TW202120534A - 用於擴增調節性t細胞之介白素-2突變蛋白 - Google Patents
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Abstract
本文提供了優先擴增和活化調節性T細胞並且適於大規模生產的IL-2突變蛋白和IL-2突變蛋白Fc融合分子。本文還提供了製備和使用本發明之組成物之方法。
Description
IL-2結合三種跨膜受體亞基:當IL-2結合後一起活化細胞內傳訊事件的IL-2Rβ和IL-2Rγ,和用於穩定IL-2和IL-2Rβγ之間的相互作用的CD25(IL-2Rα)。由IL-2Rβγ遞送的訊號包括PI3激酶、Ras-MAP激酶、和STAT5通路中那些。
T細胞需要表現CD25以響應於典型存在於組織中的低濃度的IL-2。表現CD25之T細胞包括對於抑制自體免疫性炎症而言是必需的FOXP3+調節性T細胞(Treg細胞),和已經活化以表現CD25之FOXP3-T細胞二者。FOXP3-CD25+效應T細胞(Teff)可以是CD4+或CD8+細胞,這二者都可能有助於炎症、自體免疫性疾病、器官移植排斥、或移植物抗宿主疾病。IL-2刺激的STAT5傳訊對於正常T-reg細胞生長和存活,以及對於高FOXP3表現而言是關鍵的。
在共同擁有的WO 2010/085495中,我們描述了使用IL-2突變蛋白來優先擴增或刺激Treg細胞。當投與至個體時,對Treg細胞的作用可用於治療炎性疾病和自體免疫性疾病。儘管本文描述的IL-2突變蛋白可用於在體內擴增Treg超過Teff細胞,但是期望產生對於人治療劑而言具有最佳屬性的IL-2突變蛋白。
本文描述了適合高產量可製造性並且具有藥理學活性的IL-2突變蛋白。特別地,本發明之IL-2突變蛋白具有改善的Treg : Teff選擇性窗口。努力產生此類用作人治療劑的分子,發生了許多出乎意料並且不可預知的觀察結果。從該努力產生了本文描述的組成物和方法。
本文描述的IL-2突變蛋白具有針對IL-2突變蛋白和/或內源IL-2的免疫反應的較低可能性,並且提供了Treg優先擴增和活化。此外,在某些實施方式中,將IL-2突變蛋白融合至分子,例如抗體Fc,當投與至個體時,這增加了血清半衰期。IL-2突變蛋白具有短血清半衰期(對於皮下注射,3至5 hr)。本文描述的示例性IL-2突變蛋白在人中具有至少1天、至少3天、至少5天、至少10天、至少15天、至少20天、或至少25天之半衰期。這種對於IL-2突變蛋白的藥物動力學的影響允許IL-2突變蛋白治療劑的減少的或更低頻率的給藥。
此外,當產生藥物大分子時,必須考慮大量產生大分子的能力,同時使聚集最小化,並且使分子的穩定性最大化。IL-2突變蛋白Fc融合分子顯示了此類屬性。
另外,在某些實施方式中,IL-2突變蛋白Fc融合蛋白含有IgG1 Fc區。當期望消除IgG1的效應子功能(例如ADCC活性)時,發現在位置297處的天冬醯胺突變為甘胺酸(N297G;EU編號方案)提供了很大改善的純化效能和生物物理特性,超過了導致去醣基化IgG1 Fc的其他突變。在較佳的實施方式中,將半胱胺酸工程化到Fc中,從而允許二硫鍵,該等二硫鍵增加了含去醣基化Fc的分子的穩定性。去醣基化Fc的效用超過了IL-2突變蛋白Fc融合背景。因此,本文提供了含Fc分子、Fc融合物和抗體,它們包含N297G取代和視需要地,至半胱胺酸的一個或多個另外的殘基之取代。
在一個方面,本發明提供了包含與SEQ ID NO: 1中列出的胺基酸序列具有至少90%同一性之胺基酸序列的人介白素-2(IL-2)突變蛋白,其中所述IL-2突變蛋白具有選自以下的至少一個突變:V91K、D20L;D84R、E61Q;V91K、D20A、E61Q、M104T;N88K、M104L;V91H、M104L;V91K、H16E、M104V;V91K、H16R、M104V;V91K、H16R、M104T;V91K、D20A、M104T;V91K、H16E、M104T;V91K、H16E、E61Q、M104T;V91K、H16R、E61Q、M104T;V91K、H16E;V91H、D20A、M104T;H16E、V91H、M104V;V91H、D20A、E61Q、M104T;V91H、H16R、E16Q;V91K、D20A、M104V;H16E、V91H;V91H、D20A、M104V;H16E、V91H、M104T;H16E、V91H、E61Q、M104T;V91K、E61Q、H16E;V91K、H16R、M104L;H16E、V91H、E16Q;V91K、E61Q、H16R;D20W、V91K、E61Q;V91H、H16R;V91K、H16R;D20W、V91K、E61Q、M104T;V91K、D20A;V91H、D20A、E16Q;V91K、D20A、M104L;V91H、D20A;V91K、E61Q、D20A;V91H、M104T;V91H、M104V;V91K、E61Q;V91K、N88K、E61Q、M104T;V91K、N88K、E61Q;V91H、E61Q;V91K、N88K;D20A、H16E、M104T;D20A、M104T;H16E、N88K;D20A、M104V;D20A、M104L;H16E、M104T;H16E、M104V;N88K、M104V;N88K、E61Q;D20A、E61Q;H16R、D20A;D20W、E61Q;H16E、E61Q;H16E、M104L;N88K、M104T;D20A、H16E;D20A、H16E、E16Q;D20A、H16R、E16Q;V91K、D20W;V91A、H16A;V91A、H16D;V91A、H16E;V91A、H16S;V91E、H16A;V91E、H16D;V91E、H16E;V91E、H16S;V91K、H16A;V91K、H16D;V91K、H16S;和V91S、H16E;並且在體外測定和在人源化小鼠(用CD34+造血幹細胞重構的NSG小鼠)二者中,相對於其他T細胞或NK細胞,優先刺激調節性T細胞。在一個實施方式中,所述突變蛋白與SEQ ID NO: 1中列出的胺基酸序列具有至少95%同一性。在另一個實施方式中,所述突變蛋白與SEQ ID NO: 1中列出的胺基酸序列具有至少97%同一性。在另一個實施方式中,所述突變蛋白的胺基酸序列與SEQ ID NO: 1中列出的胺基酸序列僅在C125A處和在選自以下的一個位置處不同:V91K、D20L;D84R、E61Q;V91K、D20A、E61Q、M104T;N88K、M104L;V91H、M104L;V91K、H16E、M104V;V91K、H16R、M104V;V91K、H16R、M104T;V91K、D20A、M104T;V91K、H16E、M104T;V91K、H16E、E61Q、M104T;V91K、H16R、E61Q、M104T;V91K、H16E;V91H、D20A、M104T;H16E、V91H、M104V;V91H、D20A、E61Q、M104T;V91H、H16R、E16Q;V91K、D20A、M104V;H16E、V91H;V91H、D20A、M104V;H16E、V91H、M104T;H16E、V91H、E61Q、M104T;V91K、E61Q、H16E;V91K、H16R、M104L;H16E、V91H、E16Q;V91K、E61Q、H16R;D20W、V91K、E61Q;V91H、H16R;V91K、H16R;D20W、V91K、E61Q、M104T;V91K、D20A;V91H、D20A、E16Q;V91K、D20A、M104L;V91H、D20A;V91K、E61Q、D20A;V91H、M104T;V91H、M104V;V91K、E61Q;V91K、N88K、E61Q、M104T;V91K、N88K、E61Q;V91H、E61Q;V91K、N88K;D20A、H16E、M104T;D20A、M104T;H16E、N88K;D20A、M104V;D20A、M104L;H16E、M104T;H16E、M104V;N88K、M104V;N88K、E61Q;D20A、E61Q;H16R、D20A;D20W、E61Q;H16E、E61Q;H16E、M104L;N88K、M104T;D20A、H16E;D20A、H16E、E16Q;D20A、H16R、E16Q;V91K、D20W;V91A、H16A;V91A、H16D;V91A、H16E;V91A、H16S;V91E、H16A;V91E、H16D;V91E、H16E;V91E、H16S;V91K、H16A;V91K、H16D;V91K、H16S;和V91S、H16E。
在另一個方面,本發明提供了Fc融合蛋白,其包含Fc和如上所述之人IL-2突變蛋白。在一個實施方式中,該Fc係人IgG1 Fc。在另一個實施方式中,人IgG1 Fc包含改變所述Fc之效應子功能的一個或多個突變。在另一個實施方式中,人IgG1包含在N297處的取代。在另一個實施方式中,在N297處的取代係N297G。在另一個實施方式中,Fc融合蛋白包含所述人IgG Fc的C末端離胺酸的取代或缺失。在另一個實施方式中,所述人IgG Fc的C末端離胺酸被缺失。在另一個實施方式中,連接子連接所述蛋白的Fc和人IL-2突變蛋白部分。在另一個實施方式中,連接子係GGGGS(SEQ ID NO: 5)、GGNGT、或(SEQ ID NO: 6)、和 YGNGT(SEQ ID NO: 7)。在另一個實施方式中,連接子係GGGGS(SEQ ID NO: 5)。在另一個實施方式中,當在哺乳動物細胞中表現時,該IL-2突變蛋白進一步包含改變所述Fc融合蛋白的醣基化的胺基酸添加、取代、或缺失。在另一個實施方式中,該IL-2突變蛋白包含T3取代。在另一個實施方式中,該IL-2突變蛋白包含T3N或T3A取代。在另一個實施方式中,該IL-2突變蛋白包含T3N取代。在另一個實施方式中,該IL-2突變蛋白進一步包含S5突變。在另一個實施方式中,該IL-2突變蛋白進一步包含S5T突變。在另一個實施方式中,所述Fc融合蛋白包含Fc二聚體。在另一個實施方式中,所述Fc融合蛋白包含兩個IL-2突變蛋白。在另一個實施方式中,所述Fc融合蛋白包含單個IL-2突變蛋白。
在另一個方面,本發明提供了編碼如上所述之人IL-2突變蛋白之分離的核酸。
在另一個方面,本發明提供了編碼抗體的Fc部分和如上所述之人IL-2突變蛋白之分離的核酸。在一個實施方式中,抗體的所述Fc部分和人IL-2突變蛋白係在單個開讀框內編碼的。在另一個實施方式中,該Fc係人IgG1 Fc。在另一個實施方式中,人IgG1 Fc包含改變所述Fc的效應子功能的一個或多個突變。在另一個實施方式中,人IgG1包含在N297處的取代。在另一個實施方式中,在N297處的取代係N297G。在另一個實施方式中,該核酸編碼所述人IgG Fc的C末端離胺酸的取代或缺失。在另一個實施方式中,所述人IgG Fc的C末端離胺酸被缺失。在另一個實施方式中,該核酸進一步編碼連接抗體的Fc部分和人IL-2突變蛋白的連接子。在另一個實施方式中,連接子係GGGGS(SEQ ID NO: 5)、GGNGT、或(SEQ ID NO: 6)、和 YGNGT(SEQ ID NO: 7)。在另一個實施方式中,連接子係GGGGS(SEQ ID NO: 5)。在另一個實施方式中,當在哺乳動物細胞中表現時,該IL-2突變蛋白進一步包含改變蛋白的醣基化的胺基酸添加、取代、或缺失,該蛋白包含所述IL-2突變蛋白。在另一個實施方式中,該IL-2突變蛋白包含T3取代。在另一個實施方式中,該IL-2突變蛋白包含T3N或T3A取代。在另一個實施方式中,該IL-2突變蛋白包含T3N取代。在另一個實施方式中,該IL-2突變蛋白進一步包含S5突變。在另一個實施方式中,該IL-2突變蛋白進一步包含S5T突變。
在另一個方面,本發明提供了包含可操作地連接到啟動子的以上所述之分離的核酸的表現載體。
在另一個方面,本發明提供了包含以上所述之分離的核酸的宿主細胞。在一個實施方式中,該分離的核酸可操作地連接到啟動子。在另一個實施方式中,所述宿主細胞係原核細胞。在另一個實施方式中,該宿主細胞係大腸桿菌。在另一個實施方式中,所述宿主細胞係真核細胞。在另一個實施方式中,該宿主細胞係哺乳動物細胞。在另一個實施方式中,該宿主細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
在另一個方面,本發明提供了製備人IL-2突變蛋白之方法,該方法包括在其中表現所述啟動子之條件下培養如上所述之宿主細胞,並且從所述培養收穫人IL-2突變蛋白。
在另一個方面,本發明提供了製備Fc融合蛋白之方法,該方法包括在其中表現所述啟動子之條件下培養如上所述之宿主細胞,並且從所述培養收穫Fc融合蛋白。
在另一個方面,本發明提供了增加T細胞的群體內調節性T細胞(Treg)相對於非調節性T細胞之比率之方法,該方法包括使T細胞的群體與有效量之如上所述之人IL-2突變蛋白接觸。在一個實施方式中,CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加。在另一個實施方式中,CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加至少50%。
在另一個方面,本發明提供了增加T細胞的群體內調節性T細胞(Treg)相對於非調節性T細胞之比率之方法,該方法包括使T細胞的群體與有效量之如上所述之Fc融合蛋白接觸。在一個實施方式中,CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加。在另一個實施方式中,CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加至少50%。
在另一個方面,本發明提供了增加個體的周邊血內調節性T細胞(Treg)相對於非調節性T細胞之比率之方法,該方法包括投與有效量之如上所述之人IL-2突變蛋白。在一個實施方式中,CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加。在另一個實施方式中,CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加至少50%。
在另一個方面,本發明提供了增加個體的周邊血內調節性T細胞(Treg)相對於非調節性T細胞之比率之方法,該方法包括投與有效量之如上所述之Fc融合蛋白。在一個實施方式中,CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加。在另一個實施方式中,CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加至少50%。
在另一個方面,本發明提供了增加個體的周邊血內調節性T細胞(Treg)與自然殺手(NK)細胞之比率之方法,該方法包括投與有效量之如上所述之人IL-2突變蛋白。在一個實施方式中,CD3+ FoxP3+細胞與表現CD56和/或CD16的CD3- CD19-淋巴細胞之比率增加。在另一個實施方式中,CD3+ FoxP3+細胞與表現CD56和/或CD16的CD3- CD19-淋巴細胞之比率增加至少50%。
在另一個方面,本發明提供了增加個體的周邊血內調節性T細胞(Treg)與自然殺手(NK)細胞之比率之方法,該方法包括投與有效量之如上所述之Fc融合蛋白。在一個實施方式中,CD3+ FoxP3+細胞與表現CD56和/或CD16的CD3- CD19-淋巴細胞之比率增加。在另一個實施方式中,CD3+ FoxP3+細胞與表現CD56和/或CD16的CD3- CD19-淋巴細胞之比率增加至少50%。
在另一個方面,本發明提供了治療患有炎性疾病或自體免疫性疾病的個體之方法,所述方法包括向所述個體投與治療有效量的如上所述之IL-2突變蛋白或治療有效量之如上所述之Fc融合蛋白。在一個實施方式中,投與引起疾病的至少一個症狀之減輕。在另一個實施方式中,在投與後,個體的周邊血內調節性T細胞(Treg)相對於非調節性T細胞之比率增加。在另一個實施方式中,在投與後,個體的周邊血內調節性T細胞(Treg)相對於非調節性T細胞之比率保持基本上相同。在另一個實施方式中,該炎性疾病或自體免疫性疾病係狼瘡、移植物抗宿主疾病、C型肝炎誘發的血管炎、I型糖尿病、II型糖尿病、多發性硬化、類風濕關節炎、斑禿、動脈粥樣硬化、牛皮癬、器官移植排斥、休格倫氏症(Sjögren's Syndrome)、白塞氏病(Behcet's disease)、自發性流產、異位性疾病、氣喘、或炎性腸病。
本文中所使用的部分標題僅出於組織目的,而不應被視為限制所描述之主題內容。在本說明書正文中引用的所有參考文獻都藉由引用以其全文明確地併入。
標準技術可以用於重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養和轉化、蛋白質純化等。酵素反應和純化技術可以根據製造商的說明書進行或按照本領域常規實現的或如本文所描述的進行。以下程序和技術可以總體上是根據本領域中眾所周知的常規方法並且如本說明書全篇所引用並且論述的不同通用和更特定的參考文獻中所描述的來進行。參見例如Sambrook等人, 2001,Molecular Cloning: A Laboratory Manuel
[分子選殖:實驗室手冊,第3版], Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], 紐約,出於任何目的將其藉由引用併入本文。除非提供具體定義,否則與在此所述之分析化學、有機化學以及醫學和藥物化學相關所使用的命名以及實驗室過程和技術係本領域熟知的和通常使用的那些。標準技術可以用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製和遞送以及患者的治療。IL-2
本文描述的IL-2突變蛋白係野生型人IL-2的變異體。如本文所用,「野生型人IL-2」、「野生型IL-2」、或「WT IL-2」將意指具有以下胺基酸序列之多肽:
其中X係C、S、V、或A(SEQ ID NO: 2)。
變異體可以在野生型IL-2胺基酸序列內含有一個或多個取代、缺失、或插入。殘基在本文被指定為IL-2胺基酸位置之前的一個字母的胺基酸編碼,例如K35係在SEQ ID NO: 2的位置35處的離胺酸殘基。取代在本文被指定為取代一個字母的胺基酸編碼之前的IL-2胺基酸位置之前的一個字母的胺基酸編碼,例如K35A係在SEQ ID NO: 2的位置35處用丙胺酸殘基取代離胺酸殘基。IL-2 突變蛋白
本文提供了優先刺激T調節(Treg)細胞之人IL-2突變蛋白和抗IL-2抗體。如本文所用,「優先刺激調節性T細胞」意指突變蛋白或抗體超過CD3+ FoxP3- T細胞地促進CD3+ FoxP3+ T細胞的增殖、存活、活化和/或功能。測量優先刺激Treg的能力之方法可以是藉由周邊血白血球的流動式細胞測量術進行測量,其中存在總CD4+ T細胞中的FOXP3+ CD4+ T細胞的百分比的增加、總CD8+ T細胞中的FOXP3+ CD8+ T細胞的百分比的增加、相對於NK細胞的FOXP3+ T細胞的百分比的增加、和/或FOXP3+ T細胞的表面上的CD25的表現水平相對於其他T細胞上的CD25表現的增加的更大增加。如藉由來自亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA的聚合酶鏈鎖反應(PCR)產物之定序所檢測,還可以將Treg細胞的優先生長檢測為相對於從全血提取的DNA中去甲基化的CD3基因,去甲基化的FOXP3啟動子DNA(即Treg特異性去甲基化區、或TSDR)的增加的表示(J. Sehouli等人,2011,Epigenetics [表觀遺傳學] 6: 2, 236-246)。特別地,本發明之IL-2突變蛋白具有增強的Treg : Teff窗口,即保留Treg細胞中的高水平的活性同時顯示Teff細胞中的顯著減弱的那些。由於活化的Teff細胞表現增加水平的CD25,並且患有自體免疫性疾病和炎性疾病的患者具有升高數量的該等細胞,所以我們將CD25+閘控施加到Teff細胞上,從而模擬患者中的CD25表現方面的更現實差異化。
