BR112015023145B1 - Polipeptídeos contendo fc aglicosilados e anticorpo ou proteína de fusão fc - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEOS CONTENDO Fc AGLICOSILADOS São fornecidas aqui moléculas Fc de IgG1 humana variante desprovidas de ou com função efetora altamente reduzida e alta estabilidade, apesar de desprovidas de glicosilação em N297. Também são fornecidos aqui peptídeos ligantes que são glicosilados quando expressos em células de mamífero. IL-2 liga três subunidades de receptor transmembrana: IL-2R- e IL-2Ry que juntas ativam eventos de sinalização intracelular mediante ligação de IL-2 e CD-25 (IL-2Ra) que serve para estabilizar a interação entre IL-2 e Il-2RBY. Os sinais distribuídos por IL-2RBY incluem aqueles da PI3-cinase, Ras-MAO-cinase e vias STAT5.

Description

Referência cruzada aos pedidos relacionados

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US N.° de Série 61/784.669, depositado em 14 de março de 2013. O pedido identificado acima é aqui incorporado por referência.

Referência à Listagem de Sequências

[002] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma listagem de sequências em formato eletrônico. Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo de texto intitulado A-1892-WO-PCT_ST25.txt criado em 13 de março de 2014, que é 57.344 bytes de tamanho. A informação no formato eletrônico da Listagem de Sequências está aqui incorporada por referência na sua totalidade.

Fundamentos

[003] IL-2 se liga a três subunidades do receptor transmembranar: IL-2Rβ e IL-2Ry que juntos ativam eventos de sinalização intracelulares sobre a ligação à IL-2, e CD25 (IL-2Rα), que serve para estabilizar a interação entre a IL-2 e IL-2Rβy. Os sinais liberados por IL-2Rβy incluem aqueles das vias de PI3-quinase, Ras-MAP-quinase, e STAT5.

[004] As células T requer a expressão de CD25 para responder às baixas concentrações de IL-2 que normalmente existem nos tecidos. As células T que expressam CD25 incluem ambas células T reguladoras FOXP3+ (células Treg), que são essenciais para suprimir a inflamação autoimune, e as células T FOXP3- que foram ativadas para expressar CD25. Células efetoras FOXP3- CD25+ (Teff) podem ser células T CD4+ ou CD8+, sendo que ambas podem contribuir para a inflamação, autoimunidade, rejeição de enxerto de órgãos, ou a doença do enxerto-versus-hospedeiro. A sinalização de STAT5 estimulada por IL-2 é crucial para o crescimento de células T-reg normais e sobrevivência e para a expressão elevada de FOXP3.

[005] Em WO 2010/085495 de copropriedade, descreve-se o uso de muteínas de IL-2 para expandir preferencialmente ou estimular as células Treg. Quando administrados a um sujeito, o efeito sobre as células Treg é útil para o tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes. Embora as muteínas de IL-2 descritos neste sejam úteis para a expansão de Treg sobre células Teff in vivo, era desejável criar muteínas de IL-2 que tivessem atributos ideais para uma terapêutica humana.

Sumário

[006] São aqui descritas muteínas de IL-2 que são passíveis de fabricação de alto rendimento e têm atividade farmacológica otimizada. No esforço para produzir um exemplar de IL-2 à base de muteína terapêutica humana, um certo número de observações inesperada e imprevisível ocorreu. As muteínas de IL-2 aqui descritas são o resultado desse esforço.

[007] As muteínas de IL-2 aqui descritas têm um número mínimo de alterações de IL-2, diminuindo assim a probabilidade de criação de uma resposta imune contra a muteína de IL-2 e/ou IL-2 endógena, e ainda assim manter expansão e ativação de Treg preferencial. Além disso, em certas modalidades, a muteína de IL-2 é fundida a uma molécula, por exemplo, um Fc de anticorpo, que aumenta a meia-vida sérica quando administrada a um sujeito. Muteínas de IL-2 têm uma meia-vida sérica curta (3 a 5 horas para a injeção subcutânea). As fusões de Fc e muteína de IL-2 aqui descritas exemplares têm uma meia-vida nos seres humanos de pelo menos 1 dia, pelo menos 3 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 15 dias, pelo menos 20 dias, ou pelo menos 25 dias. Este efeito sobre a farmacocinética de muteínas de IL-2 permite a diminuição ou doseamento menos frequente da muteína de IL-2 terapêutica.

[008] Além disso, durante a criação de uma molécula grande farmacêutica, consideração deve ser feita para a capacidade de produzir a grande molécula em grandes quantidades, enquanto minimiza a agregação e maximiza a estabilidade da molécula. A moléculas de fusão Fc e muteína da IL-2 demonstra tais atributos.

[009] Além disso, em certas modalidades, a proteína a de fusão de muteína de IL-2 com Fc contém uma região Fc de IgG1. Quando é desejável a supressão das funções efetoras da IgG1 (por exemplo, a atividade de ADCC), foi demonstrada que a mutação da asparagina na posição 297 para glicina (N297G; esquema de numeração EU) forneceu grandemente a eficiência melhorada de purificação e propriedades biofísicas sobre outras mutações que levam a uma aglicosilação de Fc de IgG1. Em modalidades preferenciais, cisteínas são manipulados em Fc para permitir ligações dissulfeto, o que aumentou a estabilidade da molécula contendo Fc aglicosilado. A utilidade de Fc aglicosilada ultrapassa contexto da fusão de muteína de IL-2 com Fc. Assim, são aqui fornecidas moléculas contendo Fc, fusões à Fc e anticorpos, que compreendem uma substituição N297G e opcionalmente substituição de um ou mais resíduos de cisteína.

[0010] Outro aspecto da invenção inclui ligantes peptídicos glicosilados. Peptídeos ligantes preferenciais que são passíveis de N-glicosilação incluem GGNGT (SEQ ID NO: 6) ou YGNGT (SEQ ID NO: 7).

Breve Descrição das Figuras

[0011] FIG. 1 Em um ensaio de estimulação de curto prazo, homodimerização por fusão ao C-terminal de IgG-Fc não altera a atividade de muteínas de IL-2 com reduzida potência e com alta afinidade para CD25.

[0012] FIG. 2A e a FIG. 2B são muteínas de IL-2 com as mutações indicadas e fundidas com o C-terminal de um dos lados de um Fc-heterodímero foram testadas quanto à sua capacidade para estimular a fosforilação de STAT5 em células T. Estas muteínas também continham três mutações que conferem alta afinidade para CD25 (V69A, N71, Q74P). A sua atividade foi comparada com três formas de IL-2 sem fusão a Fc (símbolos abertos): WT IL-2, HaWT (elevada afinidade para CD25) (N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, Q74P), e HaD (alta afinidade para CD25 e redução da atividade de sinalização) (N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, Q74P, N88D). Respostas Fosfo-STAT5 são mostrados para células fechadas de FOXP3+CD4+ e FOXP3-CD4+.

[0013] FIG. 3. Proliferação das subpopulações de células T em resposta a titulações de muteínas de IL-2 fundidas com Fc-heterodímero. Atividade de proteínas de fusão foi comparada com três formas de IL-2 sem fusão com Fc (símbolos abertos): WT IL-2, HaWT (elevada afinidade para CD25) (N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R,Q74P), e HaD (alta afinidade para CD25 e reduzida atividade de sinalização) (N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R,Q74P, N88D)

[0014] FIG. 4. Proliferação de células NK em resposta a titulações de muteínas de IL-2 fundidos com Fc- heterodímero. Atividade de proteínas de fusão foi comparada com três formas de IL-2 sem fusão com Fc (símbolos abertos): WT IL-2, HaWT (elevada afinidade para CD25) (N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, Q74P), e HaD (alta afinidade para CD25 e reduzida atividade de sinalização) (N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R,Q74P, N88D)

[0015] FIG. 5. Proliferação de subconjuntos de células T em resposta a titulações de muteínas de IL-2 fundidas com Fc-homodímero N297G. Atividade de Fc.muteínas foi comparada com WT IL-2 (círculos abertos) e Fc.WT (círculos fechados). As mutações que conferem uma elevada afinidade para CD25 (HaMut1) foram V69A e Q74P.

[0016] FIG. 6 Proliferação de células NK em resposta a titulações de muteínas de IL-2 fundidas com Fc-homodímero N297G. Atividade de Fc.muteínas foi comparada com WT IL-2 (círculos abertos) e Fc.WT (círculos fechados).

[0017] FIG. 7A e FIG. 7B Fc.lL-2 muteínas sem mutações que conferem afinidade elevada para CD25 promovem a expansão de e regulação positiva de FOXP3 em camundongos humanizados.

[0018] FIG. 8 Doses semanais baixas (0,5 μg por animal) de Fc.IL-2 muteínas promovem a expansão de Treg e regulação positiva de FOXP3 em camundongos humanizados, com melhor atividade observada para Fc.V91K em relação a Fc.N88D e Fc.WT.

[0019] FIG. 9 Fc.V91K e Fc.N88D persiste na superfície de células T ativadas por meio da associação com CD25.

Descrição detalhada das modalidades preferenciais

[0020] Os títulos das seções aqui utilizadas são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando o objeto descrito. Todas as referências citadas dentro do corpo da presente especificação são expressamente incorporadas por referência na sua totalidade.

[0021] Podem ser utilizadas técnicas padrão para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos, cultura de tecidos e transformação, purificação de proteínas, etc. As reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como normalmente realizadas na técnica ou como aqui descrito. Os seguintes processos e técnicas podem ser geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e tal como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da especificação. Ver, por exemplo, Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, que é aqui incorporado por referência para qualquer finalidade. Salvo se definições específicas são fornecidas, a nomenclatura utilizada em relação à, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de, química analítica, química orgânica, química medicinal e farmacêutica e aqui descritas são as bem conhecidas e comumente utilizadas na técnica. Podem ser utilizadas técnicas padrão para síntese química, análise química, preparação farmacêutica, formulação e liberação e tratamento de pacientes.

IL-2

[0022] As muteínas de IL-2 aqui descritas são variantes de tipo selvagem de IL-2 humana. Tal como aqui utilizado, “tipo selvagem de IL-2 humana”, “tipo selvagem de IL-2” ou “WT IL-2”, o polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácidos seguinte:em que X é C, S, V ou A (SEQ ID NO: 2).

[0023] As variantes podem conter uma ou mais substituições, deleções ou inserções no interior da sequência de aminoácidos do tipo selvagem de IL-2. Os resíduos são aqui designados pelo código de aminoácidos de uma letra seguida de posição de aminoácidos de IL-2, por exemplo, K35 é o resíduo de lisina na posição 35 da SEQ ID NO: 2. As substituições são aqui designadas pelo código de aminoácidos de uma letra seguida pela posição de IL-2 de aminoácidos, seguido pela substituição de um código de aminoácidos de uma letra, por exemplo, K35A é uma substituição do resíduo de lisina na posição 35 da SEQ ID NO: 2 com um resíduo de alanina.

Muteínas de IL-2

[0024] São aqui fornecidas muteínas de IL-2 humana que estimulam preferencialmente as células T reguladoras (Treg). Tal como aqui utilizado “estimula preferencialmente células T reguladoras” significa a muteína promove a proliferação, a sobrevivência, a ativação e/ou função de células T CD3+FoxP3+ sobre as células T CD3+FoxP3-. Métodos de medição da capacidade de estimular preferencialmente Tregs podem ser medidos por citometria de fluxo de leucócitos de sangue periférico, na qual não é observado um aumento na percentagem de células FoxP3+CD4+ entre células T CD4+ totais, um aumento da percentagem de células T FoxP3+ CD8+ entre células totais T CD8+, um aumento da percentagem de células FoxP3+ relativamente às células NK, e/ou um maior aumento no nível de expressão de CD25 na superfície de células FoxP3+ em relação ao aumento da expressão de CD25 em outras células T. Crescimento preferencial de células Treg também pode ser detectado como uma maior representação de DNA do promotor FoxP3 desmetilado (isto é, a região desmetilada específica de Treg, ou TSDR) em relação a genes CD3 desmetilados em DNA extraído a partir de sangue total, tal como detectado por sequenciamento de produtos da reação em cadeia da polimerase (PCR) de DNA genômico tratado com bissulfito (J. Sehouli, et al 2011. Epigenetics 6:2, 236-246).

[0025] As muteínas de IL-2 que estimulam preferencialmente as células Treg aumentam a proporção de células T CD3+FoxP3+ sobre as células T CD3+FoxP3- num sujeito ou numa amostra de sangue periférico, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400%, pelo menos 500%, pelo menos 600%, pelo menos 700%, pelo menos 800%, pelo menos 900%, ou, pelo menos 1000%.

[0026] As muteínas de IL-2 preferenciais incluem, entre outras, muteínas de IL-2 compreendendo substituição V91K ou N88D na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Um exemplar de muteína de IL-2 é apresentada na SEQ ID NO: 1. Particularmente preferida é a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 que compreende uma substituição C125A. Embora possa ser vantajosa para reduzir ainda mais o número de mutações na sequência de tipo selvagem de IL-2, a invenção inclui muteínas de IL-2 com truncamentos ou inserções adicionais, deleções ou substituições em adição à substituição V91K ou N88D, desde que as referidas muteínas mantenham a atividade de um preferencialmente simular Tregs. Assim, as modalidades incluem muteínas de IL-2 que estimulam preferencialmente células T reguladoras e que compreendem uma sequência de aminoácidos possuindo um V91K ou N88D que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em modalidades particularmente preferenciais, tais muteínas de IL-2 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.

[0027] Para sequências de aminoácidos, a identidade e/ou semelhança de sequência é determinada utilizando técnicas padrão conhecidas na técnica, incluindo, entre outras, o algoritmo de identidade de sequência de local de Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482, o algoritmo de alinhamento de identidade de sequência de Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, a pesquisa para método de similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444, implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no pacote de Wisconsin Genetics Software, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), O programa de sequência Best Fit descrito por Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12: 387-395, preferencialmente usando as configurações padrão, ou pela inspeção. Preferencialmente, a percentagem de identidade é calculada por FastDB com base nos seguintes parâmetros: penalidade de incompatibilidade de 1; penalidade de intervalo de 1; penalidade de tamanho de lacuna de 0,33; e penalidade de junção 30, “Current Methods in Sequence Comparison and Analysis”, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

[0028] Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas utilizando alinhamentos progressivos aos pares. Também pode traçar uma árvore mostrando as relações de agrupamento utilizadas para criar o alinhamento. O PILEUP utiliza uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35: 351-360; o método é semelhante ao descrito por Higgins and Sharp, 1989, CABIOS 5: 151-153. Os parâmetros úteis de PILEUP, incluindo um peso padrão de lacuna de 3,00, um peso do comprimento da lacuna padrão de 0,10, e as lacunas finais ponderadas.

[0029] Outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito em: Altschul etl al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; e Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5787. Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU-BLAST-2 que foi obtido a partir de Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266: 460-480. WU-BLAST-2 utiliza vários parâmetros de pesquisa, a maioria dos quais estão definidos para os valores padrão. Os parâmetros ajustáveis são estabelecidos com os seguintes valores: span de sobreposição = 1, fração de sobreposição = 0,125, limiar de palavra (T) = II. Os parâmetros HSP S e HSP S2 são valores dinâmicos e são estabelecidos pelo próprio programa, dependendo da composição da sequência e composição específicos do banco de dados particular contra o qual a sequência de interesse está sendo pesquisada; no entanto, os valores podem ser ajustados para aumentar a sensibilidade.

[0030] Um algoritmo útil adicional é gapped BLAST como descrito por Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402. Gapped BLAST usa pontuações de substituição BLOSUM-62; parâmetro limiar T definido para 9; o método de dois hits para acionar extensões ungapped, comprimentos diferença de cargas de k um custo de 10+k; Xu definido como 16, e Xg definido para 40 para a fase de pesquisa de banco de dados e 67 para a fase dos algoritmos de saída. Alinhamentos Gapped são acionados por uma pontuação correspondente a cerca de 22 bits.

