JP7187505B2 - 長時間作用型凝固因子およびその製造方法 - Google Patents

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Description

少なくとも１個の、凝固因子のカルボキシ末端に結合した絨毛性ゴナドトロピンのカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含むポリペプチドと、これをコードしているポリヌクレオチドとが開示される。本開示のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む医薬組成物および医薬製剤、ならびにこれを使用する方法およびこれを製造する方法も開示される。
凝固因子補充療法の開発によって、多くの血友病患者の生活が変貌した。血友病は、凝血または凝固を制御する身体能力を損なう、遺伝性の遺伝子疾患群である。血友病患者では、有効な血液凝固に必要である第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子のタンパク質が十分な量生成されない。重篤な血友病患者では、わずかな損傷でさえ、数日間または数週間にわたって続く血液の喪失を生じ得、完全に治癒することはなく、関節および他の臓器の消耗性の永続的な損傷および早死が生じる可能性がある。
血友病は、遺伝性の、凝固カスケードにおける重要な因子の欠損、または非存在により引き起こされるＸ染色体連鎖出血性障害である。血友病患者では、トロンビン生成およびフィブリン塊形成が大きく損なわれ、最も一般的には、関節および内部臓器での、自然発生的出血症状、および手術または外傷後に過度の出血が起こる。血友病患者における高頻度の出血はまた、関節腫脹、関節損傷、極度の奇形、頻発する感染症、および可動性の低下の原因となる可能性がある（メイヨークリニック）。血友病Ａは第ＶＩＩＩ因子発現の欠陥または欠損により引き起こされ、血友病Ｂは第ＩＸ因子発現の欠陥または欠損により引き起こされる。
血友病Ｂは、ＦＩＸのプロコアグラント活性の欠損をもたらす。血友病Ｂの患者は、自然発生的な軟部組織出血および再発性関節血症を有し、これが手足を不自由にする関節症につながる場合が多い。これらの患者のための現在の処置としては、組換えＦＩＸの静脈内投与が挙げられる。しかし、ＦＩＸの費用および循環からの比較的急速な排出の問題により、長時間作用型ＦＩＸの開発は難易度の高い課題となっている。市販されているＦＶＩＩＩおよびＦＩＸは、致命的な出血症状に対する制御の改善に繋がっている。多くの患者が予防治療を受け、それにより、出血およびそれに伴う合併症の危険性が低減している。しかし、かなりの割合（１０～３０％）の患者で、体外から投与されたＦＶＩＩＩおよびＦＩＸに対して阻害性の抗体が発生する。迂回性の生成物である、ＦＶＩＩａの投与は、恒常性を誘導し、阻害性の抗体を有する患者に対し効果的処置を提供し得る。
組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））が市販されており、阻害物質を伴う血友病患者における出血症状の処置用として、１９９６年に承認された。しかし、ｒＦＶＩＩａは、２．５時間という終末半減期で急速に排出される。結果として、患者は通常、軽度から中度の出血の後に、十分な恒常性を達成するために、複数回の高頻度の注入（２～３時間の間隔に２～３用量の投与）を必要とする。このことから、単回用量後に止血活性の期間を延長し、かなり低い投与頻度を可能にする長時間作用型のＦＶＩＩａの開発に関し大きな関心が持たれている。長時間作用型ＦＶＩＩａはまた、長期の予防的治療の実現性を高めるであろう。
ＦＶＩＩａの半減期を延長させるための種々の技術が開発されている。しかし、このタンパク質の生物学的活性を保存し、この改変により有意な免疫原性を誘導しないことを保証すると同時に、このタンパク質の半減期の延長を達成する必要性が残されている。本発明は、ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）をＦＶＩＩａと結合させて、半減期および生物活性を延長するようにＦＶＩＩａを修飾することにより、この必要性に対処する。
一態様では、本発明は、第ＶＩＩ凝固因子と、前記凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾ポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドはシグナルペプチドを含まない。別の態様では、本発明は、凝固因子が活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）であるＣＴＰ修飾ポリペプチドを提供する。別の態様では、ＣＴＰ修飾凝固因子の配列は、配列番号４６で示される。
別の態様では、活性化ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３を含むＣＴＰ修飾ポリペプチドは、ジスルフィド結合で連結された軽鎖および重鎖を含む。別の態様では、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによる軽鎖および重鎖の分離は、変性条件下で起こり、軽鎖は約２５ｋＤａ分子量に移動し、重鎖は約６０ｋＤａ分子量に移動する。
一態様では、本発明は、緩衝液、アミノ酸（これらは、別の実施形態では、グリシン、等張化剤である）、ならびに第ＶＩＩ凝固因子および前記凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）からなるＣＴＰ修飾ポリペプチドを含む医薬製剤を提供し、ポリペプチドはシグナルペプチドを含まない。別の態様では、緩衝液は２０ｍＭのクエン酸塩を含む。別の態様では、等張化剤は１５０ｍＭの塩化ナトリウムである。別の態様では、製剤は液体製剤である。別の態様では、製剤は約６．４のｐＨである。
別の態様では、本発明は、２０ｍＭのクエン酸塩、１３．３ｍＭのグリシン、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、約６．４のｐＨの製剤を提供する。
別の態様では、本発明は医薬製剤を提供し、凝固因子は活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）である。別の実施形態では、前記ＣＴＰ修飾凝固因子の配列は、配列番号４６で示される通りのものである。別の態様では、ポリペプチドを含む医薬製剤は、毎日、１日毎に、３日毎に、週１回、週２回、もしくは１週おきに１回、またはこれらの任意の組み合わせで投与される。別の態様では、医薬製剤の投与は、静脈内または皮下投与である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＣＴＰ修飾ポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の医薬製剤を含む医薬組成物を提供する。
一態様では、本発明は、第ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）凝固因子の生物学的半減期を延長させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩ凝固因子のカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合し、それにより、前記凝固因子の生物学的半減期を延長させるステップを含み、凝固因子の活性化型は、シグナルペプチドを含まない。別の態様では、凝固因子は活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）である。別の態様では、前記活性化ＣＴＰ修飾凝固因子の配列は、配列番号４６で示される通りである。
一態様では、本発明は、第ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）凝固因子の曲線下面積（ＡＵＣ）を増大させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩ凝固因子のカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合し、それにより、前記凝固因子のＡＵＣを増大させるステップを含み、凝固因子の活性化型は、シグナルペプチドを含まない。別の態様では、凝固因子は活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）である。別の態様では、前記活性化ＣＴＰ修飾凝固因子の配列は、配列番号４６で示される通りである。
一態様では、本発明は、第ＶＩＩａ（ＦＶＩＩ）凝固因子の投与頻度を減らす方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩ凝固因子のカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合し、それにより、前記凝固因子の投与頻度を減らすステップを含み、凝固因子の活性化型は、シグナルペプチドを含まない。別の態様では、前記活性化ＣＴＰ修飾凝固因子の配列は、配列番号４６で示される通りである。
一態様では、本発明は、対象の血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置する方法を提供し、該方法は、対象に、活性化ＣＴＰ修飾凝固因子ポリペプチドを投与し、それにより、前記対象の血液凝固障害または血液凝固異常を防止または処置するステップを含み、前記凝固因子はＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３である。別の態様では、障害は血友病である。別の態様では、血友病は、阻害物質を伴う血友病Ａまたは血友病Ｂを含む。別の態様では、投与は、皮下経路経由である。別の態様では、投与は、静脈内経路経由である。
別の態様では、本発明は出血症状を低減する方法を提供する。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、実施例および図面から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本開示の好ましい実施形態を示してはいるが、この詳細な説明から、本開示の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が当業者には明らかであり、したがって、これらは実例として与えられているにすぎないことを理解されたい。
特許または特許出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。このカラー図面（単一または複数）を含む特許または特許出願公開公報のコピーは、要求があれば、有料で米国特許商標局より提供される。
（図１Ａ）５μｇ／ｍｌのビタミンＫ３の存在下で、ＦＩＸ－ＣＴＰおよびＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ変異体で遺伝子導入および選択された限界希釈ハーベスト細胞を示す棒グラフである。ＦＩＸのレベルは、ヒトＦＩＸ ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号ＦＩＸ－ＡＧ ＲＵＯ）を用いて定量した。算出されたタンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）は、２回の独立した実験の平均値である。（図１Ｂ）ＦＩＸ抗体認識のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル顕微鏡写真を示し、ウエスタンブロットでの抗ＦＩＸ抗体の認識を示す。図１Ｂのレーン１には、組換えＦＩＸを含有する試料をロードし、図１Ｂのレーン２には、ＦＩＸ－ＣＴＰハーベストを含有する試料をロードした。図１Ｂのレーン３には、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２ハーベストを含有する試料をロードした。（図１Ｃ）ＦＩＸ抗体認識のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル顕微鏡写真を示す。図１Ｃは、ウエスタンブロットでの抗γ－カルボキシル化抗体の認識を示す。図１Ｃのレーン１には、組換えＦＩＸを含有する試料をロードした。図１Ｃのレーン２には、ＦＩＸ－ＣＴＰハーベストを含有する試料をロードした。図１Ｃのレーン３には、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２ハーベストを含有する試料をロードした。 ｒｈＦＩＸ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と比較して、匹敵する発色活性（ＥＣ５０濃度により測定）を示す、ＦＩＸ－ＣＴＰおよびＦＩＸ－（ＣＴＰ）２ハーベストを示すグラフである。 ｒｈＦＩＸ、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰのハーベスト、およびＦＩＸ－ＣＴＰのハーベストのＰＫプロファイルを示すグラフである。 ヒトＦＩＸ ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号ＦＩＸ－ＡＧ ＲＵＯ）を用いて決定した、ＦＩＸ－ＣＴＰのハーベストおよびＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰハーベストおよびＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ精製タンパク質のＦＩＸ抗原のレベルを示す棒グラフである。算出したタンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）は、２つの独立した実験の平均である。 （図５Ａ）ＦＩＸ抗体認識のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル顕微鏡写真およびクマシーブルー染色を示す。レーン１には、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２を含有する試料をロードした。レーン２には、非結合ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２を含有する試料をロードした。レーン３には、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２の濃縮された溶出液を含有する試料をロードした。（図５Ｂ）ＦＩＸ抗体認識のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル顕微鏡写真およびウエスタンブロットでの抗ＦＩＸ抗体の認識を示す。レーン１には、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２を含有する試料をロードした。レーン２には、非結合ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２を含有する試料をロードした。レーン３には、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２の濃縮された溶出液を含有する試料をロードした。（図５Ｃ）ＦＩＸ抗体認識のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル顕微鏡写真およびウエスタンブロットでの抗γ－カルボキシル化抗体の認識を示す。レーン１には、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２を含有する試料をロードした。レーン２には、非結合ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２を含有する試料をロードした。レーン３には、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２の濃縮された溶出液を含有する試料をロードした。 ヒト正常プール血漿およびｒｈＦＩＸ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と比較して、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２発色活性（試料濃度／Ｏ．Ｄ．）を示すグラフである。 精製ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ、ｒｈＦＩＸ、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰのハーベスト、およびＦＩＸ－ＣＴＰのハーベストのＰＫプロファイルを示すグラフである。 （図８Ａ）３、４または５個のＣＴＰに融合したＦＩＸの抗ＣＴＰおよび抗γ－カルボキシル化抗体のウエスタンブロットを示す。ＦＩＸ－ＣＴＰ３、ＦＩＸ－ＣＴＰ４、およびＦＩＸ－ＣＴＰ５ハーベストを、１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルに、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を、ウエスタンイムノブロットにより、抗ＣＴＰポリクローナル抗体（Ａｄａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を用いて行った。（図８Ｂ）３、４または５個のＣＴＰに融合したＦＩＸの抗ＣＴＰおよび抗γ－カルボキシル化抗体のウエスタンブロットを示す。ＦＩＸ－ＣＴＰ３、ＦＩＸ－ＣＴＰ４、およびＦＩＸ－ＣＴＰ５ハーベストを、１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルに、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を、ウエスタンイムノブロットにより、抗Ｇｌａ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いて行った。 ＦＩＸ－ＣＴＰ３、ＦＩＸ－ＣＴＰ４、およびＦＩＸ－ＣＴＰ５のクマシーブルー検出を示す。Ｊａｃａｌｉｎカラムを利用する精製プロセス（グリコシル化タンパク質の免疫親和性精製）後、ＦＩＸ－ＣＴＰ３、ＦＩＸ－ＣＴＰ４、およびＦＩＸ－ＣＴＰ５を１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルに、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、試料検出のためにクマシーブルー色素により、染色した。 ＦＩＸ発色活性を示す図である。完全に精製された（ＨＡカラム）ＦＩＸ－ＣＴＰ３、ＦＩＸ－ＣＴＰ４およびＦＩＸ－ＣＴＰ５の、対ヒトプール正常血漿のインビトロ効力の比較評価を、市販の発色活性試験キット、ＢＩＯＰＨＥＮ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ ２２１８０２）を用いて行った。全ての試料を、系列希釈し、正常ヒト血漿からなる参照調製物に対して用量反応曲線を比較することによって、効力を評価した。 ＦＩＸ－ＣＴＰ３、ＦＩＸ－ＣＴＰ４およびＦＩＸ－ＣＴＰ５の薬物動態（ＰＫ）プロファイルの比較を示す。血漿試料中のＦＩＸ濃度を、ヒトＦＩＸ Ｅｌｉｓａキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を用いて定量した。薬物動態プロファイルを算出した。これは各々時点で３匹の動物の平均である。終末半減期は、ＰＫ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ２．０ソフトウェアを用いて算出した。 （図１２Ａ）ＦＩＸ－ＣＴＰ３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析－クマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。ＦＩＸ－ＣＴＰ３ γ－カルボキシル化富化タンパク質、ｒｈＦＩＸおよびｒＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）を、１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルに対して、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー分析は、クマシーブルー試薬（８００ｎｇのタンパク質）を用いてゲルを染色することにより行った。（図１２Ｂ）ＦＩＸ－ＣＴＰ３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析－クマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。ＦＩＸ－ＣＴＰ３ γ－カルボキシル化富化タンパク質、ｒｈＦＩＸおよびｒＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）を、１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルに対して、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてロードした。ウエスタンイムノブロットは、１００ｎｇのタンパク質を用いて、抗ヒトＦＩＸポリクローナル抗体で行った。（図１２Ｃ）ＦＩＸ－ＣＴＰ３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析－クマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。ＦＩＸ－ＣＴＰ３ γ－カルボキシル化富化タンパク質、ｒｈＦＩＸおよびｒＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）を、１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルに対して、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてロードした。ウエスタンイムノブロットは、１００ｎｇのタンパク質を用いて、抗ヒトγ－カルボキシル化モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号４９９，３５７０）で行った。（図１２Ｄ）ＦＩＸ－ＣＴＰ３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析－クマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。ＦＩＸ－ＣＴＰ３ γ－カルボキシル化富化タンパク質、ｒｈＦＩＸおよびｒＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）を、１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルに対して、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてロードした。ウエスタンイムノブロットを、１００ｎｇのタンパク質を用いて、抗ＦＩＸプロペプチドポリクローナル抗体で行った。 （図１２Ｅ）ＦＩＸ－ＣＴＰ３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析－クマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。ＦＩＸ－ＣＴＰ３ γ－カルボキシル化富化タンパク質、ｒｈＦＩＸおよびｒＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）を、１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルに対して、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてロードした。ウエスタンイムノブロットは、１００ｎｇのタンパク質を用いて、抗ＣＴＰポリクローナル抗体で行った。 ＦＩＸ－ＣＴＰ３発色活性を示す。ＦＩＸ－ＣＴＰ３ハーベストおよびＦＩＸ－ＣＴＰ３ γ－カルボキシル化富化タンパク質、対ヒトプール正常血漿のインビトロ効力の比較評価を、市販の発色活性試験キット、ＢＩＯＰＨＥＮ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ ２２１８０２）を用いて行った。ＦＩＸ－ＣＴＰ３ハーベストおよびタンパク質を系列希釈し、その効力を、用量反応曲線を、正常ヒト血漿からなる参照調製物と比較することによって評価した。 凝固時間の比較を示す。インビトロａＰＴＴ（活性化部分トロンビン時間アッセイ）を行い、ＦＩＸ－ＣＴＰ３の凝固活性をＢｅｎｅＦＩＸに対して比較した。このタンパク質を系列希釈し、ヒトＦＩＸ－枯渇血漿中にスパイクして、凝固時間を評価した。 ＦＩＸ－ＣＴＰ３のＰＫプロファイルの比較を示す。ＦＩＸ濃度は、ヒトＦＩＸのＥＬＩＳＡキットｓ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号ＦＩＸ－ＡＧ ＲＵＯ）を用いて定量した。薬物動態プロファイルを各々のタンパク質について算出した。これは、各時点での３匹の動物の平均である。 （図１６Ａ）ＰＫサンプリングと並行して、ＦＩＸ－ＣＴＰ３を投与したＦＩＸ欠損動物のクエン酸処理した血漿試料を、ａＰＴＴアッセイによって、それらの凝固活性を評価し、これを活性％に変換した。各収集時点での活性％を、その時点の凝固時間／正常なプールマウス血漿の凝固時間ｘ１００として算出した。（図１６Ｂ）ＰＫサンプリングと並行して、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）を投与したＦＩＸ欠損動物のクエン酸処理した血漿試料を、ａＰＴＴアッセイによって、それらの凝固活性を評価し、これを活性％に変換した。各収集時点での活性％を、その時点の凝固時間／正常なプールマウス血漿の凝固時間ｘ１００として算出した。 （図１７Ａ）第一のチャレンジ出血パラメーターを示す。ＦＩＸ欠損マウスに、１００ＩＵ／ＫｇのＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）またはｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の単回静脈注射を投与した。尾静脈を、投与後４８時間でわずかにクリップして、尾静脈出血時間（ＴＶＢＴ）を評価した。第二の出血チャレンジを、恒常性到達１５分後に行い、同じパラメーターを測定した。（図１７Ｂ）第一の出血チャレンジのパラメーターを示す。ＦＩＸ欠損マウスに、１００ＩＵ／ＫｇのＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）またはｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の単回静脈注射を投与した。尾静脈を、投与後４８時間でわずかにクリップして、尾静脈出血時間（ＴＶＢＴ）を評価した。第二の出血チャレンジを、恒常性到達１５分後に行い、同じパラメーターを測定した。 （図１７Ｃ）第一のチャレンジ出血パラメーターを示す。ＦＩＸ欠損マウスに、１００ＩＵ／ＫｇのＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）またはｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の単回静脈注射を投与した。尾静脈を、投与４８時間後にわずかにクリップして、出血強度（ヘモグロビンＯＤ）を評価した。第二の出血チャレンジを、恒常性到達１５分後に行い、同じパラメーターを測定した。（図１７Ｄ）第一のチャレンジ出血パラメーターを示す。ＦＩＸ欠損マウスに、１００ＩＵ／ＫｇのＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）またはｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の単回静脈注射を投与した。尾静脈を、投与４８時間後にわずかにクリップして、出血強度（ヘモグロビンＯＤ）を評価した。第二の出血チャレンジを、恒常性到達１５分後に行い、同じパラメーターを測定した。 （図１８Ａ）第二のチャレンジ出血パラメーターを示す。図１９に対する凡例に記載の第一の出血が自然にまたは手動で停止すると、第二の出血チャレンジを、第一の１５分後に行い、時間を再測定した。（図１８Ｂ）第二のチャレンジ出血パラメーターを示す。図１９に対する凡例に記載の第一の出血が自然にまたは手動で停止すると、第二の出血チャレンジを、第一の１５分後に行い、時間を再測定した。 （図１８Ｃ）第二のチャレンジ出血パラメーターを示す。図１９に対する凡例に記載の第一の出血が自然にまたは手動で停止すると、第二の出血チャレンジを、第一の１５分後に行い、出血強度を再測定した。（図１８Ｄ）第二のチャレンジ出血パラメーターを示す。図１９に対する凡例に記載の第一の出血が自然にまたは手動で停止すると、第二の出血チャレンジを、第一の１５分後に行い、出血強度を再測定した。 （図１９Ａ）ｒＦＶＩＩ－ＣＴＰ構築物を示す図である。（図１９Ｂ）ｒＦＶＩＩ－ＣＴＰ－ＣＴＰ構築物を示す図である。（図１９Ｃ）ｒＦＩＸ－ＣＴＰ構築物を示す図である。（図１９Ｄ）ｒＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ構築物を示す図である。 （図２０Ａ）５μｇ／ｍｌのビタミンＫ３の存在下で、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ変異体で遺伝子導入および選択された限界希釈ハーベストクローン細胞を示す棒グラフである。ＦＶＩＩのレベルは、ＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡを用いて定量した（ＡｓｓａｙＰｒｏ）。 （図２０Ｂ）５μｇのビタミンＫ３の存在下で、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ変異体で遺伝子導入および選択された限界希釈ハーベスト細胞を示す棒グラフである。ＦＶＩＩ活性は、ＦＶＩＩ発色活性アッセイ（ＡｓｓａｙＰｒｏ）を用いて定量した。（図２０Ｃ）５μｇのビタミンＫ３の存在下で、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ変異体で遺伝子導入および選択された限界希釈のハーベスト細胞を示す棒グラフである。ＦＶＩＩの比活性は、各々のタイプについて、活性値を、ハーベストのＦＶＩＩ濃度で割ることによって、算出した。 （図２０Ｄ）ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ－ＣＴＰ、およびＦＶＩＩ－ＣＴＰのハーベストのＰＫプロファイルを示すグラフである。 （図２１Ａ）抗ＦＶＩＩ、抗ＣＴＰ、および抗γ－カルボキシル化抗体を用いて検出された、３、４および５個のＣＴＰを融合したＦＶＩＩのウエスタンブロットを示す。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４、およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５のハーベストを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎプラス二重色タンパク質マーカー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲル（ｅｘｐｅｄｅｏｎ）にロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を、ウエスタンイムノブロットにより、抗ＦＶＩＩを用いて行った。（図２１Ｂ）抗ＦＶＩＩ、抗ＣＴＰ、および抗γ－カルボキシル化抗体を用いて検出された、３、４および５個のＣＴＰを融合したＦＶＩＩのウエスタンブロットを示す。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４、およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５のハーベストを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎプラス二重色タンパク質マーカー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲル（ｅｘｐｅｄｅｏｎ）にロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を、ウエスタンイムノブロットにより、抗ＣＴＰポリクローナル抗体（Ａｄａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を用いて行った。（図２１Ｃ）抗ＦＶＩＩ、抗ＣＴＰ、および抗γ－カルボキシル化抗体を用いて検出された、３、４および５個のＣＴＰを融合したＦＶＩＩのウエスタンブロットを示す。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４、およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５のハーベストを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎプラス二重色タンパク質マーカー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲル（ｅｘｐｅｄｅｏｎ）にロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を、ウエスタンイムノブロットにより、抗Ｇｌａ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いて行った。 ＦＶＩＩ活性－発色活性を示す図である。正常なヒトプール血漿に対するＨＡ精製された（高度にγ－カルボキシル化された画分）ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４、およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５のインビトロ効力の比較評価を、市販の発色活性試験キット、ＢＩＯＰＨＥＮ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ ２２１３０４）を用いて行った。全ての試料を、系列希釈し、正常ヒト血漿からなる参照調製物に対して用量反応曲線を比較することによって、効力を評価した。 ＦＶＩＩ３、４および５ＣＴＰの薬物動態（ＰＫ）プロファイルの第１の比較を示す。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４、およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５（それぞれ、Ａ群、Ｂ群およびＣ群）を、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに対する単回の静脈注射（１処置あたり６匹のラット）により、体重１ｋｇあたり２５０μｇの用量で投与した。血液試料を、投与の０．０８３、０．５、２、５、８、２４、４８、７２および９６時間で交互に３匹のラットから眼窩後部より採取した。クエン酸処理血漿（０．３８％）をサンプリング直後に調製して、－２０℃で分析時まで保存した。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ５は、２つの他のタイプと比較して優れたプロファイルを示した。 ＦＶＩＩ３、４および５のＣＴＰのＰＫプロファイルの第２の比較を示す。ＦＶＩＩ選択およびＨＡ精製プロセス（それぞれ、Ａ群、Ｂ群およびＣ群）の後のＦＶＩＩ－ＣＴＰ３、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４、およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５を、単回静脈注射で、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（１物質あたり３匹のラット）に対して、体重１ｋｇあたり２９．４５μｇ／ｋｇの用量で投与した。血液試料を、投与の０．０８３、０．５、２、８、２４、４８、および７２時間後に眼窩後部より吸引した。クエン酸処理血漿（０．３８％）をサンプリング直後に調製して、－２０℃で分析時まで保存した。 （図２５Ａ）ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３精製プロセスの模式図を示す。バッチ３１は、ＰＫ／ＰＤ試験のために作製した。（図２５Ｂ）ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３精製プロセスの模式図を示す。バッチ３８は、生存試験のために作製した。 （図２６Ａ）最終のＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａのＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す。１０μｇ（バッチ３１）または５μｇ（バッチ３８）を、クマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥの各レーンにロードした。１．ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３ポリペプチド、２．重鎖（３ｘＣＴＰを含む）、３．軽鎖。３個全ての抗体が、ＦＶＩＩを検出する。（図２６Ｂ）最終のＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａのＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す。１０μｇ（バッチ３１）または５μｇ（バッチ３８）を、クマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥの各レーンにロードした。１．ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３ポリペプチド、２．重鎖（３ｘＣＴＰを含む）、３．軽鎖。（図２６Ｃ）最終のＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａのＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す。１０μｇ（バッチ３１）または５μｇ（バッチ３８）を、クマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥの各レーンにロードした。１．ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３ポリペプチド、２．重鎖（３ｘＣＴＰを含む）、３．軽鎖。（図２６Ｄ）最終のＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａのＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す。１０μｇ（バッチ３１）または５μｇ（バッチ３８）を、クマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥの各レーンにロードした。１．ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３ポリペプチド、２．重鎖（３ｘＣＴＰを含む）、３．軽鎖。 （図２６Ｅ）最終のＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａのＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す。１０μｇ（バッチ３１）または５μｇ（バッチ３８）を、クマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥの各レーンにロードした。１．ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３ポリペプチド、２．重鎖（３ｘＣＴＰを含む）、３．軽鎖。（図２６Ｆ）最終のＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａのＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す。１μｇのタンパク質を、ウエスタンブロットの各々のレーンにロードした。１．ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３ポリペプチド、２．重鎖（３ｘＣＴＰを含む）、３．軽鎖。３個全ての抗体が、ＦＶＩＩを検出する。ＦＶＩＩａ軽鎖は、α－ＦＶＩＩを用いて検出される。（図２６Ｇ）最終のＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａのＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す。１μｇのタンパク質を、ウエスタンブロットの各々のレーンにロードした。１．ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３ポリペプチド、２．重鎖（３ｘＣＴＰを含む）、３．軽鎖。３個全ての抗体が、ＦＶＩＩを検出する。ＦＶＩＩａ重鎖は、α－ＣＴＰにより検出される。（図２６Ｈ）最終のＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａのＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを示す。１μｇのタンパク質を、ウエスタンブロットの各々のレーンにロードした。１．ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３ポリペプチド、２．重鎖（３ｘＣＴＰを含む）、３．軽鎖。３個全ての抗体が、ＦＶＩＩを検出する。ＦＶＩＩａ重鎖は、α－Ｇｌａにより検出される。 ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３の発色活性が、セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムでの精製の結果として増強されたことを示す。工程中の画分におけるＦＶＩＩ－ＣＴＰ３ハーベスト、および精製されたＦＶＩＩ－ＣＴＰ３、対ヒトプール正常血漿のインビトロ効力の比較評価を、市販の発色活性試験キット、ＢＩＯＰＨＥＮ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ ２２１３０４）を用いて行った。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３ハーベストおよびタンパク質を系列希釈し、その効力を、用量反応曲線を正常ヒト血漿の参照調製物に対し比較することによって、評価した。 ＦＶＩＩＩ欠損マウスにおける、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３対ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）のＰＫプロファイルを示す。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３は、ＦＶＩＩ選択、ＨＡ精製プロセスおよび活性化後に生成された。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を、単回の静脈注射で、ＦＶＩＩＩ－／－血友病マウスに投与した。血液試料は、投与の０．０８３、０．５、２、８、２４、４８、および７２時間後に眼窩後部より採取した。クエン酸処理血漿（０．３８％）を、サンプリング直後に調製して、－２０℃で分析時まで保存し、ＰＫプロファイルを、ＳＴＡＣＬＯＴ市販のキットを用いてＦＶＩＩａ凝固活性に基づいて確証した。 （図２９Ａ）ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３は、ＦＶＩＩ選択、ＨＡ精製プロセスおよび活性化後に生成された。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を、単回の静脈注射で、ＦＶＩＩＩ－／－血友病マウスに投与した。血液試料は、投与の０．０８３、０．５、２、８、２４、４８、および７２時間後に眼窩後部より採取した。クエン酸処理血漿（０．３８％）をサンプリング直後に調製して、－２０℃で分析時まで保存した。トロンビン生成パラメーターを、ＰＫ実験の間に評価し、ピークに対する最大量を含むパラメーターを評価した。（図２９Ｂ）ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３は、ＦＶＩＩ選択、ＨＡ精製プロセスおよび活性化後に生成された。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を、単回の静脈注射で、ＦＶＩＩＩ－／－血友病マウスに投与した。血液試料は、投与の０．０８３、０．５、２、８、２４、４８、および７２時間後に眼窩後部より採取した。クエン酸処理血漿（０．３８％）をサンプリング直後に調製して、－２０℃で分析時まで保存した。トロンビン生成パラメーターは、ＰＫ実験の間に評価し、各時点に対するトロンビンの量を含むパラメーターを評価した。（図２９Ｃ）ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３は、ＦＶＩＩ選択、ＨＡ精製プロセスおよび活性化後に生成された。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を、単回の静脈注射で、ＦＶＩＩＩ－／－血友病マウスに投与した。血液試料は、投与の０．０８３、０．５、２、８、２４、４８、および７２時間後に眼窩後部より採取した。クエン酸処理血漿（０．３８％）をサンプリング直後に調製して、－２０℃で分析時まで保存した。トロンビン生成パラメーターは、ＰＫ実験の間に評価し、トロンビン生成速度を含むパラメーターを評価した。 （図３０Ａ）尾静脈横切開（ＴＶＴ）後の血友病性マウス生存曲線を示す。ＴＶＴは、投与１５分後に行った。マウス生存は、ＴＶＴ後２４時間にわたり観察し、最初の１２時間の間は１時間ごとに、および２４時間後に記録した。対照群データ（ビークル）は、実験あたり５匹のマウスによる３つの実験の合計である。（図３０Ｂ）尾静脈横切開（ＴＶＴ）後の血友病マウス生存曲線を示す。ＴＶＴは、ＳＣ投与２４時間後に行った。マウス生存は、ＴＶＴ後２４時間にわたり観察し、最初の１２時間の間１は時間ごとに、および２４時間後に記録した。対照群データ（ビークル）は、実験あたり５匹のマウスによる３つの実験の合計である。（図３０Ｃ）尾静脈横切開（ＴＶＴ）後の血友病マウス生存曲線を示す。ＴＶＴは、投与４８時間後に行った。マウス生存は、ＴＶＴ後２４時間にわたり観察し、最初の１２時間の間は１時間ごとに、および２４時間後に記録した。対照群データ（ビークル）は、実験あたり５匹のマウスによる３つの実験の合計である。（図３０Ｄ）ＴＶＴの２４時間後に記録したマウス生存をまとめたものである。 （図３１Ａ）ＧＬＡに対しブロットした、ＦＶＩＩ－３ＣＴＰおよびＦＶＩＩ－５ＣＴＰのイムノブロットを示す。（図３１Ｂ）ＦＶＩＩに対しブロットした、ＦＶＩＩ－３ＣＴＰおよびＦＶＩＩ－５ＣＴＰのイムノブロットを示す。 （図３１Ｃ）ＣＴＰに対しブロットした、ＦＶＩＩ－３ＣＴＰおよびＦＶＩＩ－５ＣＴＰのイムノブロットを示す。 選択およびＨＡカラム精製（ＦＶＩＩＳ対ＦＶＩＩ ＨＡ）由来のＰＫプロファイル－ＦＶＩＩ３および５ＣＴＰの比較を示す。 ＰＫプロファイル－ＦＶＩＩ３および５のＣＴＰの比較－第２の試験（ＩＶ対ＳＣ）を示す。 ＳＣ投与後に尾静脈横切開（ＴＶＴ）した後の血友病性マウスの生存曲線を示す。ＴＶＴは、投与１２時間後に行った。マウス生存は、ＴＶＴ後２４時間にわたり観察し、最初の１２時間の間１時間ごとに、および２４時間後に記録した。 （図３５Ａ）ＩＶ投与後のＭＯＤ－５０１４対ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）のＰＫプロファイルを示す。（図３５Ｂ）ＳＣ投与後のＭＯＤ－５０１４対ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）のＰＫプロファイルを示す。 単回のＳＣ投与後、ＭＯＤ－５０１４（クローン６１番号７５、番号８１）対ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）のＰＫプロファイルを示す。 ワルファリンがＰＴおよびａＰＴＴ値を高めることを示す。ＳＤラットは、１０ｍｇ／Ｋｇのワルファリンの経口投与を受け、指定時点で血液試料を採取された。血漿を調製し、ＰＴおよびａＰＴＴ値を測定した。 ワルファリン処置ラットに対する、ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）のＩＶ注射の急性効果。 広範囲のＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）用量に対する、注射２４時間後のワルファリン処置ラットの応答を示す。 投与の４８時間後までに、ＭＯＤ－５０１４がＰＴ値を正常値まで回復し、一方で、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の効果が２４時間後にはもやは存在しないことを示す。 ２４および４８時間後に、ＭＯＤ－５０１４のＩＶ注射により、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）に比べて、ワルファリン処置ラットの出血時間が短くなることを示す。 投与の４８時間後までに、ＭＯＤ－５０１４がＰＴ値を正常値まで回復することができ、一方で、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の効果が２４時間後にはもはや存在しないことを示す。 投与の４８時間にわたり、失血を低レベルに保持することにより、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）よりも優れていることを示す。 組織因子経路阻害物質（ＴＦＰＩ）は、類似の用量依存性方式でＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を阻害することを示す。 抗トロンビンＩＩＩは、類似の方法でＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を阻害したことを示す。 ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）による第Ｘ因子活性化の結果を示す。両者の結果はほぼ同じである。 ＴＦＰＩ（２０μｇ／ｍｌ～０．００２ｎｇ／ｍｌ）の存在下での、０．６ｎｇ／ｍｌで存在するＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）による第Ｘ因子活性化を示す。 ＴＦＰＩ（２０μｇ／ｍｌ～０．００２ｎｇ／ｍｌ）の存在下での、４．０ｎｇ／ｍｌで存在するＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）による第Ｘ因子活性化を示す。 ＴＦＰＩおよびヘパリンの存在下での第Ｘ因子活性化を示し、この場合、ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は類似の活性化を示した。 抗トロンビンＩＩＩの存在下での第Ｘ因子活性化を示し、この場合、ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は類似の活性化を示した。 ヘパリンの存在下での、ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）による第Ｘ因子活性化を示し、この場合には、類似の中等度の阻害が観察された。 抗トロンビンおよびヘパリンの存在下での、ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）による類似の第Ｘ因子活性化を示す。 高リン脂質（ＰＬ）濃度での、市販のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）に比べた、ＭＯＤ－５０１４トロンビン生成プロファイルを示す。 低リン脂質（ＰＬ）濃度での、市販のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）に比べた、ＭＯＤ－５０１４ピークトロンビン生成プロファイルを示す。 （図５５Ａ－図５５Ｂ）ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）に対するトロンボエラストグラフィ結果を示し、両方が凝固時間を短縮し、凝血塊形成速度を高めた。 カルシウム再沈着後のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）トロンビン生成（ＴＧ）結果を示す。（実験＃１） カルシウム再沈着後のＭＯＤ－５０１４トロンビン生成（ＴＧ）結果を示す。（実験＃１） 類似の濃度での、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ）結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ）ＴＧ結果のオーバーレイ分析である。（Ａ）は１．２５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｂ）は５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｃ）は１５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｄ）は２．５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｅ）は１０μｇ／ｍｌでの結果である。（実験＃１） 異なる濃度での、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ）結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ）ＴＧ結果のオーバーレイ分析である。（Ａ）は１．２５μｇ／ｍｌのＮＳおよび２．５μｇ／ｍｌのＰＲＯの結果を示す。（Ｂ）は５μｇ／ｍｌのＮＳおよび１０μｇ／ｍｌのＰＲＯの結果を示す。（Ｃ）は２．５μｇ／ｍｌのＮＳおよび５μｇ／ｍｌのＰＲＯの結果を示す。（Ｄ）は１０μｇ／ｍｌのＮＳおよび１５μｇ／ｍｌのＰＲＯの結果を示す。（実験＃１） 異なる濃度のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ）に対する、カルシウム再沈着後のＮＳトロンビン生成（ＴＧ）結果を示す。（実験＃２） 異なる濃度のＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ）に対する、カルシウム再沈着後のＰＲＯトロンビン生成（ＴＧ）結果を示す。（実験＃２） 類似の濃度での、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ）の結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ）ＴＧの結果のオーバーレイ分析である。（Ａ）は１．２５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｂ）は５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｃ）は１５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｄ）は２．５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｅ）は１０μｇ／ｍｌでの結果である。（実験＃２） 異なる濃度での、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ）の結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ）ＴＧの結果のオーバーレイ分析である。（Ａ）は１．２５μｇ／ｍｌのＮＳおよび２．５μｇ／ｍｌのＰＲＯの結果を示す。（Ｂ）は５μｇ／ｍｌのＮＳおよび１０μｇ／ｍｌのＰＲＯの結果を示す。（Ｃ）は２．５μｇ／ｍｌのＮＳおよび５μｇ／ｍｌのＰＲＯの結果を示す。（Ｄ）は１０μｇ／ｍｌのＮＳおよび１５μｇ／ｍｌのＰＲＯの結果を示す。（実験＃２） 低ＴＦ濃度での、カルシウム再沈着後のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）によるＴＧのデータを示す。（実験＃１） 低ＴＦ濃度での、カルシウム再沈着後のＭＯＤ－５０１４によるＴＧのデータを示す。（実験＃１） 類似の濃度での、低ＴＦでのカルシウム再沈着後の、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ）の結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ）の結果のオーバーレイ分析である。（Ａ）は１．２５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｂ）は５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｃ）は１５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｄ）は２．５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｅ）は１０μｇ／ｍｌでの結果である。（実験＃１） 低ＴＦ濃度での、カルシウム再沈着後のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）によるＴＧのデータを示す。（実験＃２） 低ＴＦ濃度での、カルシウム再沈着後のＭＯＤ－５０１４によるＴＧのデータを示す。（実験＃２） 類似の濃度下、低ＴＦでのカルシウム再沈着後の、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ）の結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ）の結果のオーバーレイ分析である。（Ａ）は１．２５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｂ）は５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｃ）は１５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｄ）は２．５μｇ／ｍｌでの結果である。（Ｅ）は１０μｇ／ｍｌでの結果である。（実験＃２） 異なる濃度での、低ＴＦでのカルシウム再沈着後の、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ）の結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ）の結果のオーバーレイ分析である。（Ａ）は１．２５μｇ／ｍｌのＮＳおよび５μｇ／ｍｌのＰＲＯの結果を示す。（Ｂ）は５μｇ／ｍｌのＮＳおよび１５μｇ／ｍｌのＰＲＯの結果を示す。（Ｃ）は２．５μｇ／ｍｌのＮＳおよび１０μｇ／ｍｌのＰＲＯの結果を示す。（実験＃２） 低ＴＦの存在および非存在下での、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）およびＭＯＤ－５０１４による結果と比較した、ＦＶＩＩＩによる完全なトロンビン生成を示す。 低ＴＦの存在および非存在下での、ＦＶＩＩＩによるトロンビン生成のオーバーレイ分析である。 漸増濃度のＴＦでの、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ；１．２５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ；１．２５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果のオーバーレイ分析である。（実験＃１） 漸増濃度のＴＦでの、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ；１．２５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ；１．２５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果のオーバーレイ分析である。（Ａ）は０ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｂ）は１ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｃ）は５ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｄ）は０．５ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｅ）は２．５ｐＭのＴＦでの結果である。（実験＃１） 漸増濃度のＴＦでの、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ；２．５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ；２．５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果のオーバーレイ分析である。（実験＃１） 漸増濃度のＴＦでの、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ；２．５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ；２．５μｇ／ｋｇ）の結果のオーバーレイ分析である。（Ａ）は０ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｂ）は１ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｃ）は５ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｄ）は０．５ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｅ）は２．５ｐＭのＴＦでの結果である。（実験＃１） 漸増濃度のＴＦでの、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ；５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ；５μｇ／ｋｇ）の結果のオーバーレイ分析である。（実験＃１） 漸増濃度のＴＦでの、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ；５μｇ／ｋｇ）ＴＧ結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ；５μｇ／ｋｇ）結果のオーバーレイ分析である。（Ａ）は０ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｂ）は１ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｃ）は５ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｄ）は０．５ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｅ）は２．５ｐＭのＴＦでの結果である。（実験＃１） ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ）の存在下で、漸増濃度のＴＦによる用量依存性ＴＧ応答を示す。（Ａ）は１．２５μｇ／ｋｇのＮＳでの結果である。（Ｂ）は５μｇ／ｋｇのＮＳでの結果である。（Ｃ）は２．５μｇ／ｋｇのＮＳでの結果である。（実験＃１） ＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ）の存在下で、漸増濃度のＴＦによる用量依存性ＴＧ応答を示す。（Ａ）は１．２５μｇ／ｋｇのＰＲＯでの結果である。（Ｂ）は５μｇ／ｋｇのＰＲＯでの結果である。（Ｃ）は２．５μｇ／ｋｇのＰＲＯでの結果である。（実験＃１） 漸増濃度のＴＦでの、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ；１０μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ；１０μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果のオーバーレイ分析である。（実験＃２） 漸増濃度のＴＦでの、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ；２．５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ；２．５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果のオーバーレイ分析である。（実験＃２） 漸増濃度のＴＦでの、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ；５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ；５μｇ／ｋｇ）の結果のオーバーレイ分析である。（実験＃２） ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ）の存在下で、漸増濃度のＴＦによる用量依存性ＴＧ応答を示す。（Ａ）は２．５μｇ／ｍｌのＮＳでの結果である。（Ｂ）は１０μｇ／ｍｌのＮＳでの結果である。（Ｃ）は５μｇ／ｍｌのＮＳでの結果である。（実験＃２） ＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ）の存在下で、漸増濃度のＴＦによる用量依存性ＴＧ応答を示す。（Ａ）は２．５μｇ／ｍｌのＰＲＯでの結果である。（Ｂ）は１０μｇ／ｍｌのＰＲＯでの結果である。（Ｃ）は５μｇ／ｍｌのＰＲＯでの結果である。（実験＃２） 漸増濃度のＴＦでの、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ；１０μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ；１０μｇ／ｋｇ）の結果のオーバーレイ分析である。（Ａ）は０ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｂ）は１ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｃ）は５ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｄ）は０．５ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｅ）は２．５ｐＭのＴＦでの結果である。（実験＃２） 漸増濃度のＴＦでの、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ；２．５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果に対するＭＤ－５０１４（ＰＲＯ；２．５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果のオーバーレイ分析である。（Ａ）は０ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｂ）は１ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｃ）は５ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｄ）は０．５ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｅ）は２．５ｐＭのＴＦでの結果である。（実験＃２） 漸増濃度のＴＦでの、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＮＳ；５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果に対するＭＯＤ－５０１４（ＰＲＯ；５μｇ／ｋｇ）ＴＧの結果のオーバーレイ分析である。（Ａ）は０ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｂ）は１ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｃ）は５ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｄ）は０．５ｐＭのＴＦでの結果である。（Ｅ）は２．５ｐＭのＴＦでの結果である。（実験＃２） ＭＯＤ－５０１４をスパイクした後のイヌの血液のＷＢＣＴのグラフを示す。 ２コンパートメント薬物動態モデルの模式図を示す。 イヌにおけるＩＶ注入後の平均血漿ＭＯＤ－５０１４濃度の、時間に対するグラフである。 イヌにおけるＩＶ注入後の平均血漿ＭＯＤ－５０１４活性の、時間に対するグラフである。 イヌにおける５０μｇ／ｋｇのＩＶ注入後のＭＯＤ－５０１４血漿中濃度および活性の比較データを示す。図９３（Ａ）はイヌＰ１４の結果を示し、図９３（Ｂ）はイヌＮ０６の結果を示す。 イヌにおける２００μｇ／ｋｇのＩＶ注入後のＭＯＤ－５０１４血漿中濃度および活性の比較データを示す。図９４（Ａ）はイヌＢｌｏｎｄｉｅの結果を示し、図９４（Ｂ）はイヌＪｏｓｉｅの結果を示す。 図９４（Ｃ）はイヌＮ０６の結果を示し、図９４（Ｄ）はイヌＰ１４の結果を示す。 イヌにおける４００μｇ／ｋｇのＩＶ注入後のＭＯＤ－５０１４血漿中濃度および活性の比較データを示す。図９５（Ａ）はイヌＢｌｏｎｄｉｅの結果を示し、図９５（Ｂ）はイヌＪｏｓｉｅの結果を示す。 イヌにおける６００μｇ／ｋｇのＩＶ注入後のＭＯＤ－５０１４血漿中濃度および活性の比較データを示す。図９６（Ａ）はイヌＮ０５の結果を示し、図９６（Ｂ）はイヌＪｏａｎｉｅの結果を示す。 血漿中ＭＯＤ－５０１４濃度の、時間に対するプロットを示す。点は観察血漿中濃度を示し、線はＴ１／２の算出に使用した最終スロープを示す。図９７（Ａ）は３０時間を超える時間後のイヌＮ０６の結果を示し、図９７（Ｂ）は３０時間を超える時間後のイヌＰ１４の結果を示す。 図９７（Ｃ）は約５０時間後のイヌＢｌｏｎｄｉｅの結果を示し、図９７（Ｄ）は約５０時間後のイヌＪｏｓｉｅの結果を示す。 図９７（Ｅ）はほぼ１００時間後のイヌＮ０６の結果を示し、図９７（Ｆ）はほぼ１００時間後のイヌＰ１４の結果を示す。 図９７（Ｇ）はほぼ１００時間後のイヌＢｌｏｎｄｉｅの結果を示し、図９７（Ｈ）はほぼ１００時間後のイヌＪｏｓｉｅの結果を示す。 図９７（Ｉ）はほぼ１００時間後のイヌＪｏａｎｉｅの結果を示し、図９７（Ｊ）はほぼ１００時間後のイヌＮ０５の結果を示す。 血漿中ＭＯＤ－５０１４活性の、時間に対するプロットを示す。点は観察血漿中濃度を示し、線はＴ１／２の算出に使用した最終スロープを示す。図９８（Ａ）は３０時間を超える時間後のイヌＮ０６の結果を示し、図９８（Ｂ）は３０時間を超える時間後のイヌＰ１４の結果を示す。 図９８（Ｃ）はほぼ５０時間後のイヌＢｌｏｎｄｉｅの結果を示し、図９８（Ｄ）は約５０時間後のイヌＪｏｓｉｅの結果を示す。 図９８（Ｅ）はほぼ５０時間後のイヌＮ０６の結果を示し、図９８（Ｆ）はほぼ５０時間後のイヌＰ１４の結果を示す。 図９８（Ｇ）はほぼ５０時間後のイヌＢｌｏｎｄｉｅの結果を示し、図９８（Ｈ）はほぼ５０時間後のイヌＪｏｓｉｅの結果を示す。 図９８（Ｉ）はほぼ５０時間後のイヌＪｏａｎｉｅの結果を示し、図９８（Ｊ）はほぼ５０時間後のイヌＮ０５の結果を示す。 モデリングによる血漿中濃度の結果を示す。点は観察血漿中濃度を示し、実線はモデルにより予測された濃度を示す。図９９（Ａ）はイヌＮ０６の結果を示し、図９９（Ｂ）はイヌＰ１４の結果を示す。 図９９（Ｃ）はイヌＢｌｏｎｄｉｅの結果を示し、図９９（Ｄ）はイヌＪｏｓｉｅの結果を示す。 図９９（Ｅ）はほぼ１００時間後のイヌＮ０６の結果を示し、図９９（Ｆ）はほぼ１００時間後のイヌＰ１４の結果を示す。 図９９（Ｇ）はほぼ１００時間後のイヌＢｌｏｎｄｉｅの結果を示し、図９９（Ｈ）はほぼ１００時間後のイヌＪｏｓｉｅの結果を示す。 図９９（Ｉ）はほぼ１００時間後のイヌＪｏａｎｉｅの結果を示し、図９９（Ｊ）はほぼ１００時間後のイヌＮ０５の結果を示す。 モデリングによる活性の結果を示す。点は観察血漿活性を示し、実線はモデルにより予測された活性を示す。図１００（Ａ）は少なくとも３２時間後のイヌＮ０６の結果を示し、図１００（Ｂ）は少なくとも３２時間後のイヌＰ１４の結果を示す。 図１００（Ｃ）は少なくとも４８時間後のイヌＢｌｏｎｄｉｅの結果を示し、図１００（Ｄ）は少なくとも４８時間後のイヌＪｏｓｉｅの結果を示す。 図１００（Ｅ）は少なくとも４８時間後のイヌＮ０６の結果を示し、図１００（Ｆ）は少なくとも４８時間後のイヌＰ１４の結果を示す。 図１００（Ｇ）は少なくとも４８時間後のイヌＢｌｏｎｄｉｅの結果を示し、図１００（Ｈ）は少なくとも４８時間後のイヌＪｏｓｉｅの結果を示す。 図１００（Ｉ）は少なくとも４８時間後のイヌＪｏａｎｉｅの結果を示し、図１００（Ｊ）は少なくとも４８時間後のイヌＮ０５の結果を示す。 イヌＮ０６における、５０、２００または４００μｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４の投与後のカオリン開始ＴＥＧ動力学の用量依存性変化を示す。（Ａ）Ｒ－時間（反応時間）、（Ｂ）Ｋ－時間（Ｒの終わりから凝血塊が２０ｍｍに達するための時間、凝血塊形成速度）、（Ｃ）角度（Ｋが到達されたときにできる曲線の接線）、および（Ｄ）ＭＡ（最大振幅）を示す。 イヌＰ－１４における、５０および２００μｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４の投与後のカオリン開始ＴＥＧ動力学の用量依存性変化を示す。（Ａ）はＲ－時間（反応時間）、（Ｂ）Ｋ－時間（Ｒの終わりから凝血塊が２０ｍｍに達するための時間、凝血塊形成速度）、（Ｃ）角度（Ｋが到達されたときにできる曲線の接線）、および（Ｄ）ＭＡ（最大振幅）を示す。 イヌＢｌｏｎｄｉｅにおける、２００および４００μｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４の投与後のカオリン開始ＴＥＧ動力学の用量依存性変化を示す。（Ａ）Ｒ－時間（反応時間）、（Ｂ）Ｋ－時間（Ｒの終わりから凝血塊が２０ｍｍに達するための時間、凝血塊形成速度）、（Ｃ）角度（Ｋが到達されたときにできる曲線の接線）、および（Ｄ）ＭＡ（最大振幅）を示す。 イヌＪｏｓｉｅにおける、２００および４００μｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４の投与後のカオリン開始ＴＥＧ動力学の用量依存性変化を示す。（Ａ）Ｒ－時間（反応時間）、（Ｂ）Ｋ－時間（Ｒの終わりから凝血塊が２０ｍｍに達するための時間、凝血塊形成速度）、（Ｃ）角度（Ｋが到達されたときにできる曲線の接線）、および（Ｄ）ＭＡ（最大振幅）を示す。 イヌＪｏａｎｉｅにおける、５０、２００または４００μｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４の投与後のカオリン開始ＴＥＧ動力学の用量依存性変化を示す。（Ａ）Ｒ－時間（反応時間）、（Ｂ）Ｋ－時間（Ｒの終わりから凝血塊が２０ｍｍに達するための時間、凝血塊形成速度）、（Ｃ）角度（Ｋが到達されたときにできる曲線の接線）、および（Ｄ）ＭＡ（最大振幅）を示す。 イヌＮ０５におけるＭＯＤ－５０１４投与後の経時的ＴＥＧ動力学を示す。（Ａ）Ｒ－時間（反応時間）、（Ｂ）Ｋ－時間（ＲＴの終わりから凝血塊が２０ｍｍに達するための時間、凝血塊形成速度）、（Ｃ）角度（Ｋが到達されたときにできる曲線の接線）、および（Ｄ）ＭＡ（最大振幅）を示す。 ２７０μｇ／ｋｇのｒｈＦＶＩＩａの投与後のＴＥＧ特性の変化を示す。（Ａ）Ｒ－時間（反応時間）、（Ｂ）角度（Ｋが到達されたときにできる曲線の接線）、（Ｃ）Ｋ－時間（ＲＴの終わりから凝血塊が２０ｍｍに達するための時間、凝血塊形成速度）、および（Ｄ）ＭＡ（最大振幅）を示す。 個々の動物（Ｂｌｏｎｄｉｅ）由来の代表的データである、ＭＯＤ－５０１４の長時間にわたるＴＥＧ効果を示す。（Ａ）Ｒ－時間（反応時間）、（Ｂ）Ｋ－時間（ＲＴの終わりから凝血塊が２０ｍｍに達するための時間、凝血塊形成速度）、（Ｃ）角度（Ｋが到達されたときにできる曲線の接線）、（Ｄ）ＭＡ（最大振幅）を示す。（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）の矢印は、投与４時間後のＭＯＤ－５０１４のＴＥＧ値を示す。 ｐＣＩ－ｄｈｆｒ－ＭＯＤ－５０１４プラスミドのマップを示す。 ラット毒性調査の合算した代表的ＰＫ－ＰＤプロファイルを示し、血漿中濃度（ｎｇ／ｍｌ）の経時的変化率は、中空正方形で示され、活性（ｍＵ／ｍｌ）の経時的変化率は、中空丸で示される。 サル毒性調査の合算した代表的ＰＫ－ＰＤプロファイルを示し、血漿中濃度（ｎｇ／ｍｌ）の経時的変化率は、中空丸で示され、活性（ｍＵ／ｍｌ）の経時的変化率は、中空正方形で示される。 雄カニクイザルにおけるＩＶボーラス投与後の平均血漿ＭＯＤ－５０１４濃度の、時間に対するグラフである。 雄カニクイザルにおけるＩＶボーラス投与後の平均ＭＯＤ－５０１４凝固活性の、時間に対するグラフである。 雄カニクイザルにおける１ｍｇ／ｋｇのＩＶボーラス注入後のＭＯＤ－５０１４血漿中濃度および凝固活性の比較のグラフである。 雄カニクイザルにおける７．５ｍｇ／ｋｇのＩＶボーラス注入後のＭＯＤ－５０１４血漿中濃度および凝固活性の比較のグラフである。 雄カニクイザルにおける１５ｍｇ／ｋｇのＩＶボーラス注入後のＭＯＤ－５０１４血漿中濃度および凝固活性の比較のグラフである。 （図１１７Ａ－図１１７Ｄ）個々の血漿ＭＯＤ－５０１４濃度および凝固活性の、時間に対するグラフである。 （図１１７Ｅ－図１１７Ｈ）個々の血漿ＭＯＤ－５０１４濃度および凝固活性の、時間に対するグラフである。 （図１１７Ｉ－図１１７Ｌ）個々の血漿ＭＯＤ－５０１４濃度および凝固活性の、時間に対するグラフである。 （図１１７Ｍ－図１１７Ｐ）個々の血漿ＭＯＤ－５０１４濃度および凝固活性の、時間に対するグラフである。 （図１１７ＡＱ－図１１７Ｒ）個々の血漿ＭＯＤ－５０１４濃度および凝固活性の、時間に対するグラフである。 ＭＯＤ－５０１４またはＦＶＩＩａ処理血小板の平均蛍光強度を示すグラフである。 ＭＯＤ－５０１４またはＦＶＩＩａ処理血小板におけるトロンビン生成を示すグラフである。 ＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）とＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＭＯＤ－５０１４）との間の基質（Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＦＶＩＩａ）切断活性の比較を示す。 組織因子に結合した場合の、ＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）とＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＭＯＤ－５０１４）との間の基質（Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＦＶＩＩａ）活性の比較を示す。 第ＶＩＩａ因子の濃度に対する、ＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）またはＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａ（ＭＯＤ－５０１４）による活性化第Ｘ因子の生成の比較を示す。 第Ｘ因子の濃度に対する、ＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）またはＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａ（ＭＯＤ－５０１４）による活性化第Ｘ因子の生成の比較を示す。 組織因子の非存在下での、脂質濃度に対する、ＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）またはＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａ（ＭＯＤ－５０１４）による活性化第Ｘ因子の生成速度の比較を示す（図１２４Ａ）。組織因子の非存在下での、脂質濃度に対する、ＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）またはＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａ（ＭＯＤ－５０１４）による活性化第Ｘ因子の生成の比較を示す（図１２４Ｂ）。 組織因子の非存在下での、第Ｘ因子濃度に対する、ＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）とＭＯＤ－５０１４との間の活性化第Ｘ因子の生成の比較を示す。 ポリブレンを考慮して、ＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）およびＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＭＯＤ－５０１４）による基質（Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＦＶＩＩａ）切断の阻害の比較を示す。 ＴＦＰＩ濃度に対して（図１２７Ａ）、およびＦＶＩＩａのＴＦＰＩ暴露期間に対して（図１２７Ｂ）、ＭＯＤ－５０１４のＴＦＰＩ暴露期間に対して（図１２７Ｃ）、ＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）およびＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＭＯＤ－５０１４）による基質（Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＦＸａ）切断の阻害の比較を示す。
