EA044349B1 - Факторы свертывания крови пролонгированного действия и способы их получения - Google Patents
Факторы свертывания крови пролонгированного действия и способы их получения Download PDFInfo
- Publication number
- EA044349B1 EA044349B1 EA201790960 EA044349B1 EA 044349 B1 EA044349 B1 EA 044349B1 EA 201790960 EA201790960 EA 201790960 EA 044349 B1 EA044349 B1 EA 044349B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- another embodiment
- ctp
- factor
- polypeptide
- clotting factor
- Prior art date
Links
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 title claims description 669
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 183
- 101800005309 Carboxy-terminal peptide Proteins 0.000 claims description 587
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 461
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 456
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 455
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 356
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 356
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 254
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 121
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 109
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 109
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 90
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 88
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 52
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 34
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 claims description 33
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 claims description 32
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 30
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 28
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 claims description 28
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 28
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 24
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 19
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 19
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 17
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 16
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 11
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 11
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 8
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 claims description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 claims description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 claims 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims 2
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 94
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 94
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 91
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 79
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 75
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 74
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 74
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 72
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 67
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 60
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 60
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 60
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 53
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 48
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 42
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 41
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 40
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 36
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 31
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 27
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 27
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 26
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 26
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 24
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 24
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 24
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 22
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 21
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 21
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 21
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 21
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 21
- MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N Menadione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C)=CC(=O)C2=C1 MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 20
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 17
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 16
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 15
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 14
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 14
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 13
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 13
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 13
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 13
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 12
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 12
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 12
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 12
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 11
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 11
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 11
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 11
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 11
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 11
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 11
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 11
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 10
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 10
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 10
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 229940112216 novoseven Drugs 0.000 description 10
- 235000012711 vitamin K3 Nutrition 0.000 description 10
- 239000011652 vitamin K3 Substances 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 9
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 9
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 9
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 9
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 8
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 7
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 7
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 6
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 6
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 229940031422 benefix Drugs 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 6
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 6
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 5
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 5
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 239000007910 chewable tablet Substances 0.000 description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 5
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 5
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 5
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 5
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 4
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 4
- 229960004667 ethyl cellulose Drugs 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 4
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 229940068953 recombinant fviia Drugs 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 3
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 3
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 3
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 3
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 3
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 3
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 description 3
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 description 3
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 3
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 3
- 101000659413 Homo sapiens Tricarboxylate transport protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 3
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 3
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 3
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 3
- 201000000839 Vitamin K Deficiency Bleeding Diseases 0.000 description 3
- 206010047634 Vitamin K deficiency Diseases 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 3
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 3
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 3
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical group [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 3
- 229940000425 combination drug Drugs 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 3
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 3
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 3
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 3
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 3
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 3
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 229940071676 hydroxypropylcellulose Drugs 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 3
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 3
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 3
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 3
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 3
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 3
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 208000016794 vitamin K deficiency hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 3
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 3
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 2
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- 229920002785 Croscarmellose sodium Polymers 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical group CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 2
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 108090000113 Plasma Kallikrein Proteins 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 2
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 208000013633 acquired hemophilia Diseases 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 2
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 2
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 2
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 2
- 239000008119 colloidal silica Substances 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- FLKPEMZONWLCSK-UHFFFAOYSA-N diethyl phthalate Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCC FLKPEMZONWLCSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 208000002085 hemarthrosis Diseases 0.000 description 2
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 2
- 230000006623 intrinsic pathway Effects 0.000 description 2
- 108010084553 jacalin Proteins 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 229920001987 poloxamine Polymers 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 2
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 2
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 2
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 2
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 2
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 2
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 2
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N (+)-Neomenthol Chemical compound CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@@H]1O NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- SBQSMJWMEQRETE-HVYQYDHPSA-N (2r)-2-amino-3-[[(2r)-2-amino-2-carboxyethyl]disulfanyl]-4-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C(C(=O)C)SSC[C@H](N)C(O)=O SBQSMJWMEQRETE-HVYQYDHPSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- LDVVTQMJQSCDMK-UHFFFAOYSA-N 1,3-dihydroxypropan-2-yl formate Chemical compound OCC(CO)OC=O LDVVTQMJQSCDMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XOQABDOICLHPIS-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-2,1-benzoxaborole Chemical compound C1=CC=C2B(O)OCC2=C1 XOQABDOICLHPIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 10043-66-0 Chemical compound [131I][131I] PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UOQHWNPVNXSDDO-UHFFFAOYSA-N 3-bromoimidazo[1,2-a]pyridine-6-carbonitrile Chemical compound C1=CC(C#N)=CN2C(Br)=CN=C21 UOQHWNPVNXSDDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 208000032484 Accidental exposure to product Diseases 0.000 description 1
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000036487 Arthropathies Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037157 Azotemia Diseases 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004255 Butylated hydroxyanisole Substances 0.000 description 1
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100408682 Caenorhabditis elegans pmt-2 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N DL-menthol Natural products CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 239000004131 EU approved raising agent Substances 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 206010016077 Factor IX deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 description 1
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 1
- 206010018276 Gingival bleeding Diseases 0.000 description 1
- 102100040890 Glucagon receptor Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000823435 Homo sapiens Coagulation factor IX Proteins 0.000 description 1
- 101001040075 Homo sapiens Glucagon receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N Hydroxylysine Natural products NCC(O)CC(N)CC(O)=O LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 108010056902 Mononine Proteins 0.000 description 1
- 206010061298 Mucosal haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010028309 Muscle haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 1
- 206010073391 Platelet dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 229920000037 Polyproline Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 206010051297 Soft tissue haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical compound [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- DOOTYTYQINUNNV-UHFFFAOYSA-N Triethyl citrate Chemical compound CCOC(=O)CC(O)(C(=O)OCC)CC(=O)OCC DOOTYTYQINUNNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 102100038182 Vitamin K-dependent gamma-carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 101710133062 Vitamin K-dependent gamma-carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006295 amino methylene group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003698 antivitamin K Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 208000015322 bone marrow disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 description 1
- 229940043253 butylated hydroxyanisole Drugs 0.000 description 1
- CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N butylated hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1.COC1=CC=C(O)C=C1C(C)(C)C CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical group OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 229960005168 croscarmellose Drugs 0.000 description 1
- 229960001681 croscarmellose sodium Drugs 0.000 description 1
- 229960000913 crospovidone Drugs 0.000 description 1
- 235000010947 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001767 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003974 emollient agent Substances 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 208000001780 epistaxis Diseases 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000013265 extended release Methods 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 235000010855 food raising agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000008369 fruit flavor Substances 0.000 description 1
- 108091005606 gamma-carboxylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000030304 gastrointestinal bleeding Diseases 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000010005 growth-factor like effect Effects 0.000 description 1
- 208000011759 gum bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-L-lysine Natural products NCCCCC(NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 239000012729 immediate-release (IR) formulation Substances 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N indium-111 Chemical compound [111In] APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N 0.000 description 1
- 229940055742 indium-111 Drugs 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 208000020658 intracerebral hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- RGXCTRIQQODGIZ-UHFFFAOYSA-O isodesmosine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC[N+]1=CC(CCC(N)C(O)=O)=CC(CCC(N)C(O)=O)=C1CCCC(N)C(O)=O RGXCTRIQQODGIZ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940099563 lactobionic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000002960 lipid emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 239000012731 long-acting form Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 229940041616 menthol Drugs 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940090053 mononine Drugs 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002102 nanobead Substances 0.000 description 1
- 125000004957 naphthylene group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 229940127216 oral anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000008012 organic excipient Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000007967 peppermint flavor Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N phosphothreonine Chemical compound OP(=O)(O)O[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 108010026466 polyproline Proteins 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 235000013809 polyvinylpolypyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000523 polyvinylpolypyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940069328 povidone Drugs 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 239000000955 prescription drug Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical class CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CSMWJXBSXGUPGY-UHFFFAOYSA-L sodium dithionate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)S([O-])(=O)=O CSMWJXBSXGUPGY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940037001 sodium edetate Drugs 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000008109 sodium starch glycolate Substances 0.000 description 1
- 229940079832 sodium starch glycolate Drugs 0.000 description 1
- 229920003109 sodium starch glycolate Polymers 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 239000006208 topical dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000001069 triethyl citrate Substances 0.000 description 1
- VMYFZRTXGLUXMZ-UHFFFAOYSA-N triethyl citrate Natural products CCOC(=O)C(O)(C(=O)OCC)C(=O)OCC VMYFZRTXGLUXMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013769 triethyl citrate Nutrition 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 208000009852 uremia Diseases 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000004034 viscosity adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 1
- 229940019333 vitamin k antagonists Drugs 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Description
Область изобретения
Раскрыты полипептиды, включающие по меньшей мере один карбоксиконцевой пептид (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенный к карбоксильному концу фактора свертывания крови, и полинуклеотиды, кодирующие их. Также описаны фармацевтические композиции, содержащие полипептиды и полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, и способы их применения и получения.
Уровень техники
Разработка заместительной терапии фактором свертывания крови изменила жизни многих лиц, больных гемофилией. Гемофилия представляет собой группу наследственных генетических болезней, при которых нарушена способность организма контролировать свертывание крови или коагуляцию. У пациентов с гемофилией не продуцируется адекватное количество белков фактора VIII или фактора IX, которые необходимы для эффективного свертывания крови. При тяжелых случаях гемофилии даже незначительное повреждение может привести к потере крови, которая продолжается в течение нескольких дней или недель, и полное заживление может так и не наступить, что создает потенциал для постоянного инвалидизирующего повреждения суставов и других органов и к преждевременной смерти.
Один тип гемофилии, гемофилия B, представляет собой X-сцепленное нарушение свертывания крови, вызванное мутацией гена фактора IX (FIX), которое приводит к потере прокоагулирующей активности FIX. У пациентов с гемофилией B возникают спонтанные кровоизлияния в мягкие ткани и рецидивирующие гемартрозы, которые часто приводят к деформирующей артропатии. Современный способ лечения данных пациентов включает внутривенное введение рекомбинантного FIX. Тем не менее, стоимость лечения и относительно быстрый клиренс FIX из кровотока обуславливают потребность в разработке FIX пролонгированного действия.
Возможность получения на рынке FVIII и FIX обеспечила улучшение контроля опасных для жизни эпизодов кровотечения. Многие пациенты получают профилактическую терапию, которая снижает риск кровотечения и сопутствующих осложнений. Тем не менее, у значительной части пациентов (10-30%) вырабатываются ингибирующие антитела к введенным экзогенным FVIII и FIX. Введение FVIIa, который представляет собой обходной продукт, может усиливать гомеостаз и обеспечивать эффективное лечение пациентов с ингибирующими антителами.
Рекомбинантный FVIIa (NovoSeven®) доступен для приобретения, и он был одобрен в 1996 г. для лечения эпизодов кровотечения у пациентов с гемофилией с ингибирующими антителами. Тем не менее, клиренс rFVIIa происходит очень быстро, конечный период полужизни составлял 2,5 ч. В результате, пациентам, как правило, требовалось множество частых инфузий (2-3 дозы, которые нужно было вводить с интервалами в 2-3 ч) для достижения достаточного гомеостаза после легкого - умеренного кровотечения. Следовательно, существует большой интерес к разработке формы FVIIa пролонгированного действия, которая бы увеличила продолжительность кровоостанавливающей активности после однократной дозы и обеспечила возможность гораздо менее частого введения. FVIIa пролонгированного действия также повысит целесообразность длительной профилактической терапии.
Разрабатываются различные способы увеличения периода полужизни FVIIa. Тем не менее, задачей является обеспечение увеличенного периода полужизни данного белка при сохранении его биологической активности и при обеспечении отсутствия существенной иммуногенности в результате модификаций.
Краткое описание изобретения
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид CTPмодифицированного фактора IX (FIX), состоящий из полипептида FIX и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного CTP-модифицированного полипептида FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая полипептид CTP-модифицированного фактора IX (FIX), состоящий из полипептида FIX и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного CTP-модифицированного полипептида FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора IX (FIX) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора IX (FIX) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена клетка, содержащая вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий CTP- модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора IX (FIX) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена композиция, содер- 1 044349 жащая вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора IX (FIX) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ увеличения биологического периода полужизни полипептида фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, вследствие чего продлевается биологический период полужизни указанного полипептида FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ увеличения площади под фармакокинетической кривой (AUC) полипептида фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, вследствие чего увеличивается AUC указанного полипептида FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ уменьшения частоты введения полипептида фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, что позволяет уменьшить частоту введения указанного полипептида FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ уменьшения скорости выведения полипептида фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, вследствие чего уменьшается скорость выведения указанного полипептида FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ получения полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, что позволяет получить CTP-модифицированный полипептид FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX), включающего полипептид FIX и три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, благодаря чему лечат гемофилию у указанного субъекта.
В одном варианте реализации согласно изобретению предложен способ предотвращения нарушения свертывания крови или коагуляции у субъекта, указанный способ включает этап введения субъекту CTPмодифицированного фактора свертывания крови, содержащего от трех до пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVII, что обеспечивает предотвращение гемофилии у указанного субъекта.
В другом варианте реализации изобретение относится к способу лечения нарушения свертывания крови или коагуляции у субъекта, указанный способ включает этап введения субъекту CTP-модифицированного фактора свертывания крови, содержащего от трех до пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного фактора свертывания крови, что обеспечивает предотвращение гемофилии гемофилию у указанного субъекта.
Другие особенности и преимущества настоящего изобретения станут очевидны после прочтения следующего подробного описания, примеров и фигур. Должно быть очевидно, тем не менее, что подробное описание и конкретные примеры, в то время, как в них приведены предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, даются лишь с целью иллюстрирования, поскольку различные изменения и модификации в рамках сущности и объема настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в данной области из данного подробного описания.
Краткое описание фигур
Фиг. 1A. Представлена столбчатая диаграмма, показывающая собранные ограниченно разбавленные, трансфицированные и подвергнутые селекции клетки с вариантами FIX-CTP и FIX-CTP-CTP в присутствии 5 мкг/мл витамина K3. Осуществляли количественный анализ уровня FIX, применяя набор для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) FIX человека (Affinity Biologics; номер в каталоге FIX-AG RUO), и рассчитанная концентрация белка (мкг/мл) представляла собой среднее значение по двум независимым экспериментам. На фиг. 1B представлены микрофотографии гелей, полученных в результате электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ЭФ в ПААГ/ДСН) и окрашивания антителом к FIX. На микрофотографии A изображено окрашивание вестернблота антителом к FIX; на микрофотографии B изображено окрашивание вестерн-блота антителом, узнающим гамма-карбоксилирование. На дорожку 1 в A-B загружали образец, содержащий рекомбинантный FIX, на дорожку 2 в A-B загружали образец, содержащий собранный FIX-CTP. На дорожку 3 в A-B загружали образец, содержащий собранный FIX-(CTP)2.
Фиг. 2. Представлена диаграмма, показывающая сравнительную хромогенную активность собранного FIX-CTP и FIX-(CTP)2 (измеряли с помощью концентрации EC50) по сравнению с рекомбинантным FIX человека (rhFIX) (American Diagnostics).
- 2 044349
Фиг. 3. Представлена диаграмма, показывающая ФК профиль rhFIX, собранного FIX-CTP-CTP и собранного FIX-CTP.
Фиг. 4. Представлена столбчатая диаграмма, показывающая уровень антигена FIX в собранном FIXCTP и собранном FIX-CTP-CTP и для очищенного белка FIX-CTP-CTP, что определяли, применяя набор для ELISA FIX человека (Affinity Biologics; номер в каталоге FIX-AG RUO). Рассчитанная концентрация белка (мкг/мл) представляла собой среднее значение по двум независимым экспериментам.
Фиг. 5. Представлены микрофотографии гелей ЭФ в ПААГ/ДСН узнавания FIX антителом. На микрофотографии A изображено окрашивание кумасси бриллиантовым голубым; на микрофотографии B изображено окрашивание вестерн-блота антителом к FIX; на микрофотографии C изображено окрашивание вестерн-блота антителом, узнающим гамма-карбоксилирование. На дорожку 1 в A-C загружали образец, содержащий FIX-(CTP)2. На дорожку 2 в A-C загружали образец, содержащий свободный FIX(CTP)2. На дорожку 3 в A-C загружали образец, содержащий концентрированный элюат FIX-(CTP)2.
Фиг. 6. Представлена диаграмма, показывающая хромогенную активность FIX-(CTP)2 (концентрация образца/оптическая плотность (О.П.)) по сравнению с объединенной нормальной плазмой человека и rhFIX (American Diagnostics).
Фиг. 7. Представлена диаграмма, показывающая ФК профиль очищенного FIX-CTP-CTP, rhFIX, собранного FIX-CTP-CTP и собранного FIX-CTP.
Фиг. 8. Представлено окрашивание антителом к CTP и антителом, узнающим гамма-карбоксилирование, вестерн-блотов FIX, слитого с тремя, четырьмя или пятью CTP. Собранные FIX-CTP3, FIX-CTP4 и FIX-CTP5 загружали на 12% трис-глициновый гель, на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Анализ ЭФ в ПААГ/ДСН осуществляли с помощью иммуноблоттинга (вестерн-блоттинга), применяя поликлональные антитела (AT) к CTP (Adar Biotech Production) или AT к Gla (American Diagnostica).
Фиг. 9. Представлено обнаружение FIX-CTP3, FIX-CTP4 и FIX-CTP5 с помощью кумасси бриллиантового голубого. После процесса очистки с применением колонки Якалин (Jacalin) (иммуноаффинная очистка гликозилированных белков), FIX-CTP3, FIX-CTP4 и FIX-CTP5 загружали на 12% трисглициновый гель, на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Гели ЭФ в ПААГ/ДСН окрашивали красителем кумасси бриллиантовым голубым для обнаружения образца.
Фиг. 10. Представлена хромогенная активность FIX. Сравнительную оценку активности in vitro полностью очищенных (на колонке с гидроксиапатитом (ГА-колонке)) FIX-CTP3 FIX-CTP4 и FIX-CTP5 по сравнению с объединенной нормальной плазмой человека осуществляли, применяя доступный для приобретения набор для анализа хромогенной активности BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Готовили серийные разведения всех образцов и оценивали активность путем сравнения кривой дозовой зависимости образцов с таковой для эталонного лекарственного средства, состоящего из нормальной плазмы человека.
Фиг. 11. Представлен сравнительный фармакокинетический (ФК) профиль FIX-CTP3, FIX-CTP4 и FIX-CTP5. Осуществляли количественный анализ концентрации FIX в образцах плазмы, применяя наборы для Elisa FIX человека (Affinity Biologics). Рассчитывали фармакокинетический профиль, и он представлял собой средние значения по 3 животным в каждый момент времени. Конечный период полужизни рассчитывали, применяя программное обеспечение PK Solutions 2.0.
Фиг. 12. Представлен анализ FIX-CTP3 с помощью ЭФ в ПААГ/ДСН с последующим окрашиванием кумасси гелей ЭФ в ПААГ/ДСН. Гамма-карбоксилированный обогащенный белок FIX-CTP3, rhFIX и rFIXa (активированный FIX) загружали на 12% трис-глициновый гель, на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Анализ ЭФ в ПААГ/ДСН с помощью окрашивания кумасси осуществляли путем окрашивания геля реагентом кумасси бриллиантовый голубой (800 нг белка) (фиг. 12A). Иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг) осуществляли, применяя 100 нг белка и поликлональные AT к FIX человека (фиг. 12B), моноклональное антитело, узнающее гаммакарбоксилирование белка человека (American Diagnostics, номер в каталоге 499, 3570) (фиг. 12C), поликлональные AT к пропептиду FIX (фиг. 12D) и поликлональные AT к CTP (фиг. 12E).
Фиг. 13. Представлена хромогенная активность FIX-CTP3. Сравнительную оценку активности in vitro собранного FIX-CTP3 и гамма-карбоксилированного обогащенного белка FIX-CTP3 по сравнению с объединенной нормальной плазмой человека осуществляли, применяя доступный для приобретения набор для анализа хромогенной активности BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Готовили серийные разведения собранного FIX-CTP3 и белка и оценивали активность путем сравнения кривой дозовой зависимости образцов с таковой для эталонного лекарственного средства, состоящего из нормальной плазмы человека.
Фиг. 14. Представлено сравнительное время свертывания крови. Осуществляли анализ in vitro АЧТВ (активированного частичного тромбопластинового времени), сравнивая свертывающую активность FIX-CTP3 с BeneFIX. Готовили серийные разведения белков и вводили в плазму, обедненную FIX человека, и оценивали время свертывания крови.
Фиг. 15. Представлен сравнительный ФК профиль FIX-CTP3. Осуществляли количественный анализ
- 3 044349 концентрации FIX, применяя наборы для Elisa FIX человека (Affinity Biologics; номер в каталоге FIX-AG
RUO). Для каждого белка рассчитывали фармакокинетический профиль, и он представлял собой средние значения по 3 животным в каждый момент времени.
Фиг. 16. Представлены параметры профиля активности. Параллельно с взятием образцов на ФК, оценивали свертывающую активность образцов цитратной плазмы животных, лишенных FIX, которым вводили либо BeneFIX®, либо FIX-CTP3, с помощью анализа АЧТВ, результаты которого преобразовывали в % активности. % активности в каждый момент сбора рассчитывали как текущее время свертывания/время свертывания объединенной нормальной плазмы мыши * 100.
Фиг. 17. Представлены параметры первого теста с кровотечением. Мышам, лишенным FIX, вводили однократную внутривенную инъекцию 100 МЕ/кг BeneFIX® или rFIX-CTP3. Хвостовую вену слегка рассекали через 48 ч после введения и оценивали время кровотечения из хвостовой вены (ВКХВ) и интенсивность кровотечения (оптическая плотность (О.П.) гемоглобина). Второе тест с кровотечением осуществляли через 15 мин после достижения гомеостаза, и измеряли те же параметры.
Фиг. 18. Представлены параметры второго теста с кровотечением. Как только первое кровотечение, описанное в подписи к фиг. 19, остановилось самопроизвольно или было остановлено вручную, осуществляли второе тест с кровотечением через 15 мин после первого, и заново измеряли время и интенсивность кровотечения.
Фиг. 19. Представлена схема, на которой проиллюстрирована конструкция rFVII-CTP (A), конструкция rFVII-CTP-CTP (B), конструкция rFIX-CTP (C) и конструкция rFIX-CTP-CTP (D).
Фиг. 20A. Представлена столбчатая диаграмма, показывающая собранные трансфицированные подвергнутыми ограниченному разведению клонами с вариантами FVII-CTP и подвергнутые селекции клетки в присутствии 5 мкг/мл витамина K3. Уровень FVII измеряли, применяя ELISA для FVII (AssayPro).
Фиг. 20B. Представлена столбчатая диаграмма, показывающая собранные трансфицированные подвергнутыми ограниченному разведению клонами с вариантами FVII-CTP и подвергнутые селекции клетки в присутствии 5 мкг витамина K3. Активность FVII измеряли, применяя анализ хромогенной активности FVII (AssayPro).
Фиг. 20C. Представлена столбчатая диаграмма, показывающая собранные трансфицированные подвергнутыми ограниченному разведению клонами с вариантами FVII-CTP и подвергнутые селекции клетки в присутствии 5 мкг витамина K3. Удельную активность FVII рассчитывали для каждого варианта путем деления значения активности на концентрацию собранного FVII.
Фиг. 20D. Представлена диаграмма, показывающая ФК профиль собранных FVII, FVII-CTP-CTP и FVII-CTP.
Фиг. 21. Представлены вестерн-блоты FVII, слитого с тремя, четырьмя и пятью CTP, обнаруженного с помощью антитела к FVII, антитела к CTP и антитела, узнающего гамма-карбоксилирование. Собранные FVII-CTP3, FVII-CTP4 и FVII-CTP5 загружали на 12% трис-глициновый гель (Expedeon), на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Анализ ЭФ в ПААГ/ДСН осуществляли посредством иммуноблоттинга (вестерн-блоттинга), применяя AT к FVII, поликлональные AT к CTP (Adar Biotech Production) или AT к Gla (American Diagnostica).
Фиг. 22. Представлена активность FVII - хромогенная активность. Осуществляли сравнительную оценку активности in vitro очищенных на ГА-колонке (сильно гамма-карбоксилированная фракция) FVIICTP3, FVII-CTP4 и FVII-CTP5 с объединенной нормальной плазмой человека, применяя доступный для приобретения набор для анализа хромогенной активности BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). Готовили серийные разведения всех образцов и оценивали активность путем сравнения кривой дозовой зависимости образцов с таковой для эталонного лекарственного средства, состоящего из нормальной плазмы человека.
Фиг. 23. Представлен первый сравнительный фармакокинетический (ФК) профиль для FVII-3, 4 и 5 CTP. FVII-CTP3, FVII-CTP4 и FVII-CTP5 (группа A, B и C, соответственно) вводили однократной внутривенной инъекцией крысам линии Sprague-Dawle (по шесть крыс на группу лечения) в дозе 250 мкг/кг массы тела. Образцы крови отбирали из ретроорбитального синуса 3 крыс поочередно через 0,083, 0,5 2, 5, 8, 24, 48, 72 и 96 ч после введения. Цитратную плазму (0,38%) получали незамедлительно после взятия образцов и хранили при -20°C до проведения анализа. Для FVII-CTP5 продемонстрировали лучший профиль по сравнению с двумя другими вариантами.
Фиг. 24. Представлен второй сравнительный ФК профиль для FVII-3, 4 и 5 CTP. FVII-CTP3, FVIICTP4 и FVII-CTP5 после селекции FVII и процесса очистки на ГА-колонке (группа A, B и C, соответственно) вводили однократной внутривенной инъекцией крысам линии Sprague-Dawle (по три крысы на вещество) в дозе 29,45 мкг/кг массы тела. Образцы крови отбирали из ретроорбитального синуса через 0,083, 0,5 2, 8, 24, 48 и 72 ч после введения. Цитратную плазму (0,38%) получали незамедлительно после взятия образцов и хранили при -20°C до проведения анализа.
Фиг. 25. Представлена принципиальная схема процесса очистки FVII-CTP3. Партию 31 получали для исследования ФК/фармакодинамики (ФД). Партию 38 получали для исследования выживаемости.
Фиг. 26. Представлен ЭФ в ПААГ/ДСН и вестерн-блоттинг конечного FVII и FVIIa. 10 мкг (партия
- 4 044349
31) или 5 мкг (партия 38) загружали на каждую дорожку геля для ЭФ в ПААГ/ДСН, который окрашивали кумасси. 1 мкг белка загружали на каждую дорожку геля для вестерн-блоттинга. 1. Полипептид FVIICTP3; 2. Тяжелая цепь, включающая 3x CTP; 3. Легкая цепь. Все три антитела детектировали FVII. Тяжелую цепь FVIIa детектировали антителом к CTP и легкую цепь детектировали антителами как к FVII, так и к Gla.
Фиг. 27. Показано, что хромогенная активность FVII-CTP3 повышалась в результате очистки на колонке с керамическим гидроксиапатитом (ГА). Осуществляли сравнительную оценку активности in vitro собранного FVII-CTP3, фракций в процессе очистки и очищенного FVII-CTP3 по сравнению с объединенной нормальной плазмой человека, применяя доступный для приобретения набор для анализа хромогенной активности BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). Готовили серийные разведения собранного FVIICTP3 и белка и оценивали эффективность путем сравнения кривой дозовой зависимости с таковой для эталонного лекарственного средства нормальной плазмы человека.
Фиг. 28. Представлен ФК профиль FVIIa-CTP3 по сравнению с NovoSeven® у мышей, лишенных FVIII. FVIIa-CTP3 получали после селекции FVII, процесса очистки на ГА-колонке и активации. FVIIaCTP3 или NovoSeven® вводили однократной внутривенной инъекцией гемофильным мышам FVIII-/-. Образцы крови отбирали из ретроорбитального синуса через 0,083, 0,5 2, 8, 24, 48 и 72 ч после введения. Цитратную плазму (0,38%) получали незамедлительно после взятия образцов и хранили при -20°C до проведения анализа, и ФК профиль определяли на основании свертывающей активности FVIIa, применяя доступный для приобретения набор STACLOT.
Фиг. 29. Показано, что FVIIa-CTP3 получали после селекции FVII, процесса очистки на ГА-колонке и активации. FVIIa-CTP3 или NovoSeven® вводили однократной внутривенной инъекцией гемофильным мышам FVIII-/-. Образцы крови отбирали из ретроорбитального синуса через 0,083, 0,5 2, 8, 24, 48 и 72 ч после введения. Цитратную плазму (0,38%) получали незамедлительно после взятия образцов и хранили при -20°C до проведения анализа. Параметры образования тромбина оценивали в процессе ФКэксперимента, и оценивали параметры, включающие максимальное количество на пик, количество тромбина в каждый момент времени и скорость образования тромбина.
Фиг. 30. Представлены кривые выживаемости мышей с гемофилией после рассечения хвостовой вены (РХВ). РХВ осуществляли через (A) 15 мин, (B) 24 ч или (C) 48 ч после введения. За выживаемостью мышей наблюдали в течение 24 ч после РХВ и регистрировали каждый час в течение первых 12 ч, а затем через 24 ч. На фиг. 30D кратко описана выживаемость мышей, зарегистрированная через 24 ч после РХВ. Результаты для контрольной группы (среда) являются результирующими по 3 экспериментам по 5 мышей/эксперимент.
Фиг. 31. Представлены иммуноблоты FVII - 3 CTP и FVII - 5 CTP. A) блоттинг GLA, B) блоттинг FVIIa, C) блоттинг CTP.
Фиг. 32. Представлен сравнительный ФК профиль FVII-3 и 5 CTP после селекции и очистки на ГАколонке (FVIIS по сравнению с ГА-FVII).
Фиг. 33. Представлен сравнительный ФК профиль FVII-3 и 5 CTP. Второе исследование (внутривенное (в/в) введение по сравнению с подкожным (п/к)).
Фиг. 34. Представлены кривые выживаемости мышей с гемофилией после рассечения хвостовой вены (РХВ). РХВ осуществляли через 12 ч после п/к введения. За выживаемостью мышей наблюдали в течение 24 ч после РХВ и регистрировали каждый час в течение первых 12 ч, а затем через 24 ч.
Фиг. 35. Представлен ФК профиль MOD-5014 по сравнению с NovoSeven® после в/в или п/к введения. A) представлено в/в введение; B) представлено п/к введение.
Фиг. 36. Представлен ФК профиль MOD-5014 (клон 61 #75, #81) по сравнению с NovoSeven® после однократного п/к введения.
Подробное описание изобретения
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложены факторы свертывания крови пролонгированного действия и способы их получения и применения. В другом варианте реализации факторы свертывания крови пролонгированного действия содержат карбоксиконцевой пептид (CTP, также называемый молекулой CTP). В другом варианте реализации полипептиды пролонгированного действия, которые содержат фактор свертывания крови, дополнительно содержат карбоксиконцевой пептид (CTP) хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). В другом варианте реализации CTP действует как защитный агент от деградации фактора свертывания крови. В другом варианте реализации CTP повышает величину максимальной концентрации (Cmax) фактора свертывания крови. В другом варианте реализации CTP повышает время достижения максимальной концентрации (Tmax) фактора свертывания крови. В другом варианте реализации CTP продлевает период полужизни из кровообращения фактора свертывания крови. В некоторых вариантах реализации, CTP повышает активность фактора свертывания крови.
В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ увеличения биологического периода полужизни фактора свертывания крови, включающий этап присоединения от одного до десяти CTP к карбоксильному концу фактора свертывания крови, вследствие чего продлевается биологический
- 5 044349 период полужизни фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ увеличения биологического периода полужизни фактора свертывания крови, включающий этап присоединения от одного до пяти CTP к карбоксильному концу фактора свертывания крови, вследствие чего продлевается биологический период полужизни фактора свертывания крови. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ увеличения периода полужизни из кровообращения фактора свертывания крови. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ увеличения периода полужизни фактора свертывания крови. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ увеличения периода полужизни фактора свертывания крови. Фактор свертывания крови VII (FVII) представляет собой гликопротеин, состоящий из 444 аминокислот (50 кДа), секретируемый гепатоцитами в кровоток в виде неактивного профермента. При повреждении ткани и при контакте с циркулирующей кровью, FVII образует комплекс с тканевым фактором (TF), который представляет собой истинный рецепторный белок для FVII и экспрессируется различными клетками, локализованными в более глубоких слоях стенки сосуда. Образование данного комплекса FVII-TF приводит к активации FVII. Активированный FVII (FVIIa) запускает внешний путь свертывания крови путем активации фактора IX и фактора X.
FVII принадлежит к группе зависимых от витамина K гликопротеинов, связанных с системой свертывания крови. Кроме FVII, данная группа состоит из фактора IX, фактора X, протеина C и протромбина. Данные белки обладают сходной доменной организацией и синтезируются в виде предшественников с Nконцевым пропептидом, за которым следует зрелая последовательность аминокислот. Пропептид содержит сайт присоединения гамма-карбоксилазы, которая превращает глутаминовую кислоту (Glu) в гаммакарбоксиглутаминовую кислоту (Gla). За этим доменом следует два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF), соединительный участок (СУ) и C-концевой домен сериновой протеазы. Перед секрецией, пропептид FVII отщепляется, образуя состоящий из 406 аминокислот одноцепочечный зимоген гликопротеина FVII. После секреции, белок можно активировать путем расщепления в СУ с получением связанного дисульфидной связью двухцепочечного гетеродимера, FVIIa. Концентрация FVII в плазме составляет 10 нМ и приблизительно 1% циркулирует в активной форме у здоровых индивидов.
Фактор IX (FIX) представляет собой гликопротеин, состоящий из 415 аминокислот (55 кДа); он принадлежит к группе зависимых от витамина K гликопротеинов, связанных с системой свертывания крови. FIX обладает сходной доменной организацией с фактором FVII, фактором X, протеином C и протромбином, которые синтезируются в виде предшественников с N-концевым пропептидом, за которым следует зрелая последовательность аминокислот.
FIX секретируется в виде одноцепочечной молекулы, которая подвергается сложным посттранскрипционным модификациям, многие из которых необходимы для его биохимических и фармакокинетических свойств. Среди всех посттранскрипционных модификаций, 12 остатков глутаминовой кислоты около аминоконца FIX, которые гамма-карбоксилируются зависимой от витамина K гаммакарбоксилазой, являются наиболее важными. Карбоксилирование необходимо для взаимодействия FIX с фосфолипидными поверхностями и для оптимальной активности FIX. Аминоконцевой пропептид служит сайтом узнавания для гамма-карбоксилазы и, таким образом, после гамма-карбоксилирования он отщепляется сериновой протеазой аппарата Гольджи, известной как фермент, расщепляющий белок в месте спаренных основных аминокислот (PACE/фурин). В аппарате Гольджи могут произойти четыре дополнительные посттранскрипционные модификации: сульфатация тирозина 155, фосфорилирование серина 158, O-гликозилирование по серину Ser 63 и 61 и, наконец, N-гликозилирование по аспарагину Asn 157 и 16, - но не было выявлено их необходимости для правильной активности FIX.
FIX циркулирует в плазме (средняя концентрация 5 мкг/мл) в виде одноцепочечного неактивного зимогена. При протеолитическом расщеплении двух пептидных связей Arg 145 и Arg 180 одним или двумя физиологическими активаторами, комплексом FVIIa-TF или FIXa, активационный пептид удаляется, превращая FIX в полностью активный фермент, состоящий из легкой и тяжелой цепи, которые скрепляются одной дисульфидной связью. N-концевая легкая цепь содержит некаталитическую гаммакарбоксиглутаминовую кислоту (Gla) и два домена, подобных эпидермальному фактору роста, тогда как C-концевая тяжелая цепь содержит трипсин-подобный каталитический домен молекулы. FIXa отдельно обладает слабой каталитической активностью. Тем не менее, когда он образует комплекс с FVIII, его протеолитическая активность возрастает на 4-5 порядков величины по отношению к его природному субстрату FX.
В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ увеличения биологического периода полужизни или способ увеличения площади под фармакокинетической кривой (AUC) фактора свертывания крови, включающий этап присоединения от одного до десяти CTP к карбоксильному концу фактора свертывания крови, вследствие чего продлевается биологический период полужизни или увеличивается AUC фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ увеличения биологического периода полужизни или способ увеличения площади под фармакокинетической кривой (AUC) фактора свертывания крови, включающий этап присоединения от одного до пяти CTP к карбоксильному концу фактора свертывания крови, вследствие чего продлевается биологический период полужизни или увеличивается AUC фактора свертывания крови. В другом варианте реа
- 6 044349 лизации в настоящей заявке предложен способ увеличения биологического периода полужизни или способ увеличения площади под фармакокинетической кривой (AUC) FIX, включающий этап присоединения от одного до пяти CTP к карбоксильному концу FIX, вследствие чего продлевается биологический период полужизни или увеличивается AUC FIX. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ увеличения биологического периода полужизни или способ увеличения площади под фармакокинетической кривой (AUC) FVII или FVIIa, включающий этап присоединения от одного до пяти CTP к карбоксильному концу FVII или FVIIa, вследствие чего продлевается биологический период полужизни или увеличивается AUC FVII или FVIIa. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ увеличения биологического периода полужизни полипептида фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, вследствие чего продлевается биологический период полужизни указанного полипептида FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ увеличения биологического периода полужизни полипептида фактора VIIa (FVIIa), включающий этап присоединения до пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa, вследствие чего продлевается биологический период полужизни указанного полипептида FVIIa. В одном варианте реализации три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина присоединяют к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa. В другом варианте реализации четыре карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина присоединяют к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa. В другом варианте реализации пять карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина присоединяют к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ увеличения площади под фармакокинетической кривой (AUC) полипептида фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, вследствие чего увеличивается AUC указанного полипептида FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ увеличения площади под фармакокинетической кривой (AUC) полипептида фактора VIIa (FVIIa), включающий этап присоединения до пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa, вследствие чего увеличивается AUC указанного полипептида FVIIa. В одном варианте реализации три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина присоединяют к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa. В другом варианте реализации четыре карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина присоединяют к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa. В другом варианте реализации пять карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина присоединяют к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa.
В другом варианте реализации фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению представляет собой белок. В другом варианте реализации фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению представляет собой пептид. В другом варианте реализации фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению представляет собой полипептид. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фермент. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой сериновую протеазу. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой гликопротеин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой трансглутаминазу. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой неактивный зимоген. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой любой фактор свертывания крови, известный специалисту в данной области.
В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор VIII (FVIII). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор V (FV). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор XIII (FXIII). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор X (FX). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фибрин.
В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор VIIa (FVIIa). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор VII (FVII). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор IX (FIX). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор X (FX). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор XIa (FXIa). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор XII (FXII). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор Xa (FXa). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор Va (FVa). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой протромбин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой тромбин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор XI (FXI). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор фон Виллебранда (vWF). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой
- 7 044349 фактор Villa (FVIIIa). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой FVIII с удаленным доменом В (FVIIIBDD). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой FVIII с удаленным B-доменом (FVIIIBDD). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой FVIII с удаленным бета-доменом (FVIIIBDD). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор IXa (FIXa). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой прекалликреин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой калликреин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор XIIa (FXIIa). В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фибриноген. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой тромбомодулин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор II (FII).
В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой гликопротеин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой зависимый от витамина K гликопротеин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой независимый от витамина K гликопротеин.
В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный белок. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный гликопротеин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный гликопротеин FV. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FVI. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FVII. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FVIII. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FIX. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FX. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FXI. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FXII. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FvW. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FII. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FIXa. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FXIa. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный фибрин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FVIIa. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FXa. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FVa. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный протромбин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный тромбин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FVIIIa. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный прекалликреин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный калликреин. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой рекомбинантный FXIIa. В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой любой известный рекомбинантный фактор свертывания крови. В другом варианте реализации фактор свертывания крови, содержащий сигнальный пептид, представляет собой любой известный рекомбинантный фактор свертывания крови.
В другом варианте реализации фактор свертывания крови содержит 1-10 повторов CTP, присоединенных к C-концу, и не содержит CTP, присоединенных к N-концу. В другом варианте реализации фактор свертывания крови содержит по меньшей мере один CTP, присоединенный к C-концу, и не содержит CTP, присоединенных к N-концу. В другом варианте реализации фактор свертывания крови, содержащий 1-10 повторов CTP, присоединенных к C-концу, и не содержащий CTP, присоединенных к N-концу, представляет собой сконструированный фактор свертывания крови. В другом варианте реализации фактор свертывания крови, содержащий по меньшей мере один CTP, присоединенный к C-концу, и не содержащий CTP, присоединенных к N-концу, представляет собой сконструированный фактор свертывания крови. В другом варианте реализации фактор свертывания крови, содержащий 1-10 повторов CTP, присоединенных к C-концу, и не содержащий CTP, присоединенных к N-концу, представляет собой конъюгированный фактор свертывания крови. В другом варианте реализации фактор свертывания крови, содержащий по меньшей мере один CTP, присоединенный к C-концу, и не содержащий CTP, присоединенных к N-концу, представляет собой конъюгированный фактор свертывания крови.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид CTPмодифицированного фактора IX (FIX), состоящий из полипептида FIX и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного CTP-модифицированного полипептида FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению дополнительно предложен полипептид CTP-модифицированного фактора VIIa (FVIIa), состоящий из полипептида FVIIa и пяти карбок- 8 044349 сиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного FVIIa.
В другом варианте реализации фактор свертывания крови представляет собой фактор свертывания крови, обладающий доменной организацией, сходной или идентичной доменной организации FIX, FVII, фактора X, протеина C или протромбина. В другом варианте реализации фактор свертывания крови синтезируется в виде предшественника с N-концевым пропептидом. В другом варианте реализации фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, находится в неактивной форме профермента. В другом варианте реализации фактор свертывания крови продуцируется в гепатоцитах. В другом варианте реализации фактор свертывания крови содержит сайт присоединения гамма-карбоксилазы, которая превращает глутаминовую кислоту (Glu) в гамма-карбоксиглутаминовую кислоту (Gla). В другом варианте реализации фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, представляет собой доступный для приобретения фактор свертывания крови.
В одном варианте реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фактор VII, включает следующую последовательность нуклеиновых кислот:
ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggagga agcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaagg aggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggacc agtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccgg aactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaa gcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacct attctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcct gttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaaga actggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtc atcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtg gtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctgg accgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtggg agactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccac atgccacccactaccggggcacgtggtacctgacgggcatcgtcagctggggccagggctgcgcaaccgtgggccactttggggtgtac accagggtctcccagtacatcgagtggctgcaaaagctcatgcgctcagagccacgcccaggagtcctcctgcgagccccatttccctga ggatgcggccgc (SEQ ID NO: 11).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фактора VII включает следующую последовательность аминокислот:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEE QCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRN CETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIP ILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKI KNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDH VVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSR KVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVG HFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP (SEQ Ш NO: 9).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фактора VII включает следующую последовательность аминокислот:
- 9 044349
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEE QCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRN CETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIP ILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKI KNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDH VVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSR KVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVG HFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP*GCGR (SEQ ID NO: 10).
В другом варианте реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фактор VIICTP (присоединенный к карбоксильному концу), включает следующую последовательность нуклеиновых кислот:
ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggagga agcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaagg aggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggacc agtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccgg aactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaa gcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacct attctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcct gttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaaga actggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtc atcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtg gtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctgg accgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtggg agactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccac atgccacccactaccggggcacgtggtacc tgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctg cagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcct gcccagccctagcagactgcctgggcccagcgacacccccatcctgccccagtgaggatccgcggccgc (SEQ TO NO: 12).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фактора VII-CTP (присоединенного к карбоксильному концу) включает следующую последовательность аминокислот:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEE QCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRN CETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIP ILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKI KNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDH VVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSR KVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVG HFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ * (SEQIDNO: 13).
В другом варианте реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фактор VIICTP-CTP (присоединенные к карбоксильному концу), включает следующую последовательность нуклеиновых кислот:
- 10 044349 ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggagga agcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaagg aggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggacc agtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccgg aactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaa gcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacct attctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcct gttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaaga actggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtc atcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtg gtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctgg accgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtggg agactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccac atgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtac accagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccag cagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagct cctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgccaggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggat ccgcggccgc (SEQ ID NO: 14).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фактора VII-CTP-CTP (присоединенных к карбоксильному концу) включает следующую последовательность аминокислот:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEE QCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRN CETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIP ILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKI KNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDH VVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSR KVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVG HFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ** (SEQ ID NO: 15).
В другом варианте реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фактор VIICTP-CTP-CTP (присоединенные к карбоксильному концу), включает следующую последовательность нуклеиновых кислот:
- 11 044349 ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggagga agcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaagg aggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggacc agtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccgg aactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaa gcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacct attctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcct gttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaaga actggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtc atcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtg gtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctgg accgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtggg agactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccac atgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtac accagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccag cagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctc cagcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaagg ctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtgatgaggatccgcggccgcttaa ttaa (SEQ ID NO: 24).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фактора VII-CTP-CTP-CTP (присоединенных к карбоксильному концу) включает следующую последовательность аминокислот:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEE QCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRN CETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIP ILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKI KNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDH VVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSR KVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVG HFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ** (SEQ Ш NO: 25).
В другом варианте реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фактор VII(CTP)4 (присоединенные к карбоксильному концу), включает следующую последовательность нуклеиновых кислот:
- 12 044349 ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggagga agcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaagg aggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggacc agtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccgg aactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaa gcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacct attctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcct gttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaaga actggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtc atcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtg gtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctgg accgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtggg agactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccac atgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtac accagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccag cagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctc cagcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaagg ctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtgatgaggatccgc (SEQ ID NO: 26).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фактора VII-(CTP)4 (присоединенных к карбоксильному концу) включает следующую последовательность аминокислот:
LEDMVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLEREC KEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFE GRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPC GKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHC FDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVL TDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQ QSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCA TVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPI LPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**G (SEQ Ш NO: 27).
В другом варианте реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фактор VII(CTP)5 (присоединенные к карбоксильному концу), включает следующую последовательность нуклеиновых кислот:
- 13 044349 ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcagtcttcgtaacccaggagga agcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaagg aggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggacc agtgtgcctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagggccgg aactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaa gcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacct attctagaaaaaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcct gttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaaga actggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtc atcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtg gtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctgg accgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtggg agactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccac atgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtac accagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccag cagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcc tctaaggctccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaaggc tcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctcccc ccagtctgccctctccaagcagactccctggcccttcagacactccaatcctcccacagtcctctagctctaaagctccacctcccagcctgc ccagccctagtagactccccggaccttctgatacccccatcttgccccagtgatgaggatccgc (SEQ ID NO: 28).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фактора VII-(CTP)5 (присоединенных к карбоксильному концу) включает следующую последовательность аминокислот:
LEDMVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLEREC KEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFE GRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPC GKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHC FDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVL TDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQ QSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCA TVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPI LPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKA PPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**GS (SEQ ID NO: 29).
В другом варианте реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фактор IX, включает следующую последовательность нуклеиновых кислот:
- 14 044349 gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccattgccttttaggatatctactcagtgctgaatgta cagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaacctt gagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagta tgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggattt gaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtt tgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaa cttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagca cccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgat gcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtga acataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagta caaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaa catcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttctccagtaccttagagttc cacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattca tgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaat gaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcacttgaacgcggccgc (SEQ ID NO: 16).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фактора IX включает следующую последовательность аминокислот:
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGN LERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYEC WCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVP FPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKP GQFPWQWLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQK RNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSG WGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGG PHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT* (SEQ Ш NO: Π)·
В другом варианте реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фактор IXCTP (присоединенный к карбоксильному концу), включает следующую последовательность нуклеиновых кислот:
- 15 044349 gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgt acagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaacc ttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagt atgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggat ttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtgg tttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaa acttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagc acccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgat gcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtga acataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagta caaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaa catcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttcc acttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcat gtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatg aaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggccc ctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagtgatgaaggtctggatccgcggcc gc (SEQ ID NO: 18).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фактора IX-CTP (присоединенного к карбоксильному концу) включает следующую последовательность аминокислот:
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGN LERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYEC WCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVP FPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKP GQFPWQWLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQK RNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSG WGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGG PHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPS PSRLPGPSDTPILPQ** (SEQ ID NO: 19).
В другом варианте реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фактор IXCTP-CTP (присоединенные к карбоксильному концу), включает следующую последовательность нуклеиновых кислот:
- 16 044349 gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgt acagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaacc ttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagt atgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggat ttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtgg tttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaa acttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatcactcaaagc acccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgat gcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtga acataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagta caaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctacaaggaatacacgaac atcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttcca cttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgt caaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaa aggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccct cccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctcca tccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatccgcggccgc (SEQ ID NO: 20).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фактора IX-CTP-CTP (присоединенных к карбоксильному концу) включает следующую последовательность аминокислот:
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGN LERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYEC WCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVP FPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKP GQFPWQWLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQK RNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSG WGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGG PHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPS PSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ** (SEQ Ш NO: 21).
В другом варианте реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фактор IX(CTP)3 (присоединенные к карбоксильному концу), включает следующую последовательность нуклеиновых кислот:
- 17 044349 tctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagt gctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttca agggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaatttt ggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgt ccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgata acaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagttt ctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacat cactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatg gtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgt cgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagcta ttaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaagga atacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtacc ttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggta gagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagag tgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcag caaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctccagcaagg ccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaaggctccccctc catctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtgatgaggatccgcggccgc (SEQ ID NO: 30).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фактора IX-(CTP)3 (присоединенных к карбоксильному концу) включает следующую последовательность аминокислот:
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGN LERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYEC WCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVP FPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKP GQFPWQWLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQK RNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSG WGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGG PHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPS PSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSD TPILPQ** (SEQIDNO: 31).
В другом варианте реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фактор IX(CTP)4 (присоединенные к карбоксильному концу), включает следующую последовательность нуклеиновых кислот:
- 18 044349 tctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagt gctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttca agggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaatttt ggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgt ccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgata acaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagttt ctgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacat cactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatg gtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgt cgcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagcta ttaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaagga atacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtacc ttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggta gagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagag tgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcag caaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctctaaggcc ccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaaggctcccccac ctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtctgc cctctccaagcagactccctggcccttcagacactcccattctgccacagtgatgaggatccgcggccgc (SEQ ID NO: 32).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фактора IX-(CTP)4 (присоединенных к карбоксильному концу) включает следующую последовательность аминокислот:
SRVDPAMQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEE FVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDI NSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKWCSCTEGYRLAENQKSC EPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGG EDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETE HTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGS GYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQ GDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKA PPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSR LPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**GSAA (SEQ ID NO: 33).
В другом варианте реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фактор IX(CTP)5 (присоединенные к карбоксильному концу), включает следующую последовательность нуклеиновых кислот:
- 19 044349 ctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtg ctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaa gggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttg gaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtc cctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataa caaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttc tgtttcacaaacttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataacatc actcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatgg taaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtc gcaggtgaacataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctat taataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaa tacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtacct tagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggta gagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagag tgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcag caaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctctaaggct ccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaaggctcccccac ctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtctgc cctctccaagcagactccctggcccttcagacactccaatcctcccacagtcctctagctctaaagctccacctcccagcctgcccagcccta gtagactccccggaccttctgatacccccatcttgccccagtgatgaggatccgcggccgc (SEQ ID NO: 34).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фактора IX-(CTP)5 (присоединенных к карбоксильному концу) включает следующую последовательность аминокислот:
RVDPAMQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEF VQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDIN SYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCE PAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGE DAKPGQFPWQWLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEH TEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSG YVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQG DSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPP PSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLP GPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILP Q**GSAA (SEQ Ш NO: 35).
В другом варианте реализации в клетку, экспрессирующую фактор свертывания крови-CTP согласно настоящему изобретению, добавляют фурин. В другом варианте реализации фурин повышает эффективность продукции в клетке фактора свертывания крови-CTP согласно настоящему изобретению. В другом варианте реализации фурин котрансфицируют с вектором, включающим кодирующую последовательность фактора свертывания крови-CTP согласно настоящему изобретению. В другом варианте реализации фурин кодируется отдельным вектором. В другом варианте реализации фурин и фактор свертывания крови-CTP кодируются одним вектором. В другом варианте реализации последовательность, кодирующую фурин, встраивают в pCI-DHFR. В другом варианте реализации последовательность, кодирующую фурин, встраивают в pCI-dhfr/smaI+NotI, Furin/AsisI F.I.+NotI.
В другом варианте реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фурин, включает следующую последовательность нуклеиновых кислот:
- 20 044349 tctagagtcgaccccgccatggagctgaggccctggttgctatgggtggtagcagcaacaggaaccttggtcctgctagcagctgatgctc agggccagaaggtcttcaccaacacgtgggctgtgcgcatccctggaggcccagcggtggccaacagtgtggcacggaagcatgggtt cctcaacctgggccagatcttcggggactattaccacttctggcatcgaggagtgacgaagcggtccctgtcgcctcaccgcccgcggca cagccggctgcagagggagcctcaagtacagtggctggaacagcaggtggcaaagcgacggactaaacgggacgtgtaccaggagcc cacagaccccaagtttcctcagcagtggtacctgtctggtgtcactcagcgggacctgaatgtgaaggcggcctgggcgcagggctacac agggcacggcattgtggtctccattctggacgatggcatcgagaagaaccacccggacttggcaggcaattatgatcctggggccagtttt gatgtcaatgaccaggaccctgacccccagcctcggtacacacagatgaatgacaacaggcacggcacacggtgtgcgggggaagtgg ctgcggtggccaacaacggtgtctgtggtgtaggtgtggcctacaacgcccgcattggaggggtgcgcatgctggatggcgaggtgaca gatgcagtggaggcacgctcgctgggcctgaaccccaaccacatccacatctacagtgccagctggggccccgaggatgacggcaaga cagtggatgggccagcccgcctcgccgaggaggccttcttccgtggggttagccagggccgaggggggctgggctccatctttgtctgg gcctcggggaacgggggccgggaacatgacagctgcaactgcgacggctacaccaacagtatctacacgctgtccatcagcagcgcca cgcagtttggcaacgtgccgtggtacagcgaggcctgctcgtccacactggccacgacctacagcagtggcaaccagaatgagaagcag atcgtgacgactgacttgcggcagaagtgcacggagtctcacacgggcacctcagcctctgcccccttagcagccggcatcattgctctca ccctggaggccaataagaacctcacatggcgggacatgcaacacctggtggtacagacctcgaagccagcccacctcaatgccaacgac tgggccaccaatggtgtgggccggaaagtgagccactcatatggctacgggcttttggacgcaggcgccatggtggccctggcccagaat tggaccacagtggccccccagcggaagtgcatcatcgacatcctcaccgagcccaaagacatcgggaaacggctcgaggtgcggaaga ccgtgaccgcgtgcctgggcgagcccaaccacatcactcggctggagcacgctcaggcgcggctcaccctgtcctataatcgccgtggc gacctggccatccacctggtcagccccatgggcacccgctccaccctgctggcagccaggccacatgactactccgcagatgggtttaat gactgggccttcatgacaactcattcctgggatgaggatccctctggcgagtgggtcctagagattgaaaacaccagcgaagccaacaact atgggacgctgaccaagttcaccctcgtactctatggcaccgcccctgaggggctgcccgtacctccagaaagcagtggctgcaagaccc tcacgtccagtcaggcctgtgtggtgtgcgaggaaggcttctccctgcaccagaagagctgtgtccagcactgccctccaggcttcgcccc ccaagtcctcgatacgcactatagcaccgagaatgacgtggagaccatccgggccagcgtctgcgccccctgccacgcctcatgtgccac atgccaggggccggccctgacagactgcctcagctgccccagccacgcctccttggaccctgtggagcagacttgctcccggcaaagcc agagcagccgagagtccccgccacagcagcagccacctcggctgcccccggaggtggaggcggggcaacggctgcgggcagggct gctgccctcacacctgcctgaggtggtggccggcctcagctgcgccttcatcgtgctggtcttcgtcactgtcttcctggtcctgcagctgcg ctctggctttagttttcggggggtgaaggtgtacaccatggaccgtggcctcatctcctacaaggggctgccccctgaagcctggcaggag gagtgcccgtctgactcagaagaggacgagggccggggcgagaggaccgcctttatcaaagaccagagcgccctctgaacgcggccg c (SEQ ID NO: 22).