[0031] Enquanto o sítio ou região para introdução de uma variação na sequência de amino ácido pode ser predeterminado, a mutação per se não precisa ser predeterminada. Por exemplo, a fim de otimizar o desempenho de uma mutação num dado sítio, a mutagênese aleatória pode ser conduzida no códon ou região alvo e a muteína de IL-2 expressa triada quanto à combinação ideal da atividade desejada. As técnicas para preparar mutações de substituição em sítios predeterminados em DNA possuindo uma sequência conhecida são bem conhecidas, por exemplo, a mutagênese de iniciador M13 e mutagênese por PCR. A triagem dos mutantes pode ser feita usando os ensaios aqui descritos, por exemplo.

[0032] As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos únicos; as inserções serão normalmente na ordem de cerca de um (1) até cerca de vinte (20) resíduos de aminoácidos, embora inserções consideravelmente maiores possam ser toleradas. As deleções variam de cerca de um (1) até cerca de vinte resíduos (20) de aminoácidos, embora em alguns casos deleções podem ser muito maiores.

[0033] Substituições, deleções, inserções ou qualquer combinação destas podem ser utilizadas para se chegar a um derivado final ou variante. Geralmente estas alterações são feitas em poucos aminoácidos para minimizar a alteração da molécula, particularmente a imunogenicidade e especificidade de ligação ao antígeno da proteína. No entanto, alterações maiores podem ser toleradas em certas circunstâncias. As substituições conservativas são geralmente feitas de acordo com o gráfico a seguir descrito como TABELA 1.TABELA 1

[0034] Mudanças substanciais na função ou identidade imunológica são feitas selecionando substituições que são menos conservativas do que as apresentadas na TABELA 1. Por exemplo, podem ser feitas substituições que afetam mais significativamente: a estrutura do esqueleto do polipeptídeo na área da alteração, por exemplo a alfa- hélice ou estrutura de folha beta; a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo; ou o volume da cadeia lateral. As substituições que em geral se espera que produzam as maiores alterações nas propriedades polipeptídicas são aquelas em que (a) um resíduo hidrofílico, por exemplo, seril ou treonil, é substituído para (ou por) um resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucil, isoleucil, fenilalanil, valil ou alanil; (b) uma cisteína ou prolina é substituída para (ou por) qualquer outro resíduo; (c) um resíduo possuindo uma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisil, arginil ou histidil, é substituído para (ou por) um resíduo eletronegativo, por exemplo, glutamil ou aspartil; ou (d) um resíduo possuindo uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, é substituída para (ou por) uma que não possui cadeia lateral, por exemplo, glicina.

[0035] As variantes exibem tipicamente a mesma atividade biológica qualitativa e provocarão a mesma resposta imune que o análogo de ocorrência natural, embora sejam também selecionadas variantes para modificar as características da muteína de IL-2, conforme necessário. Alternativamente, a variante pode ser concebida de tal modo que a atividade biológica da muteína de IL-2 é alterada. Por exemplo, sítios de glicosilação podem ser alterados ou removidos, tal como aqui discutido.

Muteínas de IL-2 tendo meia-vida sérica estendida

[0036] Porque as muteínas de IL-2 aqui fornecidas preferencialmente expandem Tregs sobre, por exemplo, células Tef ou NK, espera-se que o perfil de segurança quando administrado a um paciente seja diferente do tipo selvagem de IL-2 ou PROLEUCINA. Os efeitos colaterais associados com o tipo selvagem de IL-2 ou PROLEUCINA incluem sintomas do tipo gripal, calafrios/rigidez, artralgia, febre, exantema, prurido, reações no local da injeção, hipotensão, diarreia, náuseas, ansiedade, confusão e depressão. As muteínas de IL-2 aqui fornecidas podem ser alteradas para incluir ou fundidos com moléculas que aumentam a meia-vida sérica da muteína sem aumentar o risco de que tal extensão meia-vida iria aumentar a probabilidade ou a intensidade de um efeito colateral ou adverso em um paciente. A dosagem subcutânea de uma tal muteína de meia- vida sérica estendida pode permitir a cobertura alvo prolongada com a exposição máxima sistêmica inferior (Cmax). A meia-vida sérica estendida pode permitir um regime de dosagem mais baixo ou menos frequente da muteína.

[0037] A meia-vida sérica de muteínas de IL-2 aqui fornecidas pode ser estendida por essencialmente qualquer método conhecido na técnica. Tais métodos incluem a alteração da sequência da muteína de IL-2 para incluir um peptídeo que se liga ao receptor neonatal FCY ou se ligam à uma proteína possuindo meia-vida sérica estendida, por exemplo, IgG ou albumina de soro humano. Em outras modalidades, a muteína de IL-2 é fundida com um polipeptídeo que confere a meia-vida estendida na molécula de fusão. Tais polipeptídeos incluem um Fc de IgG ou outros polipeptídeos que se ligam ao receptor FCY neonatal, albumina de soro humano, ou polipeptídeos que se ligam à uma proteína que possui meia-vida sérica estendida. Em modalidades preferenciais, a muteína de IL-2 é fundida com uma molécula de Fc de IgG.

[0038] A muteína da IL-2 pode ser fundida com o N- terminal ou o C-terminal da região Fc de IgG. Como mostrado nos Exemplos, a fusão com a extremidade C-terminal da região Fc de IgG mantém a atividade da muteína de IL-2 em maior extensão do que quando fundida com o N-terminal de Fc de IgG.

[0039] Uma modalidade da presente invenção é dirigida a um dímero compreendendo dois polipeptídeos de fusão com Fc criados por fusão de uma muteína de IL-2 com a região Fc de um anticorpo. O dímero pode ser feito por, por exemplo, a inserção de um gene de fusão que codifica a proteína de fusão num vetor de expressão apropriado, expressar a fusão do gene em células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão recombinante, e permitindo que a proteína de fusão expressada para montar moléculas de anticorpo muito parecidas, após a qual formam ligações intercadeias entre as porções Fc para produzir o dímero.

[0040] O termo “polipeptídeo Fc” ou “região Fc” como aqui usado inclui formas de muteína e nativas de polipeptídeos derivados da região Fc de um anticorpo. As formas truncadas de tais polipeptídeos contendo a região em dobradiça que promove a dimerização estão também incluídas. Em certas modalidades, a região Fc compreende um domínio CH2 e CH3 de anticorpo. Juntamente com meia-vida sérica estendida, proteínas de fusão compreendendo porções Fc (e oligômeros formados a partir destas) oferecem a vantagem de purificação fácil por cromatografia de afinidade sobre colunas de proteína A ou de proteína G. As regiões Fc preferenciais são derivadas de IgG humana, que inclui a IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Aqui, os resíduos específicos dentro de Fc são identificados por posição. Todas as posições de Fc são baseadas no esquema de numeração da EU.

[0041] Uma das funções da porção Fc de um anticorpo é o de comunicar com o sistema imune quando o anticorpo se liga ao seu alvo. Esta é considerada “função efetora”. Comunicação leva a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). ADCC e ADCP são mediadas através da ligação de Fc ais receptores de Fc na superfície de células do sistema imune. CDC é mediada através da ligação de Fc com proteínas do sistema de complemento, por exemplo, C1q.

[0042] As subclasses de IgG variam na sua capacidade para mediar as funções efetoras. Por exemplo, IgG1 é muito superior à IgG2 e IgG4 na mediação de ADCC e CDC. Assim, em modalidades em que a função efetora é indesejável, um Fc de IgG2 seria preferencial. Moléculas contendo Fc de IgG2, no entanto, são conhecidas por serem mais difíceis de fabricar e têm propriedades biofísicas menos atraentes, tais como uma meia-vida mais curta, em comparação com moléculas contendo Fc de IgG1.

[0043] A função efetora de um anticorpo pode ser aumentada, ou diminuída, através da introdução de uma ou mais mutações em Fc. Modalidades da invenção incluem proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc contendo um Fc modificado para aumentar a função efetora (US 7.317.091 e Strohl, Curr. Opin. Biotech., 20: 685-691, 2009; ambos aqui incorporados por referência na sua totalidade). Exemplos de moléculas Fc de IgG1 com a função efetora aumentada incluem aqueles que possuem as seguintes substituições: S239D/I332E S239D/A330/I332E S239D/A330L/I332E S298A/D333A/K334A P247I/A339D P247I/A339Q D280H/K290S D280H/K290S/S298D D280H/K290S/S298V F243L/292P/Y300L F243L/R292P/Y300L/P396L F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L G236A/S239D/I332E K326A/E333A K326W/E333S K290E/S298G/T299A K290N/S298G/T299A K290E/S298G/T299A/K326E K290N/S298G/T299A/K326E

[0044] Outro método de aumentar a função efetora de proteínas contendo Fc de IgG é através da redução da fucosilação do Fc. A remoção do núcleo dos fucose dos oligossacarídeos tipo complexo biantenais ligados à Fc aumentou grandemente a função efetora de ADCC sem alterar a função efetora de ligação ao antígeno ou CDC. Várias formas são conhecidas por reduzir ou abolir fucosilação de moléculas contendo Fc, por exemplo, anticorpos. Estes incluem a expressão recombinante em certas linhagens celulares de mamíferos, incluindo uma linhagem celular nocaute FUT8, variante de linhagem CHO Lec13, linhagem celular de hibridoma de rato YB2/0, uma linhagem celular que compreende um pequeno RNA interferente, especificamente contra o gene FUT8, e uma linhagem celular de coexpressão de β-1,4-N-acetilglicosaminiltransferase III e um Golgi α- manosidase II. Alternativamente, a molécula contendo Fc pode ser expressa numa célula não mamífera, tais como uma célula de planta, levedura, ou células procarióticas, por exemplo, E. coli.

[0045] Em modalidades preferenciais da invenção, proteínas de fusão de muteína de IL-2 com Fc compreendem uma Fc modificada para diminuir a função efetora. Exemplos de moléculas de Fc tendo a função efetora reduzida incluem aqueles possuindo as seguintes substituições: N297A ou N297Q (IgG1) L234A/L235A (IgG1) V234A/G237A (IgG2) L235A/G237A/E318A (IgG4) H268Q/V309L/A330/A331S (IgG2) C220S/C226S/C229S/P238S (IgG1) C226S/C229S/E233P/L234V/L235A (IgG1) L234F/L235E/P331S (IgG1) S267E/L328F (IgG1)

[0046] Sabe-se que a IgG1 humana tem um sítio de glicosilação em N297 (sistema de numeração EU) e a glicosilação contribui para a função efetora de anticorpos IgG1. Uma sequência de IgG1 exemplar é fornecida na SEQ ID NO: 3. Grupos tendo N297 mutado em um esforço para produzir anticorpos aglicosilados. As mutações têm focos em substituição de N297 com aminoácidos que se assemelham à asparagina em natureza físico-química, tais como glutamina (N297Q) ou com alanina (N297A) que imita asparaginas sem grupos polares.

[0047] Tal como aqui utilizado, “anticorpo aglicosilado” ou “Fc aglicosilado” refere-se ao estado de glicosilação do resíduo na posição 297 de Fc. Um anticorpo, ou outra molécula pode conter a glicosilação num ou mais outros locais, mas ainda pode ser considerado um anticorpo aglicosilado ou proteína de fusão Fc aglicosilada.

[0048] No nosso esforço para fazer um Fc de IgG1 sem função efetora, descobriu-se que a mutação do aminoácido N297 de IgG1 humana para glicina, ou seja, N297G fornece uma eficácia muito superior de purificação e propriedades biofísicas sobre outras substituições de aminoácidos naquele resíduo. Ver Exemplo 8. Assim, em modalidades preferenciais, a proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc compreende Fc de IgG1 humana possuindo uma substituição N297G. O Fc compreendendo a substituição N297G é útil em qualquer contexto em que uma molécula compreende uma Fc de IgG1 humana, e não está limitada à utilização no contexto de uma fusão de muteína de IL-2 com Fc. Em certas modalidades, um anticorpo compreende a Fc possuindo uma substituição N297G.

[0049] Um Fc compreendendo um Fc de IgG1 humana que possui a mutação N297G pode também compreender outras inserções, deleções e substituições. Em certas modalidades a Fc de IgG1 humana compreende a substituição N297G e é pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3. Numa modalidade particularmente preferencial, o resíduo de lisina C-terminal é substituído ou eliminado. A sequência de aminoácidos de IgG1 humana compreendendo a substituição N297G e eliminação da lisina C-terminal é apresentada na SEQ ID NO: 4.

[0050] Moléculas contendo Fc de IgG1 glicosiladas mostraram-se menos estáveis do que moléculas contendo Fc de IgG1 glicosilada. A região Fc pode ser adicionalmente modificada para aumentar a estabilidade da molécula aglicosilada. Em algumas modalidades, um ou mais aminoácidos são substituídos para cisteína de modo a formar ligações dissulfeto no estado dimérico. Resíduos V259, A287, R292, V302, L306, V323, ou 1332 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3 podem ser substituídos com cisteínas. Em modalidades preferenciais, os pares específicos de resíduos de substituição são preferencialmente de tal modo que eles formam uma ligação dissulfeto com cada outro, assim, limitando ou impedindo o embaralhamento da ligação de dissulfeto. Pares preferenciais incluem, entre outros, A287C e L306C, V259C e L306C, R292C e V302C, e V323C e I332C.

[0051] São aqui fornecidas moléculas contendo Fc, em que um ou mais dos resíduos de V259, A287, R292, V302, L306, V323, ou 1332 são substituídos com cisteína. Moléculas contendo Fc preferenciais incluem aquelas compreendendo substituições A287C e L306C, V259C e L306C, R292C e V302C, ou V323C e I332C.

[0052] Moléculas contendo Fc exemplificativas compreendem:

[0053] Mutações adicionais que podem ser feitas para a Fc de IgG1 incluem aquelas que facilitam a formação de heterodímeros entre os polipeptídeos contendo Fc. Em algumas modalidades, a região Fc é modificada para criar “botões” e “buracos”, que facilitam a formação de heterodímero de duas cadeias diferentes de polipeptídeos contendo Fc quando coexpressas numa célula. U.S. 7.695.963. Em outras modalidades, a região Fc está alterado para usar direção eletrostática para incentivar a formação de heterodímero enquanto desencoraja a formação de homodímero de dois diferentes polipeptídeos contendo Fc quando coexpressos numa célula. O documento WO 09/089.004, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Fc heterodiméricos preferenciais incluem aqueles em que uma cadeia de Fc compreende substituições D399K e E356K e a outra cadeia de Fc compreende substituições K409D e K392D. Em outras modalidades, uma cadeia de Fc compreende substituições D399K, E356K, e E357K e a outra cadeia de Fc compreende substituições K409D, K392D, e K370D.

[0054] Em certas modalidades, pode ser vantajoso para a proteína de fusão de muteína de IL-2 da com Fc ser monomérica, isto é, contêm apenas uma única molécula de muteína de IL-2. Em tais modalidades, a região Fc da proteína de fusão pode conter uma ou mais mutações que facilitam a formação de heterodímeros. A proteína de fusão é coexpressa com uma região Fc possuindo mutações recíprocas às do polipeptídeo de fusão de muteína de IL-2 com Fc, mas desprovida de um muteína de IL-2. Quando o heterodímero das duas formas de polipeptídeos contendo Fc, a proteína resultante compreende apenas uma única muteína de IL-2.

[0055] Outro método de criar uma proteína de fusão monomérica de muteína de IL-2 com Fc se fundindo a muteína de IL-2 a um Fc monomérica, isto é, uma região Fc que não dimeriza. Fcs monoméricas compreendem mutações estáveis que desencorajam a dimerização e que estabilizam a molécula na forma monomérica. Fcs monoméricas preferenciais são divulgadas em WO 2011/063348, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Em certas modalidades, a proteínas de fusão de muteína de IL-2 com Fc compreendem uma Fc compreendendo os aminoácidos carregados negativamente nas posições 392 e 409, juntamente com uma substituição de treonina em Y349, L351, L368, V397, L398, F405, ou Y407.