優先刺激Treg細胞的IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白將個體中或周邊血樣本中CD3+ FoxP3+ T細胞相對於CD3+ FoxP3- T細胞之比率增加至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%、至少300%、至少400%、至少500%、至少600%、至少700%、至少800%、至少900%、或至少1000%。
在一些實施方式中,使用實例1之方案,在1 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有效應T細胞的小於50% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在1 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有效應T細胞的小於40% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在1 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有效應T細胞的小於30% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在1 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有效應T細胞的小於20% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在1 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有效應T細胞的小於10% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例2之方案,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白還具有大於25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的10天穩定性。
在一些實施方式中,使用實例1之方案,在200 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有效應T細胞的小於50% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在200 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有效應T細胞的小於40% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在200 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有效應T細胞的小於30% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在200 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有效應T細胞的小於20% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在200 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有效應T細胞的小於10% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例2之方案,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白還具有大於25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的10天穩定性。
在一些實施方式中,使用實例1之方案,在1 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有調節性T細胞的大於30% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在1 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有調節性T細胞的大於40% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在1 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有調節性T細胞的大於50% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在1 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有調節性T細胞的大於60% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在1 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有調節性T細胞的大於70% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例2之方案,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白還具有大於25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的10天穩定性。
在一些實施方式中,使用實例1之方案,在200 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有調節性T細胞的大於30% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在200 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有調節性T細胞的大於40% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在200 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有調節性T細胞的大於50% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在200 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有調節性T細胞的大於60% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例1之方案,在200 nM IL-2處理時,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白具有調節性T細胞的大於70% pSTAT激活。在一些實施方式中,使用實例2之方案,IL-2突變蛋白或其Fc融合蛋白還具有大於25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的10天穩定性。
IL-2突變蛋白的實例包括但不限於在SEQ ID NO: 2中列出的胺基酸序列中包含以下的IL-2突變蛋白:一個或多個V91K、D20L;D84R、E61Q;V91K、D20A、E61Q、M104T;N88K、M104L;V91H、M104L;V91K、H16E、M104V;V91K、H16R、M104V;V91K、H16R、M104T;V91K、D20A、M104T;V91K、H16E、M104T;V91K、H16E、E61Q、M104T;V91K、H16R、E61Q、M104T;V91K、H16E;V91H、D20A、M104T;H16E、V91H、M104V;V91H、D20A、E61Q、M104T;V91H、H16R、E16Q;V91K、D20A、M104V;H16E、V91H;V91H、D20A、M104V;H16E、V91H、M104T;H16E、V91H、E61Q、M104T;V91K、E61Q、H16E;V91K、H16R、M104L;H16E、V91H、E16Q;V91K、E61Q、H16R;D20W、V91K、E61Q;V91H、H16R;V91K、H16R;D20W、V91K、E61Q、M104T;V91K、D20A;V91H、D20A、E16Q;V91K、D20A、M104L;V91H、D20A;V91K、E61Q、D20A;V91H、M104T;V91H、M104V;V91K、E61Q;V91K、N88K、E61Q、M104T;V91K、N88K、E61Q;V91H、E61Q;V91K、N88K;D20A、H16E、M104T;D20A、M104T;H16E、N88K;D20A、M104V;D20A、M104L;H16E、M104T;H16E、M104V;N88K、M104V;N88K、E61Q;D20A、E61Q;H16R、D20A;D20W、E61Q;H16E、E61Q;H16E、M104L;N88K、M104T;D20A、H16E;D20A、H16E、E16Q;D20A、H16R、E16Q;V91K、D20W;V91A、H16A;V91A、H16D;V91A、H16E;V91A、H16S;V91E、H16A;V91E、H16D;V91E、H16E;V91E、H16S;V91K、H16A;V91K、H16D;V91K、H16S;和/或V91S、H16E取代。本發明之IL-2突變蛋白視需要包含C125A取代。儘管可能有利的是減少野生型IL-2序列的另外的突變的數量,本發明包括IL-2突變蛋白,該IL-2突變蛋白還包括除以下外的截短和/或另外的插入、缺失、和/或取代:V91K、D20L;D84R、E61Q;V91K、D20A、E61Q、M104T;N88K、M104L;V91H、M104L;V91K、H16E、M104V;V91K、H16R、M104V;V91K、H16R、M104T;V91K、D20A、M104T;V91K、H16E、M104T;V91K、H16E、E61Q、M104T;V91K、H16R、E61Q、M104T;V91K、H16E;V91H、D20A、M104T;H16E、V91H、M104V;V91H、D20A、E61Q、M104T;V91H、H16R、E16Q;V91K、D20A、M104V;H16E、V91H;V91H、D20A、M104V;H16E、V91H、M104T;H16E、V91H、E61Q、M104T;V91K、E61Q、H16E;V91K、H16R、M104L;H16E、V91H、E16Q;V91K、E61Q、H16R;D20W、V91K、E61Q;V91H、H16R;V91K、H16R;D20W、V91K、E61Q、M104T;V91K、D20A;V91H、D20A、E16Q;V91K、D20A、M104L;V91H、D20A;V91K、E61Q、D20A;V91H、M104T;V91H、M104V;V91K、E61Q;V91K、N88K、E61Q、M104T;V91K、N88K、E61Q;V91H、E61Q;V91K、N88K;D20A、H16E、M104T;D20A、M104T;H16E、N88K;D20A、M104V;D20A、M104L;H16E、M104T;H16E、M104V;N88K、M104V;N88K、E61Q;D20A、E61Q;H16R、D20A;D20W、E61Q;H16E、E61Q;H16E、M104L;N88K、M104T;D20A、H16E;D20A、H16E、E16Q;D20A、H16R、E16Q;V91K、D20W;V91A、H16A;V91A、H16D;V91A、H16E;V91A、H16S;V91E、H16A;V91E、H16D;V91E、H16E;V91E、H16S;V91K、H16A;V91K、H16D;V91K、H16S;和/或V91S、H16E取代,條件係所述突變蛋白維持優先刺激Treg的活性。因此,實施方式包括優先刺激Treg細胞並且包含以下胺基酸序列的IL-2突變蛋白,該胺基酸序列具有:V91K、D20L;D84R、E61Q;V91K、D20A、E61Q、M104T;N88K、M104L;V91H、M104L;V91K、H16E、M104V;V91K、H16R、M104V;V91K、H16R、M104T;V91K、D20A、M104T;V91K、H16E、M104T;V91K、H16E、E61Q、M104T;V91K、H16R、E61Q、M104T;V91K、H16E;V91H、D20A、M104T;H16E、V91H、M104V;V91H、D20A、E61Q、M104T;V91H、H16R、E16Q;V91K、D20A、M104V;H16E、V91H;V91H、D20A、M104V;H16E、V91H、M104T;H16E、V91H、E61Q、M104T;V91K、E61Q、H16E;V91K、H16R、M104L;H16E、V91H、E16Q;V91K、E61Q、H16R;D20W、V91K、E61Q;V91H、H16R;V91K、H16R;D20W、V91K、E61Q、M104T;V91K、D20A;V91H、D20A、E16Q;V91K、D20A、M104L;V91H、D20A;V91K、E61Q、D20A;V91H、M104T;V91H、M104V;V91K、E61Q;V91K、N88K、E61Q、M104T;V91K、N88K、E61Q;V91H、E61Q;V91K、N88K;D20A、H16E、M104T;D20A、M104T;H16E、N88K;D20A、M104V;D20A、M104L;H16E、M104T;H16E、M104V;N88K、M104V;N88K、E61Q;D20A、E61Q;H16R、D20A;D20W、E61Q;H16E、E61Q;H16E、M104L;N88K、M104T;D20A、H16E;D20A、H16E、E16Q;D20A、H16R、E16Q;V91K、D20W;V91A、H16A;V91A、H16D;V91A、H16E;V91A、H16S;V91E、H16A;V91E、H16D;V91E、H16E;V91E、H16S;V91K、H16A;V91K、H16D;V91K、H16S;和/或V91S、H16E取代,並且與SEQ ID NO: 2中列出的胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性。在特別較佳的實施方式中,此類IL-2突變蛋白包含以下胺基酸序列,該胺基酸序列與SEQ ID NO: 2中列出的胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性。
對於胺基酸序列,藉由使用本領域已知的標準技術確定序列同一性和/或相似性,包括但不限於,Smith和Waterman, 1981,Adv. Appl. Math.
[高級應用數學] 2: 482的局部序列同一性演算法、Needleman和Wunsch, 1970,J. Mol. Biol.
[分子生物學雜誌] 48: 443的序列同一性比對演算法、Pearson和Lipman, 1988,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.
[美國國家科學院院刊] 85: 2444的相似性方法的檢索、該等演算法的電腦化實現(威斯康辛遺傳學套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,遺傳學電腦集團,575科學大道,麥德遜,威斯康辛州(Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.))、Devereux等人, 1984,Nucl. Acid Res.
[核酸研究] 12: 387-395所述之最佳匹配序列程式,較佳的是使用預設設置,或藉由檢查。較佳的是,藉由FastDB基於以下參數計算同一性百分比:錯配罰分為1;空位罰分為1;空位大小罰分為0.33;以及連接罰分為30,「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis [序列比較和分析的當前方法]」, Macromolecule Sequencing and Synthesis [大分子定序與合成], Selected Methods and Applications [所選擇的方法與應用], 第127-149頁 (1988), Alan R. Liss公司。
有用演算法之實例係PILEUP。PILEUP使用漸進式雙序列比對從一組相關序列創建多序列比對。它還可以繪製顯示用於創建比對的聚類關係的樹突。PILEUP使用Feng和Doolittle, 1987,J.
Mol. Evol. [分子進化雜誌]35: 351-360的漸進式比對方法的簡單化;該方法類似於Higgins和Sharp, 1989,CABIOS
5: 151-153所述之方法。有用的PILEUP參數包括預設空位權重3.00、預設空位長度權重0.10和加權末端空位。
有用的演算法之另一個實例係BLAST演算法,描述於以下中:Altschul等人, 1990,J. Mol. Biol.
[分子生物學雜誌] 215: 403-410;Altschul等人, 1997,Nucleic Acids Res.
[核酸研究] 25: 3389-3402;和Karin等人, 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
[美國國家科學院院刊] 90: 5873-5787。特別有用的BLAST程式係WU-BLAST-2程式,其獲自Altschul等人, 1996,Methods in Enzymology
[酶學方法] 266: 460-480。WU-BLAST-2使用多個搜索參數,其中大多數都設置為預設值。將可調整參數設置為以下值:重疊間隔 = 1,重疊分數 = 0.125,字閾值(T)= II。HSP S和HSP S2參數為動態值,並且由程式本身根據特定序列的組成和特定數據庫的組成來確立,根據該特定數據庫來搜索感興趣的序列;然而,可以調整該等值以提高靈敏度。
另外有用的演算法係由Altschul等人, 1993,Nucl. Acids Res.
