CN1245510C - 长效重组组织因子途径抑制物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，具体涉及长效组织因子途径抑制物(LTFPI)及其制备方法和应用。本发明对组织因子途径抑制物(TFPI)及其受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)的生物信息学和结构分子生物学分析和实验，确定了TFPI羧基末端与LRP结合并被清除的部位。设计了TFPI羧基末端突变体，通过PCR定点突变构建LTFPI基因后，与原核或真核表达载体重组，转化大肠杆菌或毕赤酵母，筛选高表达工程菌。原核工程菌经发酵扩增，破碎细菌，离心收集包涵体，复性后经分子筛和离子交换二步法纯化LTFPI；真核工程菌直接将上清进行二步纯化。获得的LTFPI半衰期明显延长，具有良好的抗凝功能。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及长效重组组织因子途径抑制物(LTFPI)。更具体地，本发明涉及确定LTFPI突变位点与突变、基因克隆、基因表达、蛋白纯化与复性，以及功能测定。
背景技术
组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)是丝氨酸蛋白酶抑制物，分子量约40kd，前体有304个氨基酸，成熟蛋白则有276个氨基酸，后者出氨基术端、三个串联的Kunitz型结构域和羧基末端组成，主要功能有：(1)结构域1抑制组织因子(Tissue Factor，TF)和凝血因子VII/VIIa，并通过抑制TF产生抗血小板聚集作用；(2)结构域2抑制凝血因子X/Xa；(Broze GJ.Annu RevMed，1995；46：103-112)；(3)结构域3抑制内毒素与CD14的结合，产生显著的抗炎症作用；同时结构域3还是肝素的结合位点，肝素通过结合于TFPI结构域3发挥抗凝作用；(4)羧基术端能与受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)结合，是影响TFPI半衰期的关键部位。动物和人体实验证实TFPI能有效治疗严重感染、浓毒血症、弥漫性血管内凝血(DIC)、多脏器功能衰竭(MOF)、高凝状态、血栓栓塞性疾病和肿瘤等具有良好疗效，是一种具有良好应用前景的蛋白质。
大多数TFPI出血管内皮细胞合成和分泌，平滑肌细胞、心肌细胞和纤维母细胞在一定条件下也可产生TFPI。无论是人体自身的TFPI，还是给予的重组野生型TFPI，它的半衰期都很短，只有2分钟左右，会很快从血液中清除。TFPI进入血液循环后，迅速与肝细胞膜上的LRP结合，然后被降解和代谢。半衰期短是TFPI在发挥治疗作用时最大的缺点，必须连续72-96小时给药才能保持疗效，每个疗程约需160-320mg，如此大的剂量给病人带来了巨大的经济负担。因此，延长TFPI的半衰期，减少其用药量，是急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供半衰期长，具有良好抗凝功能的长效组织因子途径抑制物(long half-life TFPI，LTFPI)及其制备方法。
本发明根据生物信息学和结构分子生物学的分析结果，应用基因工程和蛋白质工程对TFPI羧基术端进行了突变，获得半衰期明显延长的重组组织因子途径抑制物(TFPI)长效突变体，命名为长效组织因子途径抑制物(LTFPI)，体内和动物实验表明LTFPI具有良好的抗凝功能。
TFPI的羧基末端能与LRP结合，然后被迅速降解和代谢。本发明首先在计算机工作站上模建了TFPI和LRP分子，然后将两者进行对接，发现TFPI羧基术端的某些关键氨基酸在TFPI和LRP的相互作用发挥关键作用。本发明将TFPI羧基末端267-304区域内的某些氨基酸进行不同程度的替代和缺失突变后，两者的结合能力出现了不同程度的下降，所述LTFPI的半衰期较TFPI延长10倍以上，并具备抗组织因子、凝血因子VII/VIIa和凝血因子X/Xa功能。其中将269、282、288和289位赖氨酸全部替换为丙氨酸的突变效果为佳。
本发明所述氨基酸突变后具有Sequence l的氨基酸序列。