[0056] Em certas modalidades, a proteína de fusão de muteína IL-2 com Fc compreende um elemento de ligação entre a Fc e a muteína de IL-2. Muitos polipeptídeos ligantes diferentes são conhecidos na técnica e podem ser utilizados no contexto de uma proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc. Em modalidades preferenciais, a proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc compreende uma ou mais cópias de um peptídeo que consiste em GGGGS (SEQ ID NO: 5), GGNGT (SEQ ID NO: 6), ou YGNGT (SEQ ID NO: 7) entre a Fc e a muteína de IL-2. Em algumas modalidades, a região do polipeptídeo entre a região Fc e a região de muteína de IL-2 compreende uma única cópia de GGGGS (SEQ ID NO: 5), GGNGT (SEQ ID NO: 6), ou YGNGT (SEQ ID NO: 7). Tal como aqui mostrado, os ligantes GGNGT (SEQ ID NO: 6) ou YGNGT (SEQ ID NO: 7) são glicosilados quando expressos nas células adequadas e tal glicosilação pode ajudar a estabilizar a proteína em solução e/ou quando administrada in vivo. Assim, em certas modalidades, uma proteína de fusão de muteína de IL-2 compreende um ligante glicosilado entre a região Fc e a região de IL-2 de muteína.

[0057] É contemplado que o ligante glicosilado pode ser útil quando colocado no contexto de um polipeptídeo. São aqui fornecidos polipeptídeos que compreendem GGNGT (SEQ ID NO: 6) ou YGNGT (SEQ ID NO: 7) inseridos na sequência de aminoácidos do polipeptídeo ou substituindo um ou mais aminoácidos dentro da sequência de aminoácidos do polipeptídeo. Em modalidades preferenciais, GGNGT (SEQ ID NO: 6) ou YGNGT (SEQ ID NO: 7) é inserido numa alça de um dos polipeptídeos de estrutura terciária. Em outras modalidades, um ou mais aminoácidos de uma alça são substituídos com GGNGT (SEQ ID NO: 6) ou YGNGT (SEQ ID NO: 7).

[0058] A porção C-terminal de Fc e/ou a porção amino terminal da muteína de IL-2 pode conter uma ou mais mutações que alteram o perfil de glicosilação de proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc quando expressa em células de mamífero. Em certas modalidades, a muteína de IL-2 compreende ainda uma substituição T3, por exemplo, T3N ou T3A. A muteína de IL-2 pode ainda compreender uma substituição S5, tais como S5T.

[0059] As modificações covalentes de muteína de IL-2 e proteínas de fusão de muteína de IL-2 com Fc estão incluídas dentro do escopo desta invenção, e são, em geral, mas nem sempre, feitas após a tradução. Por exemplo, vários tipos de modificações covalentes da muteína de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc são introduzidas na molécula por reação de resíduos de aminoácidos específicos da muteína de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou com os resíduos N- ou C-terminais.

[0060] Os resíduos cisteinil são mais habitualmente reagidos com α-halogenoacetatos (e aminas correspondentes), tais como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para gerar derivados carboximetil ou carboxiamidometil. Os resíduos cisteinil também são derivatizados por reação com bromotrifluoroacetona, α-bromo-β-(5-imidozoil)propiônico, fosfato de cloroacetil, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2- piridildissulfeto, metil 2-piridildissulfeto, p- cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol.

[0061] Os resíduos histidil são derivatizados por reação com dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidil. O brometo de para-bromofenacil também é útil; a reação é preferencialmente realizada em cacodilato de sódio 0,1 M a pH 6,0.

[0062] Resíduos de lisinil e amino terminais são reagidos com anidridos succínico ou outros ácidos carboxílicos. A derivatização com estes agentes tem o efeito de inverter a carga dos resíduos lisinil. Outros reagentes adequados para derivatização de lisinil contendo alfa-amino incluem imidoésteres tais como metil picolinimidato; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroboro- hidreto; ácido trinitrobenzenossulfônico; O-metilisoureia; 2,4-pentanodiona; e reação com glioxilato catalisada por transaminase.

[0063] Os resíduos de arginil são modificados por reação com um ou vários reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona, e ninidrina. A derivatização de resíduos de arginina requer que a reação seja realizada em condições alcalinas devido ao elevado pKa do grupo funcional de guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina, bem como com o grupo epsilon-amino da arginina.

[0064] A modificação específica de resíduos tirosil pode ser feita, com particular interesse na introdução de marcadores espectrais em resíduos tirosil por reação com compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. Mais comumente, N-acetilimidizol e tetranitrometano para formar espécies O-acetil tirosil e derivados 3-nitro, respectivamente. Os resíduos tirosil são iodados utilizando 125I ou 131I para preparar proteínas marcadas para utilização em radioimunoensaio, o método da cloramina T descrito supra sendo adequados.

[0065] Os grupos laterais carboxil (aspartil ou glutamil) são seletivamente modificados por reação com carbodiimidas (R’- N=C=N—R’), onde R e R’ são grupos alquil diferentes, opcionalmente, tal como 1-ciclo-hexil-3-(2- morfolinil-4-etil) carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azônia-4,4- dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, os resíduos aspartil e glutamil são convertidos em resíduos asparaginil e glutaminil por reação com íons de amônio.

[0066] A derivatização com agentes bifuncionais é útil para reticular proteínas de ligação ao antígeno em uma matriz de suporte insolúvel em água ou superfície para utilização numa variedade de métodos. Os agentes de reticulação comumente utilizados incluem, por exemplo, 1,1- bis (diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4- azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de dissuccinimidil tais como 3,3’- ditiobis(succinimidilpropionato) e maleimidas bifuncionais tais como bis-N-maleimido-1,8-octano. Os agentes de derivatização tais como metil-3-[(p- azidofenil)ditio]propioimidato geram intermediários fotoativáveis que são capazes de formar reticulações na presença de luz. Alternativamente, as matrizes reativas insolúveis em água tais como carboidratos ativados por brometo de cianogênio e os substratos reativos descritos nas Patentes US 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; e 4.330.440, são empregadas para imobilização de proteínas.

[0067] Resíduos glutaminil e asparaginil são frequentemente desamidados nos resíduos glutamil e aspartil correspondentes, respectivamente. Alternativamente, estes resíduos são desamidados sob condições suavemente ácidas. Qualquer das formas destes resíduos cai dentro do escopo da presente invenção.

[0068] Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxil de resíduos seril ou treonil, metilação dos grupos α-amino de lisina, arginina, e cadeias laterais de histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), acetilação da amina N-terminal, e amidação de qualquer grupo carboxil C-terminal.

[0069] Outro tipo de modificação covalente da muteína de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc, incluído no escopo desta invenção compreende alterar o padrão de glicosilação da proteína. Como é conhecido na técnica, os padrões de glicosilação podem depender da sequência da proteína (por exemplo, a presença ou ausência de resíduos de aminoácidos de glicosilação particulares, discutido abaixo), ou a célula hospedeira ou organismo no qual a proteína é produzida. Os sistemas de expressão particulares são discutidos abaixo.

[0070] A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente ou ligada a N ou ligada a O. N-ligada refere-se à ligação da porção carboidrato para a cadeia lateral de um resíduo asparagina. As sequências de tri-peptídeo asparagina-X- serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da porção carboidrato para a cadeia lateral da asparagina. Assim, a presença de qualquer uma destas sequências de tri-peptídeo num polipeptídeo cria um potencial sítio de glicosilação. A glicosilação ligada a O refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose, a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser utilizadas.

[0071] A adição de sítios de glicosilação à muteína de IL-2 ou a proteína de fusão da muteína de IL-2 com Fc pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de modo a conter uma ou mais das sequências de tri-peptídeo descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência de partida (para sítios de glicosilação ligados a O). Para facilidade, a muteína de IL-2 ou sequência de aminoácidos da proteína de fusão de IL-2 de muteína com Fc é preferencialmente alterada através de alterações ao nível do DNA, particularmente através de mutação de DNA que codifica o polipeptídeo alvo em bases pré-selecionadas de modo a que sejam gerados códons que serão traduzidos nos aminoácidos desejados.

[0072] Outro meio de aumentar o número de porções carboidrato sobre a muteína de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos à proteína. Estes procedimentos são vantajosos na medida em que não requerem a produção da proteína numa célula hospedeira que tem capacidades de glicosilação para glicosilação N- e O-ligados. Dependendo do modo de acoplamento utilizado, os açúcares podem ser ligados a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxil livres, (c) grupos sulfidril livres tais como os de cisteína, (d) grupos hidroxil livres tais como os de serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos tais como os de fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) o grupo amida de glutamina. Estes métodos são descritos em WO 87/05330 publicado em 11 de setembro de 1987, e em Aplin e Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259306.

[0073] A remoção de porções carboidrato presentes na muteína de IL-2 de partida ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. A desglicosilação química requer a exposição da proteína ao composto ácido trifluorometanossulfônico ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou de todos os açúcares, exceto o açúcar de ligação (N-acetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina), deixando o polipeptídeo intacto. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 e por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118: 131. A clivagem enzimática de porções carboidrato em polipeptídeos pode ser conseguida pela utilização de uma variedade de endo- e exo- glicosidases como descrito por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350. A glicosilação em sítios de glicosilação potenciais pode ser prevenida pela utilização do composto tunicamicina, como descrito por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 3105. A tunicamicina bloqueia a formação de ligações proteína-N-glicosídeo.

[0074] Outro tipo de modificação covalente de muteína de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc compreende a ligação da muteína de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc de vários polímeros não proteicos, incluindo, entre outros, vários polióis tais como polietileno glicol, polipropileno glicol ou polioxialquilenos, da maneira estabelecida nas Patentes US 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4791192 ou 4179337. Além disso, as substituições de aminoácidos podem ser feitas em várias posições dentro da muteína de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc para facilitar a adição de polímeros tais como PEG. Assim, as modalidades da invenção incluem muteínas de IL-2 peguiladas e proteínas de fusão de muteína de IL-2 com Fc. Tais proteínas peguiladas podem ter meia-vida aumentada e/ou uma imunogenicidade reduzida sobre as proteínas não peguiladas.

Polinucleotídeos que codificam muteínas de IL-2 e proteínas de fusão de muteína de IL-2 com Fc

[0075] Incluídos no escopo da invenção são ácidos nucleicos que codificam as muteínas de IL-2 e proteínas de fusão de muteína de IL-2 com Fc. Alguns aspectos da invenção incluem variantes de polinucleotídeos (por exemplo, devido à degenerescência) que codificam as sequências de aminoácidos aqui descritas. Em modalidades preferenciais, o polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico isolado é um componente de uma proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc.

[0076] As sequências de nucleotídeos correspondendo às sequências de aminoácidos aqui descritas, para serem usadas como sondas ou iniciadores para o isolamento de ácidos nucleicos ou de sequências de consulta como para pesquisas de bancos de dados, podem ser obtidas por “tradução reversa” das sequências de aminoácidos. O procedimento bem conhecido de reação em cadeia da polimerase (PCR) pode ser empregado para isolar e amplificar uma sequência de DNA que codifica as muteínas de IL-2 e proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc. Os oligonucleotídeos que definem os terminais desejados da combinação de fragmentos de DNA são utilizados como iniciadores 5’ e 3’. Os oligonucleotídeos podem conter adicionalmente sítios de reconhecimento para endonucleases de restrição, para facilitar a inserção da combinação amplificada de fragmentos de DNA num vetor de expressão. As técnicas de PCR são descritas em Saiki et al., Science 239: 487 (1988); Recombinant DNA Methodology,Wu et al., eds, Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp 189-196; e PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et. al., eds., Academic Press, Inc. (1990).

[0077] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção incluem DNA e RNA, em ambas formas de cadeia simples e de cadeia dupla, bem como as sequências complementares correspondentes. Um “ácido nucleico isolado” é um ácido nucleico que foi separado a partir de sequências genéticas adjacentes presentes no genoma do organismo a partir do qual o ácido nucleico foi isolado, no caso de ácidos nucleicos isolados a partir de fontes que ocorrem naturalmente. No caso de ácidos nucleicos sintetizados enzimaticamente a partir de um molde ou quimicamente, tais como produtos de PCR, as moléculas de cDNA ou de oligonucleotídeos, por exemplo, entende-se que os ácidos nucleicos resultantes de tais processos são os ácidos nucleicos isolados. Uma molécula isolada de ácido nucleico refere-se a uma molécula de ácido nucleico sob a forma de um fragmento separado ou como um componente de um construto de ácido nucleico maior. Numa modalidade preferencial, os ácidos nucleicos são substancialmente livres de material contaminante endógeno. A molécula de ácido nucleico foi preferencialmente derivada a partir de DNA ou RNA isolado pelo menos uma vez numa forma substancialmente pura e numa quantidade ou concentração que permita a identificação, manipulação e recuperação das suas sequências nucleotídicas componentes por métodos bioquímicos padrão (tais como os descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Tais sequências são preferencialmente fornecidas e/ou construídas sob a forma de uma região de leitura aberta não interrompida por sequências internas não traduzidas, ou íntrons, que estão tipicamente presentes em genes eucarióticos. As sequências de DNA não traduzidas podem estar presentes em 5’ ou 3’ de uma região de leitura aberta, onde a mesma não interfere com a manipulação ou expressão da região de codificação.

[0078] As variantes de acordo com a invenção são comumente preparadas por mutagênese dirigida de nucleotídeos no DNA que codifica a muteína de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc, utilizando cassete ou PCR de mutagênese ou outras técnicas bem conhecidas na técnica, para produzir o DNA que codifica a variante, e posteriormente, expressando o DNA em cultura celular recombinante tal como aqui descrito. No entanto, as muteínas de IL-2 e fusão de muteína de IL-2 com Fc podem ser preparadas por síntese in vitro utilizando técnicas estabelecidas. As variantes exibem tipicamente a mesma atividade biológica qualitativa que o análogo de ocorrência natural, por exemplo, a expansão de Treg, embora variantes possam também ser selecionadas que têm características modificadas tal como será descrito mais detalhadamente infra.

[0079] Como será apreciado pelos especialistas na técnica, devido à degenerescência do código genético, um número extremamente grande de ácidos nucleicos pode ser feito, as quais codificam muteínas de IL-2 e proteínas de fusão de muteína de IL-2 com Fc da presente invenção. Assim, depois de ter identificado uma sequência de aminoácidos em particular, os especialistas na técnica podem fazer qualquer número de diferentes ácidos nucleicos,por simples modificação da sequência de um ou mais códons de um modo que não alteram a sequência de aminoácidos da proteína codificada.

[0080] A presente invenção também fornece sistemas de expressão e construtos na forma de plasmídeos, vetores de expressão ou transcrição, cassetes de expressão, que compreendem pelo menos um polinucleotídeo, como acima. Além disso, a invenção fornece células hospedeiras compreendendo tais sistemas de expressão ou construtos.

[0081] Tipicamente, os vetores de expressão utilizados em qualquer uma das células hospedeiras conterão sequências para a manutenção de plasmídeos e para a clonagem e expressão de sequências de nucleotídeos exógenos. Tais sequências, coletivamente referidas como “sequências flanqueadoras” em certas modalidades incluirão tipicamente uma ou mais das seguintes sequências de nucleotídeos: um promotor, uma ou mais sequências potencializadoras, uma origem de replicação, uma sequência de terminação transcricional, uma sequência de íntron completa contendo um sítio de splice doador e aceitador, uma sequência que codifica uma sequência líder para a secreção de polipeptídeo, um sítio de ligação ao ribossoma, uma sequência de poliadenilação, uma região poli-ligante para inserção do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo sendo expresso, e um elemento marcador selecionável. Cada uma destas sequências é discutida a seguir.

[0082] Opcionalmente, o vetor pode conter uma sequência codificando “marcador”, ou seja, uma molécula oligonucleotídica localizada na extremidade 5’ ou 3’ das sequências de codificação de muteínas de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc; a sequência oligonucleotídica que codifica poliHis (tal como hexaHis (SEQ ID NO: 21)), ou outro “marcador”, tal como FLAG, HA (vírus influenza hemaglutinina) ou myc, para os quais existem anticorpos comercialmente disponíveis. Este marcador é tipicamente fundido com o polipeptídeo após a expressão do polipeptídeo, e pode servir como um meio para a purificação por afinidade ou de detecção da muteína de IL-2 a partir da célula hospedeira. A purificação por afinidade pode ser conseguida, por exemplo, por cromatografia em coluna utilizando anticorpos contra o marcador como uma matriz de afinidade. Opcionalmente, a marcador pode ser subsequentemente removida das muteínas de IL-2 e proteínas de fusão de muteína de IL-2 com Fc purificados por vários meios tais como a utilização de determinadas peptidases para clivagem.