В другом варианте реализации последовательность аминокислот фурина включает следующую последовательность аминокислот:
MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVARKHGFLN LGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVAKRRTKRDVYQEPT DPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIVVSILDDGIEKNHPDLAGNYDPGA SFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRML DGEVTDAVEARSLGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGL GSIF VWASGNGGREHD SCNCDGYTNSIYTLSIS S ATQFGNVPW YSEAC S STLATTYS SGN QNEKQIVTTDLRQKCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPA HLNANDWATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCiroiLTEPKDI GKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARP HDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSGEWVLEIENTSEANNYGTLTKFTLVLYGTAPEGL PVPPESSGCKTLTSSQACVVCEEGFSLHQKSCVQHCPPGFAPQVLDTHYSTENDVETIRA SVCAPCHASCATCQGPALTDCLSCPSHASLDPVEQTCSRQSQSSRESPPQQQPPRLPPEV EAGQRLRAGLLPSHLPEVVAGLSCAFIVLVFVTVFLVLQLRSGFSFRGVKVYTMDRGLIS YKGLPPEAWQEECPSDSEEDEGRGERTAFIKDQSAL* (SEQ ГО NO: 23).
- 21 044349
В одном варианте реализации термин фактор свертывания крови дополнительно включает гомолог известного фактора свертывания крови. В одном варианте реализации гомолог обладает коагулирующей активностью. В некоторых вариантах реализации, в объем термина гомология согласно настоящему изобретению также входят варианты с делецией, вставкой или заменой, включая замену аминокислоты, и биологически активные фрагменты полипептида. В одном варианте реализации вариант включает консервативные замены, или делеции, вставки, или замены, которые значительно не изменяют трехмерную структуру фактора свертывания крови. В другом варианте реализации делеция, вставка или замена не изменяет исследуемую функцию фактора свертывания крови, который, в одном варианте реализации связывается с определенным партнером по связыванию.
В другом варианте реализации настоящее изобретение включает гомолог фактора свертывания крови. В другом варианте реализации настоящее изобретение включает гомолог фактора свертывания крови, обладающий коагулирующей активностью. В другом варианте реализации настоящее изобретение включает гомолог фактора свертывания крови, осуществляющий функциональное связывание. В другом варианте реализации настоящее изобретение включает гомологи фактора свертывания крови, описанного в настоящем тексте, обладающие коагулирующей активностью. В другом варианте реализации настоящее изобретение включает гомологи фактора свертывания крови, описанного в настоящем тексте, осуществляющие функциональное связывание. В другом варианте реализации гомологи представляют собой, например, полипептиды, которые по меньшей мере на 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологичны фактору свертывания крови, что определяют с применением программного обеспечения BlastP Национального центра биотехнологической информации (NCBI), применяя параметры по умолчанию.
В другом варианте реализации настоящее изобретение включает гомологи фурина. В другом варианте реализации настоящее изобретение включает гомологи фурина, у которых сохранилась интересующая функция, которая в одном варианте реализации представляет собой расщепление белкапредшественника. В другом варианте реализации гомологи представляют собой, например, полипептиды, которые по меньшей мере на 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологичны фурину, что определяют с применением программного обеспечения BlastP Национального центра биотехнологической информации (NCBI), применяя параметры по умолчанию.
В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от одного до десяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от одного до трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от одного до пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови, содержащий по меньшей мере один CTP на карбоксильном конце.
В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от одного до пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови.
В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от одного до пяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови.
Должно быть очевидно, что композиции и способы согласно настоящему изобретению, включающие компоненты или этапы, описанные в настоящем тексте, могут в другом варианте реализации состоять из тех же компонентов или этапов или в другом варианте реализации состоять по существу из тех же компонентов или этапов. В некоторых вариантах реализации, термин включать относится к включению указанного активного агента, такого как CTP-модифицированный фактор свертывания крови, а также к включению других активных агентов, и фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ, мягчительных средств, стабилизаторов и т.д., известных в фармацевтической промышленности. В некоторых вариантах реализации, термин состоящий по существу из относится к композиции, в которой единственный активный ингредиент представляет собой указанный активный ингредиент, тем не менее, могут быть включены также другие соединения, которые нужны для стабилизации, консервирования и т.д. лекарственной формы, но непосредственно не участвуют в терапевтическом действии указанного активного ингредиента. В некоторых вариантах реализации, термин состоящий по существу из
- 22 044349 может относиться к компонентам, которые способствуют высвобождению активного ингредиента. В некоторых вариантах реализации, термин состоящий относится к композиции, которая содержит активный ингредиент и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.
В одном варианте реализации согласно изобретению предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и два карбоксиконцевых пептида (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от двух до трех CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от двух до четырех CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от двух до пяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от двух до шести CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от двух до семи CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от двух до восьми CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от двух до девяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от двух до десяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови.
В одном варианте реализации согласно изобретению предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и три карбоксиконцевых пептида (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от трех до четырех CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от трех до пяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от трех до шести CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от трех до семи CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от трех до восьми CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от трех до девяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от трех до десяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и четыре карбоксиконцевых пептида (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от четырех до пяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от четырех до шести CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от четырех до семи CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от четырех до восьми CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от четырех до девяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от четырех до десяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и пять карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от пяти до шести CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от пяти до семи CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в
- 23 044349 настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от пяти до восьми CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от пяти до девяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий фактор свертывания крови и от пяти до десяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и двух карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от двух до трех CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от двух до четырех CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от двух до пяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от двух до шести CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от двух до семи CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от двух до восьми CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от двух до девяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от двух до десяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от трех до четырех CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от трех до пяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от трех до шести CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от трех до семи CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от трех до восьми CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от трех до девяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от трех до десяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и четырех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от четырех до пяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от четырех до шести CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от четырех до семи CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от четырех до восьми CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от четырех до девяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от четырех до десяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоеди
- 24 044349 ненных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от пяти до шести CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от пяти до семи CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от пяти до восьми CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от пяти до девяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и от пяти до десяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и двух карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от двух до трех CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от двух до четырех CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от двух до пяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от двух до шести CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от двух до семи CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от двух до восьми CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от двух до девяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от двух до десяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от трех до четырех CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от трех до пяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от трех до шести CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от трех до семи CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от трех до восьми CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от трех до девяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от трех до десяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и четырех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от четырех до пяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от четырех до шести CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от четырех до семи CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от четырех до восьми
- 25 044349
CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от четырех до девяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от четырех до десяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от пяти до шести CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от пяти до семи CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от пяти до восьми CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от пяти до девяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и от пяти до десяти CTP, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови.
В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из фактора свертывания крови, на аминоконце которого нет CTP. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из фактора свертывания крови, у которого отсутствует CTP на аминоконце. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из фактора свертывания крови, содержащего по меньшей мере один CTP на карбоксильном конце и не содержащего CTP на аминоконце. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен полипептид, включающий, состоящий по существу из или состоящий из фактора свертывания крови, содержащего несколько CTP на карбоксильном конце, описанного в настоящем тексте, и не содержащего CTP на аминоконце.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, кодирующий полипептид, описанный выше в настоящем тексте.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению дополнительно предложена композиция, содержащая вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий CTPмодифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора IX (FIX) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению дополнительно предложен полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора VIIa (FVIIa) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантный фактор свертывания крови, описанный выше в настоящем тексте. В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен сконструированный фактор свертывания крови, описанный выше в настоящем тексте. В одном варианте реализации сконструированный фактор свертывания крови, описанный выше в настоящем тексте, называют CTP-модифицированным фактором свертывания крови.
В одном варианте реализации CTP, которые присоединяют к карбоксильному концу фактора свертывания крови, присоединены к карбоксильному концу последовательно.
В одном варианте реализации сконструированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, обладает эквивалентной или улучшенной биологической активностью по сравнению с не модифицированным CTP фактором свертывания крови. В другом варианте реализации сконструированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, обладает эквивалентными или улучшенными фармакологическими показателями, по сравнению с не модифицированным CTP фактором свертывания крови. В другом варианте реализации сконструированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, обладает эквивалентной или улучшенной фармакокинетикой, по сравнению с не модифицированным CTP фактором свертывания крови. В другом варианте реализации сконструированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, обладает эквивалентной или улучшенной фармакодинамикой, по сравнению с немодифицированным CTP фактором свертывания крови.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения нарушения свертывания крови или коагуляции. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий введение CTP-модифицированного фактора свертывания крови согласно настоящему изобретению. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвраще- 26 044349 ния и лечения гемофилии у субъекта, включающий введение CTP-модифицированного фактора свертывания крови согласно настоящему изобретению. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ лечения гемофилии у субъекта, включающий введение CTPмодифицированного фактора VII согласно настоящему изобретению.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ лечения гемофилии у субъекта, включающий введение CTP-модифицированного фактора IX согласно настоящему изобретению. В одном варианте реализации гемофилия представляет собой гемофилию B. В одном варианте реализации гемофилия B известна как недостаточность фактора IX или болезнь Кристмаса. В одном варианте реализации гемофилия представляет собой тяжелую гемофилию, которая, в одном варианте реализации описана как гемофилия, при которой уровни факторов свертывания крови составляют 0-1%. В другом варианте реализации гемофилия представляет собой умеренную гемофилию, которая, в одном варианте реализации описана как гемофилия, при которой уровни факторов свертывания крови составляют 1-5%. В другом варианте реализации гемофилия представляет собой легкую гемофилию, которая, в одном варианте реализации описана как гемофилия, при которой уровни факторов свертывания крови составляют 5-50%.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения нарушения свертывания крови или коагуляции у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX), включающего полипептид FIX и три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, , что обеспечивает предотвращение или лечение нарушения свертывания крови или коагуляции у указанного субъекта. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения нарушения свертывания крови или коагуляции у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTPмодифицированного фактора VII (FVII), включающего полипептид FVII и три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVII, , что обеспечивает предотвращение или лечение нарушения свертывания крови или коагуляции у указанного субъекта.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTPмодифицированного фактора IX (FIX), включающего полипептид FIX и три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора VIIa (FVIIa), включающего полипептид FVIIa и три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту одного или более CTP-модифицированных факторов свертывания крови, описанных в настоящем тексте. Таким образом, в одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX), включающего полипептид FIX и три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, и полипептида CTP-модифицированного фактора VIIa (FVIIa), включающего полипептид FVIIa и три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa, благодаря чему лечат гемофилию у указанного субъекта. В одном варианте реализации CTPмодифицированный FIX и CTP-модифицированный FVIIa вводят в составе одной и той же композиции в одно и то же время. В другом варианте реализации CTP-модифицированный FIX и CTP-модифицированный FVIIa вводят в отдельных композициях в одно и то же время. В другом варианте реализации CTP-модифицированный FIX и CTP-модифицированный FVIIa вводят в отдельных композициях в разные моменты времени.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTPмодифицированного фактора IX (FIX) или CTP-модифицированного фактора VII, включающего полипептид FIX или FVII и три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу полипептида указанного FIX или указанного FVII, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX) или CTP-модифицированного фактора VII, включающего полипептид FIX или FVII и четыре карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу полипеп- 27 044349 тида указанного FIX или указанного FVII, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX) или CTP-модифицированного фактора VII, включающего полипептид FIX или FVII и пять карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу полипептида указанного FIX или указанного FVII, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX) или CTP-модифицированного фактора VII, включающего полипептид FIX или FVII и от трех до пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу полипептида указанного FIX или указанного FVII, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX) и CTPмодифицированного фактора VII, включающего полипептид FIX и FVII и три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу полипептида указанного FIX и указанного FVII, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTPмодифицированного фактора IX (FIX) и CTP-модифицированного фактора VII, включающего полипептид FIX и FVII и от трех до пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу полипептида указанного FIX и указанного FVII, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий подкожное или внутривенное введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX) или CTP-модифицированного фактора VII, включающего полипептид FIX или FVII и три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу полипептида указанного FIX или указанного FVII, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий подкожное или внутривенное введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX) или CTP-модифицированного фактора VII, включающего полипептид FIX или FVII и четыре карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу полипептида указанного FIX или указанного FVII, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий подкожное или внутривенное введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX) или CTP-модифицированного фактора VII, включающего полипептид FIX или FVII и пять карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу полипептида указанного FIX или указанного FVII, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий подкожное или внутривенное введение указанному субъекту полипептида CTPмодифицированного фактора IX (FIX) или CTP-модифицированного фактора VII, включающего полипептид FIX или FVII и от трех до пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу полипептида указанного FIX или указанного FVII, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий подкожное или внутривенное введение указанному субъекту полипептида CTPмодифицированного фактора IX (FIX) и CTP-модифицированного фактора VII, включающего полипептид FIX и FVII и три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу полипептида указанного FIX и указанного FVII, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, включающий подкожное или внутривенное введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX) и CTP-модифицированного фактора VII, включающего полипептид FIX и FVII и от трех до пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу полипептида указанного FIX и указанного FVII, что обеспечивает предотвращение или лечение гемофилии у указанного субъекта.
В некоторых вариантах реализации, в настоящей заявке предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, указанный способ включает этап введения субъекту CTP-модифицирован- 28 044349 ного фактора свертывания крови, содержащего от трех до пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида фактора свертывания крови, при этом последовательность указанного CTP-модифицированного фактора свертывания крови выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, 27 или 29, благодаря чему предупреждают гемофилию у указанного субъекта.
В некоторых вариантах реализации, в настоящей заявке предложен способ предотвращения или лечения гемофилии у субъекта, указанный способ включает этап подкожного введения субъекту CTPмодифицированного фактора VII, включающего от трех до пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVII, при этом последовательность указанного CTP-модифицированного FVII выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, 27 или 29, благодаря чему предупреждают гемофилию у указанного субъекта.
В других вариантах реализации, сконструированный фактор свертывания крови предназначен для лечения пациентов с гемофилией B. В одном варианте реализации фактор свертывания крови IX, включающий 3 CTP, последовательно присоединенных к его карбоксильному концу, предназначен для лечения пациентов с гемофилией B. В одном варианте реализации фактор свертывания крови IX, включающий 4 CTP, последовательно присоединенных к его карбоксильному концу, предназначен для лечения пациентов с гемофилией B. В одном варианте реализации фактор свертывания крови IX, включающий 5 CTP, последовательно присоединенных к его карбоксильному концу, предназначен для лечения пациентов с гемофилией B. В другом варианте реализации фактор свертывания крови IX, включающий 2 CTP, последовательно присоединенных к его карбоксильному концу, предназначен для лечения пациентов с гемофилией B. В другом варианте реализации фактор свертывания крови IX, включающий 1 CTP, присоединенный к его карбоксильному концу, предназначен для лечения пациентов с гемофилией B. В других вариантах реализации, сконструированный фактор свертывания крови может уменьшить количество инфузий, необходимых для пациента, уменьшить необходимые для пациента дозы, или уменьшить и то и другое.
В одном варианте реализации фактор свертывания крови IX, включающий 3 CTP, последовательно присоединенных к его карбоксильному концу, проявляет улучшенный ФК профиль, при этом сохраняется его коагулирующая активность по сравнению с собранным FIX-CTP-CTP, собранным FIX-CTP или rhFIX. В одном варианте реализации период полужизни rFIX-CTP3 от 2,5 до 4 раз больший, чем таковой для rFIX у крыс и у мышей, лишенных FIX. В одном варианте реализации введение rFIX-CTP3 значительно продливает прокоагулирующий эффект у мышей, лишенных FIX, на по меньшей мере 76 ч. после введения. В одном варианте реализации введение rFIX-CTP3 вызывает более высокий пик активности, чем у rFIX у мышей, лишенных FIX. В другом варианте реализации фактор свертывания крови IX, включающий 2 CTP, последовательно присоединенных к его карбоксильному концу, проявляет улучшенный ФК профиль, при этом сохраняется его коагулирующая активность по сравнению с собранным FIX-CTP или rhFIX. В другом варианте реализации фактор свертывания крови IX, включающий 2 CTP, последовательно присоединенных к его карбоксильному концу, обладает в 3 раза большим периодом полужизни и в 4,5 раза большей AUC по сравнению с rhFIX.
В другом варианте реализации п/к введение приводит к большей биодоступности CTPмодифицированного FVII по сравнению с рекомбинантным FVII. В другом варианте реализации период полужизни увеличивается и биодоступность (AUC п/к/AUC в/в) повышается после п/к введения FVIIaCTP 3 и 5, по сравнению с п/к введением NovoSeven®. В другом варианте реализации инъецированный подкожно MOD-5014 и MOD-5019 показал улучшенную выживаемость мышей, по сравнению с рекомбинантным FVII (NovoSeven®) (см. пример 8, ниже).
В другом варианте реализации термины CTP-пептид, карбоксиконцевой пептид и последовательность CTP используют взаимозаменяемо в настоящем тексте. В другом варианте реализации карбоксиконцевой пептид представляет собой полноразмерный CTP. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
В другом варианте реализации к N-концу CTP присоединен сигнальный пептид, как описано в US 7553940, который полностью включен в данную заявку посредством ссылки.
В других вариантах реализации, термин сконструированный фактор свертывания крови относится к последовательности аминокислот созревшего фактора свертывания крови. В других вариантах реализации, термин сконструированный фактор свертывания крови относится к последовательности аминокислот фактора свертывания крови, включающей сигнальную последовательность или сигнальный пептид.
В другом варианте реализации термины сигнальная последовательность и сигнальный пептид используют взаимозаменяемо в настоящем тексте. В другом варианте реализации термин последовательность, при описании полинуклеотидной молекулы, может относиться к кодирующей части. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
В другом варианте реализации сконструированный фактор свертывания крови, содержащий по меньшей мере один CTP, описанный в настоящем тексте, обладает повышенной биологической активностью in vivo, по сравнению с тем же фактором свертывания крови без по меньшей мере одного CTP. В
- 29 044349 одном варианте реализации повышенная биологическая активность обуславливается большим периодом полужизни сконструированного фактора свертывания крови, при этом сохраняется по меньшей мере часть биологической активности. В другом варианте реализации повышенная биологическая активность обуславливается повышенной биологической активностью, возникшей в результате модификации CTP. В другом варианте реализации повышенная биологическая активность обуславливается как большим периодом полужизни, так и повышенными функциональными возможностями CTP-модифицированного фактора свертывания крови.
В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере одна последовательность CTP на карбоксильном конце фактора свертывания крови обеспечивает повышенную защиту от деградации фактора свертывания крови. В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере одна последовательность CTP на карбоксильном конце фактора свертывания крови обеспечивает повышенную защиту от клиренса. В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере одна последовательность CTP на карбоксильном конце фактора свертывания крови обеспечивает увеличенное время клиренса. В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере одна последовательность CTP на карбоксильном конце фактора свертывания крови увеличивает Cmax. В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере одна последовательность CTP на карбоксильном конце фактора свертывания крови увеличивает Tmax. В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере одна последовательность CTP на карбоксильном конце фактора свертывания крови увеличивает время полужизни (T1/2).
В другом варианте реализации конъюгированный фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению применяют таким же способом, что и немодифицированный конъюгированный фактор свертывания крови. В другом варианте реализации конъюгированный фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению обладает большим периодом полужизни из кровообращения и временем удерживания в плазме, пониженным клиренсом и повышенной клинической активностью in vivo. В другом варианте реализации благодаря улучшенным свойствам конъюгированного фактора свертывания крови, описанного в настоящем тексте, данный конъюгат вводят с меньшей частотой, чем немодифицированную форму того же фактора свертывания крови.
В другом варианте реализации уменьшение частоты введения приведет к улучшенной стратегии лечения, которая, в одном варианте реализации приведет к улучшению исполнительности пациента, что приведет к улучшению результатов лечения, а также к улучшению качества жизни пациента. В другом варианте реализации по сравнению с обычными конъюгатами факторов свертывания крови, было обнаружено, что конъюгаты, обладающие молекулярной массой и структурой линкера, как у конъюгатов согласно настоящему изобретению, обладают повышенной эффективностью, повышенной стабильностью, повышенными уровнями AUC и увеличенным периодом полужизни из кровообращения.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению дополнительно предложена фармацевтическая композиция, содержащая полипептид CTP-модифицированного фактора IX (FIX), состоящий из полипептида FIX и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного CTP-модифицированного полипептида FIX.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению дополнительно предложена фармацевтическая композиция, содержащая полипептид CTP-модифицированного фактора VIIa (FVIIa), состоящий из полипептида FVIIa и пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного FVIIa.
В другом варианте реализации в настоящей заявке предложена композиция, содержащая конъюгированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложена фармацевтическая композиция, содержащая конъюгированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество конъюгированного фактора свертывания крови, описанного в настоящем тексте. В одном варианте реализации терапевтически эффективное количество конъюгированного фактора свертывания крови определяют в соответствии с такими факторами, как конкретное состояние, от которого лечат, общее состояние пациента, которого лечат, а также другие ингредиенты в указанной композиции.
В другом варианте реализации конъюгированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, полезен для лечения субъектов, страдающих от гемофилии. В другом варианте реализации конъюгированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, полезен для профилактического лечения гемофилии, таким образом снижая риск кровотечения и сопутствующих осложнений. В другом варианте реализации конъюгированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, полезен для лечения субъектов, страдающих от гемофилии, при этом снижая риск выработки ингибирующих антител на экзогенно введенные факторы свертывания крови. В другом варианте реализации конъюгированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, полезен для лечения субъектов, страдающих от гемофилии, таким образом стимулируя гомеостаз.
В одном варианте реализации CTP-модифицированный фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению применяют в терапевтических целях. В другом варианте реализации CTP-модифицированный фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению применяют в профилакти
- 30 044349 ческих целях.
В другом варианте реализации конъюгированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, полезен для лечения субъектов, подверженных избыточному кровотечению или ушибам, или имеющих пролонгированное протромбиновое время (ПТВ) или частичное тромбопластиновое время (ЧТВ). В другом варианте реализации конъюгированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, полезен для лечения субъектов, имеющих приобретенное состояние, которое вызывает кровотечение, такое как дефицит витамина K или заболевание печени. В другом варианте реализации конъюгированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, полезен для лечения субъектов, имеющих недостаточность факторов свертывания крови, которая является приобретенной (в результате других заболеваний) или наследственной, легкой или тяжелой, постоянной или временной. В другом варианте реализации конъюгированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, полезен для лечения субъектов, страдающих от гемофилии A. В другом варианте реализации конъюгированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, полезен для лечения субъектов, страдающих от гемофилии B. В другом варианте реализации конъюгированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, полезен для лечения субъектов, имеющих приобретенную недостаточность вследствие хронических заболеваний, таких как заболевание печени или рак; вследствие острого состояния, такого как диссеминированная внутрисосудистая коагуляция крови (ДВК), при которой с большой скоростью расходуются факторы свертывания крови; или вследствие дефицита витамина K или лечения антагонистом витамина K, таким как варфарин (для продукции факторов II, VII, IX и X требуется витамин K). В другом варианте реализации конъюгированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, полезен для лечения субъектов, страдающих от заболевания, которое вызывает дисбаланс свертывания крови, такого как, но не ограничиваясь перечисленными: заболевание печени, уремия, рак, нарушение костного мозга, воздействие змеиного яда, дефицит витамина K, антикоагуляционная терапия, случайный прием внутрь антикоагулянта варфарина, множественные переливания крови (единицы крови при хранении теряют некоторое количество факторов свертывания крови) или комбинация перечисленных. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ лечения тромбоза глубоких вен у субъекта, включающий введение CTP-модифицированного фактора свертывания крови согласно настоящему изобретению. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения неконтролируемого кровотечения у субъекта с гемофилией, включающий введение CTP-модифицированного фактора свертывания крови согласно настоящему изобретению. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения эпизодов кровотечения у субъекта с гемофилией, включающий введение CTPмодифицированного фактора свертывания крови согласно настоящему изобретению. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ контролирования эпизодов кровотечения у субъекта с гемофилией B (врожденным дефицитом фактора IX).
В другом варианте реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению предназначены для лечения эпизодов кровотечения у пациентов с гемофилией A или В с помощью ингибиторов FVIII или FIX и у пациентов с приобретенной гемофилией; предотвращения кровотечения при хирургических вмешательствах или инвазивных процедурах у пациентов с гемофилией A или В с помощью ингибиторов FVIII или FIX и у пациентов с приобретенной гемофилией; лечения эпизодов кровотечения у пациентов с врожденной недостаточностью FVII и предотвращения кровотечения при хирургических вмешательствах или инвазивных процедурах у пациентов с врожденной недостаточностью FVII. В другом варианте реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению предназначены для лечения или предотвращения мышечных кровотечений. В другом варианте реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению предназначены для лечения или предотвращения суставных кровотечений. В другом варианте реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают терапевтическое или профилактическое лечение носового кровотечения и кровоточивости десен, кровотечения из слизистой оболочки, кровотечения в пределах центральной нервной системы. В другом варианте реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают терапевтическое или профилактическое лечение кровотечения желудочно-кишечного тракта или мозгового кровотечения. В другом варианте реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают терапевтическое или профилактическое лечение редких легких кровотечений. В другом варианте реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают терапевтическое или профилактическое лечение редких умеренных кровотечений. В другом варианте реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают терапевтическое или профилактическое лечение частых легких кровотечений. В другом варианте реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают терапевтическое или профилактическое лечение частых умеренных кровотечений.
В одном варианте реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают терапевтическое или профилактическое лечение бессимптомной гемофилии. В другом варианте реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают терапевтическое или профилактическое лечение легкой - умеренной гемофилии. В другом варианте реализации компози- 31 044349 ции и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают терапевтическое или профилактическое лечение тяжелой гемофилии.
В одном варианте реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают терапевтическое или профилактическое лечение кровоизлияния, которое представляет собой в одном варианте реализации некупируемое кровотечение и в другом варианте реализации внутримозговое кровоизлияние. В другом варианте реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению применяют для терапевтического или профилактического лечения коагулопатии новорожденных; тяжелого заболевания печени; для хирургических процедур с высокой степенью риска; травматической потери крови; для трансплантации костного мозга; тромбоцитопений и нарушения функции тромбоцитов; для неотложного ингибирования действия пероральных антикоагулянтов; врожденных дефицитов факторов V, VII, X и XI; или болезни фон Виллебранда, в одном варианте реализации для терапевтического или профилактического лечения болезни фон Виллебранда с помощью ингибиторов фактора фон Виллебранда.
В одном варианте реализации CTP-модифицированный фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению применяют для лечения у субъекта гемофилии или сопутствующего заболевания, описанного в настоящем тексте. В одном варианте реализации субъект представляет собой человека. В другом варианте реализации субъект представляет собой одомашненное животное. В другом варианте реализации субъект представляет собой млекопитающее. В другом варианте реализации субъект представляет собой сельскохозяйственное животное. В другом варианте реализации субъект представляет собой обезьяну. В другом варианте реализации субъект представляет собой лошадь. В другом варианте реализации субъект представляет собой корову. В другом варианте реализации субъект представляет собой мышь. В другом варианте реализации субъект представляет собой крысу. В другом варианте реализации субъект представляет собой животное из семейства псовых. В другом варианте реализации субъект представляет собой животное из семейства кошачьих. В другом варианте реализации субъект представляет собой животное из семейства бычьих, овечьих, свиньих, лошадиных, мышиных или оленьих. В одном варианте реализации субъект представляет собой мужчину. В другом варианте реализации субъект представляет собой женщину. В одном варианте реализации субъект представляет собой ребенка, в другом варианте реализации подростка, в другом варианте реализации взрослого или, в другом варианте реализации пожилого субъекта. В другом варианте реализации субъект представляет собой пациента детского возраста, в другом варианте реализации пациента старческого возраста.
В другом варианте реализации (CTP)n>1-фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, включает полноразмерный фактор свертывания крови или его активный фрагмент, соединенный посредством пептидной связи на карбоксильном конце по меньшей мере с одной молекулой CTP, при этом на его аминоконце отсутствуют CTP. В другом варианте реализации (CTP)n>1-фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, включает фактор свертывания крови или его активный фрагмент, соединенный посредством пептидной связи с по меньшей мере одной молекулой CTP, которая соединена с дополнительной молекулой CTP посредством пептидной связи, при этом на его аминоконце отсутствуют CTP. В другом варианте реализации одна молекула нуклеиновой кислоты кодирует сконструированный фактор свертывания крови, содержащий по меньшей мере один CTP, присоединенный к его Cконцу, и не содержащий CTP на аминоконце.
В другом варианте реализации CTP присоединен к фактору свертывания крови посредством линкера. В другом варианте реализации линкер, который соединяет последовательность CTP с фактором свертывания крови, представляет собой ковалентную связь. В другом варианте реализации линкер, который соединяет последовательность CTP с фактором свертывания крови, представляет собой пептидную связь. В другом варианте реализации линкер, который соединяет последовательность CTP с фактором свертывания крови, представляет собой замещенную пептидную связь. В другом варианте реализации последовательность CTP включает: DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (SEQ ID NO: 1). В другом варианте реализации последовательность CTP включает: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 2). В другом варианте реализации последовательность CTP включает последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей, описанных в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.
В другом варианте реализации карбоксиконцевой пептид (CTP) согласно настоящему изобретению включает последовательность аминокислот хорионического гонадотропина человека от положения аминокислоты 112 до положения 145, описанную в последовательности SEQ ID NO: 1. В другом варианте реализации последовательность CTP согласно настоящему изобретению включает последовательность аминокислот хорионического гонадотропина человека от положения аминокислоты 118 до положения 145, описанную в последовательности SEQ ID NO: 2. В другом варианте реализации последовательность CTP также начинается от любого положения между положениями 112-118 и заканчивается в положении 145 последовательности аминокислот хорионического гонадотропина человека. В некоторых вариантах реализации, последовательность пептида CTP имеет длину 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34 аминокислоты и начинается от положения 112, 113, 114, 115, 116, 117 или 118 последовательности аминокислот CTP.
В другом варианте реализации пептид CTP представляет собой вариант хорионического гонадотропина CTP, который отличается от нативного CTP на 1-5 консервативных замен аминокислот, как описано
- 32 044349 в патенте США номер 5712122, который включен в данную заявку посредством ссылки. В другом варианте реализации пептид CTP представляет собой вариант хорионического гонадотропина CTP, который отличается от нативного CTP на 1 консервативную замену аминокислоты. В другом варианте реализации пептид CTP представляет собой вариант хорионического гонадотропина CTP, который отличается от нативного CTP на 2 консервативные замены аминокислот. В другом варианте реализации пептид CTP представляет собой вариант хорионического гонадотропина CTP, который отличается от нативного CTP на 3 консервативные замены аминокислот. В другом варианте реализации пептид CTP представляет собой вариант хорионического гонадотропина CTP, который отличается от нативного CTP на 4 консервативные замены аминокислот. В другом варианте реализации пептид CTP представляет собой вариант хорионического гонадотропина CTP, который отличается от нативного CTP на 5 консервативных замен аминокислот.
В другом варианте реализации последовательность аминокислот пептида CTP согласно настоящему изобретению по меньшей мере на 70% гомологична нативной последовательности аминокислот CTP или соответствующему пептиду. В другом варианте реализации последовательность аминокислот пептида CTP согласно настоящему изобретению по меньшей мере на 80% гомологична нативной последовательности аминокислот CTP или соответствующему пептиду. В другом варианте реализации последовательность аминокислот пептида CTP согласно настоящему изобретению по меньшей мере на 90% гомологична нативной последовательности аминокислот CTP или соответствующему пептиду. В другом варианте реализации последовательность аминокислот пептида CTP согласно настоящему изобретению по меньшей мере на 95% гомологична нативной последовательности аминокислот CTP или соответствующему пептиду. В другом варианте реализации последовательность аминокислот пептида CTP согласно настоящему изобретению по меньшей мере на 98% гомологична нативной последовательности аминокислот CTP или соответствующему пептиду.
В другом варианте реализации полинуклеотид, кодирующий пептид CTP согласно настоящему изобретению, по меньшей мере на 70% гомологичен нативной последовательности ДНК CTP человека или соответствующего пептида. В другом варианте реализации полинуклеотид, кодирующий пептид CTP согласно настоящему изобретению, по меньшей мере на 80% гомологичен нативной последовательности ДНК CTP человека или соответствующего пептида. В другом варианте реализации полинуклеотид, кодирующий пептид CTP согласно настоящему изобретению, по меньшей мере на 90% гомологичен нативной последовательности ДНК CTP или соответствующего пептида. В другом варианте реализации полинуклеотид, кодирующий пептид CTP согласно настоящему изобретению, по меньшей мере на 95% гомологичен нативной последовательности ДНК CTP или соответствующего пептида. В другом варианте реализации полинуклеотид, кодирующий пептид CTP согласно настоящему изобретению, по меньшей мере на 98% гомологичен нативной последовательности ДНК CTP или соответствующего пептида.
В одном варианте реализации по меньшей мере одна из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина укорочена. В другом варианте реализации обе последовательности аминокислот CTP хорионического гонадотропина укорочены. В другом варианте реализации 2 из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина укорочены. В другом варианте реализации 3 из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина укорочены. В другом варианте реализации 4 из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина укорочены. В другом варианте реализации 5 из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина укорочены. В другом варианте реализации 2 или более из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина укорочены. В другом варианте реализации все последовательности аминокислот CTP хорионического гонадотропина укорочены. В одном варианте реализации укороченный CTP включает первые 10 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 3. В другом варианте реализации SEQ ID NO: 3 включает следующую последовательность аминокислот (АК): SSSSKAPPPSLP.
В одном варианте реализации укороченный CTP включает первые 10 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 4. В другом варианте реализации SEQ ID NO: 4 включает следующую последовательность аминокислот (АК): SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.
В одном варианте реализации укороченный CTP включает первые 11 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 4. В одном варианте реализации укороченный CTP включает первые 12 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 4. В одном варианте реализации укороченный CTP включает первые 8 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 3. В одном варианте реализации укороченный CTP включает первые 13 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 4. В одном варианте реализации укороченный CTP включает первые 14 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 4. В одном варианте реализации укороченный CTP включает первые 6 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 3. В одном варианте реализации укороченный CTP включает первые 5 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 3.
В одном варианте реализации по меньшей мере одна из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина гликозилирована. В другом варианте реализации обе последовательности аминокислот CTP хорионического гонадотропина гликозилированы. В другом варианте реализации 2 из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина гликозилированы. В другом ва
- 33 044349 рианте реализации 3 из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина гликозилированы. В другом варианте реализации 4 из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина гликозилированы. В другом варианте реализации 5 из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина гликозилированы. В другом варианте реализации 2 или более из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина гликозилированы. В другом варианте реализации все последовательности аминокислот CTP хорионического гонадотропина гликозилированы. В одном варианте реализации последовательность CTP согласно настоящему изобретению включает по меньшей мере один сайт гликозилирования. В одном варианте реализации последовательность CTP согласно настоящему изобретению включает 2 сайта гликозилирования. В одном варианте реализации последовательность CTP согласно настоящему изобретению включает 3 сайта гликозилирования. В одном варианте реализации последовательность CTP согласно настоящему изобретению включает 4 сайта гликозилирования. В одном варианте реализации одна или более из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина полностью гликозилирована. В другом варианте реализации одна или более из последовательностей аминокислот CTP хорионического гонадотропина частично гликозилирована. В одном варианте реализации частичное гликозилирование означает, что один из сайтов гликозилирования CTP гликозилирован. В другом варианте реализации два из сайтов гликозилирования CTP гликозилированы. В другом варианте реализации три из сайтов гликозилирования CTP гликозилированы.
В некоторых вариантах реализации, модификация последовательности CTP обеспечивает преимущество, позволяя применять меньшие дозировки. В некоторых вариантах реализации, модификация последовательностей CTP обеспечивает преимущество, позволяя применять меньшее количество дозировок. В некоторых вариантах реализации, модификация последовательностей CTP обеспечивает преимущество, позволяя оказывать безопасное, пролонгированное действие.
В некоторых вариантах реализации, в настоящем тексте в объем термина полипептид, сконструированный фактор свертывания крови или белок входят нативные полипептиды (либо продукты деградации, либо искусственно синтезированные полипептиды, либо рекомбинантные полипептиды) и пептидомиметики (обычно, искусственно синтезированные полипептиды), а также пептоиды и полупептоиды, которые представляют сбой аналоги полипептидов, которые, в некоторых вариантах реализации, содержат модификации, которые делают полипептиды, включающие фактор свертывания крови, еще более стабильными при нахождении в организме или способными лучше проникать в клетки.
В некоторых вариантах реализации, модификации включают, но не ограничены перечисленными, модификацию C-конца, модификацию полипептидной связи, включая, но не ограничиваясь перечисленными: CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH или CF=CH, модификации остова и модификацию остатков. Способы получения пептидомиметических соединений хорошо известны в данной области и подробно описаны, например, в Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., глава 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992), которая включена посредством ссылки, как если бы она была полностью описана в настоящем тексте. Дополнительные подробности в этом отношении описаны ниже в настоящем тексте.
В некоторых вариантах реализации, полипептидные связи (-CO-NH-) внутри полипептида содержат заместители. В некоторых вариантах реализации, полипептидные связи замещены N-метилированными связями (-N(CH3)-CO-). В некоторых вариантах реализации, полипептидные связи замещены сложноэфирными связями (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-). В некоторых вариантах реализации, полипептидные связи замещены кетометиленовыми связями (-CO-CH2-). В некоторых вариантах реализации, полипептидные связи замещены альфа-азо-связями (-NH-N(R)-CO-), где R представляет собой любой алкил, например метил, карбо-связями (-CH2-NH-). В некоторых вариантах реализации, полипептидные связи замещены гидроксиэтиленовыми связями (-CH(OH)-CH2-). В некоторых вариантах реализации, полипептидные связи замещены тиоамидными связями (-CS-NH-). В некоторых вариантах реализации, полипептидные связи замещены этиленовыми двойными связями (-CH=CH-). В некоторых вариантах реализации, полипептидные связи замещены ретроамидными связями (-NH-CO-). В некоторых вариантах реализации, полипептидные связи замещены производными полипептида (-N(R)-CH2-CO-), где R представляет собой нормальную боковую цепь, естественно присутствующую у атома углерода. В некоторых вариантах реализации, данные модификации могут быть осуществлены по любым связям вдоль пептидной цепи и, в одном варианте реализации по нескольким (2-3 связям) одновременно.
В некоторых вариантах реализации, природные ароматические аминокислоты полипептида, такие как Trp, Tyr и Phe, замещены на синтетические неприродные кислоты, такие как фенилглицин, TIC, нафтилеланин (Nol), метилированные по кольцу производные Phe, галогенированные производные Phe или о-метил-Tyr. В некоторых вариантах реализации, полипептиды согласно настоящему изобретению включают одну или более модифицированных аминокислот или один или более не относящихся к аминокислотам мономеров (например, жирную кислоту, сложные углеводы, и т.д.).
В одном варианте реализации предполагают, что термин аминокислота или последовательность аминокислот включает 20 встречающихся в природе аминокислот; такие аминокислоты часто оказываются посттрансляционно модифицированными in vivo, включая, например, гидроксипролин, фосфосерин
- 34 044349 и фосфотреонин; и другие необычные аминокислоты включают, но не ограничены перечисленными: 2аминоадипиновую кислоту, гидроксилизин, изодесмозин, норвалин, норлейцин и орнитин. В одном варианте реализации аминокислота включает как D-, так и L-аминокислоты.
В некоторых вариантах реализации, полипептиды согласно настоящему изобретению применяют для получения лекарственного средства, в котором полипептиды, включающие фактор свертывания крови, должны находиться в растворимой форме. В некоторых вариантах реализации, полипептиды согласно настоящему изобретению включают одну или более неприродных или природных полярных аминокислот, включая, но не ограничиваясь перечисленными, серин и треонин, которые способны повышать растворимость полипептида благодаря их боковым цепям, содержащим гидроксил.
В некоторых вариантах реализации, сконструированный фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению применяют в линейной форме, хотя для специалиста в данной области должно быть очевидно, что в случаях, когда циклизация сильно не препятствует свойствам сконструированных факторов свертывания крови, также можно применять циклические формы сконструированных факторов свертывания крови.
В некоторых вариантах реализации, сконструированные факторы свертывания крови согласно настоящему изобретению синтезируют биохимическим способом, например, применяя стандартные твердофазные методики. В некоторых вариантах реализации, данные биохимические способы включают исключительно твердофазный синтез, частично твердофазный синтез, конденсацию фрагментов или классический синтез в растворе.
В некоторых вариантах реализации, методики рекомбинантного белка применяют для получения сконструированных факторов свертывания крови согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации, методики рекомбинантного белка применяют для получения относительно длинных полипептидов (например, состоящих из более чем 18-25 аминокислот). В некоторых вариантах реализации, методики рекомбинантного белка применяют для получения больших количеств сконструированных факторов свертывания крови согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации, рекомбинантные методики описаны у Bitter и др., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier и др. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson и др. (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu и др. (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi и др. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 и Brogli и др., (1984) Science 224:838-843, Gurley и др. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 и Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, раздел VIII, стр. 421-463, которые полностью включены в данную заявку посредством ссылки.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена полинуклеотидная молекула, включающая кодирующую часть гена, кодирующего полипептид, включающий фактор свертывания крови и карбоксиконцевые пептиды гонадотропина, присоединенные к карбоксильному концу фактора свертывания крови, описанный выше в настоящем тексте. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена полинуклеотидная молекула, состоящая из кодирующей части гена, кодирующего полипептид, включающий фактор свертывания крови и карбоксиконцевые пептиды гонадотропина, присоединенные к карбоксильному концу фактора свертывания крови, описанный выше в настоящем тексте. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена полинуклеотидная молекула, состоящая по существу из кодирующей части гена, кодирующего полипептид, включающий фактор свертывания крови и карбоксиконцевые пептиды гонадотропина, присоединенные к карбоксильному концу фактора свертывания крови, описанный выше в настоящем тексте.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, кодирующий полипептид, включающий фактор свертывания крови и три карбоксиконцевых пептида гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, описанный выше в настоящем тексте. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, кодирующий полипептид, состоящий из фактора свертывания крови и трех карбоксиконцевых пептидов гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, описанный выше в настоящем тексте. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, кодирующий полипептид, состоящий по существу из фактора свертывания крови и трех карбоксиконцевых пептидов гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, описанный выше в настоящем тексте. В одном варианте реализации полинуклеотид представляет собой полинуклеотидную последовательность. В одном варианте реализации полинуклеотид представляет собой полинуклеотидную молекулу.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен вектор экспрессии, включающий полинуклеотидную молекулу, описанную в настоящем тексте. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора IX (FIX) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора VIIa (FVIIa) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, при- 35 044349 соединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена клетка, содержащая вектор экспрессии, описанный в настоящем тексте. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена клетка, содержащая вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора IX (FIX) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена клетка, содержащая вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора VIIa (FVIIa) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая вектор экспрессии, описанный в настоящем тексте. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора IX (FIX) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий CTPмодифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора VIIa (FVIIa) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая клетку, описанную в настоящем тексте. В другом варианте реализации клетка представляет собой эукариотическую клетку. В другом варианте реализации клетка представляет собой прокариотическую клетку.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ получения CTP-модифицированного фактора свертывания крови, включающий этап присоединения от одного до десяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного фактора свертывания крови, что позволяет получить CTP-модифицированный фактор свертывания крови. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ получения CTP-модифицированного фактора свертывания крови, включающий этап присоединения от одного до десяти полинуклеотидных последовательностей, кодирующих карбоксиконцевой пептид (CTP) хорионического гонадотропина, к карбоксильному концу полинуклеотидной последовательности, кодирующей указанный фактор свертывания крови, что позволяет получить CTP-модифицированный фактор свертывания крови. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ получения полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, что позволяет получить CTP-модифицированный полипептид FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ получения полипептида CTPмодифицированного фактора VIIa (FVIIa), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa, что позволяет получить CTP-модифицированный полипептид FVIIa.
В другом варианте реализации сконструированные факторы свертывания крови согласно настоящему изобретению синтезируют, применяя полинуклеотидную молекулу, кодирующую полипептид согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации, полинуклеотидную молекулу, кодирующую сконструированные факторы свертывания крови согласно настоящему изобретению, лигируют в вектор экспрессии, включающий транскрипционный контроль с помощью цис-регуляторной последовательности (например, промоторной последовательности). В некоторых вариантах реализации, цис-регуляторная последовательность подходит для контролирования конститутивной экспрессии сконструированного фактора свертывания крови согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации, цис-регуляторная последовательность подходит для контролирования тканеспецифичной экспрессии сконструированных факторов свертывания крови согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации, цис-регуляторная последовательность подходит для контролирования индуцируемой экспрессии сконструированных факторов свертывания крови согласно изобретению.
В некотором варианте реализации тканеспецифичные промоторы, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают последовательности, которые функционируют в одной или более конкретных популяциях клеток. Примеры включают, но не ограничены перечисленными, такие промоторы, как промотор альбумина, который специфичен для печени (Pinkert и др., (1987) Genes Dev. 1:268277), специфичные для лимфоидных клеток промоторы (Calame и др., (1988) Adv. Immunol. 43:235-275); в частности, промоторы T-клеточных рецепторов (Winoto и др., (1989) EMBO J. 8:729-733) и промоторы иммуноглобулинов (Banerji и др. (1983) Cell 33729-740), специфичные для нервных клеток промоторы, такие как промотор нейрофиламента (Byrne и др. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), специфичные для поджелудочной железы промоторы (Edlunch и др. (1985) Science 230:912-916) или специфичные для молочной железы промоторы, такие как промотор молочной сыворотки (патент США номер
- 36 044349
4873316 и европейская заявка на петент, номер публикации 264166). Индуцируемые промоторы, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают, например, индуцируемый тетрациклином промотор (Srour, M.A., и др., 2003. Thromb. Haemost. 90: 398-405).
В одном варианте реализации формулировка полинуклеотидная молекула относится к одно- или двунитевой последовательности нуклеиновых кислот, которую выделяют и предоставляют в виде последовательности РНК, комплементарной полинуклеотидной последовательности (кДНК), геномной полинуклеотидной последовательности и/или комбинированных полинуклеотидных последовательностей (например, комбинации описанных выше последовательностей).
В одном варианте реализации комплементарная полинуклеотидная последовательность относится к последовательности, которую получают путем обратной транскрипции матричной РНК, применяя обратную транскриптазу или любую другую РНК-зависимую ДНК полимеразу. В одном варианте реализации последовательность можно впоследствии амплифицировать in vivo или in vitro, применяя ДНКполимеразу. В одном варианте реализации геномная полинуклеотидная последовательность относится к последовательности, полученной (выделенной) из хромосомы и, таким образом, она представляет собой непрерывный участок хромосомы.
В одном варианте реализации комбинированная полинуклеотидная последовательность относится к последовательности, которая является по меньшей мере частично комплементарной и по меньшей мере частично геномной. В одном варианте реализации комбинированная последовательность может включать некоторые экзонные последовательности, необходимые для кодирования полипептида согласно настоящему изобретению, а также некоторые интронные последовательности, вставленные между ними. В одном варианте реализации интронные последовательности могут быть получены из любого источника, включая другие гены, и, как правило, будут включать консервативные сигнальные последовательности сплайсинга. В одном варианте реализации интронные последовательности включают действующие в цис-положении регуляторные компоненты экспрессии.
В одном варианте реализации после экспрессии и секреции, сигнальные пептиды отщепляются от сконструированных предшественников факторов свертывания крови, в результате чего получают зрелые сконструированные факторы свертывания крови.
В некоторых вариантах реализации, полинуклеотиды согласно настоящему изобретению получают, применяя методики ПЦР, или любой другой способ или процедуру, известную специалисту в данной области. В некоторых вариантах реализации, процедура включает лигирование двух различных последовательностей ДНК (см., например, Current Protocols in Molecular Biology, ред. Ausubel и др., John Wiley & Sons, 1992).
В одном варианте реализации полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, которые кодируют сконструированные факторы свертывания крови, встроены в векторы экспрессии (т.е., конструкции нуклеиновых кислот), чтобы позволить экспрессию рекомбинантного полипептида. В одном варианте реализации вектор экспрессии согласно настоящему изобретению включает дополнительные последовательности, которые делают данный вектор подходящим для репликации и встраивания в прокариотов. В одном варианте реализации вектор экспрессии согласно настоящему изобретению включает дополнительные последовательности, которые делают данный вектор подходящим для репликации и встраивания в эукариотов. В одном варианте реализации вектор экспрессии согласно настоящему изобретению включает челночный вектор, который делает данный вектор подходящим для репликации и встраивания как в прокариотов, так и в эукариотов. В некоторых вариантах реализации, векторы для клонирования включают последовательности инициации транскрипции и трансляции (например, промоторы, энхансеры) и терминаторы транскрипции и трансляции (например, сигналы полиаденилирования).
В одном варианте реализации множество прокариотических или эукариотических клеток можно применять в качестве хозяев для систем экспрессии для экспрессии факторов свертывания крови согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации, данные хозяева включают, но не ограничены перечисленными, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным вектором экспрессии ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, включающими кодирующую полипептид последовательность; дрожжи, трансформированные рекомбинантными дрожжевыми векторами экспрессии, включающими кодирующую полипептид последовательность; системы клеток растения, инфицированных рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом табачной мозаики, TMV) или трансформированных рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии, такими как плазмида Ti, включающими кодирующую полипептид последовательность.
В некоторых вариантах реализации, для экспрессии факторов свертывания крови согласно настоящему изобретению применяют небактериальные системы экспрессии (например, системы экспрессии млекопитающих, такие как клетки CHO). В одном варианте реализации вектор экспрессии, который применяют для экспрессии полинуклеотидов согласно настоящему изобретению в клетках млекопитающих, представляет собой вектор pCI-DHFR, включающий промотор CMV и ген устойчивости к неомицину. Конструирование вектора pCI-dhfr описано, согласно одному варианту реализации, в примере 1.
В некоторых вариантах реализации, в бактериальных системах согласно настоящему изобретению,
- 37 044349 можно успешно выбрать множество векторов экспрессии в зависимости от предполагаемого применения экспрессируемого полипептида. В одном варианте реализации желательно получить большие количества полипептида. В одном варианте реализации желательны векторы, которые направляют экспрессию высоких уровней белкового продукта, возможно соединенного с гидрофобной сигнальной последовательностью, которая направляет экспрессированный продукт в периплазму бактерий или культуральную среду, из которой белковый продукт легко очистить. В одном варианте реализации некоторые слитые белки сконструированы таким образом, что они содержат специфичный сайт расщепления, чтобы облегчить получение полипептида. В одном варианте реализации векторы, поддающиеся такой манипуляции, включают, но не ограничены перечисленными, векторы экспрессии в E. coli серии pET (Studier и др., Methods in Enzymol. 185:60-89 (1990)).
В одном варианте реализации применяют дрожжевые системы экспрессии. В одном варианте реализации множество векторов, содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, можно применять в дрожжах, как описано в заявке на патент США номер 5932447, которая полностью включена в данную заявку посредством ссылки. В другом варианте реализации применяют векторы, которые способствуют встраиванию чужеродных последовательностей ДНК в дрожжевую хромосому.
В одном варианте реализации вектор экспрессии согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать дополнительные полинуклеотидные последовательности, которые позволяют, например, транслировать несколько белков с одной мРНК, такие как участок внутренней посадки рибосомы (IRES) и последовательности для встраивания в геном полипептида с химерным промотором.
В некоторых вариантах реализации, векторы экспрессии млекопитающих включают, но не ограничены перечисленными, pcDNA3, pcDNA3,1 (+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3,l, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, которые доступны для приобретения у Invitrogen, pCI, который доступен для приобретения у Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV и pBK-CMV, которые доступны для приобретения у Strategene, pTRES, который доступен для приобретения у Clontech, и их производные.
В некоторых вариантах реализации, в настоящем изобретении применяют векторы экспрессии, включающие регуляторные компоненты из эукариотических вирусов, таких как ретровирусы. Векторы SV40 включают pSVT7 и pMT2. В некоторых вариантах реализации, векторы, полученные из вируса папилломы крупного рогатого скота, включают pBV-1MTHA и векторы, полученные из вируса ЭпштейнаБарр, включают pHEBO и p2O5. Другие примеры векторов включают pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, бакуловирусный pDSVE и любой другой вектор, позволяющий экспрессию белков под контролем раннего промотора SV-40, позднего промотора SV-40, промотора металлотионеина, промотора вируса опухоли молочной железы мыши, промотора вируса саркомы Рауса, промотора полиэдрина или других промоторов, которые эффективны для экспрессии в эукариотических клетках.
В некоторых вариантах реализации, рекомбинантные вирусные векторы полезны для экспрессии in vivo факторов свертывания крови согласно настоящему изобретению, поскольку они дают такие преимущества, как латеральная инфекция и специфичность нацеливания. В одном варианте реализации латеральная инфекция заложена в жизненном цикле, например, ретровируса, и представляет собой процесс, с помощью которого единственная инфицированная клетка продуцирует множество поколений вирионов, которые отпочковываются и заражают соседние клетки. В одном варианте реализации это приводит к тому, что быстро становится инфицированной большая область, большая часть которой не была изначально инфицирована исходными вирусными частицами. В одном варианте реализации получают вирусные векторы, которые не способны распространяться латерально. В одном варианте реализации данное свойство может быть полезно, если желательной целью является введение определенного гена лишь в ограниченное количество целевых клеток.
В одном варианте реализации для введения вектора экспрессии согласно настоящему изобретению в клетки можно применять различные способы. Такие способы в общих чертах описаны в Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Нью-Йорк (1989, 1992), в Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Балтимор, Мэриленд (1989), Chang и др., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega и др., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) и Gilboa и др. (Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986), и включают, например, стабильную или временную трансфекцию, липофекцию, электропорацию и инфекцию рекомбинантными вирусными векторами. Кроме того, описание способов положительной-отрицательной селекции см. в патентах США с номерами 5464764 и 5487992, включенных в данную заявку посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации, введение нуклеиновой кислоты путем вирусной инфекции дает несколько преимуществ над другими способами, такими как липофекция и электропорация, поскольку вследствие инфекционной природы вирусов можно добиться более эффективной трансфекции.
В одном варианте реализации должно быть очевидно, что сконструированные факторы свертывания крови согласно настоящему изобретению также можно экспрессировать с конструкции нуклеиновой кислоты, которую вводят индивиду, используя любой подходящий способ введения, описанный выше в настоящем тексте (т.е. генотерапия in vivo). В одном варианте реализации конструкцию нуклеиновой
- 38 044349 кислоты вводят в подходящую клетку с помощью подходящего носителя/способа доставки генов (трансфекции, трансдукции, гомологичной рекомбинации и т.д.) и системы экспрессии, при необходимости, а затем модифицированные клетки растят в культуре и возвращают в индивида (т.е. генотерапия ex vivo).