[核酸研究] 25: 3389-3402報導的空位BLAST。空位BLAST使用BLOSUM-62取代得分;閾值T參數設定為9;觸發非空位擴展的按兩下方法,對k的空位長度收取10 + k的成本;Xu
設定為16,並且Xg
設定為40(用於數據庫搜索階段)以及67(用於演算法的輸出階段)。有空位的比對由對應於約22位的得分觸發。
儘管可以預先確定了用於引入胺基酸序列變異的位點或區域,但突變本身不需要預先確定。例如,為了優化給定位點處的突變之性能,可以在靶密碼子或區域進行隨機誘變,並且針對所需活性的最佳組合來篩選表現的IL-2突變蛋白。在具有已知序列的DNA中的預定位點處進行取代突變的技術係熟知的,例如M13引物誘變和PCR誘變。可以使用本文描述的測定進行突變體的篩選,例如。
胺基酸取代典型地是單個殘基取代;插入通常將在從約一個(1個)至約二十個(20)胺基酸殘基的數量級,儘管可以耐受顯著更大的插入。缺失的範圍係從約一個(1個)至約二十個(20)胺基酸殘基,儘管在一些情況下,缺失可以遠遠更大。
取代、缺失、插入或其任何組合可以用於實現最終衍生物或變異體。通常該等變化在少數胺基酸上進行,從而將分子的改變,特別是抗原結合蛋白的免疫原性和特異性最小化。然而,在某些情況下,可以耐受更大變化。通常根據如表1描繪的以下圖表進行保守取代。
[表 1
]
原始殘基 | 示例性取代 |
Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Ser Thr Trp Tyr Val | Ser Lys Gln、His Glu Ser、Ala Asn Asp Pro Asn、Gln Leu、Val Ile、Val Arg、Gln、Glu Leu、Ile Met、Leu、Tyr、Trp Thr Ser Tyr、Phe Trp、Phe Ile、Leu |
藉由選擇比表1中顯示的那些更不保守的取代,造成功能或免疫特性的實質性變化。例如,可以造成具有以下更顯著影響的取代:多肽主鏈的結構(例如α螺旋或β-片層結構)在改變的區域中;在靶位點處的分子的電荷或疏水性;或側鏈的體積。通常預期產生多肽特性的最大變化的取代係以下那些:其中 (a) 親水殘基,例如絲胺醯或蘇胺醯取代以下(或被以下取代):疏水殘基,例如白胺醯、異白胺醯、苯丙胺醯、纈胺醯或丙胺醯;(b) 半胱胺酸或脯胺酸取代以下(或被以下取代):任何其他殘基;(c) 具有正電側鏈的殘基(例如賴胺醯、精胺醯、或組胺醯)取代以下(或被以下取代):負電殘基,例如麩胺醯或天冬胺醯;或 (d) 具有大體積側鏈的殘基(例如苯丙胺酸)取代以下(或被以下取代):沒有側鏈的殘基,例如甘胺酸。
與天然存在的類似物相比,該等變異體典型地表現出相同定性生物活性,並且將引發相同免疫反應,儘管還選擇變異體來根據需要修改IL-2突變蛋白的特徵。可替代地,可以設計變異體,使得改變IL-2突變蛋白的生物活性。例如,如本文討論,可以改變或移除醣基化位點。具有延長的血清半衰期的 IL-2 突變蛋白
因為例如相對於Teff或NK細胞,本文提供的IL-2突變蛋白優先擴增Treg,所以預期當投與至患者時,安全性譜將不同於野生型IL-2或PROLEUKIN®
(阿地介白素(aldesleukin);諾華公司(Novartis),巴塞爾,瑞士)。與野生型IL-2或PROLEUKIN®
相關的副作用包括流感樣症狀、感到寒冷/寒戰、關節痛、發熱、皮疹、瘙癢、注射位點反應、低血壓、腹瀉、噁心、焦慮、精神錯亂、和抑鬱。還可以將本文提供的IL-2突變蛋白改變以包括或融合至分子,所述分子延長突變蛋白的血清半衰期而不增加此類半衰期延長將增加患者中的副作用的可能性或強度之風險。這樣一種血清半衰期延長的突變蛋白的皮下給藥可以允許在更低系統性最大暴露(C最大
)情況下的延長的靶標覆蓋。延長的血清半衰期可以允許突變蛋白的更低或更小頻率的給藥方案。
可以藉由基本上本領域已知的任何方法延長本文提供的IL-2突變蛋白的血清半衰期。此類方法包括將IL-2突變蛋白的序列改變為包括結合新生兒Fcγ受體或結合具有延長的血清半衰期的蛋白(例如IgG或人血清白蛋白)的肽。在其他實施方式中,將IL-2突變蛋白融合至賦予融合分子延長的半衰期之多肽。此類多肽包括IgG Fc或結合新生兒Fcγ受體、人血清白蛋白的其他多肽、或結合具有延長的血清半衰期之蛋白的多肽。在較佳的實施方式中,將IL-2突變蛋白融合至IgG Fc分子。
可以將IL-2突變蛋白融合至IgG Fc區的N末端或C末端。如實例中所示,與融合至IgG Fc的N末端時相比,融合至IgG Fc區的C末端在更大程度上維持IL-2突變蛋白活性。
本發明之一個實施方式針對二聚體,該二聚體包含藉由將IL-2突變蛋白融合至抗體的Fc區產生的兩個Fc融合多肽。例如,可以藉由以下製備該二聚體:將編碼融合蛋白之基因融合物插入適當表現載體,在用重組表現載體轉化的宿主細胞中表現該基因融合物,並且允許表現的融合蛋白來很像抗體分子那樣進行組裝,於是在Fc部分之間形成鏈間鍵來產生二聚體。
如本文使用的,術語「Fc多肽」或「Fc區」包括衍生自抗體的Fc區之多肽的天然的和突變蛋白的形式,並且可以是本發明之IL-2突變蛋白融合蛋白或抗IL-2抗體的一部分。還包括含有促進二聚化的樞紐區的截短形式的此類多肽。在某些實施方式中,該Fc區包含抗體CH2和CH3結構域。伴隨延長的血清半衰期,包含Fc部分(和由其形成的寡聚體)的融合蛋白提供了藉由蛋白A或蛋白G柱上的親和層析進行簡便純化之優點。較佳的Fc區衍生自人IgG,其包括IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。在本文,藉由位置鑒定Fc內的特定殘基。所有Fc位置都基於EU編號方案。
抗體的Fc部分的功能之一係當抗體結合其靶時與免疫系統通信。這被認為是「效應子功能」。通信導致抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。ADCC和ADCP係經由Fc結合至免疫系統細胞表面上的Fc受體介導。CDC係經由Fc與補體系統,例如C1q的蛋白質結合所介導。
IgG亞類在其介導效應子功能的能力方面不同。例如,在介導ADCC和CDC時,IgG1遠遠優於IgG2和IgG4。因此,在其中不希望效應子功能的實施方式中,IgG2 Fc將是較佳的。然而,已知與含IgG1 Fc分子相比,含IgG2 Fc分子更難以製造,並且具有更沒吸引力的特性,例如更短的半衰期。
藉由將一個或多個突變引入Fc,可以增加、或減少抗體的效應子功能。本發明之實施方式包括具有工程化來增加效應子功能的Fc的IL-2突變蛋白Fc融合蛋白(U.S. 7,317,091和Strohl,Curr. Opin. Biotech
. [生物技術當前述評], 20: 685-691, 2009;將這兩篇文獻藉由引用以其全文併入本文)。具有增加的效應子功能的示例性IgG1 Fc分子包括具有以下取代的那些:S239D/I332E;S239D/A330S/I332E;S239D/A330L/I332E;S298A/D333A/K334A;P247I/A339D;P247I/A339Q;D280H/K290S;D280H/K290S/S298D;D280H/K290S/S298V;F243L/R292P/Y300L;F243L/R292P/Y300L/P396L;F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L;G236A/S239D/I332E;K326A/E333A;K326W/E333S;K290E/S298G/T299A;K290N/S298G/T299A;K290E/S298G/T299A/K326E;和/或K290N/S298G/T299A/K326E。
增加含IgG Fc蛋白的效應子功能的另一種方法係藉由減少Fc的岩藻醣基化。從附接至Fc的雙觸角複合型寡糖移除核心岩藻糖增加ADCC效應子功能而不改變抗原結合或CDC效應子功能。已知若干方式來減少或消除含Fc分子(例如抗體)的岩藻醣基化。該等包括在某些哺乳動物細胞系中的重組表現,該等細胞系包括FUT8敲除細胞系、變異體CHO細胞系Lec13、大鼠融合瘤細胞系YB2/0、包含特異性針對FUT8基因的小干擾RNA的細胞系、以及共表現β-1,4-N
-乙醯葡萄胺糖轉移酶III和高爾基α-甘露糖苷酶II的細胞系。可替代地,可以在非哺乳動物細胞(例如植物細胞、酵母、或原核細胞,例如大腸桿菌)中表現含Fc分子。
在某些實施方式中,本發明之IL-2突變蛋白Fc融合蛋白或抗IL-2抗體包含工程化以減少效應子功能的Fc。具有減少的效應子功能的示例性Fc分子包括具有以下取代的那些:N297A或N297Q(IgG1);L234A/L235A(IgG1);V234A/G237A(IgG2);L235A/G237A/E318A(IgG4);H268Q/V309L/A330S/A331S(IgG2);C220S/C226S/C229S/P238S(IgG1);C226S/C229S/E233P/L234V/L235A(IgG1);L234F/L235E/P331S(IgG1);和/或S267E/L328F(IgG1)。
在努力製備去醣基化抗體中多個組具有突變的N297。突變集中在用具有類似天冬醯胺的生理化學性質的胺基酸(例如麩胺醯胺(N297Q)或丙胺酸(N297A),它們模擬沒有極性基團的天冬醯胺)取代N297。
如本文使用的,「去醣基化抗體」或「去醣基化fc」係指在Fc的位置297處的殘基的醣基化狀態。抗體或其他分子可以在一個或多個其他位置處含有醣基化,但是可以仍被認為是去醣基化抗體或去醣基化Fc融合蛋白。
在努力製備無效應子功能IgG1 Fc中,發現將人IgG1的胺基酸N297突變為甘胺酸,即N297G,提供了遠遠比在此殘基處的其他胺基酸取代更優越的純化效能和生物物理特性。參見實例8。因此,在較佳的實施方式中,IL-2突變蛋白Fc融合蛋白包含具有N297G取代的人IgG1 Fc。在其中分子包含人IgG1 Fc的任何背景下,包含N297G取代的Fc係有用的,並且不限於在IL-2突變蛋白Fc融合的背景下的用途。在某些實施方式中,抗體包含具有N297G取代的Fc。
包含具有N297G突變的人IgG1 Fc的Fc還可以包含另外的插入、缺失、和取代。在某些實施方式中,人IgG1 Fc包含N297G取代並且與SEQ ID NO: 3中列出的胺基酸序列具有至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性、或至少99%同一性。在特別較佳的實施方式中,C末端離胺酸殘基被取代或缺失。在SEQ ID NO: 4中列出了包含N297G取代和C末端離胺酸缺失的人IgG1的胺基酸序列。
顯示與醣基化的含IgG1 Fc分子相比,去醣基化的含IgG1 Fc分子更不穩定。可以將Fc區進一步工程化,從而增加去醣基化分子的穩定性。在一些實施方式中,將一個或多個胺基酸殘基取代為半胱胺酸,從而在二聚體狀態下形成二硫鍵。可以用半胱胺酸取代SEQ ID NO: 3中列出的胺基酸序列的殘基V259、A287、R292、V302、L306、V323、或I332。在較佳的實施方式中,特定殘基對為以下取代,該取代使得其優先彼此形成二硫鍵,因此限制或防止二硫鍵混亂。較佳的對包括但不限於,A287C與L306C、V259C與L306C、R292C與V302C,以及V323C與I332C。
本文提供了其中殘基V259、A287、R292、V302、L306、V323、或I332中的一個或多個被半胱胺酸取代的含Fc分子,其實例包括:包含A287C和L306C、V259C和L306C、R292C和V302C、或V323C和I332C取代的那些。
可以施加至IgG1 Fc的另外的突變包括在含Fc多肽中促進異二聚體形成的那些。在一些實施方式中,將Fc區工程化從而產生「杵」和「臼」,當在細胞中共表現時,它們促進兩個不同的含Fc多肽鏈的異二聚體形成。U.S. 7,695,963。在其他實施方式中,將Fc區改變為,當在細胞中共表現時,使用靜電操縱來促進兩個不同的含Fc多肽的異二聚體形成,同時阻止同二聚體形成。WO 09/089,004,將其藉由引用以其全文併入本文。較佳的異二聚體Fc包括其中Fc的一個鏈包含D399K和E356K取代並且Fc的另一個鏈包含K409D和K392D取代的那些。在其他實施方式中,Fc的一個鏈包含D399K、E356K、和E357K取代並且Fc的另一個鏈包含K409D、K392D、和K370D取代。
在某些實施方式中,可能有利的是,IL-2突變蛋白Fc融合蛋白係單體的,即僅含有單個IL-2突變蛋白分子。類似地,可能希望可以特異性結合一個或多個另外的靶標的雙、三、或四特異性抗體。在此類實施方式中,融合蛋白或抗體的Fc區可以含有促進異二聚體形成的一個或多個突變。將融合蛋白或抗體與Fc區共表現,該Fc區具有IL-2突變蛋白Fc融合多肽中的那些突變的互惠突變(reciprocal mutation),但是缺乏IL-2突變蛋白或抗IL-2重鏈可變結構域。當兩個含Fc多肽的異二聚體形成時,所得蛋白僅包含單個IL-2突變蛋白或抗IL-2結合結構域。
產生單體IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的另一種方法係將IL-2突變蛋白融合至單體Fc,即並不二聚化的Fc區。適合的單體Fc包含阻止二聚化並且穩定單體形式的分子的突變。較佳的單體Fc揭露於WO 2011/063348中,將其藉由引用以其全文併入本文。在某些實施方式中,IL-2突變蛋白Fc融合蛋白包含Fc,該Fc包含在位置392和409處的帶負電荷的胺基酸,連同在Y349、L351、L368、V397、L398、F405、或Y407處的蘇胺酸取代。
在某些實施方式中,IL-2突變蛋白Fc融合蛋白包含在Fc和IL-2突變蛋白之間的連接子。本領域已知許多不同的連接子多肽,並且該等連接子多肽可以用於IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的背景下。在較佳的實施方式中,IL-2突變蛋白Fc融合蛋白包含在Fc和IL-2突變蛋白之間的由以下組成的肽的一個或多個拷貝:GGGGS(SEQ ID NO: 5)、GGNGT(SEQ ID NO: 6)、或YGNGT(SEQ ID NO: 7)。在一些實施方式中,Fc區和IL-2突變蛋白之間之多肽區包含以下的單拷貝:GGGGS(SEQ ID NO: 5)、GGNGT(SEQ ID NO: 6)、或YGNGT(SEQ ID NO: 7)。如本文所示,當在適當細胞中表現時,連接子GGNGT(SEQ ID NO: 6)或YGNGT(SEQ ID NO: 7)被醣基化,並且此類醣基化可以幫助在溶液中和/或在體內投與時穩定蛋白。因此,在某些實施方式中,IL-2突變蛋白融合蛋白包含在Fc區和IL-2突變蛋白區之間的醣基化連接子。
預期當置於多肽的背景下時,醣基化連接子會是有用的。本文提供了多肽,該等多肽包含GGNGT(SEQ ID NO: 6)或YGNGT(SEQ ID NO: 7),該GGNGT(SEQ ID NO: 6)或YGNGT(SEQ ID NO: 7)插入該多肽的胺基酸序列或替代該多肽的胺基酸序列內的一個或多個胺基酸。在較佳的實施方式中,GGNGT(SEQ ID NO: 6)或YGNGT(SEQ ID NO: 7)插入多肽三級結構的環中。在其他實施方式中,用GGNGT(SEQ ID NO: 6)或YGNGT(SEQ ID NO: 7)替代環的一個或多個胺基酸。
Fc的C末端部分和/或IL-2突變蛋白的胺基末端部分可以含有當在哺乳動物細胞中表現時改變IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的醣基化譜的一個或多個突變。在某些實施方式中,IL-2突變蛋白進一步包含T3取代,例如T3N或T3A。IL-2突變蛋白可以進一步包含S5取代,例如S5T。
IL-2突變蛋白和IL-2突變蛋白Fc融合蛋白以及抗IL-2抗體的共價修飾包括在本發明之範圍內,並且通常但不總是在翻譯後進行。例如,藉由使分子的某些胺基酸殘基與能夠與選擇的側鏈或N或C末端殘基反應的有機衍生劑反應,將幾種類型的共價修飾引入到該分子中。
半胱胺醯殘基最常見的是與α-鹵代乙酸鹽(和相應的胺)如氯乙酸或氯乙醯胺反應,得到羧甲基或羧醯胺甲基衍生物。半胱胺醯殘基也藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯磷酸酯、N-烷基順丁烯二醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物,對氯汞基苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應而衍生化。
組胺醯基殘基藉由與pH 5.5-7.0的焦碳酸二乙酯反應而衍生化,因為該試劑對組胺醯基側鏈具有相對特異性。對溴苯甲醯甲基溴也是有用的;該反應較佳的在pH 6.0的0.1 M二甲胂酸鈉中進行。
賴胺醯和胺基末端殘基與琥珀酸或其他羧酸酸酐反應。用該等試劑衍生化具有逆轉賴胺醯殘基電荷的作用。用於衍生含α-胺基的殘基的其他適合試劑包括亞胺酸酯,諸如甲基吡啶亞胺甲酯;磷酸吡哆醛;吡哆醛;硼氫化氯;三硝基苯磺酸;O-甲基異脲;2,4-戊二酮;以及轉胺酵素性的與乙醛酸鹽的反應。
藉由與一種或幾種常規試劑反應來修飾精胺醯基殘基,其中包括苯甲醯甲醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮和茚三酮。由於胍官能基的pKa
高,因此精胺酸殘基的衍生化需要在鹼性條件下進行反應。此外,該等試劑可以與離胺酸基團以及精胺酸ε-胺基基團反應。
可以進行酪胺醯基殘基的特定修飾,特別感興趣的是藉由與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入酪胺醯基殘基中。最常見的是,N-乙醯基咪唑和四硝基甲烷分別用於形成鄰乙醯基酪胺醯基種類和3-硝基衍生物。使用125
I或131
I碘化酪胺醯基殘基以製備用於放射免疫測定的標記蛋白質,上述氯胺T方法係適合的。
羧基側基團(天冬胺醯基或麩胺醯基)藉由與碳二亞胺(R'—N=C=N--R')反應而選擇性地修飾,其中R和R'視需要為不同的烷基基團,諸如1-環己基-3-(2-𠰌啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外,天冬胺醯基和麩胺醯基殘基藉由與銨離子反應轉化為天冬醯胺醯基和麩胺醯胺醯基殘基。
用雙功能劑情況下的衍生化可用於將抗原結合蛋白交聯到水不溶性載體基質或表面以用於多種方法中。常用的交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯(例如與4-疊氮基水楊酸的酯)、同雙官能亞胺酸酯(包括二琥珀醯亞胺酯,諸如3,3'-二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯),和雙官能順丁烯二醯亞胺,諸如雙-N-順丁烯二醯亞胺-1,8-辛烷)。衍生化試劑如甲基-3-[(對疊氮基苯基)二硫代]丙醯亞胺酯產生可光活化的中間體,其能夠在光的存在下形成交聯。可替代地,描述於美國專利案號3,969,287;3,691,016;4,195,128;4,247,642;4,229,537;和4,330,440中的反應性水不溶性基質如溴化氰活化的碳水化合物和反應性底物被採用用於蛋白質固定。
麩胺醯胺醯基和天冬醯胺醯基殘基通常分別脫醯胺成相應的麩胺醯基和天冬胺醯基殘基。可替代地,該等殘基在溫和的酸性條件下脫醯胺。該等殘基的任何一種形式都屬於本發明之範圍。
其他修飾包括脯胺酸和離胺酸的羥基化,絲胺醯基或蘇胺醯基殘基的羥基基團之磷酸化,離胺酸、精胺酸和組胺酸側鏈的α-胺基基團之甲基化(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties [蛋白質:結構和分子特性]、W. H. Freeman公司, 三藩市, 1983, 第79-86頁),N末端胺的乙醯化和任何C末端羧基的醯胺化。
包括在本發明範圍內的IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合、或抗IL-2抗體的另一種類型的共價修飾包括改變蛋白質的醣基化模式。如本領域所知,醣基化模式可取決於蛋白質之序列(例如,下文討論的特定醣基化胺基酸殘基的存在或不存在)或產生蛋白質的宿主細胞或生物二者。下面討論特定的表現系統。
多肽的醣基化通常是N-連接的或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基的側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸和天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X係除脯胺酸之外的任何胺基酸)係碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈酶促連接的識別序列。因此,多肽中該等三肽序列中任一個的存在產生潛在的醣基化位點。O-連接醣基化係指將糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一連接到羥基胺基酸上,最通常為絲胺酸或蘇胺酸,儘管也可以使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
藉由改變胺基酸序列使其含有一種或多種上述三肽序列(對於N-連接的醣基化位點),可以方便地完成向IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體中添加醣基化位點。也可以藉由將一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至起始序列或被一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代(對於O-連接的醣基化位點)來進行改變。為了方便起見,IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體胺基酸序列較佳的藉由DNA水平的變化來改變,特別是藉由在預選鹼基處突變編碼靶多肽的DNA,以使得產生將翻譯成所希望胺基酸的密碼子。
增加IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體上的碳水化合物部分的數量的另一種手段係藉由將糖苷化學或酶促偶合至蛋白質。該等方法係有利的,因為它們不需要在具有對於N-和O-連接的醣基化的醣基化能力的宿主細胞中產生蛋白質。取決於所使用的偶合方式,一種或多種糖可連接到 (a) 精胺酸和組胺酸,(b) 游離羧基基團,(c) 游離巰基基團,諸如半胱胺酸的那些,(d) 游離羥基基團,諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸的那些,(e) 芳香族殘基,諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸的那些,或 (f) 麩胺醯胺的醯胺基團。該等方法描述於1987年9月11日公佈的WO 87/05330以及Aplin和Wriston, 1981,CRC Crit. Rev. Biochem.