[0083] Sequências de flanqueamento podem ser homólogas (isto é, das mesmas espécies e/ou cepa como a célula hospedeira), heterólogas (isto é, a partir de outra espécie além das espécies célula hospedeira ou cepa), híbrida (isto é, uma combinação de sequências de flanqueamento a partir de mais do que uma fonte), sintética ou natural. Como tal, a fonte de uma sequência de flanqueamento pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado, ou qualquer planta, contanto que a sequência de flanqueamento seja funcional em, e possa ser ativada pela maquinaria da célula hospedeira.

[0084] As sequências de flanqueamento úteis nos vetores desta invenção podem ser obtidas por qualquer um de vários métodos bem conhecidos na técnica. Tipicamente, sequências de flanqueamento úteis para esta invenção terão sido previamente identificadas por mapeamento e/ou por digestão com endonuclease de restrição e podem assim ser isoladas da fonte de tecidos correta usando as endonucleases de restrição apropriadas. Em alguns casos, a sequência de nucleotídeo completa de uma sequência de flanqueamento pode ser conhecida. Aqui, a sequência de flanqueamento pode ser sintetizada utilizando os métodos aqui descritos para a síntese do ácido nucleico ou clonagem.

[0085] Se a totalidade ou apenas uma porção da sequência de flanqueamento for conhecida, esta pode ser obtida utilizando reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou por triagem de uma biblioteca genômica com uma sonda apropriada tal como um fragmento de oligonucleotídeo e/ou a sequência de flanqueamento da mesma ou de outra espécie. Onde a sequência de flanqueamento não é conhecida, um fragmento de DNA contendo uma sequência de flanqueamento pode ser isolada a partir de um pedaço maior de DNA que pode conter, por exemplo, uma sequência de codificação ou mesmo outro gene ou genes. O isolamento pode ser realizado por digestão de endonuclease de restrição para produzir o fragmento de DNA adequado, seguido por isolamento utilizando a purificação em cromatografia em coluna de gel de agarose, Qiagen* (Chatsworth, CA), ou outros métodos conhecidos dos especialistas na técnica. A seleção de enzimas apropriadas para alcançar este objetivo será facilmente aparente para um especialista na técnica.

[0086] Uma origem de replicação é normalmente uma parte desses vetores de expressão procarióticos adquiridos comercialmente, e os auxiliares de origem na amplificação do vetor numa célula hospedeira. Se o vetor de escolha não contém uma origem de sítio de replicação, pode ser sintetizado quimicamente com base numa sequência conhecida, e ligado no vetor. Por exemplo, a origem de replicação do plasmídeo pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) é apropriada para a maioria das bactérias Gram-negativas, e várias origens virais (por exemplo, SV40, polioma, adenovírus, vírus da estomatite vesicular (VSV), ou vírus do papiloma tal como HPV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamífero. Geralmente, a origem de componente de replicação não é necessária para vetores de expressão de mamíferos (por exemplo, a origem de SV40 é muitas vezes utilizada apenas porque contém também o vírus do promotor precoce).

[0087] Uma sequência de terminação da transcrição está tipicamente localizada 3’ para a extremidade de uma região de codificação de polipeptídeo e serve para terminar a transcrição. Normalmente, uma sequência de terminação da transcrição em células procarióticas é um fragmento rico em G-C, seguido por uma sequência poli-T. Embora a sequência seja facilmente clonada a partir de uma biblioteca ou mesmo adquirida comercialmente como parte de um vetor, também pode ser prontamente sintetizada utilizando métodos para a síntese de ácido nucleico, tais como aqueles aqui descritos.

[0088] Um gene marcador selecionável codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e crescimento de uma célula hospedeira cultivada num meio de cultura seletivo. Os genes marcadores de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, tetraciclina ou canamicina para células hospedeiras procarióticas; (b) complementam deficiências auxotróficas da célula; ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos ou definidos. Os marcadores específicos selecionáveis são o gene de resistência à canamicina, o gene de resistência à ampicilina, e o gene de resistência àtetraciclina. De um modo vantajoso, um gene de resistência à neomicina também pode ser utilizado para seleção em ambas as células hospedeiras procarióticas e eucarióticas.

[0089] Outros genes selecionáveis podem ser utilizados para amplificar o gene que será expresso. A amplificação é o processo em que os genes que são necessários para a produção de uma proteína crítica para o crescimento ou a sobrevivência das células são reiterados em tandem dentro dos cromossomas de gerações sucessivas de células recombinantes. Exemplos de marcadores selecionáveis apropriados para células de mamíferos incluem genes de di- hidrofolato redutase (DHFR) e timidina quinase sem promotor. Transformantes de células de mamífero são colocadas sob pressão de seleção em que apenas os transformantes estão unicamente adaptados para sobreviver em virtude do gene selecionável presente no vetor. A pressão de seleção é imposta através da cultura das células transformadas sob condições em que a concentração de agente de seleção no meio é sucessivamente aumentada, conduzindo assim à amplificação do gene selecionável e o DNA que codifica um outro gene, tal como uma muteína de IL -2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc. Como resultado, quantidades aumentadas de um polipeptídeo tal como uma muteína de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc são sintetizadas a partir do DNA de amplificado.

[0090] Um sítio de ligação ao ribossoma é geralmente necessário para a iniciação da tradução de mRNA e é caracterizado por uma sequência de Shine-Dalgarno (procariotas) ou uma sequência de Kozak (eucariotas). O elemento está tipicamente localizado 3’ em relação ao promotor e 5’ da sequência de codificação do polipeptídeo a ser expresso. Em certas modalidades, uma ou mais regiões de codificação pode ser ligada operacionalmente a um sítio de ligação ao ribossoma interno (IRES), permitindo a tradução das duas regiões de leitura abertas a partir de um único transcrito de RNA.

[0091] Em alguns casos, tais como onde a glicosilação é desejada num sistema de expressão de célula hospedeira eucariótica, pode-se manipular as várias pré ou pró- sequências para melhorar a glicosilação ou o rendimento. Por exemplo, pode-se alterar o sítio de clivagem da peptidase de um peptídeo de sinal em particular ou adicionar pró-sequências, que também podem afetar a glicosilação. O produto proteico final pode ter, na posição-1 (em relação ao primeiro aminoácido da proteína madura) um ou mais aminoácidos adicionais incidentes de expressão, que podem não ter sido totalmente removidos. Por exemplo, o produto proteico final pode ter um ou dois resíduos de aminoácidos encontrados no sítio de clivagem da peptidase, ligados ao terminal amino. Alternativamente, a utilização de alguns sítios de clivagem de enzima pode resultar numa forma ligeiramente truncada do polipeptídeo desejado, se a enzima corta em tal área dentro do polipeptídeo maduro.

[0092] Vetores de clonagem e de expressão da invenção irão conter tipicamente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e operativamente ligado à molécula que codifica a proteína de fusão de IL-2 da muteína com Fc ou muteína de IL-2. Os promotores são sequências não transcritas localizadas a montante (isto é, 5’) do códon de iniciação de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 pb) que controlam a transcrição do gene estrutural. Os promotores são agrupados convencionalmente numa de duas classes: promotores induzíveis e promotores constitutivos. Os promotores induzíveis iniciam níveis aumentados de transcrição do DNA sob o seu controle em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, tais como a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura. Os promotores constitutivos, por outro lado, uniformemente transcrevem genes aos quais estão operacionalmente ligados, isto é, com pouco ou nenhum controle sobre a expressão do gene. Um grande número de promotores, reconhecido por uma variedade de potenciais células hospedeiras, são bem conhecidos.

[0093] Os promotores adequados para utilização com hospedeiros de levedura são bem conhecidos na técnica. Estimuladores de levedura são vantajosamente utilizados com promotores de levedura. Os promotores adequados para utilização com células hospedeiras de mamífero são bem conhecidos e incluem, entre outros, aqueles obtidos a partir dos genomas de vírus tais como vírus de polioma, poxvírus de aves, adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e mais preferencialmente Vírus Símio 40 (SV40). Outros promotores de mamíferos adequados incluem promotores de mamífero heterólogos, por exemplo, promotores do choque térmico e o promotor da actina.

[0094] Os promotores adicionais que podem ser de interesse incluem, entre outros: promotor precoce de SV40 (Benoist e Chambon, 1981, Nature 290: 304-310); promotor de CMV (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81: 659-663); o promotor contido na repetição terminal 3' longa do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797); promotor de herpes timidina quinase (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 78: 1444-1445); promotor e as sequências reguladoras do gene da metalotionina (Prinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); e promotores procarióticos tais como o promotor da beta-lactamase (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727-3731); ou o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 80: 21-25). Também de interesse são as seguintes regiões de controle transcricional de animais, que exibem especificidade do tecido e têm sido utilizadas em animais transgênicos: região de controle do gene da elastase I que é ativa em células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); região de controle do gene da insulina que é ativa em células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122); região de controle do gene da imunoglobulina que é ativa em células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444); região de controle do vírus do tumor mamário de camundongos que é ativa em células testiculares, da mama, linfoides e mastócitos (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495); região de controle do gene da albumina que é ativa no fígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); região de controle de proteína alfa-feto que é ativa no fígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); região de controle de gene alfa-1-antitripsina que é ativa no fígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel: 161-171); a região de controle do gene da beta-globina que está ativa nas células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); a região de controle do gene da proteína básica de mielina que é ativa em células de oligodendrócitos no cérebro (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); região de controle do gene da cadeia leve 2 da miosina que está ativa no músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314: 283-286); e a região de controle do gene de hormônio de liberação gonadotrópica que é ativa controle no hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378).

[0095] Uma sequência potencializadora pode ser introduzida no vetor para aumentar a transcrição por eucariotas superiores. Os potencializadores são elementos cis-atuantes de DNA, normalmente cerca de 10-300 pb de comprimento, que atuam no promotor para aumentar a transcrição. Os estimuladores são de orientação e posição relativamente independentes, tendo sido encontrados em posições tanto a 5’ e 3’ em relação à unidade de transcrição. Várias sequências potencializadoras disponíveis a partir de genes de mamífero são conhecidas (por exemplo, globina, elastase, albumina, alfa-feto- proteína e insulina). Tipicamente, no entanto, um potencializador de um vírus é utilizado. O potencializador SV40, o promotor precoce de citomegalovírus, o potencializador de polioma, adenovírus e potencializadores conhecidos na técnica, são elementos potencializadores exemplares para a ativação de promotores eucarióticos. Enquanto um potencializador pode ser posicionado no vetor, 5’ ou 3’ a uma sequência de codificação, que está normalmente localizada num sítio a 5’ do promotor. Uma sequência que codifica uma sequência de sinal nativo ou heterólogo apropriada (sequência líder ou peptídeo de sinal) pode ser incorporada num vetor de expressão, para promover a secreção extracelular da muteína de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc. A escolha do peptídeo sinal ou líder depende do tipo de células hospedeiras nas quais a proteína está sendo produzida, e uma sequência de sinal heteróloga pode substituir a sequência de sinal nativa. Exemplos de peptídeos de sinal que são funcionais em células hospedeiras de mamífero incluem o seguinte: a sequência sinal para interleucina-7 (IL-7) descrita na Patente US No. 4.965.195; a sequência sinal para o receptor de interleucina-2 descrita em Cosman et al., 1984, Nature 312: 768; o peptídeo de sinal da interleucina-4 descrito na patente de receptor de EP No. 0367 566; peptídeo de sinal de receptor de interleucina-1 tipo I descrito na patente US No. 4.968.607; peptídeo de sinal do receptor da interleucina-1 do tipo II descrito na Patente EP 0 460 846.

[0096] O vetor pode conter um ou mais elementos que facilitam a expressão em que o vetor é integrado no genoma da célula hospedeira. Exemplos incluem um elemento EASE (Aldrich et al 2003 Biotechnol Prog 19: 1433-38) e uma região de ligação à matriz (MAR). MARs medeiam a organização estrutural da cromatina e podem isolar o vetor integrado de efeito “posição”. Assim, MARs são particularmente úteis quando o vetor é utilizado para criar transfectantes estáveis. Um número de MAR naturais e sintéticas contendo ácidos nucleicos são conhecidas na técnica, por exemplo, Patentes US 6.239.328; 7.326.567; 6.177.612; 6.388.066; 6.245.974; 7.259.010; 6.037.525; 7.422.874; 7.129.062.

[0097] Os vetores de expressão da invenção podem ser construídos a partir de um vetor de partida tal como um vetor disponível comercialmente. Tais vetores podem ou não conter todas as sequências de flanqueamento desejadas. Onde uma ou mais das sequências de flanqueamento aqui descritas não estão já presentes no vetor, que pode ser obtido e ligado no vetor individualmente. Os métodos utilizados para a obtenção de cada uma das sequências de flanqueamento são bem conhecidos de um especialista na técnica.

[0098] Depois de o vetor ter sido construído e uma molécula de ácido nucleico que codifica uma IL-2 ou muteína de proteína de fusão da muteína de IL-2 com Fc ter sido inserido no sítio adequado do vetor, o vetor completo pode ser inserido numa célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão do polipeptídeo. A transformação de um vetor de expressão numa célula hospedeira selecionada pode ser conseguida por métodos bem conhecidos, incluindo transfecção, infecção, fosfato de cálcio co-precipitação, eletroporação, microinjeção, lipofecção, transfecção mediada por DEAE-dextrano, ou outras técnicas conhecidas. O método selecionado será em parte uma função do tipo de célula hospedeira sendo utilizada. Estes métodos e outros métodos adequados são bem conhecidos dos especialistas na técnica, e são apresentados, por exemplo, em Sambrook et al., 2001, supra.

[0099] A célula hospedeira, quando cultivada sob condições adequadas, sintetiza um polipeptídeo muteína de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc que pode ser subsequentemente coletado a partir do meio de cultura (se a célula hospedeira secreta para o meio) ou diretamente a partir da célula hospedeira que a produz (se não é secretada). A seleção de uma célula hospedeira apropriada dependerá de vários fatores, tais como os níveis de expressão desejados, as modificações polipeptídicas que são desejáveis ou necessários para a atividade (tal como a glicosilação ou a fosforilação) e a facilidade de dobragem numa molécula biologicamente ativa. Uma célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica.

[00100] As linhagens celulares de mamífero disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidos na técnica e incluem, entre outras, linhagens celulares imortalizadas, disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC) e todas as linhagens celulares utilizadas num sistema de expressão conhecido na técnica podem ser usadas para preparar os polipeptídeos recombinantes da presente invenção. Em geral, as células hospedeiras são transformadas com um vetor de expressão recombinante que compreende DNA que codifica uma muteína da IL-2 ou fusão de muteína de IL-2 com Fc desejada. Entre as células hospedeiras que podem ser empregadas são procariotas, leveduras ou células eucarióticas superiores. Os procariotas incluem organismos Gram-negativos ou Gram- positivos, por exemplo E. coli ou bacilos. As células eucarióticas superiores incluem células de inseto e linhagens celulares estabelecidas de origem mamífera.Exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamífero adequadas incluem a linhagem celular de rim de macaco COS-7 (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23: 175), células L, células 293, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovário de hamster chinês (células CHO), ou os seus derivados, tais como Veggie CHO e linhagens celulares relacionadas de e que crescem em meio isento de soro (Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31), células HeLa, linhagens celulares BHK (ATCC CRL 10), e a linhagem celular CVI/EBNA derivada da linhagem celular de rim de macaco verde Africano CVI (ATCC CCL 70) como descrito por McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821, células de rim embrionário humano tal como 293, 293 EBNA ou MSR 293, células epidérmicas humanas A431, células humanas Colo205, outras linhagens celulares de primatas transformadas, células diploides normais, cepas celulares derivadas da cultura in vitro de tecido primário, explantes primários, HL-60, U937, células HaK ou de Jurkat.Opcionalmente, as linhagens celulares de mamífero, tais como HepG2/3B, KB, NIH 3T3 ou S49, por exemplo, podem ser usadas para a expressão do polipeptídeo, quando é desejável utilizar o polipeptídeo em vários ensaios de transdução de sinal ou repórter.

