CN113289009A - 长效凝固因子及其产生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种长效凝固因子及其产生方法。公开了多肽以及对其进行编码的多核苷酸，所述多肽包括被附接至凝固因子的羧基末端而非氨基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)。还公开了包括本公开的多肽和多核苷酸的药物组合物和药物制剂及其使用和产生方法。
Description
本申请是申请日为2016年06月19日，申请号为201680047897.0，发明名称为“长效凝固因子及其产生方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
公开了多肽，其包括被附接至凝固因子的羧基末端的绒毛膜促性腺激素的至少一个羧基末端肽(CTP)，以及对其进行编码的多核苷酸。还公开了包括本公开的所述多肽和多核苷酸的药物组合物和药物制剂及其使用和产生方法。
背景技术
凝固因子替代疗法的发展已经改变了许多患有血友病的个体的生活。血友病是一组遗传性遗传疾病，其损害了机体控制血液凝结或凝固的能力。血友病患者不产生足够量的因子VIII蛋白或因子IX蛋白，其是有效血液凝结所必需的。在重度血友病患者中，即使是轻微的损伤也能够导致持续数日或数周的失血，且可能不会发生完全康复，这可能导致关节和其他器官的衰退性永久损伤以及过早死亡。
血友病是由凝血级联中的关键因子的缺陷或缺失导致的遗传性与X染色体相关的出血性疾病。在血友病患者中，凝血酶的生成和纤维蛋白凝块的形成受到严重影响，这导致了关节和内脏器官中最常见的自发性出血事件，以及手术或创伤期间和之后的出血过多。频繁的出血还会在血友病患者中导致关节肿胀、关节损伤、严重畸形、频繁感染和行动不便(梅奥医学中心)。血友病A是由因子VIII表达缺陷或缺失导致的，而血友病B则是由因子IX表达缺陷或缺失导致的。
血友病B导致FIX的促凝血活性不足。血友病B患者具有自发性软组织出血和复发性关节积血，其通常导致严重的关节病。目前对这些患者的治疗包括进行重组FIX的静脉给药。然而，成本以及从循环相对快速清除FIX的问题使得开发长效FIX是具有挑战性的任务。FVIII和FIX的商业可用性已使得对威胁生命的出血事件的的控制得以改进。许多患者接受预防性治疗，这降低了出血及其相关并发症的风险。然而，相当大比例的患者(10％至30％)产生了针对外源性给药的FVIII和FIX的抑制性抗体。副产物FVIIa的给药能够诱导体内平衡并向具有抑制性Abs的患者提供有效的治疗。
重组FVIIa
是可商购的且在1996年被批准用于治疗具有抑制剂的血友病患者的出血事件。然而，rFVIIa以2.5小时的终末半衰期被快速清除。结果，患者通常需要多次频繁的输注(按2至3小时的间隔给予2至3个剂量)以在轻度至中度出血之后达到充分的体内平衡。因此，人们非常有兴趣开发FVIIa的长效形式，其将延长在单剂量后的止血活性的持续时间并允许大大减少给药频率。长效FVIIa也会增加长期预防性治疗的可行性。
正在开发用于延长FVIIa的半衰期的各种技术。然而，仍然需要实现这种蛋白的延长的半衰期，同时保持其生物活性并确保修饰不会诱导显著的免疫原性。本发明通过将促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至FVIIa，从而对其进行修饰以延长其半衰期和生物活性来满足这个需要。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种经CTP修饰的多肽，其由因子VII凝固因子和被附接至该凝固因子的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成，其中该多肽不包括信号肽。在另一个方面，本发明提供了经CTP修饰的多肽，其中凝固因子是活化的FVII(FVIIa)。在另一个方面中，经CTP修饰的凝固因子的序列如在SEQ ID NO:46中所列出的。
在另一个方面中，包括活化的FVIIa-CTP3的经CTP修饰的多肽包括由二硫键连接的轻链和重链。在另一个方面中，轻链和重链在SDS-PAGE凝胶上的分离发生在变性条件下，其中轻链以约25kDa的分子量迁移，且重链以约60的kDa分子量迁移。
在一个方面中，本发明提供了一种药物制剂，其包括缓冲液、氨基酸(其中在另一个实施例中为甘氨酸)、张度剂和经CTP修饰的多肽，经CTP修饰的多肽是由因子VII凝固因子和被附接至该凝固因子的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成，其中多肽不包括信号肽。在另一个方面中，缓冲液包括20mM柠檬酸盐。在另一个方面中，张度剂为150mM氯化钠。在另一个方面中，制剂为液体制剂。在另一个方面中，制剂处于约6.4的pH下。
在另一个方面中，本发明提供了一种制剂，其在约6.4的pH下包括20mM柠檬酸盐、13.3mM甘氨酸和150mM氯化钠。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物制剂，其中凝固因子是活化的FVII(FVIIa)。在另一个方面中，该经CTP修饰的凝固因子的序列如在SEQ ID NO:46中所列出的。在另一个方面中，包括多肽的药物制剂是按每日、每隔一日、每三日、每周一次、每周两次或每隔一周一次或其任何组合来进行给药的。在另一个方面中，药物制剂的给药为静脉给药或皮下给药。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包括如本文所述的经CTP修饰的多肽的和药学上可接受的载体。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包括如本文所述的药物制剂。
在一个方面中，本发明提供了一种延长因子VII(FVII)凝固因子的生物半衰期的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII凝固因子的羧基末端的步骤，从而延长该凝固因子的生物半衰期，其中凝固因子的活化形式不包括信号肽。在另一个方面中，凝固因子是活化的FVII(FVIIa)。在另一个方面中，该活化的经CTP修饰的凝固因子的序列如在SEQ ID NO:46中所列出的。
在一个方面中，本发明提供了一种改进因子VII(FVII)凝固因子的曲线下面积(AUC)的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII凝固因子的羧基末端的步骤，从而改进该凝固因子的AUC，其中凝固因子的活化形式不包括信号肽。在另一个方面中，凝固因子是活化的FVII(FVIIa)。在另一个方面中，该活化的经CTP修饰的凝固因子的序列如在SEQ ID NO:46中所列出的。
在一个方面中，本发明提供了一种降低因子VIIa(FVII)凝固因子的给药频率的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII凝固因子的羧基末端的步骤，从而降低该凝固因子的给药频率，其中FVII凝固因子的该活化形式不包括信号肽。在另一个方面中，该活化的经CTP修饰的凝固因子的序列如在SEQ ID NO:46中所列出的。
在一个方面中，本发明提供了一种预防或治疗受试者体内的血液凝结或凝固障碍的方法，该方法包括对受试者进行活化的经CTP修饰的凝固因子多肽的给药的步骤，其中该凝固因子为FVIIa-CTP3，从而预防或治疗在该受试者体内的血液凝结或凝固障碍。在另一个方面中，障碍是血友病。在另一个方面中，血友病包括具有抑制剂的血友病A或血友病B。在另一个方面中，给药是经皮下途径进行的。在另一个方面中，给药是经静脉途径进行的。
在另一个方面中，本发明提供了一种减少出血事件的方法。
根据下列详细描述、实例和附图，本发明的其它特性和优点将变得显而易见。然而，应理解的是，在指出本公开的优选实施例时，详细描述和具体实例仅仅是以说明的方式给出的，这是因为对于本领域的技术人员来说，根据该详细描述，在本公开的精神和范围内的各种变化和修改将变得显而易见。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一张彩色图纸。在请求并支付必要的费用后，事务所将提供带有彩色图纸的本专利或专利申请公布的副本。
图1A示出柱状图，其示出在5μg/ml的维生素K3的存在下具有FIX-CTP和FIX-CTP-CTP变体的受限的、稀释的、转染的和选择的细胞的收获物。FIX水平是使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals；目录号：FIX-AG RUO)来定量的，且所计算的蛋白浓度(μg/ml)是两次独立运行的平均值。
图1B示出FIX Ab识别的SDS-PAGE的凝胶显微照片并以蛋白印迹描绘了对抗FIX抗体的识别；图1B中的泳道1加载有含有重组FIX的样本；图1B中的泳道2加载有含有FIX-CTP收获物的样本。图1B中的泳道3加载有含有FIX-(CTP)2收获物的样本。
图1C示出FIX Ab识别的SDS-PAGE凝胶显微照片。图1C以蛋白印迹描绘了对抗γ羧化抗体的识别。图1C中的泳道1加载有含有重组FIX的样本。图1C中的泳道2加载有含有FIX-CTP收获物的样本。图1C中的泳道3加载有含有FIX-(CTP)2收获物的样本。
图2示出曲线图，其示出与rhFIX(American Diagnostics)相比的FIX-CTP和FIX-(CTP)2收获物的比较显色活性(由EC50浓度进行测量)。
图3示出曲线图，其示出rhFIX、FIX-CTP-CTP的收获物和FIX-CTP的收获物的PK曲线。
图4示出柱状图，其示出如使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals；目录号：FIX-AG RUO)所确定的FIX-CTP的收获物、FIX-CTP-CTP的收获物和FIX-CTP-CTP纯化蛋白的FIX抗原水平。所计算的蛋白浓度(μg/ml)是两次独立运行的平均值。
图5A示出FIX Ab识别的SDS-PAGE的凝胶显微照片并描绘了考马斯蓝染色。泳道1加载有含有FIX-(CTP)2的样本。泳道2加载有含有未结合的FIX-(CTP)2的样本。泳道3加载有含有FIX-(CTP)2的浓缩洗脱液的样本。
图5B示出FIX Ab识别的SDS-PAGE的凝胶显微照片并以蛋白印迹描绘了对抗FIX抗体的识别。泳道1加载有含有FIX-(CTP)2的样本。泳道2加载有含有未结合的FIX-(CTP)2的样本。泳道3加载有含有FIX-(CTP)2的浓缩洗脱液的样本。
图5C示出FIX Ab识别的SDS-PAGE的凝胶显微照片并以蛋白印迹描绘了对抗γ羧化抗体的识别。泳道1加载有含有FIX-(CTP)2的样本。泳道2加载有含有未结合的FIX-(CTP)2的样本。泳道3加载有含有FIX-(CTP)2的浓缩洗脱液的样本。
图6示出曲线图，其示出与人正常池血浆和rhFIX(American Diagnostics)相比的FIX-(CTP)2的显色活性(样本浓度/O.D.)。
图7示出曲线图，其示出纯化FIX-CTP-CTP、rhFIX、FIX-CTP-CTP的收获物和FIX-CTP的收获物的PK曲线。
图8A示出被融合至三个、四个或五个CTP的FIX的抗CTP和抗γ羧化抗体的蛋白印迹。FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5的收获物是使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)被加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上的。使用抗CTP多克隆Ab(Adar BiotechProduction)以蛋白免疫印迹来执行SDS-PAGE分析。
图8B示出被融合至三个、四个或五个CTP的FIX的抗CTP和抗γ羧化抗体的蛋白印迹。FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5的收获物是使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)被加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上的。使用抗Gla Ab(American Diagnostica)以蛋白免疫印迹来执行SDS-PAGE分析。
图9示出FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5的考马斯蓝检测。在利用木菠萝素柱的纯化过程(糖基化蛋白的免疫亲和纯化)之后，使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上。将SDS-PAGE用考马斯蓝染料进行染色以用于样本检测。
图10示出FIX的显色活性。使用市售的显色活性检测试剂盒，BIOPHEN(HyphenBioMed 221802)执行充分纯化的(HA柱)FIX-CTP3 FIX-CTP4和FIX-CTP5与人池正常血浆的体外效力的比较性评估。将所有样品进行连续稀释且通过将剂量反应曲线与由正常人血浆组成的基准配置品进行比较来评估效力。
图11示出FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5的比较药代动力学(PK)曲线。在血浆样本中的FIX浓度是使用人FIX Elisa试剂盒(Affinity Biologicals)进行量化的。计算药代动力学曲线且其是在每个时间点的3只动物的平均值。使用PK Solutions 2.0软件计算终末半衰期。
图12A示出FIX-CTP3 SDS-PAGE分析-考马斯SDS-PAGE。使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP3γ-羧化的富集蛋白、rhFIX和rFIXa(活化的FIX)加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上。通过用考马斯蓝试剂(800ng的蛋白)对凝胶进行染色来执行SDS-PAGE考马斯分析。
图12B示出FIX-CTP3 SDS-PAGE分析-考马斯SDS-PAGE。使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP3γ-羧化的富集蛋白、rhFIX和rFIXa(活化的FIX)加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上。使用具有抗人FIX多克隆Ab的100ng的蛋白来执行蛋白免疫印迹。
图12C示出FIX-CTP3 SDS-PAGE分析-考马斯SDS-PAGE。使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP3γ-羧化的富集蛋白、rhFIX和rFIXa(活化的FIX)加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上。使用具有抗人γ羧化单克隆抗体的100ng的蛋白(AmericanDiagnostics，目录#499,3570)来执行蛋白免疫印迹。
图12D示出FIX-CTP3 SDS-PAGE分析-考马斯SDS-PAGE。使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP3γ-羧化的富集蛋白、rhFIX和rFIXa(活化的FIX)加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上。使用具有抗FIX前肽多克隆Ab的100ng的蛋白来执行蛋白免疫印迹(图12D)。
图12E示出FIX-CTP3 SDS-PAGE分析-考马斯SDS-PAGE。使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP3γ-羧化的富集蛋白、rhFIX和rFIXa(活化的FIX)加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上。使用具有抗CTP多克隆Ab的100ng的蛋白来执行蛋白免疫印迹。
图13示出FIX-CTP3的显色活性。使用市售的显色活性检测试剂盒，BIOPHEN(Hyphen BioMed 221802)执行对FIX-CTP3收获物和FIX-CTP3γ-羧化的富集蛋白与人池正常血浆的体外效力的比较性评估。将FIX-CTP3收获物和蛋白进行连续稀释，且通过将剂量反应曲线与由正常人血浆组成的基准配置品进行比较来评估效力。
图14示出比较凝结时间。执行体外aPTT(活化部分凝血酶时间测定)以比较FIX-CTP3与BeneFIX的凝结活性。将蛋白进行连续稀释并掺入人的去FIX血浆中，且评估凝结时间。
图15示出FIX-CTP3的比较PK曲线。FIX浓度是使用人FIX ELISA试剂盒(AffinityBiologicals；目录#FIX-AG RUO)来进行量化的。针对每种蛋白计算药代动力学曲线且其是在每个时间点上的3只动物的平均值。
图16A为平行于PK采样，通过aPTT测定来评估进行FIX-CTP3给药的缺乏FIX的动物的柠檬酸化的血浆样本的凝结活性，其被转化成活性％。在每个收集点的活性％被计算为当前凝结时间/正常池小鼠血浆的凝结时间*100。
图16B为平行于PK采样，通过aPTT测定来评估进行
给药的缺乏FIX的动物的被柠檬酸化的血浆样本的凝结活性，其被转化成活性％。在每个收集点的活性％被计算为当前凝结时间/正常池小鼠血浆的凝结时间*100。
图17A示出第一次挑战的出血参数。对缺乏FIX的小鼠进行100IU/Kg的
或rFIX-CTP3的单次静脉注射的给药。在给药后的48小时稍微剪短尾静脉且评估尾静脉的出血时间(TVBT)。在达到体内平衡15分钟后执行第二次出血挑战，并测量相同的参数。
图17B示出第一次挑战的出血参数。对缺乏FIX的小鼠进行100IU/Kg的
或rFIX-CTP3的单次静脉注射的给药。在给药后的48小时稍微剪短尾静脉且评估尾静脉的出血时间(TVBT)。在达到体内平衡15分钟后执行第二次出血挑战，且测量相同的参数。
图17C示出第一次挑战的出血参数。对缺乏FIX的小鼠进行100IU/Kg的
或rFIX-CTP3的单次静脉注射的给药。在给药后的48小时稍微剪短尾静脉且评估出血强度(血红蛋白OD)。在达到体内平衡后15分钟执行第二次出血挑战，且测量相同的参数。
图17D示出第一次挑战的出血参数。对缺乏FIX的小鼠进行100IU/Kg的
或rFIX-CTP3的单次静脉注射的给药。在给药后的48小时稍微剪短尾静脉且评估出血强度(血红蛋白OD)。在达到体内平衡后15分钟执行第二次出血挑战，且测量相同的参数。
图18A示出第二次挑战的出血参数。一旦自发或手动停止在图19A至图19D的图例中描述的第一次出血，则在第一次后的15分钟执行第二次出血挑战，且重新测量时间。
图18B示出第二次挑战的出血参数。一旦自发或手动停止在图19A至图19D的图例中描述的第一次出血，则在第一次后的15分钟执行第二次出血挑战，且重新测量时间。
图18C示出第二次挑战的出血参数。一旦自发或手动停止在图19A至图19D的图例中描述的第一次出血，则在第一次后的15分钟执行第二次出血挑战，且重新测量出血强度。
图18D示出第二次挑战的出血参数。一旦自发或手动停止在图19A至图19D的图例中描述的第一次出血，则在第一次后的15分钟执行第二次出血挑战，且重新测量出血强度。
图19A示出说明rFVII-CTP构建体的图。
图19B示出说明rFVII-CTP-CTP构建体的图。
图19C示出说明rFIX-CTP构建体的图。
图19D示出说明rFIX-CTP-CTP构建体的图。
图20A示出柱状图，其示出在5μg/ml的维生素K3的存在下具有FVII-CTP变体的受限的、稀释的、克隆转染的和选择的细胞的收获物。FVII的水平是使用FVII ELISA(AssayPro)来进行量化的。
图20B示出柱状图，其示出在5μg/ml的维生素K3活性的存在下具有FVII-CTP变体的受限的、稀释的、转染的和选择的细胞的收获物。FVII活性是使用FVII显色活性测定(AssayPro)来进行量化的。
图20C示出柱状图，其示出在5μg/ml的维生素K3的存在下具有FVII-CTP变体的受限的、稀释的、转染的和选择的细胞的收获物。通过将活性值除以收获物的FVII浓度来针对每个版本计算FVII的比活性。
图20D示出曲线图，其示出FVII、FVII-CTP-CTP和FVII-CTP的收获物的PK曲线。
图21A示出使用抗FVII、抗CTP和抗γ羧化抗体检测的被融合至三个、四个和五个CTP的FVII的蛋白印迹。FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5的收获物是使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)被加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶(expedeon)上的。使用抗FVII以蛋白免疫印迹来执行SDS-PAGE分析。
图21B示出使用抗FVII、抗CTP和抗γ羧化抗体检测的被融合至三个、四个和五个CTP的FVII的蛋白印迹。FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5的收获物是使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)被加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶(expedeon)上的。使用抗CTP多克隆Ab(Adar Biotech Production)通过蛋白免疫印迹来执行SDS-PAGE分析。
图21C示出使用抗FVII、抗CTP和抗γ羧化抗体检测的被融合至三个、四个和五个CTP的FVII的蛋白印迹。FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5的收获物是使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)被加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶(expedeon)上的。使用抗GlaAb(American Diagnostica)通过蛋白免疫印迹来执行SDS-PAGE分析。
图22示出FVII活性-显色活性。使用市售的显色活性检测试剂盒，BIOPHEN(HyphenBioMed 221304)执行对HA纯化的(高度γ羧化组分)FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5与正常人池血浆的体外效力的比较性评估。将所有样品进行连续稀释且通过将剂量反应曲线与由正常人血浆组成的基准配置品进行比较来评估效力。
图23示出第一比较药代动力学(PK)曲线-FVII 3CTP、FVII 4CTP和FVII 5CTP。将FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5(分别为组A、组B和组C)按单次静脉注射以250μg/kg体重的剂量对Sprague Dawley大鼠(每次治疗六只大鼠)进行给药。在给药后的0.083小时、0.5小时、2小时、5小时、8小时、24小时、48小时、72小时和96小时交替地从3只大鼠进行血液样本的眶后抽取。在采样后，立即制备柠檬酸化的血浆(0.38％)并将其储存在-20℃直到进行分析为止。与另外两个版本相比，FVII-CTP5展现了出色的曲线。
图24示出第二比较PK曲线-FVII 3CTP、FVII 4CTP和FVII 5CTP。在FVII选择和HA纯化过程之后，将FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5(分别为组A、组B和组C)按单次静脉注射以29.45μg/kg体重的剂量对Sprague Dawley大鼠(每种物质三只大鼠)进行给药。在给药后的0.083小时、0.5小时、2小时、8小时、24小时、48小时和72小时进行血液样本的眶后抽取。在采样后，立即制备柠檬酸化的血浆(0.38％)并将其储存在-20℃直到进行分析为止。
图25A示出FVII-CTP3纯化过程的示意图。产生批次31以供PK/PD研究。
图25B示出FVII-CTP3纯化过程的示意图。产生批次38以供生存研究。
图26A示出最终的FVII和FVIIa的SDS-PAGE和蛋白印迹。将10μg的(批次31)或5μg的(批次38)加载在考马斯染色的SDS-PAGE的每条泳道中。1.FVII-CTP3多肽；2.重链，其包括3×CTP；3.轻链。所有三种抗体均检测到FVII。
图26B示出最终的FVII和FVIIa的SDS-PAGE和蛋白印迹。将10μg的(批次31)或5μg的(批次38)加载在考马斯染色的SDS-PAGE的每条泳道中。1.FVII-CTP3多肽；2.重链，其包括3×CTP；3.轻链。
图26C示出最终的FVII和FVIIa的SDS-PAGE和蛋白印迹。将10μg的(批次31)或5μg的(批次38)加载在考马斯染色的SDS-PAGE的每条泳道中。1.FVII-CTP3多肽；2.重链，其包括3×CTP；3.轻链。
图26D示出最终的FVII和FVIIa的SDS-PAGE和蛋白印迹。将10μg的(批次31)或5μg的(批次38)加载在考马斯染色的SDS-PAGE的每条泳道中。1.FVII-CTP3多肽；2.重链，其包括3×CTP；3.轻链。
图26E示出最终的FVII和FVIIa的SDS-PAGE和蛋白印迹。将10μg的(批次31)或5μg的(批次38)加载在考马斯染色的SDS-PAGE的每条泳道中。1.FVII-CTP3多肽；2.重链，其包括3×CTP；3.轻链。
图26F示出最终的FVII和FVIIa的SDS-PAGE和蛋白印迹。将1μg的蛋白加载在蛋白印迹的每条泳道中。1.FVII-CTP3多肽；2.重链，其包括3×CTP；3.轻链。所有三种抗体均检测到FVII。FVIIa轻链是用α-FVII检测的。
图26G示出最终的FVII和FVIIa的SDS-PAGE和蛋白印迹。将1μg的蛋白加载在蛋白印迹的每条泳道中。1.FVII-CTP3多肽；2.重链，其包括3×CTP；3.轻链。所有三种抗体均检测到FVII。FVIIa重链是由α-CTP检测的。
图26H示出最终的FVII和FVIIa的SDS-PAGE和蛋白印迹。将1μg的蛋白加载在蛋白印迹的每条泳道中。1.FVII-CTP3多肽；2.重链，其包括3×CTP；3.轻链。所有三种抗体均检测到FVII。FVIIa重链是由α-Gla检测的。
图27示出由于在陶瓷羟基磷灰石(HA)柱上的纯化，增强了FVII-CTP3的显色活性。使用市售的显色活性检测试剂盒，BIOPHEN(Hyphen BioMed 221304)进行对FVII-CTP3收获物、过程中的组分和纯化的FVII-CTP3与人池正常血浆的体外效力的比较性评估。将FVII-CTP3收获物和蛋白进行连续稀释且通过将剂量反应曲线与正常人血浆的基准配置品进行比较来评估效力。
图28示出在缺乏FVIII的小鼠中的FVIIa-CTP3与
的PK曲线。在FVII选择、HA纯化过程和活化后产生FVIIa-CTP3。将FVIIa-CTP3或
按单次静脉注射对FVIII-/-血友病小鼠进行给药。在给药后的0.083小时、0.5小时、2小时、8小时、24小时、48小时和72小时进行血液样本的眶后抽取。在采样后，立即制备柠檬酸化的血浆(0.38％)并将其储存在-20℃直到进行分析为止，且使用STACLOT商业试剂盒基于FVIIa凝结活性建立PK曲线。
图29A示出在FVII选择、HA纯化过程和活化后产生FVIIa-CTP3。将FVIIa-CTP3或
按单次静脉注射对FVIII-/-血友病小鼠进行给药。在给药后的0.083小时、0.5小时、2小时、8小时、24小时、48小时和72小时进行血液样本的眶后抽取。在采样后，立即制备柠檬酸化的血浆(0.38％)并将其储存在-20℃直到进行分析为止。在PK实验期间评估凝血酶生成参数，且评估包括针对峰的最大量的参数。
图29B示出在FVII选择、HA纯化过程和活化后产生FVIIa-CTP3。将FVIIa-CTP3或
按单次静脉注射对FVIII-/-血友病小鼠进行给药。在给药后的0.083小时、0.5小时、2小时、8小时、24小时、48小时和72小时进行血液样本的眶后抽取。在采样后，立即制备柠檬酸化的血浆(0.38％)并将其储存在-20℃直到进行分析为止。在PK实验期间评估凝血酶生成参数，且评估包括针对时间点的凝血酶的量的参数。
图29C示出在FVII选择、HA纯化过程和活化后产生FVIIa-CTP3。将FVIIa-CTP3或
按单次静脉注射对FVIII-/-血友病小鼠进行给药。在给药后的0.083小时、0.5小时、2小时、8小时、24小时、48小时和72小时进行血液样本的眶后抽取。在采样后，立即制备柠檬酸化的血浆(0.38％)并将其储存在-20℃直到进行分析为止。在PK实验期间评估凝血酶生成参数，且评估包括凝血酶生成速率的参数。
图30A示出在尾静脉切断(TVT)后的血友病小鼠的生存曲线。在给药后的15分钟执行TVT。在TVT之后对小鼠的存活观察24小时并在前12小时和24小时之后每一小时进行一次记录。对照组的数据(载体)是3次实验(5只小鼠/实验)的总和。
图30B示出在尾静脉切断(TVT)后的血友病小鼠的生存曲线。在给药后的24小时执行TVT。在TVT之后对小鼠的存活观察24小时并在前12小时和24小时之后每一小时进行一次记录。对照组的数据(载体)是3次实验(5只小鼠/实验)的总和。
图30C示出在尾静脉切断(TVT)后的血友病小鼠的生存曲线。在给药后的48小时执行TVT。在TVT之后对小鼠的存活观察24小时并在前12小时和24小时之后每一小时进行一次记录。对照组的数据(载体)是3次实验(5只小鼠/实验)的总和。
图30D概括了TVT后的24小时所记录小鼠存活。
图31A示出为GLA印迹的FVII-3-CTP和FVII-5CTP的免疫印迹。
图31B示出为FVII印迹的FVII-3-CTP和FVII-5CTP的免疫印迹。
图31C示出为CTP印迹的FVII-3-CTP和FVII-5CTP的免疫印迹。
图32示出来自选择和HA柱纯化的FVII 3CTP和FVII 5CTP的比较PK曲线(FVIIS对FVII HA)。
图33示出FVII 3CTP和FVII 5CTP的比较PK曲线-第二研究(IV对SC)。
图34示出在SC给药后经尾静脉切断(TVT)后的血友病小鼠的生存曲线。在给药后的12小时执行TVT。在TVT之后对小鼠的存活观察24小时并在前12小时和24小时之后每一小时进行一次记录。
图35A示出在IV给药后的MOD-5014与
的PK曲线。
图35B示出在SC给药后的MOD-5014与
的PK曲线。
图36示出在单次SC给药后的MOD-5014(克隆体61#75、#81)与
的PK曲线。
图37示出华法令增加了PT和aPTT值。使SD大鼠经口服用10mg/Kg的华法林，且在指定的时间点抽取血液样本。制备血浆并确定PT和aPTT值。
图38为IV注射MOD-5014和
对经华法林处理的大鼠的急性效应。
图39示出经华法林处理的大鼠在注射后的24小时对各种MOD-5014和
剂量的反应。
图40示出MOD-5014在给药后长达48小时内将PT值恢复至正常值，而
的作用在24小时后则不复存在。
图41示出与在注射
后的24小时和48小时相比，IV注射MOD-5014减少了经华法林处理的大鼠的出血时间。
图42示出MOD-5014能够在给药后长达48小时内将PT值恢复至正常值，而
的作用在24小时后则不复存在。
图43通过在给药后的48小时内将失血保持在低水平而显示出比
的优越性。
图44示出组织因子途径抑制剂(TFPI)以类似的剂量依赖的方式抑制MOD-5014和
图45示出抗凝血酶III以类似的方式抑制了MOD-5014和
图46示出由MOD-5014和
进行的因子X活化的结果，其几乎是相同的。
图47示出在TFPI(20μg/ml至0.002ng/ml)的存在下由以0.6ng/ml存在的MOD-5014和
进行的因子X活化。
图48示出在TFPI(20μg/ml至0.002ng/ml)的存在下由以4.0ng/ml存在的MOD-5014和
进行的因子X活化。
图49示出在TFPI和肝素的存在下的因子X活化，其中MOD-5014和
表现出相似的活化。
图50示出在抗凝血酶III的存在下的因子X活化，其中MOD-5014和
表现出相似的活化。
图51示出在肝素的存在下由MOD-5014和
进行的因子X活化，其中观察到相似的中度抑制。
图52示出在抗凝血酶和肝素的存在下由MOD-5014和
进行的相似的因子X活化。
图53示出与以高磷脂(PL)浓度的市售
相比的MOD-5014的凝血酶生成曲线。
图54示出与以低磷脂(PL)浓度的市售
相比的MOD-5014的峰值凝血酶生成曲线。
图55A和图55B示出针对MOD-5014和
的血栓弹性描记术结果，其中两者均减少了凝结时间并增加了凝块形成速率。
图56示出了再钙化之后的
的凝血酶生成(TG)的结果。(运行#1)
图57示出了再钙化之后的MOD-5014的凝血酶生成(TG)的结果。(运行#1)
图58的A-E提供了对在相似浓度的
(NS)结果相对于MOD-5014(PRO)TG结果的叠加分析。A：提供了在1.25μg/ml的结果。B：提供了在5μg/ml的结果。C：提供了在15μg/ml的结果。D：提供了在2.5μg/ml的结果。E：提供了在10μg/ml的结果。(运行#1)
图59的A-D提供了对在不同浓度的
(NS)结果相对于MOD-5014(PRO)TG结果的叠加分析。A：示出了在1.25μg/ml的NS和在2.5μg/ml的PRO的结果。B：示出了在5μg/ml的NS和在10μg/ml的PRO的结果。C：示出了在2.5μg/ml的NS和在5μg/ml的PRO的结果。D：示出了在10μg/ml的NS和在15μg/ml的PRO的结果。(运行#1)
图60示出了针对在不同浓度的NS的在再钙化之后的
(NS)的凝血酶生成(TG)的结果。(运行#2)
图61示出了针对在不同浓度的PRO的在再钙化之后的MOD-5014(PRO)的凝血酶生成(TG)的结果。(运行#2)
图62的A-E提供了对在相似浓度的
(NS)结果相对于MOD-5014(PRO)TG结果的叠加分析。A：提供了在1.25μg/ml的结果。B：提供了在5μg/ml的结果。C：提供了在15μg/ml的结果。D：提供了在2.5μg/ml的结果。E：提供了在10μg/ml的结果。(运行#2)
图63的A-D提供了对在不同浓度的
(NS)结果相对于MOD-5014(PRO)TG结果的叠加分析。A：示出了在1.25μg/ml的NS和在2.5μg/ml的PRO的结果。B：示出了在5μg/ml的NS和在10μg/ml的PRO的结果。C：示出了在2.5μg/ml的NS和在5μg/ml的PRO的结果。D：示出了在10μg/ml的NS和在15μg/ml的PRO的结果。(运行#2)
图64示出在低TF浓度下再钙化后由
进行的TG的数据。(运行#1)
图65示出在低TF浓度下再钙化后由MOD-5014进行的TG的数据。(运行#1)
图66的A-E提供了对在低TF下再钙化后的在相似浓度的
(NS)结果相对于MOD-5014(PRO)结果的叠加分析。A：提供了在1.25μg/ml的结果。B：提供了在5μg/ml的结果。C：提供了在15μg/ml的结果。D：提供了在2.5μg/ml的结果。E：提供了在10μg/ml的结果。(运行#1)
图67示出在低TF浓度下再钙化后由
进行的TG的数据。(运行#2)
图68示出在低TF浓度下再钙化后由MOD-5014进行的TG的数据。(运行#2)
图69的A-E提供了在低TF下再钙化后的在相似浓度的
(NS)结果相对于MOD-5014(PRO)TG结果的叠加分析。A：提供了在1.25μg/ml的结果。B：提供了在5μg/ml的结果。C：提供了在15μg/ml的结果。D：提供了在2.5μg/ml的结果。E：提供了在10μg/ml的结果。(运行#2)
图70的A-C提供了在低TF下再钙化后的在不同浓度下
(NS)结果相对于MOD-5014(PRO)TG结果的叠加分析。A：示出了在1.25μg/ml的NS和在5μg/ml的PRO的结果。B：示出了在5μg/ml的NS和在15μg/ml的PRO的结果。C：示出了在2.5μg/ml的NS和在10μg/ml的PRO的结果。(运行#2)
图71示出在存在和不存在低TF的情况下作为与
和MOD-5014的结果的比较的由FVIII进行的完全的凝血酶生成。
图72提供了在存在和不存在低TF的情况下对由FVIII进行的凝血酶生成的叠加分析。
图73提供了在逐步上升的TF浓度下的
(NS；1.25μg/kg)TG结果相对于MOD-5014(PRO；1.25μg/kg)TG结果的叠加分析。(运行#1)
图74的A-E提供了在逐步上升的TF浓度下的
(NS；1.25μg/kg)TG结果相对于MOD-5014(PRO；1.25μg/kg)TG结果的叠加分析。A：提供了在0pM的TF的结果。B：提供了在1pM的TF的结果。C：提供了在5pM的TF的结果。D：提供了在0.5pM的TF的结果。E：提供了在2.5pM的TF的结果。(运行#1)
图75提供了在逐步上升的TF浓度下的
(NS；2.5μg/kg)TG结果相对于MOD-5014(PRO；2.5μg/kg)TG结果的叠加分析。(运行#1)
图76的A-E提供了在逐步上升的TF浓度下的
(NS；2.5μg/kg)TG结果相对于MOD-5014(PRO；2.5μg/kg)结果的叠加分析。A：提供了在0pM的TF的结果。B：提供了在1pM的TF的结果。C：提供了在5pM的TF的结果。D：提供了在0.5pM的TF的结果。E：提供了在2.5pM的TF的结果。(运行#1)
图77提供了在逐步上升的TF浓度下的
(NS；5μg/kg)TG结果相对于MOD-5014(PRO；5μg/kg)结果的叠加分析。(运行#1)
图78的A-E提供了在逐步上升的TF浓度下的
(NS；5μg/kg)TG结果相对于MOD-5014(PRO；5μg/kg)TG结果的叠加分析。A：提供了在0pM的TF的结果。B：提供了在1pM的TF的结果。C：提供了在5pM的TF的结果。D：提供了在0.5pM的TF的结果。E：提供了在2.5pM的TF的结果。(运行#1)
图79的A-C示出了在逐步上升的TF浓度下的在
(Ns)的存在下的剂量依赖的TG反应。A：提供了在1.25μg/kg的NS的结果。B：提供了在5μg/kg的NS的结果。C：提供了在2.5μg/kg的NS的结果。(运行#1)
图80的A-C示出了在逐步上升的TF浓度下的在MOD-5014(PRO)的存在下的剂量依赖的TG反应。A：提供了在1.25μg/kg的PRO的结果。B：提供了在5μg/kg的PRO的结果。C：提供了在2.5μg/kg的PRO的结果。(运行#1)
图81提供了在逐步上升的TF浓度下的
(NS；10μg/kg)TG结果相对于MOD-5014(PRO；10μg/kg)TG结果的叠加分析。(运行#2)
图82提供了在逐步上升的TF浓度下的
(NS；2.5μg/kg)TG结果相对于MOD-5014(PRO；2.5μg/kg)TG结果的叠加分析。(运行#2)
图83提供了在逐步上升的TF浓度下的
(NS；5μg/kg)TG结果相对于MOD-5014(PRO；5μg/kg)结果的叠加分析。(运行#2)
图84的A-C示出了在逐步上升的TF浓度下的在
(NS)的存在下的剂量依赖的TG反应。A：提供了在2.5μg/ml的NS的结果。B：提供了在10μg/ml的NS的结果。C：提供了在5μg/ml的NS的结果。(运行#2)
图85的A-C示出了在逐步上升的TF浓度下的在MOD-5014(PRO)的存在下的剂量依赖的TG反应。A：提供了在2.5μg/ml的PRO的结果。B：提供了在10μg/ml的PRO的结果。C：提供了在5μg/ml的PRO的结果。(运行#2)
图86的A-E提供了对在逐步上升的TF浓度下的
(NS；10μg/kg)TG结果相对于MOD-5014(PRO；10μg/kg)TG结果的叠加分析。A：提供了在0pM的TF的结果。B：提供了在1pM的TF的结果。C：提供了在5pM的TF的结果。D：提供了在0.5pM的TF的结果。E：提供了在2.5pM的TF的结果。(运行#2)
图87的A-E提供了在逐步上升的TF浓度下的
(NS；2.5μg/kg)TG结果相对于MOD-5014(PRO；2.5μg/kg)TG结果的叠加分析。A：提供了在0pM的TF的结果。B：提供了在1pM的TF的结果。C：提供了在5pM的TF的结果。D：提供了在0.5pM的TF的结果。E：提供了在2.5pM的TF的结果。(运行#2)
图88的A-E提供了在逐步上升的TF浓度下的
(NS；5μg/kg)TG结果相对于MOD-5014(PRO；5μg/kg)TG结果的叠加分析。A：提供了在0pM的TF的结果。B：提供了在1pM的TF的结果。C：提供了在5pM的TF的结果。D：提供了在0.5pM的TF的结果。E提供了在2.5pM的TF的结果。(运行#2)
图89示出了在将MOD-5014掺入犬血之后的WBCT的曲线图。
图90示出二室药代动力学模型的示意图。
图91提供了在对狗进行IV输注后的平均血浆MOD-5014浓度相对于时间的图。
图92提供了在对狗进行IV输注后的平均血浆MOD-5014活性相对于时间的图。
图93A至图93B示出在对狗进行50μg/kg的IV输注后的MOD-5014血浆浓度和活性的比较数据。图93A示出狗P14的结果，且图93B示出狗N06的结果。
图94A至图94D示出在对狗进行200μg/kg的IV输注后的MOD-5014血浆浓度和活性的比较数据。图94A示出狗Blondie的结果；图94B为狗Josie的结果；图94C为狗N06的结果；且图94D为狗P14的结果。
图95A至图95B示出在对狗进行400μg/kg的IV输注后的MOD-5014血浆浓度和活性的比较数据。图95A示出狗Blondie的结果，且图95B示出狗Josie的结果。
图96A至图96B示出在对狗进行600μg/kg的IV输注后的MOD-5014血浆浓度和活性的比较数据。图96A示出狗N05的结果，且图96B示出狗Joanie的结果。
图97A至图97J示出血浆MOD-5014浓度相对于时间的图。点表示观察到的血浆浓度，且线表示用于计算T1/2的末端斜率。图97A示出超过30小时后的狗N06的结果；图97B为超过30小时后的狗P14的结果；图97C为约50小时后的狗Blondie的结果；图97D为约50小时后的狗Josie的结果；图97E为几乎100小时后的狗N06的结果；图97F为几乎100小时后的狗P14的结果；图97G为几乎100小时后的狗Blondie的结果；图97H为几乎100小时后的狗Josie的结果；图97I为几乎100小时后的狗Joanie的结果且图97J为几乎100小时后的狗N05的结果。
图98A至图98J示出血浆MOD-5014活性相对于时间的图。点表示观察到的血浆浓度且线表示用于计算T1/2的末端斜率。图98A示出超过30小时后的狗N06的结果；图98B为超过30小时后的狗P14的结果；图98C为几乎50小时后的狗Blondie的结果；图98D为几乎50小时后的狗Josie的结果；图98E为几乎50小时后的狗N06的结果；图98F为几乎50小时后的狗P14的结果；图98G为几乎50小时后的狗Blondie的结果；图98H为几乎50小时后的狗Josie的结果；图98I为几乎50小时后的狗Joanie的结果且图98J为几乎50小时后的狗N05的结果。
图99A至图99J示出建模结果-血浆浓度。点表示观察到的血浆浓度且实线表示通过模型预测的浓度。图99A示出对狗N06的观察和预测的结果；图99B为狗P14的结果；图99C为狗Blondie的结果；图99D为狗Josie的结果；图99E为几乎100小时后的狗N06的结果；图99F为几乎100小时后的狗P14的结果；图99G为几乎100小时后的狗Blondie的结果；图99H为几乎100小时后的狗Josie的结果；图99I为几乎100小时后的狗Joanie的结果且图99J为几乎100小时后的狗N05的结果。
图100A至图100J示出建模结果-活性。点表示观察到的血浆活性且实线表示通过模型预测的活性。图100A示出至少32小时后的对狗N06的观察和预测的结果；图100B为至少32小时后的狗P14的结果；图100C为至少48小时后的狗Blondie的结果；图100D为至少48小时后的狗Josie的结果；图100E为至少48小时后的狗N06的结果；图100F为至少48小时后的狗P14的结果；图100G为至少48小时后的狗Blondie的结果；图100H为至少48小时后的狗Josie的结果；图100I为至少48小时后的狗Joanie的结果且图100J为至少48小时后的狗N05的结果。
图101的A-D示出在对狗NO6进行50μg/kg、200μg/kg或400μg/kg的MOD-5014给药之后高岭土引发的TEG动力学方面的剂量依赖性变化。A：示出R时间(反应时间)；B：示出K时间(从R结束到凝块达到20mm的时间，凝块形成的速度)；C：示出角度(当达到K时所制曲线的切线)；和D：示出MA(最大幅度)。
图102的A-D示出在对狗P-14进行50μg/kg和200μg/kg的MOD-5014的给药之后高岭土引发的TEG动力学方面的剂量依赖性变化。A：示出R时间(反应时间)；B：示出K时间(从R结束到凝块达到20mm的时间，凝块形成的速度)；C：示出角度(当达到K时所制曲线的切线)；和D：示出MA(最大幅度)。
图103的A-D示出在对狗Blondie进行200μg/kg和400μg/kg的MOD-5014的给药之后高岭土引发的TEG动力学方面的剂量依赖性变化。A：示出R时间(反应时间)；B：示出K时间(从R结束到凝块达到20mm的时间，凝块形成的速度)；C：示出角度(当达到K时所制曲线的切线)；和D：示出MA(最大幅度)。
图104的A-D示出在对狗Josie进行200μg/kg和400μg/kg的MOD-5014的给药之后高岭土引发的TEG动力学方面的剂量依赖性变化。A：示出R时间(反应时间)；B：示出K时间(从R结束到凝块达到20mm的时间，凝块形成的速度)；C：示出角度(当达到K时所制曲线的切线)；和D：示出MA(最大幅度)。
图105的A-D示出在对狗Joanie进行50μg/kg、200μg/kg或400μg/kg的MOD-5014的给药之后高岭土引发的TEG动力学方面的剂量依赖性变化。A：示出R时间(反应时间)；B：示出K时间(从R结束到凝块达到20mm的时间，凝块形成的速度)；C：示出角度(当达到K时所制曲线的切线)；和D：示出MA(最大幅度)。
图106的A-D示出在对狗NO5进行MOD-5014给药后TEG随时间的动力学。A：示出R时间(反应时间)；B：示出K时间(从RT结束到凝块达到20mm的时间，凝块形成的速度)；C：示出角度(当达到K时所制曲线的切线)；和D：示出MA(最大幅度)。
图107的A-D示出在进行270μg/kg的rhFVIIa的给药后TEG性能的变化。A：示出R时间(反应时间)。B：示出角度(当达到K时所制曲线的切线)。C：示出K时间(从RT结束到凝块达到20mm的时间，凝块形成的速度)。D：示出MA(最大幅度)。
图108的A-D示出MOD-5014的延长TEG效应，源于个体动物(Blondie)的代表性数据。A：示出R时间(反应时间)。B：示出K时间(从RT结束到凝块达到20mm的时间，凝块形成的速度)。C：示出角度(当达到K时所制曲线的切线)。D：示出MA(最大幅度)。在B、C和D中的箭头指向给药后4小时的MOD-5014TEG值。
图109示出pCI-dhfr-MOD-5014质粒的图。
图110示出大鼠毒理学研究的组合代表性PK-PD曲线，其中血浆浓度(ng/ml)随时间的变化速率由空心方块表示，且活性(mU/ml)随时间的变化速率由空心圆表示。
图111示出猴毒理学研究的组合代表性PK-PD曲线，其中血浆浓度(ng/ml)随时间的变化速率由空心圆表示，且活性(mU/ml)随时间的变化速率由空心方块表示。
图112示出对雄性食蟹猴进行IV团注给药后的平均血浆MOD-5014浓度vs时间。
图113示出对雄性食蟹猴进行IV团注给药后的平均MOD-5014凝结活性vs时间。
图114为对雄性食蟹猴进行1mg/kg的IV团注后MOD-5014的血浆浓度和凝结活性的比较。
图115为对雄性食蟹猴进行7.5mg/kg的IV团注后MOD-5014的血浆浓度和凝结活性的比较。
图116为对雄性食蟹猴进行15mg/kg的IV团注后MOD-5014的血浆浓度和凝结活性的比较。
图117A至图117R为各个血浆MOD-5014浓度和凝结活性vs时间。
图118为经MOD-5014或FVIIa处理的血小板的平均荧光强度。
图119为在经MOD-5014或FVIIa处理的血小板中的凝血酶生成。
图120示出在FVIIa(NovoSeven)和经CTP修饰的因子VIIa(MOD-5014)之间的底物(Pefachrome FVIIa)的切割活性的比较。
图121示出当被结合至组织因子时，在FVIIa(NovoSeven)和经CTP修饰的因子VIIa(MOD-5014)之间的底物(Pefachrome FVIIa)的活性的比较。
图122示出考虑到因子VIIa浓度的由FVIIa(NovoSeven)或经CTP修饰的FVIIa(MOD-5014)导致的活化因子X的生成的比较。
图123示出考虑到因子X浓度的由FVIIa(NovoSeven)或经CTP修饰的FVIIa(MOD-5014)导致的活化因子X的生成的比较。
图124A和124B示出在不存在组织因子的情况下且考虑到脂质浓度的由FVIIa(NovoSeven)或经CTP修饰的FVIIa(MOD-5014)导致的活化因子X的生成速率的比较(124A)。示出在不存在组织因子的情况下且考虑到脂质浓度的由FVIIa(NovoSeven)或经CTP修饰的FVIIa(MOD-5014)导致的活化因子X的生成的比较(124B)。
图125示出在不存在组织因子的情况下且考虑到因子X浓度的在FVIIa(NovoSeven)和MOD-5014之间的活化因子X的生成的比较。
图126示出考虑到聚凝胺的FVIIa(NovoSeven)和经CTP修饰的FVIIa(MOD-5014)对底物(Pefachrome FVIIa)切割的抑制的比较。
图127A至图127C示出考虑到TFPI浓度(图127A)和针对FVIIa(图127B)和MOD-5014(图127C)的TFPI暴露的持续时间的FVIIa(NovoSeven)和经CTP修饰的FVIIa(MOD-5014)对底物(Pefachrome FXa)切割的抑制的比较。
具体实施方式
在一个实施例中，本发明提供了长效凝固因子及其产生和使用方法。在另一个实施例中，长效凝固因子包括羧基末端肽(CTP，也被称为CTP单元)。在另一个实施例中，包括凝固因子的长效多肽还包括人绒毛膜促性腺激素(hCG)的羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，CTP充当防止凝血因子降解的保护剂。在另一个实施例中，CTP延长了凝固因子的Cmax。在另一个实施例中，CTP延长了凝固因子的Tmax。在另一个实施例中，CTP延长了凝固因子的循环半衰期。在另一个实施例中，CTP增强了凝固因子的效力。
在另一个实施例中，本文提供了一种延长凝固因子的生物半衰期的方法，其包括将一个到十个CTP附接至凝固因子的羧基末端的步骤，从而延长凝固因子的生物半衰期。在另一个实施例中，本文提供了一种延长凝固因子的生物半衰期的方法，其包括将一个到五个CTP附接至凝固因子的羧基末端的步骤，从而延长凝固因子的生物半衰期。在另一个实施例中，本发明提供了一种用于延长凝固因子的循环半衰期的方法。在另一个实施例中，本发明提供了一种用于增加凝固因子的半衰期的方法。在另一个实施例中，本发明提供了一种用于延长凝固因子的半衰期的方法。
在一个实施例中，本公开涉及一种药物组合物，其包括经CTP修饰的凝固因子。
在一个实施例中，本公开涉及一种药物制剂，其包括缓冲液、张度剂和经CTP修饰的多肽，该经CTP修饰的多肽是由凝固因子和被附接至该凝固因子的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素CTP组成的。
在一个实施例中，本公开涉及一种用于对具有血友病A或B的受试者进行每周一次给药的制剂。在另一个实施例中，受试者缺乏凝固因子。在另一个实施例中，受试者具有获得性血友病。在另一个实施例中，本公开涉及一种用于制造用于对缺乏凝固因子或具有血友病的受试者进行每周一次给药的药物制剂的工艺，该工艺包括下列步骤：
a)通过将三个绒毛膜促性腺激素CTP附接至该凝固因子的羧基末端来修饰凝固因子；
b)将步骤a中的经修饰的凝固因子与缓冲液进行混合，且张度剂在约6.4的pH下；以及
c)用该制剂预填充注射器。
在一个实施例中，本公开涉及一种用于以本文提供的制剂填充注射器的工艺，其包括下列步骤：
a)配制具有预定量的经CTP修饰的凝固因子的该经CTP修饰的凝固因子的每周一次的剂型；以及
b)用该制剂填充注射器。
在一个实施例中，“药物组合物”或“药物制剂”是指本文所述的活性成分中的一个或多个与其他化学组分，诸如生理学适合的载体和赋形剂的制剂。药物组合物或“药物制剂”的目的是用于促进化合物至有机体的给药。在某些实施例中，“药物组合物”或“药物制剂”提供了药物的药物剂型。在某些实施例中，“药物组合物”或“药物制剂”包括缓释技术、透皮贴剂或本领域中的任何已知的剂型。
凝固因子VII(FVII)是由肝细胞分泌至血流中的作为无活性的前酶的444个氨基酸的糖蛋白(50KDa)。在组织损伤和暴露于循环血液时，FVII与组织因子(TF)形成复合物，该组织因子(TF)是FVII的真正受体蛋白且是由位于血管壁较深层中的各种细胞进行表达的。该FVII-TF复合物的形成引起了FVII的活化。活化的FVII(FVIIa)通过活化因子IX和因子X来发起外源性凝固途径。
FVII属于与凝固系统相关联的一组维生素K依赖性糖蛋白。除了FVII之外，该组由因子IX、因子X、蛋白C和前凝血酶组成。这些蛋白具有类似的结构域组织且被合成为具有随后是成熟氨基酸序列的N末端前肽的前体。前肽包含用于将谷氨酸(Glu)转换成γ羧基谷氨酸(Gla)的γ羧化酶的停泊位点。该结构域的后面是两个表皮生长因子样(EGF)结构域、连接区(CR)和C末端丝氨酸蛋白酶结构域。在分泌之前，FVII前肽被切割形成406个氨基酸的单链酶原FVII糖蛋白。在分泌之后，能够通过在CR中进行切割来将蛋白活化成二硫键连接的双链异源二聚体FVIIa。FVII的血浆浓度是10nM，且约1％在健康个体中以活性形式循环。在其他实施例中，经CTP修饰的FVII包括占据至少一个O-连接的糖基化位点。在其他实施例中，经CTP修饰的FVIIa包括占据至少一个O-连接的糖基化位点。
因子IX(FIX)是415个氨基酸(55KDa)的糖蛋白；其属于与凝固系统相关联的一组维生素K依赖性糖蛋白。FIX与被合成为具有随后是成熟氨基酸序列的N末端前肽的前体的因子FVII、因子X、蛋白C和前凝血酶具有相类似的结构域组织。
FIX被分泌为单链分子，其经历了复杂的转录后修饰，其中的许多对于其生物化学和药代动力学特性来说是至关重要的。在所有的转录后修饰中，由维生素K依赖性的γ羧化酶进行γ羧化的接近FIX的氨基末端的12个谷氨酸残基是最关键的。需要进行羧化以用于FIX与磷脂表面的相互作用以及用于实现最佳的FIX活性。氨基末端前肽用作γ羧化酶的识别位点，且因此在γ羧化之后，其通过被称为成对的碱性氨基酸切割酶(PACE/弗林蛋白酶)的高尔基体丝氨酸蛋白酶切割掉。在高尔基体可能发生四个额外的转录后修饰：酪氨酸155的硫酸化、丝氨酸158的磷酸化、在Ser63和61上的O-糖基化以及最后在Asn 157和16上的N-糖基化，但它们却被示为不是为了实现FIX的合适的活性而必需的。
FIX在血浆中作为单链无活性的酶原进行循环(平均浓度为5μg/ml)。当通过一种或两种生理活化剂FVIIa-TF复合物或FIXa在两个肽键：Arg145和Arg180进行蛋白水解切割之后，去除活化肽，这将FIX转换为由通过单个二硫键连接的轻链和重链组成的完全活性酶。N末端轻链含有非催化性γ羧基谷氨酸(Gla)和两个表皮生长因子样结构域，而C末端重链含有分子的胰蛋白酶样催化结构域。单独的FIXa的特征在于很差的催化活性。然而，当与FVIII复合时，其蛋白水解活性对于其天然底物FX增加了4-5个数量级。
在另一个实施例中，本文提供了一种延长生物半衰期的方法或一种改进凝固因子的曲线下面积(AUC)的方法，其包括将一个到十个CTP附接至凝固因子的羧基末端的步骤，从而延长生物半衰期或改进凝固因子的AUC。在另一个实施例中，本文提供了一种延长生物半衰期的方法或一种改进凝固因子的曲线下面积(AUC)的方法，其包括将一个到五个CTP附接至凝固因子的羧基末端的步骤，从而延长生物半衰期或改进凝固因子的AUC。在另一个实施例中，本文提供了一种延长生物半衰期的方法或一种改进FIX的曲线下面积(AUC)的方法，其包括将一个到五个CTP附接至FIX的羧基末端的步骤，从而延长生物半衰期或改进FIX的AUC。在另一个实施例中，本文提供了一种延长生物半衰期的方法或一种改进FVII或FVIIa的曲线下面积(AUC)的方法，其包括将一个到五个CTP附接至FVII或FVIIa的羧基末端的步骤，从而延长生物半衰期或改进FVII或FVIIa的AUC。
在另一个实施例中，本发明提供了一种延长因子IX(FIX)多肽的生物半衰期的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FIX多肽的羧基末端的步骤，从而延长该FIX多肽的生物半衰期。在另一个实施例中，本发明提供了一种延长因子VIIa(FVIIa)多肽的生物半衰期的方法，其包括将一个到至多五个的绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVIIa多肽的羧基末端的步骤，从而延长该FVIIa多肽的生物半衰期。在一个实施例中，三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)被附接至该FVIIa多肽的羧基末端。在另一个实施例中，四个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)被附接至该FVIIa多肽的羧基末端。在另一个实施例中，五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)被附接至该FVIIa多肽的羧基末端。
在另一个实施例中，本发明提供了一种改进因子IX(FIX)多肽的曲线下面积(AUC)的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FIX多肽的羧基末端的步骤，从而改进该FIX多肽的AUC。在另一个实施例中，本发明提供了一种改进因子VIIa(FVIIa)多肽的曲线下面积(AUC)的方法，其包括将至多五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVIIa多肽的羧基末端的步骤，从而改进该FVIIa多肽的AUC。在一个实施例中，三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)被附接至该FVIIa多肽的羧基末端。在另一个实施例中，四个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)被附接至该FVIIa多肽的羧基末端。在另一个实施例中，五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)被附接至该FVIIa多肽的羧基末端。
在另一个实施例中，本公开的凝固因子为蛋白。在另一个实施例中，本公开的凝固因子为肽。在另一个实施例中，本公开的凝固因子为多肽。在另一个实施例中，凝固因子为酶。在另一个实施例中，凝固因子为丝氨酸蛋白酶。在另一个实施例中，凝固因子为糖蛋白。在另一个实施例中，凝固因子为转谷氨酰胺酶。在另一个实施例中，凝固因子为无活性的酶原。在另一个实施例中，凝固因子为本领域的技术人员已知的任何凝固因子。
在另一个实施例中，凝固因子为因子VIII(FVIII)。在另一个实施例中，凝固因子为因子V(FV)。在另一个实施例中，凝固因子为因子XIII(FXIII)。在另一个实施例中，凝固因子为因子X(FX)。在另一个实施例中，凝固因子为纤维蛋白。
在另一个实施例中，凝固因子为因子VIIa(FVIIa)。在另一个实施例中，凝固因子为因子VII(FVII)。在另一个实施例中，凝固因子为因子IX(FIX)。在另一个实施例中，凝固因子为因子X(FX)。在另一个实施例中，凝固因子为因子XIa(FXIa)。在另一个实施例中，凝固因子为因子XII(FXII)。在另一个实施例中，凝固因子为因子Xa(FXa)。在另一个实施例中，凝固因子为因子Va(FVa)。在另一个实施例中，凝固因子为前凝血酶。在另一个实施例中，凝固因子为凝血酶。在另一个实施例中，凝固因子为因子XI(FXI)。在另一个实施例中，凝固因子为血管性血友病因子(vWF)。在另一个实施例中，凝固因子为因子VIIIa(FVIIIa)。在另一个实施例中，凝固因子为B缺失的结构域FVIII(FVIIIBDD)。在另一个实施例中，凝固因子为B结构域缺失的FVIII(FVIIIBDD)。在另一个实施例中，凝固因子为β结构域缺失的FVIII(FVIIIBDD)。在另一个实施例中，凝固因子为因子IXa(FIXa)。在另一个实施例中，凝固因子为前激肽释放酶。在另一个实施例中，凝固因子为激肽释放酶。在另一个实施例中，凝固因子为因子XIIa(FXIIa)。在另一个实施例中，凝固因子为纤维蛋白原。在另一个实施例中，凝固因子为凝血酶调节蛋白。在另一个实施例中，凝固因子为因子II(FII)。
在另一个实施例中，凝固因子为糖蛋白。在另一个实施例中，凝固因子为维生素K依赖性糖蛋白。在另一个实施例中，凝固因子为维生素K非依赖性糖蛋白。
在另一个实施例中，凝固因子为重组蛋白。在另一个实施例中，凝固因子为重组糖蛋白。在另一个实施例中，凝固因子为重组糖蛋白FV。在另一个实施例中，凝固因子为重组FVI。在另一个实施例中，凝固因子为重组FVII。在另一个实施例中，凝固因子为重组FVIII。在另一个实施例中，凝固因子为重组FIX。在另一个实施例中，凝固因子为重组FX。在另一个实施例中，凝固因子为重组FXI。在另一个实施例中，凝固因子为重组FXII。在另一个实施例中，凝固因子为重组FvW。在另一个实施例中，凝固因子为重组FII。在另一个实施例中，凝固因子为重组FIXa。在另一个实施例中，凝固因子为重组FXIa。在另一个实施例中，凝固因子为重组纤维蛋白。在另一个实施例中，凝固因子为重组FVIIa。在另一个实施例中，凝固因子为重组FXa。在另一个实施例中，凝固因子为重组FVa。在另一个实施例中，凝固因子为重组前凝血酶。在另一个实施例中，凝固因子为重组凝血酶。在另一个实施例中，凝固因子为重组FVIIIa。在另一个实施例中，凝固因子为重组前激肽释放酶。在另一个实施例中，凝固因子为重组激肽释放酶。在另一个实施例中，凝固因子为重组FXIIa。在另一个实施例中，凝固因子为任何已知的重组凝固因子。在另一个实施例中，包括信号肽的凝固因子为任何已知的重组凝固因子。在另一个实施例中，重组凝固因子不包括信号肽。在另一个实施例中，活化的凝固因子不包括信号肽。
在另一个实施例中，凝固因子包括被附接至C末端的1至10个CTP重复序列且不包括被附接至N末端的CTP。在另一个实施例中，凝固因子包括被附接至C末端的至少一个CTP且不包括被附接至N末端的CTP。在另一个实施例中，包括被附接至C末端的1至10个CTP重复序列且不包括被附接至N末端的CTP的凝固因子为工程化的凝固因子。在另一个实施例中，包括被附接至C末端的至少一个CTP且不包括被附接至N末端的CTP的凝固因子为工程化的凝固因子。在另一个实施例中，包括被附接至C末端的1至10个CTP重复序列且不包括被附接至N末端的CTP的凝固因子为共轭凝固因子。在另一个实施例中，包括被附接至C末端的至少一个CTP且不包括被附接至N末端的CTP的凝固因子为共轭凝固因子。
在一个实施例中，本发明提供了一种经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，其由FIX多肽和被附接至该经CTP修饰的FIX多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成。
在另一个实施例中，本发明还提供了一种经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽，其由FVIIa多肽和被附接至该FVIIa的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成。在另一个实施例中，本发明还提供了一种经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽，其由FVIIa多肽和被附接至该FVIIa的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成。
在另一个实施例中，凝固因子为包括与FIX、FVII、因子X、蛋白C或前凝血酶的结构域组织相似或相同的结构域组织的凝固因子。在另一个实施例中，凝固因子被合成为具有N末端前肽的前体。在另一个实施例中，如本文所使用的凝固因子为无活性的前酶形式。在另一个实施例中，凝固因子在肝细胞中产生。在另一个实施例中，凝固因子包括用于将谷氨酸(Glu)转换成γ羧基谷氨酸(Gla)的γ羧化酶的停泊位点。在另一个实施例中，如本文所使用的凝固因子为市售凝固因子。
在一个实施例中，对因子VII进行编码的核酸序列包括下列核酸序列：ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctgacgggcatcgtcagctggggccagggctgcgcaaccgtgggccactttggggtgtacaccagggtctcccagtacatcgagtggctgcaaaagctcatgcgctcagagccacgcccaggagtcctcctgcgagccccatttccctgaggatgcggccgc(SEQ ID NO：11)。
在另一个实施例中，因子VII的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP(SEQ ID NO：9)。
在另一个实施例中，因子VII的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP*GCGR(SEQ ID NO：10)。
在另一个实施例中，对因子VII-CTP(被附接至羧基末端)进行编码的核酸序列包括下列核酸序列：
ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagcgacacccccatcctgccccagtgaggatccgcggccgc(SEQ ID NO：12)。
在另一个实施例中，因子VII-CTP(被附接至羧基末端)的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ*(SEQ ID NO：13)。
在另一个实施例中，对因子VII-CTP-CTP(被附接至羧基末端)进行编码的核酸序列包括下列核酸序列：
ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgccaggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatccgcggccgc(SEQ ID NO：14)。
在另一个实施例中，因子VII-CTP-CTP(被附接至羧基末端)的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**(SEQ ID NO：15)。
在另一个实施例中，对因子VII-CTP-CTP-CTP(被附接至羧基末端)进行编码的核酸序列包括下列核酸序列：
ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctccagcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaaggctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtgatgaggatccgcggccgcttaattaa(SEQ ID NO：24)。
