KR102662956B1 - 장기-작용성 응고 인자 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

카복시 말단에 부착되지만 응고 인자의 아미노 말단에는 부착되지 않는 융모성 성선자극호르몬의 적어도 1종의 카복시-말단 펩타이드 (CTP) 를 포함하는 폴리펩타이드 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 개시된다. 본 개시내용의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적 제형 및 이것을 사용하고 생성하는 방법이 또한 개시된다.

Description

장기-작용성 응고 인자 및 그의 제조 방법{LONG-ACTING COAGULATION FACTORS AND METHODS OF PRODUCING SAME}
개시내용의 분야
응고 인자의 카복시 말단에 부착된 융모성 성선자극호르몬의 적어도 1종의 카복시-말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 폴리펩타이드 및 상기를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 개시된다. 본 개시내용의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적 제형 그리고 상기의 이용 및 생산 방법은 또한 개시된다.
배경
응고 인자 대체 요법의 개발은 혈우병을 가진 많은 개체의 생명을 변화시켜왔다. 혈우병은 혈액 응고 또는 응고를 제어하는 신체의 능력을 손상시키는 선천성 유전적 장애의 그룹이다. 혈우병을 가진 환자는, 효과적인 혈액 응고에 필요한, 인자 VIII 또는 인자 IX 단백질의 적절한 양을 생산하지 못한다. 중증 혈우병에 있어서 심지어 소수의 손상이 며칠 또는 몇주 계속하는 혈액 손실을 초래할 수 있고, 완전한 치유는 일어날 수 없어서, 관절 및 다른 기관에 영구적 손상, 및 조기 사망으로 쇠약하게 하는 잠재력을 초래한다.
혈우병은 응고 캐스케이드에서 결정적 인자의 결함에 의해, 또는 부재하에 야기된 선천적, X-염색체-연결된 출혈성 장애이다. 혈우병 환자에 있어서, 트롬빈 생성 및 피브린 응괴 형성은 엄격히 약화되어, 관절 및 내부 기관에서 가장 통상적으로 자발적인 출혈 에피소드, 및 수술 또는 트라우마 동안 및 이후 과도한 출혈을 초래한다. 빈번한 출혈은 또한 혈우병 환자에서 관절 팽윤, 관절 손상, 중증 기형, 빈번한 감염, 및 감소된 이동도를 유발할 수 있다 (Mayo Clinic). 혈우병 A는 인자 VIII 발현의 결함에 의해 또는 부족으로 야기되고, 반면에 혈우병 B는 인자 IX 발현의 결함에 의해 또는 부족으로 야기된다.
혈우병 B는 FIX의 응혈원 활성의 결핍을 초래한다. 혈우병 B 환자는 종종 치명적인 관절증으로 이어지는 자발적인 연조직 출혈 및 재발성 혈관절증을 갖는다. 이들 환자에 대한 현행 치료는 재조합 FIX의 정맥내 투여를 포함한다. 그러나 순환으로부터 FIX의 상대적으로 급속 청소능 및 비용의 사안은 장기-작용성 FIX 개발을 도전적 과제로 만든다. FVIII 및 FIX의 상업적 이용가능성은 생명 위협 출혈 에피소드의 개선된 관리를 초래하였다. 많은 환자는 예방적 요법을 받고, 이는 출혈 및 그것의 관련된 합병증의 위험을 감소시킨다. 그러나, 환자의 상당한 분율 (10-30%)는 외인성으로 투여된 FVIII 및 FIX에 억제성 항체를 발생시킨다. 우회 생성물인, FVIIa의 투여는 항상성을 포함할 수 있고 억제성 Abs를 가진 환자에 효과적인 치료를 제공할 수 있다.
재조합 FVIIa (NovoSeven®)는 상업적으로 입수가능하고 억제제로 혈우병 환자에 있어서 출혈 에피소드의 치료를 위하여 1996년에 승인되었다. 그러나, rFVIIa는 2.5 시간의 말단 반감기로 빠르게 소거된다. 그 결과, 환자는 일반적으로 경도 내지 중간 정도 출혈 이후 적절한 항상성을 달성하기 위해 다중, 빈번한 주입 (2-3 시간 간격으로 제공된 2-3 용량)을 요구한다. 결과적으로, 단일 용량 이후 지혈 활성의 지속기간을 연정시키고 훨씬 덜 빈번한 투여를 허용하는 FVIIa의 장기-작용성 형태의 개발에 많은 관심이 있다. 장기-작용성 FVIIa는 또한 장기간 예방적 요법의 실행성을 증가시킬 것이다.
다양한 기술은 FVIIa의 반감기 연장을 위하여 개발중이다. 그러나, 그것의 생물학적 활성을 보존하고 변형이 상당한 면역원성을 유도하지 않는 것을 확보하면서 상기 단백질의 장기적인 반감기를 달성하기 위한 요구가 남아 있다. 본 발명은 FVIIa에 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTPs)를 부착시킴으로써, 이로써 그것의 반감기 및 생물학적 활성을 연장하도록 변형시키는 상기 기술을 다룬다.
개시내용의 요약
일 측면에서, 본 발명은 인자 VII 응고 인자 및 상기 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 제공하고, 상기 폴리펩타이드는 신호 펩타이드를 포함하지 않는다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 CTP-변형된 폴리펩타이드를 제공하고, 상기 응고 인자는 활성화된 FVII (FVIIa)이다. 또 다른 측면에서, CTP-변형된 응고 인자의 서열은 서열식별번호: 46에서 제시된 것과 같다.
또 다른 측면에서, 활성화된 FVIIa-CTP3을 포함하는 CTP-변형된 폴리펩타이드는 디설파이드 결합에 의해 연결된 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 또 다른 측면에서, SDS-PAGE 겔 상?? 경쇄와 중쇄의 분리는 변성 조건 하에서 일어나고, 상기 경쇄는 약 25 kDa 분자량에서 이동하고 상기 중쇄는 약 60 kDa 분자량에서 이동한다.
일 측면에서, 본 완충액, 아미노산, 여기서 또 다른 구현예에서는 글리신, 긴장성 제제, 및 인자 VII 응고 인자 및 상기 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 제형을 제공하고, 상기 폴리펩타이드는 신호 펩타이드를 포함하지 않는다. 또 다른 측면에서, 완충액은 20 mM 시트레이트를 포함한다. 또 다른 측면에서, 긴장제는 150 mM 염화나트륨이다. 또 다른 측면에서, 제형은 액체 제형이다. 또 다른 측면에서, 제형은, 그 pH가 약 6.4이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 20 mM 시트레이트, 13.3 mM 글리신, 150 mM 염화나트륨을, 약 6.4의 pH에서 포함하는 제형을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 약제학적 제형을 제공하고, 상기 응고 인자는 활성화된 FVII (FVIIa)이다. 또 다른 측면에서, CTP-변형된 응고 인자의 서열은 서열식별번호: 46에서 제시된 것과 같다. 또 다른 측면에서, 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 제형은 매일, 격일, 매 3 일, 매주 1회, 매주 2회, 또는 격주에 1회, 또는 이들의 임의의 조합으로 투여된다. 또 다른 측면에서, 약제학적 제형의 투여는 정맥내 또는 피하 투여이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 기재된 CTP-변형된 폴리펩타이드, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 기재된 약제학적 제형을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 응고 인자의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 응고 인자의 카복시 말단에 부착하여, 상기 응고 인자의 생물학적 반감기를 연장시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 응고 인자의 활성화된 형태는 신호 펩타이드를 포함하지 않는다. 또 다른 측면에서, 응고 인자는 활성화된 FVII (FVIIa)이다. 또 다른 측면에서, 활성화된 CTP-변형된 응고 인자의 서열은 서열식별번호: 46에서 제시된 것과 같다.
일 측면에서, 본 발명은 인자 상의 인자 VII (FVII) 응고의 곡선하 면적 (AUC)을 개선하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 응고 인자의 카복시 말단에 부착하여, 상기 응고 인자의 AUC를 개선하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 응고 인자의 활성화된 형태는 신호 펩타이드를 포함하지 않는다. 또 다른 측면에서, 응고 인자는 활성화된 FVII (FVIIa)이다. 또 다른 측면에서, 활성화된 CTP-변형된 응고 인자의 서열은 서열식별번호: 46에서 제시된 것과 같다.
일 측면에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVII) 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 응고 인자의 카복시 말단에 부착하여, 상기 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함하고, 상기 FVII 응고 인자의 활성화된 형태는 신호 펩타이드를 포함하지 않는다. 또 다른 측면에서, 활성화된 CTP-변형된 응고 인자의 서열은 서열식별번호: 46에서 제시된 것과 같다.
일 측면에서, 본 발명은 대상체에서 혈액 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 활성화된 CTP-변형된 응고 인자 폴리펩타이드(상기 응고 인자는 FVIIa-CTP3임)를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈액 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서 장애는 혈우병이다. 또 다른 측면에서, 혈우병은 억제제가 있는 혈우병 A 또는 혈우병 B를 포함한다. 또 다른 측면에서, 투여는 피하 경로를 통한 투여이다. 또 다른 측면에서, 투여는 정맥내 경로를 통한 투여이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 출혈 에피소드의 감소 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명, 실시예 및 도로부터 분명해질 것이다. 그러나, 본 개시내용의 사상 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 상기 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에 분명해질 것이기 때문에 본 개시내용의 바람직한 구현예를 나타내는 동안 상세한 설명 및 특이적 실시예가 단지 설명으로써 제공되는 것이 이해되어야 한다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 1종의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청시 및 필요한 요금의 납부시 청에 의해 제공될 것이다.
도 1A. 5μg/ml의 비타민 K3의 존재하에 FIX-CTP 및 FIX-CTP-CTP 변이체로 수확물 제한된, 희석된, 형질감염된, 및 선택된 세포를 나타내는 막대 그래프를 보여준다. FIX의 수준은 인간 FIX ELISA 키트 (Affinity Biologicals; Cat. No. FIX-AG RUO)를 이용하여 정량화되었고, 계산된 단백질 농도 (μg/ml)는 2 독립 시행의 평균이다.
도 1B. FIX Ab 인식의 SDS-PAGE 겔 현미경사진을 보여주고 웨스턴-블롯에서 항-FIX 항체의 인식을 도시하고; 도 1B에서 레인 1은 재조합 FIX를 함유하는 샘플로 장입되었고; 도 1B에서 레인 2는 FIX-CTP 수확물을 함유하는 샘플로 장입되었다. 도 1B에서 레인 3은 FIX-(CTP)2 수확물을 함유하는 샘플로 장입되었다.
도 1C. FIX Ab 인식의 SDS-PAGE 겔 현미경사진을 보여준다. 도 1C는 웨스턴-블롯에서 항-γ 카복실화 항체의 인식을 도시한다. 도 1C에서 레인 1은 재조합 FIX를 함유하는 샘플로 장입되었다. 도 1C에서 레인 2는 FIX-CTP 수확물을 함유하는 샘플로 장입되었다. 도 1C에서 레인 3은 FIX-(CTP)2 수확물을 함유하는 샘플로 장입되었다.
도 2. rhFIX (American Diagnostics)에 비교된 (EC50. 농도에 의해 측정된) FIX-CTP 및 FIX-(CTP)2 수확물 비교 발색 활성을 나타내는 그래프를 보여준다.
도 3. rhFIX의 PK 프로파일, FIX-CTP-CTP의 수확물, 및 FIX-CTP의 수확물을 나타내는 그래프를 보여준다.
도 4. 인간 FIX ELISA 키트 (Affinity Biologicals; cat. No. FIX-AG RUO)를 이용하여 결정된 경우 FIX-CTP의 수확물 및 FIX-CTP-CTP 수확물 및 FIX-CTP-CTP 정제된 단백질 FIX 항원 수준을 나타내는 막대 그래프를 보여준다. 계산된 단백질 농도 (μg/ml)는 2 독립 시행의 평균이다.
도 5A. FIX Ab 인식의 SDS-PAGE 겔 현미경사진을 보여주고 쿠마씨 블루 염색을 도시한다. 레인 1은 FIX-(CTP)2를 함유하는 샘플로 장입되었다. 레인 2는 미결합된 FIX-(CTP)2를 함유하는 샘플로 장입되었다. 레인 3은 FIX-(CTP)2의 농축된 용출물을 함유하는 샘플로 장입되었다.
도 5B. FIX Ab 인식의 SDS-PAGE 겔 현미경사진을 보여주고 웨스턴-블롯에서 항-FIX 항체의 인식을 도시한다. 레인 1은 FIX-(CTP)2를 함유하는 샘플로 장입되었다. 레인 2는 미결합된 FIX-(CTP)2를 함유하는 샘플로 장입되었다. 레인 3은 FIX-(CTP)2의 농축된 용출물을 함유하는 샘플로 장입되었다.
도 5C. FIX Ab 인식의 SDS-PAGE 겔 현미경사진을 보여주고 웨스턴-블롯에서 항-γ 카복실화 항체의 인식을 도시한다. 레인 1은 FIX-(CTP)2를 함유하는 샘플로 장입되었다. 레인 2는 미결합된 FIX-(CTP)2를 함유하는 샘플로 장입되었다. 레인 3은 FIX-(CTP)2의 농축된 용출물을 함유하는 샘플로 장입되었다.
도 6. 인간 정상 풀 혈장 및 rhFIX (American Diagnostics)에 비교된 FIX-(CTP)2 발색 활성 (샘플 농도/O.D.)를 나타내는 그래프를 보여준다.
도 7. 정제된 FIX-CTP-CTP의 PK 프로파일, rhFIX, FIX-CTP-CTP의 수확물, 및 FIX-CTP의 수확물을 나타내는 그래프를 보여준다.
도 8A. 3, 4 또는 5 CTPs에 융합된 FIX의 항-CTP 및 항-감마 카복실화 항체 웨스턴 블롯을 보여준다. FIX-CTP3, FIX-CTP4, 및 FIX-CTP5 수확물은 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. SDS-PAGE 분석은 항-CTP 다클론성 Ab (Adar Biotech Production)를 이용하는 웨스턴 면역-블롯에 의해 수행되었다.
도 8B. 3, 4 또는 5 CTPs에 융합된 FIX의 항-CTP 및 항-감마 카복실화 항체 웨스턴 블롯을 보여준다. FIX-CTP3, FIX-CTP4, 및 FIX-CTP5 수확물은 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. SDS-PAGE 분석은 항-Gla Ab (American Diagnostica)를 이용하는 웨스턴 면역-블롯에 의해 수행되었다.
도 9. FIX-CTP3, FIX-CTP4, 및 FIX-CTP5의 쿠마씨 블루 검출을 보여준다. Jacalin 컬럼 (당화된 단백질의 면역친화성 정제)를 이용하는 정제 공정 이후, FIX-CTP3, FIX-CTP4, 및 FIX-CTP5는 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. SDS-PAGE는 샘플 검출용 쿠마씨 블루 염료로 염색되었다.
도 10. FIX 발색 활성을 보여준다. 인간 풀 정상 혈장에 대하여 완전히 정제된 (HA 컬럼) FIX-CTP3 FIX-CTP4 및 FIX-CTP5의 시험관내 효력의 비교 평가는 상업적으로 입수가능한 발색 활성 테스트 키트, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802)를 이용하여 수행되었다. 모든 샘플은 연속으로 희석되었고 효력은 정상 인간 혈장으로 구성되는 참조 제제에 용량 반응 곡선을 비교함으로써 평가되었다.
도 11. FIX-CTP3 FIX-CTP4 및 FIX-CTP5의 비교 약동학적 (PK) 프로파일을 보여준다. 혈장 샘플에서 FIX 농도는 인간 FIX Elisa 키트 (Affinity Biologicals)를 이용하여 정량화되었다. 약동학적 프로파일은 계산되었고 각각의 시점에서 3 동물의 평균이다. 말단 반감기는 PK 솔루션스 2.0 소프트웨어를 이용하여 계산되었다.
도 12A. FIX-CTP3 SDS-PAGE 분석 - 쿠마씨 SDS-PAGE를 보여준다. FIX-CTP3 γ-카복실화된 풍부한 단백질, rhFIX 및 rFIXa (활성화된 FIX)는 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. SDS-PAGE 쿠마씨 분석은 쿠마씨 블루 시약 (800 ng의 단백질)로 겔 염색에 의해 수행되었다.
도 12B. FIX-CTP3 SDS-PAGE 분석 - 쿠마씨 SDS-PAGE를 보여준다. FIX-CTP3 γ-카복실화된 풍부한 단백질, rhFIX 및 rFIXa (활성화된 FIX)는 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. 웨스턴 면역블롯은 항-인간 FIX 다클론성 Ab와 100 ng의 단백질을 이용하여 수행되었다.
도 12C. FIX-CTP3 SDS-PAGE 분석 - 쿠마씨 SDS-PAGE를 보여준다. FIX-CTP3 γ-카복실화된 풍부한 단백질, rhFIX 및 rFIXa (활성화된 FIX)는 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. 웨스턴 면역블롯은 항-인간 감마 카복실화 단클론성 항체 (American Diagnostics Cat #499, 3570)과 100 ng의 단백질을 이용하여 수행되었다.
도 12D. FIX-CTP3 SDS-PAGE 분석 - 쿠마씨 SDS-PAGE를 보여준다. FIX-CTP3 γ-카복실화된 풍부한 단백질, rhFIX 및 rFIXa (활성화된 FIX)는 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. 웨스턴 면역블롯은 항-FIX 프로-펩타이드 다클론성 Ab와 100 ng의 단백질을 이용하여 수행되었다 (도 12D).
도 12E. FIX-CTP3 SDS-PAGE 분석 - 쿠마씨 SDS-PAGE를 보여준다. FIX-CTP3 γ-카복실화된 풍부한 단백질, rhFIX 및 rFIXa (활성화된 FIX)는 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. 웨스턴 면역블롯은 항-CTP 다클론성 Ab와 100 ng의 단백질을 이용하여 수행되었다.
도 13. FIX-CTP3 발색 활성을 보여준다. 인간 풀 정상 혈장에 대하여, FIX-CTP3 수확물 및 FIX-CTP3 γ-카복실화된 풍부한 단백질의 시험관내 효력의 비교 평가는 상업적으로 입수가능한 발색 활성 테스트 키트, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802)를 이용하여 수행되었다. FIX-CTP3 수확물 및 단백질은 연속으로 희석되었고, 효력은 정상 인간 혈장으로 구성되는 참조 제제에 용량-반응 곡선을 비교함으로써 평가되었다.
도 14. 비교 응고 시간을 보여준다. 시험관내 aPTT (활성화된 부분적인 트롬빈 시간 검정)은 대 BeneFIX에 FIX-CTP3의 응고 활성을 비교하여 수행되었다. 단백질은 연속으로 희석되었고 인간 FIX-감손된 혈장 속에 스파이킹되었고, 응고 시간은 평가되었다.
도 15. FIX-CTP3 비교 PK 프로파일을 보여준다. FIX 농도는 인간 FIX ELISA 키트 (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO)를 이용하여 정량화되었다. 약동학적 프로파일은 각각의 단백질에 대하여 계산되었고 각각의 시점에서 3 동물의 평균이다.
도 16A. PK 샘플링과 병렬적으로, FIX-CTP3, 시트레이트화된 혈장 샘플로 투여된 FIX-결핍된 동물은 aPTT 검정에 의해 그것의 응고 활성에 대하여 평가되었고, % 활성으로 해석되었다. 각각의 수집 지점에서 % 활성은 정상 풀 마우스 혈장의 현행 응고 시간/응고 시간 *100으로서 계산되었다.
도 16B. PK 샘플링과 병렬적으로, 한쪽 BeneFIX®, 시트레이트화된 혈장 샘플로 투여된 FIX-결핍된 동물은 aPTT 검정에 의해 그것의 응고 활성에 대하여 평가되었고, % 활성으로 해석되었다. 각각의 수집 지점에서 % 활성은 정상 풀 마우스 혈장의 현행 응고 시간/응고 시간 *100으로서 계산되었다.
도 17A. 제1 공격 출혈 파라미터를 보여준다. FIX-결핍된 마우스는 100 IU/Kg의 BeneFIX® 또는 rFIX-CTP3의 단일 정맥내 주사가 투여되었다. 꼬리 정맥은 48 시간 투여후 약간 잘려졌고 꼬리 정맥 출혈 시간 (TVBT)은 평가되었다. 제2 출혈 공격은 항상성 달성 이후 15 분 수행되었고, 동일한 파라미터는 측정되었다.
도 17B. 제1 공격 출혈 파라미터를 보여준다. FIX-결핍된 마우스는 100 IU/Kg의 BeneFIX® 또는 rFIX-CTP3의 단일 정맥내 주사가 투여되었다. 꼬리 정맥은 48 시간 투여후 약간 잘려졌고 꼬리 정맥 출혈 시간 (TVBT)은 평가되었다. 제2 출혈 공격은 항상성 달성 이후 15 분 수행되었고, 동일한 파라미터는 측정되었다.
도 17C. 제1 공격 출혈 파라미터를 보여준다. FIX-결핍된 마우스는 100 IU/Kg의 BeneFIX® 또는 rFIX-CTP3의 단일 정맥내 주사가 투여되었다. 꼬리 정맥은 48 시간 투여후 약간 잘려졌고 출혈 강도 (헤모글로빈 OD)는 평가되었다. 제2 출혈 공격은 항상성 달성 이후 15 분 수행되었고, 동일한 파라미터는 측정되었다.
도 17D. 제1 공격 출혈 파라미터를 보여준다. FIX-결핍된 마우스는 100 IU/Kg의 BeneFIX® 또는 rFIX-CTP3의 단일 정맥내 주사가 투여되었다. 꼬리 정맥은 48 시간 투여후 약간 잘려졌고 출혈 강도 (헤모글로빈 OD)는 평가되었다. 제2 출혈 공격은 항상성 달성 이후 15 분 수행되었고, 동일한 파라미터는 측정되었다.
도 18A. 제2 공격 출혈 파라미터를 보여준다. 일단 도 19에 대한 범례에서 기재된 제1 출혈이 자발적으로 또는 수작업으로 중단되었다면, 제2 출혈 공격은 제1 출혈 공격 이후 15 분 수행되었고, 시간은 재-측정되었다.
도 18B. 제2 공격 출혈 파라미터를 보여준다. 일단 도 19에 대한 범례에서 기재된 제1 출혈이 자발적으로 또는 수작업으로 중단되었다면, 제2 출혈 공격은 제1 출혈 공격 이후 15 분 수행되었고, 시간은 재-측정되었다.
도 18C. 제2 공격 출혈 파라미터를 보여준다. 일단 도 19에 대한 범례에서 기재된 제1 출혈이 자발적으로 또는 수작업으로 중단되었다면, 제2 출혈 공격은 제1 출혈 공격 이후 15 분 수행되었고, 출혈 강도는 재-측정되었다.
도 18D. 제2 공격 출혈 파라미터를 보여준다. 일단 도 19에 대한 범례에서 기재된 제1 출혈이 자발적으로 또는 수작업으로 중단되었다면, 제2 출혈 공격은 제1 출혈 공격 이후 15 분 수행되었고, 출혈 강도는 재-측정되었다.
도 19A. rFVII-CTP 작제물을 실증하는 다이어그램을 보여준다.
도 19B. rFVII-CTP-CTP 작제물을 실증하는 다이어그램을 보여준다.
도 19C. rFIX-CTP 작제물을 실증하는 다이어그램을 보여준다.
도 19D. rFIX-CTP-CTP 작제물을 실증하는 다이어그램을 보여준다.
도 20A. 5μg/ml의 비타민 K3의 존재하에 FVII-CTP 변이체로 수확물 제한된 희석된 클론 형질감염된 및 선택된 세포를 나타내는 막대 그래프를 보여준다. FVII의 수준은 FVII ELISA (AssayPro)를 이용하여 정량화되었다.
도 20B. 5μg의 비타민 K3.활성의 존재하에 FVII-CTP 변이체로 제한된 희석된 형질감염된 및 선택된 세포의 수확물을 나타내는 막대 그래프를 보여준다. FVII 활성은 FVII 발색 활성 검정 (AssayPro)을 이용하여 정량화되었다.
도 20C. 5μg의 비타민 K3의 존재하에 FVII-CTP 변이체로 제한된 희석된 형질감염된 및 선택된 세포의 수확물을 나타내는 막대 그래프를 보여준다. FVII의 특이적 활성은 수확물 FVII 농도로 활성 값 분할에 의해 각각의 버전에 대하여 계산되었다.
도 20D. FVII, FVII-CTP-CTP, 및 FVII-CTP 수확물의 PK 프로파일을 나타내는 그래프를 보여준다.
도 21A. 항-FVII, 항-CTP, 및 항-감마 카복실화 항체를 이용하여 검출된, 3, 4 및 5 CTPs에 융합된 FVII의 웨스턴 블롯을 보여준다. FVII-CTP3, FVII-CTP4, 및 FVII-CTP5 수확물은 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔 (expedeon)상에서 장입되었다. SDS-PAGE 분석은 항-FVII을 이용하는 웨스턴 면역블롯에 의해 수행되었다.
도 21B. 항-FVII, 항-CTP, 및 항-감마 카복실화 항체를 이용하여 검출된, 3, 4 및 5 CTPs에 융합된 FVII의 웨스턴 블롯을 보여준다. FVII-CTP3, FVII-CTP4, 및 FVII-CTP5 수확물은 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔 (expedeon)상에서 장입되었다. SDS-PAGE 분석은 항-CTP 다클론성 Ab (Adar Biotech Production)를 이용하는 웨스턴 면역블롯에 의해 수행되었다.
도 21C. 항-FVII, 항-CTP, 및 항-감마 카복실화 항체를 이용하여 검출된, 3, 4 및 5 CTPs에 융합된 FVII의 웨스턴 블롯을 보여준다. FVII-CTP3, FVII-CTP4, 및 FVII-CTP5 수확물은 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔 (expedeon)상에서 장입되었다. SDS-PAGE 분석은 항-Gla Ab (American Diagnostica)를 이용하는 웨스턴 면역블롯에 의해 수행되었다.
도 22. FVII 활성 - 발색 활성을 보여준다. 정상 인간 풀 혈장에 대하여 HA 정제된 (고도로 감마 카복실화된 분획) FVII-CTP3, FVII-CTP4, 및 FVII-CTP5의 시험관내 효력의 비교 평가는 상업적으로 입수가능한 발색 활성 테스트 키트, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304)를 이용하여 수행되었다. 모든 샘플은 연속으로 희석되었고 효력은 정상 인간 혈장으로 구성되는 참조 제제에 용량 반응 곡선을 비교함으로써 평가되었다.
도 23. 제1 비교 약동학적 (PK) 프로파일-FVII 3, 4 및 5 CTPs를 보여준다. FVII-CTP3, FVII-CTP4, 및 FVII-CTP5 (그룹 A, B 및 C, 각각)은 250 μg/kg 체중의 용량으로 스프래그 다우리 랫트 (6 랫트 / 치료)에 단일 정맥내 주사로 투여되었다. 혈액 샘플은 대안적으로 투여후 0.083, 0.5 2, 5, 8, 24, 48, 72 및 96 시간에서 3 랫트로부터 안와후로 채혈되었다. 시트레이트화된 혈장 (0.38%)은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었다. FVII-CTP5는 2개의 다른 버전에 비교된 경우 우월한 프로파일을 입증하였다.
도 24. 제2 비교 PK 프로파일-FVII 3, 4 및 5 CTPs를 보여준다. FVII 선택 및 HA 정제 공정 이후 FVII-CTP3, FVII-CTP4, 및 FVII-CTP5 (그룹 A, B 및 C, 각각)은 29.45 μg/kg 체중의 용량으로 스프래그 다우리 랫트 (3 랫트 / 서브스턴스)에 단일 정맥내 주사로 투여되었다. 혈액 샘플은 투여후 0.083, 0.5 2, 8, 24, 48, 및 72 시간에서 안와후 채혈되었다. 시트레이트화된 혈장 (0.38%)는 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었다.
도 25A. FVII-CTP3 정제 공정의 개략도를 보여준다. 배치 31은 PK/PD 연구를 위하여 생산되었다.
도 25B. FVII-CTP3 정제 공정의 개략도를 보여준다. 배치 38은 생존 연구를 위하여 생산되었다.
도 26A. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 10 μg (배치 31) 또는 5 μg (배치 38)은 쿠마씨 염색된 SDS-PAGE의 각각의 레인에서 장입되었다. 1. FVII-CTP3 폴리펩타이드; 2. 3x CTP를 포함하는, 중쇄; 3. 경쇄. 모든 3 항체는 FVII를 검출한다.
도 26B. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 10 μg (배치 31) 또는 5 μg (배치 38)은 쿠마씨 염색된 SDS-PAGE의 각각의 레인에서 장입되었다 1. FVII-CTP3 폴리펩타이드; 2. 3x CTP를 포함하는, 중쇄; 3. 경쇄.
도 26C. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 10 μg (배치 31) 또는 5 μg (배치 38)은 쿠마씨 염색된 SDS-PAGE의 각각의 레인에서 장입되었다 1. FVII-CTP3 폴리펩타이드; 2. 3x CTP를 포함하는, 중쇄; 3. 경쇄.
도 26D. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 10 μg (배치 31) 또는 5 μg (배치 38)은 쿠마씨 염색된 SDS-PAGE의 각각의 레인에서 장입되었다 1. FVII-CTP3 폴리펩타이드; 2. 3x CTP를 포함하는, 중쇄; 3. 경쇄.
도 26E. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 10 μg (배치 31) 또는 5 μg (배치 38)은 쿠마씨 염색된 SDS-PAGE의 각각의 레인에서 장입되었다 1. FVII-CTP3 폴리펩타이드; 2. 3x CTP를 포함하는, 중쇄; 3. 경쇄.
도 26F. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 1 μg 단백질은 웨스턴 블롯의 각각의 레인에서 장입되었다. 1. FVII-CTP3 폴리펩타이드; 2. 3x CTP를 포함하는, 중쇄; 3. 경쇄. 모든 3 항체는 FVII를 검출한다. FVIIa 경쇄는 양쪽 α-FVII로 검출된다.
도 26G. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 1 μg 단백질은 웨스턴 블롯의 각각의 레인에서 장입되었다. 1. FVII-CTP3 폴리펩타이드; 2. 3x CTP를 포함하는, 중쇄; 3. 경쇄. 모든 3 항체는 FVII를 검출한다. FVIIa 중쇄는 α-CTP에 의해 검출되었다.
도 26H. 최종 FVII 및 FVIIa의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 보여준다. 1 μg 단백질은 웨스턴 블롯의 각각의 레인에서 장입되었다. 1. FVII-CTP3 폴리펩타이드; 2. 3x CTP를 포함하는, 중쇄; 3. 경쇄. 모든 3 항체는 FVII를 검출한다. FVIIa 중쇄는 α-Gla에 의해 검출되었다.
도 27. FVII-CTP3 발색 활성이 세라믹 수산화인회석 (HA) 컬럼상에서 정제의 결과로서 향상되는 것을 보여준다. 인간 풀 정상 혈장에 대하여 FVII-CTP3 수확물, 공정중 분획, 및 정제된 FVII-CTP3의 시험관내 효력의 비교 평가는 상업적으로 입수가능한 발색 활성 테스트 키트, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304)를 이용하여 수행되었다. FVII-CTP3 수확물 및 단백질은 연속으로 희석되었고 효력은 정상 인간 혈장의 참조 제제에 용량-반응 곡선을 비교함으로써 평가되었다.
도 28. FVIII-결핍된 마우스에서 FVIIa-CTP3 대 NovoSeven®의 PK 프로파일을 보여준다. FVIIa-CTP3은 FVII 선택, HA 정제 공정 및 활성화 이후 생산되었다. FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®은 FVIII-/- 혈우병 마우스에 단일 정맥내 주사로 투여되었다. 혈액 샘플은 투여후 0.083, 0.5 2, 8, 24, 48, 및 72 시간에서 안와후로 채혈되었다. 시트레이트화된 혈장 (0.38%)은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었고, PK 프로파일은 STACLOT 상업적 키트를 이용하는 FVIIa 응고 활성에 기반하여 확립되었다.
도 29A. FVIIa-CTP3이 FVII 선택, HA 정제 공정 및 활성화 이후 생산되었다는 것을 보여준다. FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®은 FVIII-/- 혈우병 마우스에 단일 정맥내 주사로 투여되었다. 혈액 샘플은 투여후 0.083, 0.5 2, 8, 24, 48, 및 72 시간에서 안와후로 채혈되었다. 시트레이트화된 혈장 (0.38%)은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었다. 트롬빈 생성 파라미터는 PK 실험 동안 평가되었고, 피크에 대한 최대 양을 포함하는 파라미터는 평가되었다.
도 29B. FVIIa-CTP3이 FVII 선택, HA 정제 공정 및 활성화 이후 생산되었다는 것을 보여준다. FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®은 FVIII-/- 혈우병 마우스에 단일 정맥내 주사로 투여되었다. 혈액 샘플은 투여후 0.083, 0.5 2, 8, 24, 48, 및 72 시간에서 안와후로 채혈되었다. 시트레이트화된 혈장 (0.38%)은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었다. 트롬빈 생성 파라미터는 PK 실험 동안 평가되었고, 시점에 대한 트롬빈의 양을 포함하는 파라미터는 평가되었다.
도 29C. FVIIa-CTP3이 FVII 선택, HA 정제 공정 및 활성화 이후 생산되었다는 것을 보여준다. FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®은 FVIII-/- 혈우병 마우스에 단일 정맥내 주사로 투여되었다. 혈액 샘플은 투여후 0.083, 0.5 2, 8, 24, 48, 및 72 시간에서 안와후로 채혈되었다. 시트레이트화된 혈장 (0.38%)은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었다. 트롬빈 생성 파라미터는 PK 실험 동안 평가되었고, 트롬빈 생성의 속도를 포함하는 파라미터는 평가되었다.
도 30A. 꼬리 바인(vain) 절단 (TVT)후 혈우병 마우스 생존 곡선을 보여준다. TVT는 투여후 15 분 수행되었다. 마우스 생존은 TVT 후 24 시간 동안 관측되었고 최초 12 시간 동안 매 단일 시간, 및 24 시간 후 기록되었다. 대조 그룹 데이터 (비히클)은 5 마우스/실험으로 3 실험의 합계이다.
도 30B. 꼬리 바인 절단 (TVT)후 혈우병 마우스 생존 곡선을 보여준다. TVT는 투여후 24 시간 수행되었다. 마우스 생존은 TVT 후 24 시간 동안 관측되었고 최초 12 시간 동안 매 단일 시간, 및 24 시간 후 기록되었다. 대조 그룹 데이터 (비히클)은 5 마우스/실험으로 3 실험의 합계이다.
도 30C. 꼬리 바인 절단 (TVT)후 혈우병 마우스 생존 곡선을 보여준다. TVT는 투여후 48 시간 수행되었다. 마우스 생존은 TVT 후 24 시간 동안 관측되었고 제1 12 시간 동안 매 단일 시간, 및 24 시간 후 기록되었다. 대조 그룹 데이터 (비히클)은 5 마우스/실험으로 3 실험의 합계이다.
도 30D. TVT후 24 시간 기록된 경우 마우스 생존을 요약한다.
도 31A. GLA로 블롯팅된, FVII-3-CTP 및 FVII-5 CTP 면역-블롯을 보여준다.
도 31B. FVII로 블롯팅된, FVII-3-CTP 및 FVII-5 CTP 면역-블롯을 보여준다.
도 31C. CTP로 블롯팅된, FVII-3-CTP 및 FVII-5 CTP 면역-블롯을 보여준다.
도 32. 선택 및 HA 컬럼 정제로부터 비교 PK 프로파일-FVII 3 & 5 CTP-를 보여준다 (FVIIS 대 FVII HA).
도 33. 비교 PK 프로파일-FVII 3 & 5 CTP-제2 연구를 보여준다 (IV 대 SC).
도 34. SC 투여 이후 꼬리 바인 절단 (TVT)후 혈우병 마우스 생존 곡선을 보여준다. TVT는 투여후 12 시간 수행되었다. 마우스 생존은 TVT 후 24 시간 관측되었고 제1 12 시간 동안 매 단일 시간, 및 24 시간 후 기록되었다.
도 35A. IV 투여 이후 MOD-5014 대 NovoSeven®의 PK 프로파일을 보여준다.
도 35B. SC 투여 이후 MOD-5014 대 NovoSeven®의 PK 프로파일을 보여준다.
도 36. 단일 SC 투여 이후 MOD-5014 (클론 61 #75, #81) 대 NovoSeven®의 PK 프로파일을 보여준다.
도 37. 와파린이 PT 및 aPTT 값을 증가시키는 것을 보여준다. SD-랫트는 경구로 10 mg/Kg 와파린을 받았고, 혈액 샘플은 지정된 시점에서 채혈되었다. 혈장은 제조되었고 PT 및 aPTT 값은 결정되었다.
도 38. 와파린 치료된 랫트에서 MOD-5014 및 NovoSeven®의 IV 주사의 급성 효과.
도 39. 주사후 24 시간, 광범위한 MOD-5014 및 NovoSeven® 용량에 대한 와파린 치료된 랫트의 반응을 보여준다.
도 40. MOD-5014가 투여후 최대 48 시간 정상에 대해 PT 값을 회복하였지만, 반면에 NovoSeven®의 효과가 24 시간 후 더 이상 존재하지 않는 것을 보여준다.
도 41. MOD-5014의 IV 주사가 주사후 24 및 48 시간 NovoSeven®에 비교된 경우 와파린 치료된 랫트에서 출혈 시간을 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 42. MOD-5014가 투여후 최대 48 시간 정상에 대해 PT 값을 회복할 수 있고, 반면에 NovoSeven®의 효과가 24 시간 후 더 이상 존재하지 않는 것을 보여준다
도. 43. 투여후 48 시간 동안 낮은 수준에서 혈액 손실 유지에 의한 NovoSeven® 보다 우월성을 보여준다.
도 44. 조직 인자 경로 억제제 (TFPI)가 유사한 용량-의존 방식으로 MOD-5014 및 NovoSeven®을 억제시킨다는 것을 보여준다.
도 45. 항-트롬빈 III이 유사한 방식으로 MOD-5014 및 NovoSeven®을 억제시켰다는 것을 보여준다.
도 46. 거의 동일하였던, MOD-5014 및 NovoSeven®에 의한 인자 X 활성화의 결과를 보여준다.
도 47. 0.6 ng/ml에서 존재하는, MOD-5014 및 NovoSeven®에 의한 TFPI (20 μg/ml 내지 0.002ng/ml)의 존재하에 인자 X 활성화를 보여준다.
도 48. 4.0 ng/ml에서 존재하는, MOD-5014 및 NovoSeven®에 의한 TFPI (20 μg/ml 내지 0.002ng/ml)의 존재하에 인자 X 활성화를 보여준다.
도 49. TFPI 및 헤파린의 존재하에 인자 X 활성화를 보여주고, 여기서 MOD-5014 및 NovoSeven®은 유사한 활성화를 나타냈다.
도 50. 항-트롬빈 III의 존재하에 인자 X 활성화를 보여주고, 여기서 MOD-5014 및 NovoSeven®은 유사한 활성화를 나타냈다.
도 51. 헤파린의 존재하에 MOD-5014 및 NovoSeven®에 의한 인자 X 활성화를 보여주고, 여기서 유사한 중간 정도 억제는 관측되었다.
도 52. 항-트롬빈 및 헤파린의 존재하에 MOD-5014 및 NovoSeven®에 의한 유사한 인자 X 활성화를 보여준다.
도 53. 높은 인지질 (PL) 농도에서 상업적으로 입수가능한 NovoSeven®에 비교된 경우 MOD-5014 트롬빈 생성 프로파일을 보여준다.
도 54. 낮은 인지질 (PL) 농도에서 상업적으로 입수가능한 NovoSeven®에 비교된 경우 MOD-5014 피크 트롬빈 생성 프로파일을 보여준다.
도 55A 및 B. MOD-5014 및 NovoSeven®에 대한 트롬보엘라스토그래피(thromboelastography) 결과를 보여주고, 여기서 양쪽은 응고 시간을 감소시켰고 응괴 형성의 속도를 증가시켰다.
도 56. 재-석회화 이후 NovoSeven® 트롬빈 생성 (TG)의 결과를 보여준다. (시행 #1)
도 57. 재-석회화 이후 MOD-5014 트롬빈 생성 (TG)의 결과를 보여준다. (시행 #1)
도 58 A -E. 유사한 농도에서 NovoSeven® (NS) 결과 대 MOD-5014 (PRO) TG 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (A)는 1.25 μg/ml에서 결과를 제공한다. (B)는 5 μg/ml에서 결과를 제공한다. (C)는 15 μg/ml에서 결과를 제공한다. (D)는 2.5 μg/ml에서 결과를 제공한다. (E)는 10 μg/ml에서 결과를 제공한다. (시행 #1)
도 59 A -D. 상이한 농도에서 NovoSeven® (NS) 결과 대 MOD-5014 (PRO) TG 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (A)는 1.25 μg/ml에서 NS 및 2.5 μg/ml에서 PRO의 결과를 보여준다. (B)는 5 μg/ml에서 NS 및 10 μg/ml에서 PRO의 결과를 보여준다 (C)는 2.5 μg/ml에서 NS 및 5 μg/ml에서 PRO의 결과를 보여준다. (D)는 10 μg/ml에서 NS 및 15 μg/ml에서 PRO의 결과를 보여준다. (시행 #1)
도 60. 상이한 농도에서 NS용 재-석회화 이후 NovoSeven® (NS) 트롬빈 생성 (TG)의 결과를 보여준다. (시행 #2)
도 61. 상이한 농도에서 PRO용 재-석회화 이후 MOD-5014 (PRO) 트롬빈 생성 (TG)의 결과를 보여준다. (시행 #2)
도 62 A -E. 유사한 농도에서 NovoSeven® (NS) 결과 대 MOD-5014 (PRO) TG 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (A)는 1.25 μg/ml에서 결과를 제공한다. (B)는 5 μg/ml에서 결과를 제공한다. (C)는 15 μg/ml에서 결과를 제공한다. (D)는 2.5 μg/ml에서 결과를 제공한다. (E)는 10 μg/ml에서 결과를 제공한다. (시행 #2)
도 63 A -D. 상이한 농도에서 NovoSeven® (NS) 결과 대 MOD-5014 (PRO) TG 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (A)는 1.25 μg/ml에서 NS 및 2.5 μg/ml에서 PRO의 결과를 보여준다. (B)는 5 μg/ml에서 NS 및 10 μg/ml에서 PRO의 결과를 보여준다. (C)는 2.5 μg/ml에서 NS 및 5 μg/ml에서 PRO의 결과를 보여준다. (D)는 10 μg/ml에서 NS 및 15 μg/ml에서 PRO의 결과를 보여준다. (시행 #2)
도 64. 낮은 TF 농도에서 재-석회화 이후 NovoSeven®에 의한 TG용 데이터를 보여준다. (시행 #1)
도 65. 낮은 TF 농도에서 재-석회화 이후 MOD-5014에 의한 TG용 데이터를 보여준다. (시행 #1)
도 66 A -E. 낮은 TF에서 재-석회화 이후, 유사한 농도에서 NovoSeven® (NS) 결과 대 MOD-5014 (PRO) 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (A)는 1.25 μg/ml에서 결과를 제공한다. (B)는 5 μg/ml에서 결과를 제공한다. (C)는 15 μg/ml에서 결과를 제공한다. (D)는 2.5 μg/ml에서 결과를 제공한다. (E)는 10 μg/ml에서 결과를 제공한다. (시행 #1)
도 67. 낮은 TF 농도에서 재-석회화 이후 NovoSeven®에 의한 TG용 데이터를 보여준다. (시행 #2)
도 68. 낮은 TF 농도에서 재-석회화 이후 MOD-5014에 의한 TG용 데이터를 보여준다. (시행 #2)
도 69 A -E. 낮은 TF에서 재-석회화 이후, 유사한 농도에서 NovoSeven® (NS) 결과 대 MOD-5014 (PRO) 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (A)는 1.25 μg/ml에서 결과를 제공한다. (B)는 5 μg/ml에서 결과를 제공한다. (C)는 15 μg/ml에서 결과를 제공한다. (D)는 2.5 μg/ml에서 결과를 제공한다. (E)는 10 μg/ml에서 결과를 제공한다. (시행 #2)
도 70 A -C. 낮은 TF에서 재-석회화 이후, 상이한 농도에서 NovoSeven® (NS) 결과 대 MOD-5014 (PRO) 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (A)는 1.25 μg/ml에서 NS 및 5 μg/ml에서 PRO의 결과를 보여준다. (B)는 5 μg/ml에서 NS 및 15 μg/ml에서 PRO의 결과를 보여준다. (C)는 2.5 μg/ml에서 NS 및 10 μg/ml에서 PRO의 결과를 보여준다. (시행 #2)
도 71. 낮은 TF의 존재 및 부재하에 NovoSeven® 및 MOD-5014를 이용한 결과에 대하여 비교로서, FVIII에 의한 완전한 트롬빈 생성을 보여준다.
도 72. 낮은 TF의 존재 및 부재하에 FVIII에 의한 트롬빈 생성의 오버레이 분석을 제공한다.
도 73. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS; 1.25 μg/kg) TG 결과 대 MOD-5014 (PRO; 1.25 μg/kg) TG 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (시행 #1)
도 74 A -E. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS; 1.25 μg/kg) TG 결과 대 MOD-5014 (PRO; 1.25 μg/kg) TG 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (A)는 0 pM TF에서 결과를 제공한다. (B)는 1 pM TF에서 결과를 제공한다. (C)는 5 pM TF에서 결과를 제공한다. (D)는 0.5 pM TF에서 결과를 제공한다. (E)는 2.5 pM TF에서 결과를 제공한다. (시행 #1)
도 75. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS; 2.5 μg/kg) TG 결과 대 MOD-5014 (PRO; 2.5 μg/kg) TG 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (시행 #1)
도 76 A -E. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS; 2.5 μg/kg) TG 결과 대 MOD-5014 (PRO; 2.5 μg/kg) 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (A)는 0 pM TF에서 결과를 제공한다. (B)는 1 pM TF에서 결과를 제공한다. (C)는 5 pM TF에서 결과를 제공한다. (D)는 0.5 pM TF에서 결과를 제공한다. (E)는 2.5 pM TF에서 결과를 제공한다. (시행 #1)
도 77. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS; 5 μg/kg) TG 결과 대 MOD-5014 (PRO; 5 μg/kg) 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (시행 #1)
도 78 A -E. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS; 5 μg/kg) TG 결과 대 MOD-5014 (PRO; 5 μg/kg) 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (A)는 0 pM TF에서 결과를 제공한다. (B)는 1 pM TF에서 결과를 제공한다. (C)는 5 pM TF에서 결과를 제공한다. (D)는 0.5 pM TF에서 결과를 제공한다. (E)는 2.5 pM TF에서 결과를 제공한다. (시행 #1)
도 79 A -C. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS)의 존재하에 용량 의존적 TG 반응을 보여준다. (A)는 1.25 μg/kg NS에서 결과를 제공한다. (B)는 5 μg/kg NS에서 결과를 제공한다. (C)는 2.5 μg/kg NS에서 결과를 제공한다. (시행 #1)
도 80 A -C. TF의 상승하는 농도에서 MOD-5014 (PRO)의 존재하에 용량 의존적 TG 반응을 보여준다. (A)는 1.25 μg/kg PRO에서 결과를 제공한다. (B)는 5 μg/kg PRO에서 결과를 제공한다. (C)는 2.5 μg/kg PRO에서 결과를 제공한다. (시행 #1)
도 81. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS; 10 μg/kg) TG 결과 대 MOD-5014 (PRO; 10 μg/kg) TG 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (시행 #2)
도 82. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS; 2.5 μg/kg) TG 결과 대 MOD-5014 (PRO; 2.5 μg/kg) TG 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (시행 #2)
도 83. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS; 5 μg/kg) TG 결과 대 MOD-5014 (PRO; 5 μg/kg) 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (시행 #2)
도 84 A -C. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS)의 존재하에 용량 의존적 TG 반응을 보여준다. (A)는 2.5 μg/ml NS에서 결과를 제공한다. (B)는 10 μg/ml NS에서 결과를 제공한다. (C)는 5 μg/ml NS에서 결과를 제공한다. (시행 #2)
도 85 A -C. TF의 상승하는 농도에서 MOD-5014 (PRO)의 존재하에 용량 의존적 TG 반응을 보여준다. (A)는 2.5 μg/ml PRO에서 결과를 제공한다. (B)는 10 μg/ml PRO에서 결과를 제공한다. (C)는 5 μg/ml PRO에서 결과를 제공한다. (시행 #2)
도 86 A -E. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS; 10 μg/kg) TG 결과 대 MOD-5014 (PRO; 10 μg/kg) TG 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (A)는 0 pM TF에서 결과를 제공한다. (B)는 1 pM TF에서 결과를 제공한다. (C)는 5 pM TF에서 결과를 제공한다. (D)는 0.5 pM TF에서 결과를 제공한다. (E)는 2.5 pM TF에서 결과를 제공한다. (시행 #2)
도 87. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS; 2.5 μg/kg) TG 결과 대 MOD-5014 (PRO; 2.5μg/kg) TG 결과의 오버레이 분석을 제공한다 (A)는 0 pM TF에서 결과를 제공한다. (B)는 1 pM TF에서 결과를 제공한다. (C)는 5 pM TF에서 결과를 제공한다. (D)는 0.5 pM TF에서 결과를 제공한다. (E)는 2.5 pM TF에서 결과를 제공한다. (시행 #2)
도 88. TF의 상승하는 농도에서 NovoSeven® (NS; 5μg/kg) TG 결과 대 MOD-5014 (PRO; 5 μg/kg) TG 결과의 오버레이 분석을 제공한다. (A)는 0 pM TF에서 결과를 제공한다. (B)는 1 pM TF에서 결과를 제공한다. (C)는 5 pM TF에서 결과를 제공한다. (D)는 0.5 pM TF에서 결과를 제공한다. (E)는 2.5 pM TF에서 결과를 제공한다. (시행 #2)
도 89. WBCT 추적 MOD-5014 스파이킹(Spiking) 갯과 혈액의 그래프를 보여준다.
도 90. 2-구획 약동학적 모델의 개략도를 보여준다.
도 91. 개에 있어서 IV 주입 이후 평균 혈장 MOD-5014 농도 대 시간의 그래프를 제공한다.
도 92. 개에 있어서 IV 주입 이후 평균 혈장 MOD-5014 활성 대 시간의 그래프를 제공한다.
도 93A-B. 개에 있어서 50μg/kg의 IV 주입 이후 활성 및 MOD-5014 혈장 농도의 비교 데이터를 보여준다. 도 93(A)는 개 P14에 대한 결과를 보여주고 도 93(B)는 개 N06에 대한 결과를 보여준다.
도 94A-D. 개에 있어서 200μg/kg의 IV 주입 이후 활성 및 MOD-5014 혈장 농도의 비교 데이터를 보여준다. 도 94(A)는 개 Blondie에 대한 결과를 보여주고; 도 94(B)는 개 Josie에 대한 결과를 보여주고; 도 94(C)는 개 N06에 대한 결과를 보여주고; 도 94(D)는 개 P14에 대한 결과를 보여준다.
도 95A-B. 개에 있어서 400μg/kg의 IV 주입 이후 활성 및 MOD-5014 혈장 농도의 비교 데이터를 보여준다. 도 95(A)는 개 Blondie에 대한 결과를 보여주고 도 95(B)는 개 Josie에 대한 결과를 보여준다.
도 96A-B. 개에 있어서 600μg/kg의 IV 주입 이후 활성 및 MOD-5014 혈장 농도의 비교 데이터를 보여준다. 도 96(A)는 개 N05에 대한 결과를 보여주고 도 96(B)는 개 Joanie에 대한 결과를 보여준다.
도 97A-J. 혈장 MOD-5014 농도 대 시간의 플롯을 보여준다. 지점은 관측된 혈장 농도를 나타내고 라인은 T1/2를 계산하는데 사용된 말단 기울기를 나타낸다. 도 97(A)는 30 시간 초과후 개 N06에 대한; 도 97(B)는 30 시간 초과후 개 P14에 대한; 도 97(C)는 약 50 시간후 개 Blondie에 대한; 도 97(D)는 약 50 시간후 개 Josie에 대한; 도 97(E)는 거의 100 시간후 개 N06에 대한; 도 97(F)는 거의 100 시간후 개 P14에 대한; 도 97(G)는 거의 100 시간후 개 Blondie에 대한; 도 97(H)는 거의 100 시간후 개 Josie에 대한; 도 97(I)는 거의 100 시간후 개 Joanie에 대한 그리고 도 97(J)는 거의 100 시간후 개 N05에 대한 결과를 보여준다.
도 98A-J. 혈장 MOD-5014 활성 대 시간의 플롯을 보여준다. 지점은 관측된 혈장 농도를 나타내고 라인은 T1/2를 계산하는데 사용된 말단 기울기를 나타낸다. 도 98(A)는 30 시간 초과후 개 N06에 대한; 도 98(B)는 30 시간 초과후 개 P14에 대한; 도 98(C)는 거의 50 시간후 개 Blondie에 대한; 도 98(D)는 거의 50 시간후 개 Josie에 대한; 도 98(E)는 거의 50 시간후 개 N06에 대한; 도 98(F)는 거의 50 시간후 개 P14에 대한; 도 98(G)는 거의 50 시간후 개 Blondie에 대한; 도 98(H)는 거의 50 시간후 개 Josie에 대한; 도 98(I)는 거의 50 시간후 개 Joanie에 대한 그리고 도 98(J)는 거의 50 시간후 개 N05에 대한 결과를 보여준다.
도 99A-J. 모델링 - 혈장 농도의 결과를 보여준다. 지점은 관측된 혈장 농도를 나타내고 실선은 모델에 의해 예상된 농도를 나타낸다. 도 99(A)는 개 N06에 대하여; 도 99(B)는 개 P14에 대하여; 도 99(C)는 개 Blondie에 대하여; 도 99(D)는 개 Josie에 대하여; 도 99(E)는 거의 100 시간후 개 N06에 대하여; 도 99(F)는 거의 100 시간후 개 P14에 대하여; 도 99(G)는 거의 100 시간후 개 Blondie에 대하여; 도 99(H)는 거의 100 시간후 개 Josie에 대하여; 도 99(I)는 거의 100 시간후 개 Joanie에 대하여 그리고 도 99(J)는 거의 100 시간후 개 N05에 대하여 관측된 및 예상된 결과를 보여준다.
도 100A-J. 모델링 - 활성의 결과를 보여준다. 지점은 관측된 혈장 활성을 나타내고 실선은 모델에 의해 예상된 활성을 나타낸다. 도 100(A)는 적어도 32 시간 이후 개 N06에 대하여 관측된 및 예상된 결과를 보여주고; 도 100(B)는 적어도 32 시간 이후 개 P14에 대하여 관측된 및 예상된 결과를 보여주고; 도 100(C)는 적어도 48 시간후 개 Blondie에 대하여; 도 100(D)는 적어도 48 시간후 개 Josie에 대하여; 도 100(E)는 적어도 48 시간후 개 N06에 대하여; 도 100(F)는 적어도 48 시간후 개 P14에 대하여; 도 100(G)는 적어도 48 시간후 개 Blondie에 대하여; 도 100(H)는 적어도 48 시간후 개 Josie에 대하여; 도 100(I)는 적어도 48 시간후 개 Joanie에 대하여 그리고 도 100(J)는 적어도 48 시간후 개 N05에 대하여 관측된 및 예상된 결과를 보여준다.
도 101A-D. 개 NO6에 있어서 50, 200 또는 400μg/kg MOD-5014의 투여 이후 카올린-개시된 TEG 동력학에서 용량-의존적 변화를 보여준다. (A)는 R-시간 (반응 시간)을 보여주고; (B)는 K-시간 (응괴가 20mm를 달성하는 때까지 R의 단부로부터 시간, 응괴 형성의 속도)를 보여주고; (C)는 각 (K가 도달되는 경우 작성된 곡선의 탄젠트)를 보여주고; (D)는 MA (최대 진폭)을 보여준다.
도 102A-D. 개 P-14에 있어서 50 및 200 μg/kg MOD-5014의 투여 이후 카올린-개시된 TEG 동력학에서 용량-의존적 변화를 보여준다. (A)는 R-시간 (반응 시간)을 보여주고; (B)는 K-시간 (응괴가 20mm를 달성하는 때까지 R의 단부로부터 시간, 응괴 형성의 속도)를 보여주고; (C)는 각 (K가 도달되는 경우 작성된 곡선의 탄젠트)를 보여주고; (D)는 MA (최대 진폭)을 보여준다.
도 103A-D. 개 Blondie에 있어서 200 및 400 μg/kg MOD-5014의 투여 이후 카올린-개시된 TEG 동력학에서 용량-의존적 변화를 보여준다. (A)는 R-시간 (반응 시간)을 보여주고; (B)는 K-시간 (응괴가 20mm를 달성하는 때까지 R의 단부로부터 시간, 응괴 형성의 속도)를 보여주고; (C)는 각 (K가 도달되는 경우 작성된 곡선의 탄젠트)를 보여주고; (D)는 MA (최대 진폭)을 보여준다.
도 104A-D. 개 Josie에 있어서 200 및 400 μg/kg MOD-5014의 투여 이후 카올린-개시된 TEG 동력학에서 용량-의존적 변화를 보여준다. (A)는 R-시간 (반응 시간)을 보여주고; (B)는 K-시간 (응괴가 20mm를 달성하는 때까지 R의 단부로부터 시간, 응괴 형성의 속도)를 보여주고; (C)는 각 (K가 도달되는 경우 작성된 곡선의 탄젠트)를 보여주고; (D)는 MA (최대 진폭)을 보여준다.
도 105A-D. 개 Joanie에 있어서 50, 200 또는 400 μg/kg MOD-5014의 투여 이후 카올린-개시된 TEG 동력학에서 용량-의존적 변화를 보여준다. (A)는 R-시간 (반응 시간)을 보여주고; (B)는 K-시간 (응괴가 20mm를 달성하는 때까지 R의 단부로부터 시간, 응괴 형성의 속도)를 보여주고; (C)는 각 (K가 도달되는 경우 작성된 곡선의 탄젠트)를 보여주고; (D)는 MA (최대 진폭)을 보여준다.
도 106A-D. 개 NO5에 있어서 MOD-5014 투여 이후 경시적으로 TEG의 동력학을 보여준다. (A)는 R-시간 (반응 시간)을 보여주고; (B)는 K-시간 (응괴가 20mm를 달성하는 때까지 R의 단부로부터 시간, 응괴 형성의 속도)를 보여주고; (C)는 각 (K가 도달되는 경우 작성된 곡선의 탄젠트)를 보여주고; (D)는 MA (최대 진폭)을 보여준다.
도 107 A -D. rhFVIIa의 270μg/kg의 투여 이후 TEG 성능에서 변화를 보여준다 (A)는 R-시간 (반응 시간)을 보여준다. (B)는 각 (K가 도달되는 경우 작성된 곡선의 탄젠트)를 보여준다. (C)는 K-시간 (응괴가 20mm를 달성하는 때까지 R의 단부로부터 시간, 응괴 형성의 속도)를 보여준다. (D)는 MA (최대 진폭)을 보여준다.
도 108A-D. 개별 동물 (Blondie)로부터 MOD-5014 확장된 TEG 효과, 대표적인 데이터를 보여준다. (A)는 R-시간 (반응 시간)을 보여준다. (B)는 K-시간 (응괴가 20mm를 달성하는 때까지 R의 단부로부터 시간, 응괴 형성의 속도)를 보여준다. (C)는 각 (K가 도달되는 경우 작성된 곡선의 탄젠트)를 보여준다. (D)는 MA (최대 진폭)을 보여준다. (B), (C) 및 (D)에서 화살표는 투여후 4 시간 MOD-5014 TEG 값을 가리키는 중이다.
도 109. pCI-dhfr-MOD-5014 플라스미드의 맵을 보여준다.
도 110. 랫트 독성학 연구의 조합된 대표적인 PK-PD 프로파일을 보여주고, 여기서 경시적으로 혈장 농도 (ng/ml)의 변화율은 개방 정사각형에 의해 지정되고 경시적으로 활성 (mU/ml)의 변화율은 개방 원형에 의해 지정된다.
도 111. 원숭이 독성학 연구의 조합된 대표적인 PK-PD 프로파일을 보여주고, 여기서 경시적으로 혈장 농도 (ng/ml)의 변화율은 개방 원형에 의해 지정되고 경시적으로 활성 (mU/ml)의 변화율은 개방 정사각형에 의해 지정된다.
도 112. 숫컷 필리핀 원숭이에 있어서 IV 볼러스 투여 이후 평균혈장 MOD-5014 농도 대 시간.
도 113. 숫컷 필리핀 원숭이에 있어서 IV 볼러스 투여 이후 평균 MOD-5014 응고 활성 대 시간.
도 114. 숫컷 필리핀 원숭이에 있어서 1 mg/kg의 IV 볼러스 주사 이후 응고 활성 및 MOD-5014 혈장 농도의 비교.
도 115. 숫컷 필리핀 원숭이에 있어서 7.5 mg/kg의 IV 볼러스 주사 이후 응고 활성 및 MOD-5014 혈장 농도의 비교.
도 116. 숫컷 필리핀 원숭이에 있어서 15 mg/kg의 IV 볼러스 주사 이후 응고 활성 및 MOD-5014 혈장 농도의 비교.
도 117A-117R. 시간에 대하여 개별 혈장 MOD-5014 농도 및 응고 활성.
도 118. MOD-5014 또는 FVIIa-치료된 혈소판의 평균 형광 강도.
도 119. MOD-5014 또는 FVIIa-치료된 혈소판에서 트롬빈 생성.
도 120. FVIIa (NovoSeven)과 CTP-변형된 인자 VIIa (MOD-5014) 사이 기질 (페파크롬 FVIIa) 절단 활성의 비교를 보여준다.
도 121. 조직 인자에 결합된 경우 FVIIa (NovoSeven)과 CTP-변형된 인자 VIIa (MOD-5014) 사이 기질 (페파크롬 FVIIa) 활성의 비교를 보여준다.