一実施形態では、本発明は、長時間作用型凝固因子、ならびにこれを製造する方法および使用する方法を提供する。別の実施形態では、長時間作用型凝固因子は、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ、ＣＴＰ単位とも呼ばれる）を含む。別の実施形態では、凝固因子を含む長時間作用型ポリペプチドはさらに、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む。別の実施形態では、ＣＴＰは、凝固因子の分解に対する保護剤として機能する。別の実施形態では、ＣＴＰは、凝固因子のＣｍａｘを延長させる。別の実施形態では、ＣＴＰは、凝固因子のＴｍａｘを延長させる。別の実施形態では、ＣＴＰは、凝固因子の循環半減期を延長させる。いくつかの実施形態では、ＣＴＰは、凝固因子の効力を増強する。
別の実施形態では、本明細書において、凝固因子の生物学的半減期を延長させる方法が提供され、該方法は、凝固因子のカルボキシ末端に１～１０個のＣＴＰを結合し、これによって、この凝固因子の生物学的半減期を延長させるステップを含む。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子の生物学的半減期を延長させる方法が提供され、該方法は、凝固因子のカルボキシ末端に１～５個のＣＴＰを結合し、これによって、凝固因子の生物学的半減期を延長するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、凝固因子の循環半減期を延長させる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、凝固因子の半減期を延長させる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、凝固因子の半減期を延長させる方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、ＣＴＰ修飾凝固因子を含む医薬組成物に関する。
一実施形態では、本開示は、緩衝液、等張化剤、ならびに凝固因子および前記凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰからなるＣＴＰ修飾ポリペプチドを含む医薬製剤に関する。
一実施形態では、本開示は、血友病ＡまたはＢの対象に、週１回投与するための製剤に関する。別の実施形態では、対象は、凝固因子欠損症を有する。別の実施形態では、対象は、後天性血友病を有する。別の実施形態では、本開示は、凝固因子欠損症、または血友病を有する対象に対する週１回投与のための医薬製剤の作製プロセスに関し、該プロセスは、
（ａ）凝固因子を、３個の絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰを前記凝固因子のカルボキシ末端に結合することにより、修飾するステップ、
（ｂ）上記ステップ（ａ）で修飾した凝固因子を前記緩衝液、および前記等張化剤と約６．４のｐＨで混合するステップ、および
（ｃ）前記製剤をシリンジにプレフィルするステップ、を含む。
一実施形態では、本開示は、本明細書で提供される製剤をシリンジに充填するプロセスに関し、該プロセスは、
（ａ）所定量のＣＴＰ修飾凝固因子を有する前記ＣＴＰ修飾凝固因子の週１回剤形を処方するステップ、および
（ｂ）前記製剤をシリンジに充填するステップ、を含む。
一実施形態では、「医薬組成物」または「医薬製剤」は、生理学的に適切な担体および賦形剤などの他の化学成分を含む、本明細書で記載の１種または複数の有効成分の配合物を意味する。医薬組成物または「医薬製剤」の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。特定の実施形態では、「医薬組成物」または「医薬製剤」は、医薬品剤形の薬剤を提供する。特定の実施形態では、「医薬組成物」または「医薬製剤」は、持続放出技術剤形、経皮貼付剤、または当該技術分野において既知の任意の剤形を含む。
凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、不活性なプロ酵素として血流中に肝細胞により分泌される４４４アミノ酸の糖タンパク質（５０ＫＤａ）である。組織損傷および循環血液への暴露の際に、ＦＶＩＩは、ＦＶＩＩに対する真のレセプタータンパク質であり、かつ血管壁の深部層に局在する種々の細胞により発現される、組織因子（ＴＦ）との複合体を形成する。このＦＶＩＩ－ＴＦ複合体の形成は、ＦＶＩＩの活性化をもたらす。活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）は、第ＩＸ因子および第Ｘ因子を活性化することによって、外因性の凝固経路を開始する。
ＦＶＩＩは、凝固系と関連するビタミンＫ依存性糖タンパク質の群に属する。ＦＶＩＩ以外に、この群は、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣおよびプロトロンビンからなる。これらのタンパク質は、同様のドメイン構成を有し、Ｎ末端プロペプチドを有する前駆体、続いて成熟アミノ酸配列として合成される。このプロペプチドは、グルタミン酸（Ｇｌｕ）をγ－カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）へ変換するガンマカルボキシラーゼに対するドッキング部位を含む。このドメインには、２つの上皮細胞増殖因子様（ＥＧＦ）ドメイン、連結部位（ＣＲ）およびＣ末端セリンプロテアーゼドメインが続く。分泌の前に、ＦＶＩＩプロペプチドは切断されて、４０６アミノ酸の単鎖チモーゲンＦＶＩＩ糖タンパク質を形成する。分泌後、このタンパク質は、ＣＲでの切断によって、ジスルフィド連結の二本鎖のヘテロ二量体、ＦＶＩＩａへと活性化され得る。ＦＶＩＩの血漿中濃度は、１０ｎＭであり、健常者では、約１％が活性型で循環する。他の実施形態では、ＣＴＰ修飾ＦＶＩＩは、少なくとも１つのＯ結合型グリコシル化部位の占有を含む。他の実施形態では、ＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａは、少なくとも１つのＯ結合型グリコシル化部位の占有を含む。
第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は、４１５個のアミノ酸（５５ＫＤａ）の糖タンパク質であり、これは、凝固系と関連するビタミンＫ依存性の糖タンパク質の群に属する。ＦＩＸは、第ＦＶＩＩ因子、第Ｘ因子、プロテインＣおよびプロトロンビン（これらは、Ｎ末端プロペプチドを有する前駆体として、続いて成熟アミノ酸配列として合成される）と同様のドメイン構成を有する。
ＦＩＸは、複雑な転写後修飾（その多くが生化学的および薬物動態学的特性にとって重要である）を受ける単鎖分子として分泌される。全ての転写後修飾の中で、ビタミンＫ依存性のγ－カルボキシラーゼによって、γ－カルボキシル化されるＦＩＸのアミノ末端に近い１２個のグルタミン酸残基が、最も重要なものである。カルボキシル化は、リン脂質表面とのＦＩＸの相互作用に、および最適のＦＩＸ活性にとって必要である。このアミノ末端プロペプチドは、γ－カルボキシラーゼの認識部位として機能し、従ってγ－カルボキシル化後に、これは、対塩基性アミノ酸切断酵素（ＰＡＣＥ／フーリン）として既知のゴルジ装置セリンプロテアーゼにより切断される。４つの追加的な転写後修飾（チロシン１５５の硫酸化、セリン１５８のリン酸化、Ｓｅｒ６３および６１でのＯ－グリコシル化、ならびに最終的には、Ａｓｎ１５７および１６でのＮ－グリコシル化）がゴルジ装置で生じ得るが、ＦＩＸの適切な活性に必要ではないことが示された。
ＦＩＸは、血漿中（５μｇ／ｍｌの平均濃度）で、単鎖の不活性なチモーゲンとして循環する。２つのペプチド結合（Ａｒｇ１４５およびＡｒｇ１８０）での、１つまたは２つの生理学的な活性化因子、ＦＶＩＩａ－ＴＦ複合体またはＦＩＸａのいずれかによるタンパク質分解性の切断の際に、活性化ペプチドは除去され、ＦＩＸが単一のジスルフィド結合によって、一緒に保持される軽鎖および重鎖からなる完全に活性な酵素に変換される。Ｎ末端軽鎖は、非触媒性γ－カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）および２つの上皮増殖因子様ドメインを含むが、このＣ末端重鎖は、この分子のトリプシン様触媒性ドメインを含む。ＦＩＸａ単独は、不十分な触媒活性を特徴とする。しかし、ＦＶＩＩＩと複合体化した場合、そのタンパク質分解性活性は、その天然の基質ＦＸに対して４～５倍の大きさまで増大する。
別の実施形態では、本明細書において、凝固因子の生物学的半減期を延長させる方法、または凝固因子の曲線下面積（ＡＵＣ）を増大させる方法が提供され、該方法は、凝固因子のカルボキシ末端に１～１０個のＣＴＰを結合し、これによって、この凝固因子の生物学的半減期を延長するかまたはＡＵＣを増大させるステップを含む。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子の生物学的半減期を延長させる方法、または凝固因子の曲線下面積（ＡＵＣ）を増大させる方法が提供され、該方法は、凝固因子のカルボキシ末端に１～５個のＣＴＰを結合し、これによって、この凝固因子の生物学的半減期を延長するかまたはＡＵＣを増大させるステップを含む。別の実施形態では、本明細書において、ＦＩＸの生物学的半減期を延長させる方法またはＦＩＸの曲線下面積（ＡＵＣ）を増大させる方法が提供され、該方法は、１～５個のＣＴＰをＦＩＸのカルボキシ末端に結合し、これによって、ＦＩＸの生物学的半減期を延長するかまたはＦＩＸのＡＵＣを増大させるステップを含む。別の実施形態では、本明細書において、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａの生物学的半減期を延長させる方法またはＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａの曲線下面積（ＡＵＣ）を増大させる方法が提供され、該方法は、１～５個のＣＴＰをＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａのカルボキシ末端に結合し、これによって、ＦＶＩＩもしくはＦＶＩＩａの生物学的半減期を延長するかまたはＡＵＣを増大させるステップを含む。
別の実施形態では、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドの生物学的半減期を延長させる方法を提供し、この方法は、３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合し、これによって、前記ＦＩＸポリペプチドの生物学的半減期を延長させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドの生物学的半減期を延長させる方法をさらに提供し、該方法は、１～最大５個までの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合し、これによって、前記ＦＶＩＩａポリペプチドの生物学的半減期を延長させるステップを含む。一実施形態では、３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）が、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合される。別の実施形態では、４個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）が前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合される。別の実施形態では、５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）が前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合される。
別の実施形態では、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドの曲線下面積（ＡＵＣ）を増大させる方法を提供し、該方法は、３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合し、これによって、前記ＦＩＸポリペプチドのＡＵＣを増大させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドの曲線下面積（ＡＵＣ）を増大させる方法を提供し、該方法は、最大５個までの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合し、これによって、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのＡＵＣを増大させるステップを含む。一実施形態では、３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）が、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合される。別の実施形態では、４個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）が前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合される。別の実施形態では、５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）が前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合される。
別の実施形態では、本開示の凝固因子はタンパク質である。別の実施形態では、本開示の凝固因子はペプチドである。別の実施形態では、本開示の凝固因子はポリペプチドである。別の実施形態では、凝固因子は酵素である。別の実施形態では、凝固因子は、セリンプロテアーゼである。別の実施形態では、凝固因子は、糖タンパク質である。別の実施形態では、凝固因子は、トランスグルタミナーゼである。別の実施形態では、凝固因子は、不活性なチモーゲンである。別の実施形態では、凝固因子は、当業者に既知の任意の凝固因子である。
別の実施形態では、凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である。別の実施形態では、凝固因子は、第Ｖ因子（ＦＶ）である。別の実施形態では、凝固因子は、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）である。別の実施形態では、凝固因子は、第Ｘ因子（ＦＸ）である。別の実施形態では、凝固因子は、フィブリンである。
別の実施形態では、凝固因子は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）である。別の実施形態では、凝固因子は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）である。別の実施形態では、凝固因子は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）である。別の実施形態では、凝固因子は、第Ｘ因子（ＦＸ）である。別の実施形態では、凝固因子は、第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）である。別の実施形態では、凝固因子は、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）である。別の実施形態では、凝固因子は、第Ｘａ因子（ＦＸａ）である。別の実施形態では、凝固因子は、第Ｖａ因子（ＦＶａ）である。別の実施形態では、凝固因子は、プロトロンビンである。別の実施形態では、凝固因子は、トロンビンである。別の実施形態では、凝固因子は、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）である。別の実施形態では、凝固因子は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）である。別の実施形態では、凝固因子は、第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）である。別の実施形態では、凝固因子は、Ｂ－欠失ドメインＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩＢＤＤ）である。別の実施形態では、凝固因子は、Ｂドメイン－欠失ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩＢＤＤ）である。別の実施形態では、凝固因子は、βドメイン－欠失ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩＢＤＤ）である。別の実施形態では、凝固因子は、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）である。別の実施形態では、凝固因子は、プレカリクレインである。別の実施形態では、凝固因子は、カリクレインである。別の実施形態では、凝固因子は、第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）である。別の実施形態では、凝固因子は、フィブリノーゲンである。別の実施形態では、凝固因子は、トロンボモジュリンである。別の実施形態では、凝固因子は、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）である。
別の実施形態では、凝固因子は、糖タンパク質である。別の実施形態では、凝固因子は、ビタミンＫ依存性糖タンパク質である。別の実施形態では、凝固因子は、ビタミンＫ非依存性糖タンパク質である。
別の実施形態では、凝固因子は、組換えタンパク質である。別の実施形態では、凝固因子は、組換え糖タンパク質である。別の実施形態では、凝固因子は、組換え糖タンパク質ＦＶである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＶＩである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＶＩＩである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＶＩＩＩである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＩＸである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＸである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＸＩである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＸＩＩである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＶＷである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＩＩである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＩＸａである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＸＩａである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えフィブリンである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＶＩＩａである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＸａである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＶａである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えプロトロンビンである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えトロンビンである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＶＩＩＩａである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えプレカリクレインである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えカリクレインである。別の実施形態では、凝固因子は、組換えＦＸＩＩａである。別の実施形態では、凝固因子は、任意の既知の組換え凝固因子である。別の実施形態では、単一のペプチドを含む凝固因子は、任意の既知の組換え凝固因子である。別の実施形態では、組換え凝固因子は、シグナルペプチドを含まない。別の実施形態では、活性化凝固因子は、シグナルペプチドを含まない。
別の実施形態では、凝固因子は、Ｃ末端に結合された１～１０個のＣＴＰ反復を含み、Ｎ末端に結合されたＣＴＰを含まない。別の実施形態では、凝固因子は、Ｃ末端に結合された少なくとも１個のＣＴＰを含み、Ｎ末端に結合されたＣＴＰを含まない。別の実施形態では、Ｃ末端に結合した１～１０個のＣＴＰ反復を含み、Ｎ末端に結合されたＣＴＰを含まない凝固因子は、操作された凝固因子である。別の実施形態では、Ｃ末端に結合された少なくとも１個のＣＴＰを含み、Ｎ末端に結合されたＣＴＰを含まない凝固因子は、操作された凝固因子である。別の実施形態では、Ｃ末端に結合された１～１０個のＣＴＰ反復を含み、Ｎ末端に結合されたＣＴＰを含まない凝固因子は、複合体化された凝固因子である。別の実施形態では、Ｃ末端に結合された少なくとも１個のＣＴＰを含み、Ｎ末端に結合されたＣＴＰを含まない凝固因子は、複合体化された凝固因子である。
一実施形態では、本発明は、ＦＩＸポリペプチドと、前記ＣＴＰ修飾ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを提供する。
別の実施形態では、本発明はさらに、ＦＶＩＩａポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａのカルボキシ末端に結合した５個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明はさらに、ＦＶＩＩａポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを提供する。
別の実施形態では、凝固因子は、ＦＩＸ、ＦＶＩＩ、第Ｘ因子、プロテインＣ、またはプロトロンビンのドメイン組織化と同様または同一のドメイン組織化を含む凝固因子である。別の実施形態では、凝固因子は、Ｎ末端プロペプチドを有する前駆体として合成される。別の実施形態では、凝固因子は、本明細書において用いられる場合、不活性なプロ酵素型である。別の実施形態では、凝固因子は、肝細胞中で生成される。別の実施形態では、凝固因子は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）をγ－カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）に変換するγ－カルボキシラーゼのためのドッキング部位を含む。別の実施形態では、凝固因子は、本明細書において用いられる場合、市販の凝固因子である。
一実施形態では、第ＶＩＩ因子をコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含む：
Figure 0007187505000001
別の実施形態では、第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000002
別の実施形態では、第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000003
別の実施形態では、第ＶＩＩ因子－ＣＴＰ（カルボキシ末端に結合）をコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含む：
Figure 0007187505000004
別の実施形態では、第ＶＩＩ因子－ＣＴＰ（カルボキシ末端に結合）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000005
別の実施形態では、第ＶＩＩ因子－ＣＴＰ－ＣＴＰ（カルボキシ末端に結合）をコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含む：
Figure 0007187505000006
別の実施形態では、第ＶＩＩ因子－ＣＴＰ－ＣＴＰ（カルボキシ末端に結合）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000007
別の実施形態では、第ＶＩＩ因子－ＣＴＰ－ＣＴＰ－ＣＴＰ（カルボキシ末端に結合）をコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含む：
Figure 0007187505000008
別の実施形態では、第ＶＩＩ因子－ＣＴＰ－ＣＴＰ－ＣＴＰ（カルボキシ末端に結合）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000009
別の実施形態では、配列番号２５のアミノ酸１～３８は、シグナル配列を含む。
別の実施形態では、シグナルペプチドを欠く第ＶＩＩ因子－ＣＴＰ－ＣＴＰ－ＣＴＰ（カルボキシ末端に結合）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000010
別の実施形態では、活性化第ＶＩＩ因子－ＣＴＰ－ＣＴＰ－ＣＴＰ（カルボキシ末端に結合）（ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３）のアミノ酸配列は、シグナルペプチドを欠き、配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３は、シグナルペプチドを欠き、配列番号４６の相同体を含む。別の実施形態では、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３は、シグナルペプチドを欠き、配列番号４６の変異体を含む。別の実施形態では、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３のアミノ酸配列は、残基１５２の位置のアルギニン（Ｒ）と、残基１５３の位置のイソロイシン（Ｉ）との間で切断される。別の実施形態では、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３のアミノ酸配列は、それぞれの鎖上に存在するシステイン残基間のジスルフィドＳ－Ｓ架橋を含むジスルフィド結合二本鎖ヘテロダイマー構造として存在する。別の実施形態では、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３のアミノ酸配列は、軽鎖中に存在するシステイン残基と重鎖中に存在するシステイン残基との間のスルフィド－Ｓ－Ｓ－結合により連結した軽鎖および重鎖を含むヘテロダイマー構造として存在する。別の実施形態では、軽鎖はＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３アミノ酸配列のＮ末端断片を含み、重鎖はＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３アミノ酸配列のＣ末端断片を含む。別の実施形態では、システイン残基は、いずれかの鎖の任意のシステイン残基であってよい。別の実施形態では、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３のアミノ酸配列は、配列番号４６のシステイン残基１３５とシステイン残基２６２との間のＳ－Ｓ架橋を含むジスルフィド結合二本鎖ヘテロダイマー構造として存在し、前記二本鎖は、アミノ酸１～１５２を含む軽鎖およびアミノ酸１５３～４９０を含む重鎖を含む。
別の実施形態では、軽鎖は、変性条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥで、約２５ｋＤａ移動する。別の実施形態では、重鎖は、変性条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥで、約５０ｋＤａ移動する。別の実施形態では、重鎖は、変性条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥで、約６０ｋＤａ移動する。
別の実施形態では、第ＶＩＩ因子－（ＣＴＰ）４（カルボキシ末端に結合）をコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含む：
Figure 0007187505000011
別の実施形態では、第ＶＩＩ因子－（ＣＴＰ）４（カルボキシ末端に結合）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000012
別の実施形態では、第ＶＩＩ因子－（ＣＴＰ）５（カルボキシ末端に結合）をコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含む：
Figure 0007187505000013
別の実施形態では、第ＶＩＩ因子－（ＣＴＰ）５（カルボキシ末端に結合）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000014
別の実施形態では、第ＩＸ因子をコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含む：
Figure 0007187505000015
別の実施形態では、第ＩＸ因子のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000016
別の実施形態では、第ＩＸ因子－ＣＴＰ（カルボキシ末端に結合）をコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含む：
Figure 0007187505000017
別の実施形態では、第ＩＸ因子－ＣＴＰ（カルボキシ末端に結合）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000018
別の実施形態では、第ＩＸ因子－ＣＴＰ－ＣＴＰ（カルボキシ末端に結合）をコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含む：
Figure 0007187505000019
別の実施形態では、第ＩＸ因子－ＣＴＰ－ＣＴＰ（カルボキシ末端に結合）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000020
別の実施形態では、第ＩＸ因子－（ＣＴＰ）３（カルボキシ末端に結合）をコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含む：
Figure 0007187505000021
別の実施形態では、第ＩＸ因子－（ＣＴＰ）３（カルボキシ末端に結合）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000022
別の実施形態では、第ＩＸ因子－（ＣＴＰ）４（カルボキシ末端に結合）をコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含む：
Figure 0007187505000023
別の実施形態では、第ＩＸ因子－（ＣＴＰ）４（カルボキシ末端に結合）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000024
別の実施形態では、第ＩＸ因子－（ＣＴＰ）５（カルボキシ末端に結合）をコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含む：
Figure 0007187505000025
別の実施形態では、第ＩＸ因子－（ＣＴＰ）５（カルボキシ末端に結合）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000026
別の実施形態では、フーリンが、本開示の凝固因子－ＣＴＰを発現する細胞に添加される。別の実施形態では、フーリンは、細胞中の本開示の凝固因子－ＣＴＰの生成効率を増大する。別の実施形態では、フーリンは、本開示の凝固因子－ＣＴＰのコード配列を含むベクターで同時遺伝子導入される。別の実施形態では、フーリンは、別のベクターによって、コードされる。別の実施形態では、フーリンおよび凝固因子－ＣＴＰは、１個のベクターによって、コードされる。別の実施形態では、フーリンのコード配列が、ｐＣＩ－ＤＨＦＲに挿入される。別の実施形態では、フーリンのコード配列は、ｐＣＩ－ｄｈｆｒ／ｓｍａＩ＋ＮｏｔＩ、フーリン／ＡｓｉｓＩ Ｆ．Ｉ．＋ＮｏｔＩ中で操作される。
別の実施形態では、フーリンをコードする核酸配列は、以下の核酸配列を含む：
Figure 0007187505000027
別の実施形態では、フーリンのアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列を含む：
Figure 0007187505000028
一実施形態では、凝固因子という用語はさらに、既知の凝固因子の相同体を含む。一実施形態では、この相同体は、凝固活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明による相同性はまた、欠失、挿入または置換変異体を含み、これには、そのアミノ酸置換、およびその生物学的に活性なポリペプチドフラグメントを含む。一実施形態では、この変異体は、凝固因子の保存的置換、または三次元構造を大きく変更しない欠失、挿入もしくは置換を含む。別の実施形態では、この欠失、挿入または置換は、一実施形態では、特定の結合相手に結合されている、凝固因子の目的の機能を変更しない。
別の実施形態では、本開示は、凝固因子の相同体を含む。別の実施形態では、本開示は、凝固活性を有している凝固因子の相同体を含む。別の実施形態では、本開示は、機能的結合を有する凝固因子の相同体を含む。別の実施形態では、本開示は、凝固活性を有している本明細書に記載の凝固因子の相同体を含む。別の実施形態では、本開示は、機能的結合を有している本明細書に記載の凝固因子の相同体を含む。別の実施形態では、相同体は、例えば、デフォールトパラメーターを用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて決定して、凝固因子に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同であるポリペプチドである。
別の実施形態では、本開示は、フーリンの相同体を含む。別の実施形態では、本開示は、一実施形態では、前駆体タンパク質の切断である、目的の機能を維持しているフーリンの相同体を含む。別の実施形態では、相同体は、例えば、デフォールトパラメーターを用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを用いて決定して、フーリンに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同であるポリペプチドである。
別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した１～１０個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した１～３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した１～５のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、そのカルボキシ末端に少なくとも１個のＣＴＰを有する凝固因子を含むポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した１～５個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した１～５個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。
本明細書に記載される構成要素またはステップを含む本発明の組成物、製剤および方法は、別の実施形態では、それらの構成要素もしくはステップからなってもよく、または別の実施形態では、それらの構成要素もしくはステップから本質的になってもよいことを理解されたい。いくつかの実施形態では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、ＣＴＰ修飾凝固因子などの、示された活性薬剤の包含、ならびに製薬産業で既知であるような他の活性剤、および薬学的に許容可能な担体、賦形剤、エモリエント、安定剤などの包含を意味する。いくつかの実施形態では、「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、その唯一の有効成分が示された有効成分である組成物であって、ただし処方物を安定化、保存などするためであり、示された有効成分の治療効果には直接関与しない他の化合物が含まれてもよい組成物を意味する。いくつかの実施形態では、「本質的に～からなる」という用語は、有効成分の放出を容易にする成分を意味してもよい。いくつかの実施形態では、「～からなる」という用語は、有効成分、および薬学的に許容可能な担体、または賦形剤を含む組成物を意味する。
一実施形態では、本発明は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～３個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～４個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～５個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～６個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～７個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～８個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～９個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～１０個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。
一実施形態では、本発明は、凝固因子および、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含むポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～４個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～５個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～６個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～７個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～８個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～９個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～１０個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。
一実施形態では、本発明は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～５個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～６個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～７個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～８個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～９のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～１０個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。
一実施形態では、本発明は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～６個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～７個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～８個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～９個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～１０個のＣＴＰとを含むポリペプチドが提供される。
一実施形態では、本発明は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～３個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～４個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～５個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～６個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～７個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～８個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～９個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～１０個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。
一実施形態では、本発明は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～４個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～５個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～６個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～７個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～８個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～９個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～１０個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。
一実施形態では、本発明は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～５個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～６個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～７個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～８個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～９個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～１０個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。
一実施形態では、本発明は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～６個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～７個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～８個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～９個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～１０個のＣＴＰとからなるポリペプチドが提供される。
一実施形態では、本発明は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とから本質的になるポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～３個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～４個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～５個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～６個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～７個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～８個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～９個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した２～１０個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。
一実施形態では、本発明は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とから本質的になるポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～４個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～５個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～６個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～７個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～８個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～９個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～１０個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。
一実施形態では、本発明は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とから本質的になるポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～５個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～６個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～７個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～８個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～９個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した４～１０個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。
一実施形態では、本発明は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とから本質的になるポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～６個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～７個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～８個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～９個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した５～１０個のＣＴＰとから本質的になるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、本明細書において、アミノ末端にＣＴＰを有さない凝固因子を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、アミノ末端にＣＴＰを欠いている凝固因子を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、カルボキシ末端に少なくとも１個のＣＴＰを有しており、かつアミノ末端にＣＴＰを有さない凝固因子を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるポリペプチドが提供される。別の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載の数のＣＴＰをカルボキシ末端に有しており、かつそのアミノ末端にＣＴＰがない凝固因子を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、本発明は、本明細書において、上記されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドと、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組成物をさらに提供する。
別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＶＩＩａ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組成物をさらに提供する。一実施形態では、ＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａは、シグナルペプチドを含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａは、シグナルペプチドを含まない。
一実施形態では、本発明は、本明細書で上記した組換え凝固因子を提供する。一実施形態では、本発明は、上記などの、操作された凝固因子を提供する。一実施形態では、上記などの操作された凝固因子は、ＣＴＰ修飾凝固因子と呼ばれる。
一実施形態では、凝固因子のカルボキシ末端に結合されるＣＴＰは、カルボキシ末端に直列に結合される。
一実施形態では、本明細書に記載の操作された凝固因子は、非ＣＴＰ修飾凝固因子と比較して、等価であるか、または改善された生物学的活性を有する。別の実施形態では、本明細書に記載の操作された凝固因子は、非ＣＴＰ修飾凝固因子と比較して等価または改善された薬理学的評価値を有する。別の実施形態では、本明細書において、記載される操作された凝固因子は、非ＣＴＰ修飾凝固因子と比較して等価または改善された薬物動態を有する。別の実施形態では、本明細書に記載される操作された凝固因子は、非ＣＴＰ修飾凝固因子と比較して等価または改善された薬力学を有する。
一実施形態では、本発明は、血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明のＣＴＰ修飾凝固因子を投与することを含む、対象の血友病を予防または処置する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明のＣＴＰ修飾凝固因子を投与することを含む、対象の血友病を予防および処置する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明のＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子を投与することを含む、対象の血友病を処置する方法を提供する。
一実施形態では、血友病は、血友病Ａである。別の実施形態では、血友病は、血友病Ｂである。別の実施形態では、血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置する本発明の方法は、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する阻害物質を伴うそれぞれ血友病ＡまたはＢの患者の血友病を予防または処置する。別の実施形態では、本発明の方法は、後天性血友病（阻害物質を伴わない血友病）の患者を予防または処置するための方法である。別の実施形態では、血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置する本発明の方法は、阻害物質を伴わない血友病ＡまたはＢを予防または処置する。別の実施形態では、血友病は、重篤な血友病である。別の実施形態では、血友病は、中等度の血友病である。別の実施形態では、血友病は、阻害物質を伴うまたは伴わない、中等度から重篤までの血友病である。用語の「中程度から重篤までの血友病」は、３％以下のＦＶＩＩＩまたはＦＩＸを有する対象を意味することは、当業者には理解されよう。
別の実施形態では、本発明は、本発明のＣＴＰ修飾第ＩＸ因子を投与することを含む、対象の血友病を処置する方法を提供する。一実施形態では、血友病Ｂは、第ＩＸ因子欠損症またはクリスマス病として知られている。一実施形態では、血友病は、重篤な血友病であり、これは、一実施形態では、凝固因子のレベルが０～１％である血友病を表す。別の実施形態では、血友病は、中等度の血友病であり、これは、一実施形態では、凝固因子のレベルが１～５％である血友病を表す。別の実施形態では、この血友病は、軽度の血友病であり、これは、一実施形態では、凝固因子のレベルが５～５０％である血友病を表す。
別の実施形態では、本発明は、対象の血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＦＩＸポリペプチドと、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを前記対象に投与し、それにより、前記対象の血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＦＶＩＩポリペプチドと、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドを前記対象に投与し、それにより、前記対象の血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置することを含む。
別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＦＩＸポリペプチドと、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＦＶＩＩａポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを、前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。
別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の１個または複数のＣＴＰ修飾凝固因子を前記対象に投与することを含む。従って、一実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、ＦＩＸポリペプチドと、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチド、ならびにＦＶＩＩａポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを、前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。一実施形態では、ＣＴＰ修飾ＦＩＸおよびＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａは、同じ組成物中で同時に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ＦＩＸおよびＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａは、別々の組成物として、同時に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ＦＩＸおよびＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａは、別々の組成物として、別々の時点に投与される。
別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）またはＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＦＩＸまたはＦＶＩＩポリペプチドおよび前記ＦＩＸまたは前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む）を前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）またはＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＦＩＸまたはＦＶＩＩポリペプチドおよび前記ＦＩＸまたは前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した４個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む）を前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）またはＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＦＩＸまたはＦＶＩＩポリペプチドおよび前記ＦＩＸまたは前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む）を前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）またはＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＦＩＸまたはＦＶＩＩポリペプチド、および前記ＦＩＸまたは前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合されている３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む）を前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）およびＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＦＩＸおよびＦＶＩＩポリペプチドならびに前記ＦＩＸおよび前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む）を前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）およびＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＦＩＸおよびＦＶＩＩポリペプチド、ならびに前記ＦＩＸおよび前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む）を前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。
別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）またはＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＦＩＸまたはＦＶＩＩポリペプチドおよび前記ＦＩＸまたは前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む）を、皮下または静脈に前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）またはＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＦＩＸまたはＦＶＩＩポリペプチドおよび前記ＦＩＸまたは前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した４個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む）を、皮下または静脈に前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）またはＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＦＩＸまたはＦＶＩＩポリペプチドおよび前記ＦＩＸまたは前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む）を、皮下または静脈に前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）またはＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＦＩＸまたはＦＶＩＩポリペプチドおよび前記ＦＩＸまたは前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む）を、皮下または静脈に前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）およびＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＦＩＸおよびＦＶＩＩポリペプチドならびに前記ＦＩＸおよび前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む）を、皮下または静脈に前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防または処置する方法を提供し、該方法は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）およびＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＦＩＸおよびＦＶＩＩポリペプチドならびに前記ＦＩＸおよび前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む）を、皮下または静脈に前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防または処置することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において、ＣＴＰ修飾凝固因子を対象に投与し、それによって前記対象の血友病を予防するステップを含む、対象の血友病を予防または処置する方法が提供され、該ＣＴＰ修飾凝固因子は、前記凝固因子ポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含み、前記ＣＴＰ修飾凝固因子の配列は、配列番号２５、２７、または２９からなる群より選択される。別の実施形態では、前記ＣＴＰ修飾凝固因子は、配列番号２５、２７、２９または４６からなる群から選択される。別の実施形態では、前記ＣＴＰ修飾凝固因子は、配列番号４６からなる。
一実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３～５個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなる、ＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞を提供する。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなる、ＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞を提供する。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した５個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなる、ＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞を提供する。
一実施形態では、用語の「３～５個」は、ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）に関連する場合、本明細書で提供される凝固因子ポリペプチドのカルボキシ末端に、３個、４個、または５個のＣＴＰを結合することを意味する。
一実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３～５個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなる、ＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなる、ＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した５個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなる、ＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドの生物学的半減期を延長させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合し、それにより、前記ＦＶＩＩポリペプチドの生物学的半減期を延長させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドの生物学的半減期を延長させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合して、それにより、前記ＦＶＩＩポリペプチドの生物学的半減期を延長させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドの生物学的半減期を延長させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合して、それにより、前記ＦＶＩＩポリペプチドの生物学的半減期を延長させるステップを含む。
別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドの曲線下面積（ＡＵＣ）を増大させる方法を提供し、該方法は、３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合し、これによって、前記ＦＶＩＩポリペプチドのＡＵＣを増大させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドの曲線下面積（ＡＵＣ）を増大させる方法を提供し、該方法は、３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合し、それにより、前記ＦＶＩＩポリペプチドのＡＵＣを増大させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドの曲線下面積（ＡＵＣ）を増大させる方法を提供し、該方法は、５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合し、それにより、前記ＦＶＩＩポリペプチドのＡＵＣを増大させるステップを含む。
一実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドの投与頻度を低減させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合して、それにより、前記ＦＶＩＩポリペプチドの投与頻度を低減させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドの投与頻度を低減させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合して、それにより、前記ＦＶＩＩポリペプチドの投与頻度を低減させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドの投与頻度を低減させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合して、それにより、前記ＦＶＩＩポリペプチドの投与頻度を低減させるステップを含む。
一実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドのクリアランス速度を低減させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合して、それにより、前記ＦＶＩＩポリペプチドのクリアランス速度を低減させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドのクリアランス速度を低減させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合して、それにより、前記ＦＶＩＩポリペプチドのクリアランス速度を低減させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドのクリアランス速度を低減させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合して、それにより、前記ＦＶＩＩポリペプチドのクリアランス速度を低減させるステップを含む。
一実施形態では、本発明は、ＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドを製造する方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合し、それにより、ＣＴＰ修飾ＦＶＩＩポリペプチドを製造するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、ＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドを製造する方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合し、それにより、ＣＴＰ修飾ＦＶＩＩポリペプチドを製造するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、ＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドを製造する方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合し、それにより、ＣＴＰ修飾ＦＶＩＩポリペプチドを製造するステップを含む。
別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、ＦＶＩＩポリペプチドと、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドを前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、ＦＶＩＩポリペプチドと、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドを前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、ＦＶＩＩポリペプチドと、前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合した５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドを前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。
別の実施形態では、本明細書において、４個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を前記ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシ末端に結合するステップをさらに含む方法が提供される。
他の実施形態では、操作された凝固因子は、血友病Ｂ患者の処置のためのものである。一実施形態では、カルボキシ末端に３個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、血友病Ｂ患者の処置のためのものである。一実施形態では、カルボキシ末端に４個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、血友病Ｂ患者の処置のためのものである。一実施形態では、カルボキシ末端に５個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、血友病Ｂ患者の処置のためのものである。別の実施形態では、カルボキシ末端に２個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、血友病Ｂ患者の処置のためのものである。別の実施形態では、カルボキシ末端に１個のＣＴＰ反復を含む第ＩＸ凝固因子は、血友病Ｂ患者の処置のためのものである。他の実施形態では、操作された凝固因子によって、患者に必要な注入の回数を低減させるか、患者に必要な用量を低減させるか、またはこれらの組み合わせが可能になる。
一実施形態では、カルボキシ末端に３個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰハーベスト、ＦＩＸ－ＣＴＰハーベストまたはｒｈＦＩＸとの対比でその凝固活性を維持すると同時に、改善されたＰＫプロファイルを示す。一実施形態では、ラットおよびＦＩＸ欠損マウスにおいて、ｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の排出半減期は、ｒＦＩＸよりも２．５倍～４倍長い。一実施形態では、ＦＩＸ欠損マウスにおけるｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の投与は、投与後少なくとも７６時間にわたり、凝固促進効果を顕著に延長した。一実施形態では、ＦＩＸ欠損マウスにおけるｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の投与は、ｒＦＩＸよりも高い活性ピークを生成した。別の実施形態では、カルボキシ末端で２個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、ＦＩＸ－ＣＴＰハーベストまたはｒｈＦＩＸとの対比でその凝固活性を維持すると同時に、改善されたＰＫプロファイルを示す。別の実施形態では、カルボキシル末端に２個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、ｒｈＦＩＸに比較して、半減期の３倍延長、および４．５倍大きいＡＵＣを示す。