[00101] Em alternativa, é possível produzir o polipeptídeo em eucariotas inferiores tais como leveduras ou em procariotas tais como bactérias. Leveduras adequadas incluem Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces, Candida, ou qualquer cepa de levedura capaz de expressar polipeptídeos heterólogos. Cepas bacterianas adequadas incluem Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ou qualquer cepa bacteriana capaz de expressar polipeptídeos heterólogos. Se o polipeptídeo é preparado em leveduras ou bactérias, pode ser desejável modificar o polipeptídeo nelas produzido, por exemplo, por fosforilação ou glicosilação dos sítios adequados, a fim de se obter o polipeptídeo funcional. Tais ligações covalentes podem ser realizadas usando métodos enzimáticos ou químicos conhecidos.

[00102] O polipeptídeo pode também ser produzido ligando operacionalmente o ácido nucleico isolado da invenção às sequências de controle adequadas num ou mais vetores de expressão de insetos e empregando um sistema de expressão de inseto. Materiais e métodos para sistemas de expressão de células de baculovírus/inseto estão disponíveis comercialmente em forma de kit a partir de, por exemplo, Invitrogen, San Diego, Calif., EUA (o kit MaxBac®), e tais métodos são bem conhecidos na técnica, tal como descrito em Summers e Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), e Luckow e Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Os sistemas de tradução de células também poderiam ser empregados para produzir polipeptídeos utilizando RNAs derivados de construtos de ácido nucleico aqui divulgados. Os vetores de clonagem e expressão apropriados para utilizar com bactérias, fungos, leveduras e mamíferos hospedeiros celulares são descritos por Pouwels et al. (Cloning Vetors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985). Uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico isolado da invenção, preferencialmente, operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência de controle de expressão, é uma “célula hospedeira recombinante”.

[00103] Em certos aspectos, a invenção inclui um ácido nucleico isolado que codifica uma muteína de IL-2 humana que estimula preferencialmente células T reguladoras e compreende substituição V91K e uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. O ácido nucleico isolado pode codificar qualquer um dos exemplares de muteínas de IL-2 aqui fornecidos.

[00104] Também estão incluídos ácidos nucleicos isolados que codificam qualquer uma das proteínas de fusão de muteína de IL-2 com Fc exemplares aqui descritos. Em modalidades preferenciais, a porção Fc de um anticorpo e a muteína de IL-2 humana são codificados dentro de uma única região de leitura aberta, opcionalmente com um ligante, codificados entre a região Fc e a muteína de IL-2.

[00105] Em outro aspecto, são aqui fornecidos vetores de expressão compreendendo a muteína de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc que codificam os ácidos nucleicos acima operacionalmente ligados a um promotor.

[00106] Em outro aspecto, são aqui fornecidas células hospedeiras que compreendem os ácidos nucleicos isolados que codificam muteínas de IL-2 ou proteínas de fusão de muteína de IL-2 com Fc acima. A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como E. coli, ou pode ser uma célula eucariótica, tal como uma célula de mamífero. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO).

[00107] Em outro aspecto, são fornecidos aqui métodos para produzir uma muteína de IL-2 humana. Os métodos compreendem a cultura de uma célula hospedeira sob condições em que um promotor ligado operacionalmente a uma muteína de IL-2 humana é expresso. Subsequentemente, a muteína de IL-2 humana é colhida a partir da referida cultura. A muteína da IL-2 pode ser colhida a partir dos meios de cultura e/ou de lisados de células hospedeiras.

[00108] Em outro aspecto, são fornecidos aqui métodos para produzir uma proteína de fusão muteína de IL-2 com Fc humana. Os métodos compreendem a cultura de uma célula hospedeira sob condições em que um promotor ligado operacionalmente a uma proteína de fusão de muteína de IL-2 humana com Fc é expressa. Subsequentemente, a proteína de fusão da muteína de IL-2 com Fc humana é colhida a partir da referida cultura. A proteína de fusão da muteína de IL-2 com Fc humana pode ser colhida a partir dos meios de cultura e/ou de lisados de células hospedeiras.

Composições Farmacêuticas

[00109] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um muteína de IL-2 em conjunto com um diluente farmaceuticamente eficaz, transportador, solubilizante, emulsionante, conservante e/ou adjuvante. Em certas modalidades, a muteína de IL-2 está dentro do contexto de uma proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc. As composições farmacêuticas da invenção incluem, entre outras, composições líquidas, congeladas, e liofilizadas.

[00110] Preferencialmente, materiais de formulação aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas. Em modalidades específicas, as composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um muteína de IL-2 contendo molécula terapêutica, por exemplo, uma fusão de muteína de IL-2 com Fc, são fornecidos.

[00111] Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou de liberação, adsorção ou penetração da composição. Em tais modalidades, os materiais de formulação adequados incluem, entre outros, aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina, prolina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogeno-sulfito de sódio); tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes de volume (tais como manitol ou glicina); agentes quelantes (tais como ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA)); agentes de complexação (tais como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); enchimentos; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (tais como glicose, manose ou dextrinas); proteínas (tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas); corantes, aromatizantes e agentes de diluição; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (tais como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; contra-íons formadores de sais (tais como sódio); conservantes (tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (tais como glicerina, propileno glicol ou polietileno glicol); álcoois de açúcares (tais como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; surfactantes ou agentes umectantes (tais como Pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos, tais como polissorbato 20, polissorbato, Triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes que melhoram a estabilidade (tais como sacarose ou sorbitol); agentes que melhoram a tonicidade (tais como halogenetos de metais alcalinos, preferencialmente cloreto de sódio ou potássio, manitol sorbitol); veículos de liberação; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Ver, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edição, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

[00112] Em certas modalidades, a composição farmacêutica ideal será determinada por um especialista na técnica dependendo de, por exemplo, a via de administração, formato de liberação e dosagem desejados. Ver, por exemplo, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. Em certas modalidades, estas composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de depuração in vivo das proteínas de ligação ao antígeno da invenção. Em certas modalidades, o veículo ou transportador primário numa composição farmacêutica pode ser aquoso ou não aquoso na natureza. Por exemplo, um veículo ou transportador adequado pode ser água para injeção, solução salina fisiológica ou fluido cerebrospinal artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. Salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina do soro são os veículos mais exemplares. Em modalidades específicas, as composições farmacêuticas compreendem tampão Tris de cerca de pH 7,0-8,5, ou tampão acetato de cerca de pH 4,0-5,5, e pode ainda incluir sorbitol ou um substituto adequado. Em certas modalidades da invenção, as composições de muteína de IL-2 podem ser preparadas para armazenamento misturando a composição selecionada possuindo o grau desejado de pureza com agentes de formulação opcionais (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) sob a forma de um bolo liofilizado ou uma solução aquosa. Além disso, em certas modalidades, o produto da muteína de IL-2 pode ser formulado como um liofilizado utilizando excipientes apropriados tais como sacarose.

[00113] As composições farmacêuticas da invenção podem ser selecionadas para liberação parenteral. Alternativamente, as composições podem ser selecionadas para inalação ou para liberação através do aparelho digestivo, tal como oralmente. A preparação de tais composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro da especialidade da técnica. Os componentes da formulação estão presentes preferencialmente em concentrações que sejam aceitáveis para o local de administração. Em certas modalidades, os tampões são utilizados para manter a composição ao pH fisiológico ou a um pH ligeiramente mais baixo, tipicamente dentro de uma faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8.

[00114] Quando é contemplada a administração parenteral, as composições terapêuticas para utilização nesta invenção podem ser fornecidas sob a forma de uma solução aquosa por via parenteral aceitável, isenta de pirogênio, compreendendo a composição de muteína de IL-2 desejada num veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para injeção parenteral é água destilada estéril em que a composição de muteína de IL-2 é formulada como uma solução isotônica estéril, adequadamente conservada. Em certas modalidades, a preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tal como microesferas injetáveis, partículas bio-erodíveis, compostos poliméricos (tais como ácido poliláctico ou ácido poliglicólico), esferas ou lipossomas, que podem fornecer a liberação controlada ou sustentada do produto, que pode ser entregada por meio de injeção de depósito. Em certas modalidades, o ácido hialurônico pode também ser utilizada, tendo o efeito de promover a duração sustentada na circulação. Em certas modalidades, os dispositivos de liberação de drogas implantáveis podem ser utilizados para introduzir a composição da muteína de IL-2.

[00115] As composições farmacêuticas adicionais serão evidentes para os especialistas na técnica, incluindo formulações que envolvem composições de muteína de IL-2 em formulações de liberação sustentada ou controlada. As técnicas para formulação de uma variedade de outros meios de liberação sustentada ou controlada, tais como transportadores, lipossomas, microparticulas bioerodíveis ou esferas porosas e injeções de depósito, são também conhecidos para os especialistas na técnica. Ver, por exemplo, Pedido de Patente Internacional No.PCT/US93/00829, que é aqui incorporado por referência e descreve liberação de micropartículas poliméricas porosas para a liberação controlada de composições farmacêuticas. Preparações de liberação sustentada podem incluir matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos formados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. As matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactidos (como divulgado na Patente US 3.773.919 e Publicação do Pedido de Patente Europeia EP 058,481, cada uma das quais é aqui incorporada por referência), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2: 547-556), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., 1981, J. Biomed Mater Res 15: 167-277 e Langer, 1982, Chem Tech. 12:98105), etileno vinil acetato (Langer et al., 1981, supra) ou ácido poli-D(-)- 3-hidroxibutírico ácido (Publicação do Pedido de Patente Europeia No. EP 133.988). Composições de liberação sustentada também podem incluir lipossomas que podem ser preparados por qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-3692;Publicação dos Pedidos de Patente Europeia EP Nos. 036.676;EP 088.046 e EP 143.949, aqui incorporada por referência.

[00116] As composições farmacêuticas utilizadas para administração in vivo são tipicamente fornecidas como preparações estéreis. A esterilização pode ser conseguida por filtração através de membranas de filtração estéreis. Quando a composição é liofilizada, a esterilização utilizando este método pode ser realizada antes ou após liofilização e reconstituição. As composições para administração parenteral podem ser armazenadas sob a forma liofilizada ou em solução. As composições parenterais são geralmente colocadas num recipiente possuindo uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa de solução intravenosa ou frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.

[00117] Alguns aspectos da invenção incluem formulações de muteína de IL-2 autotamponantes, que podem ser utilizadas na forma de composições farmacêuticas, tal como descrito no pedido de patente internacional WO 06138181A2 (PCT/US2006/022599), que é aqui incorporado por referência na sua totalidade neste documento.

[00118] Como discutido acima, certas modalidades fornecem composições farmacêuticas de muteína de IL-2, em particular as proteínas de fusão de muteína IL-2 com Fc, que compreendem, em adição à composição de muteína de IL-2, um ou mais excipientes, tais como aqueles descritos ilustrativamente e nesta secção em outras partes deste documento. Os excipientes podem ser usados na presente invenção, neste contexto, uma vasta variedade de fins, como os ajustes físicos, químicos, ou as propriedades biológicas de formulações, tais como o ajuste de viscosidade, e ou os processos da presente invenção para melhorar a eficácia e ou para estabilizar tais formulações e processos contra a degradação e deterioração devido a, por exemplo, estresses que ocorrem durante a fabricação, o transporte, o armazenamento, preparação pré-uso, administração, e daí em diante.

[00119] Uma variedade de exposições está disponível sobre a estabilização de formulações de proteína e materiais e métodos úteis para este propósito, tais como Arakawa et al., “Solvent interactions in pharmaceutical formulations”, Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al, “Physical stabilization of proteins in aqueous solution”, em: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), e Randolph et al., “Surfactant-protein interactions”, Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002), cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade, particularmente em partes pertinentes para os excipientes e os processos do mesmo para formulações de proteína autotamponantes em conformidade com a invenção, especialmente produtos de proteína farmacêutica e processos para utilizações médicas veterinária e/ou humanas.

[00120] Os sais podem ser utilizados de acordo com certas modalidades da invenção, por exemplo, ajustar a força iônica e/ou a isotonicidade de uma formulação e/ou para melhorar a solubilidade e/ou estabilidade física de uma proteína ou outro ingrediente de uma composição de acordo com a invenção.

[00121] Como é bem conhecido, os íons podem estabilizar o estado nativo de proteínas ligando-se aos resíduos carregados na superfície da proteína e protegendo grupos carregados e polares na proteína e reduzir a força das suas interações eletrostáticas, interações atrativas e repulsivas. Os íons também podem estabilizar o estado desnaturado da proteína através da ligação a, em particular, as ligações peptídicas desnaturadas (--CONH) da proteína. Além disso, a interação iônica com grupos carregados e polares numa proteína também pode reduzir as interações eletrostáticas intermoleculares e, assim, evitar ou reduzir a agregação da proteína e a insolubilidade.

[00122] Espécies iônicas diferem significativamente nos seus efeitos sobre as proteínas. Um certo número de rankings categóricos de íons e os seus efeitos nas proteínas foi desenvolvido que podem ser usados na formulação de composições farmacêuticas de acordo com a invenção. Um exemplo é a série de Hofmeister, que classifica os solutos não iônicos polares iônicos e pelo seu efeito sobre a estabilidade conformacional de proteínas em solução. Solutos estabilizantes são referidos como “cosmotrópicos”. Solutos desestabilizadores são referidos como “caotrópico.” Cosmotrópos geralmente são utilizados em concentrações elevadas (por exemplo, > 1 molar de sulfato de amônio) para precipitar proteínas a partir da solução (“salting-out”). Agentes caotrópicos são utilizados geralmente para desnaturar e/ou solubilizar as proteínas (“salting-in”). A eficácia relativa dos íons de “sal-in” e “sal-out” define a sua posição na série de Hofmeister.

[00123] Os aminoácidos livres podem ser usados na produção de formulações de muteína de IL-2 de acordo com várias modalidades da invenção como agentes de enchimento, estabilizadores e antioxidantes, assim como outros usos convencionais. Lisina, prolina, serina, alanina e podem ser utilizados para estabilizar proteínas em uma formulação. A glicina é útil na liofilização para garantir estrutura de bolo correta e propriedades. A arginina pode ser útil para inibir a agregação de proteínas, em ambas as formulações líquidas e liofilizadas. A metionina é útil como antioxidante.

[00124] Os polióis incluem açúcares, por exemplo, manitol, sacarose e sorbitol e álcoois poli-hídricos tais como, por exemplo, glicerol e propileno glicol, e, para efeitos da presente discussão, polietileno glicol (PEG) e substâncias relacionadas. Os polióis são cosmotrópicos. Eles são úteis em ambos os agentes de estabilização de formulações líquidas e liofilizados para proteger as proteínas a partir de processos de degradação física e química. Os polióis também são úteis para ajustar a tonicidade das formulações.

[00125] Entre os polióis úteis em algumas modalidades da invenção é o manitol, comumente usados para assegurar a estabilidade estrutural do bolo em formulações liofilizadas. Ele garante a estabilidade estrutural para o bolo. Ele é geralmente utilizado com um lioprotetor, por exemplo, sacarose. Sorbitol e sacarose estão entre os agentes preferenciais para ajustar a tonicidade e como estabilizadores para proteger contra estresses de congelamento e descongelamento durante o transporte ou a preparação de granéis durante o processo de fabricação. Os açúcares redutores (que contêm grupos aldeído ou cetona) livres, tais como a glicose e a lactose, podem glicar a resíduos de lisina e arginina na superfície. Por conseguinte, eles não são geralmente entre polióis preferenciais para uso de acordo com a invenção. Além disso, açúcares que formam tais espécies reativas, tais como a sacarose, que é hidrolisada para frutose e glicose em condições ácidas, e, consequentemente, gera glicação, também não se encontra entre os polióis preferenciais da invenção a este respeito. PEG é útil para estabilizar proteínas e como um crioprotetor e pode ser utilizado na presente invenção a este respeito.