도 122. 인자 VIIa 농도의 관점에서, FVIIa (NovoSeven) 또는 CTP-변형된 FVIIa (MOD-5014)에 의한 활성화된 인자 X의 생성의 비교를 보여준다.
도 123. 인자 X 농도의 관점에서, FVIIa (NovoSeven) 또는 CTP-변형된 FVIIa (MOD-5014)에 의한 활성화된 인자 X의 생성의 비교를 보여준다.
도 124A 및 124B. 조직 인자의 부재하에 그리고 지질 농도 (124A)의 관점에서, FVIIa (NovoSeven) 또는 CTP-변형된 FVIIa (MOD-5014)에 의한 활성화된 인자 X의 생성의 속도의 비교를 보여준다. 조직 인자의 부재하에 그리고 지질 농도 (124B)의 관점에서, FVIIa (NovoSeven) 또는 CTP-변형된 FVIIa (MOD-5014)에 의한 활성화된 인자 X의 생성의 비교를 보여준다.
도 125. 조직 인자의 부재하에 그리고 인자 X 농도의 관점에서, FVIIa (NovoSeven)과 MOD-5014 사이 활성화된 인자 X의 생성의 비교를 보여준다.
도 126. 폴리브렌의 관점에서 FVIIa (NovoSeven) 및 CTP-변형된 FVIIa (MOD-5014)에 의한 기질 (페파크롬 FVIIa) 절단의 억제의 비교를 보여준다.
도 127A-127C. TFPI 농도 (도 127A) 및 FVIIa (도 127B) 및 MOD-5014 (127C)에 대한 TFPI 노출의 지속기간의 관점에서 FVIIa (NovoSeven) 및 CTP-변형된 FVIIa (MOD-5014)에 의한 기질 (페파크롬 FXa) 절단의 억제의 비교를 보여준다.
발명의 상세한 설명
일 구현예에서, 본 발명은 지속성 응고 인자 및 이를 생성 및 사용하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 지속성 응고 인자는 카복시 말단 펩타이드 (CTP, 또한 일명 CTP 단위)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자를 포함하는 지속성 폴리펩타이드는 추가로, 인간 융모성 성선자극호르몬 (hCG)의 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP는 응고 인자의 열화에 대항하는 보호제로서 작용한다. 또 다른 구현예에서, CTP는 응고 인자의 Cmax를 연장한다. 또 다른 구현예에서, CTP는 응고 인자의 Tmax를 연장한다. 또 다른 구현예에서, CTP는 순환 응고 인자의 반감기를 연장한다. 일부 구현예에서, CTP는 응고 인자의 효력을 향상시킨다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 1 내지 10개의 CTP를 응고 인자의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 응고 입자의 생물학적 반감기를 연장시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 1 내지 5개의 CTP를 응고 인자의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 응고 입자의 생물학적 반감기를 연장시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 순환 응고 인자의 반감기를 연장시키는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 응고 인자의 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 응고 인자의 반감기를 연장시키는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 CTP-변형된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 완충액, 긴장성 제제, 및 응고 인자 및 상기 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 CTP로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드 를 포함하는 약제학적 제형에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 혈우병 A 또는 B를 가지고 있는 대상체 에게 1주 1회 투여하기 위한 제형에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 응고 인자 결핍를 가지고 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 후천성 혈우병을 가지고 있다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 응고 인자 결핍, 또는 혈우병을 가지고 있는 대상체에게 1주 1회 투여하기 위한 약제학적 제형을 제조하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
a) 3개의 융모성 성선자극호르몬 CTP를 상기 응고 인자의 카복시 말단에 부착시켜서 응고 인자를 변형시키는 단계;
b) 단계 a.의 변형된 응고 인자를 상기 완충액, 및 약 6.4의 pH의 상기 긴장제와 혼합하는 단계; 및,
c) 주사기에 상기 제형을 미리-채우는 단계.
일 구현예에서, 본 개시내용은 주사기에 본 명세서에서 제공된 제형을 채우는 방법을 관한 것이고, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
a) 사전-결정된 양의 CTP-변형된 응고 인자를 갖는 상기 CTP-변형된 응고 인자의 1주 1회 복용 형태 를 제형하는 단계; 및
b) 상기 주사기에 상기 제형을 채우는 단계.
일 구현예에서, "약제학적 조성물" 또는 "약제학적 제형"은 다른 화학 성분 예컨대 생리적으로 적합한 담체 및 부형제과 함께 본 명세서에 기재된 활성 성분 중 하나 이상의 제제를 지칭한다. 약제학적 조성물 또는 "약제학적 제형"의 목적은 화합물의 유기체에의 투여를 촉진하는 것이다. 특정 구현예에서, "약제학적 조성물" 또는 "약제학적 제형"은 약물의 약제학적 복용 형태를 제공한다. "약제학적 조성물" 또는 "약제학적 제형"은 특정 구현예에서, 서방형 기술, 경피 패치, 또는 당해 기술의 임의의 공지된 복용 형태를 포함한다.
응고 인자 VII (FVII)는 불활성 전구-효소로서 혈류로 간세포에 의해 분비된 444 아미노산 당단백질 (50KDa)이다. 조직 손상 및 순환 혈액에 대한 노출 시, FVII는 FVII에 대한 진정한 수용체 단백질이고 혈관 벽의 더 깊은 층에서 국재화된 다양한 세포에 의해 발현된 조직 인자 (TF) 와의 복합체를 형성한다. 이러한 FVII-TF의 형성은 FVII의 활성화로 이어진다. 활성화된 FVII (FVIIa)은 활성 인자 IX 및 인자 X에 의한 외적인 응고 경로를 개시한다.
FVII은 응고 시스템과 관련된 비타민 K-의존적 당단백질의 그룹에 속한다. FVII 외에, 이러한 그룹은 인자 IX, 인자 X, 단백질 C 및 프로트롬빈으로 구성된다. 이들 단백질은 유사한 도메인 조직화를 가지며 N-말단 프로펩타이드 그 다음 성숙한 아미노산 서열을 갖는 전구체로서 합성된다. 프로펩타이드는 글루탐산 (Glu)을 감마 카복시 글루탐산 (Gla)로 전환시키기 위한 감마카복실라제에 대한 접촉 부위를 함유한다. 이러한 도메인 다음에는 2종의 표피 성장 인자-유사 (EGF) 도메인, 연결 영역 (CR) 및 C-말단 세린 프로테아제 도메인이 뒤따른다. 분비 전에, FVII 프로펩타이드는 절단되어 406 아미노산 단일 사슬 자이모겐 FVII 당단백질을 형성한다. 분비 후, 단백질은 CR에서의 절단에 의해 디설파이드-연결된 2종의 사슬 이종이량체, FVIIa로 활성화될 수 있다. FVII의 혈장 농도는 10 nM이고 대략 1%는 건강한 개인에서 활성 형태로 순환한다. 다른 구현예에서, CTP-변형된 FVII는 적어도 1종의 O-연결된 당화 부위의 점유를 포함한다. 다른 구현예에서, CTP-변형된 FVIIa는 적어도 1종의 O-연결된 당화 부위의 점유를 포함한다.
인자 IX (FIX)는 415 아미노산 (55KDa) 당단백질이고; 응고 시스템과 관련된 비타민 K 의존적 당단백질의 그룹에 속한다. FIX는 N-말단 프로펩타이드 그 다음 성숙한 아미노산 서열를 갖는 잔구체로서 합성된 인자 FVII, 인자 X, 단백질 C 및 프로트롬빈과 유사한 도메일 조직화를 갖는다.
FIX는, 그 대부분이 그것의 생화학적 및 약력학적 특성에 중요한 복합한 후-전사 변형을 거친 단일 사슬 분자로서 분비된다. 모든 후-전사 변형 중에서, 비타민 K-의존적 감마 카복실라제에 의해 감마 카복실레이트화된 FIX의 아미노 말단 근처의 12개의 글루탐산 잔기는 가장 중요한 것이다. 카복실화가 FIX와 인지질 표면과의 상호작용 및 최적의 FIX 활성에 대해 요구된다. 아미노 말단 프로펩타이드는 감마 카복실라제에 대한 인식 부위로서 쓰이고, 따라서, 감마 카복실화 다음에, 쌍으로 된 염기성 아미노산 절단 효소 (PACE/퓨린)으로서 공지된 Golgi 장치 세린 프로테아제에 의해 절단된다. 4개의 추가 후-전사 변형은 Golgi 장치: 티로신 155의 황산화, 세린 158의 인산화, Ser 63 및 61에 대한 O-당화 및 마지막으로, Asn 157 및 16에 대한 N-당화에서 일어날 수 있지만, FIX의 적절한 활성에 대해 필요하지 않는 것으로 나타난다.
FIX는 단일 사슬 불활성 자이모겐으로서 혈장 (5 μg/ml의 평균 농도)에서 순환한다. 1 또는 2 종의 생리적 활성제, FVIIa-TF 복합체 또는 FIXa에 의해 2종의 펩타이드 결합: Arg 145 및 Arg 180에서 단백분해 절단시, 활성화 펩타이드가 제거되어, FIX는 단일 디설파이드 결합에 의해 함께 결합된 경쇄 및 중쇄로 구성된 완전한 활성 효소로 전환된다. N-말단 경쇄는 비-촉매적 감마 카복시글루탐산 (Gla) 및 2종의 표피 성장 인자-유사 도메인을 함유하고, 한편 C-말단 중쇄는 상기 분자의 트립신-유사 촉매 도메인을 함유한다. FIXa 단독은 좋지 못한 촉매적 활성을 특징으로 한다. 그러나 FVIII과 복합체화될 때, 그것의 단백분해 활성은 그것의 천연 기질 FX에 대해 4-5 자릿수까지 증가한다.
또 다른 구현예에서, 생물학적 반감기를 연장시키는 방법 또는 응고 인자의 곡선하 면적 (AUC)를 개선하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 1 내지 10개의 CTP를 응고 인자의 카복시 말단에 부착시켜서, 생물학적 반감기를 연장시키거나 응고 인자의 AUC를 개선하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 생물학적 반감기를 연장시키는 방법 또는 응고 인자의 곡선하 면적 (AUC)를 개선하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 1 내지 5개의 CTP를 응고 인자의 카복시 말단에 부착시켜서, 생물학적 반감기를 연장시키거나 응고 인자의 AUC를 개선하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 생물학적 반감기를 연장시키는 방법 또는 FIX의 곡선하 면적 (AUC)를 개선하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 1 내지 5개의 CTP를 FIX의 카복시 말단에 부착시킴으로써, 생물학적 반감기를 연장시키거나 FIX의 AUC를 개선하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 생물학적 반감기를 연장시키는 방법 또는 FVII 또는 FVIIa의 곡선하 면적 (AUC)을 개선하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 1 내지 5개의 CTP를 FVII 또는 FVIIa의 카복시 말단에 부착시킴으로써, 생물학적 반감기를 연장시키거나 FVII 또는 FVIIa의 AUC를 개선하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FIX 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 추가로, 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 1 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)을 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시킴으로써, 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)는 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된다. 또 다른 구현예에서, 4개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)는 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된다. 또 다른 구현예에서, 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)는 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드의 곡선하 면적 (AUC)을 개선하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FIX 폴리펩타이드의 AUC를 개선하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드의 곡선하 면적 (AUC)를 개선하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 최대 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)을 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시킴으로써, 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 AUC를 개선하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)는 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된다. 또 다른 구현예에서, 4개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)는 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된다. 또 다른 구현예에서, 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)는 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 응고 인자는 단백질이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 응고 인자는 펩타이드이다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 응고 인자는 폴리펩타이드이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 효소이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 세린 프로테아제이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 당단백질이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 트랜스루타미나제이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 불활성 자이모겐이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 응고 인자 이다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 VIII (FVIII)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 V (FV)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 XIII (FXIII)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 X (FX)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 피브린이다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 VIIa (FVIIa)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 VII (FVII)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 IX (FIX)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 X (FX)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 XIa (FXIa)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 XII (FXII)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 Xa (FXa)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 Va (FVa)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 프로트롬빈이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 트롬빈이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 XI (FXI)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 폰빌레브란트 인자 (vWF)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 VIIIa (FVIIIa)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 B-결실된 도메인 FVIII (FVIIIBDD)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 B 도메인-결실된 FVIII (FVIIIBDD)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 베타 도메인-결실된 FVIII (FVIIIBDD)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 IXa (FIXa)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 프리칼리크레인이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 칼리크레인이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 XIIa (FXIIa)이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 피브리노겐이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 트롬보모둘린이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 인자 II (FII)이다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자는 당단백질이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 비타민 K-의존적 당단백질이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 비타민 K-독립적인 당단백질이다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 단백질. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 당단백질이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 당단백질 FV이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FVI이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FVII이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FVIII이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FIX이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FX이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FXI이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FXII이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FvW이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FII이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FIXa이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FXIa이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 피브린이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FVIIa이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FXa이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FVa이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 프로트롬빈이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 트롬빈이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FVIIIa이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 프리칼리크레인이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 칼리크레인이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 재조합 FXIIa이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 임의의 공지된 재조합 응고 인자이다. 또 다른 구현예에서, 신호 펩타이드를 포함하는 응고 인자는 임의의 공지된 재조합 응고 인자이다. 또 다른 구현예에서, 재조합 응고 인자는 신호 펩타이드를 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 활성화된 응고 인자는 신호 펩타이드를 포함하지 않는다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자는 C-말단에 부착된 1 내지 10개의 CTP 반복체 및 N-말단에 부착되지 않은 CTP를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 C-말단에 부착된 적어도 1개의 CTP 및 N-말단에 부착되지 않은 CTP를 포함한다. 또 다른 구현예에서, C-말단에 부착된 1 내지 10개의 CTP 반복체 및 N-말단에 부착되지 않은 CTP를 포함하는 응고 인자는 조작된 응고 인자이다. 또 다른 구현예에서, C-말단에 부착된 적어도 1개의 CTP 및 N-말단에 부착되지 않은 CTP를 포함하는 응고 인자는 조작된 응고 인자이다. 또 다른 구현예에서, C-말단에 부착된 1 내지 10개의 CTP 반복체 및 N-말단에 부착되지 않은 CTP를 포함하는 응고 인자는 접합된 응고 인자이다. 또 다른 구현예에서, C-말단에 부착된 적어도 1개의 CTP 및 N-말단에 부착되지 않은 CTP를 포함하는 응고 인자는 접합된 응고 인자이다.
일 구현예에서, 본 발명은 FIX 폴리펩타이드 및 상기 CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 추가로, FVIIa 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa의 카복시 말단에 부착된 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 추가로, FVIIa 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자는 FIX, FVII, 인자 X, 단백질 C, 또는 프로트롬빈의 도메인 조직화와 유사하거나 동일한 도메인 조직화를 포함하는 응고 인자이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 N-말단 프로펩타이드를 갖는 전구체로서 합성된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 사용된 응고 인자는 불활성 전구-효소 형태이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 간세포에서 생성된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 글루탐산 (Glu)를 감마 카복시 글루탐산 (Gla)로 전환시키는 감마카복실라제의 접촉 부위를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 사용된 응고 인자는 상업적으로 입수가능한 응고 인자이다.
일 구현예에서, 인자 VII을 인코딩하는 핵산 서열 하기 핵산 서열을 포함한다: ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctgacgggcatcgtcagctggggccagggctgcgcaaccgtgggccactttggggtgtacaccagggtctcccagtacatcgagtggctgcaaaagctcatgcgctcagagccacgcccaggagtcctcctgcgagccccatttccctgaggatgcggccgc (서열식별번호: 11).
또 다른 구현예에서, 인자 VII의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP (서열식별번호: 9).
또 다른 구현예에서, 인자 VII의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP*GCGR (서열식별번호: 10).
또 다른 구현예에서, 인자 VII-CTP (이는 카복시 말단에 부착됨)을 인코딩하는 핵산 서열은 하기 핵산 서열을 포함한다: ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacc tgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagcgacacccccatcctgccccagtgaggatccgcggccgc (서열식별번호: 12).
또 다른 구현예에서, 인자 VII-CTP (이는 카복시 말단에 부착됨)의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ* (서열식별번호: 13).
또 다른 구현예에서, 인자 VII-CTP-CTP (이는 카복시 말단에 부착됨)을 인코딩하는 핵산 서열은 하기 핵산 서열을 포함한다: ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgccaggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatccgcggccgc (서열식별번호: 14).
또 다른 구현예에서, 인자 VII-CTP-CTP (이는 카복시 말단에 부착됨)의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ** (서열식별번호: 15).
또 다른 구현예에서, 인자 VII-CTP-CTP-CTP (이는 카복시 말단에 부착됨)을 인코딩하는 핵산 서열은 하기 핵산 서열을 포함한다: ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctccagcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaaggctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtgatgaggatccgcggccgcttaattaa (서열식별번호: 24).
또 다른 구현예에서, 인자 VII-CTP-CTP-CTP (이는 카복시 말단에 부착됨)의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열식별번호: 25). 또 다른 구현예에서, 서열식별번호: 25의 아미노산 1-38은 신호 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 신호 펩타이드가 없는 인자 VII-CTP-CTP-CTP (이는 카복시 말단에 부착됨)의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: ANAFLEELRP GSLERECKEE QCSFEEAREI FKDAERTKLF WISYSDGDQC ASSPCQNGGS CKDQLQSYIC FCLPAFEGRN CETHKDDQLI CVNENGGCEQ YCSDHTGTKR SCRCHEGYSL LADGVSCTPT VEYPCGKIPI LEKRNASKPQ GRIVGGKVCP KGECPWQVLL LVNGAQLCGG TLINTIWVVS AAHCFDKIKN WRNLIAVLGE HDLSEHDGDE QSRRVAQVII PSTYVPGTTN HDIALLRLHQ PVVLTDHVVP LCLPERTFSE RTLAFVRFSL VSGWGQLLDR GATALELMVL NVPRLMTQDC LQQSRKVGDS PNITEYMFCA GYSDGSKDSC KGDSGGPHAT HYRGTWYLTG IVSWGQGCAT VGHFGVYTRV SQYIEWLQKL MRSEPRPGVL LRAPFPSSSS KAPPPSLPSP SRLPGPSDTP ILPQSSSSKA PPPSLPSPSR LPGPSDTPIL PQSSSSKAPP PSLPSPSRLP GPSDTPILPQ (서열식별번호: 46).
또 다른 구현예에서, 활성화된 인자 VII-CTP-CTP-CTP (이는 카복시 말단에 부착됨) (FVIIa-CTP3)의 아미노산 서열은 신호 펩타이드가 없고 서열식별번호: 46 에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVIIa-CTP3은 신호 펩타이드가 없고 서열식별번호: 46의 동족체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVIIa-CTP3은 신호 펩타이드가 없고 서열식별번호: 46의 변이체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, FVIIa-CTP3의 아미노산 서열은 잔기 152에 있는 아르기닌 (R)과 잔기 153에 있는 이소류신 (I) 사이에서 절단된다. 또 다른 구현예에서, FVIIa-CTP3의 아미노산 서열은 구조적으로 각 사슬 상에 존재하는 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 S-S 브릿지 를 포함하는 디설파이드-연결된 2종의 사슬 이종이량체로서 존재한다. 또 다른 구현예에서, FVIIa-CTP3의 아미노산 서열은 구조적으로 경쇄 내에 존재하는 시스테인 잔기와 중쇄 내에 존재하는 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 -S-S- 결합에 의해 연결된 경쇄 및 중쇄 를 포함하는 이종이량체로서 존재한다. 또 다른 구현예에서, 경쇄는 FVIIa-CTP3 아미노산 서열의 N-말단 단편을 포함하고 중쇄는 FVIIa-CTP3 아미노산 서열의 C-말단 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 시스테인 잔기는 2개의 사슬 중 하나에서 임의의 시스테인 잔기일 수 있다. 또 다른 구현예에서, FVIIa-CTP3의 아미노산 서열은 구조적으로 서열식별번호: 46의 시스테인 잔기 135와 시스테인 잔기 262 사이의 S-S 브릿지를 포함하는 디설파이드-연결된 2종의 사슬 이종이량체 로서 존재하고, 상기 2개의 사슬은 아미노산 1-152를 포함하는 경쇄 및 아미노산 153-490을 포함하는 중쇄를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 경쇄는 SDS-PAGE 변성 조건 하에서 약 25 kDA로 이동한다. 또 다른 구현예에서, 중쇄는 SDS-PAGE 변성 조건 하에서 약 50 kDA로 이동한다. 또 다른 구현예에서, 중쇄는 SDS-PAGE 변성 조건 하에서 약 60 kDA로 이동한다.
또 다른 구현예에서, 인자 VII-(CTP)4 (이는 카복시 말단에 부착됨)을 인코딩하는 핵산 서열은 하기 핵산 서열을 포함한다: ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctccagcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaaggctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtgatgaggatccgc (서열식별번호: 26).
또 다른 구현예에서, 인자 VII-(CTP)4 (이는 카복시 말단에 부착됨)의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: LEDMVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열식별번호: 27).
또 다른 구현예에서, 인자 VII-(CTP)5 (이는 카복시 말단에 부착됨)을 인코딩하는 핵산 서열은 하기 핵산 서열을 포함한다: ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctctaaggctccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaaggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtctgccctctccaagcagactccctggcccttcagacactccaatcctcccacagtcctctagctctaaagctccacctcccagcctgcccagccctagtagactccccggaccttctgatacccccatcttgccccagtgatgaggatccgc (서열식별번호: 28).
또 다른 구현예에서, 인자 VII-(CTP)5 (이는 카복시 말단에 부착됨)의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: LEDMVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGS (서열식별번호: 29).
또 다른 구현예에서, 인자 IX를 인코딩하는 핵산 서열은 하기 핵산 서열을 포함한다: gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccattgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttctccagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcacttgaacgcggccgc (서열식별번호: 16).
또 다른 구현예에서, 인자 IX의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT* (서열식별번호: 17).
또 다른 구현예에서, 인자 IX를 인코딩하는 핵산 서열-CTP (이는 카복시 말단에 부착됨)을 인코딩하는 핵산 서열은 하기 핵산 서열을 포함한다: gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagtgatgaaggtctggatccgcggccgc (서열식별번호: 18).
또 다른 구현예에서, 인자 IX의 아미노산 서열-CTP (이는 카복시 말단에 부착됨)의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(서열식별번호: 19).
또 다른 구현예에서, 인자 IX를 인코딩하는 핵산 서열-CTP-CTP (이는 카복시 말단에 부착됨)을 인코딩하는 핵산 서열은 하기 핵산 서열을 포함한다: gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatccgcggccgc (서열식별번호: 20).
또 다른 구현예에서, 인자 IX의 아미노산 서열-CTP-CTP (이는 카복시 말단에 부착됨)의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열식별번호: 21).
또 다른 구현예에서, 인자 IX를 인코딩하는 핵산 서열-(CTP)3 (이는 카복시 말단에 부착됨)을 인코딩하는 핵산 서열은 하기 핵산 서열을 포함한다: tctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctccagcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaaggctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtgatgaggatccgcggccgc (서열식별번호: 30).
또 다른 구현예에서, 인자 IX의 아미노산 서열-(CTP)3 (이는 카복시 말단에 부착됨)의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열식별번호: 31).
또 다른 구현예에서, 인자 IX를 인코딩하는 핵산 서열-(CTP)4 (이는 카복시 말단에 부착됨)을 인코딩하는 핵산 서열은 하기 핵산 서열을 포함한다: tctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctctaaggccccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaaggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtctgccctctccaagcagactccctggcccttcagacactcccattctgccacagtgatgaggatccgcggccgc (서열식별번호: 32).
또 다른 구현예에서, 인자 IX의 아미노산 서열-(CTP)4 (이는 카복시 말단에 부착됨)의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: SRVDPAMQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGSAA (서열식별번호: 33).
또 다른 구현예에서, 인자 IX를 인코딩하는 핵산 서열-(CTP)5 (이는 카복시 말단에 부착됨)을 인코딩하는 핵산 서열은 하기 핵산 서열을 포함한다: ctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctctaaggctccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaaggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtctgccctctccaagcagactccctggcccttcagacactccaatcctcccacagtcctctagctctaaagctccacctcccagcctgcccagccctagtagactccccggaccttctgatacccccatcttgccccagtgatgaggatccgcggccgc (서열식별번호: 34).
또 다른 구현예에서, 인자 IX의 아미노산 서열-(CTP)5 (이는 카복시 말단에 부착됨)의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: RVDPAMQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGSAA (서열식별번호: 35).
또 다른 구현예에서, 퓨린은 본 개시내용의 응고 인자-CTP를 발현시키는 세포에 첨가된다. 또 다른 구현예에서, 퓨린는 세포에서 본 개시내용의 응고 인자-CTP의 생산 효율을 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 퓨린은 본 개시내용의 응고 인자-CTP의 코딩 서열을 포함하는 벡터로 공-형질감염된다. 또 다른 구현예에서, 퓨린은 별도의 벡터에 의해 인코딩된다. 또 다른 구현예에서, 퓨린 및 응고 인자-CTP는 하나의 벡터에 의해 인코딩된다. 또 다른 구현예에서, 퓨린의 코딩 서열은 pCI-DHFR에 삽입된다. 또 다른 구현예에서, 퓨린의 코딩 서열은 pCI-dhfr/smaI+NotI, Furin/AsisI F.I.+NotI에서 조작된다.
또 다른 구현예에서, 퓨린을 인코딩하는 핵산 서열은 하기 핵산 서열을 포함한다: tctagagtcgaccccgccatggagctgaggccctggttgctatgggtggtagcagcaacaggaaccttggtcctgctagcagctgatgctcagggccagaaggtcttcaccaacacgtgggctgtgcgcatccctggaggcccagcggtggccaacagtgtggcacggaagcatgggttcctcaacctgggccagatcttcggggactattaccacttctggcatcgaggagtgacgaagcggtccctgtcgcctcaccgcccgcggcacagccggctgcagagggagcctcaagtacagtggctggaacagcaggtggcaaagcgacggactaaacgggacgtgtaccaggagcccacagaccccaagtttcctcagcagtggtacctgtctggtgtcactcagcgggacctgaatgtgaaggcggcctgggcgcagggctacacagggcacggcattgtggtctccattctggacgatggcatcgagaagaaccacccggacttggcaggcaattatgatcctggggccagttttgatgtcaatgaccaggaccctgacccccagcctcggtacacacagatgaatgacaacaggcacggcacacggtgtgcgggggaagtggctgcggtggccaacaacggtgtctgtggtgtaggtgtggcctacaacgcccgcattggaggggtgcgcatgctggatggcgaggtgacagatgcagtggaggcacgctcgctgggcctgaaccccaaccacatccacatctacagtgccagctggggccccgaggatgacggcaagacagtggatgggccagcccgcctcgccgaggaggccttcttccgtggggttagccagggccgaggggggctgggctccatctttgtctgggcctcggggaacgggggccgggaacatgacagctgcaactgcgacggctacaccaacagtatctacacgctgtccatcagcagcgccacgcagtttggcaacgtgccgtggtacagcgaggcctgctcgtccacactggccacgacctacagcagtggcaaccagaatgagaagcagatcgtgacgactgacttgcggcagaagtgcacggagtctcacacgggcacctcagcctctgcccccttagcagccggcatcattgctctcaccctggaggccaataagaacctcacatggcgggacatgcaacacctggtggtacagacctcgaagccagcccacctcaatgccaacgactgggccaccaatggtgtgggccggaaagtgagccactcatatggctacgggcttttggacgcaggcgccatggtggccctggcccagaattggaccacagtggccccccagcggaagtgcatcatcgacatcctcaccgagcccaaagacatcgggaaacggctcgaggtgcggaagaccgtgaccgcgtgcctgggcgagcccaaccacatcactcggctggagcacgctcaggcgcggctcaccctgtcctataatcgccgtggcgacctggccatccacctggtcagccccatgggcacccgctccaccctgctggcagccaggccacatgactactccgcagatgggtttaatgactgggccttcatgacaactcattcctgggatgaggatccctctggcgagtgggtcctagagattgaaaacaccagcgaagccaacaactatgggacgctgaccaagttcaccctcgtactctatggcaccgcccctgaggggctgcccgtacctccagaaagcagtggctgcaagaccctcacgtccagtcaggcctgtgtggtgtgcgaggaaggcttctccctgcaccagaagagctgtgtccagcactgccctccaggcttcgccccccaagtcctcgatacgcactatagcaccgagaatgacgtggagaccatccgggccagcgtctgcgccccctgccacgcctcatgtgccacatgccaggggccggccctgacagactgcctcagctgccccagccacgcctccttggaccctgtggagcagacttgctcccggcaaagccagagcagccgagagtccccgccacagcagcagccacctcggctgcccccggaggtggaggcggggcaacggctgcgggcagggctgctgccctcacacctgcctgaggtggtggccggcctcagctgcgccttcatcgtgctggtcttcgtcactgtcttcctggtcctgcagctgcgctctggctttagttttcggggggtgaaggtgtacaccatggaccgtggcctcatctcctacaaggggctgccccctgaagcctggcaggaggagtgcccgtctgactcagaagaggacgagggccggggcgagaggaccgcctttatcaaagaccagagcgccctctgaacgcggccgc (서열식별번호: 22).
또 다른 구현예에서, 퓨린의 아미노산 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVARKHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVAKRRTKRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIVVSILDDGIEKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRMLDGEVTDAVEARSLGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCNCDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQKCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPAHLNANDWATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCIIDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSGEWVLEIENTSEANNYGTLTKFTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQACVVCEEGFSLHQKSCVQHCPPGFAPQVLDTHYSTENDVETIRASVCAPCHASCATCQGPALTDCLSCPSHASLDPVEQTCSRQSQSSRESPPQQQPPRLPPEVEAGQRLRAGLLPSHLPEVVAGLSCAFIVLVFVTVFLVLQLRSGFSFRGVKVYTMDRGLISYKGLPPEAWQEECPSDSEEDEGRGERTAFIKDQSAL (서열식별번호: 23).
일 구현예에서, 용어 응고 인자는 추가로, 공지된 응고 인자의 동족체를 포함한다. 일 구현예에서, 동족체는 응고 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 상동성은 또한 그것의 아미노산 치환 및 그것의 생물학적 활성 폴리펩타이드 단편을 포함하는 결실, 삽입, 또는 치환 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 변이체는 응고 입자의 3차원 구조를 크게 변경하지 않는 보존적 치환, 또는 결실, 삽입, 또는 치환을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 결실, 삽입, 또는 치환은 일 구현예에서, 특정한 결합 파트너에 결합하는 관심 응고 입자의 기능을 변경하지 않는다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 응고 인자의 동족체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 응고 활성을 갖는 응고 인자의 동족체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 기능적 결합을 갖는 응고 인자의 동족체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 기재된 응고 활성을 갖는 응고 인자의 동족체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 기재된 기능적 결합을 갖는 응고 인자의 동족체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 디폴트 파라미터를 사용하는 National Center of Biotechnology Information (NCBI)의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 결정되는 바와 같이 동족체 예를 들면, 응고 인자에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 89%, 적어도 91%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 폴리펩타이드.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 퓨린의 동족체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 일 구현예에서 전구단백질을 절단하는 관심 기능을 유지하는 퓨린의 동족체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 디폴트 파라미터를 사용하는 National Center of Biotechnology Information (NCBI)의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 결정되는 바와 같이 동족체 예를 들면, 퓨린에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 89%, 적어도 91%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상동성인 폴리펩타이드.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 1 내지 10개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 1 내지 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 1 내지 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 적어도 1개의 CTP를 그것의 카복시 말단 상에 갖는 응고 인자 를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 1 내지 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 1 내지 5개의 CTP 로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
본 명세서에서 기재된 요소 또는 단계를 포함하는 본 발명의 조성물, 제형 및 방법이, 또 다른 구현예에서, 요소들 또는 단계들로 구성될 수 있거나, 또 다른 구현예에서, 요소들 또는 단계들로 본질적으로 구성될 수 있음을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, 용어 "포함한다"는 지칭한다 표시된 활성제의 봉입체, 예컨대 CTP-변형된 응고 인자, 뿐만 아니라 다른 활성제의 봉입체, 및 약제학적 산업에서 공지된 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 완화제, 안정화제, 등을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "로 본질적으로 구성된"은, 유일한 활성 성분이 표시된 활성 성분이지만, 제형을 안정화, 보존하는 등을 위해서지만 표시된 활성 성분의 치료 효과에 직접적으로 관여되지 않는 다른 화합물이 포함될 수 있는 조성물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 "로 본질적으로 구성된"은 활성 성분의 방출을 촉진하는 성분을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "구성되는"은 활성 성분 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 조성물을 지칭한다.
일 구현예에서, 본 발명은 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 3개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 4개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 5개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 6개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 7개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 8개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 9개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 10개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 4개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 6개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 7개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 8개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 9개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 10개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 5개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 6개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 7개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 8개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 9개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 10개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 6개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 7개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 8개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 9개의 CTP를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 10개의 CTP 를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 3개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 4개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 5개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 6개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 7개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 8개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 9개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 10개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 4개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 6개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 7개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 8개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 9개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 10개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 5개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 6개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 7개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 8개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 9개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 10개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 6개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 7개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 8개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 9개의 CTP로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 10개의 CTP 로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 3개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 4개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 5개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 6개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 7개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 8개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 9개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 2 내지 10개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 4개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 6개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 7개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 8개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 9개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 10개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 5개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 6개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 7개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 8개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 9개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 4 내지 10개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 6개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 7개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 8개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 9개의 CTP로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 5 내지 10개의 CTP 로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 구현예에서, CTP를 그것의 아미노 말단 갖지 않는 응고 인자를 포함하고, 그것으로 본질적으로 구성되거나, 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, CTP가 그것의 아미노 말단 상에 없는 응고 인자를 포함하고, 그것으로 본질적으로 구성되거나, 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 적어도 1개의 CTP를 그것의 카복시 말단 상에 가지며 CTP를 그것의 아미노 말단 상에 갖지 않는 응고 인자를 포함하고, 그것으로 본질적으로 구성되거나, 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, CTP의 수를 본 명세서에서 기재된 그것의 카복시 말단 상에 가지며 CTP를 그것의 아미노 말단 상에 갖지 않는 응고 인자를 포함하고, 그것으로 본질적으로 구성되거나, 구성된 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기에 기재된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 추가로, 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드 및 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 추가로, 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 추가로, 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, CTP-변형된 FVIIa는 신호 펩타이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 FVIIa는 신호 펩타이드를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기에 기재된 재조합 응고 인자를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 상기에 기재된 조작된 응고 인자를 제공한다. 일 구현예에서, 상기에 기재된 조작된 응고 인자 CTP-변형된 응고 인자로 칭한다.
일 구현예에서, 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 CTP는 카복시 말단에 나란히 부착된다.
일 구현예에서, 조작된 본 명세서에서 기재된 응고 인자는 비-CTP-변형된 응고 인자와 비교하여 동등 또는 개선된 생물학적 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 조작된 본 명세서에서 기재된 응고 인자는 비-CTP-변형된 응고 인자와 비교하여 동등 또는 개선된 약리적 측정을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 조작된 본 명세서에서 기재된 응고 인자는 비-CTP-변형된 응고 인자와 비교하여 동등 또는 개선된 약동학을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 조작된 본 명세서에서 기재된 응고 인자는 비-CTP-변형된 응고 인자와 비교하여 동등 또는 개선된 약력학을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 응혈 또는 응고 장애 를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 CTP-변형된 응고 인자를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 및 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 CTP-변형된 응고 인자를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 CTP-변형된 인자 VII를 투여하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 혈우병은 혈우병 A이다. 또 다른 구현예에서, 혈우병은 혈우병 B이다. 또 다른 구현예에서, 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 방법은 FVIII 또는 FIX 각각에 대한 억제제로 혈우병 A 또는 B를 가지고 있는 환자에서 혈우병을 예방 또는 치료한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 후천성 혈우병 (억제제 없는 혈우병)을 가지고 있는 환자를 예방 또는 치료하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 방법은 억제제 없는 혈우병 A 또는 B를 예방 또는 치료한다. 또 다른 구현예에서, 혈우병은 중증 혈우병이다. 또 다른 구현예에서, 혈우병은 중간 정도 혈우병이다. 또 다른 구현예에서, 혈우병은 억제제가 있거나 없는 보통 내지 중증 혈우병이다. 용어 "보통 내지 중증 혈우병"은 3% FVIII 또는 FIX 이하를 가지고 있는 대상체를 지칭하는 것으로 숙련가에 의해 인정될 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 CTP-변형된 인자 IX를 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 혈우병은 혈우병 B이다. 일 구현예에서, 혈우병 B는 인자 IX 결핍 또는 크리스마스병으로서 공지되어 있다. 일 구현예에서, 혈우병은, 일 구현예에서, 응고 인자 수준이 0-1%인 혈우병을 기재하는 중증 혈우병이다. 또 다른 구현예에서, 혈우병은, 일 구현예에서, 응고 인자 수준이 1-5%인 혈루병을 기재하는 중간 정도 혈우병이다. 또 다른 구현예에서, 혈우병은, 일 구현예에서, 응고 인자 수준이 5-50%인 혈우병을 기재하는 경도 혈우병이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 폴리펩타이드 및 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FVII 폴리펩타이드 및 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 폴리펩타이드 및 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FVIIa 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 명세서에서 기재된 1종 이상의 CTP-변형된 응고 인자를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 폴리펩타이드 및 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드 및 FVIIa 폴리펩타이드와 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, CTP-변형된 FIX 및 CTP-변형된 FVIIa는 동일한 조성물에서 동시에 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 FIX 및 CTP-변형된 FVIIa는 별도의 조성물에서 동시에 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 FIX 및 CTP-변형된 FVIIa는 별도의 조성물에서 별도의 시간에 투여된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 또는 FVII 폴리펩타이드 및 상기 FIX 또는 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 또는 CTP-변형된 인자 VII 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 또는 FVII 폴리펩타이드 및 상기 FIX 또는 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 4개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 또는 CTP-변형된 인자 VII 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 또는 FVII 폴리펩타이드 및 상기 FIX 또는 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)을 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 또는 CTP-변형된 인자 VII 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 또는 FVII 폴리펩타이드 및 상기 FIX 또는 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 또는 CTP-변형된 인자 VII 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 및 FIX 및 FVII 폴리펩타이드와 상기 FIX 및 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 VII 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 및 FIX 및 FVII 폴리펩타이드와 상기 FIX 및 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 VII 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 또는 FVII 폴리펩타이드 및 상기 FIX 또는 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 또는 CTP-변형된 인자 VII 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 피하로 또는 정맥내로 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 또는 FVII 폴리펩타이드 및 상기 FIX 또는 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 4개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 또는 CTP-변형된 인자 VII 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 피하로 또는 정맥내로 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 또는 FVII 폴리펩타이드 및 상기 FIX 또는 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)을 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 또는 CTP-변형된 인자 VII 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 피하로 또는 정맥내로 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 또는 FVII 폴리펩타이드 및 상기 FIX 또는 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 또는 CTP-변형된 인자 VII 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 피하로 또는 정맥내로 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 및 FIX 및 FVII 폴리펩타이드와 상기 FIX 및 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 VII 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 피하로 또는 정맥내로 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 및 FIX 및 FVII 폴리펩타이드와 상기 FIX 및 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 VII 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 피하로 또는 정맥내로 투여함으로써, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 상기 대상체에게 상기 응고 인자의 카복시 말단 폴리펩타이드에 부착된 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 응고 인자 (상기 CTP-변형된 응고 인자의 서열은 서열식별번호: 25, 27, 또는 29로 구성된 군으로부터 선택됨)를 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈우병을 예방하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 CTP-변형된 응고 인자는 서열식별번호: 25, 27, 29 또는 46으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 상기 CTP-변형된 응고 인자는 서열식별번호: 46 으로 구성된다.
일 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드 및 3 내지 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드 및 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드 및 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 용어 "3 내지 5개"는, 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 언급할 때, 3, 4, 또는 5개의 CTP를 본 명세에서 제공된 응고 입자 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시키는 것을 지칭한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드 및 3 내지 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드 및 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드 및 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVII 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVII 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVII 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드의 곡선하 면적 (AUC)을 개선하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVII 폴리펩타이드의 AUC를 개선하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드의 곡선하 면적 (AUC)을 개선하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVII 폴리펩타이드의 AUC를 개선하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드의 곡선하 면적 (AUC)을 개선하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVII 폴리펩타이드의 AUC를 개선하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVII 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVII 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVII 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드의 청소율을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVII 폴리펩타이드의 청소율을 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드의 청소율을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVII 폴리펩타이드의 청소율을 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드의 청소율을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVII 폴리펩타이드의 청소율을 감소시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, CTP-변형된 FVII 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, CTP-변형된 FVII 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, CTP-변형된 FVII 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FVII 폴리펩타이드 및 3 내지 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FVII 폴리펩타이드 및 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FVII 폴리펩타이드 및 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 VII (FVII) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 추가로, 4개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVII 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시키는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 조작된 응고 인자는 혈우병 B 환자의 치료를 위한 것이다. 일 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 3개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 혈우병 B 환자의 치료를 위한 것이다. 일 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 4개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 혈우병 B 환자의 치료를 위한 것이다. 일 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 5개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 혈우병 B 환자의 치료를 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 2개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 혈우병 B 환자의 치료를 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 1개의 CTP 반복체를 포함하는 응고 인자 IX는 혈우병 B 환자의 치료를 위한 것이다. 다른 구현예에서, 조작된 응고 인자는 환자에 대해 요구된 주입의 횟수를 감소시키고, 환자에 대한 요구 용량을 감소시키거나 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 3개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 그것의 응고 활성 대 FIX-CTP-CTP 수확, FIX-CTP 수확 또는 rhFIX을 유지하면서 개선된 PK 프로파일을 나타낸다. 일 구현예에서, rFIX-CTP3의 제거 반감기는 랫트 및 FIX-결핍 마우스에서 rFIX보다 2.5- 내지 4-배 더 길다. 일 구현예에서, rFIX-CTP3의 투여는 투여 후 76시간 동안 FIX-결핍 마우스에서 전응고 효과를 상당히 지속했다. 일 구현예에서, rFIX-CTP3의 투여는 FIX-결핍 마우스에서 rFIX보다 더 높은 활성 피크를 생성한다. 또 다른 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 2개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 그것의 응고 활성 대 FIX-CTP 수확 또는 rhFIX을 유지하면서 개선된 PK 프로파일을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 2개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 rhFIX와 비교하여 반감기의 3-배수 증가 및 4.5-배 더 높은 AUC를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, SC 투여는 재조합 FVII과 비교하여 CTP-변형된 FVII의 더 높은 생체이용률을 초래한다. 또 다른 구현예에서, 반감기는 더 길고 생체이용률 (AUC SC/AUC IV)는 NovoSeven®의 SC 투여와 비교할 때 FVIIa-CTP3 및 CTP5 SC 투여 다음에 더 높다. 또 다른 구현예에서, 피하로 주사된 MOD-5014 및 MOD-5019는 재조합 FVII (NovoSeven®)와 비교하여 개선된 마우스 생존을 나타낸다 (아래의 실시예 8 참고).
일 구현예에서, MOD-5014는 (C-말단 단부에서 부착된 3개의 CTP 펩타이드를 갖는) FVIIa-CTP3 이다. 일 구현예에서, MOD-5014는 지속성 응고 인자를 제공한다. 일 구현예에서, MOD-5014는 재조합 인간 FVIIa와 비교하여 더 지속되고 장기적인 혈액 응고 반응을 제공한다. (참조 예를 들면, 실시예 14). 숙련가에 의해 인정될 것이다 that 용어들 MOD-5014 또는 FVIIa-CTP3은 모든 동일한 품질 및 의미를 가지면서 상호교환적으로 사용될 수 있고, 일 구현예에서, 아미노산 서열식별번호: 46을 포함하는 디설파이드-연결된 2종의 사슬 이종이량체 구조를 지칭한다. 또한, 숙련가는, CTP-변형된 응고 인자, 예를 들면 FVII-CTP3를 기재할 때, 용어 FVII-CTP3가 특정 사례에서 불활성 형태의 FVII-CTP3를 지칭할 수 있는 것임을 이해한다. 숙련가는, 어떤 형태가 관련된 세부사항 예컨대 활성에 기초하여 언급되는 지를 확실히 인식할 것이다. 유사하게, 용어 MOD-5014는 용어 FVIIa-CTP3와 교환가능하고, 즉, CTP-변형된 응고 인자의 활성 형태를 나타내지만, 특정 사례에서 용어 MOD-5014는 활성 형태의 FVII 또는 FVII-CTP3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 나타내기 위해 사용될 수 있고, 그 다음 세포로부터 발현 및 분비될 것이고, 시험관 내에서 정제 및 활성화되고, 이로써, 활성 형태의 FVIIa는 MOD-5014 분자에 존재하게 된다.
일 구현예에서, 조직 인자 경로 억제제 (TFPI)에 의한 MOD-5014의 탈활성화는 용량-의존적이다. 일 구현예에서, TFPI에 의한 MOD-5014의 탈활성화는 TFPI에 의해 재조합 FVIIa (NovoSeven®)와 유사한 용량-의존적 탈활성화 패턴을 보여준다. 일 구현예에서, MOD-5014는 항-트롬빈 III에 의해 억제된다. 일 구현예에서, 항-트롬빈 III에 의한 MOD-5014의 억제는 헤파린의 존재에서 증강된다. 일 구현예에서, 항-트롬빈 III에 의한 MOD-5014의 억제는 헤파린의 존재 또는 부재에서 재조합 FVIIa (NovoSeven®)와 유사한 억제 패턴 을 보여준다. (아래의 실시예 11 참고)
일 구현예에서, MOD-5014는 용량-의존 방식으로 트롬빈을 생성한다. 일 구현예에서, MOD-5014는 트롬빈 생성의 지연기를 감소시킨다. 일 구현예에서, MOD-5014는 혈액 응고 시간을 감소시킨다. 일 구현예에서, MOD-5014는 응혈 형성의 효율을 증가시킨다. 일 구현예에서, MOD-5014의 투여는 대상체에서 혈액 응고 시간을 감소시킨다. 일 구현예에서, MOD-5014의 투여는 대상체에서 응혈 형성의 효율을 증가시킨다. 일 구현예에서, MOD-5014에 의한 트롬빈의 생성은 재조합 FVIIa (NovoSeven®)에 의해 생성된 것과 유사하다. 일 구현예에서, 트롬빈 생성의 지연기의 감소 by MOD-5014는 재조합 FVIIa (NovoSeven®)에 의해 생성된 것과 유사하다. 일 구현예에서, MOD-5014에 의한 혈액 응고 시간의 감소는 재조합 FVIIa (NovoSeven®)에 의해 생성된 것과 유사하다. 일 구현예에서, MOD-5014에 의한 응혈 형성의 상승 효능은 재조합 FVIIa (NovoSeven®)에 의해 생성된 것과 유사하다 (아래의 실시예 12 참고).
본 명세서에서 제공된 바와 같은, 혈액 응고 인자, 예를 들면 인자 FVII, FVIIA 및 FX에의 CTP 부착은, 혈액 응고 인자의 반감기를 증가시킨다. 실시예 11, 12 및 13은, CTP 부착, 예를 들면 FVIIA에 부착된 3개의 CTP가 혈액 응고 활성에 영향을 미치지 것으로 보이지 않음을 나타낸다. 일 구현예에서, FVII에의 CTP 부착은 응혈 형성을 방해하지 않는다. 일 구현예에서, FVII에의 CTP 부착은 응혈 형성의 상승된 효능을 방해하지 않는다. 일 구현예에서, FVII에의 CTP 부착은 감소된 혈액 응고 시간을 방해하지 않는다. 일 구현예에서, 인지질의 FVII에의 결합은 CTP의 혈액 응고 인자에의 부착 다음에 유지된다. 일 구현예에서, FVIIA에의 CTP 부착은 응혈 형성을 방해하지 않는다. 일 구현예에서, FVIIA에의 CTP 부착은 응혈 형성의 상승된 효능을 방해하지 않는다. 일 구현예에서, FVIIA에의 CTP 부착은 감소된 응혈 형성을 방해하지 않는다. 일 구현예에서, 인지질의 FVIIA에의 결합은 CTP의 혈액 응고 인자에의 부착 다음에 유지된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 폴리펩타이드 및 3 내지 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 폴리펩타이드 및 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 폴리펩타이드 및 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FVIIa 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 명세서에서 기재된 1종 이상의 CTP-변형된 응고 인자를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 폴리펩타이드 및 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드 및 FVIIa 폴리펩타이드와 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, CTP-변형된 FIX 및 CTP-변형된 FVIIa는 동일한 조성물에서 동시에 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 FIX 및 CTP-변형된 FVIIa는 별도의 조성물에서 동시에 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 FIX 및 CTP-변형된 FVIIa는 별도의 조성물에서 별도의 시간에 투여된다.
다른 구현예에서, 조작된 응고 인자는 혈우병 B 환자의 치료를 위한 것이다. 일 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 3개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 혈우병 B 환자의 치료를 위한 것이다. 일 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 4개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 혈우병 B 환자의 치료를 위한 것이다. 일 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 5개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 혈우병 B 환자의 치료를 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 2개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 혈우병 B 환자의 치료를 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 1 CTP 반복체를 포함하는 응고 인자 IX는 혈우병 B 환자의 치료를 위한 것이다. 다른 구현예에서, 조작된 응고 인자는 환자에 대해 요구된 주입의 횟수를 감소시키고, 환자에 대한 요구 용량을 감소시키거나 이들의 조합일 수 있다.
실시예 14는 MOD-5014를 큰 포유동물 (개)에게 투여한 결과를 보여준다. MOD-5014 투여는 혈액 응고에 대한 효과적이고 안전한 지속성 FVIIa를 제공한다. MOD-5014를 사용하는 치료는 예방적 또는 주문식일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 MOD-5014를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 과잉의 출혈을 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 MOD-5014를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 과응의 출혈을 예방하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 예방적으로 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 MOD-5014를 상기 대상체에게 투여함으로써, 예방적으로 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, MOD-5014를 가지고 있는 대상체에서 혈우병을 치료하는 것은 재조합 FVIIa (NovoSeven®)와 비교하여 MOD-5014의 감소된 투여 빈도를 포함한다. 일 구현예에서, 예방적으로 MOD-5014를 가지고 있는 대상체에서 혈우병을 치료하는 것은 재조합 FVIIa (NovoSeven®)와 비교하여 MOD-5014의 감소된 투여 빈도를 포함한다. 일 구현예에서, MOD-5014로 대상체에서 과잉의 출혈을 예방하는 것은 재조합 FVIIa (NovoSeven®)와 비교하여 MOD-5014의 감소된 투여 빈도를 포함한다.
일 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 3개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 그것의 응고 활성 대 FIX-CTP-CTP 수확, FIX-CTP 수확 또는 rhFIX을 유지하면서 개선된 PK 프로파일을 나타낸다. 일 구현예에서, rFIX-CTP3의 제거 반감기는 랫트 및 FIX-결핍 마우스에서 rFIX보다 2.5- 내지 4-배 더 길다. 일 구현예에서, rFIX-CTP3의 투여는 투여 후 76시간 동안 FIX-결핍 마우스에서 전응고 효과를 상당히 지속했다. 일 구현예에서, rFIX-CTP3의 투여는 FIX-결핍 마우스에서 rFIX보다 더 높은 활성 피크를 생성한다. 또 다른 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 2개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 그것의 응고 활성 대 FIX-CTP 수확 또는 rhFIX을 유지하면서 개선된 PK 프로파일을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 2개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 IX는 rhFIX와 비교하여 반감기의 3-배수 증가 및 4.5-배 더 높은 AUC를 나타낸다.
일 구현예에서, 그것의 카복시 말단에서 3개의 CTP를 나란히 포함하는 응고 인자 VII는 그것의 응고 활성 대 NovoSeven®를 유지하면서 개선된 PK 프로파일을 나타낸다 (표 59 및 도 36 참고).
또 다른 구현예에서, 용어들 "CTP 펩타이드," "카복시 말단 펩타이드" 및 "CTP 서열"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 또 다른 구현예에서, 카복시 말단 펩타이드는 전장 CTP이다. 각각의 가능성은 본 개시내용의 별도의 구현예를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 신호 펩타이드는 하기에서 기재된 바와 같이 CTP의 아미노 말단에 부착된다: US 7,553,940(이 문헌은 그 전문이 참고로 본 명세서에 편입되어 있음). 또 다른 구현예에서, 신호 펩타이드는 CTP의 아미노 말단에 부착되지 않는다.
다른 구현예에서, 용어 조작된 응고 인자는 성숙된 응고 인자의 아미노산 서열을 지칭한다. 다른 구현예에서, 용어 조작된 응고 인자는 그것의 신호 서열 또는 신호 펩타이드를 포함하는 응고 인자의 아미노산 서열을 지칭한다.
또 다른 구현예에서, "신호 서열" 및 "신호 펩타이드"는 모든 동일한 품질 및 의미를 가지면서 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 또 다른 구현예에서, "서열"은, 폴리뉴클레오타이드 분자와 관련될 때, 코딩부를 지칭할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 적어도 1개의 CTP를 포함하는 조작된 응고 인자는 적어도 1개의 CTP 없이 향상된 생체내 생물학적 활성 비교된 동일한 응고 인자를 갖는다. 일 구현예에서, 향상된 생물학적 활성은 적어도 일부 생물학적 활성을 유지하면서 조작된 응고 인자의 더 긴 반감기로부터 비롯된다. 또 다른 구현예에서, 향상된 생물학적 활성은 CTP 변형으로 인한 향상된 생물학적 활성으로부터 비롯된다. 또 다른 구현예에서, 향상된 생물학적 활성은 더 긴 반감기와 CTP-변형된 응고 인자의 향상된 기능성 둘 모두로부터 비롯된다.
일부 구현예에서, 응고 인자의 카복시 말단에 있는 적어도 1개의 CTP 서열은 응고 인자의 열화에 대항하여 향상된 보호를 제공한다. 일부 구현예에서, 응고 인자의 카복시 말단에 있는 적어도 1개의 CTP 서열은 청소능에 대항하여 향상된 보호를 제공한다. 일부 구현예에서, 응고 인자의 카복시 말단에 있는 적어도 1개의 CTP 서열은 장기적인 청소능 시간을 제공한다. 일부 구현예에서, 응고 인자의 카복시 말단에 있는 적어도 1개의 CTP 서열은 그것의 Cmax를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 응고 인자의 카복시 말단에 있는 적어도 1개의 CTP 서열은 그것의 Tmax를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 응고 인자의 카복시 말단에 있는 적어도 1개의 CTP 서열은 그것의 T½ 연장시킨다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 접합된 응고 인자는 비변형된 접합된 응고 인자와 동일한 방식으로 사용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 접합된 응고 인자는 증가된 순환 반감기 및 혈장 체류 시간, 감소된 청소능, 및 생체내 증가된 임상 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자의 개선된 특성으로 인해, 이러한 콘주게이트는 비변형된 형태의 동일한 응고 인자보다 덜 빈번하게 투여된다.
또 다른 구현예에서, 감소된 투여 빈도는 개선된 치료 전략을 초래할 것이고, 이것은 일 구현예에서, 개선된 치료 결과, 뿐만 아니라 개선된 환자 삶의 질로 이어지는 개선된 환자 순응으로 이어질 것이다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 종래의 콘주게이트와 비교하여, 본 발명의 콘주게이트의 분자량 및 링커 구조를 갖는 콘주게이트가 개선된 효력, 개선된 안정성, 상승된 AUC 수준, 및 향상된 순환 반감기를 가짐이 밝혀졌다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 추가로, FIX 폴리펩타이드 및 상기 CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 또는 약제학적 제형을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 추가로, FVIIa 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 또는 약제학적 제형을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 추가로, FVIIa 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa의 카복시 말단에 부착된 4개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 또는 약제학적 제형을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 추가로, FVIIa 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa의 카복시 말단에 부착된 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 또는 약제학적 제형을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자의 치료적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 일 구현예에서, 치료적 유효량의 접합된 응고 인자는 인자 예컨대 치료될 특정 병태, 치료될 환자의 병태, 뿐만 아니라 다른 조성물 중 다른 성분에 따라 결정된다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 조성물, 제형, 및 방법에서 사용하기 의한 약제학적 제형을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 응고 인자 및 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드로 구성된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 제형을ㄹ 제공한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 제형은 추가로, 완충액 및 긴장성 제제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 완충액는 20mM 시트레이트 및 13.3 mM 글리신, 및 긴장제는 150 mM NaCl이다. 또 다른 구현예에서, 제형은, 그 pH가 약 6.4이다. 또 다른 구현예에서, 완충액은 20mM 시트레이트 및 13.3 mM 글리신이고, 그리고 긴장제는 150 mM NaCl이며, pH는 6.4이다. 또 다른 구현예에서, 제형은 액체 제형이다. 또 다른 구현예에서, 제형은 동결건조된 제형이다. 또 다른 구현예에서, 액체 제형은 동결건조된 CTP-변형된 응고 인자를 사용하여 형성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자는 FVII-CTP-CTP-CTP이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자는 FVIIa-CTP-CTP-CTP이다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 약제학적 제형을 포함하는 매주 1회 복용 형태가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 약제학적 제형을 포함하는 1일 1회 복용 형태 가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 약제학적 제형을 포함하는 격일 복용 형태 가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 약제학적 제형을 포함하는 이틀 간격 복용 형태 가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 약제학적 제형을 포함하는 매주 2회 복용 형태 가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 약제학적 제형을 포함하는 매주 2회 복용 형태 가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 약제학적 제형을 포함하는 매주 복용 형태 가 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 약제학적 제형을 포함하는 격주 (매 2 주) 복용 형태 가 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 응고 인자 및 상기 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 CTP로 구성된 폴리펩타이드를 포함하는 제형을 제공하고, 상기 폴리펩타이드는 선택적으로 신호 펩타이드롤 구성되고, 상기 제형은 증가된 안정성을 갖는다. 일 구현예에서, 제형은 적어도 1년 동안 안정적이다. 또 다른 구현예에서, 제형은 적어도 2년 동안 안정적이다.
일 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 액체 제형으로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 인자 VII는 액체 제형으로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 인자 VIIa는 액체 제형으로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 인자 IX는 액체 제형으로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 비강내 복용 형태로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 주사가능 복용 형태로 제형화된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 응고 인자 요법의 사용에서 순응도의 증가를 포함하고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, CTP에 의해 변형된 응고 인자를 제공하는 것을 포함하고, 이로써 응고 인자 요법의 사용에서 순응도를 증가시킨다.
또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 1일 1회 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자를 포함하는 폴리펩타이드는 이틀마다 1회 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 대상체에게 3 일마다 1회 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 대상체에게 4 일마다 1회 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 대상체에게 5일마다 1회 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는5일마다 1회 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 대상체에게 매주 1회 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 대상체에게 7-14 일마다 1회 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 대상체에게 10-20 일마다 1회 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 대상체에게 5-15 일마다 1회 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 인자는 대상체에게 15-30 일마다 1회 투여된다.
일 구현예에서, 본 발명의 제제는 주사기 또는 펜 기기를 통해 주사용 액체 제형으로 제형화된다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 제형은 또한, 하기를 포함한다: 보존제, 예컨대 벤즈알코늄 염화물 및 티메로살 및 기타 동종의 것; 킬레이트제, 예컨대 에데테이트 나트륨 및 다른 것; 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트; 긴장성 제제 예컨대 염화나트륨, 칼륨 염화물, 글리세린, 만니톨 및 다른 것; 산화방지제 예컨대 아스코르브산, 아세틸시스틴, 나트륨 메타바이설파이트 및 다른 것; 방향족 제제; 점도 조정제, 예컨대 셀룰로오스 및 그것의 유도체를 포함하는 폴리머; 및 필요에 따라 이들 수성 조성물의 pH 를 조정하기 위한 폴리비닐 알코올 및 산 및 염기. 본 조성물은 또한, 국부 마취제 또는 다른 활성물질을 포함한다. 조성물은 스프레이, 미스트, 드롭스, 및 기타 동종의 것으로서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자는 인간 응고 인자이다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자는 응혈 또는 응고 장애로 괴로운 대상체에 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 응혈 또는 응고 장애는 혈우병이다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자는 혈우병의 예방적 요법에 유용하고 따라서 출혈 및 관련된 합병증의 위험을 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 출혈 및 관련된 합병증의 위험의 감소는 자발적인 출혈의 위험을 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 출혈 및 관련된 합병증의 위험의 감소는 과도한 출혈의 위험을 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자는 외인성으로 투여된 응고 인자에 대한 억제성 항체의 발달시킨 위험을 감소시키면서 혈우병으로 괴로운 대상체의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자는 혈우병으로 괴로운 대상체의 치료에 유용하고, 따라서 항상성을 유도한다.