別の実施形態では、ＳＣ投与は、ＣＴＰ修飾ＦＶＩＩは、組換えＦＶＩＩより高いバイオアベイラビリティを生ずる。別の実施形態では、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）のＳＣ投与に比較した場合、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３およびＦＶＩＩａ－ＣＴＰ５のＳＣ投与後、半減期はより長く、バイオアベイラビリティ（ＡＵＣ ＳＣ／ＡＵＣ ＩＶ）はより大きい。別の実施形態では、皮下注射ＭＯＤ－５０１４およびＭＯＤ－５０１９は、組換えＦＶＩＩ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））と比較して、マウス生存の改善を示す（下記実施例８を参照のこと）。
一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４は、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３（Ｃ末端に結合した３個のＣＴＰペプチドを有する）である。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４は、長時間作用型凝固因子を提供する。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４は、組換え型ヒトＦＶＩＩａと比較して、より持続性で、長期の血液凝固反応をもたらす。（例えば、実施例１４を参照されたい）。用語のＭＯＤ－５０１４またはＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３は、全く同じ特性および意味を持ち、同義に使用してよく、また、一実施形態では、アミノ酸配列番号４６を含むジスルフィド結合二本鎖ヘテロダイマー構造体を意味し得ることは当業者なら理解されよう。さらに、当業者なら、ＣＴＰ修飾凝固因子、例えば、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３の説明において、用語のＦＶＩＩ－ＣＴＰ３は、特定の場合には、不活性形態のＦＶＩＩ－ＣＴＰ３を意味し得ることを理解するであろう。当業者なら、どの形態が活性などの関連する詳細に基づいて言及されているかを確実にわかるであろう。同様に、用語のＭＯＤ－５０１４は、用語のＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３と同義、すなわち、ＣＴＰ修飾凝固因子の活性型を表すが、特定の場合には、用語のＭＯＤ－５０１４は、ＦＶＩＩの活性型またはＦＶＩＩ－ＣＴＰ３をコードするヌクレオチド配列の意味に使用され得る。このヌクレオチド配列は、その後、発現および細胞から分泌され、精製されて、インビトロで活性化され、ＭＯＤ－５０１４分子中に存在する活性型のＦＶＩＩａを生ずる。
一実施形態では、組織因子経路阻害物質（ＴＦＰＩ）によるＭＯＤ－５０１４の失活は、用量依存性である。一実施形態では、ＴＦＰＩによるＭＯＤ－５０１４の失活は、ＴＦＰＩによる組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））の用量依存性失活パターンとの類似性を示す。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４は、抗トロンビンＩＩＩにより阻害される。一実施形態では、抗トロンビンＩＩＩによるＭＯＤ－５０１４の阻害は、ヘパリンの存在下で増強される。一実施形態では、抗トロンビンＩＩＩによるＭＯＤ－５０１４の阻害は、ヘパリンの存在下または非存在下で、組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））の阻害パターンとの類似性を示す（下記実施例１１参照）。
一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４は、用量依存性方式でトロンビンを生成する。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４はトロンビン生成の誘導期を短くする。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４は血液凝固時間を短くする。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４は血液凝固形成の効率を高める。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４は対象における血液凝固時間を短くする。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４は対象における血液凝固形成の効率を高める。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４によるトロンビンの生成は、組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））により生成されるものに類似である。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４によるトロンビンの生成の誘導期は、組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））により生ずるものに類似である。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４による血液凝固時間の短縮は、組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））によりもたらされるものに類似である。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４による血液凝固形成効率の上昇は、組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））によりもたらされるものに類似である。
本明細書にて提供される場合、ＣＴＰの凝固因子、例えば、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａおよびＦＸ因子への結合は、血液凝固因子の半減期を延長する。実施例１１、１２および１３は、ＣＴＰ結合、例えば、ＦＶＩＩａに結合した３個のＣＴＰは、血液凝固活性に影響を与えるようには見えない。一実施形態では、ＦＶＩＩへのＣＴＰ結合は、血餅形成と干渉しない。一実施形態では、ＦＶＩＩへのＣＴＰ結合は、血餅形成効率の上昇とは干渉しない。一実施形態では、ＦＶＩＩへのＣＴＰ結合は、血液凝固時間の短縮とは干渉しない。一実施形態では、リン脂質のＦＶＩＩへの結合は、ＣＴＰの血液凝固因子への結合後にも維持される。一実施形態では、ＦＶＩＩＡへのＣＴＰ結合は、血餅形成と干渉しない。一実施形態では、ＦＶＩＩＡへのＣＴＰ結合は、血餅形成効率の上昇とは干渉しない。一実施形態では、ＦＶＩＩＡへのＣＴＰ結合は、血餅形成の減少とは干渉しない。一実施形態では、リン脂質のＦＶＩＩＡへの結合は、ＣＴＰの血液凝固因子への結合後にも維持される。
別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、ＦＩＸポリペプチドと、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを、前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、ＦＩＸポリペプチドと、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを、前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、ＦＩＸポリペプチドと、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを、前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、ＦＶＩＩａポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。
別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載の１個または複数のＣＴＰ修飾凝固因子を前記対象に投与することを含む。従って、一実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、ＦＩＸポリペプチドと、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチド、ならびにＦＶＩＩａポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを、前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。一実施形態では、ＣＴＰ修飾ＦＩＸおよびＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａは、同じ組成物中で同時に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ＦＩＸおよびＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａは、別々の組成物として、同時に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ＦＩＸおよびＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａは、別々の組成物として、別々の時点に投与される。
他の実施形態では、操作された凝固因子は、血友病Ｂ患者の処置のためのものである。一実施形態では、カルボキシ末端に３個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、血友病Ｂ患者の処置のためのものである。一実施形態では、カルボキシ末端に４個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、血友病Ｂ患者の処置のためのものである。一実施形態では、カルボキシ末端に５個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、血友病Ｂ患者の処置のためのものである。別の実施形態では、カルボキシ末端に２個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、血友病Ｂ患者の処置のためのものである。別の実施形態では、カルボキシ末端に１個のＣＴＰ反復を含む第ＩＸ凝固因子は、血友病Ｂ患者の処置のためのものである。他の実施形態では、操作された凝固因子によって、患者に必要な注入の回数を低減させるか、患者に必要な用量を低減させるか、またはこれらの組み合わせが可能になる。
実施例１４は、ＭＯＤ－５０１４を大きな哺乳動物（イヌ）に投与した結果を示す。ＭＯＤ－５０１４の投与により、血液凝固のための効果的で安全な長時間作用型ＦＶＩＩａが提供された。ＭＯＤ－５０１４を使用した処置は、予防型または応需型であってよい。一実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、ＭＯＤ－５０１４を前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。一実施形態では、本発明は、対象の過度の出血を防止する方法を提供し、該方法は、ＭＯＤ－５０１４を前記対象に投与し、それにより、前記対象の過度の出血を防止することを含む。一実施形態では、本発明は、対象の血友病を予防的に処置する方法を提供し、該方法は、ＭＯＤ－５０１４を前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を予防的に処置することを含む。
一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４による対象の血友病の処置は、組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））と比べて、ＭＯＤ－５０１４の投与頻度の低減を含む。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４による対象の血友病の予防的処置は、組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））と比べて、ＭＯＤ－５０１４の投与頻度の低減を含む。一実施形態では、ＭＯＤ－５０１４による対象の血友病の処置は、組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））と比べて、ＭＯＤ－５０１４の投与頻度の低減を含む。
一実施形態では、カルボキシ末端に３個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰハーベスト、ＦＩＸ－ＣＴＰハーベストまたはｒｈＦＩＸとの対比でその凝固活性を維持すると同時に、改善されたＰＫプロファイルを示す。一実施形態では、ラットおよびＦＩＸ欠損マウスにおいて、ｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の排出半減期は、ｒＦＩＸよりも２．５倍～４倍長い。一実施形態では、ＦＩＸ欠損マウスにおけるｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の投与は、投与後少なくとも７６時間にわたり、凝固促進効果を顕著に延長した。一実施形態では、ＦＩＸ欠損マウスにおけるｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の投与は、ｒＦＩＸよりも高い活性ピークを生成した。別の実施形態では、カルボキシ末端で２個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、ＦＩＸ－ＣＴＰハーベストまたはｒｈＦＩＸとの対比でその凝固活性を維持すると同時に、改善されたＰＫプロファイルを示す。別の実施形態では、カルボキシル末端に２個のＣＴＰを直列に含む第ＩＸ凝固因子は、ｒｈＦＩＸに比較して、半減期の３倍延長、および４．５倍大きいＡＵＣを示す。
一実施形態では、カルボキシ末端に３個のＣＴＰを直列に含む第ＶＩＩ凝固因子は、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）との対比でその凝固活性を維持すると同時に、改善されたＰＫプロファイルを示す（表５９および図３６参照）。
別の実施形態では、用語の「ＣＴＰペプチド」、「カルボキシ末端ペプチド」および「ＣＴＰ配列」は、本明細書において同義に用いられる。別の実施形態では、カルボキシ末端ペプチドは、完全長ＣＴＰである。それぞれを本開示の別々の実施形態とすることが可能である。
別の実施形態では、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５５３，９４０号に記載のように、シグナルペプチドはＣＴＰのアミノ末端に結合される。別の実施形態では、シグナルペプチドはＣＴＰのアミノ末端に結合されない。
他の実施形態では、操作された凝固因子という用語は、成熟した凝固因子のアミノ酸配列を意味する。他の実施形態では、操作された凝固因子という用語は、シグナル配列またはシグナルペプチドを含む凝固因子のアミノ酸配列を意味する。
別の実施形態では、「シグナル配列」および「シグナルペプチド」は本明細書では同義に用いられ、全く同じ特性および意味を有する。別の実施形態では、「配列」は、ポリヌクレオチド分子に関連するときには、コード部分を指す場合がある。別の実施形態では、本明細書に記載される少なくとも１個のＣＴＰを含む操作された凝固因子は、少なくとも１個のＣＴＰを含まない同じ凝固因子と比較して、増強されたインビボの生物学的活性を有する。一実施形態では、この生物学的活性の増強は、少なくともいくつかの生物学的活性を維持すると同時に、操作された凝固因子がより長い半減期であることから生じる。別の実施形態では、この生物学的活性の増強は、ＣＴＰ修飾から生じる生物学的活性の増強から生じる。別の実施形態では、この生物学的活性の増強は、ＣＴＰ修飾凝固因子のより長い半減期と、増強された機能との両方から生じる。
いくつかの実施形態では、凝固因子のカルボキシ末端の少なくとも１個のＣＴＰ配列は、凝固因子の分解に対する増強された保護を可能とする。いくつかの実施形態では、凝固因子のカルボキシ末端の少なくとも１個のＣＴＰ配列は、クリアランスに対する増強された保護を可能とする。いくつかの実施形態では、凝固因子のカルボキシ末端の少なくとも１個のＣＴＰ配列は、クリアランス時間の延長を可能とする。いくつかの実施形態では、凝固因子のカルボキシ末端の少なくとも１個のＣＴＰ配列は、そのＣｍａｘを高める。いくつかの実施形態では、凝固因子のカルボキシ末端の少なくとも１個のＣＴＰ配列は、そのＴｍａｘを高める。いくつかの実施形態では、凝固因子のカルボキシ末端の少なくとも１個のＣＴＰ配列は、そのＴ１／２を延長させる。
別の実施形態では、本発明の複合体化凝固因子を、非修飾の複合体化凝固因子と同じ方式で用いる。別の実施形態では、本発明の複合体化凝固因子は、循環半減期および血漿中滞留時間の延長、クリアランスの低下、およびインビボでの臨床活性の増大をもたらす。別の実施形態では、本明細書に記載の複合体化凝固因子の特性の改善に起因して、この複合体は、同じ凝固因子の非修飾型よりも低頻度で投与される。
別の実施形態では、投与頻度の低下により、治療計画の改善がもたらされ、これは一実施形態では、患者の服薬遵守を向上させ、治療の転帰の改善、ならびに患者の生活の質の改善につながる。別の実施形態では、従来の凝固因子の複合体と比較して、本発明の複合体の分子量とリンカー構造とを有する複合体は、効力の改善、安定性の改善、ＡＵＣレベルの上昇、および循環半減期の延長がもたらされることが明らかになった。
別の実施形態では、本発明はさらに、ＦＩＸポリペプチドと、前記ＣＴＰ修飾ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを含む医薬組成物または医薬製剤を提供する。
別の実施形態では、本発明はさらに、ＦＶＩＩａポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを含む医薬組成物または医薬製剤を提供する。
別の実施形態では、本発明はさらに、ＦＶＩＩａポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａのカルボキシ末端に結合した４個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを含む医薬組成物または医薬製剤を提供する。
別の実施形態では、本発明はさらに、ＦＶＩＩａポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａのカルボキシ末端に結合した５個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを含む医薬組成物または医薬製剤を提供する。
別の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載の複合体化凝固因子を含む組成物が提供される。別の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載の複合体化凝固因子を含む医薬組成物が提供される。別の実施形態では、本明細書において、治療有効量の、本明細書に記載の複合体化凝固因子を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、治療有効量の複合体化凝固因子は、治療される特定の状態、処置される患者の状態、および組成物中の他の成分などの要因に応じて決定される。
したがって、一実施形態では、本開示は、本開示の組成物、処方、および方法での使用のための医薬製剤を提供する。別の実施形態では、本開示は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとからなるポリペプチドを含む医薬製剤を提供する。別の実施形態では、医薬製剤は、緩衝液および等張化剤をさらに含む。別の実施形態では、緩衝液は２０ｍＭのクエン酸塩および１３．３ｍＭのグリシンであり、等張化剤は１５０ｍＭのＮａＣｌである。別の実施形態では、製剤は約６．４のｐＨである。別の実施形態では、緩衝液は２０ｍＭのクエン酸塩および１３．３ｍＭのグリシンであり、等張化剤は１５０ｍＭのＮａＣｌで、ｐＨは６．４である。別の実施形態では、製剤は液体製剤である。別の実施形態では、製剤は凍結乾燥製剤である。別の実施形態では、液体製剤は、凍結乾燥したＣＴＰ修飾凝固因子を使って形成し得る。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子は、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ－ＣＴＰ－ＣＴＰである。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子は、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ－ＣＴＰ－ＣＴＰである。
別の実施形態では、本明細書で提供される医薬製剤を含む週１回剤形が本明細書で提供される。別の実施形態では、本明細書で提供される医薬製剤を含む１日１回剤形が本明細書で提供される。別の実施形態では、本明細書で提供される医薬製剤を含む１日おきの剤形が本明細書で提供される。別の実施形態では、本明細書で提供される医薬製剤を含む３日毎の剤形が本明細書で提供される。別の実施形態では、本明細書で提供される医薬製剤を含む週２回剤形が本明細書で提供される。別の実施形態では、本明細書で提供される医薬製剤を含む週２回剤形が本明細書で提供される。別の実施形態では、本明細書で提供される医薬製剤を含む毎週１回剤形が本明細書で提供される。別の実施形態では、本明細書で提供される医薬製剤を含む２週１回（２週毎）剤形が本明細書で提供される。
別の実施形態では、本発明は、凝固因子と、前記凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるポリペプチドを含む製剤を提供し、前記ポリペプチドは、必要に応じて、シグナルペプチドからなり、前記製剤は安定性が増加している。一実施形態では、製剤は少なくとも１年間は安定である。別の実施形態では、製剤は少なくとも２年間は安定である。
一実施形態では、ＣＴＰで修飾された凝固因子は、液体製剤に処方される。別の実施形態では、ＣＴＰで修飾された第ＶＩＩ因子は、液体製剤に処方される。別の実施形態では、ＣＴＰで修飾された第ＶＩＩａ因子は、液体製剤に処方される。別の実施形態では、ＣＴＰで修飾された第ＩＸ因子は、液体製剤に処方される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、鼻腔内用の剤形に処方される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、注入可能剤形に処方される。
別の実施形態では、本開示の方法は、凝固因子療法の使用において、服薬遵守を向上させることを含み、該方法は、ＣＴＰにより修飾された凝固因子を、それを必要としている対象に提供し、それにより、凝固因子治療薬の使用において、服薬遵守を向上させることを含む。
別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に１日１回投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子を含むポリペプチドは、対象に２日毎に１回投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に３日毎に１回投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に４日毎に１回投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に５日毎に１回投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に６日毎に１回投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に１週１回投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に７～１４日毎に１回投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に１０～２０日毎に１回投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に５～１５日毎に１回投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に１５～３０日毎に１回投与される。
一実施形態では、本発明の製剤は、シリンジまたはペン型デバイスを介した注入用の液体製剤に処方される。
一実施形態では、本明細書で提供される製剤は、塩化ベンザルコニウムおよびチメロサールなどの保存剤、エデト酸ナトリウムなどのキレート剤、リン酸、クエン酸および酢酸などの緩衝剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびマンニトールなどの等張化剤、アスコルビン酸、アセチルシスチン、メタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、芳香剤、セルロースおよびその誘導体を含むポリマーなどの粘度調整剤、ポリビニルアルコール、ならびに必要に応じてこれらの水性組成物のｐＨを調整するための酸および塩基も含む。組成物は、局所麻酔薬、または他の活性物質も含む。組成物はスプレー、ミスト、および点滴薬などとして使用することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の凝固因子は、ヒト凝固因子である。
別の実施形態では、本明細書に記載の複合体化凝固因子は、血液凝固異常または血液凝固障害に罹患している対象の処置に有用である。別の実施形態では、血液凝固異常または血液凝固障害は血友病である。別の実施形態では、本明細書に記載の複合体化凝固因子は、血友病の予防的治療において、従って、出血および関連の合併症のリスクを低減させるのに有用である。別の実施形態では、出血および関連合併症のリスクの低減は、自然発生的出血のリスクを減らす。別の実施形態では、出血および関連合併症のリスクの低減は、過度の出血のリスクを減らす。別の実施形態では、本明細書に記載の複合体化凝固因子は、外因的に投与された凝固因子に対して阻害性の抗体を発生させるリスクを低減させながら、血友病に罹患している対象を処置するのに有用である。別の実施形態では、本明細書に記載の複合体化凝固因子は、血友病に罹患している対象を処置するのに、従って、恒常性を誘導するのに有用である。
一実施形態では、本発明のＣＴＰ修飾凝固因子は、いくつかの治療用途を有する。別の実施形態では、本発明のＣＴＰ修飾凝固因子は、いくつかの予防的用途を有する。
別の実施形態では、本明細書に記載の複合化凝固因子は、過剰な出血もしくは打撲傷を受けた対象、または長いプロトロンビン時間（ＰＴ）もしくは部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）を有する対象の処置に有用である。別の実施形態では、本明細書に記載の複合体化凝固因子は、ビタミンＫ欠乏または肝疾患などの出血の原因となる後天性の状態を有する対象の処置に有用である。別の実施形態では、本明細書に記載の複合体化凝固因子は、後天性（他の疾患に起因する）または遺伝性、軽度または重度、継続的または一時的な凝固因子の欠損がある対象の処置に有用である。別の実施形態では、本明細書に記載の複合体化凝固因子は、血友病Ａに罹患している対象の治療に有用である。別の実施形態では、本明細書に記載の複合体化凝固因子は、血友病Ｂに罹患している対象の治療に有用である。別の実施形態では、本明細書に記載の複合体化凝固因子は、肝疾患もしくは癌などの慢性疾患、急速に凝固因子を使い果たす播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）などの急性状態、またはビタミンＫ欠乏症、もしくはワルファリンなどのビタミンＫアンタゴニストでの処置（第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子の生成には、ビタミンＫを要する）に起因する後天性の欠陥がある対象の処置に有用である。別の実施形態では、本明細書に記載の複合体化凝固因子は、限定するものではないが、肝疾患、尿毒症、癌、骨髄障害、ヘビ毒に対する暴露、ビタミンＫ欠乏、抗凝固療法、抗凝固ワルファリンの偶発的摂取、複数回輸血（貯蔵血液単位は、その凝固因子の一部を失う）、またはそれらの組み合わせなどの凝固の不均衡を生じる疾患に罹患している対象の治療に有用である。別の実施形態では、本発明は、対象の深部静脈血栓症を処置する方法を提供し、該方法は、本発明のＣＴＰ修飾凝固因子を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、血友病を有する対象の無制御の出血を予防する方法を提供し、該方法は、本発明のＣＴＰ修飾凝固因子を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、血友病を有する対象の出血症状を予防する方法を提供し、該方法は、本発明のＣＴＰ修飾凝固因子を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、血友病Ｂ（先天性の第ＩＸ因子欠損）を有する対象の出血症状を制御する方法を提供する。
一実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の製剤を含む。別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載の製剤を投与することを含む。別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載の製剤を含む組成物を投与することを含む。
別の実施形態では、本発明の組成物、製剤および方法は、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する阻害物質を伴う血友病ＡまたはＢの患者における、および後天性の血友病を有する患者における出血症状の処置のため、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する阻害物質を伴う血友病ＡまたはＢの患者における、および後天性の血友病を有する患者における、外科的介入または侵襲手術における出血の予防のため、先天性のＦＶＩＩ欠損症の患者での出血症状の処置および先天性のＦＶＩＩ欠損症の患者での外科的介入または侵襲手術における出血の予防のためのものである。後天性血友病は、以前に通常の止血が凝固因子、大抵の場合ＦＶＩＩＩに対する、自己抗体を発生させている、自然発生的自己免疫障害である。ＦＶＩＩＩに対する自己抗体の発生は、ＦＶＩＩＩ欠損に繋がり、これにより、凝固カスケードの内因性経路を介した第ＩＸａ因子および第ＶＩＩＩａ因子複合体によるトロンビンの生成が不十分になる。次の状態は、後天性血友病Ａと関連し得る：特発性、妊娠、自己免疫障害、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、皮膚疾患（例えば、乾癬、天疱瘡）、呼吸器疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患）、アレルギー性薬物反応、糖尿病、急性Ｂ型肝炎感染、急性Ｃ型肝炎感染、悪性病変－固形腫瘍（前立腺、肺、結腸、膵臓、胃、胆管、頭頸部、子宮頸部、乳房、黒色腫、腎臓）、血液系腫瘍。当業者なら、自己免疫障害は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、側頭動脈炎、シェーグレン症候群、自己免疫性溶血性貧血、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、グレーブス病、自己免疫性甲状腺機能低下症を含み得ることは理解されよう。当業者なら、アレルギー反応は、ペニシリンおよびその誘導体、スルファミド、フェニトイン、クロラムフェニコール、メチルドパ、デポ・チオキサンテン、インターフェロンアルファ、フルダラビン、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ワクチン接種、デスベンラファキシンから起こり得ることは理解されよう。当業者なら、血液系腫瘍には、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、および赤白血病を含み得ることは理解されよう。したがって、および一実施形態では、対象の後天性血友病を処置する方法が本明細書で提供され、該方法は、本明細書で提供されるいずれかの組成物を対象に投与することを含む。
別の実施形態では、本発明の組成物、製剤、および方法は、筋肉出血の処置または予防のための方法である。別の実施形態では、本発明の組成物、製剤、および方法は、関節出血の処置または予防のためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物、製剤、および方法は、鼻血および歯茎出血、粘膜出血、中枢神経系への出血の治療的または予防的な処置を提供する。別の実施形態では、本発明の組成物、製剤、および方法は、消化管または脳出血の治療的または予防的な処置を提供する。別の実施形態では、本発明の組成物、製剤、および方法は、低頻度の軽度出血の治療的または予防的な処置を提供する。別の実施形態では、本発明の組成物、製剤、および方法は、低頻度の中度出血の治療的または予防的な処置を提供する。別の実施形態では、本発明の組成物、製剤、および方法は、高頻度の軽度出血の治療的または予防的な処置を提供する。別の実施形態では、本発明の組成物、製剤、および方法は、高頻度の中度出血の治療的または予防的な処置を提供する。
一実施形態では、本発明の組成物、製剤、および方法は、無症候性の血友病の治療的または予防的な処置を提供する。別の実施形態では、本発明の組成物、製剤、および方法は、軽度から中度の血友病の治療的または予防的な処置を提供する。別の実施形態では、本発明の組成物、製剤、および方法は重度の血友病の治療的または予防的な処置を提供する。
一実施形態では、本発明の組成物、製剤、および方法は、一実施形態では、制御不能な出血であり、別の実施形態では、脳内出血である、出血の治療的または予防的な処置を提供する。別の実施形態では、本発明の組成物、製剤、および方法は、新生児凝固障害、重度の肝疾患、高リスクの外科的手術、外傷性失血、骨髄移植、血小板減少症および血小板機能障害、経口抗凝固薬の緊急逆転、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子および第ＸＩ因子の先天性の欠損症、またはフォン・ヴィレブランド病、一実施形態では、フォン・ヴィレブランド因子に対する阻害物質を伴うフォン・ヴィレブランド病の治療的または予防的な処置を提供する。
一実施形態では、本発明のＣＴＰ修飾凝固因子は、対象における、本明細書に記載の血友病または関連の疾患の処置のためのものである。一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象はヒトの小児である。別の実施形態では、対象は、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ ａｎｉｍａｌ）である。別の実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、対象は、家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）である。別の実施形態では、対象はサルである。別の実施形態では、対象はウマである。別の実施形態では、対象は雌ウシである。別の実施形態では、対象はマウスである。別の実施形態では、対象は、ラットである。別の実施形態では、対象は、イヌである。別の実施形態では、対象は、ネコである。別の実施形態では、対象は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、マウスまたはシカである。一実施形態では、対象は、雄性である。別の実施形態では、対象は、雌性である。一実施形態では、対象は、小児であり、別の実施形態では、青年期であり、別の実施形態では、成体であるか、または、別の実施形態では、より高齢の対象である。別の実施形態では、対象は、小児の対象であり、別の実施形態では、高齢の対象である。
別の実施形態では、本明細書に記載された［（ＣＴＰ）ｎ＞１－凝固因子］は、カルボキシ末端のペプチド結合を介して少なくとも１個のＣＴＰ単位に連結され、アミノ末端にはＣＴＰを有さない、完全長凝固因子またはその活性断片を含む。別の実施形態では、本明細書に記載された［（ＣＴＰ）ｎ＞１－凝固因子］は、ペプチド結合を介して少なくとも１個のＣＴＰ単位に連結され、ペプチド結合を介してさらなるＣＴＰ単位に連結され、アミノ末端にはＣＴＰを有さない、凝固因子またはその活性断片を含む。別の実施形態では、１個の核酸分子は、そのＣ末端に結合された少なくとも１個のＣＴＰを含み、そのアミノ末端にはＣＴＰを含まない操作された凝固因子をコードする。
別の実施形態では、ＣＴＰは、リンカーを介して凝固因子に結合される。別の実施形態では、凝固因子に対してＣＴＰ配列を連結するリンカーの結合は、共有結合である。別の実施形態では、凝固因子に対してＣＴＰ配列を連結するリンカーの結合は、ペプチド結合である。別の実施形態では、凝固因子に対してＣＴＰ配列を連結するリンカーの結合は、置換ペプチド結合である。別の実施形態では、ＣＴＰ配列は、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ（配列番号１）を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ配列は、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号２）を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ配列は、配列番号１および配列番号２で示される配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、本発明のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）ペプチドは、配列番号１で示されるヒト絨毛性ゴナドトロピンのアミノ酸位置１１２～１４５のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のＣＴＰ配列は、配列番号２に示す、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのアミノ酸１１８～１４５の位置のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、また、ＣＴＰ配列は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのアミノ酸１１２～１１８の任意の位置から始まり、１４５の位置で終わる。いくつかの実施形態では、このＣＴＰ配列のペプチドは、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４アミノ酸長であり、ＣＴＰアミノ酸配列の位置１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７または１１８で開始する。
別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７１２，１２２号に記載の１～５個の保存的アミノ酸置換が天然のＣＴＰとは異なる絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰの変異体である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、１個の保存的アミノ酸置換が天然型ＣＴＰと異なる、絨毛性ゴナドトロピンの変異体である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、２個の保存的アミノ酸置換が天然型ＣＴＰと異なる、絨毛性ゴナドトロピンの変異体である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、３個の保存的アミノ酸置換が天然型ＣＴＰと異なる、絨毛性ゴナドトロピンの変異体である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、４個の保存的アミノ酸置換が天然型ＣＴＰと異なる、絨毛性ゴナドトロピンの変異体である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、５個の保存的アミノ酸置換が天然型ＣＴＰと異なる、絨毛性ゴナドトロピンの変異体である。
別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドアミノ酸配列は、天然のＣＴＰアミノ酸配列またはそのペプチドに対して少なくとも７０％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドアミノ酸配列は、天然のＣＴＰアミノ酸配列またはそのペプチドに対して少なくとも８０％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドアミノ酸配列は、天然のＣＴＰアミノ酸配列またはそのペプチドに対して少なくとも９０％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドアミノ酸配列は、天然のＣＴＰアミノ酸配列またはそのペプチドに対して少なくとも９５％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドアミノ酸配列は、天然のＣＴＰアミノ酸配列またはそのペプチドに対して少なくとも９８％相同である。
別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然のヒトＣＴＰのＤＮＡ配列またはそのペプチドに対して少なくとも７０％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然のヒトＣＴＰのＤＮＡ配列またはそのペプチドに対して少なくとも８０％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然のヒトＣＴＰのＤＮＡ配列またはそのペプチドに対して少なくとも９０％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然のヒトＣＴＰのＤＮＡ配列またはそのペプチドに対して少なくとも９５％相同である。別の実施形態では、本発明のＣＴＰペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然のヒトＣＴＰのＤＮＡ配列またはそのペプチドに対して少なくとも９８％相同である。
一実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の少なくとも１個が切断される。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の両方が切断される。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の２個が切断される。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の３個が切断される。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の４個が切断される。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の５個が切断される。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の内の２個以上が切断される。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の全てが切断される。一実施形態では、切断されたＣＴＰは、配列番号３の最初の１０個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、配列番号３は、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰのアミノ酸（ＡＡ）配列を含む。
一実施形態では、切断されたＣＴＰは、配列番号２の最初の１０個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、配列番号２は、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱのアミノ酸（ＡＡ）配列を含む。
一実施形態では、切断されたＣＴＰは、配列番号２の最初の１１個のアミノ酸を含む。一実施形態では、切断されたＣＴＰは、配列番号２の最初の１１個のアミノ酸を含む。一実施形態では、切断されたＣＴＰは、配列番号２または配列番号３の最初の８個のアミノ酸を含む。一実施形態では、切断されたＣＴＰは、配列番号２の最初の１３個のアミノ酸を含む。一実施形態では、切断されたＣＴＰは、配列番号２の最初の１４個のアミノ酸を含む。一実施形態では、切断されたＣＴＰは、配列番号２または配列番号３の最初の６個のアミノ酸を含む。一実施形態では、切断されたＣＴＰは、配列番号２または配列番号３の最初の５個のアミノ酸を含む。
一実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰのアミノ酸配列の少なくとも１個が、グリコシル化されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の両方が、グリコシル化されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の２個が、グリコシル化されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の３個が、グリコシル化されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の４個が、グリコシル化されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の５個が、グリコシル化されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の２個以上が、グリコシル化されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の全てがグリコシル化されている。
一実施形態では、本発明のＣＴＰ配列は、少なくとも１個のグリコシル化部位を含む。一実施形態では、本発明のＣＴＰ配列は、２個のグリコシル化部位を含む。一実施形態では、本発明のＣＴＰ配列は、３個のグリコシル化部位を含む。一実施形態では、本発明のＣＴＰ配列は、４個のグリコシル化部位を含む。一実施形態では、１個または複数の絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列は、完全にグリコシル化されている。別の実施形態では、１個または複数の絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列は、部分的にグリコシル化されている。一実施形態では、部分的にグリコシル化されたとは、ＣＴＰグリコシル化部位のうちの１個がグリコシル化されていることを示す。別の実施形態では、ＣＴＰグリコシル化部位のうちの２個がグリコシル化されている。別の実施形態では、ＣＴＰグリコシル化部位のうちの３個がグリコシル化されている。
いくつかの実施形態では、ＣＴＰ配列修飾は、低用量の使用を可能にする点で有利である。いくつかの実施形態では、ＣＴＰ配列修飾は、より少ない投与量を可能にする点で有利である。いくつかの実施形態では、ＣＴＰ配列修飾は、安全で長時間作用型効果を可能にする点で有利である。
いくつかの実施形態では、「ポリペプチド」、「操作された凝固因子」、または「タンパク質」という用語は、本明細書において用いる場合、天然のポリペプチド（分解生成物、人工的に合成されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド）およびペプチド模倣物（典型的には、人工的に合成されたポリペプチド）、ならびにペプトイドおよびセミペプトイド（ポリペプチドアナログである）を包含し、これが、いくつかの実施形態では、凝固因子を含むポリペプチドを、身体内にある間より安定にするか、または細胞内へより浸透可能とする修飾を有する。
いくつかの実施形態では、修飾としては、非限定的に、Ｃ末端修飾、ポリペプチド結合修飾、例えば、限定されないがＣＨ２－ＮＨ、ＣＨ２－Ｓ、ＣＨ２－Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ－ＮＨ、ＣＨ２－Ｏ、ＣＨ２－ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ－ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＦ＝ＣＨなど、骨格修飾、および残基修飾が挙げられる。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に記載されており、同文献は、本明細書に全体を記載したものとして、参照により組み込まれる。この点に関するさらなる詳細を以下に提供する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド内のポリペプチド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）は置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、Ｎ－メチル化結合（－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＯ－）により置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、エステル結合（－Ｃ（Ｒ）Ｈ－Ｃ－Ｏ－Ｏ－Ｃ（Ｒ）－Ｎ－）により置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、ケトメチレン結合（－ＣＯ－ＣＨ２－）により置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、α－アザ結合（－ＮＨ－Ｎ（Ｒ）－ＣＯ－）により置換され、ここでＲは、任意のアルキル、例えば、メチル、カルバ結合（－ＣＨ２－ＮＨ－）である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、ヒドロキシエチレン結合（－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－）により置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、チオアミド結合（－ＣＳ－ＮＨ－）により置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、オレフィン二重結合（－ＣＨ＝ＣＨ－）により置換される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合は、レトロアミド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）により置換される。いくつかの実施形態では、このポリペプチド結合は、ポリペプチド誘導体（－Ｎ（Ｒ）－ＣＨ２－ＣＯ－）により置換され、ここでＲは、炭素原子上に天然に存在する「正常な」側鎖である。いくつかの実施形態では、これらの修飾は、ポリペプチド鎖にそって任意の結合で存在し、一実施形態では、同時にいくつか（２～３結合）存在する。
いくつかの実施形態では、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅなどのポリペプチドの天然の芳香族アミノ酸は、合成の非天然の酸、例えば、フェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチルエラニン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環－メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体またはｏ－メチル－Ｔｙｒで置換される。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、１個または複数の修飾されたアミノ酸または１個または複数の非アミノ酸モノマー（例えば、脂肪酸、複合糖質など）を含む。
一実施形態では、「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、天然由来アミノ酸２０種、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンをはじめとする、多くはインビボで翻訳後修飾されたそれらのアミノ酸、ならびに非限定的に２－アミノアジピン酸、ヒドロキシルリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含む他の異常アミノ酸を包含すると理解される。一実施形態では、「アミノ酸」は、Ｄ－およびＬ－アミノ酸の両方を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、凝固因子を含むポリペプチドが可溶型であること必要とする治療薬に利用される。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、１個または複数の非天然または天然の極性アミノ酸を含み、これには限定するものではないが、ヒドロキシル含有側鎖に起因してポリペプチド溶解度を増大できるセリンおよびトレオニンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の操作された凝固因子は、直鎖型で利用されるが、環化が操作された凝固因子の特徴を大きく妨害しない場合、この操作された凝固因子の環型も利用可能であることが当業者には理解されよう。
いくつかの実施形態では、本発明の操作された凝固因子は、標準的な固相技術を用いることなどによって、生化学的に合成される。いくつかの実施形態では、これらの生化学的な方法としては、完全固相合成法、部分的固相合成法、フラグメント縮合法、または古典的な溶液合成法が挙げられる。
いくつかの実施形態では、組換えタンパク質技術を用いて、本発明の操作された凝固因子が生成される。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質技術は、比較的長いポリペプチド（例えば、１８～２５アミノ酸より長い）の生成に用いられる。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質技術は、大量の本発明の操作された凝固因子の生成に用いられる。いくつかの実施形態では、組換え技術は、Ｂｉｔｔｅｒら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６－５４４，Ｓｔｕｄｉｅｒら、（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０－８９，Ｂｒｉｓｓｏｎら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１－５１４，Ｔａｋａｍａｔｓｕら、（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７－３１１，Ｃｏｒｕｚｚｉら、（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１－１６８０およびＢｒｏｇｌｉら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８－８４３，Ｇｕｒｌｅｙら、（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９－５６５、およびＷｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，ｐｐ４２１－４６３（これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
別の実施形態では、本開示は、本明細書において上記されるように、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合したゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドをコードする遺伝子のコード部分を含むポリヌクレオチド分子を提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書において上記されるように、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合したゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドをコードする遺伝子のコード部分からなるポリヌクレオチド分子を提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書において上記されるように、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合したゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドをコードする遺伝子のコード部分から本質的になるポリヌクレオチド分子を提供する。
別の実施形態では、本開示は、本明細書において上記されるように、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書において上記されるように、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書において上記されるように、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとから本質的になるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列である。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子である。
別の実施形態では、本開示は、本明細書で記載のポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドと、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３～５個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなる、ＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の発現ベクターを含む細胞を提供する。別の実施形態では、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドと、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞を提供する。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなる、ＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞を提供する。
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の発現ベクターを含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドと、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなる、ＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組成物を提供する。
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の細胞を含む組成物を提供する。別の実施形態では、細胞は、真核細胞である。別の実施形態では、細胞は、原核細胞である。
別の実施形態では、本発明は、ＣＴＰ修飾凝固因子を製造する方法を提供し、該方法は、前記凝固因子のカルボキシ末端に１～１０個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合することにより、ＣＴＰ修飾凝固因子を製造するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、ＣＴＰ修飾凝固因子を製造する方法を提供し、該方法は、前記凝固因子をコードするポリヌクレオチド配列のカルボキシ末端に絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）をコードする１～１０個のポリヌクレオチド配列を結合し、それにより、ＣＴＰ修飾凝固因子を製造するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ（ＦＩＸ）ポリペプチド製造する方法を提供し、該方法は、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合し、それにより、ＣＴＰ修飾ＦＩＸポリペプチドを製造するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、ＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを製造する方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合し、それにより、ＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａポリペプチドを製造するステップを含む。
別の実施形態では、本発明の操作された凝固因子は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を用いて合成される。いくつかの実施形態では、本発明の操作された凝固因子をコードしているポリヌクレオチド分子は、シス調節配列（例えば、プロモーター配列）の転写制御を含む、発現ベクターに連結される。いくつかの実施形態では、シス調節配列は、本発明の操作された凝固因子の構成的発現を誘導するのに好適する。いくつかの実施形態では、シス調節配列は、本発明の操作された凝固因子の組織特異的な発現を誘導するのに好適する。いくつかの実施形態では、シス調節配列は、本発明の操作された凝固因子の誘導性発現を行わせるのに好適する。
いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適する組織特異的プロモーターとしては、１個または複数の特定の細胞集団中で機能的である配列が挙げられる。例としては、限定されないが、肝臓特異的であるアルブミンなどのプロモーター［Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ、（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７］、リンパ系特異的なプロモーター［Ｃａｌａｍｅら、（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５］、具体的には、Ｔ細胞受容体のプロモーター［Ｗｉｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ、（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３］および免疫グロブリン、［Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ、（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３７２９－７４０］、ニューロン特異的プロモーター、例えば、神経フィラメントプロモーター［Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７］、膵臓特異的プロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈ ｅｔ ａｌ、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６］または乳腺特異的プロモーター、例えば、乳清プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。本発明での使用に適切な誘導性プロモーターとしては、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｓｒｏｕｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ、２００３．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９０：３９８－４０５）が挙げられる。
一実施形態では、「ポリヌクレオチド分子」という語句は、一本鎖または二本鎖の核酸分子を意味し、これは、ＲＮＡ配列、相補性ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組み合わせ）の形態で単離されて、提供される。
一実施形態では、「相補性ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いてメッセンジャーＲＮＡの逆転写から生じる配列を意味する。一実施形態では、この配列は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてインビボまたはインビトロで引き続いて増幅できる。
一実施形態では、「ゲノムのポリヌクレオチド配列」は、染色体に由来する（単離された）配列を意味し、従って、これは、染色体の連続部分に相当する。
一実施形態では、「複合ポリヌクレオチド配列」とは、少なくとも部分的に相補性であり、かつ少なくとも部分的にゲノムである配列を意味する。一実施形態では、複合配列は、本発明のポリペプチドをコードするのに必要ないくつかのエキソン配列、およびその間に介在するいくつかのイントロン配列を包含し得る。一実施形態では、イントロン配列は、他の遺伝子を含む、任意の供給源のものであり得、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。一実施形態では、イントロンの配列は、シス作用性の発現調節エレメントを含む。
一実施形態では、発現および分泌後、シグナルペプチドを、操作された前駆体凝固因子から切断して、シグナルペプチドを欠いている操作された成熟凝固因子を生じる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲ技術、または当業者に公知の任意の他の方法もしくは手順を用いて調製される。いくつかの実施形態では、この手順は、２つの異なるＤＮＡ配列のライゲーションを含む（例えば、"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ＳｏＮＳ；１９９２、を参照されたい）。
一実施形態では、操作された凝固因子をコードする、本発明のポリヌクレオチドを、発現ベクター（すなわち、核酸構築物）に挿入して、組換えポリペプチドの発現を可能にする。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、このベクターを原核生物中での複製および組み込みを好適にする追加の配列を含む。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、このベクターを真核生物中での複製および組み込みを好適にする追加の配列を含む。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、このベクターを原核生物および真核生物の両方での複製および組み込みを好適にするシャトルベクターを含む。いくつかの実施形態では、クローニングベクターは、転写および翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）および転写および翻訳のターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。
一実施形態では、種々の原核または真核細胞を宿主発現系として用いて、本発明の凝固因子を発現させる。いくつかの実施形態では、これらには、タンパク質コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物、ポリペプチドコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させた植物細胞系またはポリペプチドコード配列を含むＴｉプラスミドなどの組換えプラスミド発現ベクターで形質転換した植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、非細菌の発現系を用いて（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物発現系）本発明の凝固因子を発現させる。一実施形態では、哺乳動物細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いられる発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターおよびネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＣＩ－ＤＨＦＲベクターである。ｐＣＩ－ｄｈｆｒベクターの構築は、実施例１の一実施形態で記載される。
いくつかの実施形態では、本発明の細菌系で、多数の発現ベクターを、発現されるポリペプチドのための用途に応じて有利に選択できる。一実施形態では、大量のポリペプチドが所望される。一実施形態では、おそらく、タンパク質産物の精製が容易な細菌の周辺質中または培地中に発現産物を導く疎水性シグナル配列との融合物として、高レベルのタンパク質産物の発現を指示するベクターが望まれる。一実施形態では、特定の融合タンパク質は、ポリペプチドの回収に役立たせるように、特定の切断部位を用いて操作される。一実施形態では、このような操作に適合可能なベクターとしては、限定されないが、ｐＥＴシリーズのＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターが挙げられる［Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０－８９（１９９０）］。
一実施形態では、酵母発現系が使用される。一実施形態では、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む多数のベクターを、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第５，９３２，４４７号に開示の酵母で使用できる。別の実施形態では、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターが使用される。
一実施形態では、本発明の発現ベクターはさらに、例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびプロモーター－キメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列などの単一のｍＲＮＡ由来のいくつかのタンパク質の翻訳を可能にする追加のポリヌクレオチド配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、哺乳動物発現ベクターとして、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／－）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／－）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ－ＲＳＶおよびｐＢＫ－ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびに、それらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、レトロウイルスなどの真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターを、本発明で用いる。ＳＶ４０ベクターは、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２を含む。いくつかの実施形態では、ウシパピローマウイルス由来のベクターは、ｐＢＶ－１ＭＴＨＡを含み、エプスタイン・バーウイルス由来のベクターは、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５を含む。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ－４０早期プロモーター、ＳＶ－４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞での発現に有効性を示す他のプロモーターの指示によって、タンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
いくつかの実施形態では、組換えウイルスベクターは、本発明の凝固因子のインビボ発現に有用である。この理由は、組換えウイルスベクターは、水平感染および標的特異性などの利点を提供するからである。一実施形態では、水平感染は、例えば、レトロウイルスのライフサイクルでは固有であり、単一の感染した細胞が多くの子孫ビリオンを生成する（分離して近隣の細胞に感染する）プロセスである。一実施形態では、結果として、広い領域が急速に感染され、そのほとんどがもとのウイルス粒子で最初に感染されたのではなかった。一実施形態では、外部に伝染できないウイルスベクターが生成される。一実施形態では、この特徴は、望ましい目的が、限られた数の標的細胞にのみ特定の遺伝子を導入することである場合に有用であり得る。
一実施形態では、種々の方法を用いて、本発明の発現ベクターを細胞に導入できる。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２），ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９），Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．（１９８８）およびＧｉｌｂｏａ ｅｔ ａｔ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４－５１２，１９８６］に一般的に記載されており、例えば、組換えウイルスベクターによる安定なまたは一時的な遺伝子導入、リポフェクション、電気穿孔および感染を含む。さらに、ポジティブ－ネガティブ選択法に関する米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照されたい。これらの特許は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ウイルス感染による核酸の導入は、リポフェクションおよび電気穿孔などの他の方法を上回るいくつかの利点を提供する。この理由は、ウイルスの感染性の性質に起因して、より高い遺伝子導入効率が得られる可能性があるためである。
一実施形態では、本発明の操作された凝固因子はまた、本明細書において、上記で記載された、任意の適切な投与方式を使用して個体に投与される核酸構築物から発現され得る（すなわち、インビボの遺伝子療法）ことが理解されよう。一実施形態では、この核酸構築物は、適切な細胞中へ、適切な遺伝子送達ビークル／方法（遺伝子導入、形質導入、相同組換えなど）を介して、および必要に応じて発現系に導入され、次いで修飾された細胞が、培養により増殖されて、個体に戻される（すなわち、エキソビボの遺伝子療法）。
一実施形態では、植物発現ベクターが使用される。一実施形態では、ポリペプチドコード配列の発現は、多数のプロモーターにより駆動される。いくつかの実施形態では、ウイルスプロモーター、例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター［Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１－５１４（１９８４）］、またはＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター［Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７－３１１（１９８７）］を用いる。別の実施形態では、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット［Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１－１６８０（１９８４）およびＢｒｏｇｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８－８４３（１９８４）］またはヒートショックプロモーター、例えば、大豆ｈｓｐｌ７．５－Ｅまたはｈｓｐｌ７．３－Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９－５６５（１９８６）］などの植物プロモーターが使用される。一実施形態では、構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、微量注入、電気穿孔、および当業者に公知の他の技術を用いて植物細胞に導入される。例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，ｐｐ ４２１－４６３（１９８８）］を参照されたい。当技術分野で公知である昆虫および哺乳動物宿主細胞系などの他の発現系も本発明により使用することができる。
