las enzimas de restricción XhoI y ApaI, y se aisló un inserto de -1200 pb. El vector y el inserto se ligaron para producir 501-2-p139-2. Las células Dg44 se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 100 mm y se cultivaron hasta una confluencia del 50-60 %. Se usó un total de 2 mg de ADN para la transfección de una placa de 100 mm mediante el uso del reactivo FuGene (Roche) en medio libre de proteínas (Invitrogen CD Dg44). El medio se eliminó 48horas después de la transfección y se reemplazó con un medio libre de proteínas (Invitrogen CD Dg44) sin nucleósidos. Después de 14 días, la población de células transfectadas se transfirió a matraces de cultivo de tejidos T25, y la selección continuó durante 10-14 días hasta que las células comenzaron a crecer bien como un clon estable. Se seleccionaron clones de alta expresión y se usaron aproximadamente 2x107 células para inocular 300 ml de medio de crecimiento en una botella de cultivo rotatoria de 1700 cm2 (Corning, Corning NY) suplementado con 5 ng/ml de vitamina K3 (bisulfato sódico de menadiona; Sigma). El medio de producción (cosecha) se recolectó después de una rápida disminución de la viabilidad celular a alrededor del 70 %. El medio de producción se clarificó primero y después se concentró aproximadamente 20 veces y se dializó a PBS mediante el uso de un casete de filtración de flujo (10KDaMWCO; Millipore Corp, Billerica, MA). Determinación del nivel de antígeno de FVII
El ADNc que codifica el péptido CTP se fusionó con el extremo 3' del ADNc que codifica el FVII humano. El constructo de rFVII correspondiente se transfectó en células Dg44. Como control, se utilizó un ADNc de rFVII humano. Se recolectó el medio de producción (cosecha), se concentró y se evaluó posteriormente el FVII recombinante secretado. Los niveles de antígeno de rFVII, rFVII-CTP y rFVII-CTP-CTP se determinaron mediante el kit de ELISA de FVII humano AssayMax (AssayPro) (Figura 20A). No hubo diferencias significativas en el nivel de secreción de rFVII-CTP y rFVII-(CTP)2 en comparación con el rFVII nativo.
Transferencias de SDS-PAGE
El análisis de SDS-PAGE se realizó al cargar 50 ng de proteína rFVII cosechada, purificada o activada. Las muestras se cargaron en gel de tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteínas de doble color Precision Plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE se realizó mediante la realización de una inmunotransferencia Western mediante el uso de un anticuerpo monoclonal (Ab) anti-FVII humano (R&D systems) o anticuerpo policlonal anti-CTP generado en conejo.
El nivel de antígeno de rFVII se correlacionó con el nivel de proteína detectado en una inmunotransferencia de SDS-PAGE con Ab anti-FVII. rFVII-CTP migró como una sola banda, mientras que el peso molecular correspondiente del control de FVII fue de aproximadamente 52 KDa (datos no mostrados). Ambas proteínas reaccionaron con anticuerpos específicos para FVII en inmunotransferencias. El rFVII-CTP también reaccionó con anticuerpos específicos para CTP. El rFVII se secretó en su forma de zimógeno sin rastros de proteína activada.
Actividad cromogénica de FVII:
Las actividades de las cosechas de FVII, rFVII-CTP y rFVII-(CTP)2 se determinaron mediante el uso de un kit de prueba cromogénica disponible comercialmente (AssaySense Human FVII Chromogenic Activity Assay Kit (AssayPro). Para la caracterización funcional del rFVII-CTP y su capacidad para activarse posteriormente (FVIIa), el rFVII-CTP concentrado (cosechas) se colocó en un kit de prueba cromogénico disponible comercialmente que mide la capacidad de TF/FVIIa para activar el Factor X al Factor Xa que, en presencia de sustrato específico de FXa, libera una señal cuantificada (AssayPro). La adición del péptido CTP en el C-terminal de la proteína rFVII no afectó la actividad de serina proteasa del FVII (Figuras 20B y 20C).
Actividad de coagulación de FVII:
El tiempo de protrombina (PT) mide la vía extrínseca de la coagulación. El PT es el tiempo (medido en segundos) que tarda el plasma en coagularse tras la adición de un activador de la vía extrínseca, fosfolípidos y calcio. Se usa para determinar la tendencia a la coagulación de la sangre, específicamente en la medida de la dosis de warfarina, daño hepático y estado de vitamina K. El intervalo de referencia para el tiempo de protrombina es usualmente 12-15 segundos. Específicamente, el ensayo cuantificó la capacidad de la cosecha de FVII-CTP y FVII-(CTP)2 para restaurar la actividad de coagulación del plasma humano agotado en FVII mediante la adición de rhFVII. Se mezclaron 300 ml de plasma humano deficiente en FVII con 100 ml de cosechas de FVII, FVII-CTP y FVII-(CTP)2 a concentraciones específicas, o plasma humano normal combinado y se diluyeron posteriormente. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añadieron a la mezcla factor tisular (TF), CaCh y fosfolípidos. Se determinó el tiempo de coagulación en segundos. La potencia se evaluó al comparar una curva de dosis-respuesta de cosechas de FVII-CTP y FVII-(CTP)2 a una preparación de referencia que consiste de rhFVII o plasma humano combinado. Una unidad de FVII activo se definió como la cantidad de FVII que equivale a la actividad de un ml de plasma humano normal. La actividad de coagulación por PT de rFVII y rFVII-CTP se midió en un coagulómetro (Laboratorio de instrumentación).
Como se mostró anteriormente, la adición de un péptido CTP en el extremo C-terminal de la proteína rFVII no dañó su actividad serina proteasa y condujo al inicio y activación de un Factor X y un Factor IX nativos en plasma humano. Después de la inserción de un CTP adicional en el C terminal, hubo una reducción de tres veces en la actividad de serina proteasa (datos no mostrados).
Estudio de farmacocinética:
Las cosechas de FVII, rFVII-CTP y rFVII-(CTP)2 se administraron por vía intravenosa a ratas Sprague-Dawley (seis ratas por sustancia) con una dosis de 100 pg/kg de peso corporal. Para todos los experimentos in vivo, la cantidad de la proteína respectiva se determinó sobre la base del kit de ELISA de FVII. Para cada sustancia de prueba de FVII, la cantidad inyectada se calculó al tener en cuenta las diferencias en el peso molecular de rFVII frente a rFVII-CTP, lo que conduce a una concentración molar diferente.
Las muestras de sangre se extrajeron retroorbitalmente mediante el uso de un esquema de muestreo alterno para minimizar la interferencia de los niveles del procedimiento de muestreo a cuantificar: de 3 ratas a los 30 y 90 min y a las 2, 6 y 48 horas, y de las tres ratas restantes a los 15 y 60 min y a las 1,5, 4 y 24 h alternativamente. El plasma se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a - 20 °C hasta el análisis. La concentración del FVII se cuantificó mediante un ensayo específico ELISA de FVII. La semivida y el área bajo la curva (AUC) se calcularon mediante el uso de una regla trapezoidal lineal. La comparación de estos parámetros de aclaramiento reveló que la semivida in vivo y AUC de rFVII-(CTP)2 son significativamente más altas que las de rFVII (Tabla 30).
Tabla 30: Parámetros del estudio de PK
Grupo Vía Dosis T1/2 AUC0-t CL/F MRT
pg/kg min ng/min/ml ng/min/ml min
FVII IV 60 4,07 3314,7 6,195 6,2
FVII- IV 60 p=51,06 31353,9 0,287 73,7
CTP FVII- IV 60 p=13,66 7626,8 1,18 15,4
CTP-CTP
Caracterización del FVIIa-CTP recombinante:
Durante la activación, el FVII se escinde en R152 lo que da como resultado dominios de cadena pesada y ligera que se mantienen unidos por un único puente disulfuro. El rFVIIa-(CTP)2 se purifica y activa mediante un proceso de purificación en columna de intercambio iónico. Para evaluar completamente rFVIIa-(CTP)2 , la proteína se carga en SDS-PAGE en condiciones reductoras a FVIIa comercial (NovoSeven®). Los dominios de cadena pesada y ligera se separan y migran como bandas separadas de pesos moleculares de 55 y 25 KDa. Ambas proteínas reaccionan con anticuerpos específicos de FVII, pero la cadena pesada del rFVIIa-CTP reacciona específicamente con anticuerpos específicos anti-CTP, lo que indica que esta banda representa la cadena pesada de FVII fusionada con CTP. La cadena ligera reacciona específicamente con el Ab anti-gamma carboxilasa. La concentración de proteína FVIIa se determina mediante el kit ELISA específico de FVIIa.
Secuenciación N-terminal de FVIIa:
El rFVII-CTP-CTP en proteínas activadas o purificadas con zimógeno se separa por SDS-PAGE (en Tris-Glicina al 12 %) y subsecuentemente se somete a electrotransferencia a una membrana de PVDF. Las bandas de interés se cortan y se colocan en un filtro de fibra de vidrio tratado con Biobrenet purificado. El análisis de la secuencia N-terminal se lleva a cabo por degradación de Edmann mediante el uso de un secuenciador de proteína líquida pulsada equipado con un sistema de microgradiente HPLC 140C. La identidad de la proteína recombinante y la escisión apropiada del propéptido se verifica posteriormente mediante secuenciación N-terminal.
Actividad de coagulación de FVIIa:
Para evaluar la actividad de coagulación de FVII-(CTP)2, se realiza un ensayo de tiempo de tromboplastina activada parcial (aPTT). La muestra de plasma deficiente en FVII se sustituye por rFVIIa (NovoSeven®) o rFVIIa-(CTP)2.300 ml de plasma humano deficiente en FVII se mezcla con 100 ml de FVIIa o rFVIIa-(CTP)2 a concentraciones específicas, o plasma humano normal combinado que se diluye posteriormente. Después de 60 segundos de incubación a 37 °C. Se añaden factor tisular (TF), CaCl2 y fosfolípidos a la mezcla. Se determina el tiempo de coagulación en segundos. La potencia se evalúa al comparar una curva dosis-respuesta de rFVIIa-(CTP)2 con una preparación de referencia que consiste de rhFVIIa o plasma humano normal combinado. Una unidad de FVIIa se define como la cantidad de FVIIa que equivale a la actividad de 1 ml de plasma humano normal. La actividad de coagulación por aPTT de rFVII y rFVIIa-(CTP)2 se mide en un coagulómetro (Laboratorio de instrumentación). La actividad de coagulación aPTT de rFVIIa y rFVIIa-(CTP)2 es similar.
Estudios de farmacocinética en ratas:
Para caracterizar la influencia de la adición de CTP al rFVIIa sobre su potencial de longevidad, se realiza un estudio farmacocinético comparativo en ratas. NovoSeven® (rFVIIa) y rFVIIa-(CTP)2 en TBS se inyectan IV a 6 ratas SD. Los niveles de FVIIa a lo largo del tiempo se detectan mediante el uso de un kit ELISA de FVIIa. Se calculan la semivida y el AUC para cada proteína. La comparación de estos parámetros de aclaramiento revela que las mediciones in vivo de semivida, recuperación y AUC del rFVIIa-(CTP)2 son superiores a las de NovoSeven®.
Modelo de eficacia in vivo de FVIIa-CTP (modelo de ratón deficiente en FVIII de hemofilia):
Para evaluar el modelo de actividad in vivo, se obtienen ratones con desactivación de FVIII y se establece una colonia de reproducción. 10 mg de hFVIIa recombinante comercial (NovoSeven®) o rFVIIa-(CTP)2 se inyectan en la vena de la cola de un ratón con desactivación para FVIII anestesiado (22-28 g). La cantidad de proteína inyectada es igual a la concentración requerida de FVIII en plasma normal (5 mg/ml). Se toman muestras de sangre de la cola cortada en tubos capilares heparinizados en puntos temporales específicos. Las muestras de plasma se evalúan para determinar los niveles de FVIIa mediante ELISA y la eficacia se mide mediante un ensayo de coagulación de PTT.
En este estudio, se genera un constructo de fusión de FVII con CTP. Esta proteína recombinante es la base de un tratamiento que proporciona una semivida prolongada y retención de la potencia terapéutica.
Estos resultados sugieren que rFVIIa-(CTP)2 tiene una eficacia terapéutica similar a rFVIIa en pacientes con hemofilia. Además, esta tecnología requiere una dosificación menos frecuente. Parece que una sola inyección de rFVIIa-(CTP)2 es suficiente para controlar los episodios de sangrado y reducir el número de inyecciones necesarias durante la intervención quirúrgica. Esta proteína recombinante puede usarse como tratamiento profiláctico a largo plazo.
Ejemplo 5
Evaluación comparativa de FVII-CTP3 , FVII-CTP4 y FVII-CTP5 purificados
5.1 Objetivo del estudio
Evaluación comparativa de parámetros farmacocinéticos y actividad de coagulación de FVII-CTP4 y FVII-CTP5 frente a FVII-CTP3.
5.2 Producción de cosechas de FVII-CTP4 y FVII-CTP5
El ADNc de FVII fusionado en el extremo C-terminal a cuatro o cinco secuencias de CTP en tándem se expresó en células Dg44 mediante el uso del sistema de expresión Excellgene en presencia de 20 mg/l de vitamina K3 (Sigma, Mennadion). La cosecha se recolectó (300 ml), se filtró y se congeló.
5.3 Producción de cosecha de FVII-CTP3
FVII-CTP3 se expresó internamente en el sistema de expresión de mamíferos, células CHO, mediante el uso del vector pCI-DHFR (Figura 109). Mientras que la forma del casete de nucleótidos que codifica FVII-CTP3 incluye secuencias de nucleótidos que codifican el péptido señal, por ejemplo, que comprende una secuencia de ácido nucleico como se indica en la SEQ ID NO: 24, el casete está etiquetado como MOD-5014 ya que la expresión, purificación y activación del polipéptido codificado en él da como resultado la forma activa de FVIIa-CTP3 del factor de coagulación. El agrupamiento transfectado estable #71 se cultivó en matraces de agitación, en presencia de 25 ng/l de vitamina K3 (Sigma). Las cosechas se recolectaron y se filtraron.
Todas las cosechas de FVII-CTP (3, 4 y 5 CTP) se concentraron y dializaron contra TBS (Tris 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,4) mediante el uso de Pellicon XL MWCO 10 kDa.
5.4 Determinación del nivel de antígeno de FVII
El nivel de antígeno de FVII se determinó mediante el uso del kit ELISA de FVII humano (Zymotest HyPhen) (Tabla 31). La concentración de proteína calculada es el promedio de dos corridas independientes.
Tabla 31: Nivel de antígeno de FVII
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5.5 inmunotransferencia de FVII-CTP
Las cosechas de FVII-CTP3 , FVII-CTP4 y FVII-CTP5 se cargaron en gel de tris-glicina al 12 % (expedeon) mediante el uso del marcador de proteínas de doble color Precision plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE se realizó por inmunotransferencia Western mediante el uso de Ab policlonal anti-CTP (Adar Biotech Production) o Ab anti-Gla (American Diagnostica).
El FVII fusionado a tres, cuatro y cinco CTP migró a 80, 90 y 100 kDa, respectivamente. Como se esperaba, las cosechas de FVII-CTP4 y FVII-CTP5 de Excellgene contienen un bajo contenido de carboxilación gamma en comparación con la cosecha de FVII-CTP3 que se produjo en Prolor ya que el proceso de producción no estaba optimizado (Figura 21).
5.6 Evaluación comparativa de la potencia in vitro de FVII
Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de FVIICTP3 , FVII-CTP4 y FVII-CTP5 purificados por HA (fracción altamente gamma carboxilada) frente a plasma humano normal combinado se realizó mediante el uso de un kit de prueba de actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). Todas las muestras se diluyeron en serie y la potencia se evaluó al comparar una curva de respuesta a la dosis con una preparación de referencia que consiste de plasma humano normal. FVII-CTP3 y FV1I-CTP5 demostraron una actividad cromogénica inferior a la del plasma normal combinado (Figura 22). FVII-CTP4 demostró una mayor actividad como se refleja en las relaciones de EC50, en comparación con FVII-CTP3 y FVII-CTP5 (Tabla 32).
Tabla 32: Actividad de coagulación in vitro de FVII
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5.7 Actividad de coagulación in vitro de FVII:
El ensayo de actividad del Factor VII (FVII), que se realizó en el Sheba Medical Center, el Israel National Coagulation Center, es un ensayo basado en protrombina (PT) mediante el uso de plasma inmunoadsorbido deficiente en Factor VII (Siemens). El reactivo de PT es innovin y el ensayo se realiza en el instrumento Sysmex® CA 1500. El intervalo normal de fV iI está dentro de 55-145 %.
Tabla 33: Actividad cromogénica in vitro de FVII
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Dado que el nivel normal de FVII circulante en el cuerpo es de alrededor de 0,5 mg/ml, las cosechas de FVII-CTP3 y FVII-CTP5 exhiben reducciones de 3 veces en su actividad de coagulación en comparación con el plasma humano normal combinado; este resultado se correlaciona con la actividad cromogénica obtenida (Tabla 33).
La cosecha de FVII-CTP4 muestra un aumento de 3 veces en su actividad de coagulación potencial frente al plasma humano normal combinado como se observa en el ensayo de actividad cromogénica (Tabla 33). El porcentaje de actividad de FVII-CTP4 es mucho mayor en comparación con el porcentaje de actividad de FVII-CTP3 y FVII-CTP5. Las limitaciones metodológicas del método ELISA pueden limitar la precisión de los cálculos del nivel de Ag de FVII-CTP4.
5.8 Estudio farmacocinético
Se realizaron dos estudios farmacocinéticos para determinar los parámetros farmacocinéticos (PK) de FVII-CTP3 , FVII-CTP4 y FVII-CTP5. Durante el primer estudio, FVII-CTP3 , FVII-CTP4 y FVII-CTP5 (Grupo A, B y C, respectivamente) se administraron en una única inyección intravenosa a ratas Sprague Dawley (seis ratas por tratamiento) en una dosis de 250 pg/kg de peso corporal. Se extrajeron muestras de sangre retroorbitalmente de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,5 2, 5, 8, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosificación (Tabla 34). Se preparó plasma con citrato (0,38 %) inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta el análisis.
Tabla 34: Diseño del estudio farmacocinético - Cosecha concentrada
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La concentración de FVII en muestras de plasma se cuantificó mediante el uso de kits Elisa de FVII humano (Zymutest FVII-Biophen). Se calculó el perfil farmacocinético y es la media de 3 animales en cada punto temporal. Los valores de semivida terminal se calcularon mediante el uso del software PK Solutions 2.0. La Tabla 35 más abajo resume las concentraciones de FVII calculadas en los diferentes puntos temporales de muestreo. El perfil PK (Figuras 23-24) y un resumen de los parámetros farmacocinéticos (Tabla 36) también se presentan más abajo. FVII-CTP5 demostró un perfil superior en comparación con FVII-CTP3 y FVII-CTP4 (Tabla 36).
Tabla 35: Primer estudio farmacocinético - Concentraciones de FVII
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Tabla 36: Análisis farmacocinético
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La adición de cuatro o cinco CTP alargó significativamente la semivida del FVII en comparación con 3 CTP en 2 y 3 veces, respectivamente (Tabla 36). Esta superioridad fue más significativa en la parte inicial del estudio (0,083-8 h), lo que sugiere una posible recuperación mejorada de proteínas y una reducción del aclaramiento extravascular. El AUC después de la administración de FVII-CTP4 y FVII-CTP5 aumentó en 3 y 4 veces, respectivamente, en comparación con FVII-CTP3. El aclaramiento también se redujo al añadir 4 y 5 CTP al FVII (Tabla 36).
Como se observó en el estudio, la adición de cuatro y cinco CTP alargó significativamente la semivida del FVII en comparación con 3 CTP, tanto en la semivida inicial como en la terminal. Los valores de semivida en el primer y segundo estudio son diferentes debido a un enfoque de análisis diferente que se vio afectado por la dosis y la duración del estudio; sin embargo, se mantuvo la tendencia general. El AUC después de la administración de FVII-CTP4 y FVII-CTP5 aumentó en 2,5 y 7 veces, respectivamente, en comparación con FVII-CTP3.
5.9 Conclusiones:
En este estudio, se evaluaron los parámetros farmacocinéticos y la posible actividad de coagulación de FVII-CTP3 , FVII-CTP4 y FVII-CTP5. La fusión de 4 y 5 CTP a FVII proporcionó una semivida y exposición superior y mejorada, y eliminación reducida en comparación con FVII-CTP3 a la vez que mantiene una actividad cromogénica y de coagulación in vitro similar. Estos resultados se observaron a diferentes concentraciones de proteína y fueron consistentes tanto para la cosecha como para la proteína purificada. Al evaluar el efecto general de la fusión de CTP en el extremo C terminal a FVII, la fusión de 1-5 CTP aumentó considerablemente la semivida y el AUC de FVII de una manera proporcional a CTP, lo que sugiere que a medida que aumenta la porción CTP de la molécula, la longevidad y la estabilidad de FVII se mejoran significativamente a la vez que se mantiene su actividad de coagulación inicial in vitro, como se resume en la Tabla 37 a continuación.
Tabla 37:
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Como se informó anteriormente, la semivida de FVII se correlaciona con la semivida de la forma activada de FVII (FVIIa) tanto en seres humanos como en animales. Por lo tanto, se prevé que se obtendrá una mejora similar en la semivida para las versiones activadas después de la fusión con CTP.
EJEMPLO 6
Estudios de viabilidad de FVII-CTP3 en ratones hemofílicos deficientes en FVIII
Se llevaron a cabo estudios descritos anteriormente que prueban el perfil PK y la actividad de coagulación de las cosechas de FVII-CTP, FVII-CTP2 y FVII-CTP3 frente a un FVII comercial. FVII-CTP3 exhibió un perfil PK mejorado a la vez que mantuvo su actividad de coagulación frente a las cosechas de FVII-CTP y FVII-CTP2 o rhFVII. Para caracterizar aún más las propiedades in vitro e in vivo de FVII-CTP3 , se generó un mini agrupamiento estable que expresa y secreta la proteína, y se desarrollaron procesos de purificación y activación.
En el presente estudio, las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de FVIIa-CTP3 se probaron en ratones deficientes en FVIII. Se evaluó el perfil de PK de la proteína. Se estableció un perfil PK basado en la actividad específica de FVIIa y se comparó con el producto comercial NovoSeven®. Además, se probaron las capacidades hemostáticas in vivo de larga duración de FVIIa-CTP3 para inducir la coagulación en ratones deficientes en FVIII después de una transección en la vena de la cola (estudio de supervivencia).
Objetivos del estudio:
Evaluar los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos de FVIIa-CTP3 frente a rhFVIIa comercial (NovoSeven®) en ratones deficientes en FVIII después de una única administración IV a una dosis de actividad similar.
Determinar la capacidad in vivo de FVIIa-CTP3 para mantener la homeostasis en ratones deficientes en FVIII mediante una única administración IV de FVIIa-CTP3 y NovoSeven® a una dosis de actividad similar seguida de un desafío de transección de la vena de la cola (estudio de supervivencia).
Producción de cosecha de FVII-CTP3 :
FVII-CTP3 se expresó internamente en células Dg44 mediante el uso de un vector pCI-DHFR. El agrupamiento transfectado estable #71 se cultivó en matraces de agitación, en presencia de 25 ng/l de vitamina K3 (Sigma). La suspensión de células se cultivó y cosechó después de una disminución de la viabilidad al 60-80 %. La cosecha se filtró y se congeló a -70 °C.
Determinación del nivel de antígeno de cosecha de FVII:
El nivel de antígeno de FVII se determinó mediante el uso del kit ELISA de FVII humano (Zymotest HyPhen) (Tabla 38). El nivel de antígeno se calculó por cada lote de cosecha combinado.
Tabla 38: Nivel de antígeno de FVII-CTP3
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Proceso de purificación de FVII-CTP3 (Figura 25)
Esquema del proceso
Después de un breve estudio de purificación, se realizó el siguiente proceso de purificación mediante el uso de 2 columnas. Columna de afinidad VII-Select (GE) e hidroxiapatita cerámica tipo 1 (HA), 40 mm (Bio Rad), se purificó la proteína enriquecida FVII-CTP3 Y-carboxilada. La autoactivación se indujo por incubación de FVII-CTP3 purificado en presencia de CaCl2 durante la noche a 2-8 °C. El proceso de purificación se encuentra en su etapa final de desarrollo y aún se optimiza, por lo tanto, aunque la mayoría de las etapas de purificación son similares, alguna parte de las etapas de purificación no son idénticas en los dos lotes.
Ultrafiltración/diafiltración (UFDF) mediante el uso de fibra hueca de 10 kDa o casete Pellicon
La cosecha clarificada se descongeló a 4 °C durante el fin de semana (2-3 días).
En el Lote 31, la cosecha clarificada (12 litros) se concentró 4 veces (en dos corridas sucesivas) mediante el uso de un cartucho de fibra hueca (GE Healthcare núm. cat. UFP-10-C-4X2MA) con un valor de corte de peso molecular de 10 KDa. La cosecha concentrada se diafiltró frente a 1-2 volúmenes de TbS (Tris 50 mM NaCl 150 mM pH 7,4). En el Lote 38, la cosecha clarificada (8,5 litros) se concentró 4 veces mediante el uso de un casete Pellicon 2 (Millipore) con un valor de corte de peso molecular de 10 KDa. La cosecha concentrada se cargó directamente en la columna VII-Select.
Ambas ultrafiltraciones se realizaron en hielo con tampones helados. Las muestras de UFDF se filtraron a 0,22 mm antes de cargarlas.
Captura en la columna FVII-Select
La UFDF o la cosecha concentrada se cargó en la columna VII-Select (XK16/20, CV 18 ml), equilibrada previamente con TBS pH 7,4. La columna se lavó con Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,5 M pH 7,5 y FVII-CTP3 se eluyó con Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M al 50 % (v/v), Propilenglicol pH 7,5. El proceso se realizó en dos ciclos sucesivos mediante el uso de la misma columna.
Separación basada en gamma carboxilación en una columna de hidroxiapatita cerámica
El producto eluido se diluyó 1:10 con fosfato de sodio 10 mM pH 6,8 y se cargó en columnas de hidroxiapatita cerámica (XK16/20, CV 24 ml). La columna se lavó con fosfato de sodio 59 mM pH 6,8 y la fracción rica y -carboxilada de Factor VII se eluyó con fosfato de sodio 500 mM pH 6,8. Este proceso se realizó en dos ciclos sucesivos en la misma columna. En cada lote, los eluidos de los dos ciclos se combinaron y concentraron a 1,7-2 mg/ml y se diafiltraron con Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM pH 8,2 para reducir el volumen y preparar el material para la etapa de activación.
Activación de FVII
El FVII-CTP3 purificado se diluyó a 1 mg/ml y se incubó en Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM y CaCl2 1 mM pH 8,2 a 2-8 °C durante 24 horas. La activación se terminó mediante intercambio de tampón (UFDF) a tampón de formulación preliminar (tampón cítrico 20 mM, NaCl 240 mM, glicina 13,3 mM, pH 6,9).
Propiedades analíticas de FVII-CTP3 y FVIIa-CTP3:
SDS-PAGE y transferencias de Western
FVII-CTP3 purificado y FVIIa-CTP3 se cargaron en gel de tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteínas de doble color Precision Plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE Coomassie se realizó al teñir el gel con reactivo azul brillante de Coomassie (5 o 10 mg de proteína/carril). Se realizó un análisis de transferencia Western (1 mg de proteína/ carril) mediante el uso de Ab policlonal anti-FVII humano (R&D systems; AF2338), anticuerpo monoclonal anti-carboxilación gamma humana (American Diagnostics núm. cat. 499, 3570) y Ab policlonal anti-CTP. En condiciones reducidas, FVII-CTP3 migró a 75 KDa y FVIIa-CTP3 migró como dos bandas principales: una cadena pesada a 50 kDa y una cadena ligera a 25 kDa, representada en la Figura 26 como las bandas 2 y 3, respectivamente.
El procedimiento de purificación enriqueció significativamente la porción de FVII-CTP3 a la vez que redujo las impurezas. El rendimiento del proceso de purificación fue 25-30 % de FVII (de acuerdo con ELISA). La mayoría de la proteína perdida durante la purificación tenía una baja actividad cromogénica de FVII o ninguna actividad. Basado en SDS-PAGE teñido con Coomassie, el FVIIa-CTP3 reducido contiene más que las bandas previstas. Una banda que migra a alrededor de ~75 kDa representa FVII no activado (Figura 26, Banda 1). Esta banda consiste de dos bandas con diferencias menores de PM, que pueden reflejar un contenido de Y-carboxilación diferente. Se observaron bandas adicionales con PM inferior a 20 kDa. Se informó anteriormente que estas eran productos de degradación de la cadena pesada.
A c tiv id a d c ro m o g é n ica de F V II-C T P 3 :
Se realizó una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la cosecha de FVII-CTP3 , fracciones en proceso y FVIICTP3 purificado frente a plasma humano normal combinado mediante el uso de un kit de prueba de actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). La cosecha de FVII-CTP3 y la proteína se diluyeron en serie y la potencia se evaluó al comparar una curva de respuesta a la dosis con una preparación de referencia de plasma humano normal. Después de la purificación de FVII-CTP3 , la actividad cromogénica mejoró significativamente y las fracciones no activas se separaron principalmente mediante una columna de HA (Figura 27). Se observó una fuerte correlación entre la actividad cromogénica de FVII y la detección de FVII con anticuerpos monoclonales anti-Gla en transferencia Western. La potencia de la actividad cromogénica del FVII reflejada por el valor de EC50 en la cosecha se ve afectada por las fracciones de FVII tanto carboxiladas como no carboxiladas. Después de la purificación y el enriquecimiento de la fracción de FVII-CTP3 Y-carboxilada, se mejoró la actividad, lo que demuestra la importante contribución de la Y-carboxilación a la actividad del FVII (Figura 27). Este parámetro es fundamental para un FVII adecuado en la actividad in vivo y se abordará en mayor profundidad en un programa de desarrollo de clones.
Determinación de proteínas por A280
El coeficiente de extinción teórico de FVIIa-CTP3 y NovoSeven® se calculó mediante el uso del algoritmo ProtParam (http://web.expasy.org/protparam). El cálculo se basa en la secuencia de aminoácidos. Los coeficientes de extinción calculados para FVII-CTP3 y NovoSeven® son 1,186 y 1,406, respectivamente. Estos valores representan la absorbancia de 1 g/l a 280 nm.