일 구현예에서, 본 발명의 CTP-변형된 응고 인자는 치료 용도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTP-변형된 응고 인자는 예방적 용도를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자는 과도한 출혈 또는 타박상을 경험하거나 장기적인 프로트롬빈 시간 (PT) 또는 부분적인 트롬보플라스틴 시간 (PTT)을 가지고 있는 대상체의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자는 출혈을 야기하는 후천성 병태, 예컨대 비타민 K 결핍 또는 간 질환을 가지고 있는 대상체의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자는 획득된 (다른 질환으로 인해) 획득된 또는 선천적, 경증 또는 중증, 영구적 또는 일시적인 응고 인자의 결핍을 가지고 있는 대상체의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자는 혈우병 A 로 괴로운 대상체의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자는 혈우병 B 로 괴로운 대상체의 치료에 유용하다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자는 하기로 인한 후천성 결핍을 가지고 있는 대상체의 치료에 유용하다: 만성 질환으로 인한 후천성 결핍, 예컨대 간 질환 또는 암; 급성 병태 예컨대, 빠른 속도로 응고 인자를 소모하는 파종성 혈관내 응고 (DIC); 또는 비타민 K의 결핍 또는 비타민 K 길항제 예컨대 와파린 (인자 II, VII, IX, 및 X의 생성은 비타민 K를 필요로 한다)에 의한 치료. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 접합된 응고 인자는 하기의 비제한적인 예의 응고 불균형을 야기하는 질환으로 괴로운 대상체의 치료에 유용하다: 간 질환, 요독증, 암, 골수 장애, 뱀독에 노출, 비타민 K 결핍, 항응고 요법, 항응고제 와파린의 우연한 섭취, 다중 수혈 (혈액의 저장된 단위는 그것의 응고 인자 중 일부를 잃는다), 또는 이들의 조합. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 심부 정맥　혈전증을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 CTP-변형된 응고 인자를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 혈우병이 있는 대상체에서 조절되지 않는 출혈을 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 CTP-변형된 응고 인자를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 혈우병을 가지고 있는 대상체에서 출혈 에피소드 을 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 CTP-변형된 응고 인자를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 혈우병 B (선천성 인자 IX 결핍)를 가지고 있는 대상체에서 출혈 에피소드를 조정하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에서 기재된 제형을 포함하다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 본 명세서에서 기재된 제형을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 본 명세서에서 기재된 제형을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형 및 방법은 FVIII 또는 FIX에 대한 억제제를 가지고 있는 혈우병 A 또는 B 환자 에서 그리고 후천성 혈우병을 가지고 있는 환자에서 출혈 에피소드의 치료; FVIII 또는 FIX에 대한 억제제를 가지고 있는 혈우병 A 또는 B 환자에서 그리고 후천성 혈우병을 가지고 있는 환자에서 수술 개입 또는 침입 과정 에서 출혈의 예방; 선천성 FVII 결핍을 가지고 있는 환자에서 출혈 에피소드의 치료 및 선천성 FVII 결핍을 가지고 있는 환자에서 수술 개입 또는 침입 과정에서 출혈의 예방을 위한 것이다. 후천성 혈우병은, 이전에 정상 지혈을 가지고 있는 환자가 응고 인자, 가장 빈번하게 FVIII에 대항하는 자가항체를 발달시키는 자발적인 자가면역 장애이다. FVIII에 대항하는 자가항체의 발달은 FVIII 결핍으로 이어지고, 이것은 응고 캐스케이드의 고유 경로를 통한 인자 IXa 및 인자 VIIIa 복합에 의한 트롬빈의 불충분한 생성을 초래한다. 하기 병태는 후천성 혈우병 A와 관련될 수 있다: 특발성, 임신, 자가면역 장애, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 피부과 장애 (예를 들면,　건선, 천포창), 호흡 질환 (예를 들면,　천식,　만성적 폐쇄성 폐 질환), 알러지성 약물 반응, 당뇨병, 급성 B형 간염 감염, 급성 C형 간염 감염, 악성종양-고형 종양 (전립선,　폐,　결장, 췌장, 위, 담관, 두경부,　자궁경부,　유방,　흑색종, 신장), 혈액성 악성종양. 자가면역 장애가 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 일시적 동맥염, 쇼그렌 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈, 굿파스투어 증후군, 중증 근무력증, 그레이브스병, 자가면역 갑상선기능저하증을 포함할 수 있음은 숙련가에 의해 인정될 것이다. 알러지성 반응이 페니실린 및 그것의 유도체, 설파마이드, 페나이토인, 클로르암페니콜, 메틸도파, 데포 티오크산텐, 인터페론 알파, 플루다라빈, 바실리 칼메트-게린 (BCG) 예방접종, 데스벤라팍신을 투여받은 대상체로부터 발생할 수 있음을 숙련가는 인정할 것이다. 혈액성 악성종양이 만성 림프구성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 골수이형성 증후군, 골수섬유증, 및 적백혈병을 포함할 수 있음을 숙련가는 인정할 것이다. 그러므로, 및 일 구현예에서, 대상체에서 후천성 혈우병을 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공되되, 상기 방법은 상기 대상체에게 본 명세서에서 제공된 조성물 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형, 및 방법은 근육 출혈의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형, 및 방법은 관절 출혈의 치료 또는 예방을 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형, 및 방법은 비출혈 및 잇몸 출혈, 점막 출혈, 중추신경계로의 출혈 의 치료 또는 예방 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형, 및 방법은 위장 또는 뇌 출혈 의 치료 또는 예방 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형, 및 방법은 방법은 낮은 빈도의 보통의 출혈의 치료적 또는 예방적 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형, 및 방법은 방법은 낮은 빈도의 보통의 출혈의 치료적 또는 예방적 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형, 및 방법은 높은 빈도의 보통의 출혈의 치료적 또는 예방적 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형, 및 방법은 높은 빈도의 보통의 출혈의 치료적 또는 예방적 치료를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형, 및 방법은 무증상 혈우병 의 치료 또는 예방 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형, 및 방법은 경도 내지 중간 정도 혈우병 의 치료 또는 예방 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형, 및 방법은 중증 혈우병 의 치료 또는 예방 치료를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형, 및 방법은 일 구현예에서는, 통제가능하지 않은 출혈, 및, 또 다른 구현예에서, 뇌내 출혈인 출혈 의 치료 또는 예방 치료를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 제형, 및 방법은 신생아 응고장애; 중증 간질병; 고위험 수술 과정; 외상성 혈액 손실; 골수 이식; 혈소판감소증 및 혈소판 기능 장애; 경구 항응고의 긴급 역전; 인자 V, VII, X, 및 XI의 선천성 결핍; 또는 폰빌레브란트 질환, 일 구현예에서, 폰빌레브란트 인자에 대한 억제제를 갖는 폰빌레브란트 질환 의 치료 또는 예방 치료를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 CTP-변형된 응고 인자는 대상체에서 본 명세서에서 기재된 혈우병 또는 관련된 질환의 치료를 위한 것이다. 일 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 소아이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 사육된 동물이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 농장 동물. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 원숭이이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 말이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 소이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 마우스. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 랫트이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 갯과이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 고양이이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 소, 양, 돼지, 말, 쥣과, 또는 사슴이다. 일 구현예에서, 상기 대상체는 남성이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 여성이다. 일 구현예에서, 상기 대상체는 아동, 또 다른 구현예에서, 청소년, 또 다른 구현예에서, 성인 또는, 또 다른 구현예에서, 나이든 대상체이다. 또 다른 구현예에서, 상기 대상체는 소아 대상체, 또 다른 구현예에서, 노인 대상체이다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 [(CTP)n>1-응고 인자]는 그것의 아미노 말단 상에 CTP 를 갖지 않는 적어도 1개의 CTP 단위에 그것의 카복시 말단 상의 펩타이드 결합 를 통해 연결된 전장 응고 인자 또는 그것의 활성 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 [(CTP)n>1-응고 인자]는 그것의 아미노 말단 상에 를 갖지 않는 CTP에 펩타이드 결합을 통해 연결된 적어도 1개의 CTP 단위에 연결된 응고 인자 또는 그것의 활성 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 하나의 핵산 분자는 그것의 C-말단에 부착된 적어도 1개의 CTP를 포함하고 아미노 말단 상의 CTP를 포함하지 않는 조작된 응고 인자를 인코딩한다.
또 다른 구현예에서, CTP는 링커를 통해 응고 인자에 부착된다. 또 다른 구현예에서, CTP 서열을 응고 인자에 연결하는 링커는 공유결합이다. 또 다른 구현예에서, CTP 서열을 응고 인자에 연결하는 링커는 펩타이드 결합이다. 또 다른 구현예에서, CTP 서열을 응고 인자에 연결하는 링커는 치환된 펩타이드 결합이다. 또 다른 구현예에서, CTP 서열은 하기를 포함한다: DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (서열식별번호: 1). 또 다른 구현예에서, CTP 서열은 하기를 포함한다: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열식별번호: 2). 또 다른 구현예에서, CTP 서열은 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2에서 제시된 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 펩타이드는 서열식별번호: 1에서 제시된 인간 융모성 성선자극호르몬의 아미노산 112에서 위치 145번까지의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTP 서열은 서열식별번호: 2에서 제시된 인간 융모성 성선자극호르몬의 아미노산 118에서 위치 145번까지의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, CTP 서열은 또한 위치 112 내지 118 사이의 임의의 위치에서 시작하고 인간 융모성 성선자극호르몬의 위치 145에서 종료된다. 일부 구현예에서, CTP 서열 펩타이드는 그 길이가 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34종의 아미노산이고, CTP 아미노산 서열의 위치 112, 113, 114, 115, 116, 117 또는 118에서 종료된다.
또 다른 구현예에서, CTP 펩타이드는 미국 특허 번호 5,712,122(이것은 본 명세서에 참고로 편입됨)에서 기재된 바와 같이 1-5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 원상태 CTP와 상이한 융모성 성선자극호르몬 CTP의 변이체이다. 또 다른 구현예에서, CTP 펩타이드는 1개의 보존적 아미노산 치환에 의해 원상태 CTP와 상이한 융모성 성선자극호르몬 CTP의 변이체이다. 또 다른 구현예에서, CTP 펩타이드는 2개의 보존적 아미노산 치환에 의해 원상태 CTP와 상이한 융모성 성선자극호르몬 CTP의 변이체이다. 또 다른 구현예에서, CTP 펩타이드는 3개의 보존적 아미노산 치환에 의해 원상태 CTP와 상이한 융모성 성선자극호르몬 CTP의 변이체이다. 또 다른 구현예에서, CTP 펩타이드는 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 원상태 CTP와 상이한 융모성 성선자극호르몬 CTP의 변이체이다. 또 다른 구현예에서, CTP 펩타이드는 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해 원상태 CTP와 상이한 융모성 성선자극호르몬 CTP의 변이체이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTP 펩타이드 아미노산 서열은 원상태 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩타이드와 적어도 70% 상동이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTP 펩타이드 아미노산 서열은 원상태 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩타이드와 적어도 80% 상동이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTP 펩타이드 아미노산 서열은 원상태 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩타이드와 적어도 90% 상동이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTP 펩타이드 아미노산 서열은 원상태 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩타이드와 적어도 95% 상동이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTP 펩타이드 아미노산 서열은 원상태 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩타이드와 적어도 98% 상동이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTP 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 원상태 인간 CTP DNA 서열 또는 이의 펩타이드와 적어도 70% 상동이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTP 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 원상태 인간 CTP DNA 서열 또는 이의 펩타이드와 적어도 80% 상동이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTP 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 원상태 CTP DNA 서열 또는 이의 펩타이드와 적어도 90% 상동이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTP 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 원상태 CTP DNA 서열 또는 이의 펩타이드와 적어도 95% 상동이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTP 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 원상태 CTP DNA 서열 또는 이의 펩타이드와 적어도 98% 상동이다.
일 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 적어도 하나는 절단된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 둘 모두가 절단된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 2개는 절단된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 3개가 절단된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 4개는 절단된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 5개는 절단된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 2개 이상이 절단된다. 또 다른 구현예에서, 모든 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열이 절단된다. 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열식별번호: 3의 첫 번째 10개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 서열식별번호: 3은 하기 아미노산 (AA) 서열을 포함한다: SSSSKAPPPSLP.
일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열식별번호: 2의 첫 번째 10개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 서열식별번호: 2는 하기 아미노산 (AA) 서열을 포함한다: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.
일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열식별번호: 2의 첫 번째 11개의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열식별번호: 2의 첫 번째 12개의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3의 첫 번째 8개의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열식별번호: 2의 첫 번째 13개의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열식별번호: 2의 첫 번째 14개의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3의 첫 번째 6개의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 절단된 CTP는 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3의 첫 번째 5개의 아미노산을 포함한다.
일 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 적어도 하나는 당화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 둘 모두는 당화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 2개는 당화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 3개는 당화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 4개는 당화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 5개는 당화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 2개 이상은 당화된다. 또 다른 구현예에서, 모든 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열은 당화된다.
일 구현예에서, 본 발명의 CTP 서열은 적어도 1개의 당화 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 CTP 서열은 2개의 당화 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 CTP 서열은 3개의 당화 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 CTP 서열은 4개의 당화 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 하나 이상은 완전히 당화된다. 또 다른 구현예에서, 융모성 성선자극호르몬 CTP 아미노산 서열 중 하나 이상은 부분적으로 당화된다. 일 구현예에서, 부분적으로 당화된이란, CTP 당화 부위 중 하나가 당화된다는 것을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, CTP 당화 부위 중 2개는 당화된다. 또 다른 구현예에서, CTP 당화 부위 중 3개는 당화된다.
일부 구현예에서, CTP 서열 변형은 더 낮은 복용량의 용법을 허용하는데 유리하다. 일부 구현예에서, CTP 서열 변형은 더 적은 복용량을 허용하는데 유리하다. 일부 구현예에서, CTP 서열 변형은 안전한, 지속성 효과를 허용하는데 유리하다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 사용된 "폴리펩타이드", "조작된 응고 인자", 또는 "단백질"은 원상태 폴리펩타이드 (열화 생성물, 합성으로 합성된 폴리펩타이드 또는 재조합 폴리펩타이드) 및 펩타이드모사체 (전형적으로, 합성으로 합성된 폴리펩타이드), 뿐만 아니라 폴리펩타이드 유사체인 펩토이드 및 세미펩토이드를 포함하고, 이것은, 일부 구현예에서, 신체에서 또는 세포로 더 침투할 수 있는 동안 응고 인자를 포함하는 폴리펩타이드를 더욱더 안정적이도록 하는 변형을 갖는다.
일부 구현예에서, 변형은, 비제한적으로 C 말단 변형, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH 또는 CF=CH를 비제한적으로 포함하는 폴리펩타이드 결합 변형, 골격 변형, 및 잔기 변형을 포함한다. 펩타이드모사체 화합물을 제조하는 방법은 당해 기술에서 잘 알려져 있고 예를 들면, 본 명세서에서 완전히 제시된 것처럼 하기에서 구체화된다: Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)(이것은 참고로 편입됨). 이런 점에 대한 추가 세부세항은 아래에 제공된다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드 내의 폴리펩타이드 결합 (-CO-NH-)는 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 결합은 N-메틸레이트화된 결합 (-N(CH3)-CO-)에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 결합은 에스테르 결합 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 결합은 케토메틸렌 결합 (-CO-CH2-)에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 결합은 α-아자 결합 (-NH-N(R)-CO-)에 의해 치환되되, 여기서 R는 임의의 알킬, 예를 들면, 메틸, 카바 결합 (-CH2-NH-)이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 결합은 하이드록시에틸렌 결합 (-CH(OH)-CH2-)에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 결합은 티오아미드 결합 (-CS-NH-)에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 결합은 올레핀성 이중 결합 (-CH=CH-)에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 결합은 레트로 아미드 결합 (-NH-CO-)에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 결합은 폴리펩타이드 유도체 (-N(R)-CH2-CO-)에 의해 치환되되, 여기서 R는 탄소 원자 상에 천연저으로 존재하는 "노르말 " 측쇄이다. 일부 구현예에서, 이들 변형은 폴리펩타이드 사슬을 따라 결합 중 임의의 것에서 그리고 일 구현예에서 몇 개 (2-3 결합)에서 동시에 일어난다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 천연 방향족 아미노산 예컨대 Trp, Tyr 및 Phe는, 합성 비-천연 산 예컨대 페닐글리신, TIC, 나프틸알라닌 (Nol), Phe의 고리-메틸레이트화된 유도체, Phe의 할로겐화된 유도체 또는 o-메틸-Tyr 대신 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 1종 이상의 변형된 아미노산 또는 1종 이상의 비-아미노산 모노머 (예를 들면 지방산, 복합 탄수화물등)을 포함한다.
일 구현예에서, "아미노산" 또는 "아미노산 서열"는 20 자연 발생 아미노산; 예를 들면, 하이드록시프롤린, 포스포세린 및 포스포트레오닌을 포함하는 생체내에서 번역후 종종 변형된 아미노산들; 및 2-아미노아디프산, 하이드록실라이신, 이소데스모신, 노르-발린, 노르-류신 및 오르니틴을 비제한적으로 포함하는 다른 흔치않은 아미노산을 포함하는 것으로 이해된다. 일 구현예에서, "아미노산"은 D- 및 L-아미노산 둘 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는, 응고 인자를 포함하는 폴리펩타이드가 가용성 형태일 것을 요구하는 치료제에서 시용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 그것의 하이드록실-함유 측쇄로 인해 폴리펩타이드 용해도 를 증가시킬 수 있는 세린 및 트레오닌을 비제한적으로 포함하는 1종 이상의 비-천연 또는 천연 극성 아미노산 을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 응고 인자는 선형 형태로 이용되지만, 고리화가 조작된 응고 인자 특징을 심각하게 방해하지 않는 사례에서, 환형 형태의 조작된 응고 인자가 또한 이용될 수 있음이 당해 분야의 숙련가에 의해 인정될 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 응고 인자는 예컨대 표준 고상 기술을 사용하여 생화학적으로 합성된다. 일부 구현예에서, 이들 생화학적 방법은 배타적인 고상 합성, 부분적인 고상 합성, 단편 축합, 또는 고전적 용액 합성을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질 기술은 본 발명의 조작된 응고 인자를 생성하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질 기술은 상대적으로 긴 폴리펩타이드 (예를 들면, 18-25 초과의 아미노산)의 생성을 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질 기술은 본 발명의 조작된 응고 인자의 다량의 생성을 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 재조합 기술은 하기에 의해 기재되어 있다: Bitter 등, (1987) 방법 in Enzymol. 153:516-544, Studier 등 (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson 등 (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu 등 (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi 등 (1984) EMBO J. 3:1671-1680 및 Brogli 등, (1984) Science 224:838-843, Gurley 등 (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 및 Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for 식물 Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463 (이들은 그 전문이 참고로 본 명세서에 편입되어 있음).
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은, 상기에 기재된 바와 같이 응고 인자 및 이 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자의 코딩부를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용은, 상기에 기재된 바와 같이 응고 인자 및 이 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자의 코딩부로 구성된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용은, 상기에 기재된 바와 같이 응고 인자 및 이 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자의 코딩부로 본질적으로 구성된 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 상기에 기재된 바와 같이, 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용은, 상기에 기재된 바와 같이 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드로 구성된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용은, 상기에 기재된 바와 같이 응고 인자 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드로 본질적으로 구성된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 분자이다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 기재된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드 및 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 기재된 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드 및 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 기재된 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드 및 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 기재된 세포 를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 또 다른 구현예에서, 세포는 원핵 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 응고 인자를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 1 내지 10개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 응고 인자의 카복시 말단에 부착시켜서, CTP-변형된 응고 인자를 생성하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 응고 인자를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 인코딩하는 1 내지 10개의 폴리뉴클레오타이드 서열을 상기 응고 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 카복시 말단에 부착시켜서, CTP-변형된 응고 인자를 생성하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜, CTP-변형된 FVIIa 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 조작된 응고 인자는 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 사용하여 합성된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 응고 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 시스-조절 서열 (예를 들면, 프로모터 서열)의 전사 조절을 포함하는 발현 벡터로 결찰된다. 일부 구현예에서, 시스-조절 서열은 본 발명의 조작된 응고 인자의 구성적 발현을 유도하는데 적합하다. 일부 구현예에서, 시스-조절 서열은 본 발명의 조작된 응고 인자의 조직-특이적인 발현을 유도하는데 적합하다. 일부 구현예에서, 시스-조절 서열은 본 발명의 조작된 응고 인자의 유도성 발현을 유도하는데 적합하다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용하는데 적합한 조직-특이적인 프로모터는 1종 이상의 특이적인 세포 군집에서 기능성이 있는 서열을 포함한다. 그 예는 하기를 비제한적으로 포함한다: 프로모터 예컨대 간-특이적인 알부민 [Pinkert 등, (1987) Genes Dev. 1:268-277], 림프양-특이적인 프로모터 [Calame 등, (1988) Adv. Immunol. 43:235-275]; 특히 T-세포 수용체의 프로모터 [Winoto 등, (1989) EMBO J. 8:729-733] 및 면역글로불린; [Banerji 등 (1983) Cell 33729-740], 뉴런-특이적인 프로모터 예컨대 신경필라멘트 프로모터 [Byrne 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477], 췌장-특이적인 프로모터 [Edlunch 등 (1985) Science 230:912-916] 또는 유선-특이적인 프로모터 예컨대 밀크 유장 프로모터 (미국 특허 번호 4,873,316 및 유럽 출원 공개 No. 264,166). 본 발명에서 사용하는데 적합한 유도성 프로모터는, 예를 들면, 테트라사이클린-유도성 프로모터 (Srour, M.A., 등, 2003. Thromb. Haemost. 90: 398-405)을 포함한다.
일 구현예에서, 어구 "폴리뉴클레오타이드 분자"은 단리되고 RNA 서열, 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열 (cDNA), 게놈 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 복합체 폴리뉴클레오타이드 서열 (예를 들면, 상기의 조합)의 형태로 제공된 단일 또는 이중가닥 핵산 서열 을 지칭한다.
일 구현예에서, "상보적 폴리뉴클레오타이드 서열"은 역전사효소 또는 임의의 다른 RNA-의존적 DNA 폴리머라제를 사용하여 메신저 RNA의 역전사로부터 유래된 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 서열은 DNA 폴리머라제를 사용하여 생체내 또는 시험관내에서 후속적으로 증폭될 수 있다.
일 구현예에서, "게놈 폴리뉴클레오타이드 서열"은 염색체로부터 유래된 (단리된) 서열을 지칭하고 따라서 염색체의 인접 부분을 나타낸다.
일 구현예에서, "복합체 폴리뉴클레오타이드 서열"은 적어도 부분적으로 상보적이고 적어도 부분적으로 게놈인 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 복합체 서열은 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하도록 요구된 일부 엑손 서열, 뿐만 아니라 그들 사이에 개재된 일부 인트론 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 인트론 서열은 다른 유전자를 포함하는 임의의 공급원일 수 있고, 전형적으로 보존된 스플라이싱 신호 서열을 포함할 것이다. 일 구현예에서, 인트론 서열은 시스-작용 발현 조절 인자를 포함한다.
일 구현예에서, 발현 및 분비 후에, 신호 펩타이드는 전구체 조작된 응고 인자로부터 절단되고, 이로써 신호 펩타이드가 없는 성숙한 조작된 응고 인자가 생긴다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 PCR 기술, 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 방법 또는 절차를 사용하여 제조된다. 일부 구현예에서, 절차는 2개의 상이한 DNA 서열의 결찰을 수반한다 (참조, 예를 들면, "Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel 등, John Wiley & Sons, 1992).
일 구현예에서, 조작된 응고 인자를 인코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하기 위해 발현 벡터 (즉, 핵산 작제물)에 삽입된다. 일 구현예에서, 본 발명의 발현 벡터는, 이러한 벡터가 원핵생물에서 복제 및 통합에 적합하게 하는 추가 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 발현 벡터는, 이러한 벡터가 진핵생물에서 복제 및 통합에 적합하게 하는 추가 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 발현 벡터는, 이러한 벡터가 원핵생물 및 진핵생물 둘 모두에서 복제 및 통합에 적합하게 하는 셔틀 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 클로닝 벡터는 전사 및 번역 개시 서열 (예를 들면, 프로모터, 인핸서) 및 전사 및 번역 종결자 (예를 들면, 폴리아데닐화 신호)을 포함한다.
일 구현예에서, 다양한 원핵 또는 진핵 세포는 본 발명의 응고 인자를 발현시키기 위해 숙주-발현 시스템으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 미생물, 예컨대 폴리펩타이드 코딩 서열를 함유하는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터 로 전환된 박테리아; 폴리펩타이드 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 전환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들면, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터, 예컨대, 폴리펩타이드 코딩 서열을 함유하는 Ti 플라스미드로 전환된 식물 세포 시스템.
일부 구현예에서, 비-박테리아 발현 시스템는 본 발명의 응고 인자를 발현시키기 위해 사용된다 (예를 들면 포유동물 발현 시스템 예컨대 CHO 세포). 일 구현예에서, 포유동물 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위해 사용된 발현 벡터는 CMV 프로모터 및 네오마이신 저항 유전자를 포함하는 pCI-DHFR 벡터이다. pCI-dhfr 벡터의 작제는 일 구현예에 따르면, 실시예 1에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 시스템에서, 수많은 발현 벡터는 발현된 폴리펩타이드에 개해 의도된 사용에 따라 유익하게 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 큰 양의 폴리펩타이드가 바람직하다. 일 구현예에서, 단백질 생성물의 높은 수준의 발현, 가능하게는 직접적인 발현된 생성물을 박테리아의 주변세포질 또는 단백질 생성물이 쉽게 정제되는 배양 배지로 유도하는 소수성 신호 서열과의 융합으로서 유도하는 벡터가 바람직하다. 일 구현예에서, 특정 융합 단백질은 폴리펩타이드의 회수를 돕기 위해 특이적인 절단 부위로 조작된다. 일 구현예에서, 그와 같은 조작에 적응할 수 있는 벡터는, 비제한적으로, E. 콜리 발현 벡터의 pET 시리즈를 포함한다 [Studier 등, Methods in Enzymol. 185:60-89 (1990)].
일 구현예에서, 효모 발현 시스템이 사용된다. 일 구현예에서, 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유화는 수많은 벡터가 U.S. 특허 출원. No: 5,932,447(이 문헌은 그 전문이 참고로 본 명세서에 편입되어 있음)에서 개시된 바와 같이 효모에서 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 외래 DNa 서열의 효모 염색체로의 통합을 촉진하는 벡터가 사용된다.
일 구현예에서, 본 발명의 발현 벡터는 추가로, 예를 들면, 단일 mRNA 예컨대 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)로부터의 몇 개의 단백질의 번영을 허용하는 추가 폴리뉴클레오타이드 서열 및 프로모터-키메라성 폴리펩타이드의 게논 통합에 대한 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 포유동물 발현 벡터는, 비제한적으로, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81 (Invitrogen로부터 입수가능), pCI(Promega로부터 입수가능), pMbac, pPbac, pBK-RSV 및 pBK-CMV(Strategene로부터 입수가능), pTRES (Clontech로부터 입수가능), 및 그것의 유도체를 포함한다.
일부 구현예에서, 진핵 바이러스 예컨대 레트로바이러스로부터 조절 입자를 함유하는 발현 벡터는 본 발명에서 사용된다. SV40 벡터는 pSVT7 및 pMT2를 포함한다. 일부 구현예에서, 소 유두종 바이러스로부터 유래된 벡터는 pBV-1MTHA를 포함하고, 엡슈타인 Bar 바이러스로부터 유래된 벡터는 pHEBO, 및 p2O5를 포함한다. 다른 예시적인 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 배큘로바이러스 pDSVE, 및 SV-40 초기 프로모터, SV-40 후발 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥣과 유선 종양 바이러스 프로모터, 루 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서 발현에 대해 효과적인 다른 프로모터의 방향 하에서 단백질의 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 바이러스 벡터가 본 발명의 응고 인자의 생체내 발현에 유용한 것은, 이점 예컨대 측면 감염 및 표적화 특이성을 제공하기 때문이다. 일 구현예에서, 측면 감염은, 예를 들면, 레트로바이러스의 생활 주기에 내재하고 단일 감염된 세포가 인접하는 세포를 싹 트고 감염시키는 많은 자손 비리온을 생성하는 과정이다. 일 구현예에서, 그 결과는, 큰 면적이 빠르게 감염되는 것이며, 그것의 대부분은 최초 바이러스성 입자에 의해 초기에 감염되지 않았다. 일 구현예에서, 횡방향으로 퍼질 수 없는 바이러스 벡터가 생성된다. 일 구현예에서, 이러한 특징은, 요망된 목적이 지정된 유전자를 국재화된 수의 표적화된 세포에만 도입하는 것이라면 유용할 수 있다.
일 구현예에서, 다양한 방법은 본 발명의 발현 벡터를 세포에 도입하기 위해 사용될 수 있다. 그와 같은 방법은 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), in Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang 등, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega 등, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) 및 Gilboa 등 [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]에서 일반적으로 기재되어 있고 예를 들면, 안정적인 또는 일시적 형질감염, 리포펙션, 전기천공 및 재조합 바이러스 벡터에 의한 감염을 포함한다. 또한, 양성-음성 선택 방법에 대해 U.S. 특허 번호 5,464,764 및 5,487,992(이것은 본 명세서에 참고로 편입되어 있음)를 참고한다.
일부 구현예에서, 바이러스성 감염에 의한 핵산의 도입이 다른 방법 예컨대 리포펙션 및 전기천공에 비해 몇 개의 이점을 제공하는 것은, 더 높은 형질감염 효율 바이러스의 감염 본성으로 인해 수득될 수 있기 때문이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조작된 응고 인자는 또한 위에서 기재된 임의의 적합한 투여 방식 (즉, 생체내 유전자 요법)을 이용하여 개체에게 투여된 핵산 작제물로부터 발현될 수 있음이 인정될 것이다. 일 구현예에서, 핵산 작제물은 적절한 유전자 전달 비히클/방법 (형질감염, 형질도입, 상동성 재조합, 등) 및 필요에 따라 발현 시스템을 통해 적합한 세포에 도입되고 그 다음 변형된 세포는 배양물에서 팽창되고 개체로 되돌아간다 (즉, 생체외 유전자 요법).
일 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용된다. 일 구현예에서, 폴리펩타이드 코딩 서열의 발현은 수많은 프로모터에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, 바이러스성 프로모터 예컨대 CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터 [Brisson 등, Nature 310:511-514 (1984)], 또는 TMV에 대한 코트 단백질 프로모터 [Takamatsu 등, EMBO J. 6:307-311 (1987)]는 사용된다. 또 다른 구현예에서, 하기 예의 식물 프로모터가 사용된다 RUBISCO의 작은 하위단위 [Coruzzi 등, EMBO J. 3:1671-1680 (1984); 및 Brogli 등, Science 224:838-843 (1984)] 또는 열충격 프로모터, 예를 들면, 대두 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B [Gurley 등, Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)]. 일 구현예에서, 작제물은 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접적인 DNA 전환, 미세주입, 전기천공 및 숙련가에게 잘 알려진 다른 기술을 사용하여 식물 세포에 도입된다. 참고, 예를 들면, Weissbach & Weissbach [Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463 (1988)]. 당해 기술에서 잘 알려진 다른 발현 시스템 예컨대 곤충 및 포유동물 숙주세포 시스템은 본 발명에 의해 또한 사용될 수 있다.
(폴리펩타이드를 인코딩하는) 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 대한 필요한 요소를 함유하는 것 외에, 본 발명의 발현 작제물은 또한 발현된 폴리펩타이드의 안정성, 생산, 정제, 수율 또는 활성을 최적화하기 위해 조작된 서열을 포함할 수 있음이 인정될 것이다.
일부 구현예에서, 전환된 세포는 다량의 재조합 조작된 응고 인자의 발현을 허용하는 효과적인 상태 하에서 배양된다. 일부 구현예에서, 효과적인 배양 조건은 단백질을 생산할 수 있는 효과적인 배지, 생물반응기, 온도, pH 및 산소 상태를 비제한적으로 포함한다. 일 구현예에서, 효과적인 배지는, 세포가 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 생산하기 위해 배양된 임의의 배지를 지칭한다. 일부 구현예에서, 배지는 전형적으로 동화할 수 있는 탄소, 질소 및 포스페이트 공급원, 및 적절한 염, 미네랄, 금속 및 다른 영양소, 예컨대 비타민을 가지고 있는 수용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 종래의 발효 생물반응기, 진탕 플라스크, 시험관, 미세적정 디쉬 및 페트리 플레이트에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 배양은 재조합 세포에 적절한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배양 조건의 결정은 당해 분야의 숙련가의 전문지식 내에 있다.
일부 구현예에서, 생성을 위해 사용된 벡터 및 숙주 시스템에 따라, 본 발명의 수득한 조작된 응고 인자는 재조합 세포 내에 남아있고, 발효 배지로 분비되고, E. 콜리에서 2종의 세포 막, 예컨대 주변세포질 공간 사이의 공간으로 분비되거나; 세포 또는 바이러스성 막의 외면 상에 유지된다.
일 구현예에서, 배양에서 예정된 시간 후에, 재조합 조작된 응고 인자의 회수가 수행된다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 사용된 어구 " 재조합 조작된 응고 인자를 회수하는"은 폴리펩타이드를 함유하는 전체의 발효 배지를 수집하는 것을 지칭하고 분리 또는 정제의 추가 단계를 의미할 필요는 없다.
일 구현예에서, 본 발명의 조작된 응고 인자는 다양한 표준 단백질 정제 기술, 예컨대, 비제한적으로, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과, 전기영동, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 콘카나발린 A 크로마토그래피, 크로마토포커싱 및 차별적인 가용화를 사용하여 정제된다.
일 구현예에서, 회수를 촉진하기 위해, 발현된 코딩 서열은 본 발명의 조작된 응고 인자 및 융합된 절단가능 모이어티를 인코딩하기 위해 조작될 수 있다. 일 구현예에서, 융합 단백질은, 폴리펩타이드가 친화성 크로마토그래피에 의해; 예를 들면, 절단가능 모이어티에 대해 특이적인 칼럼 상에의 고정에 의해 쉽게 단리되도록 설계될 수 있다. 일 구현예에서, 절단 부위는 조작된 응고 인자와 절단가능 모이어티 사이에서 조작되고 폴리펩타이드는 이러한 부위에서 융합 단백질을 특이적으로 절단하는 적절한 효소 또는 제제에 의한 처리에 의해 크로마토그래피 칼럼으로부터 방출될 수 있다 [예를 들면, Booth 등, Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); 및 Gardella 등, J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990) 참고].
일 구현예에서, 본 발명의 조작된 응고 인자는 "실질적으로 순수한" 형태로 회수된다.
일 구현예에서, 어구 "실질적으로 순수한"은 본 명세서에서 기재된 적용에서 단백질의 효과적인 사용을 하용하는 순도를 지칭한다.
일 구현예에서, 본 발명의 조작된 응고 인자는 또한 시험관내 발현 시스템을 사용하여 합성될 수 있다. 일 구현예에서, 시험관내 합성 방법은 당해 기술에서 잘 알려져 있고 시스템의 요소는 상업적으로 입수가능하다.
일부 구현예에서, 재조합 조작된 응고 인자는 합성되고 정제되며; 그것의 치료 효능은 생체내 또는 시험관내에서 분석될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 재조합 조작된 응고 인자의 결합 활성은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 다양한 검정을 사용하여 확인될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 조작된 응고 인자는 개체 자체에게 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조작된 응고 인자는 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합되는 약제학적 조성물의 일부로서 개체에게 제공될 수 있다.
또 다른 구현예에서, "약제학적 조성물"은 다른 화학 성분 예컨대 생리적으로 적합한 담체 및 부형제와 함께 본 명세서에 기재된 활성 성분 중 하나 이상의 제제를 지칭한다. 약제학적 조성물의 목적은 화합물의 유기체에의 투여를 촉진하는 것이다.
또 다른 구현예에서, "활성 성분"은 생물학적 효과에 책임있는 관심 폴리펩타이드 서열을 지칭한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 임의의 것은 임의의 형태로 관심있는 조작된 응고 인자의 카복시 말단에만 결합된 적어도 1개의 CTP 서열을 포함할 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 조합된 제제를 제공한다. 일 구현예에서, " 조합된 제제"는, 상기에서 정의된 조합 파트너가 독립적으로 또는 상이한 고정된 조합의 사용으로 현저한 양의 조합 파트너로 즉, 동시에, 동반하여, 개별적으로 또는 순차적으로 복용될 수 있다는 의미에서 특히 "부분 키트"를 정의한다. 일부 구현예에서, 부분 키트의 구분은, 예를 들면, 동시에 또는 시간순으로 엇갈려서, 즉, 부분 키트의 임의의 일부에 대해 상이한 시점에서 및 동일한 또는 상기한 시간 간격으로 투여될 수 있다. 조합 파트너의 총량의 비는, 일부 구현예에서, 조합된 제제로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 조합된 제제는, 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 만들어질 수 있는 바와 같이 예를 들면, 치료될 환자 하위집단의 필요 또는 상이한 필요가 특정한 질환, 질환의 중증도, 연령, 성별, 또는 체중에 기인할 필요가 있는 단일 환자의 필요에 대처하기 위해 변할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상호교환적으로 사용되는 어구 "생리적으로 허용가능한 담체" 및 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 유기체에 대해 상당한 자극을 야기하지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다. 아쥬반트는 이들 어구 하에 포함된다. 일 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 담체 내에 포함된 성분들 중의 하나는 예를 들면, 유기 및 수성 매질 둘 모두에서 광범위한 용해도를 갖는 생체적합성 폴리머인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)일 수 있다 (Mutter 등 (1979)).
또 다른 구현예에서, "부형제"는 활성 성분의 투여를 추가로 촉진하기 위해 약제학적 조성물에 첨가된 불활성 서브스턴스 를 지칭한다. 일 구현예에서, 부형제는 탈산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당류 및 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜의 유형을 포함한다.
제형 기술 및 약물 투여는 하기에서 발견된다: "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판(이것은 본 명세서에 참고로 편입됨).
복용 범위의 다양한 구현예가 본 발명에 의해 고려된다. 본 발명의 조작된 응고 인자의 복용량은, 일 구현예에서, 0.005-100 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 의 범위이다 0.005-5 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 0.01-50 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 0.1-20 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 0.1-10 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 0.01-5 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 0.001-0.01 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 0.001-0.1 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 0.1-5 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 0.5-50 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 0.2-15mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 0.8-65 mg/1일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 1-50 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 5-10 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 8-15 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 10-20mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 20-40 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 60-120 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 12-40 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 40-60 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 50-100mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 1-60 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 15-25 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 5-10 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 55-65 mg/1일의 범위이다.
또 다른 구현예에서, 복용량은 50-500 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 50-150 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 100-200 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 150-250 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 200-300 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 250-400 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 300-500 mg/1일의 범위이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 350-500 mg/1일의 범위이다.
일 구현예에서, 복용량은 20 mg/1일이다. 일 구현예에서, 복용량은 30 mg/1일이다. 일 구현예에서, 복용량은 40 mg/1일이다. 일 구현예에서, 복용량은 50 mg/1일이다. 일 구현예에서, 복용량은 0.01 mg/1일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 0.1 mg/1일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 1 mg/1일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 0.530 mg/1일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 0.05 mg/1일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 50 mg/1일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 10 mg/1일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 20-70 mg/1일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 5 mg/1일이다.
일 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자의 복용량은 1-5 mg/1일이다. 일 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자의 복용량은 1-3 mg/1일이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자의 복용량은 2 mg/1일이다.
또 다른 구현예에서, 복용량은 1-90 mg/1일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 1-90 mg/2일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 1-90 mg/3일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 1-90 mg/4일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 1-90 mg/5일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 1-90 mg/6일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 1-90 mg/주이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 1-90 mg/9일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 1-90 mg/11일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 1-90 mg/14일이다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 복용량은 10-50 mg/1일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 10-50 mg/2일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 10-50 mg/3일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 10-50 mg/4일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 10-50 마이크로그램 mg/5일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 10-50 mg/6일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 10-50 mg/주이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 10-50 mg/9일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 10-50 mg/11일이다. 또 다른 구현예에서, 복용량은 10-50 mg/14일이다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 비강내 복용 형태로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 주사가능 복용 형태로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 0.0001 mg 내지 0.6 mg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 0.001 mg 내지 0.005 mg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 0.005 mg 내지 0.01 mg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 0.01 mg 내지 0.3 mg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 0.2 mg 내지 0.6 mg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 그것의 아미노 말단 상에 CTP가 없다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 1-100 마이크로그램 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 10-80 마이크로그램 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 20-60 마이크로그램 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 10-50 마이크로그램 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 40-80 마이크로그램 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 10-30 마이크로그램 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 30-60 마이크로그램 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 0.2 mg 내지 2 mg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 2 mg 내지 6 mg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 4 mg 내지 10 mg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 5 mg 내지 15 mg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다.
일 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 입자는 10μg/kg 내지 1000μg/kg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 입자는 25μg/kg 내지 600μg/kg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 입자는 50μg/kg 내지 400μg/kg 범위의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 입자는 약 25μg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 입자는 약 50μg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 입자는 약 100μg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 입자는 약 200μg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 입자는 약 300μg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 입자는 약 400μg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 입자는 약 500μg/kg의 용량으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP에 의해 변형된 응고 입자는 약 600μg/kg 의 용량으로 대상체에게 투여된다.
일 구현예에서, CTP-변형된 FIX의 복용량은 동일한 기간 동안 재조합 FIX (예를 들면, Benefix®, Wyeth 또는 Mononine®, CSL Behring)의 권고된 복용량으로 환자에게 투여된 FIX의 양의 50%를 포함한다. 일 구현예에서, CTP-변형된 FVIIa의 복용량은 동일한 기간 동안 재조합 FVIIa (예를 들면, NovoSeven®) 의 권고된 복용량으로 환자에게 투여된 FVIIa의 양의 50%를 포함한다. 일 구현예에서, CTP-변형된 FVII의 복용량은 동일한 기간 동안 환자에게 재조합 FVII의 권고된 복용량으로 투여된 FVII의 양의 50%를 포함한다. 예를 들면, NovoSeven®가 수술전 또는 수술후에 2시간마다 90 mcg/kg의 용량(즉, 85 kg 환자에 대해, 2시간마다 7.65 mg 또는 12시간 동안 6회 용량으로 45.9 mg)으로 환자에게 주어지면, 본 발명의 CTP-변형된 응고 인자는 재조합 FVIIa의 환자의 12-시간 용량의 50%인 용량으로 (즉, 12-시간 기간 동안 1회 23 mg의 용량으로) 주어질 수 있다.
또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자의 복용량은, 비-CTP-변형된 응고 인자를 사용하여 투여된 것보다 응고 인자의 양의 45%를 함유하는 정도이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자의 복용량은, 비-CTP-변형된 응고 인자를 사용하여 투여된 것보다 응고 인자의 양의 10%를 함유하는 정도이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자의 복용량은, 비-CTP-변형된 응고 인자를 사용하여 투여된 것보다 응고 인자의 양의 25%를 함유하는 정도이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자의 복용량은, 비-CTP-변형된 응고 인자를 사용하여 투여된 것보다 응고 인자의 양의 35%를 함유하는 정도이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자의 복용량은, 비-CTP-변형된 응고 인자를 사용하여 투여된 것보다 응고 인자의 양의 75%를 함유하는 정도이다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자의 복용량은, 비-CTP-변형된 응고 인자를 사용하여 투여된 것보다 응고 인자의 양의 100%를 함유하는 정도이다. 그러나, 복용량이 동일한 양의 응고 인자 (예를 들면 FIX)를 비-CTP-변형된 응고 인자를 함유할지라도, 재조합 응고 인자와 비교하여 그것의 증가된 반감기 때문에 덜 빈번하게 투여된다는 점에서 대상체에게 여전히 유리하다.
또 다른 구현예에서, 치료적 유효량의 접합된 응고 인자는 FIX에 대해서는 50 내지 500 IU / kg 체중, 1일 1회 내지 1주 1회 또는 FVIIa에 대해서는 10μg/Kg-500μg/Kg로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 치료적 유효량의 접합된 응고 인자는 150-250 IU / kg 체중, 1일 1회 투여된다. 또 다른 구현예에서, 접합된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 인간 환자에게 다양한 수단으로 투여하는데 효과적인 강도로 제형화된다.
일 구현예에서, FIX는 대상체에서 순환 인자 IX 활성을 20-30 IU/dL로 가져오는데 효과적인 양으로 투여된다. 또 다른 구현예에서, FIX는 대상체에서 순환 인자 IX 활성을 25-50 IU/dL로 가져오는데 효과적인 양으로 투여된다. 또 다른 구현예에서, FIX는 대상체에서 순환 인자 IX 활성을 50-100 IU/dL로 가져오는데 효과적인 양으로 투여된다. 또 다른 구현예에서, FIX는 대상체에서 순환 인자 IX 활성을 100-200 IU/dL로 가져오는데 효과적인 양으로 투여된다. 또 다른 구현예에서, FIX는 대상체에서 순환 인자 IX 활성을 10-50 IU/dL로 가져오는데 효과적인 양으로 투여된다. 또 다른 구현예에서, FIX는 대상체에서 순환 인자 IX 활성을 20-100 IU/dL로 가져오는데 효과적인 양으로 투여된다.
일 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자는 일주일 단위로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자는 매주 2회 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자는 격주 (2주마다 1회) 기준으로 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자는 매월 2회 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자는 1월 1회 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자는 매일 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, CTP-변형된 응고 인자는 이틀마다 대상체에게 투여된다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 3일마다 1회 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 4일마다 1회 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 5일마다 1회 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 6일마다 1회 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 7-14일마다 1회 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 10-20일마다 1회 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 5-15일마다 1회 대상체에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 15-30일마다 1회 대상체에게 투여된다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 응고 인자 요법의 사용에서 순응도를 증가시키는 것을 포함하고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자를 포함하는 폴리펩타이드 및 이 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 적어도 1종의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 제공하여, 응고 인자 요법의 사용에서 순응도를 증가시키는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 방법은, 응고 인자 요법이 필요한 만성 병으로 괴로워하는 환자의 순응도를 증가시키는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 상기에 기재된 바와 같이 응고 인자를 CTP로 변형시켜서 응고 인자의 투여 빈도를 감소시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FIX 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 용어 순응도는 부착을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 응고 인자의 투여 빈도를 감소시켜서 응고 인자 요법이 필요한 환자의 순응도를 증가시키는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도의 감소는 CTP-변형된 응고 인자를 더 안정하게 하는 CTP 변형으로 인해 달성된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도의 감소는 응고 입자의 T½의 증가의 결과로서 달성된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도의 감소는 청소능 시간의 증가 또는 응고 인자의 청소율의 감소의 결과로서 달성된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드의 청소율을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FIX 폴리펩타이드의 청소율을 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드의 청소유을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 청소율을 감소시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도의 감소는 응고 입자의 AUC 측정치를 증가시키는 결과로서 달성된다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 1 내지 10개의 CTP를 응고 인자의 카복시 말단에 부착시켜서, 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 1 내지 5개의 CTP를 응고 인자의 카복시 말단에 부착시켜서, 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 3개의 CTP를 응고 인자의 카복시 말단에 부착시켜서, 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 3 내지 5개의 CTP를 응고 인자의 카복시 말단에 부착시켜서, 응고 인자의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 요법의 사용에서 순응도를 증가시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자 및 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 1 내지 10개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 응고 인자 요법의 사용에서 순응도를 증가시키는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 요법의 사용에서 순응도를 증가시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자 및 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 1 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 응고 인자 요법의 사용에서 순응도를 증가시키는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 요법의 사용에서 순응도를 증가시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자 및 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 응고 인자 요법의 사용에서 순응도를 증가시키는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 요법의 사용에서 순응도를 증가시키는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자 및 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 응고 인자 요법의 사용에서 순응도를 증가시키는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 대상체에서 혈액 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 상기 대상체에게 응고 인자 및 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 1 내지 10개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 상기 대상체에서 혈액 응혈 또는 응고 장애를 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상체에서 혈액 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자 및 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 1 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 상기 대상체에서 혈액 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료한다. 또 다른 구현예에서, 대상체에서 혈액 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자 및 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 상기 대상체에서 혈액 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료한다. 또 다른 구현예에서, 대상체에서 혈액 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자 및 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 상기 대상체에서 혈액 응혈 또는 응고 장애를 예방 또는 치료한다.
또 다른 구현예에서, 대상체에서 혈우병을 예방하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 상기 대상체에게 응고 인자 및 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 1 내지 10개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 상기 대상체에서 혈우병을 예방하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상체에서 혈우병을 예방하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자 및 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 1 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 상기 대상체에서 혈우병을 예방하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상체에서 혈우병을 예방하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자 및 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 상기 대상체에서 혈우병을 예방하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상체에서 혈우병을 예방하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자 및 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 상기 대상체에서 혈우병을 예방하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은, 본 명세서에서 제공된 조성물이 놀랍게도 SC 투여 후 혈류에 더 효과적으로 흡수됨을 나타낸다 (본 명세서의 실시예 7-9 참고). FVIIa를 피하로 투여하는 것은, 예방적 적용에 사용될 수 있으므로 이점이 있다. 피하 주사는 또한 환자가 자가-주입하기에 훨씬 더 쉽고 환자가 아주 어리고 그것의 정맥이 작아서 찾기 어려울 때 유리하다.
또 다른 구현예에서, 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 상기 대상체에게 응고 인자 및 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 1 내지 10개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자 및 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 1 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자 및 응고 입자의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 그것을 필요로 하는 대상체에게, 응고 인자 및 응고 인자의 카복시 말단에 부착된 3 내지 5개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하여, 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다.
경구 투여는, 일 구현예에서, 정제, 캡슐, 로젠지, 씹을 수 있는 정제, 현탁액, 에멀젼 및 기타 동종의 것을 포함하는 단위 복용 형태를 포함한다. 그와 같은 단위 복용 형태는 본 개시내용의 안전하고 유효량의 요망된 응고 인자를 포함하고, 이들 각각은 일 구현예에서, 약 0.7 또는 3.5 mg 내지 약 280 mg/70 kg, 또는 또 다른 구현예에서, 약 0.5 또는 10 mg 내지 약 210 mg/70 kg이다. 경구 투여용 단위 복용 형태의 제조에 적합한 약제학적으로-허용가능한 담체는 당해 기술에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 정제는 전형적으로 하기를 포함한다: 불활성 희석제로서 종래의 약제학적으로-양립가능한 아쥬반트, 예컨대 탈산칼슘, 탄산나트륨, 만니톨, 락토오스 및 셀룰로오스; 결합제 예컨대 전분, 젤라틴 및 수크로오스; 붕해제 예컨대 전분, 알긴산 및 크로스카멜로스; 윤활제 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산 및 탈크. 일 구현예에서, 활윤제 예컨대 이산화규소는 분말-혼합물의 유동 특성을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 착색제, 예컨대 FD&C 염료는, 외관을 위해 첨가될 수 있다. 감미제 및 풍미제, 예컨대 아스파르탐, 사카린, 멘톨, 박하, 및 과일 풍미제는, 씹을 수 있는 정제용으로 유용한 아쥬반트이다. 캡슐은 전형적으로 상기에 개시된 1종 이상의 고형 희석제를 포함한다. 일부 구현예에서, 담체 성분의 선택은 2차 고려사항들 예컨대 맛, 비용, 및 저장 안정성에 좌우되고, 이들은 본 발명의 목적을 위해 중요하지 않고, 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 경구 복용 형태는 사전규정된 방출 프로파일을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 경구 복용 형태는 연장 방출 정제, 캡슐, 로젠지 또는 씹을 수 있는 정제를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 경구 복용 형태는 서방형 정제, 캡슐, 로젠지 또는 씹을 수 있는 정제를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 경구 복용 형태는 즉시 방출 정제, 캡슐, 로젠지 또는 씹을 수 있는 정제를 포함한다. 일 구현예에서, 경구 복용 형태는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 약제학적 활성 성분의 요망된 방출 프로파일에 따라 제형화된다.
경구 조성물은, 일부 구현예에서, 액체 용액, 에멀젼, 현탁액, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 그와 같은 조성물의 제조에 적합한 약제학적으로-허용가능한 담체는 당해 기술에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 액체 경구 조성물은 약 0.001% 내지 약 0.933%의 요망된 화합물 또는 화합물을 포함하거나, 또는 또 다른 구현예에서, 약 0.01% 내지 약 10%이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 조성물은 용액 또는 에멀젼을 포함하고, 이것은 일부 구현예에서 국소 비강내 투여를 위해 의도된, 안전하고 유효량의 본 발명의 화합물 및 선택적으로, 다른 화합물을 포함하는 수용액 또는 에멀젼이다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 비강내 경로에 의해 화합물의 전신 전달을 위해 사용되는 약 0.001% 내지 약 10.0% w/v의 대상 화합물, 더 바람직하게는 약 00.1% 내지 약 2.0를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 근육에 주사된다 (근육내 주사). 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 피부 아래에 주사된다 (피하 주사). 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 근육에 주사된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자 및 적어도 1개의 CTP 단위를 포함하는 폴리펩타이드는 피부에 주사된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자는 전신 투여를 통해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 투여는 비경구, 폐, 경구, 국소, 진피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경비, 안구내, 안과, 경막외, 구강, 직장, 경점막, 장 또는 비경구 전달 (수질내 주사 포함) 뿐만 아니라 척추강내 또는 직접적인 심실내 투여일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제제는 전신 방식보다는 국부로, 예를 들면, 환자의 신체의 특정의 특정 부위에 직접적으로 제제를 주사하여 투여된다.
일 구현예에서, 투여 경로는 장관일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 경로는 결막, 경피, 진피내, 동맥내, 질, 직장, 종양내, 암옆, 경점막, 근육내, 혈관내, 심실내, 두개내, 비강내, 설하, 또는 이들의 조합일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물 및 약제학적 제형은 액상 제제의 정맥내, 동맥내, 또는 근육내 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 액체 제형은 용액, 현탁액, 분산물, 에멀젼, 오일 및 기타 동종의 것을 포함한다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물 및 약제학적 제형은 정맥내로 투여되고, 따라서 정맥내 투여에 적합한 형태로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물 및 약제학적 제형은 동맥내로 투여되고, 따라서 동맥내 투여에 적합한 형태로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물 및 약제학적 제형은 근육내로 투여되고 따라서 근육내 투여에 적합한 형태로 제형화된다.
또한, 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물 및 약제학적 제형은 체표면에 국소적으로 투여되고, 따라서 국소 투여에 적당한 형태로 제형화된다. 적합한 국소 제형은 겔, 연고, 크림, 로션, 드롭스 및 기타 동종의 것을 포함한다. 국소 투여를 위해, 본 발명의 화합물은 약제학적 담체가 있거나 없는 생리적으로 허용가능한 희석제에서 용액, 현탁액, 또는 에멀젼으로 제조되고 적용되는 추가 적절한 치료제 또는 제제와 조합된다.
일 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물 및 약제학적 제형은 당해 기술에서 잘 알려진 과정에 의해, 예를 들면, 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 분말화, 에멀젼화, 캡슐화, 포획 또는 동결 건조 과정에 의해 제조된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 약제학적 조성물 및 약제학적 제형은 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로의 활성 성분의 가공을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 1종 이상의 생리적으로 허용가능한 담체를 사용하여 종래의 방식으로 제형화된다. 일 구현예에서, 제형은 선택된 투여 경로에 좌우된다.
일 구현예에서, 본 개시내용의 주사제는 수용액으로 제형화된다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 주사제는 생리적으로 양립가능한 완충액 예컨대 한스 용액, 링거액, 또는 생리적 염 완충액으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 경점막 투여를 위해, 장벽에 침투하는데 적합한 침투제가 제형에서 사용된다. 그와 같은 침투제는 일반적으로 당해 기술에서 공지되어 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 제제는 비경구 투여, 예를 들면, 볼러스 주사 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여용으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 주사용 제형은, 선택적으로, 첨가된 보존제와 함께 단위 복용 형태로, 예를 들면, 앰풀 또는 다회용량 용기에 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼이고, 제형제 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유한다.
본 조성물은 또한, 일부 구현예에서, 하기를 포함한다: 보존제, 예컨대 벤즈알코늄 염화물 및 티메로살 및 기타 동종의 것; 킬레이트제, 예컨대 에데테이트 나트륨 및 다른 것; 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트; 긴장성 제제 예컨대 염화나트륨, 칼륨 염화물, 글리세린, 만니톨 및 다른 것; 산화방지제 예컨대 아스코르브산, 아세틸시스틴, 나트륨 메타바이설파이트 및 다른 것; 방향족 제제; 점도 조정제, 예컨대 셀룰로오스 및 그것의 유도체를 포함하는 폴리머; 및 필요에 따라 이들 수성 조성물의 pH를 조정하기 위한 폴리비닐 알코올 및 산 및 염기. 본 조성물은 또한, 일부 구현예에서, 국부 마취제 또는 다른 활성물질을 포함한다. 조성물은 스프레이, 미스트, 드롭스, 및 기타 동종의 것 로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 비경구 투여용 약제학적 조성물 및 약제학적 제형은 수용성 형태로 활성 제제의 수용액을 포함한다. 추가로, 활성 성분의 현탁액은, 일부 구현예에서, 적절한 오일 또는 물 기반 주사 현탁액으로서 제조된다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은, 일부 구현예에서, 지방 오일 예컨대 참께 오일, 또는 합성 지방산 에스테르 예컨대 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은, 일부 구현예에서, 현탁액의 점도를 증가시키는 서브스턴스를 함유하고, 그 예는 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란이다. 또 다른 구현예에서, 현탁액은 또한 고농축 용액의 제조를 허용하기 위해 활성 성분의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 제제를 함유한다.
또 다른 구현예에서, 활성 화합물은 소포, 특히 리포좀으로 전달될 수 있다 (참조 Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat 등, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein 및 Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, 앞에서 언급한 것, pp. 317-327; J. E. Diederichs 등, Pharm./nd. 56 (1994) 267- 275).
또 다른 구현예에서, 조절 방출 시스템으로 전달된 약제학적 조성물은 정맥내 주입, 이식가능 삼투 펌프, 경피 패치, 리포좀, 또는 다른 투여 방식을 위해 제형화된다. 일 구현예에서, 펌프가 사용된다 (참조 Langer, 상동; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald 등, Surgery 88:507 (1980); Saudek 등, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). 또 다른 구현예에서, 폴리머성 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조절 방출 시스템은 the 치료 표적, 즉, 뇌에 근접하여 배치될 수 있고, 따라서 전신 용량의 단지 분획만을 필요로 한다 (참조, 예를 들면, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984). 다른 조절 방출 시스템은 Langer (Science 249:1527-1533 (1990)에 의한 검토에서 논의된다.
일부 구현예에서, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면, 멸균된, 무발열원 물 기반 용액으로 구성하기 위한 분말 형태이다. 조성물은, 일부 구현예에서, 원자화 및 흡입 투여를 위해 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 부착된 분사 수단을 갖는 용기 내에 함유된다.
일 구현예에서, 본 발명의 제제는 예를 들면, 종래의 좌약 염기 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드를 사용하여 직장 조성물 예컨대 좌약 또는 유지 관장제에서 제형화된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 맥락에서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물 및 약제학적 제형은, 상기 활성 성분이 의도된 목적을 달성하는데 효과적인 양으로 함유되는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료적으로 효과적인 양은, 질환의 증상을 예방, 경감 또는 완화시키거나 치료될 대상체의 생존을 연잔하는데 효과적인 활성 성분의 양을 의미한다.
일 구현예에서, 치료적으로 효과적인 양의 결정은 당해 분야의 숙련가의 능력 내이다.
그것의 약제학적으로-허용가능한 담체 또는 성분으로서 쓰일 수 있는 서브스턴스의 일부 예는 당, 예컨대 락토오스, 글루코스 및 수크로오스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로오스 및 그것의 유도체, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 및 메틸 셀룰로오스; 분말화된 트라가칸쓰; 맥아; 젤라틴; 탈크; 고형 윤활제, 예컨대 스테아르산 및 스테아르산마그네슘; 황산칼슘; 식물성 오일, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 참께 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 테오브로마의 오일; 폴리올 예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 및 폴리에틸렌 글리콜; 알긴산; 유화제, 예컨대 Tween™ 브랜드 유화제; 습윤제, 그와 같은 나트륨 라우릴 설페이트; 착색제; 풍미제; 정제화 제제, 안정화제; 산화방지제; 보존제; 무발열원 물; 등장의 염수; 및 포스페이트 완충 용액이다. 본 화합물과 함께 사용될 약제학적으로-허용가능한 담체의 선택은 본 화합물이 투여되는 방식으로 기본적으로 결정된다. 대상 화합물이 주사되면, 일 구현예에서, 약제학적으로-허용가능한 담체는, pH가 약 7.4로 조정된 혈액-양립가능한 현탁화제와 함께 멸균된 생리적 염수이다.
또한, 본 조성물은 추가로, 하기를 포함한다: 결합제 (예를 들면 아카시아, 옥수수녹말, 젤라틴, 카보머, 에틸 셀룰로오스, 구아르 검, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 포비돈), 붕해제 (예를 들면 옥수수녹말, 감자 전분, 알긴산, 이산화규소, 크로스카멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 구아르 검, 나트륨 전분 글라이콜레이트), 다양한 pH 및 이온 강도의 완충액 (예를 들면, 트리스-HCI., 아세테이트, 포스페이트), 첨가제 예컨대 표면에의 흡수를 방지하는 알부민 또는 젤라틴, 세제 (예를 들면, Tween 20, Tween 80, 플루론산 F68, 담즙산 염), 프로테아제 억제제, 계면활성제 (예를 들면 나트륨 라우릴 설페이트), 투과 증강제, 가용화제 (예를 들면, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리세롤), 산화방지제 (예를 들면, 아스코르브산, 나트륨 메타바이설파이트, 부틸화된 하이드록시아니솔), 안정화제 (예를 들면 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스), 점도 증가제(예를 들면 카보머, 콜로이드성 이산화규소, 에틸 셀룰로오스, 구아르 검), 감미제 (예를 들면 아스파르탐, 시트르산), 보존제 (예를 들면, 티메로살, 벤질 알코올, 파라벤), 윤활제 (예를 들면 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트), 유동 조제 (예를 들면 콜로이드성 이산화규소), 가소제 (예를 들면 디에틸 프탈레이트, 트리에틸 시트레이트), 유화제 (예를 들면 카보머, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 나트륨 라우릴 설페이트), 폴리머 코팅물 (예를 들면, 폴록사머 또는 폴록사민), 코팅 및 막 형성 제제 (예를 들면 에틸 셀룰로오스, 아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트) 및/또는 아쥬반트.
시럽, 엘릭시르, 에멀젼 및 현탁액에 대한 담체의 전형적인 성분은 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 액체 수크로오스, 소르비톨 및 물으ㅡㄹ 포함한다. 현탁액에 대해, 전형적인 현탁화제는 메틸 셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 (예를 들면 Avicel™, RC-591), 트라가칸쓰 및 나트륨 알기네이트를 포함하고; 전형적인 습윤제는 레시틴 및 폴리에틸렌 옥사이드 소르비탄 (예를 들면 폴리소르베이트 80)을 포함한다. 전형적인 보존제는 메틸 파라벤 및 나트륨 벤조에이트를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 경구 액체 조성물은 또한, 1종 이상의 성분 예컨대 상기에 개시된 감미제, 풍미제 및 착색제를 함유한다.
조성물은 또한 활성 물질의, 폴리머 화합물의 미립자 제제 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜 산, 하이드로겔, 등에 또는 그 상에, 또는 리포좀, 마이크로에멀젼, 교질입자, 단일라멜라 또는 다중층 소포, 적혈구 유령, 또는 스페로플라스트) 상에의 혼입을 포함한다. 그와 같은 조성물은 물리적 상태, 용해도, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 청소능의 속도에 영향을 미칠 것이다.