在另一个实施例中，因子VII-CTP-CTP-CTP(被附接至羧基末端)的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO：25)。在另一个实施例中，SEQ ID NO：25的氨基酸1至38包括信号序列。
在另一个实施例中，缺少信号肽的因子VII-CTP-CTP-CTP(被附接至羧基末端)的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：
在另一个实施例中，活化的因子VII-CTP-CTP-CTP(被附接至羧基末端)(FVIIa-CTP3)的氨基酸序列缺少信号肽并包括如在SEQ ID NO：46中所列出的氨基酸序列。在另一个实施例中，FVIIa-CTP3缺少信号肽且包括SEQ ID NO：46的同源物。在另一个实施例中，FVIIa-CTP3缺少信号肽且包括SEQ ID NO：46的变体。在另一个实施例中，FVIIa-CTP3的氨基酸序列在位于残基152处的精氨酸(R)和位于残基153处的异亮氨酸(I)之间被切割。在另一个实施例中，FVIIa-CTP3的氨基酸序列在结构上作为二硫键连接的双链异源二聚体存在，该二硫键连接的双链异源二聚体包括在每条链上存在的半胱氨酸残基之间的二硫键S-S桥。在另一个实施例中，FVIIa-CTP3的氨基酸序列在结构上是作为异源二聚体存在的，该异源二聚体包括由在存在于轻链中的半胱氨酸残基和存在于重链中的半胱氨酸残基之间的二硫-S-S-键连接的轻链和重链。在另一个实施例中，轻链包括FVIIa-CTP3氨基酸序列的N末端片段，且重链包括FVIIa-CTP3氨基酸序列的C末端片段。在另一个实施例中，半胱氨酸残基可以是任一链中的任何半胱氨酸残基。在另一个实施例中，FVIIa-CTP3的氨基酸序列在结构上是作为二硫键连接的双链异源二聚体存在的，该二硫键连接的双链异源二聚体包括在SEQ ID NO：46的半胱氨酸残基135和半胱氨酸残基262之间的S-S桥，其中该双链包括含有氨基酸1至152的轻链以及含有氨基酸153至490的重链。
在另一个实施例中，轻链在变性条件下在SDS-PAGE中以约25kDA迁移。在另一个实施例中，重链在变性条件下在SDS-PAGE中以约50kDA迁移。在另一个实施例中，重链在变性条件下在SDS-PAGE中以约60kDA迁移。
在另一个实施例中，对因子VII-(CTP)4(被附接至羧基末端)进行编码的核酸序列包括下列核酸序列：
ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctccagcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaaggctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtgatgaggatccgc(SEQ ID NO：26)。
在另一个实施例中，因子VII-(CTP)4(被附接至羧基末端)的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：
LEDMVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO：27)。
在另一个实施例中，对因子VII-(CTP)5(被附接至羧基末端)进行编码的核酸序列包括下列核酸序列：
ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctctaaggctccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaaggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtctgccctctccaagcagactccctggcccttcagacactccaatcctcccacagtcctctagctctaaagctccacctcccagcctgcccagccctagtagactccccggaccttctgatacccccatcttgccccagtgatgaggatccgc(SEQ ID NO：28)。
在另一个实施例中，因子VII-(CTP)5(被附接至羧基末端)的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：
LEDMVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGS(SEQ ID NO：29)。
在另一个实施例中，对因子IX进行编码的核酸序列包括下列核酸序列：
gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccattgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttctccagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcacttgaacgcggccgc(SEQ ID NO：16)。
在另一个实施例中，因子IX的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT*(SEQ IDNO：17)。
在另一个实施例中，对因子IX-CTP(被附接至羧基末端)进行编码的核酸序列包括下列核酸序列：
gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagtgatgaaggtctggatccgcggccgc(SEQ ID NO：18)。
在另一个实施例中，因子IX-CTP(被附接至羧基末端)的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO：19)。
在另一个实施例中，对因子IX-CTP-CTP(被附接至羧基末端)进行编码的核酸序列包括下列核酸序列：
gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatccgcggccgc(SEQID NO：20)。
在另一个实施例中，因子IX-CTP-CTP(被附接至羧基末端)的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ IDNO：21)。
在另一个实施例中，对因子IX-(CTP)3(被附接至羧基末端)进行编码的核酸序列包括下列核酸序列：
tctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctccagcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaaggctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtgatgaggatccgcggccgc(SEQ ID NO：30)。
在另一个实施例中，因子IX-(CTP)3(被附接至羧基末端)的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO：31)。
在另一个实施例中，对因子IX-(CTP)4(被附接至羧基末端)进行编码的核酸序列包括下列核酸序列：
tctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctctaaggccccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaaggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtctgccctctccaagcagactccctggcccttcagacactcccattctgccacagtgatgaggatccgcggccgc(SEQ ID NO：32)。
在另一个实施例中，因子IX-(CTP)4(被附接至羧基末端)的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：
SRVDPAMQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGSAA(SEQ ID NO：33)。
在另一个实施例中，对因子IX-(CTP)5(被附接至羧基末端)进行编码的核酸序列包括下列核酸序列：
ctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctctaaggctccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaaggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtctgccctctccaagcagactccctggcccttcagacactccaatcctcccacagtcctctagctctaaagctccacctcccagcctgcccagccctagtagactccccggaccttctgatacccccatcttgccccagtgatgaggatccgcggccgc(SEQ ID NO：34)。
在另一个实施例中，因子IX-(CTP)5(被附接至羧基末端)的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：
RVDPAMQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGSAA(SEQ ID NO：35)。
在另一个实施例中，将弗林蛋白酶添加至表达本公开的凝固因子-CTP的细胞中。在另一个实施例中，弗林蛋白酶增加了本公开的凝固因子-CTP在细胞中的产生效率。
在另一个实施例中，弗林蛋白酶与包括本公开的凝固因子-CTP的编码序列的载体进行共转染。在另一个实施例中，弗林蛋白酶是由单独的载体进行编码的。在另一个实施例中，弗林蛋白酶和凝固因子-CTP是由一个载体进行编码的。在另一个实施例中，弗林蛋白酶的编码序列被插入pCI-DHFR中。在另一个实施例中，弗林蛋白酶的编码序列是在pCI-dhfr/smaI+NotI、Furin/AsisI F.I.+NotI中被进行工程化的。
在另一个实施例中，对弗林蛋白酶进行编码的核酸序列包括下列核酸序列：
tctagagtcgaccccgccatggagctgaggccctggttgctatgggtggtagcagcaacaggaaccttggtcctgctagcagctgatgctcagggccagaaggtcttcaccaacacgtgggctgtgcgcatccctggaggcccagcggtggccaacagtgtggcacggaagcatgggttcctcaacctgggccagatcttcggggactattaccacttctggcatcgaggagtgacgaagcggtccctgtcgcctcaccgcccgcggcacagccggctgcagagggagcctcaagtacagtggctggaacagcaggtggcaaagcgacggactaaacgggacgtgtaccaggagcccacagaccccaagtttcctcagcagtggtacctgtctggtgtcactcagcgggacctgaatgtgaaggcggcctgggcgcagggctacacagggcacggcattgtggtctccattctggacgatggcatcgagaagaaccacccggacttggcaggcaattatgatcctggggccagttttgatgtcaatgaccaggaccctgacccccagcctcggtacacacagatgaatgacaacaggcacggcacacggtgtgcgggggaagtggctgcggtggccaacaacggtgtctgtggtgtaggtgtggcctacaacgcccgcattggaggggtgcgcatgctggatggcgaggtgacagatgcagtggaggcacgctcgctgggcctgaaccccaaccacatccacatctacagtgccagctggggccccgaggatgacggcaagacagtggatgggccagcccgcctcgccgaggaggccttcttccgtggggttagccagggccgaggggggctgggctccatctttgtctgggcctcggggaacgggggccgggaacatgacagctgcaactgcgacggctacaccaacagtatctacacgctgtccatcagcagcgccacgcagtttggcaacgtgccgtggtacagcgaggcctgctcgtccacactggccacgacctacagcagtggcaaccagaatgagaagcagatcgtgacgactgacttgcggcagaagtgcacggagtctcacacgggcacctcagcctctgcccccttagcagccggcatcattgctctcaccctggaggccaataagaacctcacatggcgggacatgcaacacctggtggtacagacctcgaagccagcccacctcaatgccaacgactgggccaccaatggtgtgggccggaaagtgagccactcatatggctacgggcttttggacgcaggcgccatggtggccctggcccagaattggaccacagtggccccccagcggaagtgcatcatcgacatcctcaccgagcccaaagacatcgggaaacggctcgaggtgcggaagaccgtgaccgcgtgcctgggcgagcccaaccacatcactcggctggagcacgctcaggcgcggctcaccctgtcctataatcgccgtggcgacctggccatccacctggtcagccccatgggcacccgctccaccctgctggcagccaggccacatgactactccgcagatgggtttaatgactgggccttcatgacaactcattcctgggatgaggatccctctggcgagtgggtcctagagattgaaaacaccagcgaagccaacaactatgggacgctgaccaagttcaccctcgtactctatggcaccgcccctgaggggctgcccgtacctccagaaagcagtggctgcaagaccctcacgtccagtcaggcctgtgtggtgtgcgaggaaggcttctccctgcaccagaagagctgtgtccagcactgccctccaggcttcgccccccaagtcctcgatacgcactatagcaccgagaatgacgtggagaccatccgggccagcgtctgcgccccctgccacgcctcatgtgccacatgccaggggccggccctgacagactgcctcagctgccccagccacgcctccttggaccctgtggagcagacttgctcccggcaaagccagagcagccgagagtccccgccacagcagcagccacctcggctgcccccggaggtggaggcggggcaacggctgcgggcagggctgctgccctcacacctgcctgaggtggtggccggcctcagctgcgccttcatcgtgctggtcttcgtcactgtcttcctggtcctgcagctgcgctctggctttagttttcggggggtgaaggtgtacaccatggaccgtggcctcatctcctacaaggggctgccccctgaagcctggcaggaggagtgcccgtctgactcagaagaggacgagggccggggcgagaggaccgcctttatcaaagaccagagcgccctctgaacgcggccgc(SEQ ID NO：22)。
在另一个实施例中，弗林蛋白酶的氨基酸序列包括下列氨基酸序列：MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVARKHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVAKRRTKRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIVVSILDDGIEKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRMLDGEVTD平均值ARSLGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCNCDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQKCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPAHLNANDWATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCIIDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSGEWVLEIENTSEANNYGTLTKFTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQACVVCEEGFSLHQKSCVQHCPPGFAPQVLDTHYSTENDVETIRASVCAPCHASCATCQGPALTDCLSCPSHASLDPVEQTCSRQSQSSRESPPQQQPPRLPPEVEAGQRLRAGLLPSHLPEVVAGLSCAFIVLVFVTVFLVLQLRSGFSFRGVKVYTMDRGLISYKGLPPEAWQEECPSDSEEDEGRGERTAFIKDQSAL(SEQ ID NO：23)。
在一个实施例中，术语凝固因子还包括已知凝固因子的同源物。在一个实施例中，同源物具有凝固活性。在一些实施例中，根据本发明的同源性还包含缺失变体、插入变体或取代变体，包括其氨基酸取代及其生物活性多肽片段。在一个实施例中，变体包括保守性取代或不显著改变凝固因子的三维结构的缺失、插入或取代。在另一个实施例中，缺失、插入或取代不改变凝固因子的感兴趣的功能，其在一个实施例中结合至特定的结合配合物。
在另一个实施例中，本公开包括凝固因子的同源物。在另一个实施例中，本公开包括具有凝固活性的凝固因子的同源物。在另一个实施例中，本公开包括具有功能性结合的凝固因子的同源物。在另一个实施例中，本公开包括具有凝固活性的如本文所述的凝固因子的同源物。在另一个实施例中，本公开包括具有功能性结合的如本文所述的凝固因子的同源物。在另一个实施例中，与凝固因子具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性的同源物，例如多肽是使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数确定的。
在另一个实施例中，本公开包括弗林蛋白酶的同源物。在另一个实施例中，本公开包括保持感兴趣的功能的弗林蛋白酶的同源物，该功能在一个实施例中为对前体蛋白进行切割。在另一个实施例中，与弗林蛋白酶具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性的同源物，例如多肽是使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数确定的。
在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的一个到十个促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的一个到三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的一个到五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括在其羧基末端上具有至少一个CTP的凝固因子。
在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的一个到五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。
在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的一个到五个CTP组成。
要理解的是，包括如本文所述的元素或步骤的本发明的组合物、制剂和方法在另一个实施例中可以由那些元素或步骤组成，或在另一个实施例中，可以基本上由那些元素或步骤组成。在一些实施例中，术语“包括”是指包括指定的活性剂，诸如经CTP修饰的凝固因子，以及包括如制药工业中所知的其他活性剂和药学上可接受的载体、赋形剂、柔润剂、稳定剂等。在一些实施例中，术语“基本上由......组成”是指其仅有的活性成分是指定的活性成分的组合物，然而，也可以包括其他化合物以用于使制剂稳定、保存等，但其并不直接涉及指定的活性成分的治疗效果。在一些实施例中，术语“基本上由......组成”可以指便于释放活性成分的组分。在一些实施例中，术语“由......组成”指含有活性成分和药学上可接受的载体或赋形剂的组合物。
在一个实施例中，本发明提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到三个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到四个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到五个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到六个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到七个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到八个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到九个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到十个CTP。
在一个实施例中，本发明提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到四个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到五个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到六个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到七个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到八个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到九个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到十个CTP。
在一个实施例中，本发明提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到五个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到六个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到七个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到八个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到九个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到十个CTP。
在一个实施例中，本发明提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到六个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到七个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到八个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到九个CTP。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到十个CTP。
在一个实施例中，本发明提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到三个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到四个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到五个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到六个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到七个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到八个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到九个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到十个CTP组成。
在一个实施例中，本发明提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到四个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到五个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到六个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到七个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到八个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到九个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到十个CTP组成。
在一个实施例中，本发明提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到五个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到六个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到七个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到八个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到九个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到十个CTP组成。
在一个实施例中，本发明提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到六个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到七个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到八个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到九个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到十个CTP组成。
在一个实施例中，本发明提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到三个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到四个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到五个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到六个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到七个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到八个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到九个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的两个到十个CTP组成。
在一个实施例中，本发明提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到四个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到五个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到六个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到七个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到八个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到九个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到十个CTP组成。
在一个实施例中，本发明提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到五个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到六个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到七个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到八个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到九个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的四个到十个CTP组成。
在一个实施例中，本发明提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到六个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到七个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到八个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到九个CTP组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的五个到十个CTP组成。
在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括在其氨基末端上不具有CTP的凝固因子，基本上由其组成或由其组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括在其氨基末端上缺少CTP的凝固因子，基本上由其组成或由其组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括在其羧基末端上具有至少一个CTP且在其氨基末端上不具有CTP的凝固因子，基本上由其组成或由其组成。在另一个实施例中，本文提供了一种多肽，其包括在其羧基末端上具有如本文所述数量的CTP且在其氨基末端上不具有CTP的凝固因子，基本上由其组成或由其组成。
在另一个实施例中，本发明提供了一种对如上所述的多肽进行编码的多核苷酸。
在另一个实施例中，本发明还提供了一种包括表达载体的组合物，该表达载体包括对由因子IX(FIX)多肽和被附接至该FIX多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽进行编码的多核苷酸。
在另一个实施例中，本发明还提供了一种多核苷酸，其编码由因子VIIa(FVIIa)多肽和被附接至该VIIa多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽。在另一个实施例中，本发明还提供了一种包括表达载体的组合物，该表达载体包括对因子VIIa(FVIIa)多肽和被附接至该FVIIa多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)进行编码的多核苷酸。在一个实施例中，经CTP修饰的FVIIa包括信号肽。在另一个实施例中，经CTP修饰的FVIIa不包括信号肽。
在一个实施例中，本发明提供了一种如上所述的重组凝固因子。在一个实施例中，本发明提供了一种如上所述的工程化的凝固因子。在一个实施例中，如上所述的工程化的凝固因子被称为经CTP修饰的凝固因子。
在一个实施例中，被附接至凝固因子的羧基末端的CTP被串联地附接至羧基末端。
在一个实施例中，与未经CTP修饰的凝固因子相比，如本文所述的工程化的凝固因子具有等同或改进的生物活性。在另一个实施例中，与未经CTP修饰的凝固因子相比，如本文所述的工程化的凝固因子具有等同或改进的药理学测量。在另一个实施例中，与未经CTP修饰的凝固因子相比，如本文所述的工程化的凝固因子具有等同或改进的药代动力学。在另一个实施例中，与未经CTP修饰的凝固因子相比，如本文所述的工程化的凝固因子具有等同或改进的药效学。
在一个实施例中，本发明提供了一种预防或治疗凝结或凝固障碍的方法。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对本发明的经CTP修饰的凝固因子进行给药。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试中预防和治疗血友病的方法，其包括对本发明的经CTP修饰的凝固因子进行给药。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对本发明的经CTP修饰的因子VII进行给药。
在一个实施例中，血友病是血友病A。在另一个实施例中，血友病是血友病B。在另一个实施例中，用于预防或治疗凝结或凝固障碍的本发明的方法在具有分别含对FVIII或FIX的抑制剂的血友病A或B的患者体内预防或治疗血友病。在另一个实施例中，本发明的方法为用于具有获得性血友病(不含抑制剂的血友病)的患者的预防或治疗。在另一个实施例中，用于预防或治疗凝结或凝固障碍的本发明的方法预防或治疗不含抑制剂的血友病A或B。在另一个实施例中，血友病为重度血友病。在另一个实施例中，血友病为中度血友病。在另一个实施例中，血友病为具有或不具有抑制剂的中度至重度血友病。本领域的技术人员将理解的是，术语“中度至重度血友病”是指具有小于或等于3％的FVIII或FIX的受试者。
在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括进行本发明的经CTP修饰的因子IX的给药。在一个实施例中，血友病为血友病B。在一个实施例中，血友病B也被称为因子IX缺乏或克雷司马斯病。在一个实施例中，血友病为重度血友病，其在一个实施例中描述了其中凝固因子水平为0-1％的血友病。在另一个实施例中，血友病为中度血友病，其在一个实施例中描述了其中凝固因子水平为1％-5％的血友病。在另一个实施例中，血友病为轻度血友病，其在一个实施例中描述了其中凝固因子水平为5％-50％的血友病。
在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗凝结或凝固障碍的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽和被附接至该FIX多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的给药，从而在该受试者体内预防或治疗凝结或凝固障碍。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗凝结或凝固障碍的方法，其包括对该受试者进行包括FVII多肽和被附接至该FVII多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子VII(FVII)多肽的给药，从而针对该受试者预防或治疗凝结或凝固障碍。
在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽和被附接至该FIX多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的给药，从而在针对该受试者预防或治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FVIIa多肽和被附接至该FVIIa多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽的给药，从而针对该受试者预防或治疗血友病。
在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行如本文所述的一个或多个经CTP修饰的凝固因子的给药。因此，在一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽和被附接至该FIX多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽和包括FVIIa多肽和被附接至该FVIIa多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽的给药，从而针对该受试者治疗血友病。在一个实施例中，对经CTP修饰的FIX和经CTP修饰的FVIIa以相同的组合物同时进行给药。在另一个实施例中，对经CTP修饰的FIX和经CTP修饰的FVIIa以单独的组合物同时进行给药。在另一个实施例中，对经CTP修饰的FIX和经CTP修饰的FVIIa以单独的组合物在单独的时间进行给药。
在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽或FVII多肽和被附接至该FIX多肽或该FVII多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽或经CTP修饰的因子VII多肽的给药，从而针对该受试者预防或治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽或FVII多肽和被附接至该FIX多肽或该FVII多肽的羧基末端的四个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽或经CTP修饰的因子VII多肽的给药，从而针对该受试者预防或治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽或FVII多肽和被附接至该FIX多肽或该FVII多肽的羧基末端的五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽或经CTP修饰的因子VII多肽的给药，从而针对该受试者预防或治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽或FVII多肽和被附接至该FIX多肽或该FVII多肽的羧基末端的三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽或经CTP修饰的因子VII多肽的给药，从而针对该受试者预防或治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽和FVII多肽和被附接至该FIX多肽和该FVII多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽和经CTP修饰的因子VII多肽的给药，从而针对该受试者预防或治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽和FVII多肽和被附接至该FIX多肽和该FVII多肽的羧基末端的三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽和经CTP修饰的因子VII多肽的给药，从而针对该受试者预防或治疗血友病。
在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽或FVII多肽和被附接至该FIX多肽或该FVII多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽或经CTP修饰的因子VII多肽的皮下或静脉给药，从而针对该受试者预防或治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽或FVII多肽和被附接至该FIX多肽或该FVII多肽的羧基末端的四个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽或经CTP修饰的因子VII多肽的皮下或静脉给药，从而针对该受试者预防或治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽或FVII多肽和被附接至该FIX多肽或该FVII多肽的羧基末端的五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽或经CTP修饰的因子VII多肽的皮下或静脉给药，从而针对该受试者预防或治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽或FVII多肽和被附接至该FIX多肽或该FVII多肽的羧基末端的三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽或经CTP修饰的因子VII多肽的皮下或静脉给药，从而针对该受试者预防或治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX和FVII多肽和被附接至该FIX和该FVII多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)和经CTP修饰的因子VII多肽的皮下或静脉给药，从而针对该受试者预防或治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽和FVII多肽和被附接至该FIX多肽和该FVII多肽的羧基末端的三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)和经CTP修饰的因子VII多肽的皮下或静脉给药，从而针对该受试者预防或治疗血友病。
在一些实施例中，本文提供了一种针对受试者预防或治疗血友病的方法，该方法包括对受试者进行包括被附接至凝固因子多肽的羧基末端的三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的凝固因子的给药的步骤，其中该经CTP修饰的凝固因子的序列选自SEQ ID No：25、27或29所组成的组，从而针对该受试者预防血友病。在另一个实施例中，该经CTP修饰的凝固因子选自SEQ ID NO：25、27、29或46所组成的组。在另一个实施例中，该经CTP修饰的凝固因子由SEQ ID NO：46组成。
在一个实施例中，本发明提供了一种包括表达载体的细胞，该表达载体包括编码由因子VII(FVII)多肽和被附接至该FVII多肽的羧基末端的三个到五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽的多核苷酸。在另一个实施例中，本发明提供了一种包括表达载体的细胞，该表达载体包括编码由因子VII(FVII)多肽和被附接至该FVII多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽的多核苷酸。在另一个实施例中，本发明提供了一种包括表达载体的细胞，该表达载体包括编码由因子VII(FVII)多肽和被附接至该FVII多肽的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽的多核苷酸。
在一个实施例中，当提及促性腺激素羧基末端肽(CTP)时，术语“三个到五个”指将三个、四个或五个CTP附接至本文所提供的凝固因子的羧基末端。
在一个实施例中，本发明提供了一种包括表达载体的组合物，该表达载体包括编码由因子VII(FVII)多肽和被附接至该FVII多肽的羧基末端的三个到五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽的多核苷酸。在另一个实施例中，本发明提供了一种包括表达载体的组合物，该表达载体包括编码由因子VII(FVII)多肽和被附接至该FVII多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽的多核苷酸。在另一个实施例中，本发明提供了一种包括表达载体的组合物，该表达载体包括编码由因子VII(FVII)多肽和被附接至该FVII多肽的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽的多核苷酸。
在一个实施例中，本发明提供了一种延长因子VII(FVII)多肽的生物半衰期的方法，其包括将三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而延长该FVII多肽的生物半衰期。在另一个实施例中，本发明提供了一种延长因子VII(FVII)多肽的生物半衰期的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而延长该FVII多肽的生物半衰期。在另一个实施例中，本发明提供了一种延长因子VII(FVII)多肽的生物半衰期的方法，其包括将五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而延长该FVII多肽的生物半衰期。
在另一个实施例中，本发明提供了一种改进因子VII(FVII)多肽的曲线下面积(AUC)的方法，其包括将三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而改进该FVII多肽的AUC。在另一个实施例中，本发明提供了一种改进因子VII(FVII)多肽的曲线下面积(AUC)的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而改进该FVII多肽的AUC。在另一个实施例中，本发明提供了一种改进因子VII(FVII)多肽的曲线下面积(AUC)的方法，其包括将五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而改进该FVII多肽的AUC。
在一个实施例中，本发明提供了一种降低因子VII(FVII)多肽的给药频率的方法，其包括将三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而降低该FVII多肽的给药频率。在另一个实施例中，本发明提供了一种降低因子VII(FVII)多肽的给药频率的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而降低该FVII多肽的给药频率。在另一个实施例中，本发明提供了一种降低因子VII(FVII)多肽的给药频率的方法，其包括将五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而降低该FVII多肽的给药频率。
在一个实施例中，本发明提供了一种降低因子VII(FVII)多肽的清除速率的方法，其包括将三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而降低该FVII多肽的清除速率。在另一个实施例中，本发明提供了一种降低因子VII(FVII)多肽的清除速率的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而降低该FVII多肽的清除速率。在另一个实施例中，本发明提供了一种降低因子VII(FVII)多肽的清除速率的方法，其包括将五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而降低该FVII多肽的清除速率。
在一个实施例中，本发明提供了一种产生经CTP修饰的因子VII(FVII)多肽的方法，其包括将三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而产生经CTP修饰的FVII多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种产生经CTP修饰的因子VII(FVII)多肽的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而产生经CTP修饰的FVII多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种产生经CTP修饰的因子VII(FVII)多肽的方法，其包括将五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤，从而产生经CTP修饰的FVII多肽。
在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FVII多肽和被附接至该FVII多肽的羧基末端的三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子VII(FVII)多肽的给药，从而针对该受试者治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FVII多肽和被附接至该FVII多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子VII(FVII)多肽的给药，从而针对该受试者治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FVII多肽和被附接至该FVII多肽的羧基末端的五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子VII(FVII)多肽的给药，从而针对该受试者治疗血友病。
在另一个实施例中，本文所提供的方法还包括将四个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVII多肽的羧基末端的步骤。
在其他实施例中，工程化的凝固因子用于治疗血友病B患者。在一个实施例中，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的3个CTP的凝固因子IX用于治疗血友病B患者。在一个实施例中，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的4个CTP的凝固因子IX用于治疗血友病B患者。在一个实施例中，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的5个CTP的凝固因子IX用于治疗血友病B患者。在另一个实施例中，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的2个CTP的凝固因子IX用于治疗血友病B患者。在另一个实施例中，包括在凝固因子IX羧基末端的1个CTP重复序列的凝固因子IX用于治疗血友病B患者。在其他实施例中，工程化的凝固因子能够减少患者所需的输注次数，减少患者的所需剂量或能够实现两者组合。
在一个实施例中，与FIX-CTP-CTP的收获物、FIX-CTP的收获物或rhFIX相比，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的3个CTP的凝固因子IX表现出改进的PK曲线，且同时保持了其凝固活性。在一个实施例中，rFIX-CTP3的消除半衰期在大鼠和缺乏FIX的小鼠中为rFIX的2.5至4倍。在一个实施例中，rFIX-CTP3的给药在给药后显著延长了缺乏FIX的小鼠中的前凝血效应达至少76小时。在一个实施例中，rFIX-CTP3的给药在缺乏FIX的小鼠中产生了比rFIX更高的活性峰。在另一个实施例中，与FIX-CTP的收获物或rhFIX相比，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的2个CTP的凝固因子IX表现出改进的PK曲线，且同时保持了其凝固活性。在另一个实施例中，与rhFIX相比，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的2个CTP的凝固因子IX表现出3倍的半衰期增加和4.5倍的更高的AUC。
在另一个实施例中，与重组FVII相比，SC给药导致经CTP修饰的FVII的更高的生物利用度。在另一个实施例中，当与
的SC给药相比时，在FVIIa-CTP3和CTP5 SC给药后，半衰期更长且生物利用度(AUC SC/AUC IV)更高。在另一个实施例中，与重组FVII
相比，皮下注射的MOD-5014和MOD-5019显示改进的小鼠生存(见下面的实例8)。
在一个实施例中，MOD-5014为FVIIa-CTP3(具有附接在C末端的三个CTP肽)。在一个实施例中，MOD-5014提供了长效凝固因子。在一个实施例中，MOD-5014提供了与重组人FVIIa相比的更持久且延长的血液凝结反应。(见例如实例14)。本领域的技术人员将理解的是，术语MOD-5014或FVIIa-CTP3可以互换使用，其具有所有相同的特质和含义，且在一个实施例中指代包括氨基酸SEQ ID No：46的二硫键连接的双链异源二聚体结构。此外，本领域的技术人员将理解的是，在描述经CTP修饰的凝固因子，例如FVII-CTP3时，术语FVII-CTP3在某些情况下可能是指FVII-CTP3的无活性的形式。当然，本领域的技术人员将基于相关联的细节诸如活性认出提及的是哪种形式。类似地，虽然术语MOD-5014与术语FVIIa-CTP3可互换，即表示经CTP修饰的凝固因子的活性形式，但在某些情况下，术语MOD-5014可以用于表示FVII的活性形式或编码FVII-CTP3的核苷酸序列，该FVII-CTP3随后将从细胞表达和分泌且在体外纯化和活化，这产生了存在于MOD-5014分子中的FVIIa的活性形式。
一个实施例中，由组织因子途径抑制剂(TFPI)引起的MOD-5014的失活是剂量依赖性的。在一个实施例中，由TFPI引起的MOD-5014的失活显示出与由TFPI引起的重组FVIIa
的失活相类似的剂量依赖性的失活模式。在一个实施例中，MOD-5014由抗凝血酶III抑制。在一个实施例中，在存在肝素的情况下增强了抗凝血酶III对MOD-5014的抑制。在一个实施例中，在存在或不存在肝素的情况下，抗凝血酶III对MOD-5014的抑制显示出与重组FVIIa
相类似的抑制模式。(见下面的实例11)。
在一个实施例中，MOD-5014以剂量依赖性的方式产生凝血酶。在一个实施例中，MOD-5014减少了凝血酶生成的滞后期。在一个实施例中，MOD-5014减少了血液凝结时间。在一个实施例中，MOD-5014增加了血液凝块形成的效率。在一个实施例中，MOD-5014的给药减少了受试者体内的血液凝结时间。在一个实施例中，MOD-5014的给药增加了受试者体内的血液凝块形成的效率。在一个实施例中，由MOD-5014实现的凝血酶生成类似于由重组FVIIa
所产生的凝血酶生成。在一个实施例中，由MOD-5014引起的凝血酶生成的滞后期的减少类似于由重组FVIIa
所产生的凝血酶生成的滞后期的减少。在一个实施例中，由MOD-5014实现的血液凝结时间的减少类似于由重组FVIIa
所产生的血液凝结时间的减少。在一个实施例中，由MOD-5014实现的血液凝块形成效率增加类似于由重组FVIIa
所产生的血液凝块形成效率增加(见下面的实例12)。
如本文所提供的，CTP至血液凝结因子，例如，因子FVII、因子FVIIA和因子FX的附接增加了血液凝结因子的半衰期。实例11、12和13显示CTP的附接，例如被附接至FVIIA的三个CTP似乎不影响血液凝结活性。在一个实施例中，CTP至FVII的附接不干扰血液凝块形成。在一个实施例中，CTP至FVII的附接不干扰血液凝块形成效率的增加。在一个实施例中，CTP至FVII的附接不干扰血液凝结时间的减少。在一个实施例中，在将CTP附接至血液凝结因子之后保持磷脂至FVII的结合。在一个实施例中，CTP至FVIIA的附接不干扰血液凝块形成。在一个实施例中，CTP至FVIIA的附接不干扰血液凝块形成效率的增加。在一个实施例中，CTP至FVIIA的附接不干扰血液凝块形成的减少。在一个实施例中，在将CTP附接至血液凝结因子之后保持磷脂至FVIIA的结合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽和被附接至该FIX多肽的羧基末端的三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的给药，从而针对该受试者治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽和被附接至该FIX多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的给药，从而针对该受试者治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽和被附接至该FIX多肽的羧基末端的五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的给药，从而针对该受试者治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FVIIa多肽和被附接至该FVIIa多肽的羧基末端的三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽的给药，从而针对该受试者治疗血友病。
在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行如本文所述的一个或多个经CTP修饰的凝固因子的给药。因此，在一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括进行包括FIX多肽和被附接至该FIX多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽和包括FVIIa多肽和被附接至该FVIIa多肽的羧基末端的三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽的给药，从而针对该受试者治疗血友病。在一个实施例中，将经CTP修饰的FIX和经CTP修饰的FVIIa被同时以相同的组合物进行给药。在另一个实施例中，将经CTP修饰的FIX和经CTP修饰的FVIIa同时以单独的组合物进行给药。在另一个实施例中，将经CTP修饰的FIX和经CTP修饰的FVIIa在单独的时间以单独的组合物进行给药。
在其他实施例中，工程化的凝固因子用于治疗血友病B患者。在一个实施例中，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的3个CTP的凝固因子IX用于治疗血友病B患者。在一个实施例中，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的4个CTP的凝固因子IX用于治疗血友病B患者。在一个实施例中，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的5个CTP的凝固因子IX用于治疗血友病B患者。在另一个实施例中，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的2个CTP的凝固因子IX用于治疗血友病B患者。在另一个实施例中，包括在凝固因子IX羧基末端的1个CTP重复序列的凝固因子IX用于治疗血友病B患者。在其他实施例中，工程化的凝固因子能够减少患者所需的输注次数，减少患者的所需剂量或实现其组合。
实例14示出对大型哺乳动物(狗)进行MOD-5014给药的结果。MOD-5014给药提供了用于血液凝固的有效且安全的长效FVIIa。使用MOD-5014的治疗可以是预防性的或按需的。在一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行MOD-5014的给药，从而针对该受试者治疗血友病。在一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防出血过多的方法，其包括对该受试者进行MOD-5014的给药，从而针对该受试者预防出血过多。在一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者预防性治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行MOD-5014的给药，从而针对该受试者预防性治疗血友病。
在一个实施例中，用MOD-5014针对受试者治疗血友病包括与重组FVIIa
相比的降低的MOD-5014的给药频率。在一个实施例中，用MOD-5014针对受试者预防性治疗血友病包括与重组FVIIa
相比的降低的MOD-5014的给药频率。在一个实施例中，用MOD-5014针对受试者预防出血过多包括与重组FVIIa
相比的降低的MOD-5014的给药频率。
在一个实施例中，与FIX-CTP-CTP的收获物、FIX-CTP的收获物或rhFIX相比，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的3个CTP的凝固因子IX表现出改进的PK曲线，且同时保持了其凝固活性。在一个实施例中，rFIX-CTP3的消除半衰期在大鼠和缺乏FIX的小鼠中为rFIX的2.5至4倍。在一个实施例中，rFIX-CTP3的给药在给药后显著延长了缺乏FIX的小鼠中的前凝血效应达至少76小时。在一个实施例中，rFIX-CTP3的给药在缺乏FIX的小鼠中产生了比rFIX更高的活性峰。在另一个实施例中，与FIX-CTP的收获物或rhFIX相比，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的2个CTP的凝固因子IX表现出改进的PK曲线，且同时保持了其凝固活性。在另一个实施例中，与rhFIX相比，包括在凝固因子IX羧基末端的串联的2个CTP的凝固因子IX表现出3倍的半衰期增加和4.5倍的更高的AUC。
在一个实施例中，与
相比，包括在凝固因子VII羧基末端的串联的3个CTP的凝固因子VII表现出改进的PK曲线，且同时保持了其凝固活性(见表59和图36)。
在另一个实施例中，术语“CTP肽”、“羧基末端肽”和“CTP序列”在本文中可互换使用。在另一个实施例中，羧基末端肽为全长CTP。每种可能性表示本公开的单独实施例。
在另一个实施例中，如全部内容通过引用并入本文的美国专利7553940中所述的，信号肽被附接至CTP的氨基末端。在另一个实施例中，信号肽未被附接至CTP的氨基末端。
在其他实施例中，术语工程化的凝固因子是指成熟凝固因子的氨基酸序列。在其他实施例中，术语工程化的凝固因子是指包括其信号序列或信号肽的凝固因子的氨基酸序列。
在另一个实施例中，“信号序列”和“信号肽”在本文中可互换使用，其具有所有相同的特质和含义。在另一个实施例中，当提及多核苷酸分子时，“序列”可能指编码部分。在另一个实施例中，与不具有至少一个CTP的相同的凝固因子相比，包括如本文所述的至少一个CTP的工程化的凝固因子具有增强的体内生物学活性。在一个实施例中，增强的体内生物学活性源于在保持至少一些生物学活性时工程化的凝固因子的更长的半衰期。在另一个实施例中，增强的生物学活性源于CTP修饰所产生的增强的生物学活性。在另一个实施例中，增强的生物学活性源于经CTP修饰的凝固因子的更长的半衰期和增强的功能。
在一些实施例中，在凝固因子的羧基末端的至少一个CTP序列提供了防止凝固因子降解的增强的保护。在一些实施例中，在凝固因子的羧基末端的至少一个CTP序列提供了防止清除的增强的保护。在一些实施例中，在凝固因子的羧基末端的至少一个CTP序列提供了延长的清除时间。在一些实施例中，在凝固因子的羧基末端的至少一个CTP序列增强了其Cmax。在一些实施例中，在凝固因子的羧基末端的至少一个CTP序列增强了其Tmax。在一些实施例中，在凝固因子的羧基末端的至少一个CTP序列延长了其T1/2。
在另一个实施例中，本发明的共轭凝固因子以与未经修饰的共轭凝固因子相同的方式进行使用。在另一个实施例中，本发明的共轭凝固因子具有增加的循环半衰期和血浆停留时间、减少的清除和增加的体内临床活性。在另一个实施例中，由于如本文所述的共轭凝固因子的改进的特性，该共轭物比相同凝固因子的未经修饰的形式的给药频率更低。
在另一个实施例中，降低的给药频率将导致改进的治疗策略，其在一个实施例中，将导致改进的患者依从性，这将导致改进的治疗结果以及改进的患者生活质量。在另一个实施例中，与传统的凝固因子的共轭物相比，已经发现具有本发明的共轭物的分子量和连接子结构的共轭物具有改进的效力、改进的稳定性、提高的AUC水平和增强的循环半衰期。
在另一个实施例中，本发明还提供了一种包括经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的药物组合物或药物制剂，该经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽由FIX多肽和被附接至该经CTP修饰的FIX多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成。
在另一个实施例中，本发明还提供了一种包括经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽的药物组合物或药物制剂，该经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽由FVIIa多肽和被附接至该FVIIa的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成。
在另一个实施例中，本发明还提供了一种包括经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽的药物组合物或药物制剂，该经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽由FVIIa多肽和被附接至该FVIIa的羧基末端的四个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成。
在另一个实施例中，本发明还提供了一种包括经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽的药物组合物或药物制剂，该经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽由FVIIa多肽和被附接至该FVIIa的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成。