La diferencia del coeficiente de extinción entre las dos proteínas se deriva únicamente del aumento en el peso molecular de FVIIa-CTP3 en comparación con NovoSeven®, ya que el CTP carece de residuos aromáticos y de cisteína, por lo que no contribuye a la absorbancia.
La determinación de proteínas por A280 se usa para el FVII final y para las muestras en proceso purificadas, a partir de la elución de la columna VII-Select.
Determinación del nivel de antígeno de FVIIa
El nivel de antígeno de FVIIa se determinó mediante el uso del kit ELISA de FVIIa humano (IMUBIND, American Diagnostica). El nivel de antígeno se calculó para cada lote. Sin embargo, esta herramienta no resultó útil para la determinación de la dosis a inyectar, ya que no representaba la cantidad de producto activo.
Ensayo de coagulación de FVIIa- Staclot® VIIa-rTF
El FVIIa se deriva de una escisión intracatenaria del FVII monocatenario. El factor tisular nativo (TF) es un cofactor del FVIIa. Tras la unión al TF, FVII media la activación del Factor X a Xa, a la vez que él mismo se transforma en FVIIa. El factor tisular soluble es la parte extracelular del factor tisular nativo. Ya no puede activar FVII por autoactivación, pero el FVIIa unido al factor tisular puede activar el FX a FXa.
El factor tisular soluble recombinante (rsTF) usado en este ensayo utiliza la especificidad de FVIIa para construir una prueba de coagulación de FVIIa. rsTF, en presencia de FVIIa, calcio y fosfolípidos conduce a la coagulación del plasma, sin activar el FVII a FVIIa.
El tiempo de coagulación observado en este sistema tiene una relación inversa con el contenido de FVIIa en la muestra analizada, sin interferencia de la presencia del FVII en la muestra.
El ensayo se realizó por Omri Laboratories (Nes-Ziona, Israel). Se evaluó la actividad de FVIIa tanto para NovoSeven® después de la reconstitución como para FVIIa-CTP3 antes de cada estudio. La actividad de NovoSeven® no se correlacionó con la actividad prevista según lo informado en el vial, pero la discrepancia podría deberse a un enfoque diferente para la evaluación de la actividad. La Tabla 39 resume la actividad de coagulación de FVIIa por volumen sin considerar la concentración de proteínas.
Tabla 39: Actividad de coagulación de FVIIa de productos por lotes
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A c tiv id a d esp e c ífica de FV IIa-C TP 3
La actividad específica de FVIIa (que se calcula como la actividad/ml dividida por la concentración de proteína) se calculó basado en A280 y se presenta en la Tabla 40. Al comparar la actividad específica de las dos moléculas, que difieren en PM, debe realizarse una compensación para normalizar la actividad (es decir, debido a la diferencia de peso molecular, el número de sitios activos en 1 mg de NovoSeven® es 1,185 veces mayor que en FVIIa-CTP3). El cálculo del factor de conversión se presenta en la siguiente ecuación:
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E stud io P K -P D de F V IIa -C T P 3:
Esquema del estudio
FVIIa-CTP3 y rhFVIIa (NovoSeven®, NS) se administraron en una única inyección intravenosa a ratones C57B deficientes en FVIII a una dosis de 6,4E6 U/kg de peso corporal (160 000 U/animal). Se extrajeron muestras de sangre retroorbitalmente de 4 ratones alternativamente a 0,166, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 34, 48, 58 y 72 horas después de la dosificación (Tabla 41). Se preparó plasma con citrato (0,32 %) inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta el análisis. Se evaluó el nivel de actividad de coagulación de FVIIa y se realizó un análisis PK detallado. El estudio se realizó por Omri Laboratories (Nes-Ziona, Israel).
Tabla 41: Esquema del estudio
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Perfil PK de FVIIa-CTP3 en ratones deficientes en FVIII
La actividad de FVIIa en muestras de sangre se cuantificó mediante el uso de un kit Staclot® VIIa-rTF (Stago, Parsippany, NJ). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína y representa la media de 4 animales en cada punto temporal. La Figura 28 presenta el perfil PK de FVIIa a lo largo del experimento. La recuperación de FVIIa se presenta en la Tabla 43. En la Tabla 44 se presenta un resumen de los parámetros de PK.
La Tabla 42 resume los valores de actividad de coagulación después de la administración de NovoSeven® o FVIIa-CTP3. FVIIa-CTP3 y NovoSeven® alcanzaron su máxima actividad media hora después de la dosificación. El valor de actividad más alto de NovoSeven® alcanzó solo el 43 % del valor máximo de actividad de FVIIa-CTP3. La actividad de coagulación de FVIIa-CTP3 se mantuvo durante un período de tiempo más largo, lo que demuestra una actividad alargada. La actividad de coagulación de los ratones tratados con NovoSeven® fue indetectable en puntos temporales posteriores a las 12 horas, mientras que los ratones tratados con FVII-CTP3 aún conservaban una actividad medible 48 horas después de la dosificación (Tabla 42 y Figura 28).
La adición de tres copias de CTP en tándem a FVIIa elevó la recuperación en un 100 % (Tabla 43), medida por la actividad más alta después de la dosificación y en comparación con la actividad prevista basada en análisis in vitro, y aumentó la semivida y el tiempo medio de residencia (MRT) 5 veces. El tiempo de exposición (AUC) aumentó 3 veces (Tabla 44).
Tabla 42: Actividad de coagulación de FVIIa después de una única inyección IV
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Tabla 43: Recuperación de FVIIa-CTP3
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Tabla 44: Parámetros de PK de FVIIa-CTP3 frente a NovoSeven®
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Ensayo de generación de trombina (TGA)
La generación de trombina es una parte fundamental de la cascada de la coagulación y, como tal, un estimado de qué tan bien un individuo en particular puede generar trombina puede correlacionarse con un riesgo de hemorragia o trombosis. Las variables que se miden comúnmente al analizar la generación de trombina incluyen: el tiempo de retardo, el tiempo hasta la generación máxima de trombina, el pico, el potencial de trombina endógena [ETP] (es decir, el área bajo la curva y la cola), el curso temporal del trombograma ("TG"). Después de un tiempo de retardo, se observa un estallido de trombina. Sin embargo, la coagulación se produce al final del tiempo de retardo, cuando aún no se ha formado más del 95 % de toda la trombina. El ensayo de generación de trombina se realizó en Omri Laboratories, mediante el uso de reactivos Thrombinoscope suplementados con plasma hemofílico humano. El TGA refleja la capacidad de coagulación en el plasma de los ratones, derivada de la inyección de NovoSeven® y FVIIa-CTP3. La Figura 29 presenta los valores de los parámetros de TGA para el plasma de ratones después de la administración de FVIIa-CTP3 o NovoSeven®. Después de la administración de FVIIa-CTP3, los tres parámetros (velocidad de generación de trombina, cantidad máxima de trombina generada y KIIa) demuestran una ventaja del tratamiento con FVII-CTP3 sobre NovoSeven®. Esto refuerza aún más la noción de la potencial superioridad de acción prolongada de FVII-CTP3 en comparación con NovoSeven®.
Estudio de transección de la vena de la cola (TVT) de FVIIa-CTP3:
Esquema del estudio
Los datos obtenidos de la prueba PK/PD para FVIIa-CTP3 proporcionaron información sobre la funcionalidad de FVIIa-CTP3, y demostraron que FVIIa-CTP3 tenía una ventaja farmacocinética en comparación con NovoSeven®. Sin embargo, la capacidad de la proteína para inducir un coágulo in vivo, después de un evento traumático, aún no se ha demostrado. Para evaluar la capacidad de FVIIa-CTP3 para detener el sangrado, se empleó el mismo modelo de ratones deficientes en FVIII para un desafío de sangrado. [0421] A ratones deficientes en FVIII se les administró una única inyección intravenosa de FVIIa-CTP3 o NovoSeven®. A los ratones se les administró el fármaco en cantidades que proporcionaron una actividad equivalente de FVIIa (1,6E05 unidades, 200 ml), calculada de acuerdo con la potencia de cada fármaco evaluada en el ensayo de actividad de coagulación de FVIIa (Tabla 45). Las dosis administradas fueron 9 pg/kg de NovoSeven® y 40 pg/kg de FVII-CTP3 debido a la actividad reducida de FVIIa-CTP3. A un grupo de control se le inyectó 200 ml de vehículo.
La vena de la cola se seccionó a 2,7 cm de la punta de la cola 15 min (inyección 1), 24 horas (inyección 2) o 48 horas (inyección 3) después de la administración, y se registró la supervivencia de los ratones durante 24 horas.
Tabla 45: Evaluación de muestras inyectadas
NovoSeven® FVIIa-CTP3
Núm. Conc. Actividad Actividad Conc. Actividad Actividad Actividad inyección proteínas (U/ml) específica proteínas (U/ml) específica específica (mg/ml) (U/mg) (mg/ml) (U/mg) (normalizada)
1 0,91 8,0E+05 8,8E+05 3,63 6,6E+05 1,8E+05 2,2E+05
2 0,92 8,3E+05 9,0E+05 3,81 7,8E+05 2,0E+05 2,4E+05
3
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0,89 8,8E+05 9,9E+05 3,68 7,3E+05 2,0E+05 2,3E+05
La concentración de proteínas se determinó mediante A280.
Resultados
Los datos de los grupos de control inyectados con vehículo para las tres inyecciones (5 animales x 3 inyecciones) se resumieron y se presentan en la Figura 30. Se observó un 30 % de supervivencia 24 horas después de la transección de la vena de la cola.
Los ratones tratados con NovoSeven® y FVIIa-CTP3 demostraron una actividad hemostática adecuada después de la transección de la vena de la cola realizada 15 min después de la administración de FVIIa. Se observó una tasa de supervivencia del 100 % en los animales tratados con FVIIa-CTP3 y NovoSeven® (Figura 30).
La velocidad de eliminación reducida de FVII-CTP3 que se demostró en el estudio PK/PD se aprecia más claramente después de una transección de la vena de la cola realizada 24 horas después de la administración. Se observa una disminución en la tasa de supervivencia de NovoSeven®. Al igual que en el grupo de control, se observa un 50 % de muerte dentro de 10 horas. Mientras tanto, el 90 % de los ratones tratados con FVIIa-CTP3 sobrevivieron (Figura 30). Este resultado enfatiza la eficacia a largo plazo del tratamiento con FVIIa-CTP3.
48 horas después de la administración, se demuestra una disminución en la tasa de supervivencia en los grupos tratados con FVIIa-CTP3 o NovoSeven® (Figura 30C). Se observó una ligera mejora en los ratones con FVIIa-CTP, pero la diferencia no alcanzó significación estadística.
Discusión:
La fusión de CTP con proteínas recombinantes extiende la semivida circulatoria de las proteínas a la vez que se mantiene una actividad comparable. Si bien el mecanismo detrás del aclaramiento reducido de proteínas por encima de un tamaño umbral de 70 KDa se conoce bien con respecto al aclaramiento renal, se logra una protección adicional después de la fusión con CTP. Se cree que la fusión con CTP se extiende alrededor del escudo proteico y lo protege de la escisión proteolítica, aumenta su peso molecular radial debido a la carga altamente negativa y reduce su afinidad por los receptores de aclaramiento hepático.
El presente estudio tuvo como objetivo proporcionar información específica sobre el impacto de la fusión de CTP con FVII en la semivida y el aclaramiento de la proteína y también abordar el paradigma de su actividad específica después de esta modificación. A los ratones deficientes en FVIII se les administró una única inyección IV de FVIIa-CTP3 o FVIIa comercial recombinante (NovoSeven®) a una dosis similar (basada en unidades) y se realizó un análisis basado en la actividad PK. FVIIa-CTP3 demostró una longevidad superior reflejada por un aumento de 5 y 3,5 veces en su semivida y AUC, respectivamente. Se demostró que la actividad específica (U/mg) de FVIIa-CTP calculada mediante el kit de actividad Staclot® dividida por la concentración de proteína medida por A280 era 4-5 veces menor que la actividad específica de NovoSeven®.
Para desarrollar la comprensión de cómo CTP afecta los efectos hemostáticos del FVIIa in vivo, se investigó la capacidad de FVIIa-CTP3 para reducir el sangrado. En el modelo de sangrado por transección de la vena de la cola en el modelo de ratones hemofílicos, la administración de rFVIIa puede mejorar la tasa de supervivencia de los animales expuestos y evitar que mueran desangrados. En el estudio descrito en la presente descripción, a los animales se les administró FVIIa-CTP3 o NovoSeven®. Ambas moléculas pudieron mantener la homeostasis cuando se realizó la transección 0,25 horas después de la dosificación. Se demostró una duración de la actividad significativamente prolongada para el grupo tratado con FVIIa-CTP3 cuando la transección de la cola se realizó 24 h después de la dosificación. La tasa de supervivencia del grupo tratado con vehículo fue más alta de lo previsto y más alta que la obtenida en estudios anteriores (50 % frente a 20 % en estudios anteriores, datos no mostrados). El por ciento de supervivencia de los animales tratados se evalúa adicionalmente en puntos temporales anteriores, lo que incluye a las 36 h después de la dosificación.
En conclusión, se demostró que FVIIa-CTP3 tiene una mayor duración de actividad en ratones hemofílicos, lo que se traduce en una mayor duración del efecto hemostático en comparación con NovoSeven®. Los datos recopilados sugieren que la fusión de CTP a FVII es una tecnología con el potencial de mejorar significativamente el tratamiento profiláctico en pacientes con hemofilia.
Ejemplo 7: Evaluación comparativa del perfil de FVII-CTP3 purificado frente a FVII-CTP5 tras una única inyección IV o SC a ratas SD
Objetivo del estudio
Se llevaron a cabo dos estudios:
El primer objetivo del estudio fue determinar los parámetros farmacocinéticos de rFVII-CTP3 frente a rFVII-CTP5 después de la selección y purificación en columna HA en ratas machos Sprague Dawley, después de una única administración intravenosa de 50 pg/animal.
En el segundo estudio, se examinaron los parámetros farmacocinéticos de rFVII-CTP3-HA frente a rFVII-CTP5-HA en ratas machos Sprague Dawley después de una única administración intravenosa o subcutánea de 100 mg/animal.
Resultados
Determinación del nivel de antígeno de FVII-CTP 3 y FVII-CTP 5
El nivel de antígeno de FVII se determinó mediante el uso del kit ELISA de FVII humano (Zymotest HyPhen) (Tabla 46). T
Tabla 46: Resume la concentración de proteína calculada, que es el promedio de tres corridas independientes.
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Análisis por transferencia Western de las muestras examinadas
Las muestras FVII-CTP3, 5 se cargaron en bisTrisgel al 4-12 % (NuPage, invitrogene) mediante el uso del marcador de proteínas de doble color Precision plus (Bio-Rad). El análisis de SDS-PAGE se realizó por inmunotransferencia Western mediante el uso de Ab policlonal anti FVII (R&D systems), Ab policlonal anti cTp (producción de Adar biotech) o Ab anti Gla (American diagnostica). En resumen, el FVII fusionado a tres y cinco CTP migró a 80 y 100 kDa, respectivamente (ver Figura 31).
Evaluación comparativa de la potencia in vitro de FVII
El ensayo de actividad de FVII, que se realizó en el centro médico Sheba, el centro nacional de coagulación, es un ensayo basado en PT mediante el uso de plasma inmunoadsorbido deficiente en Factor VII (Siemens). El reactivo PT es innovin y el ensayo se realiza en el instrumento Sysmex CA 1500. El intervalo normal de FVII está dentro de 55-145 %. Las actividades de la muestra se resumen en la Tabla 47.
Tabla 47: Actividad de la muestra
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El nivel normal de FVII circulante en el cuerpo es de alrededor de 0,5 mg/ml. Ambos, FVII-CTP3 y FVII-CTP5, exhiben reducciones de aproximadamente 5 veces en su actividad de coagulación en comparación con el plasma humano normal.
Estudio farmacocinético
Se realizaron dos estudios farmacocinéticos para determinar el perfil y parámetros farmacocinéticos (PK) de FVII -CTP3 y FVII-CTP5 (después de la selección de FVII y la columna de HA de FVII). En el primer estudio, FVII-CTP3 y FVII-CTP5 después de la selección/purificación en hA de FVII se administraron en una única inyección intravenosa a ratas Spargue Dawley (seis ratas por sustancia) en una dosis de 50 mg/rata.
Se extrajeron muestras de sangre retroorbitalmente de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,52, 5, 8, 24, 48, 72, 96 y 120 horas después de la dosificación. Se preparó plasma con citrato (0,38 %) inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta el análisis.
En el segundo estudio, solo se analizaron las muestras después de la columna HA. Estas muestras se administraron en una única inyección intravenosa o subcutánea a ratas Sprague Dawley (seis ratas por sustancia) mediante el uso de una dosis de 100 mg/rata. Se recolectaron muestras de sangre en los mismos puntos temporales y condiciones que en el primer estudio anterior.
Tabla 48. Diseño del primer estudio (FVII seleccionado frente a FVI1HA).
Figure imgf000076_0001
Tabla 49. Segundo diseño del estudio (IV frente a SC)
Figure imgf000076_0002
Las principales diferencias entre estos dos estudios son las dosis y la vía de administración. En el primer estudio, a las ratas se les inyectaron por vía IV 50 mg/rata, mientras que en el segundo estudio, a las ratas se les inyectaron por vía IV o SC 100 mg/rata (total 500 pg/kg; las ratas pesan 200 g). El aumento de la dosis se debe al cambio en el tipo de administración; la administración SC requiere cantidades mayores para lograr efectos similares a la administración IV.
Análisis del estudio PK
La concentración de FVII en muestras de plasma se cuantificó mediante el uso de kits Elisa de FVII humano (zymutest FVII-Biophen). Se calcularon los perfiles farmacocinéticos y reflejan la media de 3 animales en cada punto temporal. Los valores de semivida terminal se calcularon mediante el uso del software PK solutions 2.0. La tabla más abajo resume las concentraciones de FVII calculadas en los diferentes puntos temporales de muestreo. El perfil PK y un resumen de los parámetros PK se presentan en la tabla más abajo.
Tabla 50. Primer estudio farmacocinético (FVII select frente a FVII HA) -concentraciones de FVII (ng\ml).
Figure imgf000077_0002
Tabla 51. Segundo estudio farmacocinético (IV frente a SC) -Concentraciones de FVII (ng\ml).
Figure imgf000077_0003
Tabla 52. Análisis PK: primer estudio farmacocinético (FVII S frente a HA).
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La adición de cinco CTP alargó la semivida de FVII en comparación con 3 CTP. Ambas formas de 5 CTP (es decir, FVIIS y FVII HA) se detectaron en los puntos temporales largos (96 y 120 h), mientras que FVII-3 CTP HA y FVIIS-3 CTP se detectaron hasta las 72 h y 96 h, respectivamente. Basado en este hecho, la semivida de los FVII-5 CTP es más larga que las variantes de 3 CTP (ver Figura 32). La comparación de la semivida de todos los materiales examinados (3 y 5 CTP) en los mismos puntos temporales (8-72 h) mostró que las semividas medias es similar, aunque con 5 cTp son bastante más largos (Figura 32).
Tabla 53: Análisis PK - segundo estudio farmacocinético-(IV frente a SC).
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Nuevamente, como se observó en el primer estudio, la adición de 5 CTP alargó la semivida del FVII en comparación con la adición de 3 CTP, tanto en la semivida inicial como terminal y en ambas formas de administración (IV y SC, ver Figura 33). Como se esperaba, después de la administración SC, el FVII se detectó por primera vez en la sangre en un punto temporal posterior en comparación con cuando se administró por vía IV.
En lo anterior, se resumieron dos estudios de PK. El propósito principal del primer estudio fue comprobar la diferencia entre FVII-3CTP y FVII-5 CTP después de 2 columnas diferentes: FVII seleccionado y FVI1HA. En nuestros estudios anteriores, se comprobaron la cosecha frente a las proteínas purificadas y se encontró que la diferencia entre las versiones de 3 y 5 CTP de FVII era mayor cuando se inyectaba la cosecha a las ratas.
No hubo diferencias significativas entre los resultados de FVII 3\5 CTP después de ambas columnas, por lo que se decidió inyectar FVII HA 3\5 CTP en el segundo estudio (IV frente a SC).
Ejemplo 8: estudio de supervivencia de FVIIa-CTP3 (MOD-5014) en ratones con deficiencia de FVIII tras la inyección subcutánea
Objetivo del estudio
Evaluar la eficacia de NovoSeven®, MOD-5014 (FVIIA-CTP3) y MOD-5019 (FVIIA-CTP5 ) en un estudio por transección en la vena de la cola, después de la administración subcutánea.
Propiedades analíticas de FVIIa-CTP3 (MOD-5014) y FVIIa-CTPs (MOD 5019): Determinación de proteínas por A280 El coeficiente de extinción teórico de NovoSeven® se calculó mediante el uso del algoritmo ProtParam (http://web.expasy.org/protparam). El cálculo se basa en la secuencia de aminoácidos. El coeficiente de extinción calculado para Novo-Seven® es 1,406 y para MOD-5019 es 1,075 (los valores representan la absorbancia de 1 g/l a 280 nm). El coeficiente de extinción de MOD-5014 se determinó mediante análisis de aminoácidos en Mscan. El coeficiente de extinción para MOD-5014 es 1,27.
Ensayo de coagulación de FVIIa - STACLOT VIIa-rTF
El FVIIa se deriva de la escisión intracatenaria del FVII de simple cadena. El factor tisular nativo (TF) es un cofactor de FVIIa, tras unirse a TF, FVII media la activación del Factor X a Xa, mientras que él mismo se transforma en FVIIa. El factor tisular soluble es la parte extracelular del factor tisular nativo. Ya no puede activar FVII por activación automática, pero el FVIIa unido al factor tisular puede activar el FX a FXa.
El factor tisular soluble recombinante (rsTF) usado en este ensayo utiliza la especificidad de FVIIa para construir una prueba de coagulación de FVIIa. El factor tisular soluble recombinante (rsTF), en presencia de FVIIa, calcio y fosfolípidos, produce la coagulación del plasma sin activar el FVII a FVIIa.
El tiempo de coagulación observado en este sistema tiene una relación inversa con el contenido de FVIIa en la muestra analizada, sin interferencia de la presencia del FVII en la muestra.
Se evaluó la actividad de FVIIa para NovoSeven® reconstituido y para MOD-5014 y MOD-5019 antes de cada estudio.
La actividad específica de FVIIa (que se calcula como la actividad/ ml dividida por la concentración de proteína) se calculó basada en A280 y se presenta en la Tabla 54. Al comparar la actividad específica de las dos moléculas, que difieren en peso molecular, debe realizarse una compensación para normalizar la actividad (es decir, debido a la diferencia de peso molecular, el número de sitios activos en 1 mg de NovoSeven® es 1,185 veces mayor que en MOD-5014 y 1,307 veces mayor que MOD-5019). Por lo tanto, el cálculo del factor de conversión se presenta en la siguiente fórmula:
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Tabla 54- MOD-5014 Actividad específica comparada con NovoSeven®
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Esquema del estudio
La medida más significativa es la capacidad de la proteína para inducir un coágulo in vivo, después de un evento traumático. Para evaluar la capacidad de MOD-5014 para detener el sangrado, se empleó el mismo modelo de ratones deficientes en FVIII para una prueba de sangrado.
A ratones deficientes en FVIII se les administró una única inyección subcutánea de MOD-5014, MOD-5019 o NovoSeven®. A los grupos A y B se les administró NovoSeven® y MOD-5014, respectivamente, en cantidades equivalentes a la actividad de FVIIa. Se dosificó al grupo C con MOD-5019 en una cantidad equivalente de proteína FVIIa como MOD-5014, para evaluar el factor fundamental (actividad o cantidad de proteína). Las dosis administradas fueron 4,2 pg/kg de NovoSeven® y 8,6 pg/kg de MOD-5014 y MOD-5019. La vena de la cola se seccionó a 2,7 cm de la punta de la cola 12 horas después de la administración y se registró la supervivencia de los ratones durante 24 horas.
Tabla 55 - Designación del grupo
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Resultados
Los datos del experimento se resumen en la Tabla 56 y en la Figura 34.
Tabla 56. Resultados del estudio TVT
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24 horas después de la TVT, solo el 11 % de los ratones inyectados con NovoSeven® han sobrevivido. El 30 % de MOD-5014 y el 40 % deMOD-5019 han sobrevivido hasta este punto temporal. Sorprendentemente, MOD-5014 y MOD-5019 inyectados por vía subcutánea muestran una supervivencia mejorada de los ratones en comparación con NovoSeven®.
El Factor VIIa, al igual que otros factores de coagulación, se inyecta normalmente por vía intravenosa para estar directamente disponible en el torrente sanguíneo. Sin embargo, la presente invención muestra que las composiciones proporcionadas en la presente descripción se absorben sorprendentemente más efectivamente en el torrente sanguíneo después de la administración subcutánea. Poder administrar FVIIa por vía subcutánea constituye una ventaja, ya que puede usarse para aplicaciones profilácticas. Las inyecciones subcutáneas también son mucho más fáciles para que los pacientes se autoinyecten y son una ventaja cuando los pacientes son muy jóvenes y sus venas son pequeñas y difíciles de encontrar.
Por tanto, la aplicación subcutánea puede usarse para el tratamiento profiláctico.
Ejemplo 9: Estudio PK-PD comparativo de MOD-5014 recombinante frente a NovoSeven® después de la administración subcutánea en ratas SD
Objetivos del estudio
Determinar los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos de MOD-5014 frente a rFVIIa comercial en ratas SD después de una única administración SC.
Comparar dos experimentos independientes (05010 y 05034) que contienen productos MOD-5014 originados a partir de dos clones diferentes (clon núm. 28 frente a 61) por sus parámetros farmacocinéticos.
Métodos experimentales
Animales
Llegaron 24 ratas SD machos de Harlan Laboratories Israel, Ltd, al menos 4 días antes de que comenzaran las inyecciones. Los animales eran adultos jóvenes sanos, con -200 g al inicio del estudio. La variación del peso corporal de los animales en el momento del inicio del tratamiento no debe exceder ± 20 % del peso medio de cada sexo. El estado de salud de los animales usados en este estudio se examina a su llegada. Solo los animales en buen estado de salud se aclimatan a las condiciones de laboratorio y se usan en el estudio.
Ensayo de coagulación de FVIIa - STACLOT VIIa-Rtf
El factor tisular soluble recombinante (rsTF) usado en este ensayo utiliza la especificidad de FVIIa para construir una prueba de coagulación de FVIIa. rsTF, en presencia de FVIIa, calcio y fosfolípidos produce la coagulación del plasma, sin activar FVII a FVIIa.
El tiempo de coagulación observado en este sistema tiene una relación inversa con el contenido de FVIIa en la muestra analizada, sin interferencia de la presencia del FVII en la muestra.
La actividad de FVIIa se evaluó tanto para NovoSeven® después de la reconstitución como para MOD-5014 antes de cada estudio. La actividad específica de FVIIa se calculó basado en A280. Al comparar la actividad específica de las dos moléculas, que difieren en PM, debe realizarse una compensación para normalizar la actividad (es decir, debido a la diferencia de peso molecular, el número de sitios activos en 1 mg de NovoSeven® es 1,185 veces mayor que en MOD-5014).
Software PK solver
Los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante el uso del software PK solver. La curva de administración IV se analizó como bolo CA de dos compartimientos y la administración SC como análisis trapezoidal log-lineal de NCA extravascular. Se calcularon las especificaciones de semivida, AUC, aclaramiento y distribución de volumen y se estudiaron los parámetros de salida en comparación entre grupos de experimentos.
Materiales experimentales
Experimento núm. 05010:
A. NovoSeven®RT: (Núm. de lote AU61553 preparado el 31.7.12*) Concentración de FVIIa por A280: 0,86 mg/ml. Ensayo de actividad Staclot de FVIIa: 56 867 U/mg. Dosis inyectada: 946 pg/kg. *Combinación de alícuotas de NovoSeven®, todas del mismo núm. de lote
B. Clon 28: MOD-5014 RS12-001: 0,77 mg/ml** basado en A280. Ensayo de actividad Staclot de FVIIa: 34 162 U/mg. Dosis inyectada: 850 mg FVIIa/kg.
Experimento núm. 05034:
A. NovoSeven®RT: (Núm. de lote AU61347 preparado el 1.1.13) Concentración de FVIIa por A280: 0,82 mg/ml, diluido a 0,4 mg/ml con tampón NS estéril. Ensayo de actividad Staclot de FVIIa: 55688 U/mg. Dosis inyectada: 360 pg/kg y 20047,7 U/kg.
B. Clon 61: MOD-5014 Lote 75: 1,9 mg/ml** basado en A280, diluido hasta 0,89 mg/ml con tampón de formulación. Dosis inyectada: 20047,7 U/kg. Actividad de coagulación de FVIIa: 25,002* U/mg basado en el ensayo de actividad Staclot de FVIIa.
C. Clon 61: MOD-5014 Lote 81A: 2,36 mg/ml basado en A280 (filtrado en la mañana del día del estudio y medido nuevamente a 280 nm), diluido hasta 0,4 mg/ml con tampón de formulación. Dosis inyectada: 360 mg FVIIa/kg. Actividad de coagulación de FVIIa: 24943 U/mg basado en el ensayo de actividad Staclot de FVIIa. D. Clon 61: MOD-5014 Lote 81A: 2,36 mg/ml basado en A280, diluido hasta 0,89 mg/ml con tampón de formulación. Dosis inyectada: 20 047,7 U/kg. Actividad de coagulación de FVIIa: 24943 U/mg basado en el ensayo de actividad Staclot de FVIIa.
Esquemas de estudio
Experimento núm. 05010
Se administraron MOD-5014 y NovoSeven® en una única inyección intravenosa o subcutánea a ratas SD en una dosis de 0,9 pg/kg de peso corporal. Se extrajeron muestras de sangre del seno orbital del ojo de 3 ratas alternativamente a las 0,5, 4, 8, 12, 24, 34, 48 y 58 horas después de la dosificación. Se preparó plasma con citrato (0,32 %) inmediatamente después del muestreo y se almacenó a - 20 °C hasta el análisis. El estudio se realizó en "Science in Action", Nes-Ziona. Se evaluó el nivel de actividad de coagulación de FVIIa y se realizó un análisis PK detallado en Prolor-Biotech.