조직-특이적 수용체, 리간드 또는 항원에 대항하여 지향된 항체에 커플링되거나 조직-특이적 수용체의 리간드에 커플링된 폴리머 (예를 들면 폴록사머 또는 폴록사민) 및 화합물로 코팅된 미립자 조성물은 본 개시내용에 의해 또한 이해된다.
일부 구현예에서, 상기 화합물은 수용성 폴리머 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프롤린의 공유결합에 의해 변형된다. 또 다른 구현예에서, 변형된 화합물은 대응하는 비변형된 화합물보다 정맥내 주사 후 혈액에서 실질적으로 더 긴 반감기를 나타낸다. 일 구현예에서, 변형은 또한 수용액 중 화합물의 용해도를 증가시키고, 응집을 제거하고, 화합물의 물리적 및 화학적 안정성를 향상시키고 화합물의 면역원성 및 반응성을 크게 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 요망된 생체내 생물학적 활성은 비변형된 화합물보다 덜 빈번하게 또는 더 낮은 용량으로 그와 같은 폴리머-화합물 유도체의 투여에 의해 달성된다.
일부 구현예에서, 효과적인 양 또는 용량?? 제제는 시험관내 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 일 구현예에서, 용량은 동물 모델에서 제형화될 수 있고 그와 같은 정보는 인간에서 유용한 용량을 더 정확하기에 결정하기 위해 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 활성 성분의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험적 동물에서 시험관애 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 이들 시험관내 및 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이타는 인간에서 사용된 복용량의 제형 범위로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 복용량은 이용된 복용 형태 및 이용된 투여 경로에 따랄 변한다. 일 구현예에서, 정확한 제형, 투여 경로 및 복용량은 환자의 상태를 고려하여 개별 의사에 의해 선택될 수 있다. [참고, 예를 들면, Fingl, 등, (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1].
일 구현예에서, 치료될 병태의 중증도 및 반응성에 따라, 투약은 며칠 내지 몇주가 지속되는 치료의 과정과 함께 또는 치유가 영향받거나 질환 상태의 축소가 달성될 때까지, 단일 또는 복수의 투여일 수 있다.
일 구현예에서, 투여될 조성물의 양은, 물론, 치료될 대상체, 고통의 중증도, 투여 방식, 처방의의 판단 등에 좌우될 것이다.
일 구현예에서, 상용성 약제학적 담체에서 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 또한 제조되고, 적절한 용기에 넣고, 지시된 상태의 치료를 위해 표지된다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자는 복합 유기 부형제 및 안정화제 예컨대 비이온성 계면 활성제 (즉, 계면활성제), 다양한 당, 유기 폴리올 및/또는 인간 혈청 알부민과 조합된 동결건조된 (즉, 냉동건조된) 제제이다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사용 멸균수에 기재된 동결건조된 응고 인자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사용 멸균된 PBS에 기재된 동결건조된 응고 인자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사용 멸균된 0.9% NaCl에 기재된 동결건조된 응고 인자를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기재된 응고 인자 및 복합 담체 예컨대 인간 혈청 알부민, 폴리올, 당, 및 음이온성 표면 활성 안정화제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기재된 응고 인자 및 락토바이온산 및 아세테이트/글리신 완충액을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기재된 응고 인자 및 아미노산, 예컨대 아르기닌 또는 글루타메이트 (이것은 물 중 인터페론 조성물의 용해도를 증가시킴)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기재된 동결건조된 응고 인자 및 글리신 또는 인간 혈청 알부민 (HSA), 완충액 (예를 들면, 아세테이트) 및 등장제 (예를 들면, NaCl)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기재된 동결건조된 응고 인자 및 인산염 버퍼, 글리신 및 HAS를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은, 약 4 내지 7.2의 pH를 갖는 완충 용액 내에 존재할 때 안정화된다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 약 4 내지 8.5의 pH 를 갖는 완충 용액 내에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 약 6 내지 7.2의 pH 를 갖는 완충 용액 내에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 6.5의 pH 를 갖는 완충 용액 내에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 6.4의 pH 를 갖는 완충 용액 내에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 안정화제 및 일부 경우에 염으로 아미노산으로 안정화된다 (아미노산이 하전된 측쇄를 함유하지 않으면).
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 아미노산인 약 0.3% 내지 5중량 % 의 안정화제를 포함하는 액체 조성물이다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 투여 정확도 및 생성물 안전성을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 주사가능 적용에서 사용하기 위해 생물학적 활성, 안정적인 액체 제형을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기재된 비-동결건조된 응고 인자를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 투여 전에 저장 및 선적을 용이하게 하는 액체 상태로 장기간 동안 저장을 허용하는 액체 제형을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 고형 지질을 매트릭스 물질로서 포함한다. 또 다른 구현예에서, 주사가능 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 고형 지질을 매트릭스 물질로서 포함한다. 또 다른 구현예에서, 스프레이 응고에 의한 지질 극미립자의 생성은 Speiser (Speiser 등, Pharm. Res. 8 (1991) 47-54) 그 다음 경구 투여용 지질 나노펠렛 (Speiser EP 0167825 (1990))에 의해 기재되었다. 또 다른 구현예에서, 사용된 지질은, 신체에 의해 용인된다 (예를 들면 비경구 영양용 에멀젼에 존재하는 지방산을 포함하는 글리세라이드).
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 폴리머 극미립자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 나노입자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 리포좀을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 지질 에멀젼을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 마이크로구형체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 지질 나노입자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 양친매성 지질을 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 응고 인자를 포함하는 약제학적 조성물은 약물, 지질 매트릭스 및 계면활성제를 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 지질 매트릭스는 적어도 50% w/w인 모노글리세라이드 함량을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 활성 성분을 함유하는 1종 이상의 단위 복용 형태를 함유하는 팩 또는 분배기 디바이스, 예컨대 FDA 승인된 키트 내에 제공된다. 일 구현예에서, 팩은, 예를 들면, 금속 또는 플라스틱 포일, 예컨대 수포 팩을 포함한다. 일 구현예에서, 팩 또는 분배기 디바이스는 투여 지침이 동반된다. 일 구현예에서, 팩 또는 분배기는 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 용기와 관련된 통지에 의해 수용되고, 상기 통지는 조성물 또는 인간 또는 수의과 투여의 형태의 기관에 의한 승인을 반영한다. 그와 같은 통지는, 일 구현예에서는, 처방 약물 또는 승인된 제품내 삽입물에 대한 미국 식품의약품안전청에 의해 승인된 라벨링이다.
일 구현예에서, 본 발명의 응고 인자는 각각의 제제 단독에 의한 치료와 비교하여 개선된 치료 효과를 달성하기 위해 추가 활성제가 개체에게 제공될 수 있음이 인정될 것이다. 또 다른 구현예에서, 조치가 (예를 들면, 상보적 제제의 투여 및 선택)는 병용 요법과 관련된 유해한 부작용을 피하기 위해 취해진다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 FVIIa 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa의 카복시 말단에 부착된 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP) 로 구성된 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 FVIIa 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa의 카복시 말단에 부착된 5개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드의 곡선하 면적 (AUC)를 개선하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 AUC를 개선하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드의 청소유을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 청소율을 감소시키는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜, CTP-변형된 FVIIa 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FVIIa 폴리펩타이드 및 상기 FVIIa 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 VIIa (FVIIa) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 FIX 폴리펩타이드 및 상기 CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드를 제공하고, 상기 CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드의 서열은 서열식별번호: 31에서 제시된 서열이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드를 제공하되, 적어도 1개의 CTP는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 인코딩된다: 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드를 제공하되, 적어도 1개의 CTP는 당화된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드를 제공하되, 적어도 1개의 CTP는 절단된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드를 제공하되, 적어도 1개의 CTP는 링커를 통해 상기 FIX 폴리펩타이드에 부착된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드를 제공하고, 상기 링커는 펩타이드 결합이다.
일 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드 및 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)로 구성된 CTP-변형된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 상기 폴리뉴클레오타이드의 서열은 서열식별번호: 30에서 제시된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드를 제공하되, 적어도 1개의 CTP는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 인코딩된다: 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드를 제공하되, 적어도 1개의 CTP는 당화된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드를 제공하되, 적어도 1개의 CTP는 절단된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드를 제공하되, 적어도 1개의 CTP는 링커를 통해 상기 FIX 폴리펩타이드에 부착된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 링커가 펩타이드 결합인 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 발현 벡터는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FIX 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 방법을 제공한다: 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 당화되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 절단되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 링커를 통해 상기 FIX 폴리펩타이드에 부착되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 링커가 펩타이드 결합인 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드의 곡선하 면적 (AUC)을 개선하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FIX 폴리펩타이드의 AUC를 개선하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 방법을 제공한다: 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 당화되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 절단되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 링커를 통해 상기 FIX 폴리펩타이드에 부착되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 링커가 펩타이드 결합인 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FIX 폴리펩타이드의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 방법을 제공한다: 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 당화되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 절단되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 링커를 통해 상기 FIX 폴리펩타이드에 부착되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 링커가 펩타이드 결합인 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드의 청소율을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, 상기 FIX 폴리펩타이드의 청소율을 감소시키는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 방법을 제공한다: 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 당화되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 절단되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 링커를 통해 상기 FIX 폴리펩타이드에 부착되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 링커를 통해 상기 FVII 폴리펩타이드에 부착되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 링커가 펩타이드 결합인 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착시켜서, CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드의 서열이 서열식별번호: 31에서 제시된 서열인 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 방법을 제공한다: 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 당화되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 절단되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 링커를 통해 상기 FIX 폴리펩타이드에 부착되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 링커가 펩타이드 결합인 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 FIX 폴리펩타이드 및 상기 FIX 폴리펩타이드의 카복시 말단에 부착된 3개의 융모성 성선자극호르몬 카복시 말단 펩타이드 (CTP)를 포함하는 CTP-변형된 인자 IX (FIX) 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 혈우병을 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 CTP-변형된 FIX 폴리펩타이드의 서열이 서열식별번호: 31에서 제시된 서열인 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 방법을 제공한다: 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 당화되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 절단되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 적어도 1개의 CTP가 링커를 통해 상기 FIX 폴리펩타이드에 부착되는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 링커가 펩타이드 결합인 방법을 제공한다.
당해 기술에서 일반적으로 공지된 바와 같이, 본 개시내용의 변형된 펩타이드 및 단백질은 요망된 적용에 따라 라벨, 약물, 표적 치료제, 담체, 고형 지지체, 및 기타 동종의 것에 커플링될 수 있다. 표지된 형태의 변형된 생물제제는 그것의 대사 운명을 추적하기 위해 사용될 수 있고; 이러한 목적을 위한 적합한 라벨은, 특히, 방사선동위원소 라벨 예컨대 요오드 131, 테크네튬 99, 인듐 111, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 라벨은 또한, 검정 시스템에서 변형된 단백질 또는 펩타이드의 검출을 매개하기 위해 사용될 수 있고; 이러한 사례에서, 방사선동위원소는 효소 라벨, 형광 라벨, 발색 라벨, 및 기타 동종의 것으로서 또한 사용될 수 있다. 그와 같은 라벨의 사용은, 펩타이드 또는 단백질이 자체 표적 치료제 예컨대 항체 또는 수용체 리간드이면 특히 도움이 된다.
유사한 연결 기술은, 다른 것과 함께, 본 개시내용의 변형된 펩타이드 및 단백질을 고형 지지체에 커플링하기 위해 이용될 수 있다. 커플링될 때, 이들 변형된 펩타이드 및 단백질은, 특정 반응이 나타나는 요망된 성분의 분리를 위한 친화성 시약으로서 사용될 수 있다.
마지막으로, 본 개시내용의 변형된 펩타이드 및 단백질은 이들 신규한 화합물과 특이적으로 면역반응성인 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이들 항체는 비변형된 펩타이드 또는 단백질의 생물학적 활성의 본성에 따라 다양한 진단 및 치료 적용에서 유용하다. 본 개시내용이 본 명세서에서 기재된 CTP-변형된 FIX, FVII, 또는 FVIIa과 면역반응성인 항체를 제공함을 이해해야 한다. 일 구현예에서, 그와 같은 항체는 내인성 응고 인자로부터 투여된 CTP-변형된 응고 인자를 구별하거나 확인하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항체는 투여된 CTP-변형된 응고 인자를 국소화하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 목적, 이점, 및 신규한 특징은 하기 실시예의 시험시 당해 기술에서 통상적으로 숙련된 사람에게 분명해질 것이고, 이는 제한될 의도는 아니다. 추가로, 위에서 기술된 바와 같이 그리고 아래 청구범위 부문에서 청구된 바와 같이 본 발명의 각각의 다양한 구현예 및 측면은 하기 실시예에서 실험적 지지를 찾는다.
실시예
일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 그리고 본 발명에서 이용된 실험실 절차는 분자적, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기법을 포함한다. 그와 같은 기술은 문헌에서 철저하게 설명된다. 참조, 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 등, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson 등, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren 등 (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 번호 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057에서 제시된 바와 같은 방법론; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites 등 (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); 이용가능한 면역검정은 특허 및 과학 문헌에서 광범위하게 기재된다, 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak 등, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); 이들 모두는 참고로 편입된다. 다른 일반 참조문헌은 본 문서 내내 제공된다.
실시예 1
응고 인자 IX의 생성 및 이용
재조합 FIX 분자의 클로닝 및 발현:
인자 IX 클론은 현대 진핵 발현 벡터 pCI-neo (Promega, 카탈로그 번호 E1841)에서 작제되었다. 호모사피엔스 응고 인자 IX의 ORF 클론은 "OriGene" (RC219065)으로부터 정렬되었다. 프라이머는 Sigma-Genosys로부터 정렬되었다.
301-1-pCI-neo-p200-11 (인자 IX-ctp x2)의 작제:
프라이머 101: 5' GTTTAGTGAACCGTCAGAAT 3' (서열 식별 번호: 36)
프라이머 103R: 5' TTGAGGAAGATGTTCGTGTA 3' (인자 IX의 SspI 부위를 함유한다) (서열 식별 번호: 37)
PCR 반응은 템플레이트로서 인자 IX (OriGene" RC219065)의 cDNA 클론, 플라스미드 DNA 그리고 프라이머 101 및 프라이머 103R로 작제되었고; PCR 증폭의 결과로서, ~ 1085 bp (pcr 10) 생성물은 형성되었고 겔 (인자 IX 서열의 아미노 말단을 함유하는 단편)으로부터 정제되었다.
프라이머 98: 5' ATTACAGTTGTCGCAGGTGA 3' (서열 식별 번호: 38)
프라이머 99R: 5' GCTGGAGCTAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTT 3' (서열 식별 번호: 39)
프라이머 100: 5' GCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCC 3' (서열 식별 번호: 40)
프라이머 27R: 5' TTTTCACTGCATTCTAGTTGTGG 3' (서열 식별 번호: 41)
3 PCR 반응은 수행되었다. 제1 반응은 템플레이트로서 인자 IX (OriGene",RC219065)의 cDNA 클론, 플라스미드 DNA 그리고 프라이머 98 및 프라이머 99R로 수행되었고; PCR 증폭의 결과로서, ~ 540 bp 생성물이 형성되었다.
제2 반응은 템플레이트로서 402-2-p72-3 (hGH-CTP-CTP)의 플라스미드 DNA 그리고 프라이머 100 및 프라이머 27R로 수행되었고; PCR 증폭의 결과로서, ~ 258 bp 생성물은 형성되었다.
마지막 반응 (pcr 3)은 템플레이트로서 이전의 2 반응의 생성물의 혼합물 그리고 프라이머 98 및 27R로 수행되었고; PCR 증폭의 결과로서, ~ 790 bp 생성물은 형성되었고 TA 클로닝 벡터 (Invitrogen, 카탈로그 K2000-01) 속에 결찰되었다. SspI -EcoRI 단편은 단리되었다 (TA 3-3).
또 다른 PCR 반응은 템플레이트로서 pcr 3으로부터 pcr 10 및 SspI-EcoRI 단편의 생성물의 혼합물 그리고 프라이머 101 및 프라이머 27R로 수행되었고 (pcr 12); PCR 증폭의 결과로서, ~ 1700 bp 생성물은 형성되었고 (인자 IX-ctp-ctp) 클로닝 벡터 (Invitrogen, 카탈로그 K2000-01) (lig 180) 속에 결찰되었다.
실수는 인자 IX 서열에서 발견되었고 그래서 단편은 정확한 DNA 서열을 가진 인자 IX-ctp-ctp의 삽입을 형성하기 위해 대체되었다.
TA-pcr 3-3은 SspI 및 XbaI로 소화되었고 큰 단편은 단리되었다 (벡터). TA 180-4는 SspI 및 XbaI로 소화되었고 작은 단편 (삽입물)은 단리되었고 SspI 및 XbaI로 소화된 TA-pcr-3-3의 단리된 큰 단편에 결찰되었다. 신규한 플라스미드 TA-183-2는 Sal I 및 NotI로 디게이팅되었고(digated), 인자 IX-CTP-CTP 삽입물은 단리되었다 (~1575 bp). 상기 단편은 (Sal I 및 Not I로 소화된) 진핵 발현 벡터 pCI-neo 속에 삽입되어 301-2-p200-11 클론을 수득하였다.
pCI- dhfr -인자 9- ctpx2 (p223-4) 작제 : 벡터 pCI-dhfr (p6-1)은 SmaI 및 NotI로 소화되었다. 인자 IX-CTP-CTP (p200-11)은 ASisI F.I. 및 NotI로 소화되었다. 2 단편은 결찰되었다.
pCI- dhfr 인자 9- ctp x3 (p225-7) 작제 : 벡터 pCI-dhfr OXM-CTP×3 (p216-4)는 XbaI 및 ApaI로 소화되었다. 인자 IX-CTP-CTP (223-4)는 XbaI 및 ApaI로 소화되었다. 2 단편은 결찰되었다.
pCI- dhfr 인자 9- ctp x3 T148A (p243-2) 작제 : 플라스미드 p225-7은 위치 148에서 트레오닌을 함유하였고, FIX의 더욱 통상 버전이 상기 위치에서 알라닌을 함유하기 때문에, Thr은 부위 지향된 돌연변이유발 방법을 이용하여 Ala에 대체되었다.
프라이머 75: ctcccagttcaattacagct (서열 식별 번호: 42)
프라이머 122r: ggaaaaactgcctcagcacgggtgagc (서열 식별 번호: 43)
프라이머 123: gtgctgaggcagtttttcctgatgtggactat (서열 식별 번호: 44)
프라이머 124r: caacacagtgggcagcag (서열 식별 번호: 45)
3 PCR 반응은 수행되었다. 제1 반응은 템플레이트로서 플라스미드 DNA p225-7 그리고 프라이머 75 및 프라이머 122r로 수행되었고; PCR 증폭의 결과로서, ~ 692 bp 생성물은 형성되었고 겔로부터 정제되었다. 제2 PCR 반응은 템플레이트로서 플라스미드 DNA p225-7 그리고 프라이머 123 및 프라이머 124r로 수행되었고; PCR 증폭의 결과로서, ~237 bp 생성물은 형성되었고 겔로부터 정제되었다. 제3 - 중첩 PCR 반응은 템플레이트로서 이전의 2 반응의 생성물의 혼합물, 그리고 프라이머 75 및 124r로 수행되었고; PCR 증폭의 결과로서, ~ 910 bp 생성물은 형성되었다. 상기 중첩 PCR 생성물은 XbaI 및 NsiI로 소화되었고 (XbaI 및 NsiI로 소화된) p225-7 플라스미드 속에 재 결찰되어 인자 IX-ctpx3 T148A 지정된 p243-2를 수득하였다.
FIX- 4CTP (p259-4) 작제 : 3.5CTP 단편은 제한 효소 Apa1 및 Xba1에 의해 oxym-4CTP (p254-3)으로부터 단리되었다. FIX+0.5CTP 단편은 제한 효소 Apa1 및 Xba1로 FIX-3CTP (p243-2)로부터 단리되었다. 2 단편은 결찰되었다.
FIX- 5CTP (p260-18) 작제 : 4.5CTP 단편은 제한 효소 Apa1 및 Xba1에 의해 oxym-5CTP (255-1)로부터 단리되었다. FIX+0.5CTP 단편은 효소 Apa1 및 Xba1을 이용하여 FIX-3CTP (p243-2)로부터 단리되었다. 2 단편은 결찰되었다.
Dg44 세포는 100mm 조직 배양 접시에서 플레이팅되었고 50-60% 합류점으로 성장되었다. 총 2 μg (마이크로그램)의 FIX cDNA는 무단백질 배지 (Invitrogene CD Dg44)내 FuGene 시약 (Roche)을 이용하여 하나의 100mm 플레이트의 형질감염에 사용되었다. 배지는 형질감염 후 48 시간에 제거되었고 뉴클레오사이드 없이 그리고 800 μg/ml의 G418 (Neomycin)의 존재하에 무단백질 배지 (Invitrogene CD Dg44)로 대체되었다. 14 일 후, 형질감염된 세포 집단은 T25 조직 배양 플라스크 속에 전달되었고, 세포가 안정적 클론으로서 성장하기 시작한 때까지 선택은 추가의 10-14 일 동안 계속되었다. 고 발현 클론이 선택되었다. 대략 2x107 세포는 5 ng/ml의 비타민 K3 (메나디온 소듐 비설페이트; Sigma)로 보충된 1700 cm2 롤러 병 (Corning, Corning NY)에서 300 mL의 성장 배지를 접종하는데 사용되었다. 생산 배지 (수확물)는 약 70%로 세포 생존력에서 급속한 감소 이후 수집되었다. 생산 배지는 먼저 정화되었고 그 다음 대략 20-배로 농축되었고 유동 여과 카세트 (10KDa MWCO; Millipore Corp.)를 이용하여 PBS로 투석되었다.
FIX 항원 수준의 결정: FIX-CTP 수확물 항원 수준은 AssayMax 인간 FIX ELISA 키트 (AssayPro-EF1009-1)을 이용하여 결정되었다. 계산된 단백질 농도는 2 독립 시행에서 3 상이한 희석의 평균이다 (도 1A, 표 1).
FIX SDS-PAGE - 면역 블롯 : FIX-CTP 수확물 또는 정제된 rhFIX (American Diagnostics), 100 ng의 단백질은 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. SDS-PAGE 분석은 항-인간 FIX 다클론성 항체 및 항-인간 감마 카복실화 단클론성 항체 (American Diagnostics)를 이용하는 웨스턴 면역블롯에 의해 수행되었다. 이전에 보고된 바와 같이, rhFIX는 55KDa에서 이주하였고, 반면에 2 CTPs에 융합된 FIX는 75KDa에서 이주하였다. FIX-CTP 단백질의 양쪽 변이체는 FIX 활성 및 기능에 대하여 감마 카복실화된, 필수적 후-번역 변형인 것으로 나타났다 (도 1B).
FIX 발색 활성의 결정: FIX-CTP 수확물 대 rhFIX 단백질 (American Diagnostics)의 시험관내 효력의 비교 평가는 상업적으로 입수가능한 발색 활성 테스트 키트, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802)를 이용하여 수행되었다. 트롬빈, 인지질, 칼슘의 존재하에, 과잉량의 FXIa는 FIXa 속에 샘플링된 FIX를 활성화시킨다. FIXa는 트롬빈, (과잉량으로 공급된) 활성화된 FVIII:C, 인지질, 및 칼슘과 효소 복합체를 형성하고, 검정 시스템에 존재하는, 인자 X를 FXa로 활성화시킨다. 활성은 직접적으로, 제한 인자인, FIX의 양과 상관관계가 있다. 생성된 FXa는 그 다음 FXa 발색 기질 (pNA)상에서 그것의 특이적 활성에 의해 측정된다. 생성된 pNA의 양은 FIXa 활성에 직접적으로 비례한다. rhFIX 및 FIX-CTP 수확물은 연속으로 희석되었고, 효력은 rhFIX 또는 인간 혈장으로 구성되는 참조 제제에 FIX 수확물의 용량-반응 곡선 비교에 의해 평가되었다. FIX의 평균 EC50은 21 ng/ml이었고, 반면에 FIX-(CTP2) 수확물 계산된 EC50은 382 ng/ml이었고, FIX-CTP 수확물 계산된 EC50은 1644 ng/ml이었다. FIX-(CTP2) 수확물의 효소 활성에서 대략 15-배수 감소는 관측되었다 (도 2).
FIX 응고 활성 ( aPTT ): 활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)은 응고 캐스케이드의 고유 및 통상 경로의 완전성의 측정치이다. aPTT는 고유 경로 활성제, 인지질 및 칼슘의 첨가 이후 혈장이 응괴하는, 시간, 초이다. 조직 인자가 프로타임 (PT) 시약과 함께인 것처럼 인지질과 함께 포함되지 않기 때문에 aPTT 시약은 부분적인 트롬보플라스틴으로 불린다. 활성제는 시스템을 개시하고 그 다음 고유 경로의 잔존 단계는 인지질의 존재하에 발생한다. 참조 aPTT 범위는 실험실부터 실험실까지 다양하지만, 일반적으로 27-34 초의 범위이다.
검정의 주역은 rhFIX의 첨가에 의한 FIX-감손된 인간 혈장의 응고 활성을 회복하기 위한 FIX-CTP 수확물의 능력을 정량화하는 것이었다. 300 μl의 FIX-결핍된 인간 혈장은 100μl의 rhFIX 또는 FIX-CTP 수확물과 혼합되었고 연속으로 희석되었다. 37℃에서 60 초 인큐베이션 이후, 트롬보플라스틴, CaCl2, 및 인지질은 혼합물에 첨가되었고, 초로 응고 시간은 결정되었다 (American Medical Laboratories에 의해 수행되었다). 효력은 rhFIX 또는 인간 혈장으로 구성되는 참조 제제에 FIX 수확물의 용량-반응 곡선 비교에 의해 평가되었다. FIX 활성의 1 유닛은 1 ml 정상 인간 혈장의 활성과 같은 FIX 농도에 대응한다. 나타난 aPTT 결과는 FIX-(CTP)2가 rhFIX에 비교된 그것의 특이적 응고 활성으로 5.7-배수 감소를 나타내는 것을 표시한다 (표 2). 또한, 발색 활성 시험관내 검정과 함께 aPTT 결과는 FIX-(CTP)2 수확물이 개선된 효소 활성 대 FIX-CTP 수확물을 갖는 것을 시사한다 (표 2). FIX-CTP 단백질의 개선된 활성은, 푸린 (Furin)으로 초-형질감염 이후 강화된, 발현 시스템의 최적화 (즉 푸린으로 공-형질감염 및 비타민 K3 중간 농도의 최적화) 이후 수득될 수 있다 (데이터 도시되지 않음).
약동학적 연구: rhFIX (American Diagnostics) 및 FIX-CTP 수확물은 75 mg/kg 체중의 용량으로 스프래그-다우리 랫트 (6 랫트 / 서브스턴스)에 단일 정맥내 주사로 투여되었다 (표 3).
표 3 : 작업의 PK 연구 계획
혈액 샘플은 투여후 대안적으로 0.083, 0.5 1.5, 4, 8, 24, 48, 및 72 시간에서 3 랫트로부터 안와후로 채혈되었다. 혈장은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었다. FIX 농도는 FIX ELISA-특이적 검정 (AssayPro)에 의해 정량화되었다. 약동학적 프로파일은 각각의 단백질에 대하여 계산되었고 각각의 시점에서 3 동물의 평균을 나타낸다 (도 3). 말단 반감기는 PK 솔루션스 2.0 소프트웨어를 이용하여 계산되었다. 표 4는 상이한 샘플링 시점에서 관측된 FIX 농도를 요약한다.
말단 반감기의 PK 프로파일 및 요약은 표 5에서 요약된다. FIX-CTP 수확물은 rhFIX에 비교된 개선된 T1/2β 값을 나타낸다 (2- 및 5-배수 증가, 각각). FIX 투여 수집에서, 24시간에 FIX의 동물 혈청 농도가 정량화 한계 미만 (BLQ)이었고, 추가의 PK 파라미터는 계산되지 않았다.
이 연구에서, 신규한 접근법은 치료 효력을 유지하면서 FIX 반감기 연장을 위하여 기재되었다. 활성 단백질에 CTP 펩타이드 첨가는 단백질의 활성 방해에 유해한 잠재력을 갖는다. 따라서, FIX의 C-말단에서 CTP 서열 부가에 의한 활성 재조합 FIX-CTP의 생성은 의외이다.
면역친화성 정제된 FIX-CTP-CTP의 특성규명
FIX-CTP-CTP 정제
PK 프로파일이 모방하고 임상 셋팅에 외삽될 수 있는 증가된 활성을 가진 고등급 함량에서 단백질을 평가하기 위해, FIX-CTP-CTP는 그것의 카복시-말단에서 나란히 2 CTP 유닛으로 변형된 FIX이다. FIX-CTP-CTP는 FIX (American Diagnostics Cat. # 3570MX)의 N-말단 영역에서 존재하는 γ 카복시글루타밀 (Gla) 잔기에 대한 매트릭스-결합된 단클론성 항체를 이용하여 정제되었다. 단클론성 항체는 세파로오스 CL-4B에 결합되었다. 88 μg/ml의 농도에서 FIX-CTP-CTP 수확물은 PH =7.4에서 20mM Tris, 150Mm NaCl 및 10mM EDTA에 대해 투석되었다. 장입 속도는 0.5 ml/분이었고, 용출은 20Mm 트리스-HCl, 350 mM NaCl 및 50 mM CaCl을 이용하여 수행되었고, 미결합된 분획은 5회 재순환되었다. 마지막으로, 용출 분획은 PBS로 투석되었고, 채혈되었고 농축되었다.
FIX 항원 수준의 결정: FIX-CTP 수확물, FIX-(CTP)2 수확물, 및 FIX-(CTP)2 정제된 단백질 수준은 인간 FIX ELISA 키트 (Affinity Biologicals; Cat. #FIX-AG RUO)를 이요아여 결정되었다. 계산된 단백질 농도 (μg/ml)는 2 독립 시행의 평균이다 (도 4, 표 6).
추가로, FIX-CTP-CTP는 브라드포드 검정에 의해 정량화되었다. 계산된 농도는 202 μg/ml이었고, 인간 FIX ELISA에 의해 수득된 농도와 유사하다.
SDS-PAGE 블롯 : FIX-CTP-CTP 수확물, 미결합된 분획 및 정제된 단백질은 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. SDS-PAGE 쿠마씨 분석은 쿠마씨 블루 시약 (800ng의 단백질)로 겔 염색에 의해 수행되었다. 웨스턴 면역블롯은 100 ng의 단백질, 항-인간 FIX 다클론성 항체 (Ab), 및 항-인간 감마 카복실화 단클론성 Ab (American Diagnostics Cat #499 및 #3570)으로 수행되었다. 면역친화성 정제 절차는 FIX-CTP-CTP 부분을 상당히 풍부하게 하였고 그 동안 불순물을 감소시켰다 (도 5).
N-말단 서열분석: FIX-CTP-CTP 정제된 단백질은 12% 트리스-글리신 SDS-PAGE에 의해 분리되었고 PVDF 막에 후속적으로 전기-블롯팅되었다. 관심 밴드는 절단되었고 정제된 바이오브렌(Biobrene) 처리 유리 섬유 필터상에 두었다. N-말단 서열 분석은 140 C HPLC 마이크로-구배 시스템이 구비된 펄스화된 액체 단백질 시퀀서를 이용하여 애드만(Edmann) 열화에 의해 수행되었다. N-말단 서열분석은 FIX-CTP-CTP가 불완전한 및 완전한 프로-펩타이드 절단된 단백질의 혼합물인 것을 드러냈다. 부적절한 프로-펩타이드 절단은 FIX 응고 활성을 감소시키는 것으로 나타났다. 푸린으로 공-형질감염에 의해, 프로-펩타이드 절단 공정은 개선될 수 있다.
FIX 발색 활성의 결정: FIX-CTP-CTP 정제된 단백질 대 rhFIX (American Diagnostics)의 시험관내 효력 및 인간 정상 혈장의 풀의 비교 평가는 상업적으로 입수가능한 발색 활성 테스트 키트, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802)를 이용하여 수행되었다. 트롬빈, 인지질 및 칼슘의 존재하에, 과잉량의 FXIa는 FIX를 FIXa로 활성화시킨다. FIXa는 (과잉량으로 공급된) 트롬빈, 인지질 및 칼슘과 효소 복합체를 형성하고, 검정 시스템에 존재하는, 인자 X를 FXa로 활성화시킨다. 활성은 직접적으로, 제한 인자인, FIX의 양과 상관관계가 있다. 생성된 FXa는 FXa 발색 기질 (pNA)상에서 그것의 특이적 활성에 의해 측정되었다. 생성된 pNA의 양은 FIXa 활성에 직접적으로 비례한다. rhFIX, 인간 혈장 및 FIX-CTP-CTP는 연속으로 희석되었고 효력은 용량-반응 곡선 비교에 의해 평가되었다 (도 6). rhFIX의 평균 EC50은 68.74 ng/ml이었고 반면에 FIX-CTP-CTP 계산된 EC50은 505 ng/ml이었다. FIX-CTP-CTP의 효소 활성에서 대략 7-배수 감소는 재조합 FIX에 대하여 관측되었고 16.5-배수 감소는 정상 인간 채혈된 혈장에 대하여 관측되었다. 상기 감소된 활성은 N-말단 프로-펩타이드의 부적절한 절단에 의해 설명될 수 있고, 이는 N-말단 분석에 의해 확인되었다.
FIX 응고 활성 ( aPTT ): 활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)은 응고 캐스케이드의 고유 및 통상 경로의 완전성의 측정치이다. aPTT는 고유 경로 활성제, 인지질 및 칼슘의 첨가 이후 혈장이 응괴하는데 걸리는 (초로 측정된) 시간이다.
검정은 rhFIX의 첨가에 의해 FIX 감손된 인간 혈장의 응고 활성을 회복하기 위한 FIX-CTP-CTP 단백질의 능력을 정량화하였다. 300 μl의 FIX-결핍된 인간 혈장은 100 μl의 rhFIX, FIX-CTP-CTP (FIX-CTP-CTP (CTP는 C-말단에서 나란하다)), 또는 추가로 희석된 정상 풀 인간 혈장과 혼합되었다. 37℃에서 60 초 인큐베이션 이후, 조직 인자 (TF), CaCl2, 및 인지질은 혼합물에 첨가되었다. 초로 응고 시간은 결정되었다. 효력은 rhFIX 또는 인간 혈장의 참조 제제에 FIX-CTP-CTP의 용량-반응 곡선 비교에 의해 평가되었다. FIX의 1 유닛은 1 ml 인간 정상 혈장의 활성과 같은 FIX의 양으로서 정의되었다.
aPTT 결과는 FIX-CTP-CTP 응고 활성이 단지 1.4 미만 정상 풀 인간 혈장이고 rhFIX에 유사하다는 것을 표시한다. 발색 활성 시험관내 검정과 함께 aPTT 결과는 FIX-CTP-CTP 정제가 그것의 활성을 손상시키지 않았다는 것을 시사한다.
FIX- CTP - CTP의 약동학적 활성: 정제된 FIX-CTP-CTP, rhFIX (American Diagnostics) 그리고 FIX-CTP-CTP 및 FIX-CTP를 함유하는 수확물은 100μg/kg 체중의 용량으로 스프래그-다우리 랫트 (8 랫트 / 서브스턴스)에 단일 정맥내 주사로 투여되었다 (표 7).
혈액 샘플은 투여후 대안적으로 0.083, 0.5, 2, 4, 7 10, 24, 48, 및 72 시간에서 4 랫트로부터 안와후로 채혈되었다. 시트레이트화된 혈장 (0.32%)은 샘플링 직후 제조되엇고 분석까지 -20℃에서 저장되었다. FIX 농도는 인간 FIX ELISA 키트 (Affinity Biologicals)를 이용하여 정량화되었다. 약동학적 프로파일은 각각의 시점에서 4 동물의 평균으로서 각각의 단백질에 대하여 계산되었다 (도 7). 말단 반감기는 PK 솔루션스 2.0 소프트웨어를 이용하여 계산되었다. 표 8은 상이한 샘플링 시점에서 관측된 FIX 농도를 요약한다.
FIX-CTP-CTP 수확물은 FIX-CTP 수확물에 비교된 개선된 PK 프로파일을 입증하였다. 더욱이, 정제된 FIX-CTP-CTP는 rhFIX에 비교된 AUC에서 4.5-배수 증가 및 T1/2β 값에서 3-배수 증가를 나타냈다.
단일 CTP의 융합에 대하여 탠덤 CTP 분자에 융합된 분비된 FIX의 감소된 양은, 브라드포드-정제된 FIX-CTP-CTP 계산된 농도가 ELISA-계산된 농도와 유사하였기 때문에, 추가의 CTP의 첨가 때문인 것처럼 보이고 ELISA에 의한 감소된 검출 때문인 것처럼 보이지 않는다.
FIX-CTP-CTP 응고 활성은 풀링된 인간 혈장과 유사하였지만; 그러나, 그것의 시험관내 발색 활성은 rhFIX 또는 풀링된 인간 혈장에 비교된 경우 상당히 더 낮았다. 발색 활성 검정은 응고 검정에 비교하여 매우 감수성 검정으로서 보고되었다. FIX-CTP-CTP의 감소된 활성의 이유는 다양할 수 있다. CTP의 첨가는 FXIa에 FIX의 친화도를 감소시킬 수 있거나 후-전사 변형 (예를 들면 12-10 GLA 잔기 및 프로-펩타이드 절단)을 감소시킬 수 있다. N-말단 분석은 FIX-CTP-CTP 프로-펩타이드의 단백분해 절단이 분비에 앞서 완전히 완료되지 않았다는 것이 드러났다. 상기 후-전사 변형이 단백질의 정상 효소 활성에 결정적이기 때문에, 푸린-PACE 플라스미드로 공-형질감염은 양호하고 FIX-CTP-CTP 활성을 개선시킬 수 있다.
마지막으로, 랫트에서 FIX-CTP-CTP 비교 PK 연구는 FIX의 C-말단에 2 탠덤 CTPs의 융합이 확장된 반감기를 가진 FIX를 생성하였다는 것을 입증하였다.
FIX 감손된 마우스 모델 : 생체내 활성을 평가하기 위해, FIX 녹아웃 마우스는 수득되고, 교배 콜로니는 확립된다. 10μg의 한쪽 상업적 재조합 hFIX (BeneFIX®) 또는 rFIX-(CTP)2 (FIX-CTP-CTP)는 마취된 FIX 녹아웃 마우스 (22-28g)의 꼬리 정맥에 주사된다. 주사된 단백질의 양은 정상 혈장 (5μg/ml)내 FIX의 요구된 농도와 같다. 혈액 샘플은 특정 시점에서 헤파린처리된 모세관 튜브 속에 자른 꼬리로부터 채혈된다. 혈장 샘플은 ELISA에 의한 FIX 수준에 대하여 평가되고 효능은 aPTT 응고 검정에 의해 측정된다.
증가하는 FIX 프로펩타이드 절단 효능: CTP 펩타이드 cDNA는 인간 FIX cDNA의 3' 단부에 융합되었다. 대응하는 rFIX 및 푸린 발현 작제물은 Dg44 세포 속에 공-형질감염되었고; 인간 rFIX cDNA는 또한 대조로서 푸린 플라스미드로 공-형질감염되었다. FIX의 높은 수준의 분비는, 세포에서 푸린 프로테아제의 제한된 양 때문에, 프로-인자 및 성숙한 인자 FIX의 혼합물의 분비로 이어진다. 프로-인자 발현 벡터와 푸린 발현 벡터의 공-형질감염은 배지 속에서 완전히 가공된 FIX의 분비에서 회수 및 결과를 증가시킨다.
FIX-(CTP)2 및 푸린 공-형질감염 이후, 안정적인 클론은 생성되고 수확물은 프로-펩타이드 절단 평가를 위하여 수집된다. 100 ng의 단백질은 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입된다. SDS-PAGE 분석은 항-인간 FIX 다클론성 Ab (American Diagnostics) 및 항-프로-펩타이드 다클론성 항체를 이용하는 웨스턴 면역블롯에 의해 수행된다. 이전에 보고된 바와 같이, rhFIX는 55KDa에서 이주하였고, 반면에 2 CTPs에 융합된 FIX는 75 kDa에서 이주하였다. FIX 단백질의 양쪽 변이체는 적절한, 전체 프로-펩타이드 절단을 경험하는 것으로 보인다.
적절한 프로-펩타이드 절단이 FIX-(CTP)2 효소 활성을 개선하는지를 결정하기 위해, 푸린으로 공형질감염된 FIX-(CTP)2 수확물의 발색 및 응고 활성의 비교 평가는 수행된다. FIX-(CTP)2 특이적 활성에서 상당한 개선이 관측되고, 이는 rhFIX와 유사하다.
결론적으로, 본 명세서에서 기재된 결과는 FIX-CTP-CTP가 혈우병 B 환자 치료에 효율적으로 사용될 수 있다는 것을 시사한다. CTP에 융합된 FIX는 특정 시험관내 측정에서 단점을 극복하는 개선된 생체내 약리학적 성능으로부터 이점을 구성한다. 상기 제안된 치료는 주입의 속도로서 이전의 치료보다 유리하고 요구된 용량의 양은 감소된다.
알부민-융합된 분자 전략이 FIX 반감기를 개선하는데 사용된 경우, 재조합 FIX가 불활성이 된다는 것을 통지하는 것이 중요하다. 본 신규한 접근법은 개선된 장기-지속 활성을 나타내는 신규한 재조합 FIX-융합된 단백질의 설계 및 정제로 이어진다. 더 많은 크기 변형이 주사된 FIX의 약동학을 개선하지 않았기 때문에, FIX에 융합된 CTP가 약동학적 파라미터를 촉진한다는 발견은 의외이었다. 고도로 당화된 펩타이드-시알산 잔기의 존재는 단백질을 안정화시켰고 FIX 기능의 핵심 결정인자 폐기 없이 혈관 수용체와 상호작용으로부터 보호하였다.
FIX-CTP는 혈우병 B 환자에서 rFIX에 유사한 치료 효능을 갖고 덜 빈번한 투여를 요구하였다. FIX-CTP의 단일 주사는 출혈 에피소드를 제어하는데 그리고 혈우병 B 환자에 있어서 수술 개입 동안 필요한 주사의 수를 감소시키는데 충분하다.
CTP 기술은 장기-작용성 FIX의 개발을 위하여 이용되었다. 구체적으로, 재조합 rFIX 분자의 반감기 확장은 FIX에 적어도 1종의 인간 CTP의 융합에 의해 수행되었다. 재조합 FIX-CTP는 포유동물 세포에서 발현되었고 시험관내 및 생체내 특성규명되었다. rFIX-CTP의 시험관내 활성이 rFIX에 비교할만한 하였다는 것이 입증되었다. 랫트에서 약동학 및 효능 연구는 rFIX-CTP의 개선된 특성을 입증하였다. 상기 연구의 결과는 야생형 효소에 유사한 지혈 특성을 갖는 반감기 확장된 rFIX 분자를 개발하는 것이 실행가능하다는 것을 입증한다.
실시예 2
정제된 FIX-CTP 3 대 FIX-CTP 4 및 FIX-CTP 5 의 비교 평가
2.1 연구 목적
부분적인 정제 공정 이후 FIX-CTP4 및 FIX-CTP5 대 FIX-CTP3의 약동학적 파라미터의 비교 평가.
2.2 FIX-CTP 4 및 FIX-CTP 5 수확물의 생산
4 또는 5 탠덤 CTP 서열에 C-말단에서 융합된 FIX cDNA (OriGene RC219065)는 10 ng/L의 비타민 K3 (Sigma, Mennadion)의 존재하에 Excellgene 발현 시스템을 이용하여 Dg44 세포에서 발현되었다. 수확물은 수집되었고 (300ml), 여과되었고 냉동되었다.
2.3 FIX-CTP 3 수확물의 생산
FIX-CTP3은 25 ng/L의 비타민 K3 (Sigma)의 존재하에 pCI-DHFR 벡터, 클론 196, BR-9를 이용하여 CHO 세포에서 인하우스 발현되었다. 수확물은 수집되었고 여과되었다.
모든 FIX-CTP 샘플 (3, 4 및 5 CTP)은 재료의 부족 때문에 단지 Jacalin 컬럼에 의해 정제되었다.
2.4 FIX 항원 수준의 결정
FIX 항원 수준은 인간 FIX ELISA 키트 (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO)를 이용하여 결정되었다. 계산된 단백질 농도는 4 독립 시행의 평균이다. FIX-CTP3 농도는 2 추가의 버전에 비교된 경우 약간 더 높았다 (표 10).
2.5 FIX-CTP 쿠마씨 염색 및 면역-블롯
FIX-CTP3, FIX-CTP4, 및 FIX-CTP5 수확물은 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. SDS-PAGE 분석은 항-CTP 다클론성 Ab (Adar Biotech Production) 또는 항-Gla Ab (American Diagnostica)를 이용하는 웨스턴 면역-블롯에 의해 수행되었다.
이전에 보고된 바와 같이, 3 CTPs에 융합된 FIX는 80 kDa에서 이주하였고 반면에 4 또는 5 CTPs에 융합된 FIX는 85 KDa 또는 90 KDa, 각각에서 이주하였다. 기대된 대로, Excellgene으로부터 FIX-CTP4 및 FIX-CTP5 수확물은 FIX-CTP3 수확물에 비교된 감마 카복실화의 초저 수준을 보여주었고, 이는 Prolor에서 생산되었다 (도 8).
Jacalin 컬럼을 이용하는 정제 공정 (당화된 단백질의 면역친화성 정제) 이후, FIX-CTP3, FIX-CTP4, 및 FIX-CTP5는 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. SDS-PAGE는 샘플 검출을 위하여 쿠마씨 블루 염료에 의해 염색되었다. 모든 변이체는 훨씬 더 깨끗한 밴드 프로파일 (도 9)를 보여주었고, 개선된 순도를 시사하였다.
2.6 FIX 발색 활성의 결정
인간 풀 정상 혈장에 대하여 완전히 정제된 (HA 컬럼) FIX-CTP3, FIX-CTP4, 및 FIX-CTP5의 시험관내 효력의 비교 평가는 상업적으로 입수가능한 발색 활성 테스트 키트, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802)를 이용하여 수행되었다. 모든 샘플은 연속으로 희석되었고, 효력은 정상 인간 혈장의 참조 제제에 용량-반응 곡선 비교에 의해 평가되었다. 혈장에 비교된 경우 FIX-CTP4 및 FIX-CTP5의 감소된 발색 활성 (도 10)은 FIX 단백질의 부적절한 후-전사 변형, 예를 들면 부적절한 감마 카복실화 및 프로-펩타이드 절단의 결과일 수 있거나, 대안적으로, CTP 카세트의 첨가 때문일 수 있다. FIX-CTP4 및 FIX-CTP5 활성에서 변동 (표 11)은 항원 부위의 CTP 마스킹 때문에 FIX ELISA의 부적절한 정량화 능력에 의해 야기될 수 있다.
2.7 약동학적 연구
Jacalin-정제된 FIX-CTP3, FIX-CTP4, 및 FIX-CTP5 (그룹 A, B 및 C, 각각)은 250 mg/kg 체중의 용량으로 스프래그-다우리 랫트 (6 랫트 / 치료 그룹)에 단일 정맥내 주사로 투여되었다. 혈액 샘플은 투여후 대안적으로 0.083, 0.5 2, 5, 8, 24, 48, 72 및 96 시간에서 3 랫트로부터 안와후로 채혈되었다 (표 12). 시트레이트화된 혈장 (0.38%)은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었다.
표 12 : 작업의 PK 연구 계획
혈장 샘플내 FIX 농도는 인간 FIX ELISA 키트 (Affinity Biologicals)를 이용하여 정량화되었다. 약동학적 프로파일은 계산되었고 각각의 시점에서 3 동물의 평균이다. 말단 반감기는 PK 솔루션스 2.0 소프트웨어를 이용하여 계산되었다. 아래 표 13은 상이한 샘플링 시점에서 계산된 FIX 농도를 요약한다.
PK 파라미터의 요약 및 PK 프로파일은 아래 표 14에서 그리고 도 11에서 나타난다. 모든 시점에서 전체 PK 분석 프로파일은 FIX에 4 또는 5 CTP 카세트의 첨가가 FIX-CTP3에 비교된 경우 그것의 반감기를 증가시키지 않았다는 것을 시사하였다. FIX-CTP5 투여 이후 AUC는 FIX-CTP3에 대하여 1.4- 내지 1.6-배만큼 증가시켰고, 이는 통계적으로 유의미하지 않았다.
표 14 : PK 파라미터의 요약 및 PK 프로파일
96 시간 투여후 샘플이, 검정의 정량화의 하한이었던, 초저 FIX 농도를 갖는 것으로 나타나지 않았기 때문에, 말단 반감기는 더욱 정확한 및 과학적으로 적절한 계산을 제공하여 재계산되었다 (표 15). 상기 계산에 따르면, 더욱더 작은 차이가 FIX-CTP3, FIX-CTP4, 및 FIX-CTP5의 반감기 사이 수득되었다.
표 15 : 재계산된 말단 반감기
2.8 결론:
이 연구에서, FIX-CTP3, FIX-CTP4, 및 FIX-CTP5의 약동학적 파라미터 및 잠재적인 응고 활성은 평가되었다. FIX에 4 및 5 CTPs의 융합은, FIX-CTP3에 비교된 경우, 우월한 또는 개선된 반감기 확장을 제공하지 않았고, 감소된 발색 활성은 관측되지 않았다. 아래 표 16은 상이한 FIX-CTP 융합된 변이체 (1 내지 5 CTPs)에 대하여 반감기의 퍼센트 개선을 요약한다. FIX에 CTP의 융합은 그것의 약동학적 행동을 개선하였지만, 예측할 수 없게, 상기 개선은 제한되었다. 놀랍게도, FIX에 나란히 3, 4 또는 5 CTPs의 융합 이후, 유사한 반감기 값은 계산되었다.
이들 데이터는 FIX에 3 CTPs의 융합이 단백질 반감기에서 최대 개선을 생산한다는 것을 시사하여, FIX-CTP3이 추가 임상 개발을 위하여 반감기, 구조 및 잠재적인 응고 활성에 관하여 최적의 변이체라는 것을 확인한다.
실시예 3
FIX-/- 혈우병 마우스 모델의 FIX-CTP 3 치료
상기에 기재된 바와 같이, FIX-CTP, FIX-CTP2 및 FIX-CTP3 수확물 PK 프로파일 및 응고 활성 대 rhFIX를 테스트하는 연구는 수행되었다. FIX-CTP3은 그것의 응고 활성 대 FIX-CTP1 및 FIX-CTP2 수확물 또는 rhFIX를 유지하면서 개선된 PK 프로파일을 나타냈다. 상기 결과를 추가로 평가하기 위해, FIX-CTP3 γ-카복시글루타메이트 단백질은 정제되었다. FIX-CTP3은 단일 IV 투여 이후 정상 랫트에 있어서 rhFIX에 비교하여 4.5-배 더 높은 AUC 그리고 반감기에서 3-배수 증가를 나타냈다. FIX-CTP3은, 아마도 N-말단 프로-펩타이드의 불충분한 절단 때문에 그리고 적절한 후-전사 변형 (PTMs), 예컨대 적절한 감마 카복실화에서, 감소된 시험관내 발색 및 응고 활성을 입증하였다.
현행 연구에서, 3 탠덤 CTPs에 융합된 인간 재조합 FIX의 약동학적 및 약력학적 특성은 FIX-결핍된 마우스에서 테스트되었다.
연구 목적:
유사한 특이적 활성 및 용량 (PD에 대한 유사한 특이적 활성 그리고 PK에 대하여 유사한 FIX 상수)로 FIX-(CTP)3의 단일 IV 투여 이후 FIX-결핍된 마우스에 있어서 rFIX-(CTP)3 대 상업적 rhFIX (BeneFIX®)의 약동학적 및 약력학적 파라미터를 결정하기 위해.
FIX-CTP 3 수확물의 생산:
3 탠덤 CTP 서열에 C-말단에서 융합된 FIX cDNA (OriGene RC219065-Thr 148)은 25 ng/ml의 비타민 K3 (Sigma, Mennadion)의 존재하에 Excellgene 발현 시스템을 이용하여 Dg44 세포에서 발현되었다. 5 리터의 세포 현탁액을 함유하는 5 별도의 배치는 배양되었고 (총 25 리터) 60-70%까지 생존력 쇠퇴 이후 수확되었다. 수확물은 여과되었고 -70℃에서 냉동되었다.
수확물 FIX 항원 수준의 결정:
수확물 FIX 항원 수준은 인간 FIX ELISA 키트 (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO)를 이용하여 결정되었다. 항원 수준은 각각의 배치당 계산되었다. FIX 농도는 상이한 배치를 통해 유지되었다 (표 17).
FIX-CTP 3 정제 공정:
짧은 정제 연구 이후, 하기 3 컬럼을 이용하는 정제 공정은 수행되었다: DEAE 세파로오스, 헤파린 세파로오스 및 HA Bio Rad 세라믹 수산화인회석 1형 (40 mm), FIX-CTP3. γ-카복실화된 풍부한 단백질은 정제되었다. 요약하여: 5 리터의 정화된 수확물은 4 일 기간 동안 4℃에서 해동되었다. 각각의 정제 배치에 대하여, 정화된 수확물 (2 리터)은 4-배 농축되었고 10 KDa의 명목 분자량 컷오프 크기를 가진 일회용 중공 섬유 카트리지를 이용하여 20 mM 트리스-HCl pH 8.2에 대해 투석되었다. 상기 공정 (UFDF1)은 2회 수행되었고, 1 리터의 UFDF1은 DEAE 세파로오스 컬럼상에서 장입되었고, 인자 IX는 20 mM 트리스-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2 pH 8.2로 용출되었다. 생성물은 20 mM 트리스-HCl, 10 mM CaCl2 pH 7.5로 1:1 희석되었고, pH는 헤파린 세파로오스 컬럼상에서 장입 이전 7.5로 조정되었다. 용출은 20 mM 트리스-HCl, 300 mM NaCl, 및 10 mM CaCl2 pH 7.5로 수행되었다. 용출된 생성물은 농축되었고 Pellicon XL 카세트 10 KDa 컷오프 막 (UFDF2)을 이용하여 10 mM 포스페이트 pH 6.8에 대해 투석되었다. 생성물은 HA 컬럼상에서 장입되었고, 인자 IX의 활성화된 분획은 150 mM 포스페이트 pH 6.8로 용출되었다. 정제 생성물은 2 mg/ml의 표적 농도로 농축되었고 TBS pH 7.45에 대해 투석되었고, 분취액으로 분할되었고 -70℃에서 저장되었다.
정제 공정은 총 용적 (25 리터)를 정제시키기 위해 5회, 일주일 단위로 반복되었다. 정제 공정은 HA# 6-10으로 명명되었다. 각각의 정제 생성물은 개별적으로 평가되었다 (App # 1-5). 정제 공정의 마지막에, 상이한 배치는 풀링되었고 추가로 4 mg/ml의 표적 농도로 농축되었다.
FIX-CTP 3 분석적 특성:
FIX 항원 수준의 결정
FIX-CTP3 γ-카복실화된 풍부한 단백질 항원 수준은 인간 FIX ELISA 키트 (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO)를 이용하여 결정되었다. 계산된 단백질 농도는 2 독립 시행의 평균이다 (표 18).
표 18 : FIX-CTP 3 항원 수준
SDS-PAGE 블롯 :
FIX-CTP3 γ-카복실화된 풍부한 단백질, rhFIX 및 rFIXa (활성화된 FIX)는 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. SDS-PAGE 쿠마씨 분석은 쿠마씨 블루 시약 (800 ng의 단백질)으로 겔 염색에 의해 수행되었다 (도 12). 웨스턴 면역블롯은 항-인간 FIX 다클론성 Ab (도 12B), 항-인간 감마 카복실화 단클론성 항체 (American Diagnostics Cat #499, 3570) (도 12C), 항-FIX 프로-펩타이드 다클론성 Ab (도 12D), 및 항-CTP 다클론성 Ab (도 12E)를 가진 100 ng의 단백질을 이용하여 수행되었다. 이전에 보고된 바와 같이, FIX-CTP3은 75KDa에서 이주하였다.
정제 절차는 불순물을 감소시키면서 FIX-CTP3 부분을 상당히 풍부하게 하였다. 정제 공정 수율은, 항-Gla 면역블롯 (도 12B)에서 입증된 바와 같이, γ-카복실화된 FIX-CTP3 분획만을 수집하기 위한 요건 때문에 대략 2-3% 범위로 매우 낮았다 (데이터 도시되지 않음). 쿠마씨 및 FIX 면역블롯에 기반하여, FIX-CTP3 부분은 겨우 대략 60-70%이고, 짐작컨대 더 낮은 당화 형태를 가진, 추가의 더 낮은 분자량 밴드는 또한 검출되었다.
FIX-CTP 3 응고 활성:
FIX-CTP 3 발색 활성:
인간 풀 정상 혈장에 대해서, FIX-CTP3 수확물 및 FIX-CTP3 γ-카복실화된 풍부한 단백질의 시험관내 효력의 비교 평가는 상업적으로 입수가능한 발색 활성 테스트 키트, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802)를 이용하여 수행되었다. FIX-CTP3 수확물 및 단백질은 연속으로 희석되었고, 효력은 정상 인간 혈장으로 구성되는 참조 제제에 용량-반응 곡선 비교에 의해 평가되었다. 이전에 입증된 바와 같이, FIX-CTP3 수확물은 인간 풀 혈장보다 50 배 더 적은 활성이었다 (표 19, 도 13). FIX-CTP3 정제 이후, 발색 활성은 상당히 개선되었고 인간 풀 혈장보다 겨우 4.72 배 더 적은 활성이었다 (표 19, 도 13). 수확물 감소된 발색 활성은 FIX 단백질 변이체의 부적절한 후-전사 변형, 예를 들면 부적절한 감마 카복실화 및 프로-펩타이드 절단의 결과일 수 있다. FIX-CTP3 γ-카복실화된 분획의 정제 및 풍부화 이후, 활성은 개선되었고, FIX 활성에 γ-카복실화의 중요한 기여를 입증하였다.
1 스테이지 응고 검정 (aPTT):
활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)은 응고 캐스케이드의 고유 및 통상 경로의 완전성의 측정치이다. aPTT는, 고유 경로 활성제, 인지질 및 칼슘의 첨가 이후 혈장이 응괴하는, 시간, 초이다. 검정의 주역은 rhFIX의 첨가에 의한 FIX-감손된 인간 혈장의 응고 활성을 회복하기 위한 FIX-CTP 수확물의 능력을 정량화하는 것이었다. 200 μl의 FIX-결핍된 인간 혈장은 25 μg/ml의 FIX-CTP3과 혼합되었고 추가로 TBS에서 희석되었다. 37℃에서 60 초 인큐베이션 이후, 50 μl의 PTT 활성제 (액틴 FS) 및 50 μl의 칼슘 25 mM은 혼합물에 첨가되었고, 초로 응고 시간은 (증명된 aPTT 검정을 이용하여 Sheba hospital, National Coagulation Center에 의해 수행된) Sysmex® CA 1500 응고제를 이용하여 결정되었다. 효력은 정상 인간 풀 혈장의 참조 제제의 용량-반응 곡선에 FIX-CTP3의 비교에 의해 평가되었다. 결과는 <1-110%의 FIX 수준을 포함하는 표준 곡선으로부터 내삽된 활성의 퍼센트로 표현된다. 신체에 있어서 FIX의 정상 값인, 5 μg/ml에서 활성이 6.5%인 것으로 나타났기 때문에, FIX-CTP3은 정상 인간 풀 혈장에 대하여 그것의 응고 활성에서 15-20-배수 감소를 나타냈다 (표 20).
FIX-CTP3은 또한 BeneFIX®에 비교하여 증가된 응고 시간을 나타냈다 (표 21 및 도 14).
추가의 응고 검정은 PK-PD 연구의 개시에 앞서 노스캐롤라이나 대학교의 폴 모나한 박사(Dr. Paul Monahan at University of North Carolina)에 의해 FIX-결핍된 마우스에서 독립적으로 수행되었다. aPTT 결과는 FIX-CTP3 응고 활성이 적절한 응고 활성에 요구되는 (초로 측정된 경우) 더 긴 기간 및 더 높은 농도에 의해 입증된 바와 같이 40 배 미만 정상 풀링된 인간 혈장인 것을 시사하였다 (표 22).
FIX-CTP3 및 BeneFIX®에 대하여 ELISA에 의해 계산된 경우 FIX 항원 수준에 기반된, 특이적 활성 (u/ml)은 4.46 및 198.9 각각이었다.
발색 대 aPTT 검정에서 입증된 바와 같이 계산된 FIX-CTP3 활성에서 비일관성은 aPTT 검정 및 생체내 관련성의 우월한 감수성에 의해 설명될 수 있다. 발색 활성 검정에서, 덜 강력한 FIX 버전을 활성화시킬 수 있는 과잉량의 시약 및 효소는 존재한다. FIX-CTP 특이적 활성 값에서 차이는 상이한 시약 및 자동화 기계의 사용에 의해 설명될 수 있다. 노스캐롤라이나 대학교에서 계산된 바와 같이 활성 값은 PK-PD 연구 설계에 사용되었다.
FIXa 단백질 검출:
정제 공정 이후, FIX 활성화 (FIXa)가 발생하지 않았다는 것을 확인하기 위해, FIXa 검출 검정은 FIXa Biophen 발색 검정 (Cat. # Ref. 221812)를 이용하여 수행되었다. 검정은, 이전에 기재된 바와 같이, 발색 활성 캐스케이드를 이용하는 특이적 샘플에서 존재하는 FIXa의 양을 측정한다. FIX-CTP3 및 rhFIX는 희석되었고 FIXa 수준은 평가되었다. FIX-CTP3은 정제 또는 저장을 통해 활성화되지 않았다 (표 23).