[CRC生物化學關鍵評論], 第259-306頁中。
存在於起始IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體上的碳水化合物部分的去除可以化學或酶促方式完成。化學去醣基化需要將蛋白質暴露於化合物三氟甲磺酸或等效的化合物中。該處理導致除連接糖(N-乙醯葡萄胺糖或N-乙醯半乳糖胺)之外的大多數或所有糖的裂解,同時使多肽保持完整。化學去醣基化由Hakimuddin等人, 1987,Arch. Biochem. Biophys.
[生物化學與生物物理學集刊] 259: 52和Edge等人, 1981,Anal. Biochem.
[分析生物化學] 118: 131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以藉由使用多種內切糖苷酶和外切糖苷酶實現,如由Thotakura等人, 1987,Meth. Enzymol.
[酶學方法] 138: 350所述。可以藉由使用化合物衣黴素防止潛在醣基化位點處的醣基化,如由Duskin等人, 1982,J. Biol. Chem.
[生物化學雜誌] 257: 3105所述。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷連接之的形成。
例如,IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體的另一種類型的共價修飾包括以美國專利案號4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所述之方式將蛋白連接到各種非蛋白質聚合物,包括但不限於各種多元醇,例如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯。此外,可以在IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體內的不同位置處進行胺基酸取代,從而促進聚合物(例如PEG)之添加。因此,本發明之實施方式包括聚乙二醇化的IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體。此類聚乙二醇化的蛋白與其非聚乙二醇化形式相比可以具有增加的半衰期和/或減少的免疫原性。編碼 IL-2 突變蛋白和 IL-2 突變蛋白 Fc 融合蛋白的多核苷酸
本發明涵蓋了編碼IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體的核酸。本發明之方面包括編碼本文描述的胺基酸序列的多核苷酸變異體(例如由於簡並)。
可以藉由從胺基酸序列「回譯」,獲得對應於本文描述的胺基酸序列的核苷酸序列,其用作用於分離核酸的探針或引物,或用作用於數據庫檢索的查詢序列。可以採用熟知的聚合酶鏈鎖反應(PCR)程序來分離並且擴增編碼IL-2突變蛋白和IL-2突變蛋白Fc融合蛋白之DNA序列。將定義DNA片段的組合的所需末端的寡核苷酸用作5'和3'引物。該等寡核苷酸可以另外含有限制性核酸內切酶的識別位點,以促進將DNA片段的擴增的組合插入表現載體中。PCR技術描述於Saiki等人,Science
[科學],239: 487(1988);Recombinant DNA Methodology
[重組DNA方法],Wu等人編輯,學術出版社 (Academic Press, Inc.),聖迭哥(1989),第189-196頁,和PCR Protocols
:A Guide to Methods and Applications
[PCR方案: 方法和應用指南],Innis等人編輯,學術出版社(Academic Press, Inc.)(1990)中。
本發明之核酸分子包括呈單股和雙股形式的DNA和RNA,以及相應互補序列。「分離的核酸」在從天然存在的來源分離的核酸的情況下,係指已與分離出核酸的生物體基因組中存在的相鄰基因序列分離的核酸。在由模板酶法合成或化學合成核酸,例如PCR產物、cDNA分子或寡核苷酸的情況下,應理解,由此類方法獲得的核酸係分離的核酸。分離的核酸分子係指呈獨立片段形式或作為較大核酸構建體的一種組分的核酸分子。在一個較佳的實施方式中,核酸基本上不含污染性內源物質。該核酸分子較佳的是衍生自基本上純的形式和能夠利用標準生物化學方法(例如Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual
[分子選殖:實驗室手冊],第2版,Cold Spring Harbor Laboratory [冷泉港實驗室], Cold Spring Harbor [冷泉港], NY [紐約州](1989)中概述的方法)鑒別、操作和回收其組分核苷酸序列的量或濃度分離至少一次的DNA或RNA。此類序列較佳的是以不含典型地存在於真核基因中的內部非翻譯序列或內含子的可讀框形式提供和/或構建。非翻譯DNA序列可以存在於可讀框的5'或3'處,其中該等序列不干擾編碼區的操作或表現。
根據本發明之IL-2突變蛋白通常藉由以下來製備:使用盒式或PCR誘變,或本領域中熟知的其他技術,對編碼IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的DNA中的核苷酸進行位點特異性誘變,以產生編碼變異體的DNA,並且隨後如本文所概述在細胞培養中表現重組DNA。然而,可以使用確定的技術,藉由體外合成,製備IL-2突變蛋白和IL-2突變蛋白Fc融合物。該等變異體典型地表現出與天然存在的類似物相同的生物活性,例如Treg擴增,儘管還可以選擇具有如將在下文更全面地描述的改進特徵的變異體。
如本領域技術者所理解,由於遺傳密碼的簡並,本發明之每種IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、和抗IL-2抗體係由極大數量的核酸編碼的,該等核酸的每一個都在本發明之範圍內,並且可以使用標準技術進行製備。因此,藉由以不改變編碼蛋白的胺基酸序列的方式簡單地修飾一個或多個密碼子序列來標識特定胺基酸序列,熟悉該項技術者可以制得多種不同的核酸。
本發明還提供了處於質體形式的表現系統和構建體、表現載體、轉錄或表現盒,其包含至少一種如上多核苷酸。此外,本發明提供了包含此類表現系統或構建體之宿主細胞。
典型地,用於任何宿主細胞中的表現載體均將含有用於質體維持及用於選殖及表現外源核苷酸序列的序列。在某些實施方式中,統稱為「毗鄰序列」,典型地將包括以下核苷酸序列中的一個或多個:啟動子、一個或多個增強子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體和受體剪接位點的完整內含子序列、編碼用於多肽分泌的前導序列的序列、核糖體結合位、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現的多肽的核酸的多連接子區和可選擇標記物元件。該等序列分別於下文論述。
視需要,載體可以含有「標籤」編碼序列,即,位於IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體編碼序列的5'或3'末端的寡核苷酸分子;該寡核苷酸序列編碼聚His(例如六聚His(SEQ ID NO: 8)),或存在針對其的市售抗體的另一個「標籤」,例如FLAG、HA(血球凝集素流感病毒)或myc
。此標籤典型地在多肽表現時與該抗體融合,且可以用作一種自宿主細胞親和純化或檢測它的方式。親和純化可以藉由例如柱層析法,使用針對標籤的抗體作為親和基質來實現。視需要,隨後可以藉由各種方式,例如使用某些肽酶裂解,移除標籤。
毗鄰序列可以是同源的(即,來自於與宿主細胞相同的物種和/或品系)、異源的(即,來自於除宿主細胞物種或品系以外的物種)、雜合的(即,來自於多於一個來源的毗鄰序列的組合)、合成的或天然的。因此,毗鄰序列的來源可以為任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或非脊椎動物生物體,或任何植物,只要該毗鄰序列在宿主細胞機器中起作用且可以經宿主細胞機器活化。
可用於本發明載體中的毗鄰序列可以藉由本領域中熟知的若干方法中的任一種獲得。典型地,可用於本文中的毗鄰序列將預先藉由定位和/或藉由限制性核酸內切酶消化鑒別且因此可以使用適當限制性核酸內切酶自適當組織來源分離。在一些情況下,毗鄰序列的完全核苷酸序列可能為已知的。在此,可使用本文中所描述的用於核酸合成或選殖之方法來合成毗鄰序列。
無論已知毗鄰序列的全部抑或僅一部分,其均可使用聚合成酶鏈反應(PCR)和/或藉由用適合探針,例如來自相同或另一個物種的寡核苷酸和/或毗鄰序列片段篩選基因組文庫來獲得。若毗鄰序列未知,則可以自可能含有例如編碼序列或甚至另外一個或多個基因的較大DNA片段分離含有毗鄰序列之DNA片段。可以藉由以下方法來實現分離:限制性核酸內切酶消化產生適當DNA片段,隨後使用瓊脂糖凝膠純化、Qiagen®
柱層析法(查茨沃思(Chatsworth), 加利福尼亞州(CA))或技術者已知的其他方法進行分離。熟悉該項技術者將易於瞭解實現此目的的適合成酶的選擇。
複製起點典型地是可商購的原核表現載體的一部分,且該起點有助於在宿主細胞中擴增載體。若所選載體不含複製起點,則可以基於已知序列以化學方式合成,並將其連接到載體中。例如,來自質體pBR322(新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs), 貝芙麗(Beverly), 馬塞諸塞州(MA))的複製起點適用於大多數革蘭氏陰性細菌,且各種病毒起點(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水皰性口炎病毒(VSV),或乳頭瘤病毒(例如HPV或BPV))可用於在哺乳動物細胞中選殖載體。一般而言,哺乳動物表現載體不需要複製起點組分(例如,通常僅使用SV40起點,因為其還含有病毒早期啟動子)。
轉錄終止序列典型地位於多肽編碼區3'端且用於終止轉錄。通常,原核細胞中的轉錄終止序列係富含G-C之片段,後接聚T序列。雖然序列可自文庫中容易地選殖或甚至作為載體的一部分而購自市面,但其還可使用例如本文中所描述的那些核酸合成方法容易地合成。
可選擇標記物基因編碼使選擇性培養基中生長的宿主細胞存活和生長所需的蛋白質。典型的選擇標記基因編碼如下蛋白質:(a) 賦予針對抗生素或其他毒素(例如,對於原核宿主細胞,胺苄青黴素、四環素或康黴素)之抗性;(b) 補充細胞的營養缺陷;或 (c) 提供不可得自複雜培養基或限定培養基的重要營養物。特定的可選擇標記物為康黴素抗性基因、胺苄青黴素抗性基因及四環素抗性基因。有利地,新黴素抗性基因還可用於在原核及真核宿主細胞二者中進行選擇。
其他可選擇基因可用於擴增將表現的基因。擴增為如下的過程:其中使產生對生長或細胞存活非常重要的蛋白質所需的基因在重組細胞連續世代的染色體內串聯重複。哺乳動物細胞的適合可選擇標記物的實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)及無啟動子胸苷激酶基因。使哺乳動物細胞轉化株處於選擇壓力下,其中由於載體中存在可選擇基因,故僅轉化株唯一適於存活。選擇壓力係藉由以下來施加:在連續地增加培養基中選擇劑的濃度之條件下培養經轉化細胞,由此使可選擇基因和因此編碼所需多肽(例如IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體的重鏈和/或輕鏈)的基因二者擴增。因此,由擴增的DNA合成較多量的多肽。
核糖體結合位對於mRNA翻譯起始而言通常為必需的且以Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)為特徵。該組件典型地位於啟動子的3'端且在待表現之多肽編碼序列之5'端。在某些實施方式中,一個或多個編碼區可以可操作地連接到內部核糖體結合位(IRES),由此允許自單一RNA轉錄物翻譯兩個可讀框。
在一些情況下,例如在真核宿主細胞表現系統中需要醣基化的情況下,可以操作各種前序列或原序列以改善醣基化或產率。例如,可以改變特定訊息肽的肽酶裂解位點,或添加原序列,該等序列還可影響醣基化。最終蛋白質產物可以在位置-1(相對於成熟蛋白質的第一個胺基酸)具有一個或多個易於表現的另外的胺基酸,該等胺基酸可能未完全移除。例如,最終蛋白質產物可能具有一個或兩個在肽酶裂解位點中發現的胺基酸殘基附接至胺基末端。可替代地,當酶在成熟多肽內的此類區域切割時,使用一些酶裂解位點可能產生所需多肽的略微截短的形式。
本發明之表現和選殖載體典型地將含有由宿主生物體識別且可操作地連接到編碼IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體之重鏈和/或輕鏈的分子之啟動子。啟動子為位於控制結構基因轉錄的結構基因起始密碼子(一般在約100至1000 bp內)上游(即,5')的非轉錄序列。啟動子通常分組為兩種類別中的一個:誘導型啟動子及組成型啟動子。誘導型啟動子起始處於其控制下的DNA響應於培養條件的某種變化(諸如營養素的存在或不存在,或者溫度變化)以提高的水平轉錄。另一方面,組成型啟動子一致地轉錄其可操作地連接的基因,即,對基因表現具有極小控制或無控制。許多由多種潛在宿主細胞識別的啟動子為眾所周知的。
用於酵母宿主的適合啟動子在本領域中也是眾所周知的。酵母增強子宜與酵母啟動子一起使用。用於哺乳動物宿主細胞的適合啟動子為眾所周知的,且包括但不限於獲自病毒基因組的那些啟動子,該等病毒為諸如多形瘤病毒、傳染性上皮瘤病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒以及最較佳的猿猴病毒40(SV40)。其他適合哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子,例如熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子。
可能有意義的其他啟動子包括但不限於:SV40早期啟動子(Benoist和Chambon, 1981,Nature
[自然] 290: 304-310);CMV啟動子(Thornsen等人, 1984,Proc. Natl. Acad. U.S.A.
[美國國家科學院院刊] 81: 659-663);勞斯氏肉瘤病毒3'長末端重複序列中包含的啟動子(Yamamoto等人, 1980,Cell
[細胞] 22: 787-797);皰疹病毒胸苷激酶啟動子(Wagner等人, 1981,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
[美國國家科學院院刊] 78: 1444-1445);來自金屬硫蛋白基因的啟動子和調節序列(Prinster等人,1982,Nature
[自然] 296: 39-42);以及原核啟動子,諸如β-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人, 1978,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
[美國國家科學院院刊] 75: 3727-3731);或tac啟動子(DeBoer等人, 1983,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
[美國國家科學院院刊]
80: 21-25)。有意義的還有以下動物轉錄控制區,它們表現出組織特異性並已用於轉基因動物中:在胰腺腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等人, 1984,Cell
[細胞] 38: 639-646;Ornitz等人, 1986,Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
[冷泉港定量生物學研討會] 50: 399-409;MacDonald, 1987,Hepatology
[肝臟病學] 7: 425-515);在胰腺β細胞中有活性的胰島素基因控制區(Hanahan, 1985,Nature
[自然]
315: 115-122);在淋巴樣細胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人, 1984,Cell
[細胞]
38: 647-658;Adames等人, 1985, Nature
[自然] 318: 533-538;Alexander等人, 1987,Mol. Cell. Biol.
[分子細胞生物學] 7: 1436-1444);在睾丸細胞、乳腺細胞、淋巴樣細胞和肥胖細胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(Leder等人, 1986,Cell
[細胞]
45: 485-495);在肝臟中有活性的白蛋白基因控制區(Pinkert等人, 1987,Genes and Devel.
[基因與發育] 1: 268-276);在肝中具有活性的α-胎蛋白基因控制區(Krumlauf等人,1985,Mol. Cell. Biol.
[分子細胞生物學] 5: 1639-1648;Hammer等人,1987,Science
[科學] 253: 53-58);在肝臟中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人, 1987,Genes and Devel.
[基因與發育] 1: 161-171);在骨髓細胞中有活性的β-球蛋白基因控制區(Mogram等人., 1985, Nature
[自然] 315: 338-340;Kollias等人., 1986,Cell
[細胞] 46: 89-94);在大腦的寡樹突膠細胞中有活性的髓磷脂鹼性蛋白基因控制區(Readhead等人, 1987,Cell
[細胞]
48: 703-712);在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani, 1985,Nature
[自然] 314: 283-286);以及在下視丘中有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(Mason等人, 1986,Science
[科學] 234: 1372-1378)。
可將增強子序列插入該載體中以增加高等真核生物之轉錄。增強子為DNA的順式作用元件,長度通常為約10-300 bp,作用於啟動子以增加轉錄。增強子在方向及位置方面為相對獨立的,已見於轉錄單元之5'及3'位置。已知可得自哺乳動物基因的若干增強子序列(例如,球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)。然而,典型地使用來自於病毒的增強子。本領域中已知的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒增強子和腺病毒增強子係用於活化真核啟動子之例示性強化元件。儘管增強子可以定位於載體中編碼序列的5'或3',但其典型地位於啟動子5'之位點處。可將編碼適當天然或異源訊息序列(前導序列或訊息肽)的序列併入表現載體中,以促進IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體的重鏈和/或輕鏈的細胞外分泌。訊息肽或前導序列的選擇取決於待產生蛋白的宿主細胞之類型,且異源訊息序列可替換天然訊息序列。在哺乳動物宿主細胞中具有功能性的訊息肽的實例包括以下:美國專利案號4,965,195中所描述的介白素-7(IL-7)之訊息序列;Cosman等人, 1984,Nature
[自然] 312: 768中所描述的介白素-2受體訊息序列;歐洲專利案號0367 566中所描述的介白素-4受體訊息肽;美國專利案號4,968,607中所述之I型介白素-1受體訊息肽;EP專利案號0 460 846中所述之II型介白素-1受體訊息肽。在一個實施方式中,本發明之IL-2突變蛋白Fc融合物包含如圖24中所展示的前導序列。
載體可以含有當載體被整合到宿主細胞基因組中時,促進表現的一個或多個元件。實例包括EASE元件(Aldrich等人,2003,Biotechnol Prog.