Tabla 57: Diseño del estudio 05010
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Experimento núm. 05034
Se administraron MOD-5014 y NovoSeven® en una única inyección subcutánea a ratas SD en una dosis de 0,9 pg/kg de peso corporal. Se extrajeron muestras de sangre del seno orbital del ojo de 3 ratas alternativamente a las 0,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48 y 72 horas después de la dosificación. Se preparó plasma con citrato (0,32 %) inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta el análisis. El estudio se realizó en "Science in Action", Nes-Ziona.
Se evaluó el nivel de actividad de coagulación de FVIIa y se realizó un análisis PK detallado en Prolor-Biotech.
Tabla 58: Diseño del estudio 05034
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Resultados
La actividad de FVIIa en muestras de sangre se cuantificó mediante el uso del kit STACLOT VIIa-rTF (Stago). Se calculó el perfil farmacocinético para cada proteína y es la media de 3 animales en cada punto temporal.
Experimento núm. 05010
La Figura 35 presenta el perfil PK de FVIIa después de la administración IV y SC de NovoSeven® o MOD-5014. El resumen de los valores de actividad de FVIIa para cada punto temporal se presenta en la Tabla 59. La administración IV y SC tiene un patrón PK diferente como se presenta en la Figura 35 similar a los resultados anteriores. La Cmáx después de la inyección IV es más alta que la obtenida después de la inyección SC, debido a la presencia del fármaco inmediatamente después de la administración en la sangre (medida a las 0,5 h, Tabla 59 y Tabla 60). Sin embargo, después de la administración SC, las moléculas del fármaco se transfieren a la matriz intracelular y los tejidos, por lo que la Cmáx puede medirse solo después de 2 h desde la inyección. La recuperación total del fármaco después de la administración SC es menor que el valor de Cmáx después de la inyección IV. 8 h después de la inyección, Novoseven® manifestó un patrón PK igual cuando se inyectó por vía IV o SC (Figura 35). Además, la actividad de coagulación de los ratones tratados con NovoSeven® fue indetectable en puntos temporales posteriores a las 12 horas, mientras que las ratas tratadas con MOD-5014 aún conservaron la actividad medible a las 58 horas después de la dosificación (Tabla 59 y Figura 35).
Tabla 59. Actividad de coagulación de FVIIa de MOD-5014 frente a NovoSeven® después de la administración IV o SC
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Después de la reducción de fondo: 15 mU/ml.
Tabla 60. Parámetros farmacocinéticos de MOD-5014 frente a NovoSeven® después de la administración IV o SC
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Experimento núm. 05034
La Figura 36 presenta el perfil PK de FVII después de la administración SC de NovoSeven® o MOD-5017. Dos lotes diferentes de clon núm. 61 (núm. 75 y núm. 81) se examinaron en la misma concentración o las mismas unidades de actividad, en comparación con NovoSeven®. El resumen de los valores de actividad de FVIIa para cada punto temporal se presenta en la Tabla 61.
Los resultados indican un patrón PK similar después de la administración SC que corresponde a experimentos previos. Además, la actividad de coagulación de las ratas tratadas con NovoSeven® fue indetectable en puntos temporales posteriores a las 12 horas, mientras que las ratas tratadas con MOD-5014 aún conservaron la actividad medible 24 horas después de la dosificación (Tabla 61_y Figura 36; y después de la reducción de fondo: 56 mU/ml (8, 12 h) o 32 mU/ml (0,5, 2, 6, 14 h)).
Clon núm. 61 lote núm. 81 (D) Cmáx (1301 mU/ml) fue menor que los valores de Cmáx del clon núm. 61 lote núm.
75 (B) y NovoSeven® (A) (3521 mU/ml y 5908 mU/ml, respectivamente), aunque todos se inyectaron con la misma unidad de actividad (Tabla 61). Sin embargo, los lotes núm. 75 (B) y núm. 81 (D) tienen las mismas unidades de actividad (559 mU/ml y 478 mU/ml respectivamente) medidas 8 h después de la inyección (Tabla 61 y Tabla 62; y después de la reducción de fondo: 56 mU/ml (8, 12 h) o 32 mU/ml (0,5, 2, 6, 14 h)).
Tabla 61: Actividad de coagulación de FVIIa de MOD-5014 (Clon 61 núm. 75, núm. 81) frente a NovoSeven® después de una única administración SC.
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Después de la reducción de fondo: 56 mU/ml (8,12 h) o 32 mU/ml (0,5, 2, 6, 14 h).
Tabla 62: Parámetros PK de MOD-5014 (Clon 61 núm. 75, núm. 81) frente a NovoSeven® después de una única administración SC
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Este informe resumió dos estudios de PK; 05010 y 05034. Los resultados proporcionan información específica sobre el impacto de la fusión de CTP con FVII en la semivida de la proteína y el aclaramiento en la administración subcutánea y abordan el paradigma de su actividad específica después de esta modificación. En estos estudios, a las ratas s D se les administró una única inyección SC de MOD-5014 procedente de dos clones y dos lotes diferentes, en comparación con el FVIIa comercial recombinante (Novo-Seven®). Los componentes se inyectaron a una concentración similar de FVIIa (pg/kg) o al mismo nivel de actividad (U/kg) y se realizó el análisis basado en la actividad PK.
El objetivo del primer estudio fue comprobar los diferentes parámetros farmacocinéticos tras la administración IV y SC. Basado en este estudio, podemos concluir que existe una diferencia entre el patrón PK medido después de la administración IV o SC. A t1/2 de 7,78 h medido después de la inyección SC de MOD-5014, y sólo 4,2 h después de la inyección IV. Los valores de AUC fueron los mismos Tabla 60.
Sin embargo, el segundo estudio se centró en las diferencias entre dos lotes del clon MOD-5014 núm. 61, que se inyectaron con la misma concentración de FVIIa o con la misma unidad de actividad, en comparación con NovoSeven®. En este estudio, mostramos que el clon 61 lote núm. 75 manifestó mejores parámetros de PK que el lote núm. 81. El lote núm. 81, que se inyectó con el mismo nivel de actividad de la unidad, tuvo una Cmáx más baja por una razón desconocida. Además, se midió la misma Cmáx cuando se inyectó el clon 61 lote núm. 81 en dos dosis diferentes (por concentración de FVIIa o por unidad de actividad), en lugar de 2,5 veces entre los dos valores de actividad. Tras el análisis de ambos estudios juntos, podemos concluir que el clon 28 manifestó un parámetro t1/2 prolongado que el clon 61 núm. 75 (el mejor lote) después de la inyección SC (7,78 h y 5,7 h, respectivamente, Tabla 62). Los resultados muestran que las muestras de puntos temporales diferentes crean un patrón de PK diferente, lo que conduce a una variación en las curvas de PK. Los patrones de las curvas pueden enseñarnos más sobre el comportamiento del fármaco en la sangre. Por lo tanto, decidimos determinar los puntos temporales similares a los detectados por Baxter (0, 0,5, 2, 6, 8, 12, 24, 34, 48, 72 h). Además, la concentración de FVIIa en el experimento 05010 era demasiado alta y se revisó en el siguiente experimento SC (05034). Para futuros estudios de PK, se decidió inyectar el componente a 360 mg de FVIIa/kg por dosis.
Ejemplo 10: Ratas tratadas con warfarina como modelo para evaluar el Factor VIIa in vivo
Materiales y Métodos
Evaluación PT: A ratas SD se les administró por vía oral 10 pg/kg de warfarina y en un punto temporal designado se recolectó plasma y se midió el tiempo de protrombina (TP) mediante el uso de un procedimiento estándar. Para evaluar el efecto hemostático a largo plazo, se inyectaron Placebo, NovoSeven® o MOD-5014 a los animales tratados con warfarina y se midió el PT.
Desafío de corte de la cola: A animales tratados con warfarina se les inyectó Placebo, NovoSeven® o MOD-5014 en puntos temporales designados, los animales se desafiaron mediante un corte completo de la punta de la cola (0,5 cm desde la punta) y se midió la intensidad del sangrado en g durante 30 min después de la transección.
Resultados
La administración de warfarina a ratas SD produce una prolongación del PT y aPTT.
La warfarina previene la reducción de la vitamina K y, en consecuencia, disminuye la concentración de factores de la coagulación dependientes de la vitamina K en la sangre. Ratas SD machos recibieron tratamiento oral con warfarina. La reducción de los factores de la coagulación dependientes de la vitamina K se acompañó de una prolongación del PT y del aPTT. Los resultados se presentan en la Figura 37.
Debido al lavado de los factores de coagulación de la sangre, los valores de PT y aPTT aumentan gradualmente en las primeras 48 horas después de la administración de warfarina. El efecto disminuye después de eso.
El efecto de la warfarina puede restaurarse mediante un tratamiento IV agudo con NovoSeven® o MOD-5014.
Ratas SD recibieron un pretratamiento de warfarina. 24 horas después, se inyectaron MOD-5014, NovoSeven® o tampón. Se extrajeron muestras de sangre por vía intravenosa 15 minutos después de la inyección. 15 minutos después de la inyección, MOD-5014 así como también NovoSeven® restauraron con éxito los valores de PT a la normalidad (Figura 38).
El efecto de aumentar la dosis de MOD-5014 y NovoSeven® sobre los valores de PT en ratas tratadas con warfarina.
Se trataron ratas SD con 10 pg/kg de warfarina en paralelo a inyección IV de 100-1000 pg/kg de MOD-5014 o NovoSeven. 24 horas después del tratamiento, se determinó el PT en muestras de plasma. NovoSeven® inyectado 24 horas antes de la determinación de PT, no tuvo ningún efecto significativo sobre los valores de PT en todas las dosis probadas. Por el contrario, MOD-5014 muestra un comportamiento dosis-respuesta 24 horas después de la administración (Figura 39).
Se trataron ratas SD con 10 pg/kg de warfarina en paralelo a inyección IV de 1000 pg/kg de MOD-5014 o NovoSeven. El PT se determinó en muestras de plasma 10, 24, 36 y 48 horas después del tratamiento. MOD-5014 restauró los valores de PT a la normalidad hasta 48 horas después de la dosificación, mientras que el efecto de NovoSeven® ya no existe después de 24 horas (Figura 40).
El efecto de duración prolongada de MOD-5014 puede demostrarse mediante el ensayo de corte de la cola en ratas inyectadas con warfarina
Se trataron ratas SD con warfarina 24 horas antes del corte de la cola. Las ratas se anestesiaron y se colocaron sobre una almohadilla tibia, la punta de la cola se colocó en solución salina a 37 °C y se realizó una amputación completa de la cola a 0,5 cm de la punta de la cola. Se recolectó sangre durante 30 minutos y se determinó la pérdida de sangre por peso.
Se administró vehículo o 500 pg/kg de MOD-5014 o NovoSeven® 15 min, 24 o 48 horas antes del corte de la cola. Los resultados se presentan en la Figura 41. Las ratas tratadas con warfarina perdieron 5 veces más sangre que las ratas sin tratamiento previo. 15 minutos después de la inyección, el clip de la cola de las ratas tratadas con MOD-5014 y Novoseven dio como resultado una reducción del sangrado que es comparable a la de las ratas sin tratamiento previo. El efecto de MOD-5014 se conserva completamente 24 horas después de la inyección y se conserva parcialmente después de 48 horas.
La inyección subcutánea de MOD-5014 también demuestra un efecto de larga duración.
Se trataron ratas SD con 10 pg/kg de warfarina en paralelo a inyección SC de 2000 pg/kg de MOD-5014 o NovoSeven. El PT se determinó en muestras de plasma 10, 24, 36 y 48 horas después del tratamiento.
MOD-5014 puede restaurar los valores de PT a la normalidad hasta 48 horas después de la dosificación, mientras que el efecto de NovoSeven® ya no existe después de 24 horas (Figura 42).
La inyección subcutánea de MOD-5014 reduce la pérdida de sangre durante 48 horas.
Se trataron ratas SD con warfarina 24 horas antes del corte de la cola. Las ratas se anestesiaron y colocaron sobre una almohadilla tibia, la punta de la cola se colocó en solución salina a 37 °C y se realizó una amputación completa de la cola a 0,5 cm de la punta de la cola. Se recolectó sangre durante 30 minutos y se determinó la pérdida de sangre por peso.
Se administró por vía SC vehículo o 1000 pg/kg de MOD-5014 o NovoSeven® 15 min, 24 o 48 horas antes del clip de la cola. Los resultados se presentan en la Figura 43.
Ejemplo 11: Evaluación comparativa de la actividad de coagulación de MOD-5O14 y NOVOSEVEN®
Objetivos del estudio -(I) Caracterizar la actividad de coagulación in vitro y activación de FX en diferentes condiciones de MOD-5014 en comparación con NovoSeven®. (II) Comparar ex vivo, perfiles de tiempo de protrombina (PT) y tiempo tromboplástico activado parcial (aPTT) en hemofilia humana y plasma deficiente en FVII tras la adición de Mo D-5014 y NovoSeven®.
Materiales y Métodos
Materiales - MOD-5014 GMP-1: 2,5 mg/ml (basado en A280) y NovoSeven® núm. de lote CU60430: 0,943 mg/ml (basado en A280)
Método - Ensayo de coagulación
La actividad de coagulación de FVIIa se midió mediante el uso del kit Staclot VIIa-rTF disponible comercialmente (Núm. ref 00281, Stago). Este método incluía la medición del tiempo de coagulación del plasma deficiente en FVII mediante el uso de los instrumentos STA Compact MAX o Start4. Se añadieron cantidades específicas de FVIIa al plasma después de la adición de fosfolípidos, Ca2+ y factor tisular soluble recombinante (rsTF). Este último es la porción extracelular del factor tisular nativo, que ya no puede activar FVII a FVIIa por autoactivación. Sin embargo, posee una función de cofactor específica para el Factor VIIa. El FVIIa unido al factor tisular soluble convierte el Factor X en el factor activo Xa. El tiempo de coagulación observado tiene una relación inversa con el nivel de FVIIa en el plasma, ya que el factor tisular soluble no activa FVII a FVIIa. El tiempo de coagulación obtenido se convirtió en actividad (mU/ml) mediante el uso de una curva estándar de FVIIa y la actividad específica se calculó basado en la concentración de proteína de FVIIa. Este método proporcionó la actividad potencial in vitro de FVIIa, con la limitación de usar sTF, que imita sólo parcialmente el entorno in vivo.
Método - Ensayo cromogénico de FVII
La potencia de MOD-5014 y NovoSeven® se evaluó mediante el kit disponible comercialmente BIOPHEN FVII (Núm. ref 221304, HYPHEN BioMed). Este es un ensayo cromogénico destinado a probar la actividad del FVII. El FVII forma un complejo enzimático con el factor tisular y convierte el factor X en el factor Xa activado en presencia de fosfolípidos y calcio. El factor X está presente en el ensayo en una concentración constante y en exceso. La concentración del factor Xa activado se mide por su actividad sobre un sustrato cromogénico específico (SXa-11), que escinde para generar pNA. La cantidad de pNA es directamente proporcional a la actividad del Factor X, y existe una relación directa entre la cantidad del Factor VII y el nivel de actividad del factor Xa, medido por la cantidad de pNA liberado y determinado por el desarrollo de color a 405 nm.
Método: tiempo de protrombina (PT) y tiempo tromboplástica activada parcial (aPTT)
El tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de protrombina activada parcial (aPTT) se midieron con un analizador automático Siemens CA-1500 y se validaron mediante el uso de pruebas de diagnóstico de plasma humano clínicas de rutina en A.M.L.
MOD-5014 GMP-1: 2,5 mg/ml basado en la absorción a A280, diluido hasta 0,5-0,0008 mg/ml con plasma humano hemofílico/plasma deficiente en FVII.
Actividad de coagulación de FVIIa: 16720 U/mg basado en el ensayo de actividad Staclot de FVIIa.
NovoSeven® Núm. de lote CU60430: 0,943 mg/ml basado en la absorción a A280, diluido hasta 0,5-0,0008 mg/ml con plasma humano hemofílico/plasma deficiente en FVII.
Actividad de coagulación de FVIIa:50494 U/mg basado en el ensayo de actividad Staclot de FVIIa.
Matriz: Plasma humano (deficiente en FVIII) BIORECLAMATION (núm. cat. HMPLCIT-FACT8DEF, núm. de lote BRH779222-BRH779233). Plasma deficiente en FVII, núm. cat. HBM-DP030K.
Resultados
Determinación de la potencia: Las actividades específicas de MOD-5014 y NovoSeven® se evaluaron mediante el uso de un kit Staclot VIIa-rsTF calificado. La actividad específica media obtenida para MOD-5014 (lotes RS005, GMP1, ER01) y NovoSeven® determinada por 4 ensayos independientes se presenta en la Tabla 63 más abajo.
Tabla 63 - Actividades específicas de MOD-5014 y NovoSeven®
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Conclusión: La actividad específica de MOD-5014 fue 2 a 2,5 veces menor que la de NovoSeven®. Esto podría ser una consecuencia del contenido molar reducido de FVIIa en MOD-5014 cuando se añade sobre la base de la masa en lugar de la base molar, ya que MOD-5014 consiste de 83,4 % de FVIIa con 3 casetes de CTP unidos en el extremo C-terminal.
Inhibición de la actividad de coagulación en presencia de TFPI:La actividad de coagulación de MOD-5014 y NovoSeven® se evaluó en presencia de un inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), un inhibidor natural del FVIIa. El inhibidor se añadió en un intervalo de concentraciones (3125 ng/ml a 0,006 ng/ml) después de la adición de MOD-5014 o NovoSeven® a una concentración fija, plasma deficiente en FVII, factores tisulares y fosfolípidos, y se incubó durante 15 min a 37 °C. La actividad específica observada se convirtió en % de inhibición. El ensayo se repitió 3 veces y se presenta la media de los resultados en la Tabla 64 y Figura 44.
Tabla 64 - Media de inhibición de la actividad en presencia de TFPI
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Conclusión:TFPI inhibió NovoSeven® y MOD-5014 de una manera similar dependiente de la dosis. La diferencia en los valores puede ser consecuencia de la variabilidad del ensayo, como se informa en la calificación del método (% CV< 25 %).
Inhibición de la actividad de la coagulación en presencia de heparina: La actividad de coagulación de MOD-5014 y NovoSeven® se midió en presencia de heparina en un amplio intervalo de concentraciones. Se añadió heparina tras la adición de una concentración fija de MOD-5014 o NovoSeven®, plasma deficiente en FVII, factores tisulares y fosfolípidos, y se incubó durante 15 min a 37 °C. Los resultados se presentan en la Tabla 65.
T a b la 65 - Inh ib ic ión de la ac tiv id a d en p re sen c ia de he pa rina
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Conclusión: La heparina posee una alta potencia en este ensayo específico, ya que se observó una inhibición superior al 96 % tanto para MOD-5014 como para NovoSeven® incluso a una concentración extremadamente baja (0,1 U/ml).
Actividad de coagulación en presencia de antitrombina (AT): Las actividades específicas de MOD-5014 y Novo­ Seven® se evaluaron en presencia de antitrombina III (ATIII), que es un inhibidor leve de FVIIa. Se añadió antitrombina en un intervalo de concentraciones (525 mg/ml a 0,01 ng/ml) después de la adición de MOD-5014 o NovoSeven®, plasma deficiente en FVII, factores tisulares y fosfolípidos, y se incubó durante 15 min a 37 °C. La actividad específica observada se convirtió en % de inhibición. Los resultados se presentan en la Tabla 66 y la Figura 45.
Tabla 66 - Inhibición de la actividad en presencia de AT III
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Conclusión: MOD-5014 y NovoSeven® se inhibieron de manera similar por AT III.
Activación del Factor X por NovoSeven® y MOD-5014: Se evaluó la potencia de MOD-5014 y NovoSeven® y se calcularon los valores de EC50 promedio obtenidos para MOD-5014 y NovoSeven® (0,41 y 0,38 ng/ml, respectivamente). Los resultados se presentan en la Tabla 67 y una curva de dosis-respuesta representativa se presenta en la Figura 46.
Tabla 67 - Activación de FX por MOD-5014 y NovoSeven
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Activación de FX en presencia de TFPI: Se evaluó la potencia de MOD-5014 y NovoSeven® en presencia de TFPI. Este último se añadió en un intervalo de concentraciones (20 pg/ml a 0,002 ng/ml) a dos concentraciones de MOD-5014 y NovoSeven® (EC70) (0,6 y 4 ng/ml) y se midió la activación de FX. Los resultados se presentan en la Tabla 68 y la Figura 47. El ensayo realizado en presencia de NovoSeven® y MOD-5014 a una concentración de 4 ng/ml se presenta en la Tabla 69 y la Figura 48.
Tabla 68 - Activación del Factor X en presencia de TFPI (núm. 1)
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Tabla 69 - Activación del Factor X en presencia de TFPI (Núm. 2)
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Conclusión: MOD-5014 y NovoSeven® demostraron una curva de inhibición muy similar de la activación de FX en presencia de TFPI a ambas concentraciones del compuesto.
Activación de FX en presencia de TFPI y heparina - Se evaluó la potencia de MOD-5014 y NovoSeven® en presencia de TFPI y heparina. Se añadió TFPI a diferentes concentraciones (20 mg/ml a 0,002 ng/ml) y 1 U/ml de heparina a una concentración constante de MOD-5014 y NovoSeven® (0,7 ng/ml) y se midió la activación del FX. Los resultados se presentan en la Tabla 70 y la Figura 49.
T a b la 70 - A c tiva c ió n de F X en p re se n c ia de TFP I y he pa rina
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Conclusión: MOD-5014 y NovoSeven® exhibieron una activación similar de FX en presencia de TFPI. La heparina no tuvo una influencia significativa en el perfil de inhibición cuando se añadió con TFPi.
Activación de FX en presencia de antitrombina: Se evaluó la potencia de MOD-5014 y NovoSeven® en presencia de antitrombina (AT III). Se añadieron diferentes concentraciones de AT III (1,68 mg/ml a 0,16 mg/ml) a una concentración constante de MOD-5014 y NovoSeven® (0,7 ng/ml) y se midió la activación de FX. Los resultados se presentan en la Tabla 71 y la Figura 50.
Tabla 71 - Activación de FX en presencia de antitrombina
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Conclusión: MOD-5014 y NovoSeven® exhibieron una activación similar de FX en presencia de AT III.
Activación de FX en presencia de concentración constante de AT III y concentraciones variables de heparina: Se diluyó antitrombina III (AT III) hasta una concentración constante (20 mg/ml) y se añadió a una concentración constante de MOD-5014 y NovoSeven® (0,7 ng/ml). Se añadió heparina a diferentes concentraciones (6,25 U/pl-0,002 U/pl) a la mezcla y se midió la activación de FX. Los resultados se presentan en la Tabla 71 y la Figura 51.
T ab la 71 - A c tiva c ió n de FX en p re sen c ia de h e pa rina a d ife re n te s co n ce n tra c io n e s
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Conclusión: MOD-5014 y NovoSeven® exhibieron una inhibición similar y moderada por la heparina a concentraciones constantes de AT III.
Mediciones de PT y aPTT
Las mediciones de PT y aPTT se presentan en la Tabla 72.
Tabla 72
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Conclusión: Las mediciones de PT y aPTT fueron comparables tanto para MOD-5014 como para NovoSeven® cuando se añadieron a un intervalo similar de concentraciones.
Activación de FX en presencia de concentración constante de heparina y concentraciones variables de AT Objetivo del estudio
Comparar la capacidad de MOD-5014 y NovoSeven para activar FX en presencia de antitrombina y a concentración constante de heparina.
Diseño del estudio y resultados
La potencia de MOD-5014 y NovoSeven se evaluó en presencia de antitrombina (AT) y heparina. Se añadieron diferentes concentraciones de AT (1,68 mg/ml a 0,032 mg/ml) y 1 U/ml de heparina a una concentración constante de MOD-5014 y NovoSeven (0,7 ng/ml) y se midió la activación de FX. Los valores de IC50 obtenidos para la antitrombina fueron 49,65 pg/ml para MOD-5014 y 65,70 mg/ml para NovoSeven. Los resultados se presentan en la Tabla 121, Figura 52.
Tabla 121: Activación de FX en presencia de AT y heparina
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Conclusión: MOD-5014 y NovoSeven exhibieron una activación similar de FX en presencia de AT y 1 U/pl de heparina, lo que sugiere que AT tiene un efecto significativamente más pronunciado sobre la inhibición de FVIIa que la heparina.
Mediciones comparativas de PT y aPTT
Objetivo del estudio
Comparar los perfiles de PT y aPTT en plasma de hemofilia humana y deficiente en FVII tras la adición de MOD-5014 y Novo-Seven.
Diseño del estudio
El PT y el aPTT se midieron mediante el uso de un analizador automático Siemens CA-1500 y se validaron mediante el uso de pruebas de diagnóstico de plasma humano clínicas de rutina en A.M.L. MOD-5014 GMP-1: 2,5 mg/ml basado en la absorción a A280, diluido a 0,5-0,0008 mg/ml con plasma hemofílico humano/plasma deficiente en FVII.
Actividad de coagulación de FVIIa: 16720 U/mg basado en el ensayo de actividad Staclot de FVIIa.
NovoSeven, núm. lote CU60430: 0,943 mg/ml basado en la absorción a A280, diluido a 0,5-0,0008 mg/ml con plasma hemofílico humano/plasma deficiente en FVII. Actividad de coagulación de FVIIa: 50494 U/mg basado en el ensayo de actividad Staclot de FVIIa.
Matriz:
• Plasma humano (deficiente en FVIII) BIORECLAMATION (Núm. cat HMPLCITFACT8DEF, núm. de lote BRH779222-BRH779233).
• Plasma deficiente en FVII, núm. cat. HBM-DP030K.
MOD-5014 y NovoSeven se añadieron a las matrices anteriores en concentraciones de
0,5-0,0008 mg/ml y se midieron PT y aPTT. Los resultados se resumen en la Tabla 122.
Tabla 122: Mediciones de PT y aPTT
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Conclusión: Las mediciones de PT y aPTT fueron comparables tanto para MOD-5014 como para NovoSeven cuando se añadieron en un intervalo similar de concentraciones.
Resumen
La actividad de MOD-5014 se evaluó mediante una variedad de métodos in vitro y ex vivo que evaluaron diferentes aspectos de su actividad de coagulación en comparación con NovoSeven® a igual masa. Inicialmente, la actividad de MOD-5014 se comparó con NovoSeven® en el ensayo Staclot de FVIIa calificado. El estudio demostró que la actividad de MOD-5014 es de 2 a 2,5 veces menor que la de NovoSeven. Una prueba de activación del factor X mediante un ensayo cromogénico en presencia de TF, fosfolípidos y calcio también propuso una medida de actividad ligeramente menor de MOD-5014 en comparación con NovoSeven®, según lo reflejado por la EC50.
La variabilidad entre los métodos podría deberse a diferencias en la sensibilidad del ensayo o en el criterio de valoración (TF soluble frente a de cadena completa y tiempo de coagulación frente a medición de DO, respectivamente). La menor actividad de MOD-5014 podría deberse al hecho de que el 84,4 % de MOD-5014 corresponde a FVIIa y el 15,6 % corresponde a CTP.
La inactivación de MOD-5014 en presencia de TFPI, un importante inhibidor dependiente de FXa de la vía de coagulación extrínseca, se evaluó mediante los dos ensayos in vitro mencionados anteriormente (Staclot y activación de factor X). La incubación de MOD-5014 o NovoSeven® a dos concentraciones fijas con concentraciones crecientes de TFPI dio como resultado una reducción dependiente de la dosis en la coagulación o la actividad enzimática de FXa. Ambos compuestos demostraron un patrón de desactivación muy similar, reflejado por el % de inhibición de la coagulación.
Se informó anteriormente que la antitrombina III inhibe el Factor VIIa a una velocidad lenta y también demostró un aumento de la inhibición en presencia de heparina. La antitrombina III demostró un patrón de inhibición similar tanto de MOD-5014 como de NovoSeven® cuando a ambos compuestos se les añadieron concentraciones crecientes de AT III. Este patrón se mantuvo después de la adición de heparina, lo que produjo un efecto inhibidor pronunciado. Ejemplo 12: Evaluación comparativa in vitro de MOD-5014 y NOVOSEVEN® en la generación de trombina y la eficiencia de la coagulación
Objetivos del estudio -(I) Evaluación comparativa de MOD-5014 y NovoSeven® mediante la generación de trombina (TG) en plasma rico en plaquetas inhibitorias con alto título de anticuerpos inhibidores a concentraciones bajas y altas de fosfolípidos y (II) Evaluación comparativa de MOD-5014 y NovoSeven® por tromboelastografía (TEG) en plasma rico en plaquetas inhibitorias con alto título de anticuerpos inhibidores.
Materiales y Métodos
Materiales - MOD-5014: 2,0 mg/ml y NovoSeven® 1,0 mg/ml, almacenados congelados (-60 a -80 °C). No se requirió preparación de formulación de dosis. Los materiales se descongelaron solo una vez antes de la administración.
Método - Generación de trombina (TG) en concentraciones altas y bajas de fosfolípidos
Al plasma humano procedente de pacientes con títulos altos de Abs inhibidores anti FVIII se le añadió una mayor concentración de MOD-5014 o NovoSeven®, la coagulación se estimuló con factor tisular (TF) relipidado y una alta concentración de micelas de fosfolípidos (reactivo RChigh) lo que imita la situación in vivo.
Método - Tromboelastografía (TEG)
La tromboelastografía (TEG) es un método para probar la eficiencia de la coagulación en la sangre y es especialmente importante en cirugía y anestesiología. Los patrones de cambios en la resistencia y la elasticidad del coágulo proporcionan información sobre qué tan bien la sangre puede realizar la hemostasia (detener el flujo de sangre) y qué tan bien o deficientemente los diferentes factores contribuyen a la formación del coágulo.
Esta prueba determina cuatro valores que representan la formación de coágulos: el valor R (o tiempo de reacción), el valor K, el ángulo y la MA (amplitud máxima). El valor R representa el tiempo hasta que se detecta la primera evidencia de un coágulo. El valor de K es el tiempo desde el final de R hasta que el coágulo alcanza los 20 mm y esto representa la velocidad de formación del coágulo. El ángulo es la tangente de la curva que se forma cuando se alcanza K y ofrece información similar a K. La MA es un reflejo de la fuerza del coágulo.
Resultados
Generación de trombina: La generación de trombina es una parte fundamental de la cascada de la coagulación y, como tal, un estimado de qué tan bien un individuo en particular puede generar trombina puede correlacionarse con el riesgo de sangrado o trombosis. Describe todas las fases del proceso de generación de trombina (inicio, amplificación e inhibición de la generación de trombina, así como también la cantidad integral de trombina generada). De acuerdo con el sistema experimental usado, la generación de trombina puede verse influida por la mayoría de los factores que desempeñan un papel en la coagulación de la sangre in vivo.