FIX- CTP 3 PK-PD 연구: FIX-CTP3 및 rhFIX (BeneFIX®)은 100 IU FIX/kg 체중을 함유하는 625 μg/kg 체중의 용량으로 C57BI FIX-결핍된 마우스에 단일 정맥내 주사로 투여되었다. 혈액 샘플은 투여후 대안적으로 0.25, 4, 24, 48, 72, 및 96 시간에서 3 마우스로부터 안와후로 채혈되었다. 시트레이트화된 혈장 (0.32%)은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었다. hFIX 항원 수준은 평가되었고, 상세한 PK 분석은 수행되었다. BeneFIX®에 비교된 FIX-결핍된 동물의 응고 활성을 연신하는 FIX-CTP3의 능력을 평가하기 위해, FIX-/- 치료된 마우스로부터 수집된, 시트레이트화된 혈장 샘플내 FIX 활성은 자동화 FIX 활성 검정을 이용하여 계산되었다 (표 24).
FIX -/- 마우스에서 FIX-CTP 3 약동학적 프로파일
FIX 농도는 인간 FIX ELISA 키트 (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO)를 이용하여 정량화되었다. 약동학적 프로파일은 각각의 단백질에 대하여 계산되었고 각각의 시점에서 3 동물의 평균이다. 아래 표 25 및 도 15는 집단 1 & 3에 대하여 상이한 샘플링 시점에서 계산된 FIX 농도를 요약한다. PK 프로파일 그리고 PK 파라미터의 요약은 아래 나타난다 (표 26 & 27). PK 분석은 노출을 증명하기 위해 집단 #2에 대하여 또한 수행되었다 (데이터 도시되지 않음).
2-구획성 모듈은 AUC0-inf, T말단 및 청소능 (CL)을 결정하는데 사용되었다 (WinLin 소프트웨어). PK 파라미터는 표 26에서 아래에 기재된다.
rhFIX에 3 CTP "카세트"의 첨가는 적어도 2.5-배만큼 생체내 FIX 반감기를 연신시켰다. 생체내 FIX-CTP3 투여 이후 AUC는 rhFIX에 대하여 2-배 증가시켰다. FIX-CTP3-주사된 마우스는 BeneFIX®-주사된 마우스에 비교하여 개선된 PK 프로파일을 입증하였다.
FIX-결핍된 마우스에서 FIX-CTP 3 약력학적 프로파일:
PK 샘플링에 병렬적으로, 한쪽 BeneFIX® 또는 FIX-CTP3, 시트레이트화된 혈장 샘플로 투여된 FIX-결핍된 동물은, % 활성으로 해석된, aPTT 검정에 의해 그것의 응고 활성에 대하여 평가되었다. 각각의 수집 지점에서 % 활성은 정상 풀 마우스 혈장의 현행 응고 시간/응고 시간 *100으로서 계산되었다. 표 27은 한쪽 BeneFIX® 또는 FIX-CTP3의 투여 이후 활성 값을 요약한다.
FIX-CTP3 투여 이후, 상당한 응고 활성은 투여후 4시간에서 96% 활성을 달성하는 투여 1시간 이후 검출되었고, 반면에 BeneFIX® 최고 활성 값은 40%이었다 (표 27, 도 16). FIX-CTP3 응고 활성은 시간의 더 오랜 기간 동안 유지되었고, 연신된 활성을 입증하였다. BeneFIX®-치료된 마우스에 대한 응고 활성은 36 시간보다 나중 시점에서 검출불가능하였고, FIX-CTP3-치료된 마우스는 투여후 72 시간에서 측정가능한 활성을 계속 유지하였다 (표 27, 도 16). % 응고 약동학적 프로파일의 분석은 FIX-CTP3 응고 활성이 상당히 더 오랜 기간 동안 유지되고 그것의 반감기가 Benefix®보다 거의 2-배 더 높다는 것을 시사한다 (표 28).
9.3 FIX-결핍된 마우스 출혈 공격
FIX-결핍된 마우스는 100 IU/kg의 BeneFIX® 또는 rFIX-CTP3의 단일 정맥내 주사가 투여되었다. 꼬리 정맥은 투여후 48 시간에 약간 잘려졌고, 꼬리 정맥 출혈 시간 (TVBT) 및 출혈 강도 (헤모글로빈 OD)는 평가되었다. 제2 출혈 공격은 항상성 달성 이후 15 분 수행되었고, 동일한 파라미터는 측정되었다. 제1 출혈 공격 이후, FIX-CTP3-투여된 동물 출혈은 헤모글로빈 OD 값에 의해 입증된 바와 같이 BeneFIX® 출혈 보다( then ) 상당히 덜 강렬하였다 (도 17).
혈우병 마우스에서 제1 출혈 공격 동안, 출혈 시간이 필연적으로 치료 효능과 상관관계가 있지 않다는 것이 이전에 보고되었기 때문에, 추가의 출혈 이후 항상성을 평가하는 것이 권고된다. 일단 제1 출혈이 자발적으로 또는 수작업으로 중단되었다면, 제2 출혈 공격은 제1 공격 이후 15 분 수행되었고, 시간 및 출혈 강도는 재-측정되었다. 제2 출혈 에피소드 동안 FIX-CTP3-투여된 동물은 출혈 시간 및 강도를 감소시켰고, FIX-CTP3이 나중 시점에서 강력하였다는 것을 입증하였다 (도 18).
마지막으로, 동물은 제2 출혈 공격 이후 12 시간 동안 추가로 관측되었고, 모든 재발성 출혈 사례는 문서로 기록되었다. FIX-CTP3-투여된 동물은 재-발생 출혈 사례 없이 다음 12 시간 동안 혈액 항상성을 유지할 수 있었다. 그에 반해서, BeneFIX®-치료된 마우스의 50%는 꼬리로부터 자발적인 출혈 에피소드를 가졌다 (표 29).
나란히 3 CTP "카세트"에 융합된 FIX의 단일 분자로 구성된 융합 단백질인, 재조합 FIX-CTP3은 혈우병 B를 가진 환자를 치료하는데 사용된 현재 이용가능한 FIX 생성물의 짧은 반감기를 다루기 위해 개발되었다. 본 명세서에서 결과는 rFIX-CTP3의 제거 반감기가 일관되게 (이전에 보고된 바와 같이) 랫트에서 그리고 FIX-결핍된 마우스에서 rFIX보다 2.5- 내지 4-배 더 오래되었다는 것을 입증하였다.
이론에 의한 구속됨 없이, 융합 단백질은 FIX의 청소능을 감소시키고 프로테아제 활성, 마스킹에 의한 열화로부터 FIX를 보호하고 간 수용체용 FIX의 친화도를 감소시킨다. 함께 합쳐져서 CTP 도메인의 이들 특징은 FIX의 반감기를 확장시킨다.
rFIX-CTP3의 약동학적 분석에 더하여, FIX-결핍된 마우스에서 FIX-CTP3의 약력학적 특성을 검사하였다. rFIX-CTP3 및 rFIX는 FIX-결핍된 마우스에서 응고 결핍 수준을 보상하기 위해 (유닛으로) 비교할만한 용량으로 투여되었다. 그러나, FIX-결핍된 마우스에서 rFIX-CTP3의 효과는, 더 높은 활성 피크를 달성하는, 투여후 적어도 76 시간까지 상당히 장기적이었다. FIX-CTP3 응고 활성은 BeneFIX®에 비교된 1-시간 지연 이후 시작하였다. 3 탠덤 CTPs의 첨가가 이론적으로 활성화 부위를 마스킹할 수 있고 캐스케이드 개시를 지연시킬 수 있기 때문에 FIX 활성화는 요구될 수 있다. FIX-CTP3 투여 이후, 100% 피크 활성은 관측되었고, 반면에 BeneFIX® 활성은 겨우 40%이었다. 우월한 초기 활성은 매우 중요한 파라미터이고 3 CTPs의 첨가가 회복을 개선하기 위한 잠재력을 갖는다는 것을 입증한다.
혈우병 B를 가진 환자를 위한 예방적 FIX 대체 요법은 1-2% 정상 응고 활성의 혈장 수준 유지를 목표로 한다. 꼬리 정맥 출혈 검정은 인간 출혈 항상성 모델을 모방하는 낮은 활성 값에서 출혈 항상성을 유지하는 능력을 측정하는 감수성 생체내 테스트이다. 투여후 48 시간 꼬리 정맥 출혈 공격에 반응하여, rFIX-CTP3-투여된 동물은, 지속된 응고 활성을 입증하는, 더 짧은 및 덜한 중증 출혈 에피소드로 혈액 항상성을 유지하였다.
FIX는 광범위한 번역후 변형을 경험하는 수많은 작용성 도메인을 함유하는 복합 단백질이다. FIX 활성을 위한 필수적인 번역후 변형 중 하나는 비타민 K-의존적 γ-글루타밀 카복실라제에 의해 Gla 도메인에서 제1 12 글루탐산의 감마-카복실화이다. 상기 변형은 인지질 막에 FIX의 결합을 촉진시키고, 따라서, 그것의 기능에 결정적이다. 감마-카복실화되지 않는 FIX는 작용성이 아니고, 따라서 감마-카복실화는 속도-제한 단계이다.
상기 PK-PD 연구는 일시적으로 형질감염된 세포를 이용하여 수행되었다. 번역후 변형의 광범위한 분석적 평가는 안정적인 최적화된 클론으로부터 생산된 및 분비된 안정적인 FIX-CTP3 단백질상에서 수행된다.
나타난 데이터에 기반하여, FIX-CTP3 응고 인자는 FIX 대체 요법의 일상적인 예방적 용량을 받는 환자에 있어서 주사의 빈도를 감소시키는 잠재력을 갖는다. rFIX-CTP3이 인자의 각각의 용량 이후 출혈로부터 장기적인 보호를 부여, 출혈 에피소드를 치료하는데 필요한 인자의 전체 유닛을 증가, 및/또는 더 적은 주사로 외과용 절차 동안 적절한 지혈을 유지할 수 있다는 것이 기대된다.
실시예 4
응고 인자 FVII의 생성 및 이용
활성화된 인자 VII (FVIIa) 응고 인자의 장기-작용성 버전은 혈우병 A 및 B를 가진 환자의 치료에 유용할 것이다. FVIIa-CTP3 재조합 단백질은, 환자의 삶의 질을 상당히 개선할 수 있고, 자발적인 출혈 에피소드 및 관절과 다른 기관에 누적된 손상을 피할 수 있는 예방적 치료 접근법을 가능하게 하는, 주입의 빈도 감소 및 심지어 약물 부하 감소에 의해 혈우병 환자의 치료를 개선하는 임상 잠재력을 갖는다.
인간 CTP에 FVII의 융합에 기반된 확장된 반감기를 가진 재조합 FVIIa-CTP 분자의 생성은 본 명세서에서 기재된다. 재조합 FVIIa-CTP는 포유동물 세포에서 발현되었고 시험관내 및 생체내 특성규명되었다. rFVIIa-CTP 활성이 rFVIIa에 비교할만하였다는 것이 입증되었다. 랫트에서 약동학적 및 효능 연구는 rFVIIa-CTP의 개선된 특성을 입증하였다. 상기 연구의 결과는 야생형 효소와 매우 유사한 지혈 특성을 가진 반감기 확장된 rFVIIa 분자를 개발하는 것이 실행가능하다는 것을 입증하였다.
재조합 FVII 분자의 클로닝 및 발현: 몇 개의 인자 VII 클론은 현대 진핵 발현 벡터 (pCI-dhfrr)에서 작제되었다 (도 19). 인간 MGC는 호모사피엔스 응고 인자 VII의 서열을 함유하는 FL cDNA 클론 (IRCM)이 "개방형 생물계(Open Biosystems)" (OB-MHS4426)로부터 정렬되었다는 것을 증명하였다. 하기 프라이머는 하기 서열에서 Sigma-Genosys에 의해 합성되었다: 프라이머 67: 5'CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCC3' (인자 VII DNA의 5' 단부 및 XhoI의 제한 부위를 함유한다) (서열 식별 번호: 5); 프라이머 68R: 5' TCTAGAATAGGTATTTTTCCACATG3' (XbaI의 제한 부위를 함유한다) (서열 식별 번호: 6); 프라이머 69: 5' TCTAGAAAAAAGAAATGCCAGC3' (XbaI의 제한 부위를 함유한다) (서열 식별 번호: 7); 및 프라이머 70R: 5'GCGGCCGCATCCTCAGGGAAATGGGGCTCGCA3' (인자 VII DNA의 3' 단부 및 NotI의 제한 부위를 함유한다) (서열 식별 번호: 8).
클로닝은 PCR 반응의 2 세트에서 수행되었다. 제1 반응은 템플레이트로서 인자 VII 서열 (OB-MHS4426)을 가진 cDNA 플라스미드를 이용하여 프라이머 67 및 프라이머 68R로 수행되었고; PCR 증폭의 결과로서, ~534 bp 생성물은 형성되었고, 단리되었고 TA 클로닝 벡터 (Invitrogen, 카탈로그 No: K2000-01) 속에 결찰되었다. 인자 VII 서열의 아미노 말단을 함유하는 XhoI -XbaI 단편은 단리되었다. 제2 반응은 프라이머 69 및 프라이머 70R로 수행되었고 다시, 인자 VII 서열 (OB-MHS4426)을 가진 cDNA 플라스미드는 템플레이트로서 사용되었다. PCR 증폭의 결과로서, ~813 bp 생성물은 형성되었고 TA 클로닝 벡터 (Invitrogen, 카탈로그 번호: K2000-01) 속에 결찰되었다. 인자 VII 서열의 카복시 말단을 함유하는 XbaI-NotI 단편은 단리되었다. 2 단편은 현대 진핵 발현 벡터 pCI-dhfr (삼중 결찰) 속에 삽입되어 501-0-p136-1 클론을 수득하였다.
플라스미드 501-p136-1 (pCI-dhfr 벡터내 인자 VII)은 제한 효소 XhoI 및 KpnI로 소화되었다. ~1186 bp의 단편은 단리되었다. 부분적인 인자 VII 클론 (1180 bp-1322 bp) 그 다음 CTP 서열, 종료 서열 및 GeneArt (0721543)에 의해 합성된 NotI 서열은 제한 효소 KpnI 및 NotI로 소화되었다. ~253 bp의 단편은 단리되었다. 2 단편은 현대 진핵 발현 벡터 pCI-dhfr (삼중 결찰) 속에 삽입되어 501-1-p137-2 클론을 수득하였다. pCI-dhfr-701-2-p24-2는 제한 효소 XhoI 및 ApaI로 소화되었고, 큰 단편 (벡터)는 단리되었다.
pCI-dhfr-501-2-p137-2 (인자 VII-ctp x1)은 제한 효소 XhoI 및 ApaI로 소화되었고, ~1200 bp 삽입물은 단리되었다. 벡터 및 삽입물은 결찰되어 501-2-p139-2를 수득하였다. Dg44 세포는 100 mm 조직 배양 접시에서 플레이팅되었고 50-60%의 합류점으로 성장되었다. 총 2 mg의 DNA는 무단백질 배지 (Invitrogen CD Dg44)내 FuGene 시약 (Roche)을 이용하여 하나의 100 mm 플레이트의 형질감염에 사용되었다. 배지는 형질감염후 48 시간에 제거되었고 뉴클레오사이드 없이 무단백질 배지 (Invitrogen CD Dg44)로 대체되었다. 14 일 후, 형질감염된 세포 집단은 T25 조직 배양 플라스크 속에 전달되었고, 세포가 안정적인 클론으로서 양호하게 성장하기 시작한 때까지 10-14 일 동안 계속되었다. 고-발현 클론은 선택되었고 대략 2x107 세포는 5 ng/ml의 비타민 K3 (메나디온 소듐 비설페이트; Sigma)로 보충된 1700cm2 롤러 병 (Corning, Corning NY)에서 300 mL의 성장 배지를 접종하는데 사용되었다. 생산 배지 (수확물)은 대략 70%까지 세포 생존력에서 급속한 감소 이후 수집되었다. 생산 배지는 먼저 정화되었고 그 다음 대략 20-배 농축되었고 유동 여과 카세트 (10KDaMWCO; Millipore Corp, Billerica, MA)를 이용하여 PBS에 투석되었다.
FVII 항원 수준의 결정
CTP 펩타이드를 코딩하는 cDNA는 인간 FVII를 코딩하는 cDNA의 3' 단부에 융합되었다. 대응하는 rFVII 작제물은 Dg44 세포 속에 형질감염되었다. 대조로서, 인간 rFVII cDNA는 이용되었다. 생산 배지 (수확물)은 수집되었고, 농축되었고 분비된 재조합 FVII는 추가로 평가되었다. rFVII, rFVII-CTP 및 rFVII-CTP-CTP 항원 수준은 AssayMax 인간 FVII ELISA 키트 (AssayPro)에 의해 결정되었다 (도 20A). 원상태 rFVII에 비교된 rFVII-CTP 및 rFVII-(CTP)2의 분비 수준에서 유의차는 없었다.
SDS-PAGE 블롯
SDS-PAGE 분석은 50 ng의 한쪽 수확물, 정제된 또는 활성화된 rFVII 단백질 장입에 의해 실시되었다. 샘플은 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. SDS-PAGE 분석은 토끼에서 생성된 항-인간 FVII 단클론성 항체 (Ab) (R&D system) 또는 항-CTP 다클론성 항체를 이용하는 웨스턴 면역블롯 수행에 의해 실시되었다.
rFVII 항원의 수준은 항-FVII Ab로 면역블롯팅된 SDS-PAGE에서 검출된 단백질 수준과 상관관계가 있었다. rFVII-CTP는 단일 밴드로서 이주하였고, 반면에 FVII 대조의 대응하는 분자량은 대략 52 KDa이었다 (데이터 도시되지 않음). 양쪽 단백질은 면역블롯상에서 FVII에 특이적인 항체와 반응하였다. rFVII-CTP는 또한 CTP에 특이적인 항체와 반응하였다. rFVII는 활성화된 단백질의 미량 없이 그것의 효소원에서 분비되었다.
FVII 발색 활성:
rFVII, rFVII-CTP 및 rFVII-(CTP)2 수확물 활성은 상업적으로 입수가능한 발색 테스트 키트 (AssaySense Human FVII 발색 활성 검정 키트 (AssayPro)를 이용하여 결정되었다. 추가로 활성화된 (FVIIa)가 되도록 rFVII-CTP 및 그것의 능력의 작용성 특성규명을 위하여, 농축된 rFVII-CTP (수확물)은 FXa 특이적 기질의 존재하에 정량화된 신호 (AssayPro)를 방출하는 인자 X를 인자 Xa로 활성화시키는 TF/FVIIa의 능력을 측정하는 상업적으로 입수가능한 발색 테스트 키트에 배치되었다. rFVII 단백질의 C-말단에서 CTP 펩타이드의 첨가는 FVII 세린 프로테아제 활성을 손상시키지 않았다 (도 20B 및 20C).
FVII 응고 활성:
프로트롬빈 시간 (PT)은 응고의 외인성 경로를 측정한다. PT는 외인성 경로 활성제, 인지질 및 칼슘의 첨가 이후 혈장을 응괴하는데 걸리는 (초로 측정된) 시간이다. 구체적으로 와파린 복용량, 간 손상, 및 비타민 K 상태의 측정에서, 혈액의 응고 경향을 결정하는데 사용된다. 프로트롬빈 시간에 대하여 참조 범위는 일반적으로 대략 12-15 초이다. 구체적으로, 검정은 rhFVII의 첨가에 의해 FVII-감손된 인간 혈장의 응고 활성을 회복하는 FVII-CTP 및 FVII-(CTP)2 수확물의 능력을 정량화하였다. 300 μl의 FVII-결핍된 인간 혈장은 특이적 농도에서 100 μl의 FVII, FVII-CTP 및 FVII-(CTP)2 수확물, 또는 정상 풀 인간 혈장과 혼합되었고 추가로 희석되었다. 37℃에서 60 초 인큐베이션 이후, 조직 인자 (TF), CaCl2, 및 인지질은 혼합물에 첨가되었다. 초로 응고 시간은 결정되었다. 효력은 rhFVII 또는 인간 풀 혈장으로 구성되는 참조 제제의 FVII-CTP 및 FVII-(CTP)2 수확물의 용량-반응 곡선 비교에 의해 평가되었다. 활성 FVII의 1 유닛은 1 ml 인간 정상 혈장의 활성과 같은 FVII의 양으로서 정의되었다. rFVII 및 rFVII-CTP의 PT 응고 활성은 응고측정기 (Instrumentation Laboratory)상에서 측정되었다.
이전에 나타난 바와 같이, rFVII 단백질의 C-말단에서 CTP 펩타이드의 첨가는 그것의 세린 프로테아제 활성을 손상시키지 않았고 인간 혈장에서 원상태 인자 X 및 인자 IX의 개시 및 활성화로 이어진다. C 말단에서 추가의 CTP의 삽입 이후, 세린 프로테아제 활성 (데이터 도시되지 않음)에서 3-배수 감소가 있었다.
약동학 연구:
rFVII, rFVII-CTP, 및 rFVII-(CTP)2 수확물은 100μg/kg 체중의 용량으로 스프래그-다우리 랫트 (6 랫트 / 서브스턴스)에 정맥내 투여되었다. 모든 생체내 실험에 대하여, 각각의 단백질의 양은 FVII ELISA 키트를 기준으로 하여 결정되었다. 각각의 FVII 테스트 서브스턴스에 대하여, 주사된 양은, 상이한 몰 농도로 이어지는, rFVII 대 rFVII-CTP의 분자량에서 차이를 고려함으로써 계산되었다.
혈액 샘플은 정량화되는 샘플링 절차 수준의 간섭을 최소화하는 교대 샘플링 반응식을 이용하여 안와후로 채혈되었다: 30 및 90 분에서 그리고 2, 6, 및 48 시간에서 3 랫트로부터, 그리고 대안적으로 15 및 60 분에서 그리고 1.5, 4, 및 24 시간에서 잔존 3 랫트로부터. 혈장은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었다. FVII 농도는 FVII ELISA 특이적 검정에 의해 정량화되었다. 반감기 및 곡선하 면적 (AUC)은 선형 사다리꼴 규칙을 이용하여 계산되었다. 이들 청소능 파라미터의 비교는 생체내 반감기 및 rFVII-(CTP)2 AUC가 rFVII의 것보다 상당히 더 높다는 것을 드러냈다 (표 30).
재조합 FVIIa-CTP의 특성규명:
활성화 동안, FVII는 단일 디설파이드 브릿지에 의해 함께 고정되는 중쇄 및 경쇄 도메인을 초래하는 R152에서 절단된다. rFVIIa-(CTP)2는 이온 교환 컬럼 정제 공정에 의해 정제되었고 활성화되었다. rFVIIa-(CTP)2를 완전히 평가하기 위해, 단백질은 상업적 FVIIa (NovoSeven®)에 감소 조건하에 SDS-PAGE상에서 장입된다. 중쇄 및 경쇄 도메인은 분리되고 분자량 55 및 25 KDa의 분리된 밴드로서 이주한다. 양쪽 단백질은 FVII에 특이적인 항체와 반응하지만, rFVIIa-CTP의 중쇄는 구체적으로항-CTP-특이적 항체와 반응하여, 상기 밴드가 CTP에 융합된 FVII 중쇄를 나타낸다는 것을 표시한다. 경쇄는 구체적으로 항-감마 카복실라제 Ab와 반응한다. FVIIa 단백질 농도는 FVIIa-특이적 ELISA 키트에 의해 결정된다.
FVIIa N-말단 서열분석:
활성화된 또는 효소원 정제된 단백질내 rFVII-CTP-CTP는 (12% 트리스-글리신상에서) SDS-PAGE에 의해 분리되고 후속적으로 PVDF 막에 전기블롯팅된다. 관심 밴드는 절단되고 정제된 바이오브렌-치료된 유리 섬유 필터상에 배치된다. N-말단 서열 분석은 140C HPLC 마이크로구배 시스템이 구비된 펄스화된 액체 단백질 시퀀서를 이용하는 애드만 열화에 의해 수행된다. 재조합 단백질 및 적절한 프로-펩타이드 절단의 동일성은 N-말단 서열분석에 의해 추가로 확인된다.
FVIIa 응고 활성:
FVII-(CTP)2 응고 활성을 평가하기 위해, 활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간 검정 (aPTT)은 수행된다. FVII-결핍된 혈장 샘플은 rFVIIa (NovoSeven®) 또는 rFVIIa-(CTP)2로 치환된다. 300 μl의 FVII 결핍된 인간 혈장은 특이적 농도에서 100 μl의 FVIIa 또는 rFVIIa-(CTP)2, 또는 추가로 희석되는 정상 풀링된 인간 혈장과 혼합된다. 37℃에서 60 초 인큐베이션 이후, 조직 인자 (TF), CaCl2, 및 인지질은 혼합물에 첨가된다. 초로 응고 시간은 결정된다. 효력은 rhFVIIa 또는 인간 풀 정상 혈장으로 구성되는 참조 제제에 rFVIIa-(CTP)2의 용량-반응 곡선 비교에 의해 평가된다. FVIIa의 1 유닛은 1 ml 인간 정상 혈장의 활성과 같은 FVIIa의 양으로서 정의된다. rFVII 및 rFVIIa-(CTP)2의 aPTT 응고 활성은 응고측정기 (Instrumentation Laboratory)상에서 측정된다. rFVIIa 및 rFVIIa-(CTP)2의 aPTT 응고 활성은 유사하다.
랫트에서 약동학 연구:
그것의 장수 잠재력으로 rFVIIa에 CTP 첨가의 영향을 특성규명하기 위해, 랫트에서 비교 약동학적 연구는 수행된다. TBS내 NovoSeven® (rFVIIa) 및 rFVIIa-(CTP)2는 6 SD 랫트에 IV 주사된다. 경시적으로 FVIIa의 수준은 FVIIa ELISA 키트를 이용하여 검출된다. 반감기 및 AUC는 각각의 단백질에 대하여 계산된다. 이들 청소능 파라미터의 비교는 rFVIIa-(CTP)2의 반감기, 회수, 및 AUC의 생체내 측정이 NovoSeven®의 것보다 우월하다는 것을 드러낸다.
FVIIa-CTP 생체내 효능 모델 (혈우병의 FVIII-결핍된 마우스 모델):
생체내 활성 모델을 평가하기 위해, FVIII 녹아웃 마우스는 수득되고, 교배 콜로니는 확립된다. 10 μg의 한쪽 상업적 재조합 hFVIIa (NovoSeven®) 또는 rFVIIa-(CTP)2는 마취된 FVIII 녹아웃 마우스 (22-28g)의 꼬리 정맥 속에 주사된다. 주사된 단백질의 양은 정상 혈장 (5μg/ml)내 FVIII의 요구된 농도와 같다. 혈액 샘플은 특이적 시점에서 헤파린처리된 모세관 튜브 속에 자른 꼬리로부터 채혈된다. 혈장 샘플은 ELISA에 의해 FVIIa 수준에 대하여 평가되고, 효능은 a PTT 응고 검정에 의해 측정된다.
상기 연구에서, CTP를 가진 FVII의 융합 작제물은 생성된다. 상기 재조합 단백질은 치료 효력의 장기적인 반감기 및 유지를 제공하는 치료에 대한 기준이다.
이들 결과는 rFVIIa-(CTP)2가 혈우병 환자에 있어서 rFVIIa와 유사한 치료 효능을 갖는다는 것을 시사한다. 또한, 상기 기술은 덜 빈번한 투여를 요구한다. rFVIIa-(CTP)2의 단일 주사가 출혈 에피소드를 제어하는데 충분하고 수술 개입 동안 필요한 주사의 수를 감소시키는데 충분한 것처럼 보인다. 상기 재조합 단백질은 장기간 예방적 치료로서 사용될 수 있다.
실시예 5
정제된 FVII-CTP 3 , FVII-CTP 4 , 및 FVII-CTP 5 의 비교 평가
5.1 연구 목적
FVII-CTP4 및 FVII-CTP5 대 FVII-CTP3의 약동학적 파라미터 및 응고 활성의 비교 평가.
5.2 FVII-CTP 4 및 FVII-CTP 5 수확물의 생산
4 또는 5 탠덤 CTP 서열에 C-말단에서 융합된 FVII cDNA는 20 μg/L의 비타민 K3 (Sigma, Mennadion)의 존재하에 Excellgene 발현 시스템을 이용하여 Dg44 세포에서 발현되었다. 수확물은 수집되었고 (300 ml), 여과되었고 냉동되었다.
5.3 FVII-CTP 3 수확물의 생산
FVII-CTP3은, pCI-DHFR 벡터를 이용하여, 포유동물 발현 시스템, CHO 세포에서 인하우스 발현되었다 (도 109). FVII-CTP3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 카세트의 형태가, 예를 들어 서열 식별 번호: 24에서 제시된 바와 같이 핵산 서열을 포함하는, 신호 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 동안, 그안에 인코딩된 폴리펩타이드의 발현, 정제 및 활성화가 응고 인자의 활성 FVIIa-CTP3 형태를 초래하기 때문에 카세트는 MOD-5014로서 표지된다. 안정적인 형질감염된 풀 #71은 25 ng/L의 비타민 K3 (Sigma)의 존재하에, 진탕 플라스크에서 성장되었다. 수확물은 수집되었고 여과되었다.
모든 FVII-CTP 수확물 (3, 4 및 5 CTPs)는 농축되었고 Pellicon XL MWCO 10kDa를 이용하여 TBS (50 mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.4)에 대해 투석되었다.
5.4 FVII 항원 수준의 결정
FVII 항원 수준은 인간 FVII ELISA 키트 (Zymotest HyPhen)를 이용하여 결정되었다 (표 31). 계산된 단백질 농도는 2 독립 시행의 평균이다.
5.5 FVII-CTP 면역-블롯
FVII-CTP3, FVII-CTP4, 및 FVII-CTP5 수확물은 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔 (expedeon)상에서 장입되었다. SDS-PAGE 분석은 항-CTP 다클론성 Ab (Adar Biotech Production) 또는 항-Gla Ab (American Diagnostica)를 이용하는 웨스턴 면역-블롯에 의해 수행되었다.
3, 4 및 5 CTP에 융합된 FVII는 80, 90 및 100kDa, 각각에서 이주하였다. 기대된 대로, Excellgene으로부터 FVII-CTP4 및 FVII-CTP5 수확물은 생산 공정이 최적화되지 않았기 때문에 Prolor에서 생산되었던 FVII-CTP3 수확물에 비교된 경우 낮은 감마 카복실화 함량을 함유한다 (도 21).
5.6 FVII 시험관내 효력의 비교 평가
HA 정제된 (고도로 감마 카복실화된 분획) FVII-CTP3, FVII-CTP4, 및 FVII-CTP5 대 정상 인간 풀 혈장의 시험관내 효력의 비교 평가는 상업적으로 입수가능한 발색 활성 테스트 키트, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304)를 이용하여 수행되었다. 모든 샘플은 연속으로 희석되었고, 효력은 정상 인간 혈장으로 구성되는 참조 제제에 용량-반응 곡선 비교에 의해 평가되었다. FVII-CTP3 및 FVII-CTP5는 풀링된 정상 혈장보다 낮은 발색 활성을 입증하였다 (도 22). FVII-CTP4는, FVII-CTP3 및 FVII-CTP5에 비교된, EC50 비에 의해 반영된 경우 더 높은 활성을 입증하였다 (표 32).
5.7 FVII 시험관내 응고 활성:
Sheba Medical Center, Israel National Coagulation Center에서 수행된, 인자 VII (FVII) 활성 검정은 인자 VII (Siemens)에서 결핍된 면역-흡착된 혈장을 이용하는 프로트롬빈 (PT)-기반 검정이다. PT 시약은 인노빈(innovin)이고, 검정은 Sysmex® CA 1500 기기에서 수행된다. FVII 정상 범위는 55-145%이내이다.
신체에서 순환 FVII의 정상 수준이 대략 0.5 μg/ml이기 때문에, FVII-CTP3 및 FVII-CTP5 수확물은 정상 인간 풀 혈장에 대하여 그것의 응고 활성에서 3-배수 감소를 나타내고; 상기 결과는 수득된 발색 활성과 상관관계가 있다 (표 33).
FVII-CTP4 수확물은 발색 활성 검정에서 관측된 경우 정상 인간 풀 혈장에 대하여 그것의 잠재적인 응고 활성에서 3-배수 증가를 나타낸다 (표 33). FVII-CTP4의 활성 백분율은 FVII-CTP3 및 FVII-CTP5의 활성 백분율에 비교하여 훨씬 높다. ELISA 방법의 방법론적 제한은 FVII-CTP4의 Ag 수준 계산의 정확도를 제한시킬 수 있다.
5.8 약동학적 연구
2 약동학적 연구는 FVII-CTP3, FVII-CTP4, 및 FVII-CTP5 약동학 (PK) 파라미터를 결정하기 위해 수행되었다. 제1 연구 동안, FVII-CTP3, FVII-CTP4, 및 FVII-CTP5 (그룹 A, B 및 C, 각각)은 250 μg/kg 체중의 용량으로 스프래그 다우리 랫트 (6 랫트 / 치료)에 단일 정맥내 주사로 투여되었다. 혈액 샘플은 투여후 대안적으로 0.083, 0.5 2, 5, 8, 24, 48, 72 및 96 시간에서 3 랫트로부터 안와후로 채혈되었다 (표 34). 시트레이트화된 혈장 (0.38%)은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었다.
표 34 : 약동학적 연구 설계 - 농축된 수확물
혈장 샘플내 FVII 농도는 인간 FVII Elisa 키트 (Zymutest FVII-Biophen)를 이용하여 정량화되었다. 약동학적 프로파일은 계산되었고 각각의 시점에서 3 동물의 평균이다. 말단 반감기 값은 PK 솔루션스 2.0 소프트웨어를 이용하여 계산되었다. 아래 표 35는 상이한 샘플링 시점에서 계산된 FVII 농도를 요약한다. PK 프로파일 (도 23-24) 그리고 PK 파라미터의 요약 (표 36)은 또한 아래 나타낸다. FVII-CTP5는 FVII-CTP3 및 FVII-CTP4에 비교된 경우 우월한 프로파일을 입증하였다 (표 36).
표 35: 제1 약동학적 연구 - FVII 농도
표 36: 약동학적 분석
4 또는 5 CTPs의 첨가는 FVII 반감기를 3 CTPs에 비교된 경우 2- 및 3-배, 각각만큼 상당히 연신시켰다 (표 36). 상기 우월성은 연구의 초기 부분 (0.083-8 시간)에서 더욱 상당하였고, 잠재적인 개선된 단백질 회수 그리고 감소된 추가의 혈관 청소능을 시사하였다. FVII-CTP4 및 FVII-CTP5 투여 이후 AUC는 FVII-CTP3에 대하여 3- 및 4-배, 각각만큼 증가하였다. 청소능은 또한 FVII에 4 및 5 CTPs를 첨가하면서 감소되었다 (표 36).
연구에서 관측된 바와 같이, 4 및 5 CTPs의 첨가는, 양쪽 초기 및 말단 반감기에서, 3 CTPs에 비교된 경우 FVII 반감기를 상당히 연신시켰다. 제1 및 제2 연구에서 반감기 값은 용량 및 연구 지속기간에 의해 영향받았던 상이한 분석 접근법 때문에 상이하고, 그럼에도 불구하고 전체 추세는 유지되었다. FVII-CTP4 및 FVII-CTP5 투여 이후 AUC는 FVII-CTP3에 대하여 2.5- 및 7-배, 각각만큼 증가하였다.
5.9 결론:
상기 연구에서, FVII-CTP3, FVII-CTP4, 및 FVII-CTP5의 PK 파라미터 및 잠재적인 응고 활성은 평가되었다. FVII에 4 및 5 CTPs의 융합은 유사한 발색 및 시험관내 응고 활성을 유지하면서 FVII-CTP3에 비교된 경우 우월한 및 개선된 반감기, 노출 및 감소된 청소능을 제공하였다. 이들 결과는 단백질의 상이한 농도에서 관측되었고 양쪽 수확물 및 정제된 단백질에 대하여 일관성이었다. FVII에 C 말단에서 CTP의 융합의 전체 효과를 평가하는 동안, 1-5 CTPs의 융합은 CTP 비례하는 방식으로 FVII의 반감기 및 AUC를 상당히 증가시켰고, 분자의 CTP 부분이 증가함에 따라, FVII 장수 및 안정성이, 아래 본 명세서에서 표 37에 요약된 바와 같이, 그것의 초기 시험관내 응고 활성을 유지하면서 상당히 개선되는 것을 시사하였다.
이전에 보고된 바와 같이, FVII 반감기는 양쪽 인간 및 동물에 있어서 FVII의 활성화된 형태 (FVIIa)의 반감기와 상관관계가 있다. 따라서, 반감기에서 유사한 개선이 CTP 융합 이후 활성화된 버전으로 수득될 것이 기대된다.
실시예 6
FVIII-결핍된 혈우병 마우스에서 FVII-CTP 3 실행성 연구
상업적 FVII에 대하여 FVII-CTP, FVII-CTP2 및 FVII-CTP3 수확물 PK 프로파일 및 응고 활성을 테스트하는 상기 본 명세서에서 기재된 연구는 수행되었다. FVII-CTP3은 FVII-CTP 및 FVII-CTP2 수확물 또는 rhFVII에 대하여 그것의 응고 활성을 유지하면서 개선된 PK 프로파일을 나타냈다. FVII-CTP3 시험관내 및 생체내 특성을 추가로 특성규명하기 위해, 단백질을 발현하고 분비하는 미니 안정 풀은 생성되었고, 정제 및 활성화 공정은 개발되었다.
현행 연구에서, FVIIa-CTP3의 약동학적 및 약력학적 특성은 FVIII-결핍된 마우스에서 테스트되었다. 단백질의 PK 프로파일은 평가되었다. FVIIa 특이적 활성-기반 PK 프로파일은 확립되었고 상품 NovoSeven®에 비교되었다. 또한, 꼬리 바인 절단 이후 FVIII-결핍된 마우스에서 응고를 유도하는 FVIIa-CTP3의 장기-지속성 생체내 지혈 능력 (생존 연구)는 테스트되었다.
연구 목적:
유사한 활성 용량으로 단일 IV 투여 이후 FVIII-결핍된 마우스에서 상업적 rhFVIIa (NovoSeven®)에 대하여 FVIIa-CTP3의 약동학적 및 약력학적 파라미터를 평가하기 위해.
유사한 활성 용량으로 FVIIa-CTP3 및 NovoSeven®의 단일 IV 투여 그 다음 꼬리 정맥 절단의 공격에 의해 FVIII-결핍된 마우스에서 항상성을 유지하는 FVIIa-CTP3의 생체내 능력 (생존 연구)을 결정하기 위해.
FVII-CTP 3 수확물의 생산:
FVII-CTP3은 pCI-DHFR 벡터를 이용하여 Dg44 세포에서 인하우스 발현되었다. 안정적인 형질감염된 풀 #71은 25 ng/L의 비타민 K3 (Sigma)의 존재하에 진탕 플라스크에서 성장되었다. 세포 현탁액은 배양되었고 60-80%까지 생존력 쇠퇴 이후 수확되었다. 수확물은 여과되었고 -70℃에서 냉동되었다.
수확물 FVII 항원 수준의 결정:
FVII 항원 수준은 인간 FVII ELISA 키트 (Zymotest HyPhen)를 이용하여 결정되었다 (표 38). 항원 수준은 각각의 풀링된 수확물 배치당 계산되었다.
표 38 : FVII-CTP 3 항원 수준
FVII-CTP 3 정제 공정 (도 25)
공정 개요
짧은 정제 연구 이후, 2 컬럼을 이용하는 하기 정제 공정은 수행되었다. VII-Select 친화도 컬럼 (GE) 및 세라믹 수산화인회석 1형 (HA), 40 mm (Bio Rad), FVII-CTP3 γ-카복실화된 풍부한 단백질은 정제되었다. 자체-활성화는 2-8℃에서 밤새 CaCl2의 존재하에 정제된 FVII-CTP3의 인큐베이션에 의해 유도되었다. 정제 공정은 그것의 최종 발달성 스테이지에서이고 최적화중이고, 따라서 대부분의 정제 단계가 유사하여도, 정제 단계의 일부 부분은 2 배치에서 동일하지 않다.
10kDa 중공 섬유 또는 Pellicon 카세트를 이용하는 한외여과 / 정용여과 (UFDF)
정화된 수확물은 4℃에서 주말에 걸쳐 (2-3 일) 해동되었다.
배치 31에서, 정화된 수확물 (12 리터)는 10 KDa 분자량 컷-오프를 가진 중공 섬유 카트리지 (GE Healthcare 카탈로그 # UFP-10-C-4X2MA)를 이용하여 (2 연속적인 시행으로) 4-배 농축되었다. 농축된 수확물은 1-2 용적의 TBS (50mM Tris 150mM NaCl pH 7.4)에 대해 투석-여과되었다.
배치 38에서, 정화된 수확물 (8.5 리터)는 10 KDa 분자량 컷-오프를 가진 Pellicon 2 (Millipore) 카세트를 이용하여 4-배 농축되었다. 농축된 수확물은 VII-Select 컬럼상에 직접적으로 장입되었다.
양쪽 한외여과는 빙랭된 완충액으로 빙상에서 수행되었다. UFDF 샘플은 장입 이전 0.22 μm 여과되었다.
FVII-Select 컬럼상의 포착
UFDF 또는 농축된 수확물은, TBS pH 7.4로 사전-평형화된, VII-Select 컬럼 (XK16/20, CV 18ml)상에서 장입되었다. 컬럼은 50 mM 트리스-HCl, 0.5M NaCl pH 7.5로 세정되었고, FVII-CTP3은 50 mM 트리스-HCl, 1M NaCl 50% (v/v), 프로필렌 글리콜 pH 7.5로 용출되었다. 공정은 동일한 컬럼을 사용하는 2 연속적인 사이클로 수행되었다.
세라믹 수산화인회석 컬럼상에서 감마 카복실화-기반 분리
용출된 생성물은 10 mM 인산나트륨 pH 6.8로 1:10 희석되었고 세라믹 수산화인회석 컬럼 (XK16/20, CV 24ml)상에서 장입되었다. 컬럼은 59 mM 인산나트륨 pH 6.8로 세정되었고 인자 VII의 γ-카복실화된 풍부 분획은 500mM 인산나트륨 pH 6.8로 용출되었다. 상기 공정은 동일한 컬럼상에서 2 연속적인 사이클로 수행되었다. 각각의 배치에서, 2 사이클의 용출물은 풀링되었고 1.7-2 mg/ml로 농축되었고 20 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl pH 8.2로 투석-여과되어 용적을 감소시키고 활성화 단계용 재료를 제조하였다.
FVII 활성화
정제된 FVII-CTP3은 1 mg/ml로 희석되었고 24 시간 동안 2-8℃에 20 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl 및 1mM CaCl2 pH 8.2에서 인큐베이션되었다. 활성화는 예비 제형 완충액 (20 mM 시트르산 완충액, 240 mM NaCl, 13.3 mM 글리신, pH 6.9)에 완충액 교환 (UFDF)에 의해 종료되었다.
FVII-CTP 3 및 FVIIa-CTP 3 분석적 특성:
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯
정제된 FVII-CTP3, 및 FVIIa-CTP3은 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 12% 트리스-글리신 겔상에서 장입되었다. SDS-PAGE 쿠마씨 분석은 쿠마씨 브릴리언트 블루 시약 (5 또는 10 μg의 단백질/레인)으로 겔 염색에 의해 수행되었다. 웨스턴 블롯 분석은 항-인간 FVII 다클론성 Ab (R&D systems; AF2338), 항-인간 감마 카복실화 단클론성 항체 (American Diagnostics 카탈로그 #499, 3570), 및 항-CTP 다클론성 Ab를 이용하여 수행되었다 (1 μg의 단백질/ 레인). 감소된 조건하에, FVII-CTP3은 75KDa에서 이주하였고, FVIIa-CTP3은 2개의 주요 밴드로서 이주하였다: 도 26에서 밴드 2 및 3, 각각으로서 표시되는, 50 kDa에서 중쇄, 및 25 kDa에서 경쇄
정제 절차는 불순물을 감소시키면서 FVII-CTP3 부분을 상당히 풍부하게 하였다. 정제 공정 수율은 (ELISA에 따라) 25-30% FVII이었다. 정제 동안 손실된 대부분의 단백질은 낮은 FVII 발색 활성 또는 무 활성을 가졌다. 쿠마씨-염색된 SDS-PAGE에 기반하여, 감소된 FVIIa-CTP3은 예상된 밴드보다 더 많이 함유한다. 대략 ~75 kDa로 이주하는 밴드는 비-활성화된 FVII를 나타낸다 (도 26, 밴드 1). 상기 밴드는, 상이한 γ-카복실화 함량을 반영할, 소수의 MW 차이를 가진 2 밴드로 구성된다. 20 kDa 미만 MW를 가진 추가의 밴드는 관측되었다. 이것은 중쇄의 열화 생성물인 것으로 이전에 보고되었다.
FVII-CTP 3 발색 활성:
인간 풀 정상 혈장에 대하여 FVII-CTP3 수확물, 공정중 분획, 및 정제된 FVII-CTP3의 시험관내 효력의 비교 평가는 상업적으로 입수가능한 발색 활성 테스트 키트, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304)를 이용하여 수행되었다. FVII-CTP3 수확물 및 단백질은 연속으로 희석되었고 효력은 정상 인간 혈장의 참조 제제에 용량-반응 곡선 비교에 의해 평가되었다. FVII-CTP3 정제 이후, 발색 활성은 상당히 개선되었고, 비-활성 분획은 주로 HA 컬럼에 의해 분리되었다 (도 27). 웨스턴 블롯에서 단클론성 항-Gla 항체를 가진 FVII의 검출과 FVII 발색 활성 사이 강한 상관관계는 관측되었다. 수확물에서 EC50 값에 의해 반영된 바와 같이 FVII 발색 활성의 효력은 양쪽 카복실화된 및 비-카복실화된 FVII 분획으로부터 영향받는다. FVII-CTP3 γ-카복실화된 분획의 정제 및 풍부화 이후, 활성은 개선되었고, FVII 활성에 γ-카복실화의 중요한 기여를 입증하였다 (도 27). 상기 파라미터는 적절한 FVII 생체내 활성에 결정적이고 클론 개발 프로그램에서 추가로 다루어질 것이다.
A280에 의한 단백질 결정
FVIIa-CTP3 및 NovoSeven®의 이론적 소광 계수는 ProtParam 알고리즘 (http://web.expasy.org/protparam)을 이용하여 계산되었다. 계산은 아미노산 서열에 기반된다. FVII-CTP3 및 NovoSeven®에 대하여 계산된 소광 계수는 1.186 및 1.406, 각각이다. 이들 값은 280 nm에서 1 g/L의 흡광도를 나타낸다.
2 단백질 사이 소광 계수 차이는, CTP가 방향족 및 시스테인 잔기가 부족하기 때문에, NovoSeven®에 비교된 FVIIa-CTP3의 분자량에서 증가로부터 단독으로 유래하고, 따라서 흡광도에 기여하지 않는다.
A280에 의한 단백질 결정은, VII-Select 컬럼의 용출로부터 시작하는, 최종 FVII에, 그리고 정제된 공정중 샘플에 사용된다.
FVIIa 항원 수준의 결정
FVIIa 항원 수준은 인간 FVIIa ELISA 키트 (IMUBIND, American Diagnostica)를 이용하여 결정되었다. 항원 수준은 각각의 배치당 계산되었다. 그러나, 상기 도구는, 활성 생성물의 양을 나타내지 않았기 때문에, 주사용 용량의 결정에 유용하지 않았다.
FVIIa-Staclot® VIIa-rTF의 응고 검정
FVIIa는 단일-사슬 FVII의 사슬내 절단으로부터 유래된다. 원상태 조직 인자 (TF)는 FVIIa의 보조인자이다. TF에 결합시, FVII는 인자 X의 Xa로의 활성화를 매개하고, 그 동안 자체는 FVIIa로 전환된다. 가용성 조직 인자는 원상태 조직 인자의 세포외 부분이다. 자체-활성화에 의해 FVII를 더 이상 활성화시킬 수 없지만, 조직 인자에 결합된 FVIIa는 FX를 FXa로 활성화시킬 수 있다.
상기 검정에서 사용된 재조합 가용성 조직 인자 (rsTF)는 FVIIa 응고 테스트를 작제하기 위해 FVIIa 특이성을 이용한다. rsTF는, FVIIa, 칼슘 및 인지질의 존재하에, FVII의 FVIIa로의 활성화 없이, 혈장의 응고로 이어진다.
상기 시스템에서 관측된 응고 시간은, 샘플에서 FVII 존재의 간섭 없이, 테스트된 샘플에서 FVIIa 함량과 역전 관계를 갖는다.
검정은 Omri Laboratories (Nes-Ziona, Israel)에 의해 수행되었다. FVIIa 활성은 재구성 이후 NovoSeven® 그리고 각각의 연구에 앞서 FVIIa-CTP3 모두에 대하여 평가되었다. NovoSeven® 활성은 바이알 상에서 보고된 바와 같이 기대된 활성과 상관관계가 없었지만, 차이는 활성 평가에 대한 상이한 접근법 때문일 것이다. 표 39는 단백질 농도 고려 없이 FVIIa 응고 활성 / 용적을 요약한다.
FVIIa-CTP 3 의 특이적 활성
(단백질 농도에 의해 분할된 활성/ml로서 계산되는) FVIIa 특이적 활성은 A280에 기반하여 계산되고 표 40에 나타난다. MW에서 상이한, 2 분자의 특이적 활성을 비교하는 경우, 보상은 활성을 정상화하기 위해 실시되어야 한다 (즉 분자량 차이 때문에, 1 mg의 NovoSeven®내 활성 부위의 수는 FVIIa-CTP3에서 1.185-배 더 높다). 전환 인자의 계산은 하기 방정식으로 나타난다:
FVIIa-CTP 3 PK-PD 연구:
연구 개요
FVIIa-CTP3 및 rhFVIIa (NovoSeven®, NS)는 6.4E6 U/kg 체중 (160,000 U/동물)의 용량으로 C57B FVIII-결핍된 마우스에 단일 정맥내 주사로 투여되었다. 혈액 샘플은 투여후 대안적으로 0.166, 0.5, 2, 4, 8, 12, 24, 34, 48, 58, 및 72 시간에서 4 마우스로부터 안와후로 채혈되었다 (표 41). 시트레이트화된 혈장 (0.32%)은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었다. FVIIa 응고 활성 수준은 평가되었고, 상세한 PK 분석은 수행되었다. 연구는 Omri Laboratories (Nes-Ziona, Israel)에 의해 수행되었다.
FVIII-결핍된 마우스에서 FVIIa-CTP 3 PK 프로파일
혈액 샘플내 FVIIa 활성은 Staclot® VIIa-rTF 키트 (Stago, Parsippany, NJ)를 이용하여 정량화되었다. 약동학적 프로파일은 각각의 단백질에 대하여 계산되었고 각각의 시점에서 4 동물의 평균을 나타낸다. 도 28은 실험 내내 FVIIa의 PK 프로파일을 나타낸다. FVIIa 회수는 표 43에 나타난다. PK 파라미터의 요약은 표 44에 나타난다.
표 42는 한쪽 NovoSeven® 또는 FVIIa-CTP3의 투여 이후 응고 활성 값을 요약한다. FVIIa-CTP3 및 NovoSeven®은 투여후 반 시간에서 최대 활성을 도달하였다. NovoSeven®의 최고 활성 값은 FVIIa-CTP3의 최대 활성 값의 겨우 43%를 도달하였다. FVIIa-CTP3 응고 활성은, 연신된 활성을 입증하는, 시간의 더 오랜 기간 동안 유지되었다. NovoSeven®-치료된 마우스용 응고 활성은 12 시간보다 나중의 시점에서 검출불가능하였고, 반면에 FVII-CTP3 치료된 마우스는 투여후 48 시간에서 측정가능한 활성을 계속 유지하였다 (표 42 및 도 28).
FVIIa에 3 탠덤 CTP 카피의 첨가는, 시험관내 분석에 기반하여 기대된 활성에 비교된 그리고 투여후 최고 활성에 의해 측정된 경우, 100%만큼 회수를 상승시켰고 (표 43), 반감기 및 평균 상주 시간 (MRT)을 5-배 증가시켰다. 노출 시간 (AUC)은 3-배 증가되었다 (표 44).
트롬빈 생성 검정 (TGA)
트롬빈의 생성은 응고 캐스케이드의 근본적인 부분이고 그 자체로 얼마나 양호하게 특정한 개체가 트롬빈을 생성할 수 있는지의 추정은 출혈 또는 혈전증의 한쪽 위험과 상관할 수 있다. 트롬빈 생성을 분석하는 경우 통상적으로 측정된 변수는 하기를 포함한다: 지체 시간, 피크 트롬빈 생성에 대한 시간, 피크, 내인성 트롬빈 잠재력 [ETP] (즉, 곡선 및 꼬리하 면적), 트롬보그램 (thrombogram; "TG")의 시간 과정. 지체 시간 이후, 트롬빈의 분출이 관측된다. 그러나, 모든 트롬빈의 95% 초과가 아직 형성되지 않은 경우, 응고는 지체 시간의 마지막에서 발생한다. 트롬빈 생성 검정은, 인간 혈우병 혈장으로 보충된 트롬비노스코프 (Thrombinoscope) 시약을 이용하여, Omri Laboratories에서 수행되었다. TGA는, NovoSeven® 및 FVIIa-CTP3의 주사로부터 유래된, 마우스 혈장에서 응고 능력을 반영한다. 도 29는 한쪽 FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®의 투여 이후 마우스 혈장에 대하여 TGA 파라미터 값을 나타낸다. FVIIa-CTP3 투여 이후, 3 파라미터 (트롬빈 생성의 속도, 생성된 트롬빈의 최대 양 및 KIIa)는 NovoSeven® 치료에 대한 FVII-CTP3의 이점을 입증한다. 이것은 추가로 NovoSeven®에 비교된 경우 FVII-CTP3의 잠재적인 장기-작용성 우월성의 개념을 강화시킨다.
FVIIa-CTP 3 꼬리 바인 절단 (TVT) 연구:
연구 개요
FVIIa-CTP3에 대한 PK/PD 테스트로부터 수득된 데이터는 FVIIa-CTP3의 기능성에 대한 이해를 제공하였고, FVIIa-CTP3이 NovoSeven®과 비교된 경우 약동학적 이점을 가졌다는 것을 입증하였다. 그러나, 생체내 응괴를 유도하는 단백질의 능력은, 외상성 사례 이후 아직 입증되지 않았다. 출혈을 중단시키는 FVIIa-CTP3의 능력을 평가하기 위해, 동일한 FVIII-결핍된 마우스 모델은 출혈 공격에 이용되었다.
FVIII-결핍된 마우스는 FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®의 단일 정맥내 주사가 투여되었다. 마우스는, FVIIa 응괴 활성 검정에서 평가된 각각의 약물의 효력에 따라 계산된, 등가 FVIIa 활성 (1.6E05 유닛, 200 μl)을 제공하였던 양의 약물로 복용되었다 (표 45). 투여된 용량은 FVIIa-CTP3의 감소된 활성 때문에 9 mg/kg의 NovoSeven®, 및 40 mg/kg의 FVII-CTP3이었다. 대조 그룹은 200 μl 비히클로 주사되었다.
꼬리 정맥은 투여후 15 분 (주사 1), 24 시간 (주사 2) 또는 48 시간 (주사 3) 꼬리 끝에서 2.7 cm 절단되었고, 마우스 생존은 24 시간 동안 기록되었다.
단백질 농도는 A280에 의해 결정되었다.
결과
3 주사 (5 동물 x 3 주사)에 대하여 비히클-주사된 대조 그룹으로부터 데이터는 요약되었고 도 30에 나타난다. 30% 생존은 꼬리 정맥 절단 이후 24 시간에 관측되었다.
NovoSeven® 및 FVIIa-CTP3-치료된 마우스는 FVIIa 투여 이후 15 분에 수행된 꼬리 정맥 절단 이후 적절한 지혈 활성을 입증하였다. 100% 생존 속도는 FVIIa-CTP3 및 NovoSeven® 치료된 동물에서 관측되었다 (도 30).
PK/PD 연구에서 입증되었던 FVII-CTP3의 감소된 청소율은 투여후 24 시간에 수행된 꼬리 정맥 절단 이후 가장 명확히 인정된다. NovoSeven®의 생존 속도에서 쇠퇴는 관측된다. 대조 그룹에 유사하게, 50% 사망은 10 시간 이내 관측된다. 그 동안에, 90%의 FVIIa-CTP3 치료된 마우스는 생존하였다 (도 30). 상기 결과는 FVIIa-CTP3 치료의 장기-지속성 효능을 강조한다.
투여 이후 48 시간에, 생존 속도의 쇠퇴는 한쪽 FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®로 치료된 그룹에서 입증된다 (도 30C). FVIIa-CTP 마우스에서 약간의 개선은 관측되었지만; 차이는 통계적 유의도를 도달하지 않았다.
논의:
재조합 단백질에 CTP 융합은 비교할만한 활성을 유지하면서 단백질의 순환 반감기를 확장시킨다. 단백질의 감소된 청소능 미만 70 KD의 역치 크기 초과의 기전이 신장 청소능에 관하여 양호하게 이해되는 동안, 추가의 보호는 CTP 융합 이후 달성된다. CTP 융합은 단백질 차폐 주변을 휩쓸고 단백분해 절단으로부터 보호하고, 고도로 음전하 때문에 그것의 방사상 분자량을 증가시키고 그리고 간 청소능 수용체에 그것의 친화도를 감소시킨다고 여겨진다.
본 연구는 단백질 반감기 및 청소능 면에서 FVII에 CTP 융합의 영향에 관한 특이적 이해 제공을 목표로 하였고 또한 상기 변형 이후 그것의 특이적 활성의 패러다임을 다루는 것을 목표로 하였다. FVIII-결핍된 마우스는 유사한 용량 (유닛 기반)으로 FVIIa-CTP3 또는 재조합 상업적 FVIIa (NovoSeven®)의 단일 IV 주사로 투여되었고 PK 활성-기반 분석은 수행되었다. FVIIa-CTP3은 그것의 반감기 및 AUC, 각각에서 5- 및 3.5-배수 증가만큼 반영된 바와 같이 우월한 장수를 입증하였다. A280에 의해 측정된 단백질 농도로 분할된 Staclot® 활성 키트에 의해 계산된 바와 같이 특이적 활성 (U/mg)의 FVIIa-CTP는 NovoSeven®의 특이적 활성보다 4-5 배 낮은 것으로 나타났다.
CTP가 생체내 FVIIa의 지혈 효과에 얼마나 영향을 주는지의 조건하에 만들기 위해, 출혈을 감소시키는 FVIIa-CTP3의 능력은 조사되었다. 혈우병 마우스 모델 중 꼬리 정맥 절단 출혈 모델에서, rFVIIa 투여는 공격받은 동물의 생존 속도를 개선할 수 있고 사망에 이르는 그것의 출혈을 피할 수 있다. 본 명세서에서 기재된 연구에서, 동물은 FVIIa-CTP3 또는 NovoSeven®로 투여되었다. 절단이 투여후 0.25 시간에 수행되었던 경우 양쪽 분자는 항상성을 유지할 수 있었다. 꼬리 절단이 투여후 24 시간에 수행되었던 경우 활성의 상당히 장기적인 지속기간은 FVIIa-CTP3-치료된 그룹에 대하여 입증되었다. 비히클-치료된 그룹의 생존 속도는 기대된 것보다 더 높았고 이전의 연구에서 수득된 것보다 더 높았다 (이전의 연구에서 50% 대 20%, 데이터 도시되지 않음). 치료받은 동물의 퍼센트 생존은 추가로, 투여후 36 시간에서 포함하여, 조기 시점에서 평가된다.
결론적으로, FVIIa-CTP3이 NovoSeven®에 비교된 경우 지혈 효과의 더 오랜 지속기간으로 해석하는 혈우병 마우스에서 활성의 증가된 지속기간을 갖는다는 것이 입증되었다. 모집된 데이터는 FVII에 CTP의 융합이 혈우병을 가진 환자에 있어서 예방적 치료를 상당히 개선하는 잠재력을 가진 기술이라는 것을 시사한다.
실시예 7: SD 랫트에 단일 IV 또는 SC 주사 이후 정제된 FVII - CTP 3 대 FVII -CTP 5 프로파일의 비교 평가
연구 목적
2 연구가 수행되었다:
제1 연구 목적은, 50μg/동물의 단일 정맥내 투여 이후, 숫컷 스프래그 다우리 랫트에서 FVII select- 및 HA-컬럼 정제 이후 rFVII-CTP3 대 rFVII- CTP5의 약동학적 파라미터를 결정하는 것이었다.
제2 연구에서, rFVII-CTP3-HA 대 rFVII-CTP5-HA 약동학적 파라미터는 100 μg/동물의 단일 정맥내 또는 피하 투여 이후 숫컷 스프래그 다우리 랫트에서 검사되었다.
결과
FVII-CTP 3 및 FVII-CTP 5 항원 수준의 결정
FVII 항원 수준은 인간 FVII ELISA 키트 (Zymotest HyPhen)을 이용하여 결정되었다 (표 46). T
표 46. 3 독립 시행의 평균인 계산된 단백질 농도를 요약한다.
검사된 샘플의 웨스턴 블롯 분석
FVII-CTP3 , 5 샘플은 정확성 플러스 이중 컬러 단백질 마커 (Bio-Rad)를 이용하여 4-12% bisTrisgel (NuPage , invitrogene)상에서 장입되었다. SDS-PAGE 분석은 다클론성 항 FVII Ab (R&D systems), 항 CTP 다클론성 Ab (Adar Biotech Production) 또는 항 Gla Ab (American Diagnostica)를 이용하는 웨스턴 면역-블롯에 의해 수행되었다. 요약하면, 3 및 5 CTP에 융합된 FVII는 80 및 100kDa, 각각에서 이주하였다 (참조 도 31).
FVII 시험관내 효력의 비교 평가
Sheba medical center, the national coagulation center에서 수행된, FVII 활성 검정은 인자 VII (Siemens)에서 결핍된 면역흡착된 혈장을 이용하는 PT 기반 검정이다. PT 시약은 인노빈이고 검정은 Sysmex CA 1500 기기에서 수행된다. FVII 정상 범위는 55-145% 이내이다. 샘플 활성은 표 47에서 요약된다.