在另一个实施例中，本文提供了一种包括如本文所述的共轭凝固因子的组合物。在另一个实施例中，本文提供了一种包括如本文所述的共轭凝固因子的药物组合物。在另一个实施例中，本文提供了一种包括治疗有效量的如本文所述的共轭凝固因子的药物组合物。在一个实施例中，治疗有效量的共轭凝固因子是根据因素，诸如被治疗的特定病症、被治疗的患者的状况以及组合物中的其他成分来确定的。
在一个实施例中，本公开提供了一种用于本公开的组合物、制剂和方法中的药物制剂。在另一个实施例中，本公开提供了一种包括多肽的药物制剂，该多肽由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽组成。在另一个实施例中，药物制剂还包括缓冲液和张度剂。在另一个实施例中，缓冲液为20mM柠檬酸盐和13.3mM甘氨酸，且张度剂是150mM NaCl。在另一个实施例中，制剂处于约6.4的pH下。在另一个实施例中，缓冲液为20mM柠檬酸盐和13.3mM甘氨酸，张度剂是150mM NaCl且pH为6.4。在另一个实施例中，制剂为液体制剂。在另一个实施例中，制剂为冻干制剂。在另一个实施例中，可以使用冻干的经CTP修饰的凝固因子来形成液体制剂。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子为FVII-CTP-CTP-CTP。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子为FVIIa-CTP-CTP-CTP。
在另一个实施例中，本文提供了一种包括本文所提供的药物制剂的每周一次的剂型。在另一个实施例中，本文提供了一种包括本文所提供的药物制剂的每日一次的剂型。在另一个实施例中，本文提供了一种包括本文所提供的药物制剂的每隔一日的剂型。在另一个实施例中，本文提供了一种包括本文所提供的药物制剂的每隔两日的剂型。在另一个实施例中，本文提供了一种包括本文所提供的药物制剂的每周两次的剂型。在另一个实施例中，本文提供了一种包括本文所提供的药物制剂的每周两次的剂型。在另一个实施例中，本文提供了一种包括本文所提供的药物制剂的每周剂型。在另一个实施例中，本文提供了一种包括本文所提供的药物制剂的双周(每两周)的剂型。
在另一个实施例中，本发明提供了一种包括多肽的制剂，该多肽由凝固因子和被附接至该凝固因子的羧基末端的三至五个绒毛膜促性腺激素CTP组成，且其中该多肽可选地由信号肽组成，其中该制剂具有增加的稳定性。在一个实施例中，制剂在至少一年中是稳定的。在另一个实施例中，制剂在至少两年中是稳定的。
在一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是以液体制剂进行配制的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的因子VII是以液体制剂进行配制的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的因子VIIa是以液体制剂进行配制的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的因子IX是以液体制剂进行配制的。在一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是以鼻内剂型进行配制的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是以可注射剂型进行配制的。
在另一个实施例中，本公开的方法包括增加在凝固因子疗法的使用中的依从性，其包括向有需要的受试者提供由经CTP修饰的凝固因子，从而增加在凝固因子疗法的使用中的依从性。
在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子以每日一次对受试者进行给药。在另一个实施例中，包括由经CTP修饰的凝固因子的多肽以每两日一次对受试者进行给药。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子以每三日一次对受试者进行给药。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子以每四日一次对受试者进行给药。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子以每五日一次对受试者进行给药。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子以每六日一次对受试者进行给药。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子以每周一次对受试者进行给药。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子以每7至14日一次对受试者进行给药。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子以每10至20日一次对受试者进行给药。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子以每5至15日一次对受试者进行给药。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子以每15至30日一次对受试者进行给药。
在一个实施例中，本发明的制剂是以液体制剂进行配制的以用于经注射器或笔装置进行注射。
在一个实施例中，本文提供的制剂还包括防腐剂，诸如苯扎氯铵和硫柳汞等；螯合剂，诸如依地酸钠等；缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐；张度剂，诸如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇等；抗氧化剂，诸如抗坏血酸、乙酰胱氨酸、焦亚硫酸钠等；芳香剂；粘度调节剂，诸如聚合物，包括纤维素及其衍生物；以及聚乙烯醇及酸和碱以根据需要调节这些水性组合物的pH。组合物还包括局部麻醉剂或其他活性物。组合物能够被用作喷雾剂、雾剂、滴剂等。
在一个实施例中，如本文所述的凝固因子为人凝固因子。
在另一个实施例中，如本文所述的共轭凝固因子可用于治疗患有凝固或凝结障碍的受试者。在另一个实施例中，凝固或凝结障碍为血友病。在另一个实施例中，如本文所述的共轭凝固因子可用于血友病的预防性治疗，从而降低出血和相关并发症的风险。在另一个实施例中，降低出血和相关并发症的风险降低了自发性出血的风险。在另一个实施例中，降低出血和相关并发症的风险降低了出血过多的风险。在另一个实施例中，如本文所述的共轭凝固因子可用于治疗患有血友病的受试者，同时降低产生针对外源性给药的凝固因子的抑制性抗体的风险。在另一个实施例中，如本文所述的共轭凝固因子可用于治疗患有血友病的受试者，从而诱导体内平衡。
在一个实施例中，本发明的经CTP修饰的凝固因子具有治疗用途。在一个实施例中，本发明的经CTP修饰的凝固因子具有预防用途。
在另一个实施例中，如本文所述的共轭凝固因子可用于治疗经历出血过多或瘀伤或具有延长的凝血酶原时间(PT)或部分凝血致活酶时间(PTT)的受试者。在另一个实施例中，如本文所述的共轭凝固因子可用于治疗具有导致出血的获得性病症，诸如维生素K缺乏或肝病的受试者。在另一个实施例中，如本文所述的共轭凝固因子可用于治疗具有获得性(由于其他疾病)或遗传性、轻度或重度、永久性或暂时性凝固因子缺乏的受试者。在另一个实施例中，如本文所述的共轭凝固因子可用于治疗患有血友病A的受试者。在另一个实施例中，如本文所述的共轭凝固因子可用于治疗患有血友病B的受试者。在另一个实施例中，如本文所述的共轭凝固因子可用于治疗由于慢性疾病，诸如肝病或癌症；由于迅速用完凝结因子的急性病症，诸如弥散性血管内凝血(DIC)；或由于维生素K缺乏或使用维生素K拮抗剂，诸如华法林进行的处理(因子II、VII、IX和X的产生需要维生素K)而具有获得性缺乏的受试者。在另一个实施例中，如本文所述的共轭凝固因子可用于治疗患有其中导致凝结失衡的疾病的受试者，该疾病诸如但不限于：肝病、尿毒症、癌症、骨髓障碍、暴露于蛇毒、维生素K缺乏、抗凝治疗、抗凝剂华法林的意外摄入、多次输血(储存的血液单位失去其凝结因子中的一些)或其组合。在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗深静脉血栓形成的方法，其包括进行本发明的经CTP修饰的凝固因子的给药。在另一个实施例中，本发明提供了一种在患有血友病的受试者体内预防不受控制的出血的方法，其包括进行本发明的经CTP修饰的凝固因子的给药。在另一个实施例中，本发明提供了一种在患有血友病的受试者体内预防出血事件的方法，其包括进行本发明的经CTP修饰的凝固因子的给药。在另一个实施例中，本发明提供了一种在患有血友病B(先天性因子IX缺乏)的受试者体内控制出血事件的方法。
在一个实施例中，本发明的组合物包括如本文所述的制剂。在另一个实施例中，本发明的方法包括进行如本文所述的制剂的给药。在另一个实施例中，本发明的方法包括进行包括如本文所述的制剂的组合物的给药。
在另一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法用于在具有对FVIII或FIX的抑制剂的血友病A或B患者体内以及在具有获得性血友病的患者体内治疗出血事件；在具有对FVIII或FIX的抑制剂的血友病A或B患者体内或在具有获得性血友病的患者体内预防在手术介入或侵入性治疗中的出血；在具有先天性FVII缺乏的患者体内治疗出血事件以及在具有先天性FVII缺乏的患者体内预防在手术介入或侵入性治疗中的出血。获得性血友病为自发性自身免疫性障碍，其中先前正常止血的患者产生了针对凝结因子，最常见的是FVIII的自身抗体。针对FVIII的自身抗体的产生导致了FVIII缺乏，其导致因子IXa和因子VIIIa的复合物通过凝固级联的内在途径生成的凝血酶的不足。下列病症可能与获得性血友病A相关：特发性、妊娠、自身免疫性疾病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、皮肤病(例如牛皮癣、天疱疮)、呼吸系统疾病(例如哮喘、慢性阻塞性肺病)、过敏性药物反应、糖尿病、急性乙型肝炎感染、急性丙型肝炎感染、恶性肿瘤-实体瘤(前列腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌、头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、黑素瘤、肾癌)、血液恶性肿瘤。本领域的技术人员将理解的是，自身免疫性疾病可以包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、颞动脉炎、干燥综合征、自身免疫性溶血性贫血、肺出血肾炎综合征、重症肌无力、格雷夫斯病、自身免疫性甲状腺功能减退。本领域的技术人员将理解的是，进行青霉素及其衍生物、磺酰胺、苯妥英、氯霉素、甲基多巴、贮库噻吨、干扰素α、氟达拉滨、卡介苗(BCG)疫苗接种、去甲文拉法辛给药的受试者可能发生过敏反应。本领域的技术人员将理解的是，血液恶性肿瘤可以包括慢性淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化和红白血病。因此，在一个实施例中，本文提供了一种用于针对受试者治疗获得性血友病的方法，其包括对受试者进行本文所提供的组合物中的任一种的给药。
在另一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法用于治疗或预防肌肉出血。在另一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法用于治疗或预防关节出血。在另一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法提供了对鼻出血和牙龈出血、粘膜出血和至中枢神经系统中的出血的治疗或预防性治疗。在另一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法提供了对胃肠或脑出血的治疗或预防性治疗。在另一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法提供了对低频轻度出血的治疗或预防性治疗。在另一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法提供了对低频中度出血的治疗或预防性治疗。在另一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法提供了对高频轻度出血的治疗或预防性治疗。在另一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法提供了对高频中度出血的治疗或预防性治疗。
在一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法提供了对无症状血友病的治疗或预防性治疗。在另一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法提供了对轻度到中度血友病的治疗或预防性治疗。在另一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法提供了对重度血友病的治疗或预防性治疗。
在一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法提供了对出血的治疗或预防性治疗，该出血在一个实施例中为不可控制的出血，且在另一个实施例中为脑内出血。在另一个实施例中，本发明的组合物、制剂和方法提供了对新生儿凝血病；严重的肝病；高风险外科手术；创伤性失血；骨髓移植；血小板减少症和血小板功能障碍；口服抗凝的紧急逆转；因子V、VII、X和XI的先天性缺乏；或血管性血友病，在一个实施例中，为具有对血管性血友病因子的抑制剂的血管性血友病的治疗或预防性治疗。
在一个实施例中，本发明的经CTP修饰的凝固因子用于针对受试者治疗血友病或如本文所述的相关疾病。在一个实施例中，受试者为人。在另一个实施例中，受试者为人类儿童。在另一个实施例中，受试者为家养动物。在另一个实施例中，受试者为哺乳动物。在另一个实施例中，受试者为农场动物。在另一个实施例中，受试者为猴子。在另一个实施例中，受试者为马。在另一个实施例中，受试者为母牛。在另一个实施例中，受试者为小鼠。在另一个实施例中，受试者为大鼠。在另一个实施例中，受试者为犬科动物。在另一个实施例中，受试者为猫科动物。在另一个实施例中，受试者为牛科动物、羊科动物、猪科动物、马科动物、鼠科动物或鹿科动物。在一个实施例中，受试者为雄性动物。在另一个实施例中，受试者为雌性动物。在一个实施例中，受试者为儿童，在另一个实施例中，为青少年，在另一个实施例中，为成人，或在另一个实施例中，为老年受试者。在另一个实施例中，受试者为儿科受试者，在另一个实施例中，为老年科受试者。
在另一个实施例中，如本文所述的[(CTP)n>1-凝固因子]包括全长凝固因子或其活性片段，其经在其羧基末端上的肽键被连接到在其氨基末端上没有CTP的至少一个CTP单元。在另一个实施例中，如本文所述的[(CTP)n>1-凝固因子]包括凝固因子或其活性片段，其经肽键被连接到至少一个CTP单元，该至少一个CTP单元经在其氨基末端上没有CTP的肽键被连接至额外的CTP单元。在另一个实施例中，一个核酸分子编码工程化的凝固因子，该凝固因子包括被附接至其C末端且在其氨基末端上不具有CTP的至少一个CTP。
在另一个实施例中，CTP经连接子被附接至凝固因子。在另一个实施例中，将CTP序列连接至凝固因子的连接子为共价键。在另一个实施例中，将CTP序列连接至凝固因子的连接子为肽键。在另一个实施例中，将CTP序列连接至凝固因子的连接子为取代肽键。在另一个实施例中，CTP序列包括：DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO：1)。在另一个实施例中，CTP序列包括：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO：2)。在另一个实施例中，CTP序列包括选自在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中列出的序列的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明的羧基末端肽(CTP)序列包括如在SEQ ID NO：1中列出的人绒毛膜促性腺激素的氨基酸112至145位的氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的CTP序列包括如在SEQ ID NO：2中列出的人绒毛膜促性腺激素的氨基酸118至145位的氨基酸序列。在另一个实施例中，CTP序列还可以从112-118位之间的任何位置开始并终止于人绒毛膜促性腺激素的145位。在一些实施例中，CTP序列肽为28、29、30、31、32、33或34个氨基酸长并开始于CTP氨基酸序列的112、113、114、115、116、117或118位。
在另一个实施例中，CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相差1-5个保守性氨基酸取代，如通过引用并入本文的美国专利号5712122中所述的。在另一个实施例中，CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相差1个保守性氨基酸取代。在另一个实施例中，CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相差2个保守性氨基酸取代。在另一个实施例中，CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相差3个保守性氨基酸取代。在另一个实施例中，CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相差4个保守性氨基酸取代。在另一个实施例中，CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相差5个保守性氨基酸取代。
在另一个实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少70％的同源性。在另一个实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少80％的同源性。在另一个实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少90％的同源性。在另一个实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少95％的同源性。在另一个实施例中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少98％的同源性。
在另一个实施例中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然人CTP DNA序列或其肽具有至少70％的同源性。在另一个实施例中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然人CTPDNA序列或其肽具有至少80％的同源性。在另一个实施例中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然CTP DNA序列或其肽具有至少90％的同源性。在另一个实施例中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然CTP DNA序列或其肽具有至少95％的同源性。在另一个实施例中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然CTP DNA序列或其肽具有至少98％的同源性。
在一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的至少一个被截短。在另一个实施例中，两个绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列均被截短。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个被截短。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的3个被截短。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的4个被截短。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的5个被截短。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个或更多个被截短。在另一个实施例中，所有绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列均被截短。在一个实施例中，截短的CTP包括SEQ ID NO：3的前10个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO：3包括下列氨基酸(AA)序列：SSSSKAPPPSLP。
在一个实施例中，截短的CTP包括SEQ ID NO：2的前10个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO：2包括下列氨基酸(AA)序列：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ。
在一个实施例中，截短的CTP包括SEQ ID NO：2的前11个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包括SEQ ID NO：2的前12个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的前8个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包括SEQ ID NO：2的前13个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包括SEQ ID NO：2的前14个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的前6个氨基酸。在一个实施例中，截短的CTP包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的前5个氨基酸。
在一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的至少一个是糖基化的。在另一个实施例中，两个绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列均是糖基化的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个是糖基化的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的3个是糖基化的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的4个是糖基化的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的5个是糖基化的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个或更多个是糖基化的。在另一个实施例中，所有绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列均是糖基化的。
在一个实施例中，本发明的CTP序列包括至少一个糖基化位点。在一个实施例中，本发明的CTP序列包括2个糖基化位点。在一个实施例中，本发明的CTP序列包括3个糖基化位点。在一个实施例中，本发明的CTP序列包括4个糖基化位点。在一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的一个或多个是完全糖基化的。在另一个实施例中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的一个或多个是部分糖基化的。在一个实施例中，部分糖基化的是指CTP糖基化位点中的一个是糖基化的。在另一个实施例中，CTP糖基化位点中的两个是糖基化的。在另一个实施例中，CTP糖基化位点中的三个是糖基化的。
在一些实施例中，CTP序列修饰在允许使用较低剂量的方面是有利的。在一些实施例中，CTP序列修饰在允许更少剂量的方面是有利的。在一些实施例中，CTP序列修饰在允许安全的长效作用的方面是有利的。
在一些实施例中，如本文所使用的“多肽”、“工程化的凝固因子”或“蛋白”包含天然多肽(降解产物、合成多肽或重组多肽中的任一种)和模拟肽(通常为合成多肽)以及为多肽类似物的类肽和半类肽，其在一些实施例中具有使包括凝固因子的多肽在体内甚至更稳定或更能够渗透至细胞中的修饰。
在一些实施例中，修饰包括但不限于C末端修饰，多肽键修饰，其包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH，骨架修饰和残基修饰。用于制备模拟肽化合物的方法在本领域中是众所周知的且例如在QuantitativeDrug Design(定量药物设计)，C.A.Ramsden Gd.,Chapter 17.2,F.Choplin PergamonPress(1992)(其通过引用并入本文如同在本文中完全阐述的一样)中进行了指定。下面提供了在这个方面的另外的细节。
在一些实施例中，在多肽内的多肽键(-CO-NH-)被取代。在一些实施例中，多肽键被N-甲基化的键(-N(CH3)-CO-)取代。在一些实施例中，多肽键被酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)取代。在一些实施例中，多肽键被酮亚甲基键(-CO-CH2-)取代。在一些实施例中，多肽键被α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R为任何烷基，例如甲基，碳环(carba)键(-CH2-NH-)。在一些实施例中，多肽键被羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)取代。在一些实施例中，多肽键被硫代酰胺键(-CS-NH-)取代。在一些实施例中，多肽键被烯属双键(-CH＝CH-)取代。在一些实施例中，多肽键被逆向酰胺键(-NH-CO-)取代。在一些实施例中，多肽键被多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)取代，其中R是天然存在于碳原子上的“正常”侧链。在一些实施例中，这些修饰发生在沿多肽链的键中的任何一个处，且在一个实施例中同时发生在几个(2至3个键)处。
在一些实施例中，多肽的天然芳香族氨基酸，诸如Trp、Tyr和Phe被取代以用于合成的非天然酸，诸如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤代衍生物或邻甲基-Tyr。在一些实施例中，本发明的多肽包括一个或多个修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如，脂肪酸、复合碳水化合物等)。
在一个实施例中，“氨基酸”或“氨基酸序列”被理解成包括20个天然存在的氨基酸；那些通常在体内进行转译后修饰的氨基酸，其包括，例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他不寻常的氨基酸，其包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。在一个实施例中，“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸。
在一些实施例中，本发明的多肽用于需要包括凝固因子的多肽为可溶形式的治疗中。在一些实施例中，本发明的多肽包括一个或多个非天然或天然极性氨基酸，包括但不限于丝氨酸和苏氨酸，由于其含羟基的侧链，其能够增加多肽的溶解性。
在一些实施例中，本发明的工程化的凝固因子是以线性形式使用的，但本领域的技术人员将理解的是，在环化不严重干扰工程化的凝固因子的特征的情况下，也能够使用工程化的凝固因子的环的形式。
在一些实施例中，本发明的工程化的凝固因子是生物化学合成的，诸如通过使用标准的固相技术来进行。在一些实施例中，这些生物化学方法包括专用固相合成、部分固相合成、片段缩合或经典溶液合成。
在一些实施例中，重组蛋白技术用于生成本发明的工程化的凝固因子。在一些实施例中，重组蛋白技术用于生成相对长的多肽(例如，长于18至25个氨基酸)。在一些实施例中，重组蛋白技术用于生成大量的本发明的工程化的凝固因子。在一些实施例中，重组技术由以下进行了描述：Bitter等，(1987)酶学中的方法，153：516-544；Studier等，(1990)酶学中的方法，185：60-89；Brisson等，(1984)自然，310：511-514；Takamatsu等，(1987)EMBOJ.，6：307-311；Coruzzi等，(1984)EMBO J.3：1671-1680；以及Brogli等，(1984)科学，224：838-843；Gurley等，(1986)分子细胞生物学报，6：559-565；以及Weissbach&Weissbach，1988，用于植物分子生物的方法，学术出版社，纽约，第VIII章节，第421-463页，其全部内容通过引用并入本文。
在另一个实施例中，本公开提供了一种包括对多肽进行编码的基因的编码部分的多核苷酸分子，该多肽包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的促性腺激素羧基末端肽，如上所述。在另一个实施例中，本公开提供了一种由对多肽进行编码的基因的编码部分组成的多核苷酸分子，该多肽包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的促性腺激素羧基末端肽，如上所述。在另一个实施例中，本公开提供了一种基本上由对多肽进行编码的基因的编码部分组成的多核苷酸分子，该多肽包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的促性腺激素羧基末端肽，如上所述。
在另一个实施例中，本公开提供了一种对多肽进行编码的多核苷酸，该多肽包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽，如上所述。在另一个实施例中，本公开提供了一种对多肽进行编码的多核苷酸，该多肽由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽组成，如上所述。在另一个实施例中，本公开提供了一种对多肽进行编码的多核苷酸，该多肽基本上由凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽组成，如上所述。在一个实施例中，多核苷酸为多核苷酸序列。在一个实施例中，多核苷酸为多核苷酸分子。
在另一个实施例中，本公开提供了一种表达载体，其包括如本文所述的多核苷酸分子。在另一个实施例中，本发明提供了一种包括对经CTP修饰的多肽进行编码的多核苷酸的表达载体，该经CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和被附接至该FIX多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成。在另一个实施例中，本发明提供了一种包括对经CTP修饰的多肽进行编码的多核苷酸的表达载体，该经CTP修饰的多肽由因子VIIa(FVIIa)多肽和被附接至该FVIIa多肽的羧基末端的三个到五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成。
在另一个实施例中，本公开提供了一种细胞，其包括如本文所述的表达载体。在另一个实施例中，本发明提供了一种包括表达载体的细胞，该表达载体包括对由因子IX(FIX)多肽和被附接至该FIX多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽进行编码的多核苷酸。在另一个实施例中，本发明提供了一种包括表达载体的细胞，该表达载体包括对由因子VIIa(FVIIa)多肽和被附接至该FVIIa多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽进行编码的多核苷酸。
在另一个实施例中，本公开提供了一种组合物，其包括如本文所述的表达载体。在另一个实施例中，本发明提供了一种包括表达载体的组合物，该表达载体包括对由因子IX(FIX)多肽和被附接至该FIX多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽进行编码的多核苷酸。在另一个实施例中，本发明提供了一种包括表达载体的组合物，该表达载体包括对由因子VIIa(FVIIa)多肽和被附接至该FVIIa多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽进行编码的多核苷酸。
在另一个实施例中，本公开提供了一种组合物，其包括如本文所述的细胞。在另一个实施例中，细胞为真核细胞。在另一个实施例中，细胞为原核细胞。
在另一个实施例中，本发明提供了一种产生经CTP修饰凝固因子的方法，其包括将一个到十个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至凝固因子的羧基末端的步骤，从而产生经CTP修饰的凝固因子。在另一个实施例中，本发明提供了一种产生经CTP修饰的凝固因子的方法，其包括将对绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)进行编码的一个到十个多核苷酸序列附接至对该凝固因子进行编码的多核苷酸序列的羧基末端的步骤，从而产生经CTP修饰的凝固因子。在另一个实施例中，本发明提供了一种产生经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FIX多肽的羧基末端的步骤，从而产生经CTP修饰的FIX多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种产生经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVIIa多肽的羧基末端的步骤，从而产生经CTP修饰的FVIIa多肽。
在另一个实施例中，本发明的工程化的凝固因子是使用编码本发明的多肽的多核苷酸分子进行合成的。在一些实施例中，编码本发明的工程化的凝固因子的多核苷酸分子被连接至表达载体中，该表达载体包括对顺式调控序列(例如，启动子序列)的转录控制。在一些实施例中，顺式调控序列适于指导本发明的工程化的凝固因子的组成型表达。在一些实施例中，顺式调控序列适于指导本发明的工程化的凝固因子的组织特异性表达。在一些实施例中，顺式调控序列适于指导本发明的工程化的凝固因子的诱导型表达。
在一些实施例中，适于与本发明一起使用的组织特异性启动子包括在一个或多个特定细胞群体中具有功能性的序列。实例包括但不限于诸如白蛋白的肝特异性启动子[Pinkert等，(1987)基因与发育，1：268-277(Pinkert et al.,(1987)Genes Dev.1:268-277)]，淋巴特异性启动子[Calame等，(1988)免疫学进展，43：235-275(Calame et al.,(1988)Adv.Immunol.43:235-275)]；特别是T细胞受体的启动子[Winoto等，(1989)EMBOJ.8：729-733(Winoto et al.,(1989)EMBO J.8:729-733)]和免疫球蛋白；[Banerji等，(1983)细胞学33729-740(Banerji et al.(1983)Cell 33729-740)]，神经元特异性启动子，诸如神经丝启动子[Byrne等，(1989)美国科学院院报，86：5473-5477(Byrne et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477)]，胰腺特异性启动子[Edlunch等，(1985)科学，230：912-916(Edlunch et al.(1985)Science 230:912-916)]或乳腺特异性启动子，诸如牛奶乳清启动子(美国专利号4873316和欧洲申请公开号264166)。适于与本发明一起使用的诱导型启动子包括，例如，四环素诱导型启动子(Srour,M.A.等，2003，血栓形成与止血，90：398-405(Srour,M.A.,et al.,2003.Thromb.Haemost.90:398-405))。
在一个实施例中，短语“多核苷酸分子”是指单链或双链核酸序列，其是以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，上述的组合)的形式进行分离和提供的。
在一个实施例中，“互补多核苷酸序列”是指使用逆转录酶或任何其他RNA依赖性DNA聚合酶的信使RNA的逆转录所产生的序列。在一个实施例中，随后能够使用DNA聚合酶在体内或体外扩增该序列。
在一个实施例中，“基因组多核苷酸序列”是指从染色体衍生(分离)的序列且因此其表示染色体的连续部分。
在一个实施例中，“复合多核苷酸序列”是指至少部分是互补的且至少部分是基因组的序列。在一个实施例中，复合序列能够包括编码本发明的多肽所需的一些外显子序列，以及插在其之间的一些内含子序列。在一个实施例中，内含子序列能够是任何来源的，包括其他基因的，且通常将包括保守的剪接信号序列。在一个实施例中，内含子序列包括顺式作用的表达调控元件。
在一个实施例中，在表达和分泌之后，从前体工程化的凝固因子切割信号肽，这生成缺乏信号肽的成熟的工程化的凝固因子。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸是使用PCR技术或本领域的技术人员已知的任何其他方法或过程制备的。在一些实施例中，该程序涉及两个不同的DNA序列的连接(见，例如，“现代分子生物学技术(Current Protocols in Molecular Biology)”，主编Ausubel等，John Wiley&Sons，1992)。
在一个实施例中，对工程化的凝固因子进行编码的本发明的多核苷酸被插入表达载体(即，核酸构建体)中以使得能够表达重组多肽。在一个实施例中，本发明的表达载体包括使得该载体适于在原核生物中复制和整合的额外的序列。在一个实施例中，本发明的表达载体包括使得该载体适于在真核生物中复制和整合的额外的序列。在一个实施例中，本发明的表达载体包括使得该载体适于在原核生物和真核生物两者中复制和整合的穿梭载体。在一些实施例中，克隆载体包含转录和转译起始序列(例如，启动子、增强子)和转录和转译终止子(例如，多腺苷酸化信号)。
在一个实施例中，多种原核或真核细胞能够被用作宿主表达系统以表达本发明的凝固因子。在一些实施例中，这些包括但不限于微生物，诸如用含有多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；感染了重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体，诸如Ti质粒转化的植物细胞系统。
在一些实施例中，使用非细菌表达系统(例如，哺乳动物表达系统，诸如CHO细胞)来表达本发明的凝固因子。在一个实施例中，用于在哺乳动物细胞中表达本发明的多核苷酸的表达载体为包括CMV启动子和新霉素抗性基因的pCI-DHFR载体。在实例1中描述了根据一个实施例的pCI-dhfr载体的构建。
在一些实施例中，在本发明的细菌系统中，能够根据针对所表达的多肽的用途来有利地选择多个表达载体。在一个实施例中，需要大量的多肽。在一个实施例中，需要指导蛋白产物的高水平表达的载体，其可能与疏水性信号序列相融合，其将表达产物引入易于纯化蛋白产物的细菌的周质或培养基中。在一个实施例中，某些融合蛋白被用特异性切割位点进行工程化以帮助恢复多肽。在一个实施例中，适合于这种操纵的载体包括但不限于pET系列的大肠杆菌表达载体[Studier等，酶学中的方法(Methods in Enzymol.)，185：60-89(1990)]。
在一个实施例中，使用酵母表达系统。在一个实施例中，含有组成型或诱导型启动子的多个载体能够用于如全部内容通过引用并入本文的美国专利申请号：5932447中所公开的酵母中。在另一个实施例中，使用了促进外源DNA序列至酵母染色体中的整合的载体。
在一个实施例中，本发明的表达载体还能够包括额外的多核苷酸序列，其允许，例如，源于单个mRNA，诸如内部核糖体进入位点(IRES)的多个蛋白和用于启动子-嵌合多肽的基因组整合的序列的转译。
在一些实施例中，哺乳动物表达载体包括但不限于可从Invitrogen获得的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，可从Promega获得的pCI，可从Strategene获得的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，可从Clontech获得的pTRES及其衍生物。
在一些实施例中，含有源于真核病毒，诸如逆转录病毒的调控元件的表达载体用于本发明中。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在一些实施例中，源于牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，并且源于Epstein Bar病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和允许在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或在真核细胞中显示为能进行有效表达的其他启动子的指导下表达蛋白的任何其他载体。
在一些实施例中，重组病毒载体可用于本发明的凝固因子的体内表达，这是因为其提供了诸如横向感染和靶向特异性的优点。在一个实施例中，横向感染是在例如，逆转录病毒的生命周期中所固有的且是单个感染的细胞产生许多萌芽并感染相邻细胞的子代病毒颗粒的过程。在一个实施例中，结果是大面积被迅速感染，其中的大部分最初没有被原始病毒颗粒感染。在一个实施例中，产生不能横向传播的病毒载体。在一个实施例中，如果所需的用途是要将特定的基因仅引入局部数量的靶细胞中，该特征则可能是有用的。
在一个实施例中，能够使用各种方法来将本发明的表达载体引入细胞中。这种方法在Sambrook等，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，纽约(1989，1992)；Ausubel等，现代分子生物学技术，John Wiley和Sons，巴尔的摩，马里兰州(1989)；Chang等，体细胞基因治疗，CRC出版社，安娜堡，密歇根州(1995)；Vega等，基因靶向，CRC出版社，安娜堡，密歇根州(1995)；载体：分子克隆载体的调查及其用途，巴特沃思，波士顿，马萨诸塞州(1988)；以及Gilboa等，[生物技术4(6)：504-512,1986]中进行了总体描述且包括，例如，稳定或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔和用重组病毒载体进行的感染。此外，对于正负双向选择方法可参见通过引用并入本文的美国专利号5464764和5487992。
在一些实施例中，通过病毒感染引入核酸提供了比其他方法，诸如脂质体转染和电穿孔更好的多个优点，这是因为由于病毒的感染性质能够获得更高的转染效率。
在一个实施例中，将理解的是本发明的工程化的凝固因子还能够从采用如上所述的任何合适的给药模式对个体进行给药的核酸构建体进行表达(即，体内基因治疗)。在一个实施例中，根据需要，核酸构建体经适当的基因传递载体/方法(转染、转导、同源重组等)和表达系统被引入合适的细胞中，且随后经修饰的细胞在培养物中被进行扩增并被返回至个体(即，离体基因治疗)。
在一个实施例中，使用植物表达载体。在一个实施例中，多肽编码序列的表达是通过多个启动子驱动的。在一些实施例中，使用了病毒启动子，诸如CaMV的35S RNA启动子和19S RNA启动子[Brisson等，自然，310：511-514(1984)]或至TMV的外壳蛋白启动子[Takamatsu等，EMBO J.6：307-311(1987)]。在另一个实施例中，使用了植物启动子，诸如，例如RUBISCO的小亚基[Coruzzi等，EMBO J.3：1671-1680(1984)；和Brogli等，科学，224：838-843(1984)]或热休克启动子，例如，大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurley等，分子细胞生物学报，6：559-565(1986)]。在一个实施例中，使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔和本领域的技术人员所公知的其他技术将构建体引入植物细胞中。参见，例如，Weissbach&Weissbach[用于植物分子生物学的方法，学术出版社，纽约，第VIII章节，第421-463页(1988)]。本发明也能够使用在本领域中所公知的其他表达系统，诸如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统。
将理解的是，除了含有用于转录和转译插入的编码序列(其对多肽进行编码)所必需的元件外，本发明的表达构建体还能够包括工程化以优化所表达的多肽的稳定性、产出、纯化、产率或活性的序列。
在一些实施例中，在有效条件下对转化的细胞进行培养，这允许表达大量的重组工程化的凝固因子。在一些实施例中，有效的培养条件包括但不限于允许产生蛋白的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧气条件。在一个实施例中，有效培养基是指其中培养细胞以产生本发明的重组多肽的任何培养基。在一些实施例中，培养基通常包括具有可同化的碳源、氮源和磷源的水溶液，以及适当的盐、矿物质、金属和其他营养物，诸如维生素。在一些实施例中，本发明的细胞能够在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定盘和培养皿中进行培养。在一些实施例中，在适合于重组细胞的温度、pH和氧含量下进行培养。在一些实施例中，在本领域普通技术人员的专业知识范围内确定培养条件。
在一些实施例中，根据用于产出的载体和宿主系统，本发明所得的工程化的凝固因子或者保留在重组细胞内，被分泌至发酵培养基中，被分泌至两个细胞膜之间的空间中，诸如大肠杆菌中的周质空间中；或者被保留在细胞或病毒膜的外表面上。
在一个实施例中，在培养预定时间后，实施对重组工程化的凝固因子的恢复。
在一个实施例中，如本文所使用的短语“恢复重组工程化的凝固因子”是指收集含有多肽的全发酵培养基且不一定必然包含额外的分离或纯化步骤。
在一个实施例中，本发明的工程化的凝固因子是使用多种标准蛋白纯化技术，诸如，但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反向层析、伴刀豆球蛋白A层析、层析聚焦和差别溶解来纯化的。
在一个实施例中，为了便于恢复，所表达的编码序列能够进行工程化以编码本发明的工程化的凝固因子和融合的可切割部分。在一个实施例中，能够将融合蛋白设计成，以使得能够通过亲和层析很容易地分离多肽；例如，通过在专用于可切割部分的柱上固定来实现。在一个实施例中，可切割位点在工程化的凝固因子和可切割部分之间被进行工程化，且能够通过用在该位点特异性切割融合蛋白的适当的酶或试剂进行处理来从层析柱释放多肽[例如，见Booth等，免疫学通讯，19：65-70(1988)；以及Gardella等，生物化学杂志，265：15854-15859(1990)]。
在一个实施例中，本发明的工程化的凝固因子是以“基本上纯的”形式进行恢复的。
在一个实施例中，短语“基本上纯的”是指允许在本文所述的应用中有效地使用蛋白的纯度。
在一个实施例中，本发明的工程化的凝固因子还能够使用体外表达系统进行合成。在一个实施例中，体外合成方法在本领域中是公知的，且该系统的组分是可商购的。
在一些实施例中，合成和纯化重组工程化的凝固因子；其治疗功效能够在体内或体外进行测定。在一个实施例中，本发明的重组工程化的凝固因子的结合活性能够使用本领域技术人员已知的各种测定来确定。
在另一个实施例中，本发明的工程化的凝固因子能够被提供给个体本身。在一个实施例中，本发明的工程化的凝固因子能够作为药物组合物的一部分被提供至个体，在药物组合物中其与药学上可接受的载体相混合。
在另一个实施例中，“药物组合物”是指本文所述的活性成分中的一个或多个与其他化学组分，诸如生理学适合的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是用于促进化合物至有机体的给药。
在另一个实施例中，“活性成分”是指可负责生物效应的感兴趣的多肽序列。
在另一个实施例中，本发明的组合物中的任一个将包括至少一个CTP序列，其以任何形式仅被结合至感兴趣的工程化的凝固因子的羧基末端。在一个实施例中，本发明提供了组合的制剂。在一个实施例中，“组合的制剂”特别地限定“套装药盒”，其意义在于如上所述的组合配合物能够独立地或通过使用具有不同量的组合配合物的不同的固定组合，即，同时地、并存地、分别地或相继地进行给药。在一些实施例中，套装药盒的各部分随后能够，例如，同时或按时间顺序交叉地进行给药，即在不同的时间点且针对套装药盒的任何部分以相等或不同的时间间隔进行给药。在一些实施例中，能够在组合的制剂中管理组合配合物的总量的比率。在一个实施例中，能够改变组合的制剂，例如，从而应对要治疗的患者亚群的需要或由于特定的疾病、疾病的严重程度、年龄、性别或体重而可能具有不同需要的单个患者的需要，如本领域的技术人员能够很容易做出的改变一样。
在另一个实施例中，可互换使用的短语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对有机体造成显著刺激且不会消除所给药的化合物的生物学活性和特性的载体或稀释剂。在这些短语下包括佐剂。在一个实施例中，在药学上可接受的载体中包括的成分中的一种可以是，例如，聚乙二醇(PEG)、在有机介质和水性介质中具有宽范围的溶解性的生物相容性聚合物(Mutter等，(1979))。
在另一个实施例中，“赋形剂”是指被添加至药物组合物以进一步促进活性成分的给药的惰性物质。在一个实施例中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
在通过引用并入本文的“雷明顿制药科学”，Mack Publishing Co.,伊斯顿，宾州，最新版本("Remington’s Pharmaceutical Sciences,"Mack Publishing Co.,Easton,PA,latest edition)中能找到用于对药物进行配制和给药的技术。
本发明考虑了剂量范围的多个实施例。在一个实施例中，本发明的工程化凝固因子的剂量在0.005-100mg/日的范围内。在另一个实施例中，剂量在0.005-5mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在0.01-50mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在0.1-20mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在0.1-10mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在0.01-5mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在0.001-0.01mg/日的范围中。
在另一个实施例中，剂量在0.001-0.1mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在0.1-5mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在0.5-50mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在0.2-15mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在0.8-65mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在1-50mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在5-10mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在8-15mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在10-20mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在20-40mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在60-120mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在12-40mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在40-60mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在50-100mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在1-60mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在15-25mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在5-10mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在55-65mg/日的范围中。
在另一个实施例中，剂量在50-500mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在50-150mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在100-200mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在150-250mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在200-300mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在250-400mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在300-500mg/日的范围中。在另一个实施例中，剂量在350-500mg/日的范围中。
在一个实施例中，剂量为20mg/日。在一个实施例中，剂量为30mg/日。在一个实施例中，剂量为40mg/日。在一个实施例中，剂量为50mg/日。在一个实施例中，剂量为0.01mg/日。在另一个实施例中，剂量为0.1mg/日。在另一个实施例中，剂量为1mg/日。在另一个实施例中，剂量为0.530mg/日。在另一个实施例中，剂量为0.05mg/日。在另一个实施例中，剂量为50mg/日。在另一个实施例中，剂量为10mg/日。在另一个实施例中，剂量为20-70mg/日。在另一个实施例中，剂量为5mg/日。
在一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子的剂量为1-5mg/日。在一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子的剂量为1-3mg/日。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子的剂量为2mg/日。
在另一个实施例中，剂量为1-90mg/日。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/2日。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/3日。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/4日。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/5日。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/6日。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/周。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/9日。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/11日。在另一个实施例中，剂量为1-90mg/14日。
在另一个实施例中，凝固因子的剂量为10-50mg/日。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/2日。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/3日。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/4日。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/5日。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/6日。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/周。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/9日。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/11日。在另一个实施例中，剂量为10-50mg/14日。
在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按鼻内剂型进行配制的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按可注射剂型进行配制的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在0.0001mg至0.6mg的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在0.001mg至0.005mg的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在0.005mg至0.01mg的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在0.01mg至0.3mg的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在0.2mg至0.6mg的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，凝固因子在其氨基末端上不含有CTP。
在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在1-100微克的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在10-80微克的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在20-60微克的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在10-50微克的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在40-80微克的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在10-30微克的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在30-60微克的范围内的剂量对受试者进行给药的。
在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在0.2mg至2mg的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在2mg至6mg的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在4mg至10mg的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是按在5mg至15mg的范围内的剂量对受试者进行给药的。
在一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是按在10μg/kg-1000μg/kg的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是按在25μg/kg-600μg/kg的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是按在50μg/kg-400μg/kg的范围内的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是按约25μg/kg的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是按约50μg/kg的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是按约100μg/kg的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是按约200μg/kg的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是按约300μg/kg的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是按约400μg/kg的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是按约500μg/kg的剂量对受试者进行给药的。在另一个实施例中，由经CTP修饰的凝固因子是按约600μg/kg的剂量对受试者进行给药的。
在一个实施例中，经CTP修饰的FIX的剂量包括在相同的时间段按重组FIX(例如，
惠氏或
CSL Behring)的推荐剂量对患者进行给药的FIX的量的50％。在一个实施例中，经CTP修饰的FVIIa的剂量包括在相同的时间段按重组FVIIa(例如，
)的推荐剂量对患者进行给药的FVIIa的量的50％。在一个实施例中，经CTP修饰的FVII的剂量包括在相同的时间段按重组FVII的推荐剂量对患者进行给药的FVII的量的50％。例如，如果术前或术后每2小时按90mcg/kg的剂量给予患者
(即，对于85kg的患者来说，每2小时7.65mg或12小时六剂共45.9mg)，则可以按患者的重组FVIIa的12小时剂量的50％的剂量给予本发明的经CTP修饰的凝固因子(即，12小时给予一次23mg的剂量)。
在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子的剂量使得其含有使用未经CTP修饰的凝固因子给药的凝固因子的量的45％。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子的剂量使得其含有使用未经CTP修饰的凝固因子给药的凝固因子的量的10％。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子的剂量使得其含有使用未经CTP修饰的凝固因子给药的凝固因子的量的25％。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子的剂量使得其含有使用未经CTP修饰的凝固因子给药的凝固因子的量的35％。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子的剂量使得其含有使用未经CTP修饰的凝固因子给药的凝固因子的量的75％。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子的剂量使得其含有使用未经CTP修饰的凝固因子给药的凝固因子的量的100％。然而，即使剂量含有与未经CTP修饰的凝固因子相同量的凝固因子(例如，FIX)，对受试者来说仍然是有利的，这是因为由于与重组凝固因子相比，其具有延长的半衰期，因此将更少地进行给药。
在另一个实施例中，共轭凝固因子的治疗有效量为每千克体重50-500IU，其是按用于FIX的每日一次至每周一次或用于FVIIa的10μg/Kg-500μg/Kg进行给药的。在另一个实施例中，共轭凝固因子的治疗有效量为每千克体重150-250IU，其是按每日一次进行给药的。在另一个实施例中，包括共轭凝固因子的药物组合物是按可有效地通过各种方式对人类患者进行给药的强度进行配制的。
在一个实施例中，针对受试者以有效地使循环因子IX活性达到20-30IU/dL的量进行FIX的给药。在另一个实施例中，针对受试者以有效地使循环因子IX活性达到25-50IU/dL的量进行FIX的给药。在另一个实施例中，针对受试者以有效地使循环因子IX活性达到50-100IU/dL的量进行FIX的给药。在另一个实施例中，针对受试者以有效地使循环因子IX活性达到100-200IU/dL的量进行FIX的给药。在另一个实施例中，针对受试者以有效地使循环因子IX活性达到10-50IU/dL的量进行FIX的给药。在另一个实施例中，针对受试者以有效地使循环因子IX活性达到20-100IU/dL的量进行FIX的给药。
在一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子以每周一次对受试者进行给药。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子以每周两次对受试者进行给药。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子以每双周一次(每两周一次)对受试者进行给药。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子以每月两次对受试者进行给药。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子以每月一次对受试者进行给药。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子以每日一次对受试者进行给药。在另一个实施例中，经CTP修饰的凝固因子以每两日一次对受试者进行给药。