В одном варианте реализации применяют векторы экспрессии в растениях. В одном варианте реализации экспрессия последовательности, кодирующей полипептид, запускается множеством промоторов. В некоторых вариантах реализации, применяют вирусные промоторы, такие как промоторы 35S РНК и 19S РНК CaMV (Brisson и др., Nature 310:511-514 (1984)), или промотор белка оболочки TMV (Takamatsu и др., EMBO J. 6:307-311 (1987)). В другом варианте реализации применяют промоторы растений, такие как, например, малая субъединица RUBISCO (Coruzzi и др., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); и Brogli и др., Science 224:838-843 (1984)), или промоторы белков теплового шока, например, hsp17.5-E или hsp17.3-B сои (Gurley и др., Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)). В одном варианте реализации конструкции вводят в клетки растений, применяя плазмиду Ti, плазмиду Ri, вирусные векторы растений, прямую трансформацию ДНК, микроинъекцию, электропорацию и другие методики, хорошо известные квалифицированному специалисту. См., например, Weissbach & Weissbach (Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, раздел VIII, стр. 421-463 (1988)). Другие системы экспрессии, такие как системы клеток-хозяев насекомых и млекопитающих, которые хорошо известны в данной области, также можно применять в настоящем изобретении.
Должно быть очевидно, что кроме необходимых компонентов для транскрипции и трансляции внедренной кодирующей последовательности (кодирующей указанный полипептид), экспрессионная конструкция согласно настоящему изобретению также может включать последовательности, сконструированные для оптимизации стабильности, продукции, очистки, выхода или активности экспрессируемого полипептида.
В некоторых вариантах реализации, трансформированные клетки культивируют при эффективных условиях, которые обеспечивают возможность экспрессии больших количеств рекомбинантных сконструированных факторов свертывания крови. В некоторых вариантах реализации, эффективные условия культивирования включают, но не ограничены перечисленными, эффективные среды, биореактор, температуру, pH и кислородные условия, которые позволяют продуцировать белок. В одном варианте реализации эффективная среда относится к любой среде, в которой культивируют клетку с получением рекомбинантного полипептида согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации, среда обычно включает водный раствор, содержащий усваиваемые источники углерода, азота и фосфата и подходящие соли, минеральные вещества, металлы и другие питательные вещества, такие как витамины. В некоторых вариантах реализации, клетки согласно настоящему изобретению можно культивировать в обычных ферментационных биореакторах, встряхиваемых колбах, пробирках, микротитрационных чашках и чашках Петри. В некоторых вариантах реализации, культивирование осуществляют при температуре, pH и содержании кислорода, подходящих для рекомбинантной клетки. В некоторых вариантах реализации, определение условий культивирования находится в рамках компетенции среднего специалиста в данной области.
В некоторых вариантах реализации, в зависимости от вектора и системы хозяина, используемого для продукции, полученные сконструированные факторы свертывания крови согласно настоящему изобретению либо остаются в рекомбинантной клетке, секретируются в ферментационную среду, секретируются в пространство между двумя клеточными мембранами, такое как периплазматическое пространство у E.coli; либо удерживаются на внешней поверхности клетки или вирусной мембране.
В одном варианте реализации после заранее определенного времени культивирования, осуществляют получение рекомбинантного сконструированного фактора свертывания крови.
В одном варианте реализации формулировка получение рекомбинантного сконструированного фактора свертывания крови, используемая в настоящем тексте, относится к сбору цельной ферментационной среды, содержащей полипептид, и не обязательно предполагает дополнительные этапы выделения или очистки.
В одном варианте реализации сконструированные факторы свертывания крови согласно настоящему изобретению очищают, применяя множество стандартных методик очистки белка, таких как, не ограничиваясь перечисленными, аффинная хроматография, ионообменная хроматография, фильтрация, электрофорез, хроматография гидрофобных взаимодействий, гельфильтрационная хроматография, обращенно-фазовая хроматография, хроматография на конканавалине A, хроматофокусирование и дифференциальное растворение.
В одном варианте реализации чтобы облегчить получение, экспрессированную кодирующую последовательность можно разработать таким образом, чтобы она кодировала сконструированный фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению, слитый с отщепляемой молекулой. В одном варианте реализации слитый белок можно разработать таким образом, чтобы полипептид можно было легко выделить с помощью аффинной хроматографии; например, путем иммобилизации на колонке, специфично связывающей отщепляемую молекулу. В одном варианте реализации между сконструированным фактором свертывания крови и отщепляемой молекулой разрабатывают сайт расщепления, и полипептид можно высвободить из хроматографической колонки путем обработки подходящим ферментом или аген- 39 044349 том, который специфично отщепляет слитый белок в данном сайте (см., например, Booth и др., Immunol.
Lett. 19:65-70 (1988); и Gardella и др., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)).
В одном варианте реализации сконструированный фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению получают в по существу чистой форме.
В одном варианте реализации формулировка по существу чистый относится к чистоте, которая обеспечивает возможность эффективного использования данного белка в применениях, описанных в настоящем тексте.
В одном варианте реализации сконструированный фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению также можно синтезировать, применяя системы экспрессии in vitro. В одном варианте реализации способы синтеза in vitro хорошо известны в данной области и компоненты данной системы доступны для приобретения.
В некоторых вариантах реализации, рекомбинантные сконструированные факторы свертывания крови синтезируют и очищают; их терапевтическую эффективность можно проанализировать либо in vivo, либо in vitro. В одном варианте реализации активности связывания рекомбинантных сконструированных факторов свертывания крови согласно настоящему изобретению можно установить, применяя различные анализы, известные специалисту в данной области.
В другом варианте реализации сконструированный фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению можно давать индивиду сам по себе. В одном варианте реализации сконструированный фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению можно давать индивиду в составе фармацевтической композиции, в которой он смешан с фармацевтически приемлемым носителем.
В другом варианте реализации фармацевтическая композиция относится к препарату одного или более активных ингредиентов, описанных в настоящем тексте, с другими химическими компонентами, такими как физиологически подходящие носители и вспомогательные вещества. Целью получения фармацевтической композиции является облегчение введения соединения в организм.
В другом варианте реализации активный ингредиент относится к интересующей полипептидной последовательности, которая отвечает за биологический эффект.
В другом варианте реализации любая из композиций согласно настоящему изобретению будет содержать по меньшей мере одну последовательность CTP, связанную только с карбоксильным концом интересующего сконструированного фактора свертывания крови, в любой форме. В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложены комбинированные лекарственные средства. В одном варианте реализации комбинированное лекарственное средство означает, главным образом, набор из частей в том смысле, что комбинированные компоненты, описанные выше, можно дозировать независимо или путем применения различных заданных комбинаций с различными количествами комбинированных компонентов, т.е. одновременно, параллельно, отдельно или последовательно. В некоторых вариантах реализации, части указанного набора из частей затем можно, например, вводить одновременно или с разнесением во времени, а именно, в различные моменты времени и с равными или различными интервалами времени для любой части набора из частей. Соотношение суммарных количеств комбинированных компонентов, в некоторых вариантах реализации, можно вводить в виде комбинированного лекарственного средства. В одном варианте реализации комбинированное лекарственное средство можно изменять, например, чтобы удовлетворить нуждам субпопуляции пациентов, которых нужно лечить, или нуждам одного пациента, который может нуждаться в отличном лекарственном средстве вследствие конкретного заболевания, тяжести заболевания, возраста, пола или массы тела, что может легко осуществить специалист в данной области.
В другом варианте реализации формулировки физиологически приемлемый носитель и фармацевтически приемлемый носитель, которые используются взаимозаменяемо, относятся к носителю или разбавителю, который не вызывает существенного раздражения в организме и не нарушает биологическую активность и свойства вводимого соединения. Данные формулировки включают адъювант. В одном варианте реализации один из ингредиентов, включенных в фармацевтически приемлемый носитель, может представлять собой, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), биосовместимый полимер с широким диапазоном растворимости как в органических, так и в водных средах (Mutter и др. (1979)).
В другом варианте реализации вспомогательное вещество относится к инертному веществу, которое добавляют в фармацевтическую композицию, чтобы дополнительно способствовать введению активного ингредиента. В одном варианте реализации вспомогательные вещества включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.
Методики получения и введения лекарственных средств можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Истон, Пенсильвания, последнее издание, которое включено в данную заявку посредством ссылки.
В настоящем изобретении предполагаются различные варианты реализации диапазонов доз. Дозировка сконструированного фактора свертывания крови согласно настоящему изобретению, в одном варианте реализации находится в диапазоне 0,005-100 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 0,005-5 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне
- 40 044349
0,01-50 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 0,1-20 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 0,1-10 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 0,01-5 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 0,001-0,01 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 0,001-0,1 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 0,1-5 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 0,5-50 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 0,2-15 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 0,8-65 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 1-50 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 5-10 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 8-15 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 10-20 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 20-40 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 60-120 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 12-40 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 40-60 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 50-100 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 1-60 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 15-25 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 5-10 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 5565 мг/день.
В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 50-500 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 50-150 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 100-200 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 150-250 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 200-300 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 250-400 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 300-500 мг/день. В другом варианте реализации дозировка находится в диапазоне 350-500 мг/день.
В одном варианте реализации дозировка составляет 20 мг/день. В одном варианте реализации дозировка составляет 30 мг/день. В одном варианте реализации дозировка составляет 40 мг/день. В одном варианте реализации дозировка составляет 50 мг/день. В одном варианте реализации дозировка составляет 0,01 мг/день. В другом варианте реализации дозировка составляет 0,1 мг/день. В другом варианте реализации дозировка составляет 1 мг/день. В другом варианте реализации дозировка составляет 0,530 мг/день. В другом варианте реализации дозировка составляет 0,05 мг/день. В другом варианте реализации дозировка составляет 50 мг/день. В другом варианте реализации дозировка составляет 10 мг/день. В другом варианте реализации дозировка составляет 20-70 мг/день. В другом варианте реализации дозировка составляет 5 мг/день.
В одном варианте реализации дозировка CTP-модифицированного фактора свертывания крови составляет 1-5 мг/день. В одном варианте реализации дозировка CTP-модифицированного фактора свертывания крови составляет 1-3 мг/день. В другом варианте реализации дозировка CTP-модифицированного фактора свертывания крови составляет 2 мг/день.
В другом варианте реализации дозировка составляет 1-90 мг/день. В другом варианте реализации дозировка составляет 1-90 мг/2 дня. В другом варианте реализации дозировка составляет 1-90 мг/3 дня. В другом варианте реализации дозировка составляет 1-90 мг/4 дня. В другом варианте реализации дозировка составляет 1-90 мг/5 дней. В другом варианте реализации дозировка составляет 1-90 мг/6 дней. В другом варианте реализации дозировка составляет 1-90 мг/неделю. В другом варианте реализации дозировка составляет 1-90 мг/9 дней. В другом варианте реализации дозировка составляет 1-90 мг/11 дней. В другом варианте реализации дозировка составляет 1-90 мг/14 дней. В другом варианте реализации дозировка фактора свертывания крови составляет 10-50 мг/день. В другом варианте реализации дозировка составляет 10-50 мг/2 дня. В другом варианте реализации дозировка составляет 10-50 мг/3 дня. В другом варианте реализации дозировка составляет 10-50 мг/4 дня. В другом варианте реализации дозировка составляет 10-50 мг/5 дней. В другом варианте реализации дозировка составляет 10-50 мг/6 дней. В другом варианте реализации дозировка составляет 10-50 мг/неделю. В другом варианте реализации дозировка составляет 10-50 мг/9 дней. В другом варианте реализации дозировка составляет 10-50 мг/11 дней. В другом варианте реализации дозировка составляет 10-50 мг/14 дней.
В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, входит в состав интраназальной лекарственной формы. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, входит в состав инъецируемой лекарственной формы. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне от 0,0001 мг до 0,6 мг. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне от 0,001 мг до 0,005 мг. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне от 0,005 мг до 0,01 мг. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор сверты- 41 044349 вания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне от
0,01 мг до 0,3 мг. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне от 0,2 мг до 0,6 мг. В другом варианте реализации на N-конце фактора свертывания крови отсутствуют CTP.
В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне 1-100 мкг. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне 10-80 мкг. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне 20-60 мкг. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне 10-50 мкг. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне от 40-80 мкг. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне 10-30 мкг. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне от 30-60 мкг.
В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне от 0,2 мг до 2 мг. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне от 2 мг до 6 мг. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне от 4 мг до 10 мг. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту в дозе, находящейся в диапазоне от 5 мг до 15 мг.
В одном варианте реализации дозировка CTP-модифицированного FIX включает 50% от количества FIX, вводимого пациентам в течение того же периода времени в рекомендуемой дозировке рекомбинантного FIX (например, Benefix®, Wyeth или Mononine®, CSL Behring). В одном варианте реализации дозировка CTP-модифицированного FVIIa включает 50% от количества FVIIa, вводимого пациентам в течение того же периода времени в рекомендуемой дозировке рекомбинантного FVIIa (например, NovoSeven®). В одном варианте реализации дозировка CTP-модифицированного FVII включает 50% от количества FVII, вводимого пациентам в течение того же периода времени в рекомендуемой дозировке рекомбинантного FVII. Например, если NovoSeven® дают пациенту до или после операции в дозе, равной 90 мкг/кг, каждые два ч (т.е. 7,65 мг каждые два ч или 45,9 мг шестью дозами в течение 12 ч, для пациента массой 85 кг), CTP-модифицированный фактор свертывания крови согласно настоящему изобретению можно давать в дозе, которая составляет 50% от 12-часовой дозы рекомбинантного FVIIa для данного пациента (т.е. в дозе 23 мг, которую дают однократно в течение 12 ч).
В другом варианте реализации дозировка CTP-модифицированного фактора свертывания крови такова, что она включает 45% от количества фактора свертывания крови, которое вводят, применяя не модифицированный CTP фактор свертывания крови. В другом варианте реализации дозировка CTPмодифицированного фактора свертывания крови такова, что она включает 10% от количества фактора свертывания крови, которое вводят, применяя не модифицированный CTP фактор свертывания крови. В другом варианте реализации дозировка CTP-модифицированного фактора свертывания крови такова, что она включает 25% от количества фактора свертывания крови, которое вводят, применяя не модифицированный CTP фактор свертывания крови. В другом варианте реализации дозировка CTP-модифицированного фактора свертывания крови такова, что она включает 35% от количества фактора свертывания крови, которое вводят, применяя не модифицированный CTP фактор свертывания крови. В другом варианте реализации дозировка CTP-модифицированного фактора свертывания крови такова, что она включает 75% от количества фактора свертывания крови, которое вводят, применяя не модифицированный CTP фактор свертывания крови. В другом варианте реализации дозировка CTP-модифицированного фактора свертывания крови такова, что она включает 100% от количества фактора свертывания крови, которое вводят, применяя не модифицированный CTP фактор свертывания крови. Тем не менее, даже если дозировка включает такое же количество фактора свертывания крови (например, FIX), как и количество не модифицированного CTP фактора свертывания крови, она все же предпочтительна для субъектов, так как ее будут вводить реже благодаря увеличенному периоду полужизни по сравнению с рекомбинантными факторами свертывания крови.
В другом варианте реализации терапевтически эффективное количество конъюгированного фактора свертывания крови находится в диапазоне 50-500 ME на кг массы тела, и его вводят от одного раза в день до одного раза в неделю для FIX или 10-500 мкг/кг для FVIIa. В другом варианте реализации терапевтически эффективное количество конъюгированного фактора свертывания крови составляет 150-250 ME на кг массы тела, и его вводят раз в день. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция,
- 42 044349 содержащая конъюгированный фактор свертывания крови, составлена с такой дозой, которая эффективна для введения пациенту - человеку с помощью различных способов.
В одном варианте реализации FIX вводят в количестве, эффективном для достижения активности фактора IX в кровотоке у субъекта до 20-30 МЕ/дл. В другом варианте реализации FIX вводят в количестве, эффективном для достижения активности фактора IX в кровотоке у субъекта до 25-50 МЕ/дл. В другом варианте реализации FIX вводят в количестве, эффективном для достижения активности фактора IX в кровотоке у субъекта до 50-100 МЕ/дл. В другом варианте реализации FIX вводят в количестве, эффективном для достижения активности фактора IX в кровотоке у субъекта до 100-200 МЕ/дл. В другом варианте реализации FIX вводят в количестве, эффективном для достижения активности фактора IX в кровотоке у субъекта до 10-50 МЕ/дл. В другом варианте реализации FIX вводят в количестве, эффективном для достижения активности фактора IX в кровотоке у субъекта до 20-100 МЕ/дл.
В одном варианте реализации CTP-модифицированный фактор свертывания крови вводят субъекту еженедельно. В другом варианте реализации CTP-модифицированный фактор свертывания крови вводят субъекту два раза в неделю. В другом варианте реализации CTP-модифицированный фактор свертывания крови вводят субъекту раз в две недели (один раз каждые две недели). В другом варианте реализации CTP-модифицированный фактор свертывания крови вводят субъекту два раза в месяц. В другом варианте реализации CTP-модифицированный фактор свертывания крови вводят субъекту раз в месяц. В другом варианте реализации CTP-модифицированный фактор свертывания крови вводят субъекту ежедневно. В другом варианте реализации CTP-модифицированный фактор свертывания крови вводят субъекту раз в два дня.
В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту раз в три дня. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту раз в четыре дня. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту раз в пять дней. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту раз в шесть дней. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту раз в 7-14 дней. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту раз в 10-20 дней. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту раз в 5-15 дней. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, вводят субъекту раз в 15-30 дней.
В другом варианте реализации способы согласно настоящему изобретению включают повышение исполнительности пациента в отношении применения терапии фактором свертывания крови, включающей введение субъекту, нуждающемуся в этом, полипептида, включающего фактор свертывания крови и по меньшей мере один карбоксиконцевой пептид (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенный к карбоксильному концу фактора свертывания крови, тем самым повышая исполнительность пациента в отношении применения терапии фактором свертывания крови.
В другом варианте реализации способы согласно настоящему изобретению включают повышение исполнительности пациентов, страдающих от хронических заболеваний, которые нуждаются в терапии фактором свертывания крови. В другом варианте реализации способы согласно настоящему изобретению позволяют уменьшить частоту введения фактора свертывания крови путем модицикации CTP фактора свертывания крови, описанной выше в настоящем тексте.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ уменьшения частоты введения полипептида фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, что позволяет уменьшить частоту введения указанного полипептида FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ уменьшения частоты введения полипептида фактора VIIa (FVIIa), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa, что позволяет уменьшить частоту введения указанного полипептида FVIIa.
В другом варианте реализации термин исполнительность включает соблюдение указаний. В другом варианте реализации способы согласно настоящему изобретению включают повышение исполнительности пациентов, нуждающихся в терапии фактором свертывания крови, путем уменьшения частоты введения фактора свертывания крови. В другом варианте реализации уменьшения частоты введения фактора свертывания крови добиваются благодаря модификации CTP, которая делает CTPмодифицированный фактор свертывания крови более стабильным. В другом варианте реализации уменьшения частоты введения фактора свертывания крови добиваются в результате увеличения T1/2 фактора свертывания крови. В другом варианте реализации уменьшения частоты введения фактора свертывания крови добиваются в результате увеличения времени клиренса или уменьшения скорости выведения фактора свертывания крови.
- 43 044349
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ уменьшения скорости выведения полипептида фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, вследствие чего уменьшается скорость выведения указанного полипептида FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ уменьшения скорости выведения полипептида фактора VIIa (FVIIa), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa, вследствие чего уменьшается скорость выведения указанного полипептида FVIIa.
В другом варианте реализации уменьшения частоты введения фактора свертывания крови добиваются в результате увеличения меры AUC фактора свертывания крови.
В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ уменьшения частоты введения фактора свертывания крови, включающий этап присоединения от одного до десяти CTP к карбоксильному концу фактора свертывания крови, тем самым уменьшая частоту введения фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ уменьшения частоты введения фактора свертывания крови, включающий этап присоединения от одного до пяти CTP к карбоксильному концу фактора свертывания крови, тем самым уменьшая частоту введения фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ уменьшения частоты введения фактора свертывания крови, включающий этап присоединения трех CTP к карбоксильному концу фактора свертывания крови, тем самым уменьшая частоту введения фактора свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ уменьшения частоты введения фактора свертывания крови, включающий этап присоединения от трех до пяти CTP к карбоксильному концу фактора свертывания крови, тем самым уменьшая частоту введения фактора свертывания крови.
В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ повышения исполнительности в отношении применения терапии фактором свертывания крови, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и от одного до десяти карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, тем самым повышая исполнительность в отношении применения терапии фактором свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ повышения исполнительности в отношении применения терапии фактором свертывания крови, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и от одного до пяти карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, тем самым повышая исполнительность в отношении применения терапии фактором свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ повышения исполнительности в отношении применения терапии фактором свертывания крови, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и три карбоксиконцевых пептида хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, тем самым повышая исполнительность в отношении применения терапии фактором свертывания крови. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ повышения исполнительности в отношении применения терапии фактором свертывания крови, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и от трех до пяти карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, тем самым повышая исполнительность в отношении применения терапии фактором свертывания крови.
В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ предотвращения или лечения нарушения свертывания крови или коагуляции у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и от одного до десяти карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, тем самым осуществляя лечение нарушения свертывания крови или коагуляции у указанного субъекта. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ предотвращения или лечения нарушения свертывания крови или коагуляции у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и от одного до пяти карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, , что обеспечивает предотвращение или лечение нарушения свертывания крови или коагуляции у указанного субъекта. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ предотвращения или лечения нарушения свертывания крови или коагуляции у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и три карбоксиконцевых пептида хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, что обеспечивает предотвращение или лечение нарушения свертывания крови или коагуляции у указанного субъекта. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ предотвращения или лечения нарушения свертывания крови или коагуляции у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и от трех до пяти карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к
- 44 044349 карбоксильному концу фактора свертывания крови, , что обеспечивает предотвращение или лечение нарушения свертывания крови или коагуляции у указанного субъекта.
В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ предотвращения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и от одного до десяти карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, благодаря чему предупреждают гемофилию у указанного субъекта. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ предотвращения гемофилии у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и от одного до пяти карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, благодаря чему предупреждают гемофилию у указанного субъекта. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ предотвращения гемофилии у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и три карбоксиконцевых пептида хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, благодаря чему предупреждают гемофилию у указанного субъекта. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ предотвращения гемофилии у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и от трех до пяти карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, благодаря чему предупреждают гемофилию у указанного субъекта.
В другом варианте реализации в настоящем изобретении показали, что композиции, предложенные в настоящем тексте, неожиданно более эффективно всасывались в кровоток после п/к введения (см. примеры 7-9 в настоящем тексте). Возможность подкожного введения FVIIa является преимуществом, так как его можно использовать для профилактических применений. Подкожные инъекции пациентам также гораздо легче вводить самим себе, и это является преимуществом, когда пациенты очень молоды и их вены малы, и их трудно обнаружить.
В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и от одного до десяти карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, благодаря чему лечат гемофилию у указанного субъекта. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ лечения гемофилии у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и от одного до пяти карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, благодаря чему лечат гемофилию у указанного субъекта. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ лечения гемофилии у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и три карбоксиконцевых пептида хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, благодаря чему лечат гемофилию у указанного субъекта. В другом варианте реализации в настоящей заявке предложен способ лечения гемофилии у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида, включающего фактор свертывания крови и от трех до пяти карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу фактора свертывания крови, благодаря чему лечат гемофилию у указанного субъекта.
Пероральное введение в одном варианте реализации включает стандартную лекарственную форму, включающую таблетки, капсулы, пастилки для рассасывания, жевательные таблетки, суспензии, эмульсии и тому подобные формы. Такие стандартные лекарственные формы включают безопасное и эффективное количество желательного фактора свертывания крови согласно настоящему изобретению, каждое из которых представляет собой один вариант реализации, от приблизительно 0,7 или 3,5 мг до приблизительно 280 мг/70 кг или, в другом варианте реализации от приблизительно 0,5 или 10 мг до приблизительно 210 мг/70 кг. Фармацевтически приемлемые носители, подходящие для получения стандартных лекарственных форм для перорального введения, хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах реализации, таблетки, как правило, включают обычные фармацевтически совместимые адъюванты, такие как инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, маннит, лактоза и целлюлоза; связующие вещества, такие как крахмал, желатин и сахароза; разрыхлители, такие как крахмал, альгиновая кислота и кроскармеллоза; лубриканты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота и тальк. В одном варианте реализации можно применять скользящие вещества, такие как диоксид кремния, для улучшения свойств текучести порошкообразной смеси. В одном варианте реализации для лучшего внешнего вида можно добавлять красители, такие как красители FD&C. Подсластители и ароматизирующие агенты, такие как аспартам, сахарин, ментол, перечная мята и фруктовые вкусоароматические добавки, представляют собой полезные адъюванты для жевательных таблеток. Капсулы обычно содержат один или более твердых разбавителей, описанных выше. В некоторых вариантах реализации, выбор компонентов носителя зависит от вторичных факторов, таких как вкус, стоимость и стабильность при хранении, которые не являются критичными для целей настоящего изобретения, и специалист в данной
- 45 044349 области может легко сделать такой выбор.
В одном варианте реализации пероральная лекарственная форма включает заранее заданный профиль высвобождения. В одном варианте реализации пероральная лекарственная форма согласно настоящему изобретению включает таблетки, капсулы, пастилки для рассасывания или жевательные таблетки пролонгированного высвобождения. В одном варианте реализации пероральная лекарственная форма согласно настоящему изобретению включает таблетки, капсулы, пастилки для рассасывания или жевательные таблетки замедленного высвобождения. В одном варианте реализации пероральная лекарственная форма согласно настоящему изобретению включает таблетки, капсулы, пастилки для рассасывания или жевательные таблетки немедленного высвобождения. В одном варианте реализации пероральная лекарственная форма составлена с учетом желательного профиля высвобождения фармацевтически активного ингредиента, как известно специалисту в данной области.
Пероральные композиции, в некоторых вариантах реализации, включают жидкие растворы, эмульсии, суспензии и т. п. В некоторых вариантах реализации, фармацевтически приемлемые носители, подходящие для получения таких композиций, хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах реализации, жидкие пероральные композиции содержат от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,933% желательного соединения или соединений или, в другом варианте реализации от приблизительно 0,01% до приблизительно 10%.
В некоторых вариантах реализации, композиции для применения в способах согласно настоящему изобретению включают растворы или эмульсии, которые, в некоторых вариантах реализации, представляют собой водные растворы или эмульсии, содержащие безопасное и эффективное количество соединений согласно настоящему изобретению и возможно, другие соединения, предназначенные для топического интраназального введения. В некоторых вариантах реализации, композиции содержат от приблизительно 0,001% до приблизительно 10,0% в отношении массы к объему заявленного соединения, более предпочтительно от приблизительно 00,1% до приблизительно 2,0%, которые применяют для системной доставки соединений интраназальным путем.
В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, инъецируют в мышцу (внутримышечная инъекция). В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, инъецируют под кожу (подкожная инъекция). В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, инъецируют в мышцу. В другом варианте реализации полипептид, включающий фактор свертывания крови и по меньшей мере одну молекулу CTP, инъецируют в кожу. В другом варианте реализации фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, вводят путем системного введения. В другом варианте реализации фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, вводят путем внутривенной инъекции. В другом варианте реализации введение можно осуществлять парентерально, пульмонально, перорально, топически, внутрикожно, внутримышечно, интраперитонеально, внутривенно, подкожно, интраназально, трансназально, внутриглазным путем, офтальмически, эпидурально, буккально, ректально, трансмукозально, путем доставки в кишечник или парентерально, включая интрамедуллярные инъекции, а также путем интратекального или непосредственного интравентрикулярного введения.
В другом варианте реализации композицию вводят скорее местным, чем системным путем, например, путем инъекции композиции непосредственно в определенную область организма пациента.
В одном варианте реализации путь введения может быть энтеральным. В другом варианте реализации путь может быть коньюнктивальным, трансдермальным, внутрикожным, интраартериальным, вагинальным, ректальным, внутриопухолевым, параканцеральным, трансмукозальным, внутримышечным, внутрисосудистым, интравентрикулярным, интракраниальным, интраназальным, сублингвальным или комбинацией перечисленных путей.
В другом варианте реализации фармацевтические композиции вводят путем внутривенной, интраартериальной или внутримышечной инъекции жидкой композиции. В некоторых вариантах реализации, жидкие лекарственные формы включают растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии, масла и тому подобные формы. В одном варианте реализации фармацевтические композиции вводят внутривенно, и следовательно, они составлены в форме, подходящей для внутривенного введения. В другом варианте реализации фармацевтические композиции вводят внутриартериально, и следовательно, они составлены в форме, подходящей для внутриартериального введения. В другом варианте реализации фармацевтические композиции вводят внутримышечно, и следовательно, они составлены в форме, подходящей для внутримышечного введения.
Кроме того, в другом варианте реализации фармацевтические композиции вводят топически на поверхности тела и, следовательно, они составлены в форме, подходящей для топического введения. Подходящие топические лекарственные формы включают гели, мази, кремы, лосьоны, капли и тому подобные формы. Для топического введения, соединения согласно настоящему изобретению комбинируют с дополнительным подходящим терапевтическим агентом или агентами, и их получают и применяют в виде растворов, суспензий или эмульсий в физиологически приемлемом разбавителе с добавлением или без фармацевтического носителя.
- 46 044349
В одном варианте реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению получают с помощью процессов, хорошо известных в данной области, например, с помощью процессов обычного смешивания, растворения, гранулирования, получения драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, захвата или лиофилизации.
В одном варианте реализации фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением составлены обычным способом с применением одного или более физиологически приемлемых носителей, включающих вспомогательные вещества и добавки, которые способствуют получению из активных ингредиентов композиций, которые можно применять в фармацевтике. В одном варианте реализации лекарственная форма зависит от выбранного пути введения.
В одном варианте реализации инъекционные лекарственные средства согласно настоящему изобретению составлены в виде водных растворов. В одном варианте реализации инъекционные лекарственные средства согласно настоящему изобретению составлены с применением физиологически совместимых буферов, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. В некоторых вариантах реализации, для трансмукозального введения в лекарственной форме применяют проникающие вещества, подходящие для барьера, через который нужно проникнуть. Такие проникающие вещества общеизвестны в данной области.
В одном варианте реализации композиции, описанные в настоящем тексте, входят в состав лекарственной формы для парентерального введения, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. В некоторых вариантах реализации, лекарственные формы для инъекции представлены в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах возможно с добавлением консерванта. В некоторых вариантах реализации, композиции представляют собой суспензии, растворы или эмульсии в маслянистых или водных средах и включают такие вспомогательные агенты, как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.
Композиции также включают, в некоторых вариантах реализации, консерванты, такие как хлорид бензалкония и тимеросал и тому подобные консерванты; хелатирующие агенты, такие как эдетат натрия и другие хелатирующие агенты; буферы, такие как фосфат, цитрат и ацетат; регулирующие тоничность агенты, такие как хлорид натрия, хлорид калия, глицерин, маннит и другие регулирующие тоничность агенты; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, ацетилцистин, метабисульфат натрия и другие антиоксиданты; ароматические агенты; регулирующие вязкость агенты, такие как полимеры, включая целлюлозу и ее производные; и поливиниловый спирт и кислоту и основания для регулирования pH данных водных композиций при необходимости. Композиции также включают, в некоторых вариантах реализации, местные обезболивающие средства или другие активные вещества. Композиции можно применять в виде спреев, аэрозолей, капель и тому подобных форм.
В некоторых вариантах реализации, фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активного лекарственного средства в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных ингредиентов, в некоторых вариантах реализации, получают в виде суспензий для инъекций на подходящей масляной или водной основе. Подходящие липофильные растворители или среды включают, в некоторых вариантах реализации, жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Водные суспензии для инъекций включают, в некоторых вариантах реализации, вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. В другом варианте реализации суспензия также содержит подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость активных ингредиентов, чтобы обеспечить возможность получения высококонцентрированных растворов.
В другом варианте реализации активное соединение можно доставлять в везикуле, в частности, в липосоме (см. Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat и др., в Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein и Fidler (ред.), Liss, Нью-Йорк, стр. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, там же, стр. 317-327; J.E. Diederichs и др., Pharm./nd. 56 (1994) 267-275).
В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, доставляемая в системе с контролируемым высвобождением, составлена для внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, трансдермального пластыря, липосом или других способов введения. В одном варианте реализации применяют насос (см. Langer, выше; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald и др., Surgery 88:507 (1980); Saudek и др., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). В другом варианте реализации можно применять полимерные материалы. В еще одном варианте реализации систему с контролируемым высвобождением можно поместить в непосредственной близости от терапевтической мишени, т.е. головного мозга, таким образом, потребуется лишь часть от дозы для системного введения (см., например, Goodson, в Medical Applications of Controlled Release, выше, том 2, стр. 115-138 (1984). Другие системы с контролируемым высвобождением обсуждаются в обзоре Langer (Science 249:1527-1533 (1990).
В некоторых вариантах реализации, активный ингредиент находится в виде порошка для разбавления подходящей средой перед применением, например, стерильным апирогенным водным раствором. Композиции, в некоторых вариантах реализации, составлены для введения пульверизацией и ингаляцией. В другом варианте реализации композиции содержатся в контейнере с присоединенным к нему пуль- 47 044349 веризатором.
В одном варианте реализации лекарственное средство согласно настоящему изобретению включают в состав композиций для ректального введения, таких как суппозитории или удерживающие микроклизмы, применяя, например, обычные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.
В некоторых вариантах реализации, фармацевтические композиции, подходящие для применения в контексте настоящего изобретения, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения предполагаемой цели. В некоторых вариантах реализации, терапевтически эффективное количество означает количество активных ингредиентов, эффективное для предотвращения, облегчения или снижения выраженности симптомов заболевания, или для увеличения выживаемости субъекта, которого лечат.
В одном варианте реализации определение терапевтически эффективного количества находится в рамках компетенции специалистов в данной области.
Некоторые примеры веществ, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей или их компонентов, представляют собой сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и метилцеллюлоза; порошкованный трагакант; солод; желатин; тальк; твердые лубриканты, такие как стеариновая кислота и стеарат магния; сульфат кальция; растительные масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и масло какао; полиолы, такие как пропиленгликоль, глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; альгиновую кислоту; эмульгаторы, такие как эмульгаторы торговой марки Tween™; смачивающие агенты, такие как лаурилсульфат натрия; красители; ароматизирующие агенты; таблетирующие агенты, стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты; апирогенную воду; изотонический солевой раствор; и фосфатные буферные растворы. Выбор фармацевтически приемлемого носителя, который будут применять совместно с соединением, в основном определяется предполагаемым путем введения соединения. Если заявленное соединение предназначено для инъекции, в одном варианте реализации фармацевтически приемлемый носитель представляет собой стерильный физиологический солевой раствор с совместимым с кровью суспендирующим агентом, pH которого подвели приблизительно до 7,4.
Кроме того, композиции дополнительно включают связующие вещества (например, гуммиарабик, кукурузный крахмал, желатин, карбомер, этилцеллюлозу, гуаровую камедь, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, повидон), дезинтегрирующие агенты (например, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновую кислоту, диоксид кремния, кроскармеллозу натрия, кросповидон, гуаровую камедь, крахмалгликолят натрия), буферы (например, Трис-HCl, ацетат, фосфат) с различными pH и ионной силой, вспомогательные вещества, такие как альбумин или желатин, для предотвращения поглощения поверхностями, детергенты (например, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, соли желчных кислот), ингибитор протеазы, поверхностно-активные вещества (например, лаурилсульфат натрия), усилители проникновения, солюбилизирующие агенты (например, глицерин, полиэтиленглицерин), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия, бутилированный гидроксианизол), стабилизаторы (например, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу), повышающие вязкость агенты (например, карбомер, коллоидный диоксид кремния, этилцеллюлозу, гуаровую камедь), подсластители (например, аспартам, лимонную кислоту), консерванты (например, тимеросал, бензиловый спирт, парабены), лубриканты (например, стеариновую кислоту, стеарат магния, полиэтиленгликоль, лаурилсульфат натрия), агент для повышения текучести (например, коллоидный диоксид кремния), пластификаторы (например, диэтилфталат, триэтилцитрат), эмульгаторы (например, карбомер, гидроксипропилцеллюлозу, лаурилсульфат натрия), полимерные покрытия (например, полоксамеры или полоксамины), покрытие и пленкообразующие агенты (например, этилцеллюлозу, акрилаты, полиметакрилаты) и/или адъюванты.
Обычные компоненты носителей для сиропов, эликсиров, эмульсий и суспензий включают этанол, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, жидкую сахарозу, сорбит и воду. Для суспензии, обычные суспендирующие агенты включают метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия, целлюлозу (например, Avicel™, RC-591), трагакант и альгинат натрия; обычные смачивающие агенты включают лецитин и полиэтиленоксидсорбитан (например, полисорбат 80). Обычные консерванты включают метилпарабен и бензоат натрия. В другом варианте реализации пероральные жидкие композиции также включают один или более таких компонентов, как подсластители, ароматизирующие агенты и красители, описанные выше.
Композиции также включают включение или нанесение активного материала на препараты полимерных соединений в форме частиц, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота, гидрогели и т.д., или на липосомы, микроэмульсии, мицеллы, моноламеллярные или мультиламеллярные везикулы, тени эритроцитов или сферопласты. Такие композиции будут влиять на физическое состояние, растворимость, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo.
В объем настоящего изобретения также входят композиции в форме частиц, покрытые полимерами
- 48 044349 (например, полоксамерами или полоксаминами), и соединение, соединенное с антителами, направленными против тканеспецифичных рецепторов, лигандов или антигенов, или соединенное с лигандами тканеспецифичных рецепторов.
В некоторых вариантах реализации, соединения модифицированы ковалентным присоединением водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль, сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон или полипролин. В другом варианте реализации модифицированные соединения обладают по существу большим периодом полужизни из крови после внутривенной инъекции, чем таковой у соответствующих немодифицированных соединений. В одном варианте реализации модификации также повышают растворимость соединения в водном растворе, предотвращают агрегацию, повышают физическую и химическую стабильность соединения и сильно уменьшают иммуногенность и реакционную способность соединения. В другом варианте реализации желательной биологической активности in vivo добиваются введением таких абдуктов полимер-соединение с меньшей частотой или в меньших дозах, чем для немодифицированного соединения.
В некоторых вариантах реализации, получение эффективного количества или дозы можно сначала оценить в анализах in vitro. В одном варианте реализации дозу можно определить в моделях на животных, и полученную информацию можно использовать для более точного определения полезных доз у людей.
В одном варианте реализации токсичность и терапевтическую эффективность активных ингредиентов, описанных в настоящем тексте, можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур in vitro, культур клеток или экспериментальных животных. В одном варианте реализации результаты, полученные с помощью таких анализов in vitro и культур клеток и исследований на животных, можно использовать для определения диапазона дозировок для применения у человека. В одном варианте реализации дозировки изменяют в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого пути введения. В одном варианте реализации конкретную лекарственную форму, путь введения и дозировку может выбрать лечащий врач с учетом состояния пациента (см., например, Fingl, и др., (1975) The Pharmacological Basis of Therapeutics, глава 1, стр. 1).
В одном варианте реализации в зависимости от тяжести и восприимчивости к лечению состояния, от которого лечат, введение доз можно осуществлять однократным или многократным введением, при этом курс лечения длится от нескольких дней до нескольких недель или до тех пор, пока не достигнут излечения или пока не добьются ослабления симптомов болезненного состояния.
В одном варианте реализации количество композиции, которое будут вводить, конечно, будет зависеть от субъекта, которого лечат, тяжести заболевания, способа введения, мнения лечащего врача и т.д.
В одном варианте реализации также получают композиции, содержащие лекарственное средство согласно настоящему изобретению, входящее в состав лекарственной формы вместе с совместимым фармацевтическим носителем, помещают в подходящий контейнер и маркируют, что она подходит для лечения указанного состояния.
В другом варианте реализации фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, представляет собой лиофилизированное (т.е. высушенное сублимацией) лекарственное средство в комбинации с совокупностью органических вспомогательных веществ и стабилизаторов, таких как неионогенные поверхностно-активные агенты (т.е. поверхностно-активные вещества), различные сахара, органические полиолы и/или сывороточный альбумин человека. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция содержит описанный лиофилизированный фактор свертывания крови в стерильной воде для инъекции. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция содержит описанный лиофилизированный фактор свертывания крови в стерильном ФБР для инъекции. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция содержит описанный лиофилизированный фактор свертывания крови в стерильном 0,9% NaCl для инъекции.
В другом варианте реализации фармацевтическая композиция содержит фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, и совокупность носителей, таких как сывороточный альбумин человека, полиолы, сахара и анионные поверхностно-активные стабилизирующие агенты. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция содержит фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, и лактобионовую кислоту и ацетатный/глициновый буфер. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция содержит фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, и аминокислоты, такие как аргинин или глутамат, которые повышают растворимость композиций интерферона в воде. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, и глицин или сывороточный альбумин человека (ЧСАч), буфер (например, ацетатный) и изотонический агент (например, NaCl). В другом варианте реализации фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, и фосфатный буфер, глицин и ЧСА.
В другом варианте реализации фармацевтическую композицию, содержащую фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, стабилизируют путем помещения в буферные растворы, обладающие pH между приблизительно 4 и 7,2. В другом варианте реализации фармацевтическую компози- 49 044349 цию, содержащую фактор свертывания крови, помещают в буферный раствор, обладающий pH между приблизительно 4 и 8,5. В другом варианте реализации фармацевтическую композицию, содержащую фактор свертывания крови, помещают в буферный раствор, обладающий pH между приблизительно 6 и 7. В другом варианте реализации фармацевтическую композицию, содержащую фактор свертывания крови, помещают в буферный раствор, обладающий pH, равным приблизительно 6,5. В другом варианте реализации фармацевтическую композицию, содержащую фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, стабилизируют с помощью аминокислоты в качестве стабилизирующего агента и, в некоторых случаях, с помощью соли (если аминокислота не содержит заряженную боковую цепь).
В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, представляет собой жидкую композицию, содержащую стабилизирующий агент в количестве между приблизительно 0,3 и 5 мас.%, который представляет собой аминокислоту.
В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, обеспечивает точность введения и безопасность продукта. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, обеспечивает биологически активную, стабильную жидкую лекарственную форму для применения в виде инъекции. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция содержит нелиофилизированный фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте.
В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, обеспечивает жидкую лекарственную форму, позволяющую хранение в течение длительного периода времени в жидком состоянии, что упрощает хранение и транспортировку перед введением.
В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, содержит твердые липиды в качестве материала матрицы. В другом варианте реализации инъецируемая фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, содержит твердые липиды в качестве материала матрицы. В другом варианте реализации получение липидных микрочастиц путем распылительной кристаллизации описано у Speiser (Speiser и др., Pharm. Res. 8 (1991) 47-54), из которых затем получают липидные наногранулы для перорального введения (Speiser EP 0167825 (1990)). В другом варианте реализации липиды, которые используют, хорошо переносятся организмом (например, глицериды, состоящие из жирных кислот, которые присутствуют в эмульсии для парентерального введения).
В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, включает полимерные микрочастицы. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, включает наночастицы. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, включает липосомы. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, включает липидную эмульсию. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, включает микросферы. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, включает липидные наночастицы. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, включает липидные наночастицы, включающие амфифильные липиды. В другом варианте реализации фармацевтическая композиция, содержащая фактор свертывания крови, описанный в настоящем тексте, включает липидные наночастицы, содержащие лекарственное средство, липидную матрицу и поверхностноактивное вещество. В другом варианте реализации липидная матрица содержит по меньшей мере 50% в весовом отношении моноглицерида.
В одном варианте реализации композиции согласно настоящему изобретению представлены в упаковке или в дозирующем устройстве, таком как одобренный Управлением по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами (FDA) набор, который включает одну или более стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. В одном варианте реализации упаковка, например, включает металлическую или полимерную пленку, например, блистерную упаковку. В одном варианте реализации упаковка или дозирующее устройство сопровождается инструкциями для введения. В одном варианте реализации упаковка или дозирующее устройство сопровождается уведомлением, сопровождающим контейнер, в виде, предусмотренном государственным органом, регулирующим производство, применение или реализацию лекарственных средств, и на этом уведомлении отражено одобрение данным органом формы данных композиций или введения человеку или животному. Такое уведомление, в одном варианте реализации представляет собой этикетку, одобренную Управлением по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США для лекарственных средств рецептурного отпуска, или одобренный листок-вкладыш.
В одном варианте реализации должно быть очевидно, что факторы свертывания крови согласно настоящему изобретению можно давать индивиду совместно с дополнительными активными агентами,
- 50 044349 чтобы добиться улучшенного терапевтического действия, по сравнению с лечением каждым агентом отдельно. В другом варианте реализации принимают меры (например, выбор дозировки и дополнительного агента), чтобы избежать неблагоприятных побочных действий, которые связаны с комбинированными методами лечения.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид CTPмодифицированного фактора VIIa (FVIIa), состоящий из полипептида FVIIa и пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного FVIIa.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая полипептид CTP-модифицированного фактора VIIa (FVIIa), состоящий из полипептида FVIIa и пяти карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного FVIIa.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора VIIa (FVIIa) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора VIIa (FVIIa) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена клетка, содержащая вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора VIIa (FVIIa) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора VIIa (FVIIa) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ увеличения биологического периода полужизни полипептида фактора VIIa (FVIIa), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa, вследствие чего продлевается биологический период полужизни указанного полипептида FVIIa.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ увеличения площади под фармакокинетической кривой (AUC) полипептида фактора VIIa (FVIIa), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa, вследствие чего увеличивается AUC указанного полипептида FVIIa. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ уменьшения частоты введения полипептида фактора VIIa (FVIIa), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa, что позволяет уменьшить частоту введения указанного полипептида FVIIa.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ уменьшения скорости выведения полипептида фактора VIIa (FVIIa), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa, вследствие чего уменьшается скорость выведения указанного полипептида FVIIa.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ получения полипептида CTP-модифицированного фактора VIIa (FVIIa), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa, что позволяет получить CTP-модифицированный полипептид FVIIa.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора VIIa (FVIIa), включающего полипептид FVIIa и три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FVIIa, благодаря чему лечат гемофилию у указанного субъекта.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полипептид CTPмодифицированного фактора IX (FIX), состоящий из полипептида FIX и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного CTP-модифицированного полипептида FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен CTP-модифицированный полипептид FIX, при этом последовательность указанного CTP-модифицированного полипептида FIX представляет собой последовательность, описанную в SEQ ID NO: 31. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен CTP-модифицированный полипептид FIX, в котором по меньшей мере один CTP кодируется последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен CTP-модифицированный полипептид FIX, в котором по
- 51 044349 меньшей мере один CTP гликозилирован. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен CTP-модифицированный полипептид FIX, в котором по меньшей мере один CTP укорочен. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен CTP-модифицированный полипептид FIX, в котором по меньшей мере один CTP присоединен к указанному полипептиду FIX посредством линкера. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен CTP-модифицированный полипептид FIX, в котором указанный линкер представляет собой пептидную связь.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая указанный CTP-модифицированный полипептид FIX.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, кодирующий CTP-модифицированный полипептид, состоящий из полипептида фактора IX (FIX) и трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, при этом последовательность указанного полинуклеотида описана в SEQ ID NO: 30. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, в котором по меньшей мере один CTP кодируется последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, в котором по меньшей мере один CTP гликозилирован. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, в котором по меньшей мере один CTP укорочен. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, в котором по меньшей мере один CTP присоединен к указанному полипептиду FIX посредством линкера. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, в котором указанный линкер представляет собой пептидную связь. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен вектор экспрессии, содержащий указанный полинуклеотид.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена клетка, содержащая вектор экспрессии.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая вектор экспрессии.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ увеличения биологического периода полужизни полипептида фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, вследствие чего продлевается биологический период полужизни указанного полипептида FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP кодируется последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP гликозилирован. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP укорочен. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP присоединен к указанному полипептиду FIX посредством линкера. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором указанный линкер представляет собой пептидную связь. В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ увеличения площади под фармакокинетической кривой (AUC) полипептида фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, вследствие чего увеличивается AUC указанного полипептида FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP кодируется последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP гликозилирован. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP укорочен. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP присоединен к указанному полипептиду FIX посредством линкера. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором указанный линкер представляет собой пептидную связь.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ уменьшения частоты введения полипептида фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, что позволяет уменьшить частоту введения указанного полипептида FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP кодируется последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP гликозилирован. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP укорочен. В другом варианте ре- 52 044349 ализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP присоединен к указанному полипептиду FIX посредством линкера. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором указанный линкер представляет собой пептидную связь.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ уменьшения скорости выведения полипептида фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, вследствие чего уменьшается скорость выведения указанного полипептида FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP кодируется последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP гликозилирован. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP укорочен. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP присоединен к указанному полипептиду FIX посредством линкера. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором указанный линкер представляет собой пептидную связь.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ получения полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX), включающий этап присоединения трех карбоксиконцевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, что позволяет получить CTP-модифицированный полипептид FIX. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором последовательность указанного CTP-модифицированного полипептида FIX представляет собой последовательность, описанную в SEQ ID NO: 31. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP кодируется последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP гликозилирован. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP укорочен. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP присоединен к указанному полипептиду FIX посредством линкера. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором указанный линкер представляет собой пептидную связь.
В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ лечения гемофилии у субъекта, включающий введение указанному субъекту полипептида CTP-модифицированного фактора IX (FIX), включающего полипептид FIX и три карбоксиконцевых пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного полипептида FIX, благодаря чему лечат гемофилию у указанного субъекта. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором последовательность указанного CTP-модифицированного полипептида FIX представляет собой последовательность, описанную в SEQ ID NO: 31. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP кодируется последовательностью аминокислот, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP гликозилирован. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP укорочен. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором по меньшей мере один CTP присоединен к указанному полипептиду FIX посредством линкера. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен способ, в котором указанный линкер представляет собой пептидную связь.
В данной области широко известно, что модифицированные пептиды и белки согласно настоящему изобретению можно соединить с метками, лекарственными средствами, нацеливающими агентами, носителями, твердыми подложками и т. п., в зависимости от желательного применения. Меченые формы модифицированных биопрепаратов можно применять для отслеживания их метаболического пути; подходящие для данной цели метки включают, в особенности, радиоизотопные метки, такие как йод 131, технеций 99, индий 111 и тому подобные метки. Метки также можно применять в качестве средства детектирования модифицированных белков или пептидов в системах анализа; в данном примере, также можно применять радиоактивные изотопы, а также ферментные метки, флуоресцентные метки, хромогенные метки и тому подобные метки. Применение таких меток особенно полезно, если пептид или белок сам по себе является нацеливающим агентом, таким как антитело или лиганд рецептора.
Аналогичные методики связывания, наряду с другими, можно применять для соединения модифицированных пептидов и белков согласно настоящему изобретению с твердыми подложками. После присоединения, данные модифицированные пептиды и белки затем можно применять в качестве аффинных реагентов для отделения желательных компонентов, с которыми происходит специфичное связывание.
- 53 044349
Наконец, модифицированные пептиды и белки согласно настоящему изобретению можно применять для получения антител, в частности, иммунореактивных с данными новыми соединениями. Данные антитела полезны для множества диагностических и терапевтических применений, в зависимости от природы биологической активности немодифицированного пептида или белка. Должно быть очевидно, что согласно настоящему изобретению предложены антитела, которые иммунореактивны с CTPмодифицированным FIX, FVII или FVIIa, описанными в настоящем тексте. В одном варианте реализации такие антитела можно применять для того, чтобы отличить или идентифицировать CTP-модифицированные факторы свертывания крови, которые ввели, от эндогенных факторов свертывания крови. В другом варианте реализации антитела можно применять, чтобы определить местонахождение введенных CTP-модифицированных факторов свертывания крови.
Дополнительные предметы, преимущества и новые свойства настоящего изобретения станут очевидны для среднего специалиста в данной области после изучения следующих примеров, которые не предполагаются как ограничивающие. Кроме того, каждый из различных вариантов реализации и аспектов настоящего изобретения, описанных выше в настоящем тексте и заявленных в формуле изобретения ниже, находит экспериментальное подтверждение в следующих примерах.
Примеры
В целом терминология, используемая в настоящем тексте, и лабораторные процедуры, используемые в настоящем изобретении, включают молекулярные, биохимические, микробиологические методики и технологии рекомбинантной ДНК. Такие методики подробно описаны в литературе. См., например, Molecular Cloning: A laboratory Manual Sambrook и др., (1989); Current Protocols in Molecular Biology, тома I-III, Ausubel, R.M., ред. (1994); Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Балтимор, Мэриленд (1989); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Нью-Йорк (1988); Watson и др., Recombinant DNA, Scientific American Books, Нью-Йорк; Birren и др. (ред.) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, тома 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, НьюЙорк (1998); методики, описанные в патентах США с номерами 4666828; 4683202; 4801531; 5192659 и 5272о57; Cell Biology: A Laboratory Handbook, тома I-III, Cellis, J.E., ред. (1994); Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique by Freshney, Wiley-Liss, N.Y. (1994), третье издание; Current Protocols in Immunology, тома I-III, Coligan J.E., ред. (1994); Stites и др. (ред.), Basic and Clinical Immunology (8oe издание), Appleton & Lange, Норуолк, Коннектикут (1994); Mishell и Shiigi (ред.), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman и Co., Нью-Йорк (1980); доступные иммуноанализы подробно описаны в патентной и научной литературе, см., например, патенты США с номерами 3791932; 3839153; 3850752; 3850578; 3853987; 3867517; 3879262; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; 4098876; 4879219; 5011771 и 5281521; Oligonucleotide Synthesis Gait, M.J., ред. (1984); Nucleic Acid Hybridization Hames, B.D., и Higgins S.J., ред. (1985); Transcription and Translation Hames, B.D., и Higgins S.J., ред. (1984); Animal Cell Culture Freshney, R.I, ред. (1986); Immobilized Cells and Enzymes IRL Press, (1986); A Practical Guide to Molecular Cloning Perbal, B., (1984) и Methods in Enzymology, том 1-317, Academic Press; PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, Сан-Диего, Калифорния (1990); Marshak и др., Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual CSHL Press (1996); каждая из которых включена посредством ссылки. Другие основные ссылки приведены повсюду в настоящем описании.
Пример 1. Получение и применение фактора свертывания крови IX.
Клонирование и экспрессия рекомбинантной молекулы FIX.
Клоны фактора IX конструировали в эукариотическом векторе экспрессии pCI-neo (Promega, номер в каталоге E1841). Клон с открытой рамкой считывания (ОРС) фактора свертывания крови IX Homo sapiens заказали в OriGene (RC219065). Праймеры заказали в Sigma-Genosys.
Конструирование 301-1-pCI-neo-p200-11 (фактор IX-ctp x2).
Праймер 101:5' GTTTAGTGAACCGTCAGAAT 3' (SEQ ID NO: 36).
Праймер 103R: 5' TTGAGGAAGATGTTCGTGTA 3' (содержит сайт SspI фактора IX) (SEQ ID NO: 37).
Полимеразную цепную реакцию (реакцию ПЦР) осуществляли с праймером 101 и обратным праймером 103R и с плазмидной ДНК, клоном кДНК фактора IX (OriGene RC219065) в качестве матрицы; в результате амплификации ПЦР получили продукт размером ~ 1085 п.о. (пцр 10), который очищали из геля (фрагмент, содержащий N-конец последовательности фактора IX).
Праймер 98: 5' ATTACAGTTGTCGCAGGTGA 3' (SEQ ID NO: 38).
Праймер 99R : 5' GCTGGAGCTAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTT 3' (SEQ ID NO: 39).
Праймер 100: 5' GCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCC 3' (SEQ ID NO: 40).