신체에서 순환 FVII의 정상 수준은 대략 0.5μg/ml이다. FVII-CTP3 및 FVII-CTP5는 정상 인간 풀 혈장에 대하여 그것의 응고 활성에서 약 5 배수 감소를 나타낸다.
약동학적 연구
2 약동학적 연구는 FVII-CTP3 및 FVII-CTP5 (FVII select 및 FVII HA 컬럼 이후) 약동학 (PK) 프로파일 및 파라미터를 결정하기 위해 수행되었다. 제1 연구에서, FVII select/ HA 정제 이후 FVII-CTP3, 및 FVII-CTP5는 50 μg/랫트의 용량으로 스프래그 다우리 랫트 (6 랫트 / 서브스턴스)에 단일 정맥내 주사로 투여되었다.
혈액 샘플은 투여후 대안적으로 0.083, 0.5 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96 및 120 시간에서 3 랫트로부터 안와후 채혈되었다. 시트레이트화된 혈장 (0.38%)은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20에 저장되었다.
제2 연구에서, HA 컬럼 이후 샘플만이 테스트되었다. 이들 샘플은 100 μg/랫트의 용량을 이용하여 스프래그 다우리 랫트 (6 랫트 / 서브스턴스)에 단일 정맥내 또는 피하 주사로 투여되었다. 혈액 샘플은 상기 제1 연구에서와 동일한 시점 및 조건에서 수집되었다.
이들 2 연구 사이 주요 차이는 복용량 및 투여의 경로이다. 제1 연구에서, 랫트는 50 μg＼랫트로 IV 주사되었고, 반면에 제2 연구에서, 랫트는 100 μg＼랫트 (총 500 μg/kg; 랫트는 200 g이다)로 IV 또는 SC 주사되었다. 복용량에서 증가는 투여의 유형에서 변화 때문이고; SC 투여는 IV 투여에 유사한 효과를 달성하기 위해 더 많은 양을 요구한다.
PK 연구의 분석
혈장 샘플내 FVII 농도는 인간 FVII Elisa 키트 (zymutest FVII-Biophen)을 이용하여 정량화되었다. 약동학적 프로파일은 계산되었고 각각의 시점에서 3 동물에 대하여 평균을 반영한다. 말단 반감기 값은 PK 솔루션스 2.0 소프트웨어를 이용하여 계산되었다. 아래 표는 상이한 샘플링 시점에서 계산된 FVII 농도를 요약한다. PK 프로파일 및 PK 파라미터의 요약은 아래 표에 나타난다.
표 50. 제1 약동학적 연구 (FVII select 대 FVII HA) -FVII 농도 (ng＼ml).
표 51. 제2 약동학적 연구 (IV 대 SC) -FVII 농도 (ng＼ml).
표 52. PK 분석- 제1 약동학적 연구 (FVII S 대 HA).
5 CTP의 첨가는 3 CTPs에 비교된 FVII 반감기를 연신시켰다. 5 CTP의 양쪽 형태 (즉 FVIIS 및 FVII HA)는 오랜 시점 (96 및 120 시간)에서 검출되었고, 반면에 FVII-3 CTP HA 및 FVIIS -3 CTP는 72 시간 및 96 시간, 각각까지 검출되었다. 상기 사실에 기반하여, FVII-5 CTPs의 반감기는 3CTPs 변이체보다 더 길다 (참조 도 32). 동일한 시점 (8-72 시간)에서 모든 검사된 재료 (3 및 5 CTPs)의 반감기 비교는, 5 CTP가 상당히 더 길어도, 반감기가 유사하다는 것을 보여주었다 (도 32).
표 53: PK 분석 - 제2 약동학적 연구-(IV 대 SC).
재차, 제1 연구에서 관측된 바와 같이, 5 CTPs의 첨가는, 초기 및 말단 반감기에서 그리고 양쪽 투여 방식 (IV 및 SC, 참조 도 33)에서 둘 모두, 3 CTP 첨가에 비교된 경우 FVII 반감기를 연신시켰다. 기대된 대로, SC 투여 이후, FVII는 IV 투여된 경우에 비교된 바와 같이 나중 시점에 혈액에서 먼저 검출되었다.
상기에서, 2 PK 연구는 요약되었다. 제1 연구의 주요 목적은 2 상이한 컬럼: FVII select 및 FVII HA 이후 FVII-3CTP와 FVII-5 CTP 사이의 차이를 체크하는 것이었다. 이전의 연구에서, 수확물 대 정제된 단백질은 체크되었고 FVII의 3 및 5 CTP 버전 사이의 차이가 수확물이 랫트에 주사된 경우 더 컸다는 것이 밝혀졌다.
양쪽 컬럼 이후 FVII 3＼5 CTP의 결과 사이 유의차가 없었고, 따라서 제2 연구 (IV 대 SC)에서 FVII HA 3＼5 CTP를 주사하는 것이 결정되었다.
실시예 8: 피하 주사 이후 FVIII 결핍된 마우스에서 FVIIa - CTP 3 (MOD-5014) 생존 연구
연구 목적
피하 투여 이후, 꼬리 정맥 절단 연구에서 NovoSeven®, MOD-5014 (FVIIa-CTP3) 및 MOD-5019 (FVIIa-CTP5)의 효능을 평가하기 위해.
FVIIa-CTP 3 (MOD-5014) 및 FVIIa-CTP 5 (MOD 5019) 분석적 특성:
A280에 의한 단백질 결정
NovoSeven®의 이론적 소광 계수는 ProtParam 알고리즘 (http://web.expasy.org/protparam)을 이용하여 계산되었다. 계산은 아미노산 서열에 기반된다. NovoSeven®에 대하여 계산된 소광 계수는 1.406이고, MOD-5019에 대하여는 1.075이다 (값은 280 nm에서 1 g/L의 흡광도를 나타낸다). MOD-5014의 소광 계수는 Mscan에서 아미노산 분석에 의해 결정되었다. MOD-5014에 대하여 소광 계수는 1.27이다.
FVIIa - STACLOT VIIa-rTF의 응고 검정
FVIIa는 단일-사슬 FVII의 사슬내 절단으로부터 유래된다. 원상태 조직 인자 (TF)는, TF에 결합시, FVIIa의 보조인자이고, FVII는 인자 X의 Xa로의 활성화를 매개하고, 반면에 자체는 FVIIa로 전환된다. 가용성 조직 인자는 원상태 조직 인자의 추가의 세포 부분이다. 자체 활성화에 의해 FVII를 더 이상 활성화시킬 수 없지만, 조직 인자에 결합된 FVIIa는 FX를 FXa로 활성화시킬 수 있다.
상기 검정에서 사용된 재조합 가용성 조직 인자 (rsTF)는 FVIIa 응고 테스트를 작제하기 위해 FVIIa 특이성을 이용중이다. 재조합 가용성 조직 인자 (rsTF)는, FVIIa, 칼슘 및 인지질의 존재하에 FVII의 FVIIa로의 활성화 없이 혈장의 응고를 생산한다.
상기 시스템에서 관측된 응고 시간은, 샘플에서 FVII 존재의 간섭 없이, 테스트된 샘플에서 FVIIa 함량과 역전 관계를 갖는다.
FVIIa 활성은 재구성된 NovoSeven®에 대하여, 그리고 MOD-5014 및 MOD-5019에 대하여 각각의 연구에 앞서 평가되었다.
(단백질 농도에 의해 분할된 활성/ ml로서 계산되는) FVIIa 특이적 활성은 A280에 기반하여 계산되었고 표 54에 나타난다. 분자량이 상이한, 2 분자의 특이적 활성을 비교한 경우, 보상은 활성을 정상화하기 위해 실시되어야 한다 (즉 분자량 차이 때문에, 1 mg의 NovoSeven®내 활성 부위의 수는 MOD-5014에서보다 1.185 배 더 높고 MOD-5019보다 1.307 배 더 높다). 그러므로, 전환 인자의 계산은 하기 식으로 나타난다:
연구 개요
가장 유의미한 측정은, 외상성 사례 이후, 생체내 응괴를 유도하는 단백질의 능력이다. 출혈을 멈추는 MOD-5014의 능력을 평가하기 위해, 동일한 FVIII 결핍된 마우스 모델은 출혈 공격에 이용되었다.
FVIII 결핍된 마우스는 MOD-5014, MOD-5019 또는 NovoSeven®의 단일 피하 주사로 투여되었다. 그룹 A 및 B는, FVIIa 활성으로서 동등량으로, NovoSeven® 및 MOD-5014 각각으로 복용되었다. 그룹 C는, 결정적 인자 (단백질의 활성 또는 양)을 평가하기 위해, MOD-5014로서 동등량 FVIIa 단백질로 MOD-5019로 복용되었다. 투여된 용량은 4.2 mg/kg의 NovoSeven®, 및 8.6 mg/kg의 MOD-5014 및 MOD-5019이었다. 꼬리 정맥은 투여후 12 시간에 꼬리 끝에서 2.7cm 절단되었고, 마우스 생존은 24 시간 동안 기록되었다.
TVT후 24 시간, NovoSeven® 주사된 마우스의 겨우 11%가 생존하였다. MOD-5014의 30% 및 MOD-5019의 40%가 상기 시점까지 생존하였다. 놀랍게도, 피하로 주사된 MOD-5014 및 MOD-5019는 NovoSeven®에 비교하여 개선된 마우스 생존을 보여주었다.
다른 응고 인자처럼, 인자 VIIa는, 혈액 스트림에서 직접적으로 이용가능해지기 위해, 정상으로 정맥내 주사된다. 그러나, 본 발명은 본 명세서에서 제공된 조성물이 놀랍게도 SC 투여 이후 혈류 속에 더 효과적으로 흡수된다는 것을 보여준다. 피하로 FVIIa를 투여할 수 있는 것은 예방적 적용에 사용될 수 있음에 따라 이점으로서 작용한다. 피하 주사는 또한 환자가 자기-주사하기 훨씬 더 쉽고, 환자가 매우 어리고 그들의 정맥이 작고 찾기 어려운 경우 이점이다.
그러므로, 피하 적용은 예방적 치료에 사용될 수 있다.
실시예 9: SD 랫트에서 피하 투여 이후 재조합 MOD-5014 대 NovoSeven ®의 비교 PK-PD 연구
연구 목적
단일 SC 투여 이후 SD 랫트에서 MOD-5014 대 상업적 rFVIIa의 약동학적 및 약력학적 파라미터를 결정하기 위해.
그것의 약동학 파라미터에 의해 2개의 상이한 클론 (클론 번호 28 대 61)로부터 유래된 MOD-5014 생성물을 함유하는 2 독립 실험 (05010 & 05034)를 비교하기 위해.
실험적 방법
동물
주사가 시작하기 적어도 4 일 전에, 24 숫컷 SD 랫트는 Harlan Laboratories Israel, Ltd로부터 도착하였다. 동물은 연구 개시에서 ~200 gr로 건강한 어린 성체이었다. 치료 개시의 시간에서 동물의 체중 변동은 각각의 성별의 평균 중량의 ± 20%를 초과하지 않아야 한다. 상기 연구에서 사용된 동물의 건강 상황은 도착시 검사된다. 양호한 건강의 동물만이 실험실 조건에 순응되고 연구에서 사용된다.
FVIIa - STACLOT VIIa-Rtf의 응고 검정
상기 검정에서 사용된 재조합 가용성 조직 인자 (rsTF)는 FVIIa 응고 테스트를 작제하기 위해 FVIIa 특이성을 이용중이다. rsTF는, FVIIa, 칼슘 및 인지질의 존재하에, FVII의 FVIIa로의 활성화 없이, 혈장의 응고를 생산한다.
상기 시스템에서 관측된 응고 시간은, 샘플에서 FVII 존재의 간섭 없이, 테스트된 샘플에서 FVIIa 함량과 역전 관계를 갖는다.
FVIIa 활성은 재구성 이후 NovoSeven® 및 각각의 연구에 앞서 MOD-5014 둘 모두에 대하여 평가되었다. FVIIa 특이적 활성은 A280에 기반하여 계산되었다. MW이 상이한, 2 분자의 특이적 활성을 비교하는 경우, 보상은 활성을 정상화하기 위해 실시되어야 한다 (즉 분자량 차이 때문에, 1 mg의 NovoSeven®내 활성 부위의 수는 MOD-5014에서보다 1.185 배 더 높다).
PK 솔버(solver) 소프트웨어
약동학적 파라미터는 PK 솔버 소프트웨어를 이용하여 계산되었다. IV 투여 곡선은 2 구획성 CA 볼러스로서 분석하였고, SC 투여는 NCA 혈관외- Log 선형 사다리꼴 분석으로서 분석되었다. 반감기, AUC, 청소능 및 용적 분포 사양은 계산되었고 출력 파라미터는 실험의 그룹 사이 비교에서 연구되었다.
실험 재료
실험 번호 05010:
A. NovoSeven ® RT : A280에 의한 (31.7.12*상에서 제조된 Lot # AU61553) FVIIa 농도: 0.86 mg/ml. FVIIa Staclot 활성 검정: 56,867 U/mg. 주사된 용량: 946μg/kg. *NovoSeven® 분취액의 풀, 모두 동일한 Lot 번호로부터.
B. 클론 28: MOD-5014 RS12-001: A280에 기반된 0.77 mg/ml**. FVIIa Staclot 활성 검정: 34,162 U/mg. 주사된 용량: 850μg FVIIa/kg.
실험 번호 05034:
A. NovoSeven ® RT: A280에 의한 (1.1.13상에서 제조된 Lot #AU61347) FVIIa 농도: 멸균된 NS 완충액으로 0.4 mg/ml로 희석된, 0.82mg/ml. FVIIa Staclot 활성 검정: 55,688 U/mg. 주사된 용량: 360μg/kg 및 20,047.7 U/kg.
B. 클론 61: MOD-5014 배치 75: 제형 완충액으로 0.89 mg/ml로 희석된, A280에 기반된 1.9 mg/ml**. 주사된 용량: 20,047.7 U/kg. FVIIa 응고 활성: FVIIa Staclot 활성 검정에 기반된 25,002* U/mg.
C. 클론 61: MOD-5014 배치 81A: 제형 완충액으로 0.4 mg/ml로 희석된, A280에 기반된 (연구 일의 아침에 여과된 그리고 280nm에서 재-측정된) 2.36 mg/ml. 주사된 용량: 360μgFVIIa/kg. FVIIa 응고 활성: FVIIa Staclot 활성 검정에 기반된 24943U/mg.
D. 클론 61: MOD-5014 배치 81A: 제형 완충액으로 0.89 mg/ml로 희석된, A280에 기반된 2.36 mg/ml. 주사된 용량: 20,047.7 U/kg. FVIIa 응고 활성: FVIIa Staclot 활성 검정에 기반된 24,943U/mg.
연구 개요
실험 번호 05010
MOD-5014 및 NovoSeven®은 0.9 mg/kg 체중의 용량으로 SD 랫트에 단일 정맥내 또는 피하 주사로 투여되었다. 혈액 샘플은 투여후 대안적으로 0.5, 4, 8, 12, 24, 34, 48 및 58 시간에서 3 랫트로부터 안와후에서 채혈되었다. 시트레이트화된 혈장 (0.32%)은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었다. 연구는 "Science in Action", Nes-Ziona에서 수행되었다. FVIIa 응고 활성 수준은 평가되었고 상세한 PK 분석은 Prolor-Biotech에서 수행되었다.
실험 번호 05034
MOD-5014 및 NovoSeven®은 0.9 mg/kg 체중의 용량으로 SD 랫트에 단일 피하 주사로 투여되었다. 혈액 샘플은 투여후 대안적으로 0.5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48 및 72 시간에 3 랫트로부터 안와후에서 채혈되었다. 시트레이트화된 혈장 (0.32%)은 샘플링 직후 제조되었고 분석까지 -20℃에서 저장되었다. 연구는 "Science in Action", Nes-Ziona에서 수행되었다.
FVIIa 응고 활성 수준은 평가되었고 상세한 PK 분석은 Prolor-Biotech에서 수행되었다.
결과
혈액 샘플내 FVIIa 활성은 STACLOT VIIa-rTF 키트 (Stago)를 이용하여 정량화되었다. 약동학적 프로파일은 각각의 단백질에 대하여 계산되었고 각각의 시점에서 3 동물의 평균이다.
실험 번호 05010
도 35는 한쪽 NovoSeven® 또는 MOD-5014의 IV 및 SC 투여 이후 FVIIa의 PK 프로파일을 나타낸다. 각각의 시점에 대하여 FVIIa 활성 값의 요약은 표 59에서 나타난다. IV 및 SC 투여는 이전의 결과와 유사한 도 35에서 나타난 바와 같이 상이한 PK 패턴을 갖는다. IV 주사 이후 Cmax는, (0.5시간에서 측정된, 표 59 및 표 60) 혈액에서 투여 직후 약물의 존재 때문에, SC 주사 이후 수득된 것보다 더 높다. 그러나, SC 투여 약물 분자가 세포내 매트릭스 및 조직으로 이동한 이후, 따라서 Cmax는 주사로부터 단지 2시간 이후 측정될 수 있다. SC 투여 이후 약물의 총 회수는 IV 주사 이후 Cmax 값 미만이다.
주사후 8시간에, Novoseven®은 한쪽 IV 또는 SC, (도35)에 의해 주사된 경우 동일한 PK 패턴을 명시하였다. 또한, NovoSeven®-치료된 마우스에 대하여 응고 활성은 12 시간보다 나중 시점에서 검출불가능하였고, 반면에 MOD-5014-치료된 랫트는 투여후 58 시간에서 측정가능한 활성을 계속 유지하였다 (표 59 및 도 35).
표 59. IV 또는 SC 투여 이후 MOD-5014 대 NovoSeven®의 FVIIa 응고 활성
표 60. IV 또는 SC 투여 이후 MOD-5014 대 NovoSeven®의 PK 파라미터
실험 번호 05034
도 36은 한쪽 NovoSeven® 또는 MOD-5017의 SC 투여 이후 FVII의 PK 프로파일을 나타낸다. 클론 번호 61의 2개의 상이한 배치 (#75 및 #81)은, NovoSeven®에 비교된, 동일한 농도 또는 동일한 활성 유닛에서 검사되었다. 각각의 시점에 대하여 활성 값의 요약은 표 61에 나타난다.
결과는 이전의 실험에 대응하는 SC 투여 이후 유사한 PK 패턴을 나타낸다. 또한, NovoSeven® 치료된 랫트에 대하여 응고 활성은 12 시간보다 나중 시점에서 검출불가능하였고, 반면에 MOD-5014 치료된 랫트는 투여후 24 시간에서 측정가능한 활성을 계속 유지하였다 (표 61 및 도 36; 및 배경 감소 이후: 56 mU/ml (8, 12 시간) 또는 32 mU/ml (0.5, 2, 6, 14 시간)).
클론 번호 61 배치 #81 (D) Cmax (1,301mU/ml)는, 비록 이들이 동일한 유닛 활성에 의해 모두 주사되었어도, 클론 번호 61 배치 #75 (B) 및 NovoSeven® (A)의 Cmax 값 미만이었다 (3,521mU/ml 및 5,908mU/ml 각각) (표 61). 그러나, 배치 #75 (B) 및 #81 (D)는 주사 이후 8시간에 측정된 동일한 활성 유닛 (559 mU/ml 및 478 mU/ml 각각)을 갖는다 (표 61 및 표 62; 및 배경 감소 이후: 56 mU/ml (8, 12 시간) 또는 32 mU/ml (0.5, 2, 6, 14 시간)).
표 61: 단일 SC 투여 이후 MOD-5014 (클론 61 #75, #81) 대 NovoSeven®의 FVIIa 응고 활성.
표 62: 단일 SC 투여 이후 MOD-5014 (클론 61 #75, #81) 대 NovoSeven®의 PK 파라미터.
상기 보고는 2 PK 연구; 05010 & 05034를 요약하였다. 결과는 피하 투여에서 단백질 반감기 및 청소능 면에서 FVII에 CTP 융합의 영향에 관한 특이적 이해를 제공하고 상기 변형 이후 그것의 특이적 활성의 패러다임을 다룬다. 상기 연구에서, SD 랫트는, 재조합 상업적 FVIIa (NovoSeven®)에 비교된, 2 클론, 및 2개의 상이한 배치로부터 유래된 MOD-5014의 단일 SC 주사로 투여되었다. 성분은 유사한 FVIIa 농도 (μg/Kg)에서 또는 동일한 활성 수준 (U/Kg)에서 주사되었고 PK 활성 기반 분석은 수행되었다.
제1 연구의 목적은 IV 및 SC 투여 이후 상이한 PK 파라미터를 증명하는 것이었다. 상기 연구에 기반하여 IV 또는 SC 투여 이후 측정된 PK 패턴 사이 차이가 있다는 것을 결론낼 수 있다. 7.78 시간의 t1/ 2은 MOD-5014 SC 주사 이후 측정하였고, 단지 4.2 시간은 IV 주사 이후 측정하였다. AUC 값은 표 60과 동일하였다.
제2 연구는 그러나, NovoSeven®에 비교된, 동일한 FVIIa 농도에 의해 또는 똑같은 활성 유닛에서 주사되었던, MOD-5014 클론 번호 61의 2 배치 사이 차이에 집중하였다. 상기 연구에서 클론 61 배치 #75가 배치 #81보다 더 나은 PK 파라미터를 명시하였다. 동일한 유닛 활성 수준에 의해 주사되었던, 배치 #81은 미공지된 이유로 더 낮은 Cmax를 가졌다. 또한, 동일한 Cmax는, 2 활성 값 사이 2.5 배 대신에, (FVIIa 농도에 의해 또는 유닛 활성에 의해) 2개의 상이한 용량에서 클론 61 배치 #81을 주사한 경우 측정되었다. 함께 양쪽 연구의 분석 이후, 클론 28이 SC 주사 이후 클론 61 #75 (더 나은 배치)인 장기적인 t1/2 파라미터를 명시하였다는 것을 결론낼 수 있다 (7.78시간 및 5.7시간 각각, 표 62). 결과는 비유사 시점 샘플이, PK 곡선에서 변동으로 이어지는, 상이한 PK 패턴을 창출한다는 것을 보여준다. 곡선의 패턴은 혈액에서 약물 행동에 대하여 더 많이 우리를 교시할 수 있다. 따라서, Baxter에 의해 검출된 것과 유사한 시점 (0, 0.5, 2, 6, 8, 12, 24, 34, 48, 72시간)을 결정하기로 결심했다. 또한, 05010 실험에서 FVIIa 농도는 너무 높았었고, 하기 SC 실험 (05034)에서 수정되었다. 미래의 PK 연구를 위하여, 용량으로 360μg FVIIa/kg에서 성분을 주사하도록 결정되었다.
실시예 10: 생체내 인자 VIIa 평가용 모델로서 와파린 치료된 랫트
재료 & 방법
PT 평가: SD 랫트는 10mg/Kg의 와파린이 경구로 제공되었고 지정된 시점에서 혈장은 수집되었고 프로트롬빈 시간 (PT)은 표준 절차를 이용하여 측정되었다. 장기간 지혈 효과를 평가하기 위해 위약, NovoSeven® 또는 MOD-5014는 와파린 치료된 동물에 주사되었고 PT는 측정되었다.
꼬리 자르기 공격: 와파린 치료된 동물은 지정된 시점에서 위약, NovoSeven® 또는 MOD-5014로 주사되었고 동물은 꼬리 끝의 (끝으로부터 0.5 cm) 완전한 절단에 의해 공격받았고 출혈 강도는 절단후 30분 동안 gr로 측정되었다.
결과
SD-랫트에 와파린 투여는 PT 및 aPTT의 연장을 초래한다.
와파린은 비타민 K의 감소를 예방하고, 결과적으로 혈액에서 비타민 K 의존적 응고 인자 농도를 감소시킨다.
숫컷 SD 랫트는 와파린의 경구 치료를 받았다. 비타민 K 의존적 응고 인자의 감소는 PT 및 aPTT의 연장이 동반되었다. 결과는 도 37에서 나타난다.
혈액으로부터 응고-인자 세정 제거 때문에, PT 및 aPTT 값은 와파린 투여 이후 최초 48 시간에서 서서히 증가한다. 효과는 그 이후 감소한다.
와파린 효과는 NovoSeven® 또는 MOD-5014로 급성 IV 치료에 의해 회복될 수 있다.
SD-랫트는 와파린의 사전치료를 받았다. 24 시간 후, MOD-5014, NovoSeven® 또는 완충액은 정맥내 주사되었고 혈액 샘플은 주사후 15 분에 채혈되었다. 주사후 15분에, MOD-5014 뿐만 아니라 NovoSeven®은 PT 값을 정상으로 성공적으로 회복하였다 (도 38).
와파린 치료된 랫트에서 PT 값으로 MOD-5014 및 NovoSeven®의 용량 증가의 효과.
SD-랫트는 100-1000 μg/Kg MOD-5014 또는 NoveSeven IV 주사와 병렬적으로 10mg/Kg 와파린으로 치료되었다. 치료후 24 시간에, PT는 혈장 샘플에서 결정되었다. PT 결정 이전 24 시간에 주사된 NovoSeven®은 테스트된 모든 용량에서 PT 값으로 임의의 상당한 효과를 갖지 않았다. 그에 반해서, MOD-5014는 투여 이후 24 시간에 용량-반응 행동을 보여준다 (도 39).
SD-랫트는 1000 μg/Kg MOD-5014 또는 NoveSeven IV 주사와 병렬적으로 10mg/Kg 와파린으로 치료되었다. PT는 치료후 10, 24, 36 및 48 시간에 혈장 샘플에서 결정되었다. MOD-5014는 PT 값을 정상으로 투여후 최대 48 시간에 회복하였고, 반면에 NovoSeven®의 효과는 24 시간 이후 더 이상 존재하지 않는다 (도 40).
MOD-5014의 장기 지속성 효과는 와파린 주사된 랫트에서 꼬리 자르기 검정에 의해 입증될 수 있다
SD-랫트는 꼬리 자르기 이전 24 시간에 와파린으로 치료되었다. 랫트는 마취되었고 따뜻한 패드위에 배치되었고, 꼬리 끝은 37℃ 염수에 배치되었고 꼬리의 완전한 절단은 꼬리 끝으로부터 0.5 cm에 수행되었다. 혈액은 30 분 동안 수집되었고 혈액 손실은 중량에 의해 결정되었다.
비히클 또는 500 μg/Kg MOD-5014 또는 NovoSeven®은 꼬리 절단 이전 15 분, 24 또는 48 시간에 투여되었다. 결과는 도 41에 나타난다. 와파린으로 치료받은 랫트는 미접촉 랫트보다 5 배 더 많은 혈액을 손실했다. 주사후 15 분에, MOD-5014 및 Novoseven 치료된 랫트의 꼬리 자르기는 미접촉 랫트에 비교할만한 감소된 출혈을 수득하였다. MOD-5014의 효과는 주사후 24 시간에 완전히 보존되고, 48 시간 이후 부분적으로 보존된다.
MOD-5014의 피하 주사는 또한 장기 지속성 효과를 입증하고 있다.
SD-랫트는 2000 μg/Kg MOD-5014 또는 NoveSeven SC 주사와 병렬적으로 10mg/Kg 와파린으로 치료되었다. PT는 치료후 10, 24, 36 및 48 시간에 혈장 샘플에서 결정되었다.
MOD-5014는 PT 값 정상으로 투여후 최대 48 시간에 회복할 수 있고, 반면에 NovoSeven®의 효과는 24 시간 이후 더 이상 존재하지 않는다 (도 42).
MOD-5014의 SC 주사는 48 시간 동안에 혈액 손실을 감소시킨다.
SD-랫트는 꼬리 자르기 이전 24 시간에 와파린으로 치료되었다. 랫트는 마취되었고 따뜻한 패드위에 배치되었고, 꼬리 끝은 37℃ 염수에서 배치되었고 꼬리의 완전한 절단은 꼬리 끝에서 0.5 cm 수행되었다. 혈액은 30 분 수집되었고 혈액 손실은 중량에 의해 결정되었다.
비히클 또는 1000 μg/Kg MOD-5014 또는 NovoSeven®은 꼬리 자르기 이전 15 분, 24 또는 48 시간에 SC 투여되었다. 결과는 도 43에 나타난다.
실시예 11: MOD-5014 및 NOVOSEVEN®의 응고 활성의 비교 평가
연구 목적 - (I) NovoSeven®과 비교로 MOD-5014의 상이한 조건하에 시험관내 응고 활성 및 FX 활성화를 특성규명하기 위해. (II) MOD-5014 및 NovoSeven® 스파이킹시 인간 혈우병 및 FVII-결핍된 혈장내 생체외, 프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화된 부분적인 트롬보플라스틱 시간 (aPTT) 프로파일을 비교하기 위해.
재료 및 방법
재료 - MOD-5014 GMP-1: 2.5 mg/ml (A280에 기반) 및 NovoSeven® Lot# CU60430: 0.943 mg/ml (A280에 기반)
방법 - 응고 검정
FVIIa의 응고 활성은 상업적으로 입수가능한 Staclot VIIa-rTF 키트 (Ref# 00281, Stago)를 이용하여 측정되었다. 상기 방법은 STA Compact MAX 또는 Start4 기기를 이용하여 FVII-결핍된 혈장의 응고 시간 측정을 포함하였다. FVIIa의 특정 양은 인지질, Ca2 +, 및 재조합 가용성 조직 인자 (rsTF)의 첨가 이후 혈장에 첨가되었다. 후자는, 자체 활성화에 의해 FVII를 FVIIa로 더 이상 활성화시킬 수 없는, 원상태 조직 인자의 세포외 부분이다. 그러나, 인자 VIIa에 대하여 특이적인 보조인자 기능을 보유한다. 가용성 조직 인자에 결합된 FVIIa는 인자 X를 활성 인자 Xa로 전환시킨다. 가용성 조직 인자가 FVII를 FVIIa로 활성화시키지 않기 때문에, 관측된 응고 시간은 혈장에서 FVIIa 수준과 역전 관계를 갖는다. 수득된 응고 시간은 FVIIa 표준 곡선을 이용하여 활성 (mU/ml)으로 전환되었고 특이적 활성은 FVIIa 단백질 농도에 기반하여 계산되었다. 상기 방법은, 생체내 셋팅을 단지 부분적으로 모방하는, sTF 이용을 제한하면서, FVIIa의 잠재적인 시험관내 활성을 제공하였다.
방법 - FVII 발색 검정
MOD-5014 및 NovoSeven® 효력은 상업적으로 입수가능한 키트 BIOPHEN FVII (Ref#221304, HYPHEN BioMed)에 의해 평가되었다. 이것은 FVII 활성 테스팅을 위하여 의도된 발색 검정이다. FVII는 조직 인자와 효소 복합체를 형성하고 인지질 및 칼슘의 존재하에 인자 X를 활성화된 인자 Xa로 전환시킨다. 인자 X는 일정한 농도로 그리고 과량으로 검정에서 존재한다. 활성화된 인자 Xa의 농도는, 절단하여 pNA를 생성하는, 특이적 발색 기질 (SXa-11)상에서 그것의 활성에 의해 측정된다. pNA의 양은 인자 X 활성에 직접적으로 비례하고, 방출된 pNA의 양에 의해 측정된 그리고 405nm에서 색상 현상에 의해 결정된, 인자 Xa 활성의 수준과 인자 VII의 양 사이 직접적인 관계가 있다.
방법- 프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화된 부분적인 트롬보플라스틱 시간 (aPTT)
프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화된 부분적인 프로트롬빈 시간 (aPTT)은 Siemens CA-1500 자동분석기를 이용하여 측정되었고 A.M.L.에서 일상적인 임상 인간 혈장 진단 시험을 이용하여 증명되었다.
MOD-5014 GMP -1: 혈우병 인간 혈장/FVII 결핍된 혈장으로 0.5-0.0008 mg/ml로 희석된, A280에서 흡수에 기반된 2.5 mg/ml.
FVIIa 응고 활성: FVIIa Staclot 활성 검정에 기반된 16,720 U/mg.
NovoSeven ® Lot#CU60430: 혈우병 인간 혈장/FVII 결핍된 혈장으로 0.5-0.0008 mg/ml로 희석된, A280에서 흡수에 기반된 0.943 mg/ml.
FVIIa 응고 활성: FVIIa Staclot 활성 검정에 기반된 50,494 U/mg.
매트릭스: 인간 혈장 (FVIII 결핍된) BIORECLAMATION (Cat# HMPLCIT-FACT8DEF, Lot# BRH779222-BRH779233). FVII 결핍된 혈장, Cat#HBM-DP030K.
결과
효력 결정: MOD-5014 및 NovoSeven®의 특이적 활성은 적격 Staclot VIIa-rsTF 키트를 이용하여 평가되었다. 4 독립 검정에 의해 결정된 바와 같이 MOD-5014 (배치 RS005, GMP1, ER01) 및 NovoSeven®에 대하여 수득된 평균 특이적 활성은 아래 표 63에서 나타난다.
결론: MOD-5014 특이적 활성은 NovoSeven®보다 2 내지 2.5-배 낮았다. MOD-5014가 C-말단에서 부착된 3 CTP 카세트와 83.4% FVIIa로 구성됨에 따라, 이것은 몰 기준보다는 질량 기준으로 스파이킹하는 경우 MOD-5014내 FVIIa의 감소된 몰 함량의 결과일 수 있다.
TFPI의 존재하에 응고 활성 억제 : MOD-5014 및 NovoSeven®의 응고 활성은 조직 인자 경로 억제제 (TFPI), FVIIa라면 천연 억제제의 존재하에 평가되었다. 억제제는 고정된 농도에서 MOD-5014 또는 NovoSeven®, FVII-결핍된 혈장, 조직 인자 및 인지질의 첨가 이후 농도의 범위 (3125ng/ml 내지 0.006ng/ml)에서 첨가되었고, 37℃에서 15 분 인큐베이션되었다. 관측된 특이적 활성은 억제 %로 전환되었다. 검정은 3회 반복되었고 평균 결과는 표 64 및 도 44에서 나타난다.
결론: 유사한 용량-의존 방식에서 TFPI 억제된 NovoSeven® 및 MOD-5014. 값에서 차이는, 방법 적격화에서 보고된 바와 같이, 검정 가변성의 결과일 수 있다 (%CV≤ 25%).
헤파린의 존재하에 응고 활성 억제 : MOD-5014 및 NovoSeven®의 응고 활성은 광범위한 농도에서 헤파린의 존재하에 측정되었다. 헤파린은 MOD-5014 또는 NovoSeven®, FVII-결핍된 혈장, 조직 인자 및 인지질의 고정된 농도의 첨가 이후 첨가되었고, 37℃에서 15 분 인큐베이션되었다. 결과는 표 65에서 나타난다.
결론: 96% 넘는 억제가 극도로 낮은 농도 (0.1U/μl)에서조차 양쪽 MOD-5014 및 NovoSeven®에 대하여 관측되었음에 따라, 헤파린은 상기 특이적 검정에서 높은 효력을 보유한다.
항-트롬빈 (AT)의 존재하에 응고 활성 : MOD-5014 및 NovoSeven®의 특이적 활성은, FVIIa의 온화한 억제제인, 항 트롬빈 III (ATIII)의 존재하에 평가되었다. 항-트롬빈은 MOD-5014 또는 NovoSeven®, FVII-결핍된 혈장, 조직 인자 및 인지질의 첨가 이후 농도의 범위 (525μg/ml 내지 0.01ng/ml)에서 첨가되었고, 37℃에서 15 분 인큐베이션되었다. 관측된 특이적 활성은 억제 %로 전환되었다. 결과는 표 66 및 도 45에서 나타난다.
결론: MOD-5014 및 NovoSeven®은 AT III에 의해 유사한 방식에서 억제되었다.
NovoSeven ® 및 MOD-5014에 의한 인자 X 활성화 : MOD-5014 및 NovoSeven®의 효력은 평가되었고 MOD-5014 및 NovoSeven®에 대하여 수득된 평균 EC50 값은 계산되었다 (0.41 및 0.38 ng/ml, 각각). 결과는 표 67에서 나타나고 대표적인 용량-반응 곡선은 도 46에서 나타난다.
TFPI의 존재하에 FX 활성화 : MOD-5014 및 NovoSeven®의 효력은 TFPI의 존재하에 평가되었다. 후자는 MOD-5014 및 NovoSeven® (EC70)의 2 농도 (0.6 및 4ng/ml)에 농도의 범위(20μg/ml 내지 0.002ng/ml)에서 첨가되었고 FX 활성화는 측정되었다. 결과는 표 68 및 도 47에서 나타난다. 4 ng/ml의 농도에서 NovoSeven® 및 MOD-5014의 존재하에 수행된 검정은 표 69 및 도 48에서 나타난다.
결론: MOD-5014 및 NovoSeven®은 화합물의 양쪽 농도에서 TFPI의 존재하에 FX 활성화의 매우 유사한 억제 곡선을 입증하였다.
TFPI 및 헤파린의 존재하에 FX 활성화 - MOD-5014 및 NovoSeven®의 효력은 TFPI 및 헤파린의 존재하에 평가되었다. 상이한 농도 (20μg/ml 내지 0.002ng/ml)에서 TFPI 및 1U/μl 헤파린은 MOD-5014 및 NovoSeven®의 일정한 농도 (0.7ng/ml)에 첨가되었고 FX 활성화는 측정되었다. 결과는 표 70 및 도 49에서 나타난다.
결론: MOD-5014 및 NovoSeven®은 TFPI의 존재하에 FX의 유사한 활성화를 나타냈다. 헤파린은 TFPI와 첨가된 경우 억제 프로파일상에서 유의미한 영향을 갖지 않았다.
항-트롬빈의 존재하에 FX 활성화 : MOD-5014 및 NovoSeven®의 효력은 항-트롬빈 (AT III)의 존재하에 평가되었다. AT III의 상이한 농도 (1.68mg/ml 내지 0.16μg/ml)는 MOD-5014 및 NovoSeven®의 일정한 농도 (0.7ng/ml)에 첨가되었고 FX 활성화는 측정되었다. 결과는 표 71 및 도 50에서 나타난다.
결론: MOD-5014 및 NovoSeven®은 AT III의 존재에서 FX의 유사한 활성화를 나타냈다.
일정한 AT III 농도 및 다양한 헤파린 농도의 존재하에 FX 활성화 : 항-트롬빈 III (AT III)은 일정한 농도 (20 μg/ml)로 희석되었고 MOD-5014 및 NovoSeven®의 일정한 농도 (0.7ng/ml)에 첨가되었다. 헤파린은 혼합물에 상이한 농도 (6.25U/μl-0.002U/μl)에서 첨가되었고 FX 활성화는 측정되었다. 결과는 표 71 및 도 51에서 나타난다.
결론: MOD-5014 및 NovoSeven®은 일정한 AT III 농도에서 헤파린에 의해 유사한 및 중간 정도 억제를 나타냈다.
PT 및 aPTT 측정
PT 및 aPTT 측정은 표 72에서 나타난다.
결론: PT 및 aPTT 측정은 농도의 유사한 범위에서 스파이킹된 경우 양쪽 MOD-5014 및 NovoSeven®에 대하여 비교할만 하였다.
일정한 헤파린 농도 및 다양한 AT 농도의 존재하에 FX 활성화
연구 목적
항-트롬빈 존재하에 그리고 헤파린의 일정한 농도에서 FX를 활성화하는 MOD-5014 및 NovoSeven의 능력을 비교하기 위해.
연구 설계 및 결과
MOD-5014 및 NovoSeven의 효력은 항-트롬빈 (AT) 및 헤파린의 존재하에 평가되었다. AT의 상이한 농도 (1.68mg/ml 내지 0.032μg/ml) 및 1U/μl 헤파린은 MOD-5014 및 NovoSeven의 일정한 농도 (0.7ng/ml)에 첨가되었고 FX 활성화는 측정되었다. 항-트롬빈에 대하여 수득된 IC50 값은 MOD-5014에 대하여 49.65μg/ml 및 NovoSeven에 대하여 65.70 μg/ml이었다. 결과는 표 121, 도 52에서 나타난다.
표 121: AT 및 헤파린의 존재하에 FX 활성화
결론: MOD-5014 및 NovoSeven는, AT가 헤파린보다 FVIIa 억제에 관하여 상당히 더욱 확연한 효과를 갖는다는 것을 시사하는, AT 및 1U/μl 헤파린의 존재하에 FX의 유사한 활성화를 나타냈다.
비교 PT 및 aPTT 측정
연구 목적
MOD-5014 및 NovoSeven 스파이킹시 인간 혈우병 및 FVII-결핍된 혈장에서 PT & aPTT 프로파일을 비교하기 위해.
연구 설계
PT 및 aPTT는 Siemens CA-1500 자동분석기를 이용하여 측정되었고 A.M.L.에서 일상적인 임상 인간 혈장 진단 테스팅을 이용하여 증명되었다. MOD-5014 GMP-1: 혈우병 인간 혈장/FVII 결핍된 혈장으로 0.5-0.0008 mg/ml로 희석된, A280에서 흡수에 기반된 2.5 mg/ml.
FVIIa 응고 활성: FVIIa Staclot 활성 검정에 기반된 16,720 U/mg.
NovoSeven Lot#CU60430: 혈우병 인간 혈장/FVII 결핍된 혈장으로 0.5-0.0008 mg/ml로 희석된, A280에서 흡수에 기반된 0.943 mg/ml. FVIIa 응고 활성: FVIIa Staclot 활성 검정에 기반된 50,494 U/mg.
매트릭스:
· 인간 혈장 (FVIII 결핍) BIORECLAMATION (Cat# HMPLCITFACT8DEF, Lot# BRH779222-BRH779233).
· FVII 결핍 혈장, Cat#HBM-DP030K.
MOD-5014 및 NovoSeven은 0.5-0.0008 mg/ml의 농도에서 상기 매트릭스 속에 스파이킹되었고 PT 및 aPTT는 측정되었다. 결과는 표 122에서 요약된다.
표 122: PT 및 aPTT 측정
결론: PT 및 aPTT 측정은 농도의 유사한 범위에서 스파이킹된 경우 양쪽 MOD-5014 및 NovoSeven에 대하여 비교할만 하였다.
요약
MOD-5014 활성은 동등 질량에서 NovoSeven®에 비교하여 그것의 응고 활성의 상이한 측면을 평가한 다양한 시험관내 및 생체외 방법에 의해 평가되었다. 초기에, MOD-5014 활성은 적격 Staclot FVIIa 검정에서 NovoSeven®에 비교되었다. 연구는 MOD-5014 활성이 NovoSeven의 것보다 2 내지 2.5-배 낮다는 것을 입증하였다. TF, 인지질 및 칼슘의 존재하에 발색 검정에 의한 인자 X 활성화 테스트는 또한, EC50에 의해 반영된 바와 같이, NovoSeven®에 비교하여 MOD-5014의 활성의 약간 더 낮은 측정을 제시하였다.
방법들 사이 가변성은 검정 감수성 또는 종점에서 차이 (가용성 대 전체-사슬 TF 및 응고 시간 대 OD 측정, 각각) 때문일 수 있다. 더 낮은 MOD-5014 활성은 MOD-5014의 84.4%가 FVIIa에 대응하고 15.6%가 CTP에 대응한다는 사실 때문일 수 있다.
외인성 응고 경로의 주요 FXa-의존적 억제제인, TFPI의 존재하에 MOD-5014 불활성화는 상기 언급된 2 시험관내 검정 (Staclot 및 인자 X 활성화)에 의해 평가되었다. TFPI의 증가하는 농도로 2 고정된 농도에서 MOD-5014 또는 NovoSeven® 인큐베이팅은 응고 또는 FXa 효소 활성에서 용량-의존적 감소를 초래하였다. 양쪽 화합물은, % 응고 억제에 의해 반영된, 매우 유사한 탈-활성화 패턴을 입증하였다.
항-트롬빈 III은 느린 속도에서 인자 VIIa를 억제한다고 이전에 보고되었고 헤파린의 현재에서 증강된 억제를 또한 입증하였다. 항-트롬빈 III은 양쪽 화합물이 AT III의 증가하는 농도로 스파이킹되었던 경우 양쪽 MOD-5014 및 NovoSeven®의 유사한 억제 패턴을 입증하였다. 상기 패턴은, 확연한 억제성 효과를 생산하는, 헤파린의 첨가 이후 유지되었다.
실시예 12: 트롬빈 생성 및 응고 효율에서 MOD-5014 및 NOVOSEVEN ®의 비교 시험관내 평가
연구 목적 - (I) 낮은 및 높은 인지질 농도에서 억제성 항체의 고역가를 가진 억제성 혈소판 풍부 혈장내 트롬빈 생성 (TG)에 의한 MOD-5014 및 NovoSeven®의 비교 평가, 및 (II) 억제성 항체의 고역가를 가진 억제성 혈소판 풍부 혈장내 트롬보엘라스토그래피 (TEG)에 의한 MOD-5014 및 NovoSeven®의 비교 평가.
재료 및 방법
재료 - 냉동 저장된 (-60 내지 -80℃), MOD-5014: 2.0 mg/ml 및 NovoSeven® 1.0 mg/ml. 용량 제형 제조는 요구되지 않았다. 재료는 투여에 앞서 단지 1회 해동되었다.
방법 - 낮은 및 높은 인지질 농도로 트롬빈 생성 (TG)
항 FVIII 억제성 Abs의 고역가를 가진 환자로부터 유래된 인간 혈장은 MOD-5014 또는 NovoSeven®의 증가된 농도로 스파이킹되었고, 응고는 재지질화된( relipidtaed ) rh조직 인자 (TF) 그리고 생체내 상황을 모방하는 인지질 교질입자 (Reagent RChigh)의 높은 농도에 의해 자극되었다.
방법 - 트롬보엘라스토그래피 (TEG)
트롬보엘라스토그래피 (TEG)는 혈액에서 응고의 효율의 테스팅 방법이고 수술 및 마취과학에서 특히 중요하다. 응괴에서 강도 및 탄력성의 변화의 패턴은 얼마나 양호하게 혈액이 지혈 (혈액 유동의 중단)을 수행할 수 있는지, 그리고 얼마나 양호하게 또는 저조하게 상이한 인자가 응괴 형성에 기여하고 있는지에 대한 정보를 제공한다.
응괴 형성을 나타내는 4 값은 이 테스트: R 값 (또는 반응 시간), K 값, 각 및 MA (최대 진폭)에 의해 결정된다. R 값은 응괴의 제1 증거가 검출되는 때까지 시간을 나타낸다. K 값은 응괴가 20mm를 도달하는 때까지 R의 단부로부터 시간이고 이것은 응괴 형성의 속도를 나타낸다. 각은 K가 도달되는 경우 작성된 곡선의 탄젠트이고 K와 유사한 정보를 제공한다. MA는 응괴 강도의 반영이다.
결과
트롬빈 생성: 트롬빈의 생성은 응고 캐스케이드의 근본적인 부분이고 그 자체로 얼마나 양호하게 특정한 개체가 트롬빈을 생성할 수 있는지의 추정은 출혈 또는 혈전증의 한쪽 위험과 상관할 수 있다. 트롬빈 생성 공정의 모든 시기 (트롬빈 생성의 개시, 증폭 및 억제 뿐만 아니라 생성된 트롬빈의 적분 양)을 기재한다. 사용된 실험 시스템에 따르면, 트롬빈 생성은 생체내 혈액 응고에서 역할을 하는 대부분의 인자에 의해 영향받을 수 있다.
트롬빈 생성의 동력학은 Technoclone TGA로 모니터링되었다 (도 53).
피크 트롬빈의 용량-의존적 증가 그리고 지연기 및 피크 시간의 감소는 MOD-5014 또는 Novoseven으로 스파이킹 이후 관측되었다.
제2 실험에서 MOD-5014 또는 NovoSeven®은 TF의 현재에서 그리고 인지질 교질입자 (Reagent RClow)의 낮은 농도의 현재에서 증가하는 농도로 스파이킹되었다.
기대된 대로 더욱 확연한 반응은 높은 PL 농도를 가진 샘플을 스파이킹 하는 경우 관측되었다. 양쪽 화합물은 응고 캐스케이드의 적절한 활성화에 대하여 그것의 중요성을 추가로 확인하는 PL 농도의 낮은 농도에서 최대 TG 반응을 도달하였다. 도 53 및 도 54에서 나타난 바와 같이 결과는 MOD-5014 시험관내 트롬빈 생성 활성이 높은 및 낮은 PL 농도에서 NovoSeven®에 비교하여 약간 더 낮고 PPP FVIII 결핍된 혈장에서 수득된 데이터로 정렬된다는 것을 입증한다.
응고 효율: MOD-5014 및 NovoSeven®은 고역가 인간 FVIII 억제제 혈소판 도달 혈장 (PRP)에 첨가되었고, CaCl2 및 rhTF 트롬보플라스틴은 응괴 형성을 유발하기 위해 첨가되었다. R 및 각은 평가되었다. 도 55에서 관측된 바와 같이, 양쪽 MOD-5014 및 NovoSeven®은 응고 시간 (R)을 감소시켰고 유사한 농도 의존 방식에서 고역가 FVIII 억제제 혈장의 응괴 형성 (Angel)의 속도를 증가시켰고, 그 동안 MOD-5014는 그것의 응고 능력에서 소수의 감소를 입증하였다. 이들 발견은 CTP 부착이 응괴 형성을 방해하지 않는 ROTEM에 의해 수득된 결과를 추가로 강화한다.
요약
FVIII 고역가 혈장에서 TG 및 TEG 결과에 기반하여 TG 및 응괴 형성의 MOD-5014 기전이 그의 활성에서 약간의 감소를 가진 NovoSeven®과 유사할 수 있다는 것처럼 보인다. MOD-5014가 C-말단에서 부착된 3 CTP 카세트와 83.4% FVIIa로 구성됨에 따라 이것은 몰 기준보다는 질량 기준으로 스파이킹하는 경우 MOD-5014내 FVIIa의 감소된 몰 함량의 결과일 수 있고, 따라서 생체내 지혈을 유지하기 위해 MOD-5014의 약간 더 높은 농도를 요구할 것이다. 마지막으로 인지질에 대한 결합의 기전이 FVIIa에 CTP의 부착 이후 유지될 수 있다는 것처럼 보인다.
실시예 13: MOD-5014 및 NOVOSEVEN®의 비교 시험관내 활성
연구 목적 - (I) 시트레이트화된 혈소판 불량 혈장 (PPP)내 트롬빈 생성 (TG)에 의한 MOD-5014 및 NovoSeven®의 비교 평가. (II) 시트레이트화된 PPP내 트롬빈 생성에 의한 MOD-5014 및 NovoSeven® 조직 인자 (TF) 친화도의 비교 평가. (III) PPP 시트레이트화된 혈장내 트롬보엘라스토그래피 (ROTEM)에 의한 MOD-5014 및 NovoSeven®의 비교 평가.
재료 및 방법
재료 - 저장 냉동된 (-60 내지 -80℃), MOD-5014: 2.6 mg/ml 및 NovoSeven® 2.6 mg/ml. 용량 제형 제조는 요구되지 않았다. 재료는 투여에 앞서 실온으로 해동되었다.
방법 (목적 (I))- 낮은 및 높은 인지질 농도에서 트롬빈 생성 (TG)
트롬빈 생성은 Livnat 등 (2006, J. Thromb Haemost. 4(1):192-200; 2008, Haemophila. 14(4):782-786; 및 2011, Thromb Haemost. 105(4): 688-95)에 따라 측정되었다. 간단히, 풀링된 혈장은 MOD-5014 또는 NovoSeven®의 상승하는 농도로 스파이킹되었다. (1μM 조직 인자를 함유하는) PPP-시약 LOW 또는 MP-시약 (Diagnostica Stago, Lot PPL 1203/01 및 MPR 1202/01, 각각)은 작업 완충액으로서 사용되었다. 양쪽 시약은 4μM 인지질을 함유하였다.
검정은 하기와 같이 2 접근법을 이용하여 수행되었다: (a) 재-석회화 단독; 및 (b) 낮은 TF 수준(1pM).
20 μl의 작업 완충액은 둥근바닥 96-웰 미세적정 플레이트에 배치되었다. NovoSeven® 또는 MOD-5014의 상이한 농도를 가진 80 μl의 FVIII-결핍된 혈장은, 표 73에서 기재된 바와 같이, 완충액에 첨가되었다.
TG는 20　μl의 플루오로제닉 기질/CaCl2 완충액 (FluCa-키트 Thrombinoscope-BV, Diagnostica Stago, Lot FLB 1303/01) 첨가에 의해 개시되었다. 형광은 390 nm에서 여기 필터 및 460 nm에서 방출 필터 그리고 형광측정기 (Fluoroskan Ascent, Lab system, Helsinki, Finland)을 이용하여 측정되었다. 결과는 플롯 및 유래된 파라미터, 즉 지체 시간, 내인성 트롬빈 잠재력 (ETP) 및 피크 높이로서 표시되었고, 특화된 컴퓨터 소프트웨어 (버전 3.0.0.29, Thrombinoscope-BV Maastricht, the Netherlands)를 이용하여 계산되었다. 각각의 샘플은 독립적으로 2회 반복하여 (시행 1 및 2) 테스트되었다. 중복의 평균 값은 제공되고 트롬빈 표준에 비교된다 (Thrombin calibrator, Diagnostica Stago, Lot TC 1208/01).
방법 - (목적 (II)) - 트롬빈 생성 (TG)
트롬빈 생성은 Livnat 등 (2006, 2008, 2011)에 따라 측정되었다. 간단히, 풀링된 혈장은 더욱 감수성 및 용량-의존적 반응 (1.25, 2.5, 5, 및 10μg/ml)을 가능하게 하기 위해 MOD-5014 또는 NovoSeven®의 3 상당히 낮은 상승하는 농도로 스파이킹되었다. 4μM 인지질을 함유하는 MP-시약은 작업 완충액으로서 사용되었다. 각각의 지정된 샘플은 아래 표 74에서 기재된 바와 같이 TF의 상승하는 농도로 스파이킹되었고, TG는 평가되었다.
TF의 지정된 농도에서 각각의 테스트 물품의 TG는 ETP, 지체 시간 및 트롬빈 피크의 높이 측정에 의해 평가되었다. 각각의 샘플은 독립적으로 2회 반복하여 테스트되었다 (시행 1 및 2). 중복의 평균 값은 제공된다.
방법 - 목적 (III) - 회전 트롬보엘라스토그래피 (ROTEM)
중증 FVIII-결핍된 환자로부터 풀링된 혈장은 아래 표 75에서 기재된 바와 같이 4 농도에서 한쪽 NovoSeven® 또는 MOD-5014로 스파이킹되었고, 하기 조건에서 평가되었다: (a) 카올린의 첨가; (b) TF의 낮은 수준; (c) 재-분류.
ROTEM 측정은 20 mM CaCl2, (NATEM), 엘라그산 (접촉 활성화, INTEM), 또는 조직 인자 (1:1700 희석된 EXTEM 시약)의 낮은 농도의 차후의 첨가와 함께, 컵 속에 배치된 300 μL의 FVIII-결핍된 혈장을 이용하여 ROTEM 디바이스 (Pentapharm, Munich, Germany)로 수행되었다. ROTEM 시험은 37℃에서 제조자의 지침에 따라 수행되었고 최소의 45 분 동안 시행되었다. 하기 변수는 사용되었다: 응고 시간 (CT, 초), 즉 CaCl2의 도입과 응고의 시작 사이 시간; 응괴 번식을 반영하는 알파-각 (α-각, 도); 및 응괴 강도를 반영하는, 최대 응괴 견고성 (MCF, mm).
결과
목적 (I): 트롬빈 생성 (TG)에 의해 MOD-5014 및 NovoSeven ®의 비교 시험관내 평가
트롬빈 생성은 FVIIa의 지혈 효과의 평가를 위하여 빈번하게 사용되어 왔다. FVIIa가 FVIII 억제제 혈장 샘플에서 트롬빈 생성 (TG)의 변화를 매개한다는 것이 이전에 보여졌다. 재조합 FVIIa (rFVIIa)로 스파이킹된 혈장 샘플에서, TG는 조직 인자 (TF)의 부재하에 개선되었고 반면에 시험관내 rFVIIa의 TG 잠재력은 첨가된 TF의 결과로서 증가되었다. 단순히, 고전적 약동학적 검정은 그것의 작용 기전의 복합성 때문에 FVIIa에 이용불가능이다. 트롬빈이 생성된 최종 생성물이기 때문에, TG 검정은 MOD-5014 및 NovoSeven®의 약동학 및 잠재적인 효능의 평가에 사용될 수 있다. 상기 검정은 치료 동안 억제제-우회 제제의 약동학 모니터링에 적합하고 치료에 대한 반응 예측에 유용할 수 있다. 따라서 혈장에서 생성된 트롬빈 농도의 실시간 측정은 응고 시스템의 항상성에 관하여 귀중한 정보를 제공한다.
이 연구의 목적은 인간내 최초 (first-in-human; FIH) 연구에서 제안된 임상 용량에 잠재적으로 상관하는 농도의 범위에서 중증 혈우병 A 혈장내 MOD-5014 및 NovoSeven®의 시험관내 트롬빈 생성 능력을 비교하는 것이었다. 이것은 인간내 최초 (FIH) 연구에 제제의 일부로서 최소 효과적인 용량의 예측을 제공할 수 있다.
재-석회화 이후 비교 트롬빈 생성
MOD-5014 및 NovoSeven®은 중증 혈우병 A 풀링된 혈장에 광범위한 농도로 스파이킹되었다. 연구는 2회 반복되었고, 결과는 아래 표 76-79, 그리고 도 56, 57, 58(A-E), 59(A-D), 60, 61, 62(A-E) 및 63(A-D)에서 제공된다.
표 76 도 56에 대하여 (시행 #1) NovoSeven® 유도체 값
표 77 도 57에 대하여 (시행 #1) MOD-5014 유도체 값
표 78 도 60에 대하여 (시행 #2) NovoSeven® 유도체 값
표 79 도 61에 대하여 (시행 #2) MOD-5014 유도체 값
용량-의존적 반응은 2 화합물의 첨가 이후 관측되었다. 짐작컨대 40 및 80 μg/kg, 각각을 모방하는, 1.25-2.5 μg/ml의 낮은 농도에서, 증가된 지체 및 감소된 ETP에 의해 반영된 바와 같이 (도 56, 57, 60 및 61), 불량한 TG는 관측되었다. 더 높은 농도가 TG 프로파일에서 심오한 개선을 제공하였어도, 테스트된 화합물의 어느 것도 FVIII로 수득된 바와 같이 TG의 완전한 회복을 제공할 수 없었다 (도 71 및 72; 표 80).
표 80 (도 72에 대하여 유도체 값)
이들 결과는 공개된 연구와 비슷하고 hFVIIa가, 더 낮은 TG 피크, ETP, 및 다른 파라미터에 의해 입증된, 트롬빈 정정에 대하여 다른 대체 요법보다 우회 제제로서 덜 효과적이라는 것을 시사한다. 오버레이 분석 (도 58 (A-E), 59 (A-D), 62 (A-E) 및 63 (A-D))는, 주로 증가된 지체 시간, 및 (NovoSeven®에서 보다 30-40% 낮은 것으로 추정된) 더 낮은 트롬빈 피크로서 반영된, NovoSeven®에 비교된 경우 MOD-5014 TG 반응에서 약간의 감소를 시사하였다. MOD-5014가 C 말단에서 부착된 3 CTP 카세트와 83.4% FVIIa로 구성됨에 따라 이것은 몰 기준보다는 질량 기준으로 스파이킹하는 경우 MOD-5014내 FVIIa의 감소된 몰 함량의 결과일 수 있다. 소수의 변동으로 유사한 결과를 제공하는, 2 독립 시행은 서로 일치하였다.
낮은 TF 농도에서 비교 트롬빈 생성
중증 혈우병 A 풀링된 혈장이 TF의 낮은 수준으로 스파이킹되었던 경우, 테스트된 샘플에서 증가된 MOD-5014 및 NovoSeven® 농도로서 증가하였던 배경 TG 반응은 관측되었다. (도 64, 65, 66(A-E), 67, 68, 69(A-E), 70(A-C); 표 81-84)
표 81 (도 64에 대하여 NovoSeven® 유도체 값)
표 82 (도 65에 대하여 MOD-5014 유도체 값)
표 83 (도 67에 대하여 NovoSeven® 유도체 값)
표 84 (도 68에 대하여 MOD-5014 유도체 값)
용량-의존적 반응의 유사한 패턴은 양쪽 생성물에 대하여 이 연구에서 관측되었지만; 더 큰 진폭은 TF에 의한 반응 향상 때문에 수득되었다. 재차, MOD-5014는 둘 사이 적합한 오버레이를 제공하기 위해 더 높은 MOD-5014 농도를 요구하는, 재-석회화 연구에 비교하여 더욱 확연하였던 감소된 활성을 입증하였다 (도 66 (A-E) 및 도 70 (A-C)). 이것을 또한 연구하기 위해, 시험관내 연구는 수행되어, 아래에 기재된 바와 같이, TF에 대한 MOD-5014 및 FVIIa 친화도 그리고 TG에 관한 그것의 효과를 추가로 조사하였다.
결론: 양쪽 생성물은, 40-80 μg/Kg의 임상 용량을 모방하는 농도에서 초기 불량 반응으로, 중증 혈우병 A 풀링된 혈장에 스파이킹된 경우 용량-의존적 TG 반응을 입증하였다. 이들 결과는 짐작컨대 40-80μg/kg 미만 용량이 적절한 생체내 반응을 제공하지 못할 것임을 시사한다. 더욱이, MOD-5014는 NovoSeven®로서 유사한 농도에서 스파이킹된 경우 감소된 TG 성능을 입증하였고, 약간 증가된 농도 (30-40%)가 NovoSeven®의 것에 비교할만한 적절한 초기 지혈 효과를 제공하는 임상 셋팅에서 필요할 것임을 시사한다.