[00126] Modalidades das formulações de muteína de IL-2 ainda compreendem surfactantes. As moléculas de proteína podem ser susceptíveis à adsorção sobre as superfícies e à desnaturação e a consequente agregação em interfaces ar- líquido, líquido-sólido, e líquido-líquido. Estes efeitos, geralmente escalam inversamente com a concentração de proteína. Estas interações prejudiciais geralmente escalam inversamente com a concentração de proteína e, normalmente, são exacerbados por agitação física, tal como a gerado durante a expedição e manuseamento de um produto.

[00127] Os surfactantes são utilizados rotineiramente para prevenir, minimizar ou reduzir a adsorção superficial. Os surfactantes úteis na presente invenção a este respeito incluem polissorbato 20, polissorbato 80, outros ésteres de ácidos graxos de sorbitano polietoxilados, e poloxâmero 188.

[00128] Os surfactantes também são comumente utilizados para controlar estabilidade conformacional da proteína. O uso de surfactantes neste contexto é específico para a proteína, uma vez que qualquer surfactante tipicamente irá estabilizar algumas proteínas e desestabilizar outras.

[00129] Os polissorbatos são susceptíveis de degradação oxidativa e, muitas vezes, tal como é fornecido, contêm quantidades suficientes de peróxidos para causar oxidação de cadeias laterais de resíduos de proteína, especialmente metionina. Consequentemente, polissorbatos devem ser usados com cuidado, e quando usados, devem ser empregados na sua concentração eficaz mais baixa. A este respeito, polissorbatos exemplificam a regra geral de que os excipientes devem ser usados nas suas concentrações eficazes mais baixas.

[00130] Modalidades das formulações de muteína de IL-2 ainda compreendem um ou mais antioxidantes. Em certa medida a oxidação prejudicial de proteínas pode ser evitada em formulações farmacêuticas através da manutenção de níveis adequados de oxigênio e a temperatura ambiente e evitando a exposição à luz. Excipientes antioxidantes podem ser utilizados, assim como para prevenir a degradação oxidativa de proteínas. Entre antioxidantes úteis a este respeito são agentes de redução, limpadores de oxigênio/radicais livres, e agentes quelantes. Os antioxidantes para uso em formulações de proteínas terapêuticas de acordo com a invenção são preferencialmente solúveis em água e mantêm a sua atividade durante a vida de prateleira de um produto. O EDTA é um antioxidante preferencial, de acordo com a invenção a este respeito.

[00131] Os antioxidantes podem danificar proteínas. Por exemplo, os agentes redutores, tais como a glutationa, em particular, podem perturbar as ligações dissulfeto intramoleculares. Assim, antioxidantes para uso na invenção são selecionados para, entre outras coisas, suficientemente eliminar ou reduzir a possibilidade de danificar as proteínas na formulação.

[00132] As formulações de acordo com a invenção podem incluir íons de metais que são cofatores de proteínas e que são necessários para formar complexos de coordenação de proteína, tais como o zinco necessário para formar algumas suspensões de insulina. Os íons metálicos também podem inibir alguns processos que degradam proteínas. No entanto, os íons metálicos também catalisar processos físicos e químicos que degradam proteínas.

[00133] Íons de magnésio (10-120 mM) podem ser utilizados para inibir a isomerização de ácido aspártico para ácido isoaspártico. Os íons Ca+2 (até 100 mM) pode aumentar a estabilidade da desoxirribonuclease humana. Mg+2, Mn+2 e Zn+2, no entanto, pode desestabilizar rhDNase. Da mesma forma, Ca+2 e Sr+2 podem estabilizar o Fator VIII, que pode ser desestabilizado por Mg+2, Mn+2 e Zn+2, Cu+2 e Fe+2, e a sua agregação pode ser aumentada por íons Al+3.

[00134] Modalidades de formulações da muteína de IL-2 compreendem ainda um ou mais conservantes. Os conservantes são necessários durante o desenvolvimento de formulações multidose parenterais que envolvem mais do que uma extração a partir do mesmo recipiente. A sua função principal é o de inibir o crescimento microbiano e assegurar a esterilidade do produto durante todo o período de vida útil ou a duração de utilização do medicamento. Conservantes normalmente utilizados incluem álcool benzílico, fenol e m-cresol. Embora conservantes tenham uma longa história de uso com parenterais de pequenas moléculas, o desenvolvimento de formulações de proteínas que inclui conservantes pode ser um desafio. Conservantes quase sempre têm um efeito desestabilizador (agregação) em proteínas, e este tornou-se um fator importante em limitar a sua utilização em formulações de proteínas de multidose. Até o momento, a maioria das drogas proteicas têm sido formuladas para uma única utilização. No entanto, quando são possíveis formulações de doses múltiplas, que têm a vantagem adicional de permitir a conveniência do paciente e comercialização aumentada. Um bom exemplo é o de hormônio do crescimento humano (hGH), onde o desenvolvimento de formulações conservadas conduziu à comercialização de mais apresentações convenientes, multiuso em caneta de injeção. Pelo menos quatro desses dispositivos em caneta contendo formulações preservadas de hGH estão disponíveis atualmente no mercado. Norditropin (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ (líquido, Genentech) & Genotropin (cartucho de câmara dupla liofilizado, Pharmacia & Upjohn) contêm fenol enquanto Somatrope (Eli Lilly) é formulado com m-cresol.

[00135] Vários aspectos devem ser considerados na formulação e desenvolvimento de formas de dosagem preservadas. A concentração de conservante eficazes na droga tem que ser otimizada. Isto requer um testando um determinado conservante na forma de dosagem com as gamas de concentrações que conferem a eficácia antimicrobiana sem comprometer a estabilidade da proteína.

[00136] Como seria de esperar, o desenvolvimento de formulações líquidas contendo conservantes é mais desafiador do que formulações liofilizadas. Produtos liofilizados podem ser liofilizados, sem conservante e reconstituídos com um diluente contendo conservante no momento da utilização. Isto encurta o tempo para o qual um conservante está em contato com a proteína, reduzindo significativamente os riscos de estabilidade associados. Com formulações líquidas, eficácia de conservação e da estabilidade devem ser mantidas ao longo de todo o produto de vida útil (cerca de 18 a 24 meses). Um ponto importante a notar é que a eficácia de conservação deve ser demonstrada na formulação final contendo a droga ativa e todos os componentes do excipiente.

[00137] As formulações de muteína de IL-2 serão geralmente projetadas para rotas específicas e métodos de administração, para dosagens de administração específicas e frequências de administração, para tratamentos específicos de doenças específicas, com intervalos de biodisponibilidade e persistência, entre outras coisas. As formulações podem assim ser concebidas de acordo com a invenção para liberação por qualquer via adequada, incluindo, entre outras, a via oral, auricular, oftálmica, retal e vaginal, e por via parenteral, incluindo injeção intravenosa e intra-arterial, injeção intramuscular, e injeção subcutânea.

[00138] Uma vez que a composição farmacêutica foi formulada, pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, cristalino, ou como um pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas numa forma pronta para utilização ou numa forma (por exemplo, liofilizada) que é reconstituída antes da administração. A invenção também fornece kits para produzir uma unidade de administração de dose única. Os kits da invenção podem cada um conter um primeiro recipiente com uma proteína seca e um segundo recipiente que contém uma formulação aquosa. Em certas modalidades da presente invenção, kits contendo seringas preenchidas e de câmaras múltiplas (por exemplo, seringas de líquidos e lio- seringas) são fornecidos.

[00139] A quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de composição farmacêutica de contendo a muteína de IL-2 sendo empregada dependerá, por exemplo, do contexto e objetivos terapêuticos. Um especialista na técnica apreciará que os níveis de dosagem adequados para o tratamento irão variar, dependendo, em parte, da molécula liberada, a indicação para a qual a muteína de IL-2 está sendo utilizado, a via de administração, e o tamanho (peso corporal, superfície do corpo ou tamanho do órgão) e/ou condição (a idade e estado geral de saúde) do paciente. Em certas modalidades, o clínico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ideal. Uma dosagem típica pode variar entre cerca de 0,1 μg/kg até cerca de 1 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Em modalidades específicas, a dosagem pode variar de 0,5 μg/kg até cerca de 100 μg/kg, opcionalmente desde 2,5 μg/kg até cerca de 50 μg/kg.

[00140] Uma quantidade terapêutica eficaz de uma muteína de IL-2 preferencialmente resulta numa diminuição na gravidade dos sintomas da doença, num aumento da frequência ou duração de períodos livres de sintomas da doença, ou na prevenção de uma deficiência ou incapacidade devido à aflição da doença.

[00141] As composições farmacêuticas podem ser administradas utilizando um dispositivo médico. Exemplos de dispositivos médicos para a administração de composições farmacêuticas encontram-se descritos nas Patentes US 4.475.196; 4.439.196; 4.447.224; 4.447.233; 4.486.194; 4.487.603; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 5.064.413; 5.312.335; 5.312.335; 5.383.851; e 5.399.163, todas aqui incorporadas por referência.

Métodos para o tratamento de distúrbios inflamatórias ou autoimunes

[00142] Em certas modalidades, uma muteína de IL-2 da presente invenção é utilizada para tratar um distúrbio autoimune ou inflamatória. Em modalidades preferenciais, uma proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc é usada.

[00143] Os distúrbios que são particularmente sensíveis ao tratamento com muteína de IL-2 aqui divulgados incluem, entre outros, inflamação, doença autoimunes, doenças atópicas, doenças autoimunes paraneoplásicos, inflamação da cartilagem, artrite, artrite reumatoide, artrite juvenil, artrite reumatoide juvenil, artrite reumatoide juvenil pauciarticular, artrite reumatoide juvenil poliarticular, artrite reumatoide juvenil de início sistêmico, espondilite anquilosante juvenil, artrite juvenil enteropática, artrite juvenil reativa, síndrome de Eiter juvenil, Síndrome SEA (Soronegatividade, Entesopatia, Síndrome artropatia), dermatomiosite juvenil, artrite psoriática juvenil, esclerodermia juvenil, lúpus eritematoso sistêmico, vasculite juvenil, artrite reumatoide pauciarticular, artrite reumatoide poliarticular, artrite reumatoide de início sistêmico, espondilite anquilosante, artrite enteropática, artrite reativa, síndroma de Reiter, Síndrome SEA (Soronegatividade, Entesopatia, Síndrome artropatia), dermatomiosite, artrite psoriática, escleroderma, vasculite, miolite, polimiolite, dermatomiolite, poliarterite nodosa, granulomatose de Wegener, arterite, polimialgiareumática, sarcoidose, esclerose, esclerose biliar primária, colangite esclerosante, síndrome de Sjogren, psoríase, psoríase em placas, psoríase gutata, psoríase inversa, psoríase pustular, psoríase eritrodérmica, dermatite, dermatite atópica, aterosclerose, lúpus, doença de Still, Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES), miastenia gravis, doença inflamatória do intestino (DII), doença de Crohn, colite ulcerativa, doença celíaca, esclerose múltipla (MS), asma, DPOC, rinossinusite, rinossinusite com pólipos, esofagite eosinofílica,bronquite eosinofílica, doença de Guillain-Barre, diabetes mellitus tipo I, tireoidite (por exemplo, doença de Graves), doença de Addison, fenômeno de Raynaud, hepatite autoimune, GVHD, rejeição de transplante, lesão renal, vasculite induzida por hepatite C, perda espontânea da gravidez e semelhantes.

[00144] Em modalidades preferenciais, o distúrbio autoimune ou inflamatório é lúpus, doença do enxerto- versus-hospedeiro, vasculite induzida por hepatite C, diabetes de Tipo I, esclerose múltipla, a perda espontânea da gravidez, doenças atópicas, e doenças inflamatórias dos intestinos.

Métodos de Expansão de células Treg

[00145] A muteína da IL-2 ou proteínas de fusão de muteína de IL-2 com Fc pode ser utilizada para expandir as células Treg dentro de um sujeito ou amostra. São aqui fornecidos métodos para aumentar a proporção de Tregs para células T não reguladoras. O método compreende o contato de uma população de células T com uma quantidade eficaz de uma muteína de IL-2 ou fusão de muteína de IL-2 com Fc. A proporção pode ser medida por determinação da proporção de células T CD3+FoxP3+ para células CD3+FoxP3- dentro da população de células T. A frequência típica de Treg no sangue humano é de 5-10% do total de células T CD4+CD3+, no entanto, nas doenças listadas acima esta percentagem pode ser maior ou menor. Em modalidades preferenciais, a percentagem de Treg aumenta pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, em menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400%, pelo menos 500%, pelo menos 600%, pelo menos 700%, pelo menos 800%, pelo menos 900%, ou pelo menos 1000%. Aumentos máximos em múltiplos de Treg podem variar para doenças específicas; no entanto, uma frequência máxima de Treg que pode ser obtida através de tratamento de muteína de IL-2 é de 50% ou 60% do total de células T CD4+ CD3+. Em certas modalidades, a muteína de IL-2 ou proteína de fusão de muteína de IL-2 com Fc é administrada a um sujeito e a proporção de células T reguladoras (Tregs) para as células T não reguladoras dentro do sangue periférico de um sujeito aumenta.

[00146] Uma vez que a muteína de IL-2 e proteínas de fusão de muteína de IL-2 com Fc preferencialmente expandem Tregs sobre outros tipos de células, eles também são úteis para aumentar a proporção de células T reguladoras (Treg) para células natural killer (NK) no sangue periférico de um sujeito. A proporção pode ser medida por determinação da proporção de células T CD3+ FoxP3+ para linfócitos CD16+ e/ou CD56+ que são CD19- e CD3-.

[00147] É contemplado que as muteínas de IL-2 ou proteínas de fusão de muteína de IL-2 com Fc podem ter um efeito terapêutico em uma doença ou distúrbio num paciente sem aumentar significativamente a proporção de Tregs para as células T não reguladoras ou células NK no sangue periférico do paciente. O efeito terapêutico pode ser devido à atividade localizada da muteína de IL-2 ou proteína de fusão de IL-2 com Fc no local da inflamação ou autoimunidade.

EXEMPLOS

[00148] Os exemplos que se seguem, tanto reais como hipotéticos, são fornecidos com o propósito de ilustrar modalidades ou características da presente invenção específicas e não se destinam a limitar o seu escopo.

Exemplo 1 - Reduzir o número de mutações que conferem afinidade elevada para CD25

[00149] As muteínas de IL-2 com afinidade elevada para CD25 e sinalização reduzida da força através de IL-2RβY preferencialmente promovem o crescimento e função de Treg. Para reduzir a imunogenicidade potencial, foi buscado o número mínimo de mutações necessárias para atingir elevada afinidade para CD25. A estrutura de cristal de IL-2 em complexo com os seus três receptores (código PDB - 2B5I) mostra V69A e Q74P estão localizados na estrutura helicoidal que interage com CD25. Isto pode explicar porque V69A e Q74P foram frequentemente isolados em duas triagens de mutagênese de IL-2 independentes para afinidade de ligação alta à CD25 (Rao et al 2005;. Thanos et al., 2006). Este exemplo explora quais das outras mutações na muteína de IL-2 “2-4” identificadas na triagem de Rao et al. são mais importantes para aumentar a afinidade acima da observada com o V69A e Q74P sozinhos. As seguintes proteínas foram pesquisadas por citometria de fluxo para se ligar a CD25 na superfície das células T ativadas. Todos os construtos também incluíram um FLAG C-terminal e poli-His para purificação e detecção. As mutações específicas são fornecidas entre parêntesis.

[00150] HaMut7D ligou ao CD25 com quase a mesma afinidade que o isolado original “2-4” (~ 200 pM), indicando que a mutação N71R foi capaz de aumentar grandemente a afinidade superior à observada com V69A, Q74P sozinhos (HaMutlD, ~2 nM). Os outros construtos possuíam afinidades semelhantes a ou ligeiramente maiores do que HaMut1D, com a exceção de HaMut8D cuja afinidade foi apenas ligeiramente maior do que a WT IL-2.