La cinética de la generación de trombina se monitoreó por Technoclone TGA (Figura 53).
Se observó un aumento dependiente de la dosis del pico de trombina y una disminución de la fase de retardo y el tiempo hasta el pico después de añadir MOD-5014 o Novoseven.
En el segundo experimento, MOD-5014 o NovoSeven® se añadieron a concentraciones crecientes en presencia de TF y en presencia de una concentración baja de micelas de fosfolípidos (Reactivo RClow).
Como se anticipó, se observó un reposo más pronunciado cuando se añadió a la muestra una alta concentración de PL. Ambos compuestos alcanzaron la respuesta máxima de TG a una concentración baja de PL, lo que confirma aún más su importancia para la activación apropiada de la cascada de coagulación. El resultado presentado en la FIGURA 53 y la FIGURA 54 demuestra que la actividad de generación de trombina in-vitro de MOD- 5014 es ligeramente menor en comparación con NovoSeven® a concentraciones altas y bajas de PL y está alineada con los datos obtenidos en plasma deficiente en FVIII PPP.
Eficiencia de la coagulación: Se añadieron MOD-5014 y NovoSeven® a plasma rico en plaquetas (PRP) de inhibidor del FVIII humano en títulos altos, CaCl2 y tromboplastina rhTF se añadieron para desencadenar la formación de coágulos. Se evaluaron el R y el ángulo. Como se observa en la Figura 55, tanto MOD-5014 como NovoSeven® disminuyeron el tiempo de coagulación (R) y aumentaron la velocidad de formación de coágulos (ángulo) del plasma inhibidor de FVIII en título alto de una manera dependiente de la concentración similar, mientras que MOD-5014 demostró una reducción menor en su capacidad de coagulación. Estos hallazgos refuerzan aún más los resultados obtenidos por ROTEM de que la unión de CTP no interfiere con la formación de coágulos.
Resumen
Basado en los resultados de TG y TEG en plasma de alto título de FVIII, parece que el mecanismo de TG y formación de coágulos de MOD-5014 puede ser similar a NovoSeven® con una ligera reducción en su actividad. Esto podría ser una consecuencia de la reducción del contenido molar de FVIIa en MOD-5014 cuando se añade en base a la masa en lugar de en base molar, ya que MOD-5014 consiste de 83,4 % de FVIIa con 3 casetes de CTP unidos al extremo C terminal y, por lo tanto, requerirá concentraciones ligeramente mayores de MOD-5014 para mantener la hemostasia in vivo. Finalmente, parece que puede mantenerse un mecanismo de unión a fosfolípidos después de la unión de CTP a FVIIa.
Ejemplo 13: Actividad comparativa in vitro de MOD-5014 y NOVOSEVEN®
Objetivos del estudio -(I) Una evaluación comparativa de MOD-5014 y NovoSeven® mediante la generación de trombina (TG) en plasma pobre en plaquetas (PPP) con citrato. (II) Una evaluación comparativa de la afinidad del factor tisular (TF) por MOD-5014 y NovoSeven® mediante la generación de trombina en PPP con citrato. (III) Una evaluación comparativa de MOD-5014 y NovoSeven® por tromboelastografía (ROTEM) en plasma con citrato PPP. Materiales y Métodos
Materiales - MOD-5014: 2,6 mg/ml y NovoSeven® 2,6 mg/ml, almacenados congelados (-60 a -80 °C). No se requirió preparación de formulación de dosis. Los materiales se descongelaron a temperatura ambiente antes de la administración.
Método (Objetivo (I)) - Generación de trombina (TG) en concentraciones bajas y altas de fosfolípidos
La generación de trombina se midió de acuerdo con Livnat y otros (2006, J. Thromb Haemost. 4(1):192-200; 2008, Haemophila. 14(4):782-786; y 2011, Thromb Haemost. 105(4): 688-95). Brevemente, al plasma combinado se le añadió concentraciones crecientes de MOD-5014 o NovoSeven®. Se usaron como tampones de trabajo PPP-Reactivo BAJO (que contiene factor tisular 1 mM) o Mpreagent (Diagnostica Stago, Lote PPL 1203/01 y MPR 1202/01, respectivamente). Ambos reactivos contenían fosfolípidos 4 mM.
El ensayo se llevó a cabo mediante el uso de dos enfoques como sigue: (a) Recalcificación solamente; y (b) Nivel de TF bajo (1 pM).
Se colocaron veinte ml de tampón de trabajo en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo. Se añadieron al tampón ochenta ml de plasma deficiente en FVIII con diferentes concentraciones de NovoSeven® o MOD-5014, como se describe en la Tabla 73.
Tabla 73
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La TG se inició al añadir 20 pl de sustrato fluorogénico/tampón CaCh (FluCa-kit Thrombinoscope-BV, Diagnostica Stago, lote FLB 1303/01). La fluorescencia se midió mediante el uso de un filtro de excitación a 390 nm y un filtro de emisión a 460 nm y un fluorómetro (Fluoroskan Ascent, Lab system, Helsinki, Finlandia). Los resultados se mostraron como gráficos y parámetros derivados, es decir, tiempo de retardo, potencial de trombina endógena (ETP) y altura de pico, y se calcularon mediante el uso de un software informático especializado (versión 3.0.0.29, Thrombinoscope-BV Maastricht, Países Bajos). Cada muestra se analizó independientemente dos veces en duplicados (corrida 1 y 2). Se proporciona el valor medio de los duplicados y se compara con un estándar de trombina (calibrador de trombina, Diagnostica Stago, lote TC 1208/01).
Método -(Objetivo (II)) - Generación de trombina (TG)
La generación de trombina se midió de acuerdo con Livnat y otros (2006, 2008, 2011). Brevemente, al plasma combinado se le añadió 3 concentraciones crecientes bastantes bajas de MOD-5014 o NovoSeven® para permitir una respuesta más sensible y dependiente de la dosis (1,25, 2,5, 5 y 10 pg/ml). Se usó reactivo MP que contenía fosfolípidos 4 pM como tampón de trabajo. A cada muestra designada se le añadió concentraciones crecientes de TF como se describe en la Tabla 74 más abajo, y se evaluó la TG.
Tabla 74
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La TG de cada artículo de prueba a las concentraciones designadas de TF se evaluó al medir el ETP, el tiempo de retardo y la altura del pico de trombina. Cada muestra se analizó independientemente dos veces en duplicados (corrida 1 y 2). Se proporciona el valor medio de los duplicados.
Método - Objetivo (III) - Tromboelastografía por rotación (ROTEM)
Al plasma combinado de pacientes con deficiencia grave de FVIII se le añadió NovoSeven® o MOD-5014 en 4 concentraciones como se describe en la Tabla 75 más abajo, y se evaluó en las siguientes condiciones: (a) adición de caolín; (b) con bajos niveles de FT; (c) reclasificación.
Tabla 75
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Las mediciones por ROTEM se realizaron con un dispositivo ROTEM (Pentapharm, Munich, Alemania) mediante el uso de 300 ml de plasma deficiente en FVIII colocado en vasos, con una posterior adición de CaCh 20 mM, (NATEM), ácido elágico (activación por contacto, INTEM), o baja concentración de factor tisular (reactivo EXTEM diluido 1:1700). Las pruebas de ROTEM se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a 37 °C y se llevaron a cabo durante un mínimo de 45 minutos. Se usaron las siguientes variables: tiempo de coagulación (CT, s), es decir, el tiempo entre la introducción de CaCl2 y el comienzo de la coagulación; ángulo alfa (ángulo a, grados) que refleja la propagación del coágulo; y máxima firmeza del coágulo (MCF, mm), que refleja la resistencia del coágulo. Resultados
Objetivo (I): Evaluación comparativa in vitro de MOD-5014 y NovoSeven® mediante la generación de trombina (TG) La generación de trombina se ha usado con frecuencia para la evaluación del efecto hemostático de FVIIa. Anteriormente se demostró que FVIIa media los cambios en la generación de trombina (TG) en muestras de plasma con inhibidor de FVIII. En muestras de plasma enriquecidas con FVIIa recombinante (rFVIIa), la TG mejoró en ausencia de factor tisular (TF) mientras que el potencial TG de rFVIIa in vitro se incrementó como resultado de la adición de TF. No se dispone de ensayos farmacocinéticos clásicos y sencillos para FVIIa debido a la complejidad de su mecanismo de acción. Dado que la trombina es el producto final generado, podría usarse un ensayo de TG para evaluar la farmacocinética y la eficacia potencial de MOD-5014 y NovoSeven®. Este ensayo es adecuado para monitorear la farmacocinética de agentes que eluden los inhibidores durante el tratamiento y puede ser útil para predecir respuestas al tratamiento. Por lo tanto, la medición en tiempo real de la concentración de trombina generada en el plasma proporciona información valiosa con respecto a la homeostasis del sistema de coagulación. El objetivo de este estudio fue comparar la capacidad de generación de trombina in vitro de MOD-5014 y NovoSeven® en plasma de hemofilia A grave en un intervalo de concentraciones que potencialmente se correlacionan con las dosis clínicas propuestas en el primer estudio en seres humanos (FIH). Esto podría proporcionar una predicción de la dosis mínima efectiva como parte de las preparaciones para el primer estudio en seres humanos (FIH).
Generación comparativa de trombina después de la recalcificación
Se añadieron MOD-5014 y NovoSeven® en un amplio intervalo de concentraciones al plasma combinado de hemofilia A severa. El estudio se repitió dos veces y los resultados se proporcionan en las Tablas 76-79 más abajo, y las Figuras 56, 57, 58(A-E), 59(A-D), 60, 61,62(A-E) y 63(A-D).
Tabla 76 (Corrida núm. 1) Valores derivados de NovoSeven® para la Figura 56
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Tabla 77 (Corrida núm. 1) Valores derivados de MOD-5014 para la Figura 57
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T ab la 78 (C o rrid a núm . 2 ) V a lo re s d e riva d o s de N o vo S e ve n ® para la F igu ra 60
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Tabla 79 (Corrida núm. 2) Valores derivados de MOD-5014 para la Figura 61
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Se observó una respuesta dependiente de la dosis después de la adición de los dos compuestos. A bajas concentraciones de 1,25-2,5 pg/ml, que presumiblemente imitan 40 y 80 pg/kg, respectivamente, se observó una TG deficiente, reflejada por un mayor retardo y una reducción del ETP (Figuras 56, 57, 60 y 61). Aunque la concentración más alta proporcionó una mejora pronunciada en el perfil de TG, ninguno de los compuestos probados fue capaz de proporcionar una restauración completa de la TG obtenidos con FVIII (Figuras 71 y 72; Tabla 80).
Tabla 80 (Valores derivados para la Figura 72)
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Estos resultados están en línea con los estudios publicados y sugieren que el hFVIIa es menos efectivo como agente de derivación que otras terapias de reemplazo para la corrección de la trombina, demostrado por un pico de TG más bajo, ETP y otros parámetros. El análisis de superposición (Figuras 58 (A-E), 59 (A-D), 62 (A-E) y 63 (A-D)) sugirió una ligera reducción en la respuesta de TG de MOD-5014 en comparación con NovoSeven®, reflejada principalmente como un mayor tiempo de retardo y un pico de trombina más bajo (estimado en un 30-40 % más bajo que en NovoSeven®). Esto podría ser una consecuencia de la reducción del contenido molar de FVIIa en MOD-5014 cuando se añade en base a la masa en lugar de en base molar, ya que MOD-5014 consiste de 83,4 % de FVIIa con 3 casetes de CTP unidos en el extremo C terminal. Las dos corridas independientes fueron consistentes entre sí, al proporcionar resultados similares con variaciones menores.
Generación comparativa de trombina a bajas concentraciones de TF
Cuando el plasma combinado de hemofilia A grave se enriqueció con niveles bajos de TF, se observó una respuesta de fondo de TG que aumentó a medida que aumentaron las concentraciones de MOD-5014 y NovoSeven® en las muestras analizadas. (Figuras 64, 65, 66(A-E), 67, 68, 69(A-E), 70(A-C); Tablas 81-84)
Tabla 81 (Valores derivados de NovoSeven® para la Figura 64)
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T a b la 82 (V a lo re s de riva d o s de M O D -5014 para la F igu ra 65)
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Tabla 83 (Valores derivados de NovoSeven® para la Figura 67)
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T a b la 84 (V a lo re s de riva d o s de M O D -5014 para la F igu ra 68)
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En este estudio se observó un patrón similar de respuesta dependiente de la dosis para ambos productos; sin embargo, se obtuvo una mayor amplitud debido a la potenciación de la respuesta por TF. Nuevamente, MOD-5014 demostró una reducción de la actividad que fue más pronunciada en comparación con el estudio de recalcificaciones, que requirió una concentración más alta de MOD-5014 para proporcionar una superposición adecuada entre los dos (Figura 66 (A-E) y Figura 70 (A-C)). Para estudiar esto más a fondo, se realizó un estudio in vitro para investigar más a fondo la afinidad de MOD-5014 y FVIIa por TF y su efecto sobre la TG, como se describe más abajo.
Conclusiones: Ambos productos demostraron una respuesta de TG dependiente de la dosis cuando se añadieron al plasma combinado de hemofilia A grave, con una respuesta inicial deficiente a concentraciones que imitan la dosis clínica de 40-80 pg/kg. Estos resultados sugieren presumiblemente que las dosis inferiores a 40-80 pg/kg no proporcionarán una respuesta in vivo. Además, MOD-5014 demostró una reducción del rendimiento de tG cuando se adicionó a una concentración similar a NovoSeven®, lo que sugiere que podría ser necesaria una concentración ligeramente mayor (30-40 %) en el entorno clínico para proporcionar un efecto hemostático inicial adecuado que sea comparable al de NovoSeven®.
Objetivo (II): Evaluación comparativa in vitro de la afinidad de MOD-5014 y NovoSeven® a TF
El FVIIa parece tener al menos dos mecanismos efectores independientes: la activación del factor X (FX) mediada por FVII dependiente del factor tisular (TF), que es el inductor clásico de la vía extrínseca de la coagulación, y una actividad independiente de TF de altas dosis de FVIIa en superficies de fosfolípidos endógenos (PL) de monocitos o plaquetas. MOD-5014 demostró una reducción de la actividad en comparación con NovoSeven®, que fue más pronunciada en presencia de TF. Se requirieron concentraciones más altas de MOD-5014 para proporcionar una superposición adecuada entre los dos compuestos (Figura 66 (A-E) y Figura 70 (A-C)). Aunque se informó anteriormente que la afinidad de MOD-5014 por TF era similar a Novo-Seven® según lo medido por SPR y ensayos de activación in vitro, el objetivo de este estudio fue investigar más a fondo esta afinidad in vitro de MOD-5014 y FVIIa a TF mediante la TG.
Se añadieron MOD-5014 y NovoSeven® en un intervalo creciente de concentraciones a plasma combinado de hemofilia A severa, en presencia de concentraciones crecientes de TF. El estudio se repitió dos veces y los resultados de cada corrida se proporcionan en las Figuras 73-88 y las Tablas 85-90.
Tabla 85 (Valores derivados para la Figura 73)
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Tabla 86 (Valores derivados para la Figura 75)
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T a b la 87 (V a lo re s de riva dos para la F igu ra 77)
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Tabla 88 (Valores derivados para la Figura 81)
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T a b la 89 (V a lo re s de riva dos para la F igu ra 82)
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Tabla 90 (Valores derivados de la Figura 83)
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La adición de concentraciones crecientes de TF con dosis fijas de NovoSeven® o MOD-5014 proporcionó un aumento dependiente del TF en el desempeño de TG, como se refleja en la reducción del tiempo de retardo y el aumento de ETP y pico de trombina (Figuras 79 (A-C), 80 (A-C), 87 (A-E) y 88 (A-E)). Para ambos compuestos en todas las dosis y concentraciones de TF por debajo de 5 pM, se observó una respuesta de TG deficiente a moderada, como se refleja en el aumento del tiempo de retardo y la reducción de la ETP. Una mayor concentración de TF (5 pM) proporcionó una mejora pronunciada en el perfil de TG (Figuras 79 (A-C), 80 (A-C), 87 (A-E) y 88 (A-E)). Sin embargo, ninguno de los compuestos probados fue capaz de proporcionar una restauración completa de la TG obtenida con FVIII (Figuras 71 y 72, y Tabla 82). Curiosamente, el aumento de las concentraciones de NovoSeven® o MOD-5014 a niveles constantes de TF no mejoró el rendimiento de la TG (Figuras 79 (A-C), 80 (A-C), 87 (A-E) y 88 (A-E)), lo que enfatiza aún más la importancia del TF para la actividad adecuada de ambos compuestos.
La comparación de los perfiles de TG de MOD-5014 y NovoSeven® mediante análisis de superposición (Figuras 74 (A-E), 76 (A-E), 78 (A-E), 82, 85 (A-C), 86 (A-E); Tabla 89) sugirió una ligera reducción en la respuesta de MOD-5014 (estimada como un 20-30 % menor) sin TF o con una concentración de TF muy baja (0,5 pM). A medida que aumenta el nivel de TF, se observa una respuesta similar en todas las concentraciones de MOD-5014 y NovoSeven® en ambas repeticiones (Figuras 74 (A-E), 76 (A-E), 78 (A-E), 82, 85 (A-C), 86 (A-E); Tabla 89).
Conclusión: Este estudio confirma aún más los resultados in vitro al añadir ambos compuestos a concentraciones fijas en presencia de concentraciones crecientes de TF. La cantidad de TF en la muestra fue responsable predominantemente del aumento de la respuesta de TG, lo que confirma aún más una similitud biológica entre MOD-5014 y NovoSeven®.
Objetivo (III) Evaluación comparativa de la actividad de MOD-5014 y NovoSeven® mediante tromboelastografía de rotación (ROTEM)
Durante la última década, la tromboelastografía emergió como una herramienta valiosa para monitorear la hemostasia en la coagulopatía, la transfusión de sangre y la terapia de reemplazo de factores de coagulación. En este sentido, la tromboelastografía se ha usado en la hemofilia, la terapia de reemplazo de Factor VIII o IX y la evaluación del efecto de aFVIIa en pacientes con hemofilia con inhibidores. ROTEM puede usarse para evaluar los efectos de la coagulación y los agentes antifibrinolíticos en la trombocitopenia, trombastenia de Glanzmann y hemodilución. Los objetivos del estudio fueron comparar el desempeño in vitro por ROTEM de MOD-5014 y NovoSeven® en plasma con hemofilia A grave en un intervalo de concentraciones que se correlacionan con las dosis clínicas propuestas, y evaluar la dosis mínima efectiva como parte de las preparaciones para el estudio FIH.
Los resultados de los experimentos se presentan en las Tablas 91 y 92.
Tabla 91: Añadir Factor VIII a plasma deficiente en FVIII
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La Tabla 91 muestra la coagulación del plasma sin FVIII y después de la adición al plasma de FVIII (1 U/ml), que se usó como compuesto de control en el estudio. En la prueba NATEM, no se observó coagulación en el plasma intacto, mientras que la adición de FVIII a las muestras de plasma fue seguida por una ligera formación de coágulos. Por el contrario, en la prueba INTEM, la formación de coágulos se produjo tanto en el plasma intacto como en el tratado, mientras que en el último fue mucho más fuerte (el CT fue más corto y el ángulo a fue 8 veces mayor). La firmeza máxima del coágulo (MCF) aumentó ligeramente. Estos resultados sugieren que el sistema intrínseco (INTEM) puede ser una prueba útil para la evaluación del reemplazo con FVIII en la hemofilia A.
Tabla 92: El efecto de MOD-5014 y Novo Seven sobre la formación de coágulos en plasma deficiente en FVIII
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La Tabla 92 muestra los efectos de FVIIa sobre la formación de coágulos en plasma deficiente en FVIII.
Recalcificación con activación por contacto del plasma (prueba INTEM): El CT fue más corto y el ángulo a aumentó gradualmente en el plasma tratado con ambos tipos de FVIIa a 2,5 y 10 mg/ml en comparación con el plasma no tratado. Al aumentar la concentración de FVIIa a 15 mg/ml, los cambios en la formación de coágulos no difirieron de los del plasma tratado con 10 pg/ml de FVIIa. No se encontraron diferencias entre las actividades de MOD-5014 y NovoSeven.
Recalcificación con activación de la vía extrínseca (prueba EXTEM): Hubo una disminución en el CT y un aumento de MCF tanto en el plasma tratado con MOD-5014 como con NovoSeven en comparación con el plasma no tratado. Se observó un aumento en la propagación del coágulo (ángulo a) en un grado similar en el plasma tratado con ambos agentes a 2,5 y 10 mg/ml, sin cambios adicionales a 15 pg/ml.
Conclusiones: INTEM pareció ser la prueba más confiable entre las diferentes pruebas ROTEM usadas para comparar la actividad de MOD-5014 y NovoSeven. Una dosis de 2,5 mg/ml, que imita una dosis in vivo de 80 mg/kg, dio como resultado una respuesta baja para ambos compuestos reflejada por un tiempo de coagulación ligeramente menor y un ángulo a aumentado en comparación con el plasma no tratado, probado mediante el uso de INTEM y EXTEM. El aumento de las concentraciones de MOD-5014 y NovoSeven® a 10 y 25 mg/ml fue seguido por un efecto estimulador dependiente de la dosis sobre la formación de coágulos. Los resultados tampoco demuestran una diferencia esencial en los efectos de cualquiera de los agentes sobre la formación de coágulos, al proporcionar valores de ROTEM muy similares en ambos agentes.
Ejemplo 14: Evaluación de la farmacocinética, farmacodinamia y corrección de la coagulopatía hemofílica de MOD-5014 en perros con hemofilia A (deficiencia de FVIII)
Objetivo del estudio - El objetivo del presente estudio fue evaluar y caracterizar la farmacocinética, la farmacodinamia y la corrección de la coagulopatía hemofílica de MOD-5014 en perros con hemofilia A grave (deficiencia en FVIII, <0,01 % de FVIII).
Justificación del sistema de prueba
La colonia de perros con hemofilia A de Chapel Hill tiene la ventaja de que no hay actividad detectable de FVIII en bioensayos de FVIII y ensayos cromogénicos, y poco o ningún antígeno de FVIII por ELISA (<0,005 U/ml). Este modelo se ha usado en el pasado como parte de la caracterización farmacológica no clínica de diferentes factores de coagulación. Se ha propuesto que este modelo puede proporcionar una recapitulación precisa de la biología humana dentro del área particular de la hemostasia y proporcionar parámetros PK/PD comparables a los observados previamente en estudios humanos. Además, se ha demostrado que la TEG, que se usa como una herramienta de tamizaje para evaluar la disfunción hemostática general o la corrección en un entorno clínico, es una herramienta predictiva en este modelo además de sugerir una mayor correlación entre la hemostasia humana y canina.
Materiales y Métodos
Materiales - MOD-5014: 2,6 mg/ml, conservada congelada (-60 a -80 °C). No se requirió preparación de formulación de dosis. Los materiales se descongelaron a temperatura ambiente antes de la administración.
La formulación de dosificación preformulada se manipuló asépticamente y se administró tal como se recibió; no se requirió preparación de formulación de dosis. El artículo de prueba (MOD-5014) se descongeló solo una vez antes de la dosificación. El artículo de prueba se sacó del almacenamiento congelado y se descongeló hasta temperatura ambiente antes de la administración.
Método: Fase Ex vivo: La fase ex vivo se llevó a cabo de acuerdo con Knudsen y otros, 2011, Haemophilia.
17(6):962-970, para establecer la dosis mínima eficaz que respaldaría la selección de la dosis para el estudio in vivo. Durante la primera fase, se realizaron evaluaciones por tiempo de coagulación en sangre total (WBCT) y tromboelastografía (TEG) dependiente de la dosis ex vivo de MOD-5014 añadida a sangre fresca, de dos perros deficientes en FVIII individuales. La dosis más baja de MOD-5014, que mejoró significativamente el desempeño por TEG y WBCT, se consideró la dosis mínima efectiva. Basado en la primera fase y el establecimiento de la dosis mínima efectiva, se seleccionaron las dosis para la segunda fase in vivo.
Se extrajo sangre canina fresca de dos perros hemofílicos con FVIII individuales y se analizó independientemente para confirmar la reproducibilidad de los resultados. Brevemente, se extrajeron 15 ml de sangre canina en una jeringa, se transfirieron a un tubo cónico y se les añadió MOD-5014 a concentraciones finales de 0,568, 1,136, 2,273, 4,545 y 9,909 mg/ml, lo que se correlaciona con la Cmáx esperada in vivo tras la administración de 50, 100, 200, 400, 800 mg/kg de MOD-5014 en perros con deficiencia de FVIII al asumir lo siguiente: El peso estimado canino es de 20 kg y el volumen de sangre de cada animal es de 40 ml/lb (88 ml/kg).
La sangre de este proceso de adición se analizó dentro de <5 min de añadir el material de prueba de la siguiente manera:
Etapa 1: Tiempo de coagulación de la sangre total (WBCT): se usó 1 ml de sangre enriquecida con MOD-5014 a las concentraciones finales designadas para el WBCT. Brevemente, el tiempo de coagulación de la sangre total (WBCT) es una modificación del tiempo de coagulación de Lee-White mediante el uso de dos tubos de vidrio siliconizados (VacutainerTM # 6431, Becton-Dickinson, Rutherford, NJ) en un baño de agua a 28 °C. Un ml de sangre total enriquecida con MOD-5014 en concentraciones designadas se dividió en partes iguales entre dos tubos siliconizados. Se puso en marcha un temporizador. Después de un minuto, un tubo se inclinó cada 30 segundos y el otro se dejó en reposo. Cuando se formó un coágulo en el tubo inclinado, el segundo tubo se inclinó entonces cada 30 s hasta que se formó un coágulo. El tiempo para la formación de un coágulo completamente gelificado en el segundo tubo se registró como el WBCT. En perros con hemofilia A sin tratamiento previo, el WBCT es generalmente > 40 minutos pero puede ser > 60 min. La prueba se detiene si el valor supera los 60 min.
Etapa 2: Tromboelastografía: 1 ml de sangre enriquecida con MOD-5014 a las concentraciones finales designadas se mezcló con caolín (el núm. de lote lo proporciona Haemoscope), se colocaron 360 ml de esta mezcla en la copa para la prueba. Se dejó que los registros de TEG prosiguieran durante aproximadamente 90 min. Se proporciona un intervalo típico de valores de TEG en la Tabla 93 más abajo.
Tabla 93 - Intervalo típico de valores de tromboelastografía
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La dosis más baja que demuestre una mejora significativa de la coagulación se usará como dosis inicial para el estudio in vivo, se propone un control apropiado de la coagulación de la sangre y la hemostasia según lo medido durante la fase II del estudio y mediante el uso de los diferentes ensayos como se describe más abajo.
Método: Fase in vivo: Se usaron en este estudio seis perros de raza mixta con hemofilia A sin tratamiento previo de Chapel Hill (Canis familiaris) que pesan aproximadamente 20 kg. Los perros recibieron dosis intravenosas de 50 mg/kg (N=2), 200 mg/kg (N=4), 400 mg/kg (N=2) o 600 mg/kg (N=2) de MOD-5014. Las dosis se administraron como una infusión IV de 5 minutos. Se recolectaron muestras de sangre para medir la concentración y la actividad mediante punción transcutánea de la vena cefálica antes de la dosificación, y a las 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 32, 48, 72 y 96 horas después de la administración. Se administró MOD-5014 dos veces a cuatro perros durante un período de hasta 8 días, y se administraron 2 perros adicionales una vez. El estudio se diseñó como un estudio con aumento escalonado de las dosis, es decir, después de cada inyección, el análisis de la coagulación en el tiempo determinó el momento de la siguiente dosis.
Durante la fase in vivo, se analizó la farmacocinética y farmacodinamia de MOD-5014, y se evaluó WBCT, tromboelastografía, aPTT, patología clínica básica y una observación clínica (basada en el comportamiento animal). Se realizó una evaluación bioanalítica para el artículo de prueba.
Fase in vivo - Parte A
Durante la primera parte, se inyectó a 2 perros sin tratamiento previo el día 1 con una dosis inicial de 50 mg/kg de MOD-5014 y se monitoreó el desempeño por WBCT y TEG. Una vez que estos valores volvieron a los valores iniciales (antes de la dosis), se inyectó una segunda dosis de 200 mg/kg de MOD-5014. Tabla 94 presenta el esquema de la Parte A.
Tabla 94 - Diseño del estudio Parte A
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Fase in vivo - Parte B
Durante la segunda parte y después de completar la Parte A, se inyectaron dos perros sin tratamientos adicionales el día 1. Los animales se monitorearon de nuevo para determinar el desempeño por WBCT y TEG. Una vez que esos valores volvieron a los valores iniciales (antes de la dosis), se inyectó una segunda dosis. La Tabla 95 presenta el esquema de la Parte B.
Tabla 95 - Diseño del estudio Parte B
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Fase in vivo - Parte C
Durante la Parte B y después de completar la Parte A, se inyectaron dos perros sin tratamiento previo adicionales el día 1 (Tabla 96).
Tabla 96 - Diseño del estudio de la Parte C
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Justificación de la vía de administración
La vía intravenosa es la vía de administración prevista de este artículo de prueba en seres humanos.
Justificación de los niveles de dosis
Los niveles de dosis se seleccionaron sobre la base del intervalo de dosis propuesto que se probó previamente para rhFVIIa y el intervalo de dosis considerado para una evaluación adicional en el estudio de Fase I.
Para evaluar el potencial hemostático de MOD-5014 que permitirá predecir la dosis mínima efectiva en perros con hemofilia A antes de la infusión, se evaluó un intervalo de dosis en estudios de adición por WBCT y TEG en un intervalo de dosis que se aproxima al nivel máximo esperado después de la administración IV in vivo. En ambos ensayos, la adición de MOD-5014 a la dosis más baja (0,568 mg/ml, que corresponde a 50 mg/kg) demostró una mejora menor en el efecto hemostático que mejoró a medida que aumentaron las concentraciones pero sin una normalización completa de los valores de TEG, en línea con Knudsen y otros, 2011. Basado en los resultados obtenidos, la dosis más baja que se estudiará más a fondo in vivo fue la dosis más baja evaluada, es decir, 50 mg/kg.