Праймер 27R: 5' TTTTCACTGCATTCTAGTTGTGG 3' (SEQ ID NO: 41).
Осуществляли три реакции ПЦР. Первую реакцию осуществляли с праймером 98 и праймером 99R и плазмидной ДНК, клоном кДНК фактора IX (OriGene, RC219065) в качестве матрицы; в результате амплификации ПЦР получили продукт ~ 540 п.о.
Вторую реакцию осуществляли с праймером 100 и праймером 27R и плазмидной ДНК 402-2-p72-3 (hGH-CTP-CTP) в качестве матрицы; в результате амплификации ПЦР получили продукт ~ 258 п.о.
- 54 044349
Последнюю реакцию (пцр 3) осуществляли с праймерами 98 и 27R и смесью продуктов предыдущих двух реакций в качестве матрицы; в результате амплификации ПЦР получили продукт ~ 790 п.о., который лигировали в клонирующий вектор TA (Invitrogen, номер в каталоге K2000-01). Выделяли фрагмент, полученный путем обработки рестриктазами SspI -EcoRI (TA 3-3).
Другую реакцию ПЦР (пцр 12) осуществляли с праймером 101 и праймером 27R, и со смесью продуктов пцр 10 и фрагментом SspI-EcoRI из пцр 3 в качестве матрицы; в результате амплификации ПЦР получили продукт ~ 1700 п.о. (фактор IX-ctp-ctp), который лигировали в клонирующий вектор TA (Invitrogen, номер в каталоге K2000-01) (лиг 180).
В последовательности фактора IX обнаружили ошибку, поэтому фрагменты заменили, чтобы получить вставку фактора IX-ctp-ctp с правильной последовательностью ДНК.
TA-пцр 3-3 расщепляли рестриктазами SspI и XbaI и выделяли большой фрагмент (вектор). TA 1804 расщепляли рестриктазами SspI и XbaI и выделяли малый фрагмент (вставку), который лигировали с выделенным большим фрагментом ТА-пцр-3-3, расщепленным SspI и XbaI. Новую плазмиду TA-183-2 расщепляли рестриктазами SalI и NotI, и выделяли вставку фактора IX-ctp-ctp (~1575 п.о.). Данный фрагмент встраивали в эукариотический вектор экспрессии pCI-neo (расщепленный SalI и Not I) с получением клона 301-2-p200-11.
Конструирование pCI-dhfr -фактор 9- ctp x2 (p223-4). Вектор pCI-dhfr (p6-1) расщепляли рестриктазами SmaI и NotI. Фактор IX-CTP-CTP (p200-11) расщепляли рестриктазами ASisI F.I. и NotI. Полученные два фрагмента лигировали.
Конструирование pCI-dhfr-фактор 9-ctp x3 (p225-7). Вектор pCI-dhfr OXM-CTPx3 (p216-4) расщепляли рестриктазами XbaI и ApaI. Фактор IX-CTP-CTP (223-4) расщепляли рестриктазами XbaI и ApaI. Полученные два фрагмента лигировали.
Конструирование pCI-dhfr-фактор 9-ctp x3 T148A (p243-2). В плазмиде p225-7, содержащей треонин в положении 148, Thr заменили на Ala, методом сайт-направленного мутагенеза, поскольку наиболее часто встречающийся вариант FIX содержит аланин в данном положении.
Праймер 75: ctcccagttcaattacagct (SEQ ID NO: 42).
Праймер 122r: ggaaaaactgcctcagcacgggtgagc (SEQ ID NO: 43).
Праймер 123: gtgctgaggcagtttttcctgatgtggactat (SEQ ID NO: 44).
Праймер 124r: caacacagtgggcagcag (SEQ ID NO: 45).
Осуществляли три реакции ПЦР. Первую реакцию осуществляли с праймером 75 и праймером 122r и плазмидной ДНК p225-7 в качестве матрицы; в результате амплификации ПЦР получили продукт ~ 692 п.о., который очищали из геля. Вторую реакцию ПЦР осуществляли с праймером 123 и праймером 124r и плазмидной ДНК p225-7 в качестве матрицы; в результате амплификации ПЦР получили продукт ~237 п.о., который очищали из геля. Третью перекрывающуюся реакцию ПЦР осуществляли с праймерами 75 и 124r и смесью продуктов предыдущих двух реакций в качестве матрицы; в результате амплификации ПЦР получили продукт ~910 п.о. Полученный продукт перекрывающейся ПЦР расщепляли рестриктазами XbaI и NsiI и заново лигировали в плазмиду p225-7 (расщепленную XbaI и NsiI) с получением плазмиды фактор IX-ctp x3 T148A, обозначенной p243-2.
Конструирование FIX-4CTP (p259-4). Фрагмент 3,5CTP выделяли из oxym-4CTP (p254-3) с помощью рестрикционных ферментов Apa1 и Xba1. Фрагмент FIX+0,5CTP выделяли из FIX-3CTP (p243-2) с помощью рестрикционных ферментов Apa1 и Xba1. Полученные два фрагмента лигировали.
Конструирование FIX-5CTP (p260-18). Фрагмент 4,5CTP выделяли из oxym-5CTP (255-1) с помощью рестрикционных ферментов Apa1 и Xba1. Фрагмент FIX+0,5CTP выделяли из FIX-3CTP (p243-2), применяя ферменты Apa1 и Xba1. Полученные два фрагмента лигировали.
Клетки Dg44 высевали на 100 мм чашки для культивирования клеток и растили до конфлюентности 50-60%. Всего 2 мкг (микрограмма) кДНК FIX использовали для трансфекции одной 100 мм чашки, применяя реагент FuGene (Roche) в безбелковой среде (Invitrogene CD Dg44). Среды удаляли через 48 ч после трансфекции и заменяли на безбелковую среду (Invitrogene CD Dg44) без нуклеозидов в присутствии 800 мкг/мл G418 (неомицина). Через 14 дней популяцию трансфицированных клеток переносили во флаконы для культивирования клеток T25 и продолжали селекцию в течение дополнительных 10-14 дней, до тех пор, пока клетки не стали расти как стабильные клоны. Выбирали клоны с высоким уровнем экспрессии. Приблизительно 2х107 клеток использовали для инокуляции 300 мл ростовой среды в роллерной бутыли 1700 см2 (Corning, Корнинг, Нью-Йорк), дополненной 5 нг/мл витамина K3 (менадиона натрия бисульфат; Sigma). Кондиционированную среду собирали (собранный продукт) после быстрого снижения жизнеспособности клеток до приблизительно 70%. Кондиционированную среду сначала осветляли, а затем концентрировали приблизительно в 20 раз и диализовали против ФБР, применяя проточную фильтрационную кассету (с отсечкой по молекулярной массе 10 кДа; Millipore Corp.).
Определение уровня антигена FIX. Уровни антигена в полученном FIX-CTP определяли с помощью набора для ELISA FIX человека AssayMax ELISA FIX (AssayPro-EF1009-1). Рассчитанная концентрация белка представляла собой среднее значение по трем различным разведениям в двух независимых экспериментах (фиг. 1A, табл. 1).
- 55 044349
Таблица 1. Рассчитанная концентрация белка
| FIX-CTP | FIX-CTP-CTP | |
| Уровень АГ ΙΊΧ (мкл мл) | 41?) | 19.2 |
| Ciaiuapi ное οι клопеппе (СО) | 8.7б | 3,67 |
| Коэффнцпеш вариации (”<> КВ) | 20/)2 | 19,15 |
ЭФ в ПААГ/ДСН - иммунноблоттинг FIX. Собранный FIX-CTP или очищенный rhFIX (American Diagnostics), по 100 нг белка, загружали на 12% трис-глициновый гель, на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Анализ гелей после ЭФ в ПААГ/ДСН осуществляли методом иммуноблоттинга (вестерн-блоттинга), применяя поликлональное антитело к FIX человека и моноклональное антитело, распознающее гамма-карбоксилирование белка человека (American Diagnostics). Ранее сообщали, что rhFIX мигрировал в геле на уровне 55 кДа, тогда как FIX, слитый с двумя CTP, мигрировал на уровне 75 кДа. Показано, что оба варианта белков FIX-CTP были гаммакарбоксилированными, такая посттрансляционная модификация необходима для активности и функционирования FIX (фиг. 1B).
Определение хромогенной активности FIX. Осуществляли сравнительную оценку активности in vitro собранного FIX-CTP по сравнению с белком rhFIX (American Diagnostics), применяя доступный для приобретения набор для анализа хромогенной активности BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). В присутствии тромбина, фосфолипидов, кальция, избыточные количества FXIa активируют собранный FIX в FIXa. FIXa образует ферментативный комплекс с тромбином, активированным FVIII:C (подаваемым в избыточных количествах), фосфолипидами и кальцием и активирует фактор X, присутствующий в аналитической системе, в FXa. Активность непосредственно коррелирует с количеством FIX, которое является лимитирующим фактором. Затем измеряли удельную активность полученного FXa в отношении хромогенного субстрата FXa (pNA). Полученное количество pNA прямо пропорционально активности FIXa. Готовили серийные разведения rhFIX и собранного FIX-CTP, и оценивали эффективность путем сравнения кривой дозовой зависимости собранного FIX с эталонным препаратом, состоящим из rhFIX или плазмы человека. Ссреднее значение EC50 для FIX составляло 21 нг/мл, тогда как рассчитанное значение EC50 для собранного FIX-(CTP)2 составляло 382 нг/мл, и рассчитанное значение EC50 для собранного FIX-CTP составляло 1644 нг/мл. Наблюдали приблизительно 15-кратное снижение ферментативной активности собранного FIX-(CTP)2 (фиг. 2).
Свертывающая активность FIX (АЧТВ). Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) является мерой целостности внутреннего и общего путей каскада свертывания крови. АЧТВ представляет собой время в секундах свертывания плазмы после добавления активатора внутреннего пути, фосфолипида и кальция. Реагент АЧТВ называют частичным тромбопластином, так как тканевый фактор не включен в фосфолипид, в отличие от реагента протромбинового времени (ПВ). Активатор запускает систему, а затем в присутствии фосфолипида осуществляются остальные этапы внутреннего пути. Эталонный диапазон АЧТВ различается в разных лабораториях, но обычно составляет 27-34 с.
Главной целью анализа являлось количественное определение способности собранного FIX-CTP восстанавливать свертывающую активность плазмы человека, обедненной FIX, путем добавления rhFIX. 300 мкл плазмы человека, обедненной FIX, смешивали со 100 мкл rhFIX или собранного FIX-CTP и готовили серийные разведения. После инкубации в течение 60 с при 37°C в смесь добавляли тромбопластин, CaCl2 и фосфолипиды, и определяли время свертывания крови в секундах (выполняли в American Medical Laboratories). Оценивали эффективность путем сравнения кривой дозовой зависимости собранного FIX с эталонным препаратом, состоящим из rhFIX или плазмы человека. Одна единица активности FIX соответствует концентрации FIX, при которой активность равна активности одного мл нормальной плазмы человека. Представленные результаты АЧТВ указывают на то, что FIX-(CTP)2 продемонстрировал 5,7-кратное снижение удельной коагулирующей активности по сравнению с rhFIX (табл. 2). Более того, результаты АЧТВ вместе с результатами анализа хромогенной активности in vitro позволяют предположить, что собранный FIX-(CTP)2 обладает улучшенной ферментативной активностью по сравнению с собранным FIX-CTP (табл. 2). Улучшенную активность белков FIX-CTP можно получить после оптимизации системы экспрессии (т.е. котрансфекции фурином и оптимизации концентрации в среде витамина K3), которую усиливали после супертрансфекции фурином (результаты не представлены).
Таблица 2. Свертывающая активность FIX
| rhFIX(AD ) (мкг/мл) | ЧТВ (сек.) | FIX-CTP (мкг/мл) | ЧТВ (сек.) | FIX-CTP-CTP (мкг/мл) | ЧТВ (сек.) |
| 5 | 31,3 | 9 | 45,2 | 4 | 47,5 |
| 1,25 | 35,7 | 2,25 | 53,3 | 1 | 55,9 |
| 0,3125 | 43 | 0,5625 | 64,1 | 0,25 | 67 |
| 0,078125 | 52,1 | 0,140625 | 76,3 | 0,0625 | 77,4 |
- 56 044349
Фармакокинетическое исследование. RhFIX (American Diagnostic) и собранный FIX-СТР вводили однократной внутривенной инъекцией крысам линии Sprague-Dawle (по шесть крыс на вещество) в дозе мкг/кг массы тела (табл. 3).
Таблица 3. План проведения ФК исследования
| Группы лечения | Исследуемый препарат | Количество животных/ группу | Путь введения | Пол | Уровень дозы (мкг/кг) | Уровень дозы (мкг на животное) | Инъецированный объем (мкл) | Конц, (мкг/мл) | *Моменты времени (часы после введения) |
| 1 | rFIX | 6 | в/в | м | 75 | 15 | 500 | 30 | 0 (ДО введения) 0,083, 0,5, 1,5,4, 8, 24, 48, 72. |
| 2 | rFIX-СТР | 6 | в/в | м | 75 | 15 | 500 | 30 | 0 (до введения) 0,083, 0,5, 1,5,4, 8, 24, 48, 72. |
| 3 | rFIX-С TP СТР | 6 | в/в | м | 75 | 15 | 1000 | 15 | 0 (до введения) 0,083, 0,5, 1,5,4, 8, 24, 48, 72. |
Образцы крови отбирали из ретроорбитального синуса 3 крыс поочередно через 0,083, 0,5 1,5, 4, 8, 24, 48 и 72 ч после введения. Плазму получали сразу после взятия образцов и хранили при -20°С до проведения анализа. Концентрацию FIX определяли с исполыцованием специального анализа ELISA для FIX (AssayPro). Для каждого белка рассчитывали фармакокинетический профиль, и он представлял собой среднее значение по 3 животным в каждый момент времени (фиг. 3). Конечный период полужизни рассчитывали, применяя программное обеспечение РК Solutions 2.0. В табл. 4 кратко описаны наблюдаемые концентрации FIX в различные моменты времени взятия образцов.
Таблица 4. Наблюдаемые концентрации FIX
| Время (ч.) | FIX-AD (нг/мл) | FIX-СТР (нг/мл) | FIX-CTP-CTP (нг/мл) |
| 0,083 | 1506,7 | 1477,5 | 1914,8 |
| 0,5 | 1949,8 | 1150,1 | 1830,1 |
| 1,5 | 2189,4 | 1009,0 | 1264,3 |
| 4 | 733,90 | 709,33 | 1000,00 |
| 8 | 319,80 | 167,20 | 1234,67 |
| 24 | НПКО | 54,625 | 230 |
| 48 | НПКО | НПКО | 120,9 |
ФК профиль и краткое описание конечных периодов полужизни представлены в табл. 5. У собранного FIX-СТР выявили улучшенные значения tV23 по сравнению с rhFIX (повышение в 2 и 5 раз, соответственно). Поскольку в серии доз FIX концентрации FIX в сыворотках животных через 24 ч были ниже предела количественного определения (НПКО), дополнительные ФК параметры не рассчитывали.
Таблица 5. Краткое описание ФК параметров
| Продукт | Конечный период полужизни (ч.) | Отношение (FIX-(CTP)x/rhFIX) |
| rhFIX (American Diagnostics) | 2,62 | - |
| FIX-СТР | 5,55 | 2,И |
| FIX-СТР (FIX-CTP-CTP) | 12,9 | 4,92 |
В данном исследовании был описан новый подход к продлению периода полужизни FIX при сохра-57044349 нении его терапевтической эффективности. Присоединение пептида CTP к активному белку потенциально опасно, так как может снижать активность белка. Следовательно, получение активного рекомбинантного FIX-CTP путем добавления последовательности CTP на C-конце FIX является неожиданным.
Исследование FIX-CTP-CTP, очищенного иммуноаффинным способом.
Очистка FIX-CTP-CTP.
Чтобы оценить белок при высокой степени очистки с повышенной активностью, ФК профиль которого имитирует и может быть экстраполирован на клинические условия, FIX модифицировали 2 молекулами CTP, последовательно присоединенными к карбоксильному концу, с получением FIX-CTP-CTP. FIX-CTP-CTP очищали, применяя связанное с матрицей моноклональное антитело против гаммакарбоксиглутамиловых (Gla) остатков, присутствующих в аминоконцевом участке FIX (American Diagnostics, номер в каталоге 3570MX). Моноклональное антитело было связано с сефарозой CL-4B. Собранный FIX-CTP-CTP при концентрации 88 мкг/мл диализовали против 20 мМ трис, 150 мМ NaCl и 10 мМ ЭДТА при pH 7,4. Скорость загрузки на колонку составляла 0,5 мл/мин, элюирование осуществляли, применяя 20 мМ трис-HCl, 350 мМ NaCl и 50 мМ CaCl, и свободную фракцию вновь подвергали очистке еще пять раз. Наконец, элюированную фракцию диализовали против ФБР, собирали и концентрировали.
Определение уровня антигена FIX. Определяли уровни собранного FIX-CTP, собранного FIX(CTP)2 и очищенного белка FIX-(CTP)2, применяя набор для ELISA FIX человека (Affinity Biologics; номер в каталоге FIX-AG RUO). Рассчитанная концентрация белка (мкг/мл) представляла собой среднее значение по двум независимым экспериментам (фиг. 4, табл. 6).
| Таблица 6. Рассчитанная концентрация белка | ||
| FIX-CTP | FIX-CTP-CTP | FIX-CTP-CTP (очищенный) |
| У ровень ЛГ НХ (μκιμ.ι) 125.78 | 88.53 | 172.0 |
| СО Г.28 | 21.3 1 | 2.03 |
| о КВ 1354 | 24.08 | 1.52 |
Кроме того, осуществляли количественный анализ FIX-CTP-CTP с помощью метода Бредфорд. Рассчитанная концентрация составляла 202 мкг/мл, и она была сходна с концентрацией, выявленной с помощью ELISA FIX человека.
Блоты гелей после ЭФ в ПААГ/ДСН. Собранный FIX-CTP-CTP, свободную фракцию и очищенный белок загружали на 12% трис-глициновый гель, на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Анализ ЭФ в ПААГ/ДСН с помощью окрашивания кумасси осуществляли путем окрашивания геля реагентом кумасси бриллиантовым голубым (800 нг белка). Иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг) осуществляли со 100 нг белка, поликлональным антителом (AT) к FIX человека и моноклональным AT, узнающим гамма-карбоксилирование белка человека (American Diagnostics, номер в каталоге 499 и #3570). Процедура иммуноаффинной очистки значительно обогатила содержание FIX-CTP-CTP, при этом уменьшив количество примесей (фиг. 5).
Аминоконцевое секвенирование. Очищенный белок FIX-CTP-CTP разделяли с помощью ЭФ в 12% трис-глициновом ПААГ/ДСН, а затем осуществляли электроблоттинг (электрофоретический перенос) на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану. Интересующую полосу вырезали и помещали на очищенный обработанный биобреном (Biobrene) стекловолоконный фильтр. Анализ аминоконцевой последовательности осуществляли путем расщепления по Эдману, применяя импульсный жидкофазный белковый секвенатор, оборудованный микроградиентной системой ВЭЖХ 140 С. Аминоконцевое секвенирование показало, что FIX-CTP-CTP представлял собой смесь белков с неполностью и полностью отщепленным пропептидом. Было показано, что неполное отщепление пропептида снижает коагулирующую активность FIX. Процесс отщепления пропептида можно улучшить путем котрансфекции фурином.
Определение хромогенной активности FIX. Осуществляли сравнительную оценку активности in vitro очищенного белка FIX-CTP-CTP по сравнению с rhFIX (American Diagnostics) и объединенной нормальной плазмой человека, применяя доступный для приобретения набор для анализа хромогенной активности BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). В присутствии тромбина, фосфолипидов и кальция, избыточные количества FXIa активируют FIX в FIXa. FIXa образует ферментативный комплекс с тромбином (подаваемым в избыточных количествах), фосфолипиды и кальций активируют фактор X, присутствующий в аналитической системе, в FXa. Активность непосредственно коррелирует с количеством FIX, которое представляет собой лимитирующий фактор. Количество полученного FXa измеряли по его удельной активности по отношению к хромогенному субстрату FXa (pNA). Количество образованного pNA прямо пропорционально активности FIXa. Готовили серийные разведения rhFIX, плазмы человека и FIXCTP-CTP, и оценивали эффективность путем сравнения кривых дозовой зависимости (фиг. 6). Среднее значение EC50 для rhFIX составляло 68,74 нг/мл, тогда как рассчитанное для FIX-CTP-CTP EC50 составляло 505 нг/мл. Наблюдали приблизительно 7-кратное снижение ферментативной активности FIX-CTPCTP по сравнению с рекомбинантным FIX и 16,5-кратное снижение по сравнению с собранной нормальной плазмой человека. Такую пониженную активность можно объяснить неполным отщеплением аминоконцевого пропептида, которое обнаружили при аминоконцевом анализе.
Свертывающая активность FIX (АЧТВ). Активированное частичное тромбопластиновое время
- 58 044349 (АЧТВ) является мерой целостности внутреннего и общего путей каскада свертывания крови. АЧТВ представляет собой время (измеренное в секундах), которое требуется плазме для свертывания после добавления активатора внутреннего пути, фосфолипида и кальция.
В данном анализе осуществляли количественное определение способности белка FIX-CTP-CTP восстанавливать свертывающую активность плазмы человека, обедненной FIX, путем добавления rhFIX. 300 мкл плазмы человека, обедненной FIX, смешивали с 100 мкл rhFIX, FIX-CTP-CTP (FIX-CTP-CTP (CTP были последовательно присоединены к C-концу)) или объединенной нормальной плазмы человека, и дополнительно разбавляли. После инкубации в течение 60 с при 37°C в смесь добавляли тканевый фактор (TF), CaCl2 и фосфолипиды. Определяли время свертывания крови в секундах. Эффективность оценивали путем сравнения кривой дозовой зависимости FIX-CTP-CTP с таковой для эталонного препарата rhFIX или плазмы человека. За одну единицу FIX приняли количество FIX, при котором его активность равна активности 1 мл нормальной плазмы человека.
Представленные результаты АЧТВ указывают на то, что коагулирующая активность FIX-CTP-CTP лишь в 1,4 меньше, чем у объединенной нормальной плазмы человека, и аналогична rhFIX. Результаты АЧТВ вместе с результатами анализа хромогенной активности in vitro позволяют предположить, что очистка FIX-CTP-CTP не нарушала его активность.
Фармакокинетическая активность FIX-CTP-CTP. Очищенный FIX-CTP-CTP, rhFIX (American Diagnostic) и собранные FIX-CTP-CTP и FIX-CTP вводили однократной внутривенной инъекцией крысам линии Sprague-Dawle (по восемь крыс на вещество) в дозе 100 мкг/кг массы тела (табл. 7).
Таблица 7. План проведения ФК исследования
| Группы лечения | Исследуемый препарат | Кол-во животн ых/ группу/ момент времен и | Уровен ь дозы (мкг/кг) | Уровень дозы (мкг на животно е) | Инъецир ованный объем (мкл) | Конц. (мкг/мл ) | Моменты времени (часы после введения) |
| А | rFIX | 8 | 100 | 20 | 500 | 40 | 0 (до введения) 0,083, 0,5, 1, 2, 4, 7, 10, 24, 48, 72. |
| В | rFIX-CTP (собранный) | 8 | 100 | 20 | 500 | 40 | 0 (до введения) 0,083, 0,5, 1, 2, 4, 7, 10, 24, 48, 72. |
| С | rFIX-CTP СТР (собранный) | 6 | 100 | 20 | 500 | 40 | 0 (до введения) 0,083, 0,5, 1, 2, 4, 7, 10, 24, 48, 72. |
| D | rFIX-CTP СТР (очищенный) | 4 | 100 | 20 | 500 | 40 | 0,083, 0,5 1, 2, 4, 7, 10, 24, 4, 8, 72. |
Образцы крови поочередно отбирали из ретроорбитального синуса 4 крыс через 0,083, 0,5, 2, 4, 7 10, 24, 48 и 72 ч после введения. Цитратную плазму (0,32%) получали незамедлительно после взятия образцов и хранили при -20°C до проведения анализа. Концентрацию FIX определяли, применяя набор для ELISA FIX человека (Affinity Biologics). Для каждого белка рассчитывали фармакокинетический профиль в виде среднего значения по 4 животным в каждый момент времени (фиг. 7). Конечный период полужизни рассчитывали, применяя программное обеспечение PK Solutions 2.0. В табл. 8 кратко описаны наблюдаемые концентрации FIX в различные моменты времени взятия образцов.
- 59 044349
| Таблица 8. Наблюдаемые концентрации FIX | ||||
| Время | Собранный | Собранный | rhFIX, нг/мл | Очищенный |
| (ч.) | FIX-CTP, | FIX-CTP2, | FIX-CTP-CTP. | |
| нг/мл | нг/мл | нг/мл | ||
| 0,085 | 1038,97 | 1123,62 | 325,05 | 886,48 |
| 0,5 | 939,12 | 956,80 | 274,58 | 670,92 |
| 1 | 791,97 | 843,85 | 222,90 | 674,17 |
| 2 | 304,98 | 673,31 | 186,00 | 503,91 |
| 4 | 315,37 | 525,50 | 109,69 | 357,36 |
| 7 | 171,45 | 384,36 | 67,62 | 257,02 |
| 10 | 50,34 | 250,73 | 40,20 | 158,66 |
| 24 | 10,07 | 78,50 | НПКО | 52,13 |
| 48 | нпко | 23,40 | нпко | 18,07 |
Краткое описание ФК параметров представлено в табл. 9.
| Таблица 9. Краткое описание ФК параметров | |||||
| ТУ2 (ч.) | AUC, нг/ч/мл | MRT (ч.) | Vd мл/кг | CL мл/ч/кг | |
| Собранный FIX-CTP | 4,17 | 3622 | 4,5 | 155,1 | 27,6 |
| Собранный FIX-СТРг | 10,44 | 9105,7 | 12 | 165,4 | 10,9 |
| rhFIX | 3,72 | 1416,8 | 5,1 | 373,8 | 70,183 |
| Очищенный FIX-CTP-CTP | 11,14 | 6314,2 | 12,3 | 254,5 | 15,83 |
MRT - среднее время удерживания; Vd - объем распределения; CL - клиренс.
Для собранного FIX-CTP-CTP продемонстрировали улучшенный ФК профиль по сравнению с собранным FIX-CTP. Более того, для очищенного FIX-CTP-CTP выявили 3-кратное увеличение значения T1/2e и 4,5-кратное увеличение AUC по сравнению с rhFIX. Пониженное количество секретированного FIX, слитого с последовательно присоединенными молекулами CTP, по сравнению с FIX, слитым с одним CTP, видимо, является следствием присоединения дополнительного CTP, а не ухудшения детектирования методом ELISA, так как концентрация очищенного FIX-CTP-CTP, рассчитанная методом Бредфорд, была сходна с концентрацией, рассчитанной с помощью ELISA.
Свертывающая активность FIX-CTP-CTP была близка к активности для объединенной плазмы человека; тем не менее, его хромогенная активность in vitro была значительно ниже, чем у rhFIX или объединенной плазмы человека. Анализ хромогенной активности считают очень чувствительным анализом, по сравнению с анализом свертывания крови. Причина пониженной активности FIX-CTP-CTP может быть разной. Добавление CTP может снижать аффинность FIX к FXIa или уменьшать посттранскрипционные модификации (например, 12-10 остатков GLA и отщепление пропептида). Аминоконцевой анализ показал, что протеолитическое отщепление пропептида FIX-CTP-CTP не было полностью завершено перед секрецией. Поскольку данная посттранскрипционная модификация важна для нормальной ферментативной активности белка, котрансфекция плазмидой фурин-PACE полезна и может улучшить активность FIX-CTP-CTP.
Наконец, сравнительное фармакокинетическое исследование FIX-CTP-CTP на крысах продемонстрировало, что слияние двух последовательно присоединенных CTP с C-концом FIX позволяло получить FIX с увеличенным периодом полужизни.
Модель на мышах с дефицитом FIX. Для того чтобы оценить активность in vivo, получали мышей с нокаутированным геном FIX и создавали размножающуюся линию. 10 мкг либо доступного для приобретения рекомбинантного hFIX (BeneFIX®), либо rFIX-(CTP)2 (FIX-CTP-CTP) вводили путем инъекции в хвостовую вену мыши после анестезии (массой 22-28 г.) с нокаутированным геном FIX. Количество инъецированного белка было равно необходимой концентрации FIX в нормальной плазме (5 мкг/мл). Образцы крови отбирали из рассеченного хвоста в гепаринизированные капиллярные пробирки в определен- 60 044349 ные моменты времени. Оценивали уровни FIX в образцах плазмы методом ELISA и измеряли эффективность с использованием анализа АЧТВ на свертывание крови.
Повышение эффективности отщепления пропептида FIX. КДНК пептида CTP соединяли с 3'концом кДНК FIX человека. Соответствующими конструкциями, экспрессирующими rFIX и фурин, котрансфицировали клетки Dg44; кДНК rFIX человека также котрансфицировали с плазмидой, экспрессирующей фурин, в качестве контроля. Секреция высокого уровня FIX приводит к секреции смеси профактора и зрелого фактора FIX, вследствие ограниченного количества протеазы фурина в клетке. Котрансфекция вектором, экспрессирующим фурин, с вектором, экспрессирующим профактор, повышает выход и приводит к секреции в среду полностью процессированного FIX.
После котрансфекции FIX-(CTP)2 и фурином получали стабильные клоны и собирали их для оценки отщепления пропептида. 100 нг белка загружали на 12% трис-глициновый гель, на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Осуществляли анализ гелей после ЭФ в ПААГ/ДСН с помощью иммуноблоттинга (вестерн-блоттинга), применяя поликлональные AT к FIX человека (American Diagnostics) и поликлональное антитело к пропептиду. Ранее сообщали, что rhFIX мигрировал на уровне 55 кДа, тогда как FIX, слитый с двумя CTP, мигрировал на уровне 75 кДа. Показали, что оба варианта белков FIX подверглись правильному полному отщеплению пропептида.
Для того чтобы определить, улучшало ли ферментативную активность FIX-(CTP)2 правильное отщепление пропептида, проводили сравнительную оценку хромогенной и коагулирующей активности собранного FIX-(CTP)2, котрансфицированного фурином. Наблюдали существенные улучшения удельной активности FIX-(CTP)2, которая была сходна с таковой для rhFIX.
В заключение, результаты, описанные в настоящем тексте, позволяют предположить, что FIX-CTPCTP можно эффективно применять для лечения пациентов с гемофилией B. FIX, слитый с конструкциями CTP, полезен благодаря улучшенным фармакологическим свойствам in vivo, которые компенсируют недостатки некоторых показателей in vitro. Данное предложенное лечение обладает преимуществом над известными способами лечения, так как оно позволяет уменьшить частоту инфузий и необходимое количество доз.
Стоит отметить, что когда для увеличения периода полужизни FIX применяли стратегию присоединения молекулы альбумина, рекомбинантный FIX становился неактивным. Предложенный новый подход обеспечил создание и очистку нового рекомбинантного FIX-слитого белка, который проявил улучшенную длительную активность. Поскольку сами по себе модификации не улучшали фармакокинетику вводимого путем инъекции FIX, обнаружение того, что CTP, слитый с FIX, улучшает фармакокинетические параметры, было неожиданным. Присутствие высокогликозилированного пептида-остатков сиаловой кислоты стабилизировало белок и защищало его от взаимодействий с сосудистыми рецепторами, не нарушая ключевые факторы, определяющие функционирование FIX.
FIX-CTP обладает терапевтической эффективностью, близкой к эффективности у rFIX, у пациентов с гемофилией B и требует менее частого введения. Однократной инъекции FIX-CTP достаточно, чтобы контролировать эпизоды кровотечения и уменьшить количество инъекций, которые необходимы во время хирургического вмешательства у пациентов с гемофилией B.
Для разработки FIX пролонгированного действия применяли технологию CTP. В частности, продление периода полужизни рекомбинантной молекулы rFIX осуществляли путем слияния по меньшей мере одного CTP человека с FIX. Рекомбинантный белок FIX-CTP экспрессировали в клетках млекопитающих и подвергали анализу in vitro и in vivo. Продемонстрировали, что активность rFIX-CTP in vitro была сравнима с rFIX. Исследования фармакокинетики и эффективности у крыс продемонстрировали улучшенные свойства rFIX-CTP. Результаты данного исследования продемонстрировали, что разработка молекулы rFIX с продленным периодом полужизни, обладающей кровоостанавливающими свойствами, близкими с таковыми у фермента дикого типа, практически осуществима.
Пример 2. Сравнительная оценка очищенного FIX-CTP3 против FIX-CTP4 и FIX-CTP5.
2.1. Цель исследования.
Сравнительная оценка фармакокинетических параметров FIX-CTP4 и FIX-CTP5 по сравнению с FIXCTP3 после процесса частичной очистки.
2.2. Получение собранных FIX-CTP4 и FIX-CTP5.
КДНК FIX (OriGene RC219065), слитую на C-конце с четырьмя или пятью последовательно присоединенными последовательностями CTP, экспрессировали в клетках Dg44, применяя систему экспрессии Excellgene, в присутствии 10 нг/л витамина K3 (Sigma, Mennadion). Кондиционированные среды собирали (300 мл), фильтровали и замораживали.
2.3. Получение собранного FIX-CTP3.
FIX-CTP3 экспрессировали внутри хозяина в клетках CHO, применяя вектор pCI-DFIFR, клон 196, BR-9 в присутствии 25 нг/л витамина K3 (Sigma). Полученные суспензии клеток собирали и фильтровали.
Все образцы FIX-CTP (3, 4 и 5 CTP) очищали только на колонке Якалин, вследствие нехватки материала.
2.4. Определение уровня антигена FIX.
Уровень антигена FIX определяли с помощью набора для ELISA FIX человека (Affinity Biologics;
- 61 044349 номер в каталоге FIX-AG RUO). Рассчитанная концентрация белка представляла собой среднее значение по четырем независимым экспериментам. Концентрация FIX-CTP3 была немного выше по сравнению с двумя дополнительными вариантами (табл. 10).
Таблица 10. Уровень антигена FIX
| 3 СТР Конечная Якалин40 | 4 СТР Конечная Якалин40 | 5 СТР Конечная Якалин40 | |
| Средняя (нг/мл) | 1016,69 | 4644,11 | 1686,82 |
| СО | 225,41 | 925,63 | 160,07 |
| %кв | 22,17 | 19,93 | 9,49 |
2.5. Окрашивание кумасси и иммуноблоттинг FIX-CTP.
Собранные FIX-CTP3, FIX-CTP4 и FIX-CTP5 загружали на 12% трис-глициновый гель, на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Анализ гелей после ЭФ в ПААГ/ДСН осуществляли методом вестерн-блотт(иммуноблоттинга), применяя поликлональные AT к CTP (Adar Biotech Production) или AT к Gla (American Diagnostica).
Как сообщалось ранее, FIX, слитый с тремя CTP, мигрировал на уровне 80 кДа, тогда как FIX, слитый с четырьмя или пятью CTP, мигрировал на уровне 85 кДа или 90 кДа, соответственно. Как и ожидалось, у собранных FIX-CTP4 и FIX-CTP5, полученных от Excellgene, выявили очень низкие уровни гаммакарбоксилирования по сравнению с собранным FIX-CTP3, который получили от Prolor (фиг. 8).
После процесса очистки с применением колонки с якалином (иммуноаффинной очистки гликозилированных белков), FIX-CTP3, FIX-CTP4 и FIX-CTP5 загружали на 12% трис-глициновый гель, на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Гели после ЭФ в ПААГ/ДСН окрашивали красителем кумасси бриллиантовым голубым для обнаружения образцов. У всех вариантов выявили гораздо более чистые профили полос (фиг. 9), что позволяет предложить повышение чистоты белков.
2.6. Определение хромогенной активности FIX.
Сравнительную оценку активности in vitro полностью очищенных (на ГА-колонке) FIX-CTP3, FIXCTP4 и FIX-CTP5 по сравнению с объединенной нормальной плазмой человека осуществляли, применяя доступный для приобретения набор для анализа хромогенной активности BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Готовили серийные разведения всех образцов, и оценивали эффективность путем сравнения кривой дозовой зависимости с таковой для эталонного препарата нормальной плазмы человека. Пониженная хромогенная активность FIX-CTP4 и FIX-CTP5 (фиг. 10) по сравнению с плазмой может быть следствием неправильных посттранскрипционных модификаций белков FIX, например, неподходящего гамма-карбоксилирования и отщепления пропептида или, в качестве альтернативы, следствием добавления кассет CTP. Изменение активности FIX-CTP4 и FIX-CTP5 (табл. 11) может быть вызвано неадекватными возможностями количественного анализа FIX с помощью ELISA вследствие маскировки CTP сайта антигена.
Таблица 11. Отношение EC50 образец/плазма
| Отношение | |
| Образец | ЕС50 |
| образец/плазма | |
| Плазма 3 СТР, конечный, ГА | 1 2 |
| 4 СТР, конечный, ГА | 5,35 |
| 5 СТР, конечный, ГА | 2,73 |
2.7. Фармакокинетическое исследование.
Очищенные на колонке с Якалином FIX-CTP3, FIX-CTP4 и FIX-CTP5 (группы A, B и C, соответственно) вводили однократной внутривенной инъекцией крысам линии Sprague-Dawle (по шесть крыс на группу лечения) в дозе 250 мкг/кг массы тела. Образцы крови отбирали из ретроорбитального синуса 3 крыс поочередно через 0,083, 0,5 2, 5, 8, 24, 48, 72 и 96 ч после введения (табл. 12). Цитратную плазму (0,38%) получали незамедлительно после взятия образцов и хранили при -20°C до проведения анализа.
- 62 044349
Таблица 12. План проведения ФК исследования
| Группа t | 1 1 ί Уровень ! ί | ί Моменты времени ί (ч. после введения) | |||||
| ! Количество ! ЖИВОТНЫ.х/г I руппу | 1 Путь введен ' ИЯ | i дозы I (мкг на Ϊ животно ί С) | 1 Инъсцир 5 | ||||
| ! ованный объем (мкл) | ί Конц. (мкг/мл) | ||||||
| лечения | । Лечение | ||||||
| А | FIX- | i 6 | ί в/в | 50 | 200 | 250 | 0,083, 0,5, 2, 5, 8, |
| СТР*3 | 24, 48, 72, 96 | ||||||
| । Якалин | |||||||
| 1 40 | |||||||
| FIX- | |||||||
| СТР *4 | 0,083, 0,5, 2, 5, 8, | ||||||
| В | 6 | ( в/в | 50 | 200 | 250 | ||
| t Якалин | 1 24, 48, 72, 96 | ||||||
| ' 40 | ί | ||||||
| FIX- | |||||||
| СТР*5 | 0,083, 0,5, 2, 5, 8, | ||||||
| С | } 6 | f в/в | 50 | 200 | 250 | ||
| j Якалин | 24, 48, 72, 96 |
Осуществляли количественный анализ концентрации FIX в образцах плазмы, применяя наборы для Elisa FIX человека (Affinity Biologics). Рассчитывали фармакокинетический профиль, который представлял собой средние значения по 3 животным в каждый момент времени. Конечный период полужизни рассчитывали, применяя программное обеспечение PK Solutions 2.0. В табл. 13 ниже кратко описаны рассчитанные концентрации FIX в различные моменты времени взятия образцов.
Таблица 13. Рассчитанные концентрации FIX
| Время (ч.) | Ср. ЗСТР нг/мл | СО ЗСТР | Ср. 4 СТР нг/мл | СО 4 СТР | Ср. 5 СТР нг/мл | СО 5 СТР |
| 0,083 | 1087,82 | 72,39 | 904,54 | 21,06 | 1097,23 | 82,24 |
| 0,5 | 774,18 | 86,31 | 736,82 | 66,93 | 998,79 | 70,43 |
| 2 | 562,23 | 3,70 | 627,09 | 32,47 | 747,85 | 14,02 |
| 5 | 357,44 | 8,63 | 431,23 | 29,41 | 576,49 | 27,36 |
| 8 | 239,20 | 7,82 | 327,46 | 30,26 | 394,96 | 36,48 |
| 24 | 77,08 | 4,26 | 107,38 | 5,18 | 142,42 | 16,13 |
| 48 | 27,73 | 2,02 | 39,83 | 1,85 | 53,66 | 3,33 |
| 72 | 12,55 | 1,48 | 21,53 | 1,55 | 23,54 | 3,32 |
| 96 | 6,66 | 1,23 | 10,63 | 0,13 | 18,54 | 3,39 |
ФК профиль и краткое описание ФК параметров представлены ниже в табл. 14 и на фиг. 11. Полный профиль ФК-анализа во все моменты времени позволил предположить, что добавление к FIX 4 или 5 кассет CTP не увеличило период полужизни по сравнению с FIX-CTP3. AUC после введения FIX-CTP5 увеличилась в 1,4-1,6 раз по сравнению с FIX-CTP3, но это увеличение не было статистически значимым.
Таблица 14. ФК профиль и краткое описание ФК параметров
| 24 - 96 ч. | |||
| Период полужизни ('··) _ | 20,43 | 22,02 | 23,96 |
| AUC (нг/ч/мл) | 8218,38 | 10504,49 | 13329,41 |
| Vd (мл/кг) | 700,76 | 586,02 | 494,89 |
| CL (мл/ч/кг) | 23,77 | 18,45 | 14,32 |
Поскольку в образцах, полученных через 96 ч после введения, обнаружили очень низкие концентрации FIX, которые были на нижнем пределе количественного обнаружения анализа, конечный период полужизни рассчитали заново, осуществляя более точный и научно обоснованный расчет (табл. 15). Согласно данному расчету получили даже самые малые различия между периодами полужизни FIX-CTP3, FIX-CTP4 и FIX-CTP5.
- 63 044349
Таблица 15. Рассчитанный заново конечный период полужизни
Период полужизни 15,38 16,63 16,04 <4·)
2.8. Выводы.
В данном исследовании оценивали фармакокинетические параметры и потенциальную свертывающую активность FIX-CTP3, FIX-CTP4 и FIX-CTP5. Слияние 4 и 5 CTP с FIX не обеспечивало улучшение или продление периода полужизни, по сравнению с FIX-CTP3, и наблюдалось снижение хромогенной активности. В табл. 16 ниже кратко описаны процентные улучшения периода полужизни для различных слитых вариантов FIX-CTP (от 1 до 5 CTP). Слияние CTP с FIX улучшало его фармакокинетические свойства, но, непредвиденно, данное улучшение было ограниченным. Неожиданно, после последовательного присоединения 3, 4 или 5 CTP к FIX, были рассчитаны аналогичные значения периодов полужизни.
Таблица 16. Краткое описание процентного улучшения периода полужизни
| Вариант FIX | 1У2 (8 - 72 ч.) % увеличения |
| rhHX по сравнению с KIP | 112 |
| KIP по сравпе.....о с 2С 1 Р | 141 |
| 2(11’ по сравнению с 3(11’ | : 37 |
| ЗСТР по сравнению с 4СТР | b |
4( ТР по сравнению с 5(11’ о
Полученные результаты позволяют предположить, что слияние 3 CTP с FIX вызывало максимальное улучшение периода полужизни белка, подтверждая, что FIX-CTP3 представляет собой оптимальный вариант с точки зрения периода полужизни, структуры и потенциальной свертывающей активности для дальнейшей клинической разработки.
Пример 3. Лечение FIX-CTP3 на примере FIX-/- гемофильной модели на мышах.
Как описано выше, проводили исследование, в котором тестировали ФК профиль и коагулирующую активность собранных FIX-CTP, FIX-CTP2 и FIX-CTP3 по сравнению с rhFIX. FIX-CTP3 проявил улучшенный ФК профиль, при этом сохранив коагулирующую активность, по сравнению с собранными FIX-CTP1 и FIX-CTP2 или rhFIX. Для того чтобы дополнительно оценить полученный результат, очищали белок FIX-CTP3 с остатками гамма-карбоксиглутамата. После однократного в/в введения FIX-CTP3 нормальным крысам выявили 3-кратное увеличение периода полужизни и 4,5-кратное увеличение AUC по сравнению с rhFIX. Для FIX-CTP3 продемонстрировали пониженную хромогенную и свертывающую активность in vitro, наиболее вероятно вследствие недостаточного отщепления аминоконцевого пропептида и неподходящих посттранскрипционных модификаций (ПТМ), таких как неподходящее гаммакарбоксилирование.
В настоящем исследовании изучали фармакокинетические и фармакодинамические свойства рекомбинантного FIX человека, слитого с тремя последовательно присоединенными CTP, у мышей, лишенных FIX.
Цель исследования.
Определить фармакокинетические и фармакодинамические параметры rFIX-(CTP)3 по сравнению с доступным для приобретения rhFIX (BeneFIX®) у мышей, лишенных FIX, после однократного в/в введения FIX-(CTP)3 при аналогичной удельной активности и дозе (аналогичной удельной активности для ФД и аналогичных параметрах FIX для ФК).
Получение собранного FIX-CTP3.
КДНК FIX (OriGene RC219065-Thr 148), к C-концу которой последовательно присоединены три последовательности CTP, экспрессировали в клетках Dg44, применяя систему экспрессии Excellgene, в присутствии 25 нг/мл витамина K3 (Sigma, Mennadion). Пять отдельных партий, содержащих по 5 л суспензии клеток, культивировали (всего двадцать пять литров) и собирали после снижения жизнеспособности до 60-70%. Собранные суспензии фильтровали и замораживали при -70°C.
Определение уровня собранного антигена FIX.
Уровень собранного антигена FIX определяли с помощью набора для ELISA FIX человека (Affinity Biologics; номер в каталоге FIX-AG RUO). Уровень антигена рассчитывали для каждой партии. Концентрация FIX сохранялась среди различных партий (табл. 17).
- 64 044349
Таблица 17. Уровень антигена FIX
| Уровень антигена FIX | |||
| Партия | 1 | 2 | 3 |
| ( рол. (мкт мл) | 28.81 | 3204 | 42.0 |
| СО | 2,69 | 4,0 | |
| % КВ | 8,84 | 8,38,2 | 9,4 |
Процесс очистки FIX-CTP3.
После короткого исследования очистки осуществляли процесс очистки, применяя следующие 3 колонки: диэтиламиноэтанол (ДЭАЭ)-сефароза, гепарин-сефароза и керамический гидроксиапатит (ГА) 1 типа Bio Rad (40 мкм). Очищали обогащенный гамма-карбоксилированный белок FIX-CTP3. Вкратце:
пять литров осветленной собранной суспензии клеток размораживали при 4°C в течение 4 дней. Для каждой партии очистки, осветленную собранную суспензию клеток (2 литра) концентрировали в 4 раза и диализовали против 20 мМ трис-HCl pH 8,2, применяя одноразовый картридж из полого волокна с номинальной отсечкой по молекулярной массе 10 кДа. Данный процесс (УФ-ДФ1) осуществляли дважды, один литр УФ-ДФ1 загружали на колонку с ДЭАЭ-сефарозой, и фактор IX элюировали 20 мМ трис-HCl, 200 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2, pH 8,2. Полученный продукт разбавляли 1:1 20 мМ трис-HCl, 10 мМ CaCl2, pH 7,5, и pH подводили до 7,5 перед загрузкой на колонку с гепарин-сефарозой. Элюирование осуществляли 20 мМ трис-HCl, 300 мМ NaCl и 10 мМ CaCl2, pH 7,5. Элюированный продукт концентрировали и диализовали против 10 мМ фосфата, pH 6,8, применяя кассету Pellicon XL с мембраной с отсечкой по молекулярной массе 10 кДа (УФ-ДФ2). Полученный продукт загружали на ГА-колонку и активированную фракцию фактора IX элюировали 150 мМ фосфатом, pH 6,8. Очищенный продукт концентрировали до целевой концентрации, равной 2 мг/мл, диализовали против трис-буферного раствора (TBS), pH 7,45, разделяли на аликвоты и хранили при -70°C.
Процесс очистки повторяли пять раз, еженедельно, чтобы очистить весь объем (25 литров). Процессы очистки назвали ГА№ 6-10. Каждый очищенный продукт оценивали отдельно (прил. № 1-5). По окончании процесса очистки, различные партии объединяли и дополнительно концентрировали до целевой концентрации, равной 4 мг/мл.
Аналитические свойства FIX-CTP3.
Определение уровня антигена FIX.
Антигенный уровень обогащенного гамма-карбоксилированного белка FIX-CTP3 определяли с применением набора для ELISA FIX человека (Affinity Biologics; номер в каталоге FIX-AG RUO). Рассчитанная концентрация белка представляла собой среднее значение по двум независимым экспериментам (табл. 18).
Таблица 18. Уровень антигена FIX-CTP3
| ELISA №1очищенного на ГА-колонке FIX-СТРз | ELISA №2 очищенного на ГА-колонке FIXСТРз | Конечный, сред. | ||||||
| Разб. | 1 | 2 | Сред. | Разб. | 1 | 2 | Сред. | |
| 130000 | 3412240 | 3781830 | 3597035 | 130000 | 3692260 | 3568240 | 3630250 | 3613643 |
| 260000 | 3915600 | 4158440 | 4037020 | 260000 | 3706820 | 3595540 | 3651180 | 3844100 |
| 520000 | 4158544 | 4334096 | 4246320 | 520000 | 3831464 | 3530748 | 3681106 | 3963713 |
| 1040000 | 4096352 | 4004104 | 4050228 | 1040000 | 3863392 | 3684304 | 3773848 | 3912038 |
| Сред. (нг/мл) | 3895684 | 4069618 | 3982651 | Сред. (нг/мл) | 3773484 | 3594708 | 3684096 | 3833373 |
| СО | 338367,5 | 234486,7 | 274313,5 | СО | 86576,66 | 65369,65 | 63369,86 | 154459,6 |
| %кв | 8,685703 | 5,761884 | 6,887712 | %кв | 2,294343 | 1,818497 | 1,720092 | 4,029338 |
| Сред. (мг/мл) | 3,895684 | 4,069618 | 3,982651 | Сред. (мг/мл) | 3,773484 | 3,594708 | 3,684096 | 3,833373 |
- 65 044349
| ELISA №1 очищенного наГА-колонке FIX-СТРз | ELISA №2 очищенного на ГА-колонке FIXСТРз | Конечный, сред. | ||||||
| Разб. | 1 | 2 | Сред. | Разб. | 1 | 2 | Сред. | |
| 130000 | 3412240 | 3781830 | 3597035 | 130000 | 3692260 | 3568240 | 3630250 | 3613643 |
| 260000 | 3915600 | 4158440 | 4037020 | 260000 | 3706820 | 3595540 | 3651180 | 3844100 |
| 520000 | 4158544 | 4334096 | 4246320 | 520000 | 3831464 | 3530748 | 3681106 | 3963713 |
| 1040000 | 4096352 | 4004104 | 4050228 | 1040000 | 3863392 | 3684304 | 3773848 | 3912038 |
| Сред. (нг/мл) | 3895684 | 4069618 | 3982651 | Сред. (нг/мл) | 3773484 | 3594708 | 3684096 | 3833373 |
| СО | 338367,5 | 234486,7 | 274313,5 | СО | 86576,66 | 65369,65 | 63369,86 | 154459,6 |
| %кв | 8,685703 | 5,761884 | 6,887712 | %кв | 2,294343 | 1,818497 | 1,720092 | 4,029338 |
| Сред. (мг/мл) | 3,895684 | 4,069618 | 3,982651 | Сред. (мг/мл) | 3,773484 | 3,594708 | 3,684096 | 3,833373 |
Блоты гелей после ЭФ в ПААГ/ДСН.
Обогащенный гамма-карбоксилированный белок FIX-CTP3, rhFIX и rFIXa (активированный FIX) загружали на 12% трис-глициновый гель, на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Анализ с помощью окрашивания кумасси геля после ЭФ в ПААГ/ДСН осуществляли путем окрашивания геля реагентом кумасси бриллиантовым голубым (800 нг белка) (фиг. 12). Иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг) осуществляли, применяя 100 нг белка, с помощью поликлональных AT к FIX человека (фиг. 12B), моноклонального антитела, узнающего гаммакарбоксилирование белка человека (American Diagnostics, номер в каталоге 499, 3570) (фиг. 12C), поликлональных AT к пропептиду FIX (фиг. 12D) и поликлональных AT к CTP (фиг. 12E). Ранее сообщали, что FIX-CTP3 мигрировал на уровне 75 кДа.
Процедура очистки значительно обогатила содержание FIX-CTP3, при этом уменьшив количество примесей. Выход процесса очистки был очень низким и находился в диапазоне около 2-3% (результаты не представлены) вследствие необходимости сбора только гамма-карбоксилированных фракций FIXCTP3, что продемонстрировано на иммуноблоте, окрашенном антителами к Gla (фиг. 12B). На основании окрашивания кумасси и иммуноблоттинга FIX выявили, что FIX-CTP3 составлял лишь приблизительно 60-70%, также были обнаружены дополнительные полосы с меньшей молекулярной массой, предположительно, менее гликозилированные формы.
Свертывающая активность FIX-CTP3.
Хромогенная активность FIX-CTP3.
Осуществляли сравнительную оценку активности in vitro собранного FIX-CTP3 и обогащенного гамма-карбоксилированного белка FIX-CTP3, по сравнению с объединенной нормальной плазмой человека, применяя доступный для приобретения набор для анализа хромогенной активности BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Готовили серийные разведения собранного FIX-CTP3 и очищенного белка FIXCTP3 и оценивали активность путем сравнения кривой дозовой зависимости образцов с таковой для эталонного лекарственного средства, состоящего из нормальной плазмы человека. Ранее продемонстрировали, что собранный FIX-CTP3 был в 50 раз менее активным, чем объединенная плазма человека (табл. 19, фиг. 13). После очистки FIX-CTP3, хромогенная активность значительно улучшилась и была лишь в 4,72 раза меньше, чем активность объединенной плазмы человека (табл. 19, фиг. 13). Снижение хромогенной активности собранного FIX может быть следствием неправильных посттранскрипционных модификаций вариантов белка FIX, например неподходящего гамма-карбоксилирования и отщепления пропептида. После очистки и обогащения гамма-карбоксилированной фракцией FIX-CTP3, активность улучшилась, демонстрируя существенный вклад гамма-карбоксилирования в активность FIX.
Таблица 19. Хромогенная активность FIX-CTP3
| Образец | ECso (нг/мл) | Отношение ECso образец /плазма |
| Собранный ПХ-СТРз | ”41.3 | 54.4 |
| Очпщ. НХ( IPs | М.ь | 4.Х |
| Плата | 13.63 | 1 |
Одностадийный анализ свертывания крови (АЧТВ).
Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) является мерой целостности внутреннего и общего путей каскада свертывания крови. АЧТВ представляет собой время в секундах свертывания плазмы после добавления активатора внутреннего пути, фосфолипида и кальция. Основной целью
- 66 044349 данного анализа является количественное определение способности FIX-CTP3 восстанавливать свертывающую активность плазмы человека, обедненной FIX, при добавлении rhFIX. 200 мкл плазмы человека, обедненной FIX, смешивали с 25 мкг/мл FIX-CTP3 и дополнительно разбавляли в TBS. После инкубации в течение 60 секунд при 37°C, в смесь добавляли 50 мкл активатора ЧТВ (Actin FS) и 50 мкл 25 мМ кальция, и определяли время свертывания крови в секундах с применением коагулометра Sysmex® CA 1500 (выполняли в больнице Шибы, в Национальном центре свертывания крови, применяя утвержденный анализ АЧТВ). Оценивали эффективность путем сравнения FIX-CTP3 с кривой дозовой зависимости эталонного препарата объединенной нормальной плазмы человека. Результаты выражали в виде процента активности, интерполированного по стандартной кривой, покрывающей уровни FIX <1 - 110%. Выявили 15-20-кратное снижение коагулирующей активности FIX-CTP3 по сравнению с объединенной нормальной плазмой человека, поскольку было показано, что активность при концентрации 5 мкг/мл, которая является нормальной концентрацией FIX в организме, составила 6,5% (табл. 20).