在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是以每三日一次对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是以每四日一次对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是以每五日一次对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是以每六日一次对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是以每7-14日一次对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是以每10-20日一次对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是以每5-15日一次对受试者进行给药的。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽是以每15-30日一次对受试者进行给药的。
在另一个实施例中，本公开的方法包括增加在凝固因子疗法的使用中的依从性，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的多肽，从而增加在凝固因子疗法的使用中的依从性。
在另一个实施例中，本公开的方法包括增加患有需要凝固因子疗法的慢性疾病的患者的依从性。在另一个实施例中，本公开的方法使得能够如上所述的用CTP修饰凝固因子来降低凝固因子的给药频率。
在另一个实施例中，本发明提供了一种减少因子IX(FIX)多肽的给药频率的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FIX多肽的羧基末端的步骤，从而减少该FIX多肽的给药频率。在另一个实施例中，本发明提供了一种减少因子VIIa(FVIIa)多肽的给药频率的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVIIa多肽的羧基末端的步骤，从而减少该FVIIa多肽的给药频率。
在另一个实施例中，术语依从性包括顺从性。在另一个实施例中，本公开的方法包括通过降低凝固因子的给药频率来增加需要凝固因子疗法的患者的依从性。在另一个实施例中，由于使经CTP修饰的凝固因子更稳定的CTP修饰，实现了凝固因子的给药频率的降低。在另一个实施例中，由于增加了凝固因子的T1/2，实现了凝固因子的给药频率的降低。在另一个实施例中，由于增加清除时间或降低凝固因子的清除速率，实现了凝固因子的给药频率的降低。
在另一个实施例中，本发明提供了一种降低因子IX(FIX)多肽的清除速率的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FIX多肽的羧基末端的步骤，从而降低该FIX多肽的清除速率。在另一个实施例中，本发明提供了一种降低因子VIIa(FVIIa)多肽的清除速率的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVIIa多肽的羧基末端的步骤，从而降低该FVIIa多肽的清除速率。
在另一个实施例中，由于增加了凝固因子的AUC测量，实现了凝固因子的给药频率的降低。
在另一个实施例中，本文提供了一种降低凝固因子的给药频率的方法，其包括将一个到十个CTP附接至凝固因子的羧基末端的步骤，从而降低凝固因子的给药频率。在另一个实施例中，本文提供了一种降低凝固因子的给药频率的方法，其包括将一个到五个CTP附接至凝固因子的羧基末端的步骤，从而降低凝固因子的给药频率。在另一个实施例中，本文提供了一种降低凝固因子的给药频率的方法，其包括将三个CTP附接至凝固因子的羧基末端的步骤，从而降低凝固因子的给药频率。在另一个实施例中，本文提供了一种降低凝固因子的给药频率的方法，其包括将三个到五个CTP附接至凝固因子的羧基末端的步骤，从而降低凝固因子的给药频率。
在另一个实施例中，本文提供了一种增加在凝固因子疗法的使用中的依从性的方法，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的一个到十个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而增加在凝固因子疗法的使用中的依从性。在另一个实施例中，本文提供了一种增加在凝固因子疗法的使用中的依从性的方法，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的一个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而增加在凝固因子疗法的使用中的依从性。在另一个实施例中，本文提供了一种增加在凝固因子疗法的使用中的依从性的方法，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而增加在凝固因子疗法的使用中的依从性。在另一个实施例中，本文提供了一种增加在凝固因子疗法的使用中的依从性的方法，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而增加在凝固因子疗法的使用中的依从性。
在另一个实施例中，本文提供了一种针对受试者预防或治疗血液凝结或凝固障碍的方法，其包括向该受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的一个到十个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而针对该受试者治疗血液凝结或凝固障碍。在另一个实施例中，本文提供了一种针对受试者预防或治疗血液凝结或凝固障碍的方法，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的一个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而针对该受试者预防或治疗血液凝结或凝固障碍。在另一个实施例中，本文提供了一种针对受试者预防或治疗血液凝结或凝固障碍的方法，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而针对该受试者预防或治疗血液凝结或凝固障碍。在另一个实施例中，本文提供了一种针对受试者预防或治疗血液凝结或凝固障碍的方法，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而针对该受试者预防或治疗血液凝结或凝固障碍。
在另一个实施例中，本文提供了一种针对受试者预防血友病的方法，其包括向该受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的一个到十个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而针对该受试者预防血友病。在另一个实施例中，本文提供了一种针对受试者预防血友病的方法，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的一个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而针对该受试者预防血友病。在另一个实施例中，本文提供了一种针对受试者预防血友病的方法，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而针对该受试者预防血友病。在另一个实施例中，本文提供了一种针对受试者预防血友病的方法，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而针对该受试者预防血友病。
在另一个实施例中，本发明显示在SC给药之后本文提供的组合物被令人惊讶地更有效地吸收至血流中(见本文的实例7至9)。由于能够用于预防性应用，所以能够进行FVIIa的皮下给药具有优势。对于患者来说，皮下注射也更容易进行自行注射，且当患者很幼小且其静脉很小且难于找到时是有利的。
在另一个实施例中，本文提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括向该受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的一个到十个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而针对该受试者治疗血友病。在另一个实施例中，本文提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的一个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而针对该受试者治疗血友病。在另一个实施例中，本文提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而针对该受试者治疗血友病。在另一个实施例中，本文提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括向有需要的受试者提供包括凝固因子和被附接至凝固因子的羧基末端的三个到五个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽的多肽，从而针对该受试者治疗血友病。
在一个实施例中，口服给药包括单位剂型，其包括片剂、胶囊、锭剂、咀嚼片剂、混悬剂、乳剂等。这样的单位剂型包括安全且有效量的本公开的所需凝固因子，其中的各自在一个实施例中为约0.7mg或3.5mg至约280mg/70kg，或在另一个实施例中，为约0.5mg或10mg至约210mg/70kg。适于制备用于经口给药的单位剂型的药学上可接受的载体在本领域是公知的。在一些实施例中，片剂通常包括常规的药学上相容的佐剂如，惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、甘露醇、乳糖和纤维素；结合剂，诸如淀粉、明胶和蔗糖；崩解剂，诸如淀粉、海藻酸和交联羧甲基纤维素；润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。在一个实施例中，可以使用助流剂，诸如二氧化硅来改进粉末混合物的流动特征。在一个实施例中，对于外观，可以添加着色剂，诸如FD&C染料。对于咀嚼片剂来说，甜味剂和调味剂，诸如阿斯巴甜、糖精、薄荷醇、薄荷和水果调味剂是有用的佐剂。胶囊通常包括上面公开的一种或多种固体稀释剂。在一些实施例中，载体组分的选择取决于对于本发明的目的而言并非关键的次要考虑因素，如味道、成本和储存稳定性，且能够由本领域的技术人员很容易地进行。
在一个实施例中，口服剂型包括预定的释放曲线。在一个实施例中，本发明的口服剂型包括控释片剂、胶囊剂、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施例中，本发明的口服剂型包括缓释片剂、胶囊剂、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施例中，本发明的口服剂型包括速释片剂、胶囊剂、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施例中，口服剂型是根据本领域的技术人员已知的药物活性成分的所需释放曲线进行配制的。
在一些实施例中，经口组合物包括液体溶液、乳剂、混悬剂等。在一些实施例中，适于这种组合物的制备的药学上可接受的载体在本领域中是公知的。在一些实施例中，液体口服组合物包括约0.001％至约0.933％的所需化合物或在另一个实施例中包括约0.01％至约10％的所需化合物。
在一些实施例中，用于本发明的方法中的组合物包括溶液或乳剂，其在一些实施例中为水溶液或乳剂，其包括安全且有效量的本发明的化合物，且可选地，包括用于局部鼻内给药的其他化合物。在一些实施例中，组合物包括约0.001％至约10.0％w/v的标的化合物，更优选为约0.01％至约2.0％w/v的标的化合物，其通过鼻内途径进行化合物的全身递送。
在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽被注射到肌肉中(肌内注射)。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽在皮肤下进行注射(皮下注射)。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽被注射到肌肉中。在另一个实施例中，包括凝固因子和至少一个CTP单元的多肽被注射到皮肤中。在另一个实施例中，如本文所述的凝固因子是经全身给药来给药的。在另一个实施例中，如本文所述的凝固因子是通过静脉注射来给药的。在另一个实施例中，给药能够是肠胃外、肺部、口服、局部、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、经鼻、眼内、眼、硬膜外、口腔、直肠、透粘膜、肠道或肠胃外递送，包括髓内注射以及鞘内或直接脑室内给药。
在另一个实施例中，制剂是以局部而非全身的方式进行给药的，例如，通过将制剂直接注射至患者身体的特定区域中而进行。
在一个实施例中，给药途径可以是肠内的。在另一个实施例中，途径可以是结膜、透皮、皮内、动脉内、阴道、直肠、肿瘤内、肠胃外(parcanceral)、透粘膜、肌内、血管内、脑室内、颅内、鼻内、舌下或其组合。
在另一个实施例中，药物组合物和药物制剂是通过液体制剂的静脉内、动脉内或肌内注射来进行给药的。在一些实施例中，液体制剂包括溶液、混悬剂、分散剂、乳剂、油剂等。在一个实施例中，药物组合物和药物制剂是静脉内给药的，且从而以适于静脉内给药的形式进行配制。在另一个实施例中，药物组合物和药物制剂是动脉内给药的，且从而以适于动脉内给药的形式进行配制。在另一个实施例中，药物组合物和药物制剂是肌内给药的，且从而以适于肌内给药的形式进行配制。
此外，在另一个实施例中，药物组合物和药物制剂是局部给药至身体表面的，且从而以适于局部给药的形式进行配制。合适的局部制剂包括凝胶、软膏、乳膏、洗剂、滴剂等。对于局部给药而言，本发明的化合物与额外的适当的治疗剂相组合，且在具有或不具有药物载体的情况下按生理上可接受的稀释剂中的溶液、混悬剂或乳剂进行制备和施用。
在一个实施例中，本发明的药物组合物和药物制剂是通过本领域中公知的工艺制造的，例如，通过常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行。
在一个实施例中，用于根据本发明的用途的药物组合物和药物制剂是使用包括赋形剂和助剂的一种或多种生理上可接受的载体以传统的方式进行配制的，该载体便于将活性成分加工成可药用的制剂。在一个实施例中，制剂取决于所选的给药途径。
在一个实施例中，本公开的注射剂在水溶液中进行配制。在一个实施例中，本公开的注射剂在生理上相容的缓冲液，诸如Hank溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液中进行配制。在一些实施例中，为了透粘膜给药，在制剂中使用了适于待渗透的屏障的渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的。
在一个实施例中，将本文所述的制剂配制成用于肠胃外给药，例如，通过团注或连续输注进行。在一些实施例中，用于注射的制剂以单位剂型表示，例如，以具有可选的添加的防腐剂的安瓿或多剂量容器表示。在一些实施例中，组合物为在油性或水性载体中的混悬剂、溶液或乳剂且含有配制试剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
在一些实施例中，组合物还包括防腐剂，诸如苯扎氯铵和硫柳汞等；螯合剂，诸如依地酸钠等；缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐；张度剂，诸如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇等；抗氧化剂，诸如抗坏血酸、乙酰胱氨酸、焦亚硫酸钠等；芳香剂；粘度调节剂，诸如聚合物，包括纤维素及其衍生物；以及聚乙烯醇及酸和碱以根据需要调节这些水性组合物的pH。在一些实施例中，组合物还包括局部麻醉剂或其他活性物。组合物能够被用作喷雾剂、雾剂、滴剂等。
在一些实施例中，用于肠胃外给药的药物组合物和药物制剂包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。此外，在一些实施例中，活性成分的混悬剂被制备成适当的油基或水基注射混悬剂。在一些实施例中，合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。在一些实施例中，水性注射混悬剂含有增加混悬剂的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。在另一个实施例中，混悬剂还含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解性的试剂以允许制备高度浓缩的溶液。
在另一个实施例中，活性化合物能够以囊泡，特别以脂质体进行递送(见，Langer，科学，249：1527-1533(1990)；Treat等，在传染病和癌症的治疗中的脂质体(in Liposomesin the Therapy of Infectious Disease and Cancer)，Lopez-Beresteint和Fidler(主编)，Liss，纽约，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同前所述，第317-327页(Lopez-Berestein,ibid.,pp.317-327)；J.E.Diederichs等，Pharm./nd.56，(1994)267-275)。
在另一个实施例中，按控释系统进行递送的药物组合物被配制成用于静脉输注、可植入式渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其他给药模式。在一个实施例中，使用了泵(见，Langer，supra；Sefton，CRC生物医学工程杂志(CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.)，14：201(1987)；Buchwald等，外科学，88：507(1980)；Saudek等，新英格兰医学杂志，321：574(1989))。在另一个实施例中，能够使用聚合材料。在又一个实施例中，控释系统能够被置于接近治疗靶，即，脑处，从而仅需要全身剂量的一小部分(见，例如，Goodson，控释的医学应用，如上，第2卷，第115-138页(1984))。在Langer的综述中讨论了其他控释系统(科学，249：1527-1533(1990))。
在一些实施例中，活性成分为粉末形式以在使用之前与合适的载体，例如，无菌、无热原的水基溶液相组合。在一些实施例中，组合物被配制成用于雾化和吸入给药。在另一个实施例中，在具有附接的雾化工具的容器中含有组合物。
在一个实施例中，本发明的制剂使用，例如，传统的栓剂基质，诸如可可油或其他甘油酯以直肠组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂进行配制。
在一些实施例中，用于本发明的背景中的药物组合物和药物制剂包括组合物，在组合物中包含有效实现预定目的的量的活性成分。在一些实施例中，治疗有效量表示有效地预防、缓解或改善疾病症状或延长正在治疗的受试者的生存期的活性成分的量。
在一个实施例中，治疗有效量的确定完全处于本领域的技术人员的能力范围内。
能够用作药学上可接受的载体或其组分的物质的一些实例为糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，诸如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，诸如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，诸如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，诸如TweenTM牌乳化剂；润湿剂，诸如十二烷基硫酸钠；着色剂；调味剂；制片剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐水；以及磷酸盐缓冲溶液。对要与化合物联合使用的药学上可接受的载体的选择基本上是由化合物的待给药方式确定的。如果标的化合物要被注射，则在一个实施例中药学上可接受的载体是具有血液相容性悬浮试剂的无菌生理盐水，则其pH已被调节至约7.4。
此外，组合物还包括结合剂(例如，阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)，崩解剂(例如，玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、瓜尔胶、羟基乙酸淀粉钠)，具有各种pH和离子强度的缓冲液(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)，用于防止吸收到表面的添加剂，诸如白蛋白或明胶，洗涤剂(例如，吐温20、吐温80、普兰尼克F68、胆汁酸盐)，蛋白酶抑制剂，表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)，渗透增强剂，增溶剂(例如，甘油、聚乙二醇)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基化羟基茴香醚)，稳定剂(例如，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)，增粘剂(例如，卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)，甜味剂(例如，阿斯巴甜、柠檬酸)，防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)，润滑剂(例如，硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)，助流剂(例如，胶体二氧化硅)，增塑剂(例如，邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)，乳化剂(例如，卡波姆、羟丙基纤维素、十二烷基硫酸钠)，聚合物涂层(例如，泊洛沙姆或泊洛沙胺)，涂层和成膜剂(例如，乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。
用于糖浆、酏剂、乳剂和混悬剂的载体的典型组分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨糖醇和水。对于混悬剂而言，典型的悬浮试剂包括甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、纤维素(例如，AvicelTM，RC-591)、黄芪胶和海藻酸钠；典型的润湿剂包括卵磷脂和聚环氧乙烷脱水山梨糖醇(例如，聚山梨醇酯80)。典型的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。在另一个实施例中，经口的液体组合物还包含一个或多个组分，诸如上面公开的甜味剂、调味剂和着色剂。
组合物还包括将活性材料并入聚合化合物，诸如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等的颗粒制剂中或上，或至脂质体、微乳液、胶束、单层或多层囊泡、红细胞影或原生质球上。这种组合物将影响物理状态、溶解性、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
本公开还包括涂覆有聚合物(例如，泊洛沙姆或泊洛沙胺)的颗粒组合物以及被偶联到针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体或被偶联到组织特异性受体的配体的化合物。
在一些实施例中，化合物通过水溶性聚合物，诸如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸的共价附接进行修饰。在另一个实施例中，与相应的未修饰的化合物相比，经修饰的化合物在静脉注射后在血液中表现出实质上更长的半衰期。在一个实施例中，修饰还增加了化合物在水溶液中的溶解性，消除了聚集，增强了化合物的物理和化学稳定性，并大大降低了化合物的免疫原性和反应性。在另一个实施例中，所需的体内生物学活性是通过以比未经修饰的化合物更低的频率或更低的剂量进行这种聚合物-化合物加合物的给药来实现的。
在一些实施例中，有效量或剂量的制备最初能够根据体外测定进行估计。在一个实施例中，能够在动物模型中配制剂量，且能够使用这种信息以更准确地确定在人体中的有用剂量。
在一个实施例中，本文所述的活性成分的毒性和治疗功效能够通过在体外和在细胞培养物或实验动物中的标准药物过程来确定。在一个实施例中，从这些体外和细胞培养测定以及动物研究获得的数据能够用于配制用于人体中的剂量范围。在一个实施例中，剂量根据所采用的剂型和所使用的给药途径而变化。在一个实施例中，能够由个体医师基于患者的状况来选择确切的配制、给药途径和剂量。[见，例如，Fingl等，(1975)“治疗学的药理学基础”，第1章，第1页]。
在一个实施例中，根据所治疗的病症的严重性和反应性，给药能够是单次或多次给药，其中治疗过程持续数日至数周或直到实现治愈或实现疾病状态的减轻为止。
在一个实施例中，要进行给药的组合物的量当然将取决于所治疗的受试者、痛苦的严重性、给药方式、处方医师的判断等。
在一个实施例中，也制备了包括在相容性药物载体中配制的本发明的制剂的组合物，其被置于适当的容器中并进行标记以用于治疗指定的病症。
在另一个实施例中，如本文所述的凝固因子为结合有复合的有机赋形剂和稳定剂，诸如非离子表面活性剂(即，表面活性剂)、各种糖、有机多元醇和/或人血清白蛋白的冻干(即，冷冻干燥)的制剂。在另一个实施例中，药物组合物在用于注射的无菌水中包括所述的冻干凝固因子。在另一个实施例中，药物组合物在用于注射的无菌PBS中包括所述的冻干凝固因子。在另一个实施例中，药物组合物在用于注射的无菌0.9％的NaCl中包括所述的冻干凝固因子。
在另一个实施例中，药物组合物包括本文所述的凝固因子以及复合载体，诸如人血清白蛋白、多元醇、糖和阴离子表面活性稳定剂。在另一个实施例中，药物组合物包括本文所述的凝固因子和乳糖酸及乙酸盐/甘氨酸缓冲液。在另一个实施例中，药物组合物包括本文所述的凝固因子和增加干扰素组合物在水中的溶解性的氨基酸，诸如精氨酸或谷氨酸盐。在另一个实施例中，药物组合物包括本文所述的冻干凝固因子和甘氨酸或人血清白蛋白(HSA)、缓冲液(例如，乙酸盐)和等渗剂(例如，NaCl)。在另一个实施例中，药物组合物包括本文所述的冻干凝固因子和磷酸盐缓冲液、甘氨酸和HSA。
在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物在被置于具有约4至7.2的pH的缓冲溶液中时被稳定化。在另一个实施例中，包括凝固因子的药物组合物在具有约4至8.5的pH的缓冲溶液中。在另一个实施例中，包括凝固因子的药物组合物在具有约6至7的pH的缓冲溶液中。在另一个实施例中，包括凝固因子的药物组合物在具有约6.5的pH的缓冲溶液中。在另一个实施例中，包括凝固因子的药物组合物在具有约6.4的pH的缓冲溶液中。在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物通过作为稳定剂的氨基酸且在一些情况下是通过盐(如果氨基酸不含有荷电的侧链的话)进行稳定化。
在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物为液体组合物，其包括约0.3重量％至5重量％的稳定剂(其为氨基酸)。
在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物提供了给药准确性和产品安全性。在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物提供了用于可注射应用中的具有生物活性且稳定的液体制剂。在另一个实施例中，药物组合物包括本文所述的非冻干凝固因子。
在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物提供了允许在便于在给药之前储存和运输的液体状态下进行长时间储存的液体制剂。
在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物包括作为基质材料的固体脂质。在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的可注射药物组合物包括作为基质材料的固体脂质。在另一个实施例中，Speiser描述了通过喷雾冷凝来产生脂质微粒(Speiser等，化学研究，8(1991)47-54)，随后通过脂质纳米丸进行经口给药(Speiser，EP0167825(1990))。在另一个实施例中，使用的脂质被身体良好地耐受(例如，由存在于用于胃肠外营养的乳剂中的脂肪酸所组成的甘油酯)。
在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物包括聚合物微粒。在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物包括纳米粒。在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物包括脂质体。在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物包括脂质乳剂。在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物包括微球体。在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物包括脂质纳米粒。在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物包括脂质纳米粒，其包括两亲性脂质。在另一个实施例中，包括本文所述的凝固因子的药物组合物包括脂质纳米粒，其包括药物、脂质基质和表面活性剂。在另一个实施例中，脂质基质具有至少为50％w/w的单甘油酯含量。
在一个实施例中，本发明的组合物呈现于包装或分配装置，诸如FDA批准的套件中，其含有包含活性成分的一种或多种单位剂型。在一个实施例中，包装，例如，包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。在一个实施例中，包装或分配装置附有用于给药的说明书。在一个实施例中，包装或分配器提供有采用由管理药物的制造、使用或销售的政府机关规定形式的与容器相关的注意事项，该注意事项反映了该机关对组合物的形式的批准或人或兽医行政管理部门的批准。这种注意事项在一个实施例中对由美国食品和药物管理局批准用于处方药物或批准的产品插页进行贴标签。
在一个实施例中，将理解的是本发明的凝固因子能够与额外的活性试剂一起被提供给个体以实现与用每个试剂本身进行的治疗相比的改进的治疗效果。在另一个实施例中，采取措施(例如，补充剂的给药和选择)以避免与组合治疗相关的不良副作用。
在另一个实施例中，本发明提供了一种经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽，其由FVIIa多肽和被附接至该FVIIa的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成。
在另一个实施例中，本发明提供了一种包括经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽的药物组合物，该经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽由FVIIa多肽和被附接至该FVIIa的羧基末端的五个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成。
在另一个实施例中，本发明提供了一种多核苷酸，其编码由因子VIIa(FVIIa)多肽和被附接至该VIIa多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽。
在另一个实施例中，本发明提供了一种包括对经CTP修饰的多肽进行编码的多核苷酸的表达载体，该经CTP修饰的多肽由因子VIIa(FVIIa)多肽和被附接至该FVIIa多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成。
在另一个实施例中，本发明提供了一种包括表达载体的细胞，该表达载体包括编码由因子VIIa(FVIIa)多肽和被附接至该FVIIa多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽的多核苷酸。
在另一个实施例中，本发明提供了一种包括表达载体的组合物，该表达载体包括编码由因子VIIa(FVIIa)多肽和被附接至该FVIIa多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽的多核苷酸。
在另一个实施例中，本发明提供了一种延长因子VIIa(FVIIa)多肽的生物半衰期的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVIIa多肽的羧基末端的步骤，从而延长该FVIIa多肽的生物半衰期。
在另一个实施例中，本发明提供了一种改进因子VIIa(FVIIa)多肽的曲线下面积(AUC)的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVIIa多肽的羧基末端的步骤，从而改进该FVIIa多肽的AUC。
在另一个实施例中，本发明提供了一种降低因子VIIa(FVIIa)多肽的给药频率的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVIIa多肽的羧基末端的步骤，从而降低该FVIIa多肽的给药频率。
在另一个实施例中，本发明提供了一种降低因子VIIa(FVIIa)多肽的清除速率的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVIIa多肽的羧基末端的步骤，从而降低该FVIIa多肽的清除速率。
在另一个实施例中，本发明提供了一种产生经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FVIIa多肽的羧基末端的步骤，从而产生经CTP修饰的FVIIa多肽。
在另一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FVIIa多肽和被附接至该FVIIa多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽的给药，从而针对该受试者治疗血友病。
在一个实施例中，本发明提供了一种经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，其由FIX多肽和被附接至该经CTP修饰的FIX多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成。在另一个实施例中，本发明提供了一种经CTP修饰的FIX多肽，其中该经CTP修饰的FIX多肽的序列为在SEQ ID NO：31中列出的序列。在另一个实施例中，本发明提供了一种经CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP是通过选自下列组成的组的氨基酸序列进行编码的：SEQID NO:1和SEQ ID NO:2。在另一个实施例中，本发明提供了一种经CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP是糖基化的。在另一个实施例中，本发明提供了一种经CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施例中，本发明提供了一种经CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP经连接子被附接至该FIX多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种经CTP修饰的FIX多肽，其中该连接子为肽键。
在一个实施例中，本发明提供了一种药物组合物，其包括经CTP修饰的FIX多肽。
在一个实施例中，本发明提供了一种多核苷酸，其编码由因子IX(FIX)多肽和被附接至该FIX多肽的羧基末端的三个促性腺激素羧基末端肽(CTP)所组成的经CTP修饰的多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种多核苷酸，其中该多核苷酸的序列如在SEQ IDNO：30中列出的。在另一个实施例中，本发明提供了一种多核苷酸，其中至少一个CTP是通过选自下列组成的组的氨基酸序列进行编码的：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。在另一个实施例中，本发明提供了一种多核苷酸，其中至少一个CTP是糖基化的。在另一个实施例中，本发明提供了一种多核苷酸，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施例中，本发明提供了一种多核苷酸，其中至少一个CTP经连接子被附接至该FIX多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种多核苷酸，其中该连接子为肽键。一种表达载体包括多核苷酸。
在一个实施例中，本发明提供了一种细胞，其包括表达载体。
在一个实施例中，本发明提供了一种组合物，其包括表达载体。
在一个实施例中，本发明提供了一种延长因子IX(FIX)多肽的生物半衰期的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FIX多肽的羧基末端的步骤，从而延长该FIX多肽的生物半衰期。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是通过选自下列组成的组的氨基酸序列进行编码的：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是糖基化的。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP经连接子被附接至该FIX多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中该连接子为肽键。
在一个实施例中，本发明提供了一种改进因子IX(FIX)多肽的曲线下面积(AUC)的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FIX多肽的羧基末端的步骤，从而改进该FIX多肽的AUC。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是通过选自下列组成的组的氨基酸序列进行编码的：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是糖基化的。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP经连接子被附接至该FIX多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中该连接子为肽键。
在一个实施例中，本发明提供了一种降低因子IX(FIX)多肽的给药频率的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FIX多肽的羧基末端的步骤，从而降低该FIX多肽的给药频率。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是通过选自下列组成的组的氨基酸序列进行编码的：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是糖基化的。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP经连接子被附接至该FIX多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中该连接子为肽键。
在一个实施例中，本发明提供了一种降低因子IX(FIX)多肽的清除速率的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FIX多肽的羧基末端的步骤，从而降低该FIX多肽的清除速率。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是通过选自下列组成的组的氨基酸序列进行编码的：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是糖基化的。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP经连接子被附接至该FIX多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP经连接子被附接至该FVII多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中该连接子为肽键。
在一个实施例中，本发明提供了一种产生经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的方法，其包括将三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)附接至该FIX多肽的羧基末端的步骤，从而产生经CTP修饰的FIX多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中该经CTP修饰的FIX多肽的序列为在SEQ ID NO：31中列出的序列。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是通过选自下列组成的组的氨基酸序列进行编码的：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是糖基化的。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP经连接子被附接至该FIX多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中该连接子为肽键。
在一个实施例中，本发明提供了一种针对受试者治疗血友病的方法，其包括对该受试者进行包括FIX多肽和被附接至该FIX多肽的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的经CTP修饰的因子IX(FIX)多肽的给药，从而针对该受试者治疗血友病。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中该经CTP修饰的FIX多肽的序列为在SEQ IDNO：31中列出的序列。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是通过选自下列组成的组的氨基酸序列进行编码的：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是糖基化的。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP经连接子被附接至该FIX多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种方法，其中该连接子为肽键。
如本领域中通常已知的，根据所需的应用，本公开的经修饰的肽和蛋白可以被偶联至标记物、药物、靶向剂、载体、固体载体等。经修饰的生物制品的标记形式可以被用于跟踪其代谢归宿；尤其地，用于该目的的合适的标记物包括放射性同位素标记物，诸如碘131、锝99、铟111等。标记物也可用于介导测定系统中经修饰的蛋白或肽的检测；在这种情况下，也可以使用放射性同位素以及酶标记物、荧光标记物、发色标记物等。如果肽或蛋白本身是靶向剂，诸如抗体或受体配体，则这种标记物的使用是特别有用的。
可以采用类似的连接技术等以将本公开的经修饰的肽和蛋白偶联至固体载体。当偶联时，这些经修饰的肽和蛋白随后能够被用作分离表现出特定反应的所需组分的亲和试剂。
最终，本公开的经修饰的肽和蛋白可以用于产生与这些新的化合物具有特异免疫反应性的抗体。这些抗体可用于多种诊断和治疗应用中，这取决于未经修饰的肽或蛋白的生物学活性的性质。要理解的是，本公开提供了与本文所述的经CTP修饰的FIX、FVII或FVIIa具有免疫反应性的抗体。在一个实施例中，这种抗体可以用于将所给药的经CTP修饰的凝固因子与内源性凝固因子进行区别或识别。在另一个实施例中，可以使用抗体来定位所给药的经CTP修饰的凝固因子。
在查阅下列不旨在用于限制的实例后，对于本领域的普通技术人员来说，本发明的额外的目的、优点和新颖特征将变得显而易见。此外，如上面所描绘的以及如在权利要求部分中所要求保护的本发明的各种实施例和方面中的每一个均在下列实例中找到了实验支持。
实例
通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室过程包括分子、生物化学技术、微生物学技术和重组DNA技术。这些技术在文献中均进行了充分的解释。见，例如，“分子克隆：实验室手册”，Sambrook等，(1989)；“现代分子生物学技术”，第1-III卷，Ausubel，R.M.，主编，(1994)；Ausubel等，“现代分子生物学技术”，John Wiley和Sons，巴尔的摩，马里兰州(1989)；Perbal，“分子克隆实践指南”，John Wiley&Sons，纽约(1988)；Watson等，“重组DNA”，科学美国书评，纽约；Birren等(主编)“基因组分析：实验室手册系统”，第1-4卷，冷泉港实验室出版社，纽约(1998)；如在美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中阐明的方法；“细胞生物学：实验室手册”，第1-III卷，Cellis,J.E.,主编(1994)；“动物细胞的培养-基本技术手册”，Freshney、Wiley-Liss，纽约(1994)，第三版；“现代免疫学技术”，第I-III卷，Coligan J.E.,主编(1994)；Stites等(主编)，“基础和临床免疫学”(第八版)，Appleton&Lange，纽约，CT(1994)；Mishell和Shiigi(主编)，“细胞免疫学中的选择方法”，W.H.Freeman and Co.，纽约(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中进行了广泛地描述，见，例如，美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；“寡核苷酸合成”，Gait,M.J.,主编(1984)；“核酸杂交”，Hames,B.D.,和Higgins S.J.,主编(1985)；“转录和转译”，Hames,B.D.,和Higgins S.J.,主编(1984)；“动物细胞培养”，Freshney,R.I.,主编(1986)；“固定化细胞和酶”，IRL出版社，(1986)；“分子克隆实践指南”，Perbal,B.,(1984)和“酶学方法”，第1-317卷，学术出版社；“PCR协议：方法和应用指南”，学术出版社，圣地牙哥，加州(1990)；Marshak等，“蛋白质纯化与鉴定策略-实验学科指南”CSHL出版社(1996)；所有这些均通过引用并入本文。在本文档中提供了其他一般性参考。
实例1
凝固因子IX的产生和使用
重组FIX分子的克隆和表达：
因子IX克隆体被构建至我们的真核表达载体pCI-neo(Promega，目录号E1841)。从“OriGene”(RC219065)订购Homo sapiens凝固因子IX的ORF克隆体。从Sigma-Genosys订购引物。
301-1-pCI-neo-p200-11的构建(因子IX-ctp x2)：
引物101：5'GTTTAGTGAACCGTCAGAAT 3'(SEQ ID NO:36)
引物103R：5’TTGAGGAAGATGTTCGTGTA 3’(含有因子IX的SspI位点)(SEQ ID NO:37)
用引物101和引物103R及作为模板的因子IX(OriGene”RC219065)的质粒DNA、cDNA克隆体进行PCR反应；作为PCR扩增的结果，从凝胶(含有因子IX序列的氨基末端的片段)形成和纯化～1085bp(pcr 10)产物。
引物98：5'ATTACAGTTGTCGCAGGTGA 3'(SEQ ID NO:38)
引物99R：5'GCTGGAGCTAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTT 3'(SEQ ID NO:39)
引物100：5'GCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCC 3'(SEQ ID NO:40)
引物27R：5'TTTTCACTGCATTCTAGTTGTGG 3'(SEQ ID NO:41)
进行三个PCR反应。用引物98和引物99R及作为模板的因子IX(OriGene”RC219065)的质粒DNA、cDNA克隆体进行第一个反应；作为PCR扩增的结果，形成～540bp产物。
用引物100和引物27R及作为模板的402-2-p72-3(hGH-CTP-CTP)的质粒DNA进行第二个反应；作为PCR扩增的结果，形成～258bp产物。
用引物98和27R及作为模板的前两个反应的产物的混合物进行最后一个反应(pcr3)；作为PCR扩增的结果，形成～790bp产物且将其连接至TA克隆载体中(Invitrogen，目录K2000-01)。分离SspI-EcoRI片段(TA 3-3)。
用引物101和27R及作为模板的pcr 10和源于pcr 3的SspI-EcoRI片段的产物的混合物进行另一个PCR反应；作为PCR扩增的结果，形成～1700bp产物(因子IX-ctp-ctp)且将其连接至TA克隆载体中(Invitrogen，目录K2000-01)(连接180)。
在因子IX序列中发现了错误，因此替换片段从而形成具有正确的DNA序列的因子IX-ctp-ctp的插入物。
用SspI和XbaI消化TA-pcr 3-3且分离大片段(载体)。用SspI和XbaI消化TA 180-4且分离小片段(插入物)并将其连接至用SspI和XbaI消化的TA-pcr-3-3的分离的大片段中。用Sal I和NotI消化新的质粒TA-183-2，且分离因子IX-CTP-CTP插入物(～1575bp)。将该片段插入真核表达载体pCI-neo(用Sal I和Not I消化)以得到301-2-p200-11克隆体。
pCI-dhfr-因子9-ctpx2(p223-4)构建：用SmaI和NotI消化载体pCI-dhfr(p6-1)。用ASisI F.I.和NotI消化因子IX-CTP-CTP(p200-11)。连接两个片段。
pCI-dhfr因子9-ctp x3(p225-7)构建：用XbaI和ApaI消化载体pCI-dhfr OXM-CTP×3(p216-4)。用XbaI和ApaI消化因子IX-CTP-CTP(223-4)。连接两个片段。
pCI-dhfr因子9-ctp x3 T148A(p243-2)构建：质粒p225-7含有在148位的苏氨酸，由于FIX的更通用的版本含有在该位置上的丙氨酸，所以使用定点诱变法用Thr替换Ala。
引物75：ctcccagttcaattacagct(SEQ ID NO:42)
引物122r:ggaaaaactgcctcagcacgggtgagc(SEQ ID NO:43)
引物123:gtgctgaggcagtttttcctgatgtggactat(SEQ ID NO:44)
引物124r:caacacagtgggcagcag(SEQ ID NO:45)
进行三个PCR反应。用引物75和引物122r及作为模板的质粒DNA p225-7进行第一个反应；作为PCR扩增的结果，形成～692bp产物并从凝胶进行纯化。用引物123和引物124r及作为模板的质粒DNA p225-7进行第二个PCR反应；作为PCR扩增的结果，形成～237bp产物并从凝胶进行纯化。用引物75和124r及作为模板的前两个反应的产物的混合物进行第三个重叠PCR反应；作为PCR扩增的结果，形成～910bp产物。将该重叠PCR产物用XbaI和NsiI消化且重新连接至p225-7质粒(用XbaI和NsiI消化的)以产生命名为p243-2的因子IX-ctpx3T148A。
FIX-4CTP(p259-4)构建：通过限制性酶Apa1和Xba1从oxym-4CTP(p254-3)分离出3.5CTP片段。用限制性酶Apa1和Xba1从FIX-3CTP(p243-2)分离出FIX+0.5CTP片段。连接两个片段。
FIX-5CTP(p260-18)构建：通过限制性酶Apa1和Xba1从oxym-5CTP(255-1)分离出4.5CTP片段。使用酶Apa1和Xba1从FIX-3CTP(p243-2)分离出FIX+0.5CTP片段。连接两个片段。
将Dg44细胞铺在100mm的组织培养皿中并使其生长至50-60％的汇合度。使用总计为2μg(微克)的FIX cDNA在无蛋白的培养基(Invitrogene CD Dg44)中使用FuGene试剂(Roche)对一个100mm板进行转染。将该培养基在转染48小时后去除并在800μg/ml的G418(新霉素)的存在下用不具有核苷的无蛋白的培养基(Invitrogene CD Dg44)进行替换。在14天后，将转染的细胞群体转移到T25组织培养瓶中，并使选择继续进行另外的10-14天直到细胞开始作为稳定的克隆体生长为止。选择高表达的克隆体。使用约2x107个细胞在补充有5ng/ml的维生素K3(硫酸氢钠甲萘醌；Sigma)的1700cm2的滚瓶(Corning,Corning NY)中接种300ml的生长培养基。在细胞活力迅速降低至约70％之后收集生产培养基(收获物)。将生产培养基首先进行澄清且随后浓缩约20倍，并使用流式过滤盒(10KDa MWCO；MilliporeCorp.)以PBS进行透析。
FIX抗原水平的确定：FIX-CTP收获物的抗原水平是使用AssayMax人FIX ELISA试剂盒(AssayPro-EF1009-1)来确定的。所计算的蛋白浓度是两次独立运行中的三种不同的稀释液的平均值(图1A，表1)。
表1：所计算的蛋白浓度
FIX SDS-PAGE-免疫印迹：使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP收获物或纯化的rhFIX(American Diagnostics)和100ng的蛋白加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上。通过使用抗人FIX多克隆抗体和抗人γ羧化单克隆抗体(AmericanDiagnostics)的蛋白免疫印迹来执行SDS-PAGE分析。如之前报告的，rhFIX以55KDa迁移，而被融合至两个CTP的FIX则以75kDa迁移。FIX-CTP蛋白的两种变体均被示为是γ羧化的，其为用于FIX活性和功能的必要转译后修饰(图1B)。
FIX显色活性的确定：使用市售的显色活性检测试剂盒，BIOPHEN(HyphenBioMed221802)执行FIX-CTP收获物与rhFIX蛋白(American Diagnostics)的体外效力的比较性评估。在存在凝血酶、磷脂、钙的情况下，过量的FXIa将采样的FIX活化成FIXa。FIXa与凝血酶、活化的FVIII：C(以过量供应的)、磷脂和钙形成酶复合物，并将存在于测定系统中的因子X活化成FXa。活性直接与作为限制因子的FIX的量相关联。生成的FXa随后通过其在FXa显色底物(pNA)上的比活性进行测量。产生的pNA的量与FIXa活性成正比。对rhFIX和FIX-CTP收获物进行连续稀释且通过将FIX收获物的剂量反应曲线与由rhFIX或人血浆组成的基准配置品进行比较来评估效力。FIX的平均EC50为21ng/ml，而FIX-(CTP)2收获物所计算的EC50为382ng/ml，且FIX-CTP收获物所计算的EC50为1644ng/ml。观察到了FIX-(CTP)2收获物的酶活性降低了约15倍(图2)。
FIX凝结活性(aPTT)：活化部分凝血活酶时间(aPTT)是凝固级联的内在和共同途径的整合性的量度。aPTT是加入内在途径活化剂、磷脂和钙之后以秒计的血浆凝结的时间。aPTT试剂被称为部分凝血致活酶，这是因为其与凝血酶原时间(PT)试剂一样，组织因子不包括磷脂。活化剂启动系统且随后在磷脂的存在下进行内在途径的其余步骤。基准aPTT的范围因实验室而异，但通常在27-34秒的范围内。
该测定的原理是通过添加rhFIX来量化FIX-CTP收获物的恢复去FIX的人血浆的凝结活性的能力。将300μl的缺乏FIX的人血浆与100μl的rhFIX或FIX-CTP收获物相混合并进行连续稀释。在37℃下温育60秒后，将凝血致活酶、CaCl2和磷脂加入到混合物中，且确定以秒计的凝结时间(由美国医学实验室执行)。通过将FIX收获物的剂量反应曲线与由rhFIX或人血浆组成的基准配置品进行比较来评估效力。一个单位的FIX活性对应于等于1ml正常人血浆的活性的FIX浓度。所显示的aPTT结果表明，与rhFIX相比，FIX-(CTP)2表现出其比凝固活性降低了5.7倍(表2)。此外，aPTT结果与体外测定的显色活性一起表明FIX-(CTP)2收获物具有相对于FIX-CTP收获物的改进的酶活性(表2)。在用弗林蛋白酶进行超转染后得到增强的表达系统的优化(即，与弗林蛋白酶的共转染和维生素K3培养基浓度的优化)后，能够获得FIX-CTP蛋白的改进的活性(未示出数据)。
表2:FIX凝结活性
药代动力学研究：将rhFIX(American Diagnostic)和FIX-CTP收获物以75μg/kg体重的剂量按单次静脉注射对Sprague-Dawley大鼠(每种物质六只大鼠)进行给药(表3)。
表3:操作的PK研究计划
在给药后的0.083小时、0.5小时、1.5小时、4小时、8小时、24小时、48小时和72小时交替地从3只大鼠进行血液样本的眶后抽取。在采样后，立即制备血浆并将其储存在-20℃直到进行分析为止。通过FIX ELISA特异性测定(AssayPro)来量化FIX浓度。针对每种蛋白计算药代动力学曲线，其表示在每个时间点上的3只动物的平均值(图3)。使用PKSolutions 2.0软件计算终末半衰期。表4总结了在不同采样时间点观察到的FIX浓度。
表4:观察到的FIX浓度
在表5中概括了PK曲线和终末半衰期的总结。与rhFIX相比，FIX-CTP收获物表现出改进的T1/2β值(分别增加至2倍和5倍)。由于在FIX给药收集中，FIX的24小时的动物血清浓度低于定量限(BLQ)，因此不计算额外的PK参数。
表5：PK参数的总结
在这项研究中，描述了一种用于延长FIX半衰期且同时保持治疗效力的新型方法。将CTP肽添加至活性蛋白具有干扰蛋白活性的有害的可能性。因此，通过在FIX的C末端添加CTP序列来产生活性重组FIX-CTP是料想不到的。
对免疫亲和纯化的FIX-CTP-CTP的表征
FIX-CTP-CTP纯化
为了评估其PK曲线进行模拟且能够被外推至临床环境的具有提高的活性的高级含量的蛋白，FIX-CTP-CTP为在其羧基末端用串联的2个CTP单元进行修饰的FIX。使用针对存在于FIX(American Diagnostics，目录#3570MX)的N末端区域中的γ羧基谷氨酰(Gla)残基的基质结合的单克隆抗体来纯化FIX-CTP-CTP。单克隆抗体被结合至琼脂糖凝胶CL-4B。将浓度为88μg/ml的FIX-CTP-CTP收获物在pH＝7.4下以20mM Tris、150mM NaCl和10mMEDTA进行透析。加载速率为0.5ml/分钟，使用20mM Tris-HCl、350mM NaCl和50mM CaCl执行洗脱且将未结合的部分回收五次。最终，将洗脱部分用PBS透析、拉动并浓缩。
FIX抗原水平的确定：使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals；目录#FIX-AG RUO)来确定FIX-CTP收获物、FIX-(CTP)2收获物和FIX-(CTP)2纯化蛋白水平。所计算的蛋白浓度(μg/ml)是两次独立运行的平均值(图4，表6)。
表6：所计算的蛋白浓度
此外，通过Bradford测定来量化FIX-CTP-CTP。所计算的浓度为202μg/ml，其类似于通过人FIX ELISA获得的浓度。
SDS-PAGE印迹：使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP-CTP收获物、未结合的部分和纯化的蛋白加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上。通过用考马斯蓝试剂(800ng的蛋白)对凝胶进行染色来执行SDS-PAGE考马斯分析。使用100ng的蛋白、抗人FIX多克隆抗体(Ab)和抗人γ羧化单克隆Ab(American Diagnostics，目录#499和#3570)来执行蛋白免疫印迹。免疫亲和纯化过程显著地富集了FIX-CTP-CTP部分，且同时减少了杂质(图5A至图5C)。
N末端测序：通过12％的Tris-甘氨酸SDS-PAGE分离FIX-CTP-CTP纯化蛋白且随后将其电印迹至PVDF膜。将感兴趣的带切下并将其放在纯化的经Biobrene处理的玻璃纤维过滤器上。使用配备有140C HPLC微量梯度系统的脉冲液体蛋白测序仪通过Edmann降解来进行N末端序列分析。N末端测序显示FIX-CTP-CTP是不完全前肽切割蛋白和完全前肽切割蛋白的混合物。显示不充分的前肽切割降低了FIX的凝固活性。通过与弗林蛋白酶的共转染，能够改进前肽切割过程。
FIX显色活性的确定：使用市售的显色活性检测试剂盒，BIOPHEN(HyphenBioMed221802)执行FIX-CTP-CTP纯化蛋白与rhFIX(American Diagnostics)以及人正常血浆池的体外效力的比较性评估。在存在凝血酶、磷脂、钙的情况下，过量的FXIa将FIX活化成FIXa。FIXa与凝血酶(以过量供应的)、磷脂和钙形成酶复合物，并将存在于测定系统中的因子X活化成FXa。活性直接与作为限制因子的FIX的量相关联。产生的FXa通过其在FXa显色底物(pNA)上的比活性进行测量。产生的pNA的量与FIXa活性成正比。将rhFIX、人血浆和FIX-CTP-CTP进行连续稀释，且通过比较剂量反应曲线来评估效力(图6)。rhFIX的平均EC50为68.74ng/ml，而FIX-CTP-CTP的所计算的EC50为505ng/ml。与重组FIX相比，观察到FIX-CTP-CTP的酶活性降低了约7倍，且与正常的人拉制血浆相比，降低了16.5倍。这种降低的活性可以通过由N末端分析识别的对N末端前肽的不充分的切割来进行解释。
FIX凝结活性(aPTT)：活化部分凝血活酶时间(aPTT)是凝固级联的内在和共同途径的整合性量度。aPTT是加入内在途径活化剂、磷脂和钙之后使血浆凝结的时间(以秒进行测量的)。
该测定通过添加rhFIX来量化了FIX-CTP-CTP蛋白恢复去FIX的人血浆的凝结活性的能力。将300μl的缺乏FIX的人血浆与100μl的rhFIX、FIX-CTP-CTP(CTP在C末端串联)或进一步稀释的正常池人血浆相混合。在37℃下温育60秒后，将组织因子(TF)、CaCl2和磷脂加入混合物中。确定以秒计的凝结时间。通过将FIX-CTP-CTP的剂量反应曲线与rhFIX或人血浆的基准配置品进行比较来评估效力。一个单位的FIX被定义为相当于1ml人正常血浆的活性的FIX的量。
aPTT结果表明FIX-CTP-CTP凝固活性仅比正常池人血浆低1.4倍且与rhFIX相类似。aPTT结果与体外测定的显色活性一起表明FIX-CTP-CTP的纯化不损害其活性。
FIX-CTP-CTP的药代动力学活性：将纯化的FIX-CTP-CTP、rhFIX(AmericanDiagnostic)和含有FIX-CTP-CTP和FIX-CTP的收获物以100g/kg体重的剂量按单次静脉注射对Sprague-Dawley大鼠(每种物质八只大鼠)进行给药(表7)。
表7：PK研究概况
在给药后的0.083小时、0.5小时、2小时、4小时、7小时、10小时、24小时、48小时和72小时交替地从4只大鼠进行血液样本的眶后抽取。在采样后，立即制备柠檬酸化的血浆(0.32％)并将其储存在-20℃直到进行分析为止。将FIX浓度使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals)进行量化。针对每种蛋白根据在每个时间点上的4只动物的平均值计算药代动力学曲线(图7)。使用PK Solutions 2.0软件计算终末半衰期。表8总结了在不同采样时间点观察到的FIX浓度。
表8：观察到的FIX浓度
在表9中显示出PK参数的总结。
表9：PK参数的总结
FIX-CTP-CTP收获物表现出与FIX-CTP收获物相比的改进的PK曲线。此外，与rhFIX相比，纯化的FIX-CTP-CTP表现出T1/2β值的3倍的增加以及AUC的4.5倍的增加。
由于Bradford纯化的FIX-CTP-CTP所计算的浓度类似于ELISA计算的浓度，因此与单个CTP的融合相比，融合至串联CTP分子的分泌FIX的减少量似乎是由于添加额外的CTP，而不是由于减少的ELISA检测。
FIX-CTP-CTP凝结活性类似于混合的人血浆；然而，与rhFIX或混合的人血浆相比，其体外显色活性显著降低。与凝固测定相比，显色活性测定被报告为非常灵敏的测定。FIX-CTP-CTP活性降低的原因可能发生变化。CTP的加入可以降低FIX对FXIa的亲和性或减少转录后修饰(例如，12-10个GLA残基和前肽切割)。N末端分析显示FIX-CTP-CTP前肽的蛋白水解切割在分泌之前未完全完成。由于这种转录后修饰对于蛋白的正常酶活性来说是至关重要的，因此与Furine-PACE质粒的共转染是有利的且可以提高FIX-CTP-CTP的活性。
最终，大鼠的FIX-CTP-CTP比较性PK研究表明两个串联CTP至FIX的C末端的融合产生了具有延长的半衰期的FIX。
去FIX的小鼠模型：为了评估体内活性，获得FIX敲除小鼠，并建立繁殖菌落。将10μg商业重组hFIX
或rFIX-(CTP)2(FIX-CTP-CTP)注射到麻醉的FIX敲除小鼠(22-28g)的尾静脉中。注射的蛋白量等于在正常血浆中的所需的FIX浓度(5μg/ml)。在特定的时间点将血液样本从剪掉的尾部抽取至肝素化的毛细管中。通过ELISA评估血浆样品的FIX水平，并通过aPTT凝固测定来测量功效。
提高FIX前肽的切割功效：将CTP肽cDNA融合至人FIX cDNA的3’端。将相应的rFIX和表达弗林蛋白酶的构建体共转染至Dg44细胞中；还用弗林蛋白质质粒共转染人rFIXcDNA作为对照。由于细胞中有限量的弗林蛋白酶，高水平FIX的分泌导致了前因子和成熟因子FIX的混合物的分泌。表达弗林蛋白酶的载体与表达前因子的载体的共转染增加了恢复并导致全处理的FIX至培养基中的分泌。
在FIX-(CTP)2和弗林蛋白酶共转染之后，产生稳定的克隆体并收集收获物以用于前肽切割评估。使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将100ng的蛋白加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上。通过使用抗人FIX多克隆Ab(American Diagnostics)和抗前肽多克隆抗体的蛋白免疫印迹来执行SDS-PAGE分析。如之前报告的，rhFIX以55KDa迁移，而被融合至两个CTP的FIX则以75kDa迁移。FIX蛋白的两种变体被显示出经历了合适的完全的前肽切割。
为了确定合适的前肽切割是否提高了FIX-(CTP)2的酶活性，对用弗林蛋白酶进行共转染的FIX-(CTP)2收获物的显色活性和凝固活性执行了比较性评估。观察到了FIX-(CTP)2比活性的显著提高，其类似于rhFIX。
总之，本文所述的结果表明，FIX-CTP-CTP能够有效地用于治疗血友病B患者。被融合至CTP构建体的FIX优点在于克服了在某些体外测量中的缺点的改进的体内药理学性能。由于降低了输注速率和所需剂量，所以所提出的这种治疗比之前的治疗有利。