목적 (II): TF에 MOD-5014 및 NovoSeven® 친화도의 비교 시험관내 평가
FVIIa는 적어도 2 독립 효과기 기전을 갖는 것처럼 보인다: 응고의 외인성 경로의 고전적 유발제인, 인자 X (FX)의 조직 인자 (TF)-의존적 FVIIa-매개된 활성화, 및 단핵구 또는 혈소판의 내인성 인지질 (PL) 표면상에서 고-용량 FVIIa의 TF-독립 활성. MOD-5014는 TF의 현재 존재하에 더욱 확연하였던 NovoSeven®에 비교된 경우 감소된 활성을 입증하였다. 더 높은 MOD-5014 농도는 두 화합물 사이 적합한 오버레이를 제공하도록 요구되었다 (도 66 (A-E) 및 도 70 (A-C)). TF에 대한 MOD-5014 친화도가 SPR 및 시험관내 활성화 검정에 의해 측정된 경우 NovoSeven®에 유사하였던 것이 이전에 보고되었어도, 이 연구의 목적은 TG에 의해 TF에 대한 MOD-5014 및 FVIIa의 상기 시험관내 친화도를 추가로 조사하는 것이었다.
MOD-5014 및 NovoSeven®은, TF의 상승하는 농도의 존재하에, 중증 혈우병 A 풀링된 혈장에 농도의 상승하는 범위에서 스파이킹되었다. 연구는 2회 반복되었고, 각각의 시행의 결과는 도 73-88 및 표 85-90에서 제공된다.
표 85 (도 73에 대하여 유도체 값)
표 86 (도 75에 대하여 유도체 값)
표 87 (도 77에 대하여 유도체 값)
표 88 (도 81에 대하여 유도체 값)
표 89 (도 82에 대하여 유도체 값)
표 90 (도 83에 대하여 유도체 값)
한쪽 NovoSeven® 또는 MOD-5014의 고정된 용량과 TF의 증가하는 농도로 스파이킹은, 감소된 지체 시간 및 증가된 ETP 및 트롬빈 픽에 의해 반영된 바와 같이, TG 성능에서 TF-의존적 증가를 제공하였다 (도 79 (A-C), 80 (A-C), 87 (A-E) 및 88 (A-E)). 5pM 미만 TF 농도 및 모든 용량에서 양쪽 화합물에 대하여, 불량 내지 중간 정도 TG 반응은 증가된 지체 시간 및 감소된 ETP에 의해 반영된 경우 관측되었다. TF (5pM)의 더 높은 농도는 TG 프로파일에서 확연한 개선을 제공하였다 (도 79 (A-C), 80 (A-C), 87 (A-E) 및 88 (A-E)). 그러나, 테스트된 화합물의 어느 것도 FVIII로 수득된 경우 TG의 완전한 회복을 제공할 수 없었다 (도 71 및 72, 및 표 82). 흥미롭게도, 일정한 TF 수준에서 NovoSeven® 또는 MOD-5014의 농도 증가는 TG 성능을 개선시키지 못했고 (도 79 (A-C), 80 (A-C), 87 (A-E) 및 88 (A-E)), 추가로 양쪽 화합물의 적절한 활성에 대하여 TF의 중요성을 강조한다.
오버레이 분석에 의해 MOD-5014 및 NovoSeven®의 TG 프로파일의 비교 (도 74 (A-E), 76 (A-E), 78 (A-E), 82, 85 (A-C), 86 (A-E); 표 89)는 TF 없이 또는 초저 TF 농도 (0.5pM)에서 (20-30% 더 낮은 것으로 추정된) MOD-5014 반응에서 약간의 감소를 시사하였다. TF의 수준이 증가함에 따라, 유사한 반응은 양쪽 반복부상의 모든 MOD-5014 및 NovoSeven® 농도에서 관측된다 (도 74 (A-E), 76 (A-E), 78 (A-E), 82, 85 (A-C), 86 (A-E); 표 89).
결론: 이 연구는 TF의 상승하는 농도의 존재하에 고정된 농도에서 양쪽 화합물 스파이킹에 의해 시험관내 결과를 추가로 확인한다. 샘플에서 TF의 양은 증가된 TG 반응을 우세하게 책임졌고, MOD-5014와 NovoSeven® 사이 생물학적 유사성을 추가로 확인하였다.
회전 트롬보엘라스토그래피 ( ROTEM )을 이용하여 MOD-5014 및 NovoSeven ® 활성의 목적 (III) 비교 평가
지난 10년 동안, 트롬보엘라스토그래피는 응고장애, 혈액 수혈 및 응고 인자 대체 요법에서 지혈 모니터링을 위한 귀중한 도구로서 부각되었다. 이런 점에서, 트롬보엘라스토그래피는 혈우병, 인자 VIII 또는 IX 대체 요법, 및 억제제를 가진 혈우병 환자에서 aFVIIa의 효과의 평가에서 사용되어 왔다. ROTEM은 혈소판감소증, 글란즈만의 혈소판무력증 및 혈액희석에서 응고 및 항-섬유소용해 제제의 효과의 평가에 사용될 수 있다. 연구의 목적은 제안된 임상 용량에 상관하는 농도의 범위에서 중증 혈우병 A 혈장내 MOD-5014 및 NovoSeven®의 시험관내 ROTEM 성능을 비교하는 것, 그리고 FIH 연구를 위하여 제제의 일부로서 최소 효과적인 용량을 평가하는 것이었다.
실험의 결과는 표 91 및 92에서 나타난다.
표 91: 인자 VIII로 FVIII-결핍된 혈장 스파이킹
표 91은, 연구에서 대조 화합물로서 사용된, FVIII (1 U/mL)로 혈장 스파이킹 이후 그리고 FVIII 없이 혈장 응고를 보여준다. NATEM 테스트에서, 응고는 온전한 혈장에서 관측되지 않았고, 반면에 FVIII로 혈장 샘플 스파이킹은 약간의 응괴 형성이 뒤따랐다. 그에 반해서, INTEM 테스트에서 응괴 형성은 양쪽 온전한 및 치료된 혈장에서 발생하였고, 반면에 후자에서 훨씬 더 강력하였다 (CT는 더 짧았고 α-각은 8-배 더 높았다). 최대 응괴 견고성 (MCF)은 약간 증가되었다. 이들 결과는 고유 시스템 (INTEM)이 혈우병 A에서 FVIII-대체의 평가에 대하여 유용한 테스트일 수 있다는 것을 시사한다.
표 92: FVIII-결핍된 혈장내 응괴 형성에서 MOD-5014 및 Novo Seven의 효과
표 92는 FVIII-결핍된 혈장내 응괴 형성에서 FVIIa의 효과를 보여준다.
혈장의 접촉 활성화로 재석회화 ( INTEM 테스트): CT는 더 짧았고 α-각은 비-치료된 혈장에 비교된 2.5 및 10 μg/mL에서 FVIIa의 양쪽 유형으로 치료된 혈장에서 서서히 증가하였다. 15 μg/mL로 FVIIa 농도를 증가시킴으로써, 응괴 형성에서 변화는 10 μg/mL FVIIa로 치료된 혈장의 것과 상이하지 않았다. 차이는 MOD-5014 및 NovoSeven의 활성 사이 발견되지 않았다.
외인성 경로의 활성화로 재석회화 ( EXTEM 테스트): 비-치료된 혈장에 비교된 양쪽 MOD-5014 및 NovoSeven-치료된 혈장에서 MCF의 증가 및 CT의 감소가 있었다. 응괴 번식 (α-각)의 증가는, 15 μg/mL에서 추가 변화 없이, 2.5 및 10 μg/mL에서 양쪽 제제로 치료된 혈장에서 유사한 확장으로 관측되었다.
결론: INTEM은 MOD-5014 및 NovoSeven의 활성을 비교하는데 이용된 상이한 ROTEM 시험 중에서 가장 신뢰할 수 있는 테스트인 것처럼 보였다. 80μg/kg의 생체내 용량을 모방하는, 2.5μg/ml의 용량은 약간 감소된 응고 시간에 의해 반영된 경우 양쪽 화합물에 대하여 낮은 반응, 그리고 양쪽 INTEM 및 EXTEM을 이용하여 테스트된, 비-치료된 혈장에 비교하여 증가된 α-각을 초래하였다. 10 및 25 μg/ml로 MOD-5014 및 NovoSeven®의 농도 증가는 응괴 형성에서 용량-의존적 자극 효과가 뒤따랐다. 결과는 또한 양쪽 제제에서 매우 유사한 ROTEM 값을 제공하는, 응괴 형성에서 한쪽 제제의 효과에서 필수적인 차이 없음을 입증한다.
실시예 14: 혈우병 A ( FVIII 결핍)을 가진 개에서 MOD-5014 약동학, 약력학 및 혈우병 응고장애의 정정의 평가
연구 목적 - 현행 연구의 목적은 중증 혈우병 A (FVIII 결핍, <0.01% FVIII)를 가진 개에서 MOD-5014 약동학, 약력학, 및 혈우병 응고장애의 정정을 평가 및 특성규명하는 것이었다.
테스트 시스템의 정당화
Chapel Hill 혈우병 A 개 콜로니는 FVIII 생물검정 및 발색 검정에서 검출가능한 FVIII 활성 없음, 및 ELISA (<0.005 U/ml)에 의한 거의 또는 전혀 FVIII 항원 없음의 이점을 갖는다. 상기 모델은 상이한 응고 인자의 비-임상 약리적 특성규명의 일부로서 과거 사용되어 왔다. 상기 모델이 지혈의 특정한 영역 내에서 인간 생물학의 정확한 발생반복을 제공할 수 있다는 것, 그리고 인간 연구에서 이전에 관측된 것에 비교할만한 PK/PD 파라미터를 제공할 수 있다는 것이 제시되고 있다. 또한, 전체 지혈 기능이상 또는 임상 셋팅에서 정정을 평가하는 선별 도구로서 사용되는, TEG는 인간과 개 지혈 사이 추가 상관관계를 또한 시사하는 상기 모델에서 예측 도구인 것으로 나타났다.
재료 및 방법
재료 - MOD-5014: 저장 냉동된 (-60 내지 -80℃), 2.6 mg/ml. 용량 제형 제조는 요구되지 않았다. 재료는 투여에 앞서 실온으로 해동되었다.
사전-제형화된 투여 제형은 무균처리로 다루어졌고 받은채로 투여되었고; 용량 제형 제조는 요구되지 않았다. 테스트 물품 (MOD-5014)은 투여에 앞서 단지 1회 해동되었다. 테스트 물품은 냉동된 저장으로부터 제거되었고 투여에 앞서 실온으로 해동되었다.
방법: 생체외 상: 생체외 상은, 생체내 연구용 용량 선택을 지지할 최소 효과적인 용량을 확립하기 위해, Knudsen 등 2011, Haemophilia. 17(6):962-970에 따라 수행되었다.
제1 상 동안, 2 개별 FVIII 결핍된 개로부터, 신선한 혈액 속으로 스파이킹된 MOD-5014의 용량 의존적 생체외 전혈 응고 시간 (WBCT) 및 트롬보엘라스토그래피 (TEG) 평가는 수행되었다. TEG 및 WBCT 성능을 상당히 개선하였던, MOD-5014의 최저 용량은 최소 효과적인 용량으로 간주되었다. 제1 상 및 최소 효과적인 용량의 확립에 기반하여, 생체내 제2 상에 대한 용량은 선택되었다.
신선한 갯과 혈액은 결과의 재현성을 확인하기 위해 2 개별 FVIII 혈우병 개로부터 채혈되었고 독립적으로 분석되었다. 간단히, 15 mL의 갯과 혈액은 주사기 속으로 채혈되었고, 원뿔형 튜브로 전달되었고 0.568, 1.136, 2.273, 4.545, 및 9.909 μg/ml의 최종 농도까지 MOD-5014로 스파이킹되었고, 이는 하기를 추정하는 FVIII 결핍된 개에서 MOD-5014의 50, 100, 200, 400, 800 μg/kg의 투여 이후 기대된 생체내 Cmax에 상관관계가 있다: 갯과 추정된 중량은 20 kg이고 각각의 동물에 대하여 혈액 용적은 40 mL/lb (88 mL/kg)이다.
이들 스파이킹으로부터 혈액은 아래와 같이 테스트 재료 첨가의 <5 분 이내에 분석되었다:
단계 1: 전혈 응고 시간 (WBCT): 지정된 최종 농도까지 MOD-5014로 스파이킹된 1mL의 혈액은 WBCT에 사용되었다. 간단히, 전혈 응고 시간 (WBCT)는 28℃ 수조에서 2 실리콘화된 유리 튜브 (VacutainerM #6431, Becton-Dickinson, Rutherford, NJ)를 이용하여 Lee-White 응고 시간의 변형이다. 지정된 농도에서 MOD-5014로 스파이킹된 1 mL의 전혈은 2 실리콘화된 튜브 사이 동등하게 갈라졌다. 타이머는 개시되었다. 1분 후, 1 튜브는 매 30 초 편향되었고, 다른 것은 방해되지 않고 방치되었다. 응괴가 편향된 튜브에서 형성된 경우, 제2 튜브는 그 다음 응괴가 형성된 때까지 매 30 초 편향되었다. 제2 튜브에서 완전히 겔화된 응괴의 형성용 시간은 WBCT로서 기록되었다. 미접촉 혈우병 A 개에서, WBCT는 일반적으로 > 40 분이지만 > 60 분일 수 있다. 값이 60분을 초과하면 테스트는 중단된다.
단계 2: 트롬보엘라스토그래피: 지정된 최종 농도까지 MOD-5014로 스파이킹된 1 mL의 혈액은 카올린과 혼합되었고 (Lot #는 Haemoscope에 의해 제공된다), 360 μl의 상기 혼합물은 시험용 컵에 배치되었다. TEG 기록은 대략 90 분 동안 진행하도록 되었다. TEG 값의 전형적인 범위는 아래 표 93에서 제공된다.
표 93 - 트롬보엘라스토그래피 전형적인 범위의 값
상당한 응고 개선을 입증하는 최저 용량은, 연구의 상 II 동안 측정된 경우 및 아래에 기재된 바와 같이 상이한 검정 이용에 의해 혈액 응고 및 지혈의 적절한 모니터링을 제안하는, 생체내 연구를 위하여 초기 용량으로서 사용될 것이다.
방법: 생체내 상: 대략 20 kg 중량의 6 미접촉 혼합된 품종 Chapel Hill 혈우병 A 개 (카니스 파밀리아리스)는 이 연구에 사용되었다. 개는 50 μg/kg (N=2), 200 μg/kg (N=4), 400 μg/kg (N=2), 또는 600 μg/kg (N=2) MOD-5014의 IV 용량을 받았다. 용량은 5 분 IV 주입으로서 제공되었다. 혈액 샘플은 투여에서 앞서, 그리고 투여후 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 32, 48, 72 및 96 시간에서 요측피 정맥의 경피 천공에 의해 농도 및 활성 측정으로 수집되었다. 4마리 개는 최대 8 일의 기간 동안 MOD-5014로 2회 투여되었고, 2마리 추가의 개는 1회 투여되었다. 연구는 용량-엇갈린 상승하는 연구로서 설계되었다, 즉 각각의 주사 이후 적기 응고 분석은 다음 용량의 타이밍을 결정하였다.
생체내 상 동안, MOD-5014 약동학 및 약력학은 분석되었고, WBCT, 트롬보엘라스토그래피, aPTT, 기초 임상 병리학, 및 (동물 행동에 기반된) 임상 관찰은 평가되었다. 생분석 평가는 테스트 물품에 대하여 수행되었다.
생체내 상 - 파트 A
제1 파트 동안, 2마리 미접촉 개는 50 μg/kg MOD-5014의 초기 용량으로 일 1에서 주사되었고 WBCT 및 TEG 성능에 대하여 모니터링되었다. 일단 이들 값이 기준선 (사전-용량)으로 돌아오면, 200 μg/kg MOD-5014의 제2 용량은 주사되었다. 표 94는 파트 A의 개요를 나타낸다.
표 94 - 연구 설계 파트 A
생체내 상 - 파트 B
제2 파트 동안 그리고 파트 A의 완료 이후, 2마리 추가의 미접촉 개는 일 1에서 주사되었다. 동물은 재차 WBCT 및 TEG 성능에 대하여 모니터링되었다. 일단 그들 값이 기준선 (사전-용량)으로 돌아오면, 제2 용량은 주사되었다. 표 95는 파트 B의 개요를 나타낸다.
표 95 - 연구 설계 파트 B
생체내 상 - 파트 C
파트 B 동안 그리고 파트 A의 완료 이후, 2마리 추가의 미접촉 개는 일 1에서 주사되었다 (표 96).
표 96 - 파트 C의 연구 설계
투여의 경로에 대한 정당화
정맥내 경로는 인간에 있어서 상기 테스트 물품의 투여의 의도된 경로이다.
용량 수준의 정당화
용량 수준은 rhFVIIa에 대하여 이전에 테스트된 제안된 용량 범위 및 상 I 연구에서 추가 평가를 위하여 고려된 용량 범위를 기준으로 하여 선택되었다.
주입에 앞서 혈우병 A 개에 있어서 최소 효과적인 용량의 예측을 가능하게 할 MOD-5014의 지혈 잠재력을 평가하기 위해, 용량의 범위는 생체내 IV 투여 이후 최대 기대된 수준에 근사하는 용량 범위로 WBCT 및 TEG 스파이킹 연구에서 평가되었다. 양쪽 검정에서, 최저 용량 (0.568 μg/ml, 50 μg/kg에 대응함)으로 MOD-5014의 스파이킹은, Knudsen 등, 2011과 비슷하게, 증가된 농도로서 그러나 TEG 값의 완전한 정상화 없이 개선하였던 지혈 효과의 소수의 개선을 입증하였다. 수득된 결과에 기반하여 생체내 추가로 연구되는 최저 용량은 최저 평가된 용량 즉 50 μg/kg이었다.
투여
투여는 IV에 의한 것이었다. 테스트 물품은 8 일 동안 최대 2 회 투여되었다. 테스트 물품의 대략 10%는 ~1 분에 걸쳐 주사되었고 개는 임의의 명백한 임상 반응 (예를 들면, 두드러기 및 무관심)에 대하여 관측되었다. 개가 주사에 내성인 것으로 간주된 경우, 잔존 90%는 1 내지 5 분에 걸쳐 주입되었다. 주사 시간 및 용적은 기록되었다.
상이한 용량은 용량 용적 다양화에 의해 제공되었다. 테스트 물품의 투여 다음에는 염수 플러시되었다.
동물은 투여에 앞서 절식되었다.
연구 평가
물리적 시험: 개는 연구 진입에 앞서 일반적인 시험을 경험하였고, 정상인 일반적 시험을 가진 것만이 포함되었다.
케이지 측면 관찰: 동물의 임상 시험에서 언급된 동물의 행동 또는 일반적인 건강에 관하여 임의의 괸심은 기록되었다.
상세한 임상 관찰: 연구의 주입 상 동안, 혈액 샘플링은 수행되었다.
체중은 연구의 시작에서 그리고 연구 개시 이후 일 7과 14 사이 기록되었다.
음식 소비: 개는 1일 기준으로 음식의 그 일반적 양이 공급되었고 음식 소비에 대하여 관측되었다.
임상 병리학
임상 병리학 평가는 사전-용량으로 연구 동물에서 수행되었다. 혈소판 수, WBC, HCT, 및 HGB는 FOBRL에 의해 수행되었다. 샘플은 임의의 임상 사례가 발생해야 하는 추가 임상 화학 시험에 대하여 수집되었다.
혈장 분석
샘플 수집 및 취급
모든 혈액 샘플은 21G 또는 비교할만한 나비 바늘을 이용하여 요측피 정맥의 경피 천공에 의해 채혈되었다. 10 mL의 혈액은 1 mL 항응고제 (3.2% 시트르산나트륨 [0.12M])을 함유하는 10 mL 주사기에서 수집되었다. 시트르산나트륨은 혈액이 표준 랩 프로토콜에 따라 수집된 경우 1:10 희석되었다. 10 mL 혈액 샘플은 주사기로부터 15 mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브에 전달되었고 약하게 역전되어 용혈 없이 혼합을 보장하였다. 혈액은 그 다음 4℃에서 휴식 없이 15분 동안 3000g로 원심분리되었다. 원심분리 이후, 혈장 상청액은 신규한 15 mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브 속에 전달되었고 추가의 7 분 동안 4℃에서 휴식 없이 3000g로 원심분리되어, 다른 혈액 재료로부터 혈장의 충분한 분리를 보장하였다. 제2 원심분리 이후, 각각의 샘플로부터 혈장은 폴리프로필렌 피펫으로 폴리프로필렌 튜브에 전달되었고 -80℃ 냉동고에 즉시 배치되었다.
혈장의 100 μL의 다중 분취액은 Micronics 튜브 (또는 비교할만한 것)에 전달되었고 빠르게 냉동되었다 (-80℃). WBCT 및 TEG를 제외하고, 모든 검정 (효소-결합 면역흡착 검정 [ELISA], 활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간 [aPTT], 및 트롬빈 생성 검정 [TGA])은 주입 및 샘플링이 완료된 이후 모든 동물에 대하여 배치식으로 수행되었다.
MOD-5014 ELISA
MOD-5014 ELISA는, 상업적으로 입수가능한 항-FVIIa 항체 (Ab) 및 인하우스 다클론성 항-CTP Ab를 이용하는, MOD-5014를 구체적으로 및 선택적으로 검출하는 검정을 이용하여 수행되었다. 시트레이트화된 혈장 샘플은 사전-투여 (즉 기준선), 15 분, 30 분, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 32, 48, 72, 및 96 시간에서 수집되었다.
FVIIa 응고 활성
FVIIa 응고 활성은 혈우병 개 매트릭스에서 FVIIa 활성을 정량화시키기 위해 조정된 상업적으로 입수가능한 STACLOT VIIa-rTF 키트 (Ref #00281, Stago)를 이용하여 측정되었다.
WBCT
WBCT 검정은 28℃에서 2-튜브 절차에 의해 수행되었고, 수집 이후 테스트되었다. 1 mL의 전혈은 1 mL 주사기로 수집되었고 2 실리콘화된 튜브 (Vacutainer™, #6431, Becton-Dickinson, Rutherford, NJ) 사이 동등하게 분할되었다. 제1 튜브는 매 30 초 편향되었다. 응괴 형성 이후, 제2 튜브는 편향되었고 매 30 초 관측되었다. 종점은 제2 튜브의 응고 시간이었다. 상기 연구에서, WBCT는 사전-투여 (즉 기준선), 15 분, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 및 96 시간에서, 또는 기준선 값이 도달된 때까지 FOBRL에 의해 수행되었다.
TEG
TEG용 혈액은 각각의 샘플링 지점에서 채혈되었고 제조자의 지침에 따라 Haemoscope TEG 5000 트롬보엘라스토그래피 분석기를 이용하여 수집후 2 분 이내에 FOBRL/UNC에서 테스트되었다. 간단히, 최초 3 mL의 혈액은 폐기되었고, 그 다음 1 mL의 혈액은 채혈되었고 카올린과 혼합되었다 (Lot #A-30-05, Haemoscope에 의해 제공됨). 360 μL의 상기 사전혼합된 혈액/개시제는 기기에서 배치되었고 분석되었다. TEG 기록은 대략 60-90 분 동안 진행하게 되었다. 테스트는 사전-투여 (즉 기준선), 15 분, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 및 96 시간에서, 또는 기준선 값이 도달된 때까지 수행되었다.
aPTT
aPTT는 ST4 응고 기기 (Diagnostica Stago, Asnieres, France)를 이용하는 FOBRL/UNC에서 결정되었다. 테스트 혼합물은 부분적인 트롬보플라스틴 시약 (Triniclot, Diagnostica Stago), 0.025 M CaCl2 및 시트레이트화된 테스트 혈장의 동등 부분으로 구성되었다. 샘플은 사전-투여 (즉 기준선), 15 분, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 및 96 시간에서 테스트되었다.
데이터 분석
비-구획성 분석 및 약동학적 모델링은 Phoenix WinNonlin 버전 6.3 (Pharsight Corporation, Sunnyvale, CA.)을 가진 개별 동물 데이터 상에서 수행되었다. 분석은 MOD-5014 혈장 농도 데이터 상에서 뿐만 아니라 15,563 유닛/mg의 초기 특이적 활성을 추정하는 활성 데이터 상에서 수행되었다.
비-구획성 분석을 위하여 IV 주입용 프로그램은 사용되었다. 시간 제로부터 마지막 측정가능한 시점까지 곡선하 면적 (AUC0 -t)는 사다리꼴 방법을 이용하여 추정되었다. 마지막 3 이상 시점에 걸쳐 Log-선형 회귀는 하기 방정식으로부터 제로부터 무한대 (AUC0 -∞)까지 AUC 및 말단 반감기 (t1/ 2)를 추정하는데 사용된 제거 상수 (λ)를 추정하는데 사용되었다:
여기에서 Ct는 마지막 측정가능한 농도이다. 혈장 청소능 (CL)은 AUC0 -∞에 의해 분할된 용량으로부터 계산되었다. 관측된 시간 (Tmax) 및 최대 농도 (Cmax)는 직접적으로 데이터로부터 결정되었다. 분석이 IV 주입에 기반되었기 때문에, 주입의 초기에서 농도는 0으로 설정되었고 분포의 초기 용적은 계산되지 않았다.
약동학적 모델링을 위하여, 다양한 모델 및 적합화 전략은 1-, 2-, 및 3-구획 모델 및 상이한 칭량 반응식의 평가를 포함하여 조사되었다.
모델은 관측된 및 예상된 농도의 상관관계, 추정치 및 오차 추정치, 및 아카이케 (Akaike) 포함 기준, 한 모델의 또 다른 모델에 비교용 수학적 평가에 기반하여 평가되었다.
양쪽 혈장 농도 및 활성 대 시간 데이터는 2-구획 모델에 의해 최상으로 기재되었다. 농도 데이터는 예상된 농도의 제곱의 역원에 의해 계량되었고 활성 데이터는 예상된 농도의 역원에 의해 계량되었다. 계량 반응식은 곡선 맞춤에 걸쳐 너무 많은 영향을 발휘하는 것으로부터 초기, 고 농도를 예방한다. 모델은 도 90에서 설명된다.
모델은 중심 구획 (V1)의 분포의 용적, 제거율 상수 k10 및 구획간 속도 상수, k12 및 k21에 대하여 추정치를 생성한다. 중심 구획은 약물이 투여되고 샘플이 수집되는 구획, 이 경우에, 혈관 공간이다. 곡선의 분포 및 제거 상과 관련된 속도 상수, α 및 β는 구획간 속도 상수로부터 계산된다. 1차 파라미터로부터 계산된 다른 파라미터는 AUC, Cmax, Tmax, CL, MRT 그리고 곡선의 분포 및 제거 상과 관련된 반감기 (t1/2α, t1/2β)를 포함한다.
결과
생체외 연구 결과 :
WBCT
WBCT는, MOD-5014의 50, 100, 200, 400, 800 μg/kg, 각각의 투여 이후 생체내 Cmax에 등가이도록 계산되는, 0-9.09 μg/mL 범위의 최종 농도에서, 2마리 개별 혈우병 A 개의 혈액에 MOD-5014의 스파이킹 이후 측정되었다. 기준선 (사전) WBCT 값은 2마리 개 사이, 그러나 혈우병 A 동물에 대하여 허용가능한 범위 내에서 상이하였다 (참조 표 97).
표 97 - 갯과 혈액 MOD-5014 스파이킹 이후 WBCT
WBCT에서 상당한 감소는, 표 97 및 도 89에서 나타난 바와 같이, MOD-5014 농도의 최고 범위에서 최적의 정정 (~30 분, 내부 실험실 평가에 기반됨)으로 증가된 MOD-5014 농도로서 관측되었다.
개 P22에 대하여, 더 낮은 WBCT 기준선은 관측되었고 더 낮은 MOD-5014 농도는 효과적인 반면, 개 O93은 그것의 더 높은 기준선 값 때문에 상기 표적 WBCT 값을 도달하기 위해 더 높은 MOD-5014 농도를 요구하였다.
트롬보엘라스토그래피
용량의 범위에서 MOD-5014는 2마리 혈우병 A 개로부터 전혈 속에 독립적으로 스파이킹되었고 50-800 μg/kg 범위의 용량의 IV 주사 직후 혈액내 관련된 농도를 시뮬레이션하는데 사용되었다. 카올린-TEG 파라미터는 검정 가변성 또는 기술 오차 때문에 2 개체 사이 일부 변동 및 가변성을 가진 용량 의존 방식에서 개선되었다 (표 98).
표 98 - 카올린 -활성화된 TEG에 의해 평가된 갯과 혈우병 혈액에서 스파이킹된 MOD-5014의 효과
수득된 값은, MOD-5014의 감소된 특이적 활성 (FVIIa 특이적 활성에서 2.3-2.5 배수 감소) 및 더 낮은 FVIIa 함량 (72.3%)을 고려하여, 재조합 rhFVIIa에 대하여, Knudsen 등 2011에서 보고된 것에 비교할만 하였다.
결론: 양쪽 검정에서, 50 μg/kg에 대응하는, 0.568 μg/mL의 최저 용량은, Knudsen 등 2011로 정렬된, TEG 값의 완전한 정상화 없이 증가된 농도로서 개선하였던 지혈 효과의 개선을 입증하였다.
생체내 연구 결과:
생애 임상 시험
모든 주입은 양호하게 용인되었다. 주사 부위 반응은 언급되지 않았다. 헤모글로빈, 적혈구용적률, 백색 혈액 세포수, 또는 혈소판 수에서 유의미한 변화는 언급되지 않았다. 식욕 또는 다른 행동의 변화는 연구 기간 동안 언급되지 않았다. 임상 사례가 연구 기간 동안 발생하지 않았기 때문에, 추가의 임상 화학 파라미터 (예를 들면 간 효소 및 신장 기능)은 수행되지 않았다.
혈장, 약동학적 및 응고 분석
약동학 데이터는 아래 표 99 및 100에서 나타난다.
도 91 및 도 92는 IV 주입 이후 경시적으로 평균 MOD-5014 혈장 농도 및 활성을 나타낸다. 혈장 농도는 최초 8 내지 12 시간에 걸쳐 초기, 상대적으로 빠른 쇠퇴 그 다음 더 느린 쇠퇴를 보여준다. 활성은 50 μg/kg 그룹에서 약 32 시간 이후 그리고 200 및 400 μg/kg 그룹에서 48 시간 넘어 검정의 하한 (12.6 mU/mL) 아래에 해당하는 경시적으로 쇠퇴한다. 결과가 시간과 함께 증가하였고 2마리 동물 사이 일치하지 않았기 때문에 72 시간에서 그리고 그 넘어 600 μg/kg 용량 그룹으로부터 활성 데이터는 분석으로부터 제외된다.
도 93(A-B) 내지 도 96(A-B)는 각각의 개에 대하여 농도 및 활성을 함께 플롯팅한다.
50 및 200 μg/kg 용량 그룹 (도 93(A-B) 및 94(A-D))에서, 농도 및 활성은 주입 이후 8 내지 12 시간을 통해 유사한 패턴을 따랐고 그 다음 농도는 떨어지는 수준이 되는 경향이 있었고 반면에 활성은 검정의 수준 밑으로 떨어졌던 때까지 계속 쇠퇴하였다. 400 및 600 μg/kg 그룹 (도 95(A-B) 및 96(A-B))에서, 활성은 주입 직후 시작하는 농도보다 어느 정도 더 빨리 떨어지는 것처럼 보였다. 농도 곡선은 떨어지는 수준이 되는 경향이 있었고 반면에 활성 곡선은 이들이 검정 한계 밑으로 떨어졌거나, 600 μg/kg 그룹의 경우에서, 분석으로부터 제외되었던 때까지 더 빠르게 쇠퇴하였다.
비-구획성 분석의 결과는 농도 및 활성 데이터, 각각에 대하여 표 99 및 표 100에서 보여진다. 비-구획성 분석의 결과는 샘플링의 지속기간이 약동학적 및 약력학적 프로파일을 기재하는데 적절하였던 것을 표시하는 모든 경우에 AUC0 -t가 AUC0-∞만큼 거의 컸다는 것을 표시하였다. 도 97(A-J) 및 도 98(A-J)는 각각의 개에 대하여 농도 및 활성 대 시간을 보여준다. 추정된 말단 기울기는 실선에 의해 이들 그래프에서 표시된다. 각각의 그래프는 또한 (Rsq 및 Rsq_조정된) 결정의 계수, 기울기를 추정하는데 사용된 지점의 수, 및 t1/2 (HL_람다_z)를 포함하는 말단 기울기의 추정에 관련된 정보를 함유한다.
(200 μg/kg 그룹에서) 하나의 예외로 혈장 농도 및 활성 수준 양쪽은 측정된 제1 시점 (0.25 시간)에서 최고이었다. 양쪽 농도 및 활성은 용량 관련되었고 용량 그룹에 걸쳐서 Cmax/용량 및 CL 파라미터 추정치에 의해 표시된 경우 대략 용량 비례하였다. 양쪽 농도 및 활성 방안에 의해, CL은 최저 용량에서 어느 정도 더 빠른 것처럼 보였다. 최저 용량에서, 농도 및 활성은 32 시간 이후 검정 한계 밑으로 떨어졌고, 가능하게는 상기 용량에서 약동학의 전체 특성규명을 제한하였다. CL은 활성 측정에 비교된 농도 측정에 기반하여 유사하였다. 농도에 기반하여 추정된 t1/ 2은 200 μg/kg 그룹 (19.3 시간) 및 50 μg/kg 그룹 (7.76 시간)에 비교하여 400 및 600 μg/kg 용량 (>40 시간) 이후 훨씬 더 길었다. 활성에 기반하여 말단 t1/2는 대략 3 내지 5 시간이었고 용량 그룹에 걸쳐서 유사하였다.
모델에서 기반된 AUC 및 CL의 추정치는 비-구획성 분석으로부터 유래된 것과 매우 양호하게 일치하였다. 모델로부터 유래된 분포의 겉보기 용적은 혈장 농도에 기반하여 대략 90 내지 120 mL/kg이었고 (낮은 용량 그룹에서 더 컸고) 활성에 기반하여 40 내지 70 mL/kg이었다. 양쪽 혈장 및 활성 측정에 대하여 모델에 의해 추정된 t1/2β는 비-구획성 분석에 의해 추정된 말단 t1/2과 매우 유사하였다.
MRT는 개별 약물 분자가 순환하는 시간의 추정치이다. MRT 추정치는 대략 4 내지 7 시간으로, 활성에 기반하여 용량 그룹에 걸쳐서 일치하였다. 농도에 기반하여, MRT는 200 및 50 μg/kg 그룹 (16.6 및 11.7 시간, 각각)에 비교하여 더 높은 용량에서 더 길었다 (대략 25 시간).
비-구획성 분석에 의해 농도 및 활성 데이터에 대하여 계산된 파라미터는 아래 표에서 요약된다. 약동학의 특성규명이 검정 감수성에 의해 제한되고 있을 수 있는 50 μg/kg 용량 그룹을 예외로, 혈장 청소능은 혈장 농도 및 활성에 의해 측정된 경우 용량 그룹에 걸쳐서 유사하였다.
표 99 - 비- 구획성 분석에 의해 추정된 개에서 IV 주입 이후 농도 측정에 기반된 평균 MOD-5014 약동학적 파라미터
표 100 - 비- 구획성 분석에 의해 추정된 개에서 IV 주입 이후 활성에 기반된 평균 MOD-5014 약동학적 파라미터
혈우병 개에 rhFVIIa의 투여 이후, 항원 FVIIa 수준에 기반하여 그것의 반감기가 3시간이었고, 활성에 기반하여 1.8시간이었다는 것이 이전에 보고되었다 (Knudsen 등, 2011, 표 101에서 아래 요약됨).
FVIIa에 CTP의 부착은 항원 및 활성 수준, 각각에 기반하여 19.3-45 시간 및 4.72-5.22로 반감기를 상당히 증가시켰고, 따라서 보고된 데이터에 비교하여 3-5-배의 평균 만큼 생성물 반감기를 확장시켰다. 청소능은 유사한 방식으로 영향받았고, Knudsen 등 2011에 비교된 경우 2-3-배 만큼 상당히 감소되었다.
전혈 응고 시간 (WBCT) 분석
WBCTs는 기준선 값이 달성된 때까지 모니터링할 목적으로, 사전-투여 (즉 기준선), 15 분, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48에서 FOBRL에 의해 수집 이후 테스트되었다. 표 102에서 나타난 바와 같이, 모든 동물의 평균 사전-용량 WBCT 시간은 실제로 혈우병 개 기대된 WBCT의 더 낮은 범위 (50-35분)이었다.
전혈 카올린 - 트롬보엘라스토그래피 ( WB 카올린 - TEG )에 의해 혈우병 개에서 MOD-5014 특성규명
카올린-TEG 파라미터는 모든 개에 대하여 그리고 모든 용량에서 MOD-5014 투여후 지정된 시점에서 모니터링되었다. 상기 구체적 분석의 목적은 시간으로 TEG의 동력학을 특성규명하는 것, 상이한 파라미터 (R, K, 각, MA)의 정상화가 상이한 동물에 걸쳐서 발생하였던 최소 용량, 개체 내에서 용량-의존적 반응을 평가하는 것 그리고 마지막으로 유사한 용량 범위에서 rhFVIIa에 대하여 공개된 데이터 뿐만 아니라 건강한 개에서 수득된 정상 값과 MOD-5014 투여 이후 전체 TEG 프로파일을 비교하는 것이었다 (Knudsen 등, 2011). 개별 데이터는 도 101 (A-D), 102 (A-D), 103 (A-D), 104 (A-D), 105 (A-D) 및 106 (A-D)에서 제공된다.
상이한 용량에서 투여 이후 MOD-5014 전혈 카올린-TEG 성능
2마리 개에 투여된 50μg/kg의 초기 용량은, 투여후 불량한 R, K, 각 및 MA 값에 의해 반영된 바와 같이 (동물 P14; 도 102 (A-D)), TEG 성능을 상당히 개선할 수 없었지만, 다수의 파라미터는 용량이 200μg/kg으로 증가된 경우 개선되었다. 제2 동물 (N06)에서 TEG 값은 또한 50 μg/kg MOD-5014의 투여 이후 개선되지 않았고; 추가 개선이 투여후 관측되지 않았어도, 이것은, 불량한 투여후 반응에서 직접적인 효과를 잠재적으로 가졌던, 사전-용량에서 부분적으로 정상화된 TEG 값의 결과일 수 있다. 상기에 기반하여 50μg/kg 용량이 테스트된 개에서 지혈 결함을 지지하고 정정하는데 적절하지 않다는 것이 제안되었다.
다수의 동물에서 200 μg/kg MOD-5014의 투여는 여전히 정상 범위 미만인 값으로 TEG 파라미터를 정정하였지만, 50ug/kg 용량보다 상당히 더욱 확연한 효과를 제공하였다. 400μg/kg의 용량에서 TEG 값 및 장기적인 반응에 있어서 약간의 개선은 수득되었다 (도 102 (A-D); 103 (A-D) 및 104 (A-D)). 600μg/kg으로 2개의 상이한 동물 투여 경우, 하나의 동물 (Joanie; 도 105 (A-D))에서 반응은 400μg/kg으로 복용된 동물에 비교할만 하였다. 동물 N05 (도 106 (A-D))에서 K 시간, 각 및 MA 값이 정상 범위를 도달하였던 동안, 이것은 또한 개선된 사전-용량 값 및 인터-동물 가변성의 결과일 수 있다. 용량의 범위에서 MOD-5014의 투여가 TEG 값의 부분적인 정정을 가능하게 하였고, 반면에 최적의 최소 효과적인 용량이 MOD-5014의 200-400μg/kg의 범위이었던 것으로 보인다.
MOD-5014 전혈 카올린-TEG 용량-의존적 반응의 동물내 가변성
더 높은 용량이 동일한 동물에 주사된 경우 동물내 용량-의존적 개선은 관측되었다. 정상 생물학적 변동 (도 101 (A-D), 102 (A-D), 103 (A-D), 104 (A-D), 105 (A-D) 및 106 (A-D))을 반영할 수 있는, 상이한 시점에서 일부 변동이 관측되었다. 개선은, 도 101 (A-D), 102 (A-D), 103 (A-D), 104 (A-D), 105 (A-D) 및 106 (A-D)에서 나타난 바와 같이, 00 및 400 μg/kg (Blondie 및 Josie) 투여 경우 가장 확연하였다.
개체 사이 MOD-5014 전혈 카올린-TEG 결과의 재현성 (동물간 가변성)
도 101 (A-D), 102 (A-D), 103 (A-D), 104 (A-D), 105 (A-D) 및 106 (A-D)에서 관측된 바와 같이, 동물이 MOD-5014의 투여 이후 TEG 값을 정정하였어도, 이들은 측정의 시간을 통해 상이한 프로파일을 입증하였다. 이것은, 각각의 동물의 상이한 유전적 배경 및 사전-용량 값에서 약간의 차이를 고려하여, 생물학적 가변성의 결과일 수 있다. 관측된 변동은 실제로 임상 셋팅을 모방하고, 여기에서 개별 TEG 값은 유사한 투여를 받은 개체 사이 다양할 수 있고, 결국 FVIIa의 상이한 효능 및 출혈 대조 능력으로 해석할 수 있다.
장기-작용성 생성물로서 MOD-5014
MOD-5014 및 rhFVIIa의 정정 능력의 비교는 MOD-5014 최대 및 최소 값이 hFVIIa에 대하여 보고된 결과와 매우 유사하다는 것을 시사한다. 그러나, 반응의 지속기간에서 마킹된 개선은 MOD-5014로 관측되었다. hFVIIa 투여 이후 다수의 hFVIIa 분석된 파라미터는 투여후 4 시간에 기준선으로 떨어졌고 (도 107(A-D)), 반면에 MOD-5014는 투여후 24 시간에 기준선 값을 도달하는 확장된 효과를 가능하게 하고 더욱 지속된 및 장기적인 반응을 제공한다 (도 108(A-D); 흑색 화살표로 마킹됨). 데이터는 TEG 반응의 지속기간이, 추가로 조사된, 후속적으로 MOD-5014 투여 이후 확장된 반응을 확인하는, 혈우병 개에서 FVIIa 짧은 PK-PD 프로파일에 상관관계가 있다는 것을 시사한다.
활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 성능
Triniclot 시약을 활성제로서 그리고 60 초 인큐베이션을 이용하여, 갯과 혈우병 A 혈장에 대하여 aPTT 값은 65.6 초이었다 (데이터 도시되지 않음). MOD-5014 투여 이후, aPTT는 40 초까지 아래로 용량-의존 방식으로 감소되었다. 상기 정보를 이전에 보고된 데이터와 비교한 경우, FVIII-결핍된 개에 193μg/kg rhFVIIa의 투여전 및 투여후 수득된 값에 매우 유사하다는 것이 발견되었고 (Brinkhous 등, 1989), 반면에 회고 분석은 투여후 24 시간에 기준선 aPTT 값으로 차후의 복귀로, 200μg/kg MOD-5014 투여 경우 장기적인 효과를 시사한다.
결론: 상기 연구에서, 신규한, 장기-작용성 FVIIa (MOD-5014)의 안전성, PK, PD 및 혈우병 응고장애 정정 능력은 FVIII-결핍된 개에서 평가되었다. MOD-5014는 관련된 임상 용량으로 투여되었고, 반면에 개에서 잠재적인 최소 효과적인 용량은 생체외 연구에 기반하여 초기에 확립되었다.
MOD-5014는 모든 개에 의해 양호하게 용인되었고 유해 사례는 관측되지 않았다. 용량-의존적 반응은 양쪽 PK 및 PD (활성화 측정) 분석에서 관측되어, 추가로 공개된 파라미터에 비교하여 MOD-5014의 장기-작용성 특성을 확인하였다 (Knudsen 등 2011).
재조합 인간 FVIIa는 혈우병 갯과 품종에서 유효하다는 것이 이전에 나타났다. TEG 응고 프로파일의 마킹된 개선은 200-400μg/kg의 용량으로 MOD-5014의 투여 이후 관측되었고, 반면에 50μg/kg의 더 낮은 용량은 TEG 값을 정정할 수 없었고, 개에서 최소 효과적인 용량 미만인 것을 시사하였다. 용량-의존적 반응은 MOD-5014 투여 이후 관측되었고, 반면에 개체간 변동은 기대된 것보다 더 높았고 생물학적 가변성의 결과일 수 있다. MOD-5014 성능을 공개된 데이터와 비교하는 경우, MOD-5014는 더 낮은 용량 (270 및 200 μg/kg, 각각)에서 확연한 및 장기적인 효과를 가졌다. MOD-5014 생체내 활성은 또한 aPTT 값에서 감소에 의해 반영되었고, 추가로 응고 시스템의 지속된 활성화를 확인하였다.
일반적으로, 혈우병 개에서 MOD-5014 테스팅은 설치류 모델 예컨대 마우스 및 랫트에 대하여 몇 개의 이점을 제공한다. 혈우병 개는 인간의 것을 밀접하게 개요하는 질환 표현형을 나타내고; 또한, 개는 체중 뿐만 아니라 FVIIa 투여 요건 및 약동학적 특징에 관하여 인간과 더욱 비교할만하다.
전반적으로, 상기 연구는, 구체적으로 지혈에 관하여, 인간 생물학의 정확한 개요를 제공하기 위해 이전에 보여준 관련된, 양호하게-확립된 모델에서 MOD-5014의 장수를 추가로 확인하였다. 상기 연구에서 수득된 데이터는 상당한 값을 갖고 MOD-5014가 억제제로 혈우병 환자의 양쪽 예방적 및 요구시 치료를 위하여 제제로서 잠재적으로 사용될 수 있는 대형 동물에서 안전한 및 효과적인 장기-작용성 FVIIa인 제1 증거를 제공한다. 따라서, MOD-5014는 투여의 빈도 감소 및 예방적 용도 가능화에 의해 환자를 상당히 유익하게 하는 엄청난 잠재력을 갖는다.
실시예 15: 웨슬러 토끼 모델에서 단일 투여 이후 MOD-5014 및 재조합 FVIIa 혈전형성 잠재력의 비교 평가
목적: 이 연구의 목적은, FVIII 또는 FIX, 각각에 대한 억제제로 혈우병 A 또는 B를 가진 환자의 치료를 위하여 의도되는, MOD-5014를 평가하는 것이었다. 이 연구의 또 다른 목적은 덜 빈번한 투여의 목적과 함께 자발적인 출혈 (예를 들면 관절 출혈)의 요구시 치료를 위하여, 뿐만 아니라 환자의 임상 조건 및 삶의 질을 상당히 개선할 수 있는 1 주 2 내지 3회의 기대된 투여 레지멘을 가진 예방적 용도를 위하여 MOD-5014를 평가하는 것이었다.
이 연구의 추가 목적은 하기에 의해 기재된 반-정량적 방법을 이용하여 테스트 항목 MOD-5014의 혈전형성 잠재력을 평가하는 것이었다: 웨슬러 등 (1959) Serum-induced thrombosis. Studies of its induction, and evolution under controlled conditions in vivo. Circulation Nov; 20:864-74; 및 Wesslet 등 (1959) Biologic assay of a thrombosis inducing activity in human serum. Journal of Applied Physiology 14, 943-946. 0.1 및 0.3 mg/kg의 용량 수준에서 재조합 FVIIa NovoSeven®의 음성 대조 그룹 및 양성 대조 그룹과 비교되었다.
이 연구는 마비된 토끼에서 수행되었다.
정당화: 이 연구의 목적은 MOD-5014의 혈전형성 잠재력을 평가하는 것이었다. 웨슬러 토끼 모델은 정맥 혈전증 평가를 위한 고전적 모델이다. 상기 모델의 감수성은 하기에 기반된다: 1) 인간보다 더 높은 응고 인자 수준으로 높은 내인성 토끼 지혈 잠재력 및 2) 활성화된 인자에 노출되면, 정맥 정체가 혈전 형성을 위하여 일반적으로 엄청난 소인을 제공하는 엄청난 조직 손상을 교사하는 것 (웨슬러 등 (1959), Karges 등 (1994) Activity of coagulation and fibrinolysis parameters in animals. Arzneimittelforschung. Jun; 44(6):793-7.) Novoseven은 토끼 정체 모델에서 재조합 인간 FVIIa의 혈전형성성을 탐구하였던 이전의 연구에 기반하여 양성 대조로서 사용되었다 (Diness 등 (1992) Recombinant human factor VIIa (rFVIIa) in a rabbit stasis model. Thromb Res 67(2), 233-41).
연구 개요: 음성 대조, 양성 대조 및 MOD-5014는 정맥내 1회 투여되었고; 이것은 투여의 임상 경로이었다.
용량 선택 근거( Rational ): 용량 수준은 Novoseven (Diness 등 (1992) Recombinant human factor VIIa (rFVIIa) in a rabbit stasis model. Thromb Res 67(2), 233-41) 상에서 수행되었던 토끼 정체 연구로부터 이용가능한 데이터를 기준으로 하여 그리고 상 1-2a 임상 연구에서 MOD-5014 기대된 용량을 고려하여 선택되었다. 낮은 용량은 μg/kg 기준으로 형식적 낮은 임상 용량이고 상 1-2a 연구에서 낮은 용량 (50 μg/kg) 중 하나로서 사용하기 위해 FDA에 의해 승인되었다 (참조 아래 실시예 16). 더 높은 용량은, 상 1-2a 임상 연구에서 μg/kg 기준으로 기대된 최고 임상 용량인, 400 μg/kg이다.
재료 및 방법
테스트 항목: 설명, 확인 및 저장
테스트 항목은 MOD-5014, ER 배치 1017295로서 확인되었다 (유효 기일: 2015년 4월) 사용하지 않을 때 테스트 물품은 밀봉된 용기에서 저장되었다.
저장 조건: 냉동 (-60 내지 -90℃).
음성 대조는 20mM 시트레이트 150mM NaCl 13.3mM 글리신 pH 6.4로서 확인되었던 테스트 물품용 비히클이었다.
저장 조건: 냉장 (2 내지 8℃).
양성 대조 항목은 NovoSeven으로서 확인되었다.
명칭: NovoSeven (MOD-5000로서 참조됨)
배치 번호: 050115
설명/외관: 냉동된, 투명 무색 액체
분말 바이알의 유효 기일: 2016년 8월
저장 조건: 냉동 (-60 내지 -90℃)
마취제는 케타민 및 크실라진으로서 확인되었다.
사용하지 않을 때 마취제는 밀봉된 용기에서, 실온 (명목상으로 15 내지 25℃)에 저장되었고 빛으로부터 보호되었다.
테스트 항목 (MOD-5014) 및 양성 대조 제형
제제
테스트 물품은 빙상에서 20-30 분 동안 해동되었다. 각각의 일에, 사용에 앞서, 4.8 mL의 제형 완충액은 1　mg/ml의 최종 농도까지 테스트 물품의 3ml에 첨가되었다 (2.6 mg/ml). 상이한 용량은 용량 용적 변경에 의해 달성되었다.
NovoSeven은 빙상에서 20-30 분 동안 해동되었고, 받은채로 사용되었다. 상이한 용량은 용량 용적 변경에 의해 달성되었다.
마취제
마취제는 케타민 및 크실라진으로서 확인되었다. 사용하지 않을 때 마취제는 밀봉된 용기에서, 실온 (명목상으로 15 내지 25℃)에 저장되었고 빛으로부터 보호되었다.
테스트 동물
총 40 숫컷 Hsdlf:(NZW) (New Zealand White) 토끼는 Harlan UK로부터 수득되었다 토끼는 투여의 날에 2.45 내지 3.40 kg 계량되었다.
실험적 설계
음식 및 물은 자유롭게 이용가능하였고, 동물이 연구 절차를 위하여 집 우리로부터 제거된 경우 예외이었다.
마취는 케타민 (40 mg/kg) 플러스 크실라진 (5 mg/kg)의 근육내 주사에 의해 유도 및 유지되었다. 마취의 유도 이후, 토끼는 가열된 블랭킷 상에 배치되었다. 온도는 직장 프로브로 모니터링되었고 허용가능한 한계 (명목상으로　35　내지 39℃) 내에서 유지되었다.
목은 배쪽으로 면도되어 경정맥의 양측성 절개를 용이하게 하였다. 일단 정맥이 위치하였으면, 원위 및 근위 결찰은 1 내지 1.5 cm의 거리에서 배치되었지만, 강화되지 않았다.
테스트 항목, 양성 대조 또는 비히클은 용량에 적응된 용적을 이용하여 귀 정맥 반대측에 (결찰된 제1 경정맥에) 주사되었다 (참조 아래 표).
연구에 이용된 치료는 아래 표 103에서 보여진다:
용량 투여 직후 적절한 경정맥의 근위 말단은 결찰 강화에 의해 순환으로부터 단리되었다. 이것은 그 다음 잔존 경정맥에서 반복되었다. 25　초 이후 양쪽 원위 결찰은 강화되었다. 강화 10 분후 하나의 정맥 세그먼트 (이것은 모든 동물에 대하여 동일하게 유지되었다)는 동물로부터 주의하여 제거되었고, 3.8 % 시트르산나트륨 용액을 함유하는 페트리 접시에 전달되었고 절단 개방되었다. 혈전의 형성은 표 104에서 아래에 기재된 바와 같이 평가되엇다. 상기 절차는 그 다음 강화 30 분후 잔존 경정맥에서 반복되었다.
통계 분석
10 및 30 분 후 혈전 형성 스코어는 분석을 위하여 제공되었다. 각각의 시점에서 데이터는 개별적으로 분석되었다.
하기 관심의 비교는 Wilcoxon Rank Sum 테스트를 이용하여 실시되었다:
그룹 1 대 그룹 2 내지 8
그룹 3 대 그룹 7
그룹 5 대 그룹 8
결과
결과는 표 105에서 요악되고, 개별 동물 데이터는 표 106에서 나타난다.
표 105: MOD-5014 및 NovoSeven의 정맥내 투여 이후 혈전형성성의 요약
표 106: MOD-5014 및 NovoSeven의 정맥내 투여 이후 혈전형성성 평가 - 개별 동물 데이터
웨슬러 스코어
음성 대조의 정맥내 투여는 10 분후 0.0의 웨슬러 스코어를 생산하였다. 스코어는 30 분후 0.2 ± 0.27의 평균 스코어를 가진 0.0 내지 0.5 범위이었다.
0.05 mg/kg의 용량 수준에서 MOD-5014의 정맥내 투여는 10 분후 0.1 ± 0.22의 그룹 평균 스코어를 가진 0.0 내지 0.5의 범위에서 웨슬러 스코어를 생산하였다. 스코어는 30　분후 3.4 ± 0.82의 평균 스코어를 가진 2.0 내지 3.5 범위이었다.
0.1 mg/kg의 용량 수준에서 MOD-5014의 정맥내 투여는 10 분후 0.1 ± 0.22의 그룹 평균 스코어를 가진 0.0 내지 0.5의 범위에서 웨슬러 스코어를 생산하였다. 스코어는 30 분후 3.5 ± 0.87의 평균 스코어를 가진 2.0 내지 4.0 범위이었다.
0.2 mg/kg의 용량 수준에서 MOD-5014의 정맥내 투여는 10 분후 0.2 ± 0.45의 그룹 평균 스코어를 가진 0.0 내지 1.0의 범위에서 웨슬러 스코어를 생산하였다. 스코어는 30 분후 3.8 ± 0.45의 평균 스코어를 가진 3.0 내지 4.0 범위이었다.
0.3 mg/kg의 용량 수준에서 MOD-5014의 정맥내 투여는 10 분후 0.6 ± 0.89의 그룹 평균 스코어를 가진 0.0 내지 2.0의 범위에서 웨슬러 스코어를 생산하였다. 30 분후 모든 스코어는 4.0이었다.
0.4 mg/kg의 용량 수준에서 MOD-5014의 정맥내 투여는 10 분후 0.3 ± 0.45의 그룹 평균 스코어를 가진 0.0 내지 1.0의 범위에서 웨슬러 스코어를 생산하였다. 스코어는 30 분후 3.6 ± 0.89의 평균 스코어를 가진 2.0 내지 4.0 범위이었다.
0.1 mg/kg의 용량 수준에서 NovoSeven의 정맥내 투여는 10 분후 0.1 ± 0.22의 그룹 평균 스코어를 가진 0.0 내지 0.5의 범위에서 웨슬러 스코어를 생산하였다. 스코어는 30 분후 3.5 ± 0.87의 평균 스코어를 가진 2.0 내지 4.0 범위이었다.
0.3 mg/kg의 용량 수준에서 NovoSeven의 정맥내 투여는 10 분후 0.5 ± 0.87의 그룹 평균 스코어를 가진 0.0 내지 2.0의 범위에서 웨슬러 스코어를 생산하였다. 스코어는 30 분후 3.8 ± 0.45의 평균 스코어를 가진 3.0 내지 4.0 범위이었다.
통계 분석 결과, 표 107
표 107
통계 분석은 10 분후 혈전 형성이 모든 그룹에 대하여 비교할만 하다는 것을 보여준다. 그러나, 분석은 30 분후 모든 용량 수준에서 MOD-5014의 투여가 음성 대조와 비교된 경우 혈전 형성에서 통계적인 상당한 효과를 생산하였다는 것을 보여준다.
0.1 및 0.3 mg/kg의 용량 수준에서 MOD-5014의 투여는 동일한 용량 수준에서 NovoSeven에 비교된 경우 혈전 형성에서 통계적으로 유의차를 생산하지 못했다.
결론
마취된 토끼에서 0.1 및 0.3 mg/kg의 용량 수준에서 MOD-5014 및 동일한 용량 범위에서 NovoSeven의 투여는 비교할만 하였던 웨슬러 스코어를 생산하였고 따라서 유사한 혈전형성 잠재력을 생산하였다.
실시예 16: 혈우병 A 또는 B를 가진 성인 남성에서 장기-작용성 재조합 인자 VIIA (MOD- 5014)의 안전성, 약동학 및 약력학 프로파일을 평가하기 위한 상 1/2A, 개방-표지, 다중중심, 용량 단계적 확대 연구
목적:
1차: 억제제가 있거나 없는 혈우병 대상체에서 상승 MOD-5014 용량의 단일 정맥내 (IV) 투여의 급성 안전성 및 내성을 평가하기 위해.
2차: 억제제가 있거나 없는 혈우병 대상체에서 상승하는 MOD-5014 용량의 단일 IV 투여의 약동학적 프로파일을 평가하기 위해.
탐구: 억제제가 있거나 없는 혈우병 대상체에서 상승하는 MOD-5014 용량의 단일 IV 투여의 약력학적 반응을 평가하기 위해.
연구 설계 및 절차
이것은 단일-용량, 개방 표지, 용량-상승 연구일 것이다. 연구는 2 스테이지로 수행될 것이고, 각각의 스테이지는 설계 (방문 및 평가)에서 유사할 것이다:
스테이지 1: 이 스테이지는, 각각의 용량 그룹에서 4 대상체를 가진, 3 상승 용량 그룹을 포함할 것이다. 초기 MOD-5014 용량은 25 μg/kg 그 다음 50 및 100, μg/kg의 용량일 것이다. 각각의 용량 집단에서 제1 대상체는 단일 IV 주사를 받은 다음 72 시간 안전성 관찰 이후 그 집단에서 나머지 3 대상체가 투여되었다. 각각의 집단에서 마지막 대상체의 투여 다음에는 7, 14 및 30-일 안전성 관찰 기간일 것이다. 스테이지 1 데이터는 스테이지 2의 개시에 앞서 FDA에 제출될 것이다. DSMB로부터 계속되는 승인 및 IRB에 대한 통지시에만, 스테이지 2로의 등록은 개시될 것이다.
스테이지 2: 이 스테이지는 스테이지 1과 실제로 유사할 것이고 스테이지1에서 평가된 것보다 더 높은 용량을 평가하기 위해 3 상승 용량 그룹을 포함할 것이다. 스테이지 2에서 평가되는 용량은, 각각의 용량 그룹에서 4 대상체로, MOD-5014의 200, 300 및 400 μg/kg을 포함한다.
각각의 연구 스테이지에 대하여, 더 높은 용량 수준으로 진행하는 결정은, 이전의 용량 그룹의 마지막 대상체의 용량후 7 일을 포함하고 최대로 수집된, (유해 사례, 임상 실험실 및 활력 징후를 포함하는) 관련된 안전성 데이터의 검토후 DSMB에 의해 실시될 것이다.
유해 사례 공통 용어 등급 (CTCAE) 지침은 최대 용인된 용량 (MTD) 및 용량 제한 독성 (DLT)을 결정하는데 사용될 것이다 (표 108). 용량 단계적 확대는 선행 용량이 양호하게 용인되면 허용될 것이고, 투여후 7 일 동안 안전성 또는 내성 문제는 없다.
중단 규칙 및 용량 제한 독성 (DLT)
DLT는 질환 진행, 병발성 병 또는 수반되는 약물에 관련없는 및 투여 일후 최대 7 일 발생하는 경우 평가된 임상적으로 상당한 유해 사례 또는 비정상 실험실 값으로서 정의된다. 예를 들어, 등급 3 또는 4는 확실하게 또는 가능하게는 약물-관련된다. 혈전색전성 사례가 보고된 경우에서, 연구는 중단될 것이고 DSMB는 사례 및 MOD-5014 단일 용량 투여에 대한 그것의 관계를 추가로 조사하도록 요청될 것이다. 표 108은 용량 단계적 확대 기준 및 결정 트리를 요약한다.
표 108: MOD-5014 관련된 독성 및 용량 단계적 확대 기준 반응식
연구 절차
각각의 연구 스테이지는 선별 기간 (28 ± 1 일), 치료 일 및 추적검사 기간 (7, 14 및 30 일)로 구성될 것이다. 각각의 연구 스테이지 및 용량 그룹에 대하여, 방문 계획 및 평가는 유사할 것이다.
선별 기간 (일 -28 내지 -1) - 방문 1
고지에 의한 동의 서명 이후, 중간 정도 또는 중증 선천성 혈우병 A 또는 B로 진단되고 있는, 18-65 연령의 성인 남성 대상체는 포함 및 제외 기준의 평가에 의해 연구 적격성으로 선별될 수 있다. 선별 절차는 인구통계 데이터, 완전한 및 질환-관련된 병력, 물리적 시험 (신경적 평가, 높이 및 중량 포함), 활력 징후 (혈액 압력, 펄스 속도, 경구 온도 및 호흡 속도), ECG, 유해 사례, 수반되는 약물 및 혈액학, 생화학, 요검사, 응고 (프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간 (aPTTa))를 포함하는 안전성 실험실 평가의 수집을 포함할 것이다.