[生物技術進展],19: 1433-38)和基質附著區(MAR)。MAR介導染色質的結構組織化並且可以使整合的載體與「位置」效應絕緣。因此,當載體用於產生穩定轉染子時,MAR是特別有用的。本領域已知多個天然的或合成的含MAR核酸,例如美國專利案號6,239,328;7,326,567;6,177,612;6,388,066;6,245,974;7,259,010;6,037,525;7,422,874;7,129,062。
可由起始載體(例如市售載體)構建本發明之表現載體。該等載體可含有或可不含所有所需毗鄰序列。在載體中不存在一個或多個本文所描述的毗鄰序列的情況下,其可以獨立地獲得且連接到載體中。用於獲得各毗鄰序列之方法係熟悉該項技術者熟知的。
在已構建載體並且已將編碼IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體的重鏈和/或輕鏈的核酸分子插入載體的適當位點中之後,可將完整載體插入適合的宿主細胞中以用於擴增和/或多肽表現。可以藉由以下熟知的方法完成將表現載體轉化到所選的宿主細胞中,該等方法包括:轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、顯微注射、脂質轉染、DEAE-聚葡萄糖介導的轉染或其他已知的技術。所選方法將部分隨待使用的宿主細胞類型而變化。該等方法及其他適合的方法對於技術者是眾所周知的,並且闡述於例如Sambrook等人, 2001,同上
中。
宿主細胞當在適當條件下培養時合成IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體的重鏈和/或輕鏈,其隨後可以自培養基收集(若宿主細胞將其分泌至培養基中)或直接由產生其的宿主細胞收集(若其並非分泌的)。適當的宿主細胞的選擇將取決於各種因素,例如所希望的表現水平、活性所希望的或所需的多肽修飾(例如醣基化或磷酸化)和易於折疊成生物活性分子。宿主細胞可以是真核的或原核的。
可用作表現宿主的哺乳動物細胞系係本領域中熟知的且包括但不限於可得自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)的永生化細胞系,和本領域已知可以用於製備本發明之重組多肽的表現系統中使用的任何細胞系。通常用包含編碼所需IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合物、或抗IL-2抗體的DNA的重組表現載體轉化宿主細胞。其中可以採用的宿主細胞係原核生物、酵母或高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體,例如大腸桿菌或桿菌。高等真核細胞包括昆蟲細胞和哺乳動物來源的已建立的細胞系。適合的哺乳動物宿主細胞系的實例包括猴腎細胞的COS-7系(ATCC CRL 1651)(Gluzman等人., 1981, Cell [細胞] 23: 175)、L細胞、293細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL 163)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或其衍生物(例如Veggie CHO細胞)和在無血清培養基中生長的相關細胞系(Rasmussen等人,1998,Cytotechnology
[細胞工程學] 28: 31),HeLa細胞、BHK(ATCC CRL 10)細胞系、和衍生自非洲綠猴腎細胞系CVI(ATCC CCL 70)的CVI/EBNA細胞系(如McMahan等人,1991,EMBO J. [歐洲分子生物學學會雜誌] 10: 2821所述)、人胚腎細胞(例如293、293 EBNA或MSR 293)、人表皮A431細胞、人Colo205細胞、其他經轉化的靈長類動物細胞系、正常二倍體細胞,衍生自初生組織、初生外植體的體外培養的細胞株、HL-60、U937、HaK或Jurkat細胞。視需要,例如當希望在不同訊號轉導或受體測定中使用多肽時,哺乳動物細胞系,例如HepG2/3B、KB、NIH 3T3或S49可以用於表現該多肽。
可替代地,可能在低等真核生物,例如酵母中,或在原核生物,例如細菌中產生該多肽。適合的酵母包括釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、克魯維酵母屬菌株、假絲酵母屬、或能夠表現異源多肽的任何酵母菌株。適合的細菌菌株包括大腸桿菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門菌、或能夠表現異源多肽的任何細菌菌株。如果在酵母或細菌中製備該多肽,則可能希望修飾本文產生的多肽,例如藉由適當位點的磷酸化或醣基化,從而獲得功能多肽。可以使用已知的化學方法或酶促方法,完成此類共價附接。
可以藉由將本發明之分離的核酸可操作地連接到一個或多個昆蟲表現載體中的適合的控制序列並且採用昆蟲表現系統,來產生該多肽。用於桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統的材料和方法是以套組(kit)形式從例如英傑公司(Invitrogen),聖迭哥,加利福尼亞州,美國(MaxBac®套組)可商購的,並且此類方法係本領域熟知的,如描述於Summers和Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin [德州農業實驗站公告],1555期(1987),以及Luckow和Summers,Bio/Technology
[生物/技術] 6: 47(1988)中。可以採用無細胞翻譯系統以使用衍生自本文揭露的核酸構建體的RNA來產生多肽。用於與細菌、真菌、酵母、和哺乳動物細胞宿主一起使用的適當選殖和表現載體由Pouwels等人描述(Cloning Vectors: A Laboratory Manual
[選殖載體:實驗室手冊],愛思唯爾公司(Elsevier),紐約,1985)。包含較佳的可操作地連接到至少一個表現控制序列的本發明之分離的核酸的宿主細胞係「重組宿主細胞」。
在某些方面,本發明包括編碼人IL-2突變蛋白之分離的核酸,該人IL-2突變蛋白優先刺激調節性T細胞並且包含:V91K、D20L;D84R、E61Q;V91K、D20A、E61Q、M104T;N88K、M104L;V91H、M104L;V91K、H16E、M104V;V91K、H16R、M104V;V91K、H16R、M104T;V91K、D20A、M104T;V91K、H16E、M104T;V91K、H16E、E61Q、M104T;V91K、H16R、E61Q、M104T;V91K、H16E;V91H、D20A、M104T;H16E、V91H、M104V;V91H、D20A、E61Q、M104T;V91H、H16R、E16Q;V91K、D20A、M104V;H16E、V91H;V91H、D20A、M104V;H16E、V91H、M104T;H16E、V91H、E61Q、M104T;V91K、E61Q、H16E;V91K、H16R、M104L;H16E、V91H、E16Q;V91K、E61Q、H16R;D20W、V91K、E61Q;V91H、H16R;V91K、H16R;D20W、V91K、E61Q、M104T;V91K、D20A;V91H、D20A、E16Q;V91K、D20A、M104L;V91H、D20A;V91K、E61Q、D20A;V91H、M104T;V91H、M104V;V91K、E61Q;V91K、N88K、E61Q、M104T;V91K、N88K、E61Q;V91H、E61Q;V91K、N88K;D20A、H16E、M104T;D20A、M104T;H16E、N88K;D20A、M104V;D20A、M104L;H16E、M104T;H16E、M104V;N88K、M104V;N88K、E61Q;D20A、E61Q;H16R、D20A;D20W、E61Q;H16E、E61Q;H16E、M104L;N88K、M104T;D20A、H16E;D20A、H16E、E16Q;D20A、H16R、E16Q;V91K、D20W;V91A、H16A;V91A、H16D;V91A、H16E;V91A、H16S;V91E、H16A;V91E、H16D;V91E、H16E;V91E、H16S;V91K、H16A;V91K、H16D;V91K、H16S;和/或V91S、H16E取代和與SEQ ID NO: 1中列出的胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一性之胺基酸序列。
還包括的是編碼本文描述的示例性IL-2突變蛋白Fc融合蛋白中任一者之分離的核酸。在較佳的實施方式中,抗體的Fc部分和人IL-2突變蛋白係在單個開讀框內編碼的,視需要具有在Fc區和IL-2突變蛋白之間編碼的連接子。
在另一個方面,本文提供了包含可操作地連接到啟動子的以上IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白編碼核酸的表現載體。
在另一個方面,本文提供了包含編碼以上IL-2突變蛋白、IL-2突變蛋白Fc融合蛋白、或抗IL-2抗體之分離的核酸的宿主細胞。該宿主細胞可以是原核細胞,例如大腸桿菌,或可以是真核細胞,例如哺乳動物細胞。在某些實施方式中,該宿主細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
在另一個方面,本文提供了製備人IL-2突變蛋白之方法。該等方法包括在其中表現可操作地連接到人IL-2突變蛋白的啟動子之條件下,培養宿主細胞。隨後,從所述培養收穫人IL-2突變蛋白。可以從培養基和/或宿主細胞裂解物收穫IL-2突變蛋白。
在另一個方面,本文提供了製備人IL-2突變蛋白Fc融合蛋白之方法。該等方法包括在其中表現可操作地連接到人IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的啟動子之條件下,培養宿主細胞。隨後,從所述培養收穫人IL-2突變蛋白Fc融合蛋白。可以從培養基和/或宿主細胞裂解物收穫人IL-2突變蛋白Fc融合蛋白。
在另一個方面,本文提供了製備抗IL-2抗體之方法。該等方法包括在其中表現可操作地連接到抗IL-2抗體的重鏈和輕鏈的啟動子之條件下,培養宿主細胞。隨後,從所述培養收穫抗IL-2抗體。可以從培養基和/或宿主細胞裂解物收穫抗IL-2抗體。藥物組成物
在一些實施方式中,本發明提供了藥物組成物,該藥物組成物包含治療有效量之IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體連同藥學上有效的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑。在某些實施方式中,IL-2突變蛋白在IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的背景內。本發明之藥物組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾組成物。
較佳的是,可接受的配製物物質在所採用的劑量及濃度下對接受者無毒。在特定實施方式中,提供了包含治療有效量之IL-2突變蛋白的藥物組成物,該IL-2突變蛋白含有治療性分子,例如IL-2突變蛋白Fc融合物。
在某些實施方式中,藥物組成物可含有配製物物質以調節、維持或保留例如組成物的pH值、滲透性、黏度、澄明度、顏色、等張性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透。在這樣的實施方式中,適合的配製材料包括但不限於胺基酸(例如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸、脯胺酸、或離胺酸);抗微生物劑;抗氧化劑(例如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉);緩衝液(例如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸);填充劑(例如甘露醇或甘胺酸);螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA));複合劑(例如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精);填料;單糖;二糖;和其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精);蛋白質(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白);著色劑、調味劑和稀釋劑;乳化劑;親水性聚合物(例如聚乙烯吡咯啶酮);低分子量多肽;成鹽的抗衡離子(例如鈉);防腐劑(例如氯化苄烷銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、洗必泰、山梨酸或過氧化氫);溶劑(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇);糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇);懸浮劑;表面活性劑或濕潤劑(如普魯尼克酸、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨酯如聚山梨酯20、聚山梨酯、曲通、三甲胺、卵磷脂、膽固醇、替洛沙泊);穩定性增強劑(例如蔗糖或山梨糖醇);張力增強劑(例如鹼金屬鹵化物、較佳的氯化鈉或氯化鉀、甘露醇山梨糖醇);遞送媒介物;稀釋劑;賦形劑和/或藥物佐劑。參見,REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明登氏藥學全書], 第18版 (A. R. Genrmo編), 1990, 馬克出版公司(Mack Publishing Company)。
在某些實施方式中,最佳藥物組成將由本領域技術者根據例如投與的預期途徑、遞送形式和所需劑量來確定。參見,例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明登氏藥學全書],同上。在某些實施方式中,此類組成物可影響本發明之抗原結合蛋白的物理狀態、穩定性、體內釋放率及體內清除率。在某些實施方式中,藥物組成物中的主要媒介物或載體可以是水性或非水性的。例如,適合的媒介物或載體可以是注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊髓液,其可能補充有腸胃外投與組成物中常見的其他物質。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水係另外的示例性媒介物。在特定實施方式中,藥物組成物包含約pH 7.0-8.5的Tris緩衝液或約pH 4.0-5.5的乙酸鹽緩衝液,且可進一步包括山梨糖醇或其適合取代物。在本發明之某些實施方式中,Il-2突變蛋白或抗IL-2抗體組成物可以藉由將具有所希望純度的所選組成成分與視需要配製劑(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明登氏藥學全書],同上)混合以凍乾餅或水性溶液的形式製備用於儲存。此外,在某些實施方式中,可使用適當賦形劑(例如蔗糖)將IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體產物配製為凍乾物。
可以選擇本發明之藥物組成物用於腸胃外遞送。可替代地,可選擇組成物以用於吸入或用於經由消化道(例如口服)遞送。此類藥學上可接受的組成物的製備在本領域技術者的技術範圍內。配製物組分較佳的是以對投與部位可接受的濃度存在。在某些實施方式中,使用緩衝液以便將組成物維持在生理pH值或稍低pH值下,典型地在約5至約8的pH值範圍內。
當考慮腸胃外投與時,用於本發明之治療組成物可以以無熱原的、腸胃外可接受的水性溶液的形式提供,該水性溶液包含在藥學上可接受的媒介物中的所需IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體組成物。用於腸胃外注射的特別適合的媒介物係無菌蒸餾水,其中將突變蛋白或抗IL-2抗體組成物配製成適當保存的無菌等張溶液。在某些實施方式中,該製備可以包括用試劑配製所需分子,該試劑如可注射微球、生物可侵蝕顆粒、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體,它們可提供可經由積存注射遞送的產品的控制釋放或持續釋放。在某些實施方式中,也可以使用透明質酸,其具有促進在循環中的持續時間的作用。在某些實施方式中,可植入的藥物遞送設備可用於引入IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體組成物。
其他藥物組成物對於本領域技術者將顯而易見,包括呈持續或控制遞送配製物形式的關於IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體組成物的配製物。用於配製各種其他持續或控制遞送方式(如脂質體載體、生物可侵蝕微粒或多孔珠粒和積存注射)的技術也是本領域技術者已知的。參見,例如國際專利申請號PCT/US 93/00829,其藉由引用併入本文並描述了用於遞送藥物組成物的多孔聚合物微粒的控制釋放。持續釋放製劑可包括成形製品形式的半透性聚合物基質,例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質可以包括聚酯、水凝膠、聚丙交酯(如美國專利案號3,773,919和歐洲專利申請公開案號EP 058481中所揭露,其每個藉由引用併入本文)、L-麩胺酸和γ-L-麩胺酸乙酯之共聚物(Sidman等人, 1983, Biopolymers [生物聚合物] 2: 547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人, 1981, J. Biomed. Mater. Res. [生物醫學材料研究雜誌] 15: 167-277和Langer, 1982, Chem. Tech. [化學技術] 12: 98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人, 1981, 同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開案號EP 133,988)。持續釋放組成物還可包括可藉由本領域已知的幾種方法中的任一種製備的脂質體。參見,例如Eppstein等人, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 82: 3688-3692;歐洲專利申請公開案號EP 036,676;EP 088,046及EP 143,949,該等參考文獻藉由引用併入。