重要的是要注意，当使用白蛋白融合分子策略来提高FIX的半衰期时，重组FIX变得无活性。本发明的新型方法提供了具有提高的长效活性的新型重组FIX融合蛋白的设计和纯化。由于仅尺寸修饰不能改进所注射的FIX的药代动力学，因此对于被融合至FIX的CTP促进了药代动力学参数的发现是意料不到的。高度糖基化的肽-唾液酸残基的存在稳定了蛋白并保护其免受与血管受体的相互作用的损害，而不会消除FIX功能的关键决定因素。
FIX-CTP针对血友病B患者具有类似于rFIX的治疗功效并要求频率更低的给药。针对血友病B患者，单次注射FIX-CTP足以控制出血事件并减少在手术干预期间所需的注射次数。
CTP技术被用于开发长效FIX。具体地说，延长重组rFIX分子的半衰期是通过将至少一个人CTP融合至FIX来执行的。在哺乳动物细胞中对重组FIX-CTP进行表达并且在体外和体内对其进行表征。证明rFIX-CTP的体外活性与rFIX相当。大鼠中的药代动力学和功效研究证实了rFIX-CTP的改进的特性。该研究的结果表明开发具有类似于野生型酶的止血特性的半衰期延长的rFIX分子是可行的。
实例2
纯化的FIX-CTP3与FIX-CTP4和FIX-CTP5的比较性评估
2.1研究目的
在部分纯化过程之后，对FIX-CTP4和FIX-CTP5与FIX-CTP3的药代动力学参数进行比较性评估。
2.2FIX-CTP4和FIX-CTP5收获物的产生
将在C末端被融合至四个或五个串联CTP序列的FIX cDNA(OriGene RC219065)在10ng/L的维生素K3(Sigma,Mennadion)的存在下使用Excellgene表达系统在Dg44细胞中进行表达。收集收获物(300ml)并进行过滤和冷冻。
2.3FIX-CTP3收获物的产生
在25ng/L的维生素K3(Sigma)的存在下，使用pCI-DHFR载体、克隆体196、BR-9在CHO细胞中进行FIX-CTP3的内部表达。收集收获物并进行过滤。
由于缺乏材料，所有FIX-CTP样本(3个CTP、4个CTP和5个CTP)均用Jacalin柱进行纯化。
2.4FIX抗原水平的确定
FIX抗原水平是使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals；目录#FIX-AGRUO)进行确定的。所计算的蛋白浓度是四次独立运行的平均值。与另外两个版本相比，FIX-CTP3浓度略高(表10)。
表10：FIX抗原水平
2.5FIX-CTP考马斯染色和免疫印迹
将FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5的收获物使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上。使用抗CTP多克隆Ab(Adar BiotechProduction)或抗Gla Ab(American Diagnostica)以蛋白免疫印迹来执行SDS-PAGE分析。
如之前报告的，被融合至三个CTP的FIX以80kDa迁移，而被融合至四个或五个CTP的FIX则分别以85KDa或90KDa迁移。正如所料，与在Prolor产生的FIX-CTP3收获物相比，源于Excellgene的FIX-CTP4和FIX-CTP5收获物显示出非常低水平的γ羧化(图8A和图8B)。
在利用木菠萝素柱的纯化过程(糖基化蛋白的免疫亲和纯化)之后，使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上。将SDS-PAGE用考马斯蓝染料进行染色以用于样本检测。所有的变体都显示出更清洁的带轮廓(图9)，其表明了提高的纯度。
2.6FIX显色活性的确定
使用市售的显色活性检测试剂盒，BIOPHEN(Hyphen BioMed 221802)对充分纯化的(HA柱)FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5与人池正常血浆的体外效力执行比较性评估。将所有样品进行连续稀释且通过将剂量反应曲线与正常人血浆的基准配置品进行比较来评估效力。与血浆相比，FIX-CTP4和FIX-CTP5(图10)的降低的显色活性可能是对FIX蛋白的不适当的转录后修饰的结果，例如，不适当的γ羧化和前肽切割，或者，由于CTP盒的添加。FIX-CTP4和FIX-CTP5活性(表11)的波动可能是由于抗原位点的CTP掩蔽而引起的FIX ELISA的不适当的定量能力所造成的。
表11：样本/血浆EC
50的比率
2.7药代动力学研究
将经Jacalin纯化的FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5(分别为组A、组B和组C)按单次静脉注射以250μg/kg体重的剂量对Sprague Dawley大鼠(每个治疗组六只大鼠)进行给药。在给药后的0.083小时、0.5小时、2小时、5小时、8小时、24小时、48小时、72小时和96小时交替地从3只大鼠进行血液样本的眶后抽取(表12)。在采样后，立即制备柠檬酸化的血浆(0.38％)并将其储存在-20℃直到进行分析为止。
表12：操作的PK研究计划
在血浆样本中的FIX浓度是使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals)进行量化的。计算药代动力学曲线，其是在每个时间点上的3只动物的平均值。使用PKSolutions 2.0软件计算终末半衰期。下面的表13总结了在不同采样时间点所计算的FIX浓度。
表13：所计算的FIX浓度
在下面的表14和图11中显示了PK曲线和PK参数的总结。与FIX-CTP3相比，在所有时间点上的完整的PK分析曲线表明将4个或5个CTP盒添加至FIX未延长其半衰期。与FIX-CTP3相比，在FIX-CTP5给药后的AUC增加至1.4至1.6倍，这在统计学上是不显著的。
表14：PK曲线和PK参数的总结
由于给药后96小时的样本显示具有处于测定的定量下限处的非常低的FIX浓度，则重新计算终末半衰期，这提供了更精确且在科学上适当的计算(表15)。根据该计算，在FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5的半衰期之间获得了甚至更小的差异。
表15：重新计算的终末半衰期
2.8结论
在这项研究中，评估了FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5的药代动力学参数和可能的凝结活性。与FIX-CTP3相比，4个CTP和5个CTP至FIX的融合没有提供优异的或改进的半衰期延长，且观察到了降低的显色活性。下面的表16总结了不同FIX-CTP融合变体(1至5个CTP)的半衰期的百分比改进。CTP至FIX的融合改进了其药代动力学行为，但是，不可预见地，该改进是有限的。令人惊讶地，在将3个CTP、4个CTP或5个CTP串联地融合至FIX之后，计算出类似的半衰期值。
表16：半衰期的百分比改进的总结
这些数据表明3个CTP至FIX的融合产生了蛋白半衰期的最大改进，这证实了FIX-CTP3是用于进一步临床开发的在半衰期、结构和可能的凝结活性方面的最佳变体。
实例3
FIX-/-血友病小鼠模型的FIX-CTP3治疗
如上所述，进行了测试FIX-CTP、FIX-CTP2和FIX-CTP3收获物的PK曲线和相对于rhFIX的凝固活性的研究。FIX-CTP3表现出改进的PK曲线，且同时维持了其相对于FIX-CTP1和FIX-CTP2收获物或rhFIX的凝固活性。为了进一步评估该结果，纯化了FIX-CTP3的γ-羧基谷氨酸蛋白。在单次IV给药后，与正常大鼠中的rhFIX相比，FIX-CTP3表现出3倍的半衰期增加和4.5倍的AUC增加。FIX-CTP3表现出降低的体外显色活性和凝结活性，这最可能是由于N末端前肽的切割不足以及适当的转录后修饰(PTM)，诸如适当的γ羧化。
在当前的研究中，在缺乏FIX的小鼠中测试了被融合至三个串联的CTP的人重组FIX的药代动力学特性和药效学特性。
研究目的：
为了在按类似的比活性和剂量(与PD类似的比活性以及PK恒定的类似FIX)进行FIX-(CTP)3的单次IV给药后确定在缺乏FIX的小鼠中的rFIX-(CTP)3与商业rhFIX
的药代动力学和药效学的参数。
FIX-CTP3收获物的产生：
将在C末端被融合至三个串联CTP序列的FIX cDNA(OriGene RC219065-Thr 148)在25ng/mL的维生素K3(Sigma,Mennadion)的存在下使用Excellgene表达系统在Dg44细胞中进行表达。培养含有5升细胞混悬剂的五个单独批次(共25升)且在活力下降到60-70％之后进行收获。将收获物过滤并在-70℃进行冷冻。
收获物FIX抗原水平的确定：
收获物FIX抗原水平是使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals；目录#FIX-AG RUO)进行确定的。按每个批次计算抗原水平。在不同的批次中维持FIX浓度(表17)。
表17：FIX抗原水平
FIX-CTP3纯化过程：
在短暂的纯化研究之后，执行使用下列3个柱的纯化过程：DEAE琼脂糖凝胶、肝素琼脂糖凝胶和HA Bio Rad陶瓷羟基磷灰石1型(40μm)，FIX-CTP3。纯化γ-羧化的富集蛋白。简单来说：将5升澄清的收获物在4℃解冻4天。对于每个纯化批次而言，将澄清的收获物(2升)浓缩4倍并使用标称分子量截断尺寸为10KDa的一次性中空纤维筒以20mM的Tris-HCl(pH8.2)进行透析。将该过程(UFDF1)执行两次，且将一升UFDF1加载在DEAE琼脂糖凝胶柱上，且用20mM Tris-HCl、200mM NaCl、10mM CaCl2(pH8.2)洗脱因子IX。在加载在肝素琼脂糖凝胶柱上之前，用20mM Tris-HCl和10mM CaCl2(pH7.5)将产物进行1:1的稀释，并将pH调整至7.5。用20mM Tris-HCl、300mM NaCl和10mM CaCl2(pH7.5)执行洗脱。将洗脱的产物浓缩并使用Pellicon XL盒10KDa截止膜(UFDF2)以10mM磷酸盐(pH6.8)进行透析。将产物装载在HA柱上，且用150mM磷酸盐(pH6.8)洗脱因子IX的活化部分。将纯化产物浓缩至2mg/ml的目标浓度，并以TBS(pH7.45)进行透析，将其分成等份并在-70℃储存。
每周一次将该纯化过程重复五次从而纯化总体积(25升)。该纯化过程被命名为HA#6-10。分别评估每种纯化产物(应用#1-5)。在纯化过程结束时，将不同批次混合并进一步浓缩至4mg/ml的目标浓度。
FIX-CTP3的分析特性：
FIX抗原水平的确定
FIX-CTP3γ-羧化的富集蛋白的抗原水平是使用人FIX ELISA试剂盒(AffinityBiologicals；目录#FIX-AG RUO)进行确定的。所计算的蛋白浓度是两次独立运行的平均值(表18)。
表18：FIX-CTP3的抗原水平
SDS-PAGE印迹：
使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP3γ-羧化的富集蛋白、rhFIX和rFIXa(活化的FIX)加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上。通过用考马斯蓝试剂(800ng的蛋白)对凝胶进行染色来执行SDS-PAGE考马斯分析(图12A至图12E)。使用具有抗人FIX多克隆Ab(图12B)、抗人γ羧化单克隆抗体(American Diagnostics，目录#499,3570)(图12C)、抗FIX前肽多克隆Ab(图12D)和抗CTP多克隆Ab(图12E)的100ng蛋白执行蛋白免疫印迹。如之前报告的，FIX-CTP3以75KDa迁移。
纯化程序显著地富集了FIX-CTP3部分，且同时减少了杂质。如在抗Gla免疫印迹(图12B)中所表明的，由于仅需要收集γ-羧化的FIX-CTP3部分，因此纯化过程的产率非常低，在约2-3％的范围内(未示出数据)。基于考马斯和FIX免疫印迹，FIX-CTP3部分仅为约60-70％，且还检测到了额外的较低分子量的带，推测其具有较低的糖基化形式。
FIX-CTP3的凝结活性：
FIX-CTP3的显色活性：
使用市售的显色活性检测试剂盒，BIOPHEN(Hyphen BioMed 221802)执行对FIX-CTP3收获物和FIX-CTP3γ-羧化的富集蛋白与人池正常血浆的体外效力的比较性评估。将FIX-CTP3收获物和蛋白进行连续稀释且通过将剂量反应曲线与由正常人血浆组成的基准配置品进行比较来评估效力。如前面所表明的，FIX-CTP3收获物的活性比人池血浆低50倍(表19，图13)。在FIX-CTP3纯化后，显色活性显著改进且仅比人池血浆的活性低4.72倍(表19，图13)。收获物的降低的显色活性可能是FIX蛋白变体的不适当的转录后修饰，例如，不适当的γ羧化和前肽切割的结果。在FIX-CTP3的γ-羧化部分的纯化和富集之后，提高了活性，这证明了γ-羧化对FIX活性的重要贡献。
表19：FIX-CTP3的显色活性
一期凝结测定(aPTT)：
活化部分凝血活酶时间(aPTT)是凝固级联的内在和共同途径的整合性量度。aPTT是在加入内在途径活化剂、磷脂和钙之后以秒计的血浆凝结的时间。该测定的原理是通过添加rhFIX来量化FIX-CTP3的恢复对去FIX的人血浆的凝结活性的能力。将200μl的缺乏FIX的人血浆与25μg/ml的FIX-CTP3相混合并在TBS中进行进一步地稀释。在37℃下温育60秒后，将50μl的PTT活化剂(肌动蛋白FS)和50μl的25mM钙加入到混合物中，且使用
CA1500凝结器来确定以秒计的凝结时间(由使用验证的aPTT测定的国家凝血中心的Sheba医院执行)。通过比较FIX-CTP3与正常人池血浆的基准配置品的剂量反应曲线来评估效力。结果以从涵盖<1-110％的FIX水平的标准曲线插入的活性百分比进行表示。与正常人池血浆相比，FIX-CTP3表现出其凝固活性的15-20倍的降低，这是因为在5μg/ml的活性(其为体内FIX的正常值)被显示为6.5％(表20)。
表20：FIX-CTP
3
的凝结活性
与
相比，FIX-CTP3也表现出了延长的凝结时间(表21和图14)。
表21：比较凝结时间(aPTT)
在发起PK-PD研究之前，由北卡罗来纳大学的Paul Monahan博士独立地在缺乏FIX的小鼠中执行了额外的凝结测定。aPTT结果表明FIX-CTP3的凝固活性比正常混合的人血浆低40倍，如适当的凝结活性所需的更长的时期(如以秒测量的)和更高的浓度所表明的(表22)。
表22：比较凝结活性
基于如通过ELISA针对FIX-CTP3和
计算的FIX抗原水平的比活性(u/ml)分别为4.46和198.9。
如在显色测定与aPTT测定中表明的所计算的FIX-CTP3活性的不一致性可以由aPTT测定的优异灵敏性和体内相关性来进行解释。在显色活性测定中，存在过量的试剂和酶，其能够活化不那么有效的FIX版本。FIX-CTP比活性值的差异能够由不同试剂和自动化机器的使用来进行解释。在北卡罗来纳大学计算的活性值被用于PK-PD的研究设计。
FIXa蛋白检测：
为了确认在纯化过程之后，没有发生FIX活化(FIXa)，使用FIXa Biophen显色测定(目录#参考221812)来执行FIXa检测分析。如之前所述的，该测定使用显色活性级联来测量存在于特定样本中的FIXa的量。稀释FIX-CTP3和rhFIX，且评估FIXa水平。FIX-CTP3未通过纯化或储存活化(表23)。
表23：FIXa检测
FIX-CTP3的PK-PD研究：将FIX-CTP3和rhFIX(BeneFIX)以包含100IU FIX/kg体重的625μg/kg体重的剂量按单次静脉注射对C57BI缺乏FIX的小鼠进行给药。在给药后的0.25小时、4小时、24小时、48小时、72小时和96小时交替地从3只小鼠进行血液样本的眶后抽取。取样后立即制备柠檬酸化的血浆(0.32％)并将其储存在-20℃直至分析。评估hFIX抗原水平，并执行详细的PK分析。为了评估与
相比的FIX-CTP3的延长缺乏FIX动物的凝结活性的能力，使用自动化FIX活性测定来计算从经FIX-/-处理的小鼠收集的在柠檬酸化的血浆样本中的FIX活性(表24)。
表24：研究概况
*仅PK收集点
**在给药后T＝48的尾静脉出血；cohorts 1&3
在FIX-/-小鼠中的FIX-CTP3药代动力学曲线
FIX浓度是使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals；目录#FIX-AG RUO)进行量化的。针对每种蛋白计算药代动力学曲线，其是在每个时间点上的三只动物的平均值。下面的表25和图15总结了在不同采样时间点针对Cohorts 1&3计算的FIX浓度。下面显示了PK曲线和PK参数的总结(表26&27)。还针对Cohort#2执行PK分析以验证暴露(未示出数据)。
表25：FIX浓度
使用双室模块(WinLin软件)以确定AUC0-inf、T终末和清除(CL)。下面在表26中描述了PK参数。
表26：PK特性
将三个CTP“盒”添加到rhFIX使FIX的体内半衰期延长了至少2.5倍。与rhFIX相比，体内FIX-CTP3给药后的AUC增加了2倍。与注射
的小鼠相比，注射FIX-CTP3的小鼠表现现改进的PK曲线。
在缺乏FIX的小鼠中的FIX-CTP3药代动力学曲线
平行于PK采样，通过aPTT测定来评估进行
或FIX-CTP3给药的缺乏FIX的动物的柠檬酸化的血浆样本的凝结活性，其被转化成活性％。在每个收集点的活性％被计算为当前凝结时间/正常池小鼠血浆*100的凝结时间。表27总结了在进行了
或FIX-CTP3给药之后的活性值。
在FIX-CTP3给药后，给药后的1小时测定到显著的凝结活性，其在给药后四小时达到96％的活性，而
的最高活性值是40％(表27，图16A和图16B)。FIX-CTP3凝结活性维持了更长时间段，这表明了延长的活性。在36小时后的时间点不可测定到经
处理的小鼠的凝结活性，而经FIX-CTP3处理的小鼠则继续在给药后72小时保持可测量的活性(表27，图16A和图16B)。％凝结药代动力学曲线的分析表明，FIX-CTP3凝结活性维持了显著更长的时间段且其半衰期几乎比
高2倍(表28)。
表27：FIX的活性％
表28：凝结活性
9.3缺乏FIX的小鼠的出血挑战
对缺乏FIX的小鼠进行100IU/kg的
或rFIX-CTP3的单次静脉注射的给药。在给药48小时后稍微剪短尾静脉且评估尾静脉的出血时间(TVBT)和出血强度(血红蛋白OD)。在达到体内平衡15分钟后执行第二次出血挑战，且测量相同的参数。在第一次出血挑战之后，FIX-CTP3给药的动物的出血明显没有
的出血那么强烈，如血红蛋白OD值所表明的(图17A至图17D)。
由于之前报告的在血友病小鼠的第一次出血挑战期间，出血时间不一定与治疗功效相关联，因此推荐评估在额外的出血之后的体内平衡。一旦自发或手动停止第一次出血，则在第一次后的15分钟执行第二次出血挑战，且重新测量时间和出血强度。在第二次出血事件期间，FIX-CTP3给药的动物具有减少的出血时间和强度，这表明FIX-CTP3在稍后的时间点是有效的(图18A至图18D)。
最终，在第二次出血挑战后12小时进一步观察动物，且将所有再发生的出血事件进行记录。给药FIX-CTP3的动物能够在接下来的12小时维持血液体内平衡，而不再发生出血事件。相反地，50％的经
治疗的小鼠具有源于尾部的自发性出血事件。
表29：在尾部切断后的12小时的结果
开发了重组FIX-CTP3，其是由被融合至串联的三个CTP“盒”的FIX的单个分子组成的融合蛋白，以解决用于治疗患有血友病B患者的当前可用的FIX产品的短半衰期。这里的结果表明rFIX-CTP3的消除半衰期一致地为在大鼠(如之前报告的)和在缺乏FIX的小鼠中的rFIX的2.5至4倍。
不受理论的束缚，融合蛋白减少了FIX的清除并通过掩蔽保护了FIX免于蛋白酶活性的退化且减少了FIX对肝受体的亲和性。总而言之，CTP结构域的这些特征延长了FIX的半衰期。
除了rFIX-CTP3的药代动力学分析之外，我们还检查了FIX-CTP3在缺乏FIX的小鼠体内的药效学特性。将rFIX-CTP3和rFIX以相当的剂量(单位)进行给药以补偿在缺乏FIX小鼠体内的凝结缺乏的水平。然而，rFIX-CTP3在缺乏FIX的小鼠体内的效果被显著延长到给药后至少76小时，达到了更高的活性峰。与
相比，FIX-CTP3凝结活性在1小时延迟后开始。可能需要FIX活化，这是因为三个串联CTP的添加可能在理论上掩蔽活化位点并延迟级联的开始。在FIX-CTP3给药后，观察到了100％的峰活性，而
的活性仅为40％。优异的初始活性是非常重要的参数且表明3个CTP的添加具有改进恢复的可能性。
患有血友病B的患者的预防性FIX替换疗法旨在维持1-2％的正常凝结活性的血浆水平。尾静脉出血测定是一种灵敏的体内测试，其测量将出血体内平衡维持在模拟人出血体内平衡模型的低活性值下的能力。响应于给药后48小时的尾静脉出血挑战，rFIX-CTP3给药的动物以更短和较不严重的出血事件维持了血液的体内平衡，这表明了持续的凝结活性。
FIX是一种复合蛋白，其含有经历广泛的转译后修饰的多个功能结构域。用于FIX活性的必要转译后修饰中的一个是通过维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶对Gla结构域中的前12个谷氨酸进行的γ-羧化。这种修饰便于将FIX结合至磷脂膜，且因此对该功能来说是至关重要的。未经γ-羧化的FIX是非功能性的，且因此γ-羧化是速率限制步骤。
使用瞬时转染的细胞进行该PK-PD研究。对从稳定优化的克隆体产生和分泌的稳定FIX-CTP3蛋白执行转译后修饰的广泛的分析评估。
基于所呈现的数据，FIX-CTP3凝固因子具有减少对接收FIX替换疗法的常规预防剂量的患者所进行的注射频率的可能性。预计rFIX-CTP3能够在因子的每次给药后提供针对出血的延长的保护，减少治疗出血事件所需的因子的总单位和/或在手术过程期间以较少的注射维持足够的止血。
实例4
凝固因子FVII的产生和使用
活化的因子VII(FVIIa)凝固因子的长效版本将可用于治疗具有血友病A和B的患者。FVIIa-CTP3重组蛋白具有通过降低输注频率以及甚至通过减少药物负荷来改进血友病患者的治疗(这使得能够显著改进患者的生活质量的预防性治疗方式成为可能)，和避免自发性出血事件以及对关节和其他器官的累积损伤的临床可能性。
本文描述了基于FVII至人CTP的融合的具有延长的半衰期的重组FVIIa-CTP分子的产生。重组FVIIa-CTP在哺乳动物细胞中进行表达且在体外和体内进行表征。证实了rFVIIa-CTP活性与rFVIIa的活性相当。大鼠中的药代动力学和功效研究证实了rFVIIa-CTP的改进的特性。该研究的结果表明开发具有非常类似于野生型酶的止血特性的半衰期延长的rFVIIa分子是可行的。
重组FVII分子的克隆和表达：在我们的真核表达载体(pCI-dhfrr)中构建了多个因子VII克隆体(图19A至图19D)。从“Open Biosystems”(OB-MHS4426)订购了含有智人凝固因子VII的序列的经人MGC验证的FL cDNA克隆体(IRCM)。下列引物是由Sigma-Genosys按下列序列进行合成的：引物67：5’CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCC3’(含有因子VII DNA的5’端以及XhoI的限制性位点)(SEQ ID NO:5)；引物68R：5’TCTAGAATAGGTATTTTTCCACATG3’(含有XbaI的限制性位点)(SEQ ID NO:6)；引物69：5’TCTAGAAAAAAGAAATGCCAGC3’(含有XbaI的限制性位点)(SEQ ID NO:7)；以及引物70R：5’GCGGCCGCATCCTCAGGGAAATGGGGCTCGCA3’(含有因子VII DNA的3’端以及NotI的限制性位点)(SEQ ID NO:8)。
在两组PCR反应中执行克隆。使用作为模板的具有因子VII序列(OB-MHS4426)的cDNA质粒以引物67和引物68R进行第一个反应；作为PCR扩增的结果，形成～534bp产物，将其分离并连接至TA克隆载体中(Invitrogen，目录号：K2000-01)。分离了含有因子VII序列的氨基末端的XhoI-XbaI片段。以引物69和引物70R进行第二个反应，且再次使用具有因子VII序列(OB-MHS4426)的cDNA质粒作为模板。作为PCR扩增的结果，形成～813bp产物且将其连接至TA克隆载体中(Invitrogen，目录号：K2000-01)。分离了含有因子VII序列的羧基末端的XbaI-NotI片段。将两个片段插入我们的真核表达载体pCI-dhfr(三重连接)以产生501-0-p136-1克隆体。
用限制性酶XhoI和KpnI消化质粒501-p136-1(pCI-dhfr载体中的因子VII)。分离～1186bp的片段。用限制性酶KpnI和NotI消化由GeneArt(0721543)合成的随后是CTP序列、终止序列和NotI序列的部分因子VII克隆体(1180bp-1322bp)。分离～253bp的片段。将两个片段插入我们的真核表达载体pCI-dhfr(三重连接)中以产生501-1-p137-2克隆体。用限制性酶XhoI和ApaI消化pCI-dhfr-701-2-p24-2，并分离大片段(载体)。
用限制性酶XhoI和ApaI消化pCI-dhfr-501-2-p137-2(因子VII-ctp x1)，并分离～1200bp插入物。连接载体和插入物以产生501-2-p139-2。将Dg44细胞铺在100mm的组织培养皿中并使其生长至50-60％的汇合度。使用总计为2μg的DNA在无蛋白的培养基(Invitrogene CD Dg44)中使用FuGene试剂(Roche)进行一个100mm板的转染。在转染后48小时将该培养基进行去除并用不具有核苷的无蛋白的培养基(Invitrogene CD Dg44)进行替换。在14天后，将转染的细胞群体转移到T25组织培养瓶中，并使选择继续进行10-14天直到细胞开始作为稳定的克隆体良好地生长为止。选择高表达克隆体并使用约2×107个细胞在补充有5ng/ml的维生素K3(硫酸氢钠甲萘醌；Sigma)的1700cm2的滚瓶(Corning,CorningNY)中接种300ml的生长培养基。在细胞活力迅速降低至约70％之后收集生产培养基(收获物)。将生产培养基首先进行澄清且随后浓缩约20倍，并使用流氏过滤盒(10KDaMWCO MWCO；Millipore Corp，比尔里卡，马萨诸塞州)以PBS进行透析。
FVII抗原水平的确定
编码CTP肽的cDNA被融合至编码人FVII的cDNA的3’端。将相应的rFVII构建体转染至Dg44细胞中。作为对照，使用了人rFVII cDNA。收集且浓缩生产培养基(收获物)并进一步地评估分泌的重组FVII。通过AssayMax人FVII ELISA试剂盒(AssayPro)来确定rFVII、rFVII-CTP和rFVII-CTP-CTP的抗原水平(图20A)。与天然rFVII相比，rFVII-CTP和rFVII-(CTP)2的分泌水平没有显著差异。
SDS-PAGE印迹
通过加载50ng的收获物、纯化的或活化的rFVII蛋白来完成SDS-PAGE分析。使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将样本加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上。通过使用抗人FVII单克隆抗体(Ab)(R&D systems)或兔体内产生的抗CTP多克隆抗体执行蛋白免疫印迹来完成SDS-PAGE分析。
rFVII抗原水平与在用抗FVII Ab进行免疫印迹的SDS-PAGE中检测到的蛋白水平相关。rFVII-CTP以单带迁移，而FVII对照的相应的分子量则约为52KDa(数据未示出)。两种蛋白都与免疫印迹上的FVII特异性抗体起了反应。rFVII-CTP还与CTP特异性抗体起了反应。rFVII是以其酶原形式进行分泌的，且不含有微量的活化蛋白。
FVII显色活性：
使用市售的显色检测试剂盒(AssaySense人FVII显色活性检测试剂盒(AssayPro))来确定rFVII、rFVII-CTP和rFVII-(CTP)2收获物的活性。为了rFVII-CTP的功能表征及其进一步活化(FVIIa)的能力，将浓缩的rFVII-CTP(收获物)置于市售的显色检测试剂盒中，该显色检测试剂盒测量TF/FVIIa将因子X活化成因子Xa的能力，该因子Xa在FXa特异性底物的存在下释放出定量的信号(AssayPro)。在rFVII蛋白的C末端添加CTP肽不损害FVII丝氨酸蛋白酶的活性(图20B和图20C)。
FVII凝结活性：
凝血酶原时间(PT)测量了凝固的外在途径。PT是加入外在途径活化剂、磷脂和钙之后使血浆凝结的时间(以秒进行测量的)。其用于确定血液的凝结趋向，特别是在华法林剂量、肝损伤和维生素K状态的测量中。凝血酶原时间的基准范围通常在12-15秒左右。具体地说，该测定通过添加rhFVII量化了FVII-CTP和FVII-(CTP)2收获物恢复去FVII的人血浆的凝结活性的能力。将300μl的缺乏FIX的人血浆与100μl的FVII、FVII-CTP和FVII-(CTP)2收获物在特定浓度混合或与正常池人血浆相混合并进一步地稀释。在37℃下温育60秒后，将组织因子(TF)、CaCl2和磷脂加入混合物中。确定以秒计的凝结时间。通过将FVII-CTP和FVII-(CTP)2收获物的剂量反应曲线与由rhFVII或人池血浆组成的基准配置品进行比较来评估效力。一个单位的活性FVII被定义为相当于1ml人正常血浆的活性的FVII的量。在凝度计(设备试验室)上测量rFVII和rFVII-CTP的PT凝结活性。
如前所示，在rFVII蛋白的C末端添加CTP肽不会损害其丝氨酸蛋白酶活性并导致人血浆中天然因子X和因子IX的引发和活化。在C末端插入额外的CTP之后，丝氨酸蛋白酶活性降低了三倍(数据未显示)。
药代动力学研究：
将rFVII、rFVII-CTP和rFVII-(CTP)2收获物以100μg/kg体重的剂量对Sprague-Dawley大鼠(每种物质六只大鼠)进行静脉内给药。对于所有的体内实验，基于FVII ELISA试剂盒来确定各蛋白的量。对于每种FVII测试物质而言，通过考虑rFVII与rFVII-CTP的分子量的差异来计算注射量，其产生了不同的摩尔浓度。
使用改变的采样方案来眶后抽取血液样本以使对要量化的采样过程水平的干扰最小化：从3只大鼠在30分钟和90分钟至2小时、6小时和48小时，以及替代地从剩余的三只大鼠在15分钟和60分钟至1.5小时、4小时和24小时。在采样后，立即制备血浆并将其储存在-20℃直到进行分析为止。通过FVII ELISA特定测定来量化FVII浓度。使用线性梯形法则来计算半衰期和曲线下面积(AUC)。这些清除参数的比较显示体内半衰期和rFVII-(CTP)2的AUC显著高于rFVII的那些(表30)。
表30：PK研究概况
重组FVIIa-CTP的表征：
在活化期间，FVII在R152处进行切割，这产生了由单个二硫桥连接在一起的重链和轻链结构域。通过离子交换柱纯化过程来纯化和活化rFVIIa-(CTP)2。为了充分评估rFVIIa-(CTP)2，将蛋白在对商业FVIIa
的还原条件下加载在SDS-PAGE上。重链结构域和轻链结构域以分子量为55KDa和25KDa的分离的带进行分离和迁移。两种蛋白均与FVII特异性抗体起反应，但rFVIIa-CTP的重链与抗CTP特异性抗体起特异性反应，这表明该带表示被融合至CTP的FVII重链。轻链与抗γ羧化酶Ab起特异性反应。FVIIa蛋白浓度是由FVIIa特异性ELISA试剂盒确定的。
FVIIaN末端测序：
通过SDS-PAGE(在12％的Tris-甘氨酸上)分离在活化的或酶原纯化的蛋白中的rFVII-CTP-CTP并随后将其电印迹到PVDF膜上。将感兴趣的带切下并将其放在纯化的用Biobrene处理的玻璃纤维过滤器上。通过使用配备有140C HPLC微量梯度系统的脉冲液体蛋白测序仪的Edmann降解来进行N末端序列分析。通过N末端测序来进一步验证重组蛋白的身份和适当的前肽切割。
FVIIa凝结活性：
为了评估FVII-(CTP)2的凝固活性，执行活化部分凝血活酶时间测定(aPTT)。将缺乏FVII的血浆样本用rFVIIa
或rFVIIa-(CTP)2进行替换。将300μl的缺乏FVII的人血浆与100μl的FVIIa或rFVIIa-(CTP)2在特定浓度混合或与进一步稀释的正常混合的人血浆相混合。在37℃下温育60秒后，将组织因子(TF)、CaCl2和磷脂加入混合物中。确定以秒计的凝结时间。通过将rFVIIa-(CTP)2的剂量反应曲线与由rhFVIIa或人池正常血浆组成的基准配置品进行比较来评估效力。一个单位的FVIIa被定义为相当于1ml人正常血浆的活性的FVIIa的量。在凝度计(设备试验室)上测量rFVII和rFVIIa-(CTP)2的aPTT凝结活性。rFVIIa和rFVIIa-(CTP)2的aPTT凝结活性是类似的。
在大鼠体内的药代动力学研究：
为了表征将CTP添加至rFVIIa对大鼠寿命潜力的影响，执行了在大鼠体内的比较性药代动力学研究。将TBS中的
(rFVIIa)和rFVIIa-(CTP)2注射至6只SD大鼠。使用FVIIa ELISA试剂盒测定FVIIa随时间的水平。针对每种蛋白计算半衰期和AUC。这些清除参数的比较显示rFVIIa-(CTP)2的半衰期、恢复和AUC的体内测量值优于
的那些。
FVIIa-CTP体内功效模型(血友病的缺乏FVIII的小鼠模型)：
为了评估体内活性模型，获得FVIII敲除小鼠，并建立繁殖菌落。将10μg商业重组hFVIIa
或rFVIIa-(CTP)2注射到麻醉的FVIII敲除小鼠(22-28g)的尾静脉中。注射的蛋白量等于FVIII在正常血浆中的所需浓度(5μg/ml)。在特定的时间点将血液样本从剪掉的尾部抽取至肝素化的毛细管中。通过ELISA评估血浆样品的FVIIa水平，并通过PTT凝固测定来测量功效。
在该研究中，产生FVII与CTP的融合构建体。该重组蛋白是提供延长的半衰期和保持治疗效力的治疗的基础。
这些结果表明rFVIIa-(CTP)2在血友病患者中具有与rFVIIa类似的治疗功效。此外，这种技术需要更低频率的给药。其显示单次注射rFVIIa-(CTP)2足以控制出血事件并减少在手术干预期间所需的注射次数。该重组蛋白可以用作长期预防性治疗。
实例5
纯化的FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5的比较性评估
5.1研究目的
FVII-CTP4和FVII-CTP5与FVII-CTP3的药代动力学参数和凝结活性的比较性评估。
5.2FVII-CTP4和FVII-CTP5收获物的产生
在C末端被融合至四个或五个串联CTP序列的FVII cDNA是在20μg/L的维生素K3(Sigma,Mennadion)的存在下使用Excellgene表达系统在Dg44细胞中进行表达的。收集收获物(300ml)并进行过滤和冷冻。
5.3FVII-CTP3收获物的产生
使用pCI-DHFR载体在哺乳动物表达系统，即CHO细胞中进行FVII-CTP3的内部表达。在编码FVII-CTP3的核苷酸盒的形式包括编码信号肽的核苷酸序列，例如，包括如在SEQID NO:24中列出的核酸序列时，该盒被标记为MOD-5014，这是因为本文编码的多肽的表达、纯化和活化导致了凝固因子的活性FVIIa-CTP3形式。在25ng/L的维生素K3(Sigma)的存在下，稳定转染的池#71在摇瓶中生长。收集收获物并进行过滤。
将所有FVII-CTP收获物(3、4和5个CTP)进行浓缩并使用Pellicon XL MWCO10kDa以TBS(50mM Tris、150mM NaCl，pH7.4)进行透析。
5.4FVII抗原水平的确定
使用人FVII ELISA试剂盒(Zymotest HyPhen)来确定FVII抗原水平(表31)。所计算的蛋白浓度是两次独立运行的平均值。
表31：FVII抗原水平
5.5FVII-CTP免疫印迹
FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5的收获物是使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶(expedeon)上的。使用抗CTP多克隆Ab(AdarBiotech Production)或抗Gla Ab(American Diagnostica)以蛋白免疫印迹来执行SDS-PAGE分析。
被融合至三个、四个和五个CTP的FVII分别以80kDa、90kDa和100kDa迁移。正如所料，与在Prolor产生的FIX-CTP3收获物相比，源于Excellgene的FIX-CTP4和FIX-CTP5收获物含有低γ羧化含量，这是因为该生产过程不是优化的(图21A至图21C)。
5.6FVII体外效力的比较性评估
使用市售的显色活性检测试剂盒，BIOPHEN(Hyphen BioMed 221304)执行HA纯化的(高度γ羧化组分)FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5与正常人池血浆的体外效力的比较性评估。将所有样品进行连续稀释且通过将剂量反应曲线与由正常人血浆组成的基准制剂进行比较来评估效力。FVII-CTP3和FVII-CTP5表现出比混合的正常血浆更低的显色活性(图22)。与FVII-CTP3和FVII-CTP5相比，FVII-CTP4表现出如通过EC50比率所反映的更高的活性(表32)。
表32：FVII的体外凝结活性
5.7FVII的体外凝结活性：
在以色列国家凝血中心的Sheba医疗中心执行的因子VII(FVII)活性测定是使用缺乏因子VII(Siemens)的免疫吸附的血浆的基于前凝血酶(PT)的测定。PT试剂是Innovin且测定是在
CA 1500仪器中进行的。FVII的正常范围在55-145％内。
表33：FVII的体外显色活性
由于体内循环FVII的正常水平约为0.5μg/ml，与正常人池血浆相比，FVII-CTP3和FVII-CTP5收获物表现出其凝固活性增加3倍；该结果与所获得的显色活性相关(表33)。
如在显色活性测定中观察到的，与正常人池血浆相比，FVII-CTP4收获物表现出其可能的凝固活性增加3倍。与FVII-CTP3和FVII-CTP5的活性百分比相比，FVII-CTP4的活性百分比高得多。ELISA方法的方法学限制可能限制FVII-CTP4的Ag水平计算的准确性。
5.8药代动力学研究
执行两个药代动力学研究以确定FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5的药代动力学(PK)参数。在第一个研究期间，将FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5(分别为组A、组B和组C)按单次静脉注射以250μg/kg体重的剂量对Sprague Dawley大鼠(每次治疗六只大鼠)进行给药。在给药后的0.083小时、0.5小时、2小时、5小时、8小时、24小时、48小时、72小时和96小时交替地从3只大鼠进行血液样本的眶后抽取(表34)。在采样后，立即制备柠檬酸化的血浆(0.38％)并将其储存在-20℃直到进行分析为止。
表34：药代动力学研究设计-浓缩的收获物
在血浆样本中的FVII浓度是使用人FVII Elisa试剂盒(Zymutest FVII-Biophen)进行量化的。计算药代动力学曲线且其是在每个时间点上的3只动物的平均值。使用PKSolutions 2.0软件计算终末半衰期。下面的表35总结了在不同采样时间点的所计算的FVII浓度。下面还显示了PK曲线(图23和图24)和PK参数的总结(表36)。与FVII-CTP3和FVII-CTP4相比，FVII-CTP5表现出优异的曲线(表36)。
表35：第一个药代动力学研究-FVII浓度
表36：药代动力学分析
与3个CTP相比，添加4或5个CTP分别将FVII的半衰期显著地延长了2倍和3倍(表36)。这项优势在研究的最初部分(0.083-8小时)更为显著，这表明了可能提高的蛋白恢复以及减少的额外的血管清除。与FVII-CTP3相比，在FVII-CTP4和FVII-CTP5给药后的AUC分别增加了3倍和4倍。在将4和5个CTP添加至FVII时，还减少了清除(表36)。
如在研究中所观察到的，在初始和终末半衰期中，与3个CTP相比，添加四个和五个CTP显著地延长了FVII的半衰期。在第一个和第二个研究中的半衰期值由于受剂量和研究持续时间影响的不同分析方法而不同，然而总体趋势却保持不变。与FVII-CTP3相比，在FVII-CTP4和FVII-CTP5给药后的AUC分别增加了2.5倍和7倍。
5.9结论：
在这项研究中，评估了FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5的PK参数和可能的凝结活性。与FVII-CTP3相比，4个CTP和5个CTP至FVII的融合提供了优异且改进的半衰期，暴露和减少的清除，且同时保持了类似的显色活性和体外凝结活性。这些结果是在不同的蛋白浓度下观察到的且对于收获物和纯化蛋白来说是一致的。在评价在C端的CTP至FVII的融合的整体效果时，1-5个CTP的融合以与CTP成比例的方式大大增加了FVII的半衰期和AUC，这表明随着分子的CTP部分的增加，显著提高了FVII的寿命和稳定性，且同时保持了其初始的体外凝结活性，如在下面的表37中所总结的。
表37：
如之前报告的，在人和动物中，FVII半衰期与FVII(FVIIa)的活化形式的半衰期相关。因此，预期在CTP融合之后的活化版本将获得类似的半衰期改进。
实例6
在缺乏FVIII的血友病小鼠中的FVII-CTP3的可行性研究
相对于商业FVII执行了测试FVII-CTP、FVII-CTP2和FVII-CTP3收获物的PK曲线和凝固活性的上述研究。FVII-CTP3表现出改进的PK曲线，且同时维持了其相对于FVII-CTP和FVII-CTP2收获物或rhFVII的凝固活性。为了进一步表征FVII-CTP3的体外和体内特性，产生了表达并分泌蛋白的小稳定池，并开发了纯化和活化过程。
在当前的研究中，在缺乏FVIII的小鼠中测试了FVIIa-CTP3的药代动力学和药效学特性。评估了蛋白的PK曲线。建立了基于FVIIa特异性活性的PK曲线并将其与商业产品
进行比较。此外，测试了FVIIa-CTP3在尾静脉切断(生存研究)后在缺乏FVIII的小鼠体内诱导凝固的长效体内止血能力。
研究目的：
为了评估在按类似的活性剂量进行的单次IV给药后在缺乏FVIII的小鼠体内的FVIIa-CTP3与商业rhFVIIa
的药代动力学和药效学参数。
为了通过按类似的活性剂量进行了FVIIa-CTP3和
的单次IV给药且随后进行尾静脉切断的挑战(生存研究)来确定FVIIa-CTP3在缺乏FVIII的小鼠体内维持体内平衡的体内能力。
FVII-CTP3收获物的产生：
使用pCI-DHFR载体在Dg44细胞中进行FVII-CTP3的内部表达。在25ng/L的维生素K3(Sigma)的存在下，使稳定转染的池#71在摇瓶中生长。在活力下降到60-80％之后培养和收获细胞混悬剂。将收获物过滤并在-70℃进行冷冻。
收获物FVII抗原水平的确定：
使用人FVII ELISA试剂盒(Zymotest HyPhen)来确定FVII抗原水平(表38)。按每个混合的收获物批次计算抗原水平。
表38：FVII-CTP3的抗原水平
FVII-CTP3纯化过程(图25A和图25B)
过程概况
在短暂的纯化研究之后，执行使用2个柱的下列纯化过程。VII-选择亲和柱(GE)和陶瓷羟基磷灰石1型(HA)，40μm(Bio Rad)，纯化FVII-CTP3γ-羧化的富集蛋白。在CaCl2的存在下通过在2-8℃对纯化的FVII-CTP3进行温育过夜来诱导自动活化。纯化过程处于其最终的发展阶段中并正被优化，因此虽然大部分的纯化步骤是类似的，但纯化步骤中的某些部分在两个批次中是不相同的。
使用10kDa中空纤维或Pellicon盒的超滤/渗滤(UFDF)
将澄清的收获物在周末(2-3天)于4℃解冻。
在批次31中，使用具有10KDa截留分子量的中空纤维筒(GE医疗保健目录#UFP-10-C-4X2MA)将澄清的收获物(12升)浓缩4倍(在两次连续的运行中)。将浓缩的收获物以1-2体积的TBS(50mM Tris 150mM NaCl pH7.4)进行渗滤。
在批次38中，使用具有10KDa截留分子量的Pellicon 2(Millipore)盒将澄清的收获物(8.5升)浓缩4倍。将浓缩的收获物直接加载在VII-选择柱上。
两次超滤均是在具有冰冷的缓冲液的冰上执行的。在加载前，将UFDF样本以0.22μm过滤。
在FVII-选择柱上的捕获
将UFDF或浓缩的收获物加载在VII-选择柱(XK16/20,CV 18ml)上，用TBS pH 7.4进行预平衡。该柱用50mM Tris-HCl、0.5M NaCl pH7.5洗涤，且FVII-CTP3用50mM Tris-HCl、1M NaCl 50％(v/v)、丙二醇pH 7.5洗脱。在使用相同的柱以两个连续循环执行该过程。
在陶瓷羟基磷灰石柱上的基于γ羧化的分离
洗脱的产物用10mM磷酸钠pH 6.8进行1:10的稀释且被加载在陶瓷羟基磷灰石柱(XK16/20，CV 24ml)上。该柱用59mM磷酸钠pH 6.8洗涤，且因子VII的γ-羧化的富集部分用500mM磷酸钠pH 6.8洗脱。在相同柱上以两个连续循环执行该过程。在每个批次中，两个循环的洗脱液相混合并被浓缩至1.7-2mg/ml且用20mM Tris-HCl、100mM NaCl pH 8.2进行渗滤以减少体积并制备用于活化步骤的材料。
FVII活化
将纯化的FVII-CTP3稀释至1mg/ml，并在2-8℃下在20mM Tris-HCl、100mM NaCl和1mM CaCl2 pH 8.2中温育24小时。通过缓冲液交换(UFDF)来终止活化得到初步制剂缓冲液(20mM柠檬酸缓冲液、240mM NaCl、13.3mM甘氨酸，pH 6.9)。
FVII-CTP3和FVIIa-CTP3的分析特性：
SDS-PAGE和蛋白印迹
纯化的FVII-CTP3和FVIIa-CTP3是使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)加载在12％的Tris-甘氨酸凝胶上的。SDS-PAGE考马斯分析是通过用考马斯亮蓝试剂对凝胶进行染色来执行的(5μg或10μg的蛋白/泳道)。蛋白印迹分析是使用抗人FVII多克隆Ab(R&D systems；AF2338)、抗人γ羧化单克隆抗体(American Diagnostics，目录#499,3570)和抗CTP多克隆抗体来执行的(1μg的蛋白/泳道)。在还原条件下，FVII-CTP3以75KDa迁移，且FVIIa-CTP3以两条主要带迁移：50kDa的重链和25kDa的轻链，其分别在图26A至图26H中被示为带2和带3。
纯化过程显著地富集了FVII-CTP3部分，且同时减少了杂质。纯化过程的产率为25-30％的FVII(根据ELISA)。在纯化期间丢失的大部分蛋白具有低FVII显色活性或无活性。基于考马斯染色的SDS-PAGE，减少的FVIIa-CTP3含有超过预测的带。迁移到约～75kDa的带表示未活化的FVII(图26A至图26H，带1)。该带由具有较小MW差异的两个带组成，其可能反映不同的γ-羧化含量。观察到了具有低于20kDa的MW的额外的带。这之前被报告成重链的降解产物。
FVII-CTP3的显色活性：
使用市售的显色活性检测试剂盒，BIOPHEN(Hyphen BioMed 221304)执行对FVII-CTP3收获物、过程中的组分和纯化的FVII-CTP3与人池正常血浆的体外效力的比较性评估。对FVII-CTP3收获物和蛋白进行连续稀释且通过将剂量反应曲线与正常人血浆的基准配置品进行比较来评估效力。在FVII-CTP3纯化后，显著提高了显色活性，且主要由HA柱分离了非活性部分(图27)。观察到了在FVII显色活性和蛋白印迹中用单克隆抗Gla抗体检测FVII之间的强相关性。如在收获物中由EC50值反映的FVII显色活性的效力受到羧化的FVII部分和非羧化的FVII部分的影响。在FVII-CTP3的γ-羧化部分的纯化和富集之后，提高了活性，这证明了γ-羧化对FVII活性的重要贡献(图27)。该参数对于适当的FVII的体内活性来说是至关重要的且将在克隆体发展计划中进行进一步的解决。
通过A280进行的蛋白确定
使用ProtParam算法(http://web.expasy.org/protparam)计算FVIIa-CTP3和
的理论消光系数。该计算基于氨基酸序列。针对FVIIa-CTP3和
计算出的消光系数分别为1.186和1.406。这些值表示在280nm处的1g/L的吸光度。
两种蛋白之间的消光系数差异仅仅是由FVIIa-CTP3与
相比而言分子量的增加而导致的，这是因为CTP缺乏芳香族和半胱氨酸残基，因此其对吸光度不起作用。
通过A280进行的蛋白确定用于最终的FVII以及用于纯化的过程中的样本，这从VII-选择柱的洗脱开始。
FVIIa抗原水平的确定
使用人FVIIa ELISA试剂盒(IMUBIND，American Diagnostica)确定FVIIa抗原水平。针对每个批次计算抗原水平。然而，这个工具对于确定注射剂量来说是没用的，这是因为其不表示活性产物的量。
FVIIa是由单链FVII的链内切割得到的。天然组织因子(TF)是FVIIa的辅因子。在结合至TF之后，FVII介导因子X至Xa的活化，而其本身则被转化成FVIIa。可溶性组织因子是天然组织因子的胞外部分。它不能再通过自动活化来活化FVII，但被结合至组织因子的FVIIa却能够将FX活化成FXa。
该测定中使用的重组可溶性组织因子(rsTF)使用FVIIa的特异性来构建FVIIa凝结测试。在FVIIa、钙和磷脂的存在下，rsTF导致血浆凝固，而不会将FVII活化成FVIIa。
在该系统中观察到的凝结时间与在被测样本中的FVIIa含量成反比关系，且没有存在于样本中的FVII的干扰。
由Omri Laboratories(Nes-Ziona，以色列)执行该测定。在每次研究之前评估重构后的
和FVIIa-CTP3的FVIIa活性。
活性与小瓶上报告的预期活性不相关，但差异可能是由于用于活性评估的不同方法导致的。表39总结了未考虑蛋白浓度的每体积的FVIIa凝结活性。
表39：批次产品的FVIIa凝结活性
FVIIa-CTP3的比活性
FVIIa的比活性(其是按活性/ml除以蛋白浓度进行计算的)是基于A280进行计算的且被显示在表40中。当比较MW不同的两个分子的比活性时，必须进行补偿以使活性标准化(即，由于分子量的差异，在1mg的
中的活性位点的数量比是FVIIa-CTP3中的1.185倍高)。转换因子的计算被显示在下列的等式中：
表40：与
相比的FVIIa-CTP3的比活性
FIX-CTP3的PK-PD研究：
研究概况
将FVIIa-CTP3和rhFVIIa(
NS)以6.4E6U/kg体重(160,000U/动物)的剂量按单次静脉注射对C57B缺乏FVIII的小鼠进行给药。在给药后的0.166小时、0.5小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、34小时、48小时、58小时和72小时交替地从4只小鼠进行血液样本的眶后抽取(表41)。在采样后，立即制备柠檬酸化的血浆(0.32％)并将其储存在-20℃直到进行分析为止。评估FVIIa的凝结活性水平，且执行详细的PK分析。由OmriLaboratories(Nes-Ziona，以色列)执行该研究。
表41：研究概况
在缺乏FVIII的小鼠中的FVIIa-CTP3的PK曲线
使用
VIIa-rTF试剂盒(Stago，Parsippany，NJ)量化血液样本中的FVIIa活性。针对每种蛋白计算药代动力学曲线，其表示在每个时间点上的4只动物的平均值。图28表示整个实验中的FVIIa的PK曲线。在表43中显示了FVIIa恢复。在表44中显示了PK参数的总结。
表42总结了在进行了
或FVIIa-CTP3给药之后的凝结活性值。FVIIa-CTP3和
在给药后半小时达到最大活性。
的最高活性值仅达到FVIIa-CTP3的最大活性值的43％。FVIIa-CTP3的凝结活性维持了更长时间段，这表明了延长的活性。在12小时后的时间点不可测定到经
处理的小鼠的凝结活性，而经FVII-CTP3处理的小鼠则继续在给药后48小时保持可测量的活性(表42和图28)。
如给药后的最高活性所测量的且与基于体外分析的预期活性相比较，将三个串联的CTP拷贝添加至FVIIa使恢复提高了100％(表43)，且使半衰期和平均停留时间(MRT)增加5倍。暴露时间(AUC)增加3倍(表44)。
表42：单次IV注射后的FVIIa凝结活性
表43：FVIIa-CTP3的恢复
*预期的Cmax是用给药剂量除以血液体积得到的。
表44：FVIIa-CTP 3 与
的PK参数
凝血酶生成测定(TGA)
凝血酶的生成是凝结级联的基本部分，因此对特定个体能够如何好地生成凝血酶的估计可能与出血或血栓形成的风险相关。在分析凝血酶生成时通常测量的变量包括：滞后时间、凝血酶生成达到峰值的时间、峰值、内源性凝血酶潜能[ETP](即，曲线和尾部下的面积)、凝血酶生成图(thrombogram)的时间过程(“TG”)。在滞后时间后，观察到了凝血酶激增。然而，当95％以上的凝血酶尚未形成时的滞后时间的结束时发生了凝结。凝血酶生成测定是在Omri Laboratories使用补充有人血友病血浆的凝血酶生成分析(Thrombinoscope)试剂执行的。TGA反映了在从注射
和FVIIa-CTP3得到的小鼠血浆中的凝结能力。图29A至图29C表示在进行FVIIa-CTP3或
给药后的小鼠血浆的TGA参数值。在FVIIa-CTP3给药后，所有三个参数(凝血酶生成速率、生成的凝血酶的最大量和KIIa)显示出FVII-CTP3优于
治疗的优点。与
相比，这进一步增强了FVII-CTP3潜在长效优势的概念。
FVIIa-CTP3尾静脉切断(TVT)研究：
研究概况
从FVIIa-CTP3的PK/PD测试获得的数据提供了对FVIIa-CTP3的功能的深刻了解且表明当与
相比时，FVIIa-CTP3具有药代动力学优势。然而，蛋白在创伤事件之后在体内诱导凝块的能力还没有得到证实。为了评估FVIIa-CTP3止血的能力，采用相同的缺乏FVIII的小鼠模型进行出血挑战。
对缺乏FVIII的小鼠进行FVIIa-CTP3或
的单次静脉注射。对小鼠进行提供相等的FVIIa活性(1.6E05单位,200μl)的药物的量的给药，该药物的量是根据在FVIIa凝结活性测定中评估的每种药物的效力进行计算的(表45)。由于FVIIa-CTP3的活性降低，所给药的剂量为9mg/kg的
和40mg/kg的FVII-CTP3。对照组则注射200μl的载体。
在给药后的15分钟(注射1)、24小时(注射2)或48小时(注射3)在距尾尖2.7cm处切断尾静脉，并记录24小时的小鼠生存。
表45：注射样本的评估
蛋白浓度是由A280确定的。
结果
对源于三次注射(5只动物×3次注射)的注射载体的对照组的数据进行了总结并显示在图30A至图30D中。在尾静脉切断24小时后，观察到了30％的生存。
在FVIIa给药15分钟后执行尾静脉切断之后，经
和FVIIa-CTP3处理的小鼠表现出适当的止血活性。在经FVIIa-CTP3和
处理的动物体内观察到了100％的生存率(图30A至图30D)。
在给药后的24小时执行的尾静脉切断之后，最清楚地体会到在PK/PD研究中证实的FVII-CTP3的降低的清除率。观察到
的生存率降低。类似于对照组，在10小时内观察到了50％的死亡。同时，90％的经FVIIa-CTP3处理的小鼠存活(图30A至图30D)。该结果强调了FVIIa-CTP3治疗的长效功效。
在给药后的48小时，在用FVIIa-CTP3或
处理的组中显示出生存率的降低(图30C)。观察到了FVIIa-CTP小鼠体内的略微改进，但该差异没有达到统计学显著性。
讨论：
CTP至重组蛋白的融合延长了蛋白的循环半衰期，且同时保持了相当的活性。尽管在70KDa阈值大小以上的蛋白清除降低背后的机制在肾清除方面已得到很好的理解，但在CTP融合之后仍实现了额外的保护。CTP融合被认为是环绕蛋白屏障延伸并保护其免于蛋白水解切割，以由于高度负电荷来增加其径向分子量并降低其对肝清除受体的亲和性。
该研究旨在提供关于CTP至FVII的融合对蛋白半衰期和清除的影响的具体见解以及还提出在该修饰后的其比活性的范例。对缺乏FVIII的小鼠以类似的剂量(基于单位的)按单次IV注射进行FVIIa-CTP3或重组商业FVIIa
的给药并执行基于PK活性的分析。FVIIa-CTP3表现出优越的寿命，如其半衰期和AUC的分别为5倍和3.5倍的增加所反映的。如
活性试剂盒计算的FVIIa-CTP的比活性(U/mg)除以由A280测量的蛋白浓度被示为比
的比活性低4-5倍。
为了增进对CTP如何影响FVIIa在体内的止血效果的理解，研究了FVIIa-CTP3的减少出血的能力。在血友病小鼠模型的尾静脉切断的出血模型中，rFVIIa给药能够提高所挑战动物的生存率并避免其导致死亡的出血。在本文描述的研究中，给动物进行FVIIa-CTP3或
的给药。当在给药后0.25小时执行切断时，两个分子均能够保持体内平衡。当在给药后24小时执行尾部切断时，显示出经FVIIa-CTP3处理的组的活性的持续时间显著延长。载体处理组的生存率高于预期且高于在之前的研究中所获得的生存率(相对于之前研究中的20％为50％，数据未示出)。进一步评估了所处理的动物在更早的时间点，包括给药后36小时的生存百分比。
总之，其证明了FVIIa-CTP3在血友病小鼠中具有延长的活性持续时间，与
相比，其转化为更长的止血效果的持续时间。收集的数据表明，CTP至FVII的融合是一种具有显著地改进血友病患者的预防性治疗的潜力的技术。
实例7对在对SD大鼠进行单次IV或SC注射后的纯化FVII-CTP3与FVII-CTP5曲线的比较性评估
研究目的
进行了两个研究：
第一个研究目的是在按50μg/动物进行单次静脉给药后，确定在雄性SpargueDawley大鼠中进行FVII选择和HA柱纯化之后的rFVII-CTP3与rFVII-CTP5的药代动力学参数。
在第二个研究中，在按100μg/动物进行单次静脉或皮下给药后的雄性SpargueDawley大鼠中检查rFVII-CTP3-HA与rFVII-CTP5-HA的药代动力学参数。
结果
FVII-CTP 3和FVII-CTP 5抗原水平的确定
使用人FVII ELISA试剂盒(Zymotest HyPhen)来确定FVII抗原水平(表46)。T
表46.其总结了所计算的蛋白浓度，其是三次独立运行的平均值。
所测定的样本的蛋白印迹分析
将FVII-CTP3,5样本使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)加载在4-12％的bisTris凝胶(NuPage,Invitrogene)上。使用多克隆抗FVII Ab(R&D systems)、抗CTP多克隆Ab(Adar biotech production)或抗Gla Ab(American Diagnostica)以蛋白免疫印迹来执行SDS-PAGE分析。总之，被融合至三个和五个CTP的FVII分别以80kDa和100kDa迁移(见图31A至图31C)。
FVII体外效力的比较性评估
在国家凝血中心的Sheba医疗中心执行的FVII活性测定是使用缺乏因子VII(Siemens)的免疫吸附的血浆的基于PT的测定。PT试剂是Innovin且测定是在Sysmex CA1500仪器中进行的。FVII的正常范围在55-145％内。在表47中总结了样本活性。
表47：样本活性
在体内的循环FVII的正常水平约为0.5μg/ml。与正常人池血浆相比，FVII-CTP3和FVII-CTP5均表现出其凝固活性的约为5倍的降低。
药代动力学研究
执行两个药代动力学研究以确定FVII-CTP3和FVII-CTP5(在FVII选择和FVII HA柱后)的药代动力学(PK)曲线和参数。在第一个研究中，在FVII选择/HA纯化之后，将FVII-CTP3和FVII-CTP5按单次静脉注射以50μg/大鼠的剂量对Sprague Dawley大鼠(每种物质六只大鼠)进行给药。
在给药后0.083小时、0.5小时、2小时、5小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时和120小时交替地从3只大鼠进行血液样本的眶后抽取。在采样后，立即制备柠檬酸化的血浆(0.38％)并将其储存在-20℃直到进行分析为止。
在第二个研究中，仅测试在HA柱后的样本。使用100μg/大鼠的剂量按单次静脉注射或皮下注射对Spargue Dawley大鼠(每种物质六只大鼠)进行这些样本的给药。在与上面的第一个研究相同的时间点和条件下收集血液样本。
表48.第一个研究设计(FVII选择与FVII HA)
表49.第二个研究设计(IV与SC)
在这两个研究之间的主要区别是剂量和给药途径。在第一个研究中，对大鼠按50μg/大鼠进行IV注射，而在第二个研究中，对大鼠按100μg/大鼠进行IV或SC注射(总共为500μg/kg；大鼠重200g)。剂量的增加是由于给药类型的变化；SC给药则要求更高的量以实现与IV给药类似的效果。
PK研究的分析
在血浆样本中的FVII浓度是使用人FVII Elisa试剂盒(Zymutest FVII-Biophen)进行量化的。计算药代动力学曲线，其反映了在每个时间点上的3只动物的平均值。使用PKSolutions 2.0软件计算终末半衰期。下面的表总结了在不同采样时间点的所计算的FVII浓度。下表显示了PK曲线和PK参数的总结。
表50.第一个药代动力学研究(FVII选择与FVII HA)-FVII浓度(ng\ml)
表51第二个药代动力学研究(IV与SC)-FVII浓度(ng\ml)
表52：PK分析-第一个药代动力学研究(FVII S与HA)
与3个CTP相比，添加五个CTP延长了FVII的半衰期。在长时间点(96小时和120小时)测定到了5CTP的两种形式(即，FVIIS和FVII HA)，而FVII-3CTP HA和FVIIS-3CTP则分别测定到72小时和96小时为止。基于该事实，FVII-5CTP的半衰期比3CTP变体更长(见图32)。在相同的时间点(8-72小时)比较所有检查的材料(3和5个CTP)的半衰期显示半衰期相似，然而5个CTP更长(图32)。
表53：PK分析-第二个药代动力学研究-(IV与SC)
再次地，如在第一个研究中观察到的，在初始和终末半衰期以及两种给药方式(IV和SC，见图33)中，与添加3个CTP相比，添加5个CTP延长了FVII的半衰期。正如所料，在SC给药后，与IV给药时相比，在稍后的时间点在血液中第一次测定到FVII。
在上面，总结了两个PK研究。第一个研究的主要目的是在2个不同的柱(FVII选择和FVII HA)之后检查在FVII-3CTP和FVII-5CTP之间的差异。在之前的研究中，检查了收获物与纯化蛋白，发现在将收获物注射至大鼠中时，在FVII的3个CTP和5个CTP版本之间的差异更大。
在两个柱之后的FVII 3\5CTP的结果之间没有显著的差异，因此在第二个研究中决定注射(IV与SC)FVII HA 3\5CTP。
实例8：在皮下注射后在缺乏FVIII的小鼠体内的FVIIa-CTP3(MOD-5014)的生存研究
研究目的
为了在皮下给药之后在尾静脉切断研究中评估
MOD-5014(FVIIA-CTP3)和MOD-5019(FVIIA-CTP5)的功效。
FVIIa-CTP3 (MOD-5014)和FVIIa-CTP5 (MOD 5019)的分析特性：
通过A280进行的蛋白确定
使用ProtParam算法(http://web.expasy.org/protparam)计算
的理论消光系数。该计算基于氨基酸序列。计算出的
的消光系数为1.406，且MOD-5019的消光系数为1.075(数值代表在280nm下的1g/L的吸光度)。在Mscan通过氨基酸分析来确定MOD-5014的消光系数。MOD-5014的消光系数为1.27。
FVIIa-STACLOT
VIIa-rTF的凝结测定
FVIIa是由单链FVII的链内切割得到的。天然组织因子(TF)是FVIIa的辅因子，在结合至TF之后，FVII介导因子X至Xa的活化，而其本身则被转化成FVIIa。可溶性组织因子是天然组织因子的细胞外部分。它不能再通过自动活化来活化FVII，但被结合至组织因子的FVIIa却能够将FX活化成FXa。
用于该测定中的重组可溶性组织因子(rsTF)使用FVIIa的特异性来构建FVIIa凝结测试。在FVIIa、钙和磷脂的存在下，重组可溶性组织因子(rsTF)产生血浆凝固，而不会将FVII活化成FVIIa。
在该系统中观察到的凝结时间与在被测样本中的FVIIa含量成反比关系，且没有存在于样本中的FVII的干扰。
在每次研究之前评估重构的
和MOD-5014及MOD-5019的FVIIa活性。
FVIIa的比活性(其是按活性/ml除以蛋白浓度进行计算的)是基于A280进行计算的且被显示在表54中。当比较分子量不同的两个分子的比活性时，必须进行补偿以使活性标准化(即，由于分子量的差异，在1mg的
中的活性位点的数量是在MOD-5014中的1.185倍且是MOD-5019中的1.307倍)。因此，转换因子的计算被显示在下列的等式中：
表54-与
相比的MOD-5014的比活性
研究概况
最重要的测量是蛋白在创伤事件后在体内诱导凝块的能力。为了评估MOD-5014止血的能力，采用相同的缺乏FVIII的小鼠模型进行出血挑战。
对缺乏FVIII的小鼠以单次皮下注射进行MOD-5014、MOD-5019或
的给药。对组A和组B分别以与FVIIa活性相等的量进行
和MOD-5014的给药。为了评估关键因子(蛋白的活性或量)，对C组以与MOD-5014等量的FVIIa蛋白进行MOD-5019的给药。给药的剂量为4.2mg/kg的
和8.6mg/kg的MOD-5014和MOD-5019。将尾静脉在给药后12小时在距尾尖2.7cm处进行切断，并记录24小时的小鼠生存。
表55-组指定
结果
在表56和在图34中总结了实验数据。
表56.TVT研究结果
在TVT后24小时，注射有
的小鼠中仅有11％存活。30％的MOD-5014和40％的MOD-5019存活至该时间点。令人惊讶地，与
相比，皮下注射的MOD-5014和MOD-5019显示了改进的小鼠存活。
与其他凝固因子一样，因子VIIa通常是静脉注射的，从而在血流中为直接可用的。然而，本发明显示在SC给药之后本文提供的组合物被令人惊讶地更有效地吸收至血流中。由于能够用于预防性应用，所以能够进行FVIIa的皮下给药具有优势。对于患者来说，皮下注射也更容易进行自行注射，且当患者很幼小且其静脉很小且难于找到时是有利的。
因此，皮下应用能够用于预防性治疗。
实例9：在SD大鼠体内皮下给药后的重组MOD-5014与
的比较性PK-PD研究
研究目的
为了确定单次SC给药后的SD大鼠中MOD-5014与商业rFVIIa的药代动力学参数和药效学参数。
为了比较两个独立实验(05010和05034)，其含有源于两个因其药代动力学参数而不同的克隆体(克隆体号28与61)的MOD-5014产物。
实验方法
动物
在注射开始前的至少4天从Harlan Laboratories Israel,Ltd送来24只雄性SD大鼠。动物是健康的年轻成鼠，在研究开始时为～200克。治疗开始时动物的体重变化不应超过每个性别的平均体重的±20％。在送达时检查在该研究中使用的动物的健康状况。只有身体健康的动物适应于实验室条件且用于该研究中。
FVIIa-STACLOT
VIIa-Rtf的凝结测定
该测定中使用的重组可溶性组织因子(rsTF)使用FVIIa的特异性来构建FVIIa凝结测试。在FVIIa、钙和磷脂的存在下，rsTF产生血浆凝固，而不会将FVII活化成FVIIa。
在该系统中观察到的凝结时间与在被测样本中的FVIIa含量成反比关系，且没有存在于样本中的FVII的干扰。
在每次研究之前评估重构后的
和MOD-5014的FVIIa活性。基于A280计算FVIIa比活性。当比较MW不同的两个分子的比活性时，必须进行补偿以使活性标准化(即，由于分子量的差异，在1mg的
中的活性位点的数量是在MOD-5014中的1.185倍)。
PK解算器软件
使用PK解算器软件计算药代动力学参数。IV给药曲线是按两次房室CA团注进行分析的，SC给药则是作为NCA血管外-对数线性梯形分析进行的。计算半衰期、AUC、清除和体积分布规格，并在各组实验之间的比较中研究输出参数。
实验号05010：
A.