Exemplo 2 - Muteínas de IL-2 fundidas com domínios de IgG1-Fc para uma melhor meia-vida

[00151] Para reduzir a frequência de dosagem necessária para atingir enriquecimento de Treg com uma muteína de IL-2, foram avaliados vários domínios fusões entre IL-2 e de IgG1-Fc. Os domínios de Fc continham mutações pontuais para suprimir funções efetoras mediadas por IgG1, tais como lise de células alvo. As mutações Fc de função efetora utilizadas em nossos estudos foram A327Q, Ala Ala (L234A+L235A) ou N297G. Uma vez que as muteínas de IL-2 seletivas para Treg têm redução parcial na potência de IL- 2, foi importante fundir a IL-2 ao Fc, de tal maneira que não impacte significativamente a sinalização de IL-2R. Assim, as muteínas de IL-2 foram testadas para a ativação de IL-2R, com e sem fusão com Fc.

[00152] Para determinar se dimerização de IL-2 por fusão com Fc aumentaria a força de sinalização de IL-2R, devido ao aumento da avidez para a IL-2R, uma muteína de IL-2 mais fraca (haD5) (US20110274650) foi fundida com o terminal amino de Fc, separada por uma sequência de ligação GGGGS (SEQ ID NO: 5). Esta muteína possuía 3 mutações que afetam a sinalização IL-2R (E15Q H16N, N88D), 8 mutações para conferir elevada afinidade para CD25 (N29S, Y31H,K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, Q74P) (Rao et al., 2005), e C125S para evitar pareamento incorretamente de cisteína e agregação. Fusão de Fc desta maneira anulou completamente a atividade biológica de haD5, enquanto a sua ligação de alta afinidade à célula CD25 superfície foi melhorada, provavelmente devido a um aumento da avidez de dimerização.

[00153] Muteínas de IL-2 também foram fundidas a qualquer extremidade N ou C-terminal de um heterodímero de Fc, de tal modo que apenas uma cadeia do dímero Fc furou o domínio de IL-2. Emparelhamento heterodimérico entre duas cadeias Fc assimétricas foi promovido por interações eletrostáticas entre lisinas introduzidas em uma cadeia de Fc e introduziu-se ácido aspártico na outra cadeia Fc. A muteína de IL-2 haD6 foi fundida com a extremidade N- terminal de uma cadeia de Fc ou outra, no caso que uma configuração foi preferencial, resultando em dois construtos de proteínas denominados haD6.FcDD e haD6.FcKK. Também fundimos muteína haMut7D para o C-terminal do Fc heterodímero com um ou dois ligantes GGGGS (SEQ ID NO: 5) (FcKK (G4S) haMut7D, FcKK (G4S) 2haMut7D). Fusão da muteína IL-2 haD6 para o N-terminal do heterodímero Fc resultou em uma perda parcial da atividade relativa para liberar haD6 em ambas as experiências de proliferação de células T e pSTAT5. Em contraste, a fusão de haMut7D para o C-terminal do Fc heterodímero com um ou dois ligantes GGGGS (SEQ ID NO: 5) não alterou a potência da haMut7D.

[00154] Fusão de uma muteína de IL-2 para o C-terminal de um homodímero de Fc também foi investigada. PBMC total foi ativada em frascos de cultura de tecidos T75 de 300 milhões de células por 100 ml com 100 ng de anti-CD3/ml (OKT3). No dia 3 de cultura, as células foram lavadas 3 vezes e descansadas em meio fresco durante 3 dias. As células foram então estimuladas com variantes IL-2 em 10x na titulação da dose variando de 1 pM para 10 nM a um volume final de 50 μl. O nível de fosforilação de STAT5 foi medido utilizando kit BD tampão phosflow. Resumidamente, 1 ml de tampão BD lise/phosflow de fixação foi adicionado para parar a estimulação. As células foram fixadas durante 20 min a 37°C e permeabilizadas com 1x tampão BD phosflow perm em gelo antes de coradas para CD4, CD25, FoxP3 e pSTAT5.

[00155] Como pode ser visto na FIG. 1, a bioatividade de muteínas haMut1D e haMut7D não foi alterada pela fusão com a extremidade C-terminal de um homodímero de Fc. Assim, a fusão entre o N-terminal de IL-2 e C-terminal de Fc não compromete a atividade agonista das muteínas de IL-2, mesmo no contexto de um homodímero Fc.IL-2. Nestes construtos, a mutação C125A foi usada no lugar de C125S para fabricação melhorada.

Exemplo 3 - Sintonia de muteína de IL-2 para alcançar um crescimento Treg preferencial

[00156] O painel inicial de muteínas de IL-2 continha N88D sozinho ou com 1 ou 2 mutações adicionais que impactam a sinalização de IL-2R. Um segundo painel de muteínas foi concebido, todos com mutações pontuais, com o objetivo de identificar muteínas com agonismo semelhante ou ligeiramente mais potente do que os das séries N88D. Um painel de 24 mutações de sinalização foi identificado com base em aminoácidos interagindo com IL-2Rβ previstos (estrutura de cristal, código PDB - 2B5I). Substituições particulares foram selecionadas com base na diminuição prevista na energia livre de ligação entre a muteína e IL- 2Rβ. A energia livre de ligação foi calculada usando algoritmo computacional EGAD (Handel’s Laboratory, da Universidade da Califórnia em San Diego, EUA). A energia livre de ligação de um mutante é definida como ΔΔGMut= μ(ΔGmut- ΔGwt). Onde, μ (= 0,1, em geral) é o fator de escalonamento usado para normalizar as mudanças previstas na afinidade de ligação para ter uma inclinação de 1, quando comparando com as energias experimentais (Pokala e Handel 2005). A energia livre de dissociação (ΔG) foi definida como a diferença de energia entre o complexo (ΔGbound) e estados livres (ΔGfree). A energia de dissociação ΔGmut foi calculada para cada substituição.

[00157] Um painel de muteínas de IL-2 com as seguintes substituições (H16E, H16Q, L19K, D20R, D20K, D20H, D20Y, M23H, D84K, D84H, S87Y, N88D, N88K, N88I, N88H, N88Y, V91N, V91K, V91H, V91R, I92H, E95K, E95R, ou E95I) foi expresso como fusões C-terminais para o heterodímero Fc. Estes construtos também continham as mutações haMut7 em alta afinidade de ligação para CD25 (V69A, N71R, Q74P) e C125A para a dobra eficiente.

[00158] O painel foi pesquisado quanto a potência no ensaio de fosforilação STAT5 de células T do Exemplo 2, e H16E, D84K, V91N, V91K, e V91R demonstraram possuir menos atividade do que o tipo selvagem de IL-2 e mais do que N88D (Fig. 2).

[00159] H16E, D84K, V91N, V91K, e V91R possuíam menor atividade do que o tipo selvagem de IL-2 e mais do que N88D.

[00160] Muteínas selecionadas também foram testadas em células T e ensaios de crescimento de NK.

[00161] Para o ensaio de células T, o PBMC total foi ativado em 3 milhões/ml com 100 ng de OKT-3. No dia 2, as células foram lavadas 3 vezes e descansadas em meio fresco durante 5 dias. As células foram então marcadas com CFSE e a cultura prosseguiu em uma placa de 24 poços a 0,5 milhão/poço de IL-2 contendo meio durante 7 dias antes da análise de FACS. A proliferação de subgrupos de células T é apresentada na FIG. 3 como diluição CFSE (mediana fluorescência de CFSE).

[00162] Para o ensaio de células NK, MACS classificadas como células NK CD16+ foram cultivadas em IL-2 contendo meio durante 3 dias a 0,1 milhão/poço em placas de 96 poços. 0,5 μCi 3H-timidina foi adicionado a cada poço durante as 18 horas finais de incubação. Os resultados são mostrados na FIG. 4.

[00163] Mutantes H16E, D84K, V91N, V91K, e V91R foram capazes de estimular o crescimento de Treg semelhante a WT de IL-2, mas foram aproximadamente 10 x menos potentes sobre outras células T (Fig. 3), e aproximadamente 100 x menos potentes em células NK (FIG. 4).

[00164] Um painel separado de proteínas de fusão Fc.IL- 2 foi concebido em que a distância entre o heterodímero Fc e a muteína haMut7 (V69A, N71R, Q74P, C125A) foi reduzida por uma série de truncamentos de aminoácidos individuais.

[00165] Trunc1-Trunc4 possuía atividade igual ao parente de comprimento completo do construto Fc.haMut7 como medido por fosforilação de STAT5 e por proliferação de células T e células NK, como descrito para as Figs. 2, 3, e 4. Trunc5 e Trunc6 estimularam respostas mais fracas ainda mais fortes do que aquelas estimuladas pela mutação N88D (HAD e haMut7D) e muito semelhantes às estimuladas por V91K. Trunc7 foi mais fraca do que muteínas N88D, e Trunc8 tinha muito pouca atividade. Quando testado em células NK, no entanto, Trunc5 e Trunc6 eram mais fortes do que os agonistas V91K, indicando que seletividade para Treg foi mais facilmente conseguida com mutações de sinalização, em vez de impedimento estérico por um domínio Fc proximal.

Exemplo 4 - Mutações de afinidade elevada para CD25 no contexto de um homodímero de Fc

[00166] As mutações que conferem a afinidade de ligação elevada a CD25 foram consideradas vantajosas porque aumentaram o tropismo para as células T elevadas em CD25, e porque a longo prazo promoveu a associação de CD25:muteína de IL-2 e sinalização prolongada. No entanto, reduzir o número de mutação pode reduzir a imunogenicidade potencial. As muteínas N88D ou V91K, com e sem as mutações haMut1 de elevada afinidade V69A e Q74P, foram expressas como fusões com o C-terminal de um homodímero Fc e comparadas para bioatividade. Em ensaios de estimulação pSTAT5, a homodimerização não teve efeito sobre a intensidade do sinal relativo a muteína monomérica. A reversão das mutações de elevada afinidade e V69A Q74P também não afetou a sinalização de pSTAT5. Em ensaios de crescimento de células T, as mutações de elevada afinidade reduziram atividade em células T CD4+ e as células T CD8+ convencionais, mas não nas células T reguladoras (Fig. 5). As mutações de elevada afinidade também não alteraram as respostas proliferativas nas células NK (Fig. 6).

[00167] Para determinar se as mutações de elevada afinidade impactaram respostas de células T in vivo, dosamos camundongos humanizados (camundongos NOD.SCID.II2rg-null reconstituídos com células-tronco hematopoiéticas CD34+ humanas) com as proteínas de fusão Fc.IL-2 muteína e monitorada a expansão de Treg. Camundongos NOD.SCID.H2rg-null de sete semanas de idade (NSG) (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) foram irradiados (180 rad) e reconstituídos com 94.000 células-tronco hematopoiéticas CD34+ de fígado fetal humano. Em 21 semanas, os camundongos foram divididos em 6 grupos baseados em igual distribuição de quimerismo percentual (determinado por citometria de fluxo de PBL) e foram administradas injeções de subcutânea de 1 μg de proteínas de fusão Fc.muteína indicadas ou PBS no dia 0 e no dia 7. No dia 11, as frequências do subgrupo de células T no sangue foram determinadas por citometria de fluxo. Na baixa dose de 1 μg por animal, as mutações de elevada afinidade não melhoraram a expansão de Treg além da observada com mutações N88D ou V91K sozinhas (Fig. 7).

[00168] A expansão seletiva de Treg em que foi células T FoxP3-CD4+ não aumentou em abundância relativa ao total de leucócitos do sangue periférico (PBL), que inclui uma mistura de células B e T humanas, e células mieloides de camundongo. Além disso, em doses mais elevadas, as mutações de elevada afinidade promoveram um aumento em células T CD25+FoxP3-, reduzindo assim a seletividade de Treg. Assim, no contexto de homodímero Fc, as mutações de alta afinidade não foram consideradas necessárias para promover o crescimento preferencial de Treg.

Exemplo 5 - Associação prolongada de associação CD25 à superfície celular de muteínas Fc.IL-2

[00169] Um resultado inesperado a partir dos estudos de ratinho humanizado que foi, apesar da sua capacidade de sinalização reduzida, as muteínas induziram enriquecimento mais robusto de Treg relativo a Fc.WT IL-2. Maior enriquecimento de Treg e regulação positiva de FoxP3 em relação à observada com Fc.WT foi observada na dose de 1 μg/camundongo (Figura 7) e a uma dose mais baixa de 0,5 μg/ratinho (Fig. 8). Este aumento da potência in vivo pode ter resultado do consumo reduzido por células T, tornando mais muteína Fc.IL-2 disponível para sinalização prolongada.

[00170] Estudos in vitro e in vivo de PK falharam, contudo, para demonstrar significativamente a persistência aumentada de Fc.V91K ou Fc.N88D em relação ao Fc.WT em sobrenadantes de culturas de células T ativadas ou soro de camundongos tratados. Porque as fusões Fc furaram dois domínios muteína de IL-2, justificamos que o aumento da reciclagem endossomal pode resultar em associação de superfície celular estendida devido ao aumento da avidez para CD25. Com efeito, verificou-se que Fc.V91K e Fc.N88D persistiu mais eficientemente do que Fc.WT na superfície de células T ativadas anteriormente após uma breve exposição a proteínas de fusão (Fig. 9).

[00171] PBMCs primários foram pré-estimulados durante 2 dias com 100 ng/ml de OKT3. As células foram colhidas, lavadas 4 vezes e descansadas durante a noite em meio. As células foram então pulsadas com 400 pM de Fc.IL-2 durante 30 min a 37°C. Depois do pulso, as células foram colhidas para T0 após uma lavagem, ou lavadas novamente 3 vezes em 12 ml de meio morno e cultivadas durante 4 horas. Para detectar as células Fc.IL-2 associadas, as células foram coradas com anti-IgG humano-FITC (Jackson Immunoresearch) e anti-CD25-APC.

Exemplo 6 - Otimização de sequência da fusão

[00172] Em estudos pré-clínicos em camundongos, nossas muteínas Fc.IL-2 mostraram exposição diferencial quando as concentrações séricas da molécula intacta foram comparadas à porção Fc humana única, indicativo de catabolito de Fc humano circulante. Para otimizar a estabilidade in vivo e a farmacocinética dos nossas muteínas Fc.IL-2, caracterizamos as modificações da sequência de fusão para o seu impacto sobre a degradação de protoeolítica de muteínas Fc.IL-2 na circulação sistêmica, e durante a reciclagem através do sistema reticuloendotelial. Os seguintes construtos foram avaliados quanto à degradação proteolítica in vitro e in vivo.

[00173] A estabilidade foi medida por imunoensaios quantitativos que comparam as concentrações ao longo do tempo de Fc humano total à de muteína Fc.IL-2 intacta. A proteólise de muteínas Fc.IL-2 foi verificada por análise de Western blot utilizando anticorpo anti-IL-2 e anticorpos anti-Fc humano, seguido por imunocaptura de catabolitos e caracterização por espectrometria de massa. Caracterização por espectrometria de massa de catabolitos de (Ala_Ala)_G4S a partir de amostras in vitro e in vivo identificaram o Lys de C-terminal do domínio Fc como um sítio de clivagem proteolítica. Deleção ou mutação da lisina C-terminal do domínio Fc ((N297G_delK)_G4S e (N297G_KtoA)_AAPT) resultaram em prolongada estabilidade in vitro em soro de camundongo em 37°C em comparação com construtos Fc com a lisina C-terminal ((Ala_Ala)_G4S). Esta estabilidade estendida sérica in vitro traduzida a uma maior exposição em camundongos, tal como medido pela área sob a concentração de curva versus tempo de muteína Fc.IL-2 sérica (AUC). Esta estabilidade estendida de muteínas Fc.IL-2 sem a Fc lisina C-terminal também foi observada in vitro em soro de macacos cinomolgos e seres humanos. A mutação de Thr-3 de IL-2 para Ala ((N297G_KtoA)_AAPA) resultou numa diminuição da estabilidade in vitro a 37°C (em comparação com (N297G_KtoA)_AAPT) em soro de camundongos e em incubações separadas com catepsina D recombinante humana e L. Isso diminuiu estabilidade in vitro de soro traduzida para exposição inferior (AUC) em camundongos in vivo para (N297G_KtoA)_AAPA em comparação com (N297G_KtoA)_AAPT. Caracterização de catabolitos de (N297G_KtoA)_AAPA a partir de amostras in vitro e in vivo identificadas por espectrometria de massa identificou Lys 8 e Lys 9 da muteína de IL-2 como os resíduos de domínio susceptível à proteólise que não foi observado para amostras equivalentes de (N297G_KtoA)_AAPT. Diminuição da estabilidade a 37°C de (N297GKtoA) AAPA à (N297GKtoA) AAPT também foi observada in vitro em soro de macacos cinomolgos e seres humanos.