挿入されたコード配列（ポリペプチドをコードする）の転写および翻訳のための必須のエレメントを含む以外に、本発明の発現構築物はまた、発現されたポリペプチドの安定性、産生、精製、収率または活性を最適化するように操作された配列を含むことができることは理解されよう。
いくつかの実施形態では、形質転換細胞を、効果的な条件下で培養し、それにより、大量の組換え操作された凝固因子の発現を可能にする。いくつかの実施形態では、効果的な培養条件としては、限定するものではないが、タンパク質生成を可能にする有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が挙げられる。一実施形態では、有効な培地とは、細胞が培養されて本発明の組換えポリペプチドが生成される任意の培地を指す。いくつかの実施形態では、培地は典型的には、同化可能な炭素、窒素およびリン酸塩の供給源、ならびに適切な塩、鉱物、金属、および他の栄養素、例えばビタミンを有する水溶液を含む。いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿中で培養できる。いくつかの実施形態では、培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含量で行われる。いくつかの実施形態では、培養条件の決定は、当業者の専門知識の範囲内である。
いくつかの実施形態では、産生のために用いられるベクターおよび宿主系に応じて、得られた本発明の操作された凝固因子は、組換え細胞内に残るか、発酵培地中に分泌されるか、Ｅ．ｃｏｌｉ中の細胞周辺腔などの２つの細胞膜の間の空間に分泌されるか、または細胞もしくはウイルス膜の外表面上に保持される。
一実施形態では、培養の所定の時間後に、組換え操作された凝固因子の回収が実施される。
一実施形態では、本明細書で用いられる「組換え操作された凝固因子を回収する」という語句は、ポリペプチドを含有する発酵培地全体を収集することを指すものであって、分離または精製の追加のステップを意味する必要はない。
一実施形態では、本発明の操作された凝固因子は、限定するものではないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、等電点電気泳動および示差的可溶化などの種々の標準的なタンパク質精製技術を用いて精製される。
一実施形態では、回収を容易にするために、発現されたコード配列を操作して、本発明の操作された凝固因子および融合された切断可能部分をコードし得る。一実施形態では、ポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィーによって、（例えば、切断可能な部分に特異的なカラムによる固定によって、）容易に単離されるように、融合タンパク質を設計できる。一実施形態では、切断部位が、操作された凝固因子と切断可能部分との間となるように操作され、この部位で融合タンパク質を特異的に切断する適切な酵素または薬剤での処理によって、ポリペプチドが、クロマトグラフィーカラムから放出され得る［例えば、Ｂｏｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：６５－７０（１９８８）、およびＧａｒｄｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５８５４－１５８５９（１９９０）を参照］。
一実施形態では、本発明の操作された凝固因子は、「実質的に純粋な」形態で回収される。
一実施形態では、「実質気に純粋な」という語句は、本明細書に記載の用途でのタンパク質の効率的な使用を可能にする純度を意味する。
一実施形態では、本発明の操作された凝固因子はまた、インビトロの発現系を用いても合成できる。一実施形態では、インビトロの合成方法は、当該分野で周知であり、この系の構成要素は、市販されている。
いくつかの実施形態では、組換え操作された凝固因子が、合成および精製され、それらの治療効力を、インビボまたはインビトロのいずれかでアッセイし得る。一実施形態では、本発明の組換えの操作された凝固因子の結合活性は、当業者に既知の種々のアッセイを用いて確認できる。
別の実施形態では、本発明の操作された凝固因子は、それ自体個々に提供し得る。一実施形態では、本発明の操作された凝固因子は、薬学的に許容可能な担体と組み合わされた場合、個体に対して、医薬組成物の一部として提供できる。
別の実施形態では、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体および賦形剤などの他の化学成分を含む、本明細書に記載の１種または複数の有効成分の製剤を意味する。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
別の実施形態では、「有効成分」とは、生物学的効果を説明可能な、目的のポリペプチド配列を意味する。
別の実施形態では、本発明の任意の組成物は、任意の形態で、目的の操作された凝固因子のカルボキシ末端にのみ結合する少なくとも１個のＣＴＰ配列を含む。一実施形態では、本発明は混合製剤を提供する。一実施形態では、「混合製剤」は、上記で定義した組み合わせ相手が、独立して投与されるか、または特徴量の組み合わせ相手との異なる一定の組み合わせの使用により、すなわち、同時に、並行して、別々にまたは順次投与され得るという意味において、特に「パーツキット」を定義する。いくつかの実施形態では、パーツキットのパーツは、その後、例えば、同時にまたは経時的に交互に、すなわち、異なる時点でおよびパーツキットの任意のパーツについて等しい時間間隔または異なる時間間隔で投与することができる。いくつかの実施形態では、一定比率の組み合わせ相手の合計量を、混合製剤として投与することができる。一実施形態では、例えば、処置される患者の亜集団のニーズまたは異なるニーズが特定の疾患、疾患の重症度、年齢、性別、または体重によるものであり得る単一患者のニーズに対処するために、混合製剤を変更することができ、これは当業者が容易に行うことができる。
別の実施形態では、「生理学的に許容可能な担体」および「薬学的に許容可能な担体」という語句は同義に用いられ、生物体に対して有意な刺激を生じず、かつ投与された化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤を意味する。アジュバントはこれらの語句に包含される。一実施形態では、薬学的に許容可能な担体に含まれる成分の内の１つは、例えば、有機媒体および水性媒体の両方の中で広範な溶解度を有する生体適合性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とすることができる（Ｍｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７９））。
別の実施形態では、「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加された不活性物質を意味する。一実施形態では、賦形剤としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類および様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールを挙げることができる。
薬物の処方および投与のための技術は、参照により本明細書に組み込まれる、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，"Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ、の最新版に見られる。
投薬範囲の種々の実施形態は、本発明により意図されている。本発明の操作された凝固因子の投与量は、一実施形態では、０．００５～１００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、０．００５～５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、０．０１～５０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、０．１～２０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、０．１～１０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、０．０１～５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、０．００１～０．０１ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、０．００１～０．１ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、０．１～５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、０．５～５０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、０．２～１５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、０．８～６５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、１～５０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、５～１０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、８～１５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、１０～２０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、２０～４０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、６０～１２０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、１２～４０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、４０～６０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、５０～１００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、１～６０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、１５～２５ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、５～１０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、５５～６５ｍｇ／日の範囲である。
別の実施形態では、投与量は、５０～５００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、５０～１５０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、１００～２００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、１５０～２５０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、２００～３００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、２５０～４００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、３００～５００ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、３５０～５００ｍｇ／日の範囲である。
一実施形態では、投与量は、２０ｍｇ／日である。一実施形態では、投与量は、３０ｍｇ／日である。一実施形態では、投与量は、４０ｍｇ／日である。一実施形態では、投与量は、５０ｍｇ／日である。一実施形態では、投与量は、０．０１ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、０．１ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、１ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、０．５３０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、０．０５ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、５０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、１０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、２０～７０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、５ｍｇ／日である。
一実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子の投与量は、１～５ｍｇ／日である。一実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子の投与量は、１～３ｍｇ／日である。一実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子の投与量は、２ｍｇ／日である。
別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／日の範囲である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／２日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／３日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／４日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／５日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／６日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／週である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／９日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／１１日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／１４日である。
別の実施形態では、凝固因子の投与量は、１０～５０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／２日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／３日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／４日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０マイクログラムｍｇ／５日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／６日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／週である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／９日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／１１日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／１４日である。
別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、経鼻剤形で処方される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、注射可能剤形で処方される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、０．０００１ｍｇ～０．６ｍｇの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に０．００１ｍｇ～０．００５ｍｇの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に０．００５ｍｇ～０．０１ｍｇの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、０．０１ｍｇ～０．３ｍｇの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に０．２ｍｇ～０．６ｍｇの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子は、そのアミノ末端にＣＴＰを含まない。
別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に１～１００マイクログラムの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に１０～８０マイクログラムの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に２０～６０マイクログラムの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に１０～５０マイクログラムの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、４０～８０マイクログラムの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に１０～３０マイクログラムの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に３０～６０マイクログラムの範囲の用量で投与される。
別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、０．２ｍｇ～２ｍｇの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、２ｍｇ～６ｍｇの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、４ｍｇ～１０ｍｇの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、５ｍｇ～１５ｍｇの範囲の用量で投与される。
一実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に、１０μｇ／ｋｇ～１０００μｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に、２５μｇ／ｋｇ～６００μｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に、５０μｇ／ｋｇ～４００μｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に、約２５μｇ／ｋｇの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に、約５０μｇ／ｋｇの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に、約１００μｇ／ｋｇの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に、約２００μｇ／ｋｇの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に、約３００μｇ／ｋｇの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に、約４００μｇ／ｋｇの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に、約５００μｇ／ｋｇの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰにより修飾された凝固因子は、対象に、約６００μｇ／ｋｇの用量で投与される。
一実施形態では、ＣＴＰ修飾ＦＩＸの投与量は、同じ期間にわたって患者に対して組換えＦＩＸ（例えば、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）、ＷｙｅｔｈまたはＭｏｎｏｎｉｎｅ（登録商標）、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ）の推奨投与量で投与される組換えＦＩＸの量の５０％を含む。一実施形態では、ＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａの投与量は、同じ期間にわたって患者に対して組換えＦＶＩＩａ（例えば、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））の推奨投与量で投与されるＦＶＩＩａの量の５０％を含む。一実施形態では、ＣＴＰ修飾ＦＶＩＩの投与量は、同じ期間にわたって患者に対して組換えＦＶＩＩの推奨投与量で投与されるＦＶＩＩの量の５０％を含む。例えば、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は、術前または術後に患者に対して２時間ごとに９０ｍｇ／ｋｇの用量（すなわち、８５ｋｇの患者には、２時間毎に７．６５ｍｇ、または１２時間にわたって６用量で４５．９ｍｇ）で投与される場合、本発明のＣＴＰ修飾凝固因子は、組換えＦＶＩＩａの患者の１２時間用量の５０％である用量で投与されてよい（すなわち、１２時間にわたって１回に２３ｍｇの用量で投与される）。
別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子の投与量は、それが、非ＣＴＰ修飾凝固因子を用いて投与される凝固因子の量の４５％を含むような投与量である。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子の投与量は、これが、非ＣＴＰ修飾凝固因子を用いて投与される凝固因子の量の１０％を含むような投与量である。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子の投与量は、これが、非ＣＴＰ修飾凝固因子を用いて投与される凝固因子の量の２５％を含むような投与量である。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子の投与量は、これが、非ＣＴＰ修飾凝固因子を用いて投与される凝固因子の量の３５％を含むような投与量である。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子の投与量は、これが、非ＣＴＰ修飾凝固因子を用いて投与される凝固因子の量の７５％を含むような投与量である。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子の投与量は、これが、非ＣＴＰ修飾凝固因子を用いて投与される凝固因子の量の１００％を含むような投与量である。しかし、この投与量が、非ＣＴＰ修飾凝固因子と同じ量の凝固因子（例えば、ＦＩＸ）を含む場合でさえ、これは、組換え凝固因子と比較してその半減期が延長されているために低頻度で投与されるという点で、対象にとってはやはり有利である。
別の実施形態では、複合体化凝固因子の治療有効量は、ＦＩＸについては、１日１回から週に１回投与される体重１ｋｇあたり５０～５００ＩＵ、またはＦＶＩＩａについては、１０μｇ／Ｋｇ～５００μｇ／Ｋｇである。別の実施形態では、複合体化凝固因子の治療有効量は、１日１回投与で、体重１ｋｇあたり１５０～２５０ＩＵである。別の実施形態では、複合体化凝固因子を含む医薬組成物は、ヒト患者に対して種々の手段で投与するのに有効な製剤含量で処方される。
一実施形態では、ＦＩＸは、対象の２０～３０ＩＵ／ｄＬの循環第ＩＸ因子活性をもたらすために有効な量で投与される。別の実施形態では、ＦＩＸは、対象の２５～５０ＩＵ／ｄＬの循環第ＩＸ因子活性をもたらすために有効な量で投与される。別の実施形態では、ＦＩＸは、対象の５０～１００ＩＵ／ｄＬの循環第ＩＸ因子活性をもたらすために有効な量で投与される。別の実施形態では、ＦＩＸは、対象の１００～２００ＩＵ／ｄＬの循環第ＩＸ因子活性をもたらすために有効な量で投与される。別の実施形態では、ＦＩＸは、対象の１０～５０ＩＵ／ｄＬの循環第ＩＸ因子活性をもたらすために有効な量で投与される。別の実施形態では、ＦＩＸは、対象の２０～１００ＩＵ／ｄＬの循環第ＩＸ因子活性をもたらすために有効な量で投与される。
一実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子は、対象に毎週を基本として投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子は、対象に週２回投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子は、対象に、隔週に（２週毎に１回）投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子は、対象に、月２回投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子は、対象に、月１回投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子は、対象に、毎日を基本として投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾凝固因子は、対象に２日毎に投与される。
別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、３日毎に１回投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、４日毎に１回投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、５日毎に１回投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、６日毎に１回投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、７～１４日毎に１回投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、１０～２０日毎に１回投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、５～１５日毎に１回投与される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、対象に、１５～３０日毎に１回投与される。
別の実施形態では、本開示の方法は、凝固因子療法の使用において、服薬遵守を向上させることを含み、該方法は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した少なくとも１個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むポリペプチドを、それを必要としている対象に提供し、それにより、凝固因子療法の使用において、服薬遵守を向上させることを含む。
別の実施形態では、本開示の方法は、凝固因子療法の必要な慢性疾患に罹患している患者の服薬遵守を向上させることを含む。別の実施形態では、本開示の方法は、本明細書において上記のＣＴＰで凝固因子を修飾することによって、凝固因子の投与頻度を低減できる。
別の実施形態では、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドの投与頻度を低減させる方法を提供し、該方法は、３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合して、それにより、前記ＦＩＸポリペプチドの投与頻度を低減させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドの投与頻度を低減させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合して、それにより、前記ＦＶＩＩａポリペプチドの投与頻度を低減させるステップを含む。
別の実施形態では、服薬遵守という用語は、アドヒアランス（患者が能動的に治療に参加すること）を含む。別の実施形態では、本開示の方法は、凝固因子の投与の頻度を低減させることによって、凝固因子療法の必要な患者の服薬遵守を向上させることを含む。別の実施形態では、凝固因子の投与頻度の低減は、ＣＴＰ修飾凝固因子をより安定にするＣＴＰ修飾に起因して達成される。別の実施形態では、凝固因子の投与頻度の低減は、凝固因子のＴ１／２の延長の結果として達成される。別の実施形態では、凝固因子の投与頻度の低減は、凝固因子のクリアランス時間の延長またはクリアランス速度の低下の結果として達成される。
別の実施形態では、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドのクリアランス速度を低下させる方法を提供し、該方法は、３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合し、それにより、前記ＦＩＸポリペプチドのクリアランス速度を低下させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドのクリアランス速度を低減させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合して、それにより、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのクリアランス速度を低減させるステップを含む。
別の実施形態では、凝固因子の投与の頻度の低下は、凝固因子のＡＵＣの値が増大する結果として達成される。
別の実施形態では、本明細書において、凝固因子の投与頻度を低減させる方法が提供され、該方法は、１～１０個のＣＴＰを凝固因子のカルボキシ末端に結合し、それにより、凝固因子の投与頻度を低減させるステップを含む。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子の投与頻度を低減させる方法が提供され、該方法は、１～５個のＣＴＰを凝固因子のカルボキシ末端に結合し、それにより、凝固因子の投与頻度を低減させるステップを含む。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子の投与頻度を低減させる方法が提供され、該方法は、３個のＣＴＰを凝固因子のカルボキシ末端に結合し、それにより、凝固因子の投与頻度を低減させるステップを含む。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子の投与頻度を低減させる方法が提供され、該方法は、３～５個のＣＴＰを凝固因子のカルボキシ末端に結合し、それにより、凝固因子の投与頻度を低減させるステップを含む。
別の実施形態では、本明細書において、凝固因子療法の使用における服薬遵守を向上させる方法が提供され、該方法は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した１～１０個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを、それと必要とする対象に提供し、それにより、凝固因子療法の使用における服薬遵守を向上させることを含む。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子療法の使用における服薬遵守を向上させるが提供され、該方法は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した１～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを、それを必要としている対象に提供し、それにより、凝固因子療法の使用における服薬遵守を向上させることを含む。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子療法の使用における服薬遵守を向上させる方法が提供され、該方法は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを、それを必要としている対象に提供し、それにより、凝固因子療法の使用における服薬遵守を向上させることを含む。別の実施形態では、本明細書において、凝固因子療法の使用における服薬遵守を向上させる方法が提供され、該方法は、凝固因子と、その凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを、それを必要としている対象に提供し、それにより、凝固因子療法の使用における服薬遵守を向上させることを含む。
別の実施形態では、本明細書において、対象における血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置する方法が提供され、該方法は、前記対象に、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した１～１０個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを提供し、それにより、前記対象の血液凝固障害または血液凝固異常を処置することを含む。別の実施形態では、本明細書において、対象における血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置する方法が提供され、該方法は、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した１～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを、それを必要としている対象に提供し、それにより、前記対象における血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本明細書において、対象における血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置する方法が提供され、該方法は、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを、それを必要としている対象に提供し、それにより、前記対象における血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置することを含む。別の実施形態では、本明細書において、対象における血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置する方法が提供され、該方法は、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを、それを必要としている対象に提供し、それにより、前記対象における血液凝固障害または血液凝固異常を予防または処置することを含む。
別の実施形態では、本明細書において、対象の血友病を予防する方法が提供され、該方法は、前記対象に、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した１～１０個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを提供し、それにより、前記対象における血友病を予防することを含む。別の実施形態では、本明細書において、対象における血友病を予防する方法が提供され、該方法は、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した１～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを、それを必要としている対象に提供し、それにより、前記対象における血友病を予防することを含む。別の実施形態では、本明細書において、対象における血友病を予防する方法が提供され、該方法は、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを、それを必要としている対象に提供し、それにより、前記対象における血友病を予防することを含む。別の実施形態では、本明細書において、対象における血友病を予防する方法が提供され、該方法は、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを、それを必要としている対象に提供し、それにより、前記対象における血友病を予防することを含む。
別の実施形態では、本発明は、本明細書で提供される組成物が、意外にも、ＳＣ投与後に血流中にさらに効果的に吸収されることを示す（本明細書における実施例７～９を参照のこと）。皮下にＦＶＩＩａを投与可能であることは、予防適用に用いることが可能であるので、利点として作用する。また、皮下注射は、患者にとって自己注射がかなり容易であり、かつ患者がごく若く、血管が小さく見つけるのが困難である場合に有利である。
別の実施形態では、本明細書において、対象の血友病を処置する方法が提供され、該方法は、前記対象に、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した１～１０個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを提供し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。別の実施形態では、本明細書において、対象の血友病を処置する方法が提供され、該方法は、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した１～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを、それを必要としている対象に提供し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。別の実施形態では、本明細書において、対象の血友病を処置する方法が提供され、該方法は、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを、それを必要としている対象に提供し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。別の実施形態では、本明細書において、対象の血友病を処置する方法が提供され、該方法は、凝固因子と、凝固因子のカルボキシ末端に結合した３～５個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドとを含むポリペプチドを、それを必要としている対象に提供し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。
一実施形態では、経口投与は、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、チュアブル錠、懸濁液、および乳剤などを含む単位剤形を含む。このような単位剤形は、本開示の所望の凝固因子の安全かつ有効な量を含み、その各々が、一実施形態では、約０．７または３．５ｍｇ～約２８０ｍｇ／７０ｋｇ、または別の実施形態では、約０．５または１０ｍｇ～約２１０ｍｇ／７０ｋｇである。経口投与用の単位剤形の調製に適する薬学的に許容可能な担体は、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、錠剤は典型的には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、マンニトール、ラクトースおよびセルロースなどの不活性希釈液；デンプン、ゼラチンおよびスクロースなどの結合剤；デンプン、アルギン酸およびクロスカルメロースなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および滑石などの潤滑剤として、従来の薬学的に適合性のアジュバントを含む。一実施形態では、二酸化ケイ素などの流動促進剤を用いて、粉末混合物の流動特性を改善することができる。一実施形態では、ＦＤ＆Ｃ染料などの着色剤は、外観のために添加することができる。アスパルテーム、サッカリン、メントール、ペパーミント、およびフルーツフレーバーなどの甘味料および香味剤は、チュアブル錠に有用なアジュバントである。カプセル剤は通常、上記で開示した１種または複数の固体希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、担体成分の選択は、本発明の目的にとって重要ではない味、コストおよび貯蔵安定性などの二次的考慮事項に依存し、当業者によって容易になされ得る。
一実施形態では、経口剤形は、所定の放出プロファイルを含む。一実施形態では、本発明の経口剤形は、持続放出錠剤、カプセル剤、トローチ剤またはチュアブル錠を含む。一実施形態では、本発明の経口剤形は、徐放錠剤、カプセル剤、トローチ剤またはチュアブル錠を含む。一実施形態では、本発明の経口剤形は、即時放出錠剤、カプセル剤、トローチ剤またはチュアブル錠を含む。一実施形態では、経口剤形は、当業者に既知の薬学的有効成分の所望の放出プロファイルに応じて処方される。
経口組成物は、いくつかの実施形態では、液体溶液、乳剤、懸濁液などを含む。いくつかの実施形態では、このような組成物の調製に適切な薬学的に許容可能な担体は、当該分野で周知である。いくつかの実施形態では、液体経口組成物は、約０．００１％～約０．９３３％、または別の実施形態では、約０．０１％～約１０％の所望の化合物（単一または複数）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の方法における使用のための組成物は、溶液または乳剤を含み、いくつかの実施形態では、これは、本発明の化合物、および必要に応じて、局所の鼻腔投与を意図する他の化合物の安全かつ有効な量を含む水性の溶液または乳剤である。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．００１％～約１０．０％（ｗ／ｖ）の本発明の化合物、さらに好ましくは、約００．１％～約２．０の本発明の化合物を含み、これは、経鼻投与による化合物の全身送達に用いられる。
別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、筋肉に注射される（筋肉内注射）。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、皮下に注射される（皮下注射）。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、筋肉中に注射される。別の実施形態では、凝固因子と、少なくとも１個のＣＴＰ単位とを含むポリペプチドは、皮膚に注射される。別の実施形態では、本明細書に記載される凝固因子は、全身投与により投与される。別の実施形態では、本明細書に記載される凝固因子は、静脈注射により投与される。別の実施形態では、投与には、非経口、肺、経口、局所、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、経鼻、眼内、眼、硬膜外、頬側、直腸、経粘膜、腸または非経口送達であってもよく、これには、髄内注射、およびくも膜下腔内または直接の脳室内投与が挙げられる。
別の実施形態では、製剤は、全身的な方法よりもむしろ局所的に、例えば、製剤の注射を介して患者の身体の特定の領域に直接投与される。
一実施形態では、投与の経路は、腸内であってもよい。別の実施形態では、経路は、結膜、経皮、皮内、動脈内、膣、直腸、腫瘍内、癌周囲、経粘膜、筋肉内、血管内、脳室内、頭蓋内、鼻腔内、舌下、またはそれらの組み合わせであってもよい。
別の実施形態では、医薬組成物および医薬製剤は、液状調製物の静脈注射、動脈注射または筋肉注射により投与される。いくつかの実施形態では、液体配合物は、溶液、懸濁液、分散液、乳剤、油類などを含む。一実施形態では、医薬組成物および医薬製剤は、静脈内投与され、したがって、静脈投与に適した形態で処方される。別の実施形態では、これらの医薬組成物および医薬製剤は動脈投与され、したがって、動脈投与に適した形態で処方される。別の実施形態では、これらの医薬組成物および医薬製剤は筋肉投与され、したがって、筋肉投与に適した形態で処方される。
さらに、別の実施形態では、医薬組成物および医薬製剤は体表面に局所的に投与され、したがって、局所投与に適した形態で処方される。適切な局所製剤としては、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、および点滴薬などを挙げることができる。局所投与のために、本発明の化合物は、医薬担体の有無にかかわらず、追加の適切な治療薬と組み合わされ、生理学的に許容される希釈剤中の液剤、懸濁剤、または乳剤として調製、適用される。
一実施形態では、本発明の医薬組成物および医薬製剤は、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥のプロセスなどの、当技術分野で公知のプロセスによって製造される。
一実施形態では、本発明による使用のための医薬組成物および医薬製剤は、有効成分の製剤への処理を容易にする、薬剤として使用可能な賦形剤および助剤を含む１種または複数の生理学的に許容可能な担体を用いて従来の方式で処方される。一実施形態では、製剤は、選択される投与経路に依存する。
一実施形態では、本開示の注射剤は水溶液として処方される。一実施形態では、本発明の注射剤は、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的塩緩衝液などの生理的に適合する緩衝液中で処方される。いくつかの実施形態では、経粘膜投与のために、透過すべき障壁に適する浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は当該技術分野において既知である。
一実施形態では、本明細書に記載の製剤は、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に処方される。いくつかの実施形態では、注射のための製剤は、単位剤形で、例えば、アンプル中で、または複数用量容器中で、必要に応じて添加された防腐剤とともに提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、油状または水性のビークル中の、懸濁液、溶液または乳剤であり、処方剤、例えば、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤を含む。
この組成物はまた、いくつかの実施形態では、塩化ベンザルコニウムおよびチメロサールなどの防腐剤、キレート剤、例えば、エデト酸ナトリウムなど、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および酢酸塩、等張化剤、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトールなど、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、アセチルシスチン、メタ重亜硫酸ナトリウムなど、芳香族剤、粘度調整剤、例えば、ポリマー、例としては、セルロースおよびそれらの誘導体、ならびにポリビニルアルコールおよび酸および塩基（必要に応じてこれらの水性組成物のｐＨを調節するための）を含む。これらの組成物はまた、いくつかの実施形態では、局所麻酔薬または他の活性成分も含む。組成物はスプレー、ミスト、および点滴薬などとして使用することができる。
いくつかの実施形態では、非経口投与のための医薬組成物および医薬製剤としては、水溶性型の活性調製物の水溶液が挙げられる。さらに、有効成分の懸濁液は、いくつかの実施形態では、必要に応じて、オイルまたは水ベースの注射用懸濁物として調製される。適切な親油性溶媒またはビークルには、いくつかの実施形態では、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリドもしくはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射用懸濁液は、いくつかの実施形態では、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含む。別の実施形態では、懸濁液はまた、適切な安定化剤、または有効成分の溶解度を増大して、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤を含む。
別の実施形態では、活性化合物は、ベシクルに入れて、特に、リポソームに入れて送達されてもよい（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３（１９９０）、Ｔｒｅａｔら、ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ－ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．）、Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３－３６５（１９８９）、Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７－３２７、Ｊ．Ｅ．Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓら、Ｐｈａｒｍ．／ｎｄ．５６（１９９４）２６７－２７５）。
別の実施形態では、制御放出系で送達される医薬組成物は、静脈内注入、植込み型浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与方式用として処方される。一実施形態では、ポンプが使用される（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）、を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を用いることができる。さらに別の実施形態では、制御放出系は、治療標的、すなわち脳に近位に置いてもよく、それにより、全身投与量の内のある画分しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８（１９８４）を参照されたい）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒによる概説（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３（１９９０））で考察されている。
いくつかの実施形態では、有効成分は、適切なビークル、例えば、無菌の発熱物質ナシの水ベースの溶液との使用前の構成のために、粉末形態である。組成物は、いくつかの実施形態では、霧化および吸入投与用に処方される。別の実施形態では、組成物は噴霧化手段を備えた容器に入れられる。
一実施形態では、本発明の製剤は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて、坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物に処方される。
いくつかの実施形態では、本発明の状況での使用に適切な医薬組成物および医薬製剤としては、有効成分が使用目的を達成するために有効な量で含まれる組成物が挙げられる。いくつかの実施形態では、治療有効量は、疾患の症状を予防、軽減もしくは緩和するか、または治療される対象の生存を延長させるために効果的な有効成分の量を意味する。
一実施形態では、治療有効量の決定は十分に当業者の能力の範囲内にある。
薬学的に許容可能な担体またはその成分として機能し得る物質のいくつかの例としては、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、およびメチルセルロースなどのセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカント；麦芽、ゼラチン；タルク、ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウムなどの固体潤滑剤；硫酸カルシウム；落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびカカオ油などの植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸；Ｔｗｅｅｎ（商標）ブランドの乳化剤などの乳化剤；ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；着色剤；香味剤；錠剤化剤、安定化剤；酸化防止剤；防腐剤；発熱物質を含まない水；等張食塩水；ならびにリン酸緩衝液が挙げられる。化合物と組み合わせて使用される薬学的に許容可能な担体の選択は、基本的に化合物が投与される方法により決定される。化合物が注入される場合に、一実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、ｐＨが約７．４に調整されている、血液適合性懸濁剤を有する無菌の生理食塩水である。
さらに、組成物は、結合剤（例えば、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、デンプングリコール酸ナトリウム）、様々なｐＨおよびイオン強度の緩衝液（例えば、トリス塩酸塩、酢酸塩、リン酸塩）、表面への吸収を防ぐためのアルブミンまたはゼラチンなどの添加剤、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、プルロニックＦ６８、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、透過促進剤、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール）、安定化剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増粘剤（例えば、カルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム）、甘味料（例えば、アスパルテーム、クエン酸）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、滑剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、流動助剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）、可塑剤（例えば、フタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル）、乳化剤（例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）、ポリマーコーティング（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）、コーティング剤およびフィルム形成剤（例えば、エチルセルロース、アクリレート、ポリメタクリレート）ならびに／またはアジュバントをさらに含む。
シロップ剤、エリキシル剤、乳剤および懸濁剤用の担体の典型的な成分としては、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、液体スクロース、ソルビトールおよび水を挙げることができる。懸濁液については、典型的な懸濁剤としては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（商標）、ＲＣ－５９１）、トラガカントおよびアルギン酸ナトリウムが含まれ、典型的な湿潤剤としては、レシチンおよびポリエチレンオキシドソルビタン（例えば、ポリソルベート８０）を挙げることができる。典型的な防腐剤としては、メチルパラベンおよび安息香酸ナトリウムを挙げることができる。別の実施形態では、経口液体組成物はまた、上記に開示した甘味料、香味剤および着色剤などの１種または複数の成分も含む。
これらの組成物はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどの高分子化合物の粒子状製剤の中もしくは上への活性物質の取り込み、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層の小胞、赤血球ゴースト、もしくはスフェロプラスト上への活性物質の取り込みも含む。このような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼす。
ポリマー（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）でコーティングされた粒子組成物、および組織特異的な受容体、リガンドもしくは抗原に対する抗体に結合した化合物、または組織特異的受容体のリガンドに結合した化合物も本開示に包含される。
いくつかの実施形態では、化合物は、共有結合したポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンまたはポリプロリンなどの水溶性ポリマーによって修飾される。別の実施形態では、修飾された化合物は、対応する非修飾化合物よりも静脈注射後の血中半減期が実質的に長い。一実施形態では、修飾は、水溶液中の化合物の溶解度を増加させ、凝集を排除し、化合物の物理的および化学的安定性を高め、化合物の免疫原性および反応性を著しく低下させる。別の実施形態では、そのようなポリマー－化合物の付加物を、非修飾化合物よりも少ない頻度で、または低用量で投与することにより、所望のインビボ生物活性が実現される。
いくつかの実施形態では、有効量または用量の調製は、最初はインビトロアッセイから推定できる。一実施形態では、動物モデルにおいて用量を処方することができ、そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
一実施形態において、本明細書に記載の有効成分の毒性および治療効力は、インビトロ、細胞培養、または実験動物において、標準的医薬手順により決定できる。一実施形態では、これらのインビトロおよび細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに使用される一定範囲の投与量を処方するのに用いることができる。一実施形態では、投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて変わる。一実施形態では、正確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる［例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９７５）"Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，Ｃｈ．１ ｐ．１、を参照されたい］。
一実施形態では、処置すべき状態の重症度および応答性に応じて、投薬は、数日～数週間続く治療の過程を伴う、または治癒が得られるか、または病態の縮小が達成されるまでの単回または複数回投与であり得る。
一実施形態では、投与されるべき組成物の量は、当然、処置される対象、苦痛の重篤度、投与方式、処方医の判断などに依存する。
一実施形態では、適合可能な医薬担体中で処方される本発明の調製物を含む組成物も調製され、適切な容器に入れられて、適応症状の処置に関してラベル表示される。
別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子は、複合有機賦形剤および安定化剤、例えば、非イオン性表面活性剤（すなわち、サーファクタント）、様々な糖類、有機ポリオールおよび／またはヒト血清アルブミンと組み合わされた凍結乾燥（すなわち、フリーズドライ）製剤である。別の実施形態では、医薬組成物は、記載のような、注射用滅菌水中の凍結乾燥凝固因子を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、記載のような、注射用滅菌ＰＢＳ中の凍結乾燥凝固因子を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、記載のような、注射用滅菌０．９％ＮａＣｌ中の凍結乾燥凝固因子を含む。
別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の凝固因子と、複合担体、例えば、ヒト血清アルブミン、ポリオール、糖類、および陰イオン性界面活性安定化剤とを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の凝固因子と、ラクトビオン酸と、酢酸塩／グリシン緩衝剤とを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の凝固因子と、インターフェロン組成物の水中溶解度を高めるアミノ酸、例えば、アルギニンまたはグルタミン酸とを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥された、本明細書に記載の凝固因子と、グリシンまたはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、緩衝液（例えば、酢酸塩）および等張剤（例えば、ＮａＣｌ）とを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥された、本明細書に記載の凝固因子と、リン酸緩衝剤、グリシン、ＨＳＡとを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、約４～７．２のｐＨを有する緩衝溶液中にあると安定化する。別の実施形態では、凝固因子を含む医薬組成物は、約４～８．５のｐＨを有する緩衝溶液中に入れられる。別の実施形態では、凝固因子を含む医薬組成物は、約６～７のｐＨを有する緩衝溶液中に入れられる。別の実施形態では、凝固因子を含む医薬組成物は、約６．５のｐＨを有する緩衝溶液中に入れられる。別の実施形態では、凝固因子を含む医薬組成物は、約６．４のｐＨを有する緩衝溶液中に入れられる。別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、安定化剤としてアミノ酸で、およびいくつかの場合には、塩で安定化される（アミノ酸が、電荷を持つ側鎖を含まない場合）。
別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、アミノ酸の安定化剤を約０．３重量％～５重量％含む液体組成物である。
別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、投薬精度および製品安全性を提供する。別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、注射可能な用途に用いられる、生物活性のある安定した液体製剤を提供する。別の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥されていない、本明細書に記載の凝固因子を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、液体状態での長期貯蔵を可能として、投与前の貯蔵および運搬を容易にする液体製剤を提供する。
別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、固形脂質をマトリックス材料として含む。別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む注射可能な医薬組成物は、固形脂質をマトリックス材料として含む。別の実施形態では、噴霧凝固による脂質微粒子の生成は、Ｓｐｅｉｓｅｒ（Ｓｐｅｉｓｅｒ ａｎｄ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８（１９９１）４７－５４）によって記載されており、その後、経口投与用の脂質ナノペレットが生成される（Ｓｐｅｉｓｅｒによる欧州特許第０１６７８２５号（１９９０））。別の実施形態では、使用される脂質（例えば、非経口栄養用の乳剤中に存在する脂肪酸からなるグリセリド）は、体内で耐容性良好である。
別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、高分子微小粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、リポソームを含む。別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、液体乳剤を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、ミクロスフェアを含む。別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、両親媒性脂質を含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の凝固因子を含む医薬組成物は、薬物と、脂質マトリックスと、界面活性剤とを含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、脂質マトリックスは、少なくとも５０％ｗ／ｗのモノグリセリド含量を有する。
一実施形態では、本発明の組成物は、有効成分を含有する１個または複数の単位剤形を含む、パックまたはディスペンサー装置、例えば、ＦＤＡ認可のキットに入れて提供される。一実施形態では、パックは、例えば、金属またはブリスターパックなどのプラスチックホイルを含む。一実施形態では、パックまたはディスペンサー装置は、投与のための説明書が添付されている。一実施形態では、パックまたはディスペンサーは、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた形式で容器に添付された通知が同梱されており、この通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。このような通知は、一実施形態では、処方薬または承認された製品添付文書について米国食品医薬品局によって承認されたラベリングである。
一実施形態では、本発明の凝固因子が、追加の活性剤と共に個体に提供されることで、各薬剤単独での処置と比較して、改善された治療効果が達成され得ることが理解されよう。別の実施形態では、併用療法に関連する有害な副作用を回避するための方策（例えば、補助剤の投与および選択）がとられる。
別の実施形態では、本発明はさらに、ＦＶＩＩａポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａのカルボキシ末端に結合した５個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＦＶＩＩａポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａのカルボキシ末端に結合した５個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなる、ＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなる、ＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなる、ＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドの生物学的半減期を延長させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合して、それにより、前記ＦＶＩＩａポリペプチドの生物学的半減期を延長させるステップを含む。
別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドの曲線下面積（ＡＵＣ）を増大させる方法を提供し、該方法は、３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合し、それにより、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのＡＵＣを増大させるステップを含む。
別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドの投与頻度を低減させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合して、それにより、前記ＦＶＩＩａポリペプチドの投与頻度を低減させるステップを含む。
別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドのクリアランス速度を低減させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合して、それにより、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのクリアランス速度を低減させるステップを含む。
別の実施形態では、本発明は、ＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを製造する方法を提供し、該方法は、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合し、それにより、ＣＴＰ修飾ＦＶＩＩａポリペプチドを製造するステップを含む。
別の実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、ＦＶＩＩａポリペプチドと、前記ＦＶＩＩａポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドを前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。
一実施形態では、本発明は、ＦＩＸポリペプチドと、前記ＣＴＰ修飾ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号３１に示される配列であるＣＴＰ修飾第ＦＩＸポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、配列番号１および配列番号２からなる群より選択されるアミノ酸配列によって、コードされるＣＴＰ修飾ＦＩＸポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰがグリコシル化されている、ＣＴＰ修飾ＦＩＸポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが切断されている、ＣＴＰ修飾ＦＩＸポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、リンカーを介してＦＩＸポリペプチドに結合されているＣＴＰ修飾ＦＩＸポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、リンカーがペプチド結合である、ＣＴＰ修飾ＦＩＸポリペプチドを提供する。
一実施形態では、本発明は、ＣＴＰ修飾ＦＩＸポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドと、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個のゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とからなるＣＴＰ修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号３０で示されるポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、配列番号１および配列番号２からなる群より選択されるアミノ酸配列によって、コードされるポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰがグリコシル化されているポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが切断されているポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰがリンカーを介して前記ＦＩＸのポリペプチドに結合されているポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、前記リンカーがペプチド結合であるポリヌクレオチドを提供する。発現ベクターは、ポリヌクレオチドを含む。
一実施形態では、本発明は、発現ベクターを含む細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、発現ベクターを含む組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドの生物学的半減期を延長させる方法を提供し、該方法は、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合し、それにより、前記ＦＩＸポリペプチドの生物学的半減期を延長させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、配列番号１および配列番号２からなる群より選択されるアミノ酸配列によって、コードされる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰがグリコシル化されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが切断されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、リンカーを介して前記ＦＩＸポリペプチドに結合されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、前記リンカーがペプチド結合である方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドの曲線下面積（ＡＵＣ）を増大させる方法を提供し、該方法は、３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合し、それにより、前記ＦＩＸポリペプチドのＡＵＣを増大させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、配列番号１および配列番号２からなる群より選択されるアミノ酸配列によって、コードされる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰがグリコシル化されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが切断されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、リンカーを介して前記ＦＩＸポリペプチドに結合されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、前記リンカーがペプチド結合である方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドの投与頻度を低減させる方法を提供し、該方法は、３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合し、それにより、前記ＦＩＸポリペプチドの投与頻度を低減させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、配列番号１および配列番号２からなる群より選択されるアミノ酸配列によって、コードされる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰがグリコシル化されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが切断されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、リンカーを介して前記ＦＩＸポリペプチドに結合されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、前記リンカーがペプチド結合である方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドのクリアランス速度を低減させる方法を提供し、該方法は、３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合し、それにより、前記ＦＩＸポリペプチドのクリアランス速度を低減させるステップを含む。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、配列番号１および配列番号２からなる群より選択されるアミノ酸配列によって、コードされる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰがグリコシル化されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが切断されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、リンカーを介して前記ＦＩＸポリペプチドに結合されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、リンカーを介して前記ＦＶＩＩポリペプチドに結合されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、前記リンカーがペプチド結合である方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＣＴＰ修飾第ＩＸ（ＦＩＸ）ポリペプチド製造する方法を提供し、該方法は、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を結合し、それにより、ＣＴＰ修飾ＦＩＸポリペプチドを製造するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、ＣＴＰ修飾ＦＩＸポリペプチドの配列が配列番号３１に示される配列である、方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、配列番号１および配列番号２からなる群より選択されるアミノ酸配列によって、コードされる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰがグリコシル化されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが切断されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、リンカーを介して前記ＦＩＸポリペプチドに結合されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、前記リンカーがペプチド結合である方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、対象の血友病を処置する方法を提供し、該方法は、ＦＩＸポリペプチドと、前記ＦＩＸポリペプチドのカルボキシ末端に結合した３個の絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含むＣＴＰ修飾第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを、前記対象に投与し、それにより、前記対象の血友病を処置することを含む。別の実施形態では、本発明は、ＣＴＰ修飾ＦＩＸポリペプチドの配列が配列番号３１に示される配列である、方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、配列番号１および配列番号２からなる群より選択されるアミノ酸配列によって、コードされる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰがグリコシル化されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが切断されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＣＴＰが、リンカーを介して前記ＦＩＸポリペプチドに結合されている方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、前記リンカーがペプチド結合である方法を提供する。