本发明还提供了制备LTFPI的方法，包括制备至少包含表达生物活性的LTFPI编码序列部分的cDNA，在适合表达的载体中克隆cDNA片断，用该载体转染宿主细胞，在适于表达该cDNA片断的条件下培养该宿主细胞，以及从培养物中回收和纯化所需LTFPI。
本发明中LTFPI基因的制备包括经过点突变后的基因，与相关质粒重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证基因是否正确。
将本发明的LTFPI cDNA片断与表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明不限于特定的表达质粒，包括真核表达载体pPIC9K或原核表达载体pET28或pLY-4。在一优选实施方案中，本发明使用原核表达载体，例如pET28等。
上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞，包括原核表达宿主细胞是BL21或JF1125和真核表达宿主细胞GS115。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用大肠杆菌BL21等。
本发明的表达产物以包涵体形式存在于宿主细胞的胞体中，破菌分离包涵体，高浓度尿素或盐酸胍溶解包涵体，分离纯化LTFPI，经适当复性后即获得有活性的LTFPI。
以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照<分子克隆实验指南>。
本发明应用基因工程方法对LTFPI进行生产，所得产品具有高效的抗凝、抗血小板和抗炎功能，并且制备工艺简便、安全。与野生TFPI性质比较表明，LTFPI半衰期明显延长，其余功能类似。LTFPI为注射剂和非注射剂研究提供了原料，可用于预防和治疗严重感染性疾病和血栓栓塞性疾病等。
附图说明
图1是TFPI与LRP对接后相互作用的氨基酸位点。
图2是dPT法检测TFPI1-276和TFPI1-161抗凝活性。
具体实施方式
实施例1 TFPI和LRP在计算机工作站上的对接与分析
应用Insight II软件，在计算机工作站上对TFPI和LRP进行对接，寻找到了TFPI羧基末端269、282、288和289位赖氨酸是两者相互作用的关键位点。
实施例2 LTFPI的设计、制备和性质鉴定
(1)LTFPI基因的克隆、改造及原核表达质粒rLTFPI-pET28的构建
LTFPI的设计方法为：将TFPI羧基末端269、282、288和289位赖氨酸替换为丙氨酸。序列使用PCR点突变获得基因，与pUC19重组，酶解筛选阳性克隆，核苷酸序列分析证实基因序列正确。然后将LTFPI基因切出，与原核表达载体pET28重组，构成原核表达质粒rLTFPI-pET28。转化大肠杆菌JM109，提取质粒，以相应限制性内切酶酶解鉴定，获得特征性片断，证实获得阳性克隆。
LTFPI基因获取方法如下：
采用重叠延伸法，选用pET28多克隆位点NotI后400bp的一段序列设计下游引物：
5’＞CCA CTA CGT GAA CCA TCA CCC TAA TCA AGT＜3’
重叠延伸引物1：其中斜体密码从左到右依次为K254A，K241A。
5’＞CGC AAT TAG GCC TCC TTT TGA TAT TCT TTG GAT GAA ACC CGC TTT ACATGC CCT CAG ACA＜3’
重叠延伸引物2：斜体密码从左到右依次为K254A，K260A，K261A。
5’＞AAA GGA GGC CTA ATT GCG ACC AAA AGA AAA AGA GCG GCG CAG AGA GTGAAA ATA GCA TAT＜3’
以质粒pET28-TFPI为模板，上游引物与重叠延伸引物1配对，下游引物与重叠延伸引物2配对，分别PCR，回收产物后用作中间体，加上游引物和下游引物做PCR，NcoI+NotI双酶切PCR产物，即得K241A，K254A，K260A，K261A突变的LTFPI。
限制性内切酶购自BRL公司，大肠杆菌JM109、质粒pUC19 Invitrogen公司。pLy4的构建按已知方法进行。
(2)筛选高拷贝高效表达菌株
将质粒rLTFPI-pLy4电转化大肠杆菌BL21，使其与大肠杆菌染色体发生重组，G418筛选高效表达菌株。
宿主菌：大肠杆菌BL21