用於體內投與的藥物組成物典型地呈無菌製劑形式提供。滅菌可以藉由經由無菌濾膜的過濾來完成。當組成物凍乾時,可以在凍乾和重構之前或之後進行使用該方法的滅菌。用於腸胃外投與的組成物可以以凍乾形式或以溶液儲存。腸胃外組成物通常置於具有無菌進入口的容器中,例如具有可由皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。
本發明之方面包括自緩衝的IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體配製物,其可以用作藥物組成物,如國際專利申請WO 06138181A2(PCT/US 2006/022599)中所述,將其藉由引用以其全文併入本文。
如以上討論的,某些實施方式提供了IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體組成物,特別是藥物Il-2突變蛋白Fc融合蛋白,除了所述IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體組成物外,其包含一種或多種賦形劑,例如在這一部分和本文其他地方說明性描述的那些。賦形劑關於這一方面可在本發明中用於多種目的,如調節配製物的物理、化學或生物學特性(如調節黏度),和或用於提高效力和或穩定這種配製物的製程以及對抗由於例如在製造、運輸、儲存、使用前製備、投與及其後的製程中發生的應力引起的降解和腐敗的製程。
關於蛋白質穩定化和配製材料以及在這方面有用的方法,有各種論述,例如Arakawad等人,「Solvent interactions in pharmaceutical formulations [藥物製劑中的溶劑相互作用],」Pharm Res [藥物研究]. 8 (3): 285-91 (1991);Kendrick等人, RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE [穩定蛋白質製劑的合理設計:理論與實踐]中的「Physical stabilization of proteins in aqueous solution [水溶液中蛋白質的物理穩定化], Carpenter和Manning, 編輯. Pharmaceutical Biotechnology [藥物生物技術]. 13: 61-84 (2002),和Randolph等人,「Surfactant-protein interactions [表面活性劑-蛋白質相互作用],」Pharm Biotechnol [藥物生物技術]. 13: 159-75 (2002),其每一個均藉由引用以其全文併入本文,特別是關於與根據本發明之自緩衝蛋白配製物的賦形劑及其製備方法有關的部分,尤其是用於獸醫和/或人醫學用途的蛋白質藥物產品和方法。
根據本發明之某些實施方式鹽類可用於例如調節配製物的離子強度和/或等張性和/或改善蛋白質或根據本發明之組成物的其他成分的溶解性和/或物理穩定性。
眾所周知,離子可以藉由與蛋白質表面上的帶電荷的殘基結合並藉由遮罩蛋白質中的帶電荷基團和極性基團並降低其靜電相互作用、吸引和排斥相互作用的強度來穩定蛋白質的天然狀態。離子還可以藉由結合特別是蛋白質的變性肽鍵(-CONH)來穩定蛋白質的變性狀態。此外,離子與蛋白質中帶電和極性基團的相互作用還可以減少分子間靜電相互作用,從而防止或減少蛋白質聚集和不溶性。
離子種類對蛋白質的影響差異很大。已經開發了離子及其對蛋白質的影響的許多分類排名,該蛋白質可用於配製根據本發明之藥物組成物。一個實例為Hofmeister系列,其藉由離子和極性非離子溶質對溶液中蛋白質的構象穩定性的影響對該離子和極性非離子溶質進行排名。穩定溶質稱為「親液的」。不穩定溶質稱為「離液的」。通常使用高濃度的親液劑(例如,> 1莫耳硫酸銨)以從溶液中沈澱蛋白質(「鹽析」)。通常使用離液劑來使蛋白質變性和/或溶解(「鹽溶」)。離子對「鹽溶」和「鹽析」的相對有效性限定了其在Hofmeister系列中的位置。
根據本發明之多種實施方式,游離胺基酸可用於IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體配製物中以作為增積劑、穩定劑和抗氧化劑以及其他標準用途。離胺酸、脯胺酸、絲胺酸和丙胺酸可用於穩定配製物中的蛋白質。甘胺酸可用於凍乾以確保正確的餅結構和特性。在液體和凍乾配製物二者中,精胺酸可用於抑制蛋白質聚集。甲硫胺酸可用作抗氧化劑。
多元醇包括糖(例如甘露醇、蔗糖和山梨醇)和多羥基醇(例如甘油和丙二醇)以及出於本文討論的目的,包括聚乙二醇(PEG)和相關物質)。多元醇係親液的。它們係液體和凍乾配製物二者中有用的穩定劑,以保護蛋白質免受物理和化學降解過程的影響。多元醇也可用於調節配製物的張力。
可用於本發明之選擇實施方式的多元醇係甘露醇,其通常用於確保凍乾配製物中餅的結構穩定性。它確保了對於餅的結構穩定性。甘露醇通常與凍乾保護劑一起使用,例如蔗糖。山梨醇和蔗糖係用於調節張力的較佳的試劑並且用作在運輸期間或製造製程期間製備散劑期間防止凍融應力的穩定劑。還原糖(其含有游離醛或酮基團)如葡萄糖和乳糖可以糖化表面離胺酸和精胺酸殘基。因此,它們通常不是根據本發明使用的較佳的多元醇。此外,形成這種反應性種類的糖如蔗糖在酸性條件下水解成果糖和葡萄糖並因此產生糖化,這種糖在這一方面也不是本發明較佳的多元醇。PEG可用於穩定蛋白質和用作冷凍保護劑,並且在這一方面可用於本發明。
IL-2突變蛋白和/或抗IL-2抗體配製物的實施方式進一步包含表面活性劑。蛋白質分子可能易於在表面上吸附並且易於在氣-液、固-液和液-液介面處變性和隨後聚集。該等效應通常與蛋白質濃度成反比。該等有害的相互作用通常與蛋白質濃度成反比,並且通常藉由物理攪動(如在運輸和處理產品的過程產生的物理攪動)加劇。
表面活性劑通常用於防止、最小化或減少表面吸附。在這一方面,本發明中有用的表面活性劑包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脫水山梨醇聚乙氧基化物的其他脂肪酸酯和泊洛沙姆188。
表面活性劑也常用於控制蛋白質構象穩定性。在這一方面,表面活性劑的使用係蛋白質特異性的,因為任何給定的表面活性劑通常會穩定一些蛋白質而使其他蛋白質不穩定。
聚山梨醇酯易受氧化降解的影響,並且通常如所提供的含有足夠量的過氧化物以引起蛋白質殘基側鏈(尤其是甲硫胺酸)的氧化。因此,應小心採用聚山梨醇酯,使用時應使用最低有效濃度。在這一方面,聚山梨醇酯例證了賦形劑應以其最低有效濃度使用的一般規則。
IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體配製物的實施方式進一步包含一種或多種抗氧化劑。在一定程度上,藉由維持適當水平的環境氧和溫度並避免光照,可以防止藥物配製物中蛋白質的有害氧化。抗氧化賦形劑也可用於防止蛋白質的氧化降解。在這一方面,有用的抗氧化劑係還原劑、氧/自由基清除劑和螯合劑。用於根據本發明之治療性蛋白質配製物的抗氧化劑較佳的為水溶性的並且在產品的整個保質期內保持其活性。在這一方面,EDTA係根據本發明之較佳的抗氧化劑。
抗氧化劑可以破壞蛋白質。例如,還原劑如麩胱甘肽特別可以破壞分子內二硫連接。因此,用於本發明之抗氧化劑除其他方面外被選擇用於消除或充分降低它們自身損害配製物中蛋白質的可能性。
根據本發明之配製物可包含金屬離子,其是蛋白質輔因子並且是形成蛋白質配位複合物所必需的,如形成某些胰島素懸浮液所必需的鋅。金屬離子也可以抑制一些降解蛋白質的過程。然而,金屬離子也催化降解蛋白質的物理和化學過程。
鎂離子(10-120 mM)可用於抑制天冬胺酸異構化為異天冬胺酸。Ca+2
離子(高達100 mM)可以增加人去氧核糖核酸酶的穩定性。然而,Mg+2
、Mn+2
和Zn+2
可使rhDNase不穩定。類似地,Ca+2
和Sr+2
可以穩定因子VIII,它可以被Mg+2
、Mn+2
和Zn+2
、Cu+2
和Fe+2
去穩定化,並且該穩定因子的聚集可以藉由Al+3
離子強化。
IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體配製物的實施方式進一步包含一種或多種防腐劑。當開發關於從同一容器中多於一次取出的多劑量腸胃外配製物時,防腐劑是必需的。它們的主要功能係在藥物產品的整個保質期或使用期限內抑制微生物生長並確保產品無菌。常用的防腐劑包括苯甲醇、苯酚和間甲酚。雖然防腐劑與小分子腸胃外藥物一起使用已經很長的歷史,但包含防腐劑的蛋白質配製物的開發可能具有挑戰性。防腐劑幾乎總是對蛋白質具有不穩定作用(聚集),並且這已經成為限制它們在多劑量蛋白質配製物中的使用的主要因素。迄今為止,大多數蛋白質藥物僅配製成一次性使用。然而,當多劑量配製物成為可能時,它們具有使患者方便和增加適銷性的附加優點。一個很好之實例係人類生長激素(hGH)的防腐劑,其中保存配製物的開發已導致更方便、多用途的注射筆呈現的商業化。目前市場上可提供至少四種含有保存的hGH配製物的這種筆設備。Norditropin(液體,諾和諾德公司(Novo Nordisk))、Nutropin AQ(液體,基因泰克公司(Genentech))和Genotropin(凍乾的--雙室藥筒,法瑪西亞普強公司(Pharmacia & Upjohn))含有苯酚,而Somatrope(禮來公司(Eli Lilly))用間-甲酚進行配製。
在一個實施方式中,在pH 7.6下,在10 mM KPi、161 mM L-精胺酸中,配製IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白的Fc融合物,例如像本文描述的IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白的Fc融合物中的任一者。
在保存劑型的配製和開發過程中需要考慮幾個方面。必須優化藥物產品中的有效防腐劑濃度。這需要在劑型中測試給定防腐劑的濃度範圍,該防腐劑的濃度範圍賦予了抗微生物有效性而不損害蛋白質穩定性。
在另一個方面,本發明提供了凍乾配製物中的IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白的Fc融合物。冷凍乾燥的產品可以在沒有防腐劑的情況下凍乾,並在使用時用含有防腐劑的稀釋劑重構。這縮短了防腐劑與蛋白質接觸的時間,從而顯著降低了相關的穩定性風險。在液體配製物的情況下,防腐劑的有效性和穩定性應在整個產品保質期(約18至24個月)內保持。需要注意的一點是,防腐劑的有效性應該在含有活性藥物和所有賦形劑組分的最終配製物中證實。
IL-2突變蛋白配製物通常將被設計用於特定的投與途徑和方法、特定的投與劑量和頻率、特定疾病的特定治療、具有生體可用率和持久性的範圍等。因此,可以根據本發明設計配製物,以藉由任何適合的途徑(包括但不限於口服、耳內、眼科、直腸、和陰道)以及藉由腸胃外途徑(包括靜脈內和動脈內注射、肌內注射、和皮下注射)遞送。
一旦配製好藥物組成物,它可以作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體或作為脫水或凍乾粉末儲存在無菌小瓶中。此類配製物可以以即用形式或以在投與之前重構的形式(例如,凍乾的)儲存。本發明還提供了用於產生單劑量投與單元之套組。本發明之套組可各自含有具有乾燥蛋白質的第一容器和具有水性配製物的第二容器二者。在本發明之某些實施方式中,提供了含有單室和多室預填充注射器(例如液體注射器和凍乾注射器)之套組。
待採用的IL-2突變蛋白藥物組成物的治療有效量將取決於例如治療背景和目的。本領域技術者將理解,治療的適當劑量水平將部分地取決於遞送的分子、使用IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體的適應症、投與途徑、以及患者的大小(體重、體表面積或器官大小)和/或狀況(年齡和一般健康狀況)。在某些實施方式中,臨床醫師可滴定劑量且修改投與途徑以獲得最佳治療效果。根據上述因素,典型的劑量範圍可以為約0.1 μg/kg至高達約1 mg/kg或更高。在特定實施方式中,劑量範圍可以為從0.5 μg/kg至高達約100 μg/kg,視需要從2.5 μg/kg至高達約50 μg/kg。
治療有效量之IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體較佳的導致疾病症狀的嚴重程度降低、疾病無症狀期的頻率或持續時間增加或預防由於疾病痛苦引起的損傷或殘疾。
可以使用醫療設備投與藥物組成物。用於投與藥物組成物的醫療裝置的實例描述於美國專利案號4,475,196;4,439,196;4,447,224;4,447, 233;4,486,194;4,487,603;4,596,556;4,790,824;4,941,880;5,064,413;5,312,335;5,312,335;5,383,851;和5,399,163,均藉由引用併入本文。
在一個實施方式中,提供了藥物組成物,其包含:治療自體免疫性障礙或炎性障礙之方法
在某些實施方式中,將本發明之IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體用於治療身免疫性障礙或炎性障礙。在較佳的實施方式中,使用了IL-2突變蛋白Fc融合蛋白。
特別適於用本文揭露的IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體治療的障礙包括但不限於炎症、自體免疫性疾病、異位性疾病、伴腫瘤自體免疫性疾病、軟骨炎症、關節炎、類風濕關節炎、青少年關節炎、青少年類風濕關節炎、少關節型青少年類風濕關節炎、多關節型青少年類風濕關節炎、全身性發作青少年類風濕關節炎、青少年強直性脊柱炎、青少年腸病性關節炎、青少年反應性關節炎、青少年萊特爾氏綜合症(juvenile Reiter's Syndrome)、SEA綜合症(血清陰性、接骨點病變、關節病綜合症)、青少年皮肌炎、青少年牛皮癬關節炎、青少年硬皮病、青少年系統性紅斑狼瘡、青少年血管炎、少關節型類風濕關節炎、多關節型類風濕關節炎、全身性發作類風濕關節炎、強直性脊柱炎、腸病性關節炎、反應性關節炎、萊特爾氏綜合症(Reiter's Syndrome)、SEA綜合症(血清陰性、接骨點病變、關節病綜合症)、皮肌炎、牛皮癬關節炎、硬皮病、血管炎、肌炎、多發性肌炎、皮肌炎、結節性多動脈炎、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、動脈炎、風濕性多肌痛、類肉瘤病、硬化、原發性膽道硬化症、硬化性膽管炎、休格倫氏症、牛皮癬、斑塊狀牛皮癬、滴狀牛皮癬、皮褶牛皮癬、膿皰性牛皮癬、紅皮性牛皮癬、皮炎、異位性皮炎、動脈粥樣硬化、狼瘡、斯提耳氏病(Still's disease)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力、炎性腸病(IBD)、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、乳糜瀉、多發性硬化(MS)、氣喘、COPD、鼻竇炎、具有息肉的鼻竇炎、嗜酸細胞性食管炎、嗜酸細胞性支氣管炎、格林-巴厘病(Guillain-Barre disease)、I型糖尿病、甲狀腺炎(例如格雷夫斯氏病(Graves' disease))、艾迪生病(Addison's disease)、雷諾現象(Raynaud's phenomenon)、自體免疫性肝炎、GVHD、移植排斥、腎損傷、C型肝炎誘發的血管炎、自發性流產等。
在較佳的實施方式中,自體免疫性障礙或炎性障礙係狼瘡、移植物抗宿主疾病、C型肝炎誘發的血管炎、I型糖尿病、多發性硬化、自發性流產、異位性疾病、和炎性腸病。
在另一個實施方式中,用IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體(例如,本文揭露的IL-2突變蛋白,例如,如本文揭露的IL-2突變蛋白Fc融合物,或另一種本領域已知的IL-2突變蛋白,或野生型IL-2,視需要作為本文揭露的類型的Fc融合分子的一部分)治療患有自體免疫性障礙或炎性障礙或具有發展該等障礙的風險的患者,並且監測患者對治療的應答。監測的患者的應答可以是患者對治療的任何可檢測的或可測量的應答,或此類應答的任何組合。例如,應答可以是患者的生理狀態的變化,例如體溫或發熱、癖好、出汗、頭痛、噁心、疲勞、饑餓、口渴、精神敏度等。可替代地,應答可以是在取自患者的周邊血的樣本中的細胞類型或基因產物(例如蛋白、肽、或核酸)的量方面的變化。在一個實施方式中,如果患者具有對治療的可檢測的或可測量的應答,或如果此類應答超過了特定閾值,則改變患者的治療方案。該改變可以是給藥頻率的減少或增加、或每次給藥投與的IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體之量的減少或增加,或給藥的「假期」(即治療的暫時停止,持續指定時段,或直至治療醫生決定治療應繼續,或直至患者的監測的應答表明治療應恢復或可以恢復),或治療終止。在一個實施方式中,應答係患者的溫度或CRP水平的變化。例如,應答可以是患者的體溫升高,或周邊血的樣本中的CRP水平升高,或二者。在一個特定實施方式中,如果在治療的過程期間,患者的體溫升高至少0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.7°、1°、1.5°、2°、或2.5°C,則患者的治療減少、暫停、或終止。在另一個特定實施方式中,如果在治療的過程期間,患者的周邊血的樣本中CRP的濃度增加至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1、1.5、或2 mg/mL,則患者的治療減少、暫停、或終止。可以在決定是否修改、減少、暫停、或終止治療時監測和使用的其他患者反應包括以下的發展或惡化:毛細血管滲漏綜合症(低血壓和心血管不穩定)、受損的嗜中性球功能(例如造成或檢測到感染的發展或惡化)、血小板減少、血栓性血管病、注射位點反應、血管炎(例如C型肝炎病毒血管炎)、或炎性症狀或疾病。可以在決定是否修改、減少、增加、暫停、或終止治療時監測和使用的另外的患者反應包括以下的數量的增加:NK細胞、Treg細胞、FOXP3-
CD4 T細胞、FOXP3+
CD4 T細胞、FOXP3- CD8 T細胞、或嗜中性球。可以檢測該等細胞類型的增加,例如,作為每單位的周邊血的此類細胞之數量的增加(例如,表示為每毫升血液之細胞的增加),或作為與血液樣本中另一類型的一個或多個細胞相比,此類細胞類型之百分比的增加。可以監測的另一種患者反應係患者的周邊血的樣本中,CD25+
細胞上細胞表面結合的IL-2突變蛋白或抗IL-2抗體之量的增加。擴增 Treg 細胞之方法