一般に、当該技術分野において知られているとおり、本発明の修飾されたペプチドおよびタンパク質は、所望の適用に応じて、標識、薬物、標的化薬剤、担体、固体支持体などに結合されてもよい。修飾された生物製剤の標識された形態を用いて、それらの代謝的運命を追跡してもよく、この目的の適切な標識としては、特に、放射性同位体標識、例えば、ヨウ素１３１、テクネチウム９９、インジウム１１１などが挙げられる。また、標識を用いて、アッセイ系での修飾されたタンパク質またはペプチドの検出を媒介してもよく、この場合、放射性同位体と同様に、酵素標識、蛍光標識、発色標識などを用いてもよい。このような標識の使用は、このペプチドまたはタンパク質が、それ自体、抗体またはレセプターリガンドなどの標的化薬剤である場合、特に有益である。
同様の連結技術を、ほかのものと同様に使用して、本開示の修飾ペプチドおよびタンパク質を固体支持体に対して結合してもよい。結合された場合、次に、これらの修飾されたペプチドおよびタンパク質を、特定の反応を呈する所望の成分の分離のためのアフィニティー試薬として用いてもよい。
最終的に、本開示の修飾されたペプチドおよびタンパク質を用いて、これらの新規の化合物と特に免疫反応性である抗体を生成してもよい。これらの抗体は、非修飾のペプチドまたはタンパク質の生物学的活性の性質に応じて、種々の診断および治療的な適用に有用である。本開示は、本明細書に記載のＣＴＰ修飾ＦＩＸ、ＦＶＩＩ、またはＦＶＩＩａと免疫反応性である抗体を提供することを理解されたい。一実施形態では、このような抗体を用いて、内在性の凝固因子から投与されたＣＴＰ修飾凝固因子を識別または特定し得る。別の実施形態では、この抗体を用いて、投与されたＣＴＰ修飾凝固因子の場所を特定してもよい。
本発明の追加の目的、利点、および新規特徴は、限定を意図するものではない次の実施例を考察することにより、当業者に明らかとなるであろう。さらに、上記本明細書中で詳述されたような、および、下記の特許請求の範囲のセクションにおいて請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれに関する実験的裏付けが下記の実施例において認められる。
実施例
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で使用される検査法には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば、"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ" Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ" Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，"Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ"，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ"，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）"Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ"，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）、以下に示された方法論：米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号、"Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ"，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；"Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ － Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ" ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ" Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），"Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），"Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ"，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照のこと、利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献に広範に記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、第４，０９８，８７６号、第４，８７９，２１９号、第５，０１１，７７１号および第５，２８１，５２１号、"Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ" Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；"Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ" Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；"Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ" Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；"Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ" Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；"Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ" ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；"Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ" Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ "Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ" Ｖｏｌ．１－３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；"ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ" ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと、これらの全てが、参照により組み込まれる。その他の一般的な文献は、本明細書全体を通して提供される。
実施例１
第ＩＸ凝固因子の生成および利用
組換えＦＩＸ分子のクローニングおよび発現：
第ＩＸ因子クローンを、本発明者らの真核生物発現ベクターｐＣＩ－ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号．Ｅ１８４１）中で構築した。ホモサピエンス第ＩＸ凝固因子のＯＲＦクローンは、「ＯｒｉＧｅｎｅ」（ＲＣ２１９０６５）に注文した。プライマーは、Ｓｉｇｍａ－Ｇｅｎｏｓｙｓに注文した。
３０１－１－ｐＣＩ－ｎｅｏ－ｐ２００－１１の構築物（第ＩＸ因子－ｃｔｐ ｘ２）：
プライマー１０１：５´ ＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＡＴ ３´（配列番号３６）
プライマー１０３Ｒ：５´ ＴＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＧＴＧＴＡ ３´（第ＩＸ因子のＳｓｐＩ部位を含む）（配列番号３７）
ＰＣＲ反応は、プライマー１０１およびプライマー１０３Ｒならびにテンプレートとして、プラスミドＤＮＡ、第ＩＸ因子のｃＤＮＡクローン（ＯｒｉＧｅｎｅ"ＲＣ２１９０６５）を用いて行った。ＰＣＲ増幅の結果、約１０８５ｂｐ（ｐｃｒ １０）の生成物が形成され、ゲルから精製された（第ＩＸ因子配列のアミノ末端を含むフラグメント）。
プライマー９８：５´ ＡＴＴＡＣＡＧＴＴＧＴＣＧＣＡＧＧＴＧＡ ３´（配列番号３８）。
プライマー９９Ｒ：５´ ＧＣＴＧＧＡＧＣＴＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴ ３´（配列番号３９）。
プライマー１００：５´ ＧＣＴＣＡＣＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣ ３´（配列番号４０）。
プライマー２７Ｒ：５´ ＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧ ３´（配列番号４１）。
３つのＰＣＲ反応を実施した。第一の反応は、プライマー９８およびプライマー９９ＲならびにテンプレートとしてプラスミドＤＮＡ、第ＩＸ因子のｃＤＮＡクローン（ＯｒｉＧｅｎｅ"、ＲＣ２１９０６５）を用いて行った。ＰＣＲ増幅の結果として、約５４０ｂｐの生成物が形成された。
第二の反応は、プライマー１００およびプライマー２７Ｒならびにテンプレートとして、４０２－２－ｐ７２－３のプラスミドＤＮＡ（ｈＧＨ－ＣＴＰ－ＣＴＰ）を用いて行った。ＰＣＲ増幅の結果、約２５８ｂｐの生成物を得た。
最後の反応（ｐｃｒ ３）を、プライマー９８および２７Ｒ、ならびにテンプレートとして前の２つの反応の生成物の混合物を用いて行った。ＰＣＲ増幅の結果、約７９０ｂｐの生成物を得て、ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログＫ２０００－０１）に連結した。ＳｓｐＩ－ＥｃｏＲＩフラグメントを単離した（ＴＡ ３－３）。
別のＰＣＲ反応（ｐｃｒ１２）を、プライマー１０１およびプライマー２７Ｒを用い、ならびにｐｃｒ １０の生成物およびｐｃｒ３のＳｓｐＩ－ＥｃｏＲＩフラグメントの混合物をテンプレートとして用いて行った。ＰＣＲ増幅の結果、約１７００ｂｐの生成物を得て（第ＩＸ因子－ｃｔｐ－ｃｔｐ）、ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ Ｋ２０００－０１）中に連結した（ｌｉｇ １８０）。
誤りが第ＩＸ因子配列中で見出され、そのフラグメントを置き換えて、正しいＤＮＡ配列を有する第ＩＸ因子－ｃｔｐ－ｃｔｐの挿入物を形成した。
ＴＡ－ｐｃｒ３－３を、ＳｓｐＩおよびＸｂａＩで消化し、大きいフラグメントを単離した（ベクター）。ＴＡ１８０－４を、ＳｓｐＩおよびＸｂａＩで消化して、小さいフラグメント（挿入物）を単離し、ＳｓｐＩおよびＸｂａＩで消化されたＴＡ－ｐｃｒ－３－３の単離された大きいフラグメントに連結した。この新しいプラスミドＴＡ－１８３－２を、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、第ＩＸ因子－ＣＴＰ－ＣＴＰ挿入物を、単離した（約１５７５ｂｐ）。このフラグメントを真核生物発現ベクターｐＣＩ－ｎｅｏ（ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化した）中に挿入し、３０１－２－ｐ２００－１１クローンを得た。
ｐＣＩ－ｄｈｆｒ－第９因子－ｃｔｐｘ２（ｐ２２３－４）の構築：ベクターｐＣＩ－ｄｈｆｒ（ｐ６－１）を、ＳｍａＩおよびＮｏｔＩで消化した。第ＩＸ因子－ＣＴＰ－ＣＴＰ（ｐ２００－１１）を、ＡＳｉｓＩＦ．Ｉ．およびＮｏｔＩで消化した。２つのフラグメントを連結した。
ｐＣＩ－ｄｈｆｒ第９因子－ｃｔｐｘ３（ｐ２２５－７）の構築：ベクターｐＣＩ－ｄｈｆｒ ＯＸＭ－ＣＴＰｘ３（ｐ２１６－４）を、ＸｂａＩおよびＡｐａＩで消化した。第ＩＸ因子－ＣＴＰ－ＣＴＰ（２２３－４）を、ＸｂａＩおよびＡｐａＩで消化した。２つのフラグメントを連結した。
ｐＣＩ－ｄｈｆｒ第９因子－ｃｔｐｘ３ Ｔ１４８Ａ（ｐ２４３－２）の構築：プラスミドｐ２２５－７は、トレオニンを１４８位に含んでいた。この理由は、ＦＩＸのより一般的な形態は、この位置にアラニンを含み、Ｔｈｒが、部位特異的変異誘発方法を用いてＡｌａに置換されたためであった。
プライマー７５：ｃｔｃｃｃａｇｔｔｃａａｔｔａｃａｇｃｔ（配列番号４２）。
プライマー１２２ｒ：ｇｇａａａａａｃｔｇｃｃｔｃａｇｃａｃｇｇｇｔｇａｇｃ（配列番号４３）
プライマー１２３：ｇｔｇｃｔｇａｇｇｃａｇｔｔｔｔｔｃｃｔｇａｔｇｔｇｇａｃｔａｔ（配列番号４４）
プライマー１２４ｒ：ｃａａｃａｃａｇｔｇｇｇｃａｇｃａｇ（配列番号４５）。
３つのＰＣＲ反応を実施した。第一の反応は、プライマー７５およびプライマー１２２ｒならびにテンプレートとしてプラスミドＤＮＡ ｐ２２５－７を用いて行った。ＰＣＲ増幅の結果、約６９２ｂｐの生成物を得て、ゲルから精製した。第二のＰＣＲ反応は、プライマー１２３およびプライマー１２４ｒ、ならびにプラスミドＤＮＡ ｐ２２５－７をテンプレートとして用いて行った。ＰＣＲ増幅の結果、約２３７ｂｐの生成物を得て、ゲルから精製した。第三の重複ＰＣＲ反応を、プライマー７５および１２４ｒ、ならびにテンプレートとして前の２つの反応の生成物の混合物を用いて行った。ＰＣＲ増幅の結果、約９１０ｂｐの生成物を得た。この重複ＰＣＲ生成物を、ＸｂａＩおよびＮｓｉＩで消化し、ｐ２２５－７プラスミド（ＸｂａＩおよびＮｓｉＩで消化）に再連結して、第ＩＸ因子－ｃｔｐｘ３ Ｔ１４８Ａ（ｐ２４３－２と命名）を得た。
ＦＩＸ－４ＣＴＰ（ｐ２５９－４）の構築：３．５ＣＴＰフラグメントを、制限酵素Ａｐａ１およびＸｂａ１によって、ｏｘｙｍ－４ＣＴＰ（ｐ２５４－３）から単離した。ＦＩＸ＋０．５ＣＴＰフラグメントを、制限酵素Ａｐａ１およびＸｂａ１を用いてＦＩＸ－３ＣＴＰ（ｐ２４３－２）から単離した。２つのフラグメントを連結した。
ＦＩＸ－５ＣＴＰ（ｐ２６０－１８）の構築：４．５ＣＴＰフラグメントを、制限酵素Ａｐａ１およびＸｂａ１によって、ｏｘｙｍ－５ＣＴＰ（２５５－１）から単離した。ＦＩＸ＋０．５ＣＴＰフラグメントを、酵素Ａｐａ１およびＸｂａ１を用いてＦＩＸ－３ＣＴＰ（ｐ２４３－２）から単離した。２つのフラグメントを連結した。
Ｄｇ４４細胞を、１００ｍｍの組織培養皿に播種し、５０～６０％集密度まで増殖させた。総計２μｇ（マイクログラム）のＦＩＸ ｃＤＮＡを、タンパク質を含まない培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ ＣＤ Ｄｇ４４）中でＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いた１つの１００ｍｍプレートの遺伝子導入用として使用した。培地を遺伝子導入の４８時間後に取り出して、ヌクレオシドなしで、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｎｅｏｍｙｃｉｎ）の存在下で、タンパク質を含まない培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ ＣＤ Ｄｇ４４）で置き換えた。１４日後、遺伝子導入した細胞集団を、Ｔ２５組織培養フラスコ中に移して、選択をさらに１０～１４日間、細胞が安定なクローンとして増殖を開始するまで続けた。高発現のクローンを選択した。約２×１０７個の細胞を用いて、１７００ｃｍ２のローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）中の、５ｎｇ／ｍｌのビタミンＫ３（メナジオン重亜硫酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ）を補充した３００ｍｌの増殖培地に接種した。この生成培地（ハーベスト）を、細胞生存率が約７０％に急速に低下した後に収集した。生成培地を、最初は透明化させ、その後、約２０倍に濃縮し、フローろ過カセット（１０ＫＤａ分画分子量、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）を用いてＰＢＳで透析した。
ＦＩＸ抗原レベルの測定：ＦＩＸ－ＣＴＰハーベストの抗原レベルを、ＡｓｓａｙＭａｘ ＨｕｍａｎＦＩＸ ＥＬＩＳＡキット（ＡｓｓａｙＰｒｏ－ＥＦ１００９－１）を用いて測定した。算出タンパク質濃度は、２つの独立した実験における３種の異なる希釈の平均である（図１Ａ、表１）。
Figure 0007187505000029
ＦＩＸ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ－イムノブロット：ＦＩＸ－ＣＴＰハーベストまたは精製されたｒｈＦＩＸ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、１００ｎｇのタンパク質を、１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルに、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、抗ヒトＦＩＸポリクローナル抗体および抗ヒトγ－カルボキシル化モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、ウエスタンイムノブロットにより行った。以前に報告のとおり、ｒｈＦＩＸは、５５ＫＤａに移動したが、２個のＣＴＰと融合したＦＩＸは、７５ＫＤａに移動した。ＦＩＸ－ＣＴＰタンパク質の両方の変異体とも、γ－カルボキシル化され、ＦＩＸ活性および機能に対する不可欠の翻訳後修飾が認められた（図１Ｂ）。
ＦＩＸ発色活性の測定：ＦＩＸ－ＣＴＰハーベストの、ｒｈＦＩＸタンパク質（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に対するインビトロ効力の比較評価を、市販の発色活性試験キット，ＢＩＯＰＨＥＮ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ ２２１８０２）を用いて行った。トロンビン、リン脂質、カルシウムの存在下で、過剰量のＦＸＩａは、サンプリングしたＦＩＸをＦＩＸａに活性化した。ＦＩＸａは、トロンビン、活性化ＦＶＩＩＩ：Ｃ（過剰量で供給）、リン脂質、およびカルシウムと酵素複合体を形成して、アッセイ系に存在する第Ｘ因子をＦＸａに活性化させる。この活性は、制限因子である、ＦＩＸの量と直接相関する。次いで、生成されたＦＸａは、ＦＸａ発色基質（ｐＮＡ）に対するその比活性により測定される。生成されたｐＮＡの量は、ＦＩＸａ活性に正比例する。ｒｈＦＩＸおよびＦＩＸ－ＣＴＰハーベストを系列希釈して、その効力を、ｒｈＦＩＸまたはヒト血漿からなる参照調製物に対してＦＩＸハーベストの用量反応曲線を比較することによって、評価した。ＦＩＸの平均ＥＣ５０は、２１ｎｇ／ｍｌであったが、ＦＩＸ－（ＣＴＰ２）ハーベストの算出ＥＣ５０は、３８２ｎｇ／ｍｌであり、ＦＩＸ－ＣＴＰハーベストの算出ＥＣ５０は、１６４４ｎｇ／ｍｌであった。ＦＩＸ－（ＣＴＰ２）ハーベストの酵素活性の約１５倍の減少が観察された（図２）。
ＦＩＸ凝固活性（ａＰＴＴ）：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、凝固カスケードの内因性かつ共通の経路の完全性を示す尺度となる。ａＰＴＴとは、内因性経路活性化因子、リン脂質およびカルシウムの添加後に血漿が凝固するのにかかる時間（秒）である。組織因子は、プロタイム（ＰＴ）試薬に含まれ、リン脂質中に含まれないので、ａＰＴＴ試薬は、部分トロンボプラスチンと呼ばれる。活性化因子は、この系を開始し、次いで内因性経路の残りのステップは、リン脂質の存在下で生じる。基準ａＰＴＴ範囲は、実験の間で変化するが、通常は、２７～３４秒の範囲である。
アッセイの原理は、ｒｈＦＩＸの添加によるＦＩＸ枯渇ヒト血漿の凝固活性を回復するＦＩＸ－ＣＴＰハーベストの能力を定量することであった。３００μｌのＦＩＸ枯渇ヒト血漿を、１００μｌのｒｈＦＩＸまたはＦＩＸ－ＣＴＰハーベストと混合して、系列希釈した。３７℃での６０秒のインキュベーション後、トロンボプラスチン、ＣａＣｌ２、およびリン脂質を、この混合物に添加し、凝固時間の秒数を測定した（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで実施）。効力は、ＦＩＸハーベストの用量反応曲線を、ｒｈＦＩＸまたはヒト血漿からなる参照調製物と比較することによって、評価した。１単位のＦＩＸ活性は、１ｍｌの正常なヒト血漿の活性に等しいＦＩＸ濃度に相当する。示したａＰＴＴ結果から、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２が、ｒｈＦＩＸに比較して特異的凝固活性の５．７倍の低下を示すことが示された（表２）。さらに、発色活性インビトロアッセイに加えて、ａＰＴＴの結果は、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２ハーベストが、ＦＩＸ－ＣＴＰハーベストに対して改善された酵素活性を有することを示唆する（表２）。ＦＩＸ－ＣＴＰタンパク質の改善された活性は、発現系の最適化（すなわち、フーリンとの同時遺伝子導入、およびビタミンＫ３培地濃度の最適化）後に得ることが可能で、これは、フーリンを使ったスーパートランスフェクション（Ｓｕｐｅｒ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）後に強化された（データ示さず）。
Figure 0007187505000030
ｒｈＦＩＸ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）およびＦＩＸ－ＣＴＰハーベストを、単回の静脈注射で、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（１物質あたり６匹のラット）に対して、体重１Ｋｇあたり７５μｇの用量で投与した（表３）。
Figure 0007187505000031
血液試料を、投与後０．０８３、０．５、１．５、４、８、２４、４８、および７２時間後に、交互に３匹のラットから眼窩後部より採取した。血漿は、サンプリング直後に調製し、－２０℃で分析時まで保管した。ＦＩＸ濃度は、ＦＩＸ ＥＬＩＳＡ特異的アッセイ（ＡｓｓａｙＰｒｏ）によって、定量した。薬物動態プロファイルは、各々のタンパク質について算出し、各時点での３匹の動物の平均を示す（図３）。終末半減期は、ＰＫ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ２．０ソフトウェアを用いて算出した。表４に、異なるサンプリング時点で観察されたＦＩＸ濃度をまとめている。
Figure 0007187505000032
ＰＫプロファイルおよび終末半減期の要約を、表５にまとめている。ＦＩＸ－ＣＴＰハーベストは、ｒｈＦＩＸと比較して改善されたＴ１／２β値を示す（それぞれ、２倍および５倍増加）。ＦＩＸ投与では、２４時間後に回収した動物血清濃度は、定量限界未満（ＢＬＱ）であったので、さらなるＰＫパラメーターを算出しなかった。
Figure 0007187505000033
この試験では、治療効力を保持すると同時に、ＦＩＸ半減期を延長させるための新規の手法について記載した。活性タンパク質に対してＣＴＰペプチドを付加することは、タンパク質の活性を妨げるという点で有害となる可能性がある。従って、ＦＩＸのＣ末端にＣＴＰ配列を付加することによる活性な組換えＦＩＸ－ＣＴＰの生成は予想外のことである。
免疫親和性精製されたＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰのキャラクタリゼーション
ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ精製
活性の増大した高品質含有物のタンパク質（ＰＫプロファイルが臨床設定を模倣しており、かつ臨床設定に外挿できる）を評価するために、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰは、そのカルボキシ末端で直列の２ＣＴＰ単位で修飾されたＦＩＸである。ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰは、ＦＩＸのＮ末端領域に存在するγ―カルボキシグルタミル（Ｇｌａ）残基に対するマトリックス結合モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログ番号３５７０ＭＸ）を用いて精製した。モノクローナル抗体を、セファロースＣＬ－４Ｂに結合した。８８μｇ／ｍｌの濃度のＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰハーベストを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ＭｍのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＥＤＴＡ（ＰＨ＝７．４）に対して透析した。負荷速度は、０．５ｍｌ／分とし、２０ＭｍのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、３５０ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＣａＣｌを用いて溶出を行い、非結合画分を、５回リサイクルした。最後に、溶出画分をＰＢＳで透析し、取り出して、濃縮した。
ＦＩＸ抗原レベルの測定：ＦＩＸ－ＣＴＰハーベスト、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２ハーベスト、およびＦＩＸ－（ＣＴＰ）２精製タンパク質レベルを、Ｈｕｍａｎ ＦＩＸ ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号ＦＩＸ－ＡＧ ＲＵＯ）を用いて測定した。算出タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）は、２つの独立した実験の平均である（図４、表６）。
Figure 0007187505000034
さらに、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰを、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで定量した。算出濃度は、２０２μｇ／ｍｌであり、これは、ヒトＦＩＸのＥＬＩＳＡによって、得られた濃度と同様である。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥブロット：ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰハーベスト、非結合画分および精製タンパク質を、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルにロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー分析を、クマシーブルー試薬（８００ｎｇのタンパク質）を用いてゲルを染色することにより行った。ウエスタンイムノブロットを、１００ｎｇのタンパク質、抗ヒトＦＩＸポリクローナル抗体（Ａｂ）、および抗ヒトγ－カルボキシル化モノクローナルＡｂ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号４９９およびカタログ番号３５７０）を用いて行った。免疫親和性精製法は、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ部分を大きく濃縮し、同時に不純物を低下させた（図５）。
Ｎ末端配列決定：ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ精製タンパク質を、１２％のＴｒｉｓ－グリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、続けて、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットした。目的のバンドを切り出して、精製Ｂｉｏｂｒｅｎｅ処理ガラスファイバーフィルター上に置いた。Ｎ末端配列分析は、１４０Ｃ ＨＰＬＣ微小勾配システム（ｍｉｃｒｏ－ｇｒａｄｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）を装備したパルス液相プロテインシーケンサーを用いてエドマン分解により行った。Ｎ末端の配列決定によって、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰが、不完全および完全プロペプチド切断タンパク質の混合物であることが明らかになった。不十分なプロペプチド切断は、ＦＩＸ凝固活性を低減させることが示された。フーリンを使った同時遺伝子導入によって、プロペプチド切断プロセスは改善できる。
ＦＩＸ発色活性の測定：ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ精製タンパク質の、ｒｈＦＩＸ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）およびヒト正常血漿のプールに対するインビトロ効力の比較評価を、市販の発色活性試験キット、ＢＩＯＰＨＥＮ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ ２２１８０２）を用いて行った。トロンビン、リン脂質、およびカルシウムの存在下では、過剰量のＦＸＩａは、ＦＩＸをＦＩＸａに活性化する。ＦＩＸａは、トロンビン（過剰量で供給された）との酵素複合体を形成し、リン脂質およびカルシウムは、アッセイ系中に存在する第Ｘ因子を、ＦＸａに活性化する。この活性は、制限因子である、ＦＩＸの量と直接相関する。生成されたＦＸａは、ＦＸａ発色基質（ｐＮＡ）に対するその比活性により測定された。生成されたｐＮＡの量は、ＦＩＸａ活性と正比例した。ｒｈＦＩＸ、ヒト血漿およびＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰを系列希釈し、用量反応曲線と比較することにより効力を評価した（図６）。ｒｈＦＩＸの平均ＥＣ５０は、６８．７４ｎｇ／ｍｌであり、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰの算出ＥＣ５０は、５０５ｎｇ／ｍｌであった。ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰの酵素活性における約７倍の低下が、組換えＦＩＸに対して観察され、正常ヒトのプール血漿に対して１６．５倍低下する。この低下した活性は、Ｎ末端分析により特定された、Ｎ末端プロペプチドの不適切な切断で説明可能であろう。
ＦＩＸ凝固活性（ａＰＴＴ）：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、凝固カスケードの内因性かつ共通の経路の完全性を示す尺度となる。ａＰＴＴとは、内因性の経路活性化因子、リン脂質およびカルシウムの添加後に血漿が凝固するのにかかる時間（秒で測定）である。
このアッセイは、ｒｈＦＩＸの添加により、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰタンパク質が、ＦＩＸ枯渇ヒト血漿の凝固活性を回復するための能力を定量した。３００μｌのＦＩＸ欠損ヒト血漿を、１００μｌのｒｈＦＩＸ、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ（ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ（ＣＴＰは、Ｃ末端で直列））、または正常プールヒト血漿と混合し、これをさらに希釈した。３７℃で６０秒のインキュベーション後に、組織因子（ＴＦ）、ＣａＣｌ２、およびリン脂質を、この混合物に添加した。凝固時間の秒数を測定した。効力は、ｒｈＦＩＸまたはヒト血漿の参照調製物に対してＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰの用量反応曲線を比較することによって評価した。一単位のＦＩＸを、１ｍｌのヒト正常血漿の活性に等しい量のＦＩＸとして定義した。
ａＰＴＴの結果により、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ凝固活性は、正常なプールのヒト血漿よりも１．４少ないだけであり、ｒｈＦＩＸと同様であることが示された。発色活性のインビトロアッセイと共に、ａＰＴＴの結果により、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ精製によって、その活性が損なわれなかったことが示唆される。
ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰの薬物動態学的活性：精製ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ、ｒｈＦＩＸ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）およびハーベスト（ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰおよびＦＩＸ－ＣＴＰを含有）を、単回の静脈注射で、体重１ｋｇあたり１００μｇの用量で、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに投与した（１物質あたり８匹のラット）（表７）。
Figure 0007187505000035
血液試料を、投与後０．０８３、０．５、２、４、７、１０、２４、４８、および７２時間に、４匹のラットから交互に眼窩後から採取した。クエン酸処理血漿（０．３２％）をサンプリング直後に調製して、－２０℃で分析時まで保存した。ＦＩＸ濃度を、ヒトＦＩＸ ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を用いて定量した。薬物動態プロファイルを、各々の時点で４匹の動物の平均として、それぞれのたんぱく質に対し算出した（図７）。終末半減期を、ＰＫ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ２．０ソフトウェアを用いて算出した。表８は、観察されたＦＩＸ濃度を、異なるサンプリング時点についてまとめている。
Figure 0007187505000036
ＰＫパラメーターのまとめを表９に示す。
Figure 0007187505000037
ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰハーベストは、ＦＩＸ－ＣＴＰハーベストと比較して改善されたＰＫプロファイルを示した。さらに、精製されたＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰは、Ｔ１／２β値の３倍の延長、およびＡＵＣの４．５倍の増大をｒｈＦＩＸと比較して示した。
単一のＣＴＰの融合物に比較して、直列のＣＴＰ分子の融合物の分泌ＦＩＸの量の減少は、余分なＣＴＰの付加に起因するのであって、ＥＬＩＳＡによる検出の減少に起因するのではないと思われる。この理由は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ精製のＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ算出濃度は、ＥＬＩＳＡ算出濃度と同様であったからである。
ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ凝固活性は、プールされたヒト血漿と同様であった。しかし、そのインビトロ発色活性は、ｒｈＦＩＸまたはプールされたヒト血漿と比較した場合、かなり低かった。発色活性アッセイは、凝固アッセイと比較して極めて鋭敏なアッセイとして報告された。ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰの活性の低下の理由は変わる可能性がある。ＣＴＰの付加は、ＦＸＩａに対するＦＩＸの親和性を減少させる場合もあり、または転写後修飾を低減させる場合もある（例えば、１２－１０ＧＬＡ残基およびプロペプチド切断）。Ｎ末端分析によって、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰプロペプチドのタンパク質切断は、分泌の前に完全には完了しなかったことが明らかになった。この転写後修飾は、タンパク質の正常な酵素活性に重要であるので、フーリン－ＰＡＣＥプラスミドによる同時遺伝子導入が好適であり、また、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ活性を改善する可能性がある。
最終的に、ラットでのＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰの比較のＰＫ試験によって、ＦＩＸのＣ末端に対する２個の直列のＣＴＰの融合が、半減期が延長されたＦＩＸを生じることが示された。
ＦＩＸ欠損マウスモデル：インビボ活性を評価するために、ＦＩＸノックアウトマウスを得て、繁殖コロニーを確立する。市販の組換えｈＦＩＸ（ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標））またはｒＦＩＸ－（ＣＴＰ）２（ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰ）のいずれか１０μｇを、麻酔を施したＦＩＸノックアウトマウス（２２～２８ｇ）の尾静脈に注射した。注入タンパク質の量は、正常な血漿に必要なＦＩＸの濃度（５μｇ／ｍｌ）に等しい。血液試料は、クリップした尾からヘパリン処理した毛細管中へ、特定の時点で採取する。血漿試料のＦＩＸレベルについてＥＬＩＳＡにより評価し、効力をａＰＴＴ凝固アッセイによって、測定する。
ＦＩＸプロペプチド切断効力の増大：ＣＴＰペプチドｃＤＮＡを、ヒトＦＩＸｃＤＮＡの３´末端に融合した。対応するｒＦＩＸおよびフーリン発現構築物を、Ｄｇ４４細胞に同時遺伝子導入し、ヒトｒＦＩＸ ｃＤＮＡも、対照としてフーリンプラスミドを使って同時遺伝子導入した。高レベルのＦＩＸの分泌によって、細胞中の限られた量のフーリンプロテアーゼに起因する、プロファクターと成熟のＦＩＸ因子との混合物の分泌が生じる。フーリン発現ベクターとプロファクター発現ベクターとの同時遺伝子導入によって、回収が増大し、完全にプロセシングされたＦＩＸの培地中への分泌が生じる。
ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２およびフーリンの同時遺伝子導入後、安定なクローンが生成され、ハーベストがプロペプチドの切断評価のために収集される。１００ｎｇのタンパク質を、１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルに、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を、ウエスタンイムノブロットによって、抗ヒトＦＩＸポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および抗プロペプチドポリクローナル抗体を用いて行う。前に報告されたとおり、ｒｈＦＩＸは、５５ｋＤａに移動したが、２個のＣＴＰに融合されたＦＩＸは、７５ｋＤａに移動した。ＦＩＸタンパク質の両方の変異体は、適切な全長プロペプチド切断を受けることが示される。
適切なプロペプチド開裂が、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２酵素活性を向上させるか否かを判定するために、フーリンと同時遺伝子導入したＦＩＸ－（ＣＴＰ）２ハーベストの発色活性と凝固活性との比較評価を実施する。ｒｈＦＩＸと類似の、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）２特異的活性の大きな向上が観察される。
結論として、本明細書に記載される結果によって、ＦＩＸ－ＣＴＰ－ＣＴＰは、血友病Ｂ患者を処置するのに有効に用いることができることが示唆される。ＣＴＰ構築物に融合されたＦＩＸは、特定のインビトロ指標での欠点を克服するという、改善されたインビボ薬理学的性能の恩恵を受ける。この提唱された処置は、注入速度および必要な投与量が低減されるので、以前の処置に比べて有利である。
アルブミン融合分子戦略を用いて、ＦＩＸ半減期を改善する場合、組換えＦＩＸが不活性になることに注意することが重要である。本発明の新規の手法は、改善された長時間作用型活性を示す新規の組換えＦＩＸ融合タンパク質の設計および精製をもたらす。わずかな程度の改変では、注入ＦＩＸの薬物動態が改善しなかったので、ＦＩＸに融合されたＣＴＰが、薬物動態学的パラメーターを向上させるという知見は予想外であった。高度にグリコシル化されたペプチド－シアル酸残基の存在によって、タンパク質は安定化され、ＦＩＸ機能の重要な決定基を阻害することなく血管受容体との相互作用から保護された。
ＦＩＸ－ＣＴＰは、血友病Ｂ患者において、ｒＦＩＸに対して同様の治療効力を有し、投与頻度を少なくする。ＦＩＸ－ＣＴＰの単回注射は、出血症状を制御し、血友病Ｂ患者における外科的介入の間に必要な注射の回数を減らすのに十分である。
ＣＴＰ技術を、長時間作用型ＦＩＸの開発のために利用した。特に、組換えｒＦＩＸ分子の半減期の延長は、ＦＩＸに対する少なくとも１個のヒトＣＴＰの融合により行われた。組換えＦＩＸ－ＣＴＰは、哺乳動物細胞で発現され、インビトロおよびインビボでキャラクタリゼーションされた。ｒＦＩＸ－ＣＴＰのインビトロ活性は、ｒＦＩＸと同等であることが示された。ラットにおける薬物動態学的試験および有効性試験によって、ｒＦＩＸ－ＣＴＰの改善された特性が示された。この試験の結果、野性型酵素に対して同様の止血特性を有し、半減期が延長されたｒＦＩＸ分子を開発することが実現可能であることが示される。
実施例２
精製ＦＩＸ－ＣＴＰ３の、ＦＩＸ－ＣＴＰ４およびＦＩＸ－ＣＴＰ５に対する比較評価
２．１ 試験の目的
部分精製プロセス後のＦＩＸ－ＣＴＰ４およびＦＩＸ－ＣＴＰ５の、ＦＩＸ－ＣＴＰ３に対する薬物動態学的パラメーターの比較評価
２．２ ＦＩＸ－ＣＴＰ４およびＦＩＸ－ＣＴＰ５ハーベストの生成
４～５個の直列のＣＴＰ配列に対してＣ末端で融合されたＦＩＸ ｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ ＲＣ２１９０６５）は、１０ｎｇ／ＬのビタミンＫ３（Ｓｉｇｍａ，Ｍｅｎｎａｄｉｏｎ）の存在下で、Ｅｘｃｅｌｌｇｅｎｅ発現系を用いて、Ｄｇ４４細胞中で発現された。ハーベストを収集し（３００ｍｌ）、濾過して、凍結した。
２．３ ＦＩＸ－ＣＴＰ３ハーベストの生成
ＦＩＸ－ＣＴＰ３は、ＣＨＯ細胞中で、ｐＣＩ－ＤＨＦＲベクター、クローン１９６、ＢＲ－９を用いて、２５ｎｇ／ＬのビタミンＫ３（Ｓｉｇｍａ）の存在下、社内で発現させた。ハーベストを、収集して濾過した。
全てのＦＩＸ－ＣＴＰ試料（３、４および５個のＣＴＰ）を、材料がないという理由で、Ｊａｃａｌｉｎカラムのみで精製した。
２．４ ＦＩＸ抗原レベルの測定
ＦＩＸ抗原レベルは、ヒトＦＩＸ ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号ＦＩＸ－ＡＧ ＲＵＯ）を用いて測定した。算出タンパク質濃度は、４つの独立した実験の平均である。ＦＩＸ－ＣＴＰ３の濃度は、２つの追加の場合と比較してわずかに高かった（表１０）。
Figure 0007187505000038
２．５ ＦＩＸ－ＣＴＰクマシー染色およびイムノブロット
ＦＩＸ－ＣＴＰ３、ＦＩＸ－ＣＴＰ４、およびＦＩＸ－ＣＴＰ５ハーベストを、１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルに、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を、ウエスタンイムノブロットにより、抗ＣＴＰポリクローナル抗体（Ａｄａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）または抗Ｇｌａ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いて行った。
前に報告のとおり、３個のＣＴＰに融合されたＦＩＸは、８０ｋＤａに移動したが、４または５個のＣＴＰに融合されたＦＩＸは、それぞれ、８５ＫＤａまたは９０ＫＤａに移動した。予想どおり、Ｅｘｃｅｌｌｇｅｎｅ由来のＦＩＸ－ＣＴＰ４およびＦＩＸ－ＣＴＰ５ハーベストは、Ｐｒｏｌｏｒで生成されたＦＩＸ－ＣＴＰ３ハーベストと比較して極めて低レベルのγ－カルボキシル化を示した（図８）。
Ｊａｃａｌｉｎカラムを利用する精製プロセス（グリコシル化タンパク質の免疫親和性精製）後、ＦＩＸ－ＣＴＰ３、ＦＩＸ－ＣＴＰ４、およびＦＩＸ－ＣＴＰ５を１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルに、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、試料検出のためにクマシーブルー色素により染色した。全ての変異体によって、かなりきれいなバンドプロファイルが示され（図９）、これは純度の改善を示唆していた。
２．６ ＦＩＸ発色活性の測定
完全に精製された（ＨＡカラム）ＦＩＸ－ＣＴＰ３、ＦＩＸ－ＣＴＰ４およびＦＩＸ－ＣＴＰ５の、ヒトプール正常血漿に対するインビトロ効力の比較評価を、市販の発色活性試験キット、ＢＩＯＰＨＥＮ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ ２２１８０２）を用いて行った。全ての試料を系列希釈して、その効力を、正常ヒト血漿の参照調製物に対して用量反応曲線を比較することによって評価した。血漿と比較したＦＩＸ－ＣＴＰ４およびＦＩＸ－ＣＴＰ５の発色活性の低下（図１０）は、例えば、不適切なγ－カルボキシル化およびプロペプチド切断、などのＦＩＸタンパク質の不適切な転写後修飾の結果、あるいはＣＴＰカセットの付加が原因であり得る。ＦＩＸ－ＣＴＰ４およびＦＩＸ－ＣＴＰ５活性における変動（表１１）は、抗原部位のＣＴＰマスキングに起因する、ＦＩＸ ＥＬＩＳＡの不適切な定量能力によって、生じる可能性がある。
Figure 0007187505000039
２．７ 薬物動態学的試験
Ｊａｃａｌｉｎ精製ＦＩＸ－ＣＴＰ３、ＦＩＸ－ＣＴＰ４、およびＦＩＸ－ＣＴＰ５（それぞれ、群Ａ、ＢおよびＣ）を、単回の静脈注射により、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（１群あたり６匹のラット）体重１ｋｇあたり２５０μｇの用量で投与した。血液試料を、投与の０．０８３、０．５、２、５，８、２４、４８、７２および９６時間後に、３匹のラットから交互に眼窩後部より採取した（表１２）。クエン酸処理血漿（０．３８％）をサンプリング直後に調製して、－２０℃で分析時まで保存した。
Figure 0007187505000040
血漿試料中のＦＩＸ濃度は、ヒトＦＩＸ ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を用いて定量した。薬物動態プロファイルを算出した。これは、各時点での３匹の動物の平均である。終末半減期は、ＰＫ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ２．０ソフトウェアを用いて算出した。下の表１３は、異なるサンプリング時点での算出ＦＩＸ濃度をまとめている。
Figure 0007187505000041
ＰＫプロファイルおよびＰＫパラメーターのまとめを、下表１４および図１１に示す。全ての時点での完全なＰＫ分析プロファイルによって、ＦＩＸに対する４または５個のＣＴＰカセットの付加は、ＦＩＸ－ＣＴＰ３と比較してその半減期を延長しなかったことが示唆された。ＦＩＸ－ＣＴＰ５投与後のＡＵＣは、ＦＩＸ－ＣＴＰ３に対して１．４倍～１．６倍まで増大したが、これは統計学的に有意ではなかった。
Figure 0007187505000042
投与９６時間後の試料は、アッセイの定量の下限である、極めて低いＦＩＸ濃度を有することが示され、終末半減期を再算出して、より正確かつ科学的に妥当な算出結果を得た（表１５）。この算出によれば、ＦＩＸ－ＣＴＰ３、ＦＩＸ－ＣＴＰ４、およびＦＩＸ－ＣＴＰ５の半減期の間でさらに小さい相違が得られた。
Figure 0007187505000043
２．８ 結論：
この試験では、ＦＩＸ－ＣＴＰ３、ＦＩＸ－ＣＴＰ４、およびＦＩＸ－ＣＴＰ５の薬物動態学的パラメーターおよび潜在的な凝固活性を評価した。ＦＩＸに対する４および５個のＣＴＰの融合では、ＦＩＸ－ＣＴＰ３と比較して優れた半減期の延長も改善された半減期の延長も得られず、また、発色活性の低下が観察された。下の表１６は、種々のＦＩＸ－ＣＴＰ融合変異体（１～５個のＣＴＰ）についての半減期の改善パーセントをまとめている。ＦＩＸに対するＣＴＰの融合は、その薬物動態学的挙動を改善したが、予期せぬことに、この改善には限界があった。意外にも、ＦＩＸに対する３、４または５個のＣＴＰの直列の融合後、類似の半減期の値が算出された。
Figure 0007187505000044
これらのデータによって、ＦＩＸに対する３ＣＴＰの融合は、タンパク質の半減期に最大の改善を生じることが示唆され、ＦＩＸ－ＣＴＰ３は、半減期、構造および潜在的な凝固活性に関するさらなる臨床開発のための最適の変異体であることが確認される。
実施例３
ＦＩＸ－／－血友病マウスモデルのＦＩＸ－ＣＴＰ３処置
上記のとおり、ＦＩＸ－ＣＴＰ、ＦＩＸ－ＣＴＰ２およびＦＩＸ－ＣＴＰ３ハーベストのＰＫプロファイルならびにｒｈＦＩＸに対する凝固活性を調査する試験を行った。ＦＩＸ－ＣＴＰ３は、改善されたＰＫプロファイルを示し、同時に、その凝固活性を、ＦＩＸ－ＣＴＰ１およびＦＩＸ－ＣＴＰ２ハーベストまたはｒｈＦＩＸと比較して、維持していた。この結果をさらに評価するために、ＦＩＸ－ＣＴＰ３ γ－カルボキシグルタメートタンパク質を精製した。ＦＩＸ－ＣＴＰ３は、単回のＩＶ投与後、正常なラットにおいて、ｒｈＦＩＸと比較して、半減期の３倍の延長と、４．５倍大きいＡＵＣを示す。ＦＩＸ－ＣＴＰ３は、ほとんどの場合、Ｎ末端プロペプチドの不適切な切断および不適切な転写後修飾（ＰＴＭ）、例えば、適切なγ－カルボキシル化におそらく起因して、インビトロの発色の活性と凝固活性の低下を示した。
この試験において、３個の直列のＣＴＰに融合されたヒト組換えＦＩＸの薬物動態学的特性および薬力学的特性を、ＦＩＸ欠損マウスで試験した。
試験の目的：
類似の比活性および用量（ＰＤに対する類似の比活性およびＰＫについて類似のＦＩＸ定数）での、ＦＩＸ欠損マウスにおける、ＦＩＸ－（ＣＴＰ）３の単回のＩＶ投与後のｒＦＩＸ－（ＣＴＰ）３の、市販のｒｈＦＩＸ（ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標））に比較した、薬物動態学的パラメーターおよび薬力学的パラメーターを決定すること。
ＦＩＸ－ＣＴＰ３ハーベストの生成：
３個の直列のＣＴＰ配列に対してＣ末端で融合されたＦＩＸのｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ ＲＣ２１９０６５－Ｔｈｒ １４８）を、２５ｎｇ／ｍｌのビタミンＫ３（Ｓｉｇｍａ，Ｍｅｎｎａｄｉｏｎ）の存在下で、Ｅｘｃｅｌｌｇｅｎｅ発現系を用いてＤｇ４４細胞中で発現させた。５リットルの細胞懸濁液を含む５つの別々のバッチを培養して（総計２５リットル）、６０～７０％への生存率低下後に回収した。このハーベストを濾過し、－７０℃で凍結した。
ハーベストのＦＩＸ抗原レベルの測定：
ハーベストＦＩＸ抗原レベルは、ヒトＦＩＸ ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号ＦＩＸ－ＡＧ ＲＵＯ）を用いて測定した。各々のバッチについて抗原レベルを算出した。ＦＩＸ濃度は、異なるバッチ間で維持された（表１７）。
Figure 0007187505000045
ＦＩＸ－ＣＴＰ３精製プロセス：
短い精製試験の後、３個のカラムを用いる下記の精製プロセスを実施した：ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｈｅｐａｒｉｎ ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＨＡ Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ｔｙｐｅ １（４０μｍ）、ＦＩＸ－ＣＴＰ３。γ－カルボキシル化富化タンパク質を精製した。手短に言えば、下記の通り。５リットルの清澄化ハーベストを、４℃で４日間にかけて解凍した。各々の精製バッチについて、清澄化ハーベスト（２リットル）を４倍に濃縮し、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）に対して、１０ｋＤａの公称分画分子量サイズの使い捨て型中空ファイバーカートリッジを用いて、透析した。このプロセス（ＵＦＤＦ１）を２回行って、１リットルのＵＦＤＦ１を、ＤＥＡＥセファロースカラムにロードし、第ＩＸ因子を２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ８．２）で溶出した。生成物を２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ７．５）を用いて１：１に希釈し、ｐＨを７．５に調節した後に、Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードした。溶出は、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、および１０ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ７．５）で行った。溶出生成物を濃縮し、１０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．８）に対して、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬカセット １０ＫＤａカットオフ膜を用いて透析した（ＵＦＤＦ２）。生成物をＨＡカラムにロードして、第ＩＸ因子の活性化画分を、１５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．８）で溶出した。精製生成物を２ｍｇ／ｍｌの標的濃度まで濃縮して、ＴＢＳ（ｐＨ７．４５）に対して透析し、一定分量に分けて、－７０℃で保管した。
総容積（２５リットル）を精製するために、この精製プロセスを、毎週、５回繰り返した。この精製プロセスを、ＨＡ番号６～１０と名付けた。各々の精製生成物を、別々に評価した（Ａｐｐ番号１～５）。精製プロセスの終わりに、異なるバッチをプールして、４ｍｇ／ｍｌの標的濃度までさらに濃縮した。
ＦＩＸ－ＣＴＰ３の分析特性：
ＦＩＸ抗原レベルの測定
ＦＩＸ－ＣＴＰ３γ－カルボキシル化富化タンパク質抗原レベルを、ヒトＦＩＸ ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号ＦＩＸ－ＡＧ ＲＵＯ）を用いて測定した。算出タンパク質濃度は、２つの独立した実験の平均である（表１８）。
Figure 0007187505000046
ＳＤＳ－ＰＡＧＥブロット：
ＦＩＸ－ＣＴＰ３ γ－カルボキシル化富化タンパク質、ｒｈＦＩＸおよびｒＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）を、１２％のＴｒｉｓ－グリシンゲルに対して、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてロードした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー分析を、クマシーブルー試薬（８００ｎｇのタンパク質）を用いてゲルを染色することにより行った（図１２）。ウエスタンイムノブロットを、１００ｎｇのタンパク質と、抗ヒトＦＩＸポリクローナル抗体（図１２Ｂ）、抗ヒトγ－カルボキシル化モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号４９９，３５７０）（図１２Ｃ）、抗ＦＩＸプロペプチドポリクローナル抗体（図１２Ｄ）、および抗ＣＴＰポリクローナル抗体（図１２Ｅ）とを用いて行った。前に報告されたとおり、ＦＩＸ－ＣＴＰ３は、７５ＫＤａに移動した。
精製手順は、ＦＩＸ－ＣＴＰ３部分をかなり濃縮し、同時に、不純物を低減させた。この精製プロセスの収率は、極めて低く、抗－Ｇｌａイムノブロットで示されるように（図１２Ｂ）、γ－カルボキシル化ＦＩＸ－ＣＴＰ３画分のみを収集する要求のためにほぼ２～３％（データ示さず）の範囲であった。クマシーおよびＦＩＸイムノブロットに基づくと、ＦＩＸ－ＣＴＰ３部分は、ほぼ６０～７０％のみであり、追加のより低分子のバンド（おそらくより低いグリコシル化型を有する）も同様に検出された。
ＦＩＸ－ＣＴＰ３凝固活性：
ＦＩＸ－ＣＴＰ ３ 発色活性：
ＦＩＸ－ＣＴＰ３ハーベストおよびＦＩＸ－ＣＴＰ３ γ－カルボキシル化富化タンパク質の、ヒトプール正常血漿に対するインビトロ効力の比較評価を、市販の発色活性試験キット，ＢＩＯＰＨＥＮ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ ２２１８０２）を用いて行った。ＦＩＸ－ＣＴＰ３ハーベストおよびタンパク質を系列希釈し、その効力を、用量反応曲線を、正常ヒト血漿からなる参照調製物と比較することによって評価した。前に示したとおり、ＦＩＸ－ＣＴＰ３ハーベストは、ヒトプール血漿よりも５０倍活性が低かった（表１９、図１３）。ＦＩＸ－ＣＴＰ３精製後、発色活性は、大きく改善されて、ヒトプール血漿よりも４．７２倍活性が低いだけであった（表１９、図１３）。ハーベストの低下した発色活性は、ＦＩＸタンパク質変異体の不適切な転写後修飾、例えば、不十分なγ－カルボキシル化およびプロペプチド切断の結果であり得る。ＦＩＸ－ＣＴＰ３のγ－カルボキシル化画分の精製および濃縮後、活性は改善され、これは、ＦＩＸ活性に対するγ－カルボキシル化の重要な寄与を示す。
Figure 0007187505000047
一段階凝固アッセイ（ａＰＴＴ）：
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、凝固カスケードの内因性かつ共通の経路の完全性を示す尺度となる。ａＰＴＴとは、内因性経路活性化因子、リン脂質およびカルシウムの添加後に血漿が凝固するのに要する時間（秒）である。アッセイの原理は、ｒｈＦＩＸの添加によるＦＩＸ枯渇ヒト血漿の凝固活性を回復するＦＩＸ－ＣＴＰ３の能力を定量することであった。２００μｌのＦＩＸ欠損ヒト血漿を、２５μｇ／ｍｌのＦＩＸ－ＣＴＰ３と混合し、さらにＴＢＳ中で希釈した。３７℃で６０秒のインキュベーション後、５０μｌのＰＴＴ活性化因子（Ａｃｔｉｎ ＦＳ）および５０μｌのカルシウムの２５ｍＭを、この混合物に添加し、凝固時間の秒数を、Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）ＣＡ １５００ Ｃｏａｇｕｌａｔｏｒを用いて決定した（検証済ａＰＴＴアッセイを用いて、Ｓｈｅｂａ ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒにより行った）。その効力を、正常なヒトプール血漿の参照調製物の用量反応曲線に対するＦＩＸ－ＣＴＰ３の比較により評価した。結果は、１％未満～１１０％のＦＩＸレベルをカバーしている標準曲線から外挿した活性のパーセントで表す。ＦＩＸ－ＣＴＰ３は、身体中のＦＩＸの正常値である５μｇ／ｍｌでの活性は、６．５％であることが示されたので、正常ヒトプール血漿に対してその凝固活性の１５～２０倍の低下を示した（表２０）。
Figure 0007187505000048
また、ＦＩＸ－ＣＴＰ３は、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）と比較して凝固時間の延長を示した（表２１および図１４）。
Figure 0007187505000049
追加の凝固アッセイが、ＦＩＸ欠損マウスに対し、ノースカロライナ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）のＰａｕｌ Ｍｏｎａｈａｎ博士により独立に実施され、その後にＰＫ－ＰＤ試験を開始した。ａＰＴＴの結果により、ＦＩＸ－ＣＴＰ３凝固活性は、適切な凝固作用には、より長期間（秒で測定）およびより高濃度が必要なことで示されるとおり、正常なプールされたヒト血漿よりも４０倍小さいことが示唆された（表２２）。
Figure 0007187505000050
ＦＩＸ－ＣＴＰ３およびＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）についてＥＬＩＳＡにより算出されたＦＩＸ抗原レベルに基づいた比活性（ｕ／ｍｌ）は、それぞれ、４．４６および１９８．９であった。
ａＰＴＴアッセイに対する発色アッセイにおいて示されるとおり、算出されたＦＩＸ－ＣＴＰ３活性の不一致は、ａＰＴＴアッセイの優れた感度およびインビボとの関連性によって、説明可能である。発色活性アッセイでは、過剰量の試薬および酵素が存在し、これは、強度の劣るＦＩＸ形態を活性化し得る。ＦＩＸ－ＣＴＰ比活性値の相違は、異なる試薬および自動装置の使用によって、説明できる。ノースカロライナ大学で算出された活性値を、ＰＫ－ＰＤ試験計画のために用いた。
ＦＩＸａタンパク質検出：
精製プロセス後に、ＦＩＸ活性化（ＦＩＸａ）は生じなかったことを確認するために、ＦＩＸａ検出アッセイを、ＦＩＸａ Ｂｉｏｐｈｅｎ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ａｓｓａｙ（カタログ番号Ｒｅｆ．２２１８１２）を用いて行った。このアッセイは、前に記載のとおり、発色活性カスケードを用いて特定の試料に存在するＦＩＸａの量を測定する。ＦＩＸ－ＣＴＰ３およびｒｈＦＩＸを希釈し、ＦＩＸａレベルを評価した。ＦＩＸ－ＣＴＰ３は、精製しても貯蔵しても活性化されなかった（表２３）。
Figure 0007187505000051
ＦＩＸ－ＣＴＰ３のＰＫ－ＰＤ試験：ＦＩＸ－ＣＴＰ３およびｒｈＦＩＸ（ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標））を、単回の静脈注射で、Ｃ５７ＢＩのＦＩＸ欠損マウスに対して、体重１ｋｇあたり６２５μｇ（体重１ｋｇあたり１００ＩＵのＦＩＸを含む）の用量で投与した。血液試料を、投与０．２５、４、２４、４８、７２、および９６時間後に交互に３匹のマウスから眼窩後部より採取した。クエン酸処理した血漿（０．３２％）をサンプリング直後に調製して、－２０℃で分析時まで保管した。ｈＦＩＸ抗原レベルを評価し、詳細なＰＫ分析を行った。ＦＩＸ－ＣＴＰ３がＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）と比較してＦＩＸ欠損動物の凝固活性を延長させる能力を評価するために、ＦＩＸ－／－処置したマウスから収集した、クエン酸処理血漿試料におけるＦＩＸ活性を、自動化ＦＩＸ活性アッセイを用いて算出した（表２４）。
Figure 0007187505000052
ＦＩＸ －／－ マウスにおけるＦＩＸ－ＣＴＰ ３ 薬物動態プロファイル
ＦＩＸ濃度を、ヒトＦＩＸのＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号ＦＩＸ－ＡＧ ＲＵＯ）を用いて定量した。薬物動態プロファイルを、各々のタンパク質について算出した。この算出値は、各時点での３匹の動物の平均である。下表２５および図１５には、コホート１および３について異なるサンプリング時点で算出されたＦＩＸ濃度をまとめている。ＰＫプロファイルおよびＰＫパラメーターのまとめを、以下に示す（表２６および２７）。また、ＰＫ分析をコホート番号２について行い、暴露を確認した（データ示さず）。
Figure 0007187505000053
２区画モジュールを用いて（ＷｉｎＬｉｎソフトウェア）、ＡＵＣ０－ｉｎｆ、Ｔ終末およびクリアランス（ＣＬ）を決定した。ＰＫパラメーターを、下表２６に記載する。
Figure 0007187505000054
ｒｈＦＩＸに対する３個のＣＴＰ「カセット」の付加は、インビボＦＩＸ半減期を少なくとも２．５倍延長した。インビボでＦＩＸ－ＣＴＰ３投与後のＡＵＣは、ｒｈＦＩＸに比較して２倍まで増大した。ＦＩＸ－ＣＴＰ３注射マウスは、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）注射マウスと比較して改善されたＰＫプロファイルを示した。
ＦＩＸ欠損マウスにおけるＦＩＸ－ＣＴＰ ３ 薬力学的プロファイル：
ＰＫサンプリングと並行して、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）またはＦＩＸ－ＣＴＰ３のいずれかを投与したＦＩＸ欠損動物（クエン酸処理した血漿試料）を、ａＰＴＴアッセイによって、それらの凝固活性について評価し、これを活性％に変換した。各収集時点での活性％を、その時点の凝固時間／正常なプールマウス血漿の凝固時間ｘ１００として算出した。表２７に、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）またはＦＩＸ－ＣＴＰ３のいずれかの投与後の活性値をまとめている。
ＦＩＸ－ＣＴＰ３投与後、顕著な凝固活性を、投与１時間後に検出し、投与後４時間で９６％活性に到達していたが、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）の最大の活性値は、４０％であった（表２７、図１６）。ＦＩＸ－ＣＴＰ３凝固活性は、より長期間維持され、活性の延長を示す。ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）処置マウスの凝固活性は、３６時間より後の時点では検出不能であったが、ＦＩＸ－ＣＴＰ３処置マウスは、投与後７２時間で測定可能な活性を保持し続けていた（表２７、図１６）。凝固％の薬物動態プロファイルの分析によって、ＦＩＸ－ＣＴＰ３凝固活性は、顕著により長期間維持され、その半減期はＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）よりもほぼ２倍長いことが示唆される（表２８）。
Figure 0007187505000055
Figure 0007187505000056
９．３ ＦＩＸ欠損マウスの出血チャレンジ
ＦＩＸ欠損マウスに、１００ＩＵ／ＫｇのＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）またはｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の単回静脈注射による投与を行った。尾静脈を、投与後４８時間でわずかにクリップして、尾静脈出血時間（ＴＶＢＴ）および出血強度（ヘモグロビンＯＤ）を評価した。第二の出血チャレンジを、恒常性到達１５分後に行い、同じパラメーターを測定した。第一の出血チャレンジ後、ＦＩＸ－ＣＴＰ３投与動物の出血は、ヘモグロビンＯＤ値で示されたとおりＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）出血よりもかなり強度が低かった（図１７）。
血友病性マウスにおける第一の出血チャレンジの間、出血時間は、処置効力と必ずしも相関しないことが以前に報告されたので、さらなる出血後に恒常性を評価することが推奨されている。第一の出血が自然にまたは手作業で停止されると、第二の出血性チャレンジを初回の１５分後に行い、その時間と出血強度を再測定した。第二の出血症状の間、ＦＩＸ－ＣＴＰ３投与動物は、出血の時間および強度が低減し、ＦＩＸ－ＣＴＰ３は後の時点で強力であったことが示されている（図１８）。
最終的に、第二の出血チャレンジの後、動物を１２時間の間さらに観察し、全ての再発性の出血事象を記録した。ＦＩＸ－ＣＴＰ３投与動物は、出血事象が再発することなく次の１２時間の間血液の恒常性を維持できた。対照的に、５０％のＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）処置マウスは、尾からの自然発生的な出血症状があった（表２９）。
Figure 0007187505000057
直列の３個のＣＴＰ「カセット」に対して融合されたＦＩＸの単一の分子から構成された融合タンパク質である組換えＦＩＸ－ＣＴＰ３は、血友病Ｂを有する患者を処置に用いられている現在利用可能なＦＩＸ製品の短い半減期に対処するために開発された。本明細書の結果は、ｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の排泄半減期がラットにおいて、（以前に報告したとおり）およびＦＩＸ欠損マウスにおいて、ｒＦＩＸよりも一貫して２．５倍～４倍長いことを実証した。
理論に拘束されるものではないが、融合タンパク質は、ＦＩＸのクリアランスを低減し、ＦＩＸをプロテアーゼ活性、マスキングによる分解から保護し、肝受容体に対するＦＩＸの親和性を低下させる。総合的に考えると、ＣＴＰドメインのこれらの特性が、ＦＩＸの半減期を延長させる。
ｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の薬物動態解析に加えて、本発明者らは、ＦＩＸ欠損マウスにおけるＦＩＸ－ＣＴＰ３の薬力学的特性を調べた。ｒＦＩＸ－ＣＴＰ３およびｒＦＩＸを、ＦＩＸ欠損マウスにおける凝固欠損レベルを補償するのに匹敵する用量（単位）で投与した。しかし、ＦＩＸ欠損マウスにおけるｒＦＩＸ－ＣＴＰ３の効果は、投与後少なくとも７６時間まで顕著に延長され、より高い活性のピークに達した。ＦＩＸ－ＣＴＰ３凝固活性は、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）と比較して１時間遅れて開始された。ＦＩＸ活性化が必要とされる場合がある。この理由は、３個直列のＣＴＰの付加は、理論的には、活性化部位をマスクし、カスケードの開始を遅らせるからである。ＦＩＸ－ＣＴＰ３投与後、１００％のピーク活性が観察されたが、ＢｅｎｅＦＩＸ（登録商標）活性は４０％でしかなかった。優れた初期活性は極めて重要なパラメーターであり、３個のＣＴＰの付加には、回復を改善する能力があることを示す。
血友病Ｂの患者への予防的なＦＩＸ補充療法は、正常な凝固活性の１～２％という血漿レベルを維持することを目的とする。尾静脈出血アッセイは、鋭敏なインビボ試験であり、ヒトの出血の恒常性モデルを模倣している、低い活性値で出血恒常性を維持する能力を測定する。投与４８時間後の尾静脈出血チャレンジに対する応答では、ｒＦＩＸ－ＣＴＰ３を投与した動物は、血液恒常性を維持し、出血症状は短くかつ重篤度は低く、このことは、凝固活性の持続を示す。
ＦＩＸは、複合体タンパク質であって、広範囲にわたる翻訳後修飾を受ける、多数の機能的なドメインを含む。ＦＩＸ活性に対する必須の翻訳後修飾の１つは、ビタミンＫ依存性γ－グルタミルカルボキシラーゼによるＧｌａドメイン中の最初の１２個のグルタミン酸のγ－カルボキシル化である。この修飾は、リン脂質膜に対するＦＩＸの結合を容易にし、従って、その機能に重要である。γ－カルボキシル化されていないＦＩＸは、機能的ではなく、従って、γ－カルボキシル化は、律速段階である。
このＰＫ－ＰＤ試験は、一過性に遺伝子導入された細胞を用いて行った。翻訳後修飾の広範囲にわたる分析評価は、安定な最適化クローンから生成され、分泌された安定なＦＩＸ－ＣＴＰ３タンパク質で実施される。
示されたデータに基づけば、ＦＩＸ－ＣＴＰ３凝固因子は、ＦＩＸ補充療法の予防的用量を日常的に投与されている患者における注射の頻度を低減させる可能性を有する。ｒＦＩＸ－ＣＴＰ３によって、各因子の投与後の出血からの長期的な保護を付与するか、出血症状を処置するのに必要な因子の全体的単位を低減するか、および／または外科手術の間十分な恒常性を少ない注射で維持することが可能になる。
実施例４
凝固因子ＦＶＩＩの生成および利用
長時間作用型の活性化第ＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）凝固因子は、血友病Ａおよび血友病Ｂの患者の処置に有用である。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３組換えタンパク質は、注入の頻度を低減することにより、および薬物負荷を低減させることによっても、血友病患者の処置を改善する臨床的可能性を有し、その結果として、患者の生活の質を大きく改善し、自発性の出血症状を回避し、関節および他の臓器に対する損傷の蓄積を回避し得る予防的な処置手法を可能にする。
ヒトＣＴＰに対するＦＶＩＩの融合に基づく、半減期の延長を伴う組換えＦＶＩＩａ－ＣＴＰ分子の生成について本明細書で記載される。組換えＦＶＩＩａ－ＣＴＰを、哺乳動物細胞で発現して、インビトロおよびインビボでの特性を明らかにした。ｒＦＶＩＩａ－ＣＴＰ活性は、ｒＦＶＩＩａに匹敵することが示された。ラットでの薬物動態学的試験および効力の試験では、ｒＦＶＩＩａ－ＣＴＰの改善された特性が示された。本試験の結果、野性型酵素と極めて類似の止血性特性を有する、半減期が延長されたｒＦＶＩＩａ分子を開発することが実現可能であることが示された。
組換えＦＶＩＩ分子のクローニングおよび発現：いくつかの第ＶＩＩ因子クローンを、本発明者らの真核生物発現ベクター（ｐＣＩ－ｄｈｆｒｒ）中で構築した（図１９）。ヒトＭＧＣの検証済ＦＬのｃＤＮＡクローン（ＩＲＣＭ）（ホモサピエンスの第ＶＩＩ凝固因子の配列を含む）は、「Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」（ＯＢ－ＭＨＳ４４２６）に注文した。以下のプライマーは、以下の配列でＳｉｇｍａ－Ｇｅｎｏｓｙｓにより合成された：プライマー６７：５' ＣＴＣＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣ ３'（第ＶＩＩ因子ＤＮＡの５'末端およびＸｈｏＩの制限部位を含む）（配列番号５）、プライマー６８Ｒ：５' ＴＣＴＡＧＡＡＴＡＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＡＣＡＴＧ ３'（ＸｂａＩの制限部位を含む）（配列番号６）、プライマー６９：５´ ＴＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＧＣ ３´（ＸｂａＩの制限部位を含む）（配列番号７）、およびプライマー７０Ｒ：５´ ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＣＡ ３´（第ＶＩＩ因子ＤＮＡの３´末端およびＮｏｔＩの制限部位を含む）（配列番号８）。
クローニングは、２セットのＰＣＲ反応で行った。第一の反応は、テンプレートとして第ＶＩＩ因子配列（ＯＢ－ＭＨＳ４４２６）を有するｃＤＮＡプラスミドを用いて、プライマー６７およびプライマー６８Ｒで行った。ＰＣＲ増幅の結果、約５３４ｂｐの生成物を得て、単離し、ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号：Ｋ２０００－０１）に連結した。第ＶＩＩ因子配列のアミノ末端を含むＸｈｏＩ－ＸｂａＩフラグメントを単離した。第二の反応を、プライマー６９およびプライマー７０Ｒを用いて行い、再度、第ＶＩＩ因子配列（ＯＢ－ＭＨＳ４４２６）を有するｃＤＮＡプラスミドをテンプレートとして用いた。ＰＣＲ増幅の結果として、約８１３ｂｐの生成物を得て、ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号：Ｋ２０００－０１）に連結した。第ＶＩＩ因子配列のカルボキシ末端を含むＸｂａＩ－ＮｏｔＩフラグメントを単離した。２つのフラグメントを、本発明者らの真核生物発現ベクターｐＣＩ－ｄｈｆｒ（三重連結）に挿入して、５０１－０－ｐ１３６－１クローンを得た。
プラスミド５０１－ｐ１３６－１（ｐＣＩ－ｄｈｆｒベクター中の第ＶＩＩ因子）を、制限酵素ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで消化した。約１１８６ｂｐのフラグメントを単離した。部分的な第ＶＩＩ因子クローン（１１８０ｂｐ～１３２２ｂｐ）に続くＣＴＰ配列、末端配列、およびＧｅｎｅＡｒｔにより合成されたＮｏｔＩ配列（０７２１５４３）を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化した。約２５３ｂｐのフラグメントを単離した。２つのフラグメントを、本発明者らの真核生物発現ベクターｐＣＩ－ｄｈｆｒ（三重連結）に挿入して、５０１－０－ｐ１３７－２クローンを得た。ｐＣＩ－ｄｈｆｒ－７０１－２－ｐ２４－２を、制限酵素ＸｈｏＩおよびＡｐａＩで消化して、大きなフラグメント（ベクター）を単離した。
ｐＣＩ－ｄｈｆｒ－５０１－２－ｐ１３７－２（第ＶＩＩ因子－ｃｔｐｘ１）を、制限酵素ＸｈｏＩおよびＡｐａＩで消化して、約１２００ｂｐの挿入物を単離した。ベクターおよび挿入物を連結して、５０１－２－ｐ１３９－２を得た。Ｄｇ４４細胞を１００ｍｍの組織培養皿に播種し、５０～６０％集密度まで増殖した。総計２μｇのＤＮＡを、タンパク質を含まない培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣＤ Ｄｇ４４）中でＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いる１つの１００ｍｍのプレートの遺伝子導入に使用した。培地を遺伝子導入の４８時間後に取り出して、ヌクレオシドなしでタンパク質を含まない培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣＤ Ｄｇ４４）と入れ替えた。１４日後、遺伝子導入細胞集団を、Ｔ２５組織培養フラスコに移し、選択を１０～１４日間、細胞が安定なクローンとして十分に増殖を始めるまで続けた。高度発現クローンを選択し、約２ｘ１０７個の細胞を用いて、１７００ｃｍ２のローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）中で３００ｍｌの５ｎｇ／ｍｌのビタミンＫ３（メナジオン重亜硫酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ）を補充した増殖培地に接種した。この生成培地（ハーベスト）を、細胞生存率が約７０％まで急速に低下した後に収集した。生成培地を、最初に清澄化し、次いで約２０倍に濃縮し、フローろ過カセット（１０ＫＤａ分画分子量、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いてＰＢＳに対し透析した。