培养液：LBK
Kan工作浓度：30ug/ml
IPTG工作浓度：1mM
①挑单克隆菌落接种至5ml LBK medium，37℃×250rpm至OD600＝1～2。
②接种至500ml LBK medium，37℃×250rpm至OD600＝1～2。
③接种至25L LBK medium，37℃×600rpm，溶氧50％，至OD600＝0.6～0.8。
④加1M IPTG至终浓度1mM，诱导表达3h。
⑤4℃×4000rpm×35min，收集菌体。
⑥50mM Tris.HCl pH8.0洗涤菌体1次，收集菌体，称重。
挑取上述阳性克隆接种于10ml低营养液BMG〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，1％甘油〗中，30℃快速振遥(250RPM)，培养过夜。次日测定光密度OD600，离心弃除BMG培液，用无菌水洗涤后用BMM培液〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，0.5％甲醇〗稀释至OD600＝1。每天补加体积百分数为0.5％的甲醇。甲醇诱导培养7天，每隔24小时取样1ml，测定抗TF/FVIIa(rhTFPI-APl)或抗Fxa(rhTFPI-AP2)活性。离心弃沉淀，上清于-20℃保存。直接取培液上清与2x上样缓冲液等体积混合后取20ul上样，作还原性SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝R-250染色后，Pharmacia Imagenaster VDS扫描定纯度、分子量。可见诱导后上清液在分子量约6kd处有一浓集的条带，经扫描，目的蛋白约占上清总蛋白的84％；结果表明表达产物rhTFPI-AP1有明显的抗TF/FVIIa作用，rhTFPI-AP2有明显的抗FXa作用。上述还原性SDS-PAGE按Laemmli方法进行。
(3)发酵表达工程菌
按上述筛选高表达菌株作为工程菌，然后以5L发酵罐进行高密度发酵。从-70℃深低温冰箱中取出种子菌，室温下解冻，在种子菌培养室100级洁净度条件下划YPD平板，30℃温箱培养2-3天。从平板上挑取单菌落，同样在100级洁净度条件下接种于10ml BMG培养液中，30℃培养过夜，此为一级种子液。再将一级种子液加入140ml培养液中，30℃培养6-8小时，直至OD600＝6，此为二级种子液。种子菌接入后，自然增值，待基础培养基中预加的甘油被耗尽以后，开始补充甘油，补充速度16ml/L/h，待OD600达到120左右，停止补加甘油。待培养液中甘油全部耗尽后，开始甲醇诱导。甲醇补料速度从1ml/L/h逐渐升高至12ml/L/h，以后一直维持此速度。本发明的发酵技术是用低盐培养基扩增工程菌，诱导前用含微量元素的甘油溶液进行补料，到达一定菌体浓度后用含微量元素的甲醇溶液进行诱导表达。
甲醇诱导40h以后，停止发酵，从发酵罐中立即放出菌液进行离心，分离沉淀菌体，收集上清进行纯化。上清中rhTFPI-AP1对TF/FVIIa的抑制常数达Ki＝0.12uM，rhTFPI-AP2对FXa的抑制常数达Ki＝0.09uM。发酵参数为：温度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，搅拌速度与DO连动。
(4)超滤浓缩脱盐
将离心所获上清以1∶10稀释，经Millipore超滤装置(NMWL：3000，Millipore公司)超滤浓缩至1.0L，脱去无机盐。
(5)凝胶过滤
Sephadex G-50(Pharmacia公司)柱用20mmol/LPB(pH7.4)平衡后，将超滤浓缩液上样，加样时注意勿搅动Sephadex G-50胶面。然后用PB洗脱，流速10ml/min，收集活性峰。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱层析
以10倍体积的50mmol/L PB(pH7.4)平衡Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，凝胶过滤后收集的抗凝活力部分以50ml/min的速率将其吸附到Q-Sepharose F.F.柱上。用PB洗柱直至OD280达0.00，然后用0-1mol/L NaCl(50mmol/L PB pH7.4)线性梯度洗脱，收集有抗凝活性部分，分装，冷冻干燥，-40℃保存。