Administración
La administración fue por vía intravenosa. El artículo de prueba se administró hasta 2 veces durante 8 días. Aproximadamente el 10 % del artículo de prueba se inyectó durante ~1 min y se observó al perro para detectar cualquier reacción clínica obvia (por ejemplo, urticaria y apatía). Cuando se consideró que el perro toleraba la inyección, el 90 % restante se infundió durante 1 a 5 minutos. Se registraron el tiempo y el volumen de la inyección. Se proporcionaron diferentes dosis al variar el volumen de la dosis. La administración del artículo de prueba se siguió de un lavado con solución salina.
Los animales se mantuvieron en ayunas antes de la dosificación.
Evaluaciones de estudios
Exámenes físicos: los perros se sometieron a un examen general antes de ingresar al estudio, y solo se incluyeron aquellos con exámenes generales normales.
Observaciones clínicas: se registró cualquier inquietud respecto al comportamiento o la salud general del animal observada en el examen clínico del animal.
Observaciones clínicas detalladas: Durante la fase de infusión del estudio, se realizó el muestreo de sangre.
Los pesos corporales se registraron al comienzo del estudio y entre los días 7 y 14 después del inicio del estudio. Consumo de comida: Los perros se alimentaron con su cantidad habitual de comida a diario y se observó el consumo de alimentos.
Patología clínica
Las evaluaciones de patología clínica se llevaron a cabo en animales de estudio antes de la dosis. Los recuentos de plaquetas, WBC, HCT y HGB se realizaron mediante FOBRL. Se recolectaron muestras para realizar más pruebas de química clínica en caso de que se hubiese producido algún evento clínico.
Análisis de plasma
Recolección y manipulación de muestras
Todas las muestras de sangre se tomaron mediante punción transcutánea de la vena cefálica mediante el uso de una aguja mariposa 21G o similar. Se recolectaron 10 ml de sangre en una jeringa de 10 ml que contenía 1 ml de anticoagulante (citrato de sodio al 3,2 % [0,12 M]). El citrato de sodio se diluyó 1:10 a medida que se recolectaba la sangre, de acuerdo con el protocolo de laboratorio estándar. La muestra de sangre de 10 ml se transfirió de la jeringa a un tubo cónico de polipropileno de 15 ml y se invirtió suavemente para asegurar la mezcla sin hemólisis. A continuación, la sangre se centrifugó a 3000 g durante quince minutos sin pausa a 4 °C. Después de la centrifugación, el sobrenadante del plasma se transfirió a un nuevo tubo cónico de polipropileno de 15 ml y se centrifugó a 3000 g sin pausa a 4 °C durante 7 minutos adicionales, para asegurar una separación suficiente del plasma de otros materiales sanguíneos. Después de la segunda centrifugación, el plasma de cada muestra se transfirió mediante una pipeta de polipropileno a un tubo de polipropileno y se colocó inmediatamente en un congelador a -80 °C.
Se transfirieron múltiples alícuotas de 100 ml de plasma a tubos Micronics (o comparables) y se congelaron rápidamente (-80 °C). A excepción de WBCT y TEG, todos los ensayos (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas [ELISA], tiempo de tromboplastina activada parcial [aPTT] y ensayo de generación de trombina [TGA]) se realizaron en lotes para todos los animales después de completar la infusión y el muestreo.
ELISA de MOD-5014
El ELISA de MOD-5014 se realizó mediante el uso de un ensayo que detecta de forma específica y selectivamente MOD-5014, mediante el uso de un anticuerpo anti-FVIIa (Ab) disponible comercialmente y un Ab anti-CTP policlonal interno. Se recolectaron muestras de plasma con citrato antes de la dosificación (es decir, valor inicial), 15 min, 30 min, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 32, 48, 72 y 96 horas.
Actividad de coagulación de FVIIa
La actividad de coagulación de FVIIa se midió al utilizar el kit STACLOT VIIa-rTF disponible comercialmente (Núm. Ref 00281, Stago) ajustado para cuantificar la actividad de FVIIa en una matriz de perro hemofílico.
WBCT
Los ensayos de WBCT se realizaron mediante un procedimiento de dos tubos a 28 °C y se analizaron después de la recolección. Se recolectó un ml de sangre total con una jeringa de 1 ml y se dividió en partes iguales entre dos tubos siliconizados (Vacutainer™, núm. 6431, Becton-Dickinson, Rutherford, NJ). El primer tubo se inclinó cada 30 s. Después de la formación del coágulo, el segundo tubo se inclinó y se observó cada 30 s. El criterio de valoración fue el tiempo de coagulación del segundo tubo. En este estudio, FOBRL realizó el WBCT antes de la dosificación (es decir, el valor inicial), 15 min, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 y 96 horas, o hasta que se alcanzaron los valores iniciales. TEG
La sangre para TEG se extrajo en cada punto de muestreo y se analizó en FOBRL/UNC dentro de los 2 minutos posteriores a la recolección mediante el uso del analizador de tromboelastografía Haemoscope TEG 5000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se descartaron los primeros 3 ml de sangre, después se extrajo 1 ml de sangre y se mezcló con caolín (núm. lote A-30-05, proporcionado por Haemoscope). Se colocaron 360 ml de esta sangre/iniciador premezclada en el instrumento y se analizaron. Se dejó que los registros de TEG prosiguieran durante aproximadamente 60-90 min. La prueba se realizó antes de la administración (es decir, valor inicial), 15 minutos, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 y 96 horas, o hasta que se alcanzaron los valores iniciales. aPTT
El aPTT se determinó en FOBRL/UNC mediante el uso del instrumento de coagulación ST4 (Diagnostica Stago, Asnieres, Francia). La mezcla de prueba consistió en porciones iguales de reactivo de tromboplastina parcial (Triniclot, Diagnostica Stago), CaCh 0,025 M y plasma de prueba con citrato. Las muestras se analizaron antes de la administración (es decir, valor base), 15 min, 1,2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 y 96 horas.
Análisis de Datos
El análisis no compartimental y el modelado farmacocinético se realizaron en datos de animales individuales con Phoenix WinNonlin versión 6.3 (Pharsight Corporation, Sunnyvale, CA). El análisis se realizó sobre los datos de concentración plasmática de MOD-5014 así como también sobre los datos de actividad al asumir una actividad específica inicial de 15563 unidades/mg.
Para el análisis no compartimental se usó un programa para la infusión intravenosa. El área bajo la curva desde el tiempo cero hasta el último punto temporal medible (AUC0-t) se calculó mediante el uso del método trapezoidal. Se utilizó regresión log-lineal en los últimos tres o más puntos temporales para estimar la constante de eliminación (A) que se usó para estimar la semivida terminal (ti/2) y el AUC de cero a infinito (AUC0-~) a partir de las siguientes ecuaciones:
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A U C A i U ' Q w CVa
donde Ct es la última concentración medióle. El aclaramiento plasmático (CL) se calculó a partir de la dosis dividida por el AUC0-~. La concentración máxima (Cmáx) y el tiempo en que se observó (Tmáx) se determinaron directamente a partir de los datos. Dado que el análisis se basó en una infusión IV, la concentración al inicio de la infusión se estableció en 0 y no se calculó un volumen de distribución inicial.
Para el modelado farmacocinético, se investigaron diversos modelos y estrategias de ajuste, lo que incluye la evaluación de modelos de uno, dos y tres compartimientos y diferentes esquemas de ponderación.
Los modelos se evaluaron basado en la correlación de las concentraciones observadas y predichas, los valores relativos de los estimados de los parámetros y los estimados de errores, y el criterio de inclusión de Akaike, una evaluación matemática para comparar un modelo con otro.
Tanto la concentración plasmática como los datos de actividad frente al tiempo se describieron mejor mediante un modelo de dos compartimientos. Los datos de concentración se ponderaron por el inverso del cuadrado de los datos de concentración y actividad predichos se ponderaron por el inverso de la concentración predicha. Los esquemas de ponderación evitan que las altas concentraciones tempranas ejerzan mucha influencia sobre el ajuste de la curva. El modelo se ilustra en la Figura 90.
El modelo genera estimados para el volumen de distribución del compartimiento central (VI), la constante de velocidad de eliminación k10 y las constantes de velocidad entre compartimientos, k12 y k21. El compartimiento central es el compartimiento en el que se administra el fármaco y del que se recolectan las muestras, en este caso, el espacio vascular. Las constantes de velocidad asociadas con las fases de distribución y eliminación de la curva, a y p, se calculan a partir de las constantes de velocidad intercompartimentales. Otros parámetros calculados a partir de los parámetros primarios incluyen AUC, Cmáx, Tmáx, CL, MRT y las semividas asociadas con las fases de distribución y eliminación de la curva (ti/2a, ti/2p).
Resultados
Resultados del estudio ex vivo:
WBCT WBCT se midió después de añadir MOD-5014 a la sangre de dos perros hemofílicos A individuales, a concentraciones finales que varían de 0-9,09 mg/ml, que se calcula que son equivalentes a la Cmáx in vivo tras la administración de 50, 100, 200, 400, 800 mg/kg de m Od -5014, respectivamente. El valor inicial (pre) de WBCT fue diferente entre los dos perros, pero dentro del intervalo aceptable para los animales con hemofilia A (ver la Tabla 97).
Tabla 97 - WBCT después de añadir MOD-5014 a sangre de canino
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Se observó una reducción significativa en WBCT a medida que aumentaba la concentración de MOD-5014 con una corrección óptima (~30 min, basado en la evaluación interna del laboratorio) en el intervalo más alto de concentraciones de MOD-5014, como se presenta en la Tabla 97 y la Figura 89.
Para el perro P22, se observó un valor inicial WBCT más bajo y las concentraciones de MOD-5014 más bajas fueron efectivas, mientras que el perro O93 requirió concentraciones de MOD-5014 más altas para alcanzar el valor de WBCT objetivo debido a su valor de valor inicial más alto.
Tromboelastografía
Se añadió MOD-5014 en un intervalo de dosis independientemente a la sangre total de dos perros con hemofilia A y se usó para simular una concentración relevante en sangre poco después de la inyección IV de dosis que variaban entre 50-800 pg/kg. Los parámetros de caolín-TEG mejoraron de manera dependiente de la dosis con alguna fluctuación y variabilidad entre los dos individuos debido a la variabilidad del ensayo o a un error técnico (Tabla 98).
Tabla 98 - Efecto de la adición de MOD-5014 en la evaluación de sangre canina con hemofilia mediante TEG activada por caolín
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Los valores obtenidos fueron comparables a los reportados por Knudsen y otros, 2011, para rhFVIIa recombinante, al tener en cuenta la actividad específica reducida de MOD-5014 (reducción de 2,3-2,5 veces en la actividad específica de FVIIa) y menor contenido de FVIIa (72,3 %).
Conclusión:En ambos ensayos, la dosis más baja de 0,568 mg/ml, que corresponde a 50 mg/kg, demostró una mejora en el efecto hemostático que mejoró a medida que aumentaron las concentraciones sin una normalización completa de los valores de TEG, alineado con Knudsen y otros, 2011.
Resultados del estudio in vivo:
Exámenes clínicos en vida
Todas las infusiones se toleraron bien. No se observaron reacciones en el lugar de la inyección. No se observaron cambios significativos en la hemoglobina, el hematocrito, el recuento de glóbulos blancos o el recuento de plaquetas. No se observaron cambios en el apetito u otros comportamientos durante el período de estudio. Dado que no se produjeron eventos clínicos durante el período de estudio, no se realizaron parámetros de química clínica adicionales (por ejemplo, enzimas hepáticas y función renal).
Análisis plasmático, farmacocinético y de coagulación
Los datos farmacocinéticos se presentan en las Tablas 99 y 100 más abajo.
La Figura 91 y la Figura 92 presentan la concentración plasmática media de MOD-5014 y la actividad a lo largo del tiempo después de la infusión IV. Las concentraciones plasmáticas muestran una disminución inicial relativamente rápida durante las primeras 8 a 12 horas, seguida de una disminución más lenta. La actividad disminuye con el tiempo y cae por debajo del límite inferior del ensayo (12,6 mU/ml) después de aproximadamente 32 horas en el grupo de 50 mg/kg y más allá de las 48 horas en los grupos de 200 y 400 mg/kg. Los datos de actividad del grupo de dosis de 600 mg/kg a las 72 horas y más se excluyen del análisis porque los resultados aumentaron con el tiempo y no fueron consistentes entre los dos animales.
Las Figuras 93(A-B) a las Figuras 96(A-B) representan gráficamente la concentración y la actividad juntas para cada perro.
E n lo s g ru p o s d e d o s is d e 50 y 200 m g /k g (F ig u ra s 93 (A -B ) y 94 (A -D )) , la c o n c e n tra c ió n y la a c t iv id a d s ig u ie ro n p a tro n e s s im ila re s d u ra n te 8 a 12 h o ra s d e s p u é s d e la in fu s ió n y d e s p u é s la s c o n c e n tra c io n e s m o s tra ro n u n a te n d e n c ia a e s ta b il iz a rs e m ie n tra s q u e la a c t iv id a d c o n t in u ó su d is m in u c ió n h a s ta q u e c a y ó p o r d e b a jo d e l n iv e l d e l e n s a y o . E n lo s g ru p o s d e 400 y 600 m g /k g (F ig u ra s 95 (A -B ) y 96 (A -B )) , la a c t iv id a d p a re c ió c a e r a lg o m á s rá p id o q u e la c o n c e n tra c ió n co n in ic io in m e d ia ta m e n te d e s p u é s d e la in fu s ió n . L a s c u rv a s d e c o n c e n tra c ió n te n d ie ro n a e s ta b il iz a rs e m ie n tra s q u e la s c u rv a s d e a c t iv id a d d is m in u y e ro n m á s rá p id a m e n te h a s ta q u e c a y e ro n p o r d e b a jo de l lím ite d e l e n s a y o o, e n e l c a s o d e l g ru p o d e 600 m g /k g , s e e x c lu y e ro n d e l a n á lis is .
L o s re s u lta d o s d e l a n á lis is no c o m p a r t im e n ta l se m u e s tra n e n la T a b la 99 y la T a b la 100 p a ra lo s d a to s de c o n c e n tra c ió n y a c t iv id a d , re s p e c t iv a m e n te . L o s re s u lta d o s d e l a n á lis is no c o m p a r t im e n ta l in d ic a ro n q u e e l A U C 0-t e ra c a s i ta n g ra n d e c o m o A U C ü-» e n to d o s lo s c a s o s , lo q u e in d ic a q u e la d u ra c ió n d e l m u e s tre o fu e a d e c u a d a p a ra d e s c r ib ir lo s p e r f i le s fa rm a c o c in é tic o s y fa rm a c o d in á m ic o s . L a s F ig u ra s 97 (A -J ) y la s F ig u ra s 98 (A -J ) m u e s tra n la c o n c e n tra c ió n y la a c t iv id a d f re n te a l t ie m p o p a ra c a d a p e rro . L a p e n d ie n te te rm in a l e s t im a d a s e re p re s e n ta e n e s to s g rá f ic o s m e d ia n te u n a lín e a c o n tin u a . C a d a g rá f ic o c o n t ie n e a d e m á s in fo rm a c ió n re la c io n a d a c o n e l e s t im a d o d e la p e n d ie n te te rm in a l, lo q u e in c lu y e e l c o e f ic ie n te d e d e te rm in a c ió n (R s q y R s q _ a ju s ta d o ) , e l n ú m e ro d e p u n to s u s a d o s p a ra e s t im a r la p e n d ie n te y la t 1/2 te rm in a l (H L _ L a m b d a _ z ) .
C o n u n a e x c e p c ió n (e n e l g ru p o d e 200 m g /k g ), la c o n c e n tra c ió n p la s m á tic a y lo s n iv e le s d e a c t iv id a d fu e ro n m á s a lto s e n e l p r im e r p u n to te m p o ra l m e d id o (0 ,25 h). T a n to la c o n c e n tra c ió n c o m o la a c t iv id a d e s ta b a n re la c io n a d a s c o n la d o s is y e ra n a p ro x im a d a m e n te p ro p o rc io n a le s a la d o s is s e g ú n lo in d ic a d o p o r lo s e s t im a d o s d e C m áx/dosis y lo s p a rá m e tro s d e C L e n to d o s lo s g ru p o s d e d o s is . T a n to p o r la s m e d ic io n e s d e c o n c e n tra c ió n c o m o p o r la s de a c t iv id a d , e l C L p a re c ió s e r a lg o m á s rá p id o c o n la d o s is m á s b a ja . A la d o s is m á s b a ja , la s c o n c e n tra c io n e s y la a c t iv id a d c a y e ro n p o r d e b a jo d e lo s lím ite s d e l e n s a y o d e s p u é s d e 32 h o ra s , lo q u e lim ita p o s ib le m e n te la c a ra c te r iz a c ió n c o m p le ta d e la fa rm a c o c in é t ic a a e s ta d o s is . E l C L fu e s im ila r b a s a d o e n la s m e d ic io n e s d e c o n c e n tra c ió n en c o m p a ra c ió n co n la s m e d ic io n e s d e a c t iv id a d . L a s t 1/2 e s t im a d a s b a s a d o e n la s c o n c e n tra c io n e s fu e ro n m u c h o m á s la rg a s d e s p u é s d e la s d o s is d e 400 y 600 m g /k g (> 40 h o ra s ) e n c o m p a ra c ió n c o n e l g ru p o de 200 m g /k g (19 ,3 h o ra s ) y e l g ru p o d e 50 m g /k g (7 ,76 h o ra s ) . L a t 1/2 te rm in a l b a s a d a e n la a c t iv id a d fu e d e a p ro x im a d a m e n te 3 a 5 h o ra s y s im ila r en to d o s lo s g ru p o s d e d o s is .
L o s e s t im a d o s d e A U C y C L b a s a d o s e n lo s m o d e lo s c o in c id ie ro n m u y b ie n c o n la s d e r iv a d a s d e a n á lis is no c o m p a r t im e n ta le s . E l v o lu m e n a p a re n te d e d is tr ib u c ió n d e r iv a d o d e lo s m o d e lo s fu e a p ro x im a d a m e n te d e 90 a 120 m l/k g (m a y o r e n e l g ru p o d e d o s is b a ja ) b a s a d o e n la s c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s y d e 40 a 70 m l/k g b a s a d o e n la a c t iv id a d . L a t i / 2p e s t im a d a p o r lo s m o d e lo s p a ra la s m e d ic io n e s d e a c t iv id a d y d e p la s m a fu e ro n m u y s im ila re s a la t 1/2 te rm in a l e s t im a d a p o r a n á lis is n o c o m p a r t im e n ta l.
M R T e s un e s t im a d o d e l t ie m p o q u e u n a m o lé c u la d e fá rm a c o in d iv id u a l e s tá en c irc u la c ió n . L o s e s t im a d o s d e M R T fu e ro n c o n s is te n te s e n to d o s lo s g ru p o s d e d o s is b a s a d o e n la a c t iv id a d , a p ro x im a d a m e n te d e 4 a 7 h o ra s . B a s a d o e n la c o n c e n tra c ió n , la M R T fu e m á s p ro lo n g a d a co n la s d o s is m á s a lta s (a p ro x im a d a m e n te 25 h o ra s ) en c o m p a ra c ió n co n lo s g ru p o s d e 200 y 50 m g /k g (16 ,6 y 11 ,7 h o ra s , re s p e c t iv a m e n te ) .
L o s p a rá m e tro s c a lc u la d o s p a ra lo s d a to s d e c o n c e n tra c ió n y a c t iv id a d m e d ia n te a n á lis is n o c o m p a r t im e n ta le s se re s u m e n e n la s ta b la s m á s a b a jo . C o n la e x c e p c ió n d e l g ru p o d e d o s is d e 50 m g /k g e n e l q u e la c a ra c te r iz a c ió n d e la fa rm a c o c in é tic a p u e d e h a b e r e s ta d o lim ita d a p o r la s e n s ib il id a d d e l e n s a y o , e l a c la ra m ie n to p la s m á tic o fu e s im ila r e n to d o s lo s g ru p o s d e d o s is c u a n d o s e m id ió ta n to p o r la c o n c e n tra c ió n p la s m á tic a c o m o p o r la a c t iv id a d .
T a b la 99 - P a rá m e tro s fa rm a c o c in é tic o s m e d io s d e M O D -5014 b a s a d o s e n m e d ic io n e s d e c o n c e n tra c ió n d e s p u é s d e la in fu s ió n IV e n p e rro s e s t im a d o s m e d ia n te a n á lis is n o c o m p a r t im e n ta l
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T a b la 100 - P a rá m e tro s fa rm a c o c in é tic o s m e d io s d e M O D -5014 b a s a d o s e n la a c t iv id a d d e s p u é s d e la in fu s ió n IV en p e rro s e s t im a d o s m e d ia n te a n á lis is n o c o m p a r t im e n ta l
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Se informó anteriormente que, después de la administración de rhFVIIa a perros hemofílicos, su semivida basada en el nivel de antígeno FVIIa fue de 3 h, y basada en la actividad de 1,8 horas (Knudsen y otros, 2011, resumido más abajo en la Tabla 101).
Tabla 101
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La unión de CTP a FVIIa aumentó significativamente la semivida a 19,3-45 h y 4,72-5,22 basado en el antígeno y el nivel de actividad, respectivamente, lo que extiende por tanto la semivida del producto en un promedio de 3-5 veces en comparación con los datos informados. El aclaramiento se vio afectado de manera similar y se redujo significativamente en 2-3 veces en comparación con Knudsen y otros, 2011.
Análisis del tiempo de coagulación en sangre total (WBCT)
Los WBCT se probaron después de la recolección por FOBRL antes de la administración (es decir, valor inicial), 15 min, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, con el objetivo de monitorearlos hasta que se alcanzaran los valores iniciales. Como se presenta en la Tabla 102, el tiempo promedio de WBCT antes de la administración de todos los animales estuvo en realidad en el intervalo más bajo de WBCT previsto en perros hemofílicos (50-35 min).
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Caracterización de MOD-5014 en perros hemofílicos por caolín-tromboelastografía de sangre total (caolín-TEG WB) Los parámetros de caolín-TEG se monitorearon en puntos temporales designados después de la administración de MOD-5014 para todos los perros y en todas las dosis. Los objetivos de este análisis específico fueron caracterizar la cinética de TEG con el tiempo, evaluar la dosis mínima en la que se produjo la normalización de los diferentes parámetros (R, K, ángulo, MA) en los diferentes animales, la respuesta dependiente de la dosis entre los individuos y finalmente comparar el perfil de TEG general después de la administración de MOD-5014 con los datos publicados para rhFVIIa en un intervalo de dosis similar, así como también con los valores normales obtenidos en perros sanos (Knudsen y otros, 2011). Los datos individuales se proporcionan en las Figuras 101 (A-D), 102 (A-D), 103 (A-D), 104 (A-D), 105 (AD) y 106 (A-D).
Desempeño de caolín-TEG en sangre total de MOD-5014 después de la administración en diferentes dosis La dosis inicial de 50 mg/kg administrada a 2 perros no pudo mejorar significativamente el desempeño de TEG, como se refleja en los valores deficientes de R, K, ángulo y MA después de la administración (animal P14; Figuras 102 (A-D)), pero la mayoría de los parámetros mejoraron cuando se aumentó la dosis hasta 200 mg/kg. En el segundo animal (N06), los valores de TEG tampoco mejoraron después de la administración de 50 mg/kg de MOD-5014; esto podría ser una consecuencia de los valores de TEG parcialmente normalizados antes de la dosis, lo que potencialmente tuvo un efecto directo sobre la deficiente respuesta posterior a la administración, aunque no se observó ninguna mejoría posterior a la administración. Basado a lo anterior, se propuso que la dosis de 50 mg/kg no es adecuada para soportar y corregir el defecto hemostático en los perros evaluados.
La administración de 200 mg/kg de MOD-5014 en la mayoría de los animales corrigió los parámetros de TEG a valores que todavía están por debajo del intervalo normal, pero proporcionó un efecto que es significativamente más pronunciado que la dosis de 50 ug/kg. A una dosis de 400 mg/kg se obtuvo una ligera mejoría en los valores de TEG y una respuesta prolongada (Figuras 102 (A-D); 103 (A-D) y 104 (A-D)). Al administrar dos animales diferentes con 600 mg/kg, la respuesta en un animal (Joanie; Figura 105 (A-D)) fue comparable a los animales a los que se les administró una dosis de 400 mg/kg. Mientras que los valores de tiempo K, ángulo y MA en el animal N05 (Figura 106 (A-D)) alcanzaron el intervalo normal, esto también podría ser una consecuencia de la mejora de los valores antes de la dosis y la variabilidad entre animales. Parece que la administración de MOD-5014 en un intervalo de dosis permitió la corrección parcial de los valores de TEG, mientras que la dosis mínima efectiva óptima estaba en el intervalo de 200-400 mg/kg de MOD-5014.
Variabilidad intraanimales de la respuesta dependiente de la dosis de caolín-TEG en sangre total con MOD-5014 Se observó una mejora dependiente de la dosis intraanimal cuando se inyectó una dosis más alta al mismo animal. Se observó alguna variación en diferentes puntos temporales, que podría reflejar una variación biológica normal. (Figuras 101 (A-D), 102 (A-D), 103 (A-D), 104 (A-D), 105 (A-D) y 106 (A-D)).La mejora fue más pronunciada cuando se administraron las dosis de 200 y 400 mg/kg (Blondie y Josie), como se presenta en las Figuras 101 (A-D), 102 (A-D), 103 (A-D), 104 (A-D), 105 (A-D) y 106 (A-D).
Reproducibilidad de los resultados de caolín-TEG en sangre total de MOD-5014 entre individuos (variabilidad entre animales)
Como se observa en las Figuras 101 (A-D), 102 (A-D), 103 (A-D), 104 (A-D), 105 (A-D) y 106 (A-D), aunque los animales corrigieron los valores de TEG después de la administración de MOD-5014, demostraron diferentes perfiles durante el tiempo de medición. Esto podría ser el resultado de la variabilidad biológica, al considerar los diferentes antecedentes genéticos de cada animal y las ligeras diferencias en los valores anteriores a las dosis. La variación observada en realidad imita el entorno clínico, en el que los valores de TEG individuales pueden variar entre individuos que reciben dosis similares y, eventualmente, pueden traducirse en una eficacia y capacidad de control del sangrado diferentes del FVIIa.
MOD-5014 como producto de acción prolongada
La comparación de la capacidad de corrección de MOD-5014 y rhFVIIa sugiere que los valores máximo y mínimo de MOD-5014 son muy similares a los resultados informados para hFVIIa. Sin embargo, se observó una mejora marcada en la duración de la reacción con MOD-5014. Después de la administración de hFVIIa, la mayoría de los parámetros analizados de hFVIIa volvieron al valor inicial 4 horas después de la dosificación (Figuras 107(A-D)), mientras que MOD-5014 permite un efecto prolongado que alcanza los valores iniciales 24 horas después de la dosificación y proporciona una respuesta más sostenida y prolongada (Figuras 108(A-D); marcado con flechas negras). Los datos sugieren que la duración de la respuesta por TEG se correlaciona con el perfil de PKPD corto de FVIIa en perros hemofílicos, que se investigó más a fondo, lo que confirmó subsecuentemente la respuesta prolongada después de la administración de MOD-5014.
Desempeño del tiempo de tromboplastina activada parcial (aPTT)
Mediante el uso el reactivo Triniclot como activador y una incubación de 60 segundos, los valores de aPTT para el plasma canino con hemofilia A fueron de 65,6 segundos (datos no mostrados). Después de la administración de MOD-5014, el aPTT se redujo de una manera dependiente de la dosis hasta 40 s. Al comparar esta información con los datos reportados anteriormente, se encontró que era muy similar a los valores obtenidos antes y después de la administración de 193 mg/kg de rhFVIIa a un perro con deficiencia de FVIII (Brinkhous y otros, 1989), mientras que un análisis retrospectivo sugiere un efecto prolongado cuando se administra 200 mg/kg de MOD-5014, con un retorno subsecuente a los valores iniciales de aPTT 24 horas después de la administración.
Conclusiones: En este estudio, se evaluó la seguridad, la PK, la PD y la capacidad de corrección de la coagulopatía hemofílica de un nuevo FVIIa de acción prolongada (MOD-5014) en perros con deficiencia de FVIII. MOD-5014 se administró en dosis clínicas relevantes, mientras que la dosis mínima efectiva potencial en los perros se estableció inicialmente basado en un estudio ex vivo.
MOD-5014 se toleró bien por todos los perros y no se observaron efectos adversos. Se observó una respuesta dependiente de la dosis tanto en los análisis de PK como de PD (medición de la activación), lo que confirma aún más las propiedades de acción prolongada de MOD-5014 en comparación con los parámetros publicados (Knudsen y otros, 2011).
Se ha demostrado previamente que el FVIIa humano recombinante es eficaz en el tratamiento de sangrados en caninos hemofílicos. Se observó una marcada mejora del perfil de coagulación por TEG después de la administración de MOD-5014 a dosis de 200-400 mg/kg, mientras que una dosis más baja de 50 mg/kg no pudo corregir los valores de TEG, lo que sugiere que está por debajo de la dosis mínima efectiva en perros. Se observó una respuesta dependiente de la dosis después de la administración de MOD-5014, mientras que la variación interindividual fue mayor de lo esperado y podría ser una consecuencia de la variabilidad biológica. Al comparar el desempeño de MOD-5014 con los datos publicados, MOD-5014 tuvo un efecto pronunciado y prolongado a dosis más bajas (270 y 200 mg/kg, respectivamente). La actividad in vivo de MOD-5014 también se reflejó en una reducción en los valores de aPTT, lo que confirmó además una activación sostenida del sistema de coagulación.
En general, la evaluación de MOD-5014 en perros hemofílicos ofrece varias ventajas sobre los modelos de roedores tales como ratones y ratas. Los perros hemofílicos exhiben un fenotipo de enfermedad que se asemeja mucho al de los humanos; además, los perros son más comparables con los humanos en lo que respecta al peso corporal, así como también a los requisitos de administración de FVIIa y a las características farmacocinéticas.
En general, este estudio confirmó aún más la longevidad de MOD-5014 en un modelo relevante y bien establecido que se demostró anteriormente proporciona una recapitulación precisa de la biología humana, específicamente con respecto a la hemostasia. Los datos obtenidos en este estudio tienen un valor significativo y proporcionan la primera evidencia de que MOD-5014 es un FVIIa seguro y efectivo de acción prolongada en animales grandes que puede usarse potencialmente como agente tanto para el tratamiento profiláctico como para el tratamiento a demanda de pacientes hemofílicos con inhibidores. Por lo tanto, MOD-5014 tiene un enorme potencial para beneficiar significativamente a los pacientes al reducir la frecuencia de administración y permitir el uso profiláctico.