ＦＶＩＩ抗原レベルの測定
ＣＴＰペプチドをコードしているｃＤＮＡを、ヒトＦＶＩＩをコードしているｃＤＮＡの３´末端に融合した。対応するｒＦＶＩＩ構築物を、Ｄｇ４４細胞に遺伝子導入した。対照として、ヒトｒＦＶＩＩのｃＤＮＡを利用した。生成培地（ハーベスト）を収集し、濃縮して、分泌された組換えＦＶＩＩをさらに評価した。ｒＦＶＩＩ、ｒＦＶＩＩ－ＣＴＰおよびｒＦＶＩＩ－ＣＴＰ－ＣＴＰ抗原レベルを、ＡｓｓａｙＭａｘヒトＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡキット（ＡｓｓａｙＰｒｏ）により測定した（図２０Ａ）。ｒＦＶＩＩ－ＣＴＰおよびｒＦＶＩＩ－（ＣＴＰ）２の分泌レベルは、天然型ｒＦＶＩＩに比較して、大きな差異がなかった。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥブロット
ｒＦＶＩＩタンパク質の収集物、精製タンパク質または活性化タンパク質のいずれか５０ｎｇを負荷することによりＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を実施した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いた１２％トリス－グリシンゲルに試料を負荷した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析は、抗ヒトＦＶＩＩモノクローナル抗体（Ａｂ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）またはウサギで作製した抗ＣＴＰポリクローナル抗体を用いたウエスタンイムノブロットを実施することにより実施した。
ｒＦＶＩＩ抗原のレベルには、抗ＦＶＩＩ Ａｂを用いてイムノブロットを実施したＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出されたタンパク質レベルとの相関が認められた。ｒＦＶＩＩ－ＣＴＰはシグナルバンドとして移動し、これに対応するＦＶＩＩ対照の分子量は約５２ＫＤａであった（データ不掲載）。両タンパク質とも、イムノブロットではＦＶＩＩに特異的な抗体と反応した。ｒＦＶＩＩ－ＣＴＰはほかにも、ＣＴＰに特異的な抗体と反応した。ｒＦＶＩＩは、そのチモーゲンの形態で分泌され、活性化タンパク質の痕跡は一切みられなかった。
ＦＶＩＩの発色活性：
市販の発色試験キット（ＡｓｓａｙＳｅｎｓｅ Ｈｕｍａｎ ＦＶＩＩ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＡｓｓａｙＰｒｏ社））を用いてｒＦＶＩＩ、ｒＦＶＩＩ－ＣＴＰおよびｒＦＶＩＩ－（ＣＴＰ）２収集物を測定した。ｒＦＶＩＩ－ＣＴＰおよびそれがさらに活性化型（ＦＶＩＩａ）になる能力を機能的に特徴付けるため、ＴＦ／ＦＶＩＩａが第Ｘ因子を活性化させ、ＦＸａ特異的基質の存在下で定量化されるシグナルを放出する第Ｘａ因子にする能力を測定する市販の発色試験キット（ＡｓｓａｙＰｒｏ社）に濃縮ｒＦＶＩＩ－ＣＴＰ（収集物）を入れた。ｒＦＶＩＩタンパク質のＣ末端へのＣＴＰペプチド付加がＦＶＩＩセリンプロテアーゼ活性を障害することはなかった（図２０Ｂおよび２０Ｃ）。
ＦＶＩＩの凝固活性：
プロトロンビン時間（ＰＴ）は外因系凝固経路を測定するものである。ＰＴは、外因系経路活性化因子、リン脂質およびカルシウムを添加してから血漿が凝固するまでに要する時間（秒で測定する）である。ＰＴは、具体的にはワルファリン用量、肝損傷およびビタミンＫ状態を測定する際に、血液の凝固傾向を判定するのに用いられる。プロトロンビン時間の基準範囲は通常、約１２～１５秒である。具体的には、このアッセイでは、ｒｈＦＶＩＩの添加によってＦＶＩＩ－ＣＴＰおよびＦＶＩＩ－（ＣＴＰ）２の収集物がＦＶＩＩ枯渇ヒト血漿の凝固活性を回復させる能力を定量化した。ＦＶＩＩ欠乏ヒト血漿３００μｌを特定の濃度のＦＶＩＩ、ＦＶＩＩ－ＣＴＰおよびＦＶＩＩ－（ＣＴＰ）２の収集物または正常なプールヒト血漿１００μｌと混合し、さらに希釈した。３７℃で６０秒間インキュベートした後、混合物に組織因子（ＴＦ）、ＣａＣｌ２およびリン脂質を添加した。凝固時間を秒で測定した。ＦＶＩＩ－ＣＴＰおよびＦＶＩＩ－（ＣＴＰ）２の収集物の用量反応曲線をｒｈＦＶＩＩまたはヒトプール血漿からなる基準調製品と比較することにより効力を評価した。１単位の活性ＦＶＩＩをヒト正常血漿１ｍｌの活性に相当するＦＶＩＩの量と定義した。凝固計（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）でｒＦＶＩＩおよびｒＦＶＩＩ－ＣＴＰのＰＴ凝固活性を測定した。
既に示したように、ｒＦＶＩＩタンパク質のＣ末端へのＣＴＰペプチド付加がそのセリンプロテアーゼ活性を障害することはなく、ヒト血漿中の天然の第Ｘ因子および第ＩＸ因子の反応開始および活性化を引き起こした。Ｃ末端にＣＴＰをさらに挿入したところ、セリンプロテアーゼ活性が３分の１に低下した（データ不掲載）。
薬物動態試験：
ｒＦＶＩＩ、ｒＦＶＩＩ－ＣＴＰおよびｒＦＶＩＩ－（ＣＴＰ）２の収集物をＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（１物質当たりラット６匹）に１００μｇ／ｋｇ体重の用量で静脈内投与した。いずれのｉｎ ｖｉｖｏ実験でも、ＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡキットに基づいて各タンパク質の量を求めた。各ＦＶＩＩ被験物質について、ｒＦＶＩＩとｒＦＶＩＩ－ＣＴＰのモル濃度の差の原因となる分子量の差を考慮に入れることにより注射量を算出した。
サンプリング手順レベルの干渉が定量化されるのを最小限に抑えるため、サンプリングを変化させたスキームを用いて、具体的には、３０分後、９０分後、２時間後、６時間後および４８時間後に３匹のラットの後眼窩から、１５分後、６０分後、１．５時間後、４時間後および２４時間後に残る３匹のラットの後眼窩から交互に血液試料を採取した。サンプリング直後に血漿を調製し、解析まで－２０℃で保管した。ＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡ特異的アッセイによりＦＶＩＩ濃度を定量化した。直線台形公式を用いて半減期および曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。これらのクリアランスパラメータの比較から、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期およびｒＦＶＩＩ－（ＣＴＰ）２のＡＵＣがｒＦＶＩＩのものよりも有意に大きいことが明らかになった（表３０）。
Figure 0007187505000058
組換えＦＶＩＩａ－ＣＴＰの特徴付け：
活性化過程でＦＶＩＩがＲ１５２で切断されると、単一のジスルフィド架橋によって結合した重鎖ドメインと軽鎖ドメインが生じる。イオン交換カラム精製工程によりｒＦＶＩＩａ－（ＣＴＰ）２を精製し活性化させる。ｒＦＶＩＩａ－（ＣＴＰ）２を十全に評価するため、このタンパク質を還元性条件下、市販のＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥに負荷する。重鎖ドメインと軽鎖ドメインが分離し、分子量が５５ＫＤａおよび２５ＫＤａの分離したバンドとして移動する。両タンパク質とも、ＦＶＩＩに特異的な抗体とは反応するが、ｒＦＶＩＩａ－ＣＴＰの重鎖は抗ＣＴＰ特異的抗体と特異的に反応し、このことから、このバンドがＣＴＰと融合したＦＶＩＩ重鎖を表すことがわかる。軽鎖は抗γカルボキシラーゼＡｂと特異的に反応する。ＦＶＩＩａ特異的ＥＬＩＳＡキットによりＦＶＩＩａタンパク質濃度を測定する。
ＦＶＩＩａのＮ末端シーケンシング：
活性化型またはチモーゲン型精製タンパク質のｒＦＶＩＩ－ＣＴＰ－ＣＴＰをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１２％トリス－グリシン）により分離し、次いでＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットする。目的とするバンドを切り出し、精製したＢｉｏｂｒｅｎｅ処理ガラス繊維フィルター上に置く。１４０Ｃ ＨＰＬＣマイクログラジエントシステムを備えたパルス液体タンパク質シーケンサーを用いたエドマン分解によりＮ末端配列解析を実施する。組換えタンパク質の同定および適切なプロペプチド切断をＮ末端シーケンシングによりさらに確認する。
ＦＶＩＩａの凝固活性：
ＦＶＩＩ－（ＣＴＰ）２の凝固活性を評価するため、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を実施する。ＦＶＩＩ欠乏血漿試料をｒＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））またはｒＦＶＩＩａ－（ＣＴＰ）２に置き換える。ＦＶＩＩ欠乏ヒト血漿３００μｌを特定の濃度のＦＶＩＩａもしくはｒＦＶＩＩａ－（ＣＴＰ）２または正常なプールヒト血漿１００μｌと混合し、これをさらに希釈する。３７℃で６０秒間インキュベートした後、混合物に組織因子（ＴＦ）、ＣａＣｌ２およびリン脂質を添加する。凝固時間を秒で測定する。ｒＦＶＩＩａ－（ＣＴＰ）２の用量反応曲線をｒｈＦＶＩＩａまたはヒトプール血漿からなる基準調製品と比較することにより効力を評価する。１単位の活性ＦＶＩＩａをヒト正常血漿１ｍｌの活性に相当するＦＶＩＩａの量と定義する。凝固計（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）でｒＦＶＩＩおよびｒＦＶＩＩａ－（ＣＴＰ）２のａＰＴＴ凝固活性を測定する。ｒＦＶＩＩａとｒＦＶＩＩａ－（ＣＴＰ）２のａＰＴＴ凝固活性はほぼ同じである。
ラットでの薬物動態試験：
ｒＦＶＩＩａへのＣＴＰ付加がその長時間の存在能に及ぼす影響の特徴を明らかにするため、ラットで比較薬物動態試験を実施する。ＴＢＳに溶かしたＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ｒＦＶＩＩａ）およびｒＦＶＩＩａ－（ＣＴＰ）２をＳＤラット６匹にＩＶ注射する。ＦＶＩＩａ ＥＬＩＳＡキットを用いてＦＶＩＩａのレベルを経時的に検出する。各タンパク質の半減期およびＡＵＣを算出する。これらのクリアランスパラメータの比較から、ｒＦＶＩＩａ－（ＣＴＰ）２の方がＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）よりも半減期、回収率およびＡＵＣのｉｎ ｖｉｖｏ値が優れていることを明らかになる。
ＦＶＩＩａ－ＣＴＰのｉｎ ｖｉｖｏ効果モデル（血友病のＦＶＩＩＩ欠乏マウスモデル）：
ｉｎ ｖｉｖｏ活性モデルを評価するため、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスを入手し、繁殖コロニーを確立する。市販の組換えｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））またはｒＦＶＩＩａ－（ＣＴＰ）２のいずれか１０μｇを麻酔下ＦＶＩＩＩノックアウトマウス（２２～２８ｇ）の尾静脈内に注射する。注射するタンパク質の量は正常血漿（５μｇ／ｍｌ）で必要とされるＦＶＩＩＩ濃度に相当する。特定の時点で、切込みを入れた尾から血液試料をヘパリン処置毛細管に採取する。血漿試料のＦＶＩＩａレベルをＥＬＩＳＡにより評価し、ＰＴＴ凝固アッセイにより効果を測定する。
この試験ではＦＶＩＩとＣＴＰとの融合構築物を作製する。この組換えタンパク質は、半減期が長く治療効力が保持される治療の基礎となる。
以上の結果は、ｒＦＶＩＩａ－（ＣＴＰ）２が血友病患者にｒＦＶＩＩａと同等の治療効果を示すことを示唆するものである。さらに、この技術は、必要とする投薬頻度が少ない。出血エピソードを管理し外科的介入時に必要とされる注射の回数を減らすには、ｒＦＶＩＩａ－（ＣＴＰ）２の単回注射で十分であるものと思われる。この組換えタンパク質は、長期予防的治療として使用し得るものである。
実施例５
精製したＦＶＩＩ－ＣＴＰ３、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５の比較評価
５．１ 試験の目的
ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５とＦＶＩＩ－ＣＴＰ３とで薬物動態パラメータおよび凝固活性を比較評価すること。
５．２ ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５の収集物の作製
２０μｇ／ＬのビタミンＫ３（Ｓｉｇｍａ社、メンナジオン（Ｍｅｎｎａｄｉｏｎ））の存在下、Ｅｘｃｅｌｌｇｅｎｅ発現システムを用いて、４つまたは５つの縦列ＣＴＰ配列とＣ末端で融合したＦＶＩＩ ｃＤＮＡをＤｇ４４細胞に発現させた。収集物を回収し（３００ｍｌ）、ろ過し、凍結させた。
５．３ ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３収集物の作製
社内にて、哺乳動物発現システムであるＣＨＯ細胞にｐＣＩ－ＤＨＦＲベクター（図１０９）を用いてＦＶＩＩ－ＣＴＰ３を発現させた。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３をコードするヌクレオチドカセットの形態は、例えば配列番号２４で示される核酸配列を含む、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むが、そのカセットにコードされるポリペプチドの発現、精製および活性化によって活性なＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３形態の凝固因子が生じることから、同カセットをＭＯＤ－５０１４と命名する。安定にトランスフェクトされたプール＃７１を振盪フラスコ中、２５ｎｇ／ＬのビタミンＫ３（Ｓｉｇｍａ社）の存在下で増殖させた。収集物を回収し、ろ過した。
いずれのＦＶＩＩ－ＣＴＰ収集物（３ＣＴＰ、４ＣＴＰおよび５ＣＴＰ）も濃縮し、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａを用いてＴＢＳ（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して透析した。
５．４ ＦＶＩＩ抗原レベルの測定
ヒトＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡキット（Ｚｙｍｏｔｅｓｔ ＨｙＰｈｅｎ）を用いてＦＶＩＩ抗原レベルを測定した（表３１）。算出したタンパク質濃度は２つの独立した測定の平均値である。
Figure 0007187505000059
５．５ ＦＶＩＩ－ＣＴＰの免疫ブロット
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌｕｓ ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いた１２％トリス－グリシンゲル（ｅｘｐｅｄｅｏｎ社）にＦＶＩＩ－ＣＴＰ３、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５の収集物を負荷した。抗ＣＴＰポリクローナルＡｂ（Ａｄａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ社）または抗Ｇｌａ Ａｂ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社）を用いたウエスタンイムノブロットによりＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を実施した。
３つ、４つおよび５つのＣＴＰと融合したＦＶＩＩは、それぞれ８０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび１００ｋＤａまで移動した。予想される通り、Ｅｘｃｅｌｌｇｅｎｅ社のＦＶＩＩ－ＣＴＰ４収集物およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５収集物は、作製工程が最適化されなかったため、Ｐｒｏｌｏｒ社で作製したＦＶＩＩ－ＣＴＰ３収集物よりもγカルボキシル化含有量が低い（図２１）。
５．６ ＦＶＩＩのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力の比較評価
市販の発色活性試験キットであるＢＩＯＰＨＥＮ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ社、２２１３０４）を用いて、ＨＡ精製（高γカルボキシル化画分）ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５と正常ヒトプール血漿のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力の比較評価を実施した。いずれの試料も連続希釈し、用量反応曲線を正常ヒト血漿からなる基準調製品と比較することにより効力を評価した。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５は、発色活性がプール正常血漿よりも低かった（図２２）。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４は、ＥＣ５０比によって表される活性がＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５よりも低かった（表３２）。
Figure 0007187505000060
５．７ ＦＶＩＩのｉｎ ｖｉｔｒｏ凝固活性：
シバ医療センター、イスラエル国立凝固センターで実施した第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の活性アッセイは、免疫吸着により第ＶＩＩ因子を欠乏させた血漿を用いるプロトロンビン（ＰＴ）ベースのアッセイである（Ｓｉｅｍｅｎｓ社）。ＰＴ試薬はｉｎｎｏｖｉｎとし、アッセイはＳｙｓｍｅｘ（登録商標）ＣＡ１５００機器で実施する。ＦＶＩＩの正常範囲は５５～１４５％である。
Figure 0007187505000061
体内の循環血中ＦＶＩＩの正常レベルは約０．５μｇ／ｍｌであることから、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５の収集物は、その凝固活性が正常ヒトプール血漿の３分の１に低下していると言え、この結果は、得られた発色活性（表３３）と相関している。
ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４収集物は、発色活性アッセイ（表３３）からわかるように、その凝固活性能が正常ヒトプール血漿の３倍である。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４活性のパーセンテージは、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５のものよりもはるかに高い。ＥＬＩＳＡ法の方法論的限界により、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４のＡｇレベルの算出精度が制限されると思われる。
５．８ 薬物動態試験
ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５の薬物動態（ＰＫ）パラメータを求めるため、薬物動態試験を２件実施した。第一の試験では、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（処置１回当たりラット６匹）にＦＶＩＩ－ＣＴＰ３、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５（それぞれグループＡ、ＢおよびＣ）を２５０μｇ／ｋｇ体重の用量の単回静脈内注射で投与した。投与から０．０８３時間後、０．５時間後、２時間後、５時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後および９６時間後、交互に３匹のラットの後眼窩から血液試料を採取した（表３４）。サンプリング直後にクエン酸血漿（０．３８％）を調製し、解析まで－２０℃で保管した。
Figure 0007187505000062
ヒトＦＶＩＩ Ｅｌｉｓａキット（Ｚｙｍｕｔｅｓｔ ＦＶＩＩ－Ｂｉｏｐｈｅｎ）を用いて血漿試料中のＦＶＩＩ濃度を定量化した。薬物動態プロファイルを算出し、各時点の３個体の平均値とする。ＰＫ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ２．０ソフトウェアを用いて終末相半減期の値を算出した。算出した様々なサンプリング時点でのＦＶＩＩ濃度を下の表３５にまとめる。このほか、ＰＫプロファイル（図２３～２４）およびＰＫパラメータのまとめ（表３６）を下に示す。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ５はＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ４よりも優れたプロファイルを示した（表３６）。
Figure 0007187505000063
Figure 0007187505000064
ＣＴＰを４つまたは５つ付加することにより、ＦＶＩＩの半減期が３ＣＴＰのそれぞれ２倍および３倍と大幅に延びた（表３６）。この優位性は試験の開始部分（０．０８３～８時間）でより顕著であることから、タンパク質回収が改善され、血管外クリアランスが減少した可能性が示唆される。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５の投与後のＡＵＣは、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３のそれぞれ３倍および４倍増大した。このほか、４ＣＴＰおよび５ＣＴＰをＦＶＩＩに付加するとクリアランスが減少した（表３６）。
この試験で観察されたように、ＣＴＰを４つおよび５つ付加することにより、ＦＶＩＩの半減期が初期相半減期および終末相半減期ともに３ＣＴＰよりも大幅に延びた。第一の試験と第二の試験は、用量および試験期間の影響により解析方法が異なるため、半減期の値に差がみられるものの、全体的な傾向は維持された。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５の投与後のＡＵＣは、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３のそれぞれ２．５倍および７倍増大した。
５．９ 結論：
この試験では、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ４およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５のＰＫパラメータおよび凝固活性能を評価した。ＦＶＩＩに４ＣＴＰおよび５ＣＴＰを付加することにより、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３よりも優れた半減期および曝露時間の改善ならびにクリアランスの減少がもたらされると同時に、発色活性およびｉｎ ｖｉｔｒｏ凝固活性は同程度で維持された。以上の結果は、様々な濃度のタンパク質で観察されたものであり、収集物および精製タンパク質の両方で一致していた。下の表３７にまとめる通り、ＦＶＩＩのＣ末端へのＣＴＰの融合の全体的効果を評価した際、１～５個のＣＴＰの融合によってＦＶＩＩの半減期およびＡＵＣがＣＴＰに比例して大幅に増大し、このことは、分子のＣＴＰ部分の増大に伴いＦＶＩＩの寿命および安定性が大幅に改善されると同時に、その最初のｉｎ ｖｉｔｒｏ凝固活性は維持されることを示唆している。
Figure 0007187505000065
既に報告されているように、ヒトおよび動物ともに、ＦＶＩＩの半減期は活性化型ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の半減期と相関する。したがって、ＣＴＰ融合後の活性化型でも半減期が同じように改善されると予想される。
実施例６
ＦＶＩＩＩ欠乏血友病マウスを用いたＦＶＩＩ－ＣＴＰ３の実現可能性に関する試験
ＦＶＩＩ－ＣＴＰ、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ２およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ３の収集物のＰＫプロファイルおよび凝固活性を市販のＦＶＩＩと比較して試験する上記の試験を実施した。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３では、ＦＶＩＩ－ＣＴＰおよびＦＶＩＩ－ＣＴＰ２の収集物またはｒｈＦＶＩＩと比較して、ＰＫプロファイルの改善がみられる同時にその凝固活性が維持された。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの特性をさらに特徴付けるため、同タンパク質を発現し分泌する安定なミニプールを作製し、精製工程および活性化工程を開発した。
本試験では、ＦＶＩＩＩ欠乏マウスを用いてＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３の薬物動態的特性および薬力学特性を検討した。同タンパク質のＰＫプロファイルを評価した。ＦＶＩＩａの比活性ベースのＰＫプロファイルを明らかにし、市販製品のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）と比較した。さらに、ＦＶＩＩＩ欠乏マウスの尾静脈を切断した後にＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３が長時間にわたって凝固を誘導するｉｎ ｖｉｖｏ止血能（生存試験）を検討した。
試験の目的：
ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３と市販のｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））をＦＶＩＩＩ欠乏マウスに同じ活性用量で単回ＩＶ投与し、両物質の薬物動態パラメータおよび薬力学パラメータを比較して評価すること。
ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を同じ活性用量で単回ＩＶ投与した後、尾静脈切断による負荷を与えること（生存試験）により、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３がｉｎ ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩ欠乏マウスの恒常性を維持することができるかどうかを明らかにすること。
ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３収集物の作製：
社内にて、Ｄｇ４４細胞にｐＣＩ－ＤＨＦＲベクターを用いてＦＶＩＩ－ＣＴＰ３を発現させた。安定にトランスフェクトされたプール＃７１を振盪フラスコ中、２５ｎｇ／ＬのビタミンＫ３（Ｓｉｇｍａ社）の存在下で増殖させた。細胞懸濁物を培養し、生存率が６０～８０％に低下してから収集した。収集物をろ過し、－７０℃で凍結させた。
収集物のＦＶＩＩ抗原レベルの測定：
ヒトＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡキット（Ｚｙｍｏｔｅｓｔ ＨｙＰｈｅｎ）を用いてＦＶＩＩ抗原レベルを測定した（表３８）。プールした収集物バッチ毎に抗原レベルを算出した。
Figure 0007187505000066
ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３の精製工程（図２５）
工程の概要
短期間の精製試験の後、２つのカラムを用いた以下の精製工程を実施した。ＶＩＩ－Ｓｅｌｅｃｔアフィニティーカラム（ＧＥ）およびＣｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅタイプ１（ＨＡ）、４０μｍ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社）、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３γカルボキシル化濃縮タンパク質を精製した。精製ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３をＣａＣｌ２の存在下、２～８℃で一晩インキュベートすることにより自己活性化を誘導した。精製工程は開発の最終段階にあり、最適化されつつあることから、精製段階のほとんどがほぼ同じものであるが、その一部については、２つのバッチで同一のものではない。
１０ｋＤａ中空糸またはＰｅｌｌｉｃｏｎカセットを用いた限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）
清澄化した収集物を週末に（２～３日かけて）４℃で解凍した。
バッチ３１では、分子量カットオフが１０ＫＤａの中空糸カートリッジ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号ＵＦＰ－１０－Ｃ－４Ｘ２ＭＡ）を用いて、清澄化した収集物（１２リットル）を（連続２回の実施で）４倍に濃縮した。濃縮収集物を１～２体積のＴＢＳ（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対するダイアフィルトレーションに供した。
バッチ３８では、分子量カットオフが１０ＫＤａのＰｅｌｌｉｃｏｎ ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）カセットを用いて、清澄化した収集物（８．５リットル）を４倍に濃縮した。濃縮収集物を直接ＶＩＩ－Ｓｅｌｅｃｔカラムに負荷した。
限外ろ過はともに、氷冷緩衝液を用いて氷上で実施した。ＵＦＤＦ試料を０．２２μｍでろ過した後、負荷した。
ＦＶＩＩ－Ｓｅｌｅｃｔカラムでの捕捉
ＴＢＳ（ｐＨ７．４）で予め平衡化したＶＩＩ－Ｓｅｌｅｃｔカラム（ＸＫ１６／２０、ＣＶ １８ｍｌ）にＵＦＤＦまたは濃縮収集物を負荷した。カラムを５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄し、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ ５０％（ｖ／ｖ）、プロピレングリコール（ｐＨ７．５）でＦＶＩＩ－ＣＴＰ３を溶出させた。この工程を２つの連続するサイクルで同じカラムを用いて実施した。
セラミックヒドロキシアパタイトカラムでのγカルボキシル化に基づく分離
溶出産物を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で１：１０に希釈し、セラミックヒドロキシアパタイトカラム（ＸＫ１６／２０、ＣＶ ２４ｍｌ）に負荷した。カラムを５９ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で洗浄し、γカルボキシル化された第ＶＩＩ因子を多く含む画分を５００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で溶出させた。この工程を２つの連続するサイクルで同じカラムにて実施した。各バッチで２つのサイクルの溶出物をプールし、１．７～２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、２０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．２）によるダイアフィルトレーションを実施して体積を減らし、活性化段階の材料を調製した。
ＦＶＩＩ活性化
精製ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３を１ｍｇ／ｍｌに希釈し、２０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ８．２）中、２～８℃で２４時間インキュベートした。予備製剤緩衝液（２０ｍＭクエン酸緩衝剤、２４０ｍＭ ＮａＣｌ、１３．３ｍＭグリシン、ｐＨ６．９）への緩衝液交換（ＵＦＤＦ）によって活性化を停止させた。
ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３の分析的特性：
ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いた１２％トリス－グリシンゲルに精製ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３を負荷した。クマシーブリリアントブルー試薬でゲルを染色することによりＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー解析を実施した（１レーン当たりのタンパク質５μｇまたは１０μｇ）。抗ヒトＦＶＩＩポリクローナルＡｂ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社；ＡＦ２３３８）、抗ヒトγカルボキシル化モノクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、カタログ番号４９９，３５７０）および抗ＣＴＰポリクローナルＡｂを用いてウエスタンブロット解析を実施した（１レーン当たりのタンパク質１μｇ）。還元条件下で、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３は７５ＫＤａに移動し、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３は、図２６のバンド２および３としてそれぞれ示される２つの主要なバンド、すなわち、５０ｋＤａの重鎖および２５ｋＤａの軽鎖として移動した。
この精製方法により、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３部分が大幅に濃縮されると同時に、不純物が減少した。この精製工程の収率は２５～３０％ＦＶＩＩであった（ＥＬＩＳＡによる）。精製過程で喪失したタンパク質のほとんどは、ＦＶＩＩの発色活性が低いか、活性を全く示さないものであった。クマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥに基づけば、還元ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３には、予測されたバンドよりも多くのものが含まれていた。約７５ｋＤａ付近まで移動したバンドは非活性化ＦＶＩＩを表す（図２６、バンド１）。このバンドはＭＷがわずかに異なる２つのバンドからなり、このＭＷの差はγカルボキシル化含有量の差を反映しているものと思われる。ほかにも、ＭＷが２０ｋＤａに満たないバンドが観察された。これは重鎖の分解産物であることが既に報告されている。
ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３の発色活性：
市販の発色活性試験キットであるＢＩＯＰＨＥＮ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ社、２２１３０４）を用いて、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３収集物、工程内の画分および精製ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３とヒト正常プール血漿のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力の比較評価を実施した。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３収集物およびタンパク質を連続希釈し、用量反応曲線を正常ヒト血漿の基準調製品と比較することにより効力を評価した。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３精製後、発色活性は大幅に改善され、非活性画分は主にＨＡカラムによって分離された（図２７）。ＦＶＩＩ発色活性と、モノクローナル抗Ｇｌａ抗体を用いたウエスタンブロットでのＦＶＩＩ検出との間には強い相関が認められた。収集物のＥＣ５０によって反映されるＦＶＩＩ発色活性の効力は、カルボキシル化ＦＶＩＩ画分および非カルボキシル化ＦＶＩＩ画分の両方の影響を受ける。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３のγカルボキシル化画分を精製および濃縮した後、活性は改善され、このことは、ＦＶＩＩ活性にはγカルボキシル化の寄与が重要であることを示している（図２７）。このパラメータはＦＶＩＩの適切なｉｎ ｖｉｖｏ活性に極めて重要であり、クローン開発プログラムでさらに取り組むことになる。
Ａ２８０によるタンパク質測定
ＰｒｏｔＰａｒａｍアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ）を用いてＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の理論的吸光係数を算出した。この計算はアミノ酸配列に基づくものである。算出されたＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の吸光係数は、それぞれ１．１８６および１．４０６である。この値は２８０ｎｍでの１ｇ／Ｌの吸光度を表す。
ＣＴＰは芳香族化合物とシステイン残基を含んでおらず、吸光度には寄与しないことから、２つのタンパク質の間の吸光係数の差は、単にＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３の分子量がＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）よりも増大したことに起因するものである。
最終ＦＶＩＩおよびＶＩＩ－Ｓｅｌｅｃｔカラムの溶出から開始する工程内の精製試料には、Ａ２８０によるタンパク質測定を用いる。
ＦＶＩＩａ抗原レベルの測定
ヒトＦＶＩＩａ ＥＬＩＳＡキット（ＩＭＵＢＩＮＤ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社）を用いてＦＶＩＩａ抗原レベルを求めた。バッチ毎に抗原レベルを算出した。ただし、この手段は活性産物の量を示すものではなかったため、注射用量の決定に有用なものではなかった。
ＦＶＩＩａ－Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）ＶＩＩａ－ｒＴＦの凝固アッセイ
ＦＶＩＩａは一本鎖ＦＶＩＩの鎖内切断により生じる。天然の組織因子（ＴＦ）はＦＶＩＩａの補因子の１つである。ＦＶＩＩは、ＴＦと結合すると、第Ｘ因子から第Ｘａ因子への活性化を仲介し、それ自体はＦＶＩＩａに変換される。可溶性組織因子は天然の組織因子の細胞外部分である。この因子は、自己活性化によるＦＶＩＩの活性化ができなくなっているが、組織因子と結合したＦＶＩＩａはＦＸをＦＸａに活性化することができる。
このアッセイに用いる組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）は、ＦＶＩＩａ特異性を利用してＦＶＩＩａ凝固試験を構成するものである。ｒｓＴＦは、ＦＶＩＩａ、カルシウムおよびリン脂質の存在下では、ＦＶＩＩをＦＶＩＩａに活性化することなく血漿の凝固を引き起こす。
このシステムで観察される凝固時間は被験試料中のＦＶＩＩａ含有量と逆相関があり、試料中にＦＶＩＩが存在することによる干渉を受けない。
Ｏｍｒｉ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ネスジオナ、イスラエル）にてアッセイを実施した。各試験の前に、復元したＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）およびＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３の両方についてＦＶＩＩａ活性を評価した。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の活性にはバイアルで報告された予測活性との相関は認められなかったが、この不一致は活性評価の方法の違いに起因するものと思われる。タンパク質濃度を考慮しない体積当たりのＦＶＩＩａ凝固活性を表３９にまとめる。
Figure 0007187505000067
ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３の比活性
Ａ２８０に基づきＦＶＩＩａの比活性（活性／ｍｌをタンパク質濃度で除して算出する）を算出し、これを表４０に示す。ＭＷが異なる２つの分子の比活性を比較する際には、正規化するために補正を実施しなければならない（すなわち、分子量の差により、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）１ｍｇ中の活性部位の数はＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３の１．１８５倍である）。換算係数の計算は以下の方程式で表される：
Figure 0007187505000068
Figure 0007187505000069
ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３のＰＫ－ＰＤ試験：
試験の概要
用量６．４Ｅ６ Ｕ／ｋｇ体重（１６０，０００Ｕ／個体）のＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３およびｒｈＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、ＮＳ）をＣ５７Ｂ ＦＶＩＩＩ欠乏マウスに単回静脈内注射で投与した。投与から０．１６６時間後、０．５時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、３４時間後、４８時間後、５８時間後および７２時間後、交互に４匹のマウスの後眼窩から血液試料を採取した（表４１）。サンプリング直後にクエン酸血漿（０．３２％）を調製し、解析まで－２０℃で保管した。ＦＶＩＩａの凝固活性レベルを評価し、詳細なＰＫ解析を実施した。試験はＯｍｒｉ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ネスジオナ、イスラエル）にて実施した。
Figure 0007187505000070
ＦＶＩＩＩ欠乏マウスにおけるＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３のＰＫプロファイル
Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）ＶＩＩａ－ｒＴＦキット（Ｓｔａｇｏ社、パーシッパニー、ニュージャージー州）を用いて血液試料中のＦＶＩＩａの活性を定量化した。各タンパク質の薬物動態プロファイルを算出し、各時点の４個体の平均値で表す。図２８に実験全体を通じたＦＶＩＩａのＰＫプロファイルを示す。ＦＶＩＩａの回収率を表４３に示す。ＰＫパラメータのまとめを表４４に示す。
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）またはＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３のいずれかを投与した後の凝固活性値を表４２にまとめる。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は、投与から０．５時間後に活性が最大値に達した。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の最大活性値はＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３の最大活性値の４３％に達するにとどまった。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３の凝固活性の方が長い時間維持され、活性の時間が長くなったことがわかる。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）処置マウスの凝固活性は１２時間よりも後の時点では検出不可能であったが、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３処置マウスでは、投与後４８時間でも依然として測定可能な活性が保持されていた（表４２および図２８）。
ＦＶＩＩａに縦列ＣＴＰコピーを３つ付加することにより、投与後最も高い活性の測定および解析に基づき予測した活性との比較で回収率の１００％の増大がみられた（表４３）ほか、半減期および平均滞留時間（ＭＲＴ）が５倍になった。曝露時間（ＡＵＣ）は３倍になった（表４４）。
Figure 0007187505000071
Figure 0007187505000072
Figure 0007187505000073
トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）
トロンビンの生成は凝固カスケードの基礎となる部分であり、したがって、特定の個体のトロンビン生成能は、出血または血栓症のリスクと相関があると思われる。トロンビン生成を分析する際に一般的に測定する変数としては、遅延時間、トロンビン生成がピーク値に達するまでの時間、ピーク値、内因性トロンビン能［ＥＴＰ］（すなわち、曲線下面積およびテール）、トロンボグラム（「ＴＧ」）の経時変化が挙げられる。遅延時間の後、トロンビンのバーストがみられる。しかし、未形成のトロンビンが全体の９５％を超える場合、遅延時間終了時に凝固が起こる。Ｏｍｒｉ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社にて、ヒト血友病血漿を添加したＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ試薬を用いてトロンビン生成アッセイを実施した。ＴＧＡは、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）およびＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３の注射に起因するマウス血漿での凝固能を反映する。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）のいずれかを投与した後のマウス血漿のＴＧＡパラメータ値を図２９に示す。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３投与後の全３種類のパラメータ（トロンビン生成速度、最大トロンビン生成量およびＫＩＩａ）から、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３処置がＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）処置よりも有利であることがわかる。このことは、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３の方が長時間作用するという点でＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）よりも優れているのではないかという考えをさらに裏付けるものである。
ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３の尾静脈切断（ＴＶＴ）試験：
試験の概要
ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３のＰＫ／ＰＤ試験で得たデータから、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３の機能性に関する理解がもたらされ、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３にはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）と比較して薬物動態上の利点があることが明らかになった。しかし、このタンパク質が外傷事象後にｉｎ ｖｉｖｏで血餅を誘導することができるかどうかは未だ明らかになっていない。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３の止血能を評価するため、出血負荷に同じＦＶＩＩＩ欠乏マウスモデルを用いた。
ＦＶＩＩＩ欠乏マウスにＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の単回静脈内注射を実施した。ＦＶＩＩａ血餅活性アッセイで評価した各薬物の効力から算出したＦＶＩＩａ活性が等しくなる量（１．６Ｅ０５単位、２００μｌ）の薬物をマウスに投与した（表４５）。投与量は、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）が９ｍｇ／ｋｇ、ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３が活性の低下により４０ｍｇ／ｋｇであった。対照群には溶媒２００μｌを注射した。
投与から１５分後（注射１）、２４時間後（注射２）または４８時間後（注射３）、尾端から２．７ｃｍのところで尾静脈を切断し、マウスの生存を２４時間にわたって記録した。
Figure 0007187505000074
Ａ２８０によりタンパク質濃度を測定した。
結果
溶媒を注射した対照群の３回の注射のデータ（５個体×注射３回）をまとめ、図３０に示す。尾静脈切断から２４時間後の生存率は３０％であった。
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）処置マウスおよびＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３処置マウスには、ＦＶＩＩａ投与から１５分後に尾静脈切断を実施した後も正常な止血活性がみられた。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３処置個体およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）処置個体の生存率は１００％であった（図３０）。
ＰＫ／ＰＤ試験で示されたＦＶＩＩ－ＣＴＰ３のクリアランス速度の低下は、投与から２４時間後に実施した尾静脈切断の後に最も明白にわかる。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）では生存率の低下が観察された。対照群と同じく、１０時間以内に５０％が死亡した。一方、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３処置マウスの９０％が生存した（図３０）。この結果は、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３処置の効果が長時間持続することを強調するものである。
投与から４８時間後、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）で処置したグループに生存率の低下がみられた（図３０Ｃ）。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰマウスにわずかな改善がみられたが、その差は統計的有意性に達するものではなかった。
考察：
組換えタンパク質へのＣＴＰ融合により、同等の活性が維持されたままタンパク質の循環血中半減期が長くなる。閾値サイズの７０ＫＤａを超えるタンパク質のクリアランス低下の背後にある機序は、腎クリアランスに関して十分に理解されているが、ＣＴＰ融合によってさらなる保護が得られる。ＣＴＰ融合は、タンパク質遮蔽物の周囲に広がってタンパク質分解による切断からタンパク質を保護し、高い負電荷によってタンパク質の半径方向の分子量を増大させ、肝クリアランス受容体に対するタンパク質の親和性を低下させるものと考えられる。
本試験は、ＦＶＩＩへのＣＴＰ融合がタンパク質の半減期およびクリアランスに及ぼす影響を具体的に理解することのほかにも、この修飾を施した後のＦＶＩＩの比活性の実例に取り組むことを目的としたものである。ＦＶＩＩＩ欠乏マウスにＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３または市販の組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））を同じ用量（単位ベース）で単回ＩＶ注射により投与し、ＰＫ活性ベースの解析を実施した。ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３は、その半減期およびＡＵＣがそれぞれ５倍および３．５倍になったことに反映されるように、優れた長時間存在能を示した。Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）活性キットにより算出したＦＶＩＩａ－ＣＴＰの比活性（Ｕ／ｍｇ）をＡ２８０により測定したタンパク質濃度で除した商は、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の比活性の５分の１～４分の１未満であることがわかった。
ＣＴＰがｉｎ ｖｉｖｏでＦＶＩＩａの止血効果に影響を及ぼす仕組みに関する理解を深めるため、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３が出血を抑えることができるかどうかを検討した。血友病マウスモデルを用いた尾静脈切断出血モデルでは、ｒＦＶＩＩａ投与によって負荷個体の生存率を改善し、失血死を防ぐことができる。本明細書に記載される試験では、個体にＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を投与した。両分子とも、投与から０．２５時間後に切断を実施した場合、恒常性を維持することができた。投与から２４時間後に切断を実施した場合、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３処置群に活性持続時間の有意な延長がみられた。溶媒処置群の生存率は予測値よりも高く、それまでの試験で得られた生存率よりも高かった（それまでの研究の２０％に対し５０％、データ不掲載）。処置個体のパーセント生存率については、今後、投与から３６時間後を含めたさらに早い時点で評価する。
結論として、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３はＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）と比較して、血友病マウスにおける活性持続時間が長い、換言すれば、止血効果の持続時間が長いことが明らかになった。データを考え合わせると、ＦＶＩＩへのＣＴＰの融合は、血友病患者の予防的治療を大幅に改善する可能性を秘めた技術であることが示唆される。
実施例７：ＳＤラットに単回ＩＶ注射または単回ＳＣ注射したときの精製ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３と精製ＦＶＩＩ－ＣＴＰ５のプロファイルの比較評価
試験の目的
試験を２件実施した：
第一の試験の目的は、雄Ｓｐａｒｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを用いて、ＦＶＩＩ ｓｅｌｅｃｔおよびＨＡカラムで精製したｒＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびｒＦＶＩＩ－ＣＴＰ５を５０μｇ／個体で静脈内に単回投与した後の薬物動態パラメータを明らかにすることとした。
第二の試験では、雄Ｓｐａｒｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを用いて、ｒＦＶＩＩ－ＣＴＰ３－ＨＡおよびｒＦＶＩＩ－ＣＴＰ５－ＨＡを１００μｇ／個体で静脈内または皮下に単回投与した後の薬物動態パラメータを検討した。
結果
ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５の抗原レベルの測定
ヒトＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡキット（Ｚｙｍｏｔｅｓｔ ＨｙＰｈｅｎ）を用いてＦＶＩＩ抗原レベルを測定した（表４６）。
Figure 0007187505000075
被験試料のウエスタンブロット解析
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌｕｓ ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いた４～１２％ビスｂｉｓＴｒｉｓｇｅｌ（ＮｕＰａｇｅ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社）にＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５の試料を負荷した。ポリクローナル抗ＦＶＩＩ Ａｂ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗ＣＴＰポリクローナルＡｂ（Ａｄａｒ ｂｉｏｔｅｃｈ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ社）または抗Ｇｌａ Ａｂ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社）を用いたウエスタンイムノブロットによりＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を実施した。まとめると、３つおよび５つのＣＴＰと融合したＦＶＩＩは、それぞれ８０ｋＤａおよび１００ｋＤａまで移動した（図３１を参照されたい）。
ＦＶＩＩのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力の比較評価
シバ医療センター、イスラエル国立凝固センターで実施したＦＶＩＩ活性アッセイは、免疫吸着により第ＶＩＩ因子を欠乏させた血漿を用いるＰＴベースのアッセイである（Ｓｉｅｍｅｎｓ社）。ＰＴ試薬はｉｎｎｏｖｉｎとし、アッセイはＳｙｓｍｅｘ ＣＡ １５００機器で実施する。ＦＶＩＩの正常範囲は５５～１４５％である。試料の活性を表４７にまとめる。
Figure 0007187505000076
体内の循環血中ＦＶＩＩの正常レベルは約０．５μｇ／ｍｌである。ＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５はともに、その凝固活性が正常ヒトプール血漿の約５分の１である。
薬物動態試験
（ＦＶＩＩ ｓｅｌｅｃｔおよびＦＶＩＩ ＨＡカラムの後）のＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５の薬物動態（ＰＫ）プロファイルおよびパラメータを明らかにするため、薬物動態試験を２件実施した。第一の試験では、ＦＶＩＩ ｓｅｌｅｃｔ／ＨＡ精製後のＦＶＩＩ－ＣＴＰ３およびＦＶＩＩ－ＣＴＰ５をＳｐａｒｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（１物質当たりラット６匹）に用量５０μｇ／ラットで静脈内注射により投与した。
投与から０．０８３時間後、０．５時間後、２時間後、５時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後および１２０時間後、交互に３匹のラットの後眼窩から血液試料を採取した。サンプリング直後にクエン酸血漿（０．３８％）を調製し、解析まで－２０で保管した。
第二の試験では、ＨＡカラム後の試料のみを検討した。この試料をＳｐａｒｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（１物質当たりラット６匹）に用量１００μｇ／ラットを用いて単回の静脈内注射または皮下注射により投与した。上の第一の試験と同じ時点および条件で血液試料を採取した。
Figure 0007187505000077
Figure 0007187505000078
上記の試験２件の間の主な違いは、用量および投与経路である。第一の試験ではラットに５０μｇ／ラットでＩＶ注射し、第二の試験では、ラットに１００μｇ／ラット（計５００μｇ／ｋｇ；ラットの体重２００ｇ）でＩＶ注射またはＳＣ注射した。用量を増加させたのは、投与のタイプを変えたことが理由であり、具体的には、ＳＣ投与でＩＶ投与と同等の効果を得るには、ＩＶ投与よりも多くの量が必要とされるからである。
ＰＫ試験の解析
ヒトＦＶＩＩ Ｅｌｉｓａキット（ｚｙｍｕｔｅｓｔ ＦＶＩＩ－Ｂｉｏｐｈｅｎ）を用いて血漿試料中のＦＶＩＩ濃度を定量化した。薬物動態プロファイルを算出し、各時点の３個体の平均値を示す。ＰＫ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ２．０ソフトウェアを用いて終末相半減期の値を算出した。様々なサンプリング時点について算出したＦＶＩＩ濃度を下の表にまとめる。ＰＫプロファイルおよびＰＫパラメータのまとめを下の表に示す。
Figure 0007187505000079
Figure 0007187505000080
Figure 0007187505000081
５つのＣＴＰを付加することにより、ＦＶＩＩの半減期が３ＣＴＰよりも長くなった。５ＣＴＰは両形態とも（すなわち、ＦＶＩＩＳおよびＦＶＩＩ ＨＡ）、長時間経過した時点（９６時間および１２０時間）で検出されたが、ＦＶＩＩ－３ＣＴＰ ＨＡおよびＦＶＩＩＳ－３ＣＴＰが検出されたのはそれぞれ７２時間および９６時間までであった。この事実に基づけば、ＦＶＩＩ－５ＣＴＰの半減期は３ＣＴＰバリアントよりも長い（図３２を参照されたい）。全被験物質（３ＣＴＰおよび５ＣＴＰ）の半減期を同じ時点（８～７２時間）で比較したところ、半減期はほぼ同じであることがわかったが、５ＣＴＰの方がはるかに長い（図３２）。
Figure 0007187505000082
第一の試験で観察されたのと同じく、５ＣＴＰを付加することにより、両投与法（ＩＶおよびＳＣ）でＦＶＩＩの半減期が初期相半減期および終末相半減期とも３ＣＴＰを付加した場合よりも長くなった（図３３を参照されたい）。予想された通り、ＳＣ投与後にＦＶＩＩが最初に血液中に検出されたのは、ＩＶ投与した場合よりも後の時点であった。
２件のＰＫ試験の結果を上にまとめた。第一の試験の主な目的は、ＦＶＩＩ－３ＣＴＰとＦＶＩＩ－５ＣＴＰを２種類の異なるカラム、すなわちＦＶＩＩ ｓｅｌｅｃｔおよびＦＶＩＩ ＨＡにかけた後の両者間の差を検討することであった。本発明者らのこれまでの試験では、収集物と精製タンパク質を比較して検討し、収集物をラットに注射した場合の方が３ＣＴＰ型ＦＶＩＩと５ＣＴＰ型ＦＶＩＩとの間の差が大きいことがわかった。
両カラムとも、ＦＶＩＩ ３ＣＴＰとＦＶＩＩ ５ＣＴＰの結果に有意差はみられず、このため、第二の試験（ＩＶ対ＳＣ）ではＦＶＩＩ ＨＡ ３ＣＴＰ／５ＣＴＰを注射することにした。
実施例８：ＦＶＩＩＩ欠乏マウスを用いたＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３（ＭＯＤ－５０１４）皮下注射後の生存率に関する試験
試験の目的
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、ＭＯＤ－５０１４（ＦＶＩＩＡ～ＣＴＰ３）およびＭＯＤ－５０１９（ＦＶＩＩＡ～ＣＴＰ５）の皮下投与後の効果を尾静脈切断試験で評価すること。
ＦＶＩＩａ－ＣＴＰ３（ＭＯＤ－５０１４）およびＦＶＩＩａ－ＣＴＰ５（ＭＯＤ ５０１９）の分析的特性：
Ａ２８０によるタンパク質測定
ＰｒｏｔＰａｒａｍアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ）を用いてＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の理論的吸光係数を算出した。この計算はアミノ酸配列に基づくものである。算出された吸光係数は、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）が１．４０６、ＭＯＤ－５０１９が１．０７５である（数値は２８０ｎｍでの１ｇ／Ｌの吸光度を表す）。Ｍｓｃａｎでのアミノ酸解析によりＭＯＤ－５０１４の吸光係数を求めた。ＭＯＤ－５０１４の吸光係数は１．２７である。
ＦＶＩＩａ－ＳＴＡＣＬＯＴ ＶＩＩａ－ｒＴＦの凝固アッセイ
ＦＶＩＩａは一本鎖ＦＶＩＩの鎖内切断により生じる。天然の組織因子（ＴＦ）はＦＶＩＩａの補因子の１つであり、ＦＶＩＩがＴＦと結合すると、第Ｘ因子から第Ｘａ因子への活性化を仲介し、それ自体はＦＶＩＩａに変換される。可溶性組織因子は天然の組織因子の細胞外部分である。この因子は、自己活性化によるＦＶＩＩの活性化ができなくなっているが、組織因子と結合したＦＶＩＩはＦＸをＦＸａに活性化することができる。
このアッセイに用いる組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）は、ＦＶＩＩａ特異性を利用してＦＶＩＩａ凝固試験を構成するものである。組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）は、ＦＶＩＩａ、カルシウムおよびリン脂質の存在下では、ＦＶＩＩをＦＶＩＩａに活性化することなく血漿の凝固を引き起こす。
このシステムで観察される凝固時間は被験試料中のＦＶＩＩａ含有量と逆相関があり、試料中にＦＶＩＩが存在することによる干渉を受けない。
各試験の前に、復元したＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ならびにＭＯＤ－５０１４およびＭＯＤ－５０１９についてＦＶＩＩａ活性を評価した。
Ａ２８０に基づきＦＶＩＩａ比活性（活性／ｍｌをタンパク質濃度で除して算出する）を算出し、表５４に示す。分子量が異なる２つの分子の比活性を比較する際には、活性を正規化するために補正を実施しなければならない（すなわち、分子量の差により、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）１ｍｇ中の活性部位の数はＭＯＤ－５０１４の１．１８５倍、ＭＯＤ－５０１９の１．３０７倍である）。したがって、換算係数の計算は以下の式で表される：
Figure 0007187505000083
Figure 0007187505000084
試験の概要
最も重要な測定は、このタンパク質が外傷事象後性にｉｎ ｖｉｖｏで血餅を誘導することができるかどうかである。ＭＯＤ－５０１４の止血能を評価するため、出血負荷に同じＦＶＩＩＩ欠乏マウスモデルを用いた。
ＦＶＩＩＩ欠乏マウスにＭＯＤ－５０１４、ＭＯＤ－５０１９またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の単回皮下注射を実施した。グループＡおよびＢには、ＦＶＩＩａ活性が等しくなる量のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）およびＭＯＤ－５０１４をそれぞれ投与した。決定的因子（タンパク質の活性または量）を評価するため、グループＣにはＭＯＤ－５０１９をＦＶＩＩａタンパク質の量がＭＯＤ－５０１４と等しくなるように投与した。投与した用量は、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）が４．２ｍｇ／ｋｇ、ＭＯＤ－５０１４およびＭＯＤ－５０１９が８．６ｍｇ／ｋｇであった。投与から１２時間後、尾端から２．７ｃｍのところで尾静脈を切断し、マウスの生存を２４時間にわたって記録した。
Figure 0007187505000085
結果
実験データを表５６および図３４にまとめる。
Figure 0007187505000086
ＴＶＴから２４時間後、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を注射したマウスのうち生存していたのはわずか１１％であった。この時点では、ＭＯＤ－５０１４の３０％、ＭＯＤ－５０１９の４０％が生存していた。ＭＯＤ－５０１４およびＭＯＤ－５０１９の皮下注射によりマウス生存率がＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）よりも改善されたのは驚くべきことである。
第ＶＩＩａ因子は、ほかの凝固因子と同じように、血流中で直接利用できるよう静脈内に注射するのが通常である。しかし、本発明は、本明細書に提供される組成物が、驚くべきことに、ＳＣ投与後、さらに効率的に血流中に吸収されることを示している。ＦＶＩＩａを皮下に投与することが可能であることは、それを予防用途に使用することが可能であるため利点となる。また、患者が自己注射するには皮下注射の方がはるかに容易であるほか、患者が極めて若年であり、静脈が細く見つけにくい場合には皮下注射が利点となる。
したがって、予防的治療に皮下適用を用いることができる。
実施例９：ＳＤラットを用いた組換えＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の皮下投与後の比較ＰＫ－ＰＤ試験
試験の目的
ＭＯＤ－５０１４および市販のｒＦＶＩＩａをＳＤラットに単回ＳＣ投与した後の薬物動態パラメータおよび薬力学パラメータを明らかにすること。
２つの異なるクローン（クローン番号２８および６１）に由来するＭＯＤ－５０１４産物を含めた２つの独立した実験（０５０１０および０５０３４）をその薬物動態パラメータにより比較すること。
実験方法
動物
注射開始の少なくとも４日前、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｓｒａｅｌ社から雄ＳＤラット２４匹が到着した。個体は健常な若年成体であり、試験開始時、約２００グラムであった。処置開始時の体重の個体のばらつきは、各性別の平均重量の±２０％を超えてはいけない。この試験に用いる個体の健康状態を到着時に検査する。健康状態が良好な個体のみを実験室条件に馴化させ、試験に用いる。
ＦＶＩＩａ－ＳＴＡＣＬＯＴ ＶＩＩａ－Ｒｔｆの凝固アッセイ
このアッセイに使用する組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）は、ＦＶＩＩａ特異性を利用してＦＶＩＩａ凝固試験を構成するものである。ｒｓＴＦは、ＦＶＩＩａ、カルシウムおよびリン脂質の存在下では、ＦＶＩＩをＦＶＩＩａに活性化することなく血漿の凝固を引き起こす。
このシステムで観察される凝固時間は被験試料中のＦＶＩＩａ含有量と逆相関があり、試料中にＦＶＩＩが存在することによる干渉を受けない。
各試験の前に、復元後のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）およびＭＯＤ－５０１４の両方についてＦＶＩＩａ活性を評価した。Ａ２８０に基づきＦＶＩＩａ比活性を算出した。ＭＷが異なる２つの分子の比活性を比較する際には、活性を正規化するために補正を実施しなければならない（すなわち、分子量の差により、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）１ｍｇ中の活性部位の数はＭＯＤ－５０１４の１．１８５倍である）。
ＰＫ ｓｏｌｖｅｒソフトウェア
ＰＫ ｓｏｌｖｅｒソフトウェアを用いて薬物動態パラメータを算出した。ＩＶ投与曲線を２コンパートメントＣＡボーラスとして解析し、ＳＣ投与をＮＣＡ血管外－対数線形台形解析として解析した。半減期、ＡＵＣ、クリアランスおよび容積分布の規格値を算出し、出力パラメータを実験グループ間で比較して検討した。
実験材料
実験番号０５０１０：
Ａ．ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ＲＴ：（３１．７．１２に調製したロット番号ＡＵ６１５５３＊）Ａ２８０によるＦＶＩＩａ濃度：０．８６ｍｇ／ｍｌ。ＦＶＩＩａ Ｓｔａｃｌｏｔ活性アッセイ：５６，８６７Ｕ／ｍｇ。注射用量：９４６μｇ／ｋｇ。＊いずれも同じロット番号のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）アリコートのプール。
Ｂ．クローン２８：ＭＯＤ－５０１４ ＲＳ１２－００１：Ａ２８０で０．７７ｍｇ／ｍｌ＊＊。ＦＶＩＩａ Ｓｔａｃｌｏｔ活性アッセイ：３４，１６２Ｕ／ｍｇ。注射用量：８５０μｇ ＦＶＩＩａ／ｋｇ。
実験番号０５０３４：
Ａ．ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ＲＴ：（１．１．１３に調製したロット番号ＡＵ６１３４７）Ａ２８０によるＦＶＩＩａ濃度：０．８２ｍｇ／ｍｌ、無菌ＮＳ緩衝液で０．４ｍｇ／ｍｌに希釈。ＦＶＩＩａ Ｓｔａｃｌｏｔ活性アッセイ：５５，６８８ Ｕ／ｍｇ。注射用量：３６０μｇ／ｋｇおよび２０，０４７．７Ｕ／ｋｇ。
Ｂ．クローン６１：ＭＯＤ－５０１４バッチ７５：Ａ２８０で１．９ｍｇ／ｍｌ＊＊、製剤緩衝液で０．８９ｍｇ／ｍｌに希釈。注射用量：２０，０４７．７Ｕ／ｋｇ。ＦＶＩＩａ凝固活性：ＦＶＩＩａ Ｓｔａｃｌｏｔ活性アッセイで２５，００２＊Ｕ／ｍｇ。
Ｃ．クローン６１：ＭＯＤ－５０１４バッチ８１Ａ：Ａ２８０で２．３６ｍｇ／ｍｌ（試験当日の朝にろ過し、２８０ｎｍで再測定した）、製剤緩衝液で０．４ｍｇ／ｍｌに希釈。注射用量：３６０μｇ ＦＶＩＩａ／ｋｇ。ＦＶＩＩａ凝固活性：ＦＶＩＩａ Ｓｔａｃｌｏｔ活性アッセイで２４９４３Ｕ／ｍｇ。
Ｄ．クローン６１：ＭＯＤ－５０１４バッチ８１Ａ：Ａ２８０で２．３６ｍｇ／ｍｌ、製剤緩衝液で０．８９ｍｇ／ｍｌに希釈。注射用量：２０，０４７．７Ｕ／ｋｇ。ＦＶＩＩａ凝固活性：ＦＶＩＩａ Ｓｔａｃｌｏｔ活性アッセイで２４，９４３Ｕ／ｍｇ。
試験の概要
実験番号０５０１０
用量０．９ｍｇ／ｋｇ体重のＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）をＳＤラットに単回の静脈内注射または皮下注射で投与した。投与から０．５時間後、４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、３４時間後、４８時間後および５８時間後、交互に３匹のラットの眼窩洞から血液試料を採取した。サンプリング直後にクエン酸血漿（０．３２％）を調製し、解析まで－２０℃で保管した。試験はネスジオナの「Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ａｃｔｉｏｎ」で実施した。Ｐｒｏｌｏｒ－Ｂｉｏｔｅｃｈ社にてＦＶＩＩａ凝固活性レベルを評価し、詳細なＰＫ解析を実施した。
Figure 0007187505000087
実験番号０５０３４
用量０．９ｍｇ／ｋｇ体重のＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）をＳＤラットに単回の皮下注射で投与した。投与から０．５時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、３４時間後、４８時間後および７２時間後、交互に３匹のラットの眼窩洞から血液試料を採取した。サンプリング直後にクエン酸血漿（０．３２％）を調製し、解析まで－２０℃で保管した。試験はネスジオナの「Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ａｃｔｉｏｎ」で実施した。
Ｐｒｏｌｏｒ－Ｂｉｏｔｅｃｈ社にてＦＶＩＩａ凝固活性レベルを評価し、詳細なＰＫ解析を実施した。
Figure 0007187505000088
結果
ＳＴＡＣＬＯＴ ＶＩＩａ－ｒＴＦキット（Ｓｔａｇｏ社）を用いて血液試料のＦＶＩＩａ活性を定量化した。各タンパク質について薬物動態プロファイルを算出し、各時点の３個体の平均値とする。
実験番号０５０１０
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）またはＭＯＤ－５０１４をＩＶ投与後およびＳＣ投与後のＦＶＩＩａのＰＫプロファイルを図３５に示す。各時点のＦＶＩＩａ活性値のまとめを表５９に示す。図３５に示されるように、ＩＶ投与とＳＣ投与は、これまでの結果と同じくＰＫパターンが異なる。ＩＶ注射後のＣｍａｘは、投与直後に薬物が血液中に存在するため、ＳＣ注射後に得られるものよりも大きい（０．５時間に測定、表５９および表６０）。しかし、ＳＣ投与後は薬物分子が細胞内基質および組織に移動するため、Ｃｍａｘを測定することができるのは注射から２時間後である。ＳＣ投与後の薬物の総回収率はＩＶ注射後のＣｍａｘ値よりも小さい。
注射から８時間後、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）では、ＩＶ注射でもＳＣ注射でも同じＰＫパターンがみられた（図３５）。さらに、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）処置マウスの凝固活性は１２時間よりも後の時点では検出不可能であったが、ＭＯＤ－５０１４処置ラットでは、投与後５８時間でも依然として測定可能な活性が保持されていた（表５９および図３５）。
Figure 0007187505000089
表６０．ＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）のＩＶ投与後またはＳＣ投与後のＰＫパラメータの比較
Figure 0007187505000090
Figure 0007187505000091
実験番号０５０３４
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）またはＭＯＤ－５０１７のＳＣ投与後のＦＶＩＩのＰＫプロファイルを図３６に示す。クローン６１の２つ異なるバッチ（＃７５および＃８１）を同じ濃度または同じ活性単位で試験し、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）と比較した。各時点のＦＶＩＩａ活性値のまとめを表６１に示す。
これらの結果は、これまでの実験に対応する同様のＳＣ投与後のＰＫパターンを示している。さらに、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）処置ラットの凝固活性は１２時間よりも後の時点では検出不可能であったが、ＭＯＤ－５０１４処置ラットは投与後２４時間でも依然として測定可能な活性が保持されていた（表６１および図３６；ならびにバックグランド減算後：５６ｍＵ／ｍｌ（８時間後、１２時間後）または３２ｍＵ／ｍｌ（０．５時間後、２時間後、６時間後、１４時間後））。