本发明的色谱操作均为常规操作。
(7)纯度鉴定及分子量测定
样品进行16.5％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，PharmaciaInagemasterVDS扫描测定纯度、分子量。所得产品纯度97％以上，分子量约6kD。
(8)抗TF/FVIIa活性测定：使用稀释后的凝血酶原时间(dilutedprothrombin time，dPT)测定，方法如下。
将凝血活酶干粉试剂加2mL生理盐水稀释至终浓度5000U/L，此为凝血活酶原液，再用生理盐水分别稀释10、100和500倍，置37℃备用。取100μL正常人混合血浆，加10μL蛋白溶液，分别加100μL不同浓度的凝血活酶溶液，37℃孵育1min，加100μL 30mmol/L CaCl2溶液，开始计时血浆凝固时间。反应体系中TFPI1-276和TFPI1-161终浓度均为0.2μmol/L，取3次实验平均值记为实验结果，所有试剂均需37℃预热，全部操作2h内完成。结果表明LTFPI使dPT明显延长。
(9)抗FXa测定：应用发色低物发测定，方法如下。
采正常人全血，109mM枸橼酸钠1∶9抗凝，4℃离心15min，4000r/min，等体积混合30份正常人新鲜血浆，56℃孵育15min，置37℃备用，此为参照血浆。每毫升此参照血浆中的TFPI定义为1个活性单位(1U)。
将野生型TFPI和LTFPI分别溶于TS(20mM Tris/HCl pH7.8+150mM NaCl)96孔板，每孔加100μL待测定溶液，再加100μL反应液(100ng/mL FXa+0.2％BSA)，室温孵育30min，加发色底物Spectrozyme Xa至终浓度0.25mM，测OD405。结果表明LTFPI的抗Xa活性与野生型TFPI类似。表1是野生型TFPI和LTFPI抗Xa活性。
表1
| 样本 | 抗Xa活性(U/mg×103) |
| TFPI | 41 |
| LTFPI | 39 |
实施例3 LTFPI半衰期测定
dPT法测大鼠体内TFPI半衰期：大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，股静脉给药(1mg/kg)，颈总动脉插管，给药后不同时间分别取血，109mM枸橼酸钠1∶9抗凝，4℃离心15min，4000r/min，吸取上层血浆，测定dPT。
用生理盐水将凝血活酶标准溶液稀释500倍，此为凝血活酶工作液。取100μL血浆，加100μL凝血活酶工作液，37℃孵育1min，加10μL 250mmol/LCaCl2溶液，开始计时血浆凝固时间。取3次实验平均值记为实验结果。
以野生型TFPI为对照组，观察LTFPI(K282A)和LTFPI(K269A，K282A，K288A和K289A)的半衰期，结果可见LTFPI(K282A)和LTFPI(K269A，K282A，K288A和K289A)的T1/2α分别比TFPI延长了5.1倍和14.5倍。半衰期计算使用上海宏能软件有限公司PKS统计学软件。表2是大鼠给药前后dPT的变化。表3是二级拟合参数表——二室模型。
表2
| 给药后时间(分钟) | 血浆凝固时间(秒) | ||
| TFPI | LTFPI(K282A) | LTFPI(K269A，K282A，K288A和K289A) | |
| 0 | 77.6 | 78 | 78.8 |
| 1 | 106 | 104 | 106.2 |
| 2 | 103 | 104 | 105.8 |
| 3 | 95.3 | 104 | 104.6 |
| 4 | 93.8 | 99.7 | 104 |
| 5 | 93.2 | 99.5 | 95.6 |
| 7 | 92.5 | 99.2 | 93.2 |
| 9 | 91.8 | 98.0 | 92 |
| 12 | 91.5 | 96.6 | 91.4 |
| 15 | 89.6 | 95.1 | 91.4 |
| 20 | 86.6 | 94.1 | 89.6 |
| 25 | 84.2 | 92.5 | 89 |
| 30 | 84.2 | 92.9 | 86 |
表3.