Ejemplo 15: Evaluación comparitiva del MOD-5014 y el potencial trombogénico recombinante de FVIIa tras una única adminstración en el modelo en conejo de Wessler
Objetivo: El objetivo de este estudio fue evaluar MOD-5014, que está destinado al tratamiento de pacientes con hemofilia A o B con inhibidores de FVIII o FIX, respectivamente. Otro objetivo de este estudio fue evaluar MOD-5014 para el tratamiento a demanda de sangrados espontáneos (por ejemplo, sangrado articular) con el objetivo de administraciones menos frecuentes, así como también para uso profiláctico con un régimen de dosificación previsto de dos a tres veces por semana que puede mejorar significativamente la condición clínica y la calidad de vida de los pacientes.
Otro objetivo de este estudio fue evaluar el potencial trombogénico del elemento de prueba MOD-5014 mediante el uso de un método semicuantitativo descrito por Wessler y otros (1959) Serum-induced thrombosis. Studies of its induction, and evolution under controlled conditions in vivo. Circulation Nov; 20:864-74; y Wesslet y otros (1959) Biologic assay of a thrombosis inducing activity in human serum. Journal of Applied Physiology 14, 943-946. Se hicieron comparaciones con un grupo de control negativo y un grupo de control positivo de FVIIa recombinante NovoSeven® a un nivel de dosis de 0,1 y 0,3 mg/kg.
Este estudio se realizó en conejos anestesiados.
Justificación: El propósito de este estudio fue evaluar el potencial trombogénico de MOD-5014. El modelo en conejo de Wessler es un modelo clásico para evaluar la trombosis venosa. La sensibilidad de este modelo se basa en 1) el alto potencial de hemostasia endógena del conejo con un nivel de factor de coagulación más alto que el de los humanos y 2) que la estasis venosa provoca un daño tisular enorme que proporciona una predisposición generalmente masiva a la formación de trombos, si se expone a factores activados (Wessler y otros (1959), Karges y otros (1994) Activity of coagulation and fibrinolysis parameters in animals. Arzneimittelforschung. Jun; 44(6):793-7). Novoseven se usó como control positivo basado en un estudio previo que exploró la trombogenicidad del FVIIa humano recombinante en un modelo de estasis de conejo (Diness y otros (1992) Recombinant human Factor VIIa (rFVIIa) in a rabbit stasis model. Thromb Res 67(2), 233-41).
Esquema del estudio: El control negativo, el control positivo y MOD-5014 se administraron una vez por vía intravenosa; esta es la vía de administración clínica.
Fundamentación de la selección de dosis: Los niveles de dosis se seleccionaron en base a los datos disponibles de un estudio de estasis en conejos que se llevó a cabo en Novoseven (Diness y otros (1992) Recombinant human Factor VIIa (rFVIIa) in a rabbit stasis model. Thromb Res 67(2), 233-41) y en consideración de las dosis previstas de MOD-5014 en el estudio clínico de fase 1-2a. La dosis baja es la dosis clínica baja formal en base a mg/kg y se aprobó por la FDA para su uso como una de las dosis bajas (50 mg/kg) en el estudio de fase 1-2a (ver el Ejemplo 16 más abajo). La dosis más alta es 400 mg/kg, la dosis clínica más alta prevista sobre una base de mg/kg en el estudio clínico de fase 1-2a.
Materiales y Métodos
Elementos de prueba: Descripción, identificación y almacenamiento
El artículo de prueba se identificó como MOD-5014, lote ER 1017295 (fecha de caducidad: abril de 2015) Cuando no estaba en uso, el artículo de prueba se almacenó en un contenedor sellado.
Condiciones de almacenamiento: Congelado (-60 a -90 °C).
El control negativo fue el vehículo para el artículo de prueba que se identificó como citrato 20 mM NaCl 150 mM glicina 13,3 mM pH 6,4.
Condiciones de almacenamiento: Refrigerado (2 a 8 °C).
El elemento de control positivo se identificó como NovoSeven.
Nombre: NovoSeven (referido como MOD-5000)
Núm. lote: 050115
Descripción/Apariencia: Líquido incoloro transparente congelado
Fecha de caducidad del vial de polvo: Agosto de 2016
Condiciones de almacenamiento: Congelado (-60 a -90 °C)
El agente anestésico se identificó como ketamina y xilazina.
Cuando no estaba en uso, el agente anestésico se almacenó en un contenedor sellado, a temperatura ambiente (nominalmente de 15 a 25 °C) y protegido de la luz.
Formulación de artículo de prueba (MOD-5014) y control positivo
Preparación
El artículo de prueba se descongeló durante 20-30 minutos en hielo. Cada día, antes del uso, se añadieron 4,8 ml de tampón de formulación a 3 ml del artículo de prueba (2,6 mg/ml) hasta una concentración final de 1 mg/ml. Se lograron diferentes dosis al alterar el volumen de la dosis.
NovoSeven se descongeló durante 20-30 minutos en hielo y se usó tal como se recibió. Se lograron diferentes dosis al alterar el volumen de la dosis.
Agentes anestésicos
Los agentes anestésicos se identificaron como ketamina y xilazina. Cuando no estaba en uso, el agente anestésico se almacenó en un contenedor sellado, a temperatura ambiente (nominalmente de 15 a 25 °C) y protegido de la luz. Animales de prueba
Se obtuvieron un total de 40 conejos machos Hsdlf:(NZW) (blanco de Nueva Zelanda) de Harlan UK. Los conejos pesaban entre 2,45 y 3,40 kg el día de la administración de las dosis.
Diseño experimental
La comida y el agua estuvieron disponibles libremente, excepto cuando los animales se sacaron de su caja para los procedimientos del estudio.
La anestesia se indujo y mantuvo mediante una inyección intramuscular de ketamina (40 mg/kg) más xilacina (5 mg/kg). Después de la inducción de la anestesia, los conejos se colocaron sobre una manta caliente. La temperatura se monitoreó con una sonda rectal y se mantuvo dentro de límites aceptables (nominalmente 35 a 39 °C).
Se afeitó el cuello ventralmente para facilitar la disección bilateral de las venas yugulares. Una vez localizadas las venas, se colocó una ligadura distal y una proximal a una distancia de entre 1 y 1,5 cm, pero sin ajustarlas.
El elemento de prueba, el control positivo o el vehículo se inyectaron en la vena contralateral de la oreja (a la primera yugular que se liga) mediante el uso de un volumen adaptado a la dosis (ver Tabla más abajo).
Los tratamientos empleados para el estudio se muestran en la Tabla 103 más abajo:
Tabla 103
Grupo Tratamiento Nivel de Volumen de Concentración de Animal dosis dosis dosis Números (mg/kg) (ml/kg) (mg/ml)
1 Control negativo - 0,15 - 5
2 MOD-5014 0,05 0,05 1,0 5
3 MOD-5014 0,1 0,10 1,0 5
4 MOD-5014 0,2 0,20 1,0 5
5 MOD-5014 0,3 0,30 1,0 5
6 MOD-5014 0,4 0,40 1,0 5
7 NovoSeven 0,1 0,11 0,943 5
8 NovoSeven 0,3 0,32 0,943 5
Inmediatamente después de la administración de la dosis, se aisló de la circulación el extremo proximal de la vena yugular apropiada al ajustar la ligadura. Esto se repitió después en la vena yugular restante. Después de 25 segundos se ajustaron ambas ligaduras distales. Diez minutos después de ajustar, un segmento de la vena (este se mantuvo igual para todos los animales) se retiró cuidadosamente del animal, se transfirió a una placa de Petri que contenía una solución de citrato de sodio al 3,8 % y se abrió. La formación de trombos se evaluó como se describe más abajo en la Tabla 104. Este procedimiento se repitió después en la vena yugular restante 30 minutos después de ajustar.
Tabla 104
Grado de formación de trombos Puntuación Sangre líquida sin trombos 0
Pocos trombos pequeños 0,5 a 1
Varios trombos de tamaño mediano o muchos trombos pequeños 2
Mayor número de trombos de tamaño mediano 3
Pocos trombos más grandes 3,5
Un trombo más grande 4
Análisis estadístico
Se proporcionaron para el análisis las puntuaciones de formación de trombos después de 10 y 30 minutos. Los datos en cada punto temporal se analizaron por separado.
Las siguientes comparaciones de interés se realizaron mediante el uso de una prueba de suma de rangos de Wilcoxon:
Grupo 1 frente a Grupos 2 a 8
Grupo 3 frente a Grupo 7
Grupo 5 frente a Grupo 8
Resultados
Los resultados se resumen en la Tabla 105, los datos de animales individuales se presentan en la Tabla 106.
Tabla 105: Resumen de la evaluación de la trombogenicidad después de la administración intravenosa de MOD-5014 y NovoSeven
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Tabla 106: Evaluación de la trombogenicidad después de la administración intravenosa de MOD-5014 y NovoSeven - datos de animales individuales
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Puntuación de Wessler
La administración intravenosa del control negativo produjo una puntuación de Wessler de 0,0 después de 10 minutos. La puntuación varió entre 0,0 y 0,5 con una puntuación media de 0,2 ± 0,27 después de 30 minutos.
La administración intravenosa de MOD-5014 a un nivel de dosis de 0,05 mg/kg produjo puntuaciones de Wessler en el intervalo de 0,0 a 0,5 con una puntuación media del grupo de 0,1 ± 0,22 después de 10 minutos. La puntuación varió entre 2,0 y 3,5 con una puntuación media de 3,4 ± 0,82 después de 30 minutos.
La administración intravenosa de MOD-5014 a un nivel de dosis de 0,1 mg/kg produjo puntuaciones de Wessler en el intervalo de 0,0 a 0,5 con una puntuación media del grupo de 0,1 ± 0,22 después de 10 minutos. La puntuación varió entre 2,0 y 4,0 con una puntuación media de 3,5 ± 0,87 después de 30 minutos.
La administración intravenosa de MOD-5014 a un nivel de dosis de 0,2 mg/kg produjo puntuaciones de Wessler en el intervalo de 0,0 a 1,0 con una puntuación media del grupo de 0,2 ± 0,45 después de 10 minutos. La puntuación varió entre 3,0 y 4,0 con una puntuación media de 3,8 ± 0,45 después de 30 minutos.
La administración intravenosa de MOD-5014 a un nivel de dosis de 0,3 mg/kg produjo puntuaciones de Wessler en el intervalo de 0,0 a 2,0 con una puntuación media del grupo de 0,6 ± 0,89 después de 10 minutos. Después de 30 minutos, todas las puntuaciones fueron de 4,0.
La administración intravenosa de MOD-5014 a un nivel de dosis de 0,4 mg/kg produjo puntuaciones de Wessler en el intervalo de 0,0 a 1,0 con una puntuación media del grupo de 0,3 ± 0,45 después de 10 minutos. La puntuación varió entre 2,0 y 4,0 con una puntuación media de 3,6 ± 0,89 después de 30 minutos.
La administración intravenosa de NovoSeven a un nivel de dosis de 0,1 mg/kg produjo puntuaciones de Wessler en el intervalo de 0,0 a 0,5 con una puntuación media del grupo de 0,1 ± 0,22 después de 10 minutos. La puntuación varió entre 2,0 y 4,0 con una puntuación media de 3,5 ± 0,87 después de 30 minutos.
La administración intravenosa de NovoSeven a un nivel de dosis de 0,3 mg/kg produjo puntuaciones de Wessler en el intervalo de 0,0 a 2,0 con una puntuación media del grupo de 0,5 ± 0,87 después de 10 minutos. La puntuación varió entre 3,0 y 4,0 con una puntuación media de 3,8 ± 0,45 después de 30 minutos.
Resultados del análisis estadístico, Tabla 107
Tabla 107
Variable Comparación por pares Método Valor de
P
Puntuación de formación de trombos después de 10 minutos Grupo W 1,0000
1M frente a Grupo 2M
Grupo 1M frente a Grupo W 1,0000
3M
Grupo 1M frente a Grupo W 1,0000
4M
Grupo 1M frente a Grupo W 0,4444
5M
Grupo 1M frente a Grupo W 0,4444
6M
Grupo 1M frente a Grupo W 1,0000
1M
Grupo 1M frente a Grupo W 0,4444
8M
Grupo 3M frente a Grupo W 1,0000
7M
Grupo 5M frente a Grupo W 1,0000
8M
Puntuación de formación de trombos después de 30 minutos Grupo W 0,0079**
1M frente a Grupo 2M
Grupo 1M frente a Grupo W 0,0079**
3M
Grupo 1M frente a Grupo W 0,0079**
4M
Grupo 1M frente a Grupo W 0,0079**
5M
Grupo 1M frente a Grupo W 0,0079**
6M
Grupo 1M frente a Grupo W 0,0079**
7M
Grupo 1M frente a Grupo W 0,0079**
8M
Grupo 3M frente a Grupo W 1,0000
7M
Grupo 5M frente a Grupo W 1,0000
8M
*P<0,05
**P<0,01
***P<0,001
W= Prueba de suma de rangos de Wilcoxon
El análisis estadístico muestra que la formación de trombos después de 10 minutos es comparable para todos los grupos. Sin embargo, el análisis muestra que después de 30 minutos, la administración de MOD-5014 a todos los niveles de dosis produjo un efecto estadísticamente significativo sobre la formación de trombos en comparación con el control negativo.
La administración de MOD-5014 a un nivel de dosis de 0,1 y 0,3 mg/kg no produjo una diferencia estadísticamente significativa en la formación de trombos en comparación con NovoSeven a los mismos niveles de dosis.
Conclusión
La administración de MOD-5014 a un nivel de dosis de 0,1 y 0,3 mg/kg y NovoSeven al mismo intervalo de dosis en el conejo anestesiado produjo puntuaciones de Wessler que fueron comparables y, por lo tanto, con un potencial trombogénico similar.
Ejemplo 16: Un estudio de fase 1/2a, abierto, multicéntrico, de escalado de dosis para evaluar el perfil de seguridad, farmacocinética y farmacodinamia de un factor VIIa recombinante de larga acción (MOD-5014) en hombres adultos con hemofilia A o B
Objetivos:
Primario: Evaluar la seguridad y tolerabilidad aguda de la administración intravenosa (IV) única de dosis crecientes de MOD-5014 en sujetos hemofílicos con y sin inhibidores.
Secundario: Evaluar el perfil farmacocinético de la administración intravenosa única de dosis crecientes de MOD-5014 en sujetos hemofílicos con y sin inhibidores.
Exploratorio: Evaluar la respuesta farmacodinámica de la administración intravenosa única de dosis crecientes de MOD-5014 en sujetos hemofílicos con y sin inhibidores.
Diseño y procedimientos del estudio
Este será un estudio de dosis única, abierto y de aumento gradual de las dosis. El estudio se realizará en dos etapas, cada etapa tendrá un diseño similar (visitas y evaluaciones):
Etapa 1: Esta etapa incluirá tres grupos de dosis crecientes, con cuatro sujetos en cada grupo de dosis. La dosis inicial de MOD-5014 será de 25 mg/kg seguida de dosis de 50 y 100 mg/kg. El primer sujeto en cada cohorte de dosis recibirá una única inyección IV seguida de un período de observación de seguridad de 72 horas antes de administrar la dosis a los tres sujetos restantes de esa cohorte. La administración de la dosis del último sujeto de cada cohorte será seguida por un período de observación de seguridad de 7, 14 y 30 días. Los datos de la Etapa 1 se enviarán a la FDA antes del inicio de la Etapa 2. Solo después de la aprobación para continuar del DSMB y la notificación al IRB, se iniciará la inscripción en la Etapa 2.
Etapa 2: Esta etapa tendrá un diseño similar a la Etapa 1 e incluirá tres grupos de dosis crecientes para evaluar dosis más altas que las evaluadas en la Etapa 1. Las dosis a evaluar en la Etapa 2 incluyen 200, 300 y 400 mg/kg de MOD-5014, con 4 sujetos en cada grupo de dosis.
Para cada etapa del estudio, DSMB tomará la decisión de pasar al nivel de dosis más alto después de revisar los datos de seguridad relevantes (lo que incluye los eventos adversos, el laboratorio clínico y los signos vitales), recolectados hasta 7 días, incluido este, después de la dosis del último sujeto del grupo de dosis anterior.
Se usarán las directrices de Criterios de terminología común para los eventos adversos (CTCAE) para determinar la dosis máxima tolerada (MTD) y la toxicidad limitante de la dosis (DLT) (Tabla 108). Se permitirá el aumento gradual de la dosis si la dosis anterior se tolera bien y no existen problemas de seguridad o tolerabilidad durante los 7 días posteriores a la administración.
Reglas de interrupción y toxicidades que limitan la dosis (DLT)
La DLT se define como un evento adverso clínicamente significativo o un valor de laboratorio anormal evaluado como no relacionado con la progresión de la enfermedad, enfermedad intercurrente o medicamentos concomitantes y que se produce hasta 7 días después del día de la administración. Por ejemplo, grado 3 o 4, que está definitiva o posiblemente relacionado con las drogas. En caso de que se notifique un evento tromoembólico, el estudio se detendrá y se solicitará al DSMB que investigue más el evento y su relación con la administración de la dosis única de MOD-5014. La Tabla 108 resume los criterios de aumento gradual de la dosis y el árbol de decisiones.
Tabla 108: Esquema de criterios de aumento gradual de la dosis y toxicidad relacionada con MOD-5014
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Procedimientos de estudio
Cada etapa del estudio estará compuesta por un período de tamizaje (28 ± 1 días), un día de tratamiento y un período de seguimiento (7, 14 y 30 días). Para cada etapa del estudio y grupo de dosis, la programación de las visitas y las evaluaciones serán similares.
Período de detección (día -28 a -1) - Visita 1
Después de firmar el consentimiento informado, los sujetos varones adultos de 18-65 años de edad, que se hayan diagnosticado con hemofilia A o B congénita moderada o grave, se evaluarán para la elegibilidad al estudio mediante la evaluación de los criterios de inclusión y exclusión. Los procedimientos de tamizaje incluirán una recolección de datos demográficos, historial médico completo y relacionado con la enfermedad, examen físico (lo que incluye evaluaciones neurológicas, altura y peso), signos vitales (presión arterial, frecuencia del pulso, temperatura oral y frecuencia respiratoria), ECG, eventos adversos, medicamentos concomitantes y evaluaciones de laboratorio de seguridad lo que incluye hematología, bioquímica, análisis de orina, coagulación (tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina activada parcial (aPTTa)).
Día antes de la dosificación (día -1)
Los sujetos elegibles se contactarán por teléfono la noche anterior a la administración de la dosis para confirmar que: Los sujetos no han recibido terapia de reemplazo como se describe más abajo (Tabla 109). Se tomará en consideración el tiempo de la llamada telefónica con respecto a las restricciones de tiempo que se describen más abajo. Si tienen un episodio de sangrado durante esa noche y se les administra la terapia de reemplazo, no deben venir a la clínica a la mañana siguiente, sino llamar a su persona de contacto del estudio.
Tabla 109: Terapia de reemplazo prohibida antes de la administración de la dosis
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Día de tratamiento (día 0) - Visita 2
Antes de la dosis
En la clínica, se realizarán las siguientes evaluaciones y procedimientos antes de la administración de las dosis: examen físico (lo que incluye evaluaciones neurológicas), signos vitales, electrocardiograma (ECG), laboratorio de seguridad (hematología, bioquímica y análisis de orina), PT, aPTT dentro de 1 hora antes de la dosis a, inmunogenicidad, farmacocinética (dentro de 1 hora antes de la dosis) b, farmacodinamia (actividad de FVIIa a través del ensayo STAClot), tromboelastografía (dentro de 1 hora antes de la dosis), generación de trombina (dentro de 1 hora antes de la dosis), eventos adversos y medicaciones concomitantes.
Administración de las dosis
Los sujetos recibirán una única inyección intravenosa basada en el peso y la dosis de MOD-5014 (definida por la cohorte de dosis).
Posterior a la dosis
Las siguientes evaluaciones y procedimientos se realizarán el día 0, en los puntos temporales posteriores a la dosificación, como se indica:
Signos vitales (presión arterial, pulso, frecuencia respiratoria, temperatura) a 1 ± 0,5 horas, 4 ± 0,5 horas y 8 horas ± 0,5 horas
• ECG a 1 ± 0,5 horas, 4 ± 0,5 horas y 8 ± 0,5 horas
• Evaluaciones de laboratorio de seguridad (hematología, bioquímica y análisis de orina) a las 4 ± 0,5 horas • Panel de coagulación a 30 ± 5 minutos, 2 horas ± 20 minutos, 4 ± 0,5 horas y 8 ± 1 horas
• Farmacocinética a 30 ± 5 minutos, 2 horas ± 20 minutos, 4 ± 0,5 horas y 8 ± 1 horas
• Farmacodinamia a 30 ± 5 minutos, 2 horas ± 20 minutos, 4 ± 0,5 horas y 8 ± 1 horas. Los ensayos incluyen:
o Actividad de FVIIa mediante ensayo STAClot
o Tromboelastografía (opcional)
o Generación de trombina
• Medicaciones concomitantes
• Reacción cutánea local en el lugar de administración a los 10 minutos y 2 horas ± 20 minutos después del final de la administración IV
• Eventos adversos
Período de seguimiento (FU) (visitas 3 a 8, día 1 a 30)
El período de seguimiento comenzará el día después de la administración. Los sujetos se siguen durante 30 días después de la dosis y se someten a seis visitas de seguimiento como se indica más abajo. En la visita de FU 3/día 1 (24 horas), la visita de FU 4/día 2 (48 horas) y la visita de FU 5/día 3 (72 horas) se realiza lo siguiente: examen físico (lo que incluye evaluaciones neurológicas) (solo visita 3 y 5), signos vitales, ECG, laboratorio de seguridad (hematología, bioquímica y análisis de orina), panel de coagulación (una única extracción de sangre), farmacocinética (una única extracción de sangre), farmacodinamia (una única extracción de sangre), tromboelastografía, generación de trombina, eventos adversos, reacciones cutáneas locales y medicamentos concomitantes. Si se administró medicación de rescate dentro de las primeras 72 horas, solo se realiza la Visita de FU 5.
Los siguientes procedimientos de estudio se realizarán en la visita de FU 6 / día 7 si no se administró tratamiento de rescate para episodios de sangrado: examen físico (lo que incluye evaluaciones neurológicas), signos vitales, ECG, laboratorio de seguridad (hematología, bioquímica y análisis de orina), panel de coagulación, farmacocinética, farmacodinamia, tromboelastografía, generación de trombina, eventos adversos y medicación concomitante. En el caso de que se produjera un episodio de sangrado después de las primeras 72 horas y se administrara tratamiento de rescate, se completa un cuestionario telefónico sobre el bienestar clínico del paciente.
Visitas de FU 7-8, días 14 y 30 (visita de finalización)
En estas visitas se realizarán los siguientes procedimientos del estudio: inmunogenicidad, anticuerpos anti-HCP (solo en la visita 8), eventos adversos y medicamentos concomitantes.
Duración del estudio
La duración del estudio para cada sujeto participante es de hasta 58 días de la siguiente manera:
• Período de tamizaje: -28 a -1 días antes de la administración del fármaco
• Tratamiento: administración de dosis única el día 1
• Seguimiento: al menos 72 horas de seguridad aguda, 7 días de seguridad y 14 y 30 días de inmunogenicidad Tamaño de muestra y población objetivo
Veinticuatro (24) sujetos varones adultos (de 18-65 años de edad), 12 sujetos en cada fase del estudio, diagnosticados con hemofilia A o B congénita moderada o grave. Cada grupo de dosis incluye 4 sujetos.
Criterios de inclusión
Los sujetos deben cumplir con todos los criterios de inclusión para ser elegibles para el estudio:
1. Hombres, 18-65 años de edad, incluido estos, en la visita de tamizaje.
2. Diagnóstico de hemofilia A o B congénita moderada o grave con o sin inhibidores, definida como menor o igual al 3 % de los niveles normales de FVIII o FIX, respectivamente.
3. Índice de masa corporal (IMC) inferior a 35,0 kg/m2.
4. Acceso venoso adecuado.
5. Los hombres fértiles deben aceptar usar un anticonceptivo de barrera (condón) durante 90 días después de la administración de la dosis y no pueden donar esperma durante el estudio y durante 90 días después de la dosis.
Ruta del producto en investigación y forma de dosificación
MOD-5014, un Factor VIIa recombinante modificado de acción prolongada, se suministra en viales de vidrio que contienen una solución transparente de 1 mg/ml de MOD-5014 en tampón citrato.
Los viales congelados se descongelarán el día de la administración a temperatura ambiente 2 horas antes de la preparación de la dosis. Los viales descongelados se introducen en una o más jeringas (en dependencia de la cantidad de IP para inyección). Las instrucciones detalladas de manipulación y administración se proporcionan en un documento de "Instrucciones de uso".
Se planean seis grupos de dosis (tres en cada etapa); los sujetos en cada etapa y grupo de dosis reciben una sola administración de MOD-5014 como una inyección IV basada en el peso corporal del sujeto (ver un ejemplo de dosis a administrar en la Tabla 110)
T a b la 110 : E je m p lo d e d o s is d e M O D -5014 y d u ra c ió n c a lc u la d a d e la in y e c c ió n
Figure imgf000128_0001
M e d ic a c ió n d e re s c a te
E n c a s o d e q u e un s u je to e x p e r im e n te un e p is o d io d e s a n g ra d o d u ra n te e l p e r ío d o d e e s tu d io (d e n tro d e lo s 30 d ía s p o s te r io re s a la s e v a lu a c io n e s d e la d o s is ), s e le t ra ta rá d e a c u e rd o co n la s p rá c t ic a s h a b itu a le s d e l h o s p ita l y su e s ta d o c lín ic o .
C r ite r io s d e v a lo ra c ió n d e s e g u r id a d (p r in c ip a le s )
E l c r ite r io d e v a lo ra c ió n p r in c ip a l d e s e g u r id a d c o n s is t irá e n e l m o n ito re o y re g is tro :
1. E v e n to s a d v e rs o s y u s o d e m e d ic a c ió n c o n c o m ita n te d u ra n te to d o e l e s tu d io
2. In m u n o g e n ic id a d , s in a p a r ic ió n d e a n t ic u e rp o s n e u tra liz a n te s
3. E C G , c o n s ta n te s v ita le s , e x p lo ra c ió n f ís ic a ( lo q u e in c lu y e e v a lu a c io n e s n e u ro ló g ic a s ) .
4. P a rá m e tro s d e la b o ra to r io , in c lu y e e l p e rfil q u ím ic o s é r ic o , e n z im a s h e p á tic a s , h e m a to lo g ía , p a n e l d e c o a g u la c ió n ( t ie m p o d e T P , a P T T , t ro m b in a y c o m p le jo a n tit ro m b in a , f ra g m e n to d e p ro tro m b in a 1+ 2 , d ím e ro D ) y a n á lis is d e o r in a
5. T o le ra b il id a d lo c a l ( re a c c ió n en e l s it io d e la in y e c c ió n )
C r ite r io s d e v a lo ra c ió n fa rm a c o c in é tic o s (P K ) (s e c u n d a r io s )
L a re s p u e s ta P K s e e v a lú a d e s p u é s d e u n a ú n ic a in y e c c ió n m e d ia n te la m e d ic ió n d e la c o n c e n tra c ió n p la s m á t ic a d e M O D -5014 , c o m o
m e d id a m e d ia n te un e n s a y o E L IS A e s p e c íf ic o . S e c a lc u la n lo s s ig u ie n te s p a rá m e tro s : C m á x , A U C , s e m iv id a te rm in a l, V ss ,
a c la ra m ie n to , re c u p e ra c ió n y T m á x .
C m á x - c o n c e n tra c ió n p la s m á tic a m á x im a d e M O D -5014
T m á x - t ie m p o h a s ta C m á x
T la g - t ie m p o d e re ta rd o d e a b s o rc ió n p a ra M O D -5014
A U C - á re a b a jo la c u rv a h a s ta la c o n c e n tra c ió n f in a l > lím ite d e c u a n tif ic a c ió n (L O Q ), A U C (0 - t ) y h a s ta e l in fin ito A U C in f
Az - c o n s ta n te d e v e lo c id a d d e e lim in a c ió n
t 1/2 - s e m iv id a
V s s - v o lu m e n en e s ta d o e s ta c io n a r io , a c la ra m ie n to y re c u p e ra c ió n
L o s t ie m p o s d e m u e s tre o d e P K s o n e l d ía 0 (d e n tro d e 1 h o ra a n te s d e la d o s is ). T o d a s la s m e d ic io n e s p o s te r io re s a la in y e c c ió n s e in ic ia rá n a l f in a l d e la a d m in is tra c ió n IV: 30 ± 5 m in u to s , 2 h o ra s ± 20 m in u to s , 4 ± 0 ,5 h o ra s 8 ± 1 h o ra s , 24 ± 2 h o ra s (D ía 1), 48 ± 3 h o ra s (D ía 2 ), 72 ± 3 h o ra s (D ía 3 ) y e n e l D ía 7 d e s p u é s d e la d o s is .
C r ite r io s d e v a lo ra c ió n fa rm a c o d in á m ic o s (P D ) (e x p lo ra to r io s )
L a fa rm a c o d in a m ia s e e v a lú a p o r la a c t iv id a d d e F V IIa m e d ia n te e l e n s a y o S T A C lo t. L a P D s e m id e e n lo s s ig u ie n te s puntos temporales: Día 0 (dentro de 1 hora antes de la dosis). Todas las mediciones posteriores a la inyección se inician al final de la administración intravenosa: 30 ± 5 minutos, 2 horas ± 20 minutos, 4 ± 0,5 horas 8 ± 1 horas, 24 ± 2 horas (Día 1), 48 ± 3 horas (Día 2), 72 ± 3 horas (día 3) y en el Día 7 después de la dosis. Se realiza un bioanálisis.
Métodos estadísticos
Las estadísticas descriptivas se usan para resumir los datos demográficos, las características iniciales, la seguridad y los datos de PK/PD, lo que incluye el tamaño de muestra (n), la media y la desviación estándar.
Se realiza una revisión de los datos de seguridad, farmacocinética y farmacocinética para cada grupo de dosis en la etapa 1.