クローン番号６１バッチ＃８１（Ｄ）のＣｍａｘ（１，３０１ｍＵ／ｍｌ）はクローン番号６１バッチ＃７５（Ｂ）およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（Ａ）（それぞれ３，５２１ｍＵ／ｍｌおよび５，９０８ｍＵ／ｍｌのＣｍａｘ値よりも小さかったが、これらはいずれも同じ単位活性で投与したものである（表６１））。しかし、バッチ＃７５（Ｂ）と＃８１（Ｄ）は、注射から８時間後に測定した活性単位が同等であった（それぞれ５５９ｍＵ／ｍｌおよび４７８ｍＵ／ｍｌ）（表６１および表６２；ならびにバックグランド減算後：５６ｍＵ／ｍｌ（８時間後、１２時間後）または３２ｍＵ／ｍｌ（０．５時間後、２時間後、６時間後、１４時間後））。
Figure 0007187505000092
Figure 0007187505000093
この報告は２件のＰＫ試験；０５０１０および０５０３４をまとめたものである。これらの結果は、ＦＶＩＩへのＣＴＰの融合が皮下投与時のタンパク質の半減期およびクリアランスに及ぼす影響に関する具体的な理解をもたらすほか、この修飾を施した後のＦＶＩＩの比活性の実例を取り扱うものである。これらの試験では、２種類のクローンおよび２種類の異なるバッチに由来するＭＯＤ－５０１４をＳＤラットに単回ＳＣ注射で投与し、市販の組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））と比較した。成分を同等のＦＶＩＩａ濃度（μｇ／Ｋｇ）または同じ活性レベル（Ｕ／Ｋｇ）で注射し、ＰＫ活性ベースの解析を実施した。
第一の試験の目的は、ＩＶ投与後とＳＣ投与後の様々なＰＫパラメータを検証することであった。この試験に基づき、ＩＶ投与後またはＳＣ投与後に測定したＰＫパターンの間に差が認められると結論付けることができる。ＭＯＤ－５０１４のＳＣ注射後に測定したｔ１／２は７．７８時間であり、ＩＶ注射後に測定したｔ１／２は４．２時間にとどまった。ＡＵＣ値は同程度であった（表６０）。
一方、第二の試験は、同じＦＶＩＩａ濃度または同じ活性単位で注射したＭＯＤ－５０１４クローン番号６１の２種類のバッチの間の差に主眼を置き、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）と比較したものである。この試験では、クローン６１のバッチ＃７５がバッチ＃８１よりも優れたＰＫパラメータを示すことがわかった。理由は明らかではないが、同じ単位活性レベルで投与したバッチ＃８１の方がＣｍａｘが小さかった。さらに、クローン６１バッチ＃８１を異なる２種類の用量（ＦＶＩＩａ濃度または単位活性）で投与したところ、同じＣｍａｘが測定され、代わりに両者の活性の間に２．５倍の開きがあった。両試験の解析を考え合わせると、クローン２８の方がクローン６１＃７５（優れている方のバッチ）よりもＳＣ注射後のｔ１／２パラメータが長い（それぞれ７．７８時間および５．７時間、表６２）と結論付けることができる。以上の結果から、試料の時点が異なればＰＫパターンも異なるものとなり、それによりＰＫ曲線に差が生じることがわかる。曲線のパターンから、血液中の薬物挙動に関してさらに多くのことがわかる。このため、Ｂａｘｔｅｒが検出したものと同じ時点（０時間、０．５時間、２時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、３４時間、４８時間、７２時間）に定めることにした。さらに、実験０５０１０はＦＶＩＩａ濃度が高すぎ、のちのＳＣ実験（０５０３４）ではこれを修正した。のちのＰＫ試験には、成分を１回３６０μｇ ＦＶＩＩａ／ｋｇで注射することにした。
実施例１０：第ＶＩＩａ因子をｉｎ ｖｉｖｏで評価するモデルとしてのワルファリン処置ラット
材料および方法
ＰＴ評価：ＳＤラットに１０ｍｇ／Ｋｇのワルファリンを経口投与し、所定の時点で血漿を採取し、標準的手順を用いてプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定した。長時間の止血効果を評価するため、ワルファリン処置ラットにプラセボ、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）またはＭＯＤ－５０１４を注射し、ＰＴを測定した。
尾部切断負荷：ワルファリン処置ラットにプラセボ、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）またはＭＯＤ－５０１４を注射し、所定の時点で尾端（先端から０．５ｃｍ）を完全に切断することによって個体に負荷を与え、切断３０分後に出血程度をグラム数で測定した。
結果
ＳＤラットにワルファリンを投与することによりＰＴおよびａＰＴＴが長くなる。
ワルファリンはビタミンＫの還元を阻害し、その結果、ビタミンＫ依存性凝固因子の血中濃度を低下させる。雄ＳＤラットにワルファリンを経口投与した。ビタミンＫ依存性凝固因子の減少に伴いＰＴおよびａＰＴＴが長くなった。結果を図３７に示す。
ワルファリン投与後の最初の４８時間は、凝固因子が血液中から除去されるため、ＰＴおよびａＰＴＴの値が徐々に増大する。その後、この効果は低下する。
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）またはＭＯＤ－５０１４での急性ＩＶ処置によってワルファリンの効果を回復させることができる。
ＳＤ－ラットにワルファリンによる前処置を実施した。２４時間後、ＭＯＤ－５０１４、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）または緩衝液を静脈内注射し、注射から１５分後に血液試料を採取した。注射から１５分後、ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）によってＰＴ値を正常値に回復させることに成功した（図３８）。
ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の用量増大がワルファリン処置ラットのＰＴ値に及ぼす効果。
ＳＤラットに１００～１０００μｇ／ＫｇのＭＯＤ－５０１４またはＮｏｖｅＳｅｖｅｎのＩＶ注射と同時に１０ｍｇ／Ｋｇのワルファリンによる処置を実施した。処置から２４時間後、血漿試料のＰＴを測定した。ＰＴ測定の２４時間前にＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を投与したところ、いずれの被験用量でもＰＴ値に対する有意な効果は認められなかった。これに対し、ＭＯＤ－５０１４では、投与から２４時間後に用量依存性の挙動がみられる（図３９）。
ＳＤラットに１０００μｇ／ＫｇのＭＯＤ－５０１４またはＮｏｖｅＳｅｖｅｎのＩＶ注射と同時に１０ｍｇ／Ｋｇのワルファリンによる処置を実施した。処置から１０時間後、２４時間後、３６時間後および４８時間後、血漿試料のＰＴを測定した。ＭＯＤ－５０１４では投与４８時間後までＰＴ値の正常値への回復がみられたが、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の効果は２４時間より後にはみられない（図４０）。
ワルファリン注射ラットを用いる尾部切断アッセイによってＭＯＤ－５０１４の効果が長時間持続することを示すことができる。
ＳＤラットに尾部切断を実施する２４時間前、ワルファリンによる処置を実施した。ラットに麻酔をかけ、温かいパッドの上に置き、尾端を３７℃の生理食塩水に浸け、尾端から０．５ｃｍのところで尾を完全に切断した。３０分間血液を採取し、失血量を体重により測定した。
溶媒または５００μｇ／ＫｇのＭＯＤ－５０１４もしくはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を投与してから１５分後、２４時間後または４８時間後に尾部切断を実施した。結果を図４１に示す。ワルファリンで処置したラットの失血量は未処置ラットの５倍であった。注射から１５分後のＭＯＤ－５０１４処置ラットおよびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ処置ラットの尾部切断では、未処置ラットと同程度に出血が抑えられた。ＭＯＤ－５０１４の効果は、注射から２４時間後までは完全に保持され、４８時間後も一部保持された。
ＭＯＤ－５０１４の皮下注射でも長時間持続する効果がみられる。
ＳＤラットに２０００μｇ／ＫｇのＭＯＤ－５０１４またはＮｏｖｅＳｅｖｅｎのＳＣ注射と同時に１０ｍｇ／Ｋｇのワルファリンによる処置を実施した。処置から１０時間後、２４時間後、３６時間後および４８時間後、血漿試料のＰＴを測定した。
ＭＯＤ－５０１４では投与から４８時間後までＰＴ値を正常に回復させることができるが、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の効果は２４時間より後にはみられなくなる（図４２）。
ＭＯＤ－５０１４のＳＣ注射により４８時間後も失血量が抑えられる。
ＳＤラットをワルファリンで処置してから２４時間後、尾部切断を実施した。ラットに麻酔をかけ、温かいパッドの上に置き、尾端を３７℃の生理食塩水に浸け、尾部ｔから０．５ｃｍのところで尾を完全に切断した。
ｉｐ．血液を３０分間採取し、失血量を体重により測定した。
溶媒または１０００μｇ／ＫｇのＭＯＤ－５０１４もしくはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）をＳＣ投与し、１５分後、２４時間後または４８時間後に尾部切断を実施した。結果を図４３に示す。
実施例１１：ＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の凝固活性の比較評価
試験の目的－（Ｉ）様々な条件下でＭＯＤ－５０１４のｉｎ ｖｉｔｒｏの凝固活性およびＦＸ活性化の特徴を明らかにしＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）と比較すること。（ＩＩ）ヒト血友病およびＦＶＩＩ欠乏血漿でのプロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）のプロファイルをＭＯＤ－５０１４添加とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）添加とでｅｘ ｖｉｖｏで比較すること。
材料および方法
材料－ＭＯＤ－５０１４ ＧＭＰ－１：２．５ｍｇ／ｍｌ（Ａ２８０による）およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ロット番号ＣＵ６０４３０：０．９４３ｍｇ／ｍｌ（Ａ２８０による）
方法－凝固アッセイ
市販のＳｔａｃｌｏｔ ＶＩＩａ－ｒＴＦキット（参照番号００２８１、Ｓｔａｇｏ社）を用いてＦＶＩＩａの凝固活性を測定した。この方法では、ＳＴＡ Ｃｏｍｐａｃｔ ＭＡＸまたはＳｔａｒｔ４機器を用いたＦＶＩＩ欠乏血漿の凝固時間測定を実施した。血漿にリン脂質、Ｃａ２＋および組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）を添加した後、特定量のＦＶＩＩａを添加した。ｒｓＴＦは天然の組織因子の細胞外部分であり、自己活性化によるＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの活性化ができなくなっている。しかし、第ＶＩＩａ因子に特異的な補因子機能はある。可溶性組織因子と結合したＦＶＩＩａは第Ｘ因子を活性な第Ｘａ因子に変換する。可溶性組織因子がＦＶＩＩをＦＶＩＩａに活性化することはないため、観察される凝固時間は血漿中ＦＶＩＩａレベルと逆相関する。ＦＶＩＩａの標準曲線を用いて、得られた凝固時間を活性（ｍＵ／ｍｌ）に変換し、ＦＶＩＩａタンパク質濃度に基づき比活性を算出した。この方法はＦＶＩＩａのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性能を明らかにするものであるが、ｓＴＦの使用が制限されるため、ｉｎ ｖｉｖｏの状況を一部模倣するにとどまる。
方法－ＦＶＩＩ発色アッセイ
市販のキットであるＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩ（参照番号２２１３０４、ＨＹＰＨＥＮ ＢｉｏＭｅｄ社）によりＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の効力を評価した。これはＦＶＩＩ活性の試験を目的とする発色アッセイの１つである。ＦＶＩＩは、リン脂質およびカルシウムの存在下で組織因子と酵素複合体を形成し、第Ｘ因子を活性化第Ｘａ因子に変換する。このアッセイでは、第Ｘ因子が一定濃度で過剰に存在する。活性化第Ｘａ因子の濃度は、同因子によって切断されｐＮＡを生じる特異的発色基質（ＳＸａ－１１）に対する活性によって測定される。ｐＮＡの量は第Ｘ因子の活性に正比例するとともに、第ＶＩＩ因子の量と第Ｘａ因子の活性レベルとの間には直接的な関係があり、それは、放出されたｐＮＡの量によって測定され、４０５ｎｍでの発色によって判定される。
方法－プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）
Ｓｉｅｍｅｎｓ ＣＡ－１５００自動分析器を用いてプロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分プロトロンビン時間（ａＰＴＴ）を測定し、Ａ．Ｍ．Ｌに日常的に用いられる臨床ヒト血漿診断検査を用いて検証した。
ＭＯＤ－５０１４ ＧＭＰ－１：Ａ２８０での吸収により２．５ｍｇ／ｍｌ、血友病ヒト血漿／ＦＶＩＩ欠乏血漿で０．５～０．０００８ｍｇ／ｍｌに希釈。
ＦＶＩＩａ凝固活性：ＦＶＩＩａ Ｓｔａｃｌｏｔ活性アッセイにより１６，７２０Ｕ／ｍｇ。
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ロット番号ＣＵ６０４３０：Ａ２８０での吸収により０．９４３ｍｇ／ｍｌ、血友病ヒト血漿／ＦＶＩＩ欠乏血漿で０．５～０．０００８ｍｇ／ｍｌに希釈。
ＦＶＩＩａ凝固活性：ＦＶＩＩａ Ｓｔａｃｌｏｔ活性アッセイにより５０，４９４Ｕ／ｍｇ。
基質：ヒト血漿（ＦＶＩＩＩ欠乏）ＢＩＯＲＥＣＬＡＭＡＴＩＯＮ（カタログ番号ＨＭＰＬＣＩＴ－ＦＡＣＴ８ＤＥＦ、ロット番号ＢＲＨ７７９２２２－ＢＲＨ７７９２３３）。ＦＶＩＩ欠乏血漿、カタログ番号ＨＢＭ－ＤＰ０３０Ｋ。
結果
効力測定：適格なＳｔａｃｌｏｔ ＶＩＩａ－ｒｓＴＦキットを用いてＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の比活性を評価した。４つの独立したアッセイにより測定して得たＭＯＤ－５０１４（バッチＲＳ００５、ＧＭＰ１、ＥＲ０１）およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の比活性の平均値を下の表６３に示す。
Figure 0007187505000094
結論：ＭＯＤ－５０１４の比活性はＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の２～２．５倍低くかった。これは、ＭＯＤ－５０１４が８３．４％のＦＶＩＩａからなり、Ｃ末端に３つのＣＴＰカセットが付加されていることから、モル数ではなく質量を基準に添加したときにＭＯＤ－５０１４中のＦＶＩＩａのモル含有量が少なくなった結果であると考えられる。
ＴＦＰＩ存在下での凝固活性阻害：ＦＶＩＩａの天然の阻害因子である組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）の存在下でＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の凝固活性を評価した。固定濃度のＭＯＤ－５０１４またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、ＦＶＩＩ欠乏血漿、組織因子およびリン脂質を添加した後、様々な濃度（３１２５ｎｇ／ｍｌ～０．００６ｎｇ／ｍｌ）の阻害因子を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。観察された比活性を阻害の％に変換した。アッセイを３回反復し、結果の平均値を表６４および図４４に示す。
Figure 0007187505000095
結論：ＴＦＰＩによってＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）およびＭＯＤ－５０１４が同じように用量依存性に阻害された。数値の差は、方法修正の部分で報告したように、アッセイのばらつきの結果であると考えられる（％ＣＶ≦２５％）。
ヘパリン存在下での凝固活性阻害：様々な濃度のヘパリンの存在下でＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の凝固活性を測定した。固定濃度のＭＯＤ－５０１４またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、ＦＶＩＩ欠乏血漿、組織因子およびリン脂質を添加した後、ヘパリンを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。結果を表６５に示す。
Figure 0007187505000096
結論：ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の両方の事象において極めて低濃度（０．１Ｕ／μｌ）で９６％を超える阻害が観察されたことから、ヘパリンはこの特定のアッセイで高い効力を示すと言える。
アンチトロンビン（ＡＴ）存在下での凝固活性：ＦＶＩＩａの穏やかな阻害因子であるアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）の存在下でＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の比活性を評価した。ＭＯＤ－５０１４またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、ＦＶＩＩ欠乏血漿、組織因子およびリン脂質を添加した後、様々な濃度（５２５μｇ／ｍｌ～０．０１ｎｇ／ｍｌ）のアンチトロンビンを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。観察された比活性を阻害の％に変換した。結果を表６６および図４５に示す。
Figure 0007187505000097
結論：ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）はＡＴ ＩＩＩによって同じように阻害された。
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）およびＭＯＤ－５０１４による第Ｘ因子活性化：ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の効力を評価し、ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）で得られたＥＣ５０値の平均値を算出した（それぞれ０．４１ｎｇ／ｍｌおよび０．３８ｎｇ／ｍｌ）。結果を表６７に示し、代表的な用量反応曲線を図４６に示す。
Figure 0007187505000098
ＴＦＰＩ存在下でのＦＸ活性化：ＴＦＰＩ存在下でのＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の効力を評価した。２種類の濃度のＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（ＥＣ７０）（０．６ｎｇ／ｍｌおよび４ｎｇ／ｍｌ）に様々な濃度（２０μｇ／ｍｌ～０．００２ｎｇ／ｍｌ）のＴＦＰＩを添加し、ＦＸ活性化を測定した。結果を表６８および図４７に示す。濃度４ｎｇ／ｍｌのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）およびＭＯＤ－５０１４の存在下で実施したアッセイについては表６９および図４８に示す。
Figure 0007187505000099
Figure 0007187505000100
結論：ＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は両濃度とも、ＴＦＰＩ存在下でのＦＸ活性化の阻害曲線が極めて類似していた。
ＴＦＰＩとヘパリンの存在下でのＦＸ活性化－ＴＦＰＩとヘパリンの存在下でＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の効力を評価した。一定濃度のＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（０．７ｎｇ／ｍｌ）に様々な濃度（２０μｇ／ｍｌ～０．００２ｎｇ／ｍｌ）のＴＦＰＩおよび１Ｕ／μｌのヘパリンを添加し、ＦＸ活性化を測定した。結果を表７０および図４９に示す。
Figure 0007187505000101
結論：ＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は、ＴＦＰＩの存在下で同程度のＦＸ活性化を示した。ヘパリンをＴＦＰＩとともに添加しても、阻害プロファイルに有意な影響を及ぼすことはなかった。
アンチトロンビン存在下でのＦＸ活性化：アンチトロンビン（ＡＴ ＩＩＩ）の存在下でＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の効力を評価した。一定濃度のＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（０．７ｎｇ／ｍｌ）に様々な濃度のＡＴ ＩＩＩ（１．６８ｍｇ／ｍｌ～０．１６μｇ／ｍｌ）を添加し、ＦＸ活性化を測定した。結果を表７１－１および図５０に示す。
Figure 0007187505000102
結論：ＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は、ＡＴ ＩＩＩの存在下で同程度のＦＸ活性化を示した。
ＡＴ ＩＩＩ濃度を一定にしてヘパリン濃度を変化させたときのＦＸ活性化：アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ ＩＩＩ）を一定濃度（２０μｇ／ｍｌ）に希釈し、一定濃度のＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（０．７ｎｇ／ｍｌ）に添加した。この混合物に様々な濃度（６．２５Ｕ／μｌ～０．００２Ｕ／μｌ）のヘパリンを添加し、ＦＸ活性化を測定した。結果を表７１－２および図５１に示す。
Figure 0007187505000103
結論：ＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）は、ＡＴ ＩＩＩ濃度が一定のとき、ヘパリンによって同じように中程度に阻害される。
ＰＴおよびａＰＴＴの測定値
ＰＴおよびａＰＴＴの測定値を表７２に示す。
Figure 0007187505000104
結論：ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を同じ濃度範囲で加えたとき、両者のＰＴおよびａＰＴＴの測定値はほぼ同じであった。
ヘパリン濃度を一定にしてＡＴ濃度を変化させたときのＦＸ活性化
試験の目的
アンチトロンビンおよび一定濃度のヘパリンの存在下でのＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎのＦＸ活性化能を比較すること。
試験のデザインおよび結果
アンチトロンビン（ＡＴ）とヘパリンの存在下でのＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎの効力を評価した。一定濃度のＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（０．７ｎｇ／ｍｌ）に様々な濃度のＡＴ（１．６８ｍｇ／ｍｌ～０．０３２μｇ／ｍｌ）および１Ｕ／μｌのヘパリンを添加し、ＦＸ活性化を測定した。アンチトロンビンに対するＩＣ５０値は、ＭＯＤ－５０１４が４９．６５μｇ／ｍｌ、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎが６５．７０μｇ／ｍｌであった。結果を表１２１、図５２に示す。
Figure 0007187505000105
結論：ＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎはＡＴと１Ｕ／μｌのヘパリンの存在下で同程度のＦＸ活性化を示し、ＦＶＩＩａ阻害に及ぼす影響はＡＴの方がヘパリンよりもはるかに大きいことが示唆された。
ＰＴおよびａＰＴＴの測定値の比較
試験の目的
ヒト血友病血漿およびＦＶＩＩ欠乏血漿にＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎを添加したときのＰＴプロファイルおよびａＰＴＴプロファイルを比較すること。
試験デザイン
Ｓｉｅｍｅｎｓ ＣＡ－１５００自動分析器を用いてＰＴおよびａＰＴＴを測定し、Ａ．Ｍ．Ｌに日常的に用いられる臨床ヒト血漿診断検査を用いて検証した。ＭＯＤ－５０１４ ＧＭＰ－１：Ａ２８０での吸収により２．５ｍｇ／ｍｌ、血友病ヒト血漿／ＦＶＩＩ欠乏血漿で０．５～０．０００８ｍｇ／ｍｌに希釈。
ＦＶＩＩａ凝固活性：ＦＶＩＩａ Ｓｔａｃｌｏｔ活性アッセイにより１６，７２０Ｕ／ｍｇ。
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎロット番号ＣＵ６０４３０：Ａ２８０での吸収により０．９４３ｍｇ／ｍｌ、血友病ヒト血漿／ＦＶＩＩ欠乏血漿で０．５～０．０００８ｍｇ／ｍｌに希釈。ＦＶＩＩａ凝固活性：ＦＶＩＩａ Ｓｔａｃｌｏｔ活性アッセイにより５０，４９４Ｕ／ｍｇ。
基質：
・ヒト血漿（ＦＶＩＩＩ欠乏）ＢＩＯＲＥＣＬＡＭＡＴＩＯＮ（カタログ番号ＨＭＰＬＣＩＴＦＡＣＴ８ＤＥＦ、ロット番号ＢＲＨ７７９２２２～ＢＲＨ７７９２３３）。
・ＦＶＩＩ欠乏血漿、カタログ番号ＨＢＭ－ＤＰ０３０Ｋ。
上記の基質に０．５～０．０００８ｍｇ／ｍｌの濃度のＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎを添加し、ＰＴおよびａＰＴＴを測定した。結果を表１２２にまとめる。
Figure 0007187505000106
結論：ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎを同じ濃度範囲で加えたとき、両者のＰＴおよびａＰＴＴの測定値はほぼ同じであった。
まとめ
様々なｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの方法でＭＯＤ－５０１４の凝固活性の様々な側面を等質量のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）と比較して評価するによりＭＯＤ－５０１４の活性を評価した。最初に、適格なＳｔａｃｌｏｔ ＦＶＩＩａアッセイでＭＯＤ－５０１４の活性をＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）と比較した。この試験では、ＭＯＤ－５０１４の活性がＮｏｖｏＳｅｖｅｎの２～２．５倍低いことが明らかになった。ＴＦ、リン脂質およびカルシウムの存在下での発色アッセイによる第Ｘ因子活性化試験でも、ＥＣ５０によって表されるＭＯＤ－５０１４の活性の測定値は、ＭＯＤ－５０１４の方がＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）よりもわずかに低いことがわかった。
方法間のばらつきは、アッセイ感度または評価項目（それぞれ可溶性ＴＦ対完全鎖ＴＦおよび凝固時間対ＯＤ測定値）の差によるものであると思われる。ＭＯＤ－５０１４の方が活性が低いのは、ＭＯＤ－５０１４の８４．４％がＦＶＩＩａに相当し、１５．６％がＣＴＰに相当することに起因するものと思われる。
外因系凝固経路の主要なＦＸａ依存性阻害因子であるＴＦＰＩの存在下でのＭＯＤ－５０１４の不活化を上記の２種類のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（Ｓｔａｃｌｏｔおよび第Ｘ因子活性化）により評価した。２種類の固定濃度のＭＯＤ－５０１４またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を漸増濃度のＴＦＰＩとインキュベートしたところ、凝固活性またはＦＸａ酵素活性の用量依存性の低下がみられた。両化合物は、％凝固阻害によって表される不活化パターンが極めて類似していた。
アンチトロンビンＩＩＩは、第ＶＩＩａ因子を低速度で阻害することが既に報告されているほか、ヘパリンの存在下で阻害作用が増大することも明らかにされている。アンチトロンビンＩＩＩの濃度を漸増させてＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）に添加したところ、両化合物で同じ阻害パターンがみられた。このパターンはヘパリン添加後も維持され、顕著な阻害作用をもたらした。
実施例１２：ＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）のトロンビン生成および凝固効率に関するｉｎ ｖｉｔｒｏでの比較評価
試験の目的－（Ｉ）高力価の阻害抗体を含む阻害性多血小板血漿中での低リン脂質濃度および高リン脂質濃度におけるトロンビン生成（ＴＧ）によるＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の比較評価ならびに（ＩＩ）高力価の阻害抗体を含む阻害性多血小板血漿を用いたトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）によるＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の比較評価。
材料および方法
材料－凍結保存（－６０～－８０℃）した２．０ｍｇ／ｍｌのＭＯＤ－５０１４および１．０ｍｇ／ｍｌのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）。用量製剤の調製は不要であった。投与前に材料を１回のみ解凍した。
方法－低リン脂質濃度および高リン脂質濃度でのトロンビン生成（ＴＧ）
高力価の抗ＦＶＩＩＩ阻害Ａｂを有する患者に由来するヒト血漿に漸増濃度のＭＯＤ－５０１４またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を添加し、ｉｎ ｖｉｖｏの状況を模倣してｒｅｌｉｐｉｄｔａｅｄｒｈ組織因子（ＴＦ）および高濃度のリン脂質ミセル（Ｒｅａｇｅｎｔ ＲＣｈｉｇｈ）により凝固を刺激した。
方法－トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）
トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）は、血液中での凝固の効率を試験する方法の１つであり、外科手術および麻酔学で特に重要なものである。血餅の強度および弾性の変化のパターンから、血液にどの程度止血（血流停止）能があるか、また様々な因子が血餅形成にどの程度寄与しているかに関する情報が得られる。
この試験によって、血餅形成を表す４つの値、すなわちＲ値（または反応時間）、Ｋ値、角度およびＭＡ（最大振幅）が求められる。Ｒ値は、血餅が存在する証拠が最初に検出されるまでの時間を表す。Ｋ値は、Ｒの終了時から血餅が２０ｍｍに達するまでの時間のことであり、この値は血餅形成の速度を表す。角度とは、Ｋに達するときに作成した曲線の正接のことであり、Ｋと同じような情報が得られる。ＭＡは血餅強度を表す数値である。
結果
トロンビン生成：トロンビンの生成は凝固カスケードの基礎となる部分であり、したがって、特定の個体のトロンビン生成能を評価し、出血または血栓症のリスクと相関させることができる。それによりトロンビン生成過程のあらゆる段階（トロンビン生成の開始、増幅および阻害ならびに生成されるトロンビンの総量）が表される。使用する実験系によれば、トロンビン生成には、ｉｎ ｖｉｖｏの血液凝固に何らかの役割を果たす因子の大部分が影響を及ぼすと思われる。
Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ ＴＧＡによりトロンビン生成動態をモニターした（図５３）。
ＭＯＤ－５０１４またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎを添加したところ、用量依存性のトロンビンピーク値の増大ならびにラグ相およびピーク時間の短縮が観察された。
第二の試験では、ＴＦの存在下および低濃度のリン脂質ミセル（Ｒｅａｇｅｎｔ ＲＣｌｏｗ）の存在下、漸増濃度のＭＯＤ－５０１４またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を添加した。
予想された通り、試料に高濃度ＰＬを添加したときの方が顕著な反応が観察された。両化合物とも、低濃度のＰＬで最大ＴＧ応答に達し、凝固カスケードの適切な活性化に重要なものであることがさらに裏付けられた。図５３および図５４に示される結果から、ｉｎ ｖｉｔｒｏのトロンビン生成活性は、高濃度ＰＬ、低濃度ＰＬともにＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）よりもＭＯＤ－５０１４の方がわずかに低いことがわかり、ＰＰＰ ＦＶＩＩＩ欠乏血漿で得られたデータと一致する。
凝固効率：高力価ヒトＦＶＩＩＩ阻害性多血小板血漿（ＰＲＰ）にＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を添加し、ＣａＣｌ２およびｒｈＴＦトロンボプラスチンを添加して血餅形成を誘発した。Ｒおよび角度を評価した。図５５からわかるように、ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）はともに、同じように濃度依存性に凝固時間（Ｒ）を短縮し、高力価ＦＶＩＩＩ阻害血漿の血餅形成速度（角度）を増大させたが、ＭＯＤ－５０１４には凝固能のわずかな低下がみられた。以上の観察結果は、ＲＯＴＥＭによって得られた、ＣＴＰ付加が血餅形成に干渉することはないという結果をさらに裏付けるものである。
まとめ
ＦＶＩＩＩ高力価血漿を用いたＴＧおよびＴＥＧの結果に基づけば、ＭＯＤ－５０１４のＴＧおよび血餅形成の機序は、活性がわずかに低下しているものの、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）とほぼ同じであると思われる。これは、ＭＯＤ－５０１４が８３．４％のＦＶＩＩａからなり、Ｃ末端に３つのＣＴＰカセットが付加されていることから、モル数ではなく質量を基準に添加したときにＭＯＤ－５０１４中のＦＶＩＩａのモル含有量が少なくなった結果であり、このため、ｉｎ ｖｉｖｏで止血を維持するのに必要な濃度はＭＯＤ－５０１４の方がわずかに高くなるのではないかと思われる。最後に、リン脂質との機序は、ＦＶＩＩａにＣＴＰを付加した後も維持され得るものと思われる。
実施例１３：ＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の比較
試験の目的－（Ｉ）クエン酸添加乏血小板血漿（ＰＰＰ）中でのトロンビン生成（ＴＧ）によるＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の比較評価。（ＩＩ）クエン酸添加ＰＰＰ中でのトロンビン生成によるＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の組織因子（ＴＦ）親和性の比較評価。（ＩＩＩ）ＰＰＰクエン酸添加血漿を用いたトロンボエラストグラフィー（ＲＯＴＥＭ）によるＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の比較評価。
材料および方法
材料－凍結保存（－６０～－８０℃）した２．６ｍｇ／ｍｌのＭＯＤ－５０１４および２．６ｍｇ／ｍｌのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）。用量製剤の調製は不要であった。投与前に材料を室温まで解凍した。
方法（目的（Ｉ））－低リン脂質濃度および高低リン脂質濃縮でのトロンビン生成（ＴＧ）
Ｌｉｖｎａｔら（２００６，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．４（１）：１９２－２００；２００８，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌａ．１４（４）：７８２－７８６；および２０１１，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．１０５（４）：６８８－９５）に従ってトロンビン生成を測定した。簡潔に述べれば、プールした血漿に漸増濃度のＭＯＤ－５０１４またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を添加した。作業緩衝液としてＰＰＰ－Ｒｅａｇｅｎｔ ＬＯＷ（１μＭの組織因子を含有する）またはＭＰ－Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社、それぞれロットＰＰＬ１２０３／０１およびＭＰＲ１２０２／０１）を用いた。両試薬には４μＭのリン脂質が含まれていた。
（ａ）カルシウム再加のみ；および（ｂ）低ＴＦレベル（１ｐＭ）の２つの方法を用いてアッセイを実施した。
丸底９６ウェルマイクロタイタープレートに作業緩衝液２０μｌを入れた。表７３に記載するように、異なる濃度のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）またはＭＯＤ－５０１４を含むＦＶＩＩＩ欠乏血漿８μｌを緩衝液に添加した。
Figure 0007187505000107
蛍光発生基質／ＣａＣｌ２緩衝液（ＦｌｕＣａキットＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ－ＢＶ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社、ロットＦＬＢ１３０３／０１）２０μｌを添加することによりＴＧを開始させた。３９０ｎｍの励起フィルターおよび４６０ｎｍの発光フィルターならびに蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ、Ｌａｂ ｓｙｓｔｅｍ社、ヘルシンキ、フィンランド）を用いて蛍光を測定した。結果をプロットならびに導出パラメータ、すなわち、遅延時間、内因性トロンビン能（ＥＴＰ）およびピーク高さとして表し、特殊なコンピュータソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０．０．２９、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ社、マーストリヒト、オランダ）を用いて算出した。各試料を個別に二重反復で２回（実施１および２）試験した。二重反復の平均値を記載し、トロンビン標準物質（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社、ロットＴＣ１２０８／０１）と比較する。
方法－（目的（ＩＩ））－トロンビン生成（ＴＧ）
Ｌｉｖｎａｔら（２００６、２００８、２０１１）に従ってトロンビン生成を測定した。簡潔に述べれば、より高感度な用量依存性の応答が可能になるように、プールした血漿に３種類の極めて低い漸増濃度のＭＯＤ－５０１４またはＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を添加した（１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ）。４μＭリン脂質を含有するＭＰ試薬を作業緩衝液として用いた。下の表７４に記載するように、所定の各試料に漸増濃度のＴＦを添加し、ＴＧを評価した。
Figure 0007187505000108
所定濃度のＴＦでの各被験物質のＴＧをＥＴＰ、遅延時間およびトロンビンのピーク高さの測定により評価した。各試料を個別に二重反復で２回（実施１および２）試験した。二重反復の平均値を記載する。
方法－目的（ＩＩＩ）－回転トロンボエラストグラフィー（ＲＯＴＥＭ）
重度のＦＶＩＩＩ欠乏患者からプールした血漿に下の表７５に記載する４種類の濃度のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）またはＭＯＤ－５０１４を添加し、（ａ）カオリンの添加；（ｂ）低レベルのＴＦ；（ｃ）再分類の条件下で評価した。
Figure 0007187505000109
ＦＶＩＩＩ欠乏血漿３００μＬをカップに入れ、次いで２０ｍＭ ＣａＣｌ２（ＮＡＴＥＭ）、アレグ酸（ａｌｌｅｇｉｃ ａｃｉｄ）（接触活性化、ＩＮＴＥＭ）または低濃度の組織因子（１：１７００に希釈したＥＸＴＥＭ試薬）を添加したものを用いて、ＲＯＴＥＭ装置（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社、ミュンヘン、ドイツ）でＲＯＴＥＭ測定を実施した。ＲＯＴＥＭ試験を製造業者の指示通りに３７℃で実施し、最低４５分間実施した。以下の変数を用いた：凝固時間（ＣＴ、秒）、すなわち、ＣａＣｌ２導入から凝固開始までの時間；血餅増加を反映するアルファ角（α角、度）；および血餅強度を反映する最大血餅硬度（ＭＣＦ、ｍｍ）。
結果
目的（Ｉ）：トロンビン生成（ＴＧ）によるＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの比較評価
ＦＶＩＩａの止血効果の評価にはトロンビン生成がよく用いられてきた。ＦＶＩＩａはこれまでに、ＦＶＩＩＩ阻害血漿試料中でのトロンビン生成（ＴＧ）の変化を媒介することがわかっている。組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）を添加した血漿試料では、組織因子（ＴＦ）の不在下でＴＧが改善されたが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｒＦＶＩＩａのＴＧ能はＴＦの添加により増大した。ＦＶＩＩａは作用機序が複雑であるため、簡便で古典的な薬物動態アッセイを用いることはできない。トロンビンが生成の最終産物であることから、ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の薬物動態および潜在的有効性の評価にはＴＧアッセイを用いることが可能であると思われる。このアッセイは、治療中に阻害因子バイパス剤の薬物動態をモニターするのに適しており、治療に対する応答を予測するのに有用なものとなり得る。したがって、血漿中で生成するトロンビンの濃度をリアルタイムで測定することにより、凝固系の恒常性に関する有益な情報が得られる。
本試験の目的は、重度血友病Ａ血漿中でのＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）のｉｎ ｖｉｔｒｏトロンビン生成能を、ヒト初回投与（ＦＩＨ）試験で提唱される臨床用量と相関があると考えられる様々な濃度で比較することとした。これにより、ヒト初回投与（ＦＩＨ）試験への準備の一環として最小有効量の予測が可能になるものと考えられる。
カルシウム再加後のトロンビン生成の比較
重度血友病Ａプール血漿に様々な濃度のＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を添加した。この試験を２回反復し、その結果を下の表７６～７９ならびに図５６、５７、５８（Ａ～Ｅ）、５９（Ａ～Ｄ）、６０、６１、６２（Ａ～Ｅ）および６３（Ａ～Ｄ）に示す。
Figure 0007187505000110
Figure 0007187505000111
Figure 0007187505000112
Figure 0007187505000113
化合物を添加したところ、２種類とも用量依存性の応答が観察された。それぞれ４０μｇ／ｋｇおよび８０μｇ／ｋｇを再現すると推測される１．２５～２．５μｇ／ｍｌの低濃度では、遅延の増大およびＥＴＰの低下に反映されるように、ＴＧが不良であった（図５６、５７、６０および６１）。濃度が高くなるとＴＧプロファイルの顕著な改善がみられたが、いずれの被験化合物も、ＦＶＩＩＩで得られたＴＧを完全に回復させることはできなかった（図７１および７２；表８０）。
Figure 0007187505000114
以上の結果は、公開されている試験のものと一致し、ｈＦＶＩＩａは、ＴＧピーク値、ＥＴＰをはじめとするパラメータが小さいことからわかるように、トロンビンを是正する他の補充療法よりもバイパス剤としての効果が低いことを示唆している。重ね合せ解析（図５８（Ａ～Ｅ）、５９（Ａ～Ｄ）、６２（Ａ～Ｅ）および６３（Ａ～Ｄ））では、ＭＯＤ－５０１４のＴＧ応答がＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）よりもわずかに低いことが示唆され、このことは主として、長い遅延時間および低いトロンビンピーク値（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）よりも３０～４０％低いと推定される）に反映されている。これは、ＭＯＤ－５０１４が８３．４％のＦＶＩＩａからなり、Ｃ末端に３つのＣＴＰカセットが付加されていることから、モル数ではなく質量を基準に添加したときにＭＯＤ－５０１４中のＦＶＩＩａのモル含有量が少なくなった結果であると思われる。２回の独立した実施は互いに一致し、わずかな差がみられるものの、ほぼ同じ結果が得られた。
低ＴＦ濃度でのトロンビン生成の比較
重度血友病Ａプール血漿に低レベルのＴＦを添加したところ、バックグランドのＴＧ応答が観察され、被験試料中のＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）濃度の上昇に伴い増大した（図６４、６５、６６（Ａ～Ｅ）、６７、６８、６９（Ａ～Ｅ）、７０（Ａ～Ｃ）；表８１～８４）。
Figure 0007187505000115
Figure 0007187505000116
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Figure 0007187505000118
この試験では、両製品とも同じパターンの用量依存性の応答が観察されたが、ＴＦによる応答増強によって振幅がさらに増大した。ここでも同じく、ＭＯＤ－５０１４にカルシウム再加試験よりも顕著な活性の低下がみられ、両化合物を適切に重ね合せるにはＭＯＤ－５０１４の濃度を高くする必要があった（図６６（Ａ～Ｅ）および図７０（Ａ～Ｃ））。このことをさらに検討するため、のちに記載するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を実施して、ＭＯＤ－５０１４およびＦＶＩＩａのＴＦに対する親和性ならびにそれがＴＧに及ぼす影響をさらに検討した。
結論：両製品とも、重度血友病Ａプール血漿に添加すると用量依存性のＴＧ応答がみられ、臨床用量４０～８０μｇ／ｋｇを再現した濃度での最初の応答は不良であった。以上の結果は、４０～８０μｇ／ｋｇよりも低い用量ではｉｎ ｖｉｖｏでの応答が十分に得られないことを示唆しているものと推測される。さらに、ＭＯＤ－５０１４をＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）と同じ濃度で添加してもＴＧの成績は低く、臨床状況でＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）と同等の適切な初期止血効果を得るには濃度をわずかに高くする（３０～４０％）必要があることが示唆される。
目的（ＩＩ）：ＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）のＴＦに対する親和性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの比較評価
ＦＶＩＩａには少なくとも２つの独立したエフェクター機序、すなわち、凝固の外因系経路の古典的な誘導因子である第Ｘ因子（ＦＸ）の活性化であって、ＦＶＩＩａを介する組織因子（ＴＦ）依存性の活性化および高用量ＦＶＩＩａによる単球または血小板の内因性リン脂質（ＰＬ）表面でのＴＦ依存性作用があると考えられる。ＭＯＤ－５０１４はＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）よりも活性が低く、このことは、ＴＦ存在下でより顕著にみられた。両化合物が適切に重なり合うにはＭＯＤ－５０１４濃度を高くする必要があった（図６６（Ａ～Ｅ）および図７０（Ａ～Ｃ））。ＳＰＲおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの活性化アッセイによる測定では、ＭＯＤ－５０１４のＴＦに対する親和性はＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）と同程度であることが既に報告されているが、この試験の目的は、ＭＯＤ－５０１４およびＦＶＩＩａのＴＦに対するこのｉｎ ｖｉｔｒｏの親和性をＴＧによって検討することとした。
重度血友病Ａプール血漿に漸増濃度のＴＦの存在下、ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を漸増濃度で添加した。この試験を２回反復し、各実施の結果を図７３～８８および表８５～９０に示す。
Figure 0007187505000119
Figure 0007187505000120
Figure 0007187505000121
Figure 0007187505000122
Figure 0007187505000123
Figure 0007187505000124
固定用量のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）またはＭＯＤ－５０１４とともに漸増濃度のＴＦを添加することによってＴＧの成績がＴＦ依存性に上昇し、このことは、遅延時間の短縮ならびにＥＴＰおよびトロンビンピーク値の増大に反映されている（図７９（Ａ～Ｃ）、８０（Ａ～Ｃ）、８７（Ａ～Ｅ）および８８（Ａ～Ｅ））。両化合物は全用量で、ＴＦは５ｐＭ未満の濃度で、遅延時間の増大およびＥＴＰの低下によって反映されるように、不良ないし中程度のＴＧ応答が観察された。ＴＦ濃度が高くなると（５ｐＭ）、ＴＧプロファイルの顕著な改善がみられた（図７９（Ａ～Ｃ）、８０（Ａ～Ｃ）、８７（Ａ～Ｅ）および８８（Ａ～Ｅ））。しかし、いずれの被験化合物も、ＦＶＩＩＩで得られたＴＧを完全に回復させることはできなかった（図７１および７２ならびに表８２）。興味深いことに、一定のＴＦレベルでＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）またはＭＯＤ－５０１４の濃度を漸増させてもＴＧの成績は改善されず（図７９（Ａ～Ｃ）、８０（Ａ～Ｃ）、８７（Ａ～Ｅ）および８８（Ａ～Ｅ））、両化合物の適切な活性にはＴＦが重要であることがさらに強調される形となった。
重ね合せ解析によるＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）のＴＧプロファイルの比較（図７４（Ａ～Ｅ）、７６（Ａ～Ｅ）、７８（Ａ～Ｅ）、８２、８５（Ａ～Ｃ）、８６（Ａ～Ｅ）；表８９）では、ＴＦが存在しない場合またはＴＦ濃度が極めて低い（０．５ｐＭ）場合にＭＯＤ－５０１４の応答がわずかに減少する（２０～３０％低いと推定される）ことが示唆された。ＴＦレベルが増大すると、いずれの反復でも、全濃度のＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）で同程度の応答が観察される（図７４（Ａ～Ｅ）、７６（Ａ～Ｅ）、７８（Ａ～Ｅ）、８２、８５（Ａ～Ｃ）、８６（Ａ～Ｅ）；表８９）。
結論：この試験は、漸増濃度のＴＦの存在下で固定濃度の両化合物を添加することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果をさらに裏付けるものである。ＴＧ応答増大には主として試料中のＴＦの量が関与し、ＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）との間の生物学的類似性がさらに裏付けられた。
目的（ＩＩＩ）回転トロンボエラストグラフィー（ＲＯＴＥＭ）を用いたＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の活性の比較評価
この１０年の間に、トロンボエラストグラフィーが凝固障害の止血のモニタリング、輸血および凝固因子補充療法の有用なツールとして登場した。この点において、トロンボエラストグラフィーは、血友病、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子補充療法および阻害因子を有する血友病患者におけるａＦＶＩＩａの効果の評価に用いられてきた。ＲＯＴＥＭは、血小板減少症、グランツマン血小板無力症および血液希釈における凝固および抗線維素溶解剤の効果の評価に用い得る。この試験の目的は、重度血友病Ａ血漿を用いて、提唱される臨床用量と相関する様々な濃度のＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）について、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＲＯＴＥＭの成績を比較し、ＦＩＨ試験の準備の一環として最小有効量を評価することとした。
実験結果を表９１および９２に示す。
Figure 0007187505000125
この試験で対照化合物として用いたＦＶＩＩＩを添加しない場合およびＦＶＩＩＩ（１Ｕ／ｍＬ）を添加した場合の血漿凝固を表９１に示す。ＮＡＴＥＭ試験では、未処置血漿には凝固が観察されなかったが、血漿試料にＦＶＩＩＩを添加すると、わずかな血餅形成がみられた。これに対し、ＩＮＴＥＭ試験では、未処置血漿にも処置血漿にも血餅形成が起こったが、後者の方がはるかに強力なものであった（ＣＴが短く、α角が８倍であった）。最大血餅硬度（ＭＣＦ）はわずかに増大した。以上の結果から、血友病ＡのＦＶＩＩＩ補充の評価には内因系（ＩＮＴＥＭ）が有用な試験となり得ることが示唆される。
Figure 0007187505000126
表９２は、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿での血餅形成に対するＦＶＩＩａの効果を示している。
血漿の接触活性化を伴うカルシウム再加（ＩＮＴＥＭ試験）：２．５μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬのＦＶＩＩａで処置した血漿は、いずれの種類のＦＶＩＩａでも、未処置血漿に比してＣＴが短縮され、α角が徐々に増大した。ＦＶＩＩａ濃度を１５μｇ／ｍＬまで上昇させても、１０μｇ／ｍＬのＦＶＩＩａで処置した血漿のものとの間に血餅形成の変化の差はみられなかった。ＭＯＤ－５０１４とＮｏｖｏＳｅｖｅｎとの間に活性の差はみられなかった。
外因系経路の活性化を伴うカルシウム再加（ＥＸＴＥＭ試験）：ＭＯＤ－５０１４処置血漿、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ処置血漿ともに、未処置血漿に比してＣＴの減少およびＭＣＦの増大はみられなかった。両薬剤とも、２．５μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬで処置した血漿に同程度の血餅増加（α角）の増大が観察され、１５μｇ／ｍＬではそれ以上の変化はみられなかった。
結論：ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎの活性の比較に用いた様々なＲＯＴＥＭ試験のうち、ＩＮＴＥＭが最も信頼度の高いものであるように思われた。両化合物とも、ＩＮＴＥＭを用いた試験でもＥＸＴＥＭを用いた試験でも、ｉｎ ｖｉｖｏの用量８０μｇ／ｋｇを再現する用量２．５μｇ／ｍｌでは、未処置血漿よりも凝固時間がわずかに短縮され、α角が増大したことに反映されるように、応答が低いという結果が得られた。ＭＯＤ－５０１４およびＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の濃度を１０μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌに増大させたところ、血餅形成に対して用量依存性の刺激効果がみられた。これらの結果からほかにも、血餅形成に対する両薬剤の効果に本質的な差はなく、ＲＯＴＥＭの数値は両薬剤間で極めて類似していることがわかる。
実施例１４：血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ欠乏）イヌを用いたＭＯＤ－５０１４の薬物動態、薬力学および血友病凝固障害の是正の評価
試験の目的－本試験の目的は、重度血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ欠乏、ＦＶＩＩＩが０．０１％未満）イヌを用いてＭＯＤ－５０１４の薬物動態、薬力学および血友病凝固障害の是正を評価し特徴を明らかにすることとした。
試験系の妥当性
チャペルヒルの血友病Ａイヌのコロニーには、ＦＶＩＩＩバイオアッセイおよび発色アッセイでＦＶＩＩＩ活性が検出されず、ＥＬＩＳＡでもＦＶＩＩＩ抗原がほとんどないし全く検出されない（０．００５Ｕ／ｍｌ未満）という利点がある。このモデルは過去に、様々な凝固因子の薬理学的特徴を非臨床で明らかにすることの一環として用いられたことがある。このモデルは、特に止血の領域でヒトを生物学的に忠実に再現し、ヒト試験でこれまでに観察されているものと同等のＰＫ／ＰＤパラメータを得ることが可能であることが提唱されてきた。さらに、このモデルでは、臨床状況で止血の機能不全または是正を総合的に評価するスクリーニング手段の１つとして用いられているＴＥＧが１つの予測ツールとなることが示されているほか、ヒトとイヌの止血には相関があることも裏付けられている。
材料および方法
材料－凍結保存（－６０～－８０℃）したＭＯＤ－５０１４：２．６ｍｇ／ｍｌ。用量製剤の調製は不要であった。投与前に材料を室温まで解凍した。
予め製剤化した投与製剤は無菌状態で取り扱い、受け取ったときの状態で投与し、用量製剤の調製は不要であった。被験物質（ＭＯＤ－５０１４）は投与前に１回のみ解凍した。被験物質を投与する前に、凍結保管の場所から取り出し、室温まで解凍した。
方法：ｅｘ ｖｉｖｏ段階：ｉｎ ｖｉｖｏ試験の際の用量選択の土台となる最小有効量を確立するため、Ｋｎｕｄｓｅｎら（２０１１，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．１７（６）：９６２－９７０）に従ってｅｘ ｖｉｖｏ段階を実施した。
第一段階では、２匹のＦＶＩＩＩ欠乏イヌそれぞれに由来する新鮮な血液に添加したＭＯＤ－５０１４の用量依存性ｅｘ ｖｉｖｏ全血凝固時間（ＷＢＣＴ）およびトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）の評価を実施した。ＴＥＧおよびＷＢＣＴの成績が有意に改善された最低用量のＭＯＤ－５０１４を最小有効量とした。第一の段階および最小有効量の確立に基づき、ｉｎ ｖｉｖｏでの第二段階に用いる用量を選択した。
結果の再現性を確認するため、２匹のＦＶＩＩＩ血友病イヌそれぞれから新鮮な血液を採取し、個別に分析した。簡潔に述べれば、イヌ血液１５ｍＬをシリンジに採ってコニカルチューブに移し、ＦＶＩＩＩ欠乏イヌの推定体重が２０ｋｇ、各個体の血液量が４０ｍＬ／ｌｂ（８８ｍＬ／ｋｇ）であると仮定して、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４を同イヌに投与したときに予想されるｉｎ ｖｉｖｏのＣｍａｘと相関する最終濃度０．５６８μｇ／ｍＬ、１．１３６μｇ／ｍＬ、２．２７３μｇ／ｍＬ、４．５４５μｇ／ｍＬおよび９．９０９μｇ／ｍＬになるようにＭＯＤ－５０１４を添加した。
上のように添加を実施した血液について、被験物質を添加してから５分以内に以下の通りにアッセイした：
段階１：全血凝固時間（ＷＢＣＴ）：ＭＯＤ－５０１４を所定の最終濃度まで添加した血液１ｍＬをＷＢＣＴに用いた。簡潔に述べれば、全血凝固時間（ＷＢＣＴ）は、リー・ホワイト凝固時間を改変したものであり、２本のシリコンガラス管（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）、番号６４３１、Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ラザフォード、ニュージャージー州）を２８℃の水浴中で用いる。所定濃度のＭＯＤ－５０１４を添加した全血１ｍＬを２本のシリコン管に等量に分けた。タイマーを起動させた。１分後、一方の管を３０秒毎に傾け、他方はそのままにした。傾けた管で血餅が形成された後、２本目の管を血餅が形成されるまで３０秒毎に傾ける。２本目の管で完全にゲル化した血餅が形成されるまでにかかった時間をＷＢＣＴとして記録する。未処置の血友病ＡイヌのＷＢＣＴは一般に４０分超であるが、６０分を超えることもある。数値が６０分を超えた場合、試験を中止する。
段階２：トロンボエラストグラフィー：ＭＯＤ－５０１４を所定の最終濃度まで添加した血液１ｍＬとカオリン（ロット番号はＨａｅｍｏｓｃｏｐｅ社により与えられるもの）とを混合し、この混合物３６０μｌを試験用のカップに入れた。ＴＥＧの記録を約９０分間進行させた。ＴＥＧ値の典型的な範囲を下の表９３に記載する。
Figure 0007187505000127
有意な凝固改善がみられる最低用量をｉｎ ｖｉｖｏ試験の初回用量として用い、試験の第２段階でのちに記載する様々なアッセイを用いて測定される血液凝固および止血の適切なモニタリングを提案する。
方法：ｉｎ ｖｉｖｏ段階：この試験には、体重約２０ｋｇの未処置の雑種チャペルヒル血友病Ａイヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）６個体を用いた。イヌに用量５０μｇ／ｋｇ（Ｎ＝２）、２００μｇ／ｋｇ（Ｎ＝４）、４００μｇ／ｋｇ（Ｎ＝２）または６００μｇ／ｋｇ（Ｎ＝２）のＭＯＤ－５０１４をＩＶ投与した。投与は５分間のＩＶ注入の形で実施した。投与前ならびに投与から０．２５時間後、０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、３２時間後、４８時間後、７２時間後および９６時間後、濃度および活性の測定用に血液試料を橈側皮静脈の経皮穿刺により採取した。最大８日にわたる期間の間に、４個体にはＭＯＤ－５０１４を２回投与し、ほかの２個体にはＭＯＤ－５０１４を１回投与した。この試験は、投与をずらす漸増試験、すなわち、注射後毎回、時間内の凝固解析により次回の投与のタイミングを決定する試験としてデザインしたものである。
ｉｎ ｖｉｖｏ段階では、ＭＯＤ－５０１４の薬物動態および薬力学を解析し、ＷＢＣＴ、トロンボエラストグラフィー、ａＰＴＴ、基本的な臨床病理学検査および臨床観察（動物の行動に基づくもの）を評価した。被験物質の生物学的分析評価を実施した。
ｉｎ ｖｉｖｏ段階－Ａ部
第一の部では、第１日に初回用量５０μｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４を未処置イヌ２個体に注射し、ＷＢＣＴおよびＴＥＧの成績をモニターした。これらの数値がベースライン（投与前）値に戻ってから、２回目の用量２００μｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４を注射した。表９４にＡ部の概要を示す。
Figure 0007187505000128
ｉｎ ｖｉｖｏ段階－Ｂ部
第二の部の間およびＡ部終了後、第１日にさらに２個体の未処置イヌに注射を実施した。この個体も同じようにＷＢＣＴおよびＴＥＧの成績をモニターした。これらの数値がベースライン（投与前）値に戻ってから、２回目の用量を注射した。表９５にＢ部の概要を示す。
Figure 0007187505000129
ｉｎ ｖｉｖｏ段階－Ｃ部
Ｂ部の間およびＡ部終了時、第１日にさらに２個体のイヌに注射を実施した（表９６）。
Figure 0007187505000130
投与経路の妥当性
静脈内経路は、この被験物質をヒトに投与するための経路である。
用量レベルの妥当性
用量レベルは、既にｒｈＦＶＩＩａで試験され提唱されている用量範囲および今後第１相試験で評価の対象となる用量範囲に基づき選択したものである。
投与前に血友病Ａイヌでの最小有効量の予測を可能にするＭＯＤ－５０１４の止血能を評価するため、ｉｎ ｖｉｖｏのＩＶ投与後の最大予測レベルに近似する用量範囲の様々な用量をＷＢＣＴおよびＴＥＧ添加試験で評価した。両アッセイとも、ＭＯＤ－５０１４を最低用量（５０μｇ／ｋｇに相当する０．５６８μｇ／ｍＬ）で添加すると、Ｋｎｕｄｓｅｎら，２０１１と同じように、止血効果のわずかな改善がみられ、濃度の上昇に伴いさらに改善されたが、ＴＥＧの数値が完全に正常化することはなかった。得られた結果に基づき、ｉｎ ｖｉｖｏでさらに検討するべき最低用量は、評価した最低用量、すなわち５０μｇ／ｋｇとした。
投与
ＩＶによる投与とした。被験物質を８日間で最大２回投与した。被験物質の約１０％を１分程度かけて注射し、個体の明らかな臨床反応（例えば、蕁麻疹および気力低下）を観察した。個体が注射に対して耐容性があると考えられた場合、残りの９０％を１～５分かけて注入した。注射の時間および量を記録した。
投与量を変化させることによって様々な用量にした。被験物質を投与した後、生理食塩水洗浄を実施した。
投与前にイヌを絶食させた。
試験の評価
身体検査：イヌを試験に組み入れる前に全身検査を実施し、正常な個体のみを組み入れた。
ケージ外部からの観察：診察時にイヌの行動または全般的健康状態に関して懸念事項があれば記録した。
詳細な臨床観察：試験の注入段階で血液サンプリングを実施した。
試験開始時および試験開始後第７日～１４日の体重を記録した。
摂餌量：イヌに通常量の飼料を毎日給餌し、摂餌量を観察した。
臨床病理学検査
投与前、被験個体に臨床病理学的評価を実施した。ＦＯＢＲＬにより血小板計数、ＷＢＣ、ＨＣＴおよびＨＧＢを実施した。何らかの臨床事象が認められた場合、試料を採取し、さらなる臨床化学検査に供した。
血漿解析
試料の採取および処理
血液試料はいずれも、２１Ｇまたはこれと同等の翼状針を用いて橈側皮静脈の経皮穿刺により採取した。抗凝固薬剤（３．２％クエン酸ナトリウム［０．１２Ｍ］）１ｍＬの入った１０ｍＬシリンジに血液１０ｍＬを採取した。クエン酸ナトリウムは標準的な検査プロトコルの通り、血液採取時に１：１０に希釈された。血液試料１０ｍＬをシリンジから１５ｍＬポリプロピレンコニカルチューブに移し、溶血が起こさず確実に混ざるよう穏やかに逆さまにした。次いで、血液を４℃、３０００ｇで１５分間、ブレーキをかけずに遠心分離した。遠心分離後、血漿上清を新たな１５ｍＬポリプロピレンコニカルチューブに移し、４℃、３０００ｇでさらに７分間、ブレーキをかけずに遠心分離して、血漿をほかの血液物質から十分に分離した。２回目の遠心分離の後、各試料の血漿をポリプロピレンピペットでポリプロピレンチューブに移し、直ちに－８０℃の冷凍庫に入れた。
血漿を１００μＬずつ複数に等分したものをＭｉｃｒｏｎｉｃｓチューブ（またはこれと同等のもの）に移し、急速凍結させた（－８０℃）。注入後、全個体にＷＢＣＴおよびＴＥＧを除く全アッセイ（酵素結合免疫測定［ＥＬＩＳＡ］、活性化部分トロンボプラスチン時間［ａＰＴＴ］およびトロンビン生成アッセイ［ＴＧＡ］）をバッチで実施し、サンプリングを完了させた。
ＭＯＤ－５０１４ ＥＬＩＳＡ
ＭＯＤ－５０１４を特異的かつ選択的に検出するアッセイに市販の抗ＦＶＩＩａ抗体（Ａｂ）および社内製ポリクローナル抗ＣＴＰ Ａｂを用いてＭＯＤ－５０１４ ＥＬＩＳＡを実施した。投与前（すなわち、ベースライン）、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、３２時間後、４８時間後、７２時間後および９６時間後にクエン酸血漿試料を採取した。
ＦＶＩＩａ凝固活性
血友病イヌの基質でＦＶＩＩａ活性を定量化するよう調整した市販のＳＴＡＣＬＯＴ ＶＩＩａ－ｒＴＦキット（参照番号００２８１、Ｓｔａｇｏ社）を用いてＦＶＩＩａ凝固活性を測定した。
ＷＢＣＴ
採取後、２管法によりＷＢＣＴアッセイを２８℃で実施し試験した。全血１ｍＬを１ｍＬシリンジで採取し、２本のシリコン管（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）、番号６４３１、Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ラザフォード、ニュージャージー州）に等分した。１本目の管を３０秒毎に傾けた。血餅形成後、２本目の管を傾け、３０秒毎に観察した。評価項目を２本目の管の凝固時間とした。この試験では、投与前（すなわち、ベースライン）、１５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後および９６時間後に、またはベースライン値に達するまで、ＷＢＣＴをＦＯＢＲＬにより実施した。
ＴＥＧ
各サンプリング時点でＴＥＧ用の血液を採取し、採取後２分以内にＴＥＧ ５０００ Ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを製造業者の指示通りに用いＦＯＢＲＬ／ＵＮＣで試験した。簡潔に述べれば、血液の最初の３ｍＬを捨てた後、血液１ｍＬを採取し、カオリン（ロット番号Ａ－３０－０５、Ｈａｅｍｏｓｃｏｐｅ社製）と混合した。この予め混合した血液／開始剤３６０μＬを機器内に置き分析した。ＴＥＧの記録を約６０～９０分間進めた。この試験を投与前（すなわち、ベースライン）、１５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後および９６時間後に、またはベースライン値に達するまで実施した。
ａＰＴＴ
ＳＴ４凝固測定器（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社、アニエール、フランス）を用いＦＯＢＲＬ／ＵＮＣでａＰＴＴを測定した。被験混合物は、等しい割合の部分トロンボプラスチン試薬（Ｔｒｉｎｉｃｌｏｔ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社）、０．０２５Ｍ ＣａＣｌ２およびクエン酸添加被験血漿からなるものとした。試料を投与前（すなわち、ベースライン）、１５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後および９６時間後に試験した。
データ解析
Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、サニーベール、カリフォルニア州）を用い、各個体のデータについてノンコンパートメント解析および薬物動態モデリングを実施した。解析は、ＭＯＤ－５０１４の血漿中濃度データのほか、初期比活性を１５，５６３単位／ｍｇと仮定し活性データについても実施した。
ノンコンパートメント解析にはＩＶ注入用のプログラムを用いた。台形法を用いて０時間から最後測定可能時点までの曲線下面積（ＡＵＣ０－ｔ）を推定した。最後の３つ以上の時点にわたる対数線形回帰を用いて消失定数（λ）を推定し、これを用いて以下の方程式から終末相半減期（ｔ１／２）および０時間から無限時間までのＡＵＣ（ＡＵＣ０－∞）を推定した。
Figure 0007187505000131
（式中、Ｃｔは最終測定可能濃度である）。用量をＡＵＣ０－∞で除した商から血漿クリアランス（ＣＬ）を算出した。最高濃度（Ｃｍａｘ）およびそれが観察された時間（Ｔｍａｘ）をデータから直接求めた。この解析はＩＶ注入に基づくものであったため、注入開始時の濃度は０に設定し、初期分布容積は算出しなかった。
１コンパートメントモデル、２コンパートメントモデルおよび３コンパートメントモデルの評価ならびに様々な重み付けスキームを含め、薬物動態モデリング、様々なモデルおよびフィッティング戦略を検討した。
実測濃度と実測濃度の相関、パラメータ推定値と誤差推定値の相対値およびモデル同士を比較する数学的評価である赤池の組入れ基準に基づきモデルを評価した。
時間データに対する血漿中濃度および活性が最も良く示されたのは２コンパートメントモデルであった。濃度データは予測濃度の２乗の逆数によって重み付けし、活性データは予測濃度の逆数によって重み付けした。重み付けスキームは、初期の高濃度が曲線フィットに過度の影響を及ぼすのを防ぐものである。このモデルを図９０に示す。
このモデルから中央コンパートメントの分布容積（Ｖ１）、消失速度定数ｋ１０ならびにコンパートメント間の速度定数ｋ１２およびｋ２１の推定値が得られる。中央コンパートメントとは、薬物を投与し試料を採取するコンパートメント、この場合、血管内空間のことである。コンパートメント間の速度定数から曲線の分布相および消失相であるαおよびβに関連する速度定数を算出する。主要パラメータから算出する他のパラメータには、ＡＵＣ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＣＬ、ＭＲＴのほか、曲線の分布相および消失相に関連する半減期（ｔ１／２α、ｔ１／２β）が含まれる。
結果
ｅｘ ｖｉｖｏ試験の結果：
ＷＢＣＴ
血友病Ａイヌ２個体それぞれの血液に、投与後のＭＯＤ－５０１４のｉｎ ｖｉｖｏ Ｃｍａｘがそれぞれ５０，１００，２００，４００，８００μｇ／ｋｇに等しくなるように算出される最終濃度０～９．０９μｇ／ｍＬの範囲でＭＯＤ－５０１４を添加した後、ＷＢＣＴを測定した。ベースライン（前）のＷＢＣＴ値には２個体間で差がみられたが、血友病Ａ個体で許容される範囲内であった（表９７を参照されたい）。
Figure 0007187505000132
表９７および図８９に示されるように、ＭＯＤ－５０１４濃度の上昇とともにＷＢＣＴの有意な減少が観察され、最も高いＭＯＤ－５０１４濃度範囲で最適な是正（内部の臨床検査評価に基づき約３０分）が得られた。
イヌＰ２２は、観察されたＷＢＣＴベースラインが低く、効果が得られるＭＯＤ－５０１４濃度も低かったが、イヌＯ９３は、ベースライン値が高いため、目的ＷＢＣＴ値に達するのに必要なＭＯＤ－５０１４濃度も高かった。
トロンボエラストグラフィー
様々な用量のＭＯＤ－５０１４を血友病Ａイヌ２個体の全血に個別に添加し、用量範囲５０～８００μｇ／ｋｇのＩＶ注射の直後の関連する血中濃度のシミュレーションに用いた。カオリン－ＴＥＧパラメータに用量依存性の改善がみられ、アッセイのばらつきまたは技術的誤差により２個体間にいくぶん変動およびばらつきがみられた（表９８）。
Figure 0007187505000133
得られた数値は、ＭＯＤ－５０１４の比活性が低い（ＦＶＩＩａ比活性が２．３～２．５倍低い）ことおよびＦＶＩＩａ含有量が低い（７２．３％）ことを考慮に入れると、組換えｒｈＦＶＩＩａに関してＫｎｕｄｓｅｎら（２０１１）が報告している数値に匹敵するものであった。
結論：両アッセイとも、止血効果は、５０μｇ／ｋｇに相当する最低用量０．５６８μｇ／ｍＬで改善され、ＴＥＧ値の完全な正常化には至らなかったものの、濃度上昇とともにさらに改善し、Ｋｎｕｄｓｅｎら（２０１１）との一致がみられた。
ｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果：
生存中の臨床検査
いずれの注入も高い耐容性が認められた。注射部位の反応は認められなかった。ヘモグロビン、ヘマトクリット、白血球数または血小板数の有意な変化は認められなかった。試験期間中、食欲をはじめとする行動に変化は認められなかった。試験期間中、いかなる臨床事象もみられなかったため、それ以上の臨床化学パラメータ（例えば、肝酵素および腎機能）の検査は実施しなかった。
血漿、薬物動態および凝固の解析
薬物動態データを下の表９９および１００に示す。
図９１および図９２にＭＯＤ－５０１４の血漿中濃度および活性の平均値を経時的に示す。血漿中濃度は、最初の８～１２時間に初期の比較的速い減少を示し、その後、緩やかに減少している。活性は経時的に低下し、５０μｇ／ｋｇのグループでは約３２時間後に、２００μｇ／ｋｇおよび４００μｇ／ｋｇのグループでは４８時間を超えてから、アッセイの下限値（１２．６ｍＵ／ｍＬ）を下回っている。用量６００μｇ／ｋｇのグループの７２時間以降の活性データについては、結果が時間とともに増大し２個体の間で一致がみられないため、解析から除外されている。
図９３（Ａ～Ｂ）～図９６（Ａ～Ｂ）に各イヌの濃度および活性を一緒にプロットする。
用量５０μｇ／ｋｇおよび２００μｇ／ｋｇのグループ（図９３（Ａ～Ｂ）および９４（Ａ～Ｄ））では、注入後８～１２時間は濃度と活性がほぼ同じパターンに従い、その後、濃度は横ばい状態になる傾向がみられたが、活性はアッセイのレベルを下回るまで低下し続けた。４００μｇ／ｋｇおよび６００μｇ／ｋｇのグループ（図９５（Ａ～Ｂ）および９６（Ａ～Ｂ））では、注入直後から活性の方が濃度よりもいくぶん低下が速いように思われる。濃度の曲線は横ばい状態になる傾向がみられたが、活性の曲線は、アッセイのレベルを下回るまで低下し続けるか、アッセイ限界未満に達するまで速く低下し、６００μｇ／ｋｇのグループの場合、解析から除外された。
ノンコンパートメント解析の結果について、濃度データおよび活性データをそれぞれ表９９および表１００に示す。ノンコンパートメント解析の結果から、いずれの場合もＡＵＣ０－ｔがＡＵＣ０－∞とほぼ同じ大きさであることがわかり、このことは、サンプリング持続時間が薬物動態プロファイルおよび薬力学プロファイルを記述するのに十分なものであったことを示している。図９７（Ａ～Ｊ）および図９８（Ａ～Ｊ）に各イヌの時間に対する濃度および活性を示す。これらのグラフでは、推定される終端の傾きが実線で表されている。各グラフにはこのほか、決定係数（ＲｓｑおよびＲｓｑ＿補正）、傾きの推定に用いたポイントの数および終末相ｔ１／２（ＨＬ＿Ｌａｍｂｄａ＿ｚ）を含め、終端の傾きの推定に関連する情報が記載されている。
血漿中濃度および活性レベルは、（２００μｇ／ｋｇグループに）例外が１つあるものの、ともに最初に測定した時点（０．２５時間）が最も高かった。濃度および活性はともに、用量群全体にわたって、Ｃｍａｘ／用量および推定ＣＬパラメータによって示されるように、用量と相関があり、用量にほぼ比例していた。濃度および活性の両方の測定値により、最低用量でのＣＬがいくぶん速いと思われた。最低用量では、濃度および活性が３２時間後にアッセイ限界未満まで低下し、この用量での薬物動態の特徴を完全に明らかにすることを制限している可能性が考えられた。濃度測定値と活性測定値との比較に基づくＣＬに差はなかった。濃度に基づくｔ１／２推定値は、用量４００μｇ／ｋｇおよび６００μｇ／ｋｇ（４０時間超）の方が２００μｇ／ｋｇのグループ（１９．３時間）および５０μｇ／ｋｇのグループ（７．７６時間）よりもはるかに長かった。活性に基づく終末相ｔ１／２は約３～５時間であり、グループ全体でほぼ同じであった。
モデルに基づくＡＵＣおよびＣＬの推定値は、ノンコンパートメント解析から求めたものと極めてよく一致していた。モデルから求めた見かけの分布容積は、血漿中濃度に基づくものが約９０～１２０ｍＬ／ｋｇ（低用量群の方が大きい）、活性に基づくものが４０～７０ｍＬ／ｋｇであった。血漿測定値および活性測定値についてモデルにより推定したｔ１／２βはともに、ノンコンパートメント解析により推定した終末相ｔ１／２と極めて類似していた。
ＭＲＴとは、個々の薬物分子が循環血中に存在する時間の推定値のことである。活性に基づくＭＲＴ推定値は用量群全体で一致しており、約４～７時間であった。濃度に基づくＭＲＴは、２００μｇ／ｋｇおよび５０μｇ／ｋｇのグループ（それぞれ１６．６時間および１１．７時間）と比較して、これより高用量（約２５時間）の方が長かった。
ノンコンパートメント解析により濃度データおよび活性データについて算出したパラメータを下の表にまとめる。薬物動態の特徴付けがアッセイ感度によって制限されたと思われる用量５０μｇ／ｋｇのグループを除いて、血漿クリアランスは、血漿中濃度によって測定しても活性によって測定しても、用量群全体でほぼ同じであった。