RT:(在31.7.12*制备的批号#AU61553)根据A280的FVIIa浓度：0.86mg/ml。FVIIa Staclot活性测定：56,867U/mg。注射剂量：946μg/kg。
等份池，所有的均源于相同的批号。
B.克隆体28：MOD-5014 RS12-001:基于A280的0.77mg/ml**。FVIIa Staclot活性测定：34,162U/mg。注射剂量：850μg FVIIa/kg。
实验号05034：
A.
RT:(在1.1.13*制备的批号#AU61347)根据A280的FVIIa浓度：0.82mg/ml，其以无菌的NS缓冲液被稀释至0.4mg/ml。FVIIa Staclot活性测定：55,688U/mg。注射剂量：360μg/kg和20,047.7U/kg。
B.克隆体61：MOD-5014批次75:基于A280的1.9mg/ml**，其以配制的缓冲液被稀释至0.89mg/ml。注射剂量：20,047.7U/kg。FVIIa凝结活性：基于FVIIa Staclot活性测定的25,002*U/mg。
C.克隆体61：MOD-5014批次81A:基于A280的2.36mg/ml(其在研究当日的早上进行过滤且在280nm处进行重新测量)，其以配制的缓冲液被稀释至0.4mg/ml。注射剂量：360μgFVIIa/kg。FVIIa凝结活性：基于FVIIa Staclot活性测定的24943U/mg。
D.克隆体61：MOD-5014批次81A:基于A280的2.36mg/ml，其以配制的缓冲液被稀释至0.89mg/ml。注射剂量：20,047.7U/kg。FVIIa凝结活性：基于FVIIa Staclot活性测定的24,943U/mg。
研究概况
实验号05010
以0.9mg/kg体重的剂量按单次静脉或皮下注射对SD大鼠进行MOD-5014和
的给药。在给药后的0.5小时、4小时、8小时、12小时、24小时、34小时、48小时和58小时交替地从3只大鼠的窦眶眼抽取血液样本。在采样后，立即制备柠檬酸化的血浆(0.32％)并将其储存在-20℃直到进行分析为止。在Nes-Ziona的“行动中的科学”中执行研究。评估FVIIa的凝结活性水平，且在Prolor-Biotech执行详细的PK分析。
表57：研究设计05010
实验号05034
以0.9mg/kg体重的剂量按单次皮下注射对SD大鼠进行MOD-5014和
的给药。在给药后的0.5小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、34小时、48小时和72小时交替地从3只大鼠的窦眶眼抽取血液样本。在采样后，立即制备柠檬酸化的血浆(0.32％)并将其储存在-20℃直到进行分析为止。在Nes-Ziona的“行动中的科学”中执行研究。
评估FVIIa的凝结活性水平，且在Prolor-Biotech执行详细的PK分析。
表58：研究设计05034
结果
使用STACLOT VIIa-rTF试剂盒(Stago)量化血液样本中的FVIIa活性。针对每种蛋白计算药代动力学曲线，其是在每个时间点上的3只动物的平均值。
实验号05010
图35A和图35B表示了在
或MOD-5014的IV和SC给药后的FVIIa的PK曲线。在表59中显示了针对每个时间点的FVIIa活性值的总结。与之前的结果相类似地，IV和SC给药具有不同的PK图案，如在图35A和图35B中所显示的。IV注射后的Cmax高于在SC注射后获得的，这是由于在血液中给药之后立即存在有药物(在0.5小时进行测量，表59和表60)。然而，在SC给药后，药物分子转移至胞内基质和组织，因此能够仅在注射后2小时后测量Cmax。在SC给药后的药物的总恢复低于在IV注射后的Cmax值。
在注射后的8小时，
在通过IV或SC注射时表现出相同的PK图案(图35A和图35B)。而且，在12小时后的时间点不可测定到经
处理的小鼠的凝结活性，而经MOD-5014处理的大鼠则继续在给药后的58小时保持可测量的活性(表59和图35A和图35B)。
表59.在IV或SC给药后MOD-5014与
的FVIIa凝结活性
在本底扣除后：15mU/ml。
表60.在IV或SC给药后MOD-5014与
的PK参数
A.IV
| PK参数 | Novoseven RT(A) | MOD-5014(RS 12-001)(B) |
| 半衰期-α(0.5-4小时) | 0.24 | 1.04 |
| 半衰期-β(4-58小时) | 1.31 | 3.17 |
| AUC o-inf mU/ml*小时 | 702467.95 | 820778.67 |
| Vss[U/Kg/(mU/ml)] | 0.13 | 0.13 |
| CL[(U/Kg)/(mU/ml)/小时] | 0.08 | 0.04 |
| MRT(小时) | 1.74 | 3.62 |
B.SC
| PK参数 | Novoseven RT(B) | MOD-5014(RS 12-001)(C) |
| 半衰期(小时) | 1.40 | 7.78 |
| Cmax(mU/ml) | 21385.00 | 12018.33 |
| AUC 0-inf(mU/ml*小时) | 115099.72 | 84158.87 |
| MRT 0-inf(小时) | 4.32 | 7.04 |
| Vz/F(U/Kg)/(mU/ml) | 0.95 | 3.88 |
| Cl/F(U/Kg)/(mU/ml)/小时 | 0.47 | 0.35 |
实验号05034
图36表示了在
或MOD-5017的SC给药后的FVII的PK曲线。与
相比，以相同的浓度或相同的活性单位检查克隆体61的两个不同批次(#75和#81)。在表61中显示了针对每个时间点的FVIIa活性值的总结。
结果表明与之前的实验相应的在SC给药后的类似的PK图案。而且，在12小时后的时间点不可测定到经
处理的大鼠的凝结活性，而经MOD-5014处理的大鼠则继续在给药后24小时保持可测量的活性(表61和图36；在本底扣除后：56mU/ml(8、12小时)或32mU/ml(0.5、2、6、14小时))。
克隆体61批次#81(D)的Cmax(1,301mU/ml)低于克隆体61批次#75(B)和
(A)(分别为3,521mU/ml和5,908mU/ml)的Cmax值，但它们均是按相同的单位活性注射的(表61)。然而，批次#75(B)和#81(D)具有相同的活性单位(分别为559mU/ml和478mU/ml)，其是在注射后8小时进行测量的(表61和表62；56mU/ml(8小时、12小时)或32mU/ml(0.5小时、2小时、6小时、14小时))。
表61：在单次SC给药后的MOD-5014(克隆体61#75、#81)与
的FVIIa凝结活性。
在本底扣除后：56mU/ml(8小时、12小时)或32mU/ml(0.5小时、2小时、6小时、14小时)。
表62：在单次SC给药后的MOD-5014(克隆体61#75、#81)与
的PK参数。
该报告总结了两个PK研究；05010&05034。该结果提供了关于在皮下给药中的CTP至FVII的融合对蛋白半衰期和清除的影响的具体见解以及还提出了在该修饰后的其比活性的范例。在这些研究中，与重组商业FVIIa
相比，对SD大鼠进行源于两个克隆体和两个不同批次的MOD-5014的单次SC注射。按类似的FVIIa浓度(μg/Kg)或按相同的活性水平(U/Kg)注射组分且执行基于PK活性的分析。
第一个研究的目的是验证在IV和SC给药后的不同PK参数。基于该研究，我们能够得出结论，在IV或SC给药后测量的PK图案之间存在差异。在MOD-5014SC注射后测量到7.78小时的t1/2，而在IV注射后仅为4.2小时。AUC值是相同的，表60。
然而，第二个研究集中于在按与
相比的相同的FVIIa浓度或按相同的活性单位注射的MOD-5014克隆体61的两个批次之间的差异。在该研究中，我们发现克隆体61批次#75表现出比批次#81更好的PK参数。由于未知的原因，按相等的单位活性水平注射的批次#81具有更低的Cmax。而且，当按两个不同的剂量(以FVIIa浓度或单位活性计)注射克隆体61批次#81时，测量到了相同的Cmax，而不是在两个活性值之间的2.5倍。在两个研究的共同分析后，我们能够得出结论：克隆体28在SC注射后表现出比克隆体61#75(更好的批次)延长的t1/2参数(分别为7.78小时和5.7小时，表62)。结果显示不同的时间点样本创建了不同的PK图案，这导致了PK曲线的变化。曲线的图案能够使我们更多地了解在血液中的药物行为。因此，我们决定确定类似于通过Baxter测定的那些的时间点(0小时、0.5小时、2小时、6小时、8小时、12小时、24小时、34小时、48小时、72小时)。而且，在05010实验中的FVIIa浓度太高了，而在下列的SC实验中进行了修改(05034)。对于未来的PK研究，决定按360μgFVIIa/kg的剂量注射组分。
实例10：作为用于评估在体内的因子VIIa的模型的经华法林处理的大鼠
材料&方法
PT测定：使SD大鼠口服10mg/Kg的华法林并在指定的时间点收集血浆并使用标准程序测量凝血酶原时间(PT)。为了评估长期止血效果，将安慰剂、
或MOD-5014注射到经华法林处理的动物中，并测量PT。
尾部剪短挑战：在指定的时间点对经华法林处理的动物注射安慰剂、
或MOD-5014，通过完全切断尾尖(在距离尖端0.5cm处)来对动物进行挑战，且在切断后的30分钟以克测量出血强度。
结果
对SD大鼠进行华法林给药导致了PT和aPTT的延长。
华法林防止了维生素K的减少，并因此降低了血液中维生素K依赖性凝固因子的浓度。雄性SD大鼠接受了口服华法林治疗。维生素K依赖性凝固因子的减少伴随着PT和aPTT的延长。在图37中显示了结果。
由于凝固因子从血液洗出，因此PT和aPTT值在华法林给药后的前48小时内逐渐增加。在那之后，效果下降。
华法林的效果能够通过用
或MOD-5014进行急性IV处理来进行恢复。
Sd大鼠接受了华法林的预处理。24小时后，进行MOD-5014、
或缓冲液的静脉注射，且在注射后的15分钟抽取血液样本。注射后的15分钟，MOD-5014以及
成功地将PT值恢复成正常值(图38)。
在经华法林处理的大鼠体内，增加MOD-5014和
的剂量对PT值有影响。
与100-1000μg/Kg的MOD-5014或NoveSeven IV注射相并行地，用10mg/Kg华法林来处理SD大鼠。在处理后的24小时，确定在血浆样本中的PT。在所有测试的剂量中，在PT确定前24小时，注射的
对PT值不具有任何显著的影响。相反地，MOD-5014示出在给药后24小时的剂量反应行为(图39)。
与1000μg/Kg的MOD-5014或NoveSeven IV注射相并行地，用10mg/Kg华法林来处理SD大鼠。在处理后的10小时、24小时、36小时和48小时，确定在血浆样本中的PT。MOD-5014在给药后长达48小时内将PT值恢复至正常值，而
的效应在24小时后则不复存在(图40)。
MOD-5014的长效作用能够通过在注射华法林的大鼠体内的尾部剪短测定来证实。
在尾部剪短前24小时，用华法林处理SD大鼠。将大鼠麻醉并置于温垫上，将尾尖置于37℃的盐水中，且在距离尾尖0.5cm处执行尾部的全部切除。收集血液30分钟且以重量确定失血。
在尾部剪短前15分钟、24或48小时，进行载体或500μg/Kg的MOD-5014或
的给药。在图41中显示了结果。用华法林处理的大鼠比天然大鼠失去5倍多的血液。在注射后的15分钟，经MOD-5014和Novoseven处理的大鼠的尾巴剪短导致了与天然大鼠相比减少的出血。在注射后24小时完全保持了MOD-5014的效果，且在48小时后部分保持了该效果。
MOD-5014的皮下注射也显示出长效作用。
与2000μg/Kg的MOD-5014或NoveSeven SC注射相并行地，用10mg/Kg华法林来处理SD大鼠。在处理后的10小时、24小时、36小时和48小时，确定在血浆样本中的PT。
MOD-5014在给药后长达48小时内将PT值恢复至正常值，而
的效应在24小时后则不复存在(图42)。
MOD-5014的SC注射减少失血达48小时。
在尾部剪短前24小时，用华法林处理SD大鼠。将大鼠麻醉并置于温垫上，将尾尖置于37℃的盐水中，且在距离尾尖0.5cm处执行尾部的全部切除。
收集血液30分钟以重量确定失血。
在尾部剪短前15分钟、24或48小时，进行载体或1000μg/Kg的MOD-5014或
的SC给药。在图43中显示了结果。
实例11：MOD-5014和
的凝结活性的比较性评估
研究目的-(I)为了表征与
相比的MOD-5014在不同条件下的体内凝结活性和FX活化。(II)为了比较在掺入MOD-5014和
之后在人血友病和缺乏FVII的血浆中的离体凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)曲线。
材料和方法
材料-MOD-5014GMP-1：2.5mg/ml(基于A280)和
批号#CU60430:0.943mg/ml(基于A280)
方法-凝结测定
使用市售的Staclot VIIa-rTF试剂盒(参考#00281，Stago)来测量FVIIa的凝结活性。该方法包括使用STA紧凑型MAX或Start4仪器来进行缺乏FVII血浆的凝结时间的测量。在添加磷脂、Ca2+和重组可溶性组织因子(rsTF)之后，将特定量的FVIIa添加至血浆。后者(rsTF)是天然组织因子的胞外部分，其不再能通过自动活化将FVII活化成FVIIa。然而，其具有因子VIIa所特有的辅因子功能。被结合至可溶性组织因子的FVIIa将因子X转换成活性因子Xa。观察到的凝结时间与在血浆中的FVIIa水平成反比关系，这是因为可溶性组织因子未将FVII活化成FVIIa。使用FVIIa标准曲线将所获得的凝结时间转换为活性(mU/ml)，并且基于FVIIa蛋白浓度来计算比活性。在使用仅仅部分地模拟了体内环境的sTF的限制下，该方法提供了FVIIa的潜在体外活性。
方法-FVII显色测定
通过市售试剂盒BIOPHEN FVII(参考#221304，HYPHEN BioMed)来评估MOD-5014和
的效力。这是旨在测试FVII活性的显色测定。FVII与组织因子形成酶复合物，并在磷脂和钙的存在下将因子X转换成活化的因子Xa。因子X以恒定的浓度和过量存在于测定中。活化的因子Xa的浓度是通过其在特定显色底物(SXa-11)上的活性进行测量的，该显色底物进行切割以产生pNA。pNA的量与因子X活性成正比，且在因子VII的量与因子Xa活性水平之间存在正比关系，因子Xa活性水平是通过释放的pNA的量来测量的且是通过在405nm处的显色来确定的。
方法-凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)
凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶原时间(aPTT)是使用Siemens CA-1500自动分析仪测量的且是在A.M.L.使用常规临床人血浆诊断测试进行验证的。
MOD-5014GMP-1:基于A280处的吸收的2.5mg/ml，其用血友病人血浆/缺乏FVII的血浆稀释至0.5-0.0008mg/ml。
FVIIa凝结活性：基于FVIIa Staclot活性测定的16,720U/mg。
FVIIa凝结活性：基于FVIIa Staclot活性测定的50,494U/mg。
基质：人血浆(缺乏FVIII)BIORECLAMATION(目录#HMPLCIT-FACT8DEF，批号#BRH779222-BRH779233)。缺乏FVII的血浆，目录#HBM-DP030K。
结果
效力确定：使用合格的Staclot VIIa-rsTF试剂盒来评估MOD-5014和
的比活性。在下面的表63中显示了如通过4次独立测定所确定的所获得的针对MOD-5014(批次RS005、GMP1、ER01)和
的平均比活性。
表63-MOD-5014和
的比活性
结论：MOD-5014的比活性比
的低2至2.5倍。这可能是在以质量基而非摩尔基进行掺入时FVIIa在MOD-5014中的摩尔含量降低的结果，这是因为MOD-5014是由83.4％FVIIa组成的，该FVIIa具有在C末端附接的3个CTP盒。
在TFPI的存在下的凝结活性的抑制：在组织因子途径抑制剂(TFPI)(FVIIa的天然抑制剂)的存在下评估MOD-5014和
的凝结活性。在添加固定浓度的MOD-5014或
缺乏FVII的血浆、组织因子和磷脂之后，按浓度范围(3125ng/ml至0.006ng/ml)添加抑制剂，且在37℃温育15分钟。观察到的比活性被转换成为抑制％。该测定重复了3次且在表64和图44中显示了平均结果。
表64-在TFPI的存在下的平均活性抑制
结论：TFPI按类似的剂量依赖性方式抑制了
和MOD-5014。如方法确认中所报告的，值的差异可能是测定变化性的结果(％CV≤25％)。
在肝素的存在下的凝结活性的抑制：在大范围的浓度下，在肝素的存在下测量MOD-5014和
的凝结活性。在添加固定浓度的MOD-5014或
缺乏FVII的血浆、组织因子和磷脂后，添加肝素，并在37℃温育15分钟。在表65中显示出结果。
表65-在肝素的存在下的活性抑制
结论：肝素在该特定测定中具有高效力，如即使在极低浓度(0.1U/μl)下也能观察到MOD-5014和
的超过96％的抑制。
在抗凝血酶(AT)的存在下的凝结活性：在作为FVIIa的轻度抑制剂的抗凝血酶III(ATIII)的存在下评估MOD-5014和
的比活性。在添加MOD-5014或
缺乏FVII的血浆、组织因子和磷脂之后，按浓度范围(525μg/ml至0.01ng/ml)添加抗凝血酶，且在37℃温育15分钟。观察到的比活性被转换成为抑制％。在表66和图45中显示出结果。
表66-在AT III的存在下的活性抑制
结论：通过AT III以类似的方式抑制了MOD-5014和
由
和MOD-5014进行的因子X活化：评估MOD-5014和
的效力，并计算获得的针对MOD-5014和
的平均EC50值(分别为0.41ng/ml和0.38ng/ml)。在表67中显示出结果，且在图46中显示出代表性的剂量反应曲线。
表67-由MOD-5014和NovoSeven进行的FX活化
在TFPI的存在下的FX活化：在TFPI的存在下评估MOD-5014和
的效力。后者(TFPI)按浓度范围(20μg/ml至0.002ng/ml)被添加至两个浓度的MOD-5014和
(EC70)(0.6ng/ml和4ng/ml)中，并测量FX活化。在表68和图47中显示出结果。在表69和图48中显示出在4ng/ml的浓度下在
和MOD-5014的存在下执行的测定。
表68-在TFPI(#1)的存在下的因子X的活化
表69-在TFPI(#2)的存在下的因子X的活化
结论：MOD-5014和
在两种浓度的化合物下在TFPI的存在下表现出FX活化的非常类似的抑制曲线。
在TFPI和肝素存在下的FX活化-在TFPI和肝素的存在下评估MOD-5014和
和效力。将在不同浓度(20μg/ml至0.002ng/ml)的TFPI和1U/μl的肝素添加至恒定浓度(0.7ng/ml)的MOD-5014和
且测量FX活化。在表70和图49中显示出结果。
表70-在TFPI和肝素存在下的FX活化
结论：MOD-5014和
在TFPI的存在下表现出类似的FX活化。在添加有TFPI时肝素对抑制曲线没有显著的影响。
在抗凝血酶的存在下的FX活化：在抗凝血酶(AT III)的存在下评估MOD-5014和
的效力。将不同浓度(1.68mg/ml至0.16μg/ml)的AT III添加至恒定浓度(0.7ng/ml)的MOD-5014和
且测量FX活化。在表71和图50中显示出结果。
表71-在抗凝血酶的存在下的FX活化
结论：MOD-5014和
在AT III的存在下表现出类似的FX活化。
在恒定AT III的浓度和变化的肝素浓度的存在下的FX活化：抗凝血酶III(ATIII)被稀释至恒定浓度(20μg/ml)且被添加至恒定浓度(0.7ng/ml)的MOD-5014和
将肝素以不同的浓度(6.25U/μl-0.002U/μl)添加至混合物，并测量FX活化。在表71和图51中显示出结果。
表71-在不同浓度的肝素的存在下的FX活化
结论：在恒定的AT III浓度下，MOD-5014和
表现出由肝素实现的类似且中度的抑制。
PT和aPTT测量
在表72中显示出PT和aPTT测量。
表72
结论：当以类似的浓度范围掺入时，MOD-5014和
的PT和aPTT的测量是相当的。
在恒定的肝素浓度和变化的AT浓度的存在下的FX活化
研究目的
为了比较在抗凝血酶的存在下以及在恒定的肝素浓度下的MOD-5014和NovoSeven活化FX的能力。
研究设计和结果
在抗凝血酶(AT)和肝素的存在下评估MOD-5014和NovoSeven的效力。将不同浓度(1.68mg/ml至0.032μg/ml)的AT和1U/μl的肝素添加至恒定浓度(0.7ng/ml)的MOD-5014和NovoSeven，且测量FX活化。对于所获得的抗凝血酶的IC50值，MOD-5014的为49.65μg/ml且NovoSeven的为65.70μg/ml。在表121和图52中显示出结果。
表121：在AT和肝素存在下的FX活化
结论：MOD-5014和NovoSeven在AT和1U/μl的肝素的存在下表现出类似的FX活化，这表明AT对FVIIa抑制具有比肝素显著的更明显的影响。
比较性PT和aPTT测量
研究目的
为了比较在MOD-5014和NovoSeven掺入后在人血友病和缺乏FVII的血浆中的PT&aPTT曲线。
研究设计
PT和aPTT是使用Siemens CA-1500自动分析仪测量的且是在A.M.L.使用常规临床人血浆诊断测试进行验证的。MOD-5014GMP-1:基于A280处的吸收的2.5mg/ml，其用血友病人血浆/缺乏FVII的血浆稀释至0.5-0.0008mg/ml。
FVIIa凝结活性：基于FVIIa Staclot活性测定的16,720U/mg。
NovoSeven批号#CU60430:基于A280处的吸收的0.943mg/ml，其用血友病人血浆/缺乏FVII的血浆稀释至0.5-0.0008mg/ml。FVIIa凝结活性：基于FVIIa Staclot活性测定的50,494U/mg。
基质：
·人血浆(缺乏FVIII)BIORECLAMATION(目录#HMPLCITFACT8DEF，批号#BRH779222-BRH779233)。
·缺乏FVII的血浆，目录#HBM-DP030K。
以0.5-0.0008mg/ml的浓度将MOD-5014和NovoSeven掺入上述基质中，
且测量PT和aPTT。在表122中总结了结果。
表122：PT和aPTT测量
结论：当以类似的浓度范围掺入时，MOD-5014和NovoSeven的PT和aPTT的测量是相当的。
总结
通过多种体外和离体方法评估MOD-5014活性，所述方法其评估了与相同质量的
相比的其凝固活性的不同方面。最初，在合格的Staclot FVIIa测定中将MOD-5014的活性与
进行比较。研究表明MOD-5014的活性比NovoSeven的低2至2.5倍。在TF、磷脂和钙的存在下由显色测定进行的因子X活化测试还提出了与
相比的MOD-5014活性的稍低的测量，如由EC50所反映的。
在方法之间的变化性可能是由于在测定灵敏性或终点方面的差异导致的(分别为可溶性与全链TF和凝结时间与OD测量)。较低的MOD-5014活性可能是由于84.4％的MOD-5014对应于FVIIa且15.6％对应于CTP的事实。
在TFPI(其为外源性凝固途径的主要的FXa依赖性抑制剂)的存在下的MOD-5014失活是通过上述两种体内测定(Staclot和因子X活化)来进行评估的。用增加浓度的TFPI温育在两个固定浓度的MOD-5014或
导致了凝结或FXa酶活性的剂量依赖性的降低。两种化合物表明了非常类似的失活模式，这是由％凝结抑制反映的。
之前报告了抗凝血酶III以缓慢的速率抑制因子VIIa，且还表现出在肝素存在下的增强的抑制。当两种化合物掺有增加浓度的AT III时，抗凝血酶III表现出对MOD-5014和
的类似的抑制模式。在添加肝素后维持这种模式，这产生了明显的抑制作用。
实例12：对MOD-5014和
在凝血酶生成和凝固效率中的比较性体外评估
研究目的-(I)通过在低和高磷脂浓度下的具有高效价的抑制性抗体的富含抑制性血小板的血浆中的凝血酶生成(TG)对MOD-5014和
进行比较性评估，以及(II)通过在具有高效价的抑制性抗体的富含抑制性血小板的血浆中的血栓弹性描记术(TEG)对MOD-5014和
进行比较性评估。
材料和方法
材料-MOD-5014：2.0mg/ml和
1.0mg/ml，冷冻储存(-60至-80℃)。不需要制备剂量制剂。材料在给药之前仅解冻一次。
方法-在低和高磷脂浓度下的凝血酶生成(TG)
将源于具有高效价的抗FVIII的抑制性Ab的患者的人血浆掺入增加浓度的MOD-5014或
通过再脂化的rh组织因子(TF)和模拟体内情况的高浓度的磷脂胶束(试剂RChigh)来刺激凝固。
方法-血栓弹性描记术(TEG)
血栓弹性描记术(TEG)是一种测试在血液中的凝固效率的方法http:// en.wikipedia.org/wiki/Coagulation http://en.wikipedia.org/wiki/Blood且在外科和麻醉学中特别重要http://en.wikipedia.org/wiki/Surgeryhttp:// en.wikipedia.org/wiki/Anesthesiology。凝块中强度和弹性的变化模式提供了关于血液能够如何好地执行止血(血流的停止)以及不同因子是如何良好地或不良地促成凝块形成的信息。
表示凝块形成的四个值是由这个测试确定的：R值(或反应时间)、K值、角度和MA(最大幅度)。R值表示直到测定到凝块的第一个证据为止的时间。K值为从R结束到凝块达到20mm的时间，且这表示凝块形成的速度。角度为在达到K时所制曲线的切线且提供了与K类似的信息。MA反映凝块强度。
结果
凝血酶生成：凝血酶的生成是凝结级联的基本部分，因此对特定个体能够如何好地生成凝血酶的估计可能与出血或血栓形成的风险相关。其描述了凝血酶生成过程的所有阶段(凝血酶生成的开始、扩增和抑制以及所生成的凝血酶的整体量)。根据所使用的实验系统，凝血酶生成可能受到在体内血液凝固中发挥作用的大部分因子的影响。
通过Technoclone TGA来监测凝血酶生成的动力学(图53)。
在掺有MOD-5014或Novoseven之后观察到了峰值凝血酶的剂量依赖性增加以及滞后期和峰值时间的减少。
在第二个实验中，MOD-5014或
是在TF的存在下和在低浓度的磷脂胶束(试剂RClow)的存在下以增加的浓度进行掺入的。
如预期的那样，当以高PL浓度掺入样本时，观察到了更明显的休止。两种化合物在低PL浓度下都达到了最大TG反应，这进一步确认了其对于凝结级联的适当活化的重要性。如在图53和图54中显示的结果表明，MOD-5014的体外凝血酶生成活性与在高和低PL浓度下的
相比略低且与在PPP的缺乏FVIII的血浆中获得的数据相匹配。
凝固效率：将MOD-5014和
加入到高效价的人FVIII抑制剂富血小板血浆(PRP)中，并加入CaCl2和rhTF凝血致活酶来触发凝块形成。评估R和角度。如在图55A和图55B中所观察到的，MOD-5014和
以类似的浓度依赖性方式减少了凝结时间(R)并增加了高效价的FVIII抑制剂血浆的凝块形成速率(角度)，同时MOD-5014表现出其凝结能力稍有下降。这些发现进一步加强了由ROTEM获得的结果，即CTP附接不会干扰凝块形成。
总结
基于FVIII高效价的血浆中的TG和TEG结果，看起来TG和凝块形成的MOD-5014机制可能类似于活性稍微降低的
这可能是在以质量基而非摩尔基进行掺入时FVIIa在MOD-5014中的摩尔含量降低的结果，这是因为MOD-5014是由83.4％FVIIa组成的，该FVIIa具有在C末端附接的3个CTP盒，因此将需要稍高浓度的MOD-5014以维持体内止血。最后，看起来在将CTP附接至FVIIa之后可以维持结合至磷脂的机制。
实例13：MOD-5014和
的比较性体外活性
研究目的-(I)通过在柠檬酸化的贫血小板血浆(PPP)中的凝血酶生成(TG)进行MOD-5014和
的比较性评估。(II)通过在柠檬酸化的PPP中的凝血酶生成进行MOD-5014和
组织因子(TF)亲和性的比较性评估。(III)通过在PPP柠檬酸化的血浆中的血栓弹性描记术(ROTEM)进行MOD-5014和
的比较性评估。
材料和方法
材料-MOD-5014：2.6mg/ml和
2.6mg/ml，冷冻储存(-60至-80℃)。不需要制备剂量制剂。材料在给药之前被解冻至室温。
方法(目的(I))-在低和高磷脂浓度下的凝血酶生成(TG)
根据Livnat等(2006，血栓形成与止血，4(1):192-200；2008,血友病，14(4):782-786；以及2011，血栓形成与止血，105(4):688-95)测量凝血酶生成。简而言之，将混合的血浆掺有递增浓度的MOD-5014或
使用低浓度的PPP试剂(含有1μM组织因子)或MP试剂(Diagnostica Stago，批号分别为PPL 1203/01和MPR 1202/01)作为工作缓冲液。两种试剂均含有4μM的磷脂。
使用如下的两种方式进行测定：(a)仅再钙化；以及(b)低TF水平(1pM)。
将20μl的工作缓冲液置于圆底96孔微量滴定板中。将80μl具有不同浓度的
或MOD-5014的缺乏FVIII的血浆加入缓冲液中，如在表73中所述。
表73
*基于Livnat等，2008。
TG是通过加入20μl的荧光底物/CaCl2缓冲液(FluCa-试剂盒凝血酶生成分析-BV，Diagnostica Stago，批号FLB 1303/01)来发起的。使用在390nm处的激发滤光片和在460nm处的发射滤光片以及荧光计(Fluoroskan Ascent，实验室系统，赫尔辛基，芬兰)来测量荧光。结果被显示为图和衍生参数，即，滞后时间、内源性凝血酶生成潜力(ETP)和峰高，且使用专门的计算机软件(版本3.0.0.29，凝血酶生成分析-BV，马斯特里赫特，荷兰)进行计算。每个样本独立地以复本(运行1和运行2)进行两次测试。提供了复本的平均值，并将其与凝血酶标准进行比较(凝血酶校准物，Diagnostica Stago,批号TC 1208/01)。
方法-(目的(II))-凝血酶生成(TG)
根据Livnat等(2006、2008、2011)来测量凝血酶生成。简而言之，将混合的血浆掺入3个相当低的递增浓度的MOD-5014或
以使得能够进行更灵敏且更具剂量依赖性的反应(1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml)。含有4μM磷脂的MP试剂被用作工作缓冲液。每个指定的样品掺有递增浓度的TF，如在下面的表74中所述的，且评估TG。
表74
*基于Livnat等，2008。
通过测量ETP、滞后时间和凝血酶的峰高来评估在指定浓度的TF的每种测试物质的TG。每个样本独立地以复本(运行1和运行2)进行两次测试。提供复本的平均值。
方法-目的(III)-旋转血栓弹性描记术(ROTEM)
将源于严重的缺乏FVIII的患者的混合血浆掺有如表75所述的4个浓度的
或MOD-5014，且在下列条件下进行评估：(a)添加高岭土；(b)具有低水平的TF；(c)重新分类。
表75
以使用被置于杯中的300μL的缺乏FVIII的血浆的ROTEM装置(Pentapharm，慕尼黑，德国)进行ROTEM测量，接下来添加20mM的CaCl2、(NATEM)、变应性酸(接触活化，INTEM)或低浓度的组织因子(按1∶1700稀释的EXTEM试剂)。根据制造商的说明在37℃执行ROTEM测试并使其运行至少45分钟。使用下列变量：凝血时间(CT，秒)，即，引入CaCl2和凝结开始之间的时间；反映凝块传播的α角(α角，度)；以及最大的凝块硬度(MCF，mm)，其反映了凝块强度。
结果
目的(I)：通过凝血酶生成(TG)进行MOD-5014和
的比较性体外评估
凝血酶生成经常用于评估FVIIa的止血效果。先前示出FVIIa介导了在FVIII抑制剂血浆样品中凝血酶生成(TG)的变化。在掺有重组FVIIa(rFVIIa)的血浆样本中，在不存在组织因子(TF)的情况下改进了TG，而作为添加的TF的结果，增加了rFVIIa的体外TG的可能性。由于其作用机制的复杂性，简单的经典药代动力学测定不可用于FVIIa。由于凝血酶是产生的最终产物，TG测定可以用于评估MOD-5014和
的药代动力学和潜在功效。该测定适用于监测在治疗期间的抑制剂旁路剂的药代动力学且可以用于预测对治疗的反应。因此，对血浆中产生的凝血酶浓度的实时测量给出了关于凝固系统的体内平衡的有价值的信息。
该研究的目的是比较在浓度范围中的重度血友病A血浆中的MOD-5014和
的体外凝血酶生成能力，该浓度范围可能与人类首次(FIH)研究中提出的临床剂量相关。这可以提供作对为人类首次(FIH)研究的制剂的一部分的最小有效剂量的预测。
在再钙化之后的比较性凝血酶生成
按大范围的浓度将MOD-5014和
掺入重度血友病A的混合血浆中。该研究重复两次，且在下面的表76-表79和图56、图57、图58的A-E、图59的A-D、图60、图61、图62的A-E和图63的A-D中提供了结果。
表76(运行#1)图56的
的衍生值
| 1.25μg/ml | 2.5μg/ml | 5μg/ml | 10μg/ml | 15μg/ml | |
| 滞后时间 | 29.5 | 20.67 | 15.83 | 12.33 | 11.15 |
| 滞后时间SD | 2.17 | 0 | 0.5 | 0.33 | 0.17 |
| ETP | 141 | 242 | 460 | 727 | 659.5 |
| ETPSD | 13 | 0 | 115 | 54 | 15.5 |
| 峰值 | 6.2 | 11.45 | 20.33 | 33.45 | 39.85 |
| 峰值sD | 0.66 | 0 | 2.32 | 0.03 | 1.34 |
| tt峰值 | 44.17 | 33.67 | 28.5 | 22.83 | 21.33 |
| tt峰值SD | 1.83 | 0 | 0.5 | 0.5 | 0 |
| 开始尾部 | 76 | 76 | 73 | 71.5 | 74 |
| 开始尾部SD | 0 | 0 | 2 | 3.5 | 0 |
| 编辑的 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 |
表77(运行#1)图57的MOD-5014的衍生值
| 滞后时间 | 37.33 | 29.33 | 20.17 | 16.17 | 13.67 |
| 滞后时间SD | 0.67 | 0.33 | 0.5 | 0.5 | 0 |
| ETP | 108.5 | 144.5 | 295 | 426 | 623.5 |
| ETPSD | 2.5 | 0.5 | 39 | 19 | 179.5 |
| 峰值 | 4.85 | 6.85 | 12.32 | 20.32 | 26.57 |
| 峰值SD | 0.15 | 0.11 | 0.34 | 0.76 | 2.46 |
| tt峰值 | 52.5 | 42.83 | 34 | 28 | 25.33 |
| tt峰值SD | 0.83 | 0.5 | 0.33 | 0.67 | 1 |
| 开始尾部 | 76 | 76 | 75 | 72.5 | 76 |
| 开始尾部SD | 0 | 0 | 0 | 0.5 | 0 |
| 编辑的 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 |
表78(运行#2)图60的
的衍生值
| 1.25μg/ml | 2.5μg/ml | 5μg/ml | 10μg/ml | 15μg/ml | |
| 滞后时间 | 18.7 | 13.85 | 12.35 | 10.35 | 8.68 |
| 滞后时间SD | 0 | 0.5 | 0.67 | 0.33 | 0.33 |
| ETP | 226 | 269 | 363.5 | 554.5 | 756 |
| ETPSD | 0 | 16 | 26.5 | 76.5 | 31 |
| 峰值 | 8.96 | 11.45 | 17.61 | 29.23 | 46.22 |
| 峰值SD | 0 | 0.8 | 1.64 | 2.03 | 4.13 |
| tt峰值 | 33.72 | 29.04 | 25.04 | 21.2 | 18.19 |
| tt峰值SD | 0 | 0.67 | 0.67 | 0.17 | 0.5 |
| 开始尾部 | 75 | 75 | 69 | 57 | 43.5 |
| 开始尾部SD | 0 | 0 | 2 | 10 | 0.5 |
| 编辑的 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 |
表79(运行#2)图61的MOD-5014的衍生值
| 滞后时间 | 30.05 | 20.2 | 15.36 | 12.19 | 10.18 |
| 滞后时间SD | 0 | 0.17 | 0.33 | 0.5 | 0.17 |
| ETP | 118 | 179 | 300.5 | 406.5 | 602.5 |
| ETPSD | 0 | 1 | 18.5 | 19.5 | 111.5 |
| 峰值 | 4.36 | 7.2 | 12.86 | 19.8 | 28.55 |
| 峰值SD | 0 | 0.18 | 0.42 | 0.73 | 3.15 |
| tt峰值 | 46.74 | 35.55 | 28.88 | 24.54 | 21.37 |
| tt峰值SD | 0 | 0.83 | 0.17 | 0.17 | 0.33 |
| 开始尾部 | 76 | 76 | 74.5 | 67.5 | 69.5 |
| 开始尾部SD | 0 | 0 | 0.5 | 0.5 | 5.5 |
| 编辑的 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
在添加两种化合物之后，观察到了剂量依赖性的反应。在推测分别模拟40μg/kg和
80μg/kg的1.25μg/ml-2.5μg/ml的低浓度下，观察到了不良TG，如通过增加的滞后和减少的ETP所反映的(图56、图57、图60和图61)。尽管较高的浓度在TG曲线中提供了明显的改进，但所测试的化合物都不能提供TG的完全恢复，如用FVIII所获得的(图71和图72；表80)。
表80(图72的衍生值)
| FVIII+低TF | FVIII | |
| 滞后时间 | 6.17 | 11.33 |
| 滞后时间SD | 0.17 | 0.33 |
| ETP | 1869 | 1604 |
| ETPSD | 1 | 48 |
| 峰值 | 323.34 | 233 |
| 峰值SD | 13.43 | 17.69 |
| tt峰值 | 8.67 | 15.5 |
| tt峰值SD | 0 | 0.17 |
| 开始尾部 | 27.5 | 33.5 |
| 开始尾部SD | 0.5 | 0.5 |
| 编辑的 | 0 | 0 |
这些结果与所发布的研究相一致并表明hFVIIa与用于凝血酶校正的其他替换疗法相比作为旁路剂来说不那么有效，这由较低TG峰、ETP和其他参数所证实。叠加分析(图58的A-E、图59的A-D、图62的A-E和图63的A-D)表明与
相比MOD-5014TG的反应稍微降低，这主要表现为增加的滞后时间和较低的凝血酶峰(估计比
的低30-40％)。这可能是在以质量基而非摩尔基进行掺入时FVIIa在MOD-5014中的摩尔含量降低的结果，这是因为MOD-5014是由83.4％FVIIa组成的，该FVIIa具有在C末端附接的3个CTP盒。两个独立运行彼此是一致的，其提供了具有微小变化的类似结果。
在低TF浓度下的比较性凝血酶生成
当重度血友病A混合血浆掺入低水平的TF时，观察到了背景TG反应随着MOD-5014和
浓度在测试样本中的增加而增加。(图64、图65、图66的A-E、图67、图68、图69的A-E、图79的A-C；表81-84)
表81(图64的
衍生值)
| μg | 对照 | 1.25μg/ml | 2.5μg/ml | 5μg/ml | 10μg/ml | 15μg/ml |
| 滞后时间 | 7.33 | 4.33 | 4.17 | 4.17 | 4.17 | 4.17 |
| 滞后时间SD | 0 | 0 | 0.17 | 0.17 | 0.17 | 0.17 |
| ETP | 592 | 880 | 903 | 1003.5 | 1256.5 | 1350 |
| ETPSD | 0 | 83 | 34 | 63.5 | 77.5 | 72 |
| 峰值 | 28.6 | 46.23 | 51.39 | 62.15 | 77.12 | 92.79 |
| 峰值SD | 0.81 | 0.74 | 0.87 | 3.23 | 1.02 | 5.15 |
| tt峰值 | 17.33 | 12.83 | 12.33 | 12.33 | 12 | 11.5 |
| tt峰值SD | 0.67 | 0.17 | 0 | 0 | 0 | 0.17 |
| 开始尾部 | 59 | 64 | 57 | 44.5 | 49 | 64 |
| 开始尾部SD | 1 | 0 | 7 | 0.5 | 2 | 0 |
| 编辑的 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 |
表82(图65的MOD-5014衍生值)
| 1.25μgml | 2.5μg/ml | 5μg/ml | 10μg/ml | 15μg/ml | |
| 滞后时间 | 4.33 | 4.17 | 4.17 | 4.33 | 4.17 |
| 滞后时间SD | 0 | 0.17 | 0.17 | 0 | 0.17 |
| ETP | 699.5 | 822.5 | 932 | 1088 | 1223.5 |
| ETPSD | 6.5 | 39.5 | 11 | 31 | 26.5 |
| 峰值 | 40.28 | 49.32 | 53.53 | 64.13 | 72.19 |
| 峰值SD | 0.41 | 1.91 | 1.72 | 3.65 | 2.76 |
| tt峰值 | 12.67 | 12.33 | 12.83 | 12.83 | 12.17 |
| tt峰值SD | 0.33 | 0 | 0.17 | 0.17 | 0.17 |
| 开始尾部 | 50.5 | 60.5 | 47.5 | 48 | 49.5 |
| 开始尾部SD | 1.5 | 3.5 | 2.5 | 1 | 1.5 |
| 编辑的 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 |
表83(图67的
衍生值)
| 对照 | 1.25μg/ml | 2.5μg/ml | 5μg/ml | 10μg/ml | 15μg/ml | |
| 滞后时间 | 6.17 | 3.5 | 3.67 | 3.67 | 3.67 | 3.67 |
| 滞后时间SD | 0.17 | 0.17 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| ETP | 526.5 | 671.5 | 790.5 | 795 | 928 | 955 |
| ETPSD | 7.5 | 13.5 | 11.5 | 5 | 27 | 44 |
| 峰值 | 25.34 | 40.13 | 46.66 | 53.84 | 61.35 | 65.69 |
| 峰值SD | 1.4 | 0.4 | 0.47 | 0.13 | 0.18 | 0.66 |
| tt峰值 | 16 | 11.83 | 11.5 | 11.5 | 11.67 | 11.33 |
| tt峰值SD | 0.33 | 0.17 | 0.17 | 0.17 | 0 | 0 |
| 开始尾部 | 56.5 | 53.5 | 56 | 36.5 | 41 | 44 |
| 开始尾部sD | 1.5 | 0.5 | 8 | 2.5 | 2 | 2 |
| 编辑的 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 |
表84(图68的MOD-5014衍生值)
| 1.25μg/ml | 2.5μg/ml | 5μg/ml | 10μg/ml | 15μg/ml | |
| 滞后时间 | 4 | 3.83 | 4 | 4 | 3.83 |
| 滞后时间SD | 0 | 0.17 | 0.33 | 0.33 | 0.5 |
| ETP | 587 | 657.5 | 723.5 | 761 | 833.5 |
| ETPSD | 11 | 21.5 | 49.5 | 4 | 94.5 |
| 峰值 | 35.35 | 38.62 | 42.52 | 49.28 | 51.34 |
| 峰值SD | 0.15 | 1.51 | 4.87 | 3.88 | 7.12 |
| tt峰值 | 11.83 | 12.17 | 13 | 12.67 | 12.33 |
| tt峰值SD | 0.17 | 0.17 | 0.67 | 1 | 1 |
| 开始尾部 | 48 | 52 | 51 | 39.5 | 64 |
| 开始尾部SD | 1 | 2 | 6 | 7.5 | 0 |
| 编辑的 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 |
在这项研究中观察到了两种产品的剂量依赖性反应的类似模式；然而，由于由TF实现的反应增强，获得了更大的幅度。而且，与再钙化研究相比，MOD-5014显示出降低的活性更为明显，这需要更高的MOD-5014浓度以在两者之间提供合适的叠加(图66的A-E和图70的A-C)。为了进一步研究这一点，执行体外研究，这进一步地研究了MOD-5014和FVIIa对TF的亲和性及其对TG的作用，如下所述。
结论：当被掺入重度血友病A的混合血浆中时，这两种产品均表现出剂量依赖性TG反应，其中在模拟40-80μg/kg临床剂量的浓度下具有初始不良反应。据推测，这些结果表明低于40-80μg/kg的剂量将不会提供足够的体内反应。此外，当按与
相似的浓度掺入时，MOD-5014表现出降低的TG性能，这表明在临床环境中可能需要稍微增加的浓度(30-40％)以提供与
相当的适当的初始止血效果。
目的(II)：对MOD-5014和
对TF的亲和性的比较性体外评估
FVIIa似乎具有至少两种独立的效应机制：组织因子(TF)依赖性FVIIa介导的因子X(FX)(其是凝固的外在途径的经典诱导剂)的活化，以及单核细胞或血小板的内源性磷脂(PL)表面上的高剂量FVIIa的TF非依赖性活性。当与
相比时，MOD-5014表现出降低的活性，这在TF存在的情况下，更加明显。需要更高的MOD-5014浓度以在两种化合物之间提供合适的叠加(图66的A-E和图70的A-C)。虽然之前报告了MOD-5014对TF的亲和性类似于
的，如通过SPR和体外活化测定所测量的，但该研究的目的是进一步通过TG研究MOD-5014和FVIIa对TF的体外亲和性。
在存在递增浓度的TF的情况下，按递增的浓度范围将MOD-5014和
掺入重度血友病A的混合血浆中。该研究重复两次，且在图73、图74的A-E、图75、图76的A-E、图77、图78的A-E、图79的A-C、图80的A-C、图81、图82、图83、图84的A-C、图85的A-C、图86的A-E、图87的A-E、和图88的A-E和表85-90中提供每个运行的结果。
表85(图73的衍生值)
表86(图75的衍生值)
表87(图77的衍生值)
表88(图81的衍生值)
表89(图82的衍生值)
表90(图83的衍生值)
掺有具有固定剂量的
或MOD-5014的浓度增加的TF提供了TG性能的TG依赖性增加，如通过减少的滞后时间和增加的ETP和凝血酶选择所反映的(图79的A-C、图80的A-C、图87的A-E和图88的A-E)。对于在所有剂量和低于5pM的TF浓度下的两种化合物而言，观察到了不良至中度的TG反应，如通过延长的滞后时间和减少的ETP所反映的。较高浓度的TF(5pM)在TG曲线中提供了明显改进(图79的A-C、图80的A-C、图87的A-E和图88的A-E)。然而，所测试的化合物都不能提供TG的完全恢复，如用FVIII所获得的(图71和图72以及表82)。有趣的是，在恒定TF水平下增加
或MOD-5014的浓度不能改进TG性能(图79的A-C、图80的A-C、图87的A-E和图88的A-E)，这进一步强调了TF对于两种化合物的适当活性的重要性。
通过叠加分析(图74的A-E、图76的A-E、图78的A-E、图82、图85的A-C、图86的A-E；表89)进行的MOD-5014和
的TG曲线的比较表明在不具有TF或在非常低的TF浓度(0.5pM)的情况下MOD-5014的反应略微降低了(估计低20-30％)。随着TF水平的增加，在两次重复的所有MOD-5014和
浓度下都观察到了类似的反应(图74的A-E、图76的A-E、图78的A-E、图82、图85的A-C、图86的A-E；表89)。
结论：该研究通过在递增浓度的TF的存在下掺入固定浓度的两种化合物进一步证实了体外结果。样品中TF的量对增加的TG反应负主要责任，这进一步证实了在MOD-5014和
之间的生物学相似性。
目的(III)使用旋转血栓弹性描记术(ROTEM)对MOD-5014和
活性的比较性评估
在过去的十年，血栓弹性描记术成为了监测凝血病止血、输血和凝结因子替换疗法的有价值的工具。在这个方面，血栓弹性描记术已被用于血友病、因子VIII或IX替换疗法中，以及对aFVIIa在具有抑制剂的血友病患者体内效果的评估中。ROTEM可以用于评估凝固和抗纤溶剂在血小板减少症、Glanzmann血小板无力症和血液稀释中的效果。该研究的目的是比较在重度血友病A血浆中在浓度范围中的MOD-5014和
的体外ROTEM性能，该浓度范围与提出的临床剂量相关且评估了作为FIH研究的制剂的一部分的最小有效剂量。
在表91和图92中显示出实验的结果。
表91：使缺乏FVIII的血浆掺有因子VIII
表91示出没有FVIII且在使血浆掺有FVIII(1U/mL)之后的血浆凝结，FVIII在研究中被用作对照化合物。在NATEM测试中，在完整的血浆中没有观察到凝结，而在使血浆样本掺有FVIII之后则稍有凝块形成。相反地，在INTEM测试中，在完整的和处理的血浆中发生了凝块形成，而在后者中其则强得多(CT较短，且α角为8倍高)。最大的凝块硬度(MCF)略有增加。这些结果表明，内在系统(INTEM)可能是用于评估FVIII替换在血友病A中的作用的有用测试。
表92：MOD-5014和Novo Seven在缺乏FVIII的血浆中对凝块形成的影响
nd-未确定
表92显示了FVIIa在缺乏FVIII的血浆中对凝块形成的影响。
具有血浆的接触活化的再钙化(INTEM测试)：与未处理的血浆相比，在用2.5μg/mL和10μg/mL的两种类型的FVIIa处理的血浆中，CT更短且α角逐渐增加。通过将FVIIa浓度增加至15μg/mL，在凝块形成中的变化与用10μg/mL的FVIIa处理的血浆没有差异。在MOD-5014和NovoSeven的活性之间没有发现差异。
具有外在途径的活化的再钙化(EXTEM测试)：与未处理的血浆相比，在经MOD-5014和NovoSeven两者处理的血浆中的CT减少且MCF增加。在以2.5μg/mL和10μg/mL的两种试剂处理的血浆中观察到凝块传播(α角)的类似程度的增加，且在15μg/mL没有进一步的变化。
结论：在用于比较MOD-5014和NovoSeven的活性的不同ROTEM测试中，INTEM似乎是最可靠的测试。模拟80μg/kg的体内剂量的2.5μg/ml的剂量导致了两种化合物的低反应性，如由与未处理的血浆相比的略微减少的凝结时间和增加的α角(其是使用INTEM和EXTEM进行测试的)所反映的。将MOD-5014和
的浓度增加至10μg/ml和25μg/ml，随后对凝块形成产生剂量依赖性的刺激作用。结果还表明任一试剂对凝块形成的影响没有本质差异，两种试剂提供了非常类似的ROTEM值。
实例14：对MOD-5014在患有血友病A(FVIII缺乏症)的狗体内的药代动力学、药效学及血友病性凝血病的纠正的评估
研究目的-该研究的目的是评估和表征MOD-5014在患有重度血友病A(FVIII缺乏症，<0.01％FVIII)的狗体内的药代动力学、药效学和血友病性凝血病的纠正。
测试系统的理由
Chapel Hill血友病A狗菌落具有的优点是在FVIII生物测定和显色测定中没有可测定到的FVIII活性，且ELISA表明具有很少或没有FVIII抗原(<0.005U/ml)。过去，该模型已被用作不同凝结因子的非临床药理学表征的一部分。已经提出，该模型能够在特定的止血区域内提供人类生物学的准确概括并提供与在之前在人类研究中观察到的那些相类似的PK/PD参数。此外，用作评估整体止血功能障碍或临床环境的校正的筛选工具的TEG已被示为在该模型中的预测工具，且表明了在人和狗止血之间的进一步的相关性。
材料和方法
材料-MOD-5014：2.6mg/ml，冷冻储存(-60至-80℃)。不需要制备剂量制剂。材料在给药之前被解冻至室温。
将预先配制的给药制剂进行无菌处理且按接收到的样子进行给药；不需要制备剂量制剂。测试物质(MOD-5014)在给药之前仅解冻一次。将测试物质从冷冻储存取出并在给药之前解冻至室温。
方法：离体阶段：离体阶段是根据Knudsen等，2011，血友病，17(6)：962-970进行的，以建立将支持体内研究的剂量选择的最小有效剂量。
在第一阶段中，执行了被掺入源于两只个体缺乏FVIII的狗的新鲜血液中的MOD-5014的剂量依赖性离体全血凝结时间(WBCT)和血栓弹性描记术(TEG)评估。显着改进了TEG和WBCT性能的MOD-5014的最低剂量被认为是最小有效剂量。基于第一阶段和最小有效剂量的建立，选择用于体内第二阶段的剂量。
从两个个体FVIII血友病狗抽取新鲜犬血并进行独立分析以确认结果的再现性。简而言之，将15mL犬血抽入注射器中，转移至锥形管中且掺入MOD-5014至0.568μg/mL、1.136μg/mL、2.273μg/mL、4.545μg/mL和9.909μg/mL的最终浓度，其与在缺乏FVIII的狗体内进行50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg、800μg/kg的MOD-5014给药后的预期体内Cmax相关，假定如下：犬的体重估计为20千克，且每只动物的血液量为40mL/lb(88mL/kg)。
在添加测试材料的<5分钟内测定源于这些掺加的血液，如下所述：
步骤1：全血凝结时间(WBCT)：将掺有MOD-5014至指定的最终浓度的1ml血液用于WBCT。简而言之，全血凝固时间(WBCT)是在28℃的水浴中使用两个硅化玻璃管(VacutainerTM#6431，Becton-Dickinson，卢瑟福，新泽西)的对Lee-White凝结时间的修饰。将掺有指定浓度的MOD-5014的1mL全血平均分于两个硅化管中。启动计时器。一分钟后，每30秒钟倾斜一个管，而另一个管则保持不受干扰。当在倾斜的管中形成凝块时，随后每30秒倾斜第二个管直到形成凝块为止。将在第二个管中形成完全胶凝的凝块的时间记录为WBCT。在天然血友病A的狗体内，WBCT通常>40分钟，但也能够>60分钟。如果值超过60分钟，则停止测试。
步骤2：血栓弹性描记术：将掺有MOD-5014至指定的最终浓度的1ml血液与高岭土(由Haemoscope提供的批号#)相混合，并将360μl的该混合物置于杯中以进行测试。允许进行约90分钟的TEG记录。在下面的表93中提供了TEG值的典型范围。
表93-血栓弹性描记术的典型的值的范围
表现出显著凝结改进的最低剂量将被用作体内研究的初始剂量，其提出对如在研究的II阶段中以及通过使用如下所述的不同测定所测量的血液凝结和止血进行适当的监测。
方法：体内阶段：在该研究中使用六只重约20kg的天然的混合品种的Chapel Hill血友病A狗(Canis familiaris)。狗接受MOD-5014的50μg/kg(N＝2)、200μg/kg(N＝4)、400μg/kg(N＝2)或600μg/kg(N＝2)的IV剂量。以5分钟的IV输注给予剂量。在给药前以及在给药后0.25小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、32小时、48小时、72小时和96小时通过对头静脉的经皮穿刺来收集血液样本以用于浓度和活性测量。在长达8天的时间内对四只狗进行两次MOD-5014的给药，且对另外两只狗进行一次给药。该研究被设计为剂量交错上升的研究，即，在每次注射后，以实时凝结分析来确定下一个剂量的时间。
在体内阶段中，分析MOD-5014的药代动力学和药效学，并评估WBCT、血栓弹性描记术、aPTT、基础临床病理学和临床观察(基于动物行为)。对测试物质进行生物分析评估。
体内阶段-部分A
在第一部分中，在第一天以50μg/kg的初始剂量对2只天然的狗注射MOD-5014，并监测WBCT和TEG性能。一旦这些值返回基线(给药前)，则注射为200μg/kg的第二剂量的MOD-5014。表94显示出部分A的概况。
表94-研究设计部分A
体内阶段-部分B
在第二部分中以及在完成部分A之后，在第一天对另外两只天然的狗进行注射。再次监测动物的WBCT和TEG性能。一旦那些值返回基线(给药前)，则注射第二剂量。表95显示出部分B的概况。
表95-研究设计部分B
体内阶段-部分C
在部分B中以及在完成部分A之后，在第一天对另外两只天然的狗进行注射(表96)。
表96-部分C的研究设计
给药途径的理由
静脉途径是该测试物质在人体内的预期给药途径。
剂量水平的理由
剂量水平是基于之前测试的rhFVIIa的建议的剂量范围和在I期的研究中进行进一步评估所考虑的剂量范围来进行选择的。
为了评估将能够在输注之前预测在血友病A狗体内的最小有效剂量的MOD-5014的止血潜力，在按接近体内IV给药后的最大预测水平的剂量范围进行的WBCT和TEG的掺入研究中评估一系列剂量。在两种测定中，按最低剂量(0.568μg/mL，其对应于50μg/kg)掺入MOD-5014表明随浓度增加而改进的止血效果的微小改进，但TEG值却没有实现完全的标准化，这与Knudsen等，2011相一致。基于所获得的结果，要在体内进一步研究的最低剂量是最低评估剂量，即，50μg/kg。
给药
给药是通过IV进行的。在8天内将测试物质进行多达2次的给药。将约10％的测试物质在～1分钟内进行注射，并观察狗的任何明显的临床反应(例如，荨麻疹和精神萎靡)。当狗被认为是对注射耐受时，在1至5分钟内进行剩余90％的输注。记录注射时间和体积。
通过改变剂量体积来提供不同的剂量。给药测试物质之后进行盐水冲洗。
在给药之前，使动物禁食。
研究评估
身体检查：在进入研究前，对狗进行一般检查，且仅包括具有正常的一般检查的那些。
笼侧观察：记录关于动物行为的任何问题或在动物的临床检查中注意到的一般健康状况。
详细的临床观察：在研究的输注阶段中，执行血液采样。
在研究开始时和研究开始后的第7天和第14天之间记录下体重。
食物消耗：每天给狗喂食其常规量的食物并观察食物的消耗。
临床病理学
在给药前对研究动物执行临床病理学评估。由FOBRL执行血小板计数、WBC、HCT和HGB。如果已发生任何临床事件，则收集样品以用于进一步的临床化学测试。
血浆分析
样品收集和处理
所有血液样本都是通过使用21G或类似的蝶形针进行的对头静脉的经皮穿刺来抽取的。在含有1mL抗凝剂(3.2％柠檬酸钠[0.12M])的10mL注射器中收集10mL的血液。根据标准实验室协议，在收集血液时，按1:10稀释柠檬酸钠。将10mL的血液样品从注射器转移至15mL的聚丙烯锥形管并轻轻倒转以确保混合而不发生溶血。然后将血液以3000g离心15分钟而不在4℃进行制动。离心后，将血浆上清液转移到新的15mL的聚丙烯锥形管中，以3000g离心另外的7分钟且不在4℃进行制动，以确保血浆与其他血液材料充分分离。在第二次离心后，通过聚丙烯移液管将源于每个样本的血浆转移至聚丙烯管中并立即置于-80℃的冰箱中。
将多等份的100μL血浆转移到Micronics管(或类似物)并迅速冷冻(-80℃)。除WBCT和TEG外，所有测定(酶联免疫吸附测定[ELISA]、活化部分凝血活酶时间[aPTT]和凝血酶生成测定[TGA])均是在完成输注和取样后对所有动物按批次执行的。
MOD-5014ELISA
使用特异性和选择性检测MOD-5014的测定并使用市售的抗FVIIa抗体(Ab)和内部多克隆抗CTP Ab来执行MOD-5014ELISA。在给药前(即基线)、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、32小时、48小时、72小时和96小时收集柠檬酸化的血浆样本。
FVIIa凝结活性
使用被调整用于量化在血友病狗基质中的FVIIa活性的市售的STACLOT VIIa-rTF试剂盒(参考#00281，Stago)来测量FVIIa凝结活性。
WBCT
通过在28℃以双管程序执行WBCT测定且在收集之后进行测试。用1mL注射器收集1mL全血并将其等分在两个硅化管(VacutainerTM，#6431，Becton-Dickinson，卢瑟福，新泽西)中。每30秒倾斜第一管。在凝块形成后，倾斜第二个管且每30秒进行观察。终点是第二个管的凝结时间。在该研究中，在给药前(即，基线)、15分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时和96小时或直到达到基线值为止由FOBRL来执行WBCT。
TEG
在每个采样点抽取血液以用于TEG，且根据制造商的说明使用HaemoscopeTEG5000血栓弹性描记术分析仪在收集后2分钟内在FOBRL/UNC进行测试。简而言之，丢弃前3mL的血液，然后抽取1mL的血液并与高岭土(批号#A-30-05，由Haemoscope提供)相混合。将360μL的这种预混合的血液/引发剂置于该仪器中并进行分析。允许进行约60-90分钟的TEG记录。在给药前(即，基线)、15分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时和96小时或直到达到基线值为止来执行测试。
aPTT
在FOBRL/UNC使用ST4凝固仪器(Diagnostica Stago，阿斯涅尔，法国)来确定aPTT。测试混合物由等份的部分凝血致活酶试剂(Triniclot，Diagnostica Stago)、0.025M的CaCl2和柠檬酸化的测试血浆组成。在给药前(即基线)、15分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时和96小时测试样本。
数据分析
以Phoenix WinNonlin版本6.3(Pharsight Corporation，森尼韦尔，加州)对个体动物数据执行非房室分析和药代动力学建模。对MOD-5014血浆浓度数据以及活性数据进行分析，假定初始的比活性为15,563单位/mg。
对于非房室分析而言，使用了IV输注程序。使用梯形法估计从时间零点至最后一个可测量时间点的曲线下面积(AUC0-t)。使用在最后三个或更多时间点上的对数线性回归来估计消除常数(λ)，其用于根据下列等式来估计终末半衰期(t1/2)和从零点至无穷大的AUC(AUC0-∞)：
t1/2＝ln(2)/λ
AUC0-∞＝AUC0-t+Ct/λ
其中，Ct是最后一个可测量浓度。血浆清除(CL)是用剂量除以AUC0-∞来计算的。最大浓度(Cmax)和观察的时间(Tmax)是直接由数据确定的。由于分析基于IV输注，因此在输注开始时的浓度被设置为0且不计算初始分布体积。
对于药代动力学建模而言，研究了各种模型和拟合策略，包括评估一、二、三室模型和不同的加权方案。
基于观察和预测浓度的相关性、参数估计和误差估计的相对值以及赤池纳入标准(用于比较一个模型与另一个模型的数学评估)来评估模型。
血浆浓度和活性相对于时间的数据通过二室模型最好地进行了描述。浓度数据是通过预测浓度的平方的倒数来进行加权的，且活性数据是通过预测浓度的倒数来进行加权的。加权方案防止了早期高浓度对曲线拟合施加太大的影响。在图90中示出了该模型。
模型生成了对中央室(V1)的分布体积、消除速率常数k10和房室间速率常数k12和k21的估计。中央室是向其中进行给药且从其收集样本的房室，在这种情况下，其为血管空间。根据房室间速率常数来计算与曲线的分布相和消除相，α和β相关联的速率常数。根据主要参数计算的其他参数包括与曲线的分布和消除相(t1/2α,t1/2β)相关联的AUC、Cmax、Tmax、CL、MRT和半衰期。
结果
离体研究结果：
WBCT
WBCT是在将MOD-5014掺入两只个体血友病A狗的血液中之后测量的，其最终浓度的范围是0-9.09μg/mL，该最终浓度被计算为相当于在分别进行50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg、800μg/kg的MOD-5014给药后的体内Cmax。基线(给药前)WBCT值在两只狗之间不同，但却在血友病A动物的可接受范围内(见表97)。
表97-在将MOD-5014掺入犬血之后的WBCT
如表97和图89所示，在MOD-5014浓度的最高范围具有最佳校正(～30分钟，基于内部实验室评估)下随着MOD-5014浓度增加，在WBCT中观察到了显著的降低。
对于狗P22而言，观察到了较低的WBCT基线，且较低的MOD-5014浓度是有效的，而狗O93由于其更高的基线值，则需要更高的MOD-5014浓度以达到目标WBCT值。
血栓弹性描记术
将一系列剂量的MOD-5014独立地掺入源于两只血友病A狗的全血中并用于模拟在以范围是50-800μg/kg的剂量进行IV注射后不久的在血液中的相关浓度。高岭土-TEG参数是以剂量依赖性方式进行改进的，由于测定变化性或技术误差，在两个个体之间存在一些波动和变化性(表98)。
表98-通过高岭土-活化的TEG来评估掺入犬血友病血液中的MOD-5014的效果
考虑到MOD-5014的降低的比活性(FVIIa的比活性降低2.3-2.5倍)和较低的FVIIa含量(72.3％)，所得的值与Knudsen等在2011报道的用于重组rhFVIIa的值相类似。
结论：在两种测定中，对应于50μg/kg的最低剂量0.568μg/mL表明随浓度增加而改进的止血效果的改进，但TEG值却没有实现完全的标准化，这与Knudsen等，2011相一致。
体内研究结果：
活体临床检查
良好地耐受所有输注。未注意到有注射部位反应。在血红蛋白、血细胞比容、白血细胞计数或血小板计数中未注意到有显著变化。在研究期间未注意到有食欲或其他行为的变化。由于在研究期间没有发生临床事件，因此未执行额外的临床化学参数(例如，肝酶和肾功能)。
血浆、药代动力学和凝结分析
在下面的表99和100中示出了药代动力学数据。
图91和图92示出在IV输注后随时间的平均MOD-5014血浆浓度和活性。血浆浓度在最初的8至12小时内呈现初始的相对较快的下降，接着则是缓慢的下降。在50μg/kg组中约32小时后以及在200μg/kg组和400μg/kg组中超过48小时，活性随时间下降，其降至测定的下限(12.6mU/mL)以下。源于600μg/kg剂量组的在72小时以上的活性数据被排除在分析之外，这是因为结果会随时间增加且在两只动物之间不一致。
图93A和图93B至图96A和图96B一起绘制了每只狗的浓度和活性。
在50μg/kg和200μg/kg的剂量组(图93A和图93B和图94A至图94D)中，浓度和活性在输注后的8至12小时遵循类似的图式，随后浓度则趋于平稳而活性则继续下降直到其降至测定水平以下为止。在400μg/kg和600μg/kg组(图95A和图95B和图96A和图96B)中，活性似乎比输注后立即开始的浓度下降得稍快。浓度曲线趋于平稳，而活性曲线则下降得更快直到其降至测定限以下为止，或在600μg/kg组的情况下，则排除在分析之外。
表99和表100中分别示出分别针对浓度和活性数据的非房室分析的结果。非房室分析的结果表明，在所有情况下AUC0-t与AUC0-∞几乎一样大，这表明采样的持续时间足以描绘药代动力学和药效学曲线。图97A和图97B以及图98A至图98J示出了每只狗的随时间的浓度和活性。在这些图上以实线表示了估计的终末斜率。每个图还包含与包括确定系数(Rsq和Rsq_调节)、用于估计斜率的点的数量和终末t1/2(HL_Lambda_z)的终末斜率的估计相关的信息。
除了一个例外(在200μg/kg组中)，血浆浓度和活性水平均在所测量的第一个时间点(0.25小时)处为最高的。浓度和活性都是剂量相关的且大约与剂量成比例，如跨剂量组的Cmax/剂量和CL参数估计所表明的。通过浓度和活性测量，CL似乎在最低剂量下稍快。在最低剂量下，浓度和活性在32小时后下降至测定限以下，这可能限制了在该剂量下药代动力学的完整表征。与活性测量相比，基于浓度测量的CL是类似的。与200μg/kg组(19.3小时)和50μg/kg组(7.76小时)相比，在400μg/kg和600μg/kg剂量后，基于浓度估计的t1/2则长得多(>40小时)。基于活性的终末t1/2约为3至5小时且在各剂量组中为类似的。
基于模型的AUC和CL的估计与根据非房室分析得到的那些良好得契合。从模型得到的表观体积分布基于血浆浓度为约90-120mL/kg(低剂量组较大)且基于活性为为40-70mL/kg。通过血浆和活性测量的模型估计的t1/2β与通过非房室分析估计的终末t1/2非常相似。
MRT是单个药物分子循环所在时间的估计。基于活性的MRT估计在各剂量组中是一致的，约为4至7小时。基于浓度，与200μg/kg组和50μg/kg组(分别为16.6小时和11.7小时)相比，MRT在较高剂量下更长(约25小时)。
在下表中总结了通过非房室分析计算的浓度和活性数据的参数。除了50μg/kg剂量组(其中药代动力学的表征可能受到测定灵敏度的限制)之外，当通过血浆浓度和活性测量时，血浆清除在各剂量组中是类似的。
表99-通过非房室分析估计的在对狗进行IV输注后基于浓度测量的平均MOD-5014药代动力学参数
表100-通过非房室分析估计的在对狗进行IV输注后基于活性的平均MOD-5014药代动力学参数
之前报告了，在对血友病狗进行rhFVIIa的给药之后，其基于抗原FVIIa水平的半衰期为3小时，且基于活性的半衰期为1.8小时(Knudsen等，2011，下面在表101中进行了总结)。
表101
CTP至FVIIa的附接将半衰期显著地延长至分别基于抗原和活性水平的19.3-45小时和4.72-5.22小时，从而与报告的数据相比使产品的半衰期平均延长3-5倍。清除以类似的方式受到影响且与Knudsen等2011相比，显著下降了2-3倍。
全血凝结时间(WBCT)分析
在给药前(即，基线)、15分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时由FOBRL收集后测试WBCT，其目的是监测其直到达到基线值为止。如表102中所示，所有动物的平均给药前WBCT时间实际上在较低范围的血友病狗的预期WBCT内(50-35分钟)。
表102-WBCT分析
通过全血高岭土-血栓弹性描记术(WB高岭土-TEG)进行的血友病狗体内的MOD-5014表征
在对所有狗按所有剂量进行MOD-5014给药后的指定时间点监测高岭土-TEG参数。本特定分析的目的是表征TEG随时间的动力学，以评估其中在不同动物身上发生不同参数(P、K、角度、MA)的标准化的最小剂量和在个体内的剂量依赖性反应，以及最后将在MOD-5014给药后的总TEG曲线与所发布的在类似的剂量范围的rhFVIIa数据以及与健康狗体内获得的正常值进行比较(Knudsen等，2011)。在图101的A-D、图102的A-D、图103的A-D、图104的A-D、图105的A-D和图106的A-D中提供了各个数据。
在按不同剂量给药后的MOD-5014全血高岭土-TEG性能
对2只狗进行给药的初始剂量50μg/kg不能显著地改进TEG性能，如给药后的不良的P、K、角度和MA值所反映的(动物P14；图102的A-D)，但当剂量增加至200μg/kg时，大多数参数都得到了改进。在第二只动物(N06)中，在进行50μg/kg的MOD-5014给药之后，TEG值也没有改进；这可能是给药前部分标准化的TEG值所导致的结果，尽管在给药后没有观察到进一步的改进，但这可能对给药后的不良反应产生直接影响。基于上述内容，提出50μg/kg的剂量不足以在所测试的狗体内支持并纠正止血缺陷。