Ejemplo 17: Estudios de toxicologia
Evaluación integral de la seguridad y eficacia del factor VIIa-CTP fase que respalda un estudio fase 1/2a Objetivo
El objetivo de estos estudios fue evaluar la seguridad, PK y PD de FVIIa-CTP después de la administración a ratas y monos como parte de los estudios toxicológicos que respaldan el estudio de fase 1/2a en curso en pacientes hemofílicos.
Métodos
El FVII-CTP se expresó en células CHO, se purificó y se activó mediante el uso de un proceso de purificación específico de CTP.
El lote GMP se usó en los estudios toxicológicos evaluados en ratas macho y monos con el respaldo de un análisis toxicocinético que confirmó los márgenes adecuados por encima de la dosis clínica inicial en el estudio FIH.
Estudios (Un resumen de los estudios realizados se presenta más abajo en la Tabla 111)
Estudio GLP de toxicocinética agudo del MOD-5014: Un estudio de toxicidad y PK/PD de dosis única intravenosa en monos cynomolgus machos:
El estudio en monos Cynomolgus machos fue un estudio de toxicología de dosis única que cumplía con las GLP para evaluar y caracterizar la toxicidad aguda, estimar la dosis máxima tolerada (MTD) y evaluar la toxicocinética del MOD-5014 en monos cynomolgus machos.
Diseño del estudio
Se obtuvieron veintiséis monos cynomolgus machos (2 a 4 kg), de aproximadamente 2 a 4 años de edad, de Covance Reseach Products, Inc. Se asignaron veinticuatro a los grupos de tratamiento de acuerdo con la Tabla 1. Métodos
Los animales recibieron una única inyección en bolo IV lento (2 a 3 minutos) en la vena safena de MOD-5014 (núm. lote ER 1017295, 2,6 mg/ml). Se recolectaron muestras de sangre de la vena femoral en tubos que contenían tampón citrato. Se recolectaron muestras de todos los animales antes de la administración de la dosis y a 0,25, 0,5, 2, 4, 6, 8, 12 y 24. Se recolectaron muestras adicionales de los animales de recuperación a las 48, 60 y 72 horas después de la administración de la dosis. Se recolectaron todas las muestras de los animales del grupo de control (Grupo 1) pero solo se analizaron las muestras de 0,5 horas. Las concentraciones plasmáticas de MOD-5014 se determinaron mediante un ELISA validado (Informe de validación bioanalítica AR5437) en Intertek Pharmaceutical Services (San Diego, CA). La actividad de MOD-5014 se determinó en un ensayo de coagulación calificado (STAGO) (Informe de calificación CD-05-0276) en OPKO Biologics, Israel.
Análisis de Datos
Se realizó un análisis no compartimental sobre los datos de los animales individuales con Phoenix WinNonlin versión 6.3 (Pharsight Corporation, Sunnyvale, CA). El análisis se realizó sobre los datos de concentración plasmática de MOD-5014 así como también sobre los datos de actividad de coagulación al asumir una actividad específica inicial de 15563 unidades/mg (MOD-5014 ER#1017295 Release SUM). Se usó un programa de administración por bolo intravenoso.
Para el análisis de la concentración plasmática, se estimó el área bajo la curva desde el tiempo cero hasta las 24 horas (AUC0-24h) mediante el método trapezoidal. La concentración máxima (Cmáx) y el tiempo en que se observó (Tmáx) se determinaron directamente a partir de los datos. La concentración plasmática en el tiempo cero (C0) se estimó por extrapolación inversa mediante los dos primeros puntos temporales. El volumen de distribución aparente inicial (Vi) se calculó a partir de la siguiente ecuación:
Vi = Dosis / C0
P a ra lo s a n im a le s e n lo s g ru p o s d e re c u p e ra c ió n , s e d is p u s o d e d a to s a d ic io n a le s p a ra lo s p u n to s te m p o ra le s d e 48 , 60 y 72 h o ra s . E l p e rfil d e e s to s p u n to s te m p o ra le s a d ic io n a le s d e m o s tró u n a fa s e te rm in a l m á s p la n a q u e n o se o b s e rv ó e n lo s p e r f i le s d e lo s a n im a le s te rm in a d o s a la s 24 h o ra s . P o r lo ta n to , la s p e n d ie n te s te rm in a le s y los p a rá m e tro s re la c io n a d o s s o lo s e e s t im a ro n a p a r t ir d e lo s a n im a le s d e re c u p e ra c ió n y no d e lo s te rm in a d o s a la s 24 h o ra s . A u n q u e e s to s ig n if ic a q u e la s p e n d ie n te s te rm in a le s y lo s p a rá m e tro s re la c io n a d o s s e e s t im a ro n s o lo a p a r t ir d e 2 a n im a le s p o r g ru p o , lo s e s t im a d o s re s u lta n te s a ú n d e s c r ib e n lo s p e r f i le s d e P K m e jo r q u e lo s e s t im a d o s b a s a d a s e n d a to s d e s o lo 24 h o ra s .
P a ra lo s a n im a le s d e re c u p e ra c ió n , s e u s ó u n a re g re s ió n lo g - l in e a l e n lo s ú lt im o s tre s p u n to s te m p o ra le s p a ra e s t im a r la c o n s ta n te d e v e lo c id a d d e e lim in a c ió n (A) q u e s e u só p a ra e s t im a r la s e m iv id a te rm in a l (t 1/2) y e l A U C d e c e ro a in f in ito (A U C 0-~) d e la s s ig u ie n te s e c u a c io n e s :
T i n = ln ( 2 ) /A
AUC0_„ =AUC0_24ti C24t/A
d o n d e C24h e s la c o n c e n tra c ió n a la s 24 h. E l a c la ra m ie n to s é r ic o (C L ) s e c a lc u ló a p a r t ir d e la d o s is d iv id id a p o r e l A U C 0-~. E l v o lu m e n e n la fa s e te rm in a l (V z ) y en e s ta d o e s ta c io n a r io (V s s ) s e c a lc u la ro n a p a r t ir d e la s s ig u ie n te s e c u a c io n e s :
Vss = Dosis * AUMC/AUC2
Vz= CL/A
D o n d e A U M C e s e l á re a b a jo la c u rv a d e l p r im e r m o m e n to .
P a ra e l a n á lis is d e lo s d a to s d e la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n , la p e n d ie n te te rm in a l m á s p la n a e n lo s p u n to s te m p o ra le s p o s te r io re s n o e s e v id e n te . P o r lo ta n to , s e e s t im a ro n la s p e n d ie n te s te rm in a le s d e to d o s lo s a n im a le s m e d ia n te re g re s ió n lo g - l in e a l m e d ia n te lo s ú lt im o s t re s o m á s p u n to s te m p o ra le s y s e c a lc u la ro n lo s p a rá m e tro s re la c io n a d o s c o m o s e d e s c r ib ió a n te r io rm e n te .
U n re s u m e n d e to d o s lo s e s tu d io s c o m p le ta d o s s e d e s c r ib e e n la T a b la 111 m á s a b a jo :
Figure imgf000131_0001
Resultados
Ratas Sprague Dawley: Todos los animales se encontraban en buen estado clínico. La única observación clínica detallada observada dentro de los animales del estudio principal que se consideró relacionada con el artículo de prueba (relacionada con MOD-5014) se observó en un animal de 9 mg/kg con decoloración púrpura o roja de la cola. Se observaron cambios reversibles relacionados con el artículo de prueba en la patología clínica en los animales del estudio principal que incluyeron reducciones leves en el tiempo de protrombina en todos los grupos con artículo de prueba. (Figura 110, Tablas 112 y 113)
Tabla 112: Rata MOD-5014 Parámetros farmacocinéticos basados en la concentración plasmática después de la inyección por bolo IV estimados mediante análisis no compartimental Dosis Cmáx Tmáx AUC0-t T1/2
(mg/kg) (ng/ml) (h) (h*ng/ml) (h)
1 10700 0,50 72200 7,8
3 24700 0,50 154000 15,8
9 102000 0,50 529000 7,9
21 190000 0,50 1110000 7,5
Tabla 113: Rata MOD-5014 Parámetros farmacodinámicos basados en la concentración plasmática después de la inyección en bolo IV estimada mediante análisis no compartimental Dosis Cmáx Tmáx AUC0-t T1/2
(mg/kg) (mu/ml) (h) (h*mu/ml) (h)
1 155000 0,50 825000 5,3
3 606000 0,50 2 200000 6,7
9 1660000 0,50 5 330000 5,17
21 3200000 0,50 13400000 5,8
No hubo hallazgos macroscópicos relacionados con el artículo de prueba o cambios en el peso de órganos en los animales del estudio principal en las necropsias terminales o de recuperación.
Estudios no GLP y GLP de monos Cynomolgus:
Todos los animales se encontraban en buen estado clínico, la administración de una dosis única de MOD-5014 por vía intravenosa a monos cynomolgus machos produjo disminuciones en el tiempo de protrombina y antitrombina III, y un aumento en el dímero D a dosis de 7,5 y 15 mg/kg. (Figura 111, Tablas 114, 115, 116, 117) Estos cambios eran indicativos de un estado protrombótico, que es consistente con el mecanismo de acción pretendido del fármaco. Tabla 114: Mono MOD-5014 Parámetros farmacocinéticos basados en la concentración plasmática después de la inyección en bolo IV estimados por análisis no compartimental (el estudio no GLP) Dosis Cmáx AUC0-»
(mg/kg) (ng/ml) (h*ng/ml) T1/2 (h)
1 14300 48800 29,0
3 41200 150000 29,5
9 153000 536000 15,3
T a b la 115 : M ono M O D -5014 P a rá m e tro s fa rm a c o d in á m ic o s b a s a d o s e n la c o n c e n tra c ió n p la s m á tic a d e s p u é s d e la in y e c c ió n e n b o lo IV e s t im a d o s p o r a n á lis is n o c o m p a r t im e n ta l (e l e s tu d io n o G L P )
Dosis Cmáx AUC0-»
(mg/kg) (U/kg) (mU/ml) (h*mu/ml) T1/2 (h)
1 21 600 158 000 471 000 5 ,6
3 64 800 383 000 1 360 000 5 ,9
9 194 400 1 900 000 5 750 000 8 ,98
T a b la 116: R e s u m e n d e lo s p a rá m e tro s fa rm a c o c in é tic o s d e M O D -5014 e n m o n o s c y n o m o lg u s m a c h o s (e s tu d io
G L P )
Figure imgf000133_0001
L o s d a to s d e c o n c e n tra c ió n p la s m á tic a y a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n d e a n im a le s in d iv id u a le s u s a d o s e n e l e s tu d io G L P s e p re s e n ta n e n la s T a b la s 117 y 118 , re s p e c t iv a m e n te . L o s d a to s d e a c t iv id a d p re s e n ta n la m e d ia d e m e d ic io n e s d u p lic a d a s p a ra c a d a a n im a l e n c a d a p u n to te m p o ra l.
Figure imgf000134_0001
Figure imgf000135_0001
Figure imgf000136_0001
Figure imgf000137_0001
Figure imgf000138_0001
Los parámetros de PK concentración plasmática de animales individuales se presentan en la Tabla 119.
Figure imgf000139_0002
L o s p a rá m e tro s P K d e la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n d e a n im a le s in d iv id u a le s s e p re s e n ta n e n la T a b la 120 :
Figure imgf000139_0001
(c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000140_0001
L a F ig u ra 112 y F ig u ra 113 m u e s tra n la c o n c e n tra c ió n p la s m á tic a m e d ia d e M O D -5014 y la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n d e s p u é s d e la in y e c c ió n IV. La F ig u ra 114 h a s ta la F ig u ra 116 re p re s e n ta n g rá f ic a m e n te la c o n c e n tra c ió n m e d ia y la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n ju n ta s p a ra c a d a n iv e l d e d o s is . L o s g rá f ic o s in d iv id u a le s d e la c o n c e n tra c ió n p la s m á tic a y la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n s e p re s e n ta n en la s F ig u ra s 117 A -R . E s ta s f ig u ra s ilu s tra n q u e d u ra n te la s p r im e ra s 24 h o ra s d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e la s d o s is , la s c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s y la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n d is m in u y e n a v e lo c id a d e s s im ila re s . M á s a llá d e la s 24 h o ra s , la s c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s te n d ie ro n a e s ta b il iz a rs e y lo s n iv e le s d e a c t iv id a d c o n t in u a ro n su d is m in u c ió n . L o s d a to s p o s te r io re s a la s 24 h o ra s s o lo e s tá n d is p o n ib le s d e lo s a n im a le s d e re c u p e ra c ió n , 2 p o r g ru p o .
L o s re s u lta d o s d e l a n á lis is n o c o m p a r t im e n ta l se m u e s tra n e n la T a b la 119 y T a b la 120 p a ra lo s d a to s d e c o n c e n tra c ió n p la s m á tic a y a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n , re s p e c t iv a m e n te . L a s c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s fu e ro n m á s a lta s e n e l p r im e r p u n to te m p o ra l m e d id o (0 ,25 h). E l T m á x d e la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n s e o b s e rv ó a la s 0 ,25 h o 0 ,50 h e n la m a y o r ía d e lo s a n im a le s . T a n to la c o n c e n tra c ió n c o m o la a c t iv id a d a u m e n ta ro n co n e l a u m e n to d e la d o s is , p e ro n o c o m p le ta m e n te d e m a n e ra p ro p o rc io n a l a la d o s is . H u b o u n a te n d e n c ia p a ra la s AUC0-24h y A U C 0-~ a a u m e n ta r d e 30 a 50 % m á s q u e e l a u m e n to e n la d o s is . La s e m iv id a te rm in a l fu e m á s p ro lo n g a d a b a s a d o e n las c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s q u e b a s a d o e n la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n : a p ro x im a d a m e n te d e 12 a 28 h o ra s fre n te a a p ro x im a d a m e n te d e 5 a 7 h o ra s . E l C L p a re c ió s e r a p ro x im a d a m e n te un 50 % m á s rá p id o a la d o s is m á s b a ja d e 1 m g /k g e n c o m p a ra c ió n co n la s d o s is d e 7 ,5 m g /k g y 15 m g /k g . E l C L b a s a d o e n la s c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s y b a s a d o e n la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n fu e s im ila r.
T a b la 119 : P a rá m e tro s fa rm a c o c in é tic o s d e M O D -5014 b a s a d o s e n c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s d e s p u é s d e la in y e c c ió n e n b o lo IV e n m o n o s C y n o m o lg u s m a c h o s
Figure imgf000141_0001
T a b la 120 : P a rá m e tro s fa rm a c o d in á m ic o s d e M O D -5014 b a s a d o s e n m e d ic io n e s d e a c t iv id a d d e s p u é s d e la in y e c c ió n e n b o lo IV e n m o n o s C y n o m o lg u s m a c h o s
Figure imgf000141_0002
A c t iv id a d b a s a d a e n 15 563 u n id a d e s /m g
N o s e o b s e rv a ro n te n d e n c ia s c o n s is te n te s a p a r t ir d e lo s e s t im a d o s d e l v o lu m e n d e d is tr ib u c ió n . E l v o lu m e n en e s ta d o e s ta c io n a r io (V s s ) , c u a n d o te ó r ic a m e n te la s c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s y t is u la re s e s tá n e n e q u ilib r io , y en la fa s e te rm in a l (V z ), c u a n d o la s c o n c e n tra c io n e s d is m in u y e n , fu e ro n m á s a lto s b a s a d o s e n e s t im a d o s de c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s q u e e n la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n . E l v o lu m e n d e d is tr ib u c ió n in ic ia l (V i) fu e a lg o m a y o r e n lo s g ru p o s d e d o s is d e 1 ,0 m g /k g y 7 ,5 m g /k g b a s a d o e n la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n q u e b a s a d o en las c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s . V i ta m b ié n fu e m á s a lto a la s d o s d o s is m á s b a ja s q u e a la d o s is a lta . E s ta o b s e rv a c ió n p o d ría e s ta r re la c io n a d a c o n e l h e c h o d e q u e n o to d a s la s m e d ic io n e s d e a c t iv id a d d e la c o a g u la c ió n a lc a n z a ro n su p u n to m á x im o e n e l p u n to te m p o ra l m á s te m p ra n o y d e s p u é s d is m in u y e ro n d rá s t ic a m e n te . En c a m b io , a lg u n a s d e la s c u rv a s d e a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n a lc a n z a ro n su p u n to m á x im o en un m o m e n to p o s te r io r lo q u e p ro d u jo u n a fa s e in ic ia l m á s p la n a d e la c u rv a . E s te p a tró n lle v ó a un e s t im a d o m á s b a jo d e C 0 y p o r lo ta n to un e s t im a d o m á s a lto d e V i b a s a d o e n la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n .
R e s u m e n d e l e s tu d io G L P
L a s c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s fu e ro n m á s a lta s en e l p r im e r p u n to te m p o ra l m e d id o (0 ,25 h ). E l T m á x d e la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n s e o b s e rv ó a la s 0 ,25 h o 0 ,50 h e n la m a y o r ía d e lo s a n im a le s . T a n to lo s p a rá m e tro s d e c o n c e n tra c ió n c o m o d e a c t iv id a d a u m e n ta ro n c o n e l a u m e n to d e la d o s is , p e ro n o c o m p le ta m e n te d e fo rm a p ro p o rc io n a l a la d o s is . H u b o u n a te n d e n c ia p a ra la s AUC0-24h y A U C 0-~ a a u m e n ta r d e 30 a 50 % m á s q u e e l a u m e n to e n la d o s is . L a s e m iv id a te rm in a l fu e m á s p ro lo n g a d a b a s a d o e n la s c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s q u e b a s a d o e n la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n : a p ro x im a d a m e n te d e 12 a 28 h o ra s f re n te a a p ro x im a d a m e n te d e 5 a 7 h o ra s . E l C L p a re c ió s e r a p ro x im a d a m e n te un 50 % m á s rá p id o a la d o s is m á s b a ja d e 1 m g /k g e n c o m p a ra c ió n co n la s d o s is d e 7 ,5 m g /k g y 15 m g /k g . E l C L b a s a d o e n la s c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s y b a s a d o e n la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n fu e s im ila r.
N o s e o b s e rv a ro n te n d e n c ia s c o n s is te n te s a p a r t ir d e lo s e s t im a d o s d e l v o lu m e n d e d is tr ib u c ió n . E l v o lu m e n a p a re n te e n e s ta d o e s ta c io n a r io (V s s ) , c u a n d o te ó r ic a m e n te la s c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s y t is u la re s e s tá n en e q u ilib r io , y en la fa s e te rm in a l (V z ) , c u a n d o la s c o n c e n tra c io n e s d is m in u y e n , fu e ro n m á s a lto s b a s a d o e n los e s t im a d o s a p a r t ir d e la s c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s q u e la s b a s a d a s e n la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n . E l v o lu m e n d e d is tr ib u c ió n in ic ia l (V i) fu e a lg o m á s a lto e n lo s g ru p o s d e d o s is d e 1 ,0 m g /k g y 7 ,5 m g /k g b a s a d o e n la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n q u e e l b a s a d o e n la s c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s . V i ta m b ié n fu e m á s a lto a la s d o s d o s is m á s b a ja s q u e a la d o s is a lta . E s ta o b s e rv a c ió n p o d ría e s ta r re la c io n a d a c o n e l h e c h o d e q u e n o to d a s la s m e d ic io n e s de a c t iv id a d d e la c o a g u la c ió n a lc a n z a ro n su p u n to m á x im o e n e l p u n to te m p o ra l m á s te m p ra n o y d e s p u é s d is m in u y e ro n d rá s t ic a m e n te . A lg u n a s d e la s c u rv a s d e a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n a lc a n z a ro n su p u n to m á x im o en un m o m e n to p o s te r io r lo q u e p ro d u jo u n a fa s e in ic ia l m á s p la n a d e la c u rv a . E s te p a tró n lle v ó a un e s t im a d o m á s b a jo d e C 0 y p o r lo ta n to un e s t im a d o m á s a lto d e V i b a s a d o e n la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n .
D e s p u é s d e u n a in y e c c ió n e n b o lo IV e n m o n o s c y n o m o lg u s m a c h o s , la e x p o s ic ió n d e M O D -5014 b a s a d a e n las c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s y e n la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n a u m e n tó c o n e l a u m e n to d e la d o s is , p e ro a lg o m á s q u e e l a u m e n to d e la d o s is . P o r lo ta n to , la e x p o s ic ió n d e M O D -5014 b a s a d a en c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s y b a s a d a en la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n e s tu v o re la c io n a d a c o n la d o s is p e ro n o p ro p o rc io n a l a la d o s is . E l C L m e d id o p o r c o n c e n tra c io n e s y a c t iv id a d fu e s im ila r y a m b o s fu e ro n a p ro x im a d a m e n te un 50 % m á s a lto s d e s p u é s d e u n a d o s is d e 1 m g /k g e n c o m p a ra c ió n c o n e l C L d e s p u é s d e d o s is d e 7 ,5 m g o 15 m g /k g . L a s e m iv id a te rm in a l fu e m á s p ro lo n g a d a b a s a d o e n la s c o n c e n tra c io n e s p la s m á tic a s q u e b a s a d o en la a c t iv id a d d e c o a g u la c ió n : a p ro x im a d a m e n te d e 12 a 28 h o ra s f re n te a a p ro x im a d a m e n te d e 5 a 7 h o ra s .
L o s re s u lta d o s e n c o n e jo s N Z W se p re s e n ta n a n te r io rm e n te e n e l E je m p lo 15.
C o n c lu s io n e s :
R e s u m e n d e la e v a lu a c ió n d e s e g u r id a d :
T o d o s lo s h a lla z g o s d e te c ta d o s e n lo s e s tu d io s to x ic o ló g ic o s s o n c o n s is te n te s y p re d ic h o s b a s a d o e n e l m e c a n is m o d e a c c ió n d e e s te fá rm a c o . N o h u b o h a lla z g o s n u e v o s o ú n ic o s a s o c ia d o s c o n M O D -5014 q u e n o se h a y a n o b s e rv a d o ta m b ié n c o n e l rh F V II c o m e rc ia l u o tro s fá rm a c o s d e fa c to re s d e c o a g u la c ió n . L o s e fe c to s tro m b o g é n ic o s s e p ro b a ro n e n e l m o d e lo d e W e s s le r y s e d e m o s tró q u e e ra n c o m p a ra b le s a l rh F V IIa .
V e n ta ja s fa rm a c o c in é tic a s :
Figure imgf000142_0001
E n g e n e ra l, M O D -5014 d e m o s tró e x c e le n te s p e rf ile s d e s e g u r id a d , a l p ro p o rc io n a r m á rg e n e s d e e x p o s ic ió n a d e c u a d o s p o r e n c im a d e la s d o s is c lín ic a s a d m in is tra d a s p ro p u e s ta s en e l e s tu d io d e e n s a y o c lín ic o p r im e r e s tu d io e n s e re s h u m a n o s (F 1H ) fa s e 1 -2 A .
E je m p lo 18: E v a lu a c ió n c o m p a ra t iv a d e la u n ió n p la q u e ta r ia in v it ro d e M O D -5014 y h F V IIa
1. Fundamentación y resumen del proyecto
1.1. Objetivo
Estos estudios se diseñaron para evaluar in vitro la unión a plaquetas de MOD-5014 en comparación con el FVIIa humano recombinante de tipo silvestre. Ésta es una característica importante de las moléculas similares a FVIIa como agentes de derivación en la hemofilia, ya que se cree que la actividad en la superficie plaquetaria es un componente importante del mecanismo de acción del FVIIa en este entorno clínico. Además de los fosfolípidos simples, las plaquetas tienen numerosas características superficiales que contribuyen a la unión y la actividad de las proteasas de coagulación. Por lo tanto, los ensayos de unión y actividad de fosfolípidos por sí solos pueden inducir a error a la hora de predecir los efectos biológicos de los factores de coagulación tales como el FVIIa.
1.2. Métodos
Los estudios examinaron:
• Unión a plaquetas evaluada por citometría de flujo
• Unión a plaquetas evaluada mediante la generación de trombina en la superficie de las plaquetas
1.3. Resultados y Conclusiones
Los estudios de citometría de flujo no proporcionaron datos útiles. Estos ensayos permitieron que FVIIa y MOD-5014 se unieran a plaquetas humanas activadas. La unión se detectó mediante un anticuerpo policlonal purificado por afinidad contra el FVII humano. Si bien la preparación de anticuerpos que usó OPKO para la citometría de flujo se unió igualmente bien a FVIIa y MOD-5014 en transferencias de Western, no lo hizo en ELISA ni en los ensayos de citometría de flujo. Por lo tanto, este enfoque no fue útil para comparar la unión de FVIIa y MOD-5014 a las plaquetas.
Como enfoque alternativo, se evaluó la capacidad de la unión de MOD-5014 a plaquetas para soportar la generación de trombina en la superficie de las plaquetas. Este enfoque se basa en el hecho de que FVIIa tiene poca capacidad para catalizar la activación de FXa en solución. Sin embargo, cuando las moléculas de FVIIa y FVIIa modificado se unen a las plaquetas activadas, son mucho más eficientes para activar el FX. El FXa producido en las plaquetas activadas puede medirse entonces por su capacidad para activar protrombina a trombina en la superficie de las plaquetas.
Se encontró que a concentraciones equimolares, MOD-5014 soportaba velocidades de generación de trombina en la superficie plaquetaria que eran ligeramente menores que las de FVIIa. Sin embargo, el retardo antes del inicio de la generación de trombina fue aproximadamente un 40 % más largo con MOD-5014 que con FVIIa. Esto es consistente con los estudios bioquímicos que muestran que MOD-5014 tiene una velocidad máxima de activación de FX ligeramente más baja que el FVIIa de tipo salvaje. El tiempo más largo hasta la generación máxima de trombina podría superarse con un nivel más alto de MOD-5014. Muchos factores intervienen en las consideraciones de administración. Sin embargo, estos datos in vitro sugieren que MOD-5014 puede requerir una dosificación ligeramente diferente a la de FVIIa.
2. Evaluación de la unión a plaquetas mediante citometría de flujo
2.1. Método
Se aislaron plaquetas a partir de la sangre de un donante humano sano y se activaron con trombina y convulxina (un agonista del receptor de colágeno). Las plaquetas activadas se incubaron con 10, 50, 100 y 250 nM de MOD-5014 o FVIIa, y subsecuentemente se fijaron con paraformaldehído al 1 %. Las plaquetas fijadas se tiñeron para FVIIa mediante el uso de un anticuerpo policlonal anti-FVII humano y un anticuerpo secundario unido a FITC. Las plaquetas teñidas se analizaron por citometría de flujo. Se determinó la intensidad media de fluorescencia (brillo) de la población de plaquetas a cada concentración de FVIIa.
2.2. Resultados
La Figura 118 muestra la intensidad media de fluorescencia de las poblaciones de plaquetas a cada concentración de MOD-5014 o FVIIa. A pesar de la baja unión global detectada para MOD-5014, M o D -5014 y FVIIa tenían curvas de unión de forma similar. Si MOD-5014 no se une bien a las plaquetas, esto daría como resultado una curva muy plana que no parece saturarse. Por lo tanto, parece más probable que el anticuerpo usado para detectar FVIIa/MOD-5014 podría no detectar bien MOD-5014. Se observó que el mismo anticuerpo policlonal usado para detectar la unión en los estudios de citometría de flujo dio una señal igualmente fuerte con las muestras desnaturalizadas con SDS de MOD-5014 y FVIIa de tipo salvaje.
A continuación, se probó la capacidad del anticuerpo policlonal para detectar FVIIa y MOD-5014 mediante el uso de un ensayo ELISA. En este ensayo, los pocillos de microtitulación se recubrieron con el anticuerpo para capturar las muestras de proteína. La unión de la proteína al anticuerpo de captura se detectó con el mismo anticuerpo policlonal. Como FVIIa y MOD-5014 permanecen en sus conformaciones nativas, MOD-5014 se detectó considerablemente menos bien que FVIIa.
Esto nos llevó a buscar una técnica diferente para detectar la unión de FVIIa y MOD-5014.
3. Evaluación de la unión a plaquetas por generación de trombinas
3.1. Método
En estos experimentos, las plaquetas se activaron nuevamente con trombina y convulxina, se incubaron con diferentes concentraciones de FVII o MOD-5014, y subsecuentemente se añadieron a concentraciones plasmáticas de FX (135 nM) y protrombina (1,2 mM) en presencia del sustrato cromogénico Gly-Pro-Arg-paranitroanilida (500 mM). En estas condiciones, el FVIIa o MOD-5014 que se ha unido a la plaqueta activa FX. El FXa formado de esta forma en la superficie de las plaquetas se combina con el FVa derivado de plaquetas, y el complejo resultante activa la protrombina a trombina, que se detecta por escisión del sustrato cromogénico.
3.2. Resultados
La escisión del sustrato en ausencia de plaquetas fue mínima. En la Figura 119, la velocidad máxima de escisión del sustrato a cada concentración se representa en función de la concentración de FVIIa o MOD-5014. La velocidad de generación de trombina es algo más baja para MOD-5014 que para FVIIa. Esto es consistente con los ensayos de actividad realizados en vesículas de fosfolípidos.
Ejemplo 19: Propiedades bioquímicas de MOD -5014 con relación al hFVIIa recombinante comercial - efecto de un péptido carboxi-terminal (CTP) sobre la actividad del Factor VIIa
Fundamentación y resumen del proyecto
Estos estudios se diseñaron para evaluar las propiedades bioquímicas de MOD - 5014 con relación al hFVIIa recombinante comercial, denominado en la presente descripción MOD-5000.
Los estudios examinaron:
Escisión del sustrato sintético de MOD-5014
Unión al factor tisular (TF) de MOD-5014 medida por escisión del sustrato sintético
Unión al TF de MOD-5014 medida por la activación del factor X (FX)
Cinética de la activación de FX por MOD-5014 unido a TF
Unión a lípidos de MOD-5014 medida por la activación de FX
Cinética de la activación del factor por MOD-5014 unido a lípidos
Inactivación de MOD-5014 por antitrombina (AT)
Inactivación de MOD-5014 por TFPI
En general, los datos sugieren que, con relación a MOD-5000, MOD-5014 tiene un mecanismo de acción similar con una actividad catalítica ligeramente reducida. Estos resultados demostraron una actividad ligeramente reducida de MOD-5014 unido a TF y una actividad algo más reducida, independiente de TF.
Estos efectos se reflejaron principalmente en las velocidades de reacción más que en la extensión de las reacciones, y las reacciones para las que puede medirse todo el transcurso del tiempo sí se completan.