Figure 0007187505000134
Figure 0007187505000135
血友病イヌにｒｈＦＶＩＩａを投与した場合、その半減期は抗原ＦＶＩＩａレベルに基づくものが３時間、活性に基づくものが１．８時間であることが既に報告されている（Ｋｎｕｄｓｅｎら，２０１１、下の表１０１にまとめる）。
Figure 0007187505000136
ＦＶＩＩａにＣＴＰを付加することにより、抗原レベルに基づく半減期および活性レベルに基づく半減期がそれぞれ１９．３～４５時間および４．７２～５．２２時間まで大幅に増大し、これにより製品の半減期が、報告されているデータの平均３～５倍に延びた。クリアランスも同様に影響を受け、Ｋｎｕｄｓｅｎら（２０１１）の３分の１～２分の１と大幅に減少した。
全血凝固時間（ＷＢＣＴ）の解析
ベースライン値に達するまでＷＢＣＴをモニターすることを目的として、投与前（すなわち、ベースライン）、１５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後のＦＯＢＲＬによる採取後にＷＢＣＴを試験した。表１０２に示されるように、全個体の投与前のＷＢＣＴの平均時間は実際、血友病イヌで予想されるＷＢＣＴの低い方の範囲（５０～３５分）に収まっていた。
Figure 0007187505000137
血友病イヌを用いた全血カオリン－トロンボエラストグラフィー（ＷＢカオリン－ＴＥＧ）によるＭＯＤ－５０１４の特徴付け
ＭＯＤ－５０１４投与後の所定の時点での全個体および全用量のカオリン－ＴＥＧパラメータをモニターした。この特異的解析の目的は、ＴＥＧの経時的動態の特徴を明らかにし異なる個体全体の様々なパラメータ（Ｒ、Ｋ、角度、ＭＡ）、個体内の用量依存性応答が正常化される最小量を評価し、最終的には、ＭＯＤ－５０１４投与後のＴＥＧプロファイル全体と、公開されているｒｈＦＶＩＩａのデータおよび健常イヌで得られた正常値（Ｋｎｕｄｓｅｎら，２０１１）とを同じ用量範囲で比較することとした。個々のデータを図１０１（Ａ～Ｄ）、１０２（Ａ～Ｄ）、１０３（Ａ～Ｄ）、１０４（Ａ～Ｄ）、１０５（Ａ～Ｄ）および１０６（Ａ～Ｄ）に示す。
ＭＯＤ－５０１４を様々な用量で投与した場合の全血カオリン－ＴＥＧの成績
２個体に初回用量５０μｇ／ｋｇを投与しても、投与後のＲ、Ｋ、角度およびＭＡの数値値が芳しくないことからわかるように、ＴＥＧの成績に有意な改善をもたらすことはできなかった（個体Ｐ１４；図１０２（Ａ～Ｄ））が、用量を２００μｇ／ｋｇに増大させたところ、パラメータの大部分が改善された。第二の個体（Ｎ０６）でも、５０μｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４の投与によりＴＥＧの数値が改善することはなく、これは、投与前のＴＥＧの数値が一部正常化されていた結果であると思われ、それが投与後の応答不良に直接影響を及ぼした可能性が考えられるが、投与後さらに改善されることはなかった。以上のことに基づき、用量５０μｇ／ｋｇは、被験イヌの止血異常を補い是正するのに十分なものではないと考えられた。
２００μｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４を投与したところ、大部分の個体のＴＥＧパラメータが依然として正常範囲未満の数値までの是正にととまったが、用量５０μｇ／ｋｇよりも有意に顕著な効果が得られた。用量４００μｇ／ｋｇでは、ＴＥＧの数値にわずかな改善がみられたほか、応答時間が長くなった（図１０２（Ａ～Ｄ）；１０３（Ａ～Ｄ）および１０４（Ａ～Ｄ））。異なる２個体に６００μｇ／ｋｇで投与したところ、一方の個体の応答（Ｊｏａｎｉｅ；図１０５（Ａ～Ｄ））が４００μｇ／ｋｇを投与した個体と同程度のものとなった。個体Ｎ０５のＫ時間、角度およびＭＡの数値（図１０６（Ａ～Ｄ））は正常範囲に達したが、これは、投与前の数値の改善および個体間変動の結果であるとも考えられた。様々な用量のＭＯＤ－５０１４を投与することによりＴＥＧの数値を一部是正することができ、ＭＯＤ－５０１４の最適な最小有効量は２００～４００μｇ／ｋｇの範囲であったと考えられる。
ＭＯＤ～５０１４の全血カオリン－ＴＥＧの用量依存性応答の個体内変動
同一個体に高い用量を注射したところ、個体内の用量依存性の改善が観察された。時点によるばらつきがいくぶん観察されたが、これは正常な生物学的変動が反映されたものであると考えられる（図１０１（Ａ～Ｄ）、１０２（Ａ～Ｄ）、１０３（Ａ～Ｄ）、１０４（Ａ～Ｄ）、１０５（Ａ～Ｄ）および１０６（Ａ～Ｄ））。図１０１（Ａ～Ｄ）、１０２（Ａ～Ｄ）、１０３（Ａ～Ｄ）、１０４（Ａ～Ｄ）、１０５（Ａ～Ｄ）および１０６（Ａ～Ｄ）に示されるように、２００μｇ／ｋｇおよび４００μｇ／ｋｇ（ＢｌｏｎｄｉｅおよびＪｏｓｉｅ）と投与した場合に改善が最も顕著であった。
ＭＯＤ～５０１４の全血カオリン－ＴＥＧの結果の個体間での再現性（個体間変動）
図１０１（Ａ～Ｄ）、１０２（Ａ～Ｄ）、１０３（Ａ～Ｄ）、１０４（Ａ～Ｄ）、１０５（Ａ～Ｄ）および１０６（Ａ～Ｄ）で観察されるように、ＭＯＤ～５０１４の投与後にＴＥＧの数値が改善されたが、測定時間全体を通じたプロファイルには個体による差がみられた。個体毎に遺伝的背景が異なることおよび投与前の数値が異なることを考慮すれば、これは生物学的変動の結果であると考えられる。臨床状況では、同じ用量を投与した個体間でも個々のＴＥＧの数値に差が生じ、最終的にＦＶＩＩａの効果および出血制御能の差となって現れるものと思われ、観察された変動は実際のところ、この臨床状況を再現していると言える。
長時間作用型製品としてのＭＯＤ－５０１４
ＭＯＤ－５０１４とｒｈＦＶＩＩａの是正能の比較から、ＭＯＤ－５０１４の最大値および最小値は報告されているｈＦＶＩＩａの結果と極めて類似していることが示唆される。しかし、ＭＯＤ－５０１４では、反応持続時間の著明な改善が観察された。ｈＦＶＩＩａの投与では、解析したｈＦＶＩＩａのパラメータの大部分が投与４時間後にベースラインまで再び低下している（図１０７（Ａ～Ｄ））、ＭＯＤ－５０１４では、ベースライン値に達するのが投与後２４時間になるまで効果を持続させことが可能であり、応答がさらに保持および持続される（図１０８（Ａ～Ｄ）；黒い矢印を付した部分）。このデータは、血友病イヌではＴＥＧ応答の持続時間がＦＶＩＩａの短時間のＰＫ－ＰＤプロファイルと相関することを示唆するものであり、これについてはさらに検討し、その結果、ＭＯＤ－５０１４投与によって応答時間が長くなることが裏付けられた。
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の成績
活性化因子であるＴｒｉｎｉｃｌｏｔ試薬を用いて６０秒間インキュベートしたところ、イヌ血友病Ａ血漿のａＰＴＴ値は６５．６秒であった（データ不掲載）。ＭＯＤ－５０１４投与後、ａＰＴＴは４０秒まで用量依存性に減少した。この情報を既に報告されているデータと比較したところ、ＦＶＩＩＩ欠乏イヌに１９３μｇ／ｋｇのｒｈＦＶＩＩａを投与する前と投与した後に得られた数値（Ｂｒｉｎｋｈｏｕｓら，１９８９）と極めて類似していることがわかり、後ろ向き解析では、２００μｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４を投与すると効果の持続時間が長くなり、その後、投与２４時間後にベースラインのａＰＴＴ値戻ることが示唆される。
結論：この試験では、ＦＶＩＩＩ欠乏イヌを用いて新規な長時間作用型ＦＶＩＩａ（ＭＯＤ－５０１４）の安全性、ＰＫ、ＰＤおよび血友病凝固障害是正能を評価した。ＭＯＤ－５０１４を関連する臨床用量で投与し、最初に、イヌで考えられる最小有効量をｅｘ ｖｉｖｏ試験に基づき確立した。
ＭＯＤ－５０１４は、いずれのイヌでも高い耐容性を示し、有害事象は観察されなかった。ＰＫ解析およびＰＤ（活性化測定）解析ともに用量依存性の応答が観察され、さらに、公開されているパラメータ（Ｋｎｕｄｓｅｎら，２０１１）との比較でＭＯＤ－５０１４の長時間作用型の特性が裏付けられた。
これまでに、組換えヒトＦＶＩＩａが血友病イヌの出血の治療に有効であることが明らかにされている。ＭＯＤ－５０１４を２００～４００μｇ／ｋｇの用量で投与したところ、ＴＥＧ凝固プロファイルの著明な改善が観察されたが、これより低い５０μｇ／ｋｇの用量ではＴＥＧの数値を是正することはできず、この用量はイヌの最小有効量未満であることが示唆された。ＭＯＤ－５０１４投与後に用量依存性の応答が観察されたが、個体間のばらつきが予想以上に大きく、生物学的変動の結果であると考えられた。ＭＯＤ－５０１４の成績を公開されているデータと比較したところ、ＭＯＤ－５０１４の方が低い用量（それぞれ２７０μｇ／ｋｇおよび２００μｇ／ｋｇ）で顕著で長時間持続する効果が得られることがわかった。ＭＯＤ－５０１４のｉｎ ｖｉｖｏ活性もａＰＴＴ値の減少によって示され、凝固系の活性化が保持されることがさらに裏付けられた。
一般に、血友病イヌを用いてＭＯＤ－５０１４の試験を実施することには、マウスおよびラットなどのげっ歯類モデルよりも優れた利点がいくつかある。血友病イヌは、ヒトのものを忠実に再現した疾患表現型を示し、さらに、体重のほか、ＦＶＩＩａに必要な条件および薬物動態特性の点でもヒトに匹敵するのはイヌの方である。
全体をまとめると、この研究では、特に止血に関してヒトを生物学的に忠実に模倣することが既に明らかにされている関連する十分に確立されたモデルにおいてＭＯＤ－５０１４が長時間存在することがさらに裏付けられた。この試験で得られたデータは、大きな価値があるほか、ＭＯＤ－５０１４が大型動物に安全で有効な長時間作用型ＦＶＩＩａであり、阻害因子を有する血友病患者の予防的治療およびオンデマンド治療の両方に薬物として使用できる可能性があることを初めて示した証拠となる。したがって、ＭＯＤ－５０１４は、投与頻度を減らし予防的使用を可能にすることによって患者に多大な利益をもたらす絶大なる可能性を秘めたものである。
実施例１５：Ｗｅｓｓｌｅｒウサギモデルを用いたＭＯＤ－５０１４と組換えＦＶＩＩａの単回投与後の血栓形成能の比較評価
目的：この試験の目的は、それぞれＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する阻害因子を有する血友病ＡまたはＢの患者を治療するためのＭＯＤ－５０１４を評価することとした。この試験の別の目的は、投与頻度の減少を目的とする自然出血（例えば、関節出血）のオンデマンド治療ならびに患者の臨床状態および生活の質を大幅に改善し得る週２～３回の投与レジメンが予想される予防的使用についてＭＯＤ－５０１４を評価することとした。
この試験のまた別の目的は、Ｗｅｓｓｌｅｒら（１９５９）（Ｓｅｒｕｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｎｏｖ；２０：８６４－７４）；およびＷｅｓｓｌｅｔら（１９５９）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｓｓａｙ ｏｆ ａ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｍ ｓｅｒｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １４，９４３－９４６）によって記載されている半定量的方法を用いて被験物質ＭＯＤ－５０１４の血栓形成能を評価することとした。用量レベル０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇで組換えＦＶＩＩａのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の陰性対照群および陽性対照群と比較した。
この試験は、麻酔をかけたウサギを用いて実施した。
妥当性：この試験の目的は、ＭＯＤ－５０１４の血栓形成能を評価することとした。Ｗｅｓｓｌｅｒウサギモデルは静脈血栓症を評価するための古典的モデルである。このモデルの感度は、（１）ウサギは内因系凝固能が高く凝固因子レベルがヒトよりも高いことおよび（２）活性化因子に曝露すると、静脈うっ血によって組織に多大な損傷が起こり、一般に血栓形成の素因が大きくなること（Ｗｅｓｓｌｅｒら（１９５９），Ｋａｒｇｅｓら（１９９４）（Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌｓ．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．Ｊｕｎ；４４（６）：７９３－７．））に基づくものである。ウサギうっ血モデルを用いて組換えヒトＦＶＩＩａの血栓形成を検討したこれまでの試験（Ｄｉｎｅｓｓら（１９９２）（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）ｉｎ ａ ｒａｂｇｉｔ ｓｔａｓｉｓ ｍｏｄｅｌ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ６７（２），２３３－４１））に基づき、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎを陽性対照に用いた。
試験の概要：陰性対照、陽性対照およびＭＯＤ－５０１４を、臨床投与経路である静脈内に１回投与した。
用量選択の理論：用量は、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎで実施されたウサギうっ血試験（Ｄｉｎｅｓｓら（１９９２）（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）ｉｎ ａ ｒａｂｂｉｔ ｓｔａｓｉｓ ｍｏｄｅｌ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ６７（２），２３３－４１））で得られたデータに基づき、第１～２ａ相臨床試験で予想されたＭＯＤ－５０１４の用量を考慮に入れて選択したものである。低用量は、μｇ／ｋｇで表される公式の低臨床用量とし、これは第１～２ａ相試験で低用量の１つとして使用することがＦＤＡによって承認されているもの（５０μｇ／ｋｇ）である（のちの実施例１６を参照されたい）。高用量は４００μｇ／ｋｇとし、これは第１～２ａ相臨床試験で予想された最高臨床用量をμｇ／ｋｇで表したものである。
材料および方法
被験物質：仕様、命名および保管
被験物質をＭＯＤ－５０１４、ＥＲバッチ１０１７２９５（使用期限：２０１５年４月）と命名した。被験物質は使用時以外、密閉容器で保管した。
保管条件：冷凍（－６０～－９０℃）。
陰性対照は被験物質の溶媒とし、２０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１３．３ｍＭグリシン、ｐＨ６．４と命名した。
保管条件：冷蔵（２～８℃）。
陽性対照物質をＮｏｖｏＳｅｖｅｎと命名した。
名称：ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（ＭＯＤ－５０００と称する）
バッチ番号：０５０１１５
仕様／外観：冷凍状態で無色透明の液体
粉末バイアルの使用期限：２０１６年８月
保管条件：冷凍（－６０～－９０℃）
麻酔剤をケタミン／キシラジンと命名した。
麻酔剤は使用時以外、密閉容器に入れ、室温（通常、１５～２５℃）で光を避けて保管した。
被験物質（ＭＯＤ－５０１４）および陽性対照製剤
調製
被験物質を氷上で２０～３０分間解凍した。毎日使用前、被験物質（２．６ｍｇ／ｍｌ）３ｍｌに製剤緩衝液４．８ｍｌを加えて最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。投与量を変化させることによって様々な用量にした。
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎを氷上で２０～３０分間解凍し、受け取ったときの状態で使用した。投与量を変化させることによって様々な用量にした。
麻酔剤
麻酔剤をケタミン／キシラジンと命名した。麻酔剤は使用時以外、密閉容器に入れ、室温（通常、１５～２５℃）で光を避けて保管した。
被験動物
Ｈａｒｌａｎ社（ＵＫ）から雄Ｈｓｄｌｆ：（ＮＺＷ）（ニュージーランドホワイト）ウサギを計４０匹入手した。投与当日の体重は２．４５～３．４０ｋｇであった。
実験デザイン
試験手順で収容ケージから取り出すとき以外は、飼料および水を自由摂取させた。
ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射によって麻酔を導入し維持した。麻酔導入後、ウサギを加温ブランケットの上に置いた。直腸プローブで体温をモニターし、許容限界内（通常、３５～３９℃）に維持した。
頸静脈の両側を切開しやすくするため頸部の腹側を剃毛した。静脈の位置を確認してから、１～１．５ｃｍの距離にある位置で遠位結紮糸および近位結紮糸を通したが、締めることはしなかった。
用量に合わせた量を用いて、（結紮する１つ目の頸静脈と）反対側の耳静脈内に被験物質、陽性対照または溶媒を注射した（下の表を参照されたい）。
試験に用いた処置を下の表１０３に示す：
Figure 0007187505000138
投与直後、しかるべき頸静脈の近位端の結紮糸を締めることによって、これを循環から孤立させた。次いで、残りの頸静脈にこの作業を繰り返した。２５秒後、両方の遠位結紮糸を締めた。締めてから１０分後、１つの静脈区画（いずれの個体も同じになるようにした）を慎重に摘出し、３．８％クエン酸ナトリウム溶液の入ったペトリ皿に移し、切開した。下の表１０４に記載する通りに血栓の形成を評価した。次いで、締めてから３０分後、残りの頸静脈にこの手順を繰り返した。
Figure 0007187505000139
統計解析
１０分後および３０分後の血栓形成スコアを解析に供した。各時点のデータを別個に解析した。ウィルコクソン順位和検定を用いて以下の目的とする比較を実施した：
グループ１対グループ２～８
グループ３対グループ７
グループ５対グループ８
結果
結果を表１０５にまとめ、個体別データを表１０６に示す。
Figure 0007187505000140
Figure 0007187505000141
Ｗｅｓｓｌｅｒスコア
陰性対照の静脈内投与では、１０分後のＷｅｓｓｌｅｒスコアは０．０であった。３０分後のスコアの範囲は０．０～０．５であり、平均スコアは０．２±０．２７であった。
用量レベル０．０５ｍｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４の静脈内投与では、１０分後のＷｅｓｓｌｅｒスコアは範囲が０．０～０．５であり、グループの平均スコアは０．１±０．２２であった。３０分後のスコアの範囲は２．０～３．５であり、平均スコアは３．４±０．８２であった。
用量レベル０．１ｍｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４の静脈内投与では、１０分後のＷｅｓｓｌｅｒスコアは範囲が０．０～０．５であり、グループの平均スコアは０．１±０．２２であった。３０分後のスコアの範囲は２．０～４．０であり、平均スコアは３．５±０．８７であった。
用量レベル０．２ｍｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４の静脈内投与では、１０分後のＷｅｓｓｌｅｒスコアは範囲が０．０～１．０であり、グループの平均スコアは０．２±０．４５であった。３０分後のスコアの範囲は３．０～４．０であり、平均スコアは３．８±０．４５であった。
用量レベル０．３ｍｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４の静脈内投与では、１０分後のＷｅｓｓｌｅｒスコアは範囲が０．０～２．０であり、グループの平均スコアは０．６±０．８９であった。３０分後のスコアのいずれも４．０であった。
用量レベル０．４ｍｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４の静脈内投与では、１０分後のＷｅｓｓｌｅｒスコアは範囲が０．０～１．０であり、グループの平均スコアは０．３±０．４５であった。３０分後のスコアの範囲は２．０～４．０であり、平均スコアは３．６±０．８９であった。
用量レベル０．１ｍｇ／ｋｇのＮｏｖｏＳｅｖｅｎの静脈内投与では、１０分後のＷｅｓｓｌｅｒスコアは範囲が０．０～０．５であり、グループの平均スコアは０．１±０．２２であった。３０分後のスコアの範囲は２．０～４．０であり、平均スコアは３．５±０．８７であった。
用量レベル０．３ｍｇ／ｋｇのＮｏｖｏＳｅｖｅｎの静脈内投与では、１０分後のＷｅｓｓｌｅｒスコアは範囲が０．０～２．０であり、グループの平均スコアは０．５±０．８７であった。３０分後のスコアの範囲は３．０～４．０であり、平均スコアは３．８±０．４５であった。
統計解析の結果、表１０７
Figure 0007187505000142
統計解析から、１０分後の血栓形成は全グループとも同程度であることがわかる。しかし、この解析から、ＭＯＤ－５０１４の投与３０分後では全用量レベルとも、陰性対照と比較して血栓形成に対する有意な効果が得られたことがわかる。
用量レベル０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４の投与では、同じ用量レベルのＮｏｖｏＳｅｖｅｎと比較して血栓形成に対する統計的有意差はみられなかった。
結論
用量レベル０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇのＭＯＤ－５０１４と同じ用量範囲のＮｏｖｏＳｅｖｅｎは、麻酔をかけたウサギへの投与によって同等のＷｅｓｓｌｅｒスコアを示し、したがって、同程度の血栓形成能を示した。
実施例１６：血友病ＡまたはＢの成人男性と対象とする長時間作用型組換え第ＶＩＩａ因子（ＭＯＤ－５０１４）の安全性、薬物動態および薬力学のプロファイルを評価する第１／２Ａ相、非盲検、多施設、用量漸増試験
目的：
主目的：阻害因子を有する血友病被験者または同因子を有さない血友病被験者を対象に用量漸増ＭＯＤ－５０１４の単回静脈内（ＩＶ）投与の急性の安全性および耐容性を評価すること。
副次的目的：阻害因子を有する血友病被験者または同因子を有さない血友病被験者を対象に用量漸増ＭＯＤ－５０１４の単回ＩＶ投与の薬物動態プロファイルを評価すること。
探索：阻害因子を有する血友病被験者または同因子を有さない血友病被験者を対象に用量漸増ＭＯＤ－５０１４の単回ＩＶ投与の薬力学反応を評価すること。
試験のデザインおよび手順
単回投与、非盲検、用量漸増試験とする。この試験は２段階で実施し、各段階のデザインは同じものとする（来院および評価）：
段階１：この段階には、各グループが被験者４例からなる３つの漸増用量群を組み入れる。ＭＯＤ－５０１４の初回用量を２５μｇ／ｋｇとし、その後、５０μｇ／ｋｇおよび１００μｇ／ｋｇの用量とする。各用量コホートの１例目の被験者に単回ＩＶ注射を実施し、次いで７２時間の安全性観察を実施した後、そのコホートの残りの被験者３例に投与を実施する。各コホートの最後の被験者に投与を実施した後、７日間、１４日間および３０日間の安全性観察期間を設ける。段階１のデータをＦＤＡに提出した後、段階２を開始する。ＤＳＭＢから継続の承認を受けＩＲＢに通知してから初めて、段階２への登録を開始する。
段階２：この段階は段階１と同じデザインとし、段階１で評価した用量よりも高い用量を評価する３つの漸増用量群を組み入れる。段階２で評価するＭＯＤ－５０１４の用量として２００μｇ、３００μｇおよび４００μｇ／ｋｇを採用し、各用量群は被験者４例とする。
各試験段階において、さらに高い用量レベルに進むかどうかは、前の用量群の最後の被験者に投与してから７日後までに収集した関連する安全性データ（有害事象、臨床検査結果およびバイタルサインを含む）をＤＳＭＢが審査した後、ＤＳＭＢが決定する。
最大耐量（ＭＴＤ）および用量制限毒性（ＤＬＴ）の決定には有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）のガイドラインを用いる（表１０８）。前の用量が耐容性に優れ、投与後７日間にわたって安全性にも耐容性にも懸念事項がなければ、用量増大が認められる。
中止規則および用量制限毒性（ＤＬＴ）
ＤＬＴは、疾患進行、併発疾患、併用薬のいずれも関係がなく、投与日から７日後までに認められる臨床的に重要な有害事象または臨床検査値異常と定義される。例えば、グレード３または４は、疑いなく、または可能性として、薬物と関係があるとするグレードである。血栓塞栓事象が報告された場合、試験を中止し、その事象およびそのＭＯＤ－５０１４単回投与との関係をさらに調査するようＤＳＭＢに依頼する。表１０８に用量漸増の基準および決定木をまとめる。
Figure 0007187505000143
試験手順
各試験段階は、スクリーニング期間（２８±１日）、治療日および追跡期間（７日、１４日および３０日）からなるものとする。各試験段階および用量群は、来院スケジュールおよび評価を同じものとする。
スクリーニング期間（第－２８日～－１日）－来院１
中等度ないし重度の先天性血友病ＡまたはＢである診断されインフォームドコンセントに署名した１８～６５歳の成人男性被験者について、選択基準および除外基準の評価によって試験への適格性をスクリーニングする。スクリーニング手順には、人口統計学的データ、疾患に関連する完全な既往歴、身体検査結果（神経学的評価、身長および体重を含む）、バイタルサイン（血圧、脈拍数、口腔温度および呼吸数）、ＥＣＧ、有害事象、併用薬のほか、血液学検査、生化学検査、尿検査、凝固検査（プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴａ））を含めた安全性に関する臨床評価の結果の収集を含める。
投与前日（第－１日）
投与前日、適格被験者に電話で連絡し、被験者が下（表１０９）に記載する補充療法を受けていないことを確認する。下に記載する時間制限に関して電話の時間を考慮に入れる。その晩に出血エピソードがあり、補充療法を実施する場合、その被験者は翌日に来院してはならないが、試験担当者に電話をかけなければならない。
Figure 0007187505000144
治療日（第０日）－来院２
投与前
診療所で投与前に以下の評価および手順を実施する：身体検査（神経学的評価を含む）、バイタルサイン、心電図（ＥＣＧ）、安全性臨床検査（血液学検査、生化学検査および尿検査）、ＰＴ、投与前１時間以内のａＰＴＴ、免疫原性、薬物動態（投与前１時間以内）ｂ、薬力学（ＳＴＡＣｌｏｔアッセイによるＦＶＩＩａ活性）、トロンボラストグラフィー（ｔｈｒｏｍｂｏｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）（投与前１時間以内）、トロンビン生成（投与前１時間以内）、有害事象および併用薬。
投与
体重およびＭＯＤ－５０１４用量（用量コホートによって定められる）に基づき被験者に単回静脈内注射を実施する。
投与後
第０日、示される投与後の時点で以下の評価および手順を実施する：
・１±０．５時間後、４±０．５時間後および８時間±０．５時間後のバイタルサイン（血圧、脈拍、呼吸数、体温）
・１±０．５時間後、４±０．５時間後および８±０．５時間後のＥＣＧ
・４±０．５時間後の安全性臨床検査（血液学検査、生化学検査および尿検査）による評価
・３０±５分後、２時間±２０分後、４±０．５時間後および８±１時間後の凝固パネル
・３０±５分後、２時間±２０分後、４±０．５時間後および８±１時間後の薬物動態
・３０±５分後、２時間±２０分後、４±０．５時間後および８±１時間後の薬力学。アッセイには以下のものを含める：
○ＳＴＡＣｌｏｔアッセイによるＦＶＩＩａ活性
○トロンボラストグラフィー（ｔｈｒｏｍｂｏｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）（任意選択）
○トロンビン生成
・併用薬
・ＩＶ投与終了から１０分後および２時間±２０分後の投与部位における局所皮膚反応
・有害事象
追跡（ＦＵ）期間（来院３～８、第１～３０日）
追跡期間の開始を投与の翌日とする。被験者を投与後３０日間追跡し、以下に概要を示すように６回追跡来院させる。ＦＵ来院３／第１日（２４時間後）、ＦＵ来院４／第２日（４８時間後）およびＦＵ来院５／第３日（７２時間後）に以下のものを実施する：身体検査（神経学的評価を含む）（来院３および５のみ）、バイタルサイン、ＥＣＧ、安全性臨床検査（血液学検査、生化学検査および尿検査）、凝固パネル（単回採血）、薬物動態（単回採血）、薬力学（単回採血）、トロンボラストグラフィー（ｔｈｒｏｍｂｏｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）、トロンビン生成、有害事象、局所皮膚反応および併用薬。最初の７２時間以内にレスキュー投薬を実施した場合、ＦＵ来院５のみを実施する。
出血エピソードのレスキュー処置を実施しなかった場合、ＦＵ来院６／第７日に以下の試験手順を実施する：身体検査（神経学的評価を含む）、バイタルサイン、ＥＣＧ、安全性臨床検査（血液学検査、生化学検査および尿検査）、凝固パネル、薬物動態、薬力学、トロンボラストグラフィー（ｔｈｒｏｍｂｏｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）、トロンビン生成、有害事象および併用薬。最初の７２時間経過後に出血エピソードがみられ、レスキュー処置を実施した場合、患者の臨床健康状態に関する電話問診票をすべて記入する。
ＦＵ来院７～８、第１４日および第３０日（終了来院）
この来院では以下の試験手順を実施する：免疫原性、抗ＨＣＰ抗体（来院８のみ）、有害事象および併用薬。
試験期間
各参加被験者の試験期間は、以下のように最大５８日とする：
・スクリーニング期間：投与前の第－２８日～第－１日
・治療：１日の単回投与
・追跡：急性安全性に関して少なくとも７２時間、安全性に関して７日および免疫原性に関して３０日。
標本数および対象集団
中等度ないし重度の先天性血友病ＡまたはＢと診断された成人男性被験者（年齢１８～６５歳）２４例、各試験段階に１２例。各用量群に被験者４例を組み入れる。
選択基準
被験者が試験に適格であるとするには選択基準をすべて満たさなければならない：
１．スクリーニング来院時の年齢が１８～６５歳の男性。
２．阻害因子の有無を問わず、中等度ないし重度の先天性血友病ＡまたはＢ（それぞれＦＶＩＩＩまたはＦＩＸレベルが正常の３％以下であると定義される）と診断されている。
３．体格指数（ＢＭＩ）が３５．０ｋｇ／ｍ２未満である。
４．十分に静脈が確保できる。
５．生殖可能な男性は、投与後９０日間はバリア型避妊具（コンドーム）を使用することに同意しなければならず、試験期間中および投与後９０日間は精子提供が制限される。
治験薬の経路および剤形
長時間作用型改変組換え第ＶＩＩａ因子であるＭＯＤ－５０１４は、クエン酸緩衝液中１ｍｇ／ｍＬのＭＯＤ－５０１４の透明な溶液をガラスバイアルに入れた形で提供する。
投与当日の投与準備２時間前に凍結バイアルを室温で解凍する。解凍したバイアルを１つまたは複数のシリンジ（注射するＩＰ量によって異なる）内に吸引する。取扱いおよび使用に関する詳細な説明は「使用説明書」に記載する。
６つの用量群（各段階３グループ）で計画を立て、各段階および用量群の被験者に被験者の体重に基づくＩＶ注射の形でＭＯＤ－５０１４を単回投与する（投与する用量の例については表１１０を参照されたい）。
Figure 0007187505000145
レスキュー投薬
試験期間中（用量評価後３０日以内）、被験者に出血エピソードがみられた場合、病院での常法に従い、被験者の臨床状態に応じて処置を実施する。
安全性評価項目（主要）
主要安全性評価項目は以下に挙げるモニタリングおよび記録からなる：
１．試験全体を通じた有害事象および併用薬の使用
２．免疫原性、中和抗体が認められない
３．ＥＣＧ、バイタルサイン、身体検査（神経学的評価を含む）
４．血清化学検査プロファイル、肝酵素、血液学検査、凝固パネル（ＰＴ時間、ａＰＴＴ、トロンビン／アンチトロンビン複合体、プロトロンビンフラグメント１＋２、Ｄ－二量体）および尿検査を含めた臨床検査パラメータ
５．局所耐容性（注射部位反応）。
薬物動態（ＰＫ）評価項目（副次的）
単回注射後、特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるＭＯＤ－５０１４の血漿中濃度を測定することによりＰＫ応答を評価する。以下のパラメータを算出する：Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、終末相半減期、Ｖｓｓ、クリアランス、回収率およびＴｍａｘ。
Ｃｍａｘ－ＭＯＤ－５０１４の最大血漿中濃度
Ｔｍａｘ－Ｃｍａｘまでの時間
Ｔｌａｇ－ＭＯＤ－５０１４の吸収遅延時間
ＡＵＣ－最終濃度≧定量限界（ＬＯＱ）となる部分までの曲線下面積ＡＵＣ（０－ｔ）および無限時間までの曲線下面積ＡＵＣｉｎｆ
λｚ－消失速度定数
ｔ１／２－半減期
Ｖｓｓ－定常状態での容積、クリアランスおよび回収率
ＰＫサンプリング時間は第０日（投与前１時間以内）のものとする。注射後の測定はいずれもＩＶ投与終了時に開始し、投与後３０±５分、２時間±２０分、４±０．５時間、８±１時間、２４±２時間（第１日）、４８±３時間（第２日）、７２±３時間（第３日）および第７日に実施する。
薬力学（ＰＤ）評価項目（探索）
ＳＴＡＣｌｏｔアッセイによるＦＶＩＩａ活性により薬力学を評価する。ＰＤは第０日（投与前１時間以内）の時点で測定する。注射後の測定はいずれもＩＶ投与終了時に開始し、投与後３０±５分、２時間±２０分、４±０．５時間、８±１時間、２４±２時間（第１日）、４８±３時間（第２日）、７２±３時間（第３日）および第７日に実施する。生物学的分析を実施する。
統計学的方法
記述統計を用いて、標本数（ｎ）、平均値および標準偏差を含めた人口統計学的データ、ベースライン特性、安全性およびＰＫ／ＰＤに関するデータをまとめる。
段階１の各用量群のＰＫ、ＰＤおよび安全性に関するデータの検討を実施する。
実施例１７：毒性試験
第１／２ａ相試験を裏付ける第ＶＩＩＡ因子－ＣＴＰの安全性および有効性の総合的評価
目的
この諸試験の目的は、血友病患者を対象に進行中の第１／２ａ相試験を裏付ける試験の一環として、ＦＶＩＩａ－ＣＴＰをラットおよびサルに投与したときの安全性、ＰＫおよびＰＤを評価することとした。
方法
ＦＶＩＩ－ＣＴＰをＣＨＯ細胞で発現させ、ＣＴＰ特異的精製工程を用いて精製および活性化した。
雄のラットおよびサルを用いて評価する毒性試験に、ＦＩＨ試験の初期臨床用量を超える適切な限界を確認する毒物動態解析によって裏付けられたＧＭＰバッチを用いた。
試験（実施した試験のまとめを下の表１１１に示す）
ＭＯＤ－５０１４の急性毒物動態ＧＬＰ試験：雄カニクイザルを用いた単回静脈内投与のＰＫ／ＰＤおよび毒性試験：
雄カニクイザルを用いたこの試験は、雄カニクイザルを対象に急性毒性の評価および特徴付けを実施し、最大耐量（ＭＴＤ）を推定し、ＭＯＤ－５０１４の毒物動態を評価する、ＧＬＰに準拠した単回投与毒性試験であった。
試験デザイン
約２～４歳の雄カニクイザル（２～４ｋｇ）２６匹をＣｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社から入手した。２４匹を表１に従って処置群に割り付けた。
方法
カニクイザルにＭＯＤ－５０１４（ロット番号ＥＲ１０１７２９５、２．６ｍｇ／ｍＬ）の単回ＩＶ緩徐ボーラス（２～３分）伏在静脈注射を実施した。大腿静脈からクエン酸緩衝液の入ったチューブに血液試料を採取した。試料は全個体とも、投与前ならびに０．２５、０．５、２、４、６、８、１２および２４に採取した。投与から４８時間後、６０時間後および７２時間後、回復個体から追加の試料を採取した。全試料とも対照群の個体（グループ１）から採取したが、０．５時間後の試料のみを評価した。Ｉｎｔｅｒｔｅｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社（サンディエゴ、カリフォルニア州）にて、検証済みのＥＬＩＳＡ（生物学的分析による検証報告ＡＲ５４３７）により血漿中ＭＯＤ－５０１４濃度を求めた。イスラエルのＯＰＫＯ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社にて、適格な凝固アッセイ（ＳＴＡＧＯ）（適格性に関する報告ＣＤ－０５－０２７６）でＭＯＤ－５０１４の活性を求めた。
データ解析
Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、サニーベール、カリフォルニア州）を用い、各個体のデータについてノンコンパートメント解析を実施した。解析は、ＭＯＤ－５０１４の血漿中濃度データのほか、初期比活性を１５，５６３単位／ｍｇ（ＭＯＤ－５０１４ ＥＲ＃１０１７２９５ Ｒｅｌｅａｓｅ ＳＵＭ）と仮定し凝固活性データについても実施した。ＩＶボーラス投与用のプログラムを用いた。
血漿中濃度の解析では、台形法を用いて０時間から２４時間までの曲線下面積（ＡＵＣ０－２４ｈ）を推定した。最大濃度（Ｃｍａｘ）およびそれが観察された時間（Ｔｍａｘ）をデータから直接求めた。最初の２時点からの逆外挿により０時間での血漿中濃度（Ｃ０）を求めた。以下の方程式：
Ｖｉ＝用量／Ｃ０
から見かけの初期分布容積（Ｖｉ）を算出した。
回復群の個体については、４８時間後、６０時間後および７２時間後の追加のデータが利用可能であった。上記の追加の時点のプロファイルには、２４時間後に終了した個体のプロファイルにはみられない平坦な終末相がみられた。このため、終末相の傾きおよびそれに関連するパラメータは回復個体のみから推定し、２４時間後に終了した個体からは推定しなかった。このことは、終末相の傾きおよびそれに関連するパラメータが１グループ当たり２個体のみから推定されたことを意味するが、得られた推定値は依然として、２４時間後のデータのみに基づく推定値よりもＰＫプロファイルをよく表している。
回復個体については、最後の３時点にわたる対数直線回帰を用いて消失速度定数（λ）を推定し、これを用いて以下の方程式から終末相半減期（ｔ１／２）および０時間から無限時間までのＡＵＣ（ＡＵＣ０－∞）を推定した：
ｔ１／２＝ｌｎ（２）／λ
ＡＵＣ０－∞＝ＡＵＣ０－２４ｈ＋Ｃ２４ｈ／λ
（式中、Ｃ２４ｈは２４時間後の濃度である）。用量をＡＵＣ０－∞で除した商から血清クリアランス（ＣＬ）を算出した。終末相（Ｖｚ）および定常状態（Ｖｓｓ）における容積を以下の方程式から算出した：
Ｖｓｓ＝用量×ＡＵＭＣ／ＡＵＣ２
Ｖｚ＝ＣＬ／λ
（式中、ＡＵＭＣは１次モーメント曲線下面積である）。
凝固活性データの解析では、後期の時点での平坦な終末相の傾きは明白ではなかった。このため、最後の３つ以上の時点にわたる対数直線回帰により終末相の傾きを全個体から推定し、関連するパラメータを上記の通りに算出した。
完了した全試験のまとめを下の表１１１に記載する：
Figure 0007187505000146
結果
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット：全個体とも臨床状態は良好であった。詳細な臨床観察で初めてわかったものであるが、主要な被験個体のうち９ｍｇ／ｋｇの１個体の尾部に、被験物質（ＭＯＤ－５０１４）によるものと考えられる紫色ないし赤色の変色が観察された。主要な被験個体の臨床病理学検査の結果に被験物質による可逆的な変化が観察され、具体的には、全被験物質群にプロトロンビン時間のわずかな減少がみられた（図１１０、表１１２および１１３）。
Figure 0007187505000147
Figure 0007187505000148
終了時剖検または回復時剖検で主要な被験個体に被験物質に関連する肉眼的所見も臓器重量変化も認められなかった。
カニクイザル非ＧＬＰ試験およびＧＬＰ試験：
全個体とも臨床状態は良好であり、雄カニクイザルの静脈内にＭＯＤ－５０１４を単回投与したところ、用量７．５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇでプロトロンビン時間およびアンチトロンビンＩＩＩの減少ならびにＤ－二量体の増大がみられた（図１１１、表１１４、１１５、１１６、１１７）。これらの変化は血栓形成促進状態示すものであり、この薬物の目的とする作用機序と一致する。
Figure 0007187505000149
Figure 0007187505000150
Figure 0007187505000151
ＧＬＰ試験に用いた各個体の血漿中濃度および凝固活性のデータをそれぞれ表１１７および１１８に示す。活性データを各個体の各時点での二重反復測定の平均値で表した。
表１１７：各個体の血漿中濃度データ
投与前の活性測定値はＢＬＱとし、ＰＫパラメータの推定では「欠測値」に設定した。
Figure 0007187505000152
Figure 0007187505000153
Figure 0007187505000154
各個体の凝固活性データ
１個体あたり２回の測定値の平均値（ｍＵ／ｍＬ）であり、投与前の活性測定値はＢＬＱとし、ＰＫパラメータの推定では「欠測値」に設定し、＃４０４の投与前の値は無視できるものと見なし、同じく欠測値に設定した。
Figure 0007187505000155
Figure 0007187505000156
Figure 0007187505000157
各個体の血漿中濃度ＰＫパラメータを表１１９に示す。
Figure 0007187505000158
各個体の凝固活性ＰＫパラメータを表１２０に示す：
Figure 0007187505000159
Figure 0007187505000160
Figure 0007187505000161
図１１２および図１１３にＭＯＤ－５０１４のＩＶ注射後の血漿中濃度および凝固活性の平均値を示す。図１１４～図１１６に各用量レベルの濃度および凝固活性の平均値を一緒にプロットする。血漿中濃度および凝固活性の個々のプロットを図１１７Ａ～１１７Ｒに示す。これらの図から、投与後の最初の２４時間は血漿中濃度および凝固活性がほぼ同じ速度で減少しているのがわかる。２４時間を超えると、血漿中濃度は安定する傾向を示し、活性レベルは低下し続けた。２４時間後のデータは、１グループ当たり２匹の回復個体のものだけである。
血漿中濃度および凝固活性のデータに関するノンコンパートメント解析の結果をそれぞれ表１２３および表１２４に示す。血漿中濃度は最初の測定時点（０．２５時間後）が最も高かった。凝固活性Ｔｍａｘは、ほとんどの個体で０．２５時間後または０．５０時間後に観察された。濃度、活性ともに用量の増大に伴い増大したが、完全に用量に比例するわけではなかった。ＡＵＣ０－２４ｈおよびＡＵＣ０－∞は、用量の増大よりも３０～５０％多く増大する傾向がみられた。終末相半減期は、凝固活性よりも血漿中濃度に基づくものの方が長く、前者が約５～７時間であったのに対し、後者は約１２～２８時間であった。ＣＬは、最低用量の１ｍｇ／ｋｇの方が用量７．５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇよりも約５０％速いように思われた。ＣＬは、血漿中濃度に基づくものと凝固活性に基づくものとでほぼ同じであった。
Figure 0007187505000162
Figure 0007187505000163
分布容積の推定値から明らかな一貫した傾向はみられなかった。血漿中濃度と組織中濃度が理論上平衡状態にある定常状態での容積（Ｖｓｓ）および濃度が低下しつつある終末相での容積（Ｖｚ）は、凝固活性よりも血漿中濃度からの推定値に基づくものの方が大きかった。初期分布容積（Ｖｉ）は、１．０ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇの用量群では、血漿中濃度よりも凝固活性に基づくものの方がいくぶん大きかった。Ｖｉはこのほか、高用量よりも２種類の低用量の方が高かった。この観察結果は、凝固活性測定値がすべて最初の時点でピークに達し、その後急激に低下するというわけではなかったことと関係があるものと思われた。代わりに、一部の凝固活性曲線は、より遅い時点でピークに達し、曲線の初期相がより平坦になっていた。このパターンが原因でＣ０の推定値が小さくなり、ひいては凝固活性に基づくＶｉの推定値が大きくなった。
ＧＬＰ試験のまとめ
血漿中濃度は最初の測定時点（０．２５時間後）が最も高かった。凝固活性Ｔｍａｘは、ほとんどの個体で０．２５時間後または０．５０時間後に観察された。濃度、活性ともに用量の増大に伴いパラメータが増大したが、完全に用量に比例するわけではなかった。ＡＵＣ０－２４ｈおよびＡＵＣ０－∞は、用量の増大よりも３０～５０％多く増大する傾向がみられた。終末相半減期は、凝固活性よりも血漿中濃度に基づくものの方が長く、前者が約５～７時間であったのに対し、後者は約１２～２８時間であった。ＣＬは、最低用量の１ｍｇ／ｋｇの方が用量７．５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇよりも約５０％速いように思われた。ＣＬは、血漿中濃度に基づくものと凝固活性に基づくものとでほぼ同じであった。
分布容積の推定値から明らかな一貫した傾向はみられなかった。血漿中濃度と組織中濃度が理論上平衡状態にある定常状態での見かけの容積（Ｖｓｓ）および濃度が低下しつつある終末相での容積（Ｖｚ）は、凝固活性に基づくものよりも血漿中濃度からの推定値に基づくものの方が大きかった。初期分布容積（Ｖｉ）は、１．０ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇの用量群では、血漿中濃度よりも凝固活性に基づくものの方がいくぶん大きかった。Ｖｉはこのほか、高用量よりも２種類の低用量の方が高かった。この観察結果は、凝固活性測定値がすべて最初の時点でピークに達し、その後急激に低下するというわけではなかったことと関係があるものと思われた。一部の凝固活性曲線は、より遅い時点でピークに達し、曲線の初期相がより平坦になっていた。このパターンが原因でＣ０の推定値が小さくなり、ひいては凝固活性に基づくＶｉの推定値が大きくなった。
雄カニクイザルにＭＯＤ－５０１４の緩徐ＩＶボーラス注射を実施したところ、ＭＯＤ－５０１４曝露量は、血漿中濃度に基づくものも凝固活性に基づくものも用量の増大とともに増大したが、用量の増大よりもいくぶん大きいものであった。したがって、ＭＯＤ－５０１４曝露量は、血漿中濃度に基づくものも凝固活性に基づくものも用量依存性ではあるが、用量比例性ではなかった。ＣＬは、濃度によって測定したものと活性によって測定したものとでほぼ同じであり、ともに、用量１ｍｇ／ｋｇの場合のＣＬが用量７．５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇの場合よりも約５０％高かった。終末相半減期は、凝固活性よりも血漿中濃度に基づくものの方が長く、後者が約５～７時間であったのに対し、前者は約１２～２８時間であった。
ＮＺＷウサギでの結果は上の実施例１５に示した。
結論：
安全性評価のまとめ：
毒性試験で認められた所見はいずれも、この薬物の作用機序と一致し、同作用機序に基づき予想されるものである。ＭＯＤ－５０１４と関連する新たな所見または特有の所見であって、市販のｒｈＦＶＩＩをはじめとする凝固因子薬にもみられなかった所見は認められなかった。Ｗｅｓｓｌｅｒモデルを用いて血栓形成効果を試験したところ、ｒｈＦＶＩＩａに匹敵するものであることがわかった。
薬物動態的利点：
以上の結果から、回収率が２倍増大し、ＭＯＤ－５０１４の半減期が市販のｒｈＦＶＩＩの半減期の４倍と優れていることがわかった。さらに、ＭＯＤ－５０１４への曝露が改善された（ＡＵＣが３～４倍）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ凝固活性の解析から、ｉｎ ｖｉｔｒｏ凝固活性が市販製品に匹敵するものであることがわかった。
全体をまとめると、ＭＯＤ－５０１４は、優れた安全性プロファイルを示し、ヒト初回投与（ＦＩＨ）第１～２Ａ相臨床試験の推奨臨床投与量を上回る十分な曝露マージンが得られることがわかった。
実施例１８：ＭＯＤ－５０１４とｈＦＶＩＩａのｉｎ ｖｉｔｒｏでの血小板結合の比較評価
１．計画の理論およびまとめ
１．１．目的
これらの試験は、ＭＯＤ－５０１４のｉｎ ｖｉｔｒｏでの血小板結合を野生型組換えヒトＦＶＩＩａと比較して評価するようデザインしたものである。血友病の臨床状況では、血小板の表面活性がＦＶＩＩａ作用機序の重要な構成要素であると考えられることから、血小板結合が、血友病のバイパス剤であるＦＶＩＩａ様分子の重要な特徴の１つとなっている。単純なリン脂質に加えて、血小板には凝固プロテアーゼの結合および活性に寄与する表面特性が多数みられる。このため、リン脂質の結合および活性のみのアッセイでは、ＦＶＩＩａなどの凝固因子の生物学的効果を予測するうえで誤解を招く可能性がある。
１．２．方法
試験では、
・フローサイトメトリーによって評価される血小板結合
・血小板表面でのトロンビン生成によって評価される血小板結合
を検討した。
１．３．結果および結論
フローサイトメトリー試験では有用なデータが得られなかった。このアッセイでは、ＦＶＩＩａおよびＭＯＤ－５０１４を活性化ヒト血小板と結合させた。ヒトＦＶＩＩに対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体によって結合を検出した。Ｗｈｉｌｅ ＯＰＫＯ社がフローサイトメトリーに用いた抗体調製物は、ウエスタンブロットではＦＶＩＩａおよびＭＯＤ－５０１４と同程度に良好に結合したが、ＥＬＩＳＡアッセイでもフローサイトメトリーアッセイでもそのようなことはなかった。したがって、この方法はＦＶＩＩａとＭＯＤ－５０１４の血小板結合の比較に有用なものではなかった。
別法として、血小板表面でのトロンビン生成を裏付けるＭＯＤ－５０１４の血小板との結合能を評価した。この方法は、溶液中ではＦＶＩＩａがＦＸａの活性化を触媒することがほとんどできないことに基づくものである。しかし、ＦＶＩＩａおよび改変ＦＶＩＩａ分子は、活性化血小板と結合するとＦＸを活性化する効率がはるかに高くなる。次いで、活性化血小板上で生じたＦＸａが血小板表面でプロトロンビンをトロンビンに活性化する能力によって、そのＦＸａを測定することができる。
等モル濃度では、ＭＯＤ－５０１４は血小板表面でのトロンビン生成速度がＦＶＩＩａよりもわずかに低いことがわかった。しかし、トロンビン生成開始前までの遅延時間は、ＭＯＤ－５０１４の方がＦＶＩＩａよりも約４０％長かった。このことは、ＭＯＤ－５０１４はＦＸ活性化の最大速度が野生型ＦＶＩＩａよりもわずかに低いことを示した生化学的試験と一致する。トロンビン生成が最大に達するまでの時間が長いことは、ＭＯＤ－５０１４のレベルを高くすることによって克服し得るものと思われる。投与する際の考慮事項には多数の因子が加わる。しかし、上に挙げたｉｎ ｖｉｔｒｏデータは、ＭＯＤ－５０１４がＦＶＩＩａとわずかに異なる投与を必要とし得ることを示唆している。
２．フローサイトメトリーによる血小板結合の評価
２．１．方法
健常ヒトドナーの血液から血小板を単離し、トロンビンおよびコンバルキシン（コラーゲン受容体アゴニスト）で活性化した。活性化した血小板を１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭおよび２５０ｎＭのＭＯＤ－５０１４またはＦＶＩＩａとインキュベートした後、１％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した血小板を、ポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩ抗体およびＦＩＴＣ結合二次抗体を用いてＦＶＩＩａについて染色した。染色した血小板をフローサイトメトリーにより解析した。各ＦＶＩＩａ濃度での血小板集団の平均蛍光強度（輝度）を求めた。
２．２．結果
図１１８に各濃度のＭＯＤ－５０１４またはＦＶＩＩａに対する血小板集団の平均蛍光強度を示す。ＭＯＤ－５０１４で検出された結合は全体的に低いものの、ＭＯＤ－５０１４とＦＶＩＩａはほぼ同じ形状の結合曲線を示した。ＭＯＤ－５０１４が血小板と十分に結合しない場合、飽和するとは思われない極めて平坦な曲線になる。したがって、ＦＶＩＩａ／ＭＯＤ－５０１４の検出に使用した抗体ではＭＯＤ－５０１４が十分に検出されなかった可能性が高いと思われる。フローサイトメトリー試験で結合の検出に使用した同じポリクローナル抗体によってＭＯＤ－５０１４および野生型ＦＶＩＩａのＳＤＳ変性試料で同程度の強いシグナルが生成するのが観察された。
次いで、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ポリクローナル抗体がＦＶＩＩａおよびＭＯＤ－５０１４を検出する能力を試験した。このアッセイでは、マイクロタイターウェルを抗体でコートしてタンパク質試料を捕捉した。タンパク質と捕捉抗体との結合を同じポリクローナル抗体で検出した。ＦＶＩＩａおよびＭＯＤ－５０１４がそれ本来のコンホメーションのままであるため、ＭＯＤ－５０１４の検出がＦＶＩＩａよりもはるかに不十分なものとなった。
このことを受けて、ＦＶＩＩａおよびＭＯＤ－５０１４の結合を検出するのに別の手法を探すこととなった。
３．トロンビン生成による血小板結合の評価
３．１．方法
これらの実験では、同じくトロンビンおよびコンバルキシンで血小板を活性化し、様々な濃度のＦＶＩＩまたはＭＯＤ－５０１４とインキュベートした後、発色基質であるＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－パラニトロアニリド（５００μＭ）の存在下、血漿中濃度のＦＸ（１３５ｎＭ）およびプロトロンビン（１．２μＭ）を加えた。上記の条件下で、血小板と結合したＦＶＩＩａまたはＭＯＤ－５０１４がＦＸを活性化する。このようにして血小板表面で形成されたＦＸａが血小板由来ＦＶａと結合し、これにより生じた複合体がプロトロンビンをトロンビンに活性化し、これが発色基質の切断によって検出される。
３．２．結果
血小板の不在下での基質切断が最小値を示した。図１１９に、各濃度での基質切断の最大速度をＦＶＩＩａまたはＭＯＤ－５０１４の濃度の関数としてプロットする。トロンビン生成速度はＭＯＤ－５０１４の方がＦＶＩＩａよりもいくぶん低い。このことは、リン脂質小胞で実施した活性アッセイと一致する。
実施例１９：市販の組換えｈＦＶＩＩａと比較したＭＯＤ－５０１４の生化学的－カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）が第ＶＩＩａ因子の活性に及ぼす影響
計画の理論およびまとめ
これらの試験は、ＭＯＤ－５０１４の生化学的特性を本明細書でＭＯＤ－５０００と称する市販の組換えｈＦＶＩＩａと比較して評価するようデザインしたものである。
試験では、
・ＭＯＤ－５０１４の合成基質切断
・合成基質切断によって測定されるＭＯＤ－５０１４の組織因子（ＴＦ）
・第Ｘ因子（ＦＸ）活性化によって測定されるＭＯＤ－５０１４のＴＦ結合
・ＴＦ結合ＭＯＤ－５０１４によるＦＸ活性化の動態
・ＦＸ活性化によって測定されるＭＯＤ－５０１４の脂質結合
・脂質結合ＭＯＤ－５０１４による因子活性化の動態
・アンチトロンビン（ＡＴ）によるＭＯＤ－５０１４の不活化
・ＴＦＰＩによるＭＯＤ－５０１４の不活化
データ全体から、ＭＯＤ－５０００と比較したとき、ＭＯＤ－５０１４は作用機序がほぼ同じであり、触媒活性がわずかに低いことが示唆される。これらの結果から、ＴＦ結合ＭＯＤ－５０１４の活性はわずかに低下しており、ＴＦから独立していると、さらにいくぶん低下することがわかった。
これらの影響は、反応の大きさよりはむしろ反応速度が主として反映されたものであり、経時変化全体を測定することができる反応は確かに終了まで進行する。
ＡＴ阻害速度のわずかな低下は、ＭＯＤ－５０１４のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長くなり、適切な阻害応答が起こることを示唆している。
実験材料
・ＭＯＤ－５０１４ ＧＭＰ－１：２．５ｍｇ／ｍｌ（Ａ２８０に基づく）
・ＭＯＤ－５０００と称するＮｏｖｏＳｅｖｅｎロット番号ＣＵ６０４３０：０．９４３ｍｇ／ｍｌ（Ａ２８０に基づく）
ＭＯＤ－５０１４の合成基質切断
理論：合成基質の切断は、もっぱら機能的活性部位が利用可能であるかどうかに依存しているはずである。
方法：ＭＯＤ－５０００およびＭＯＤ－５０１４をモル濃度基準で等しい濃度に希釈した。次いで、同じ濃度を固定濃度の基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＦＶＩＩａ（メチルスルホニル－Ｄ－シクロヘキシルアラニル－２－アミノブチリル－アルギニン－ｐ－ニトロアニリド）に加え、黄色の呈色によって基質の切断をモニターした。
結果
濃度：ＦＶＩＩａ ３６０ｎＭ；基質５００μＭ
解析：既知の吸光係数を用いて、４０５ｎｍでの吸光度をｐ－ニトロアニリンの濃度に変換した。ｐ－ニトロアニリンの濃度を時間に対してプロットし、基質の割合を求めた。
切断。データを
速度＝ｋ１［ＶＩＩａ］
ｋ１＝２７．５ｍｏｌ ｐＮＡ／（分・モルＶＩＩａ）
に当てはめた。
結論：モル濃度基準では、ＭＯＤ－５０００とＭＯＤ－５０１４は基質切断速度が同じである（図１２０）。のちの試験には、基質切断の測定値を希釈およびピペット操作の対照として用いる。
合成基質切断によって測定されるＭＯＤ－５０１４のＴＦ結合
理論：第ＶＩＩａ因子がＴＦと結合すると、第ＶＩＩａ因子のコンホメーション変化が起こり、それにより基質切断速度が増大する。このことは、基質切断の増大を用いて第ＶＩＩａ因子とＴＦとの結合をモニターすることが可能であることを意味する。
方法：様々な濃度のＭＯＤ－５０００およびＭＯＤ－５０１４を固定濃度のＴＦに加え、５分間インキュベートした。基質（Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＦＶＩＩａ）を加えた。黄色の呈色により４０５ｎｍで基質切断をモニターした。
結果：
濃度：ＦＶＩＩａ ０～２５ｎＭ；ＴＦ ８．７ｎＭ；基質５００μＭ
解析：ＴＦの濃度が予測Ｋｄを十分に上回っているとき、いずれのＦＶＩＩａも低濃度でＴＦと結合するはずである。基質切断速度はＶＩＩａ／ＴＦ複合体の基質切断速度となる。ＦＶＩＩａの濃度がＴＦの濃度を上回ると、基質切断速度は遊離ＦＶＩＩａの速度まで低下するはずである。ＦＶＩＩａとＴＦはモル比１：１の複合体を形成することから、基質切断速度の変化が起こるときのＦＶＩＩａの濃度がＦＶＩＩａの推定濃度の判断材料となる。
データを下記の数式に当てはめた。
速度＝ｋ１［ＶＩＩａ］＋ｋ２［ＶＩＩａ／ＴＦ］
Figure 0007187505000164
結論：ＭＯＤ－５０００（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）とＭＯＤ－５０１４は予測されたＴＦ濃度（８．７ｎＭ）で同じ変曲点を示している（図１２１）。このことは、基質切断によって予測されるＭＯＤ－５０００およびＭＯＤ－５０１４のモル濃度が正しいことを裏付けるものである。ＭＯＤ－５０１４は、ＴＦと結合したとき、ＭＯＤ－５０００よりも基質切断速度が極わずかに低かった（９８％）（図１２１）。
第Ｘ因子活性化によって測定されるＭＯＤ－５０１４のＴＦ結合
理論：ＦＶＩＩａによるＦＸの切断は、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体による切断に比べて速度が遅い。したがって、ＦＸ活性化の速度を測定することによりＦＶＩＩａとＴＦとの結合を評価することができる。
方法：様々な濃度のＭＯＤ－５０００およびＭＯＤ－５０１４を固定濃度のＴＦに加え、ＦＸ活性化の速度を測定した。合成基質Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＦＸａ（メトキシカルボニル－Ｄ－シクロヘキシルアラニル－グリシル－アルギニンパラニトロアニリド）の切断により第Ｘ因子活性化を評価した。標準曲線により合成基質の切断をＦＸａ濃度に変換する。ＦＶＩＩａもＦＶＩＩａ／ＴＦも相当な速度でＦＸ基質を切断することはない。
結果
濃度：ＦＶＩＩａ ０～２ｎＭ；ＴＦ １０ｐＭ；ＦＸ １３５ｎＭ；基質５００μＭ
血漿中の第Ｘ因子の濃度は８μｇ／ｍＬ（約１３５ｎＭ）である。
解析：ＦＸ活性化の速度は、ＦＶＩＩａがＴＦと結合するのに伴い増大するはずである。ＴＦがすべてＦＶＩＩａで飽和されると、ＦＸ活性化の速度が最大値に達する（図１２２Ａ）。
データを下記の数式に当てはめた。
Figure 0007187505000165
Figure 0007187505000166
結論：ＦＶＩＩａがＴＦと結合する際に極めて弱い負の協同性がみられる（Ｈｉｌｌ値が１未満である）。このことはＭＯＤ－５０００でもＭＯＤ－５０１４でも同じである。ＴＦと結合すると、ＭＯＤ－５０１４のＦＸ活性化の速度はＭＯＤ－５０００に比べてわずかに低下する（９３％）。ＭＯＤ－５０１４のＴＦに対する親和性はＭＯＤ－５０００のものと同程度である（図１２２Ａ）。
ＦＸ濃度の関数としてのＦＸ活性化の速度
理論：ＴＦと結合するとＭＯＤ－５０１４の活性化速度がわずかに低下するのは、ＦＸａに対する親和性が低下するか、ＦＸが複合体と結合したときにその回転率が低下する結果であると考えられる。ＦＸ活性化の速度をＦＸ濃度の関数として測定することにより、複合体の動力学的パラメータを確立した。
方法：様々な濃度のＦＸを固定濃度のＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体とインキュベートした。
合成基質（Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＦＸａ）の切断により第Ｘ因子活性化を評価した。標準曲線により合成基質の切断をＦＸａ濃度に変換した。
結果
濃度：ＦＶＩＩａ １ｎＭ；ＴＦ ５ｐＭ；ＦＸ ０～１５００ｎＭ；基質５００μＭ
解析：ＦＸ添加量の増大に伴い、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体がすべてＦＸと結合する時点まで、ＦＸと結合するＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体が増加したはずである。上記の時点での反応は、ＦＸが活性化される速度によって制限された。したがって、ＦＸ活性化の速度はＦＸの濃度の増大とともに増大したはずであり、曲線の形状は漸近的に最大速度に近づくものとなっている（図１２３）。
データを下記の数式に当てはめた。
Figure 0007187505000167
Figure 0007187505000168
結論：ＴＦと結合すると、ＭＯＤ－５０１４はＦＸの回転率がＭＯＤ－５０００に比べてわずかに低下した（９２％）。ＦＸとＭＯＤ－５０１４／ＴＦ複合体との結合は、ＦＸとＭＯＤ－５０００／ＴＦ複合体との結合と同じであった（図１２３）。
ＦＸ活性化によって測定されるＭＯＤ－５０１４の脂質結合
理論：血小板上での第Ｘ因子活性化はＦＶＩＩａの止血効果に寄与すると考えられる。この血小板活性は、低ＴＦ環境下またはＴＦ不在下で起こると考えられる。ＴＦ不在下での第Ｘ因子活性化は脂質小胞上で試験することができる。
方法：脂質上でのＦＶＩＩａによる第Ｘ因子活性化は、酵素（ＦＶＩＩａ）およびタンパク質基質（ＦＸ）の両者の結合の関数となる。脂質の比をＰＣ：ＰＥ：ＰＳ＝４１：４４：１４とし、高活性化血小板の組成を模倣するよう設計した。脂質は大型の一枚膜小胞（２００ｎｍ）として調製した。漸増濃度の小胞をＦＶＩＩａおよびＦＸに添加した。合成基質（Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＦＸａ）の切断により第Ｘ因子活性化を評価した。標準曲線により合成基質の切断をＦＸａ濃度に変換した。
結果
濃度：ＦＶＩＩａ ２０ｎＭ；ＦＸ ５００ｎＭ；脂質０～１０００μＭ；基質５００μＭ。
解析：ＦＸａ生成速度を脂質小胞の濃度に対してプロットした（図１２４Ａ）。予想された通り、脂質濃度の増大に伴い反応に利用可能な表面積が増大するため、ＦＸａ生成が増大した。脂質が十分な濃度になったとき、ＦＶＩＩａとＦＸが異なる脂質小胞上に分離したため反応速度が低下した。この鋳型反応は、この系で予想されることである。データを方程式に当てはめることはせず、示される線は視覚的に参照するためのものにとどめてある。ＭＯＤ－５０００とＭＯＤ－５０１４との間のＦＸａ生成速度の差は、脂質に対する親和性の差によるものではなかった。このことは、それぞれの最大値に対する相対ＦＸａ生成速度を脂質濃度に対してプロットした図１２４Ｂからわかる。
結論：ＴＦ不在下でのＦＸ活性化の速度は、ＭＯＤ－５０００よりもＭＯＤ－５０１４の方が低い（約６０％）。ＭＯＤ－５０１４の脂質に対する親和性はＭＯＤ－５０００のものと同じである。
脂質結合ＭＯＤ－５０１４によるＦＸ活性化の動態
理論：ＴＦ不在下でＭＯＤ－５０１４のＦＸ活性化の速度がＭＯＤ－５０００に比べて低下するは、ＦＸａに対する親和性が低下するか、ＦＸが脂質表面で酵素と結合するとその回転率が低下する結果であると考えられる。
方法：様々な濃度のＦＸを固定濃度のＦＶＩＩａおよび脂質小胞とインキュベートした。合成基質（Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＦＸａ）の切断により第Ｘ因子活性化を評価した。標準曲線により合成基質の切断をＦＸａ濃度に変換した。
結果
濃度：ＦＶＩＩａ ２０ｎＭ；ＦＸ ０～２５００ｎＭ；脂質１００μＭ；基質５００μＭ。
解析：ＦＸ添加量の増大に伴い、ＦＶＩＩａがすべてＦＸと結合する時点まで、ＦＸと結合する脂質表面のＦＶＩＩａが増加したはずである。上記の時点での反応は、ＦＸが活性化される速度によって制限される。したがって、ＦＸ活性化の速度はＦＸの濃度の増大とともに増大し、曲線の形状は漸近的に最大速度に近づくものとなるはずである。予想される通り、ＦＶＩＩａのＦＸに対する親和性はＴＦ不在下で低下し（Ｋｍが大きくなり）、ＦＸａ生成速度はＴＦ不在下で低下している（図１２５）。
データを下記の数式に当てはめた。
Figure 0007187505000169
Figure 0007187505000170
結論：ＴＦ不在下では、脂質表面でのＦＸ活性化の速度はＭＯＤ－５０１４の方がＭＯＤ－５０００よりも低い（４５％）。脂質表面でのＦＸとＭＯＤ－５０１４との結合はＦＸとＭＯＤ－５０００との結合と同じであった（図１２５）。
ＡＴによるＭＯＤ－５０１４の不活性化
理論：ＦＶＩＩａのｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスのかなりの部分が、ＡＴとのＦＶＩＩａ複合体の形成を介するものであると考えられる。この反応の速度は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＦＶＩＩａがＴＦと結合する場合にのみ測定可能である。このｉｎ ｖｉｔｒｏの反応が測定可能な速度で進行するにはほかにも、天然のグリコサミノグリカンの作用を模倣すると考えられる高濃度のヘパリンが必要である。
方法：第ＶＩＩａ因子をＴＦとインキュベートして複合体を形成させた。この複合体をＡＴおよびヘパリンとインキュベートした。決まった時間間隔で、ポリブレン（臭化ヘキサジメトリン）を添加してヘパリンを中和することにより反応を停止させた。合成基質（Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＦＶＩＩａ）の切断により残存ＦＶＩＩａ／ＴＦ活性を測定した。このアッセイに用いた濃度でポリブレンが基質切断を変化させることはなかった。
結果
濃度：ＦＶＩＩａ １０ｎＭ；ＴＦ １１ｎＭ；ＡＴ １μＭ；ヘパリン５Ｕ／ｍＬ；ＦＶＩＩａ／ＴＦ ８．２ｎＭ；ポリブレン１００μｇ／ｍＬ；基質５００μＭ。
解析：基質切断速度として測定したＦＶＩＩａ／ＴＦの濃度を、分で表した時間に対してプロットした（図１２６）。予想された通り、ＡＴ／ヘパリンによってＦＶＩＩａが阻害され、それによりＦＶＩＩａ／ＴＦ活性が失われた。
データを下記の数式に当てはめた。
ｖ＝Ｖｔ＝０ｅ－ｋ＊時間
Figure 0007187505000171
結論：Ｔ＝０での活性の値がほぼ同じであったことから、反応物中に存在する量はＭＯＤ－５０００とＭＯＤ－５０１４とで同じであったことがわかる。ＭＯＤ－５０１４の阻害速度はＭＯＤ－５０００よりもわずかに遅かった（６２％）（図１２６）。両反応とも完全に阻害するまで進行した。
ＴＦＰＩによるＭＯＤ－５０１４の不活化
理論：ＴＦＰＩはＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の生理的阻害因子である。ＴＦＰＩのＫ２ドメインがＦＸａとの最初の複合体を形成する。この複合体はＦＶＩＩａ／ＴＰＩと結合し、そこでＴＦＰＩのＫ１ドメインがＦＶＩＩａと相互作用する。したがって、ＦＶＩＩａ／ＴＦによってＦＸが活性化されると、複合体が阻害され、ＦＶＩＩａ－ＴＦＰＩ間の作用が停止するはずである。
方法：第ＶＩＩａ因子とＴＦを一緒にインキュベートして複合体を形成させた。この複合体をＴＦＰＩ／ＦＸ／ＦＸａ基質に添加した。合成基質（Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＦＸａ）の切断により第Ｘ因子活性化を評価した。標準曲線により合成基質の切断をＦＸａ濃度に変換した。
結果
濃度－阻害：ＦＶＩＩａ １ｎＭ；ＴＦ ２０ｐＭ；ＦＸ １３５ｎＭ；ＴＦＰＩ ０～５ｎＭ；基質５００μＭ。
解析：予想された通り、初期のＦＸａ生成は、いずれの反応でも同じ速度で起こった（図１２７Ａ～Ｃ）。ＴＦＰＩの存在下では、ＦＶＩＩａ／ＴＦＰＩ複合体がＴＦＰＩ／ＦＸａによって阻害されたため、ＦＸａ生成速度が遅くなった（下の２つのパネル）。ＴＦＰＩ複合体の作用停止は、ＴＦＰＩの濃度が高いほど短時間でみられた（下の２つのパネル）。ＦＶＩＩａ／ＴＦＰＩの作用が停止する前に形成されたＦＸａの量は、ＴＦＰＩとＦＶＩＩａ／ＴＦとの相互作用の尺度となる。ＭＯＤ－５０１４はＦＸａ生成速度がわずかに低く、そのためＦＸａ／ＴＦＰＩ複合体の形成が遅くなったことから、反応がプラトーに達するまでに要した時間は、ＭＯＤ－５０００よりもＭＯＤ－５０１４の方が長かった。
結論：上のパネルからわかるように、ＴＦＰＩによるＦＸａのＭＯＤ－５０１４／ＴＦ生成阻害の濃度依存性は、ＭＯＤ－５０００のものと極めて類似している。ＭＯＤ－５０１４の方がＴＦＰＩ阻害に対する感受性がわずかに高い（１２４％）と思われ、あるいは、これはＦＸａ生成速度がわずかに遅いことによるアーティファクトであると思われる。
本明細書ではここまで、本開示の特定の特徴について説明および記載してきたが、現時点で当業者には多数の修正、置換、改変および均等物が思いつくであろう。したがって、添付の「特許請求の範囲」は、そのような修正および改変をいずれも本開示の真の趣旨の範囲内に包含することを意図するものであることが理解されるべきである。

Claims (25)

  1. 第ＶＩＩａ（ＦＶＩＩ）凝固因子を投与するための医薬製剤の製造における、絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ポリペプチドの使用であって、
    前記医薬製剤は、緩衝剤と、等張化剤と、前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドとを含み、
    前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドは、前記ＦＶＩＩ凝固因子および前記凝固因子のカルボキシ末端に結合した３つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）からなり、
    前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドが、シグナルペプチドを含まず、
    前記医薬製剤のｐＨが６．４であり、
    前記緩衝剤が、２０ｍＭクエン酸塩と、１３．３ｍＭグリシンとを含み、
    前記等張化剤が１５０ｍＭ塩化ナトリウムであることを特徴とする使用。
  2. 第ＶＩＩａ（ＦＶＩＩ）凝固因子の投与頻度を減らすようにＦＶＩＩ凝固因子を投与するための医薬製剤の製造における、絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ポリペプチドの使用であって、
    前記医薬製剤は、緩衝剤と、等張化剤と、前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドとを含み、
    前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドは、前記ＦＶＩＩ凝固因子および前記凝固因子のカルボキシ末端に結合した３つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）からなり、
    前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドが、シグナルペプチドを含まず、
    前記医薬製剤のｐＨが６．４であり、
    前記緩衝剤が、２０ｍＭクエン酸塩と、１３．３ｍＭグリシンとを含み、
    前記等張化剤が１５０ｍＭ塩化ナトリウムであることを特徴とする使用。
  3. 第ＶＩＩａ（ＦＶＩＩ）凝固因子の生物学的半減期を延長させるようにＦＶＩＩ凝固因子を投与するための医薬製剤の製造における、絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ポリペプチドの使用であって、
    前記医薬製剤は、緩衝剤と、等張化剤と、前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドとを含み、
    前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドは、前記ＦＶＩＩ凝固因子および前記凝固因子のカルボキシ末端に結合した３つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）からなり、
    前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドが、シグナルペプチドを含まず、
    前記医薬製剤のｐＨが６．４であり、
    前記緩衝剤が、２０ｍＭクエン酸塩と、１３．３ｍＭグリシンとを含み、
    前記等張化剤が１５０ｍＭ塩化ナトリウムであることを特徴とする使用。
  4. 第ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）凝固因子の曲線下面積（ＡＵＣ）を改善するようにＦＶＩＩ凝固因子を投与するための医薬製剤の製造における、絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ポリペプチドの使用であって、
    前記医薬製剤は、緩衝剤と、等張化剤と、前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドとを含み、
    前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドは、前記ＦＶＩＩ凝固因子および前記凝固因子のカルボキシ末端に結合した３つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）からなり、
    前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドが、シグナルペプチドを含まず、
    前記医薬製剤のｐＨが６．４であり、
    前記緩衝剤が、２０ｍＭクエン酸塩と、１３．３ｍＭグリシンとを含み、
    前記等張化剤が１５０ｍＭ塩化ナトリウムであることを特徴とする使用。
  5. 請求項１～４のいずれか１項に記載の使用であって、
    前記医薬製剤が、薬学的に許容される担体を含み、前記薬学的に許容される担体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、および植物からなる群から選択される、使用。
  6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の使用であって、
    前記医薬製剤が、液体製剤である、使用。
  7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の使用であって、
    少なくとも１つの前記ＣＴＰの配列が、配列番号１および配列番号２からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、使用。
  8. 請求項１～７のいずれか１項に記載の使用であって、
    少なくとも１つの前記ＣＴＰが短縮されている、使用。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の使用であって、
    少なくとも１つの前記ＣＴＰがグリコシル化されている、使用。
  10. 請求項１～９のいずれか１項に記載の使用であって、
    少なくとも１つの前記ＣＴＰが、選択に応じてリンカーを介して前記凝固因子に結合されており、前記リンカーが、例えばペプチド結合である、使用。
  11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用であって、
    前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドの配列が、配列番号４６に記載されたものである、使用。
  12. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用であって、
    前記ＦＶＩＩ凝固因子が、活性化された第ＶＩＩ凝固因子（ＦＶＩＩａ）を含む、使用。
  13. 請求項１２に記載の使用であって、
    前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドが、ジスルフィド結合によって連結された軽鎖と重鎖とを含む、使用。
  14. 請求項１３に記載の使用であって、
    前記軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号４６の残基１～１５２の配列を含み、前記重鎖のアミノ酸配列が、配列番号４６の残基１５３～４６０の配列を含む、使用。
  15. 請求項１３または１４のいずれか１項に記載の使用であって、
    ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上での前記軽鎖と前記重鎖の分離が変性条件下で起こり、前記軽鎖が２５ｋＤａの分子量に移動し、前記重鎖が６０ｋＤａの分子量に移動する、使用。
  16. 請求項１３～１５のいずれか１項に記載の使用であって、
    前記ジスルフィド結合が、配列番号４６のシステイン残基１３５とシステイン残基２６２との間で生ずる、使用。
  17. 請求項１～１６のいずれか１項に記載の使用であって、
    前記医薬製剤は対象に投与される、使用。
  18. 請求項１７に記載の使用であって、
    前記対象がヒト成人またはヒト小児である、使用。
  19. 請求項１７または１８に記載の使用であって、
    前記対象が、血液凝固障害を有する、使用。
  20. 請求項１９に記載の使用であって、
    前記血液凝固障害が血友病である、使用。
  21. 請求項２０に記載の使用であって、
    前記血友病が、血友病Ａまたは血友病Ｂを含む、使用。
  22. 請求項２０に記載の使用であって、
    前記血友病が、阻害因子を有する血友病Ａまたは血友病Ｂを含む、使用。
  23. 請求項１７～２２のいずれか１項に記載の使用であって、
    前記投与が皮下経路または静脈内経路を介するものである、使用。
  24. 請求項１７～２３のいずれか１項に記載の使用であって、
    前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドは、毎日、１日置きに、２日置きに、週１回、週２回もしくは２週間に１回またはその任意の組合せで投与される、使用。
  25. 請求項１７～２４のいずれか１項に記載の使用であって、
    前記ＣＴＰ修飾ポリペプチドの前記投与は、５０μｇ／ｋｇ～４００μｇ／ｋｇの範囲の用量で行われる、使用。
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