| 用药对象 | 剂量 | T1/2α | T1/2β | CL | Vd | V1 | V2 | AUC∞ | K10 | K21 | K12 |
| 1 | 1 | 1.70 | 46.21 | 0.062168 | 4.1445 | 1.6406 | 2.5039 | 16.085 | 0.037893 | 0.16133 | 0.22332 |
| 2 | 1 | 8.66 | 187.2 | 0.013921 | 3.7598 | 2.2779 | 1.4820 | 71.832 | 0.006112 | 0.04849 | 0.02914 |
| 3 | 1 | 24.72 | 25.16 | 0.076884 | 2.7908 | 2.7612 | 0.0296 | 13.007 | 0.027845 | 0.02774 | 0.00000 |
| 均数 | 11.70 | 86.19 | 0.05099 | 3.5650 | 2.2266 | 1.338 | 33.64 | 0.02395 | 0.07919 | 0.0842 | |
| SD | 11.81 | 88.11 | 0.03294 | 0.6976 | 0.5620 | 1.243 | 33.11 | 0.01624 | 0.07189 | 0.1214 |
其中，用药对象中的1代表TFPI，
2代表LTFPI(K282A)，
3代表LTFPI(K269A，K282A，K288A和K289A)。
无需进一步详细阐述，根据上述所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，上述的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
从以上描述，本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。
SEQUENCE LISTING
Organization Applicant
---------------------
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City：上海
State：上海
Country：中国
PostalCode：200032
PhoneNumber：8621-54237045
FaxNumber：8621-64037324
<110>复旦大学
<120>长效重组组织因子途径抑制物及其制备方法
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>304
<212>PRT
<213>human
<400>1
Met Ile Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu
20 25 30
Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys
35 40 45
Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys
50 55 60
Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu
65 70 75 80
Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser
85 90 95
Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg Ile
100 105 110
Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu
115 120 125
Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn
130 135 140
Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly
145 150 155 160
Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu
165 170 175
Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn
180 185 190
Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu
195 200 205
Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly
210 215 220
Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly
225 230 235 240
Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn
245 250 255
Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Ala Gly Phe Ile
260 265 270
Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Ala Thr Lys Arg Lys Arg Ala
275 280 285
Ala Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met
290 295 300
Claims (7)
1、一种重组组织因子途径抑制物长效突变体，其氨基酸序列是将野生型组织因子途径抑制物的282位赖氨酸替换为丙氨酸后得到的序列。
2、一种重组组织因子途径抑制物长效突变体，其氨基酸序列是序列1的序列。
3、按权利要求1或2所述的重组组织因子途径抑制物长效突变体的制备方法，通过下述步骤获得：(1)获得编码权利要求1或2所述的重组组织因子途径抑制物长效突变体的基因；(2)将上述基因与原核或真核表达载体重组；(3)将重组表达载体转导原核或真核宿主细胞；(4)表达后的重组组织因子途径抑制物长效突变体经分子筛和离子交换层析后，获得纯度大于95％的重组组织因子途径抑制物长效突变体；(5)宿主细胞表达纯化后的重组组织因子途径抑制物长效突变体经复性获得活性。
4、根据权利要求3的制备方法，其中所述的原核表达载体是pET-28或pLY-4。
5、根据权利要求3的制备方法，其中所述的真核表达载体是pPIC9K。
6、根据权利要求3的制备方法，其中所述的原核宿主细胞是BL21或JF1125。
7、根据权利要求3的制备方法，其中所述的真核宿主细胞是GS115。
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