Таблица 20. Свертывающая активность FIX-CTP3
| FIX-СТРз | Концентрация FIX от поставщика (мг/мл) | Концентрация в исследованном образце (мкг/мл) | % активности FIX (нормированный на активность объединенной нормальной плазмы человека) |
| 3,83 | 25 | 34,7 | |
| 5 | 6,5 |
FIX-CTP3 также проявил повышенное время свертывания крови по сравнению с BeneFIX® (табл. 21 и фиг. 14).
Таблица 21. Сравнительное время свертывания крови (АЧТВ)
Время свертывания крови
| 1 I.X-CTP; | Beuel IX К | |
| 38 мкт мл | 77,6 | |
| 19 мкт мл | 83.4 | |
| .б мкт Μ. 1 | 03.2 | 5(>.(ι |
| 3.8 мкт мл | 104.8 | 57,6 |
| 1.9 мкт м.ι | 1 12.2 | 63,7 |
| 0.95 мкт/мл | 122.6 | 71,5 |
| 0.4^5 мкт м. ι | 83,7 | |
| 0.238 мкт мл | 64.3 |
Дополнительный анализ свертывания крови был проведен независимо на мышах с дефицитом FIX доктором Paul Monahan в Университете Северной Каролины перед началом исследования ФК-ФД. Результаты анализа АЧТВ позволили предположить, что коагулирующая активность FIX-CTP3 была в 40 раз меньше, чем таковая у объединенной нормальной плазмы человека, что продемонстрировали необходимостью более длительного периода (измеренного в секундах) и более высокой концентрации для достаточной свертывающей активности (табл. 22).
Таблица 22. Сравнительная свертывающая активность
Активность FIX (единицы)
| 1 IX-C I р; | ВспсНХ^ | |
| 38 мкт'м.· | 13.0 | |
| 19 мкт мл | 8.8 | |
| 06 МКТ M.I | 4 | 1 16.8 |
| 3.8 мкт'м.· | . 1,6: | 67.4 |
| 1.9 мкт мл | 0.0 | 41.7 |
| 0.95 мк1 /мл | • 0,4.'' | 22.4 |
| 0.4^5 мы мл | 8.5 | |
| 0.238 мкт мл | 3,7 |
Удельная активность (ед./мл), которую рассчитывали на основании уровня антигена FIX, что рассчитывали с помощью ELISA для FIX-CTP3 и BeneFIX®, составляла 4,46 и 198,9 соответственно.
Несоответствие рассчитанной активности FIX-CTP3, продемонстрированной в хромогенном анализе по сравнению с анализом АЧТВ можно объяснить повышенной чувствительностью анализа АЧТВ и значимостью анализа in vivo. В анализе хромогенной активности, присутствует избыточное количество реагентов и ферментов, которые могут активировать менее эффективные варианты FIX. Различие в значениях удельной активности FIX-CTP можно объяснить применением различных реагентов и автоматизированных устройств. Значение активности, рассчитанное в Университете Северной Каролины, использовали для дизайна исследования ФК-ФД.
Детектирование белка FIXa.
Чтобы подтвердить, что после процесса очистки активация FIX (FIXa) не произошла, осуществляли
- 67 044349 анализ детектирования FIXa, применяя хромогенный анализ FIXa Biophen (номер в каталоге 221812). В данном анализе измеряют количество FIXa, присутствующего в конкретном образце, применяя каскад хромогенной активности, описанный ранее. FIX-CTP3 и rhFIX разбавляли и оценивали уровни FIXa. FIXCTP3 не активировался в процессе очистки или хранения (табл. 23).
Таблица 23. Детектирование FIXa
| Образец | FIX- СТРз | rhFIX |
| Исходная | 1000 | 5,7 |
| кони, (мгмл) | ||
| ι·|·ΊХа (мг мл) | НИКО | 0.0048 |
| % I IХа в | НИКО | 0.085 |
обра ию
Исследование ФК-ФД FIX-CTP3.
FIX-CTP3 и rhFIX (BeneFIX®) вводили однократной внутривенной инъекцией мышам C57BI, лишенным FIX, в дозе 625 мкг/кг массы тела, содержащей 100 ME FIX/кг массы тела. Образцы крови отбирали из ретроорбитального синуса 3 мышей поочередно через 0,25, 4, 24, 48, 72 и 96 ч после введения. Цитратную плазму (0,32%) получали незамедлительно после взятия образцов и хранили при -20°C до проведения анализа. Оценивали уровень антигена hFIX, и осуществляли тщательный ФК-анализ. Чтобы оценить способность FIX-CTP3 продливать свертывающую активность у животных, лишенных FIX, по сравнению с BeneFIX®, рассчитывали активность FIX в образцах цитратной плазмы, собранных у мышей FIX’/’, подвергнутых лечению, применяя автоматизированный анализ активности FIX (табл. 24).
Таблица 24. Схема исследования
| Проду кт | Введение | Доза | Колво мыше й | Точки сбора (ч. после введения) | Необходимое количество | |
| **Группа 1 | FIXСТРз | Однократн ая доза: в/в | 100 МЕ/кг 2,5 МЕ/мышь (553 мкг/мышь) | 12 мыше й | 0,25, 1,4,8, 16, 24,48 | 6636 мкг |
| Группа 2 | FIXСТРз | Однократн ая доза: в/в | **472 мкг/кг 12,57 мкг/мышь | 18 мыше й | *0,25,1*, 4*,8 *, 16*, 24*,48*, 72*, 96* | 200 мкг 12,57 мкг/мышь |
| **Группа 3 | BeneFI X® | Однократн ая доза: в/в | 100 МЕ/кг 2,5 МЕ/мышь | 18 мыше й | 0,25, 1,4,8, 16, 24, 48, *72, *96 | 226,3 мкг 12,57 мкг/мышь |
* Только точки сбора результатов ФК ** Кровотечение из хвостовой вены через T=48 ч после введения; группы 1 и 3
Фармакокинетический профиль FIX-CTP3 у мышей FIX’/’.
Концентрацию FIX рассчитывали, применяя наборы для ELISA FIX человека (Affinity Biologics; номер в каталоге FIX-AG RUO). Для каждого белка рассчитывали фармакокинетический профиль, и он представлял собой средние значения по трем животным в каждый момент времени. Ниже в табл. 25 и на фиг. 15 кратко описаны рассчитанные концентрации FIX в различные моменты времени взятия образцов для групп 1 и 3. ФК профиль и краткое описание ФК параметров представлены ниже (табл. 26 и 27). Анализ ФК также осуществляли для группы №2, чтобы проверить воздействие (результаты не представлены).
- 68 044349
| Таблица 25. Ко: | нцентрации FIX | |
| Момент | FIX-СТРз | BeneFIX® |
| времени (ч.) | нг/мл | нг/мл |
| 0,25 | 3645.397 | 2823,023 |
| 1 | 241 1.00 | 2416.248 |
| 1703.205 | 1506,228 | |
| 8 | 1 139.730 | 804.764 |
| 1И1® | 415.32 | димм |
| 24 | 238.37 | 158.7973 |
| 36 | 141.0105 | 94,40067 |
| 48 | 95.461 | 42.28833 |
| одними | 76.90953 | |
| 96 | 24,955 | нпко |
Двухкомпартментный модуль (программного обеспечения WinLin) применяли для определения AUC0-6eCKOHe4., Тконеч. и клиренса (CL). ФК параметры описаны ниже в табл. 26.
Таблица 26. ФК свойства
| Вариант FIX | ТУ2а (1/ч.) | 1½ β (1/ч.) | AUC нг/мл*ч. | CL мл/кг/ч. | MRT (ч.) | Vss (мл/кг) |
| Benel lX к | 3.4 | 12.7 | 22428 | 20 | 1 1.5 | 320.8 |
| FIX-СТРз | 4 | 28,7 | 31770 | 19 | 22 | 425,2 |
Vss - стационарный объем распределения.
Добавление трех кассет CTP к rhFIX удлиняло период полужизни FIX in vivo по меньшей мере в 2,5 раза. AUC после введения FIX-CTP3 in vivo возрастала в 2 раза по сравнению с введением rhFIX. У мышей, которым вводили FIX-CTP3, продемонстрировали улучшенный ФК профиль по сравнению с мышами, которым вводили BeneFIX®.
Фармакодинамический профиль FIX-CTP3 у мышей, лишенных FIX.
Параллельно с взятием образцов на ФК, у образцов цитратной плазмы животных, лишенных FIX, которым вводили либо BeneFIX®, либо FIX-CTP3, оценивали свертывающую активность с помощью анализа АЧТВ, результаты которого преобразовывали в % активности. % активности в каждый момент сбора рассчитывали как текущее время свертывания/время свертывания объединенной нормальной плазмы мыши*100. В табл. 27 кратко описаны значения активности после введения либо BeneFIX®, либо FIX-CTP3.
После введения FIX-CTP3, значительная свертывающая активность была обнаружена через один час после введения, достигая активности 96% через 4 ч после введения, тогда как наивысшее значение активности BeneFIX® составляло 40% (табл. 27, фиг. 16). Свертывающая активность FIX-CTP3 поддерживалась в течение более продожительного периода времени, демонстрируя продленную активность. Свертывающая активность у мышей, которых лечили BeneFIX®, не детектировалась в моменты времени после 36 ч, тогда как у мышей, которых лечили FIX-CTP3, продолжала сохраняться измеримая активность через 72 ч после введения (табл. 27, фиг. 16). Анализ фармакокинетического профиля % свертывания позволяет предположить, что свертывающая активность FIX-CTP3 сохраняется в течение значительно более продолжительного периода времени, и его период полужизни почти в 2 раза выше, чем у Benefix® (табл. 28).
Таблица 27. % активности FIX
Ч. после введения % активности BeneFIX® % активности FIX-СТРз
| 0,25 | 39.9 | 1,0 |
| 1 | 33.4 | 15,5...... |
| 8 | 18.8 | 65,2 |
| 16 | ||
| 24 | 1,7 | 11,9 |
| 36 | ||
| 48 | <1 | 4,6 |
| 72 | 1 | 1,4 |
- 69 044349
Таблица 28. Свертывающая активность
| Вариант FIX | Τ'Λσ (1/ч.) | 1½ β (1/ч.) |
| BeneFIXк | 5,7 | — |
| FIX-СТРз | 7,3 | 16 |
Тест на кровотечение у мышей, лишенных FIX.
Мышам с дефицитом FIX вводили однократную внутривенную инъекцию 100 МЕ/кг BeneFIX® или rFIX-CTP3. Хвостовую вену слегка рассекали через 48 ч после введения и оценивали время кровотечения из хвостовой вены (ВКХВ) и интенсивность кровотечения (О.П. гемоглобина). Второй тест с кровотечением проводили через 15 мин после достижения гомеостаза и измеряли те же параметры. После первого теста с кровотечением кровотечение у животных, которым вводили FIX-CTP3, было значительно менее интенсивным, чем кровотечение у животных, которым вводили BeneFIX®, что продемонстрировали с помощью значений О.П. гемоглобина (фиг. 17).
Поскольку ранее было описано, что в процессе первого теста с кровотечением у мышей с гемофилией время кровотечения не обязательно коррелирует с эффективностью лечения, рекомендуется оценить гомеостаз после дополнительного кровотечения. Как только первое кровотечение остановилось самопроизвольно или было остановлено вручную, осуществляли второе тест с кровотечением через 15 мин после первого и заново измеряли время и интенсивность кровотечения. Во время второго эпизода кровотечения у животных, которым вводили FIX-CTP3, время и интенсивность кровотечения были меньше, демонстрируя, что FIX-CTP3 был эффективен в более поздние моменты времени (фиг. 18).
Наконец, за животными далее наблюдали в течение 12 ч после второго теста с кровотечением, и все повторения эпизодов кровотечения были зафиксированы. Животные, которым вводили FIX-CTP3, оказались способны поддерживать гомеостаз крови в течение следующих 12 ч, без повторения эпизодов кровотечения. Наоборот, у 50% мышей, которых лечили BeneFIX®, наблюдались спонтанные эпизоды кровотечения из хвоста (табл. 29).
Таблица 29. Результат через 12 ч после рассечения хвоста
| Группа мышей | Отсроченное повторное кровотечение | Смерть или сильное нарушение, требующее эвтаназии |
| FIX-СТРз (100 МЕ/кг) | 0/5 (0%) | 0/5 |
| BeneFIX® (100 МЕ/кг) | 3/6 (50%) | 0/6 |
| FIX-/- (не лечили) | 5/6 (100%) | 1/6 |
Рекомбинантный FIX-CTP3, слитый белок, состоящий из одной молекулы FIX, слитой с последовательно присоединенными тремя кассетами CTP, разработали, чтобы решить проблему короткого периода полужизни доступных на сегодняшний день продуктов FIX, применяемых для лечения пациентов с гемофилией B. Мы продемонстрировали, что период полужизни rFIX-CTP3 был стабильно в 2,5-4 раза больше, чем для rFIX у крыс (как сообщали ранее) и у мышей, лишенных FIX. Без привязки к какой-либо конкретной теории, слитый белок уменьшал клиренс FIX и защищал FIX от активности протеаз, деградации благодаря маскированию и уменьшал аффинность FIX к рецепторам печени. В совокупности данные свойства домена CTP увеличивают период полужизни FIX.
В дополнение к фармакокинетическому анализу rFIX-CTP3 мы исследовали фармакодинамические свойства FIX-CTP3 у мышей, лишенных FIX. rFIX-CTP3 и rFIX вводили в сопоставимых дозах (в единицах), чтобы компенсировать недостаточность свертывания крови уровни у мышей, лишенных FIX. Тем не менее, действие rFIX-CTP3 у мышей, лишенных FIX, значительно увеличивалось, по меньшей мере до 76 ч после введения, достигая более высокого пика активности. Свертывающая активность FIX-CTP3 начала проявляться с задержкой в 1 ч по сравнению с BeneFIX®. Активация FIX может быть необходима, поскольку добавление трех последовательно присоединенных CTP теоретически может маскировать сайт активации и задерживать начало каскада. После введения FIX-CTP3, наблюдали пик 100% активности, тогда как активность BeneFIX® составляла лишь 40%. Более высокая исходная активность является очень важным параметром, было продемонстрировано, что добавление 3 CTP потенциально может улучшить выход.
Целью профилактической заместительной терапии FIX пациентов с гемофилией B является поддержание в плазме 1-2% уровня нормальной свертывающей активности. Анализ кровотечения из хвостовой вены представляет собой чувствительный тест in vivo, позволяющий измерить способность поддержания гомеостаза свертывания крови при низких значениях активности, имитируя модель гомеостаза
- 70 044349 свертывания крови у человека. В ответ на тест с кровотечением из хвостовой вены через 48 ч после введения у животных, которым вводили rFIX-CTP3, поддерживался гомеостаз свертывания крови с более короткими и менее тяжелыми эпизодами кровотечения, демонстрируя продленную свертывающую активность.
FIX представляет собой сложный белок, который содержит множество функциональных доменов, которые подвергаются большому количеству посттрансляционных модификаций. Одна из необходимых для активности FIX посттрансляционных модификаций представляет собой гамма-карбоксилирование первых 12 глутаминовых кислот в домене Gla зависимой от витамина K гамма-глутамилкарбоксилазой. Данная модификация способствует связыванию FIX с фосфолипидными мембранами и, таким образом, важна для его функционирования. FIX, который не гамма-карбоксилирован, не функционален, и, следовательно, гамма-карбоксилирование представляет собой стадию, лимитирующую скорость реакции.
Данное исследование ФК-ФД осуществляли, применяя временно трансфицированные клетки. Обширную аналитическую оценку посттрансляционных модификаций выполняли на стабильном белке FIXCTP3, продуцированном и секретированном стабильным оптимизированным клоном.
На основании представленных результатов фактор свертывания крови FIX-CTP3 потенциально может уменьшить частоту инъекций пациентам, получающим рутинные профилактические дозы FIXзаместительной терапии. Ожидается, что rFIX-CTP3 может обеспечивать пролонгированную защиту от кровотечения после каждого введенияы фактора, уменьшать общее количество единиц фактора, необходимых для лечения эпизодов кровотечения, и/или сохранять достаточный гемостаз при проведении хирургических процедур после меньшего количества инъекций.
Пример 4. Получение и применение фактора свертывания крови FVII.
Версия активированного фактора свертывания крови VII (FVIIa) пролонгированного действия будет полезна для лечения пациентов с гемофилией A и B. Рекомбинантный белок FVIIa-CTP3 обладает клиническим потенциалом для улучшения лечения пациентов с гемофилией путем уменьшения частоты инфузий и даже путем уменьшения нагрузки лекарственного средства, делая возможным подход профилактического лечения, который может значительно улучшить качество жизни пациента, избежать спонтанных эпизодов кровотечения и накопления повреждения суставов и других органов.
В настоящем тексте описано получение рекомбинантной молекулы FVIIa-CTP с продленным периодом полужизни, основанное на слиянии FVII с CTP человека. Рекомбинантный FVIIa-CTP экспрессировали в клетках млекопитающих и охарактеризовали in vitro и in vivo. Продемонстрировали, что активность rFVII-CTP была сравнима с rFVII. Исследования фармакокинетики и эффективности у крыс продемонстрировали улучшенные свойства rFVII-CTP. Результаты данного исследования продемонстрировали, что разработка молекулы rFVIIa с продленным периодом полужизни и с кровоостанавливающими свойствами, очень близкими ферменту дикого типа, практически осуществима.
Клонирование и экспрессия рекомбинантной молекулы FVII.
Сконструировали несколько клонов фактора VII в нашем эукариотическом векторе экспрессии (pCI-dhfrr) (фиг. 19). Проверенный MGC клон кДНК FL человека (IRCM), включающий последовательность фактора свертывания крови VII homo sapiens, заказали в Open Biosystems (OB-MHS4426). Следующие праймеры были синтезированы в Sigma-Genosys со следующими последовательностями: праймер 67: 5'CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCC3' (включает 5'-конец ДНК фактора VII и сайт рестрикции XhoI) (SEQ ID NO: 5); праймер 68R: 5'TCTAGAATAGGTATTTTTCCACATG3' (включает сайт рестрикции XbaI) (SEQ ID NO: 6); праймер 69: 5' TCTAGAAAAAAGAAATGCCAGC3' (включает сайт рестрикции XbaI) (SEQ ID NO: 7); и праймер 70R: 5'GCGGCCGCATCCTCAGGGAAATGGGGCTCGCA3' (включает 3'-конец ДНК фактора VII и сайт рестрикции NotI) (SEQ ID NO: 8).
Клонирование осуществляли двумя сериями реакций ПЦР. Первую реакцию осуществляли с праймером 67 и праймером 68R, используя плазмиду кДНК с последовательностью фактора VII (OBMHS4426) в качестве матрицы; в результате амплификации ПЦР получили продукт ~534 п.о., выделили его и лигировали в клонирующий вектор TA (Invitrogen, номер в каталоге: K2000-01). Выделили фрагмент XhoI-XbaI, включающий последовательность N-конца фактора VII. Вторую реакцию осуществляли с праймером 69 и праймером 70R, и снова плазмиду кДНК с последовательностью фактора VII (OBMHS4426) использовали в качестве матрицы. В результате амплификации ПЦР получили продукт ~813 п.о. и лигировали его в клонирующий вектор TA (Invitrogen, номер в каталоге: K2000-01). Выделили фрагмент XbaI-NotI, включающий последовательность карбоксильного конца фактора VII. Полученные два фрагмента встраивали в наш эукариотический вектор экспрессии pCI-dhfr (тройное лигирование) с получением клона 501-0-p136-1.
Плазмиду 501-p136-1 (фактор VII в векторе pCI-dhfr) расщепляли ферментами рестрикции XhoI и KpnI. Выделяли фрагмент размером ~1186 п.о. Частичный клон фактора VII (1180 п.о. -1322 п.о.), за которым следовала последовательность CTP, терминирующая последовательность и последовательность NotI, который синтезировали в GeneArt (0721543), расщепляли ферментами рестрикции KpnI и NotI. Выделяли фрагмент размером ~253 п.о. Полученные два фрагмента встраивали в наш эукариотический вектор экспрессии pCI-dhfr (тройное лигирование) с получением клона 501-1-p137-2. pCI-dhfr-701-2-p24-2 расщепляли ферментами рестрикции XhoI и ApaI и выделяли большой фрагмент (вектор).
- 71 044349 pCI-dhfr-501-2-p137-2 (фактор VII-ctp x1) расщепляли ферментами рестрикции XhoI и ApaI и выделяли вставку размером ~1200 п.о. Вектор и вставку лигировали с получением 501-2-p139-2. Клетки Dg44 высевали на чашки для культивирования клеток размером 100 мм и растили до конфлюентности 50-60%. Всего 2 мкг ДНК использовали для трансфекции одной 100 мм чашки, применяя реагент FuGene (Roche) в безбелковой среде (Invitrogen CD Dg44). Среду удаляли через 48 ч после трансфекции и заменяли на безбелковую среду (Invitrogen CD Dg44) без нуклеозидов. Через 14 дней, популяцию трансфицированных клеток переносили во флаконы для культивирования клеток T25, и селекцию продолжали в течение 10-14 дней до тех пор, пока клетки не начали хорошо расти как стабильные клоны. Выбирали клоны с высоким уровнем экспрессии и приблизительно 2x10' клеток использовали для инокуляции 300 мл ростовой среды, в роллерной бутыли 1700 см2 (Corning, Корнинг, Нью-Йорк), дополненной 5 нг/мл витамина K3 (менадиона натрия бисульфата; Sigma). Кондиционированную среду собирали после быстрого снижения жизнеспособности клеток до приблизительно 70%. Кондиционированную среду сначала осветляли, а затем концентрировали приблизительно в 20 раз и диализовали против ФБР, применяя проточную фильтрационную кассету (с отсечкой по молекулярной массе 10 кДа; Millipore Corp, Биллерика, Массачусетс).
Определение уровня антигена FVII.
КДНК, кодирующую пептид CTP, соединяли с З'-концом кДНК, кодирующей FVII человека. Соответствующей конструкцией rFVII трансфицировали клетки Dg44. В качестве контроля использовали кДНК rFVII человека. Кондиционированную среду собирали, концентрировали, и далее оценивали секретированный рекомбинантный FVII. Уровни антигенов rFVII, rFVII-CTP и rFVII-CTP-CTP определяли с помощью набора для ELISA FVII человека AssayMax (AssayPro) (фиг. 20A). Не наблюдали значимого различия в уровне секреции rFVII-CTP и rFVII-(CTP)2 по сравнению с нативным rFVII.
Блоты гелей после ЭФ в ПААГ/ДСН.
Анализ ЭФ в ПААГ/ДСН осуществляли путем загрузки 50 нг либо собранного, либо очищенного, либо активированного белка rFVII. Образцы загружали на 12% трис-глициновый гель, на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Анализ геля после ЭФ в ПААГ/ДСН осуществляли путем иммуноблоттинга (вестерн-блоттинга), применяя моноклональное антитело к FVII человека (AT) (R&D Systems) или поликлональное антитело к CTP, полученное в кролике.
Уровень антигена rFVII коррелировал с обнаруженным уровнем белка на гелях после ЭФ в ПААГ/ДСН, подвергнутых иммуноблоттингу с AT к FVII. rFVII-CTP мигрировал в виде одной полосы, тогда как соответствующая молекулярная масса контроля FVII составляла приблизительно 52 кДа (результаты не представлены). Оба белка реагировали с антителами, специфичными к FVII, на иммуноблотах. RFVII-CTP также реагировал с антителами, специфичными к CTP. rFVII секретировался в виде зимогена, при этом не было и следа активированного белка.
Хромогенная активность FVII.
Активности собранных rFVII, rFVII-CTP и rFVII-(CTP)2 определяли, применяя доступный для приобретения набор для хромогенного анализа (набор AssaySense для анализа хромогенной активности FVII человека (AssayPro)). Для функциональной характеристики rFVII-CTP и его способности в дальнейшем активироваться (FVIIa), концентрированный собранный rFVII-CTP помещали в доступный для приобретения набор для хромогенного анализа, который позволяет измерить способность TF/FVIIa активировать фактор X в фактор Xa, в результате чего в присутствии специфичного субстрата FXa высвобождает сигнал, количество которого определяют (AssayPro). Добавление пептида CTP к C-концу белка rFVII не нарушало активность FVII как сериновой протеазы (фиг. 20B, 20C).
Свертывающая активность FVII.
Протромбиновое время (ПВ) является мерой внешнего пути свертывания крови. ПВ представляет собой время (измеренное в секундах), которое требуется плазме для свертывания после добавления активатора внешнего пути, фосфолипида и кальция. Его используют для определения склонности крови к сворачиванию, в частности, для измерения дозировки варфарина, повреждения печени и статуса по витамину К. Эталонный диапазон для протромбинового времени обычно составляет приблизительно 12-15 с. В частности, в данном анализе осуществляли количественное определение способности собранных FVII-CTP и FVII-(CTP)2 восстанавливать свертывающую активность плазмы человека, обедненной FVII, путем добавления rhFVII. 300 мкл плазмы человека, обедненной FVII, смешивали с 100 мкл собранных FVII, FVII-CTP и FVII-(CTP)2 при определенных концентрациях, или объединенной нормальной плазмы человека, и дополнительно разбавляли. После инкубации в течение 60 с при 37°C, в смесь добавляли тканевый фактор (TF), CaCl2 и фосфолипиды. Определяли время свертывания крови в секундах. Эффективность оценивали путем сравнения кривой дозовой зависимости собранных FVII-CTP и FVII-(CTP)2 с эталонным препаратом, состоящим из rhFVII или объединенной плазмы человека. За одну единицу активного FVII принимали такое количество FVII, активность которого была равна активности одного мл нормальной плазмы человека. ПВ свертывающей активности rFVII и rFVII-CTP измеряли на коагулометре (Instrumentation Laboratory).
Ранее показали, что добавление пептида CTP к C-концу белка rFVII не нарушало его активность как сериновой протеазы и приводило к стимуляции и активации нативного фактора X и фактора IX в плазме
- 72 044349 человека. После добавления дополнительных CTP на C-конце наблюдалось трехкратное снижение активности сериновой протеазы (результаты не представлены).
Фармакокинетическое исследование.
Собранные rFVII, rFVII-CTP и rFVII-(CTP)2 вводили внутривенно крысам линии Sprague-Dawle (по шесть крыс на вещество) в дозе по 100 мкг/кг массы тела. Для всех экспериментов in vivo количество соответствующего белка определяли с помощью набора для ELISA FVII. Для каждого исследуемого вещества FVII инъецируемое количество рассчитывали, принимая во внимание различия в молекулярной массе между rFVII и rFVII-CTP, которые приводят к различным молярным концентрациям.
Образцы крови отбирали из ретроорбитального синуса, применяя измененную схему взятия образцов, чтобы минимизировать влияние процедуры взятия образцов на измеряемые уровни: поочередно из 3 крыс через 30 и 90 мин и через 2, 6 и 48 ч, и из трех оставшихся крыс через 15 и 60 мин и через 1,5, 4 и 24 ч. Плазму получали незамедлительно после взятия образцов и хранили при -20°C до проведения анализа. Осуществляли количественный анализ концентрации FVII с помощью анализа ELISA, специфичного для FVII. Период полужизни и площадь под фармакокинетической кривой (AUC) рассчитывали, применяя линейное правило трапеций. Сравнение данных параметров клиренса показало, что период полужизни in vivo и AUC для rFVII-(CTP)2 были значительно выше, чем таковые для rFVII (табл. 30).
Таблица 30. Параметры ФК исследования
| Г руппа | Путь | Доза | 1½ | AUCo-t | CL/F | MRT |
| МКТ КТ | мин | 111 МИН Μ. 1 | M.l МИН KT | мин | ||
| FVII | в/в | 60 | 4,07 | 3314,7 | 6,195 | 6,2 |
| IVHf IP | 13 51.06 | 3 1353.0 | 0.287 | 73,7 | ||
| FVIIСТРСТР | в/в | 60 | β=13,66 | 7626,8 | 1,18 | 15,4 |
CL/F - отношение клиренса к степени всасывания (фильтрации).
Определение характеристик рекомбинантного FVIIa-CTP.
В процессе активации, FVII расщепляется в положении R152, что приводит к получению доменов тяжелой и легкой цепи, которые связаны одной дисульфидной связью. rFVIIa-(CTP)2 очищали и активировали с помощью процесса очистки на ионообменной колонке. Для того чтобы полностью оценить rFVIIa-(CTP)2, данный белок загружали на гель для ЭФ в ПААГ/ДСН при восстановительных условиях, на который также загружали доступный для приобретения FVIIa (NovoSeven®). Домены тяжелой и легкой цепи разделялись и мигрировали в виде двух отдельных полос с молекулярными массами 55 и 25 кДа. Оба белка реагировали с антителами, специфичными к FVII, но тяжелая цепь rFVIIa-CTP специфично реагировала с антителами, специфичными к CTP, свидетельствуя о том, что данная полоса представляет собой тяжелую цепь FVII, слитую с CTP. Легкая цепь специфично реагировала с AT к гаммакарбоксилазе. Концентрацию белка FVIIa определяли с помощью набора для ELISA, специфичного к FVIIa.
N-концевое секвенирование FVIIa.
Очищенные белки rFVII-CTP-CTP в активированной или зимогенной форме разделяли с помощью ЭФ в ПААГ/ДСН (на 12% трис-глициновом геле), а затем осуществляли электроблоттинг на мембрану PVDF. Интересующие полосы вырезали и помещали на очищенный обработанный биобреном (Biobrene) стекловолоконный фильтр. Анализ аминоконцевой последовательности осуществляли путем расщепления по Эдману, применяя импульсный жидкофазный белковый секвенатор, оборудованный микроградиентной системой ВЭЖХ 140 C. Идентичность рекомбинантного белка и правильное отщепление пропептида дополнительно проверяли с помощью аминоконцевого секвенирования.
Свертывающая активность FVIIa.
Чтобы оценить коагулирующую активность FVII-(CTP)2, осуществляли анализ активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ). В образец плазмы, обедненной FVII, добавляли rFVIIa (NovoSeven®) или rFVIIa-(CTP)2. 300 мкл плазмы человека, обедненной FVII, смешивали со 100 мкл FVIIa или rFVIIa-(CTP)2 при определенных концентрациях, или с нормальной объединенной плазмой человека, и дополнительно разбавляли. После инкубации в течение 60 с при 37°C, в смесь добавляли тканевый фактор (TF), CaCl2 и фосфолипиды. Определяли время свертывания крови в секундах. Эффективность оценивали путем сравнения кривой дозовой зависимости для rFVIIa-(CTP)2 с таковой для эталонного препарата, состоящего из rhFVIIa или объединенной нормальной плазмы человека. За одну единицу FVIIa принимали такое количество FVIIa, активность которого была равна активности 1 мл нормальной плазмы человека. Свертывающую активность АЧТВ rFVII и rFVIIa-(CTP)2 измеряли на коагулометре (Instrumentation Laboratory). Свертывающая активность АЧТВ rFVIIa и rFVIIa-(CTP)2 была сходной.
Фармакокинетические исследования у крыс.
Для того чтобы охарактеризовать влияние добавления CTP к rFVIIa на увеличение его периода полужизни, проводили сравнительное фармакокинетическое исследование у крыс. NovoSeven® (rFVIIa) и
- 73 044349 rFVIIa-(CTP)2 в TBS вводили путем в/в инъекии 6 крысам SD. Уровни FVIIa в динамике детектировали с помощью набора для ELISA FVIIa. Период полужизни и AUC рассчитывали для каждого белка. Сравнение полученных параметров клиренса показало, что величины in vivo периода полужизни, выхода и AUC для rFVIIa-(CTP)2 превосходили таковые для NovoSeven®.
Модель эффективности FVIIa-CTP in vivo (модель гемофилии у мышей, лишенных FVIII).
Для того чтобы оценить модель активности in vivo, получали мышей с нокаутированным геном FVIII, и создавали размножающуюся линию. 10 мкг либо доступного для приобретения рекомбинантного hFVIIa (NovoSeven®), либо rFVIIa-(CTP)2 вводили путем инъекции в хвостовую вену анестезированной мыши (массой 22-28 г) с нокаутированным геном FVIII. Количество инъецированного белка было равно необходимой концентрации FVIII в нормальной плазме (5 мкг/мл). Образцы крови отбирали из рассеченного хвоста в гепаринизированные капиллярные трубки в определенные моменты времени. Оценивали уровни FVIIa в образцах плазмы с помощью ELISA и измеряли эффективность с помощью анализа свертывания крови ЧТВ. В данном исследовании, получали слитую конструкцию FVII с CTP. Данный рекомбинантный белок представлял собой базовый компонент лечения, который обеспечивал увеличенный период полужизни и сохранение терапевтической эффективности.
Полученные результаты позволяют предположить, что rFVIIa-(CTP)2 обладает терапевтической эффективностью, близкой к таковой для rFVIIa, у пациентов с гемофилией. Более того, данная технология требует менее частого введения. По-видимому, однократной инъекции rFVIIa-(CTP)2 достаточно, чтобы контролировать эпизоды кровотечения и уменьшить количество инъекций, которые необходимы во время хирургического вмешательства. Данный рекомбинантный белок можно применять для длительного профилактического лечения.
Пример 5. Сравнительная оценка очищенных FVII-CTP3, FVII-CTP4 и FVII-CTP5.
5.1. Цель исследования.
Сравнительная оценка фармакокинетических параметров и свертывающей активности FVII-CTP4 и FVII-CTP5 по сравнению с FVII-CTP3.
5.2. Получение собранных FVII-CTP4 и FVII-CTP5.
КДНК FVII, слитого на C-конце с четырьмя или пятью последовательно присоединенными последовательностями CTP, экспрессировали в клетках Dg44, применяя систему экспрессии Excellgene, в присутствии 20 мкг/л витамина K3 (Sigma, Mennadion). Кондиционированные среды собирали (300 мл), фильтровали и замораживали.
5.3. Получение собранного FVII-CTP3.
FVII-CTP3 экспрессировали внутри хозяина в системе экспрессии млекопитающего, в клетках CHO, применяя вектор pCI-DHFR. Стабильно трансфицированный пул №71 растили во встряхиваемых колбах в присутствии 25 нг/л витамина K3 (Sigma). Полученные суспензии клеток собирали и фильтровали.
Все собранные FVII-CTP (3, 4 и 5 CTP) концентрировали и диализовали против TBS (50 мМ трис, 150 мМ NaCl, pH 7,4), применяя кассету Pellicon XL с отсечкой по молекулярной массе 10 кДа.
5.4. Определение уровня антигена FVII.
Уровень антигена FVII определяли с применением набора для ELISA FVII человека (Zymotest HyPhen) (табл. 31). Рассчитанная концентрация белка представляла собой среднее значение по двум независимым экспериментам.
Таблица 31. Уровень антигена FVII (р. (Ill мл) 224^7 1 X”XS4 I W423 (О 44^ι>ς ^4χ - о,цч
5.5. Иммуноблоттинг FVII-CTP.
Собранные FVII-CTP3, FVII-CTP4 и FVII-CTP5 загружали на 12% трис-глициновый гель (expedeon), на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Анализ гелей после ЭФ в ПААГ/ДСН осуществляли с помощью вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга), применяя поликлональные AT к CTP (Adar Biotech Production) или AT к Gla (American Diagnostica). FVII, слитый с тремя, четырьмя и пятью CTP, мигрировал на уровне 80, 90 и 100 кДа соответственно. Как и ожидалось, собранные FVII-CTP4 и FVII-CTP5, полученные от Excellgene, обладали низким гаммакарбоксилированием по сравнению с собранным FVII-CTP3, который был получен от Prolor, поскольку процесс получения не был оптимизирован (фиг. 21).
5.6. Сравнительная оценка активности FVII in vitro.
Сравнительную оценку активности in vitro очищенных на ГА-колонке (сильно гамма-карбоксилированная фракция) FVII-CTP3, FVII-CTP4 и FVII-CTP5 по сравнению с объединенной нормальной плазмой человека осуществляли, применяя доступный для приобретения набор для анализа хромогенной активности BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). Готовили серийные разведения всех образцов и оценивали активность путем сравнения кривой дозовой зависимости образцов с таковой для эталонного лекарст- 74 044349 венного средства, состоящего из нормальной плазмы человека. Для FVII-CTP3 и FVII-CTP5 продемонстрировали более низкую хромогенную активность, чем для объединенной нормальной плазмы (фиг. 22).
Для FVII-CTP4 продемонстрировали более высокую активность, как видно из отношений EC50, по сравнению с FVII-CTP3 и FVII-CTP5 (табл. 32).
Таблица 32. Свертывающая активность FVII in vitro
| ll.ia nia | ().()> |
| 1 VII 3( I P | <>.I2 |
| I VI1 4( I P 1 VII 5( I P | O.O3 (1.(1(1 |
5.7. Свертывающая активность FVII in vitro.
Анализ активности фактора VII (FVII), который проводили в Медицинском центре им. Шибы, в Национальном центре свертывания крови Израиля, представлял собой анализ на основе протромбина (ПВ) с применением иммуносорбированной плазмы, обедненной фактором VII (Siemens). Реагент ПВ представлял собой инновин (innovin), и анализ осуществляли с помощью устройства CA 1500 Sysmex®. Нормальный диапазон FVII составлял 55-145%.
Таблица 33. Хромогенная активность FVII in vitro
| l\ II 3(Ί P | 36 | 0,5 | 224 2 |
| ——.——— | 0,25 | ||
| 6 | ||j[^ | ||
| 1 \ II 4( 1 P | ——— | 8” o | |
| 0,25 | |||
| 93 | |||
| 1 \ II 5(Ί P | _____ Ю | 0,5 .............. 0.125 | >8 о |
Поскольку нормальный уровень циркулирующего в организме FVII составляет приблизительно 0,5 мкг/мл, выявили 3-кратное снижение коагулирующей активности собранных FVII-CTP3 и FVII-CTP5 по сравнению с объединенной нормальной плазмой человека; данный результат коррелирует с полученной хромогенной активностью (табл. 33).
Собранный FVII-CTP4 проявил 3-кратное повышение потенциальной коагулирующей активности по сравнению с объединенной нормальной плазмой человека, что наблюдали в анализе хромогенной активности (табл. 33). Процент активности FVII-CTP4 был гораздо выше, чем процент активности FVIICTP3 и FVII-CTP5. Методологические ограничения метода ELISA могут ограничить точность расчетов уровня AT FVII-CTP4.
5.8. Фармакокинетическое исследование.
Проводили два фармакокинетических исследования, чтобы определить фармакокинетические (ФК) параметры FVII-CTP3, FVII-CTP4 и FVII-CTP5. В процессе первого исследования, FVII-CTP3, FVII-CTP4 и FVII-CTP5 (группы A, B и C, соответственно) вводили однократной внутривенной инъекцией крысам линии Sprague-Dawle (по шесть крыс на группу лечения) в дозе 250 мкг/кг массы тела. Образцы крови отбирали из ретроорбитального синуса 3 крыс поочередно через 0,083, 0,5 2, 5, 8, 24, 48, 72 и 96 ч после введения (табл. 34). Цитратную плазму (0,38%) получали незамедлительно после взятия образцов и хранили при -20°C до проведения анализа.
- 75 044349
Таблица 34. Дизайн фармакокинетического исследования - концентрированный собранный продукт
| Группа | Исследуе | Количество | Пу n> | Уровень | Иньенпро | Конц. | Моменгы времени |
| . 1ечсппя | мыВ | живо ι пых/ | вве, ie | .юзы | ванный | (мкг/м | (часы после |
| iipcnapai | 1 ру ину/ моменι времени | пня | (мкт па животно |1||Д | об кем (мкл) | введения) | ||
| FVII- СТР*3 | В'В | и | 200 | 250 | 0 (до введения) 0,083. 0,5, 2, 5. 8, 24, 48, 72, 96 | ||
| ид | Ι·'VII- C'1P*4 | В'В | 111и | 250 | 0 (до введения) 0,083. 0,5. 2, 5. 8, 24, 48, 72, | ||
| FVIT- СТР*5 | В'В | 200 | 250 | 0 (до введения) 0,083. 0,5. |
Осуществляли количественный анализ концентрации FVII в образцах плазмы, применяя наборы для ELISA FVII человека (Zymutest FVII-Biophen). Рассчитывали фармакокинетический профиль, и он представлял собой средние значения по 3 животным в каждый момент времени. Значения конечного периода полужизни рассчитывали, применяя программное обеспечение PK Solutions 2.0. Ниже в табл. 35 кратко описаны рассчитанные концентрации FVII в различные моменты времени взятия образцов. ФК профиль (фиг. 23-24) и краткое описание ФК параметров (табл. 36) также представлены ниже. Для FVII-CTP5 продемонстрировали лучший профиль по сравнению с FVII-CTP3 и FVII-CTP4 (табл. 36).
Таблица 35. Первое фармакокинетическое исследование - концентрации FVII
| Время | нивми | СО (ред. | ||||^^ | |
| 1\ 11-4- | ||||
| ННВННННВВ· | (Ill мл) | ВНВВИНВН· | ||
| 0.083 | 4214 5X3 | 3600 | 42” 4888 | 504 |
| 0.5 | 3386 8<>2 | 5213 | 1682 5384 | 2>41> |
| 2 | 1138 2Г> | 3603 | 133Х 3082 | 28ч |
| 5 | 1390 3”4 | 226 | 112” 2480 | 561 |
| 8 | 333 16” | 1349 | 44 2316 | 631 |
| 24 | 133 12 | 46 | 1>8 88 | U |
| 48 | 38 3 | 165 | 24 384 | |
| 2 | 12 2 | 91 | 62 16 | ^1 |
| 96 | ИВ|!^ | 42 | 8 93 | |
| Таб ища 36. Фармакокине1ическии анализ | ||||
| 1\ ПЗ-( ГР | 1\ 11-4-( II’ | l \ П-5( 11’ | ||
| 1lepiю i Ί.) | но ι\ ,ι,и чin (0.083 - 8 | 2 5 | 6,6 | |
| 1lepiю i | ।io.ι\ /КН ιιιιι (8 - 2 ч.) | 13.3 | 16.6 | Г.” |
| А1 С(н | i ч'мл) (8 - 2 ч.) | 18374.0 | 5 1224.4 | 72654.2 |
| \ d (мл кч) (8 - 2 ч.) | 2430 | О| о | 6”.” | |
| ( 1. (м.ь | ч κι )(8-72 ч.) | 1 и.О | 2 7 |
Добавление четырех или пяти CTP значительно продлевало период полужизни FVII по сравнению с добавлением 3 CTP в 2 и 3 раза, соответственно (табл. 36). Такое превосходство было наиболее важным в начальной части исследования (0,083-8 ч), позволяя предложить потенциально улучшенный выход белка и пониженный внесосудистый клиренс. AUC после введения FVII-CTP4 и FVII-CTP5 увеличилась в 3 и 4 раза, соответственно, по сравнению с FVII-CTP3. Клиренс также уменьшился при добавлении 4 и 5 CTP к FVII (табл. 36).
В данном исследовании наблюдали, что добавление четырех и пяти CTP значительно продлевало период полужизни FVII по сравнению с добавлением 3 CTP, причем как начальный, так и конечный период полужизни. Значения периода полужизни в первом и втором исследовании были различными вследствие различных аналитических подходов, и на них влияла доза и продолжительность исследования, тем не менее, общая тенденция сохранялась. AUC после введения FVII-CTP4 и FVII-CTP5 увеличи
- 76 044349 лась в 2,5 и 7 раз, соответственно, по сравнению с таковой для FVII-CTP3.
5.9. Выводы.
В данном исследовании оценивали ФК параметры и потенциальную свертывающую активность FVII-CTP3, FVII-CTP4 и FVII-CTP5. Присоединение 4 и 5 CTP к FVII обеспечивало наибольший и улучшенный период полужизни, улучшенное воздействие и пониженный клиренс по сравнению с присоединением FVII-CTP3, при этом сохранялась сходная хромогенная активность и свертывающая активность in vitro. Данные результаты наблюдали при различных концентрациях белка, и они были сходными у собранного и очищенного белка. При оценке влияния присоединения CTP к C-концу FVII в целом, присоединение 1-5 CTP значительно увеличивало период полужизни и AUC FVII пропорционально присоединенным CTP, позволяя предложить, что по мере увеличения количества молекул CTP, период полужизни и стабильность FVII значительно улучшались, при этом сохранялась его исходная свертывающая активность in vitro, как показано ниже в настоящем тексте в табл. 37.
Таблица 37
| FVII по сравнению с FVII-CTP2 | 268 | 200 |
| FVII-CTP2 по сравнению с FVII-СТРз | 67 | 57,8 |
| FVII-СТРз по сравнению С FVII-CTP4 | 24 | 178 |
| FVII-CTP4 по сравнению с FVII-CTPs | 6 | 42 |
Ранее сообщали, что период полужизни FVII коррелировал с периодом полужизни активированной формы FVII (FVIIa) как у людей, так и у животных. Следовательно, ожидается, что будет достигнуто аналогичное улучшение периода полужизни для активированного варианта после присоединения CTP.
Пример 6.
Исследования пригодности FVII-CTP3 для лишенных FVIII мышей с гемофилией.
Проводили исследования, описанные выше в настоящем тексте, в которых тестировали ФК профиль и коагулирующую активность собранных FVII-CTP, FVII-CTP2 и FVII-CTP3 по сравнению с таковыми у доступного для приобретения FVII. Для FVII-CTP3 выявили улучшенный ФК профиль, при сохранении его коагулирующей активности, по сравнению с таковым для собранных FVII-CTP и FVII-CTP2 или rhFVII. Для того, чтобы дополнительно охарактеризовать свойства FVII-CTP3 in vitro и in vivo, получили небольшой стабильный пул клеток, экспрессирующих и секретирующих указанный белок, и разработали процессы очистки и активации.
В настоящем исследовании исследовали фармакокинетические и фармакодинамические свойства FVIIa-CTP3 у мышей, лишенных FVIII. Оценивали ФК профиль белка. Определяли ФК профиль на основании удельной активности FVIIa и сравнивали с таковым у доступного для приобретения продукта NovoSeven®. Кроме того, исследовали in vivo длительную гемостатическую способность FVIIa-CTP3 (способность вызывать свертывание крови) у мышей, лишенных FVIII, после рассечения хвостовой вены (исследование выживаемости).
Цели исследования.
Оценить фармакокинетические и фармакодинамические параметры FVIIa-CTP3 по сравнению с таковыми у доступного для приобретения rhFVIIa (NovoSeven®) у мышей, лишенных FVIII, после однократного в/в введения сходной дозы активности.
Определить способность in vivo FVIIa-CTP3 поддержания гомеостаза у мышей, лишенных FVIII, после однократного в/в введения FVIIa-CTP3 и NovoSeven® в сходной дозе активности, после чего проводили испытание рассечением хвостовой вены (исследование выживаемости).
Получение собранного FVII-CTP3.
FVII-CTP3 экспрессировали внутри хозяина в клетках Dg44, применяя вектор pCI-DHFR. Стабильный трансфицированный пул № 71 растили во встряхиваемых колбах, в присутствии 25 нг/л витамина K3 (Sigma). Суспензию клеток культивировали и собирали после снижения жизнеспособности до 6080%. Собранные суспензии фильтровали и замораживали при -70°C.
Определение уровня антигена собранного FVIL.
Уровень антигена FVII определяли с применением набора для ELISA FVII человека (Zymotest HyPhen) (табл. 38). Уровень антигена рассчитывали для каждой объединенной собранной партии.
- 77 044349
Таблица 38. Уровень антигена FVII-CTP3
| Уровень антигена IVII | |||
| 11 ее. юдоваи не ФК-Ф, 1 | 1 1сс. юдова ппс выживаемости | ||
| Собранная парны 31Л | Собранная парны 31В | Собранная парны 38 | |
| Сред. (мкг/м. I) | 16,0 | 15,9 | 16,6 |
| СО | 1.5 | 0.0 | о.Х |
| % КВ | 9,1 | 0,1 | 4,у |
Процесс очистки FVII-CTP3 (фиг. 25).
План процесса.
После короткого исследования очистки осуществляли следующий процесс очистки, применяя 2 колонки. С помощью аффинной колонки VII-Select (GE) и колонки с керамическим гидроксиапатитом типа 1 (ГА), 40 мкм (Bio Rad), очищали обогащенный гамма-карбоксилированный белок FVII-CTP3. Самоактивацию вызывали путем инкубации очищенного FVII-CTP3 в присутствии CaCl2 в течение ночи при 28°C. Процесс очистки находился на конечной стадии разработки и его оптимизировали, поэтому часть этапов очистки не была идентичной для двух партий.
Ультрафильтрация/диафильтрация (УФ-ДФ) с применением кассеты из полого волокна или кассеты Pellicon с отсечкой по молекулярной массе 10 кДа.
Осветленную собранную суспензию клеток размораживали при 4°C в течение выходных (2-3 дней).
Для партии 31 осветленную собранную суспензию клеток (12 л) концентрировали в 4 раза (двумя последовательными циклами), применяя картридж из полого волокна (GE Healthcare, номер в каталоге UFP-10-C-4X2MA) с отсечкой по молекулярной массе 10 кДа. Концентрированную суспензию клеток подвергали диафильтрации против 1-2 объемов TBS (50 мМ трис, 150 мМ NaCl, pH 7,4).
Для партии 38 осветленную собранную суспензию клеток (8,5 л) концентрировали в 4 раза, применяя кассету Pellicon 2 (Millipore) с отсечкой по молекулярной массе 10 кДа. Концентрированную суспензию клеток непосредственно загружали на колонку VII-Select.
Обе ультрафильтрации осуществляли на льду с ледяными буферами. Образцы УФ-ДФ фильтровали перед загрузкой через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
Захват на колонке FVII-Select.
УФ-ДФ или концентрированную собранную суспензию клеток загружали на колонку VII-Select (XK16/20, объем колонки 18 мл), заранее уравновешенную TBS, pH 7,4. Колонку промывали 50 мМ трисHCl, 0,5 М NaCl, pH 7,5, и элюировали FVII-CTP3 50 мМ трис-HCl, 1 М NaCl, 50% (в объемном отношении) пропиленгликоль, pH 7,5. Процесс осуществляли двумя последовательными циклами с применением одной и той же колонки.
Разделение на колонке с керамическим гидроксиапатитом на основе гамма-карбоксилирования.
Элюированный продукт разбавляли 1:10 10 мМ фосфатом натрия, pH 6,8, и загружали на колонки с керамическим гидроксиапатитом (XK16/20, объем колонки 24 мл). Колонку промывали 59 мМ фосфата натрия, pH 6,8, и сильно гамма-карбоксилированную фракцию фактора VII элюировали 500 мМ фосфатом натрия, pH 6,8. Данный процесс осуществляли двумя последовательными циклами на одной и той же колонке. Для каждой партии элюаты после двух циклов объединяли и концентрировали до 1,7-2 мг/мл и подвергали диафильтрации с 20 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl, pH 8,2, чтобы уменьшить объем и подготовить материал к этапу активации.
Активация FVIL.
Очищенный FVII-CTP3 разбавляли до 1 мг/мл и инкубировали с 20 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl и 1 мМ CaCl2, pH 8,2, при 2-8°C в течение 24 ч. Активацию завершали заменой буфера (УФ-ДФ) на предварительный рецептурный буфер (20 мМ цитрат, 240 мМ NaCl, 13,3 мМ глицин, pH 6,9).
Аналитические свойства FVII-CTP3 и FVIIa-CTP3.
ЭФ в ПААГ/ДСН и вестерн-блоттинг.
Очищенные FVII-CTP3 и FVIIa-CTP3 загружали на 12% трис-глициновый гель, на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Анализ ЭФ в ПААГ/ДСН с помощью окрашивания кумасси осуществляли путем окрашивания геля реагентом кумасси бриллиантовым голубым (5 или 10 мкг белка/дорожку). Осуществляли анализ методом вестерн-блот (1 мкг белка/дорожку), применяя поликлональные AT к FVII человека (R&D Systems; AF2338), моноклональное антитело, узнающее гамма-карбоксилирование белка человека (American Diagnostics, номер в каталоге 499, 3570), и поликлональные AT к CTP. При восстановительных условиях, FVII-CTP3 мигрировал на уровне 75 кДа, а FVIIa-CTP3 мигрировал в виде двух основных полос: тяжелой цепи на уровне 50 кДа и легкой цепи на уровне 25 кДа, представленных на фиг. 26 как полосы 2 и 3, соответственно.
Процедура очистки позволила значительно повысить содержание FVII-CTP3 и уменьшить количество примесей. Выход процесса очистки составлял 25-30% FVII (согласно ELISA). Большая часть белка, потерянного в процессе очистки, обладала низкой хромогенной активностью FVII или не обладала активностью. На основании окрашивания кумасси геля после ЭФ в ПААГ/ДСН выявили, что восстанов
- 78 044349 ленный FVIIa-CTP3 мигрировал большим количеством полос, чем предсказывали. Полоса, которая мигрировала на уровне приблизительно ~75 кДа представляла собой неактивированный FVII (фиг. 26, полоса 1). Данная полоса состояла из двух полос с незначительными различиями в молекулярной массе, что может отражать различную степень гамма-карбоксилирования. Также наблюдали дополнительные полосы с молекулярной массой ниже 20 кДа. Ранее было описано, что они представляют собой продукты деградации тяжелой цепи.
Хромогенная активность FVII-CTP3.
Сравнительная оценка активности in vitro собранного FVII-CTP3, фракций в процессе очистки и очищенного FVII-CTP3 по сравнению с объединенной нормальной плазмой человека осуществляли, применяя доступный для приобретения набор для анализа хромогенной активности BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). Готовили серийные разведения собранного FVII-CTP3 и очищенного белка и оценивали эффективность путем сравнения кривой дозовой зависимости с таковой для эталонного препарата нормальной плазмы человека. После очистки FVII-CTP3, хромогенная активность значительно улучшалась, и неактивные фракции преимущественно отделяли на ГА-колонке (фиг. 27). Наблюдали сильную корреляцию между хромогенной активностью FVII и обнаружением FVII моноклональными антителами к Gla на вестерн-блоте. По значению EC50 видно, что хромогенная активность FVII в собранном материале была нарушена как в карбоксилированной, так и в некарбоксилированной фракции FVII. После очистки и обогащения гамма-карбоксилированной фракцией FVII-CTP3, активность улучшалась, демонстрируя существенный вклад гамма-карбоксилирования в активность FVII (фиг. 27). Данный параметр важен для адекватной активности FVII in vivo и будет дополнительно проработан в программе разработки клонов.
Определение количества белка на длине волны A280.
Теоретический коэффициент поглощения FVIIa-CTP3 и NovoSeven® рассчитывали, применяя алгоритм ProtParam (http://web.expasy.org/protparam). Расчет был основан на последовательности аминокислот. Рассчитанные коэффициенты поглощения для FVII-CTP3 и NovoSeven® составляли 1,186 и 1,406, соответственно. Данные значения представляют собой поглощение 1 г/л при 280 нм.
Различие в коэффициенте поглощения между двумя белками возникло исключительно благодаря увеличению молекулярной массы FVIIa-CTP3 по сравнению с NovoSeven®, поскольку в CTP отсутствуют ароматические и остатки цистеина, следовательно, он не вносит вклад в поглощение.
Определение количества белка на A280 использовали для конечного FVII и для очищенных образцов в процессе очистки, начиная с элюирования с колонки VII-Select.
Определение уровня антигена FVIIa.
Уровень антигена FVIIa определяли с применением набора для ELISA FVIIa человека (IMUBIND, American Diagnostica). Уровень антигена рассчитывали для каждой партии. Тем не менее, данный способ не был полезен для определения дозы для инъекции, поскольку он не отражал количество активного продукта.