可以使用IL-2突變蛋白、抗IL-2抗體、或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白來擴增個體或樣本內的Treg細胞。本文提供了增加Treg相對於非調節性T細胞之比率之方法。該方法包括使T細胞的群體與有效量之人IL-2突變蛋白、抗IL-2抗體或IL-2突變蛋白Fc融合物接觸。該比率可以藉由以下來測量:確定T細胞的群體內CD3+ FOXP3+細胞相對於CD3+ FOXP3-細胞之比率。在人血液中,典型的Treg頻率為總CD4+ CD3+ T細胞的5%-10%,然而,在以上列出的疾病中,此百分比可以是更低或更高。在較佳的實施方式中,Treg的百分比增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少200%、至少300%、至少400%、至少500%、至少600%、至少700%、至少800%、至少900%、或至少1000%。對於特定疾病,Treg的最大倍數增加可以變化;然而,藉由IL-2突變蛋白治療可能獲得的最大Treg頻率係50%或60%的總CD4+ CD3+ T細胞。在某些實施方式中,將IL-2突變蛋白、抗IL-2抗體、或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白投與至個體,並且在個體的周邊血內的調節性T細胞(Treg)相對於非調節性T細胞之比率增加。
因為IL-2突變蛋白、抗IL-2抗體、和IL-2突變蛋白Fc融合蛋白優先擴增Treg超過其他細胞類型,它們還可用於增加個體的周邊血內的調節性T細胞(Treg)與自然殺手(NK)細胞之比率。該比率可以藉由以下來測量:確定CD3+ FOXP3+ 細胞與CD16+和/或CD56+淋巴細胞(其是CD19-且CD3-)之比率。
預期IL-2突變蛋白、抗IL-2抗體、或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白可能對於患者內的疾病或障礙具有治療效果,而不顯著擴增患者的周邊血內的Treg相對於非調節性T細胞或NK細胞之比率。該治療效果可以歸因於在炎症或自體免疫性的部位處的IL-2突變蛋白、抗IL-2抗體、或IL-2突變蛋白Fc融合蛋白的局部活性。實例
提供以下實例(實際的和預測的二者)係為了說明本發明之具體實施方式或特徵,而不是為了限制其範圍。實例 1-IL-2 突變蛋白的 pSTAT5 傳訊
針對相對pSTAT5活化研究IL-2突變蛋白。設計活性篩選來鑒定具有增強的Treg : Teff窗口的突變蛋白,即保留在Treg細胞中的高水平的活性同時顯示Teff細胞中的顯著減弱的那些。由於活化的Teff細胞表現增加水平的CD25,並且患有自體免疫性疾病和炎性疾病的患者具有升高數量的該等細胞,所以我們將CD25+閘控施加到Teff細胞上,從而模擬患者中的CD25表現方面的更現實差異化。藉由在細胞中的用基於FACS的測定測量的磷光體-STAT5應答,評估IL-2突變蛋白的活性。簡而言之,將先前冷凍的人PBMC解凍,並且在完全培養基中靜息0.5-2 hr。按5-10百萬個細胞/ml懸浮細胞,並且按100 ul/孔等分到96孔深孔板(0.5-1百萬個細胞/孔)中。按10 µl的最終體積,以範圍從1 nM至200 nM的10x劑量滴定,用IL-2突變蛋白刺激細胞,持續30 min。使用BD磷流式緩衝液套組測量STAT5磷酸化的水平。簡而言之,添加1 ml的BD裂解/固定磷流式緩衝液來停止刺激。在37°C下固定細胞10-15 min,並且在冰上用1x BD磷流式透化緩衝液透化,之後針對CD3、CD4、CD25、FOXP3、CD8和pSTAT5進行染色。下表2中顯示了PBMC的兩種供體之結果。
[表2]. IL-2突變蛋白的pSTAT5活化
實例 2-IL-2 突變蛋白之穩定性
供體 1 | 供體 2 | |||||||
IL2 | 1 nM IL2 處理 | 200 nM IL2 處理 | 1 nM IL2 處理 | 200 nM IL2 處理 | ||||
%pSTAT5+ Treg | %pSTAT5+ Teff | %pSTAT5+ Treg | %pSTAT5+ Teff | %pSTAT5+ Treg | %pSTAT5+ Teff | %pSTAT5+ Treg | %pSTAT5+ Teff | |
僅培養基 | 1.86 | 0.655 | 2.57 | 0.68 | 0.29 | 1.24 | 0.59 | 0.4 |
WTIL2 | 89.95 | 48.3 | 94.4 | 41 | 96.6 | 80.4 | 95.4 | 78.1 |
N88D | 92.2 | 27 | 89.3 | 39.9 | 95.2 | 56 | ||
V91R | 87.45 | 40.3 | 97.25 | 39.25 | ||||
H16R | 47.5 | 5.135 | 66.5 | 11.85 | 56.4 | 14.6 | 73.7 | 19.3 |
N88R | 70.2 | 20.1 | 87.6 | 38.8 | 84.3 | 32.6 | 91.7 | 44.5 |
V91H | 90.4 | 61.35 | 95.8 | 54.35 | 95.7 | 81.7 | 96.3 | 76.6 |
N88K | 31.2 | 3.195 | 67.1 | 17.35 | 42 | 6.61 | 77.3 | 15.5 |
D20W | 5.445 | 1.15 | 31.1 | 5.5 | 8.48 | 2.55 | 27.9 | 2.66 |
D20A | 38.85 | 5.435 | 63.65 | 19.45 | 49 | 5.94 | 64 | 15 |
H16E | 88.2 | 52.3 | 95.5 | 52.25 | 95.7 | 70.8 | 95.4 | 72 |
E61Q | 88.65 | 68.05 | 95.4 | 67.3 | 96.3 | 84 | 96.5 | 83.2 |
V91K 、 H16E | 41.45 | 5.425 | 60.25 | 15.55 | 53 | 10.1 | 67.9 | 15.3 |
V91R 、 C125A | 88.95 | 50.45 | 95.7 | 51.7 | 95.7 | 76.6 | 96.2 | 75.7 |
V91H 、 E61Q | 87.05 | 43.8 | 96.75 | 68.85 | 93 | 59.7 | 97.5 | 83.1 |
V91K 、 H16R | 1.61 | 0.63 | 6.96 | 1.845 | 2.31 | 2.22 | 2.96 | 1.65 |
V91K 、 D20W | 1.215 | 0.85 | 3.265 | 1.465 | 2.14 | 2.68 | 1.74 | 1.99 |
V91K 、 D20A | 9.19 | 1.185 | 30.15 | 4.385 | 15.9 | 2.43 | 30.8 | 5.79 |
V91K 、 N88K | 1.69 | 0.64 | 6.87 | 1.075 | 2.01 | 1.65 | 2.68 | 0.91 |
H16E 、 V91H | 78.45 | 24.75 | 88.1 | 36.55 | 89.6 | 42.2 | 92.1 | 48.7 |
V91H 、 D20A | 7.15 | 0.805 | 24.55 | 3.11 | 11.1 | 1.83 | 22.5 | 4.32 |
H16R 、 D20A | 1.205 | 1.13 | 4.27 | 0.93 | 2.19 | 1.45 | 0.86 | 1.89 |
D20A 、 H16E | 19.85 | 1.66 | 39.3 | 5.945 | 28.6 | 3.67 | 39 | 5.3 |
V91H 、 H16R | 14.35 | 1.35 | 35.1 | 4.55 | 24.5 | 3.3 | 36.1 | 4.8 |
H16E 、 N88K | 1.475 | 0.495 | 3.14 | 0.625 | 1.09 | 1.09 | 0.8 | 0 |
D20A 、 E61Q | 10.13 | 1.005 | 65.95 | 20.1 | 9.72 | 1.82 | 68.9 | 16.3 |
H16E 、 E61Q | 64.95 | 12.05 | 95.45 | 61.35 | 70.6 | 10.2 | 96 | 75.5 |
V91K 、 E61Q | 69.5 | 14.3 | 95.4 | 57.05 | 73.7 | 12.1 | 96.6 | 74.1 |
V91K 、 E61Q 、 H16E | 6.02 | 1.135 | 52.5 | 11.7 | 6.21 | 1.15 | 58.6 | 10.5 |
V91K 、 E61Q 、 H16R | 3.075 | 1.435 | 8.52 | 1.155 | 1.87 | 0.65 | 3.74 | 1.68 |
V91K 、 E61Q 、 D20A | 2.215 | 0.88 | 26.6 | 2.71 | 1.84 | 0.98 | 22.5 | 2.51 |
D20A 、 H16E 、 E61Q | 2.715 | 0.775 | 32.25 | 3.325 | 1.49 | 0.81 | 27.6 | 3.73 |
D20A 、 H16R 、 E61Q | 15.35 | 1.465 | 80.9 | 27.65 | 13.3 | 1.88 | 86 | 29.9 |
V91H 、 H16R 、 E61Q | 76.85 | 24.6 | 95.1 | 44.3 | 82.5 | 24.7 | 95.4 | 68.3 |
H16E 、 V91H 、 E61Q | 24.4 | 1.235 | 83.4 | 33.55 | 26.7 | 2.04 | 90.9 | 44.1 |
V91H 、 D20A 、 E61Q | 16.8 | 1.3 | 94.1 | 51.6 | 19 | 2.54 | 95.3 | 64.2 |
N88K 、 M104T | 2.2 | 0.71 | 11.035 | 0.98 | 3.6 | 1.06 | 9.22 | 1.47 |
V91H 、 M104T | 89.35 | 47.65 | 97.65 | 44.6 | 96.9 | 77.5 | 97.1 | 69.5 |
D20A 、 M104T | 52.7 | 7.195 | 70.3 | 17.1 | 67 | 12.3 | 78.3 | 19.8 |
H16E 、 M104T | 88.15 | 47.7 | 96.25 | 44 | 95.9 | 71.7 | 95.9 | 63.3 |
N88K 、 M104V | 4.89 | 1.025 | 21 | 1.655 | 4.26 | 0.91 | 17.7 | 2.72 |
V91H 、 M104V | 89.35 | 50.8 | 97 | 50.9 | 95.2 | 73.1 | 96.7 | 71.7 |
D20A 、 M104V | 52.55 | 6.245 | 70.05 | 16.2 | 66.7 | 12 | 76.2 | 18.9 |
H16E 、 M104V | 88.95 | 47.4 | 96.25 | 44.2 | 91.1 | 59.8 | 96.5 | 67.5 |
V91K 、 H16E 、 M104T | 44.45 | 4.105 | 62.7 | 11.175 | 54.7 | 7.07 | 70.7 | 17.2 |
V91K 、 H16R 、 M104T | 1.92 | 1.16 | 10.9 | 2.3 | 3.22 | 1.64 | 5.64 | 1.65 |
V91K 、 D20A 、 M104T | 9.34 | 0.9 | 31.05 | 4.78 | 18.5 | 2.52 | 28.9 | 1.59 |
D20A 、 H16E 、 M104T | 22.25 | 1.94 | 42 | 8.835 | 34.2 | 2.33 | 46 | 9.92 |
H16E 、 V91H 、 M104T | 78.6 | 24.6 | 89.05 | 37.75 | 91 | 35.2 | 93.2 | 46.7 |
V91H 、 D20A 、 M104T | 8.825 | 1.105 | 27.1 | 4.355 | 15.3 | 1.9 | 21.7 | 3.48 |
V91K 、 H16E 、 M104V | 39.15 | 4.94 | 57.5 | 13.1 | 56.6 | 9.66 | 66.7 | 11.7 |
V91K 、 H16R 、 M104V | 2.175 | 1.06 | 8.995 | 1.74 | 4.09 | 1.5 | 3.98 | 0.7 |
V91K 、 D20A 、 M104V | 9.07 | 1.275 | 30.2 | 4.165 | 21.3 | 2.74 | 34.8 | 4.81 |
H16E 、 V91H 、 M104V | 79.3 | 22.7 | 86.3 | 33.4 | 90.3 | 36.8 | 92.3 | 50.4 |
V91H 、 D20A 、 M104V | 7.985 | 1.365 | 25.6 | 3.78 | 11.2 | 2.96 | 21.1 | 2.6 |
V91K 、 H16E 、 E61Q 、 M104T | 35.25 | 3.21 | 88.1 | 35.95 | 37.6 | 4.74 | 93.4 | 45.4 |
V91K 、 H16R 、 E61Q 、 M104T | 1.57 | 0.81 | 13.8 | 1.4 | 1.68 | 0.74 | 6.93 | 1.27 |
H16E 、 V91H 、 E61Q 、 M104T | 25.8 | 1.925 | 84.1 | 39.8 | 38.9 | 2.63 | 91.9 | 47.7 |
V91H 、 D20A 、 E61Q 、 M104T | 49.5 | 6.74 | 71.2 | 18.2 | 67.4 | 11.3 | 79.5 | 22.9 |
D20W 、 E61Q | 2.29 | 0.77 | 6.655 | 1.34 | 2.45 | 1.2 | 2.97 | 1 |
D20W 、 V91K 、 E61Q | 3.855 | 1.1 | 36.3 | 4.41 | 2.89 | 1.15 | 32.5 | 4.57 |
N88K 、 E61Q | 18.2 | 1.64 | 92.95 | 45.7 | 26.7 | 4.22 | 97.1 | 64.1 |
V91K 、 N88K 、 E61Q | 5.42 | 0.485 | 83.25 | 30.15 | 6.34 | 1.45 | 91.5 | 41.5 |
V91K 、 N88K 、 E61Q 、 M104T | 2.9 | 0.765 | 76.2 | 21.4 | 4.02 | 1.35 | 87.7 | 29.6 |
D20W 、 V91K 、 E61Q 、 M104T | 80.6 | 27.05 | 95.2 | 41.25 | 89.2 | 35.7 | 97 | 61.5 |
V91H 、 M104L | 90.55 | 47.85 | 96.85 | 39.65 | 98.1 | 63.9 | 96.9 | 66.3 |
D20A 、 M104L | 47.7 | 5.28 | 69.2 | 15.35 | 66 | 12.6 | 76.7 | 24.4 |
H16E 、 M104L | 89.25 | 43.45 | 95.6 | 38.75 | 97.2 | 61 | 96.6 | 62.1 |
V91K 、 H16R 、 M104L | 3.4 | 1.04 | 10.265 | 0.785 | 5.19 | 2.74 | 5.93 | 1.64 |
V91K 、 D20A 、 M104L | 11.95 | 1.47 | 30.55 | 3.665 | 21 | 2.89 | 30.5 | 4.89 |
測試DSC Tm測量的分子評估測定連同藉由SEC層析法測量的40°C 10天穩定性,從而選擇具有良好可製造性潛力的穩定分子。圖1中顯示了10天後的% MP之結果。實例 3- 人 IL-2 突變蛋白之減弱
針對體外pSTAT5測定中小鼠脾細胞中的活性,評估減弱的人IL-2突變蛋白。我們確認了在小鼠脾細胞pSTAT5測定中,選擇的突變蛋白對小鼠免疫細胞之活性(圖2)。顯示了三種減弱的突變蛋白H16R、V91K D20A M104V、D20W,和對照、野生型人IL-2. Fc、重組人IL-2、以及重組小鼠IL-2的劑量滴定曲線。在含有滴定濃度的突變蛋白的培養基中刺激小鼠脾細胞30 min,並且藉由FACS進行分析。在小鼠Treg細胞中,突變蛋白顯示了與它們在人Treg細胞中表現類似的活性排序(即WT > H16R > V91K D20A M104V > D20W)。排序對於效應T細胞也是類似的。實例 4- 小鼠中人 IL-2 突變蛋白的體內活性
在第0天,給予C57Bl6小鼠單劑量的PBS(媒介物對照)、野生型IL-2-Fc、V91K D20A M104V、H16R、或D20W,並且在第4天收穫脾細胞,並且分析對Treg細胞、CD8 T細胞和NK細胞的影響。評估三個劑量(1 ug、5 ug、或25 ug/小鼠),除了僅按25 ug給予的D20W。在總的活閘控細胞中的Treg細胞(如藉由CD4+ CD25+ FoxP3+細胞定義)的百分比顯示在 (A) 中,並且顯示Treg細胞 (B)、CD8 T細胞 (C)、和NK細胞 (D) 的計算的總數。如圖3中所展示,在體內,野生型IL-2、H16R、和V91K D20A M104V以劑量依賴方式誘導Treg細胞的顯著擴增。兩種突變蛋白H16R和V91K D20A M104V顯示了針對Treg細胞的出人意料地穩健的活性,程度與野生型IL-2. Fc相比類似的或甚至更大。相比之下,與野生型IL-2. Fc相比,H16R和V91K D20A M104V都沒有針對CD8 T或NK細胞顯示顯著活性。該等結果證明,儘管如藉由體外pSTAT5讀出測量,活性顯著減弱,但是減弱的突變蛋白保留了在體內誘導穩健Treg應答同時誘導最小CD8 T和NK細胞應答的能力。因此,減弱不成比例地影響了體內Treg : 非Treg選擇性。實例 5-IL-2 突變蛋白的 pSTAT5 傳訊
針對相對pSTAT5活化研究IL-2突變蛋白。設計活性篩選來鑒定具有增強的Treg : Teff窗口的突變蛋白,即保留在Treg細胞中的高水平的活性同時顯示Teff細胞中的顯著減弱的那些。由於活化的Teff細胞表現增加水平的CD25,並且患有自體免疫性疾病和炎性疾病的患者具有升高數量的該等細胞,所以我們將CD25+閘控施加到Teff細胞上,從而模擬患者中的CD25表現方面的更現實差異化。藉由在細胞中的用基於FACS的測定測量的磷光體-STAT5應答,評估IL-2突變蛋白的活性。簡而言之,將先前冷凍的人PBMC解凍,並且在完全培養基中靜息0.5-2 hr。按5-10百萬個細胞/ml懸浮細胞,並且按100 ul/孔等分到96孔深孔板(0.5-1百萬個細胞/孔)中。按10 µl的最終體積,以範圍從0.4 nM至25 nM的10x劑量滴定,用IL-2突變蛋白刺激細胞,持續30 min。使用BD磷流式緩衝液套組測量STAT5磷酸化的水平。簡而言之,添加1 ml的BD裂解/固定磷流式緩衝液來停止刺激。在37°C下固定細胞10-15 min,並且在冰上用1x BD磷流式透化緩衝液透化,之後針對CD3、CD4、CD25、FOXP3、CD8和pSTAT5進行染色。下表2中顯示了PBMC的兩種供體之結果。