사전-투여 일 (일-1)
적격 대상체는 하기를 확인하기 위해 투여 이전 밤에 전화로 접촉될 수 있다: 대상체가 아래에 기재된 바와 같이 대체 요법을 받지 않았다 (표 109). 아래 기재된 시간 제한에 관하여 통화의 시간은 고려될 것이다. 이들이 그 밤 동안 출혈 에피소드를 가질 것이고 대체 요법을 투여할 것이면, 이들은 다음날 아침 치료소에 오지 않아도 되지만, 그 연구 접촉자를 불러야 한다.
표 109: 투여에 앞서 금지된 대체 요법
치료 일 (일 0) - 방문 2
사전-용량
치료소에서, 하기 평가 및 절차는 투여에 앞서 실시되어야 한다: 물리적 시험 (신경적 평가 포함), 활력 징후, 심전도 (ECG), 안전성 실험실 (혈액학, 생화학 및 요검사), PT, 사전-용량a 1 시간 이내 aPTT, 면역원성, 약동학 (사전-용량 1 시간 이내)b, 약력학 (STAClot 검정을 통한 FVIIa 활성), 트롬보엘라스토그래피 (사전-용량 1 시간 이내), 트롬빈 생성 (사전-용량 1 시간 이내), 유해 사례 및 수반되는 약물.
투여
대상체는 (용량 집단에 의해 정의된) 중량 및 MOD-5014 용량에 기반하여 단일 정맥내 주사를 받을 것이다.
사후-용량
하기 평가 및 절차는, 표시된 대로 투여후 시점에서, 일 0에서 수행될 것이다:
· 1 ± 0.5 시간, 4 ± 0.5 시간 및 8 시간 ± 0.5 시간에서 활력 징후 (혈액 압력, 펄스, 호흡수, 온도)
· 1 ± 0.5 시간, 4 ± 0.5 시간 및 8 ± 0.5 시간에서 ECG
· 4 ± 0.5 시간에서 안전성 실험실 (혈액학, 생화학 및 요검사) 평가
· 30 ± 5 분, 2 시간 ±20 분, 4 ± 0.5 시간 및 8 ± 1 시간에서 응고 패널
· 30 ± 5분, 2 시간 ± 20 분, 4 ± 0.5 시간 및 8 ± 1 시간에서 약동학
· 30 ± 5분, 2 시간 ± 20 분, 4 ± 0.5 시간 및 8 ± 1 시간에서 약력학. 검정은 하기를 포함한다:
o STAClot 검정을 통한 FVIIa 활성
o 트롬보엘라스토그래피 (선택적)
o 트롬빈 생성
· 수반되는 약물
· IV 투여의 마지막 이후 10 분 및 2 시간 ± 20 분에서 투여 부위에 국부 피부 반응
· 유해 사례
추적검사 (FU) 기간 (방문 3 내지 8, 일 1 내지 30)
추적검사 기간은 투여 다음 날 시작할 것이다. 대상체는 사후-용량 30 일 동안 따르고 아래에서 요약한 바와 같이 6 추적검사 방문을 경험한다. FU 방문 3 / 일 1 (24 시간), FU 방문 4 / 일 2 (48 시간) 및 FU 방문 5/ 일 3 (72 시간)에서 하기가 수행된다: 물리적 시험 (신경적 평가 포함) (방문 3 및 5 단독), 활력 징후, ECG, 안전성 실험실 (혈액학, 생화학 및 요검사), 응고 패널 (단일 채혈), 약동학 (단일 채혈), 약력학 (단일 채혈), 트롬보엘라스토그래피, 트롬빈 생성, 유해 사례, 국부 피부 반응 및 수반되는 약물. 응급 약물이 최초 72 시간 이내 투여되었다면, FU 방문 5 단독이 수행된다.
출혈 에피소드에 대하여 응급 치료가 투여되지 않았다면 하기 연구 절차는 FU 방문 6 / 일 7에서 실시될 것이다: 물리적 시험 (신경적 평가 포함), 활력 징후, ECG, 안전성 실험실 (혈액학, 생화학 및 요검사), 응고 패널, 약동학, 약력학, 트롬보엘라스토그래피, 트롬빈 생성, 유해 사례 및 수반되는 약물. 출혈 에피소드가 최초 72 시간 이후 발생하였고 응급 치료가 투여되었던 사례에서, 환자 임상 웰빙에 관한 전화기 설문지는 완료된다.
FU 방문 7-8, 일 14 및 30 (방문 종료)
하기 연구 절차는 이들 방문시 실시될 것이다: 면역원성, 항 HCP 항체 (방문 8 단독), 유해 사례 및 수반되는 약물.
연구 지속기간
각각의 참가 대상체에 대하여 연구 지속기간은 아래와 같이 최대 58 일이다:
· 선별 기간: 약물 투여 이전 -28 내지 -1 일
· 치료: 1 일 단일-용량 투여
· 추적조사: 적어도 72 시간 급성 안전성, 7 일 안전성, 및 14, 및 30 일 면역원성
샘플 크기 및 표적 집단
중간 정도 또는 중증 선천성 혈우병 A 또는 B로 진단된, 이십사 (24)명 성인 남성 대상체 (18-65 연령), 각각의 연구 상에서 12 대상체. 각각의 용량 그룹은 4 대상체를 포함한다.
포함 기준
대상체는 연구에 적격이도록 모든 포함 기준을 충족시켜야 한다:
1. 남성, 18-65 세, (포함), 선별 방문에서.
2. 3% 정상 FVIII 또는 FIX 수준, 각각 미만 또는 동등으로 한정된, 억제제가 있거나 없이 중간 정도 또는 중증 선천성 혈우병 A 또는 B의 진단.
3. 체질량 지수 (BMI) 35.0 kg/m2 미만.
4. 적절한 정맥 접근.
5. 가임 남성은 투여후 90 일 동안 장벽 피임약 (콘돔) 사용에 동의해야 하고 투여후 90 일 동안 그리고 연구 동안 정자 기증으로부터 제한된다.
조사 생성물 경로 및 복용 형태
MOD-5014, 장기-작용성 변형된 재조합 인자 VIIa는 시트레이트 완충액내 1 mg/mL MOD-5014의 투명 용액을 함유하는 유리 바이알로 제공된다.
냉동된 바이알은 용량 제제에 앞서 2 시간 실온에서 투여의 날에 해동될 것이다. 해동된 바이알은 (주사용 IP 양에 의존하여) 1종 이상의 주사기 속에 들어간다. 취급 및 투여에 대하여 상세한 지침은 "사용 지침" 문서에서 제공된다.
6 용량 그룹은 (각각의 스테이지에서 3) 계획되고; 각각의 스테이지 및 용량 그룹에서 대상체는 대상체 체중에 기반하여 IV 주사로서 MOD-5014의 단일 투여를 받는다 (참조 투여된 용량의 예로 표 110)
표 110: 예 MOD-5014 용량 및 계산된 주사 지속기간
응급 약물
대상체가 (용량 평가후 30 일 이내) 연구 기간 동안 출혈 에피소드를 경험하는 사례에서, 그는 병원 통상 실시 및 그의 임상 조건에 따라 치료받는다.
안전성 종점 (1차)
1차 안전성 종점은 모니터링 및 기록으로 구성될 것이다:
1. 연구 내내 유해 사례 및 수반되는 약물 사용
2. 면역원성, 중화 항체의 발생 없음
3. ECG, 활력 징후, 물리적 시험 (신경적 평가 포함).
4. 혈청 화학 프로파일, 간 효소, 혈액학, 응고 패널 (PT 시간, aPTT, 트롬빈& 항-트롬빈 복합체, 프로트롬빈 단편 1+2, D-이량체), 및 요검사를 포함하는, 실험실 파라미터
5. 국부 내성 (주사 부위 반응)
약동학적 (PK) 종점 (2차)
PK 반응은, 특이적 ELISA 검정에 의해 측정된 바와 같이, MOD-5014 혈장 농도 측정에 의해 단일 주사 이후 평가된다. 하기 파라미터는 계산된다: Cmax, AUC, 말단 반감기, Vss, 청소능, 회수 및 Tmax.
Cmax - 최대 MOD-5014 혈장 농도
Tmax - Cmax까지 시간
Tlag - MOD-5014에 대하여 흡수 지체-시간
AUC - 최종 농도 ≥ 정량화 한계 (LOQ), AUC(0-t) 및 무한대 AUCinf에 대한 곡선하 면적
λz - 제거율 상수
t1/2 - 반감기
Vss - 용적 정상 상태, 청소능 및 회수
PK 샘플링 시간은 (사전-용량 1 시간 이내) 일 0이다. 모든 주사후 측정은 IV 투여의 마지막에 개시될 것이다: 30 ± 5 분, 2 시간 ± 20 분, 4 ± 0.5 시간 8 ± 1 시간, 24 ± 2 시간 (일 1), 48 ± 3 시간 (일 2), 72 ± 3 시간 (일 3) 및 용량후 일 7에서.
약력학적 (PD) 종점 (탐구)
약력학은 STAClot 검정을 통해 FVIIa 활성에 의해 평가된다. PD는 하기 시점에서 측정된다: 일 0 (사전-용량 1 시간 이내). 모든 주사후 측정은 IV 투여의 마지막에 개시된다: 30 ± 5 분, 2 시간 ± 20 분, 4 ± 0.5 시간 8 ± 1 시간, 24 ± 2 시간 (일 1), 48 ± 3 시간 (일 2), 72 ± 3 시간 (일 3) 및 용량후 일 7에서. 생분석은 수행된다.
통계 방법
서술적인 통계는, 샘플 크기 (n), 평균 및 표준 편차를 포함하는, 인구통계, 기준선 특징, 안전성 및 PK/PD 데이터를 요약하는데 사용된다.
스테이지 1에서 각각의 용량 그룹에 대하여 PK, PD 및 안전성 데이터용 데이터 검토는 수행된다.
실시예 17: 독성학 연구
인자 VIIA-CTP 지지 상 1/2A 연구의 안전성 및 효능의 포괄적인 평가
목적
이들 연구의 목적은 혈우병 환자에 있어서 진행 중인 상 1/2a 연구를 지지하는 독물학적 연구의 일부로서 랫트 및 원숭이에 투여 이후 FVIIa-CTP의 안전성, PK 및 PD를 평가하는 것이었다.
방법
FVII-CTP는 CHO 세포에서 발현되었고, 정제되었고 CTP 특이적 정제 공정을 이용하여 활성화되었다.
GMP 배치는 FIH 연구에서 초기 임상 용량을 넘는 적절한 마진을 확인하는 독성동태학 분석에 의해 지지된 숫컷 랫트 및 원숭이에서 평가된 독물학적 연구에서 사용되었다.
연구 (수행된 연구의 요약은 표 111에서 아래 나타난다)
MOD-5014의 급성 독성동태학 GLP 연구 : 숫컷 필리핀 원숭이에서 단일 정맥내 용량 PK/PD 및 독성 연구:
숫컷 필리핀 원숭이에서 연구는 급성 독성을 평가 및 특성규명하기 위한, 최대 용인된 용량 (MTD)을 추정하기 위한, 그리고 숫컷 필리핀 원숭이에서 MOD-5014의 독성동태학을 평가하기 위한 GLP-순응하는 단일-용량 독성학 연구이었다.
연구 설계
26 숫컷 필리핀 원숭이 (2 내지 4 kg), 대략 2 내지 4 세는 Covance Reseach Products, Inc.로부터 수득되었다. 24마리는 표 1에 따라 치료 그룹으로 배정되었다.
방법
동물은 MOD-5014 (Lot No. ER 1017295, 2.6 mg/mL)의 단일, IV 저속 볼러스 (2 내지 3 분) 복재 정맥 주사를 받았다. 혈액 샘플은 시트레이트 완충액을 함유하는 튜브에서 대퇴 정맥으로부터 수집되었다. 샘플은 투여에 앞서 그리고 0.25, 0.5, 2, 4, 6, 8, 12, 및 24에 모든 동물로부터 수집되었다. 추가의 샘플은 투여후 48, 60 및 72 시간에서 회수 동물로부터 수집되었다. 모든 샘플은 대조 그룹 동물 (그룹 1)로부터 수집되었지만 단지 0.5 시간 샘플은 분석되었다. 혈장 MOD-5014 농도는 Intertek Pharmaceutical Services (San Diego, CA)에서 증명된 ELISA (Bioanalytical validation report AR5437)에 의해 결정되었다. MOD-5014의 활성은 OPKO Biologics, Israel에서 적격 응고 검정 (STAGO) (Qualification report CD-05-0276)으로 결정되었다.
데이터 분석
비-구획성 분석은 Phoenix WinNonlin 버전 6.3 (Pharsight Corporation, Sunnyvale, CA.)으로 개별 동물로부터 데이터상에서 수행되었다. 분석은 MOD-5014 혈장 농도 데이터 상에서 뿐만 아니라 15,563 유닛/mg의 초기 특이적 활성을 추정하는 응고 활성 데이터 상에서 수행되었다 (MOD-5014 ER#1017295 Release SUM). IV 볼러스 투여용 프로그램은 사용되었다.
혈장 농도 분석을 위하여, 시간 제로 내지 24 시간 곡선하 면적 (AUC0 -24h)은 사다리꼴 방법을 이용하여 추정되었다. 최대 농도 (Cmax) 및 관측되는 시간 (Tmax)은 데이터로부터 직접적으로 결정되었다. 시간 제로에서 혈장 농도 (C0)는 최초 2 시점을 통해 역 외삽에 의해 추정되었다. 분포의 초기 겉보기 용적 (Vi)는 하기 방정식으로부터 계산되었다:
Vi = 용량 / C0
회수 그룹에서 동물에 대하여, 추가의 데이터는 48, 60 및 72 시간 시점 동안 이용가능하였다. 이들 추가의 시점의 프로파일은 24 시간에서 종료된 동물의 프로파일에서 보여지지 않았던 납작한 말단 상을 입증하였다. 따라서, 말단 기울기 및 관련된 파라미터는 회수 동물로부터 단지 추정되었고 24 시간에서 종료된 것으로부터는 아니었다. 말단 기울기 및 관련된 파라미터가 그룹당 단지 2 동물로부터 추정된 것이었다는 것을 이것이 의미하여도, 수득한 추정치는 오직 24 시간 데이터에 기반된 추정치보다 더 나은 PK 프로파일을 기재한다.
회수 동물에 대하여, 마지막 3 시점에 걸쳐 Log-선형 회귀는 하기 방정식으로부터 제로 내지 무한대 (AUC0 -∞) AUC 및 말단 반감기 (t1/ 2)를 추정하는데 사용되었던 제거율 상수 (λ)를 추정하는데 사용되었다:
t1/2= ln (2)/λ
AUC0-∞ = AUC0-24h + C24h/λ
여기에서 C24h는 24 시간에서 농도이다. 혈청 청소능 (CL)은 AUC0 -∞에 의해 분할된 용량으로부터 계산되었다. 말단 상에서 용적 (Vz) 그리고 정상 상태에서 용적 (Vss)는 하기 방정식으로부터 계산되었다:
Vss= 용량 * AUMC/AUC2
Vz = CL/λ
여기에서 AUMC는 제1 모멘트 곡선하 면적이다.
응고 활성 데이터 분석을 위하여, 나중 시점에서 납작한 말단 기울기는 분명하지 않다. 따라서, 말단 기울기는 마지막 3 이상 시점을 통해 Log-선형 회귀에 의해 모든 동물로부터 추정되었고 관련된 파라미터는 상기에 기재된 바와 같이 계산되었다.
완료된 모든 연구의 요약은 아래 표 111에서 기재된다:
표 111
결과
스프래그 다우리 랫트 : 모든 동물은 양호한 임상 조건이었다. 테스트 물품-관련된 (MOD-5014-관련된) 것으로 간주되었던 주요 연구 동물 내에서 관측된 상세한 임상 관찰만이 꼬리의 자주색 또는 적색 변색을 가진 하나의 9 mg/kg 동물에서 언급되었다. 임상 병리학에서 가역적, 테스트 물품-관련된 변화는 모든 테스트 물품 그룹에서 프로트롬빈 시간으로 온화한 감소를 포함하였던 주요 연구 동물에서 관측되었다. (도 110, 표 112 및 113)
표 112: 비-구획성 분석에 의해 추정된 IV 볼러스 주사 이후 혈장 농도에 기반된 랫트 MOD-5014 약동학적 파라미터
표 113: 비-구획성 분석에 의해 추정된 IV 볼러스 주사 이후 혈장 농도에 기반된 랫트 MOD-5014 약력학 파라미터
말단 또는 회수 검시에서 주요 연구 동물의 테스트 물품-관련된 거시적 발견 또는 장기 중량 변화는 없었다.
필리핀 원숭이 비-GLP 및 GLP 연구:
모든 동물은 양호한 임상 조건이었고, 숫컷 필리핀 원숭이에 정맥내 MOD-5014의 단일 용량의 투여는 프로트롬빈 시간 및 항-트롬빈 III의 감소, 및 7.5 및 15 mg/kg의 용량에서 D-이량체의 증가를 생산하였다.(도 111, 표 114, 115, 116, 117) 이들 변화는, 약물의 의도된 작용 기전과 일치하는, 전혈전 상태를 표시하였다.
표 114: 비-구획성 분석에 의해 추정된 IV 볼러스 주사 이후 혈장 농도에 기반된 원숭이 MOD-5014 약동학적 파라미터 (비-GLP 연구)
표 115: 비-구획성 분석에 의해 추정된 IV 볼러스 주사 이후 혈장 농도에 기반된 원숭이 MOD-5014 약력학 파라미터 (비-GLP 연구)
표 116: 숫컷 필리핀 원숭이에서 MOD-5014 약동학의 요약 (GLP 연구)
GLP 연구에서 사용된 개별 동물로부터 혈장 농도 및 응고 활성 데이터는 표 117 및 118, 각각에서 나타난다. 활성 데이터는 각각의 시점에서 각각의 동물에 대하여 중복 측정의 평균을 나타냈다.
표 117: 개별 동물로부터 혈장 농도 데이터
사전-용량 활성 측정은 BLQ이었고 PK 파라미터의 추정에 대하여 '누락'으로 설정되었다.
표 118: 개별 동물로부터 응고 활성 데이터
2 결정 / 동물의 평균 (mU/mL), 사전-용량 활성 측정은 BLQ이었고 PK 파라미터의 추정에 대하여 '누락'으로 설정되었고, #404에 대하여 사전-용량 값은 무시할만한 것으로 간주되었고 또한 누락으로 설정되었다.
개별 동물로부터 혈장 농도 PK 파라미터는 표 119에서 나타난다.
개별 동물로부터 응고 활성 PK 파라미터는 표 120에서 나타난다:
도 112 및 도 113은 IV 주사 이후 평균 MOD-5014 혈장 농도 및 응고 활성을 보여준다. 도 114 내지 도 116은 각각의 용량 수준에 대하여 평균 농도 및 응고 활성을 함께 플롯팅한다. 혈장 농도 및 응고 활성의 개별 플롯은 도 117A-R에서 나타난다. 이들 도는 투여 이후 최초 24 시간에 걸쳐 혈장 농도 및 응고 활성이 유사한 속도로 쇠퇴한다는 것을 설명한다. 24 시간을 넘어서, 혈장 농도는 수준이 떨어지는 경향이 있었고 활성 수준은 계속 쇠퇴하였다. 24 시간후 데이터는 회수 동물, 2 / 그룹으로부터 단지 이용가능하다.
비-구획성 분석의 결과는 혈장 농도 및 응고 활성 데이터, 각각에 대하여 표 119 및 표 120에서 보여진다. 혈장 농도는 측정된 제1 시점 (0.25 시간)에서 최고이었다. 응고 활성 Tmax는 대부분의 동물에서 0.25 시간 또는 0.50 시간에 관측되었다. 양쪽 농도 및 활성은 증가 용량으로 증가하였지만 완전히 용량 비례하지 않았다. AUC0 -24h 및 AUC0 -∞가 용량의 증가보다 30 내지 50% 초과 증가하는 추세가 있었다. 말단 반감기는 응고 활성에 기반된 것보다 혈장 농도에 기반하여 더 길었다: 대략 12 내지 28 시간 대 대략 5 내지 7 시간. CL은 7.5 mg/kg 및 15 mg/kg 용량에 비교된 1 mg/kg의 최저 용량에서 약 50% 더 빠른 것처럼 보였다. 혈장 농도에 기반된 그리고 응고 활성에 기반된 CL은 유사하였다.
표 119: 숫컷 필리핀 원숭이에서 IV 볼러스 주사 이후 혈장 농도에 기반된 MOD-5014 약동학적 파라미터
표 120: 숫컷 필리핀 원숭이에서 IV 볼러스 주사 이후 활성 측정에 기반된 MOD-5014 약력학적 파라미터
일치하는 추세는 분포의 용적의 추정치로부터 분명하지 않았다. 이론적으로 혈장 및 조직 농도가 평형에서인 경우, 정상 상태에서 용적 (Vss), 및 농도가 쇠퇴하는 경우, 말단 상에서 용적 (Vz)은 응고 활성 보다 혈장 농도로부터 추정치에 기반하여 더 높았다. 분포의 초기 용적 (Vi)는 혈장 농도에 기반된 것보다 응고 활성에 기반된 1.0 mg/kg 및 7.5 mg/kg 용량 그룹에서 어느 정도 더 높았다. Vi는 높은 용량에서보다 2개의 더 낮은 용량에서 또한 더 높았다. 상기 관찰은 응고 활성 측정이 가장 이른 시점에서 모두 절정에 도달하지 않았고 그 다음 빈틈없이 쇠퇴한다는 사실에 관련될 수 있다. 대신에, 응고 활성 곡선의 일부는 곡선의 납작한 초기 상을 생산하는 나중 시간에서 절정에 도달하였다. 상기 패턴은 C0의 더 낮은 추정치 및 따라서 응고 활성에 기반된 Vi의 더 높은 추정치로 이어졌다.
GLP 연구를 위한 요약
혈장 농도는 측정된 제1 시점 (0.25 시간)에서 최고이었다. 응고 활성 Tmax는 대부분의 동물에서 0.25 시간 또는 0.50 시간에 관측되었다. 양쪽 농도 및 활성 파라미터는 증가 용량으로 증가하였지만 완전히 용량 비례하지 않았다. AUC0 -24h 및 AUC0-∞가 용량의 증가보다 30 내지 50% 초과 증가하는 추세가 있었다. 말단 반감기는 응고 활성에 기반된 것보다 혈장 농도에 기반하여 더 길었다: 대략 12 내지 28 시간 대 대략 5 내지 7 시간. CL은 7.5 mg/kg 및 15 mg/kg 용량에 비교된 1 mg/kg의 최저 용량에서 약 50% 더 빠른 것처럼 보였다. 혈장 농도에 기반된 그리고 응고 활성에 기반된 CL은 유사하였다.
일치하는 추세는 분포의 용적의 추정치로부터 분명하지 않았다. 이론적으로 혈장 및 조직 농도가 평형에서인 경우, 정상 상태에서 겉보기 용적 (Vss), 및 농도가 쇠퇴하는 경우, 말단 상에서 용적 (Vz)는 응고 활성 보다 혈장 농도로부터 추정치에 기반하여 더 높았다. 분포의 초기 용적 (Vi)는 혈장 농도에 기반된 것보다 응고 활성에 기반된 1.0 mg/kg 및 7.5 mg/kg 용량 그룹에서 어느 정도 더 높았다. Vi는 높은 용량에서보다 2개의 더 낮은 용량에서 또한 더 높았다. 상기 관찰은 응고 활성 측정이 가장 이른 시점에서 모두 절정에 도달하지 않았고 그 다음 빈틈없이 쇠퇴한다는 사실에 관련될 수 있다. 응고 활성 곡선의 일부는 곡선의 납작한 초기 상을 생산하는 나중 시간에서 절정에 도달하였다. 상기 패턴은 C0의 더 낮은 추정치 및 따라서 응고 활성에 기반된 Vi의 더 높은 추정치로 이어졌다.
숫컷 필리핀 원숭이에서 저속 IV 볼러스 주사 이후, 혈장 농도에 기반된 및 응고 활성에 기반된 MOD-5014 노출은 증가 용량으로 증가하였지만, 어느 정도 용량의 증가 초과이었다. 따라서, 혈장 농도에 기반된 및 응고 활성에 기반된 MOD-5014 노출은 용량 관련되었지만 용량 비례하지 않았다. 농도 및 활성에 의해 측정된 CL은 유사하였지만 양쪽은 7.5 mg 또는 15 mg/kg의 용량 이후 CL에 비교된 1 mg/kg의 용량 이후 약 50% 더 높았다. 말단 반감기는 응고 활성에 기반된 것보다 혈장 농도에 기반하여 더 길었다: 대략 12 내지 28 시간 대 대략 5 내지 7 시간.
NZW 토끼 결과는 상기 실시예 15에서 나타난다.
결론:
안전성 평가 요약:
독물학적 연구에서 언급된 모든 발견은 상기 약물의 작용 기전에 기반하여 기대되고 상기와 일치한다. 상업적 rhFVII 또는 다른 응고 인자 약물에 대하여 또한 보여지지 않았던 MOD-5014와 관련된 신규한 또는 특유의 발견은 없었다. 혈전형성 효과는 웨슬러 모델에서 테스트되었고 rhFVIIa에 비교할만한 것으로 보여졌다.
약동학적 이점:
결과는 회수가 2-배 향상되었다는 것, 그리고 MOD-5014가 우월한 반감기, 상업적 rhFVII 것의 4배 제공하였다는 것을 보여주었다. 또한, MOD-5014에 대해 개선된 노출 (AUC 3-4X)은 없었다. 시험관내 응고 활성의 분석은 상품과 비교된 비교할만한 시험관내 응고 활성을 보여주었다.
전반적으로, MOD-5014는, 인간내 최초 (FIH) 상 1-2A 임상시험 연구에서 제안된 투여된 임상 용량을 넘어 적절한 노출을 제공하는, 탁월한 안전성 프로파일을 입증하였다.
실시예 18: MOD-5014 및 hFVIIa 시험관내 혈소판 결합의 비교 평가
1. 프로젝트 근거 및 요약
1.1. 목적
이들 연구는 야생형 재조합 인간 FVIIa에 비교된 경우 MOD-5014의 생체내 혈소판 결합을 평가하기 위해 설계되었다. 혈소판 표면 활성이 상기 임상 셋팅에서 FVIIa 작용 기전의 중요한 성분인 것으로 생각되기 때문에, 이것은 혈우병에서 우회 제제로서 FVIIa-유사 분자의 중요한 특징이다. 단순 인지질에 더하여, 혈소판은 응고 프로테아제의 결합 및 활성에 기여하는 수많은 표면 특징을 갖는다. 따라서, 인지질 결합 및 활성 단독의 검정은 응고 인자 예컨대 FVIIa의 생물학적 효과 예측에서 오해일 수 있다.
1.2. 방법
검사된 연구:
· 유세포측정에 의해 평가된 경우 혈소판 결합
· 혈소판 표면 트롬빈 생성에 의해 평가된 경우 혈소판 결합
1.3. 결과 및 결론
유세포측정 연구는 유용한 데이터를 제공하지 않았다. 이들 검정은 FVIIa 및 MOD-5014를 활성화된 인간 혈소판에 결합하도록 하였다. 결합은 인간 FVII에 대한 친화도-정제된 다클론성 항체에 의해 검출되었다. 유세포측정을 위하여 OPKO에 의해 사용하였던 항체 제조가 웨스턴 블롯상에서 FVIIa 및 MOD-5014에 동등 양호하게 결합하였던 반면, ELISA에서 또는 유세포측정 검정에서 그렇게 하지 않았다. 따라서, 상기 접근법은 혈소판에 결합하는 FVIIa 및 MOD-5014 비교에 유용하지 않았다.
대안적인 접근법으로서, 혈소판 표면상에서 트롬빈 생성을 지지하기 위한 혈소판의 MOD-5014 결합의 능력은 평가되었다. 상기 접근법은 FVIIa가 용액에서 FXa의 활성화를 촉매화하는 능력이 거의 없다는 사실에 기반된다. 그러나, FVIIa 및 변형된 FVIIa 분자가 활성화된 혈소판에 결합하는 경우, 이들은 활성화 FX에서 훨씬 더 효율적이다. 활성화된 혈소판에서 생산된 FXa는 그 다음 혈소판 표면에서 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화하기 위한 그것의 능력에 의해 측정될 수 있다.
등몰 농도에서, MOD-5014가 FVIIa보다 약간 덜했던 혈소판 표면 트롬빈 생성의 속도를 지지하였다는 것이 발견되었다. 그러나, 트롬빈 생성의 개시 이전 지체는 FVIIa를 이용한 것보다 MOD-5014를 이용한 것에서 약 40% 더 길었다. 이것은 MOD-5014가 야생형 FVIIa보다 FX 활성화의 약간 더 낮은 최대 속도를 갖는다는 것을 보여주는 생화학적 연구와 일치한다. 최대 트롬빈 생성에 대한 더 긴 시간은 MOD-5014의 더 높은 수준에 의해 극복될 수 있다. 많은 인자는 투여 고려사항들 속에 들어간다. 그러나, 이들 시험관내 데이터는 MOD-5014가 FVIIa보다 약간 상이한 투여를 요구할 수 있다는 것을 시사한다.
2. 유세포측정에 의한 혈소판 결합의 평가
2.1. 방법
혈소판은 건강한 인간 공여체 혈액으로부터 단리되었고 트롬빈 및 콘불신 (convulxin)(콜라겐 수용체 효능제)로 활성화되었다. 활성화된 혈소판은 MOD-5014 또는 FVIIa의 10, 50, 100, 및 250 nM으로 인큐베이션되었고, 후속적으로 1% 파라포름알데하이드로 고정되었다. 고정된 혈소판은 다클론성 항-인간 FVII 항체 및 FITC-연결된 2차 항체를 이용하여 FVIIa로 염색되었다. 염색된 혈소판은 유세포측정에 의해 분석되었다. 각각의 FVIIa 농도에서 혈소판 집단의 평균 형광 강도 (휘도)는 결정되었다.
2.2. 결과
도 118은 MOD-5014 또는 FVIIa의 각각의 농도에서 혈소판 집단의 평균 형광 강도를 보여준다. MOD-5014에 대하여 검출된 낮은 전체 결합에도 불구하고, MOD-5014 및 FVIIa는 유사하게 형상화된 결합 곡선을 가졌다. MOD-5014가 혈소판에 양호하게 결합하지 않으면, 이것은 포화하는 것처럼 보이지 않는 매우 편평한 곡선을 초래할 것이다. 따라서, 아마도 FVIIa/MOD-5014를 검출하는데 사용된 항체가 MOD-5014를 양호하게 검출할 수 없는 것처럼 보인다. 유세포측정 연구에서 결합을 검출하는데 사용된 동일한 다클론성 항체가 MOD-5014 및 야생형 FVIIa의 SDS 변성된 샘플로 동등하게 강한 신호를 제공하였다는 것이 관측되었다.
FVIIa 및 MOD-5014를 검출하기 위한 다클론성 항체의 능력은 그 다음 ELISA 검정을 이용하여 테스트되었다. 상기 검정에서, 미세적정 웰들은 단백질 샘플을 포착하기 위해 항체로 코팅되었다. 포착 항체에 단백질의 결합은 동일한 다클론성 항체로 검출되었다. FVIIa 및 MOD-5014가 그것의 원상태 형태로 남아있음에 따라, MOD-5014는 FVIIa보다 상당히 덜 양호하게 검출되었다.
이것은 FVIIa 및 MOD-5014의 결합을 검출하는 상이한 기술을 찾기 위해 우리를 자극시켰다.
3. 트롬빈 생성에 의한 혈소판 결합의 평가
3.1. 방법
이들 실험에서, 혈소판은 재차 트롬빈 및 콘불신으로 활성화되었고, 상이한 농도의 FVII 또는 MOD-5014로 인큐베이션되었고, 발색 기질 Gly-Pro-Arg-파라니트로아닐라이드 (500 μM)의 존재하에 FX (135 nM) 및 프로트롬빈 (1.2 μM)의 혈장 농도에 후속적으로 첨가되었다. 이들 조건하에, 혈소판에 결합되어 있던 FVIIa 또는 MOD-5014는 FX를 활성화시킨다. 따라서 혈소판 표면에서 형성된 FXa는 혈소판-유래된 FVa와 조합하고, 수득한 복합체는, 발색 기질의 절단에 의해 검출되는, 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시킨다.
3.2. 결과
혈소판의 부재하에 기질 절단은 최소이었다. 도 119에서, 각각의 농도에서 기질 절단의 최대 속도는 FVIIa 또는 MOD-5014 농도의 함수로서 플롯팅되었다. 트롬빈 생성의 속도는 FVIIa에 대한 것보다 MOD-5014에 대하여 어느 정도 더 낮다. 이것은 인지질 소포에서 수행된 활성 검정과 일치한다.
실시예 19: 상업적 재조합 hFVIIa에 비한 MOD -5014의 생화학적 특성 - 인자 VIIa 활성에서 카복시-말단 펩타이드 (CTP)의 효과
프로젝트 근거 및 요약
이들 연구는 상업적 재조합 hFVIIa , 본 명세서에서 일명 MOD-5000에 비해 MOD-5014의 생화학적 특성을 평가하기 위해 설계되었다.
검사된 연구:
· MOD-5014의 합성 기질 절단
· 합성 기질 절단에 의해 측정된 경우 MOD-5014의 조직 인자 (TF) 결합
· 인자 X (FX) 활성화에 의해 측정된 경우 MOD-5014의 TF 결합
· TF-결합된 MOD-5014에 의한 FX 활성화의 동력학
· FX 활성화에 의해 측정된 경우 MOD-5014의 지질 결합
· 지질-결합된 MOD-5014에 의한 인자 활성화의 동력학
· 항-트롬빈 (AT)에 의한 MOD-5014의 불활성화
· TFPI에 의한 MOD-5014의 불활성화
전체 데이터는, MOD-5000에 비하여, MOD-5014가 약간 감소된 촉매적 활성을 가진 유사한 작용 기전을 갖는다는 것을 시사한다. 이들 결과는, TF와 독립적으로, TF-결합된 MOD-5014의 약간 감소된 활성 및 어느 정도 더욱 감소된 활성을 입증하였다.
이들 효과는 주로 반응의 정도 보다는 반응 속도, 및 전체 시간 과정이 완료하도록 측정될 수 있는 반응에 의해 반영되었다.
AT 억제의 약간 감소된 속도는 적절한 억제 반응으로 생체내 MOD-5014 반감기의 확장을 시사한다.
실험적 재료
· MOD-5014 GMP-1: 2.5 mg/ml (A280에 기반됨)
· NovoSeven Lot# CU60430: 0.943 mg/ml (A280에 기반됨), MOD-5000로 칭함.
MOD-5014의 합성 기질 절단
근거: 합성 기질의 절단은 작용성 활성 부위의 이용가능성에 배타적으로 의존할 수 있다.
방법: MOD-5000 및 MOD-5014는 몰 기준으로 동등 농도로 희석되었다. 동일한 농도는 그 다음 기질 페파크롬 FVIIa (메틸설포닐-D-사이클로헥실알라닐-2-아미노부티릴-아르기닌-p-니트로아닐라이드)의 고정된 농도로 첨가되었고 기질의 절단은 황색 색상의 외관에 의해 모니터링되었다.
결과
농도: FVIIa 360 nM; 기질 500 μM
분석: 405 nm에서 흡광도는 공지된 소광 계수를 이용하여 p-니트로아닐린의 농도로 전환되었다. p-니트로아닐린의 농도는 기질의 속도를 결정하기 위해 시간에 대하여 플롯팅되었다.
절단. 데이터는 하기로 맞춤화되었다:
속도 =
k1= 27.5 mol pNA/분/mol VIIa
결론: 몰 기준으로, MOD-5000 및 MOD-5014는 기질 절단의 동일한 속도를 갖는다 (도 120). 차후의 연구를 위하여, 기질 절단의 측정은 희석 및 피펫팅용 대조로서 사용된다.
합성 기질 절단에 의해 측정된 경우 MOD-5014의 TF 결합
근거: 인자 VIIa가 TF를 결합시키는 경우, 형태적 변화는 기질 절단의 속도에서 증가를 초래하는 인자 VIIa에서 발생한다. 이것은 증가된 기질 절단이 TF에 대한 인자 VIIa 결합을 모니터링하는데 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
방법: MOD-5000 및 MOD-5014의 다양한 농도는 TF의 고정된 농도에 첨가되었고 5 분 동안 인큐베이션되었다. 기질 (페파크롬 FVIIa)은 첨가되었다. 기질 절단은 황색 색상의 외관에 의해 405 nm에서 모니터링되었다.
결과:
농도: FVIIa 0-25 nM; TF 8.7 nM; 기질 500 μM
분석: TF의 농도가 기대된 Kd 초과에서 양호함에 따라, 낮은 농도에서 FVIIa의 모두는 TF에 결합되어야 한다. 기질 절단의 속도는 VIIa/TF 복합체의 것일 수 있다. 일단 FVIIa의 농도가 TF의 것을 초과하면, 기질 절단의 속도는 자유 FVIIa의 것으로 떨어져야 한다. FVIIa 및 TF가 1:1 몰 복합체를 형성하기 때문에, 기질 절단의 속도에서 변화가 발생하는 FVIIa의 농도는 FVIIa의 추정된 농도에서 체크이다.
데이터는 하기로 맞춤화되었다:
속도 =
결론: MOD-5000 (Novoseven) 및 MOD-5014는 TF의 기대된 농도 (8.7 nM)에서 동일한 굴절점을 보여준다 (도 121). 이것은 기질 절단에 의해 예상된 바와 같이 MOD-5000 및 MOD-5014의 몰 농도가 정확하다는 것을 확인한다. MOD-5014는 MOD-5000에 비해 TF에 결합된 경우 기질 절단의 매우 약간 더 낮은 속도 (98%)를 가졌다 (도 121).
인자 X 활성화에 의해 측정된 경우 MOD-5014의 TF 결합
근거: FVIIa에 의한 FX의 절단은 FVIIa/TF 복합체의 절단에 비해 느리다. 따라서, TF에 FVIIa의 결합은 FX 활성화의 속도 측정에 의해 평가될 수 있다.
방법: MOD-5000 및 MOD-5014의 다양한 농도는 TF의 고정된 농도에 첨가되었고 FX 활성화의 속도는 측정되었다. 인자 X 활성화는 합성 기질 페파크롬 FXa (메톡시카보닐-D-사이클로헥실알라닐-글라이실-아르기닌 파라니트로아닐라이드)의 절단에 의해 평가되었다. 합성 기질의 절단은 표준 곡선에 의해 FXa 농도로 전환된다. FVIIa도 FVIIa/TF도 주목할 만한 속도로 FX 기질을 절단하지 않는다.
결과
농도: FVIIa 0-2 nM; TF 10 pM; FX 135 nM; 기질 500 μM
혈장에서 인자 X 농도는 8 μg/ml (~ 135 nM)이다.
분석: FX 활성화의 속도는 FVIIa가 TF에 결합함에 따라 증가해야 한다. 모든 TF가 FVIIa로 포화되면, FX 활성화의 속도는 최대 값을 도달할 것이다 (도 122A).
데이터는 하기로 맞춤화되었다:
결론: TF에 FVIIa의 결합에서 매우 약간 음성 협동성 (Hill 값 <1)이 있다. 이것은 MOD-5000 및 MOD-5014에 대하여 동일하다. TF에 결합된 경우, MOD-5014는 MOD-5000에 비해 FX 활성화의 약간 감소된 속도 (93%)를 갖는다. TF에 대한 MOD-5014의 친화도는 MOD-5000의 친화도와 동등하다 (도 122A).
FX 농도의 함수로서 FX 활성화의 속도
근거: TF에 결합된 경우 MOD-5014 활성화의 약간 감소된 속도는 일단 복합체에 결합되면 FXa에 대하여 감소된 친화도 또는 FX의 감소된 턴오버의 결과일 수 있다. FX 농도의 함수로서 FX 활성화의 속도 측정은 복합체의 동력학 파라미터를 확립하였다.
방법: FX의 다양한 농도는 FVIIa/TF 복합체의 고정된 농도로 인큐베이션되었다.
인자 X 활성화는 합성 기질 (페파크롬 FXa)의 절단에 의해 평가되었다. 합성 기질의 절단은 표준 곡선에 의해 FXa 농도로 전환된다.
결과
농도: FVIIa 1 nM; TF 5 pM; FX 0-1500 nM; 기질 500 μM
분석: 더 많은 FX가 첨가됨에 따라, 더 많은 FVIIa/TF 복합체는 모든 FVIIa/TF 복합체가 결합된 FX를 갖는 FX 결합된 최대 지점을 가져야 한다. 그 지점에서 반응은 FX가 활성화되었던 속도에 의해 제한되었다. 따라서, FX 활성화의 속도는, 최대 속도를 점근적으로 접근하는 곡선의 형상으로, FX의 증가 농도로 증가해야 한다 (도 123).
데이터는 하기로 맞춤화되었다:
결론: TF에 결합된 경우, MOD-5014는 MOD-5000에 비해 FX의 약간 감소된 턴오버 (92%)를 가졌다. MOD-5014/TF 복합체에 FX의 결합은 MOD-5000/TF 복합체에 그것의 결합과 동일하였다 (도 123).
FX 활성화에 의해 측정된 경우 MOD-5014의 지질 결합
근거: 혈소판에서 인자 X 활성화는 FVIIa의 지혈 효과에 기여한다고 여겨진다. 상기 혈소판 활성은 저-TF 환경에서, 또는 TF의 부재하에 발생한다고 여겨진다. TF 없이 인자 X 활성화는 지질 소포에서 연구될 수 있다.
방법: 지질에서 FVIIa에 의한 인자 X 활성화는 양쪽 효소 (FVIIa) 및 단백질 기질 (FX)의 결합의 함수이다. 지질 비는, 고도로 활성화된 혈소판의 조성을 모방하도록 설계된, PC:PE:PS 41:44:14이었다. 지질은 큰 단일라멜라 소포 (200 nm)로서 제조되었다. 소포의 증가 농도는 FVIIa 및 FX에 첨가되었다. 인자 X 활성화는 합성 기질 (페파크롬 FXa)의 절단에 의해 평가되었다. 합성 기질의 절단은 표준 곡선에 의해 FXa 농도로 전환되었다.
결과
농도: FVIIa 20 nM; FX 500 nM; 지질 0-1000 μM; 기질 500 μM.
분석: FXa 생성의 속도는 지질 소포의 농도에 대해 플롯팅되었다 (도 124A). 기대된 대로, 더 많은 표면적이 반응에 이용가능하였기 때문에, FXa 생성은 지질의 증가 농도로 증가하였다. 지질의 충분히 높은 농도에서, FVIIa 및 FX가 상이한 지질 소포 상에 분리됨에 따라 반응의 속도는 감소하였다. 상기 템플레이트 반응은 상기 시스템으로 기대된다. 데이터는 방정식에 맞춤화되지 않았고 보여진 라인은 단지 시각적 참조용이다. MOD-5000과 MOD-5014 사이 FXa 생성의 속도에서 차이는 지질에 대하여 친화도의 차이 때문이 아니었다. 이것은 도 124B에서 보여지고, 여기에서 각각에 대하여 최대에 비해 FXa 생성의 속도는 지질 농도에 대해 플롯팅된다.
결론: TF의 부재하에 FX 활성화의 속도는 MOD-5000에 비해 MOD-5014에 대하여 더 낮다 (~60%). 지질에 대하여 MOD-5014의 친화도는 MOD-5000에 대해서와 동일하다.
지질-결합된 MOD-5014에 의한 FX 활성화의 동력학
근거: MOD-5000에 비해 MOD-5014에 대하여 TF의 부재하에 FX 활성화의 감소된 속도는 일단 지질 표면에서 효소에 결합되면 FXa에 대하여 감소된 친화도 또는 FX의 감소된 턴오버의 결과일 수 있다.
방법: 다양한 FX 농도는 FVIIa 및 지질 소포의 고정된 농도로 인큐베이션되었다. 인자 X 활성화는 합성 기질 (페파크롬 FXa)의 절단에 의해 평가되었다. 합성 기질의 절단은 표준 곡선에 의해 FXa 농도로 전환되었다.
결과
농도: FVIIa 20 nM; FX 0-2500 nM; 지질 100 μM; 기질 500 μM.
분석: 더 많은 FX가 첨가됨에 따라, 지질 표면 상에서 더 많은 FVIIa는 모든 FVIIa가 FX에 결합되는 FX 결합된 최대 지점을 가져야 한다. 그 지점에서 반응은 FX가 활성화되는 속도에 의해 제한된다. 따라서, FX 활성화의 속도는, 최대 속도를 점근적으로 접근하는 곡선의 형상으로, FX의 증가 농도로 증가해야 한다. 기대된 대로, FVIIa의 FX에 대한 친화도는 TF의 부재하에 감소되고 (더 높은 Km) FXa 생성의 속도는 TF의 부재하에 감소된다 (도 125).
데이터는 하기로 맞춤화되었다:
결론: TF의 부재하에 지질 표면에서 FX 활성화의 속도는 MOD-5000에 비해 MOD-5014에 대하여 더 낮다 (45%). 지질 표면에서 MOD-5014에 FX의 결합은 MOD-5000에 그것의 결합과 동일하였다 (도 125).
AT에 의한 MOD-5014의 불활성화
근거: 생체내 FVIIa 청소능의 상당한 부분은 AT를 가진 FVIIa 복합체의 형성을 통해서일 것으로 여겨진다. 상기 반응의 속도는 FVIIa가 TF에 결합되는 경우에만 시험관내 측정가능하다. 측정가능한 속도에서 진행하기 위해, 시험관내 반응은 또한 헤파린의 고 농도를 요구하고, 이것은 자연 발생 글리코사미노글리칸의 효과를 모방하는 것으로 여겨진다.
방법: 인자 VIIa는 TF로 인큐베이션되어 복합체의 형성을 허용하였다. 복합체는 AT 및 헤파린으로 인큐베이션되었다. 반응은 헤파린을 중화시키기 위해 폴리브렌 (헥사디메트린 브로마이드)의 첨가에 의해 적시의 간격에서 중단되었다. 잔류 FVIIa/TF 활성은 합성 기질 (페파크롬 FVIIa)의 절단에 의해 측정되었다. 검정에서 사용된 농도에서, 폴리브렌은 기질 절단을 변경하지 않았다.
결과
농도: FVIIa 10 nM; TF 11 nM; AT 1 μM; 헤파린 5 U/mL; FVIIa/TF 8.2 nM; 폴리브렌 100 μg/mL; 기질 500 μM.
분석: 기질 절단의 속도로서 측정된, FVIIa/TF의 농도는 분으로 시간에 대해 플롯팅되었다 (도 126). 기대된 대로, AT/헤파린은 FVIIa를 억제시켜, FVIIa/TF 활성의 손실을 초래하였다.
데이터는 하기로 맞춤화되었다:
결론: T=0에서 활성에 대하여 유사한 값은 MOD-5000 및 MOD-5014의 동등량이 반응에서 존재하였다는 것을 표시한다. MOD-5014는 MOD-5000보다 약간 더욱 서서히 억제되었다 (62%) (도 126). 양쪽 반응은 완전한 억제로 진행하였다.
TFPI에 의한 MOD-5014의 불활성화
근거: TFPI는 FVIIa/TF 복합체의 생리적 억제제이다. TFPI의 K2 도메인은 FXa와 초기 복합체를 형성한다. 상기 복합체는 FVIIa/TPI를 결합시키고, 여기에서 TFPI의 K1 도메인은 FVIIa와 상호작용한다. 따라서, FVIIa/TF에 의한 FX 활성화는 억제된 복합체 및 FVIIa-TFPI의 폐쇄로 이어질 수 있다.
방법: 인자 VIIa 및 TF는 함께 인큐베이션되어 복합체를 형성한다. 복합체는 TFPI/FX/FXa 기질에 첨가되었다. 인자 X 활성화는 합성 기질 (페파크롬 FXa)의 절단에 의해 평가되었다. 합성 기질의 절단은 표준 곡선에 의해 FXa 농도로 전환되었다.
결과
농도 - 억제: FVIIa 1 nM; TF 20 pM; FX 135 nM; TFPI 0-5 nM; 기질 500 μM.
분석: 기대된 대로, 초기 FXa 생성은 모든 반응에서 동일한 속도로 발생하였다 (도 127 A -C). TFPI의 존재하에, FXa 생성의 속도는 FVIIa/TFPI 복합체가 TFPI/FXa (하부 2 패널)에 의해 억제되었음에 따라 느려졌다. TFPI 복합체의 폐쇄는 TFPI (하부 2 패널)의 더 높은 농도에서 더욱 빠르게 발생하였다. FVIIa/TFPI가 폐쇄되기 이전 형성된 FXa의 양은 FVIIa/TF와 TFPI 상호작용의 측정치이다. MOD-5014가 따라서 FXa/TFPI 복합체의 형성을 느리게 하는 FXa 생성의 약간 감소된 속도를 갖기 때문에, 반응은 MOD-5000으로보다 MOD-5014로 안정기를 도달하는데 더 오래 걸렸다.
결론: 상부 패널에서 나타낸 바와 같이, FXa의 MOD-5014/TF 생성의 TFPI 억제에 대하여 농도 의존은 MOD-5000의 것과 매우 유사하였다. MOD-5014는 TFPI 억제에 약간 더 감수성일 수 있고 (124%); 대안적으로, 이것은 FXa 생성의 약간 더 느린 속도의 인공물일 수 있다.
본 개시내용의 특정 특징이 본 명세서에서 설명 및 기재되어 있어도, 많은 변형, 치환, 변화, 및 등가물은 당해 분야의 숙련가에 이제 생길 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들이 본 개시내용의 진정한 사상 내에 해당함에 따라 모든 상기 변형 및 변화를 포함하도록 의도되는 것이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> OPKO Biologics Ltd. FIMA, UDI EYAL HART, GILI <120> LONG-ACTING COAGULATION FACTORS AND METHODS OF PRODUCING SAME <130> P-9520-PC7 <150> 62/182,370 <151> 2015-06-19 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu 20 25 30 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 1 5 10 15 Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 20 25 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 1 5 10 15 Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 20 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for Factor VII <400> 5 ctcgaggaca tggtctccca ggccc 25 <210> 6 <211> 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accaggcctc 60 atcaccatct gccttttagg atatctactc agtgctgaat gtacagtttt tcttgatcat 120 gaaaacgcca acaaaattct gaatcggcca aagaggtata attcaggtaa attggaagag 180 tttgttcaag ggaaccttga gagagaatgt atggaagaaa agtgtagttt tgaagaagca 240 cgagaagttt ttgaaaacac tgaaagaaca actgaatttt ggaagcagta tgttgatgga 300 gatcagtgtg agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt gcaaggatga cattaattcc 360 tatgaatgtt ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact gtgaattaga tgtaacatgt 420 aacattaaga atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata gtgctgataa caaggtggtt 480 tgctcctgta ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga agtcctgtga accagcagtg 540 ccatttccat gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta agctcacccg tgctgaggca 600 gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct actgaagctg aaaccatttt ggataacatc 660 actcaaagca cccaatcatt taatgacttc actcgagttg ttggtggaga agatgccaaa 720 ccaggtcaat tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt ctgtggaggc 780 tctatcgtta atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac tggtgttaaa 840 attacagttg tcgcaggtga acataatatt gaggagacag aacatacaga gcaaaagcga 900 aatgtgattc gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag ctattaataa gtacaaccat 960 gacattgccc ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt tacacctatt 1020 tgcattgctg acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt 1080 ggctggggaa gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttcttcagta ccttagagtt 1140 ccacttgttg accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta taacaacatg 1200 ttctgtgctg gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc 1260 catgttactg aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaagag 1320 tgtgcaatga aaggcaaata tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactggatt 1380 aaggaaaaaa caaagctcac tagctccagc agcaaggccc ctcccccgag cctgccctcc 1440 ccaagcaggc tgcctgggcc cagtgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctccagcaag 1500 gccccacccc ctagcctgcc ttctccttct cggctgcctg gccccagcga tactccaatt 1560 ctgccccagt cctccagcag taaggctccc cctccatctc tgccatcccc cagcagactg 1620 ccaggccctt ctgatacacc catcctccca cagtgatgag gatccgcggc cgc 1673 <210> 31 <211> 545 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CTP-modified 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cgagaagttt ttgaaaacac tgaaagaaca actgaatttt ggaagcagta tgttgatgga 300 gatcagtgtg agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt gcaaggatga cattaattcc 360 tatgaatgtt ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact gtgaattaga tgtaacatgt 420 aacattaaga atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata gtgctgataa caaggtggtt 480 tgctcctgta ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga agtcctgtga accagcagtg 540 ccatttccat gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta agctcacccg tgctgaggca 600 gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct actgaagctg aaaccatttt ggataacatc 660 actcaaagca cccaatcatt taatgacttc actcgagttg ttggtggaga agatgccaaa 720 ccaggtcaat tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt ctgtggaggc 780 tctatcgtta atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac tggtgttaaa 840 attacagttg tcgcaggtga acataatatt gaggagacag aacatacaga gcaaaagcga 900 aatgtgattc gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag ctattaataa gtacaaccat 960 gacattgccc ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt tacacctatt 1020 tgcattgctg acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt 1080 ggctggggaa gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttcttcagta ccttagagtt 1140 ccacttgttg accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta taacaacatg 1200 ttctgtgctg gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc 1260 catgttactg aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaagag 1320 tgtgcaatga aaggcaaata tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactggatt 1380 aaggaaaaaa caaagctcac tagctccagc agcaaggccc ctcccccgag cctgccctcc 1440 ccaagcaggc tgcctgggcc ctctgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctcctctaag 1500 gccccaccac cttccctgcc tagcccttca agactgccag gccctagcga tacaccaatt 1560 ctgccccagt cctccagcag caaggctccc ccacctagcc tgccttctcc atcaaggctg 1620 cctggcccat ccgatacccc aattttgcct cagagcagct ctagcaaggc acctcccccc 1680 agtctgccct ctccaagcag actccctggc ccttcagaca ctcccattct gccacagtga 1740 tgaggatccg cggccgc 1757 <210> 33 <211> 583 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CTP-modified Factor IX <400> 33 Ser Arg Val Asp Pro Ala Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu 1 5 10 15 Ser Pro Gly Leu Ile Thr Ile Cys 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gaaccttgag agagaatgta tggaagaaaa gtgtagtttt gaagaagcac 240 gagaagtttt tgaaaacact gaaagaacaa ctgaattttg gaagcagtat gttgatggag 300 atcagtgtga gtccaatcca tgtttaaatg gcggcagttg caaggatgac attaattcct 360 atgaatgttg gtgtcccttt ggatttgaag gaaagaactg tgaattagat gtaacatgta 420 acattaagaa tggcagatgc gagcagtttt gtaaaaatag tgctgataac aaggtggttt 480 gctcctgtac tgagggatat cgacttgcag aaaaccagaa gtcctgtgaa ccagcagtgc 540 catttccatg tggaagagtt tctgtttcac aaacttctaa gctcacccgt gctgaggcag 600 tttttcctga tgtggactat gtaaattcta ctgaagctga aaccattttg gataacatca 660 ctcaaagcac ccaatcattt aatgacttca ctcgagttgt tggtggagaa gatgccaaac 720 caggtcaatt cccttggcag gttgttttga atggtaaagt tgatgcattc tgtggaggct 780 ctatcgttaa tgaaaaatgg attgtaactg ctgcccactg tgttgaaact ggtgttaaaa 840 ttacagttgt cgcaggtgaa cataatattg aggagacaga acatacagag caaaagcgaa 900 atgtgattcg aattattcct caccacaact acaatgcagc tattaataag tacaaccatg 960 acattgccct tctggaactg gacgaaccct tagtgctaaa cagctacgtt acacctattt 1020 gcattgctga caaggaatac acgaacatct tcctcaaatt tggatctggc tatgtaagtg 1080 gctggggaag agtcttccac aaagggagat cagctttagt tcttcagtac cttagagttc 1140 cacttgttga ccgagccaca tgtcttcgat ctacaaagtt caccatctat aacaacatgt 1200 tctgtgctgg cttccatgaa ggaggtagag attcatgtca aggagatagt gggggacccc 1260 atgttactga agtggaaggg accagtttct taactggaat tattagctgg ggtgaagagt 1320 gtgcaatgaa aggcaaatat ggaatatata ccaaggtatc ccggtatgtc aactggatta 1380 aggaaaaaac aaagctcact agctccagca gcaaggcccc tcccccgagc ctgccctccc 1440 caagcaggct gcctgggccc tctgacaccc ctatcctgcc tcagtccagc tcctctaagg 1500 ctccaccacc ttccctgcct agcccttcaa gactgccagg ccctagcgat acaccaattc 1560 tgccccagtc ctccagcagc aaggctcccc cacctagcct gccttctcca tcaaggctgc 1620 ctggcccatc cgatacccca attttgcctc agagcagctc tagcaaggca cctcccccca 1680 gtctgccctc tccaagcaga ctccctggcc cttcagacac tccaatcctc ccacagtcct 1740 ctagctctaa agctccacct cccagcctgc ccagccctag tagactcccc ggaccttctg 1800 atacccccat cttgccccag tgatgaggat ccgcggccgc 1840 <210> 35 <211> 610 <212> PRT <213> Artificial 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350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser 405 410 415 Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu 420 425 430 Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro 435 440 445 Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser 450 455 460 Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 485 490

Claims (24)

  1. 카복시 말단에 부착된 3개의 융모막 성선자극호르몬 카복시 말단 펩티드(CTP)를 갖는 인자 VII 응고 인자(CTP-변형된 인자 VII)를 완충제 및 긴장성 제제(tonicity agent)와 혼합하는 단계
    를 포함하는 약제학적 제형의 제조 방법으로서,
    상기 완충제는 시트레이트 및 글리신이고, 상기 긴장성 제제는 염화나트륨이며 150mM의 양으로 존재하고, pH 6.4 내지 6.5의 제형을 형성하는,
    약제학적 제형의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    혼합 후, 주사기 또는 주사용 펜 기기에 제형을 사전 충전하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 제형이 혈액 응고 또는 응고 장애를 치료하기 위한 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 장애가 혈우병, 후천성 혈우병, FVII 결핍증, 선천성 FVII 결핍증, 후천성 혈우병 A, 혈우병 A, 혈우병 B, 억제제가 있는 혈우병 A, 억제제가 있는 혈우병 B, 억제제가 없는 혈우병 A, 또는 억제제가 없는 B형 혈우병인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTP-변형된 인자 VII이 CHO 세포로부터 발현되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTP-변형된 인자 VII이 신호 펩티드를 포함하지 않는, 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    제형이 액체 제형인, 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTP 중 적어도 하나가 절단된 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTP 중 적어도 하나가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTP 중 적어도 하나가 글리코실화된 것인, 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTP 중 적어도 하나가 펩티드 결합을 포함하는 링커를 통해 인자 VII에 부착되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTP-변형된 인자 VII이 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    시트레이트 완충제가 20mM의 양으로 존재하고, 글리신 완충제가 3.3mM의 양으로 존재하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTP-변형된 인자 VII이 1 mg/ml 또는 2.6 mg/ml의 농도로 존재하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    인자 VII이 활성화된 인자 VII인, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    활성화된 인자 VII은 이황화 결합에 의해 연결된 경쇄 및 중쇄를 포함하고,
    상기 경쇄는 서열번호 46의 아미노산 1-152를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 46의 아미노산 153-490을 포함하며,
    상기 이황화 결합은 서열번호 46의 시스테인 잔기 135와 시스테인 잔기 262 사이에서 발생하는, 방법.
  17. 완충제,
    긴장성 제제, 및
    카복시 말단에 부착된 3개의 CTP를 갖는 융모막 성선자극호르몬 카복시 말단 펩티드(CTP)-변형된 인자 VII 응고 인자(CTP-변형된 인자 VII)
    를 포함하는 약제학적 제형으로 채워진 주사가능한 투여 장치로서,
    상기 완충제는 시트레이트 및 글리신이고, 상기 긴장성 제제는 염화나트륨이며 150mM의 양으로 존재하고, 제형의 pH는 6.4 ~ 6.5인,
    투여 장치.
  18. 제17항에 있어서,
    주사가능한 투여 장치가 주사기인, 장치.
  19. 제17항에 있어서,
    주사가능한 투여 장치가 펜 기기인, 장치.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 약제학적 제형이 혈액 응고 또는 응고 장애를 치료하기 위한 것인, 장치.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 장애가 혈우병, 후천성 혈우병, FVII 결핍증, 선천성 FVII 결핍증, 후천성 혈우병 A, 혈우병 A, 혈우병 B, 억제제가 있는 혈우병 A, 억제제가 있는 혈우병 B, 억제제가 없는 혈우병 A, 또는 억제제가 없는 B형 혈우병인, 장치.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTP-변형된 인자 VII이 CHO 세포로부터 발현되거나;
    CTP-변형된 인자 VII이 신호 펩티드를 포함하지 않거나;
    CTP 중 적어도 하나가 절단된 것이거나;
    CTP 중 적어도 하나가 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것이거나;
    CTP 중 적어도 하나가 글리코실화된 것이거나;
    CTP 중 적어도 하나가 펩티드 결합을 포함하는 링커를 통해 인자 VII에 부착되는 것이거나; 또는
    CTP-변형된 인자 VII이 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 것인,
    장치.
  23. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제형이 액체 제형이거나;
    시트레이트 완충제가 20mM의 양으로 존재하고 글리신 완충제가 3.3mM의 양으로 존재하거나;
    CTP-변형된 인자 VII이 1 mg/ml 또는 2.6 mg/ml의 농도로 존재하거나;
    인자 VII이 활성화된 인자 VII인,
    장치.
  24. 제23항에 있어서,
    활성화된 인자 VII은 이황화 결합에 의해 연결된 경쇄 및 중쇄를 포함하고,
    상기 경쇄는 서열번호 46의 아미노산 1-152를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 46의 아미노산 153-490을 포함하며,
    상기 이황화 결합은 서열번호 46의 시스테인 잔기 135와 시스테인 잔기 262 사이에서 발생하는,
    장치.
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