Анализ свертывания крови FVIIa-Staclot® VIIa-rTF.
FVIIa получали путем расщепления внутри цепи одноцепочечного FVII. Нативный тканевый фактор (TF) представляет собой кофактор FVIIa. При связывании с TF, FVII опосредует активацию фактора X в Xa, при этом сам превращается в FVIIa. Растворимый тканевый фактор представляет собой внеклеточную часть нативного тканевого фактора. Он больше не может активировать FVII путем самоактивации, но FVIIa, связанный с тканевым фактором, может активировать FX в FXa.
Рекомбинантный растворимый тканевый фактор (rsTF), применяемый в данном анализе, специфичен к FVIIa, что используют для создания анализа свертывания крови FVIIa. RsTF в присутствии FVIIa, кальция и фосфолипидов приводит к свертыванию плазмы без активации FVII в FVIIa.
Наблюдаемое время свертывания крови в данной системе обратно пропорционально содержанию FVIIa в исследуемом образце, и не зависит от присутствия FVII в образце.
Анализ проводили в Omri Laboratories (Нес-Циона, Израиль). Активность FVIIa оценивали как у NovoSeven® после восстановления влагосодержания, так и у FVIIa-CTP3 перед каждым исследованием. Активность NovoSeven® не коррелировала с предполагаемой активностью, указанной на флаконе, но такое несоответствие могло возникнуть вследствие различных подходов к оценке активности. В табл. 39 кратко описана свертывающая активность FVIIa на объем без учета концентрации белка.
Таблица 39. Свертывающая активность FVIIa в продуктах партий
| ФК исследование | Исследование выживаемости | |||
| ΙΛ На34 ТР (ГЛНаЗ!) | NovoSeven | 1\ Ila- 34 IP (1\ На 38) | NovoSeven ΐΒίβϋβ· | |
| Активность (Ед./мл) | 1,3*106 | 2,5*105 | 1,3*106 | 7,4*105 |
Удельная активность FVIIa-CTP3.
Удельную активность (УА) FVIIa (которую рассчитывали как активность/мл, деленную на концентрацию белка) рассчитывали на основании A280 и представили в табл. 40. При сравнении удельных ак- 79 044349 тивностей двух указанных молекул, которые отличаются по молекулярной массе, нужно внести корректировку для того, чтобы нормировать активность (т.е. вследствие различия в молекулярной массе, количество активных сайтов в 1 мг NovoSeven® в 1,185 раз больше, чем в 1 мг FVIIa-CTP3). Расчет переводного коэффициента представлен в следующем уравнении:
Нормированная_УА=(УА(FVΠa-CTP3)/мол. массу(FVΠ-CTP3)) х мол. массу нативного FVII=(УА(FVIIaСТРз)/53419,5 Да) х 45079,1 Да = (УА(FVIIa-CTPз) х 1,185
Таблица 40. Удельная активность FVIIa-CTP3 по сравнению с NovoSeven®
| Образец | Сред | СО (0=9 ) | Чо | Коэффпипен | Конц, белка | Ед./м. । | Удельная активность | Кра1 пость снижения относи ТС.1Ы1 |1И||||М^ИД NovoSeven R | |
| Λ2ΧΟ | КВ | УА'У' ΤΥ У:.·. IIOI. кипения | (мг/мл ) | Ε,ιΛιγ белка | Ед./мг FVIIa | ||||
| NovoSeven ® | 1,274 | 0,03 1 | 2,39 8 | 1,406 | 0,906 | 8,36*10 5 | 9,23*10 5 | 9,23*10 5 | 1,о |
| FVIIaСТРз | 4,396 | 0,09 2 | 2,09 4 | 1,186 | 3,706 | 7,23*10 5 | 1,95*10 5 | 2,31*10 5 | 4,0 |
Исследование ФК-ФД FVIIa-CTP3.
План исследования.
FVIIa-CTP3 и rhFVIIa (NovoSeven®, NS) вводили однократной внутривенной инъекцией мышам C57B, лишенным FVIII, в дозе 6,4*106 ед./кг массы тела (160000 ед./животное). Образцы крови отбирали из ретроорбитального синуса 4 мышей поочередно через 0,166, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 34, 48, 58 и 72 ч после введения (табл. 41). Цитратную плазму (0,32%) получали незамедлительно после взятия образцов и хранили при -20°C до проведения анализа. Оценивали уровень свертывающей активности FVIIa и проводили тщательный ФК анализ. Исследование осуществляли в Omri Laboratories (Нес-Циона, Израиль).
Таблица 41. Схема исследования
| 1 руин ы леченн я | Исследуемы й ирепаpa r | Количеств ||И|1ИД1МИ животных /группу момент времени | Пу । ь введенп | Количеств о единиц живо· ное | Пньецнровапп ый объем (мкл) | Момент ы времени (часы после введенп я) |
| А | rhFVIIa | 4 | в/в | 1,6*105 | 200 | 0 (до введения ) 0Д66, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 34, 48, 58, 72 |
| В | FVIIa-СТРз | 4 | в/в | 1,6*105 | 200 | 0 (до введения ) 0,166, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 34, 48, 58, 72 |
ФК профиль FVIIa-CTP3 у мышей, лишенных FVIII.
Осуществляли количественный анализ активности FVIIa в образцах крови, применяя набор Staclot® VIIa-rTF (Stago, Парсиппани, Нью-Джерси). Для каждого белка рассчитывали фармакокинетический профиль и он представлял собой среднее значение по 4 животным в каждый момент времени. На фиг. 28 представлен ФК профиль FVIIa в процессе эксперимента. Выход FVIIa представлен в табл. 42. Краткое описание ФК параметров представлено в табл. 43.
В табл. 41 кратко описаны значения свертывающей активности после введения либо NovoSeven®, либо FVIIa-CTP3. FVIIa-CTP3 и NovoSeven® достигали максимальной активности через полчаса после введения. Наивысшее значение активности NovoSeven® достигло лишь 43% максимального значения активности FVIIa-CTP3. Свертывающая активность FVIIa-CTP3 сохранялась в течение более продожительного периода времени, демонстрируя продленную активность. Свертывающая активность у мышей, которых лечили NovoSeven®, не детектировалась в моменты времени после 12 ч, тогда как у мышей, которых лечили FVII-CTP3, измеримая активность продолжала сохраняться в течение 48 ч после введения (табл. 41 и фиг. 28). Добавление трех последовательно присоединенных копий CTP к FVIIa повышало выход на 100% (табл. 42), что измеряли по наибольшей активности после введения и сравнивали с предполагаемой активностью на основании анализа in vitro, и увеличивало период полужизни и среднее время удерживания (MRT) в 5 раз. Время воздействия (AUC) повышалось в 3 раза (табл. 43).
- 80 044349
Таблица 41. Свертывающая активность FVIIa после однократной в'в инъекции
| Время после введения (часы) | Средняя свертывающая активность 1 Vila (сд.мл) | |
| EVHa-СТРз | NovoSeven“ | |
| 0.16 | 6,84 о’ | 3.24 0' |
| О.5 | 9, 7*1 о' | 4.3*10' |
| 2 | 2, РН ·' | 3.94 0 |
| 4 | 7,7*106 | 7.340s |
| 8 | 2,7*1 о | 4.24 01 |
| 12 | 3,74 0' | 6.2* ИГ |
| 24 | 2,4*1 о1 | НПКО |
| 34 | 4,64 о; | ннко |
| 48 | 1,5403 | НПКО |
Таблица 42. Выход FVIIa-СТРз
| Групп ы лечени я | Исследуемы ii препарат | Количеств о единиц животное | Факгичсск н вводимая лот (ел. мл) | Предполагаема я Стах (ед..мл крови) | Стах (ел. мл ) | выход а |
| А | rFVIIa | 1,60405 | 1,20406 | 1,40405 | 4,25*10 4 | 30 |
| В | FVIIa-СТРз | 1,60405 | 1,29406 | 1,50*105 | 9,74*10 4 | 64,6 |
^Предполагаемая Cmax представляет собой вводимую дозу, деленную на объем крови.
Таблица 43. ФК параметры FVIIa-CTP3 по сравнению с NovoSeven®
| ФК параметры | NovoSeven К· | ЕУПа-СТРз |
| 11ериод полужизни-а (0,5 - 12 ч.) | 0,94 | 1,57 |
| 11срнол полежи шп-р (12-48 ч.) | нд | 4.62 |
| А1С (м1л.*чм.1) Vd-κτ (мл. кг) | 5.80* |о' 1408 | 1.80* К Г 2375 |
| Cl.. KI ( M.I Ч. ΚΊ ) \1НТ (ч) | 1 < >34 1.3 | 356 6,7 |
Анализ образования тромбина (TGA).
Образование тромбина является основной частью каскада свертывания крови, и по существу оценка того, насколько хорошо конкретный индивид может образовывать тромбин, может коррелировать с риском кровотечения или тромбоза. Переменные, которые обычно измеряют при анализе образования тромбина, включают: время задержки, время до пика образования тромбина, пик, эндогенный потенциал тромбина (ETP) (т.е. площадь под фармакокинетической кривой и хвостом), динамика тромбограммы (TG). После времени задержки наблюдался выброс тромбина. Тем не менее, свертывание крови происходит по окончании времени задержки, когда более чем 95% всего тромбина еще не образовалось. Анализ образования тромбина проводили в Omri Laboratories, применяя реагенты Thrombinoscope, дополненные гемофильной плазмой человека. TGA отражает способность свертывания плазмы мышей, вызванную инъекцией NovoSeven® и FVIIa-CTP3. На фиг. 29 представлены значения параметров TGA для плазмы мышей после введения FVIIa-CTP3 или NovoSeven®. После введения FVIIa-CTP3, все три параметра (скорость образования тромбина, максимальное количество образованного тромбина и КПа) демонстрируют преимущество лечения FVII-CTP3 над лечением NovoSeven®. Это дополнительно подкрепляет наличие преимущества потенциального пролонгированного действия FVII-CTP3 над NovoSeven®.
Исследование лечения FVIIa-CTP3 после рассечения хвостовой вены (РХВ).
План исследования.
Результаты, полученные при исследовании ФК/ФД FVIIa-CTP3, дали представление о функциональных свойствах FVIIa-CTP3 и продемонстрировали, что FVIIa-CTP3 обладает фармакокинетическим преимуществом над NovoSeven®. Тем не менее, способность белка вызывать свертывание крови in vivo после травматического случая еще не была продемонстрирована. Чтобы оценить способность FVIIa-CTP3 останавливать кровотечение, использовали ту же модель мышей, лишенных FVIII, для теста с кровотечением.
Мышам, лишенным FVIII, вводили однократную внутривенную инъекцию FVIIa-CTP3 или NovoSeven®. Мышам вводили дозу лекарственного средства в количествах, которые обеспечивали эквивалентную FVIIa активность (1,6405 единиц, 200 мкл), рассчитанную в соответствии с эффективностью каждого лекарственного средства, оцененной в анализе свертывающей активности FVIIa (табл. 44). Вво- 81 044349 димые дозы составляли 9 мг/кг NovoSeven® и 40 мг/кг FVII-CTP3 вследствие пониженной активности
FVIIa-CTP3. Контрольной группе вводили путем инъекции 200 мкл среды. Хвостовую вену рассекали на расстоянии 2,7 см от кончика хвоста через 15 мин (инъекция 1), 24 ч (инъекция 2) или 48 ч (инъекция 3) после введения, и выживаемость мышей регистрировали в течение 24 ч.
Таблица 44. Оценка введенных путем инъекции образцов
| Xo>oSe>en “ | 1 Vlla-CHL | ||||||
| ЛЬ иньский 11 | Копп, бе. пса (мг/м. 1 ) | Акч IIBIIOC । ь (ед./мл) | Удельная aici и внос ί ь (ед./м· ) | Копп, белка (мг/м. 1 ) | Aid IIвнос • ь (ед./мл) | Удельная aid нвнос । ь (ед./м·) | Уде. 1ьная aid нвнос । ь (нормирован·· ая) |
| 1 | 0,91 | 8,0*105 | 8,8*105 | 3,63 | 6,6*105 | 1,8*105 | 2,2*105 |
| 2 | 0,92 | 8,3*105 | 9,0*105 | 3,81 | 7,8*105 | 2,0*105 | 2,4*105 |
| 3 | 0,89 | 8,8*105 | 9,9*105 | 3,68 | 7,3*105 | 2,0*105 | 2,3*105 |
Концентрацию белка определяли по A280.
Результаты.
Результаты для контрольных групп, которым вводили среду путем трех инъекций (5 животных x 3 инъекции), кратко описали и представили на фиг. 30. Наблюдали выживаемость 30% через 24 ч после рассечения хвостовой вены.
У мышей, которых лечили NovoSeven® и FVIIa-CTP3, продемонстрировали адекватную гемостатическую активность после рассечения хвостовой вены, которое осуществляли через 15 мин после введения FVIIa. У животных, которых лечили FVIIa-CTP3 и NovoSeven®, наблюдали коэффициент выживаемости 100% (фиг. 30).
Пониженная скорость выведения FVII-CTP3, которую продемонстрировали в исследовании ФК/ФД, была наиболее явно видна, когда рассечение хвостовой вены осуществляли через 24 ч после введения. Наблюдалось уменьшение коэффициента выживаемости для NovoSeven®. Аналогично контрольной группе, 50% смертей наблюдалось в течение 10 ч. Тем временем 90% мышей, которых лечили FVIIaCTP3, выжило (фиг. 30). Полученные результаты подчеркивают длительную эффективность лечения FVIIa-CTP3.
Через 48 ч после введения продемонстрировали уменьшение коэффициента выживаемости в группах, которых лечили любым из FVIIa-CTP3 и NovoSeven® (фиг. 30C). Наблюдали небольшое улучшение у мышей, которых лечили FVIIa-CTP, но различие не достигло статистической значимости.
Обсуждение.
Слияние CTP с рекомбинантными белками продлевает период полужизни белков из кровообращения, при этом сохраняется их сопоставимая активность. Хотя механизм, обуславливающий пониженный клиренс белка больше порогового размера 70 кДа, хорошо изучен по сравнению с почечным клиренсом, дополнительной защиты добиваются после присоединения CTP. Полагают, что присоединение CTP разворачивает белковый щит и защищает его от протеолитического расщепления, увеличивает его радиальную молекулярную массу благодаря сильно отрицательному заряду и уменьшает его аффинность к рецепторам клиренса печени.
Целью настоящего исследования было дать определенное представление о влиянии слияния CTP с FVII на период полужизни и клиренс белка, а также исследовать его удельную активность после данной модификации. Мышам, лишенным FVIII, вводили однократную в/в инъекцию FVIIa-CTP3 или доступного для приобретения рекомбинантного FVIIa (NovoSeven®) в сходных дозах (в единицах), и осуществляли ФК анализ на основании активности. Для FVIIa-CTP3 продемонстрировали большее время полужизни, как видно по 5- и 3,5-кратному увеличению периода полужизни и AUC, соответственно. Было показано, что удельная активность (ед./мг) FVIIa-CTP, рассчитанная по активности, определенной с помощью набора Staclot®, деленной на концентрацию белка, измеренную на A280, была в 4-5 раз ниже, чем удельная активность NovoSeven®. Чтобы закрепить понимание того, как CTP влияет на кровоостанавливающее действие FVIIa in vivo, исследовали способность FVIIa-CTP3 уменьшать кровотечение. В модели кровотечения с рассечением хвостовой вены, в модели мышей с гемофилией, введение rFVIIa могло улучшить коэффициент выживаемости подвергнутых рассечению животных и избежать у них смертельного кровотечения. В исследовании, описанном в настоящем тексте, животным вводили FVIIa-CTP3 или NovoSeven®. Обе молекулы были способны поддерживать гомеостаз, если рассечение осуществляли через 0,25 ч после введения. Значительно долыпую продолжительность активности продемонстрировали для группы лечения FVIIa-CTP3, когда рассечение хвоста осуществляли через 24 ч после введения. Коэффициент выживаемости в группе лечения средой был выше, чем предполагаемый, и выше, чем полученный в предыдущих исследованиях (50% по сравнению с 20% в предыдущих исследованиях, результаты не
- 82 044349 представлены). Процент выживаемости подвергнутых лечению животных дополнительно оценивали в более ранние моменты времени, например через 36 ч после введения.
В заключение, продемонстрировали, что FVIIa-CTP3 обладает большей продолжительностью активности у мышей с гемофилией, которая приводит к большей продолжительности кровоостанавливающего действия по сравнению с NovoSeven®. Полученные результаты позволяют предположить, что слияние CTP с FVII представляет собой технологию, которая потенциально может значительно улучшить профилактическое лечение пациентов с гемофилией.
Пример 7. Сравнительная оценка профиля очищенного FVII-CTP3 по сравнению с таковым для FVII-CTP5 после однократной в/в или п/к инъекции крысам SD.
Цель исследования.
Проводили два исследования.
Целью первого исследования было определить фармакокинетические параметры rFVII-CTP3 по сравнению с rFVII-CTP5 после очистки на колонке FVII-Select (FVII-S) и ГА-колонке у самцов крыс линии Sprague-Dawle, после однократного внутривенного введения 50 мкг/животное.
Во втором исследовании изучали фармакокинетические параметры rFVII-CTP3-ГА по сравнению с rFVII-CTP5-ГА у самцов крыс линии Sprague-Dawle после однократного внутривенного или подкожного введения 100 мкг/животное.
Результаты.
Определение уровня антигена FVII-CTP 3 и FVII-CTP 5.
Уровень антигена FVII определяли с применением набора для ELISA FVII человека (Zymotest HyPhen) (см. табл. 45).
Таблица 45. Кратко описана рассчитанная концентрация белка, которая представляет собой среднее значение по трем независимым экспериментам
| 1 VII 3 СТР | 1 VII 5 СТР | |||
| FVITS46_ )!. КОНЦ. .ilia, ϊ. | mi-гл 46 ).i. | FVII-S м. | FVH-I Л 5 100% В | |
| кони, дна. 1. | копи, диал. | кони, лна.1. | ||
| Сред, (пгмл) | 3,78*106 | 1,594о | 1,8840 | 7,92 4 |
| СО | 1,30^106 | 6,03 4 05 | 7,15405 | 3,57405 |
| КВ (%) | 3,43 4 01 | 3,80401 | 3,80401 | 4,51401 |
Анализ методом вестерн-блот исследованных образцов.
Образцы FVII-CTP3,5 загружали на 4-12% бис-трис гель (NuPage, invitrogene), на который также загружали маркер молекулярной массы белков Precision plus dual color (Bio-Rad). Анализ гелей после ЭФ в ПААГ/ДСН осуществляли с помощью вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга), применяя поликлональные AT к FVII (R&D Systems), поликлональные AT к CTP (Adar Biotech Production) или AT к Gla (American Diagnostica). Вкратце, FVII, слитый с тремя и пятью CTP, мигрировал на уровне 80 и 100 кДа, соответственно (см. фиг. 31).
Сравнительная оценка активности FVII in vitro.
Анализ активности FVII, который проводили в Медицинском центре им. Шибы, в Национальном центре свертывания крови, представлял собой анализ на основе ПВ с применением иммуноадсорбированной плазмы, обедненной фактором VII (Siemens). Реагент ПВ представлял собой инновин (innovin), и анализ осуществляли с помощью устройства CA 1500 Sysmex. Нормальный диапазон FVII составлял 55 145%. Активности образцов кратко описаны в табл. 46.
Таблица 46. Активность образцов
| Обра sen | Коппет рання (мг/м. ι) согласно XAXODROP | Копнен।рання в псс. le.ioBainio.M образце (мкт/м. ) | Резу, ibiaibi (%) | Средняя акцизное· ь - ”/<» о । акцизное· н ii. ia >мы |
| FVII-5CTP FVII-S эл. | 2 | 87 | ||
| 2,19 | 1 | 30 | 16% | |
| конц. диал. | ||||
| 0,5 | 10 | |||
| FVII-5CTP-TA 5 100% | 2 | 97 | ||
| 1 | 1 | 36 | 21% | |
| В конц. диал. | 0,5 | 13 | ||
| FVII-S 46 эл. конц. | 3,17 | 2 | 100 | |
| 1 0,5 | 35 | 18% | ||
| диал. | ||||
| 12 | ||||
| FVII-ГА 46 эл. конц. | 1,5 | 2 | 92 | 20% |
| диал. (1) | 1 | 33 | ||
| 0,5 | 10 |
Нормальный уровень циркулирующего в организме FVII составляет приблизительно 0,5 мкг/мл.
- 83 044349
Оба FVII-CTP3 и FVII-CTP5 проявили приблизительно 5-кратное снижение коагулирующей активности по сравнению с объединенной нормальной плазмой человека.
Фармакокинетическое исследование.
Проводили два фармакокинетических исследования, чтобы определить фармакокинетический (ФК) профиль и параметры FVII-CTP3 и FVII-CTP5 (после очистки на колонке FVII-Select и колонке FVII-ГА). В первом исследовании, FVII-CTP3 и FVII-CTP5 после очистки на колонке FVII-Select/ГА вводили однократной внутривенной инъекцией крысам линии Sprague-Dawle (по шесть крыс на вещество) в дозе 50 мкг/крысу.
Образцы крови отбирали из ретроорбитального синуса 3 крыс поочередно через 0,083, 0,5 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96 и 120 ч после введения. Цитратную плазму (0,38%) получали незамедлительно после взятия образцов и хранили при -20°C до проведения анализа.
Во втором исследовании изучали только образцы после ГА-колонки. Данные образцы вводили однократной внутривенной или подкожной инъекцией крысам линии Sprague-Dawle (по шесть крыс на вещество), применяя дозу 100 мкг/крысу. Образцы крови собирали в те же моменты времени и при тех же условиях, что и в первом исследовании, описанном выше.
Таблина 47. Дизайн первого исследования (FVII-Select по сравнению с FVII-ГА)
| 1 рун Ш>1 лечен пя | II селе.дуемый пропара ι | Ко. шчес 1ВО ЖИВО! пы х/ группу | 11уп> введен пя | Уровень Д0>Ы (мкт па ЖИВО 1 пос) | Ипьепир ованный обьсм («κι) | Копп, (м кт/м л) | Момен ι ы времени (часы после введения) |
| 0 (до | |||||||
| А | FVII-CTP*3, партия 46, ГА | 6 | в/в | 50 | 200 | 250 | введения) 0,083 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96, |
| 120 | |||||||
| 0 (до | |||||||
| В | FVII-CTP*3 партия 46, FVII-S | 6 | в/в | 50 | 200 | 250 | введения) 0,083 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96, |
| 120 | |||||||
| 0 (до введения) | |||||||
| С | FVII-CTP*5, партия 5, ГА | 6 | в/в | 50 | 200 | 250 | 0,083 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96, |
| 120 | |||||||
| 0 (до | |||||||
| D | FVII-CTP*5, партия 5, FVII-S | 6 | в/в | 50 | 200 | 250 | введения) 0,083 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96, |
| 120 |
- 84 044349
Таблица 4S. Дттзашт второго исследования (внутривенное введение по сравнению с подкожным)
| 1 руины . ючення | Исследуемый преиараι | Ко. шчес 1 во животы х/ ι руину/ | 1 |у ι ь введен пя | Уровень ДО >Ы (мкт па живо· ное) | Иньенп роваппы йобнем (мкл) | Копп, (мкт/м. 1 ) | Момеп ι ы времени (часы после введения) |
| А | FVII-CTP*3, партия 46, ГА | 6 | в/в | 100 | 200 | 500 | 0 (до введения ) 0,083 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96, 120 |
| В | FVII-CTP*3, партия 46, ГА | 6 | п/к | 100 | 200 | 500 | 0 (до введения ) 0,083 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96, 120 |
| С | FVII-CTP*5, партия 5, ГА | 6 | в/в | 100 | 200 | 500 | 0 (до введения ) 0,083 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96, 120 |
| D | FVII-CTP*5, партия 5, ГА | 6 | п/к | 100 | 200 | 500 | 0 (до введения ) 0,083 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96, 120 |
Основные различия между данными двумя исследованиями представляли дозировки и путь введения. В первом исследовании крысам вводили путем в/в инъекции дозу 50 мкг/крысу, тогда как во втором исследовании крысам вводили путем в/в или п/к инъекции дозу 100 мкг/крысу (всего 500 мкг/кг; масса крыс 200 г). Повышение дозировки произошло вследствие изменения типа введения; п/к введение требует больших количеств для достижения эффекта, близкого к эффекту в/в введения.
Анализ ФК исследования.
Осуществляли количественный анализ концентрации FVII в образцах плазмы, применяя наборы для ELISA FVII человека (zymutest FVII-Biophen). Рассчитывали фармакокинетические профили, и они отражали среднее значение по 3 животным в каждый момент времени. Конечные значения периода полужизни рассчитывали, применяя программное обеспечение РК Solutions 2.0. В табл, ниже кратко описаны рассчитанные концентрации FVII в различные моменты времени взятия образцов. ФК профиль и краткое описание ФК параметров представлены в таблице ниже.
Таблица 49. Первое фармакокинетическое исследование (FVII-Select ______по сравнению с FVII-ГА) - концентрации FVII (нг/мл)______
| Время (часы) | FVII СТР*3. партия 46. ГА | 1 VII стрйз. партия 46. 1 VII-S | FVII СТР*5. партия 5, 1 А | 1 VH СТР*5. партия 5. 1 VII-S |
| 0,083 | 1816,3 | 1633,9 | 2064,3 | 1853,5 |
| 0,5 | 1523,7 | 1409,9 | 1351,4 | 1418,0 |
| 2 | 1284,9 | 1041,7 | 1389,7 | 834,4 |
| 5 | 607,9 | 531,6 | 722,7 | 737,2 |
| 8 | 524,2 | 430,0 | 712,2 | 614,6 |
| 24 | 115,5 | 132,9 | 272,5 | 201,8 |
| 48 | 21,1 | 31,6 | 62,3 | 90,4 |
| 72 | 9,5 | 15,8 | 29,1 | 31,8 |
| 96 | нпко | 5,8 | 7,0 | 16,9 |
| 120 | нпко | НПКО | 8,5 | 13,4 |
-85044349
Таблица 50. Второе фармакокинетическое исследование (внутривенное введение по сравнению с под_____________кожным) - концентрации FVII (нг/мл)_____________
| Время (часы) | FV II ( 1 Р*3. партия 46, 1 A-в в | FVII ( 1 Рй5. наргия 5. ГА-в/в | FVII ( 1 Рй3, партия 46. ГА-п'к* | FVII ( | партия 5. ГА-п-к |
| 0,083 | 6452,6 | 6153,3 | 5,0 | НПКО |
| 0,5 | 3930,7 | 3660,6 | 14,5 | 14,6 |
| 2 | 1992,3 | 2176,2 | 113,6 | 96,2 |
| 5 | 1598,9 | 2087,3 | 106,6 | 70,5 |
| 8 | 781,6 | 1075,6 | 188,9 | 129,7 |
| 24 | 268,5 | 627,2 | 155,0 | 239,2 |
| 48 | 51,9 | 143,3 | 43,0 | 88,6 |
| 72 | 8,8 | 39,0 | 7,0 | 36,7 |
| 96 | нпко | 10,8 | НПКО | 10,4 |
| 120 | нпко | 8,2 | нпко | 8,7 |
Таблица 51. ФК анализ - первое фармакокинетическое исследование (FVII-S по сравнению с ГА)
| I V II ( 1 Рй3. партия 46. 1 А | IV II ( 1 Рй3. парт пя 46. FVII-S | FVII ( ГРЙ5. наргия 5. 1 А | IV II ( 1РЙ5. нар гия 5. FVII-S | |
| Период iio.iyajBHii роЖЗ - 8 ч.) | 4,3 | 4,0 | 5,51 | 5,59 |
| Период полужизни (8 72\96\120 ч.) | П,1 | 12,1 | 16,46 | 20,29 |
| Период полужизни (8 - 72) (ч.) | И,1 | 13,4 | 13,62 | 15,64 |
| AUC(O-t) (набл. площадь) (8 - 72/96/120 ч.) | 14566,9 | 13686,4 | 21812,7 | 19307,9 |
| Площадь AUC (со) (8 72/96/120 ч.) | 14718,2 | 13788,1 | 22013,9 | 19701 |
| Vd (площадь)/кг (мл/кг)(8 2/96/120 ч.) | 271,1 | 316,1 | 269,7 | 371,5 |
| CL (площадь)/кг(мл/ч/кг) (8 - 72/96/120 ч.) | 17,0 | 18,1 | 11,356 | 12,69 |
Добавление пяти CTP продлевало период полужизни FVII по сравнению с 3 CTP. Обе формы с 5 CTP (т.е. FVII-S и FVII-ГА) были обнаружены в далекие моменты времени (96 и 120 ч), тогда как FVII-3 CTP-ГА и FVII-3 CTP-S были обнаружены до 72 ч и 96 ч, соответственно. На основании данного факта, период полужизни FVII-5 CTP оказался большим, чем таковой у вариантов 3CTP (см. фиг. 32). Сравнение периодов полужизни всех исследованных материалов (3 и 5 CTP) в одни и те же моменты времени (8-72 ч) показало, что периоды полужизни были сходными, хотя 5 CTP гораздо длиннее (фиг. 32).
- 86 044349
Таблица 52. ФК анализ - второе фармакокинетическое исследование (внутривенное введение по сравнению с подкожным)
| 1 VII СТР*3. партия 46. 1 А- в в | 1 VII ( ΙΊ»ή5. партия 5. 1 Ав в | 1 VII ( ΊΊ»*3. наргня 46. ΓΑ- ιι К’ | ΙΛ II СТР*5. наргня 5. 1 А- II к* | 1>пожня1ес пособность СТР*3 | Ьножи nice πособиость (ГР;:5 | |
| Период полужизни (0,083 - 8 ч.) | з,о | 3,9 | -1,8 | -3,18 | ||
| Период полужизни (872\96\120 ч.) | 9,9 | 14,6 | 13,14 | 22,94 | ||
| Период полужизни (8-72) (ч.) | 9,9 | 13,0 | 13,14 | 29,47 | ||
| AUC(O-t) (набл. площадь) (8 - 72/96/120 ч.) | 28866,8 | 43761,0 | 6600 | 9822,7 | 22,9 | 22,4 |
| AUC (оо) площадь (8 72/96/120 ч.) | 28993,0 | 43934,4 | 6733 | 10110,8 | 23,22 | 23,01 |
| Vd (площадь)/кг (мл/кг) (8 72/96/120 ч.) | 246,4 | 240,5 | 1407,6 | 1636,8 | ||
| CL (площадь)/кг (мл/ч/кг) (8 72/96/120 ч.) | 17,2 | И,4 | 74,261 | 49,452 |
Вновь, как наблюдали в первом исследовании, добавление 5 CTP продлевало период полужизни FVII по сравнению с добавлением 3 CTP, причем как начальный, так и конечный период полужизни и при обоих путях введения (в/в и п/к, см. фиг. 33). Как и ожидалось, после п/к введения FVII впервые обнаруживали в крови в более поздний момент времени по сравнению с в/в введением.
Выше были кратко описаны два ФК исследования. Основной целью первого исследования была проверка различия между FVII-3CTP и FVII-5CTP после очистки на 2 различных колонках: FVII-Select и FVII-ГА. В наших предыдущих исследованиях мы сравнивали собранные белки с очищенными белками и обнаружили, что различие между вариантами FVII с 3 и 5 CTP было больше, когда крысам вводили путем инъекции собранные белки.
Не наблюдали значимого различия между результатами FVII 3/5 CTP после очистки на обоих колонках, следовательно решили во втором исследовании инъецировать FVII 3/5 CTP-ГА.
Пример 8. Исследование выживаемости мышей, лишенных FVIII, после подкожной инъекции FVIIA-CTP3 (MOD-5014).
Цель исследования.
Оценить эффективность NovoSeven®, MOD-5014 (FVIIA-CTP3) и MOD-5019 (FVIIA-CTP5) в исследовании рассечения хвостовой вены, после подкожного введения.
Аналитические свойства FVIIa-CTP3 (MOD-5014) и FVIIa-CTP5 (MOD 5019).
Определение количества белка на A280.
Теоретический коэффициент поглощения NovoSeven® рассчитывали, применяя алгоритм ProtParam (http://web.expasy.org/protparam). Расчет был основан на последовательности аминокислот. Рассчитанный коэффициент поглощения для NovoSeven® составлял 1,406, а для MOD-5019 составлял 1,075 (значения представляют поглощение 1 г/л на 280 нм). Коэффициент поглощения MOD-5014 определяли с помощью анализа аминокислот Mscan. Коэффициент поглощения для MOD-5014 составлял 1,27.
Анализ свертывания крови FVIIa - STACLOT VIIa-rTF.
FVIIa получали путем расщепления внутри цепи одноцепочечного FVII. Нативный тканевый фактор (TF) представляет собой кофактор FVIIa, при связывании с TF, FVII опосредует активацию фактора X в Xa, при этом сам превращается в FVIIa. Растворимый тканевый фактор представляет собой внеклеточную часть нативного тканевого фактора. Он больше не может активировать FVII путем самоактивации, но FVIIa, связанный с тканевым фактором, может активировать FX в FXa.
Рекомбинантный растворимый тканевый фактор (rsTF), используемый в данном анализе, специфи- 87 044349 чен к FVIIa, что используют для создания теста свертывания крови FVIIa. Рекомбинантный растворимый тканевый фактор (rsTF) в присутствии FVIIa, кальция и фосфолипидов, вызывает свертывание плазмы без активации FVII в FVIIa. Наблюдаемое время свертывания крови в данной системе обратно пропорционально содержанию FVIIa в исследуемом образце, и не зависит от присутствия FVII в образце.
Активность FVIIa оценивали для NovoSeven® с восстановленным влагосодержанием и для MOD5014 и MOD-5019 перед каждым исследованием.
Удельную активность FVIIa (которую рассчитывали как активность/мл, деленную на концентрацию белка) рассчитывали на основании A280 и представили в табл. 53. При сравнении удельной активности указанных двух молекул, которые отличаются по молекулярной массе, нужно внести корректировку для того, чтобы нормировать активность (т.е. вследствие различия в молекулярной массе, количество активных сайтов в 1 мг NovoSeven® в 1,185 раз больше, чем в MOD-5014, и в 1,307 раз больше, чем в MOD5019). Следовательно, расчет переводного коэффициента представлен в следующем уравнении: Нормированная_УА=(УА(FVIIa-CTP3)/мол. массу нативного FVII) х мол. массу (FVII-CTP3)= (УА(FVIIaСТРз)/45079,1 Да) х 53419,5 Да=(УА(FVIIa-CTPз) х 1,185
Таблица 53. Удельная активность MOD-5014 по сравнению с NovoSeven®
| Обра юн | Копп, белка на А280 (мг мл) | 5 дельная активность (ел. мг FVIIa) | Кратность снижения относительно ©.NovoSeven |
| ©NovoSeven | 0,93 | 52487 | ι,ο |
| MOD-5014, партия 73 | 1,4 | 25490 | 2,05 |
| MOD-5019, партия 9 | з,о | 11698 | 4,48 |
План исследования.
Наиболее значимой мерой является способность белка вызывать свертывание крови in vivo после травматического случая. Чтобы оценить способность MOD-5014 останавливать кровотечение, использовали ту же модель мышей, лишенных FVIII, для теста с кровотечением.
Мышам, лишенным FVIII, вводили однократной подкожной инъекцией MOD-5014, MOD-5019 или
NovoSeven®. Группам A и B вводили дозу NovoSeven® и MOD-5014, соответственно, в эквивалентных количествах по активности FVIIa. Группе C вводили дозу MOD-5019 в эквивалентном количестве белка FVIIa, что и в дозе MOD-5014, чтобы оценить решающий фактор (активность или количество белка).
Введенные дозы составляли 4,2 мг/кг NovoSeven® и 8,6 мг/кг MOD-5014 и MOD-5019. Хвостовую вену рассекали на расстоянии 2,7 см от кончика хвоста через 12 ч после введения и выживаемость мышей ре гистрировали в течение 24 ч.
Таблица 54. Обозначение групп
| Г руппа | Дата инъекции | Исследуемый препарат | Вводимая доза | Инъецируемый объем (мкл) | Кол-во мышей на группу | Время кровотечения, часы после введения | |
| мг FVII /кг | мЕд./кг | ||||||
| А | 13.1.13 | ©NovoSeven | 4,23 | 221876 | 100 | 10 | 12 |
| В | 15.1.13 | MOD-5014, партия 73 | 8,59 | 218750 | 160 | 10 | 12 |
| С | 27.1.13 | MOD-5019, партия 9 | 8,59 | 100496 | 160 | 10 | 12 |
Результаты.
Результаты эксперимента кратко описаны в табл. 55 и на фиг. 34.
- 88 044349
Таблица 55. Результаты исследования РХВ
| Время после РХВ (ч) | Кол-во выживших мышей | % выживаемости | ||||
| NovoSeven® | MOD5014 | MOD5019 | NovoSeven ® | MOD5014 | MOD5019 | |
| 0 | 9 | 10 | 10 | 100 | 100 | 100 |
| 1 | 9 | 10 | 10 | 100 | 100 | 100 |
| 2 | 9 | 10 | 10 | 100 | 100 | 100 |
| 3 | 8 | 10 | 8 | 89 | 100 | 80 |
| 4 | 6 | 9 | 8 | 67 | 90 | 80 |
| 5 | 5 | 9 | 7 | 56 | 90 | 70 |
| 6 | 4 | 8 | 5 | 44 | 80 | 50 |
| 7 | 3 | 8 | 5 | 33 | 80 | 50 |
| 8 | 2 | 7 | 5 | 22 | 70 | 50 |
| 9 | 1 | 6 | 5 | И | 60 | 50 |
| 10 | 1 | 5 | 5 | И | 50 | 50 |
| И | 1 | 3 | 5 | И | 30 | 50 |
| 12 | 1 | 3 | 5 | и | 30 | 50 |
| 24 | 1 | 3 | 4 | и | 30 | 40 |
Через 24 ч после РХВ, выжило лишь 11% мышей, которым ввели путем инъекции NovoSeven®. 30% мышей, которым инъецировали MOD-5014, и 40% мышей, которым инъецировали MOD-5019, выжило к данному моменту времени. Подкожная инъекция MOD-5014 и MOD-5019 привела к улучшенной выживаемости мышей по сравнению с NovoSeven®. Тем не менее, результаты не были оптимальными, поскольку более чем 50% животных погибло при проведении эксперимента.
Фактор VIIa, подобно другим факторам свертывания крови, обычно вводят путем внутривенной инъекции, для того чтобы он попал непосредственно в кровоток. Тем не менее, в настоящем изобретении показали, что композиции, предусмотренные в настоящем тексте, неожиданно более эффективно попадают в кровоток после п/к введения. Возможность подкожного введения FVIIa дает преимущество, так как подкожное введение FVIIa обеспечивает возможность профилактического применения. Подкожные инъекции пациентам также гораздо легче вводить самим себе, и они дают преимущество, когда пациенты очень молоды и их вены малы, и их трудно обнаружить.
Следовательно, подкожное введение можно применять для профилактического лечения.
Пример 9. Сравнительное исследование ФК-ФД рекомбинантного MOD-5014 по сравнению с NovoSeven® после подкожного введения крысам SD.
Цели исследования.
Определить фармакокинетические и фармакодинамические параметры MOD-5014 по сравнению с доступным для приобретения rFVIIa у крыс SD после однократного п/к введения.
Сравнить два независимых эксперимента (05010 и 05034) с продуктами MOD-5014, полученными из двух различных клонов (клон № 28 по сравнению с № 61), по их фармакокинетическим параметрам.
Экспериментальные методы.
Животные.
самца крыс SD прибыли из Harlan Laboratories Israel, Ltd, no меньшей мере за 4 дня до начала введения инъекций. Животные представляли собой здоровых молодых взрослых крыс массой ~200 г к началу исследования. Отклонение массы тела животных к моменту начала лечения не должно было превышать ± 20% от средней массы каждого пола. Состояние здоровья животных, используемых в данном исследовании, изучали по прибытии. Только здоровых животных акклиматизировали к лабораторным условиям и использовали для исследования.
Анализ свертывания крови FVIIa - STACLOT VIIa-Rtf.
Рекомбинантный растворимый тканевый фактор (rsTF), используемый в данном анализе, специфичен к FVIIa, что используют для создания теста свертывания крови FVIIa. RsTF, в присутствии FVIIa, кальция и фосфолипидов, вызывает свертывание плазмы без активации FVII в FVIIa.
Наблюдаемое время свертывания крови в данной системе обратно пропорционально содержанию FVIIa в исследуемом образце и не зависит от присутствия FVII в образце.
Активность FVIIa оценивали как для NovoSeven® после восстановления влагосодержания, так и для MOD-5014 перед каждым исследованием. Удельную активность FVIIa рассчитывали на основании A280. При сравнении удельной активности двух молекул, которые отличаются по молекулярной массе, нужно внести корректировку для того, чтобы нормировать активность (т.е. вследствие различия в молекулярной массе, количество активных сайтов в 1 мг NovoSeven® в 1,185 раз больше, чем в MOD-5014).
Программное обеспечение PK solver.
Фармакокинетические параметры рассчитывали, применяя программное обеспечение PK solver. Кривую в/в введения анализировали с помощью двухкомпартментного анализа (CA) введения болюсной дозы, а затем п/к введение анализировали с помощью некомпартментного анализа (NCA) внесосудистого введения -линейно-логарифмического метода трапеций. Рассчитывали характеристики периода полу- 89 044349 жизни, AUC, клиренса и объема распределения и исследовали параметры вывода путем сравнения между экспериментальными группами.
Экспериментальные материалы.
Эксперимент № 05010.
A. NovoSeven® RT: (партия № AU61553, получали 31.7.12*). Концентрация FVIIa на A280: 0,86 мг/мл. Анализ активности FVIIa Staclot: 56867 ед./мг. Инъецируемая доза: 946 мкг/кг. *Пул аликвот NovoSeven®, все из одного и того же № партии.
B. Клон 28. MOD-5014 RS12-001: 0,77 мг/мл** на основании A280. Анализ активности FVIIa Staclot: 34162 ед./мг. Инъецируемая доза: 850 мкг FVIIa/кг.
Эксперимент № 05034.
A. NovoSeven® RT: (партия № AU61347, получали 1.1.13). Концентрация FVIIa на A280: 0,82 мг/мл, разбавляли до 0,4 мг/мл стерильным буфером NS. Анализ активности FVIIa Staclot: 55688 ед./мг. Инъецируемая доза: 360 мкг/кг и 20047,7 ед./кг.
B. Клон 61. MOD-5014, партия 75: 1,9 мг/мл** на основании A280, разбавляли до 0,89 мг/мл рецептурным буфером. Инъецируемая доза: 20047,7 ед./кг. Свертывающая активность FVIIa: 25002* ед./мг на основании анализа активности FVIIa Staclot.
C. Клон 61. MOD-5014, партия 81A: 2,36 мг/мл на основании A280 (фильтровали утром в день исследования и перемеряли на 280 нм), разбавляли до 0,4 мг/мл рецептурным буфером. Инъецируемая доза: 360 мкг FVIIa/кг. Свертывающая активность FVIIa: 24943 ед./мг на основании анализа активности FVIIa Staclot.
D. Клон 61. MOD-5014, партия 81A: 2,36 мг/мл на основании A280, разбавляли до 0,89 мг/мл рецептурным буфером. Инъецируемая доза: 20047,7 ед./кг. Свертывающая активность FVIIa: 24943 ед./мг на основании анализа активности FVIIa Staclot.
План исследования.
Эксперимент № 05010.
MOD-5014 и NovoSeven® вводили однократной внутривенной или подкожной инъекцией крысам SD в дозе 0,9 мг/кг массы тела. Образцы крови отбирали из ретроорбитального синуса 3 крыс поочередно через 0,5, 4, 8, 12, 24, 34, 48 и 58 ч после введения. Цитратную плазму (0,32%) получали незамедлительно после взятия образцов и хранили при -20°C до проведения анализа. Данное исследование проводили в научном парке Science in Action, Hec-Циона, Израиль. Оценивали уровень свертывающей активности FVIIa и проводили тщательный ФК анализ в Prolor-Biotech.
Таблица 55. Дизайн исследования 05010
| 1 руины . ichciiiisi | Ike. юл хсмый нренар а1 | Ко. ι-βο ЖИВО 1 II их /группу а | Ко. । очес । во ЖИВО 1 пых / группу/ XI0X101II времени | Нун, вводе 1111» | Но. । | Урове пь ЛО1Ы (ΜΚΊ 7 К 1) | Пньеинр оваппый обьем (чм) | Момен । и времени (часы IIOC.IC введения) |
| А | rFVIIa (Novo Seven ®) | 6 | 3 | в/в | м | 946 | 220 | 0, 0,5, 4, 8, 12, 24, 34, 48, 58 |
| В | rFVIIa RS 12001 (кЛОН 28) | 6 | 3 | в/в | м | 850 | 220 | 0, 0,5, 4, 8, 12, 24, 34, 48, 58 |
| 11 \ Ila (\о\ о Se\ еп М | 6 | 11 'к | ιιιιιι^^ | 940 | 220 | о. (>.5.4. 8. 12. 24. 34. 48. 58 | ||
| D | ri Vila RS 12ОСИ (клоп 28) | 6 | 3 | П'К | м | 850 | 220 | 0. 0.5. 4. 8. 12. 24. 34. 48. 58 |
Эксперимент № 05034.
MOD-5014 и NovoSeven® вводили однокртной подкожной инъекцией крысам SD в дозе 0,9 мг/кг массы тела. Образцы крови отбирали из ретроорбитального синуса 3 крыс поочередно через 0,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48 и 72 ч после введения. Цитратную плазму (0,32%) получали незамедлительно после взятия образцов и хранили при -20°C до проведения анализа. Данное исследование проводили в Science in Action, Hec-Циона.
- 90 044349
Оценивали уровень свертывающей активности FVIIa и проводили тщательный ФК анализ в ProlorBiotech.
Таблица 56. Дизайн исследования 05034
| 1 руины лечения | lice. ie.i уем ып препар ат | Ko. mneciBO живо· пых/ группу/ момеш времени * * * | Путь введен ня | Пол | У ровен ь ивы па ЖИВО 1II ое (μκί /кт) | Уровень ДО5Ы па ЖИВО! НО е (ел./κι ) | 11 πьеип ровапны й обнем (мкл) | Момеп । ы времени (часы пос. ie введения) |
| А | FVIIa (NovoS even®) | 3 | п/к | м | 360 | 20047, 7 | 207 | 0, 0,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48, 72 |
| В | FVIIa 75 (клон 61) | 3 | п/к | м | 801,8 4 | 20047, 7 | 207 | 0, 0,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48, 72 |
| С | FVIIa 81A (клон 61) | 3 | п/к | м | 360 | 8979,4 8 | 207 | 0, 0,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48, 72 |
| D | FVIIa 81A (клон 61) | 3 | п/к | м | 803,7 4 | 20047, 7 | 207 | 0, 0,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48, 72 |
Результаты.
Осуществляли количественный анализ активности FVIIa в образцах крови, применяя набор STACLOT VIIa-rTF (Stago). Рассчитывали фармакокинетический профиль для каждого белка, и он представлял собой среднее значение по 3 животным в каждый момент времени.
Эксперимент № 05010.
После вычитания фона: 15 мЕд./мл.
На фиг. 35 представлен ФК профиль FVIIa после в/в и п/к введения либо NovoSeven®, либо MOD5014. Краткое описание значений активности FVIIa в каждый момент времени представлено в табл. 57. ФК паттерны при в/в и п/к введении различаются (см. фиг. 35; после вычитания фона: 15 мЕд./мл). Cmax после в/в инъекции выше, чем таковая после п/к инъекции, вследствие попадания лекарственного средства в кровь незамедлительно после введения (измеряли через 0,5 ч, табл. 57 и 58). Тем не менее, после п/к введения молекулы лекарственного средства переносятся во внутриклеточный матрикс и ткани, таким образом, Cmax можно измерить лишь через 2 ч после инъекции. Общее извлечение лекарственного средства после п/к введения было меньше, чем значение Cmax после в/в инъекции.
Через 8 ч. после инъекции обнаружили, что NovoSeven® обладает одинаковым ФК паттерном при введении путем либо в/в, либо п/к инъекции (после вычитания фона: 15 мЕд./мл, фиг. 35). Более того, свертывающая активность у мышей, которых лечили NovoSeven®, не детектировалась в моменты времени после 12 ч, тогда как у мышей, которых лечили MOD-5014, продолжала сохраняться измеримая активность через 58 ч после введения (табл. 57; после вычитания фона: 15 мЕд./мл; фиг. 35).
Таблица 57. Свертывающая активность FVIIa MOD-5014 по сравнению с NovoSeven® после в/в или п/к введения
| Время (ч.) <>.5 4 | NovoSevei (Л) мЕд. мл 304051.7 40068,3 | 1 к . в в % КВ 18.7 7,8 | MOD-50I (В) мЕл. мл 232818.3 62085,0 | 14. в в % КВ 5.о 9,5 | \ovoSci II к ( мЕл. м л 1 1401.7 21385,0 | . еп к. О % кв 2.4 22,6 | MOD-: II к ( мЕд. м л 3001.7 12018, 3 | '014. 1» % кв 1 од I 15,8 |
| 8 | 5276,7 | 2,5 | 25931,7 | 6,1 | 5525,0 | 32,5 | 6445,0 | 2,2 |
| 12 | 255,0 | 13,8 | 5633,3 | 9,3 | 297,7 | 41,4 | 924,7 | 24,1 |
| 24 | 1,3 | 7,1 | 251,3 | 11,8 | 1,3 | 89,2 | 249,3 | 60,3 |
| 34 | о,о | 78,3 | 4,5 | о,о | 63,7 | 85,5 | ||
| 48 | 29,0 | 9,9 | о,о | 35,0 | 47,2 | |||
| 58 | 10,3 | 4,6 | о,о | 13,7 | 33,5 |
После вычитания фона: 15 мЕд./мл.
- 91 044349
Таблица 58. ФК параметры MOD-5014 по сравнению с NovoSeven® после в/в или п/к введения
A. в/в
| ФК параметры | NovoSeven'к: RT (М | MOD-5014 (RS 12-001) (В) | |
| Период полужизни-а (0,5 | 0,24 | 1,04 | |
| - 4 ч.) | |||
| Период полужизни-β (4 58 ч.) | 1,31 | 3,17 | |
| AUC 0-беск., мЕд./мл*ч. | 702467,95 | 820778,67 | |
| Vss (Ед./кг/(мЕд./мл)) | 0,13 | 0,13 | |
| CL ((Ед./кг)/(мЕд./мл)/ч.) | 0,08 | 0,04 | |
| MRT (ч.) | 1,74 | 3,62 | |
| B. п/к |
| ФК параметры | NovoSeven* RT (В) | MOD-5014(RS 12-001)(() |
| Период полужизни (ч.) | 1,40 | 7,78 |
| Стах (мЕд./мл) | 21385,00 | 12018,33 |
| AUC 0-беск. (мЕд./мл*ч.) | 115099,72 | 84158,87 |
| MRT 0-беск. (ч.) | 4,32 | 7,04 |
| Vz/F (Ед./кг)/(мЕд./мл) | 0,95 | 3,88 |
| CL/F (Ед./кг)/(мЕд./мл)/ч. | 0,47 | 0,35 |
Vz/F - объем распределения в конечной фазе.
Эксперимент № 05034.
На фиг. 36 представлен ФК профиль FVII после п/к введения либо NovoSeven®, либо MOD-5017. Исследовали две различные партии клона номер 61 (№ 75 и 81) в одной и той же концентрации или с одними и теми же единицами активности, по сравнению с NovoSeven®. Краткое описание значений активности FVIIa в каждый момент времени представлено в табл. 59.
Результаты свидетельствуют о близком ФК паттерне после п/к введения, соответствующем предыдущим экспериментам. Более того, свертывающая активность у мышей, которых лечили NovoSeven®, не детектировалась в моменты времени после 12 ч, тогда как у мышей, которых лечили MOD-5014, продолжала сохраняться измеримая активность через 24 ч после введения (табл. 59 и фиг. 36; и после вычитания фона: 56 мЕд./мл (8, 12 ч) или 32 мЕд./мл (0,5, 2, 6, 14 ч)).
Значения Cmax партии № 81 (D) клона номер 61 (1301 мЕд./мл) были ниже, чем значения Cmax партии № 75 (B) клона номер 61 и NovoSeven® (A) (3521 мЕд./мл и 5908 мЕд./мл, соответственно), хотя их всех вводили путем инъекции в одном и том же количестве единиц активности (табл. 6). Тем не менее, у партий № 75 (B) и № 81 (D) наблюдалась почти одинаковая активность (559 мЕд./мл и 478 мЕд./мл, соответственно), которую измеряли через 8 ч. после инъекции (фиг. 36 и табл. 59; и после вычитания фона: 56 мЕд./мл (8, 12 ч) или 32 мЕд./мл (0,5, 2, 6, 14 ч)).
Таблица 59. Свертывающая активность FVIIa MOD-5014 (клон 61, партии № 75, 81) по сравнению с NovoSeven® после однократного п/к введения
| Врем я (ч.) | NinoSe^en « (А) | MOD-50I4. клон Ы. нар।ня 75 (В) - равные ел./кт | MOD-5014. клопЫ. пар· ня 81А (С) равная кони. 1А На. ΜΚΊ /кт | MOD-5014. клон 61. парны 81А (1)) - равные ел./кт | ||||
| мЕл. /м. 1 | % кв | мЕл./мл | % КВ | м Ел./м | % КВ | м Ел./м л | кв | |
| <>.5 | 3271 | 40.5 | 350,3 | 26,6 | 101,3 | 24,1 | 208,7 | 51,2 |
| 2 | 5908 ,0 | 18,1 | 3521,3 | 70,9 | 1294,7 | 7,0 | 1301,3 | 31,6 |
| 6 | 1411 ,7 | 23,6 | 1349,7 | 45,6 | 425,3 | 27,6 | 663,0 | 13,4 |
| 8 | 1029 ,0 | 12,4 | 559,3 | 52,7 | 152,7 | 19,5 | 478,0 | 25,4 |
| 12 | 121, 3 | 9,9 | 563,0 | 17,4 | 148,7 | 36,3 | 712,7 | 16,2 |
| 24 | 1,0 | 25,0 | 117,0 | 41,9 | 21,3 | 36,4 | 99,0 | 36,7 |
После вычитания фона: 56 мЕд./мл (8, 12 ч) или 32 мЕд./мл (0,5, 2, 6, 14 ч).
- 92 044349
Таблица 60. ФК параметры MOD-5014 (клон 61, партии № 75, 81) по сравнению с NovoSeven® после однократного п/к введения
| ФК нараме· ры | XovoSoen к RT(A) | MOD-5014. к. юн 61. iiap i ня 75 (В) - равные e.i./ici | MOD-50I4. кмоп 61. нар। ня 81А (()равная копи. FVIIa мкт/кт | MOD-50I4. к. 1011 61. нар·ня 81А (D)- равные ел./кт |
| Период полужизни (ч.) | 1,67 | 5,70 | 4,62 | 6,41 |
| Стах (мЕд./мл) | 5908,00 | 3521,33 | 1294,67 | 1301,33 |
| AUC 0-беск. (мЕд./мл*ч.) | 24688,18 | 20456,96 | 6260,23 | 13098,16 |
| MRT 0-беск. (ч.) | 3,73 | 7,86 | 6,40 | 10,59 |
| Vz/F (Ед./кг)/(мЕд./ мл) | 1,96 | 8,06 | 9,55 | 14,15 |
| CL/F (Ед./кг)/(мЕд./ мл)/ч. | 0,81 | 0,98 | 1,43 | 1,53 |
В настоящем изобретении кратко описаны два ФК исследования: 05010 и 05034. Нашей целью было дать определенное представление о влиянии присоединения CTP к FVII на период полужизни и клиренс белка при подкожном введении, а также исследовать его удельную активность после данной модификации. В данных исследованиях крысам SD вводили путем однократной п/к инъекции MOD-5014, полученный из двух клонов, и двух различных партий, и сравнивали с рекомбинантным доступным для приобретения FVIIa (NovoSeven®). Указанные компоненты вводили путем инъекции в сходных концентрациях FVIIa (мкг/кг) или на одном и том же уровне активности (ед./кг) и осуществляли анализ на основе ФК активности.