[00174] Devido à importância de glicosilação nessa região, e, potencialmente, melhorar a partir da capacidade de fabricação da proteína de fusão, as sequências de fusão foram alteradas para promover glicosilação N-ligada em vez de O-ligada, como se segue.

Exemplo 7 -Determinação de PK/PD de Macaco cinomolgos

[00175] Terapias imunoestimulantes de IL-2 padrão exigem dias livres de drogas (sem exposição) entre ciclos de dosagem para evitar efeitos colaterais indesejáveis. Em contraste, expansão de Treg ou terapias de estimulação podem exigir exposição prolongada em níveis de vala de droga sustentados (Cmin sérica) suficientes para a estimulação de Treg, mas com exposições máximas (Cmax sérica) abaixo dos níveis de drogas que levam à ativação imune. Este exemplo demonstra estratégias de dosagem de meia-vida de muteínas estendidas em macacos cinomolgos para cobertura alvo estendida (Cmin sérica) mantendo ao mesmo tempo a exposição máxima (Cmax sérica) abaixo dos níveis de droga contemplados como sendo necessário para a ativação imunológica pró-inflamatória.

[00176] Macacos cinomolgos são doseados com Fc.V91K(IgG1Fc(N297G_delK):: G4S::huIL-2(V91K, C125A) em quatro grupos (A-D), com três grupos (A-C) dosados por via subcutânea e um grupo (D) doseado por via intravenosa. Para cada grupo, quatro macacos cinomolgos machos biologicamente naive são doseados pela estratégia de dosagem descrita a seguir. A dosagem subcutânea de meia-vida estendida de muteínas pode permitir uma maior absorção linfática resultando em menor exposição máxima (Cmax sérica) e/ou uma resposta farmacológica mais robusta (expansão de Treg). A estratégia de dosagem para o grupo A consiste em três períodos consecutivos de doses de 10 microgramas por kg no dia 0, 2, e 4 para o ciclo 1 e 10 microgramas por quilograma no dia 14, permitindo a cobertura alvo estendida semelhante a uma dose inicial mais elevada de 50 microgramas por quilograma, mantendo uma exposição máxima inferior (Cmax). A estratégia de dosagem para o grupo B é de 50 microgramas por quilograma doseadas no dia 0 e 14, para comparação com o grupo A. A estratégia de dosagem para o grupo C é de 50 microgramas por quilograma doseadas no dia 0 e 28. Permitindo que a determinação de se a cobertura da vala é necessária para sustentar enriquecimento de Treg ou se um período livre de drogas é benéfico entre ciclos de dosagem. A estratégia de dosagem para o grupo do braço D de dosagem intravenosa é de 50 microgramas por quilograma doseadas no dia 0, permitindo uma comparação das posições máximas (Cmax) e as diferenças de enriquecimento de Treg para às da administração por via subcutânea.

[00177] Farmacocinética (imunoensaio quantitativo para a molécula intacta e Fc humana total), os anticorpos anti- droga, CD25 vertido solúvel, e citocinas séricas (IL-Iβ, TNF-α, IFN-Y, IL-10, IL-5, IL-4 e IL-13) são medidos nos seguintes pontos de tempo para cada grupo de dose especificado:

[00178] Grupo A: pré-dose (primeiro ciclo; dose 1), 48 (pré-dose primeiro ciclo; dose 2), 96 (pré-dose de primeiro ciclo; dose 3), 100, 104, 120, 168, 216, 264, 336 (pré-dose de segundo ciclo), 340, 344, 360, 408, 456, 504, 576, 672, 744, 840, e 1008 horas.

[00179] Grupo B: pré-dose (primeiro ciclo), 4, 8, 24, 72, 120, 168, 240, 336 (pré-dose de segundo ciclo dose), 340, 344, 360, 408, 456, 504, 576, 672, 744, 840, e 1008 horas.

[00180] Grupo C: pré-dose (primeiro ciclo), 4, 8, 24, 72, 120, 168, 240, 336, 408, 504, 672 (pré-dose de segundo ciclo), 676, 680, 696, 744, 792, 840, 912, 1008, 1080, e 1176 horas.

[00181] Grupo D: pré-dose (primeiro ciclo), 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 120, 168, 240, 336, 408, 504, e 672 horas.

[00182] Farmacodinâmica (imunofenotipagem e enumeração de Tregs do sangue periférico, células T CD4 e CD8 não reguladoras, e células NK) é medida nos seguintes pontos de tempo para cada grupo de dose especificado:

[00183] Grupo A: pré-dose (primeiro ciclo; dose 1), 96 (pré-dose de primeiro ciclo; dose 3), 168, 336 (pré-dose de segundo ciclo), 456, e 576 horas.

[00184] Grupo B: pré-dose (primeiro ciclo), 120, 240, 336 (pré-dose de segundo ciclo), 456, e 576 horas.

[00185] Grupo C: pré-dose (primeiro ciclo), 120, 240, 672 (pré-dose de segundo ciclo), 792, e 912 horas.

[00186] Grupo D: pré-dose (primeiro ciclo), 120 e 240 horas.

[00187] Hematologia e bioquímica são avaliadas para todos os animais e pré-dose de grupos de dose em 24 horas após a dosagem inicial por grupo de dose. Os seguintes parâmetros são avaliados.

[00188] Hematologia: • contagem de leucócitos (total e diferencial absoluta) • contagem de eritrócitos • hemoglobina • Hematócrito • hemoglobina corpuscular média, volume corpuscular médio, hemoglobina corpuscular média concentração (calculada) • reticulócitos absolutos • contagem de plaquetas • morfologia das células do sangue • amplitude de distribuição dos eritrócitos • volume médio de plaquetas

[00189] Química Clínica: • fosfatase alcalina • bilirrubina total (com bilirrubina direta se bilirrubina total excede 1 mg/dL) • aspartato aminotransferase • alanina aminotransferase • gama glutamil transferase • nitrogênio da ureia • creatinina • proteína total • albumina • globulina e proporção A/G (albumina/globulina) (calculada) • glicose • colesterol total • triglicerídeos • eletrólitos (sódio, potássio, cloreto) • cálcio • fósforo

Exemplo 8 - Fc de IgG1aglicosilada

[00190] Anticorpos IgG que ocorrem naturalmente possuem um sítio de glicosilação no domínio constante 2 da cadeia pesada (CH2). Por exemplo, os anticorpos IgG1 humanos tem um sítio de glicosilação localizado na posição Asn297 (numeração EU). Até o momento, as estratégias para a produção de anticorpos aglicosilados envolvem a substituição do resíduo de Asn por um aminoácido que se assemelha a Asn em termos de propriedades físico-químicas (por exemplo, Gln) ou com resíduo Ala que imita a cadeia lateral de Asn sem grupos polares. Este Exemplo demonstra os benefícios resultantes da substituição de Asn com glicina (N297G). N297G Fc são moléculas aglicosiladas com melhores propriedades biofísicos e atributos de capacidade de fabricação (por exemplo, recuperação durante a purificação).

[00191] O exame das várias estruturas de cristal conhecidas de fragmentos Fc e anticorpos IgG revelou considerável flexibilidade conformacional em torno do segmento de alça glicosilado, na posição Asn297 que é glicosilada. Em muitas das estruturas cristalinas conhecidas, Asn297 adaptou ângulos diedros do esqueleto positivos. Gly tem alta propensão para se adaptar ao ângulo diedro positivo do esqueleto devido à falta de átomos de cadeia lateral. Portanto, com base nessa conformação e razão de estrutura, Gly pode ser um melhor substituto para Asn que N297Q ou N297A.

[00192] Mutação Asn297 com Gly leva a moléculas aglicosiladas com muito melhor recuperação (ou eficiência) no processo de purificação e propriedades biofísicas. Por exemplo, a percentagem de recuperação (rendimento final) a partir de pool de proteína A foi de 82,6% para a mutação N297G, em comparação com 45,6% para 39,6% e N297Q para N297A. Análise de coluna SPHP revelou a menor porcentagem de recuperação para os mutantes N297Q e N297A foi devido a uma distorção de picos, o que indica a agregação de alto peso molecular e/ou espécies dobradas erradas. Este resultado foi novamente confirmado em uma corrida escala maior de 2L.

[00193] Na indústria biofarmacêutica, as moléculas com a necessidade potencial de produção em larga escala, por exemplo, o potencial para serem vendidas como uma droga, são avaliados por um número de atributos para minimizar o risco de que a molécula não seja favorável à produção e purificação em grande escala. Nas avaliações de capacidade de fabricação, N297G revelou robustez a alterações de pH. N297G não tinha questão de agregação; enquanto que N297Q e N297A tinham 20% e 10% de aumento na agregação, respectivamente. Embora N297G tinha atributos melhores de capacidade de fabricação, que foi semelhante ao N297Q e N297A em todos os ensaios funcionais em que foram testados. Por exemplo, em ensaios de ADCC, N297G foi desprovido de citotoxicidade de forma semelhante ao N297Q e N297A.

Exemplo 9 - Fc de IgG1 a glicosilada estabilizada

[00194] Este Exemplo descreve um método de melhorar a estabilidade de estruturas de anticorpo IgG através da introdução de ligações dissulfeto modificadas. Os anticorpos IgG são moléculas estáveis que ocorrem naturalmente. No entanto, para algumas aplicações terapêuticas, pode ser necessário fazer mutações ou criar moléculas aglicosiladas. Por exemplo, as moléculas de IgG aglicosiladas podem ser utilizadas em indicações terapêuticas onde existe uma necessidade de evitar a ADCC e a ligação a receptores Fcgama. No entanto, a IgG1 aglicosilada tem muito mais baixa temperatura de fusão (temperatura de fusão de domínio CH2 diminui por cerca de 10°C; 70°C a 60°C) do que a IgG1 glicosilada. A temperature de fusão mais baixa observada afeta negativamente várias propriedades biofísicas da IgG1 aglicosilada. Por exemplo, IgG1 aglicosilada aumentou nível de agregação a um pH baixo em comparação com IgG1 glicosilada.

[00195] A fim de modificar ligações dissulfeto, um método baseado em estrutura que envolve o cálculo da distância entre os átomos de C-alfa foi inicialmente utilizado para identificar 54 pares de resíduos na região Fc para mutação para Cis. Estes 54 sítios foram ainda mais reduzidos a 4 pares de resíduos (V259C-L306C, R292C-V302C, A287C-L306C, e V323C-I332C). Os critérios usados incluem (i) posições dentro do domínio CH2, (ii) distância de alças, voltas e carboidratos, (iii) distância a partir do receptor Fcgamma e sítios de interação FcRn, (iv) acessibilidade do solvente (posições preferenciais enterradas), etc.

[00196] As substituições de cisteína pareadas foram criadas no contexto de N297G Fc aglicosilada. Análise de mapeamento do peptídeo não reduzido revelou que 3 dos 4 sítios modificados formara ligação dissulfeto como esperado e concebidos neste contexto. A mutação V259C-L306C não forma ligação dissulfeto correta e levou a emparelhamento incorreto com o dissulfeto nativo já presente no domínio CH2. As outras três concepções R292C-V302C, A287C-L306C, e V323C-I332C formaram ligação dissulfeto corretamente como previsto e concebido. Adicionando a ligação dissulfeto para a mutação N297G levou a cerca de 15C de melhoria na estabilidade térmica sobre a mutação N297G sozinha. Das variantes dissulfeto de R292C-V302C, A287C-L306C, e V323CI332C, R292C-V302C e A287C-L306C tiveram boa farmacocinética, quando administrados aos camundongos (t1/2 de 11 dias e 9 dias, respectivamente). Isto está em contraste com o perfil de farmacocinética observado em camundongos para a ligação dissulfeto do domínio CH2 L247C- K339C publicado anteriormente (Gong et al., J. Biol. Chem. 2009 284: 14203-14210), que teve a t1/2 de 5 dias.

[00197] Modificar uma ligação dissulfeto no domínio CH2 melhora a estabilidade da molécula aglicosilada em par com moléculas IgG1 glicosiladas (10 a 15°C na melhoria da temperatura de fusão como determinado por calorimetria de varrimento diferencial). Os sítios modificados aqui descritos não conduzem ao embaralhamento de dissulfeto e os dissulfetos são formados como previsto em aproximadamente 100% da população. Mais importante ainda, ao contrário do sítio de ligação de dissulfeto publicado no domínio CH2, as ligações dissulfeto aqui descritas não têm impacto sobre a PK de rato.

[00198] O perfil de farmacocinética (PK) de anticorpos aglicosilados estabilizados foi determinado em macacos cinomolgos. Um anticorpo IgG1 tendo substituições N297G, A287C, e L306C (Ab2-1) e um anticorpo IgG1 tendo substituições N297G, R292C, e V302C (Ab2-2) foram injetados por via subcutânea a 5 mg/kg em macaco cinomolgo (n = 2).As amostras de soro foram coletadas na pré-dose, 0,5, 2, 8, 24, 48, 96, 168, 336, 504, 672, 840, 1008, 1176, 1344, 1512, e 1680 horas após a dose. As amostras foram analisadas para os níveis de anticorpos Ab2-1 e Ab2-2 usando um ELISA sanduíche anti-IgG hu. Para medir o nível sérico de IgG hu nas amostras de estudo de farmacocinética, o seguinte método foi utilizado: placa com ^ área preta (Corning 3694) foi revestido com 2 μg/ml de anti-hu Fc, anticorpo 1.35.1 em PBS e depois incubadas durante a noite a 4°C. A placa foi, em seguida, lavada e bloqueada com I- Block™ (Applied Biosystems) durante a noite a 4°C. Se as amostras necessárias para ser diluídas, em seguida, foram diluídas em soro de macaco cinomolgo. Os padrões e as amostras foram, em seguida, diluídos 1: 20 em 1X PBS+ NaCl 1M+ 0,5% Tween 20 e tampão de BSA a 1% (5% de soro). A placa foi lavada e as amostras de 50 μl de padrões diluídos e as amostras diluídas foram transferidas em uma placa revestida com anticorpo 1.35.1 e incubada durante 1,5 h em temperatura ambiente. A placa foi lavada, em seguida, 50 μl de 100 ng/ml de anticorpo anti-Fc hu conjugado com HRP 21.1 em I-Block™ + 5% de BSA e incubadas durante 1,5 h. A placa foi lavada, em seguida, 50 μl de substrato Pico foram adicionadas, após o qual a placa foi imediatamente analisada com um luminômetro. Dados de concentração de tempo foram analisados utilizando métodos não compartimentados com WinNonLin® (Enterprise versão 5.1.1, 2006, Pharsight® Corp. Mountain View, CA).

[00199] Exposições de PK de anticorpos Ab2-1 e Ab2-2 em macacos cinomolgos foram comparadas com o anticorpo IgG1 compreendendo apenas a substituição N297G e o anticorpo IgG1 compreendendo N297G, L247C, e K339C. As exposições de PK de anticorpos Ab2-1 e Ab2-2 em macacos cinomolgos foram mais elevadas do que o anticorpo IgG1 compreendendo apenas a substituição N297G e o anticorpo IgG1 compreendendo N297G, L247C, e K339C. Além disso, Ab2-2 teve exposição e depuração comparáveis ao anticorpo parente IgG1.

Claims (2)

1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região Fc de um anticorpo de IgG1 humana, em que a referida região Fc compreende uma mutação N297G utilizando o esquema de numeração EU e a referida região Fc de uma IgG1 humana e compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:3, ou compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:4 e ainda em que A287 e L306; V259 e L306; R292 e V302; ou V323 e I332, utilizando o esquema de numeração EU da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4, são substituídos por cisteína.

2. Anticorpo ou proteína de Fusão FC, caracterizado pelo fato de que compreende uma região Fc, conforme definida na reivindicação 1.