[表3]. IL-2突變蛋白之pSTAT5活化
供體 1 | 供體 2 | |||||||||||
IL2 | 25 nM IL2 處理 | 0.4 nM IL2 處理 | 25 nM IL2 處理 | 0.4 nM IL2 處理 | ||||||||
%pSTAT5+ Treg | %pSTAT5+ Teff | %pSTAT5+ Treg | %pSTAT5+ Teff | %pSTAT5+ Treg | %pSTAT5+ Teff | %pSTAT5+ Treg | %pSTAT5+ Teff | |||||
僅培養基 | 3.85 | .045 | ||||||||||
WTIL2 | 100 | 87.7 | 99.7 | 85.3 | 99.8 | 91.9 | 99.5 | 90.3 | ||||
V91A 、 H16A | 99.7 | 89 | 99.8 | 85.8 | 99.8 | 91.4 | 99.2 | 43.4 | ||||
V91A 、 H16D | 99.4 | 82.9 | 99.7 | 76.4 | 100 | 84.5 | 95.1 | 22 | ||||
V91A 、 H16E | 99.6 | 76.7 | 100 | 63.6 | 99.6 | 69.4 | 84.4 | 11 | ||||
V91A 、 H16S | 99.9 | 84.1 | 99.8 | 80.9 | 99.7 | 88.6 | 99.1 | 38.1 | ||||
V91E 、 H16A | 99.6 | 85 | 99.8 | 78.1 | 99.8 | 87.5 | 96.4 | 28.3 | ||||
V91E 、 H16D | 99.5 | 72.6 | 99.2 | 56.9 | 99.8 | 64.7 | 81.2 | 11.2 | ||||
V91E 、 H16E | 99.3 | 63.3 | 99.3 | 48.1 | 99 | 62.3 | 74.3 | 7.16 | ||||
V91E 、 H16S | 100 | 84.2 | 99.3 | 76.1 | 99.8 | 87.3 | 96.6 | 28.3 | ||||
V91K 、 H16A | 99.3 | 73.4 | 98.9 | 55.9 | 100 | 65.6 | 82.4 | 12.6 | ||||
V91K 、 H16D | 96.1 | 37.5 | 93.8 | 22.8 | 95.4 | 30 | 45.1 | 2.1 | ||||
V91K 、 H16S | 99.4 | 71 | 99 | 53.3 | 99.8 | 68.5 | 70.7 | 3.36 | ||||
V91S 、 H16E | 98.6 | 60.1 | 98.9 | 45 | 98.9 | 53.6 | 70.5 | 7.58 | ||||
無
[圖1]顯示了具有藉由SEC層析法測量的40°C 10天穩定性的IL-2突變蛋白的DSC Tm測量之結果。
[圖2]顯示了在體外pSTAT5測定中,三種減弱的突變蛋白H16R、V91K D20A M104V、D20W,和對照、野生型人IL-2. Fc、重組人IL-2,以及重組小鼠IL-2之劑量滴定曲線。
[圖3]顯示了對於小鼠中的體內活性,人IL-2突變蛋白V91K D20A M104V、H16R、D20W、和對照野生型IL-2-Fc之評估。
無
Claims (80)
- 一種人介白素-2(IL-2)突變蛋白,其包含與SEQ ID NO: 1中列出的胺基酸序列具有至少90%同一性之胺基酸序列,其中所述IL-2突變蛋白具有以下中的一個或多個突變:V91K、D20L;D84R、E61Q;V91K、D20A、E61Q、M104T;N88K、M104L;V91H、M104L;V91K、H16E、M104V;V91K、H16R、M104V;V91K、H16R、M104T;V91K、D20A、M104T;V91K、H16E、M104T;V91K、H16E、E61Q、M104T;V91K、H16R、E61Q、M104T;V91K、H16E;V91H、D20A、M104T;H16E、V91H、M104V;V91H、D20A、E61Q、M104T;V91H、H16R、E16Q;V91K、D20A、M104V;H16E、V91H;V91H、D20A、M104V;H16E、V91H、M104T;H16E、V91H、E61Q、M104T;V91K、E61Q、H16E;V91K、H16R、M104L;H16E、V91H、E16Q;V91K、E61Q、H16R;D20W、V91K、E61Q;V91H、H16R;V91K、H16R;D20W、V91K、E61Q、M104T;V91K、D20A;V91H、D20A、E16Q;V91K、D20A、M104L;V91H、D20A;V91K、E61Q、D20A;V91H、M104T;V91H、M104V;V91K、E61Q;V91K、N88K、E61Q、M104T;V91K、N88K、E61Q;V91H、E61Q;V91K、N88K;D20A、H16E、M104T;D20A、M104T;H16E、N88K;D20A、M104V;D20A、M104L;H16E、M104T;H16E、M104V;N88K、M104V;N88K、E61Q;D20A、E61Q;H16R、D20A;D20W、E61Q;H16E、E61Q;H16E、M104L;N88K、M104T;D20A、H16E;D20A、H16E、E16Q;D20A、H16R、E16Q;V91K、D20W;V91A、H16A;V91A、H16D;V91A、H16E;V91A、H16S;V91E、H16A;V91E、H16D;V91E、H16E;V91E、H16S;V91K、H16A;V91K、H16D;V91K、H16S;或V91S、H16E,並且相對於其他T細胞優先刺激調節性T細胞。
- 如請求項1之人IL-2突變蛋白,其中該IL-2突變蛋白進一步相對於NK細胞優先刺激調節性T細胞。
- 如請求項1之人IL-2突變蛋白,其中所述突變蛋白與SEQ ID NO: 1中列出的胺基酸序列具有至少95%同一性。
- 如請求項1之人IL-2突變蛋白,其中所述突變蛋白與SEQ ID NO: 1中列出的胺基酸序列具有至少99%同一性。
- 如請求項1至4中任一項之人IL-2突變蛋白,其中所述突變蛋白之胺基酸序列與SEQ ID NO: 1中列出的胺基酸序列在C125A處和在以下突變處不同:V91K、D20L;D84R、E61Q;V91K、D20A、E61Q、M104T;N88K、M104L;V91H、M104L;V91K、H16E、M104V;V91K、H16R、M104V;V91K、H16R、M104T;V91K、D20A、M104T;V91K、H16E、M104T;V91K、H16E、E61Q、M104T;V91K、H16R、E61Q、M104T;V91K、H16E;V91H、D20A、M104T;H16E、V91H、M104V;V91H、D20A、E61Q、M104T;V91H、H16R、E16Q;V91K、D20A、M104V;H16E、V91H;V91H、D20A、M104V;H16E、V91H、M104T;H16E、V91H、E61Q、M104T;V91K、E61Q、H16E;V91K、H16R、M104L;H16E、V91H、E16Q;V91K、E61Q、H16R;D20W、V91K、E61Q;V91H、H16R;V91K、H16R;D20W、V91K、E61Q、M104T;V91K、D20A;V91H、D20A、E16Q;V91K、D20A、M104L;V91H、D20A;V91K、E61Q、D20A;V91H、M104T;V91H、M104V;V91K、E61Q;V91K、N88K、E61Q、M104T;V91K、N88K、E61Q;V91H、E61Q;V91K、N88K;D20A、H16E、M104T;D20A、M104T;H16E、N88K;D20A、M104V;D20A、M104L;H16E、M104T;H16E、M104V;N88K、M104V;N88K、E61Q;D20A、E61Q;H16R、D20A;D20W、E61Q;H16E、E61Q;H16E、M104L;N88K、M104T;D20A、H16E;D20A、H16E、E16Q;D20A、H16R、E16Q;V91K、D20W;V91A、H16A;V91A、H16D;V91A、H16E;V91A、H16S;V91E、H16A;V91E、H16D;V91E、H16E;V91E、H16S;V91K、H16A;V91K、H16D;V91K、H16S;或V91S、H16E。
- 如請求項1至5中任一項之人IL-2突變蛋白,其中使用實例1之方案,在1 nM IL-2處理時,該IL-2突變蛋白具有效應T細胞的小於30% pSTAT激活。
- 如請求項1至5中任一項之人IL-2突變蛋白,其中使用實例1之方案,在1 nM IL-2處理時,該IL-2突變蛋白具有效應T細胞之小於30% pSTAT激活和調節性T細胞之大於40% pSTAT激活。
- 如請求項1至5中任一項之人IL-2突變蛋白,其中使用實例1之方案,在1 nM IL-2處理時,該IL-2突變蛋白具有調節性T細胞之大於40% pSTAT激活。
- 如請求項1至8中任一項之人IL-2突變蛋白,進一步其中使用實例2之方案,該IL-2突變蛋白具有大於30%穩定性。
- 一種Fc融合蛋白,其包含Fc和如請求項1至9中任一項之人IL-2突變蛋白。
- 如請求項10之Fc融合蛋白,其中該Fc係人IgG1 Fc。
- 如請求項11之Fc融合蛋白,其中該人IgG1 Fc包含改變所述Fc的效應子功能的一個或多個突變。
- 如請求項12之Fc融合蛋白,其中該人IgG1包含在N297處的取代。
- 如請求項13之Fc融合蛋白,其中該在N297處的取代係N297G。
- 如請求項11至14中任一項之Fc融合蛋白,其包含所述人IgG Fc的C末端離胺酸的取代或缺失。
- 如請求項15之Fc融合蛋白,其中所述人IgG Fc的C末端離胺酸缺失。
- 如請求項11至16中任一項之Fc融合蛋白,其中連接子連接所述蛋白的Fc和人IL-2突變蛋白部分。
- 如請求項17之Fc融合蛋白,其中該連接子係GGGGS(SEQ ID NO: 5)、GGNGT、或(SEQ ID NO: 6)、和YGNGT(SEQ ID NO: 7)。
- 如請求項18之Fc融合蛋白,其中該連接子係GGGGS(SEQ ID NO: 5)。
- 如請求項11至19中任一項之Fc融合蛋白,其中該IL-2突變蛋白進一步包含當在哺乳動物細胞中表現時改變所述Fc融合蛋白的醣基化的胺基酸添加、取代、或缺失。
- 如請求項20之Fc融合蛋白,其中該IL-2突變蛋白包含T3取代。
- 如請求項21之Fc融合蛋白,其中該IL-2突變蛋白包含T3N或T3A取代。
- 如請求項22之Fc融合蛋白,其中該IL-2突變蛋白包含T3N取代。
- 如請求項23之Fc融合蛋白,其中該IL-2突變蛋白進一步包含S5突變。
- 如請求項24之Fc融合蛋白,其中該IL-2突變蛋白進一步包含S5T突變。
- 如請求項11至25中任一項之Fc融合蛋白,其中所述Fc融合蛋白包含Fc二聚體。
- 如請求項26之Fc融合蛋白,其中所述Fc融合蛋白包含兩個IL-2突變蛋白。
- 如請求項26之Fc融合蛋白,其中所述Fc融合蛋白包含單個IL-2突變蛋白。
- 一種分離的核酸,其編碼如請求項1至9中任一項之人IL-2突變蛋白。
- 一種分離的核酸,其編碼抗體之Fc部分和如請求項1至9中任一項之人IL-2突變蛋白。
- 如請求項30所述之分離的核酸,其中抗體之所述Fc部分和該人IL-2突變蛋白係在單個開讀框內編碼的。
- 如請求項30或31之分離的核酸,其中該Fc係人IgG1 Fc。
- 如請求項32之分離的核酸,其中該人IgG1 Fc包含改變所述Fc的效應子功能的一個或多個突變。
- 如請求項33之分離的核酸,其中該人IgG1包含在N297處的取代。
- 如請求項32之分離的核酸,其中該在N297處的取代係N297G。
- 如請求項32至35中任一項之分離的核酸,其編碼所述人IgG Fc的C末端離胺酸的取代或缺失。
- 如請求項36之分離的核酸,其中所述人IgG Fc的C末端離胺酸缺失。
- 如請求項30至37中任一項之分離的核酸,其進一步編碼連接抗體的Fc部分和該人IL-2突變蛋白之連接子。
- 如請求項38之分離的核酸,其中該連接子係GGGGS(SEQ ID NO: 5)、GGNGT、或(SEQ ID NO: 6)、和 YGNGT(SEQ ID NO: 7)。
- 如請求項39之分離的核酸,其中該連接子係GGGGS(SEQ ID NO: 5)。
- 如請求項30至40中任一項之分離的核酸,其中該IL-2突變蛋白進一步包含當在哺乳動物細胞中表現時改變包含所述IL-2突變蛋白之蛋白的醣基化的胺基酸添加、取代、或缺失。
- 如請求項41之分離的核酸,其中該IL-2突變蛋白包含T3取代。
- 如請求項42之分離的核酸,其中該IL-2突變蛋白包含T3N或T3A取代。
- 如請求項43之分離的核酸,其中該IL-2突變蛋白包含T3N取代。
- 如請求項44之分離的核酸,其中該IL-2突變蛋白進一步包含S5突變。
- 如請求項45之分離的核酸,其中該IL-2突變蛋白進一步包含S5T突變。
- 一種表現載體,其包含可操作地連接到啟動子的如請求項29至46中任一項之分離的核酸。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項29至46中任一項之分離的核酸。
- 如請求項48之宿主細胞,其中該分離的核酸可操作地連接到啟動子。
- 如請求項48或49之宿主細胞,其中所述宿主細胞係原核細胞。
- 如請求項50之宿主細胞,其中該宿主細胞係大腸桿菌。
- 如請求項48或49之宿主細胞,其中所述宿主細胞係真核細胞。
- 如請求項52之宿主細胞,其中該宿主細胞係哺乳動物細胞。
- 如請求項53之宿主細胞,其中該宿主細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
- 一種製備人IL-2突變蛋白之方法,該方法包括在其中表現所述啟動子之條件下培養如請求項49至54中任一項之宿主細胞,並且從所述培養收穫該人IL-2突變蛋白。
- 一種製備Fc融合蛋白之方法,該方法包括在其中表現所述啟動子之條件下培養如請求項49至54中任一項之宿主細胞,並且從所述培養收穫該Fc融合蛋白。
- 一種增加T細胞之群體內調節性T細胞(Treg)相對於非調節性T細胞之比率之方法,該方法包括使該T細胞的群體與有效量之如請求項1至9中任一項之人IL-2突變蛋白接觸。
- 如請求項57之方法,其中CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加。
- 如請求項58之方法,其中CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加至少50%。
- 一種增加T細胞之群體內調節性T細胞(Treg)相對於非調節性T細胞之比率之方法,該方法包括使該T細胞的群體與有效量之如請求項10至28中任一項之Fc融合蛋白接觸。
- 如請求項60之方法,其中CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加。
- 如請求項61之方法,其中CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加至少50%。
- 一種增加個體的周邊血內調節性T細胞(Treg)相對於非調節性T細胞之比率之方法,該方法包括投與有效量之如請求項1至9中任一項之人IL-2突變蛋白。
- 如請求項63之方法,其中CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加。
- 如請求項64之方法,其中CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加至少50%。
- 一種增加個體的周邊血內調節性T細胞(Treg)相對於非調節性T細胞之比率之方法,該方法包括投與有效量之如請求項10至28中任一項之Fc融合蛋白。
- 如請求項66之方法,其中CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加。
- 如請求項67之方法,其中CD3+ FoxP3+細胞相對於CD3+ FoxP3-之比率增加至少50%。
- 一種增加個體的周邊血內調節性T細胞(Treg)與自然殺手(NK)細胞之比率之方法,該方法包括投與有效量之如請求項1至9中任一項之人IL-2突變蛋白。
- 如請求項69之方法,其中CD3+ FoxP3+細胞與表現CD56和/或CD16的CD3- CD19-淋巴細胞之比率增加。
- 如請求項70之方法,其中CD3+ FoxP3+細胞與表現CD56和/或CD16的CD3- CD19-淋巴細胞之比率增加至少50%。
- 一種增加個體的周邊血內調節性T細胞(Treg)與自然殺手(NK)細胞之比率之方法,該方法包括投與有效量之如請求項10至28中任一項之Fc融合蛋白。
- 如請求項72之方法,其中CD3+ FoxP3+細胞與表現CD56和/或CD16的CD3- CD19-淋巴細胞之比率增加。
- 如請求項73之方法,其中CD3+ FoxP3+細胞與表現CD56和/或CD16的CD3- CD19-淋巴細胞之比率增加至少50%。
- 一種治療患有炎性疾病或自體免疫性疾病的個體之方法,該方法包括向所述個體投與治療有效量之如請求項1至9中任一項之IL-2突變蛋白。
- 一種治療患有炎性疾病或自體免疫性疾病的個體之方法,該方法包括向所述個體投與治療有效量之如請求項10至25中任一項之Fc融合蛋白。
- 如請求項75或76之治療患有炎性疾病或自體免疫性疾病的個體之方法,其中投與引起該疾病的至少一個症狀的減輕。
- 如請求項77之方法,其中在該投與後,個體的周邊血內調節性T細胞(Treg)相對於非調節性T細胞之比率增加。
- 如請求項77之方法,其中在該投與後,個體的周邊血內調節性T細胞(Treg)相對於非調節性T細胞之比率保持基本上相同。
- 如請求項75至79中任一項之方法,其中該炎性疾病或自體免疫性疾病係狼瘡、移植物抗宿主疾病、C型肝炎誘發的血管炎、I型糖尿病、II型糖尿病、多發性硬化、類風濕關節炎、斑禿、動脈粥樣硬化、牛皮癬、器官移植排斥、休格倫氏症、白塞氏病、自發性流產、異位性疾病、氣喘、或炎性腸病。
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