Основной целью первого исследования было сверить различные ФК параметры после в/в и п/к введения. На основании данного исследования мы можем заключить, что существует различие между ФК паттерном, измеренным после в/в или п/к введения. T1/2 после п/к инъекции MOD-5014 составлял 7,78 ч, и лишь 4,2 ч после в/в инъекции. Значения AUC были одинаковы (табл. 58).
Во втором исследовании, тем не менее, сосредоточились на различиях между двумя партиями MOD-5014 клона номер 61, который вводили путем инъекции в одной и той же концентрации FVIIa или в равных единицах активности, и сравнивали с NovoSeven®. В данном исследовании мы показали, что клон 61 партии № 75 проявил лучшие ФК параметры, чем партии № 81. У партии № 81, которую вводили путем инъекции на одном и том же уровне активности, Cmax оказалась ниже по неизвестной причине. Более того, намеряли одинаковую Cmax, когда вводили путем инъекции клон 61 партии № 81 в двух различных дозах (по концентрации FVIIa или по единицам активности), вместо 2,5-кратного различия между двумя значениями активности. После совместного анализа обоих исследований, мы можем прийти к заключению, что клон 28 проявил больший параметр t1/2, чем клон 61 № 75 (лучшая партия) после п/к инъекции (7,78 и 5,7 ч, соответственно, табл. 60). Мы также можем прийти к заключению, что образцы в разные моменты времени дают различные ФК паттерны, что приводит к изменению ФК кривых. Паттерны указанных кривых могут нам дать большее представление о поведении лекарственного средства в крови. Следовательно, мы решили установить моменты времени, аналогичные таковым, обнаруженным в Baxter (0, 0,5, 2, 6, 8, 12, 24, 34, 48, 72 ч). Более того, концентрация FVIIa в эксперименте 05010 была слишком высокой, и ее заново измерили в следующем эксперименте (05034) с п/к введением. Для будущих ФК исследований мы решили вводить путем инъекции компонент в дозе 360 мкг FVIIa/кг.
В общей сложности, мы можем больше узнать о продукте MOD-5014 после п/к введения, чтобы определить клон и партию с наилучшим качеством и чтобы выявить наилучший способ определения количества инъекцируемого MOD-5014 - по концентрации или единицам активности FVIIa.
Хотя свойства настоящего изобретения были проиллюстрированы и описаны в настоящем тексте, средние специалисты в данной области теперь смогут придумать множество его модификаций, замен, изменений и эквивалентов. Следовательно, должно быть очевидно, что в объем прилагаемой формулы изобретения должны входить все такие модификации и изменения как явно входящие в объем настоящего изобретения.
- 93 044349
Список последовательностей < 110> ОПКО БАЙОЛОДЖИКС ЛТД.
< 12 0> ФАКТОРЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ < 130> P-9520-PC5 < 150> 13/372,540 < 151> 2012-02-14 < 160>45 < 170> PatentIn версии 3.5 < 210>1 < 211>32 < 212> Белок < 213> Homo sapiens < 400>1
| Asp Pro Arg 1 | Phe | Gln 5 | Asp | Ser | Ser | Ser | Ser 10 | Lys | Ala | Pro | Pro | Pro 15 | Ser |
| Leu Pro Ser | Pro 20 | Ser | Arg | Leu | Pro | Gly 25 | Pro | Ser | Asp | Thr | Pro 30 | Ile | Leu |
| <210> 2 <211> 28 <212> Белок <213> Homo sapiens | |||||||||||||
| <400> 2 | |||||||||||||
| Ser Ser Ser 1 | Ser | Lys 5 | Ala | Pro | Pro | Pro | Ser 10 | Leu | Pro | Ser | Pro | Ser 15 | Arg |
| Leu Pro Gly | Pro 20 | Ser | Asp | Thr | Pro | Ile 25 | Leu | Pro | Gln |
< 210>3 < 211>12 < 212> Белок < 213> Homo sapiens < 400>3
Ser Ser Ser
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
510 < 210>4 < 211>28 < 212> Белок < 213> Homo sapiens <400> 4
- 94 044349
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln <210> 5 <211> 25 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> ПЦР Праймер для Фактора VII < 400> 5 ctcgaggaca tggtctccca ggccc <210> 6 <211> 24 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> ПЦР Праймер для Фактора VII < 400> 6 tctagaatag gtatttttcc acat <210> 7 <211> 22 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> ПЦР Праймер для Фактора VII < 400> 7 tctagaaaaa agaaatgcca gc <210> 8 <211> 32 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> ПЦР Праймер для Фактора VII < 400>8 gcggccgcat cctcagggaa atggggctcg ca < 210>9 <211>444 < 212> Белок < 213> Homo sapiens <400> 9
- 95 044349
Met Val Ser Gln Ala 1 5
Leu Arg Leu Leu Cys
Leu Leu Leu Gly Leu
Gly Cys Leu Ala Ala 20
Val Phe Val Thr Gln
Glu Glu Ala His Gly 30
Leu His Arg Arg Arg 35
Arg Ala Asn Ala Phe 40
Leu Glu Glu Leu Arg 45
Gly Ser Leu Glu Arg 50
Glu Cys Lys Glu Glu 55
Gln Cys Ser Phe Glu 60
Ala Arg Glu Ile Phe 65
Lys Asp Ala Glu Arg 70
Thr Lys Leu Phe Trp 75
Ser Tyr Ser Asp Gly 85
Asp Gln Cys Ala Ser 90
Ser Pro Cys Gln Asn 95
Gly Ser Cys Lys Asp
100
Gln Leu Gln Ser Tyr
105
Ile Cys Phe Cys Leu
110
Ala Phe Glu Gly Arg 115
Asn Cys Glu Thr His 120
Lys Asp Asp Gln Leu
125
Cys Val Asn Glu Asn 130
Gly Gly Cys Glu Gln
135
Tyr Cys Ser Asp His 140
Gly Thr Lys Arg Ser 145
Cys Arg Cys His Glu 150
Gly Tyr Ser Leu Leu 155
Asp Gly Val Ser Cys
165
Thr Pro Thr Val Glu
170
Tyr Pro Cys Gly Lys
175
Pro Ile Leu Glu Lys
180
Arg Asn Ala Ser Lys
185
Pro Gln Gly Arg Ile
190
Gly Gly Lys Val Cys 195
Pro Lys Gly Glu Cys
200
Pro Trp Gln Val Leu
205
Leu Val Asn Gly Ala
210
Gln Leu Cys Gly Gly
215
Thr Leu Ile Asn Thr
220
Trp Val Val Ser Ala 225
Ala His Cys Phe Asp 230
Lys Ile Lys Asn Trp 235
Asn Leu Ile Ala Val
245
Leu Gly Glu His Asp
250
Leu Ser Glu His Asp
255
Gln
Val
Pro
Glu
Ile 80
Gly
Pro
Ile
Thr
Ala 160
Ile
Val
Leu
Ile
Arg 240
Gly
- 96 044349
Asp Glu Gln
Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro 260 265
Val Pro Gly
275
Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg
280 285
Ser Thr Tyr 270
Leu His Gln
Pro Val Val
290
Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu
295 300
Pro Glu Arg
Thr Phe Ser 305
Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser
310 315
Leu Val Ser
320
Gly Trp Gly
Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu
325 330
Glu Leu Met
335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met
340
Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile
355 360
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser
370 375
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr 385 390
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val 405
| Thr | Glu | Tyr | Met 365 | Phe | Cys | Ala |
| Cys | Lys | Gly 380 | Asp | Ser | Gly | Gly |
| Trp | Tyr 395 | Leu | Thr | Gly | Ile | Val 400 |
| Gly 410 | His | Phe | Gly | Val | Tyr 415 | Thr |
Arg Val Ser
Pro Arg Pro
435
Gln Tyr 420
Gly Val
Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
425 430
Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 440
| <210> <211> <212> <213> <400> Met Val 1 | 10 448 Белок | Leu | Cys 10 | Leu | Leu | Leu | Gly | Leu 15 | Gln | |||||
| Homo 10 Ser | sapiens | |||||||||||||
| Gln | Ala 5 | Leu | Arg | Leu | ||||||||||
| Gly Cys | Leu | Ala 20 | Ala | Val | Phe | Val | Thr 25 | Gln | Glu | Glu | Ala | His 30 | Gly | Val |
- 97 044349
Leu
Gly
Ala 65
Ser
Gly
Ala
Cys
Gly 145
Asp
Pro
Gly
Leu
Trp 225
Asn
Asp
Val
His Arg 35
Ser Leu 50
Arg Glu
Tyr Ser
Ser Cys
Phe Glu
115
Val Asn 130
Thr Lys
Gly Val
Ile Leu
Gly Lys
195
Val Asn 210
Val Val
Leu Ile
Glu Gln
Pro Gly
Arg Arg
Glu Arg
Ile Phe
Asp Gly
Lys Asp 100
Gly Arg
Glu Asn
Arg Ser
Ser Cys
165
Glu Lys 180
Val Cys
Gly Ala
Ser Ala
Ala Val
245
Ser Arg 260
Thr Thr
Arg Ala
Glu Cys 55
Lys Asp 70
Asp Gln
Gln Leu
Asn Cys
Gly Gly
135
Cys Arg 150
Thr Pro
Arg Asn
Pro Lys
Gln Leu
215
Ala His 230
Leu Gly
Arg Val
Asn His
Asn Ala 40
Lys Glu
Ala Glu
Cys Ala
Gln Ser 105
Glu Thr 120
Cys Glu
Cys His
Thr Val
Ala Ser 185
Gly Glu 200
Cys Gly
Cys Phe
Glu His
Ala Gln
265
Asp Ile
Phe Leu
Glu Gln
Arg Thr
Ser Ser 90
Tyr Ile
His Lys
Gln Tyr
Glu Gly
155
Glu Tyr 170
Lys Pro
Cys Pro
Gly Thr
Asp Lys
235
Asp Leu 250
Val Ile
Ala Leu
Glu Glu
Cys Ser 60
Lys Leu
Pro Cys
Cys Phe
Asp Asp
125
Cys Ser 140
Tyr Ser
Pro Cys
Gln Gly
Trp Gln
205
Leu Ile
220
Ile Lys
Ser Glu
Ile Pro
Leu Arg
Leu Arg
Phe Glu
Phe Trp
Gln Asn
Cys Leu 110
Gln Leu
Asp His
Leu Leu
Gly Lys
175
Arg Ile 190
Val Leu
Asn Thr
Asn Trp
His Asp
255
Ser Thr
270
Leu His
Pro
Glu
Ile 80
Gly
Pro
Ile
Thr
Ala 160
Ile
Val
Leu
Ile
Arg 240
Gly
Tyr
Gln
- 98 044349
275
280
285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
290 295300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
305 310 315320
Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
420 425430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Gly Cys Gly Arg
435 440445 <210>11 <211>1356 <212> ДНК <213> Homo sapiens
| <400> 11 ctcgaggaca | tggtctccca | ggccctcagg | ctcctctgcc | ttctgcttgg | gcttcagggc | 60 |
| tgcctggctg | cagtcttcgt | aacccaggag | gaagcccacg | gcgtcctgca | ccggcgccgg | 120 |
| cgcgccaacg | cgttcctgga | ggagctgcgg | ccgggctccc | tggagaggga | gtgcaaggag | 180 |
| gagcagtgct | ccttcgagga | ggcccgggag | atcttcaagg | acgcggagag | gacgaagctg | 240 |
| ttctggattt | cttacagtga | tggggaccag | tgtgcctcaa | gtccatgcca | gaatgggggc | 300 |
| tcctgcaagg | accagctcca | gtcctatatc | tgcttctgcc | tccctgcctt | cgagggccgg | 360 |
| aactgtgaga | cgcacaagga | tgaccagctg | atctgtgtga | acgagaacgg | cggctgtgag | 420 |
- 99 044349
| cagtactgca | gtgaccacac | gggcaccaag | cgctcctgtc | ggtgccacga | ggggtactct | 480 |
| ctgctggcag | acggggtgtc | ctgcacaccc | acagttgaat | atccatgtgg | aaaaatacct | 540 |
| attctagaaa | aaagaaatgc | cagcaaaccc | caaggccgaa | ttgtgggggg | caaggtgtgc | 600 |
| cccaaagggg | agtgtccatg | gcaggtcctg | ttgttggtga | atggagctca | gttgtgtggg | 660 |
| gggaccctga | tcaacaccat | ctgggtggtc | tccgcggccc | actgtttcga | caaaatcaag | 720 |
| aactggagga | acctgatcgc | ggtgctgggc | gagcacgacc | tcagcgagca | cgacggggat | 780 |
| gagcagagcc | ggcgggtggc | gcaggtcatc | atccccagca | cgtacgtccc | gggcaccacc | 840 |
| aaccacgaca | tcgcgctgct | ccgcctgcac | cagcccgtgg | tcctcactga | ccatgtggtg | 900 |
| cccctctgcc | tgcccgaacg | gacgttctct | gagaggacgc | tggccttcgt | gcgcttctca | 960 |
| ttggtcagcg | gctggggcca | gctgctggac | cgtggcgcca | cggccctgga | gctcatggtc | 1020 |
| ctcaacgtgc | cccggctgat | gacccaggac | tgcctgcagc | agtcacggaa | ggtgggagac | 1080 |
| tccccaaata | tcacggagta | catgttctgt | gccggctact | cggatggcag | caaggactcc | 1140 |
| tgcaaggggg | acagtggagg | cccacatgcc | acccactacc | ggggcacgtg | gtacctgacg | 1200 |
| ggcatcgtca | gctggggcca | gggctgcgca | accgtgggcc | actttggggt | gtacaccagg | 1260 |
| gtctcccagt | acatcgagtg | gctgcaaaag | ctcatgcgct | cagagccacg | cccaggagtc | 1320 |
| ctcctgcgag | ccccatttcc | ctgaggatgc | ggccgc | 1356 |
<210> 12 <211> 1442 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CTP-модифицированный Фактор VII <400>12 ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc60 tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg120 cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc tggagaggga gtgcaaggag180 gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg240 ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc300 tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg360 aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag420 cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct480 ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct540 attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc600 cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg660
- 100 044349 gggaccctga aactggagga gagcagagcc aaccacgaca cccctctgcc ttggtcagcg ctcaacgtgc tccccaaata tgcaaggggg ggcatcgtga gtgtcccagt ctgctgagag cctagcagac gc tcaacaccat acctgatcgc ggcgggtggc tcgcgctgct tgcccgaacg gctggggcca cccggctgat tcacggagta acagtggagg gctggggcca acatcgagtg cccccttccc tgcctgggcc ctgggtggtc ggtgctgggc gcaggtcatc ccgcctgcac gacgttctct gctgctggac gacccaggac catgttctgt cccacatgcc gggctgcgcc gctgcagaaa cagcagcagc cagcgacacc tccgcggccc gagcacgacc atccccagca cagcccgtgg gagaggacgc cgtggcgcca tgcctgcagc gccggctact acccactacc accgtgggcc ctgatgagaa tccaaggccc cccatcctgc actgtttcga tcagcgagca cgtacgtccc tcctcactga tggccttcgt cggccctgga agtcacggaa cggatggcag ggggcacgtg acttcggcgt gcgagcccag ctccccctag cccagtgagg caaaatcaag cgacggggat gggcaccacc ccatgtggtg gcgcttctca gctcatggtc ggtgggagac caaggactcc gtacctgacc gtacaccagg acccggcgtg cctgcccagc atccgcggcc
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1442 <210> 13 <211> 472 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> CTP-модифицированный Фактор VII <400>13
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu 15
Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1015
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val 20
Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn
40
Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys
55
Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala 65 70
Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys 85
Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
95
- 101 044349
Gly
Ala
Cys
Gly 145
Asp
Pro
Gly
Leu
Trp 225
Asn
Asp
Val
Pro
Thr 305
Gly
Val
Ser Cys
Phe Glu
115
Val Asn 130
Thr Lys
Gly Val
Ile Leu
Gly Lys
195
Val Asn 210
Val Val
Leu Ile
Glu Gln
Pro Gly
275
Val Val 290
Phe Ser
Trp Gly
Leu Asn
Lys Asp 100
Gly Arg
Glu Asn
Arg Ser
Gln Leu
Asn Cys
Gly Gly
135
Cys Arg 150
Ser Cys
165
Glu Lys 180
Val Cys
Gly Ala
Ser Ala
Ala Val
245
Ser Arg 260
Thr Thr
Leu Thr
Glu Arg
Gln Leu
325
Val Pro 340
Thr Pro
Arg Asn
Pro Lys
Gln Leu
215
Ala His 230
Leu Gly
Arg Val
Asn His
Asp His
295
Thr Leu 310
Leu Asp
Arg Leu
Gln Ser 105
Glu Thr 120
Cys Glu
Cys His
Thr Val
Tyr Ile
Cys Phe
His Lys
Gln Tyr
Glu Gly
155
Glu Tyr 170
Ala Ser
185
Gly Glu 200
Cys Gly
Cys Phe
Glu His
Ala Gln
265
Asp Ile 280
Val Val
Ala Phe
Arg Gly
Met Thr
345
Lys Pro
Cys Pro
Gly Thr
Asp Lys
235
Asp Leu 250
Val Ile
Ala Leu
Pro Leu
Val Arg
315
Ala Thr 330
Gln Asp
Asp Asp
125
Cys Ser 140
Tyr Ser
Pro Cys
Gln Gly
Trp Gln
205
Leu Ile
220
Ile Lys
Ser Glu
Ile Pro
Leu Arg
285
Cys Leu 300
Phe Ser
Ala Leu
Cys Leu
Cys Leu 110
Gln Leu
Asp His
Leu Leu
Gly Lys
175
Arg Ile 190
Val Leu
Asn Thr
Asn Trp
His Asp
255
Ser Thr
270
Leu His
Pro Glu
Leu Val
Glu Leu
335
Gln Gln 350
Pro
Ile
Thr
Ala 160
Ile
Val
Leu
Ile
Arg 240
Gly
Tyr
Gln
Arg
Ser 320
Met
Ser
- 102 044349
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn
355 360
Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp
370375
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly
385390
Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 380
Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val 395400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr 405
Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp 420
Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg
435 440
Ala Pro Phe Pro Ser Ser Ser Ser
445
Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
450 455
Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro 460
Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
465470 <210>14 < 211>1535 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> CTP-модифицированный Фактор VII <400> 14
| ctcgaggaca | tggtctccca | ggccctcagg | ctcctctgcc | ttctgcttgg | gcttcagggc | 60 |
| tgcctggctg | cagtcttcgt | aacccaggag | gaagcccacg | gcgtcctgca | ccggcgccgg | 120 |
| cgcgccaacg | cgttcctgga | ggagctgcgg | ccgggctccc | tggagaggga | gtgcaaggag | 180 |
| gagcagtgct | ccttcgagga | ggcccgggag | atcttcaagg | acgcggagag | gacgaagctg | 240 |
| ttctggattt | cttacagtga | tggggaccag | tgtgcctcaa | gtccatgcca | gaatgggggc | 300 |
| tcctgcaagg | accagctcca | gtcctatatc | tgcttctgcc | tccctgcctt | cgagggccgg | 360 |
| aactgtgaga | cgcacaagga | tgaccagctg | atctgtgtga | acgagaacgg | cggctgtgag | 420 |
| cagtactgca | gtgaccacac | gggcaccaag | cgctcctgtc | ggtgccacga | ggggtactct | 480 |
| ctgctggcag | acggggtgtc | ctgcacaccc | acagttgaat | atccatgtgg | aaaaatacct | 540 |
| attctagaaa | aaagaaatgc | cagcaaaccc | caaggccgaa | ttgtgggggg | caaggtgtgc | 600 |
- 103 044349
| cccaaagggg | agtgtccatg | gcaggtcctg | ttgttggtga | atggagctca | gttgtgtggg | 660 |
| gggaccctga | tcaacaccat | ctgggtggtc | tccgcggccc | actgtttcga | caaaatcaag | 720 |
| aactggagga | acctgatcgc | ggtgctgggc | gagcacgacc | tcagcgagca | cgacggggat | 780 |
| gagcagagcc | ggcgggtggc | gcaggtcatc | atccccagca | cgtacgtccc | gggcaccacc | 840 |
| aaccacgaca | tcgcgctgct | ccgcctgcac | cagcccgtgg | tcctcactga | ccatgtggtg | 900 |
| cccctctgcc | tgcccgaacg | gacgttctct | gagaggacgc | tggccttcgt | gcgcttctca | 960 |
| ttggtcagcg | gctggggcca | gctgctggac | cgtggcgcca | cggccctgga | gctcatggtc | 1020 |
| ctcaacgtgc | cccggctgat | gacccaggac | tgcctgcagc | agtcacggaa | ggtgggagac | 1080 |
| tccccaaata | tcacggagta | catgttctgt | gccggctact | cggatggcag | caaggactcc | 1140 |
| tgcaaggggg | acagtggagg | cccacatgcc | acccactacc | ggggcacgtg | gtacctgacc | 1200 |
| ggcatcgtga | gctggggcca | gggctgcgcc | accgtgggcc | acttcggcgt | gtacaccagg | 1260 |
| gtgtcccagt | acatcgagtg | gctgcagaaa | ctgatgagaa | gcgagcccag | acccggcgtg | 1320 |
| ctgctgagag | cccccttccc | cagcagcagc | tccaaggccc | ctccccctag | cctgcccagc | 1380 |
| cctagcagac | tgcctgggcc | ctccgacaca | ccaatcctgc | cacagagcag | ctcctctaag | 1440 |
| gcccctcctc | catccctgcc | atccccctcc | cggctgccag | gcccctctga | cacccctatc | 1500 |
| ctgcctcagt | gatgaaggtc | tggatccgcg | gccgc | 1535 |
<210> 15 <211> 500 < 212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CTP-модифицированный Фактор VII <400> 15
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu 1 5
Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val 20
Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn
40
Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys
55
Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala 65 70
Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
80
- 104 044349
Ser
Gly
Ala
Cys
Gly 145
Asp
Pro
Gly
Leu
Trp 225
Asn
Asp
Val
Pro
Thr 305
Gly
Tyr Ser Asp
Gly Asp Gln 85
Cys Ala Ser
Ser Pro Cys
Gln Asn Gly 95
Ser Cys Lys
100
Phe Glu Gly 115
Val Asn Glu 130
Thr Lys Arg
Gly Val Ser
Ile Leu Glu
180
Gly Lys Val
195
Val Asn Gly 210
Val Val Ser
Leu Ile Ala
Glu Gln Ser
260
Pro Gly Thr
275
Val Val Leu 290
Phe Ser Glu
Trp Gly Gln
Asp Gln Leu
Arg Asn Cys
Asn Gly Gly
135
Ser Cys Arg
150
Cys Thr Pro 165
Lys Arg Asn
Cys Pro Lys
Ala Gln Leu
215
Ala Ala His
230
Val Leu Gly 245
Arg Arg Val
Thr Asn His
Thr Asp His
295
Arg Thr Leu
310
Leu Leu Asp 325
Gln Ser Tyr
105
Glu Thr His 120
Cys Glu Gln
Cys His Glu
Thr Val Glu
170
Ala Ser Lys
185
Gly Glu Cys 200
Cys Gly Gly
Cys Phe Asp
Glu His Asp
250
Ala Gln Val
265
Asp Ile Ala 280
Val Val Pro
Ala Phe Val
Arg Gly Ala
330
Ile Cys Phe
Lys Asp Asp
125
Tyr Cys Ser
140
Gly Tyr Ser 155
Tyr Pro Cys
Pro Gln Gly
Pro Trp Gln
205
Thr Leu Ile
220
Lys Ile Lys 235
Leu Ser Glu
Ile Ile Pro
Leu Leu Arg
285
Leu Cys Leu 300
Arg Phe Ser 315
Thr Ala Leu
Cys Leu Pro 110
Gln Leu Ile
Asp His Thr
Leu Leu Ala
160
Gly Lys Ile
175
Arg Ile Val 190
Val Leu Leu
Asn Thr Ile
Asn Trp Arg
240
His Asp Gly
255
Ser Thr Tyr 270
Leu His Gln
Pro Glu Arg
Leu Val Ser
320
Glu Leu Met
335
- 105 044349
Val Leu
Asn Val
340
Pro Arg
Leu Met
Arg Lys
Val Gly 355
Asp Ser
Pro Asn
360
Gly Tyr
370
Ser Asp
Gly Ser
Lys Asp 375
Pro His 385
Ala Thr
His Tyr
390
Arg Gly
Thr Gln 345
Ile Thr
Ser Cys
Thr Trp
Asp Cys
Glu Tyr
Lys Gly
380
Tyr Leu 395
Ser Trp
Gly Gln
Gly Cys 405
Ala Thr
Val Gly
410
His Phe
Arg Val
Ser Gln
420
Tyr Ile
Pro Arg
Pro Gly 435
Val Leu
Leu Gln
350
Gln Ser
Met Phe 365
Asp Ser
Thr Gly
Gly Val
Cys Ala
Gly Gly
Ile Val
400
Tyr Thr 415
Lys Ala
450
Pro Pro
Pro Ser
Ser Asp 465
Thr Pro
Ile Leu
470
Pro Ser
Leu Pro
Ser Pro
485
Glu Trp
Leu Arg 440
Leu Pro 455
Pro Gln
Ser Arg
Leu Gln 425
Ala Pro
Ser Pro
Ser Ser
Leu Pro
490
Ile Leu Pro Gln
500
Lys Leu
Phe Pro
Ser Arg
460
Ser Ser
475
Gly Pro
Met Arg
430
Ser Glu
Ser Ser 445
Ser Ser
Leu Pro
Gly Pro
Lys Ala
Pro Pro
480
Ser Asp
Thr Pro 495 <210>16 <211>1404 <212> ДНК <213> Homo <400>16 gcgatcgcca gccttttagg acaaaattct ggaaccttga ttgaaaacac agtccaatcc sapiens tgcagcgcgt atatctactc gaatcggcca gagagaatgt tgaaagaaca atgtttaaat gaacatgatc agtgctgaat aagaggtata atggaagaaa actgaatttt ggcggcagtt atggcagaat gtacagtttt attcaggtaa agtgtagttt ggaagcagta gcaaggatga caccaggcct tcttgatcat attggaagag tgaagaagca tgttgatgga cattaattcc catcaccatt gaaaacgcca tttgttcaag cgagaagttt gatcagtgtg tatgaatgtt
120
180
240
300
360
- 106 044349 ggtgtccctt atggcagatg ctgagggata gtggaagagt atgtggacta cccaatcatt tcccttggca atgaaaaatg tcgcaggtga gaattattcc ttctggaact acaaggaata gagtcttcca accgagccac gcttccatga aagtggaagg aaggcaaata caaagctcac tggatttgaa cgagcagttt tcgacttgca ttctgtttca tgtaaattct taatgacttc ggttgttttg gattgtaact acataatatt tcaccacaac ggacgaaccc cacgaacatc caaagggaga atgtcttcga aggaggtaga gaccagtttc tggaatatat ttgaacgcgg ggaaagaact tgtaaaaata gaaaaccaga caaacttcta actgaagctg actcgagttg aatggtaaag gctgcccact gaggagacag tacaatgcag ttagtgctaa ttcctcaaat tcagctttag tctacaaagt gattcatgtc ttaactggaa accaaggtat ccgc gtgaattaga gtgctgataa agtcctgtga agctcacccg aaaccatttt ttggtggaga ttgatgcatt gtgttgaaac aacatacaga ctattaataa acagctacgt ttggatctgg ttctccagta tcaccatcta aaggagatag ttattagctg cccggtatgt tgtaacatgt caaggtggtt accagcagtg tgctgagact ggataacatc agatgccaaa ctgtggaggc tggtgttaaa gcaaaagcga gtacaaccat tacacctatt ctatgtaagt ccttagagtt taacaacatg tgggggaccc gggtgaagag caactggatt aacattaaga tgctcctgta ccatttccat gtttttcctg actcaaagca ccaggtcaat tctatcgtta attacagttg aatgtgattc gacattgccc tgcattgctg ggctggggaa ccacttgttg ttctgtgctg catgttactg tgtgcaatga aaggaaaaaa
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1404 <210>17 <211>461 <212> Белок <213> Homo sapiens <400>17
Met Gln 1
Arg Val
Asn Met 5
Ile Met
Ala Glu
Ser Pro
Gly Leu
Ile Cys
Leu Leu
Gly Tyr
Leu Leu
Ser Ala 25
Glu Cys
Thr Val
Asp His
Glu Asn 35
Ala Asn
Lys Ile 40
Leu Asn
Arg Pro
Lys Arg 45
Ser Gly 50
Lys Leu
Glu Glu
Phe Val 55
Gln Gly
Asn Leu
Glu Arg
Ile Thr 15
Phe Leu
Tyr Asn
Glu Cys
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu 65 70
Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
80
- 107 044349
Thr
Cys
Asn
Glu
Cys 145
Tyr
Pro
Glu
Thr
Thr 225
Gln
Val
Val
His
Tyr 305
Leu
Glu Arg Thr
Glu Ser Asn
100
Ser Tyr Glu
115
Leu Asp Val 130
Lys Asn Ser
Arg Leu Ala
Cys Gly Arg
180
Thr Val Phe
195
Ile Leu Asp 210
Arg Val Val
Val Val Leu
Asn Glu Lys
260
Lys Ile Thr
275
Thr Glu Gln 290
Asn Ala Ala
Asp Glu Pro
Thr Glu Phe 85
Pro Cys Leu
Cys Trp Cys
Thr Cys Asn
135
Ala Asp Asn
150
Glu Asn Gln 165
Val Ser Val
Pro Asp Val
Asn Ile Thr
215
Gly Gly Glu
230
Asn Gly Lys 245
Trp Ile Val
Val Val Ala
Lys Arg Asn
295
Ile Asn Lys
310
Leu Val Leu 325
Trp Lys Gln 90
Tyr Val Asp
Gly Asp Gln 95
Asn Gly Gly
105
Pro Phe Gly 120
Ile Lys Asn
Lys Val Val
Lys Ser Cys
170
Ser Gln Thr
185
Asp Tyr Val 200
Gln Ser Thr
Asp Ala Lys
Val Asp Ala
250
Thr Ala Ala
265
Gly Glu His 280
Val Ile Arg
Tyr Asn His
Asn Ser Tyr
330
Ser Cys Lys
Phe Glu Gly
125
Gly Arg Cys
140
Cys Ser Cys 155
Glu Pro Ala
Ser Lys Leu
Asn Ser Thr
205
Gln Ser Phe
220
Pro Gly Gln 235
Phe Cys Gly
His Cys Val
Asn Ile Glu
285
Ile Ile Pro
300
Asp Ile Ala 315
Val Thr Pro
Asp Asp Ile 110
Lys Asn Cys
Glu Gln Phe
Thr Glu Gly
160
Val Pro Phe
175
Thr Arg Ala 190
Glu Ala Glu
Asn Asp Phe
Phe Pro Trp
240
Gly Ser Ile
255
Glu Thr Gly 270
Glu Thr Glu
His His Asn
Leu Leu Glu
320
Ile Cys Ile
335
- 108 044349
Ala Asp
Lys Glu
340
Tyr Thr
Asn Ile
Val Ser
Gly Trp 355
Gly Arg
Val Phe
360
Leu Gln
370
Tyr Leu
Arg Val
Pro Leu 375
Ser Thr
385
Lys Phe
Thr Ile
390
Tyr Asn
Glu Gly
Gly Arg
Asp Ser 405
Cys Gln
Thr Glu
Val Glu
420
Gly Thr
Ser Phe
Glu Glu
Cys Ala 435
Met Lys
Gly Lys
440
Arg Tyr
450
Val Asn
Trp Ile
Lys Glu 455
Phe Leu 345
His Lys
Val Asp
Asn Met
Gly Asp 410
Leu Thr 425
Tyr Gly
Lys Thr
Lys Phe
Gly Arg
Arg Ala
380
Phe Cys 395
Ser Gly
Gly Ile
Ile Tyr
Lys Leu
460
Gly Ser
350
Ser Ala
365
Thr Cys
Ala Gly
Gly Pro
Ile Ser
430
Thr Lys 445
Thr
Gly Tyr
Leu Val
Leu Arg
Phe His
400
His Val 415
Trp Gly
Val Ser <210> 18 <211> 1502 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> CTP-модифицированный Фактор IX <400> 18 gcgatcgcca tgccttttag aacaaaattc gggaaccttg tttgaaaaca gagtccaatc tggtgtccct aatggcagat actgagggat tgtggaagag tgcagcgcgt gatatctact tgaatcggcc agagagaatg ctgaaagaac catgtttaaa ttggatttga gcgagcagtt atcgacttgc tttctgtttc gaacatgatc cagtgctgaa aaagaggtat tatggaagaa aactgaattt tggcggcagt aggaaagaac ttgtaaaaat agaaaaccag acaaacttct atggcagaat tgtacagttt aattcaggta aagtgtagtt tggaagcagt tgcaaggatg tgtgaattag agtgctgata aagtcctgtg aagctcaccc caccaggcct ttcttgatca aattggaaga ttgaagaagc atgttgatgg acattaattc atgtaacatg acaaggtggt aaccagcagt gtgctgagac catcaccatc tgaaaacgcc gtttgttcaa acgagaagtt agatcagtgt ctatgaatgt taacattaag ttgctcctgt gccatttcca tgtttttcct
120
180
240
300
360
420
480
540
600
- 109 044349
| gatgtggact | atgtaaattc | tactgaagct | gaaaccattt | tggataacat | cactcaaagc | 660 |
| acccaatcat | ttaatgactt | cactcgagtt | gttggtggag | aagatgccaa | accaggtcaa | 720 |
| ttcccttggc | aggttgtttt | gaatggtaaa | gttgatgcat | tctgtggagg | ctctatcgtt | 780 |
| aatgaaaaat | ggattgtaac | tgctgcccac | tgtgttgaaa | ctggtgttaa | aattacagtt | 840 |
| gtcgcaggtg | aacataatat | tgaggagaca | gaacatacag | agcaaaagcg | aaatgtgatt | 900 |
| cgaattattc | ctcaccacaa | ctacaatgca | gctattaata | agtacaacca | tgacattgcc | 960 |
| cttctggaac | tggacgaacc | cttagtgcta | aacagctacg | ttacacctat | ttgcattgct | 1020 |
| gacaaggaat | acacgaacat | cttcctcaaa | tttggatctg | gctatgtaag | tggctgggga | 1080 |
| agagtcttcc | acaaagggag | atcagcttta | gttcttcagt | accttagagt | tccacttgtt | 1140 |
| gaccgagcca | catgtcttcg | atctacaaag | ttcaccatct | ataacaacat | gttctgtgct | 1200 |
| ggcttccatg | aaggaggtag | agattcatgt | caaggagata | gtgggggacc | ccatgttact | 1260 |
| gaagtggaag | ggaccagttt | cttaactgga | attattagct | ggggtgaaga | gtgtgcaatg | 1320 |
| aaaggcaaat | atggaatata | taccaaggta | tcccggtatg | tcaactggat | taaggaaaaa | 1380 |
| acaaagctca | ctagctccag | cagcaaggcc | cctcccccga | gcctgccctc | cccaagcagg | 1440 |
| ctgcctgggc | cctccgacac | accaatcctg | ccacagtgat | gaaggtctgg | atccgcggcc | 1500 |
gc
1502 <210> 19 <211> 489 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CTP-модифицированный Фактор IX <400>19
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met 15
Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1015
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu 20
Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile
40
Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val
55
Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu 65 70
Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
80
- 110 044349
Thr
Cys
Asn
Glu
Cys 145
Tyr
Pro
Glu
Thr
Thr 225
Gln
Val
Val
His
Tyr 305
Leu
Glu Arg
Glu Ser
Ser Tyr
115
Leu Asp 130
Lys Asn
Arg Leu
Cys Gly
Thr Val
195
Ile Leu 210
Arg Val
Val Val
Asn Glu
Lys Ile
275
Thr Glu
290
Asn Ala
Asp Glu
Thr Thr
Glu Phe
Trp Lys
Asn Pro
100
Cys Leu
Asn Gly
105
Glu Cys
Trp Cys
Pro Phe 120
Val Thr
Cys Asn
135
Ile Lys
Gln Tyr 90
Gly Ser
Gly Phe
Asn Gly
Val Asp
Cys Lys
Glu Gly
125
Arg Cys 140
Ser Ala
Ala Glu
165
Arg Val 180
Phe Pro
Asp Asn
Val Gly
Leu Asn
245
Lys Trp 260
Thr Val
Gln Lys
Ala Ile
Pro Leu
325
Asp Asn 150
Asn Gln
Ser Val
Asp Val
Ile Thr
215
Gly Glu 230
Gly Lys
Ile Val
Val Ala
Arg Asn
295
Asn Lys 310
Val Leu
Lys Val
Lys Ser
Ser Gln
185
Asp Tyr 200
Gln Ser
Asp Ala
Val Asp
Thr Ala
265
Gly Glu 280
Val Ile
Tyr Asn
Asn Ser
Gly Asp 95
Asp Asp 110
Lys Asn
Glu Gln
Val Cys
155
Cys Glu 170
Thr Ser
Val Asn
Thr Gln
Lys Pro
235
Ala Phe 250
Ala His
His Asn
Arg Ile
His Asp
315
Tyr Val 330
Ser Cys
Thr Glu
Pro Ala
Lys Leu
Ser Thr
205
Ser Phe 220
Gly Gln
Cys Gly
Cys Val
Ile Glu
285
Ile Pro 300
Ile Ala
Val Pro
175
Thr Arg 190
Glu Ala
Asn Asp
Phe Pro
Gly Ser
255
Glu Thr
270
Glu Thr
His His
Leu Leu
Gln
Ile
Cys
Phe
Gly 160
Phe
Ala
Glu
Phe
Trp 240
Ile
Gly
Glu
Asn
Glu 320
Ile
Thr Pro
Ile Cys
335
- 111 044349
Ala Asp
Lys Glu
340
Tyr Thr
Val Ser
Gly Trp 355
Gly Arg
Leu Gln
370
Tyr Leu
Arg Val
Ser Thr
385
Lys Phe
Thr Ile
390
Glu Gly
Gly Arg
Asp Ser 405
Thr Glu
Val Glu
420
Gly Thr
Glu Glu
Cys Ala 435
Met Lys
Arg Tyr
450
Val Asn
Trp Ile
Ser Lys 465
Ala Pro
Pro Pro
470
Pro Ser
Asp Thr
Pro Ile 485
Asn Ile
Val Phe
360
Pro Leu 375
Tyr Asn
Cys Gln
Ser Phe
Gly Lys
440
Lys Glu 455
Ser Leu
Leu Pro
Phe Leu 345
His Lys
Val Asp
Asn Met
Gly Asp 410
Leu Thr 425
Tyr Gly
Lys Thr
Pro Ser
Gln
Lys Phe
Gly Arg
Arg Ala
380
Phe Cys 395
Ser Gly
Gly Ile
Ile Tyr
Lys Leu
460
Pro Ser 475
Gly Ser
350
Ser Ala
365
Thr Cys
Ala Gly
Gly Pro
Ile Ser
430
Thr Lys 445
Thr Ser
Arg Leu
Gly Tyr
Leu Val
Leu Arg
Phe His
400
His Val 415
Trp Gly
Val Ser
Ser Ser
Pro Gly
480 <210> 20 <211> 1585 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> CTP-модифицированный Фактор IX < 400> 20 gcgatcgcca tgcagcgcgt gaacatgatc atggcagaat caccaggcct catcaccatc tgccttttag gatatctact cagtgctgaa tgtacagttt ttcttgatca tgaaaacgcc aacaaaattc tgaatcggcc aaagaggtat aattcaggta aattggaaga gtttgttcaa gggaaccttg agagagaatg tatggaagaa aagtgtagtt ttgaagaagc acgagaagtt tttgaaaaca ctgaaagaac aactgaattt tggaagcagt atgttgatgg agatcagtgt gagtccaatc catgtttaaa tggcggcagt tgcaaggatg acattaattc ctatgaatgt tggtgtccct ttggatttga aggaaagaac tgtgaattag atgtaacatg taacattaag
120
180
240
300
360
420
- 112 044349
| aatggcagat | gcgagcagtt | ttgtaaaaat | agtgctgata | acaaggtggt | ttgctcctgt |
| actgagggat | atcgacttgc | agaaaaccag | aagtcctgtg | aaccagcagt | gccatttcca |
| tgtggaagag | tttctgtttc | acaaacttct | aagctcaccc | gtgctgagac | tgtttttcct |
| gatgtggact | atgtaaattc | tactgaagct | gaaaccattt | tggataacat | cactcaaagc |
| acccaatcat | ttaatgactt | cactcgagtt | gttggtggag | aagatgccaa | accaggtcaa |
| ttcccttggc | aggttgtttt | gaatggtaaa | gttgatgcat | tctgtggagg | ctctatcgtt |
| aatgaaaaat | ggattgtaac | tgctgcccac | tgtgttgaaa | ctggtgttaa | aattacagtt |
| gtcgcaggtg | aacataatat | tgaggagaca | gaacatacag | agcaaaagcg | aaatgtgatt |
| cgaattattc | ctcaccacaa | ctacaatgca | gctattaata | agtacaacca | tgacattgcc |
| cttctggaac | tggacgaacc | cttagtgcta | aacagctacg | ttacacctat | ttgcattgct |
| acaaggaata | cacgaacatc | ttcctcaaat | ttggatctgg | ctatgtaagt | ggctggggaa |
| gagtcttcca | caaagggaga | tcagctttag | ttcttcagta | ccttagagtt | ccacttgttg |
| accgagccac | atgtcttcga | tctacaaagt | tcaccatcta | taacaacatg | ttctgtgctg |
| gcttccatga | aggaggtaga | gattcatgtc | aaggagatag | tgggggaccc | catgttactg |
| aagtggaagg | gaccagtttc | ttaactggaa | ttattagctg | gggtgaagag | tgtgcaatga |
| aaggcaaata | tggaatatat | accaaggtat | cccggtatgt | caactggatt | aaggaaaaaa |
| caaagctcac | tagctccagc | agcaaggccc | ctcccccgag | cctgccctcc | ccaagcaggc |
| tgcctgggcc | ctccgacaca | ccaatcctgc | cacagagcag | ctcctctaag | gcccctcctc |
| catccctgcc | atccccctcc | cggctgcctg | gcccctctga | cacccctatc | ctgcctcagt |
| gatgaaggtc | tggatccgcg | gccgc |
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1585 <210> 21 <211> 517 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CTP-модифицированный Фактор IX <400> 21
Met Gln Arg Val 1
Asn Met Ile Met 5
Ala Glu Ser Pro
Gly Leu Ile Thr 15
Ile Cys Leu Leu 20
Gly Tyr Leu Leu
Ser Ala Glu Cys 25
Thr Val Phe Leu
Asp His Glu Asn 35
Ala Asn Lys Ile 40
Leu Asn Arg Pro
Lys Arg Tyr Asn 45
- 113 044349
Ser
Met 65
Thr
Cys
Asn
Glu
Cys 145
Tyr
Pro
Glu
Thr
Thr 225
Gln
Val
Val
His
Gly Lys 50
Glu Glu
Glu Arg
Glu Ser
Leu Glu
Lys Cys
Thr Thr
Asn Pro 100
Ser Tyr
115
Leu Asp 130
Lys Asn
Arg Leu
Cys Gly
Thr Val
195
Ile Leu 210
Arg Val
Val Val
Asn Glu
Lys Ile
275
Thr Glu
290
Glu Cys
Val Thr
Ser Ala
Ala Glu
165
Arg Val 180
Phe Pro
Asp Asn
Val Gly
Leu Asn
245
Lys Trp 260
Thr Val
Gln Lys
Glu Phe
Ser Phe 70
Glu Phe
Cys Leu
Trp Cys
Cys Asn
135
Asp Asn 150
Asn Gln
Ser Val
Asp Val
Ile Thr
215
Gly Glu 230
Gly Lys
Ile Val
Val Ala
Arg Asn
295
Val Gln
Glu Glu
Trp Lys
Asn Gly 105
Pro Phe 120
Ile Lys
Lys Val
Lys Ser
Ser Gln
185
Asp Tyr 200
Gln Ser
Asp Ala
Val Asp
Thr Ala
265
Gly Glu 280
Val Ile
Gly Asn
Ala Arg
Gln Tyr 90
Gly Ser
Gly Phe
Asn Gly
Val Cys
155
Cys Glu 170
Thr Ser
Val Asn
Thr Gln
Lys Pro
235
Ala Phe 250
Ala His
His Asn
Arg Ile
Leu Glu 60
Glu Val
Val Asp
Cys Lys
Arg Glu
Phe Glu
Gly Asp 95
Asp Asp 110
Glu Gly
125
Lys Asn
Arg Cys 140
Glu Gln
Ser Cys
Thr Glu
Pro Ala
Lys Leu
Ser Thr
205
Ser Phe 220
Gly Gln
Cys Gly
Cys Val
Ile Glu
285
Ile Pro 300
Val Pro
175
Thr Arg 190
Glu Ala
Asn Asp
Phe Pro
Gly Ser
255
Glu Thr
270
Glu Thr
Cys
Asn 80
Gln
Ile
Cys
Phe
Gly 160
Phe
Ala
Glu
Phe
Trp 240
Ile
Gly
Glu
Asn
His His
- 114 044349
Tyr Asn Ala 305
Ala Ile Asn
310
Lys Tyr Asn
His Asp Ile
315
Ala Leu Leu
Leu Asp Glu
Pro Leu Val
325
Leu Asn Ser
Tyr Val Thr 330
Pro Ile Cys
335
Ala Asp Lys
Glu Tyr Thr 340
Asn Ile Phe
345
Leu Lys Phe
Gly Ser Gly
350
Val Ser Gly
355
Trp Gly Arg
Val Phe His
360
Lys Gly Arg
Ser Ala Leu 365
Leu Gln Tyr
370
Leu Arg Val
Pro Leu Val 375
Asp Arg Ala
380
Thr Cys Leu
Ser Thr Lys 385
Phe Thr Ile
390
Tyr Asn Asn
Met Phe Cys
395
Ala Gly Phe
Glu Gly Gly
Arg Asp Ser
405
Cys Gln Gly
Asp Ser Gly 410
Gly Pro His 415
Thr Glu Val
Glu Gly Thr 420
Ser Phe Leu
425
Thr Gly Ile
Ile Ser Trp
430
Glu Glu Cys
435
Ala Met Lys
Gly Lys Tyr
440
Gly Ile Tyr
Thr Lys Val 445
Arg Tyr Val
450
Asn Trp Ile
Lys Glu Lys 455
Thr Lys Leu
460
Thr Ser Ser
Ser Lys Ala 465
Pro Pro Pro
470
Ser Leu Pro
Ser Pro Ser
475
Arg Leu Pro
Pro Ser Asp
Thr Pro Ile
485
Leu Pro Gln
Ser Ser Ser 490
Ser Lys Ala
495
Pro Pro Ser
Leu Pro Ser 500
Pro Ser Arg
505
Leu Pro Gly
Pro Ser Asp
510
Glu 320
Ile
Tyr
Val
Arg
His 400
Val
Gly
Ser
Ser
Gly 480
Pro
Thr
Pro Ile Leu
515
Pro Gln <210> 22 <211> 2413 <212> ДНК <213> Homo sapiens
- 115 044349
| <400> 22 | ||||||
| tctagagtcg | accccgccat | ggagctgagg | ccctggttgc | tatgggtggt | agcagcaaca | 60 |
| ggaaccttgg | tcctgctagc | agctgatgct | cagggccaga | aggtcttcac | caacacgtgg | 120 |
| gctgtgcgca | tccctggagg | cccagcggtg | gccaacagtg | tggcacggaa | gcatgggttc | 180 |
| ctcaacctgg | gccagatctt | cggggactat | taccacttct | ggcatcgagg | agtgacgaag | 240 |
| cggtccctgt | cgcctcaccg | cccgcggcac | agccggctgc | agagggagcc | tcaagtacag | 300 |
| tggctggaac | agcaggtggc | aaagcgacgg | actaaacggg | acgtgtacca | ggagcccaca | 360 |
| gaccccaagt | ttcctcagca | gtggtacctg | tctggtgtca | ctcagcggga | cctgaatgtg | 420 |
| aaggcggcct | gggcgcaggg | ctacacaggg | cacggcattg | tggtctccat | tctggacgat | 480 |
| ggcatcgaga | agaaccaccc | ggacttggca | ggcaattatg | atcctggggc | cagttttgat | 540 |
| gtcaatgacc | aggaccctga | cccccagcct | cggtacacac | agatgaatga | caacaggcac | 600 |
| ggcacacggt | gtgcggggga | agtggctgcg | gtggccaaca | acggtgtctg | tggtgtaggt | 660 |
| gtggcctaca | acgcccgcat | tggaggggtg | cgcatgctgg | atggcgaggt | gacagatgca | 720 |
| gtggaggcac | gctcgctggg | cctgaacccc | aaccacatcc | acatctacag | tgccagctgg | 780 |
| ggccccgagg | atgacggcaa | gacagtggat | gggccagccc | gcctcgccga | ggaggccttc | 840 |
| ttccgtgggg | ttagccaggg | ccgagggggg | ctgggctcca | tctttgtctg | ggcctcgggg | 900 |
| aacgggggcc | gggaacatga | cagctgcaac | tgcgacggct | acaccaacag | tatctacacg | 960 |
| ctgtccatca | gcagcgccac | gcagtttggc | aacgtgccgt | ggtacagcga | ggcctgctcg | 1020 |
| tccacactgg | ccacgaccta | cagcagtggc | aaccagaatg | agaagcagat | cgtgacgact | 1080 |
| gacttgcggc | agaagtgcac | ggagtctcac | acgggcacct | cagcctctgc | ccccttagca | 1140 |
| gccggcatca | ttgctctcac | cctggaggcc | aataagaacc | tcacatggcg | ggacatgcaa | 1200 |
| cacctggtgg | tacagacctc | gaagccagcc | cacctcaatg | ccaacgactg | ggccaccaat | 1260 |
| ggtgtgggcc | ggaaagtgag | ccactcatat | ggctacgggc | ttttggacgc | aggcgccatg | 1320 |
| gtggccctgg | cccagaattg | gaccacagtg | gccccccagc | ggaagtgcat | catcgacatc | 1380 |
| ctcaccgagc | ccaaagacat | cgggaaacgg | ctcgaggtgc | ggaagaccgt | gaccgcgtgc | 1440 |
| ctgggcgagc | ccaaccacat | cactcggctg | gagcacgctc | aggcgcggct | caccctgtcc | 1500 |
| tataatcgcc | gtggcgacct | ggccatccac | ctggtcagcc | ccatgggcac | ccgctccacc | 1560 |
| ctgctggcag | ccaggccaca | tgactactcc | gcagatgggt | ttaatgactg | ggccttcatg | 1620 |
| acaactcatt | cctgggatga | ggatccctct | ggcgagtggg | tcctagagat | tgaaaacacc | 1680 |
| agcgaagcca | acaactatgg | gacgctgacc | aagttcaccc | tcgtactcta | tggcaccgcc | 1740 |
| cctgaggggc | tgcccgtacc | tccagaaagc | agtggctgca | agaccctcac | gtccagtcag | 1800 |
| gcctgtgtgg | tgtgcgagga | aggcttctcc | ctgcaccaga | agagctgtgt | ccagcactgc | 1860 |
- 116 044349 cctccaggct accatccggg gccctgacag tgctcccggc cccccggagg gaggtggtgg gtcctgcagc ggcctcatct tcagaagagg tgaacgcggc tcgcccccca ccagcgtctg actgcctcag aaagccagag tggaggcggg ccggcctcag tgcgctctgg cctacaaggg acgagggccg cgc agtcctcgat cgccccctgc ctgccccagc cagccgagag gcaacggctg ctgcgccttc ctttagtttt gctgccccct gggcgagagg acgcactata cacgcctcat cacgcctcct tccccgccac cgggcagggc atcgtgctgg cggggggtga gaagcctggc accgccttta gcaccgagaa gtgccacatg tggaccctgt agcagcagcc tgctgccctc tcttcgtcac aggtgtacac aggaggagtg tcaaagacca tgacgtggag ccaggggccg ggagcagact acctcggctg acacctgcct tgtcttcctg catggaccgt cccgtctgac gagcgccctc
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2413 <210>23 <211>794 <212> Белок <213> Homo sapiens <400>23
Met Glu 1
Leu Arg
Pro Trp 5
Leu Leu
Trp Val 10
Val Ala
Ala Thr
Leu Val
Leu Leu
Ala Ala
Asp Ala
Gln Gly 25
Gln Lys
Val Phe
Thr Trp
Ala Val 35
Arg Ile
Pro Gly 40
Gly Pro
Ala Val
Ala Asn 45
Ala Arg 50
Lys His
Gly Phe
Leu Asn 55
Leu Gly
Gln Ile
Phe Gly
Gly Thr 15
Thr Asn
Ser Val
Asp Tyr
Tyr His 65
Phe Trp
His Arg 70
Gly Val
Thr Lys
Arg Ser 75
Leu Ser
Pro His
Arg Pro
Arg His
Ser Arg 85
Leu Gln
Arg Glu 90
Pro Gln
Val Gln
Trp Leu 95
Glu Gln
Gln Val
100
Ala Lys
Arg Arg
Thr Lys 105
Arg Asp
Val Tyr
110
Gln Glu
Pro Thr
Asp Pro 115
Lys Phe
Pro Gln
120
Gln Trp
Tyr Leu
Ser Gly 125
Val Thr
Gln Arg
130
Asp Leu
Asn Val
Lys Ala 135
Ala Trp
Ala Gln
140
Gly Tyr
Thr Gly
- 117 044349
His Gly Ile Val Val 145
Ser Ile Leu Asp Asp 150
Gly Ile Glu Lys Asn 155
Pro Asp Leu Ala Gly
165
Asn Tyr Asp Pro Gly
170
Ala Ser Phe Asp Val
175
Asp Gln Asp Pro Asp
180
Pro Gln Pro Arg Tyr
185
Thr Gln Met Asn Asp
190
Arg His Gly Thr Arg 195
Cys Ala Gly Glu Val
200
Ala Ala Val Ala Asn
205
Gly Val Cys Gly Val 210
Gly Val Ala Tyr Asn
215
Ala Arg Ile Gly Gly
220
Arg Met Leu Asp Gly 225
Glu Val Thr Asp Ala 230
Val Glu Ala Arg Ser 235
Gly Leu Asn Pro Asn
245
His Ile His Ile Tyr
250
Ser Ala Ser Trp Gly
255
Glu Asp Asp Gly Lys
260
Thr Val Asp Gly Pro
265
Ala Arg Leu Ala Glu
270
Ala Phe Phe Arg Gly
275
Val Ser Gln Gly Arg
280
Gly Gly Leu Gly Ser
285
Phe Val Trp Ala Ser
290
Gly Asn Gly Gly Arg
295
Glu His Asp Ser Cys 300
Cys Asp Gly Tyr Thr 305
Asn Ser Ile Tyr Thr 310
Leu Ser Ile Ser Ser 315
Thr Gln Phe Gly Asn
325
Val Pro Trp Tyr Ser
330
Glu Ala Cys Ser Ser
335
Leu Ala Thr Thr Tyr
340
Ser Ser Gly Asn Gln
345
Asn Glu Lys Gln Ile
350
Thr Thr Asp Leu Arg
355
Gln Lys Cys Thr Glu 360
Ser His Thr Gly Thr
365
Ala Ser Ala Pro Leu
370
Ala Ala Gly Ile Ile
375
Ala Leu Thr Leu Glu
380
Asn Lys Asn Leu Thr 385
Trp Arg Asp Met Gln 390
His Leu Val Val Gln 395
His 160
Asn
Asn
Asn
Val
Leu 240
Pro
Glu
Ile
Asn
Ala 320
Thr
Val
Ser
Ala
Thr 400
- 118 044349
Ser
Gly
Ala
Lys
Leu 465
Ile
Arg
Ser
Asn
Gly 545
Gly
Gly
Ser
Ser
Thr 625
Cys
Lys Pro Ala
His Leu Asn 405
Ala Asn Asp
410
Trp Ala Thr
Asn Gly Val 415
Arg Lys Val
420
Met Val Ala
435
Cys Ile Ile 450
Glu Val Arg
Thr Arg Leu
Arg Gly Asp
500
Thr Leu Leu
515
Asp Trp Ala 530
Glu Trp Val
Thr Leu Thr
Leu Pro Val
580
Gln Ala Cys
595
Cys Val Gln 610
His Tyr Ser
Ala Pro Cys
Ser His Ser
Tyr Gly Tyr
425
Gly Leu Leu
Asp Ala Gly 430
Leu Ala Gln
Asp Ile Leu
455
Lys Thr Val
470
Glu His Ala 485
Leu Ala Ile
Ala Ala Arg
Phe Met Thr
535
Leu Glu Ile
550
Lys Phe Thr 565
Pro Pro Glu
Val Val Cys
His Cys Pro
615
Thr Glu Asn
630
His Ala Ser
Asn Trp Thr 440
Thr Val Ala
445
Pro Gln Arg
Thr Glu Pro
Lys Asp Ile
460
Gly Lys Arg
Thr Ala Cys
Leu Gly Glu 475
Pro Asn His
480
Gln Ala Arg
490
Leu Thr Leu
Ser Tyr Asn
495
His Leu Val
505
Pro His Asp 520
Thr His Ser
Glu Asn Thr
Leu Val Leu
570
Ser Ser Gly
585
Glu Glu Gly 600
Pro Gly Phe
Asp Val Glu
Cys Ala Thr
Ser Pro Met
Tyr Ser Ala
525
Trp Asp Glu
540
Ser Glu Ala 555
Tyr Gly Thr
Cys Lys Thr
Phe Ser Leu
605
Ala Pro Gln
620
Thr Ile Arg 635
Cys Gln Gly
Gly Thr Arg 510
Asp Gly Phe
Asp Pro Ser
Asn Asn Tyr
560
Ala Pro Glu
575
Leu Thr Ser 590
His Gln Lys
Val Leu Asp
Ala Ser Val
640
Pro Ala Leu
- 119 044349
655
Val Glu
645
650
Thr Asp
Cys Leu
660
Ser Cys
Pro Ser
Gln Thr
Cys Ser 675
Arg Gln
Ser Gln
680
Gln Gln
690
Pro Pro
Arg Leu
Pro Pro 695
Arg Ala 705
Gly Leu
Leu Pro
710
Ser His
Ser Cys
Ala Phe
Ile Val
725
Leu Val
Gln Leu
Arg Ser
740