在大多数动物中进行200μg/kg的MOD-5014给药将TEG参数校正为仍低于正常范围，但却提供了比50μg/kg剂量显著更明显的效果的值。在400μg/kg的剂量下，获得了TEG值的略微改进和持续很久的反应(图102的A-D；图103的A-D和图104的A-D)。当以600μg/kg对两只不同的动物进行给药时，一只动物(Joanie；图105的A-D)体内的反应与按400μg/kg给药的动物相类似。当动物N05(图106的A-D)体内的K时间、角度和MA值达到正常范围时，这也可能是改进的给药前的值和动物间的变化性所导致的结果。在一定剂量范围内进行的MOD-5014的给药似乎能够进行TEG值的部分校正，而最佳的最小有效剂量则在200-400μg/kg的MOD-5014的范围内。
MOD-5014全血高岭土-TEG剂量依赖性反应的动物内的变异性
当将较高剂量注射到同一动物时，观察到了动物内的剂量依赖性改进。观察到了在不同时间点的一些变化，其可能反映正常的生物学变化(图101的A-D、图102的A-D、图103的A-D、图104的A-D、图105的A-D和图106的A-D)。当以200和400μg/kg(Blondie和Josie)进行给药时，改进更加明显，如在图101的A-D、图102的A-D、图103的A-D、图104的A-D、图105的A-D和图106的A-D中所示。
MOD-5014全血高岭土-TEG结果在个体之间的再现性(动物间变化性)
如在图101的A-D、图102的A-D、图103的A-D、图104的A-D、图105的A-D和图106的A-D中所观察到的，尽管动物在进行MOD-5014的给药后校正了TEG值，但其在整个测量时间内表现出不同的曲线。考虑到每只动物的不同遗传背景和给药前值的细微差别，这可能是生物学变化的结果。观察到的变化实际上模拟了临床环境，其中各个TEG值可能在接收类似给药的个体之间发生变化，且可能最终转化为FVIIa的不同功效和出血控制能力。
作为长效产品的MOD-5014
MOD-5014和rhFVIIa的校正能力的比较表明MOD-5014的最大值和最小值与报告的用于hFVIIa的结果非常相似。然而，在MOD-5014下观察到了在反应的持续期间的显著改进。在进行hFVIIa的给药后，大多数的hFVIIa分析参数在给药后4小时均回落至基线(图107的A-D)，而MOD-5014能够实现在给药后24小时达到基线值的延长效果并提供了更持续且延长的反应(图108的A-D；以黑色箭头进行标记)。数据表明，TEG反应的持续时间与血友病狗体内的FVIIa的短PK-PD曲线相关，对其进行进一步的研究，随后确认在MOD-5014给药后的延长的反应。
活化部分凝血活酶时间(aPTT)性能
使用Triniclot试剂作为活化剂以及60秒的温育，用于犬血友病A血浆的aPTT值为65.6秒(数据未示出)。在MOD-5014给药后，aPTT以剂量依赖性方式下降至40秒。当将该信息与之前报告的数据进行比较时，发现其与对缺乏FVIII的狗进行193μg/kg的rhFVIIa给药前和给药后获得的值非常相似(Brinkhous等，1989)，而回顾性分析则表明当进行200μg/kg的MOD-5014的给药时具有延长的效果，且其随后在给药后的24小时返回至基线aPTT值。
结论：在该研究中，在缺乏FVIII的狗体内评估了新型长效FVIIa(MOD-5014)的安全性、PK、PD和血友病性凝血病的纠正能力。MOD-5014是按相关的临床剂量进行给药的，而在狗体内可能的最小有效剂量最初是基于离体研究建立的。
所有的狗都良好耐受MOD-5014且未观察到不良事件。在PK和PD(活化测量)分析中观察到了剂量依赖性反应，进一步证实了与已发布的参数(Knudsen等，2011)相比的MOD-5014的长效特性。
之前已经显示重组人FVIIa在治疗血友病犬的血液中是有效的。在按剂量200-400μg/kg进行MOD-5014的给药后，观察到了TEG凝固曲线的显著改进，而较低的剂量50μg/kg则不能校正TEG值，这表明其低于狗体内的最小有效剂量。在MOD-5014给药后，观察到了剂量依赖性反应，而个体间变化则高于预期且可能是生物学变化的结果。当将MOD-5014的性能与发布的数据进行比较时，MOD-5014在较低剂量(分别为270μg/kg和200μg/kg)下具有明显且延长的效果。MOD-5014的体内活性也通过aPTT值的降低反映出来，进一步证实了凝固系统的持续活化。
一般来说，与啮齿动物模型，诸如小鼠和大鼠相比，在血友病狗体内测试MOD-5014具有多个优点。血友病狗表现出与人类密切相关的疾病表型；而且，就体重以及FVIIa给药要求和药代动力学特征而言，狗与人类相似。
总的来说，该研究进一步证实了MOD-5014在相关的完善的模型中的寿命，该模型之前被示为提供了对人类生物学的准确概括，特别是在止血方面。在该研究中获得的数据具有显著的价值且提供了关于MOD-5014在大型动物体内是安全且有效的长效FVIIa的第一个证据，且该长效FVIIa能够被用作具有抑制剂的血友病患者的预防性和按需治疗的试剂。因此，MOD-5014具有通过减少给药频率和启用预防性使用来显著地使患者受益的巨大潜力。
实例15：对在WESSLER兔模型中单次给药后的MOD-5014与重组FVIIa的血栓形成潜能的比较性评估
目的：该研究的目的是评估旨在治疗具有对FVIII或FIX的抑制剂的血友病A或B的患者的MOD-5014。该研究的另一个目的是评估MOD-5014，针对其目的在于减少给药频率的用于按需治疗自发性出血(例如，关节出血)；以及针对其用于以每周两到三次的预期给药方案进行预防性使用(这可以显著地改进患者的临床状况和生活质量)。
该研究的另一个目的是使用在Wessler等(1959)，血清诱导的血栓形成，在体内受控条件下的对其诱导和进化的研究，循环，11月；20：864-74(Wessler et al(1959)Serum-induced thrombosis.Studies of its induction,and evolution under controlledconditions in vivo.Circulation Nov；20:864-74)；以及在Wesslet等(1959)，人血清中血栓形成诱导活性的生物测定，应用生理学杂志，14,943-946中所描述的半定量方法来评估测试项目MOD-5014的血栓形成潜能。与在0.1mg/kg和0.3mg/kg剂量水平的重组FVIIa和
的阴性对照组和阳性对照组进行比较。
该研究是在麻醉的兔子中进行的。
理由：该研究的目的是评估MOD-5014的血栓形成潜能。Wessler兔模型是用于评估静脉血栓形成的经典模型。该模型的灵敏性是基于1)具有比人类更高的凝固因子水平的高内源性兔止血潜能，以及2)如果暴露于活化的因子，则静脉淤滞引起巨大的组织损伤，这提供了通常巨大的针对血栓形成的易感性(Wessler等(1959)，Karges等(1994)，动物体内的凝固和纤溶参数，Arzneimittelforschung，6月；44(6):793-7)。基于之前探究重组人FVIIa在兔血瘀模型中的促凝性的研究(Diness等(1992)在兔血瘀模型中的重组人因子VIIa(rFVIIa)，血栓研究，67(2),233-41)，将Novoseven用作阳性对照。
研究概况：进行阴性对照、阳性对照和MOD-5014的一次静脉给药；这是临床给药途径。
剂量选择合理性：基于可从对Novoseven进行的兔血瘀研究(Diness等(1992)，在兔血瘀模型中的重组人因子VIIa(rFVIIa)，血栓研究，67(2),233-41)获得的数据且通过考虑在1-2a期临床研究中的MOD-5014预期剂量来选择剂量水平。低剂量是以μg/kg为基础的正式低临床剂量，并且被FDA批准用作1-2a期研究中的低剂量(50μg/kg)中的一个(见下面的实例16)。较高的剂量是400μg/kg，其是在1-2a期临床研究中以μg/kg为基础的预期最高临床剂量。
材料和方法
测试项目：描述、识别和储存
测试项目被确定为MOD-5014，ER批次1017295(有效期：2015年4月)。当不使用时，将测试物质储存在密封的容器中。
储存条件：冷冻(-60至-90℃)。
阴性对照是用于被确定为20mM的柠檬酸盐、150mM的NaCl和13.3mM的甘氨酸(pH6.4)的测试物质的载体。
储存条件：冷藏(2-8℃)。
阳性对照项目被确定为NovoSeven。
名称：NovoSeven(被称为MOD-5000)
批号：050115
描述/外观：冷冻、澄清的无色液体
粉末小瓶的有效期：2016年8月
储存条件：冷冻(-60至-90℃)
麻醉剂被确定为氯胺酮和甲苯噻嗪。
当不使用时，将麻醉剂在室温(通常为15-25℃)下储存在密封容器中并避光保存。
测试项目(MOD-5014)和阳性对照的制剂
制备
将测试物质在冰上解冻20-30分钟。每天在使用之前，将4.8ml的制剂缓冲液加入至3ml的测试物质(2.6mg/ml)中至1mg/ml的最终浓度。通过改变剂量体积来实现不同的剂量。
将NovoSeven在冰上解冻20-30分钟并按收到的原样使用。通过改变剂量体积来实现不同的剂量。
麻醉剂
麻醉剂被确定为氯胺酮和甲苯噻嗪。当不使用时，将麻醉剂储存在室温(通常为15至25℃)下的密封容器中并避光保存。
测试动物
从英国Harlan获得总共40只雄性Hsdlf:(NZW)(新西兰白色)兔子。在给药当天，兔子的体重为2.45-3.40kg。
实验设计
食物和水是自由提供的，除非当把动物从家里的笼子取出以用于研究过程之外。
通过肌肉注射氯胺酮(40mg/kg)加甲苯噻嗪(5mg/kg)来诱导和维持麻醉。在诱导麻醉后，将兔子置于加热的毯子上。用直肠探针监测温度并将其保持在可接受的限值内(标称为35至39℃)。
将颈部剃至腹侧以便对颈静脉进行双侧解剖。一旦定位静脉，则将远侧和近侧结扎线置于相距1-1.5cm的距离处，但却不收紧。
使用适于给药的体积(见下表)将测试项目、阳性对照或载体注射至对侧(至结扎的第一颈静脉)耳静脉中。
在下面的表103中示出了用于研究的处理：
表103
在剂量给药后，立即通过收紧结扎线将适当的颈静脉的近端从循环分离出来。然后，在剩下的颈静脉上重复该操作。在25秒之后，收紧两个远侧结扎线。在收紧后10分钟，小心地将一个静脉段(对于所有动物来说这均保持相同)从动物体内取出，转移至含有3.8％的柠檬酸钠溶液的培养皿中并切开。评估血栓的形成，如下面在表104中所述的。然后，在收紧后30分钟在剩下的颈静脉上重复该程序。
表104
统计分析
提供10分钟和30分钟后的血栓形成评分以用于分析。分别分析在每个时间-点的数据。
使用Wilcoxon秩和检验来进行下列感兴趣的比较：
组1与组2至8
组3与组7
组5与组8
结果
在表105中总结了结果，且在表106中示出各个动物数据。
表105：在MOD-5014和NovoSeven的静脉给药后的血栓形成评估的总结
sd-标准偏差
n＝5
表106：在MOD-5014和NovoSeven的静脉注射之后的血栓形成评估-个体动物数据
由于轻度麻醉，在^23分钟和*26分钟后取出静脉段。
Wessler评分
阴性对照的静脉给药在10分钟后产生了0.0的Wessler评分。30分钟后的评分的范围为0.0至0.5，其中平均评分为0.2±0.27。
按0.05mg/kg的剂量水平进行的MOD-5014的静脉给药在10分钟后产生了范围为0.0至0.5的Wessler评分，其中组平均评分为0.1±0.22。30分钟后的评分的范围为2.0至3.5，其中平均评分为3.4±0.82。
按0.1mg/kg的剂量水平进行的MOD-5014的静脉给药在10分钟后产生了范围是0.0至0.5的Wessler评分，其中组平均评分为0.1±0.22。30分钟后的评分的范围为2.0至4.0，其中平均评分为3.5±0.87。
按0.2mg/kg的剂量水平进行的MOD-5014的静脉给药在10分钟后产生了范围是0.0至1.0的Wessler评分，其中组平均评分为0.2±0.45。30分钟后的评分的范围为3.0至4.0，其中平均评分为3.8±0.45。
按0.3mg/kg的剂量水平进行的MOD-5014的静脉给药在10分钟后产生了范围是0.0至2.0的Wessler评分，其中组平均评分为0.6±0.89。在30分钟后，所有评分为4.0。
按0.4mg/kg的剂量水平进行的MOD-5014的静脉给药在10分钟后产生了范围是0.0至1.0的Wessler评分，其中组平均评分为0.3±0.45。30分钟后的评分的范围为2.0至4.0，其中平均评分为3.6±0.89。
按0.1mg/kg的剂量水平进行的NovoSeven的静脉给药在10分钟后产生了范围是0.0至0.5的Wessler评分，其中组平均评分为0.1±0.22。30分钟后的评分的范围为2.0至4.0，其中平均评分为3.5±0.87。
按0.3mg/kg的剂量水平进行的NovoSeven的静脉给药在10分钟后产生了范围是0.0至2.0的Wessler评分，其中组平均评分为0.5±0.87。30分钟后的评分的范围为3.0至4.0，其中平均评分为3.8±0.45。
统计分析结果，表107
表107
在30分钟后的血栓形成评分
*P≤0.05
**P≤0.01
***P≤0.001
W＝Wilcoxon秩和检验
统计分析显示在10分钟后的血栓形成对于所有组来说是相似的。然而，分析显示当与阴性对照相比时，在按所有剂量水平进行MOD-5014的给药后30分钟对血栓形成产生了统计学显著的影响。
当与相同剂量水平的NovoSeven比较时，按0.1mg/kg和0.3mg/kg的剂量水平进行的MOD-5014给药未对血栓形成产生统计学显著的差异。
结论
在麻醉的兔子体内进行0.1mg/kg和0.3mg/kg剂量水平的MOD-5014给药和在相同剂量范围的NovoSeven给药产生了相似的Wessler评分且从而产生相似的血栓形成潜能。
实例16：用于评估长效重组因子VIIA(MOD-5014)在患有血友病A或B的成年男性体内的安全性、药代动力学和药效学曲线的1/2A期、开放标签、多中心及剂量递增的研究
目的：
主要的：为了评估递增MOD-5014剂量的单次静脉(IV)给药在具有和不具有抑制剂的血友病受试者体内的急性安全性和耐受性。
次要的：为了评估递增MOD-5014剂量的单次IV给药在具有和不具有抑制剂的血友病受试者体内的药代动力学曲线。
探索性的：为了评估递增MOD-5014剂量的单次IV给药在具有和不具有抑制剂的血友病受试者体内的药效学反应。
研究设计和过程
这将是单剂量、开放标签及剂量递增的研究。该研究将以两个阶段执行，每个阶段在设计(访问和评估)方面将是类似的：
阶段1：该阶段将包括三个递增剂量组，每个剂量组有四个受试者。初始MOD-5014剂量将为25μg/kg，接下来为50μg/kg和100μg/kg。在每个剂量队列中的第一个受试者将接受单次IV注射，接下来是在对该队列中的余下三个受试者进行给药之前进行72小时的安全性观察期。在对每个队列中的最后一个受试者给药之后将是7天、14天和30天的安全性观察期。在开始阶段2之前要将阶段1的数据提交给FDA。只有DSMB(安全监测委员会)批准继续进行研究并通知IRB后，才能开始进入阶段2。
阶段2：该阶段在设计上与阶段1相类似且将包括三个递增剂量组以评估比在阶段1中评估的那些更高的剂量。要在阶段2中进行评估的剂量包括200μg/kg、300μg/kg和400μg/kg的MOD-5014，每个剂量组有4名受试者。
对于每个研究阶段而言，DSMB在审查相关的安全性数据(包括不良事件、临床实验室和生命体征)之后将作出转入更高剂量水平的决定，该安全性数据是在前一个剂量组的最后一个受试者给药后长达7天(包括7天)内收集的。
不良事件的通用术语分级(CTCAE)指南将用于确定最大耐受剂量(MTD)和剂量限制性毒性(DLT)(表108)。如果良好的耐受了先前的剂量且在给药后7天内没有安全性或耐受性问题，则将允许剂量递增。
停止规则和剂量限制毒性(DLT)
DLT被定义为临床显著的不良事件或异常实验室值，其被评估为与疾病进展、并发疾病或合并用药无关且发生在给药日后长达7天。例如，3或4级是明确或可能与药物相关的。在报告血栓栓塞事件的情况下，将停止研究且将请求DSMB进一步调查该事件及其与MOD-5014单次剂量给药的关系。表108总结了剂量递增标准和决策树。
表108MOD-5014的相关毒性和剂量递增标准方案
研究程序
每个研究阶段将包括筛选期(第28±1天)、处理日和随访期(第7天、14天和30天)。对于每个研究阶段和剂量组而言，访问调度和评估将是类似的。
筛选期(第-28天至-1天)-访问1
在签署知情同意书后，将筛选已被诊断患有中度或重度先天性血友病A或B的18-65岁成年男性受试者以通过纳入和排除标准的评估获取研究资格。筛选过程将包括收集人口统计数据、完整的和与疾病有关的病史、身体检查(包括神经学评估、身高和体重)、生命体征(血压、脉率、口腔温度和呼吸率)、ECG、不良事件、合并用药和安全性实验室评估，包括血液学、生物化学、尿液分析、凝固(凝血酶原时间(PT)和活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTTa))。
给药前一天(第-1天)
在给药前一晚通过电话联系合格的受试者以确认：受试者没有接受过如下所述的替换疗法(表109)。将考虑针对下面描述的时间限制的电话通话时间。如果他们在那个晚上将发生出血事件且将接受替换疗法，他们则不应该在第二天早上来诊所，而是要呼叫其研究联系人。
表109：给药前禁用的替换疗法
处理日(第0天)-访问2
给药前
在诊所，在给药前进行下列评估和过程：身体检查(包括神经学评估)、生命体征、心电图(ECG)、安全性实验室(血液学、生物化学和尿液分析)、PT、给药前1小时内的aPTT、免疫原性、药代动力学(在给药前1小时内)b、药效学(经STAClot测定的FVIIa活性)、血栓弹性描记术(在给药前1小时内)、凝血酶生成(在给药前1小时内)、不良事件和合并用药。
给药
受试者将接受基于体重和MOD-5014剂量(由剂量队列限定)的单次静脉注射。
给药后
将在第0天在所示的给药后的时间点上执行下列评估和过程：
·在1±0.5小时、4±0.5小时和8小时±0.5小时的生命体征(血压、脉搏、呼吸率、温度)
·在1±0.5小时、4±0.5小时和8±0.5小时的ECG
·在4±0.5小时的安全性实验室(血液学、生物化学和尿液分析)
·在30±5分钟、2小时±20分钟、4±0.5小时和8±1小时的凝固操作盘
·在30±5分钟、2小时±20分钟、4±0.5小时和8±1小时的药代动力学
·在30±5分钟、2小时±20分钟、4±0.5小时和8±1小时的药效学。测定包括：
o经STAClot测定的FVIIa活性
o血栓弹性描记术(可选的)
o凝血酶生成
·合并用药
·在IV给药结束后10分钟和2小时±20分钟的给药部位的局部皮肤反应
·不良事件
随访(FU)期(访问3至8，第1天至30天)
随访期将在给药后一天开始。在给药后30天对受试者进行跟踪，且受试者经历了如下所概括的六次随访。在FU访问3/第1天(24小时)、FU访问4/第2天(48小时)和FU访问5/第3天(72小时)，执行以下内容：身体检查(包括神经学评估)(仅访问3和5)、生命体征、ECG、安全性实验室(血液学、生物化学和尿液分析)、凝固操作盘(单次抽血)、药代动力学(单次抽血)、药效学(单次抽血)、血栓弹性描记术、凝血酶生成、不良事件、局部皮肤反应和合并用药。如果在前72小时内给予了急救用药，则仅执行FU访问5。
如果未对出血事件给予急救处理，则将在FU访问6/第7天完成下列研究过程：身体检查(包括神经学评估)、生命体征、ECG、安全性实验室(血液学、生物化学和尿液分析)、凝固操作盘、药代动力学、药效学、血栓弹性描记术、凝血酶生成、不良事件和合并用药。在前72小时后出现了出血事件且给予了急救处理的情况下，则完成对患者临床安康的电话问卷调查。
FU访问7-8，第14和30天(终止访问)
将在这些访问中完成下列研究过程：免疫原性、抗HCP抗体(仅访问8)、不良事件和合并用药。
研究的持续时间
针对每个参与的受试者的研究持续时间长达58天，详情如下：
·筛选期：在给药前的第-28至-1天
·处理：单次剂量给药的第1天
·随访：至少72小时，急性安全性；第7天，安全性；以及第14和30天，免疫原性
样本大小和目标人群
被诊断为患有中度或重度先天性血友病A或B的二十四(24)名成年男性受试者(年龄18-65岁)，每个研究阶段12名受试者。每个剂量组包括4名受试者。
纳入标准
受试者必须满足所有纳入标准才有资格参加研究：
1.男性，18-65岁，纳入，在筛选访问时。
2.具有或不具有抑制剂的中度或重度先天性血友病A或B的诊断，其被分别定义为小于或等于正常的FVIII或FIX水平的3％。
3.小于35.0kg/m2的身体质量指数。
4.足够的静脉通路。
5.生育男性必须同意在给药后90天内使用屏障式避孕(避孕套)且在研究期间和给药后90天内限制其不得捐献精子。
研究用产品的途径和剂型
以在柠檬酸盐缓冲液中含有1mg/mL的MOD-5014的澄清溶液的玻璃小瓶提供MOD-5014，一种长效修饰的重组因子VIIa。
在剂量制备前2小时，在给药当天于室温下解冻冷冻小瓶。将解冻的小瓶拉入一个或多个注射器(取决于用于注射的IP量)。在“使用说明书”的文件中提供了用于处理和给药的详细说明。
计划六个剂量组(每个阶段三组)；在每个阶段和剂量组中的受试者基于受试者的体重按IV注射接收单次MOD-5014的给药(关于要进行给药的剂量的实例，见表110)。
表110：实例MOD-5014的剂量和计算的注射持续时间
a最大注射速率为10mL/分钟
急救用药
在受试者在研究期间(在给药后30天内的评估)经历出血事件的情况下，根据医院通常的做法和他的临床状况对其进行处理。
安全性终点(主要的)
主要的安全性终点将由监测和记录组成：
1.在整个研究中的不良事件和合并用药
2.免疫原性、未出现中和抗体
3.ECG、生命体征、身体检查(包括神经学评估)
4.实验室参数，包括血清化学曲线、肝酶、血液学、凝固操作盘(PT时间、aPTT、凝血酶和抗凝血酶复合物、前凝血酶片段1+2、D-二聚体)和尿液分析
5.局部耐受性(注射部位反应)
药代动力学(PK)终点(次要的)
通过测量MOD-5014血浆浓度在单次注射后评估PK反应，如通过特异性ELISA测定所测量的。计算下列参数：Cmax、AUC、终末半衰期、Vss、清除、恢复和Tmax。
Cmax-最大MOD-5014血浆浓度
Tmax-至Cmax的时间
Tlag-MOD-5014的吸收滞后时间
AUC-至最终浓度≥定量限(LOQ)AUC(0-t)以及至无限AUCinf的曲线下面积
λz-消除速率常数
t1/2-半衰期
Vss-体积稳定状态、清除和恢复
在第0天的PK采样次数(在给药后1小时内)。将在IV给药结束时发起所有注射后测量：给药后30±5分钟、2小时±20分钟、4±0.5小时、8±1小时、24±2小时(第1天)、48±3小时(第2天)、72±3小时(第3天)和第7天。
药效学(PD)终点(探索性的)
通过经STAClot测定的FVIIa活性来评估药效学。在下列时间点测量PD：第0天(给药前1小时内)。在IV给药结束时发起所有注射后测量：给药后30±5分钟、2小时±20分钟、4±0.5小时、8±1小时、24±2小时(第1天)、48±3小时(第2天)、72±3小时(第3天)和第7天。执行生物分析。
统计方法
使用描述性统计来总结人口统计特征、基线特征、安全性和PK/PD数据，包括样本大小(n)、平均值和标准偏差。
进行阶段1中每个剂量组的PK、PD和安全性数据的数据审查。
实例17：毒理学研究
支持1/2A期研究的对因子VIIA-CTP的安全性和功效的比较性评估
目的
这些研究的目的是在对大鼠和猴进行给药后评估FVIIa-CTP的安全性、PK和PD，以作为支持在血友病患者中正在进行的1/2a期研究的毒理学研究的一部分。
方法
将FVII-CTP在CHO细胞中进行表达且使用CTP特异性纯化方法来进行纯化和活化。
GMP批次用于受到毒代动力学分析支持的在雄性大鼠和猴体内进行评估的毒理学研究中，该毒代动力学分析证实了在FIH研究中在初始临床剂量以上的合适的余量。
研究(下面在表111中显示了所执行的研究的总结)。
MOD-5014的急性毒代动力学GLP研究：在雄性食蟹猴体内的单次静脉剂量PK/PD和毒性研究：
在雄性食蟹猴中的研究是GLP依从性的单剂量毒理学研究，其用于评估和表征急性毒性，评估最大耐受剂量(MTD)并评估MOD-5014在雄性食蟹猴体内的毒代动力学。
研究设计
从Covance Reseach Products,Inc获得二十六只约2至4岁的雄性食蟹猴(2至4kg)。根据表1将二十四只分配至处理组。
方法
动物接受MOD-5014(批号ER1017295，2.6mg/mL)的单次IV缓慢团注(2至3分钟)隐静脉注射。在含有柠檬酸盐缓冲液的管中从股静脉收集血液样本。在给药前以及在0.25、0.5、2、4、6、8、12和24从所有动物收集样本。在给药后48小时、60小时和72小时从恢复的动物收集额外的样本。从对照组的动物(组1)收集所有样本，但仅测定0.5小时的样本。在Intertek Pharmaceutical Services(圣地牙哥，加州)通过验证的ELISA(生物分析验证报告AR5437)来确定血浆MOD-5014浓度。在以色列的OPKO Biologics以合格的凝结测定(STAGO)(合格报告CD-05-0276)来确定MOD-5014的活性。
数据分析
以Phoenix WinNonlin版本6.3(Pharsight Corporation，森尼韦尔，加州)对源于个体动物的数据执行非房室分析。对MOD-5014血浆浓度数据以及凝结活性数据进行分析，假定初始的比活性为15,563单位/mg(MOD-5014ER#1017295版本SUM)。使用IV团注给药的程序。
对于血浆浓度分析而言，使用梯形法来估计0至24小时的曲线下面积(AUC0-24h)。最大浓度(Cmax)和观察的时间(Tmax)是直接由数据确定的。在时间零点(C0)的血浆浓度是由通过前两个时间点的后向外推进行估计的。根据下列等式计算初始表观分布体积(Vi)：
Vi＝剂量/C0
对于恢复组中的动物而言，额外的数据可用于48小时、60小时和72小时的时间点。这些额外的时间点的曲线表明在动物曲线中未看到的更平坦的终末期终止于24小时。因此，仅根据恢复的动物，而不是根据终止于24小时的那些来估计终末斜率和相关参数。即使这意味着是仅根据每组2只动物来估计终末斜率和相关参数的，但所得到的估计仍比仅基于24小时的数据更好地描述了PK曲线。
对于恢复的动物而言，使用在最后三个时间点上的对数线性回归来估计消除速率常数(λ)，其用于根据下列等式来估计终末半衰期(t1/2)和从零点至无穷大的AUC(AUC0-∞)：
t1/2＝ln(2)/λ
AUC0-∞＝AUC0-24h+C24h/λ
其中，C24h是在24小时的浓度。血清清除(CL)是用剂量除以AUC0-∞来计算的。根据下列等式计算在终末期(Vz)和在稳定状态(Vss)的体积：
Vss＝剂量*AUMC/AUC2
Vz＝CL/λ
其中AUMC是在一阶矩曲线下的面积。
对于凝结活性数据分析而言，在较晚时间点的较平坦的终末斜率不明显。因此，由通过最后三个或更多个时间点的对数线性回归来从所有动物估计终末斜率且按如上所述来计算相关参数。
在下面的表111中描述了所有完成的研究的总结。
表111
结果
Sprague Dawley大鼠：所有动物均处于良好的临床状况中。在一只尾部变紫或变红的9mg/kg的动物体内注意到了在主要研究的动物体内观察到的被认为是与测试物质相关的(与MOD-5014相关的)唯一详细的临床观察。可逆地，在主要研究的动物体内观察到了临床病理学的与物质相关的变化，其包括在所有测试物质组中的凝血酶原时间的轻度减少。(图110，表112和113)
表112：由非房室分析估计的在IV团注后基于血浆浓度的大鼠MOD-5014的药代动力学参数
表113由非房室分析估计的在IV团注后基于血浆浓度的大鼠MOD-5014的药效学参数
在终末或恢复尸检时在主要研究的动物体内没有与测试物质相关的宏观发现或器官重量的变化。
食蟹猴的非GLP和GLP研究：
所有动物均处于良好的临床状况中，对雄性食蟹猴进行MOD-5014的单次剂量的静脉给药减少了凝血酶原时间和抗凝血酶III并在7.5mg/kg和15mg/kg剂量下增加了D-二聚体(图111，表114、115、116、117)。这些变化表示血栓前状态，其与药物的预期作用机制一致。
表114：由非房室分析估计的在IV团注后基于血浆浓度的猴MOD-5014的药代动力学参数(非GLP研究)
表115由非房室分析估计的在IV团注后基于血浆浓度的猴MOD-5014的药效学参数(非GLP研究)
表116在雄性食蟹猴中的MOD-5014药代动力学的总结(GLP研究)
活性单位为mU而不是ng。
在表117和118中分别示出了用于GLP研究中的源于个体动物的血浆浓度和凝结活性数据。活性数据表示在每个时间点的每只动物的复本测量的平均值。
表117：源于个体动物的血浆浓度数据
给药前活性测量为BLQ且被设置为“缺失的”以用于PK参数的评估。
表118：源于个体动物的凝结活性数据
每只动物的两次确定的平均值(mU/mL)：给药前活性测量为BLQ且被设置为“缺失的”以用于PK参数的评估，用于#404的给药前值被认为是可忽略的且也被设置为缺失的。
在表119中示出了源于个体动物的血浆浓度PK参数。
在表120中示出了源于个体动物的凝结活性PK参数：
图112和图113示出在IV注射后的平均MOD-5014血浆浓度和凝结活性。图114至图116一起绘制了用于每个剂量水平的平均浓度和凝结活性。在图117A至图117R中显示了血浆浓度和凝结活性的各个图。这些图示出在给药后的前24小时内，血浆浓度和凝结活性以类似的速率下降。24小时以后，血浆浓度趋于平稳，且活性水平继续下降。24小时后的数据只能恢复动物(每组2只)中获得。
表119和表120中分别示出分别针对血浆浓度和凝结活性数据的非房室分析的结果。血浆浓度在测量的第一个时间点(0.25小时)最高。在大多数动物体内，在0.25小时或0.50小时观察到了凝结活性Tmax。浓度和活性均随剂量的增加而增加，但并不完全与剂量成比例。存在有一种趋势，即AUC0-24h和AUC0-∞比剂量的增加多增加30至50％。基于血浆浓度的终末半衰期比基于凝结活性的终末半衰期更长：即约12至28小时相对于约5至7小时。与7.5mg/kg和15mg/kg的剂量相比，CL在最低剂量1mg/kg下似乎快了约50％。基于血浆浓度和基于凝结活性的CL是类似的。
表119在对雄性食蟹猴进行IV团注后基于血浆浓度的MOD-5014的药代动力学参数
表120在对雄性食蟹猴进行IV团注后的基于活性测量的MOD-5014的药效学参数
基于15,563单位/mg的活性
从分布体积的估值来看，没有明显的一致性趋势。当理论上血浆浓度和组织浓度处于平衡中时的在稳定状态下的体积(Vss)和当浓度下降时在终末期的体积(Vz)在基于源于血浆浓度的估计下的值均比基于凝结活性的更高。初始分布体积(Vi)在1.0mg/kg和7.5mg/kg剂量组在基于凝结活性下的值稍高于基于血浆浓度下的值。Vi在两个较低剂量下也比在高剂量下的更高。该观察可能与凝结活性的测量并不都是在最早的时间点达到峰值且随后均急剧下降的事实相关。相反地，一些凝结活性曲线在稍晚的时间达到峰值，这产生了曲线的更平坦的初始阶段。该图式导致了C0的较低估值且从而为基于凝结活性的Vi较高估值。
GLP研究的总结
血浆浓度在测量的第一个时间点(0.25小时)最高。在大多数动物体内，在0.25小时或0.50小时观察到了凝结活性Tmax。浓度和活性参数均随剂量的增加而增加，但并不完全与剂量成比例。存在有一种趋势，即AUC0-24h和AUC0-∞比剂量的增加多增加30至50％。基于血浆浓度的终末半衰期比基于凝结活性的终末半衰期更长：即约12至28小时相对于约5至7小时。与7.5mg/kg和15mg/kg的剂量相比，CL在最低剂量1mg/kg下似乎快了约50％。基于血浆浓度和基于凝结活性的CL是类似的。
从分布体积的估值来看，没有明显的一致性趋势。当理论上血浆浓度和组织浓度处于平衡中时的在稳定状态下的表观体积(Vss)和当浓度下降时在终末期的表观体积(Vz)在基于源于血浆浓度的估计下的值均比基于凝结活性的那些更高。初始分布体积(Vi)在1.0mg/kg和7.5mg/kg剂量组在基于凝结活性下的值稍高于基于血浆浓度的值。Vi在两个较低剂量下也比在高剂量下的更高。该观察可能与凝结活性的测量并不都是在最早的时间点达到峰值且随后急剧下降的事实相关。一些凝结活性曲线在稍晚的时间达到峰值，这产生了曲线的更平坦的初始阶段。该图式导致了C0的较低估值且从而为基于凝结活性的Vi较高估值。
在对雄性食蟹猴进行缓慢IV团注后，基于血浆浓度和基于凝结活性的MOD-5014暴露随着剂量的增加而增加，但却稍多于剂量的增加。因此，基于血浆浓度和基于凝血活性的MOD-5014暴露是剂量相关的，但却不与剂量成比例。由浓度和活性测量的CL是类似的且在1mg/kg的剂量后比7.5mg或15mg/kg剂量后的CL高出约50％。基于血浆浓度的终末半衰期比基于凝结活性的的终末半衰期更长：即约12至28小时与约5至7小时。
在上面实例15中示出了NZW兔子的结果。
结论：
安全性评估总结：
在毒理学研究中提到的所有发现都与该药物的作用机制相一致且是基于其进行预期的。没有对于商业rhFVII或其他凝固因子药物而言尚未看到的与MOD-5014相关联的新的或独特的发现。在Wessler模型中测试血栓形成效应，且其被示为与rhFVIIa相类似。
药代动力学优点：
结果显示恢复提高了两倍，且MOD-5014提供了优异的半衰期，其是商业rhFVII的四倍。此外，提高了至MOD-5014的暴露(AUC 3-4X)。体外凝结活性的分析示出与商业产品相比的类似的体外凝结活性。
总体而言，MOD-5014显示了出色的安全性曲线，其提供了在人类首次(FIH)1-2A期临床试验研究中建议的给药临床剂量之上的足够的暴露余量。
实例18：MOD-5014和hFVIIa体外血小板结合的比较性评估
1.项目的基本原理和总结
1.1.目的
这些研究被设计为评估MOD-5014与野生型重组人FVIIa相比的体外血小板结合。这是FVIIa样分子作为血友病旁路剂的一个重要特征，这是因为血小板的表面活性被认为是该临床环境中FVIIa作用机制的重要组成部分。除了简单的磷脂之外，血小板具有许多有助于凝结蛋白酶的结合和活性的表面特性。因此，仅磷脂结合和活性的测定在预测凝固因子，诸如FVIIa的生物效应方面可能有误导性。
1.2.方法
所检查的研究：
·如通过流式细胞术评估的血小板结合
·如通过血小板表面凝血酶生成评估的血小板结合
1.3.结果和结论
流式细胞术研究未提供有用的数据。这些测定允许FVIIa和MOD-5014结合至活化的人血小板。通过针对人FVII的亲和纯化的多克隆抗体来检测结合。虽然由OPKO用于流式细胞术的抗体制剂在蛋白印迹上被同样良好地结合至FVIIa和MOD-5014，但其在ELISA或流式细胞术测定中并不如此。因此，该方法对于比较结合至血小板的FVIIa和MOD-5014来说是无用的。
作为可替选方法，评估了用于支持在血小板表面上的凝血酶生成的血小板的MOD-5014结合能力。该方法是基于FVIIa具有很低的在溶液中催化FXa活化的能力的事实。然而，当FVIIa和经修饰的FVIIa分子结合至活化的血小板时，它们在活化FX中的效率则高得多。随后能够通过其在血小板表面上将前凝血酶活化成凝血酶的能力来测量在活化的血小板上产生的FXa。
发现在等摩尔浓度下，MOD-5014支持的血小板表面的凝血酶生成速率略低于FVIIa。然而，与FVIIa相比，MOD-5014在凝血酶生成开始前的滞后长约40％。这与生化研究一致，其显示MOD-5014具有比野生型FVIIa略低的最大FX活化速率。可以通过较高的MOD-5014水平来克服至最大凝血酶生成的较长的时间。给药要考虑许多因素。然而，这些体外数据表明MOD-5014可能需要与FVIIa略微不同的给药。
2.通过流式细胞术进行的血小板结合的评估
2.1.方法
从健康的人供体血液分离血小板并用凝血酶和convulxin(胶原受体激动剂)来进行活化。将活化的血小板用10nM、50nM、100nM和250nM的MOD-5014或FVIIa进行温育且随后用1％的多聚甲醛进行固定。使用多克隆抗人FVII抗体和FITC连接的二抗为FVIIa进行固定血小板的染色。通过流式细胞术来分析染色的血小板。确定在每个FVIIa浓度的血小板亚群的平均荧光强度(亮度)。
2.2.结果
图118示出在每个MOD-5014或FVIIa的浓度下的血小板亚群的平均荧光强度。尽管对于MOD-5014检测到的总体结合很低，但MOD-5014和FVIIa仍具有相似形状的结合曲线。如果MOD-5014未良好地结合至血小板，这将导致似乎不饱和的非常平坦的曲线。因此，用于检测FVIIa/MOD-5014的抗体很可能不能很好地检测MOD-5014。观察到用于在流式细胞术研究中检测结合的相同的多克隆抗体产生了与MOD-5014的SDS变性样品和野生型FVIIa同样强的信号。
随后，使用ELISA测定来测试多克隆抗体用于检测FVIIa和MOD-5014的能力。在该测定中，微量滴定孔涂覆有抗体以捕获蛋白样本。用相同的多克隆抗体来检测蛋白至捕获抗体的结合。由于FVIIa和MOD-5014保持了其天然构象，因此MOD-5014的检测比FVIIa的差得多。
这促使我们寻求不同的技术来检测FVIIa和MOD-5014的结合。
3.通过凝血酶生成进行的血小板结合的评估
3.1.方法
在这些实验中，将血小板再次用凝血酶和convulxin进行活化，用不同浓度的FVII或MOD-5014温育，且随后在显色底物Gly-Pro-Arg-对硝基苯胺(500μM)的存在下添加至血浆浓度的FX(135nM)和前凝血酶(1.2μM)中。在这些条件下，已结合至血小板的FVIIa或MOD-5014活化FX。如此在血小板表面上形成的FXa与血小板衍生的FVa相结合，且所得到的复合物将前凝血酶活化成凝血酶，这是通过显色底物的切割来检测的。
3.2.结果
在不存在血小板的情况下，底物切割是最小的。在图119中，在每个浓度的底物切割的最大速率被绘制为FVIIa或MOD-5014浓度的函数。MOD-5014的凝血酶生成速率略低于FVIIa的凝血酶生成速率。这与在磷脂囊泡上执行的活性测定相一致。
实例19：MOD-5014相对于商业重组hFVIIa的生物化学特性-羧基末端肽(CTP)对因子VIIa活性的影响
项目的基本原理和总结
这些研究被设计为评估MOD-5014相对于商业重组hFVIIa(本文被称为MOD-5000)的生物化学特性。
所检查的研究：
·MOD-5014的合成底物切割
·如合成底物切割所测量的MOD-5014的组织因子(TF)结合
·如通过因子X(FX)活化测量的MOD-5014的TF结合
·由TF结合的MOD-5014进行的FX活化的动力学
·如通过FX活化测量的MOD-5014的脂质结合
·由脂质结合的MOD-5014进行的因子活化的动力学
·由抗凝血酶(AT)进行的MOD-5014灭活
·由TFPI进行的MOD-5014灭活
总体而言，数据表明，相对于MOD-5000而言，MOD-5014具有类似的作用机理，其中催化活性稍微降低。这些结果表明TF-结合的MOD-5014的活性略微降低且独立于TF的活性降低地略多一些。
这些影响主要反映在反应速度上，而不是反应的程度上，且要去完成能够测量整个时间过程的反应。
略微降低的AT抑制速率表明具有适当的抑制反应的MOD-5014半衰期在体内的延长。
实验材料
·MOD-5014GMP-1:2.5mg/ml(基于A280)
·NovoSeven批号#CU60430:0.943mg/ml(基于A280)，被称为MOD-5000。
MOD-5014的合成底物切割
基本原理：合成底物的切割应完全取决于功能活性位点的可用性。
方法：将MOD-5000和MOD-5014以摩尔基稀释到相同的浓度。然后，将相同浓度添加至固定浓度的底物Pefachrome FVIIa(甲基磺酰基-D-环己基丙氨酰-2-氨基丁酰基-精氨酸-对硝基苯胺)并通过黄色的外观来监测底物的切割。
结果
浓度：FVIIa 360nM；底物500μM
分析：使用已知的消光系数将405nm处的吸光度转换成对硝基苯胺的浓度。相对于时间绘制对硝基苯胺的浓度以确定底物切割速率。
数据被拟合至：
速率＝k1[VIIa]
k1＝27.5摩尔pNA/分钟/摩尔VIIa
结论：基于摩尔数，MOD-5000和MOD-5014具有相同的底物切割速率(图120)。对于后续的研究而言，底物切割的测量被用作对稀释和移液的控制。
如合成底物切割所测量的MOD-5014的TF结合
基本原理：当因子VIIa结合TF时，因子VIIa中发生构象变化，其导致底物切割速率增加。这表示增长的底物切割能够被用于监测因子VIIa至TF的结合。
方法：将变化浓度的MOD-5000和MOD-5014添加至固定浓度的TF并温育5分钟。
添加底物(Pefachrome FVIIa)。通过黄色的外观在405nm处监测底物切割。
结果：
浓度：FVIIa 0-25nM；TF 8.7nM；底物500μM
分析：由于TF的浓度远高于预期的Kd，所以在低浓度下，所有的FVIIa应结合至TF。底物切割速率将是VIIa/TF复合物的速率。一旦FVIIa的浓度超过TF的浓度，底物切割速率将下降至游离FVIIa的速率。由于FVIIa和TF形成了1：1摩尔的复合物，因此发生底物切割速率变化的FVIIa浓度是对估计的FVIIa浓度的核对。
数据被拟合至：
速率＝k1[VIIa]+k2[VIIa/TF]
结论：MOD-5000(Novoseven)和MOD-5014在预期的TF浓度(8.7nM)下显示相同的拐点(图121)。这证实了通过底物切割预测的MOD-5000和MOD-5014的摩尔浓度是正确的。相对于MOD-5000而言，MOD-5014在结合至TF(98％)时具有极略低的底物切割速率。
如通过因子X活化测量的MOD-5014的TF结合
基本原理：相对于FVIIa/TF复合物的切割而言，FVIIa对FX的切割是缓慢的。因此，能够通过测量FX活化的速率来评估FVIIa至TF的结合。
方法：将不同浓度的MOD-5000和MOD-5014添加到固定浓度的TF中，并测量FX活化的速率。通过切割合成底物Pefachrome FXa(甲氧基羰基-D-环己基丙氨酰-甘氨酰-精氨酸对硝基苯胺)来评估因子X活化。通过标准曲线将合成底物的切割转换成FXa浓度。FVIIa和FVIIa/TF都不能以可观的速率切割FX底物。
结果
浓度：FVIIa 0-2nM；TF 10pM；FX 135nM；底物500μM
血浆中的因子X浓度为8μg/mL(～135nM)。
分析：随着FVIIa结合至TF，FX的活化速度将增加。一旦所有TF都被FVIIa所饱和，FX活化的速率则将已达到最大值(图122)。
数据被拟合至：
结论：在FVIIa至TF的结合中，存在有极细微的负协同性(Hill值<1)。这对于MOD-5000和MOD-5014来说是相同的。当结合至TF时，相对于MOD-5000来说，MOD-5014具有略微降低的FX活化速率(93％)。MOD-5014对TF的亲和性等于MOD-5000的亲和性(图122)。
作为FX浓度的函数的FX活化速率
基本原理：当结合至TF时，MOD-5014略微降低的速率可能是降低的对FXa的亲和性或一旦其被结合至复合物而减少的FX代谢回转的结果。测量作为FX浓度的函数的FX活化速率建立了复合物的动力学参数。
方法：将不同浓度的FX用固定浓度的FVIIa/TF复合物进行温育。
通过合成底物(Pefachrome FXa)的切割来评估因子X的活化。通过标准曲线将合成底物的切割转换成FXa浓度。
结果
浓度：FVIIa 1nM；TF 5pM；FX 0-1500nM；底物500μM
分析：随着添加了更多的FX，更多的FVIIa/TF复合物将使FX结合至所有FVIIa/TF复合物均具有结合的FX的点。在该点上，反应受限于FX的活化速率。因此，FX活化的速率将随着FX浓度的增加而增加，其具有渐近地接近最大速率的曲线形状(图123)。
数据被拟合至：
结论：当结合至TF时，相对于MOD-5000来说，MOD-5014具有略微降低的FX代谢回转(92％)。FX至MOD-5014/TF复合物的结合与其至MOD-5000/TF复合物的结合相同(图123)。
如通过FX活化测量的MOD-5014的脂质结合
基本原理：在血小板上的因子X活化被认为是有助于FVIIa的止血作用。该血小板活性被认为发生在低TF环境中或在不存在TF的情况下。能够在脂质囊泡上研究不具有TF的因子X活化。
方法：在脂质上由FVIIa实现的因子X活化是酶(FVIIa)和蛋白底物(FX)结合的函数。脂质比率为PC：PE：PS＝41:44:14，其被设计为模拟高度活化血小板的组成。脂质被制备成大的单层囊泡(200nm)。将增加浓度的囊泡添加到FVIIa和FX中。通过合成底物(Pefachrome FXa)的切割来评估因子X的活化。通过标准曲线将合成底物的切割转换成FXa浓度。
结果
浓度：FVIIa 20nM；FX 500nM；脂质0-1000μM；底物500μM。
分析：相对于脂质囊泡的浓度来绘制FXa的生成速率(图124A)。正如所料，FXa的生成随脂质浓度的增加而增加，这是因为更多的表面积可用于反应。在足够高的脂质浓度下，随着FVIIa和FX被分离至不同的脂质囊泡上，反应速率降低。这个系统预计将具有该模板反应。数据未被拟合至等式且所示的线仅供视觉参考。MOD-5000和MOD-5014之间FXa生成速率的差异并不是由于对脂质的亲和性的差异而造成的。这被示于图124B中，其中相对于每一个的最大值的FXa相对于脂质浓度绘制生成速率。
结论：相对于MOD-5000而言，MOD-5014在不存在TF的情况下的FX活化速率更低(～60％)。MOD-5014对脂质的亲和性与MOD-5000相同。
由脂质结合MOD-5014进行的FX活化的动力学
基本原理：相对于MOD-5000而言，MOD-5014在不存在TF的情况下的降低的FX活化速率可能是降低的对FXa的亲和性或一旦其被结合至脂质表面上的酶而减少的FX代谢回转的结果。
方法：用固定浓度的FVIIa和脂质囊泡来温育变化浓度的FX。通过合成底物(Pefachrome FXa)的切割来评估因子X的活化。通过标准曲线将合成底物的切割转换成FXa浓度。
结果
浓度：FVIIa 20nM；FX 0-2500nM；脂质100μM；底物500μM.
分析：随着添加了更多的FX，在脂质表面上的更多的FVIIa将使FX结合至所有FVIIa均被结合至FX的点。在该点上，反应受限于FX的活化速率。因此，FX活化的速率将随着FX浓度的增加而增加，其具有渐近地接近最大速率的曲线形状。正如所料，在不存在TF的情况下FVIIa对FX的亲和性下降(更高的Km)，且在不存在TF的情况下FXa的生成速率降低(图125)。
数据被拟合至：
结论：相对于MOD-5000而言，MOD-5014在不存在TF的情况下在脂质表面上的FX活化速率更低。在脂质表面上的FX至MOD-5014的结合与其至MOD-5000的结合相同(图125)。
由AT进行的MOD-5014灭活
基本原理：FVIIa体内清除的重要部分被认为是通过与AT形成FVIIa复合物。当FVIIa被结合至TF时，该反应的速率仅可在体外测量。为了以可测量的速率进行，体外反应也需要高浓度的肝素，其被认为模拟了天然存在的糖胺聚糖的作用。
方法：因子VIIa用TF进行温育以使得形成复合物。将该复合物用AT和肝素进行温育。通过添加聚凝胺(溴化己二甲铵)中和肝素来按安排的间隔停止反应。通过合成底物(Pefachrome FVIIa)的切割来测量剩余的FVIIa/TF的活性。在该测定中所使用的浓度下，聚凝胺未改变底物切割。
结果
浓度：FVIIa 10nM；TF 11nM；AT 1μM；肝素5U/mL；FVIIa/TF 8.2nM；聚凝胺100μg/mL；底物500μM。
分析：相对于以分钟计的时间来绘制作为底物切割的速率测得的FVIIa/TF的浓度(图126)。正如所料，AT/肝素抑制了FVIIa，这导致了FVIIa/TF活性的损失。
数据被拟合至：
v＝Vt＝0e-k·时间
结论：在T＝0处的活性的相似值表明在反应中存在有等量的MOD-5000和MOD-5014。与MOD-5000相比，MOD-5014得以稍微更缓慢地抑制(62％)(图126)。两个反应都继续进行至完全抑制。
由TFPI进行的MOD-5014灭活
基本原理：TFPI是FVIIa/TF复合物的生理抑制剂。TFPI的K2结构域与FXa形成了初始复合物。该复合物结合了FVIIa/TPI，其中TFPI的K1结构域与FVIIa相互作用。因此，通过FVIIa/TF进行的FX活化将导致抑制的复合物并关闭FVIIa-TFPI。
方法：将因子VIIa和TF一起温育以形成复合物。将复合物添加至TFPI/FX/FXa底物中。通过合成底物(Pefachrome FXa)的切割来评估因子X的活化。通过标准曲线将合成底物的切割转换成FXa浓度。
结果
浓度-抑制：FVIIa 1nM；TF 20pM；FX 135nM；TFPI 0-5nM；底物500μM。
分析：正如所料，在所有反应中最初的FXa生成是以相同速率发生的(图127A-图127C)。在TFPI存在的情况下，由于FVIIa/TFPI复合物受到TFPI/FXa的抑制(下面两栏)，FXa的生成速率减慢。在较高浓度的TFPI下，TFPI复合物的关闭发生得更快(下面两栏)。在FVIIa/TFPI关闭之前形成的FXa的量是TFPI与FVIIa/TF相互作用的量度。由于MOD-5014具有稍微降低的FXa生成速率(其因此会减缓FXa/TFPI复合物的形成)，所以与MOD-5000相比，MOD-5014使该反应花费更长的时间以达到稳定。
结论：如上栏所示，MOD-5014/TF的FXa生成的TFPI抑制的浓度依赖性与MOD-5000的非常相似。MOD-5014可能对TFPI抑制稍微更敏感(124％)；可替选地，这可能是稍慢的FXa生成速率的人为因素。
虽然本文已经说明和描述了本公开的某些特征，但本领域的普通技术人员现在将想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，要理解的是，所附权利要求旨在涵盖落在本公开的真实精神内的所有这些修改和变化。
序列表
<110> OPKO生物科学有限公司（OPKO Biologics Ltd.）
乌迪·埃亚尔·菲玛（FIMA, UDI EYAL）
吉里·哈特（HART, GILI）
<120> 长效凝固因子及其产生方法
<130> P-9520-PC7
<150> 62/182,370
<151> 2015-06-19
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg 240
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aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420
cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct 480
ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct 540
attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600
cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660
gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720
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ggaaccttga gagagaatgt atggaagaaa agtgtagttt tgaagaagca cgagaagttt 240
ttgaaaacac tgaaagaaca actgaatttt ggaagcagta tgttgatgga gatcagtgtg 300
agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt gcaaggatga cattaattcc tatgaatgtt 360
ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact gtgaattaga tgtaacatgt aacattaaga 420
atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata gtgctgataa caaggtggtt tgctcctgta 480
ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga agtcctgtga accagcagtg ccatttccat 540
gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta agctcacccg tgctgagact gtttttcctg 600
atgtggacta tgtaaattct actgaagctg aaaccatttt ggataacatc actcaaagca 660
cccaatcatt taatgacttc actcgagttg ttggtggaga agatgccaaa ccaggtcaat 720
tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt ctgtggaggc tctatcgtta 780
atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac tggtgttaaa attacagttg 840
tcgcaggtga acataatatt gaggagacag aacatacaga gcaaaagcga aatgtgattc 900
gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag ctattaataa gtacaaccat gacattgccc 960
ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt tacacctatt tgcattgctg 1020
acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt ggctggggaa 1080
gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttctccagta ccttagagtt ccacttgttg 1140
accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta taacaacatg ttctgtgctg 1200
gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc catgttactg 1260
aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaagag tgtgcaatga 1320
aaggcaaata tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactggatt aaggaaaaaa 1380
caaagctcac ttgaacgcgg ccgc 1404
<210> 17
<211> 461
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
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50 55 60
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Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
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130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
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195 200 205
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Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
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Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
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420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
450 455 460
<210> 18
<211> 1502
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> 经CTP修饰的因子IX
<400> 18
gcgatcgcca tgcagcgcgt gaacatgatc atggcagaat caccaggcct catcaccatc 60
tgccttttag gatatctact cagtgctgaa tgtacagttt ttcttgatca tgaaaacgcc 120
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gagtccaatc catgtttaaa tggcggcagt tgcaaggatg acattaattc ctatgaatgt 360
tggtgtccct ttggatttga aggaaagaac tgtgaattag atgtaacatg taacattaag 420
aatggcagat gcgagcagtt ttgtaaaaat agtgctgata acaaggtggt ttgctcctgt 480
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ttcccttggc aggttgtttt gaatggtaaa gttgatgcat tctgtggagg ctctatcgtt 780
aatgaaaaat ggattgtaac tgctgcccac tgtgttgaaa ctggtgttaa aattacagtt 840
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gc 1502
<210> 19
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 经CTP修饰的因子IX
<400> 19
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1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
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180 185 190
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195 200 205
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Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
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Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
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485
<210> 20
<211> 1585
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> 经CTP修饰的因子IX
<400> 20
gcgatcgcca tgcagcgcgt gaacatgatc atggcagaat caccaggcct catcaccatc 60
tgccttttag gatatctact cagtgctgaa tgtacagttt ttcttgatca tgaaaacgcc 120
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gggaaccttg agagagaatg tatggaagaa aagtgtagtt ttgaagaagc acgagaagtt 240
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acccaatcat ttaatgactt cactcgagtt gttggtggag aagatgccaa accaggtcaa 720
ttcccttggc aggttgtttt gaatggtaaa gttgatgcat tctgtggagg ctctatcgtt 780
aatgaaaaat ggattgtaac tgctgcccac tgtgttgaaa ctggtgttaa aattacagtt 840
gtcgcaggtg aacataatat tgaggagaca gaacatacag agcaaaagcg aaatgtgatt 900
cgaattattc ctcaccacaa ctacaatgca gctattaata agtacaacca tgacattgcc 960
cttctggaac tggacgaacc cttagtgcta aacagctacg ttacacctat ttgcattgct 1020
acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt ggctggggaa 1080
gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttcttcagta ccttagagtt ccacttgttg 1140
accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta taacaacatg ttctgtgctg 1200
gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc catgttactg 1260
aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaagag tgtgcaatga 1320
aaggcaaata tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactggatt aaggaaaaaa 1380
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<210> 21
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 经CTP修饰的因子IX
<400> 21
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
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Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
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275 280 285
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370 375 380
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435 440 445
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Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
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515
<210> 22
<211> 2413
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
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ggcatcgaga agaaccaccc ggacttggca ggcaattatg atcctggggc cagttttgat 540
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ggccccgagg atgacggcaa gacagtggat gggccagccc gcctcgccga ggaggccttc 840
ttccgtgggg ttagccaggg ccgagggggg ctgggctcca tctttgtctg ggcctcgggg 900
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ctcaccgagc ccaaagacat cgggaaacgg ctcgaggtgc ggaagaccgt gaccgcgtgc 1440
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tataatcgcc gtggcgacct ggccatccac ctggtcagcc ccatgggcac ccgctccacc 1560
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agcgaagcca acaactatgg gacgctgacc aagttcaccc tcgtactcta tggcaccgcc 1740
cctgaggggc tgcccgtacc tccagaaagc agtggctgca agaccctcac gtccagtcag 1800
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tgaacgcggc cgc 2413
<210> 23
<211> 794
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Met Glu Leu Arg Pro Trp Leu Leu Trp Val Val Ala Ala Thr Gly Thr
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Ala Ala Asp Ala Gln Gly Gln Lys Val Phe Thr Asn
20 25 30
Thr Trp Ala Val Arg Ile Pro Gly Gly Pro Ala Val Ala Asn Ser Val
35 40 45
Ala Arg Lys His Gly Phe Leu Asn Leu Gly Gln Ile Phe Gly Asp Tyr
50 55 60
Tyr His Phe Trp His Arg Gly Val Thr Lys Arg Ser Leu Ser Pro His
65 70 75 80
Arg Pro Arg His Ser Arg Leu Gln Arg Glu Pro Gln Val Gln Trp Leu
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100 105 110
Pro Thr Asp Pro Lys Phe Pro Gln Gln Trp Tyr Leu Ser Gly Val Thr
115 120 125
Gln Arg Asp Leu Asn Val Lys Ala Ala Trp Ala Gln Gly Tyr Thr Gly
130 135 140
His Gly Ile Val Val Ser Ile Leu Asp Asp Gly Ile Glu Lys Asn His
145 150 155 160
Pro Asp Leu Ala Gly Asn Tyr Asp Pro Gly Ala Ser Phe Asp Val Asn
165 170 175
Asp Gln Asp Pro Asp Pro Gln Pro Arg Tyr Thr Gln Met Asn Asp Asn
180 185 190
Arg His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Val Ala Ala Val Ala Asn Asn
195 200 205
Gly Val Cys Gly Val Gly Val Ala Tyr Asn Ala Arg Ile Gly Gly Val
210 215 220
Arg Met Leu Asp Gly Glu Val Thr Asp Ala Val Glu Ala Arg Ser Leu
225 230 235 240
Gly Leu Asn Pro Asn His Ile His Ile Tyr Ser Ala Ser Trp Gly Pro
245 250 255
Glu Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Gly Pro Ala Arg Leu Ala Glu Glu
260 265 270
Ala Phe Phe Arg Gly Val Ser Gln Gly Arg Gly Gly Leu Gly Ser Ile
275 280 285
Phe Val Trp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Arg Glu His Asp Ser Cys Asn
290 295 300
Cys Asp Gly Tyr Thr Asn Ser Ile Tyr Thr Leu Ser Ile Ser Ser Ala
305 310 315 320
Thr Gln Phe Gly Asn Val Pro Trp Tyr Ser Glu Ala Cys Ser Ser Thr
325 330 335
Leu Ala Thr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Gln Asn Glu Lys Gln Ile Val
340 345 350
Thr Thr Asp Leu Arg Gln Lys Cys Thr Glu Ser His Thr Gly Thr Ser
355 360 365
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370 375 380
Asn Lys Asn Leu Thr Trp Arg Asp Met Gln His Leu Val Val Gln Thr
385 390 395 400
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405 410 415
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Ala Met Val Ala Leu Ala Gln Asn Trp Thr Thr Val Ala Pro Gln Arg
435 440 445
Lys Cys Ile Ile Asp Ile Leu Thr Glu Pro Lys Asp Ile Gly Lys Arg
450 455 460