La velocidad ligeramente reducida de inhibición de AT sugiere una extensión de la semivida de MOD-5014 in vivo con una respuesta de inhibición adecuada.
Materiales experimentales
• MOD-5014 GMP-1: 2,5 mg/ml (basado en A280)
• NovoSeven núm. de lote CU60430: 0,943 mg/ml (basado en A280), denominado MOD-5000.
Escisión del sustrato sintético de MOD-5014
Fundamentación: La escisión del sustrato sintético debe depender exclusivamente de la disponibilidad de un sitio activo funcional.
Métodos: MOD-5000 y MOD-5014 se diluyeron a concentraciones iguales sobre una base molar. A continuación, se añadió la misma concentración a una concentración fija del sustrato Pefachrome FVIIa (metilsulfonil-D-ciclohexilalanil-2-aminobutiril-arginina-p-nitroanilida) y se monitoreó la escisión del sustrato mediante la aparición de un color amarillo.
Resultados
Concentración: FVIIa 360 nM; Sustrato 500 mM
A n á lis is : L a a b s o rb a n c ia a 405 n m s e c o n v ir t ió e n c o n c e n tra c ió n d e p -n it ro a n il in a m e d ia n te e l u so d e l c o e f ic ie n te d e e x t in c ió n c o n o c id o . L a c o n c e n tra c ió n d e p -n it ro a n ilin a s e re p re s e n tó g rá f ic a m e n te f re n te a l t ie m p o p a ra d e te rm in a r u n a v e lo c id a d d e e s c is ió n d e l s u s tra to . L o s d a to s s e a ju s ta ro n a:
velocidad = k^Vlla]
k 1= 27 ,5 m o l p N A /m in /m o l V IIa
C o n c lu s ió n : S o b re u n a b a s e m o la r , M O D -5000 y M O D -5014 t ie n e n la m is m a v e lo c id a d d e e s c is ió n d e l s u s tra to (F ig u ra 120 ). P a ra e s tu d io s s u b s e c u e n te s , la m e d ic ió n d e la e s c is ió n d e l s u s tra to se u s a c o m o c o n tro l p a ra d ilu c io n e s y p ip e te o .
U n ió n a T F d e M O D -5014 m e d id a p o r la e s c is ió n d e l s u s tra to s in té t ic o
F u n d a m e n ta c ió n : C u a n d o e l F a c to r V IIa s e u n e a T F , s e p ro d u c e un c a m b io c o n fo rm a c io n a l en e l F a c to r V IIa q u e d a c o m o re s u lta d o un a u m e n to en la v e lo c id a d d e e s c is ió n d e l s u s tra to . E s to s ig n if ic a q u e p u e d e u s a rs e u n a m a y o r e s c is ió n d e l s u s tra to p a ra m o n ito re a r la u n ió n d e l F a c to r V IIa a T F .
M é to d o s : S e a ñ a d ie ro n c o n c e n tra c io n e s v a r ia b le s d e M O D -5000 y M O D -5014 a u n a c o n c e n tra c ió n f i ja d e T F y se in c u b a ro n d u ra n te 5 m in u to s . S e a ñ a d ió e l s u s tra to (P e fa c h ro m e F V IIa ). La e s c is ió n d e l s u s tra to s e m o n ito re ó a 405 n m p o r la a p a r ic ió n d e c o lo r a m a r illo .
R e s u lta d o s :
C o n c e n tra c ió n : F V IIa 0 -25 nM ; T F 8 ,7 nM ; S u s tra to 500 m M
A n á lis is : C o m o la c o n c e n tra c ió n d e T F e s tá m u y p o r e n c im a d e la K d e s p e ra d a , a c o n c e n tra c io n e s b a ja s to d o el F V IIa d e b e u n irs e a T F . L a v e lo c id a d d e e s c is ió n d e l s u s tra to s e rá la d e l c o m p le jo V IIa /T F . U n a v e z q u e la c o n c e n tra c ió n d e F V IIa s u p e ra la d e l T F , la v e lo c id a d d e e s c is ió n d e l s u s tra to d e b e r ía d e s c e n d e r a la d e l F V IIa lib re . D a d o q u e F V IIa y T F fo rm a n un c o m p le jo m o la r 1 :1 , la c o n c e n tra c ió n d e F V IIa a la q u e se p ro d u c e e l c a m b io en la v e lo c id a d d e e s c is ió n d e l s u s tra to e s u n a v e r i f ic a c ió n d e la c o n c e n tra c ió n e s t im a d a d e F V IIa .
L o s d a to s se a ju s ta ro n a:
velocidad = k,[Vlla]+ k^ Vlla/TF]
M O D -5000 M O D -5014
k 1 27 ,5 27 ,5 m o l p N A /m in /m o l V IIa
k2 365 357 m o l p N A /m in /m o l V IIa /T F
C o n c lu s ió n : M O D -5000 (N o v o s e v e n ) y M O D -5014 m u e s tra n e l m is m o p u n to d e in f le x ió n a la c o n c e n tra c ió n e s p e ra d a d e T F (8 ,7 n M ) (F ig u ra 121 ). E s to c o n f irm a q u e la s c o n c e n tra c io n e s m o la re s d e M O D -5000 y M O D -5014 p re d ic h a s p o r la e s c is ió n d e l s u s tra to s o n c o rre c ta s . M O D -5014 tu v o u n a v e lo c id a d d e e s c is ió n d e s u s tra to m u y l ig e ra m e n te m á s b a ja c u a n d o s e u n ió a T F (98 % ) co n re la c ió n a M O D -5000 (F ig u ra 121 ).
U n ió n a T F d e M O D -5014 m e d id a p o r la a c t iv a c ió n d e l fa c to r X
F u n d a m e n ta c ió n : L a e s c is ió n d e F X p o r F V IIa e s le n ta co n re la c ió n a la e s c is ió n p o r e l c o m p le jo F V IIa /T F . P o r lo ta n to , la u n ió n d e F V IIa a T F p u e d e e v a lu a rs e a l m e d ir la v e lo c id a d d e a c t iv a c ió n d e FX .
M é to d o s : S e a ñ a d ie ro n c o n c e n tra c io n e s v a r ia b le s d e M O D -5000 y M O D -5014 a u n a c o n c e n tra c ió n f i ja d e T F y se m id ió la v e lo c id a d d e a c t iv a c ió n d e FX . L a a c t iv a c ió n d e l fa c to r X s e e v a lu ó m e d ia n te la e s c is ió n d e l s u s tra to s in té t ic o P e fa c h ro m e F X a (m e to x ic a rb o n il-D -c ic lo h e x ila la n il-g l ic i l- a rg in in a p a ra n it ro a n ilid a ) . L a e s c is ió n d e l s u s tra to s in té t ic o s e c o n v ie r te e n c o n c e n tra c ió n d e F X a m e d ia n te u n a c u rv a e s tá n d a r . N i F V IIa n i F V IIa /T F e s c in d e n e l s u s tra to F X a u n a v e lo c id a d a p re c ia b le .
R e s u lta d o s
C o n c e n tra c ió n : F V IIa 0 -2 nM ; T F 10 pM ; F X 135 nM ; S u s tra to 500 pM
L a c o n c e n tra c ió n d e l fa c to r X e n p la s m a e s 8 p g /m l ( ~ 135 nM ).
A n á lis is : La v e lo c id a d d e a c t iv a c ió n d e F X d e b e r ía a u m e n ta r a m e d id a q u e F V IIa s e u n e a T F . U n a v e z q u e to d o el T F e s té s a tu ra d o c o n F V IIa , la v e lo c id a d d e a c t iv a c ió n d e F X h a b rá a lc a n z a d o un v a lo r m á x im o (F ig u ra 122 a ).
L o s d a to s se a ju s ta ro n a:
Figure imgf000146_0001
M O D -5000 M O D -5014
Vmáx 1 ,40 1 ,30 nM F X a /m in
Kd 3 ,3 3 ,0 p m
V a lo r H ill 0 ,93 0,91
C o n c lu s ió n : E x is te u n a c o o p e ra t iv id a d n e g a t iv a m u y le v e ( v a lo r d e H ill < 1 ) en la u n ió n d e F V IIa a T F . E s to e s lo m is m o p a ra M O D -5000 y M O D -5014. C u a n d o e s tá u n id o a T F , M O D -5014 t ie n e u n a v e lo c id a d d e a c t iv a c ió n d e F X l ig e ra m e n te re d u c id a (93 % ) co n re la c ió n a M O D -5000. L a a f in id a d d e M O D -5014 p o r T F e s e q u iv a le n te a la a f in id a d d e M O D -5000 (F ig u ra 122 A ).
V e lo c id a d d e a c t iv a c ió n d e l F X e n fu n c ió n d e la c o n c e n tra c ió n d e l F X
F u n d a m e n ta c ió n : L a v e lo c id a d l ig e ra m e n te re d u c id a d e a c t iv a c ió n d e M O D -5014 c u a n d o se u n e a T F p o d ría s e r u n a c o n s e c u e n c ia d e la a f in id a d re d u c id a p o r F X a o d e la re d u c c ió n d e l re c a m b io d e F X u n a v e z q u e s e u n e a l c o m p le jo . L a m e d ic ió n d e la v e lo c id a d d e a c t iv a c ió n d e F X e n fu n c ió n d e la c o n c e n tra c ió n d e F X e s ta b le c ió lo s p a rá m e tro s c in é t ic o s d e l c o m p le jo .
M é to d o s : S e in c u b a ro n c o n c e n tra c io n e s v a r ia b le s d e F X c o n u n a c o n c e n tra c ió n f ija d e c o m p le jo F V IIa /T F .
L a a c t iv a c ió n d e l fa c to r X s e e v a lu ó m e d ia n te la e s c is ió n d e un s u s tra to s in té t ic o (P e fa c h ro m e F X a ). L a e s c is ió n de l s u s tra to s in té t ic o s e c o n v ie r te e n c o n c e n tra c ió n d e F X a m e d ia n te u n a c u rv a e s tá n d a r .
R e s u lta d o s
C o n c e n tra c ió n : F V IIa 1 nM ; T F 5 pM ; F X 0 -1500 nM ; S u s tra to 500 pM
A n á lis is : A m e d id a q u e s e a ñ a d ió m á s F X , m á s d e l c o m p le jo F V IIa /T F d e b e r ía te n e r F X u n id o h a s ta e l p u n to e n e l q u e to d o s lo s c o m p le jo s F V IIa /T F s e h a y a n u n id o a F x . E n e s e m o m e n to , la re a c c ió n e s ta b a lim ita d a p o r la v e lo c id a d a la q u e s e a c t iv a b a e l FX . P o r lo ta n to , la v e lo c id a d d e a c t iv a c ió n d e F X d e b e r ía h a b e r a u m e n ta d o co n u n a c o n c e n tra c ió n c re c ie n te d e FX , d o n d e la fo rm a d e la c u rv a s e a c e rc a a s in tó t ic a m e n te a u n a v e lo c id a d m á x im a (F ig u ra 123 ).
L o s d a to s se a ju s ta ro n a:
Figure imgf000146_0002
M O D -5000 M O D -5014
Vmáx 1 ,78 1 ,64 nM F X a /m in
Km 140 120 nM
C o n c lu s ió n : C u a n d o s e u n ió a l T F , M O D -5014 tu v o un re c a m b io lig e ra m e n te re d u c id o d e F X (92 % ) c o n re la c ió n a M O D -5000. L a u n ió n d e F X a l c o m p le jo M O D -5014 /T F fu e la m is m a q u e su u n ió n a l c o m p le jo M o D -5000 /T F (F ig u ra 123 ).
U n ió n a líp id o s d e M O D -5014 m e d id a p o r la a c t iv a c ió n d e F X
F u n d a m e n ta c ió n : S e c re e q u e la a c t iv a c ió n d e l fa c to r X e n la s p la q u e ta s c o n tr ib u y e a l e fe c to h e m o s tá t ic o d e l F V IIa . S e c re e q u e e s ta a c t iv id a d p la q u e ta r ia s e p ro d u c e e n un e n to rn o d e b a jo T F o e n a u s e n c ia d e T F . L a a c t iv a c ió n d e l fa c to r X s in T F p u e d e e s tu d ia rs e e n v e s íc u la s lip íd ic a s .
M é to d o s : L a a c t iv a c ió n d e l fa c to r X p o r F V IIa en lo s líp id o s e s u n a fu n c ió n d e la u n ió n ta n to d e la e n z im a (F V IIa ) c o m o d e l s u s tra to p ro te ic o (F X ). L a re la c ió n d e líp id o s fu e P C :P E :P S 41 :44 :14 , d is e ñ a d a p a ra im ita r la c o m p o s ic ió n d e p la q u e ta s a lta m e n te a c t iv a d a s . L o s líp id o s s e p re p a ra ro n c o m o g ra n d e s v e s íc u la s u n ila m e la re s (200 n m ). S e a ñ a d ie ro n c o n c e n tra c io n e s c re c ie n te s d e v e s íc u la s a F V IIa y F X . L a a c t iv a c ió n d e l fa c to r X s e e v a lu ó m e d ia n te la e s c is ió n d e un s u s tra to s in té t ic o (P e fa c h ro m e F X a ). La e s c is ió n d e l s u s tra to s in té t ic o s e c o n v ir t ió e n c o n c e n tra c ió n d e F X a m e d ia n te u n a c u rv a e s tá n d a r .
R e s u lta d o s
C o n c e n tra c ió n : F V IIa 20 nM ; F X 500 nM ; L íp id o s 0 -1000 pM ; S u s tra to 500 pM .
A n á lis is : L a v e lo c id a d d e g e n e ra c ió n d e F X a s e re p re s e n tó g rá f ic a m e n te f re n te a la c o n c e n tra c ió n d e v e s íc u la s lip íd ic a s (F ig u ra 124 A ). C o m o se e s p e ra b a , la g e n e ra c ió n d e F X a a u m e n tó co n e l a u m e n to d e la s c o n c e n tra c io n e s d e líp id o s , y a q u e h a b ía m á s á re a s u p e r f ic ia l d is p o n ib le p a ra la re a c c ió n . A u n a c o n c e n tra c ió n s u f ic ie n te m e n te a lta d e líp id o s , la v e lo c id a d d e la re a c c ió n d is m in u y ó a m e d id a q u e F V IIa y F X s e s e g re g a ro n en d ife re n te s v e s íc u la s lip íd ic a s . S e e s p e ra e s ta re s p u e s ta d e p la n t il la p a ra e s te s is te m a . L o s d a to s no s e a ju s ta ro n a u n a e c u a c ió n y las lín e a s m o s tra d a s s o n s o lo p a ra re fe re n c ia v is u a l. L a d ife re n c ia e n la v e lo c id a d d e g e n e ra c ió n d e F X a e n tre M O D -5000 y M O D -5014 n o se d e b ió a d ife re n c ia s e n la a f in id a d p o r lo s líp id o s . E s to s e m u e s tra e n la F ig u ra 124 B , d o n d e la v e lo c id a d d e g e n e ra c ió n d e F X a c o n re la c ió n a l m á x im o p a ra c a d a u n o s e re p re s e n ta g rá f ic a m e n te f re n te a la c o n c e n tra c ió n d e líp id o s .
C o n c lu s ió n : L a v e lo c id a d d e a c t iv a c ió n d e F X e n a u s e n c ia d e T F e s m e n o r p a ra M O D -5014 ( -60 % ) c o n re la c ió n a M O D -5000. L a a f in id a d d e M O D -5014 p o r lo s líp id o s e s la m is m a q u e la d e M O D -5000.
C in é t ic a d e la a c t iv a c ió n d e F X p o r M O D -5014 u n id o a líp id o s
F u n d a m e n ta c ió n : L a v e lo c id a d re d u c id a d e a c t iv a c ió n d e F X e n a u s e n c ia d e T F p a ra M O D -5014 c o n re la c ió n a M O D -5000 p o d ría s e r u n a c o n s e c u e n c ia d e u n a a f in id a d re d u c id a p o r F X a o un re c a m b io re d u c id o d e F X u n a v e z q u e s e u n e a la e n z im a e n la s u p e r f ic ie lip íd ic a .
M é to d o s : S e in c u b a ro n c o n c e n tra c io n e s v a r ia b le s d e F X co n u n a c o n c e n tra c ió n f i ja d e F V IIa y v e s íc u la s lip íd ic a s . La a c t iv a c ió n d e l fa c to r X s e e v a lu ó m e d ia n te la e s c is ió n d e un s u s tra to s in té t ic o (P e fa c h ro m e F X a ). L a e s c is ió n d e l s u s tra to s in té t ic o s e c o n v ir t ió e n c o n c e n tra c ió n d e F X a m e d ia n te u n a c u rv a e s tá n d a r .
R e s u lta d o s
C o n c e n tra c ió n : F V IIa 20 nM ; F X 0 -2500 nM ; L íp id o s 100 pM ; S u s tra to 500 pM .
A n á lis is : A m e d id a q u e s e a ñ a d e m á s F X , m á s d e l F V IIa e n la s u p e r f ic ie lip íd ic a d e b e te n e r F X u n id o h a s ta e l p u n to e n q u e to d o e l F V IIa e s tá u n id o a F X . E n e s e p u n to , la re a c c ió n e s tá lim ita d a p o r la v e lo c id a d a la q u e s e a c t iv a FX. P o r lo ta n to , la v e lo c id a d d e a c t iv a c ió n d e F X d e b e r ía a u m e n ta r c o n u n a c o n c e n tra c ió n c re c ie n te d e F X , d o n d e la fo rm a d e la c u rv a s e a c e rc a a s in tó t ic a m e n te a u n a v e lo c id a d m á x im a . C o m o e ra d e e s p e ra r , la a f in id a d p o r F X d e F V IIa se re d u c e (m a y o r K m ) e n a u s e n c ia d e T F y la v e lo c id a d d e g e n e ra c ió n d e F X a s e re d u c e e n a u s e n c ia d e T F (F ig u ra 125 ).
L o s d a to s se a ju s ta ro n a:
Figure imgf000147_0001
M O D -5000 M O D -5014
Vmáx 0 ,253 0 ,115 nM F X a /m in
Km 878 848 nM F X a /m in
C o n c lu s ió n : L a v e lo c id a d d e a c t iv a c ió n d e F X e n u n a s u p e r f ic ie lip íd ic a e n a u s e n c ia d e T F e s m e n o r p a ra M O D -5014 (45 % ) c o n re la c ió n a M O D -5000. L a u n ió n d e F X a M O D -5014 e n la s u p e r f ic ie lip íd ic a fu e la m is m a q u e su u n ió n a M O D -5000 (F ig u ra 125 ).
In a c t iv a c ió n d e M O D -5014 p o r A T
F u n d a m e n ta c ió n : S e c re e q u e u n a p a rte s ig n if ic a t iv a d e l a c la ra m ie n to d e F V IIa in v iv o e s m e d ia n te la fo rm a c ió n de un c o m p le jo d e F V IIa c o n A T . L a v e lo c id a d d e e s ta re a c c ió n p u e d e m e d irs e in v it ro s o lo c u a n d o F V IIa s e u n e a l T F . P a ra p ro c e d e r a u n a v e lo c id a d m e d ib le , la re a c c ió n in v it ro ta m b ié n re q u ie re a lta s c o n c e n tra c io n e s d e h e p a r in a , q u e s e c re e q u e im ita lo s e fe c to s d e un g l ic o s a m in o g lic a n o n a tu ra l.
M é to d o s : E l F a c to r V IIa s e in c u b ó co n T F p a ra p e rm it ir la fo rm a c ió n d e l c o m p le jo . E l c o m p le jo s e in c u b ó c o n A T y h e p a r in a . L a re a c c ió n se d e tu v o a in te rv a lo s p ro g ra m a d o s m e d ia n te la a d ic ió n d e p o lib re n o (b ro m u ro d e h e x a d im e tr in a ) p a ra n e u tra liz a r la h e p a r in a . L a a c t iv id a d re s id u a l d e F V IIa /T F s e m id ió m e d ia n te la e s c is ió n d e un s u s tra to s in té t ic o (P e fa c h ro m e F V IIa ). A la s c o n c e n tra c io n e s u s a d a s e n e l e n s a y o , e l p o lib re n o n o a lte ró la e s c is ió n d e l s u s tra to .
R e s u lta d o s
C o n c e n tra c ió n : F V IIa 10 nM ; T F 11 nM ; A T 1 |j M; H e p a r in a 5 U /m l; F V IIa /T F 8 ,2 nM ; P o lib re n o 100 p g /m l; S u s tra to 500 j M.
A n á lis is : L a c o n c e n tra c ió n d e F V IIa /T F , m e d id a c o m o v e lo c id a d d e e s c is ió n d e l s u s tra to , s e re p re s e n tó f re n te a l t ie m p o e n m in u to s (F ig u ra 126 ). C o m o e ra d e e s p e ra r , A T /h e p a r in a in h ib ió F V IIa , lo q u e c o n d u jo a u n a p é rd id a de a c t iv id a d d e F V IIa /T F .
L o s d a to s se a ju s ta ro n a:
Figure imgf000148_0001
M O D -5000 M O D -5014
Va 11 ,89 11 ,93
k 0 ,354 0 ,217 m in -1
C o n c lu s ió n : V a lo re s s im ila re s p a ra la a c t iv id a d a T = 0 in d ic a n q u e e n la re a c c ió n e s ta b a n p re s e n te s c a n t id a d e s ig u a le s d e M O D -5000 y M o D -5014. M O D -5014 s e in h ib ió un p o c o m á s le n ta m e n te (62 % ) q u e M O D -5000 (F ig u ra 126 ). A m b a s re a c c io n e s p ro c e d ie ro n h a s ta la in h ib ic ió n c o m p le ta .
In a c t iv a c ió n d e M O D -5014 p o r T F P I
F u n d a m e n ta c ió n : T F P I e s e l in h ib id o r f is io ló g ic o d e l c o m p le jo F V IIa /T F . E l d o m in io K 2 d e T F P I fo rm a un c o m p le jo in ic ia l c o n F X a . E s te c o m p le jo s e u n e a F V IIa /T P I, d o n d e e l d o m in io K1 d e T F P I in te ra c tú a c o n F V IIa . P o r lo ta n to , la a c t iv a c ió n d e F X p o r F V IIa /T F d e b e r ía c o n d u c ir a c o m p le jo s in h ib id o s y a la d e s c o n e x ió n d e F V IIa -T F P I.
M é to d o s : E l F a c to r V IIa y e l T F s e in c u b a ro n ju n to s p a ra fo rm a r un c o m p le jo . E l c o m p le jo s e a ñ a d ió a l s u s tra to T F P I/ F X /F X a . L a a c t iv a c ió n d e l fa c to r X s e e v a lu ó m e d ia n te la e s c is ió n d e un s u s tra to s in té t ic o (P e fa c h ro m e F X a ). La e s c is ió n d e l s u s tra to s in té t ic o s e c o n v ir t ió e n c o n c e n tra c ió n d e F X a m e d ia n te u n a c u rv a e s tá n d a r .
R e s u lta d o s
C o n c e n tra c ió n - in h ib ic ió n : F V IIa 1 nM ; T F 20 pM ; F X 135 nM ; T F P I 0 -5 nM ; S u s tra to 500 j M.
A n á lis is : C o m o e ra d e e s p e ra r , la g e n e ra c ió n in ic ia l d e F X a s e p ro d u jo a la m is m a v e lo c id a d e n to d a s la s re a c c io n e s (F ig u ra 127 A -C ) . E n p re s e n c ia d e T F P I, la v e lo c id a d d e g e n e ra c ió n d e F X a d is m in u y ó a m e d id a q u e e l c o m p le jo F V IIa /T F P I s e in h ib ió p o r T F P I/F X a (d o s p a n e le s in fe r io re s ) . L a d e s c o n e x ió n d e lo s c o m p le jo s d e T F P I se p ro d u jo m á s rá p id a m e n te a c o n c e n tra c io n e s m á s a lta s d e T F P I (d o s p a n e le s in fe r io re s ) . L a c a n t id a d d e F X a fo rm a d a a n te s d e q u e s e c e r ra ra e l F V IIa /T F P I e s u n a m e d id a d e la in te ra c c ió n d e T F P I c o n F V IIa /T F . D a d o q u e M O D -5014 t ie n e u n a v e lo c id a d d e g e n e ra c ió n d e F X a lig e ra m e n te re d u c id a q u e , p o r lo ta n to , ra le n t iz a r ía la fo rm a c ió n d e c o m p le jo s F X a /T F P I, la re a c c ió n ta rd ó m á s e n a lc a n z a r u n a m e s e ta co n M O D -5014 q u e c o n M O D -5000.
C o n c lu s ió n : C o m o s e m u e s tra e n e l p a n e l s u p e r io r , la d e p e n d e n c ia d e la c o n c e n tra c ió n p a ra la in h ib ic ió n d e T F P I d e la g e n e ra c ió n p o r M O D -5014 /T F d e F X a e s m u y s im ila r a la d e M O D -5000. M O D -5014 p o d ría s e r l ig e ra m e n te m á s s e n s ib le a la in h ib ic ió n d e T F P I (124 % ); a lte rn a t iv a m e n te , e s to p o d ría s e r un a r te fa c to d e la v e lo c id a d lig e ra m e n te m á s le n ta d e g e n e ra c ió n d e F X a .

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. U n a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a q u e c o m p re n d e un ta m p ó n , un a g e n te d e to n ic id a d y un p o lip é p tid o m o d if ic a d o c o n p é p tid o c a rb o x i te rm in a l (C T P ) d e g o n a d o tro p in a c o r ió n ic a q u e c o n s is te d e un fa c to r d e c o a g u la c ió n d e F a c to r V II y t re s p é p tid o s c a rb o x i te rm in a le s (C T P ) d e g o n a d o tro p in a c o r ió n ic a u n id o s a l e x tre m o c a rb o x i te rm in a l d e d ic h o fa c to r d e c o a g u la c ió n , e n d o n d e d ic h o p o lip é p tid o n o in c lu y e un p é p tid o s e ñ a l, y e n d o n d e d ic h a fo rm u la c ió n t ie n e un pH d e 6 ,4 a 6 ,5 , d ic h o ta m p ó n e s c it ra to 20 m M y g lic in a 13 ,3 m M , y d ic h o a g e n te d e to n ic id a d e s c lo ru ro d e s o d io 150 m M .
2. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 1, e n d o n d e d ic h a fo rm u la c ió n e s u n a fo rm u la c ió n líq u id a .
3. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a d e c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 o 2 , e n d o n d e la s e c u e n c ia de a m in o á c id o s d e a l m e n o s un C T P s e e x p o n e e n S E Q ID N O : 1 o S E Q ID N O : 2.
4. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -2 , e n d o n d e a l m e n o s u n o d e d ic h o s C T P e s tá tru n c a d o .
5. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -4 , e n d o n d e a l m e n o s u n o d e d ic h o s C T P e s tá g lic o s ila d o .
6. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -5 , e n d o n d e a l m e n o s un C T P e s tá u n id o a d ic h o fa c to r d e c o a g u la c ió n m e d ia n te un e n la z a d o r , p o r e je m p lo , e n d o n d e e l e n la z a d o r e s un e n la c e p e p tíd ic o .
7. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -6 , e n d o n d e la s e c u e n c ia d e d ic h o p o lip é p tid o m o d if ic a d o c o n C T P s e e x p o n e en S E Q ID N O : 46.
8. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -7 , e n d o n d e d ic h o fa c to r d e c o a g u la c ió n d e F a c to r V II c o m p re n d e u n fa c to r d e c o a g u la c ió n d e F a c to r V II a c t iv a d o .
9. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a d e a c u e rd o co n la re iv in d ic a c ió n 8, e n d o n d e d ic h o p o lip é p tid o m o d if ic a d o co n C T P a c t iv a d o c o m p re n d e u n a c a d e n a lig e ra y u n a c a d e n a p e s a d a u n id a s p o r un e n la c e d is u lfu ro .
10. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 9, e n d o n d e la s e p a ra c ió n d e d ic h a c a d e n a lig e ra y d ic h a c a d e n a p e s a d a e n un g e l S D S P A G E s e p ro d u c e e n c o n d ic io n e s d e s n a tu ra liz a n te s , y e n d o n d e d ic h a c a d e n a lig e ra m ig ra a un p e s o m o le c u la r d e 25 k D a y d ic h a c a d e n a p e s a d a m ig ra a un p e s o m o le c u la r d e 60 k D a .
11. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a d e a c u e rd o co n la re iv in d ic a c ió n 9, e n d o n d e e l e n la c e d is u lfu ro s e p ro d u c e e n tre e l re s id u o d e c is te ín a 135 y e l re s id u o d e c is te ín a 262 d e la S E Q ID N O : 46.
12. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 9, e n d o n d e la c a d e n a lig e ra c o m p re n d e los a m in o á c id o s 1 -152 d e la S E Q ID : 46 y la c a d e n a p e s a d a c o m p re n d e lo s a m in o á c id o s 153 -490 d e la S E Q ID N O : 46.
13. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -12 p a ra su u s o en la p re v e n c ió n o e l t ra ta m ie n to d e un t ra s to rn o d e la c o a g u la c ió n d e la s a n g re e n un s u je to .
14. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a p a ra su u so d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 13, e n d o n d e d ic h o t ra s to rn o e s la h e m o filia .
15. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a p a ra su u s o d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 14, en d o n d e d ic h a h e m o fil ia c o m p re n d e h e m o fil ia A o h e m o fil ia B c o n in h ib id o re s .
16. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a p a ra su u s o d e a c u e rd o co n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 13 -15 , en d o n d e d ic h o s u je to e s un a d u lto h u m a n o o un n iñ o h u m a n o .
17. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a p a ra su u s o d e a c u e rd o co n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 13 -16 , en d o n d e d ic h a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a s e a d m in is tra p o r v ía s u b c u tá n e a o in tra v e n o s a .
18. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a p a ra su u s o d e a c u e rd o c o n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 13 -17 , en d o n d e d ic h o p o lip é p tid o s e a d m in is t ra d ia r ia m e n te , c a d a d o s d ía s , c a d a tre s d ía s , u n a v e z a la s e m a n a , d o s v e c e s a la s e m a n a o u n a v e z c a d a d o s s e m a n a s , o c u a lq u ie r c o m b in a c ió n d e e s to s .
19. L a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a p a ra su u s o d e a c u e rd o co n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 13 -18 , en d o n d e d ic h a fo rm u la c ió n fa rm a c é u tic a s e a d m in is tra a a p ro x im a d a m e n te 50 m g /k g a 400 m g /k g d e d ic h o p o lip é p tid o m o d if ic a d o c o n C T P .
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