Gly Phe
Ser Phe
Asp Arg
Gly Leu 755
Ile Ser
Tyr Lys
760
Glu Glu
770
Cys Pro
Ser Asp
Ser Glu
775
Thr Ala 785
Phe Ile
Lys Asp
790
Gln Ser
His Ala 665
Ser Ser
Glu Val
Leu Pro
Phe Val 730
Arg Gly 745
Gly Leu
Glu Asp
Ala Leu
Ser Leu
Arg Glu
Glu Ala
700
Glu Val 715
Thr Val
Val Lys
Pro Pro
Glu Gly
780
Asp Pro
670
Ser Pro 685
Gly Gln
Val Ala
Phe Leu
Val Tyr
750
Glu Ala 765
Arg Gly
Pro Gln
Arg Leu
Gly Leu
720
Val Leu 735
Thr Met
Trp Gln
Glu Arg <210> 24 <211> 1621 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> CTP-модифицированный Фактор VII <400> 24 ctcgaggaca tgcctggctg cgcgccaacg gagcagtgct ttctggattt tcctgcaagg aactgtgaga cagtactgca tggtctccca cagtcttcgt cgttcctgga ccttcgagga cttacagtga accagctcca cgcacaagga gtgaccacac ggccctcagg aacccaggag ggagctgcgg ggcccgggag tggggaccag gtcctatatc tgaccagctg gggcaccaag ctcctctgcc gaagcccacg ccgggctccc atcttcaagg tgtgcctcaa tgcttctgcc atctgtgtga cgctcctgtc ttctgcttgg gcgtcctgca tggagaggga acgcggagag gtccatgcca tccctgcctt acgagaacgg ggtgccacga gcttcagggc ccggcgccgg gtgcaaggag gacgaagctg gaatgggggc cgagggccgg cggctgtgag ggggtactct
120
180
240
300
360
420
480
- 120 044349
| ctgctggcag | acggggtgtc | ctgcacaccc | acagttgaat | atccatgtgg | aaaaatacct |
| attctagaaa | aaagaaatgc | cagcaaaccc | caaggccgaa | ttgtgggggg | caaggtgtgc |
| cccaaagggg | agtgtccatg | gcaggtcctg | ttgttggtga | atggagctca | gttgtgtggg |
| gggaccctga | tcaacaccat | ctgggtggtc | tccgcggccc | actgtttcga | caaaatcaag |
| aactggagga | acctgatcgc | ggtgctgggc | gagcacgacc | tcagcgagca | cgacggggat |
| gagcagagcc | ggcgggtggc | gcaggtcatc | atccccagca | cgtacgtccc | gggcaccacc |
| aaccacgaca | tcgcgctgct | ccgcctgcac | cagcccgtgg | tcctcactga | ccatgtggtg |
| cccctctgcc | tgcccgaacg | gacgttctct | gagaggacgc | tggccttcgt | gcgcttctca |
| ttggtcagcg | gctggggcca | gctgctggac | cgtggcgcca | cggccctgga | gctcatggtc |
| ctcaacgtgc | cccggctgat | gacccaggac | tgcctgcagc | agtcacggaa | ggtgggagac |
| tccccaaata | tcacggagta | catgttctgt | gccggctact | cggatggcag | caaggactcc |
| tgcaaggggg | acagtggagg | cccacatgcc | acccactacc | ggggcacgtg | gtacctgacc |
| ggcatcgtga | gctggggcca | gggctgcgcc | accgtgggcc | acttcggcgt | gtacaccagg |
| gtgtcccagt | acatcgagtg | gctgcagaaa | ctgatgagaa | gcgagcccag | acccggcgtg |
| ctgctgagag | cccccttccc | cagcagcagc | tccaaggccc | ctccccctag | cctgcccagc |
| cctagcagac | tgcctgggcc | cagtgacacc | cctatcctgc | ctcagtccag | ctccagcaag |
| gccccacccc | ctagcctgcc | ttctccttct | cggctgcctg | gccccagcga | tactccaatt |
| ctgccccagt | cctccagcag | taaggctccc | cctccatctc | tgccatcccc | cagcagactg |
| ccaggccctt | ctgatacacc | catcctccca | cagtgatgag | gatccgcggc | cgcttaatta |
a
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1621 <210> 25 <211> 528 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CTP-модифицированный Фактор VII <400> 25
Met Val Ser Gln 1
Ala Leu Arg Leu 5
Leu Cys Leu Leu 10
Leu Gly Leu Gln 15
Gly Cys Leu Ala 20
Ala Val Phe Val
Thr Gln Glu Glu 25
Ala His Gly Val 30
Leu His Arg Arg 35
Arg Arg Ala Asn
Ala Phe Leu Glu
Glu Leu Arg Pro 45
- 121 044349
Gly
Ala 65
Ser
Gly
Ala
Cys
Gly 145
Asp
Pro
Gly
Leu
Trp 225
Asn
Asp
Val
Pro
Ser Leu Glu 50
Arg Glu Ile
Tyr Ser Asp
Ser Cys Lys
100
Phe Glu Gly 115
Val Asn Glu 130
Thr Lys Arg
Gly Val Ser
Ile Leu Glu
180
Gly Lys Val
195
Val Asn Gly 210
Val Val Ser
Leu Ile Ala
Glu Gln Ser
260
Pro Gly Thr
275
Val Val Leu 290
Arg Glu Cys 55
Phe Lys Asp 70
Gly Asp Gln 85
Asp Gln Leu
Arg Asn Cys
Asn Gly Gly
135
Ser Cys Arg
150
Cys Thr Pro 165
Lys Arg Asn
Cys Pro Lys
Ala Gln Leu
215
Ala Ala His
230
Val Leu Gly 245
Arg Arg Val
Thr Asn His
Thr Asp His
295
Lys Glu Glu
Ala Glu Arg
Cys Ala Ser
Gln Ser Tyr 105
Glu Thr His 120
Cys Glu Gln
Cys His Glu
Thr Val Glu
170
Ala Ser Lys
185
Gly Glu Cys 200
Cys Gly Gly
Cys Phe Asp
Glu His Asp
250
Ala Gln Val
265
Asp Ile Ala 280
Val Val Pro
Gln Cys Ser 60
Thr Lys Leu 75
Ser Pro Cys
Ile Cys Phe
Lys Asp Asp
125
Tyr Cys Ser
140
Gly Tyr Ser 155
Tyr Pro Cys
Pro Gln Gly
Pro Trp Gln
205
Thr Leu Ile
220
Lys Ile Lys 235
Leu Ser Glu
Ile Ile Pro
Leu Leu Arg
285
Leu Cys Leu 300
Phe Glu Glu
Phe Trp Ile 80
Gln Asn Gly 95
Cys Leu Pro 110
Gln Leu Ile
Asp His Thr
Leu Leu Ala
160
Gly Lys Ile
175
Arg Ile Val 190
Val Leu Leu
Asn Thr Ile
Asn Trp Arg
240
His Asp Gly
255
Ser Thr Tyr 270
Leu His Gln
Pro Glu Arg
- 122 044349
Thr Phe Ser Glu Arg 305
Thr Leu Ala Phe Val 310
Arg Phe Ser Leu Val 315
Gly Trp Gly Gln Leu
325
Leu Asp Arg Gly Ala
330
Thr Ala Leu Glu Leu
335
Val Leu Asn Val Pro
340
Arg Leu Met Thr Gln
345
Asp Cys Leu Gln Gln
350
Arg Lys Val Gly Asp
355
Ser Pro Asn Ile Thr
360
Glu Tyr Met Phe Cys
365
Gly Tyr Ser Asp Gly
370
Ser Lys Asp Ser Cys
375
Lys Gly Asp Ser Gly
380
Pro His Ala Thr His 385
Tyr Arg Gly Thr Trp 390
Tyr Leu Thr Gly Ile 395
Ser Trp Gly Gln Gly
405
Cys Ala Thr Val Gly
410
His Phe Gly Val Tyr
415
Arg Val Ser Gln Tyr
420
Ile Glu Trp Leu Gln
425
Lys Leu Met Arg Ser
430
Pro Arg Pro Gly Val
435
Leu Leu Arg Ala Pro
440
Phe Pro Ser Ser Ser
445
Lys Ala Pro Pro Pro
450
Ser Leu Pro Ser Pro
455
Ser Arg Leu Pro Gly
460
Ser Asp Thr Pro Ile 465
Leu Pro Gln Ser Ser 470
Ser Ser Lys Ala Pro 475
Pro Ser Leu Pro Ser
485
Pro Ser Arg Leu Pro
490
Gly Pro Ser Asp Thr
495
Ile Leu Pro Gln Ser
500
Ser Ser Ser Lys Ala
505
Pro Pro Pro Ser Leu
510
Ser Pro Ser Arg Leu
515
Pro Gly Pro Ser Asp
520
Thr Pro Ile Leu Pro
525
Ser 320
Met
Ser
Ala
Gly
Val 400
Thr
Glu
Ser
Pro
Pro 480
Pro
Pro
Gln <210> 26 <211> 1607 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 123 044349 <220>
<223> CTP-модифицированный Фактор VII <400>26 ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc60 tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg120 cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc tggagaggga gtgcaaggag180 gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg240 ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc300 tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg360 aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag420 cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct480 ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct540 attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc600 cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg660 gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag720 aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat780 gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc840 aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg900 cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc tggccttcgt gcgcttctca960 ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc1020 ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac1080 tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc1140 tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacc1200 ggcatcgtga gctggggcca gggctgcgcc accgtgggcc acttcggcgt gtacaccagg1260 gtgtcccagt acatcgagtg gctgcagaaa ctgatgagaa gcgagcccag acccggcgtg1320 ctgctgagag cccccttccc cagcagcagc tccaaggccc ctccccctag cctgcccagc1380 cctagcagac tgcctgggcc cagtgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctccagcaag1440 gccccacccc ctagcctgcc ttctccttct cggctgcctg gccccagcga tactccaatt1500 ctgccccagt cctccagcag taaggctccc cctccatctc tgccatcccc cagcagactg1560 ccaggccctt ctgatacacc catcctccca cagtgatgag gatccgc1607 <210>27 <211>532 <212> Белок <213> Искусственная последовательность
- 124 044349 <220>
<223> CTP-модифицированный Фактор VII <400> 27
Leu Glu Asp Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu 1 5 10 15
Gly Leu Gln Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu
25 30
His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu 35 40 45
Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys 50 55 60
Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys 65 70 75
Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro 85 90 95
Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys
100 105 110
Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp
115 120 125
Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys
130 135 140
Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr
145 150 155
Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro
165 170 175
Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln
180 185 190
Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp
195 200 205
Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu
210 215 220
Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile
Leu
Ala
Glu
Ser
Leu 80
Cys
Phe
Asp
Ser
Ser 160
Cys
Gly
Gln
Ile
Lys
- 125 044349
230
235
240
225
Asn
His
Ser
Leu
Pro 305
Leu
Glu
Gln
Phe
Ser 385
Gly
Val
Arg
Ser
Pro 465
Trp Arg Asn
Leu Ile Ala 245
Val Leu Gly
250
Glu His Asp
Leu Ser Glu
255
Asp Gly Asp
260
Thr Tyr Val
275
His Gln Pro 290
Glu Arg Thr
Val Ser Gly
Leu Met Val
340
Gln Ser Arg
355
Cys Ala Gly 370
Gly Gly Pro
Ile Val Ser
Tyr Thr Arg
420
Ser Glu Pro
435
Ser Ser Lys 450
Gly Pro Ser
Glu Gln Ser
Pro Gly Thr
Val Val Leu
295
Phe Ser Glu
310
Trp Gly Gln 325
Leu Asn Val
Lys Val Gly
Tyr Ser Asp
375
His Ala Thr
390
Trp Gly Gln 405
Val Ser Gln
Arg Pro Gly
Ala Pro Pro
455
Asp Thr Pro
470
Arg Arg Val
265
Ala Gln Val
Ile Ile Pro 270
Thr Asn His 280
Thr Asp His
Arg Thr Leu
Leu Leu Asp
330
Pro Arg Leu
345
Asp Ser Pro 360
Gly Ser Lys
His Tyr Arg
Gly Cys Ala
410
Tyr Ile Glu
425
Val Leu Leu 440
Pro Ser Leu
Ile Leu Pro
Asp Ile Ala
285
Val Val Pro
300
Ala Phe Val 315
Arg Gly Ala
Met Thr Gln
Asn Ile Thr
365
Asp Ser Cys 380
Gly Thr Trp 395
Thr Val Gly
Trp Leu Gln
Arg Ala Pro
445
Pro Ser Pro
460
Gln Ser Ser 475
Leu Leu Arg
Leu Cys Leu
Arg Phe Ser
320
Thr Ala Leu
335
Asp Cys Leu 350
Glu Tyr Met
Lys Gly Asp
Tyr Leu Thr
400
His Phe Gly 415
Lys Leu Met 430
Phe Pro Ser
Ser Arg Leu
Ser Ser Lys
480
- 126 044349
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro
485
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser
500505
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro
515520
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
490 495
Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro 510
Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile 525
Leu Pro Gln Gly
530 <210>28 <211>1775 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> CTP-модифицированный Фактор VII
| <400> 28 ctcgaggaca | tggtctccca | ggccctcagg | ctcctctgcc | ttctgcttgg | gcttcagggc | 60 |
| tgcctggctg | cagtcttcgt | aacccaggag | gaagcccacg | gcgtcctgca | ccggcgccgg | 120 |
| cgcgccaacg | cgttcctgga | ggagctgcgg | ccgggctccc | tggagaggga | gtgcaaggag | 180 |
| gagcagtgct | ccttcgagga | ggcccgggag | atcttcaagg | acgcggagag | gacgaagctg | 240 |
| ttctggattt | cttacagtga | tggggaccag | tgtgcctcaa | gtccatgcca | gaatgggggc | 300 |
| tcctgcaagg | accagctcca | gtcctatatc | tgcttctgcc | tccctgcctt | cgagggccgg | 360 |
| aactgtgaga | cgcacaagga | tgaccagctg | atctgtgtga | acgagaacgg | cggctgtgag | 420 |
| cagtactgca | gtgaccacac | gggcaccaag | cgctcctgtc | ggtgccacga | ggggtactct | 480 |
| ctgctggcag | acggggtgtc | ctgcacaccc | acagttgaat | atccatgtgg | aaaaatacct | 540 |
| attctagaaa | aaagaaatgc | cagcaaaccc | caaggccgaa | ttgtgggggg | caaggtgtgc | 600 |
| cccaaagggg | agtgtccatg | gcaggtcctg | ttgttggtga | atggagctca | gttgtgtggg | 660 |
| gggaccctga | tcaacaccat | ctgggtggtc | tccgcggccc | actgtttcga | caaaatcaag | 720 |
| aactggagga | acctgatcgc | ggtgctgggc | gagcacgacc | tcagcgagca | cgacggggat | 780 |
| gagcagagcc | ggcgggtggc | gcaggtcatc | atccccagca | cgtacgtccc | gggcaccacc | 840 |
| aaccacgaca | tcgcgctgct | ccgcctgcac | cagcccgtgg | tcctcactga | ccatgtggtg | 900 |
| cccctctgcc | tgcccgaacg | gacgttctct | gagaggacgc | tggccttcgt | gcgcttctca | 960 |
| ttggtcagcg | gctggggcca | gctgctggac | cgtggcgcca | cggccctgga | gctcatggtc | 1020 |
| ctcaacgtgc | cccggctgat | gacccaggac | tgcctgcagc | agtcacggaa | ggtgggagac | 1080 |
| tccccaaata | tcacggagta | catgttctgt | gccggctact | cggatggcag | caaggactcc | 1140 |
- 127 044349
| tgcaaggggg | acagtggagg | cccacatgcc | acccactacc | ggggcacgtg | gtacctgacc | 1200 |
| ggcatcgtga | gctggggcca | gggctgcgcc | accgtgggcc | acttcggcgt | gtacaccagg | 1260 |
| gtgtcccagt | acatcgagtg | gctgcagaaa | ctgatgagaa | gcgagcccag | acccggcgtg | 1320 |
| ctgctgagag | cccccttccc | cagcagcagc | tccaaggccc | ctccccctag | cctgcccagc | 1380 |
| cctagcagac | tgcctgggcc | ctctgacacc | cctatcctgc | ctcagtccag | ctcctctaag | 1440 |
| gctccaccac | cttccctgcc | tagcccttca | agactgccag | gccctagcga | tacaccaatt | 1500 |
| ctgccccagt | cctccagcag | caaggctccc | ccacctagcc | tgccttctcc | atcaaggctg | 1560 |
| cctggcccat | ccgatacccc | aattttgcct | cagagcagct | ctagcaaggc | acctcccccc | 1620 |
| agtctgccct | ctccaagcag | actccctggc | ccttcagaca | ctccaatcct | cccacagtcc | 1680 |
| tctagctcta | aagctccacc | tcccagcctg | cccagcccta | gtagactccc | cggaccttct | 1740 |
| gataccccca | tcttgcccca | gtgatgagga | tccgc | 1775 |
<210> 29 <211> 589 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> CTP-модифицированный Фактор VII <400>29
Leu Glu Asp Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu
5 1015
Gly Leu Gln Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala 20 2530
His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu 35 4045
Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser 50 5560
Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu 65 70 7580
Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys 85 9095
Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe
100 105110
Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp
115 120125
- 128 044349
Gln
Asp 145
Leu
Gly
Arg
Val
Asn 225
Asn
His
Ser
Leu
Pro 305
Leu
Glu
Gln
Phe
Leu Ile Cys 130
His Thr Gly
Leu Ala Asp
Lys Ile Pro
180
Ile Val Gly
195
Leu Leu Leu 210
Thr Ile Trp
Trp Arg Asn
Asp Gly Asp
260
Thr Tyr Val
275
His Gln Pro 290
Glu Arg Thr
Val Ser Gly
Leu Met Val
340
Gln Ser Arg
355
Cys Ala Gly
Val Asn Glu
135
Asn Gly Gly
Cys Glu Gln
140
Tyr Cys Ser
Thr Lys Arg
150
Gly Val Ser 165
Ile Leu Glu
Gly Lys Val
Val Asn Gly
215
Val Val Ser
230
Leu Ile Ala 245
Glu Gln Ser
Pro Gly Thr
Val Val Leu
295
Phe Ser Glu
310
Trp Gly Gln 325
Leu Asn Val
Lys Val Gly
Tyr Ser Asp
Ser Cys Arg
Cys Thr Pro
170
Lys Arg Asn
185
Cys Pro Lys 200
Ala Gln Leu
Ala Ala His
Val Leu Gly
250
Arg Arg Val
265
Thr Asn His 280
Thr Asp His
Arg Thr Leu
Leu Leu Asp
330
Pro Arg Leu
345
Asp Ser Pro 360
Gly Ser Lys
Cys His Glu 155
Gly Tyr Ser
160
Thr Val Glu
Tyr Pro Cys
175
Ala Ser Lys
Pro Gln Gly 190
Gly Glu Cys
205
Cys Gly Gly
220
Cys Phe Asp 235
Glu His Asp
Ala Gln Val
Asp Ile Ala
285
Val Val Pro
300
Ala Phe Val 315
Arg Gly Ala
Met Thr Gln
Asn Ile Thr
365
Asp Ser Cys
Pro Trp Gln
Thr Leu Ile
Lys Ile Lys
240
Leu Ser Glu
255
Ile Ile Pro 270
Leu Leu Arg
Leu Cys Leu
Arg Phe Ser
320
Thr Ala Leu
335
Asp Cys Leu 350
Glu Tyr Met
Lys Gly Asp
- 129 044349
370
375
380
Ser Gly Gly Pro His 385
Ala Thr His Tyr Arg 390
Gly Thr Trp Tyr Leu 395
Gly Ile Val Ser Trp
405
Gly Gln Gly Cys Ala
410
Thr Val Gly His Phe
415
Val Tyr Thr Arg Val
420
Ser Gln Tyr Ile Glu
425
Trp Leu Gln Lys Leu
430
Arg Ser Glu Pro Arg 435
Pro Gly Val Leu Leu
440
Arg Ala Pro Phe Pro 445
Ser Ser Ser Lys Ala
450
Pro Pro Pro Ser Leu
455
Pro Ser Pro Ser Arg
460
Pro Gly Pro Ser Asp 465
Thr Pro Ile Leu Pro 470
Gln Ser Ser Ser Ser 475
Ala Pro Pro Pro Ser
485
Leu Pro Ser Pro Ser
490
Arg Leu Pro Gly Pro
495
Asp Thr Pro Ile Leu
500
Pro Gln Ser Ser Ser
505
Ser Lys Ala Pro Pro
510
Ser Leu Pro Ser Pro
515
Ser Arg Leu Pro Gly 520
Pro Ser Asp Thr Pro
525
Leu Pro Gln Ser Ser
530
Ser Ser Lys Ala Pro
535
Pro Pro Ser Leu Pro
540
Pro Ser Arg Leu Pro 545
Gly Pro Ser Asp Thr 550
Pro Ile Leu Pro Gln 555
Ser Ser Ser Lys Ala
565
Pro Pro Pro Ser Leu
570
Pro Ser Pro Ser Arg
575
Thr
400
Gly
Met
Ser
Leu
Lys 480
Ser
Pro
Ile
Ser
Ser 560
Leu
Pro Gly Pro Ser Asp
580
Thr Pro Ile Leu Pro
585
Gln Gly Ser <210> 30 <211> 1673 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> CTP-модифицированный Фактор IX
- 130 044349 <400> 30 tctagagtcg accccgccat gcagcgcgtg aacatgatca tggcagaatc accaggcctc 60 atcaccatct gccttttagg atatctactc agtgctgaat gtacagtttt tcttgatcat120 gaaaacgcca acaaaattct gaatcggcca aagaggtata attcaggtaa attggaagag180 tttgttcaag ggaaccttga gagagaatgt atggaagaaa agtgtagttt tgaagaagca240 cgagaagttt ttgaaaacac tgaaagaaca actgaatttt ggaagcagta tgttgatgga300 gatcagtgtg agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt gcaaggatga cattaattcc360 tatgaatgtt ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact gtgaattaga tgtaacatgt420 aacattaaga atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata gtgctgataa caaggtggtt480 tgctcctgta ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga agtcctgtga accagcagtg540 ccatttccat gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta agctcacccg tgctgaggca600 gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct actgaagctg aaaccatttt ggataacatc660 actcaaagca cccaatcatt taatgacttc actcgagttg ttggtggaga agatgccaaa720 ccaggtcaat tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt ctgtggaggc780 tctatcgtta atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac tggtgttaaa840 attacagttg tcgcaggtga acataatatt gaggagacag aacatacaga gcaaaagcga900 aatgtgattc gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag ctattaataa gtacaaccat960 gacattgccc ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt tacacctatt1020 tgcattgctg acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt1080 ggctggggaa gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttcttcagta ccttagagtt1140 ccacttgttg accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta taacaacatg1200 ttctgtgctg gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc1260 catgttactg aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaagag1320 tgtgcaatga aaggcaaata tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactggatt1380 aaggaaaaaa caaagctcac tagctccagc agcaaggccc ctcccccgag cctgccctcc1440 ccaagcaggc tgcctgggcc cagtgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctccagcaag1500 gccccacccc ctagcctgcc ttctccttct cggctgcctg gccccagcga tactccaatt1560 ctgccccagt cctccagcag taaggctccc cctccatctc tgccatcccc cagcagactg1620 ccaggccctt ctgatacacc catcctccca cagtgatgag gatccgcggc cgc1673 <210>31 <211>545 <212> Белок <213> Искусственная последовательность
- 131 044349 <220>
<223> CTP-модифицированный Фактор IX <400> 31
Met Gln Arg Val Asn 1 5
Met Ile Met Ala Glu
Ser Pro Gly Leu Ile
Ile Cys Leu Leu Gly 20
Tyr Leu Leu Ser Ala
Glu Cys Thr Val Phe
Asp His Glu Asn Ala 35
Asn Lys Ile Leu Asn 40
Arg Pro Lys Arg Tyr 45
Ser Gly Lys Leu Glu 50
Glu Phe Val Gln Gly 55
Asn Leu Glu Arg Glu 60
Met Glu Glu Lys Cys 65
Ser Phe Glu Glu Ala 70
Arg Glu Val Phe Glu 75
Thr Glu Arg Thr Thr
Glu Phe Trp Lys Gln 90
Tyr Val Asp Gly Asp 95
Cys Glu Ser Asn Pro
100
Cys Leu Asn Gly Gly
105
Ser Cys Lys Asp Asp
110
Asn Ser Tyr Glu Cys 115
Trp Cys Pro Phe Gly 120
Phe Glu Gly Lys Asn 125
Glu Leu Asp Val Thr 130
Cys Asn Ile Lys Asn
135
Gly Arg Cys Glu Gln 140
Cys Lys Asn Ser Ala 145
Asp Asn Lys Val Val 150
Cys Ser Cys Thr Glu 155
Tyr Arg Leu Ala Glu
165
Asn Gln Lys Ser Cys
170
Glu Pro Ala Val Pro
175
Pro Cys Gly Arg Val
180
Ser Val Ser Gln Thr
185
Ser Lys Leu Thr Arg
190
Glu Ala Val Phe Pro
195
Asp Val Asp Tyr Val 200
Asn Ser Thr Glu Ala
205
Thr Ile Leu Asp Asn
210
Ile Thr Gln Ser Thr
215
Gln Ser Phe Asn Asp
220
Thr Arg Val Val Gly 225
Gly Glu Asp Ala Lys 230
Pro Gly Gln Phe Pro 235
Thr
Leu
Asn
Cys
Asn 80
Gln
Ile
Cys
Phe
Gly 160
Phe
Ala
Glu
Phe
Trp 240
- 132 044349
Gln
Val
Val
His
Tyr 305
Leu
Ala
Val
Leu
Ser 385
Glu
Thr
Glu
Arg
Ser 465
Pro
Val Val Leu
Asn Glu Lys
260
Lys Ile Thr
275
Thr Glu Gln 290
Asn Ala Ala
Asp Glu Pro
Asp Lys Glu
340
Ser Gly Trp
355
Gln Tyr Leu 370
Thr Lys Phe
Gly Gly Arg
Glu Val Glu
420
Glu Cys Ala
435
Tyr Val Asn 450
Lys Ala Pro
Ser Asp Thr
Asn Gly Lys 245
Trp Ile Val
Val Val Ala
Lys Arg Asn
295
Ile Asn Lys
310
Leu Val Leu 325
Tyr Thr Asn
Gly Arg Val
Arg Val Pro
375
Thr Ile Tyr
390
Asp Ser Cys 405
Gly Thr Ser
Met Lys Gly
Trp Ile Lys
455
Pro Pro Ser
470
Pro Ile Leu
Val Asp Ala
250
Phe Cys Gly
Gly Ser Ile
255
Thr Ala Ala
265
Gly Glu His 280
Val Ile Arg
Tyr Asn His
Asn Ser Tyr
330
Ile Phe Leu
345
Phe His Lys 360
Leu Val Asp
Asn Asn Met
Gln Gly Asp
410
Phe Leu Thr
425
Lys Tyr Gly 440
Glu Lys Thr
Leu Pro Ser
Pro Gln Ser
His Cys Val
Glu Thr Gly 270
Asn Ile Glu
285
Glu Thr Glu
Ile Ile Pro
300
His His Asn
Asp Ile Ala 315
Val Thr Pro
Lys Phe Gly
Gly Arg Ser
365
Arg Ala Thr
380
Phe Cys Ala 395
Ser Gly Gly
Gly Ile Ile
Ile Tyr Thr
445
Lys Leu Thr
460
Pro Ser Arg 475
Ser Ser Ser
Leu Leu Glu
320
Ile Cys Ile
335
Ser Gly Tyr 350
Ala Leu Val
Cys Leu Arg
Gly Phe His
400
Pro His Val
415
Ser Trp Gly 430
Lys Val Ser
Ser Ser Ser
Leu Pro Gly
480
Lys Ala Pro
- 133 044349
Asp Thr
485 490 495
Pro Pro
Ser Leu
500
Pro Ser
Pro Ser
Pro Ile
Leu Pro 515
Gln Ser
Ser Ser
520
Pro
Ser Pro Ser 530
Arg Leu
Pro Gly 535
Arg Leu 505
Ser Lys
Pro Ser
Pro Gly
Ala Pro
Asp Thr
540
Pro Ser
510
Pro Pro 525
Pro Ile
Ser Leu
Leu Pro
Gln
545 <210> 32 <211> 1757 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> CTP-модифицированный Фактор IX
| <400> 32 tctagagtcg | accccgccat | gcagcgcgtg | aacatgatca | tggcagaatc | accaggcctc | 60 |
| atcaccatct | gccttttagg | atatctactc | agtgctgaat | gtacagtttt | tcttgatcat | 120 |
| gaaaacgcca | acaaaattct | gaatcggcca | aagaggtata | attcaggtaa | attggaagag | 180 |
| tttgttcaag | ggaaccttga | gagagaatgt | atggaagaaa | agtgtagttt | tgaagaagca | 240 |
| cgagaagttt | ttgaaaacac | tgaaagaaca | actgaatttt | ggaagcagta | tgttgatgga | 300 |
| gatcagtgtg | agtccaatcc | atgtttaaat | ggcggcagtt | gcaaggatga | cattaattcc | 360 |
| tatgaatgtt | ggtgtccctt | tggatttgaa | ggaaagaact | gtgaattaga | tgtaacatgt | 420 |
| aacattaaga | atggcagatg | cgagcagttt | tgtaaaaata | gtgctgataa | caaggtggtt | 480 |
| tgctcctgta | ctgagggata | tcgacttgca | gaaaaccaga | agtcctgtga | accagcagtg | 540 |
| ccatttccat | gtggaagagt | ttctgtttca | caaacttcta | agctcacccg | tgctgaggca | 600 |
| gtttttcctg | atgtggacta | tgtaaattct | actgaagctg | aaaccatttt | ggataacatc | 660 |
| actcaaagca | cccaatcatt | taatgacttc | actcgagttg | ttggtggaga | agatgccaaa | 720 |
| ccaggtcaat | tcccttggca | ggttgttttg | aatggtaaag | ttgatgcatt | ctgtggaggc | 780 |
| tctatcgtta | atgaaaaatg | gattgtaact | gctgcccact | gtgttgaaac | tggtgttaaa | 840 |
| attacagttg | tcgcaggtga | acataatatt | gaggagacag | aacatacaga | gcaaaagcga | 900 |
| aatgtgattc | gaattattcc | tcaccacaac | tacaatgcag | ctattaataa | gtacaaccat | 960 |
| gacattgccc | ttctggaact | ggacgaaccc | ttagtgctaa | acagctacgt | tacacctatt | 1020 |
| tgcattgctg | acaaggaata | cacgaacatc | ttcctcaaat | ttggatctgg | ctatgtaagt | 1080 |
- 134 044349
| ggctggggaa | gagtcttcca | caaagggaga | tcagctttag | ttcttcagta | ccttagagtt | 1140 |
| ccacttgttg | accgagccac | atgtcttcga | tctacaaagt | tcaccatcta | taacaacatg | 1200 |
| ttctgtgctg | gcttccatga | aggaggtaga | gattcatgtc | aaggagatag | tgggggaccc | 1260 |
| catgttactg | aagtggaagg | gaccagtttc | ttaactggaa | ttattagctg | gggtgaagag | 1320 |
| tgtgcaatga | aaggcaaata | tggaatatat | accaaggtat | cccggtatgt | caactggatt | 1380 |
| aaggaaaaaa | caaagctcac | tagctccagc | agcaaggccc | ctcccccgag | cctgccctcc | 1440 |
| ccaagcaggc | tgcctgggcc | ctctgacacc | cctatcctgc | ctcagtccag | ctcctctaag | 1500 |
| gccccaccac | cttccctgcc | tagcccttca | agactgccag | gccctagcga | tacaccaatt | 1560 |
| ctgccccagt | cctccagcag | caaggctccc | ccacctagcc | tgccttctcc | atcaaggctg | 1620 |
| cctggcccat | ccgatacccc | aattttgcct | cagagcagct | ctagcaaggc | acctcccccc | 1680 |
| agtctgccct | ctccaagcag | actccctggc | ccttcagaca | ctcccattct | gccacagtga | 1740 |
| tgaggatccg | cggccgc | 1757 |
<210> 33 <211> 583 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> CTP-модифицированный Фактор IX <400>33
Ser Arg Val Asp Pro Ala Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu
5 1015
Ser Pro Gly Leu Ile Thr Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala 20 2530
Glu Cys Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn 35 4045
Arg Pro Lys Arg Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly 50 5560
Asn Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala 65 70 7580
Arg Glu Val Phe Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln 85 9095
Tyr Val Asp Gly Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly
100 105110
- 135 044349
Ser
Phe
Gly 145
Cys
Glu
Ser
Asn
Gln 225
Pro
Phe
His
Asn
Ile 305
Asp
Val
Lys
Cys Lys
115
Glu Gly 130
Arg Cys
Ser Cys
Pro Ala
Lys Leu
195
Ser Thr
210
Ser Phe
Gly Gln
Cys Gly
Cys Val
275
Ile Glu
290
Ile Pro
Ile Ala
Thr Pro
Phe Gly
355
Asp Asp
Lys Asn
Glu Gln
Thr Glu
165
Val Pro 180
Thr Arg
Glu Ala
Asn Asp
Phe Pro
245
Gly Ser 260
Glu Thr
Glu Thr
His His
Leu Leu
325
Ile Cys 340
Ser Gly
Ile Asn
Cys Glu
135
Phe Cys 150
Gly Tyr
Phe Pro
Ala Glu
Glu Thr
215
Phe Thr 230
Trp Gln
Ile Val
Gly Val
Glu His
295
Asn Tyr 310
Glu Leu
Ile Ala
Tyr Val
Ser Tyr 120
Leu Asp
Lys Asn
Arg Leu
Cys Gly 185
Ala Val 200
Ile Leu
Arg Val
Val Val
Asn Glu
265
Lys Ile 280
Thr Glu
Asn Ala
Asp Glu
Asp Lys
345
Ser Gly 360
Glu Cys
Val Thr
Ser Ala
155
Ala Glu 170
Arg Val
Phe Pro
Asp Asn
Val Gly
235
Leu Asn
250
Lys Trp
Thr Val
Gln Lys
Ala Ile
315
Pro Leu 330
Glu Tyr
Trp Gly
Trp Cys
125
Cys Asn 140
Asp Asn
Asn Gln
Ser Val
Asp Val
205
Ile Thr
220
Gly Glu
Gly Lys
Ile Val
Val Ala
285
Arg Asn 300
Asn Lys
Val Leu
Thr Asn
Arg Val
365
Pro Phe
Ile Lys
Lys Val
Lys Ser
175
Ser Gln 190
Asp Tyr
Gln Ser
Asp Ala
Val Asp
255
Thr Ala
270
Gly Glu
Val Ile
Tyr Asn
Asn Ser
335
Ile Phe
350
Phe His
Gly
Asn
Val 160
Cys
Thr
Val
Thr
Lys 240
Ala
Ala
His
Arg
His 320
Tyr
Leu
Lys
- 136 044349
Gly Arg Ser
370
Ala Leu Val
Arg Ala Thr 385
Cys Leu Arg
390
Phe Cys Ala
Gly Phe His
405
Ser Gly Gly
Pro His Val 420
Gly Ile Ile
435
Ser Trp Gly
Ile Tyr Thr
450
Lys Val Ser
Lys Leu Thr 465
Ser Ser Ser
470
Pro Ser Arg
Leu Pro Gly
485
Ser Ser Ser
Lys Ala Pro 500
Pro Gly Pro
515
Ser Asp Thr
Ala Pro Pro
530
Pro Ser Leu
Asp Thr Pro 545
Ile Leu Pro
550
Ser Leu Pro
Ser Pro Ser
565
Leu Pro Gln
Gly Ser Ala 580
Leu Gln Tyr 375
Ser Thr Lys
Glu Gly Gly
Thr Glu Val
425
Glu Glu Cys 440
Arg Tyr Val 455
Ser Lys Ala
Pro Ser Asp
Pro Pro Ser
505
Pro Ile Leu 520
Pro Ser Pro 535
Gln Ser Ser
Arg Leu Pro
Ala
Leu Arg Val
380
Phe Thr Ile
395
Arg Asp Ser 410
Glu Gly Thr
Ala Met Lys
Asn Trp Ile
460
Pro Pro Pro
475
Thr Pro Ile 490
Leu Pro Ser
Pro Gln Ser
Ser Arg Leu
540
Ser Ser Lys
555
Gly Pro Ser 570 <210> 34 <211> 1840 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
Pro Leu Val
Tyr Asn Asn
Cys Gln Gly
415
Ser Phe Leu
430
Gly Lys Tyr 445
Lys Glu Lys
Ser Leu Pro
Leu Pro Gln
495
Pro Ser Arg
510
Ser Ser Ser 525
Pro Gly Pro
Ala Pro Pro
Asp Thr Pro
575
Asp
Met 400
Asp
Thr
Gly
Thr
Ser 480
Ser
Leu
Lys
Ser
Pro 560
Ile
- 137 044349 <220>
<223> CTP-модифицированный Фактор IX <400>34 ctagagtcga ccccgccatg cagcgcgtga acatgatcat ggcagaatca ccaggcctca60 tcaccatctg ccttttagga tatctactca gtgctgaatg tacagttttt cttgatcatg120 aaaacgccaa caaaattctg aatcggccaa agaggtataa ttcaggtaaa ttggaagagt180 ttgttcaagg gaaccttgag agagaatgta tggaagaaaa gtgtagtttt gaagaagcac240 gagaagtttt tgaaaacact gaaagaacaa ctgaattttg gaagcagtat gttgatggag300 atcagtgtga gtccaatcca tgtttaaatg gcggcagttg caaggatgac attaattcct360 atgaatgttg gtgtcccttt ggatttgaag gaaagaactg tgaattagat gtaacatgta420 acattaagaa tggcagatgc gagcagtttt gtaaaaatag tgctgataac aaggtggttt480 gctcctgtac tgagggatat cgacttgcag aaaaccagaa gtcctgtgaa ccagcagtgc540 catttccatg tggaagagtt tctgtttcac aaacttctaa gctcacccgt gctgaggcag600 tttttcctga tgtggactat gtaaattcta ctgaagctga aaccattttg gataacatca660 ctcaaagcac ccaatcattt aatgacttca ctcgagttgt tggtggagaa gatgccaaac720 caggtcaatt cccttggcag gttgttttga atggtaaagt tgatgcattc tgtggaggct780 ctatcgttaa tgaaaaatgg attgtaactg ctgcccactg tgttgaaact ggtgttaaaa840 ttacagttgt cgcaggtgaa cataatattg aggagacaga acatacagag caaaagcgaa900 atgtgattcg aattattcct caccacaact acaatgcagc tattaataag tacaaccatg960 acattgccct tctggaactg gacgaaccct tagtgctaaa cagctacgtt acacctattt1020 gcattgctga caaggaatac acgaacatct tcctcaaatt tggatctggc tatgtaagtg1080 gctggggaag agtcttccac aaagggagat cagctttagt tcttcagtac cttagagttc1140 cacttgttga ccgagccaca tgtcttcgat ctacaaagtt caccatctat aacaacatgt1200 tctgtgctgg cttccatgaa ggaggtagag attcatgtca aggagatagt gggggacccc1260 atgttactga agtggaaggg accagtttct taactggaat tattagctgg ggtgaagagt1320 gtgcaatgaa aggcaaatat ggaatatata ccaaggtatc ccggtatgtc aactggatta1380 aggaaaaaac aaagctcact agctccagca gcaaggcccc tcccccgagc ctgccctccc1440 caagcaggct gcctgggccc tctgacaccc ctatcctgcc tcagtccagc tcctctaagg1500 ctccaccacc ttccctgcct agcccttcaa gactgccagg ccctagcgat acaccaattc1560 tgccccagtc ctccagcagc aaggctcccc cacctagcct gccttctcca tcaaggctgc1620 ctggcccatc cgatacccca attttgcctc agagcagctc tagcaaggca cctcccccca1680 gtctgccctc tccaagcaga ctccctggcc cttcagacac tccaatcctc ccacagtcct1740 ctagctctaa agctccacct cccagcctgc ccagccctag tagactcccc ggaccttctg1800
- 138 044349 atacccccat cttgccccag tgatgaggat ccgcggccgc
1840 <210> 35 <211> 610 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> CTP-модифицированный Фактор IX <400> 35
Arg Val 1
Asp Pro
Ala Met 5
Gln Arg
Val Asn
Met Ile
Met Ala
Pro Gly
Leu Ile
Thr Ile
Cys Leu
Leu Gly 25
Tyr Leu
Leu Ser
Cys Thr
Val Phe 35
Leu Asp
His Glu
Asn Ala
Asn Lys
Ile Leu 45
Pro Lys 50
Arg Tyr
Asn Ser
Gly Lys 55
Leu Glu
Glu Phe
Val Gln
Glu Ser 15
Ala Glu
Asn Arg
Gly Asn
Leu Glu 65
Arg Glu
Cys Met 70
Glu Glu
Lys Cys
Ser Phe 75
Glu Glu
Ala Arg 80
Glu Val
Phe Glu
Asn Thr 85
Glu Arg
Thr Thr
Glu Phe
Trp Lys
Gln Tyr 95
Val Asp
Gly Asp
100
Gln Cys
Glu Ser
Asn Pro 105
Cys Leu
Asn Gly
110
Gly Ser
Cys Lys
Asp Asp 115
Ile Asn
Ser Tyr
120
Glu Cys
Trp Cys
Pro Phe 125
Gly Phe
Glu Gly
130
Lys Asn
Cys Glu
Leu Asp 135
Val Thr
Cys Asn
140
Ile Lys
Asn Gly
Arg Cys 145
Ser Cys
Pro Ala
Lys Leu
Glu Gln
Thr Glu
Val Pro
180
Thr Arg
Phe Cys
150
Gly Tyr 165
Phe Pro
Ala Glu
Lys Asn
Arg Leu
Cys Gly
Ala Val
Ser Ala
Ala Glu
170
Arg Val 185
Phe Pro
Asp Asn 155
Asn Gln
Ser Val
Asp Val
Lys Val
Lys Ser
Ser Gln
190
Asp Tyr
Val Cys
160
Cys Glu 175
Thr Ser
Val Asn
- 139 044349
195
200
205
Ser Thr Glu Ala Glu
210
Thr Ile Leu Asp Asn
215
Ile Thr Gln Ser Thr
220
Ser Phe Asn Asp Phe 225
Thr Arg Val Val Gly 230
Gly Glu Asp Ala Lys 235
Gly Gln Phe Pro Trp
245
Gln Val Val Leu Asn
250
Gly Lys Val Asp Ala
255
Cys Gly Gly Ser Ile
260
Val Asn Glu Lys Trp
265
Ile Val Thr Ala Ala
270
Cys Val Glu Thr Gly
275
Val Lys Ile Thr Val
280
Val Ala Gly Glu His
285
Ile Glu Glu Thr Glu
290
His Thr Glu Gln Lys
295
Arg Asn Val Ile Arg 300
Ile Pro His His Asn 305
Tyr Asn Ala Ala Ile 310
Asn Lys Tyr Asn His 315
Ile Ala Leu Leu Glu
325
Leu Asp Glu Pro Leu
330
Val Leu Asn Ser Tyr
335
Thr Pro Ile Cys Ile
340
Ala Asp Lys Glu Tyr
345
Thr Asn Ile Phe Leu
350
Phe Gly Ser Gly Tyr
355
Val Ser Gly Trp Gly
360
Arg Val Phe His Lys 365
Arg Ser Ala Leu Val
370
Leu Gln Tyr Leu Arg
375
Val Pro Leu Val Asp
380
Ala Thr Cys Leu Arg 385
Ser Thr Lys Phe Thr 390
Ile Tyr Asn Asn Met 395
Cys Ala Gly Phe His
405
Glu Gly Gly Arg Asp
410
Ser Cys Gln Gly Asp
415
Gly Gly Pro His Val
420
Thr Glu Val Glu Gly
425
Thr Ser Phe Leu Thr
430
Ile Ile Ser Trp Gly
435
Glu Glu Cys Ala Met
440
Lys Gly Lys Tyr Gly 445
Gln
Pro 240
Phe
His
Asn
Ile
Asp 320
Val
Lys
Gly
Arg
Phe 400
Ser
Gly
Ile
- 140 044349
Tyr
Thr
450
Lys
Val
Ser
Arg
Tyr
455
Val
Asn
Trp
Ile
Lys 460
Glu
Lys
Thr
Lys
Leu
465
Thr
Ser
Ser
Ser
Ser 470
Lys
Ala
Pro
Pro
Pro
475
Ser
Leu
Pro
Ser
Pro
480
Ser
Arg
Leu
Pro
Gly 485
Pro
Ser
Asp
Thr
Pro
490
Ile
Leu
Pro
Gln
Ser
495
Ser
Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro
500 505 510
Gly Pro Ser Asp Thr Pro
515
Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala
520 525
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro
530 535
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp 540
Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser
545 550
Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
555 560
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro 565
Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
570 575
Pro Gln Ser Ser
580
Ser Ser
Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro
585 590
Ser Arg Leu Pro
595
Gly Pro
Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly Ser
600 605
Ala Ala
610 <210> 36 <211> 20 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Праймер 101 для FIX-(CTP)2 < 400> 36 gtttagtgaa ccgtcagaat <210> 37 <211> 20 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Праймер 103-R для FIX-(CTP)2
- 141 044349 <400> 37 ttgaggaaga tgttcgtgta <210> 38 <211> 20 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Праймер 98 для FIX-(CTP)2 < 400> 38 attacagttg tcgcaggtga <210> 39 <211> 30 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Праймер 99-R для FIX-(CTP)2 <400> 39 gctggagcta gtgagctttg ttttttcctt <210> 40 <211> 25 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Праймер 100 для FIX-(CTP)2 < 400> 40 gctcactagc tccagcagca aggcc <210> 41 <211> 23 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Праймер 27-R для FIX-(CTP)2 <400> 41 ttttcactgc attctagttg tgg <210> 42 <211> 20 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Праймер 75 < 400> 42 ctcccagttc aattacagct 20
- 142 044349 <210> 43 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер 122r <400>43 ggaaaaactg cctcagcacg ggtgagc27 <210>44 <211>32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер 123 <400>44 gtgctgaggc agtttttcct gatgtggact at32 <210>45 <211>18 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>
< 223> Праймер 124r <400> 45 caacacagtg ggcagcag 18
Claims (19)
1. Применение модифицированного фактора свертывания крови карбоксиконцевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, состоящего из фактора свертывания крови и трех CTP, присоединенных к карбоксильному концу указанного фактора свертывания крови, в получении лекарственного средства для уменьшения избыточного кровотечения или ушиба у субъекта или для поддержания гемостаза при проведении хирургических процедур или при хирургических вмешательствах у субъекта, где указанный фактор свертывания крови содержит либо предшественник с N-концевым пропептидом, либо зрелый фактор свертывания крови без N-концевого пропептида, где указанный N-концевой пропептид содержит сигнальный пептид, где указанный CTP-модифицированный фактор свертывания крови выбран из группы, состоящей из: (a) CTP-модифицированного полипептида Фактора VII (FVII), имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, где указанный фактор свертывания крови содержит предшественник фактора свертывания крови, и аминокислоты 39-528 последовательности SEQ ID NO: 25, где указанный фактор свертывания крови содержит зрелый фактор свертывания крови, и (b) CTP-модифицированного активированного полипептида Фактора VII (FVIIa), имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, где указанный фактор свертывания крови содержит предшественник фактора свертывания крови, и аминокислоты 39-528 последовательности SEQ ID NO: 25, где указанный фактор свертывания крови содержит зрелый фактор свертывания крови.
2. Применение согласно п.1, где указанный субъект имеет уменьшенное время и интенсивность кровотечения после указанного применения.
3. Применение согласно п.1, где поддержание гемостаза включает поддержание гемостаза крови без повторения эпизодов кровотечения.
4. Применение согласно п.3, где поддержание гемостаза крови включает сохранение свертывающей активности.
5. Применение согласно любому из пп.1-4, где по меньшей мере один CTP гликозилирован.
- 143 044349
6. Применение согласно любому из пп.1-5, где применение указанного лекарственного средства осуществляется посредством подкожного введения.
7. Применение согласно любому из пп.1-6, где субъект представляет собой ребенка.
8. Применение по любому из пп.1-7, где CTP-модифицированный FVII полипептид или CTPмодифицированный FVIIa полипептид содержит легкую цепь и тяжелую цепь, скрепленные дисульфидной связью.
9. Применение по п.8, где разделение указанной легкой цепи и указанной тяжелой цепи в ПААГ/ДСН геле происходит при денатурирующих условиях.
10. Применение по п.9, где указанная легкая цепь мигрирует на уровне молекулярной массы 25 кДа и указанная тяжелая цепь мигрирует на уровне молекулярной массы 50 кДа.
11. Применение по любому из пп.8-10, где дисульфидная связь присутствует при остатке 152 указанного фактора свертывания крови FVII или фактора свертывания крови FVIIa.
12. Применение по п.11, где указанная легкая цепь содержит аминокислоты 39-190 последовательности SEQ ID NO: 25 и указанная тяжелая цепь содержит аминокислоты 191-528 последовательности SEQ ID NO: 25.
13. Модифицированный фактор свертывания крови карбоксиконцевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, состоящий из фактора свертывания крови и трех CTP, присоединенных к карбоксильному концу указанного фактора свертывания крови, где указанный фактор свертывания крови содержит либо предшественник с N-концевым пропептидом, либо зрелый фактор свертывания крови без N-концевого пропептида, где указанный CTP-модифицированный фактор свертывания крови содержит связанную дисульфидной связью двухцепочечную гетеродимерную структуру, где указанный Nконцевой пропептид содержит сигнальный пептид, где указанный CTP-модифицированный фактор свертывания крови выбран из группы, состоящей из: (a) CTP-модифицированного полипептида Фактора VII (FVII), имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, где указанный фактор свертывания крови содержит предшественник фактора свертывания крови, и аминокислоты 39-528 последовательности SEQ ID NO: 25, где указанный фактор свертывания крови содержит зрелый фактор свертывания крови, и (b) CTP-модифицированного активированного полипептида Фактора VII (FVIIa), имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, где указанный фактор свертывания крови содержит предшественник фактора свертывания крови, и аминокислоты 39-528 последовательности SEQ ID NO: 25, где указанный фактор свертывания крови содержит зрелый фактор свертывания крови.
14. CTP-модифицированный фактор свертывания крови по п.13, где CTP-модифицированный FVII полипептид или CTP-модифицированный FVIIa полипептид содержит легкую цепь и тяжелую цепь, скрепленные дисульфидной связью.
15. CTP-модифицированный фактор свертывания крови по п.14, где разделение указанной легкой цепи и указанной тяжелой цепи в ПААГ/ДСН геле происходит при денатурирующих условиях.
16. CTP-модифицированный фактор свертывания крови по п.15, где указанная легкая цепь мигрирует на уровне молекулярной массы 25 кДа и указанная тяжелая цепь мигрирует на уровне молекулярной массы 50 кДа.
17. CTP-модифицированный фактор свертывания крови по любому из пп.13-16, где дисульфидная связь присутствует при остатке 152 указанного фактора свертывания крови FVII или фактора свертывания крови FVIIa.
18. CTP-модифицированный фактор свертывания крови по п.17, где указанная легкая цепь содержит аминокислоты 39-190 последовательности SEQ ID NO: 25 и указанная тяжелая цепь содержит аминокислоты 191-528 последовательности SEQ ID NO: 25.
19. Фармацевтическая композиция, содержащая CTP-модифицированный фактор свертывания крови, как определен в любом из пп.13-18, и фармацевтически приемлемый носитель.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13/372,540 | 2012-02-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044349B1 true EA044349B1 (ru) | 2023-08-18 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6430592B2 (ja) | 長期作用性凝固因子およびそれを製造する方法 | |
| US10144921B2 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
| US8759292B2 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
| JP6510002B2 (ja) | 長時間作用型凝固因子およびその生成方法 | |
| US11066658B2 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
| KR102473014B1 (ko) | 장기-작용성 응고 인자 및 그의 제조 방법 | |
| US20220170005A1 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
| AU2017201513B2 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
| EA044349B1 (ru) | Факторы свертывания крови пролонгированного действия и способы их получения | |
| BR112014020198B1 (pt) | Fator de coagulação modificado por peptídeos carbóxiterminais da gonadotrofina coriônica (ctp) e seu uso, método para produzir e extender a meia-vida do referido fator de coagulação, polinucleotídeo e composição farmacêutica |