Leu Glu Val Arg Lys Thr Val Thr Ala Cys Leu Gly Glu Pro Asn His
465 470 475 480
Ile Thr Arg Leu Glu His Ala Gln Ala Arg Leu Thr Leu Ser Tyr Asn
485 490 495
Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ile His Leu Val Ser Pro Met Gly Thr Arg
500 505 510
Ser Thr Leu Leu Ala Ala Arg Pro His Asp Tyr Ser Ala Asp Gly Phe
515 520 525
Asn Asp Trp Ala Phe Met Thr Thr His Ser Trp Asp Glu Asp Pro Ser
530 535 540
Gly Glu Trp Val Leu Glu Ile Glu Asn Thr Ser Glu Ala Asn Asn Tyr
545 550 555 560
Gly Thr Leu Thr Lys Phe Thr Leu Val Leu Tyr Gly Thr Ala Pro Glu
565 570 575
Gly Leu Pro Val Pro Pro Glu Ser Ser Gly Cys Lys Thr Leu Thr Ser
580 585 590
Ser Gln Ala Cys Val Val Cys Glu Glu Gly Phe Ser Leu His Gln Lys
595 600 605
Ser Cys Val Gln His Cys Pro Pro Gly Phe Ala Pro Gln Val Leu Asp
610 615 620
Thr His Tyr Ser Thr Glu Asn Asp Val Glu Thr Ile Arg Ala Ser Val
625 630 635 640
Cys Ala Pro Cys His Ala Ser Cys Ala Thr Cys Gln Gly Pro Ala Leu
645 650 655
Thr Asp Cys Leu Ser Cys Pro Ser His Ala Ser Leu Asp Pro Val Glu
660 665 670
Gln Thr Cys Ser Arg Gln Ser Gln Ser Ser Arg Glu Ser Pro Pro Gln
675 680 685
Gln Gln Pro Pro Arg Leu Pro Pro Glu Val Glu Ala Gly Gln Arg Leu
690 695 700
Arg Ala Gly Leu Leu Pro Ser His Leu Pro Glu Val Val Ala Gly Leu
705 710 715 720
Ser Cys Ala Phe Ile Val Leu Val Phe Val Thr Val Phe Leu Val Leu
725 730 735
Gln Leu Arg Ser Gly Phe Ser Phe Arg Gly Val Lys Val Tyr Thr Met
740 745 750
Asp Arg Gly Leu Ile Ser Tyr Lys Gly Leu Pro Pro Glu Ala Trp Gln
755 760 765
Glu Glu Cys Pro Ser Asp Ser Glu Glu Asp Glu Gly Arg Gly Glu Arg
770 775 780
Thr Ala Phe Ile Lys Asp Gln Ser Ala Leu
785 790
<210> 24
<211> 1621
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> 经CTP修饰的因子VII
<400> 24
ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc 60
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cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc tggagaggga gtgcaaggag 180
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ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc 300
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aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420
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ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct 540
attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600
cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660
gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720
aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780
gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840
aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg 900
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ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc 1020
ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac 1080
tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc 1140
tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacc 1200
ggcatcgtga gctggggcca gggctgcgcc accgtgggcc acttcggcgt gtacaccagg 1260
gtgtcccagt acatcgagtg gctgcagaaa ctgatgagaa gcgagcccag acccggcgtg 1320
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ctgccccagt cctccagcag taaggctccc cctccatctc tgccatcccc cagcagactg 1560
ccaggccctt ctgatacacc catcctccca cagtgatgag gatccgcggc cgcttaatta 1620
a 1621
<210> 25
<211> 528
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 经CTP修饰的因子VII
<400> 25
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
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Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
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Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
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Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
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Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
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Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
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Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395 400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
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Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ser Ser Ser Ser
435 440 445
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Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro
465 470 475 480
Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro
485 490 495
Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
500 505 510
Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
515 520 525
<210> 26
<211> 1607
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> 经CTP修饰的因子VII
<400> 26
ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc 60
tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg 120
cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc tggagaggga gtgcaaggag 180
gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg 240
ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc 300
tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg 360
aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420
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attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600
cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660
gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720
aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780
gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840
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cctagcagac tgcctgggcc cagtgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctccagcaag 1440
gccccacccc ctagcctgcc ttctccttct cggctgcctg gccccagcga tactccaatt 1500
ctgccccagt cctccagcag taaggctccc cctccatctc tgccatcccc cagcagactg 1560
ccaggccctt ctgatacacc catcctccca cagtgatgag gatccgc 1607
<210> 27
<211> 532
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 经CTP修饰的因子VII
<400> 27
Leu Glu Asp Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Leu Gln Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala
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His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu
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Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys
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Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe
100 105 110
Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp
115 120 125
Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser
130 135 140
Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser
145 150 155 160
Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys
165 170 175
Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly
180 185 190
Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln
195 200 205
Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile
210 215 220
Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys
225 230 235 240
Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu
245 250 255
His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro
260 265 270
Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg
275 280 285
Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu
290 295 300
Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser
305 310 315 320
Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu
325 330 335
Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu
340 345 350
Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met
355 360 365
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370 375 380
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Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ser
435 440 445
Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu
450 455 460
Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys
465 470 475 480
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
485 490 495
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
500 505 510
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
515 520 525
Leu Pro Gln Gly
530
<210> 28
<211> 1775
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 经CTP修饰的因子VII
<400> 28
ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc 60
tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg 120
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gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg 240
ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc 300
tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg 360
aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420
cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct 480
ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct 540
attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600
cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660
gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720
aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780
gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840
aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg 900
cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc tggccttcgt gcgcttctca 960
ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc 1020
ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac 1080
tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc 1140
tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacc 1200
ggcatcgtga gctggggcca gggctgcgcc accgtgggcc acttcggcgt gtacaccagg 1260
gtgtcccagt acatcgagtg gctgcagaaa ctgatgagaa gcgagcccag acccggcgtg 1320
ctgctgagag cccccttccc cagcagcagc tccaaggccc ctccccctag cctgcccagc 1380
cctagcagac tgcctgggcc ctctgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctcctctaag 1440
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<210> 29
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 经CTP修饰的因子VII
<400> 29
Leu Glu Asp Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Leu Gln Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala
20 25 30
His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu
35 40 45
Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser
50 55 60
Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu
65 70 75 80
Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys
85 90 95
Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe
100 105 110
Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp
115 120 125
Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser
130 135 140
Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser
145 150 155 160
Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys
165 170 175
Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly
180 185 190
Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln
195 200 205
Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile
210 215 220
Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys
225 230 235 240
Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu
245 250 255
His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro
260 265 270
Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg
275 280 285
Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu
290 295 300
Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser
305 310 315 320
Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu
325 330 335
Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu
340 345 350
Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met
355 360 365
Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp
370 375 380
Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr
385 390 395 400
Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly
405 410 415
Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met
420 425 430
Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ser
435 440 445
Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu
450 455 460
Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys
465 470 475 480
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
485 490 495
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
500 505 510
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
515 520 525
Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser
530 535 540
Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser
545 550 555 560
Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu
565 570 575
Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly Ser
580 585
<210> 30
<211> 1673
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 经CTP修饰的因子IX
<400> 30
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cgagaagttt ttgaaaacac tgaaagaaca actgaatttt ggaagcagta tgttgatgga 300
gatcagtgtg agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt gcaaggatga cattaattcc 360
tatgaatgtt ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact gtgaattaga tgtaacatgt 420
aacattaaga atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata gtgctgataa caaggtggtt 480
tgctcctgta ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga agtcctgtga accagcagtg 540
ccatttccat gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta agctcacccg tgctgaggca 600
gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct actgaagctg aaaccatttt ggataacatc 660
actcaaagca cccaatcatt taatgacttc actcgagttg ttggtggaga agatgccaaa 720
ccaggtcaat tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt ctgtggaggc 780
tctatcgtta atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac tggtgttaaa 840
attacagttg tcgcaggtga acataatatt gaggagacag aacatacaga gcaaaagcga 900
aatgtgattc gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag ctattaataa gtacaaccat 960
gacattgccc ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt tacacctatt 1020
tgcattgctg acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt 1080
ggctggggaa gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttcttcagta ccttagagtt 1140
ccacttgttg accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta taacaacatg 1200
ttctgtgctg gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc 1260
catgttactg aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaagag 1320
tgtgcaatga aaggcaaata tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactggatt 1380
aaggaaaaaa caaagctcac tagctccagc agcaaggccc ctcccccgag cctgccctcc 1440
ccaagcaggc tgcctgggcc cagtgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctccagcaag 1500
gccccacccc ctagcctgcc ttctccttct cggctgcctg gccccagcga tactccaatt 1560
ctgccccagt cctccagcag taaggctccc cctccatctc tgccatcccc cagcagactg 1620
ccaggccctt ctgatacacc catcctccca cagtgatgag gatccgcggc cgc 1673
<210> 31
<211> 545
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 经CTP修饰的因子IX
<400> 31
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
65 70 75 80
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe
210 215 220
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn
290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr Ser Ser Ser
450 455 460
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
485 490 495
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
500 505 510
Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
515 520 525
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
530 535 540
Gln
545
<210> 32
<211> 1757
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 经CTP修饰的因子IX
<400> 32
tctagagtcg accccgccat gcagcgcgtg aacatgatca tggcagaatc accaggcctc 60
atcaccatct gccttttagg atatctactc agtgctgaat gtacagtttt tcttgatcat 120
gaaaacgcca acaaaattct gaatcggcca aagaggtata attcaggtaa attggaagag 180
tttgttcaag ggaaccttga gagagaatgt atggaagaaa agtgtagttt tgaagaagca 240
cgagaagttt ttgaaaacac tgaaagaaca actgaatttt ggaagcagta tgttgatgga 300
gatcagtgtg agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt gcaaggatga cattaattcc 360
tatgaatgtt ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact gtgaattaga tgtaacatgt 420
aacattaaga atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata gtgctgataa caaggtggtt 480
tgctcctgta ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga agtcctgtga accagcagtg 540
ccatttccat gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta agctcacccg tgctgaggca 600
gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct actgaagctg aaaccatttt ggataacatc 660
actcaaagca cccaatcatt taatgacttc actcgagttg ttggtggaga agatgccaaa 720
ccaggtcaat tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt ctgtggaggc 780
tctatcgtta atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac tggtgttaaa 840
attacagttg tcgcaggtga acataatatt gaggagacag aacatacaga gcaaaagcga 900
aatgtgattc gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag ctattaataa gtacaaccat 960
gacattgccc ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt tacacctatt 1020
tgcattgctg acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt 1080
ggctggggaa gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttcttcagta ccttagagtt 1140
ccacttgttg accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta taacaacatg 1200
ttctgtgctg gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc 1260
catgttactg aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaagag 1320
tgtgcaatga aaggcaaata tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactggatt 1380
aaggaaaaaa caaagctcac tagctccagc agcaaggccc ctcccccgag cctgccctcc 1440
ccaagcaggc tgcctgggcc ctctgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctcctctaag 1500
gccccaccac cttccctgcc tagcccttca agactgccag gccctagcga tacaccaatt 1560
ctgccccagt cctccagcag caaggctccc ccacctagcc tgccttctcc atcaaggctg 1620
cctggcccat ccgatacccc aattttgcct cagagcagct ctagcaaggc acctcccccc 1680
agtctgccct ctccaagcag actccctggc ccttcagaca ctcccattct gccacagtga 1740
tgaggatccg cggccgc 1757
<210> 33
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 经CTP修饰的因子IX
<400> 33
Ser Arg Val Asp Pro Ala Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu
1 5 10 15
Ser Pro Gly Leu Ile Thr Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala
20 25 30
Glu Cys Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn
35 40 45
Arg Pro Lys Arg Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly
50 55 60
Asn Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala
65 70 75 80
Arg Glu Val Phe Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln
85 90 95
Tyr Val Asp Gly Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly
100 105 110
Ser Cys Lys Asp Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly
115 120 125
Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn
130 135 140
Gly Arg Cys Glu Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val
145 150 155 160
Cys Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys
165 170 175
Glu Pro Ala Val Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val
195 200 205
Asn Ser Thr Glu Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr
210 215 220
Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys
225 230 235 240
Pro Gly Gln Phe Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala
245 250 255
Phe Cys Gly Gly Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala
260 265 270
His Cys Val Glu Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His
275 280 285
Asn Ile Glu Glu Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg
290 295 300
Ile Ile Pro His His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His
305 310 315 320
Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr
325 330 335
Val Thr Pro Ile Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu
340 345 350
Lys Phe Gly Ser Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys
355 360 365
Gly Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp
370 375 380
Arg Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met
385 390 395 400
Phe Cys Ala Gly Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp
405 410 415
Ser Gly Gly Pro His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr
420 425 430
Gly Ile Ile Ser Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly
435 440 445
Ile Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr
450 455 460
Lys Leu Thr Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser
465 470 475 480
Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser
485 490 495
Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu
500 505 510
Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys
515 520 525
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
530 535 540
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
545 550 555 560
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
565 570 575
Leu Pro Gln Gly Ser Ala Ala
580
<210> 34
<211> 1840
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 经CTP修饰的因子IX
<400> 34
ctagagtcga ccccgccatg cagcgcgtga acatgatcat ggcagaatca ccaggcctca 60
tcaccatctg ccttttagga tatctactca gtgctgaatg tacagttttt cttgatcatg 120
aaaacgccaa caaaattctg aatcggccaa agaggtataa ttcaggtaaa ttggaagagt 180
ttgttcaagg gaaccttgag agagaatgta tggaagaaaa gtgtagtttt gaagaagcac 240
gagaagtttt tgaaaacact gaaagaacaa ctgaattttg gaagcagtat gttgatggag 300
atcagtgtga gtccaatcca tgtttaaatg gcggcagttg caaggatgac attaattcct 360
atgaatgttg gtgtcccttt ggatttgaag gaaagaactg tgaattagat gtaacatgta 420
acattaagaa tggcagatgc gagcagtttt gtaaaaatag tgctgataac aaggtggttt 480
gctcctgtac tgagggatat cgacttgcag aaaaccagaa gtcctgtgaa ccagcagtgc 540
catttccatg tggaagagtt tctgtttcac aaacttctaa gctcacccgt gctgaggcag 600
tttttcctga tgtggactat gtaaattcta ctgaagctga aaccattttg gataacatca 660
ctcaaagcac ccaatcattt aatgacttca ctcgagttgt tggtggagaa gatgccaaac 720
caggtcaatt cccttggcag gttgttttga atggtaaagt tgatgcattc tgtggaggct 780
ctatcgttaa tgaaaaatgg attgtaactg ctgcccactg tgttgaaact ggtgttaaaa 840
ttacagttgt cgcaggtgaa cataatattg aggagacaga acatacagag caaaagcgaa 900
atgtgattcg aattattcct caccacaact acaatgcagc tattaataag tacaaccatg 960
acattgccct tctggaactg gacgaaccct tagtgctaaa cagctacgtt acacctattt 1020
gcattgctga caaggaatac acgaacatct tcctcaaatt tggatctggc tatgtaagtg 1080
gctggggaag agtcttccac aaagggagat cagctttagt tcttcagtac cttagagttc 1140
cacttgttga ccgagccaca tgtcttcgat ctacaaagtt caccatctat aacaacatgt 1200
tctgtgctgg cttccatgaa ggaggtagag attcatgtca aggagatagt gggggacccc 1260
atgttactga agtggaaggg accagtttct taactggaat tattagctgg ggtgaagagt 1320
gtgcaatgaa aggcaaatat ggaatatata ccaaggtatc ccggtatgtc aactggatta 1380
aggaaaaaac aaagctcact agctccagca gcaaggcccc tcccccgagc ctgccctccc 1440
caagcaggct gcctgggccc tctgacaccc ctatcctgcc tcagtccagc tcctctaagg 1500
ctccaccacc ttccctgcct agcccttcaa gactgccagg ccctagcgat acaccaattc 1560
tgccccagtc ctccagcagc aaggctcccc cacctagcct gccttctcca tcaaggctgc 1620
ctggcccatc cgatacccca attttgcctc agagcagctc tagcaaggca cctcccccca 1680
gtctgccctc tccaagcaga ctccctggcc cttcagacac tccaatcctc ccacagtcct 1740
ctagctctaa agctccacct cccagcctgc ccagccctag tagactcccc ggaccttctg 1800
atacccccat cttgccccag tgatgaggat ccgcggccgc 1840
<210> 35
<211> 610
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 经CTP修饰的因子IX
<400> 35
Arg Val Asp Pro Ala Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser
1 5 10 15
Pro Gly Leu Ile Thr Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu
20 25 30
Cys Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg
35 40 45
Pro Lys Arg Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg
65 70 75 80
Glu Val Phe Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr
85 90 95
Val Asp Gly Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser
100 105 110
Cys Lys Asp Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe
115 120 125
Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly
130 135 140
Arg Cys Glu Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys
145 150 155 160
Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu
165 170 175
Pro Ala Val Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Arg Ala Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn
195 200 205
Ser Thr Glu Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln
210 215 220
Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro
225 230 235 240
Gly Gln Phe Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe
245 250 255
Cys Gly Gly Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His
260 265 270
Cys Val Glu Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn
275 280 285
Ile Glu Glu Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile
290 295 300
Ile Pro His His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp
305 310 315 320
Ile Ala Leu Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val
325 330 335
Thr Pro Ile Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys
340 345 350
Phe Gly Ser Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly
355 360 365
Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg
370 375 380
Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe
385 390 395 400
Cys Ala Gly Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser
405 410 415
Gly Gly Pro His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly
420 425 430
Ile Ile Ser Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile
435 440 445
Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys
450 455 460
Leu Thr Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro
465 470 475 480
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser
485 490 495
Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro
500 505 510
Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala
515 520 525
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
530 535 540
Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
545 550 555 560
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
565 570 575
Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro
580 585 590
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly Ser
595 600 605
Ala Ala
610
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 用于FIX-(CTP)2的引物101
<400> 36
gtttagtgaa ccgtcagaat 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 用于FIX-(CTP)2的引物103-R
<400> 37
ttgaggaaga tgttcgtgta 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 用于FIX-(CTP)2的引物98
<400> 38
attacagttg tcgcaggtga 20
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 用于FIX-(CTP)2的引物99
<400> 39
gctggagcta gtgagctttg ttttttcctt 30
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 用于FIX-(CTP)2的引物100
<400> 40
gctcactagc tccagcagca aggcc 25
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 用于FIX-(CTP)2的引物27-R
<400> 41
ttttcactgc attctagttg tgg 23
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 引物75
<400> 42
ctcccagttc aattacagct 20
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 引物122r
<400> 43
ggaaaaactg cctcagcacg ggtgagc 27
<210> 44
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 引物123
<400> 44
gtgctgaggc agtttttcct gatgtggact at 32
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_structure
<223> 引物124r
<400> 45
caacacagtg ggcagcag 18
<210> 46
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> MUTAGEN
<223> 因子VII-CTP-CTP-CTP无信号肽
<400> 46
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu
1 5 10 15
Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys
20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp
35 40 45
Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln
50 55 60
Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn
65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly
85 90 95
Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys
100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr
115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg
130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro
145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln
165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala
180 185 190
His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu
195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg
210 215 220
Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn
225 230 235 240
His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp
245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr
260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu
275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg
290 295 300
Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser
305 310 315 320
Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser
325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr
340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys
355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile
370 375 380
Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu
385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
405 410 415
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
420 425 430
Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro
435 440 445
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser
450 455 460
Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
485 490
Claims (32)
1.药物制剂在制备用于降低因子VIIa凝固因子的给药频率的药物中的用途，其中，所述药物制剂包括缓冲液、张度剂和经绒毛膜促性腺激素羧基末端肽修饰的多肽，所述经绒毛膜促性腺激素羧基末端肽修饰的多肽由因子VII凝固因子和被附接至所述凝固因子的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽组成。
2.药物制剂在制备用于延长因子VII凝固因子的生物半衰期的药物中的用途，其中，所述药物制剂包括缓冲液、张度剂和经绒毛膜促性腺激素羧基末端肽修饰的多肽，所述经绒毛膜促性腺激素羧基末端肽修饰的多肽由因子VII凝固因子和被附接至所述凝固因子的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽组成。
3.药物制剂在制备用于改进因子VII凝固因子的曲线下面积的药物中的用途，其中，所述药物制剂包括缓冲液、张度剂和经绒毛膜促性腺激素羧基末端肽修饰的多肽，所述经绒毛膜促性腺激素羧基末端肽修饰的多肽由因子VII凝固因子和被附接至所述凝固因子的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽组成。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述羧基末端肽修饰的多肽不包括信号肽。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中，所述药物制剂处于6.4的pH。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中，所述张度剂为150mM氯化钠。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中，所述缓冲液包括20mM柠檬酸盐。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中，所述缓冲液包括20mM柠檬酸盐和13.3mM甘氨酸。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的用途，其中，所述药物制剂包括20mM柠檬酸盐、13.3mM甘氨酸、150mM氯化钠，并且处于6.4的pH。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的用途，其中，所述药物制剂是液体制剂。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的用途，其中，至少一个羧基末端肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的用途，其中，所述羧基末端肽中的至少一个被截短。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的用途，其中，羧基末端肽中的至少一个是糖基化的。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的用途，其中，至少一个羧基末端肽可选地经连接子被附接至所述凝固因子。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的用途，其中，所述羧基末端肽修饰的多肽的序列在SEQ ID NO:46中列出。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的用途，其中，所述因子VII凝固因子包括活化的因子VII凝固因子。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述羧基末端肽修饰的多肽包括由二硫键连接的轻链和重链。
18.根据权利要求17所述的用途，其中，所述轻链包括SEQ ID NO:46的氨基酸1-152并且所述重链包括SEQ ID NO:46的氨基酸153-490。
19.根据权利要求17-18中任一项所述的用途，其中，所述轻链和所述重链在SDS-PAGE凝胶上的分离发生在变性条件下，且其中所述轻链以25kDa分子量迁移，且所述重链以60kDa分子量迁移。
20.根据权利要求17-18中任一项所述的用途，其中，所述二硫键出现在SEQ ID NO:46的半胱氨酸残基135和半胱氨酸残基262之间。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的用途，其中，将所述药物制剂给予受试者。
22.根据权利要求21所述的用途，其中，所述受试者是人类成人或人类儿童。
23.根据权利要求21-22中任一项所述的用途，其中，所述受试者患有血液凝结或凝固障碍。
24.根据权利要求23所述的用途，其中，所述障碍是血友病。
25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述血友病包括血友病A或血友病B。
26.根据权利要求24所述的用途，其中，所述血友病包括具有抑制剂的血友病A或血友病B。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的用途，其中，所述给予是通过皮下或静脉途径进行的。
28.根据权利要求21-27中任一项所述的用途，其中，所述多肽是按每日、每隔一日、每三日、每周一次、每周两次或每隔一周一次或它们的任何组合来进行给予的。
29.根据权利要求21-28中任一项所述的用途，其中，以50μg/Kg至400μg/Kg的所述羧基末端肽修饰的多肽进行所述给予。
30.根据权利要求14所述的用途，其中，所述连接子为肽键。
31.药物制剂在制备用于治疗血液凝结或凝固障碍的药物中的用途，其中，所述药物制剂包括缓冲液、张度剂和经绒毛膜促性腺激素羧基末端肽修饰的多肽，所述经绒毛膜促性腺激素羧基末端肽修饰的多肽由因子VII凝固因子和被附接至所述凝固因子的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽组成，其中，所述药物制剂用于降低因子VIIa凝固因子的给药频率、延长因子VIIa凝固因子的生物半衰期、和/或改进因子VIIa凝固因子的曲线下面积。
32.缓冲液、张度剂和经绒毛膜促性腺激素羧基末端肽修饰的多肽在制备用于治疗血液凝结或凝固障碍的药物制剂中的用途，所述经绒毛膜促性腺激素羧基末端肽修饰的多肽由因子VII凝固因子和被附接至所述凝固因子的羧基末端的三个绒毛膜促性腺激素羧基末端肽组成，其中，所述药物制剂用于降低因子VIIa凝固因子的给药频率、延长因子VIIa凝固因子的生物半衰期、和/或改进因子VIIa凝固因子的曲线下面积。
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