BR112014020198B1 - Fator de coagulação modificado por peptídeos carbóxiterminais da gonadotrofina coriônica (ctp) e seu uso, método para produzir e extender a meia-vida do referido fator de coagulação, polinucleotídeo e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

FATOR DE COAGULAÇÃO MODIFICADO POR PEPTÍDEOS CARBÓXI-TERMINAIS DA GONADOTROFINA CORIÔNICA (CTP), SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO E USO, BEM COMO MÉTODO PARA A EXTENSÃO DA MEIA-VIDA BIOLÓGICA, MELHORANDO A ÁREA SOB A CURVA (AUC), REDUZINDO A FREQUÊNCIA DA DOSAGEM OU REDUZINDO A TAXA DE LIBERAÇÃO DE UM FATOR DE COAGULAÇÃO E POLINUCLEOTÍDEO São divulgados polipeptídeos que compreendem pelo menos um peptídeo carbóxi-terminal da gonadotrofina coriônica (CTP) anexado ao carbóxi-terminal, mas não ao terminal amino de um fator de coagulação e polinucleotídeos codificando o mesmo. Também são divulgadas composições compreendendo os polipeptídeos e polinucleotídeos da invenção e métodos de uso e produção dos mesmos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Polipeptídeos compreendendo pelo menos um peptídeo carboxi-terminal (CTP) da gonadotrofina coriônica ligado ao carboxi- terminal de um fator de coagulação e polinucleotídeos que codificam a mesma são descritos. As composições farmacêuticas compreendendo os polipeptídeos e polinucleotídeos da presente invenção e métodos de utilização e produção dos mesmos são também revelados.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] O desenvolvimento da terapia de reposição de fator de coagulação tem transformado a vida de muitas pessoas com hemofilia. A hemofilia é um grupo de doenças genéticas hereditárias que prejudicam a capacidade do corpo para controlar a coagulação do sangue. Os pacientes com hemofilia não produzem quantidades adequadas de proteínas do fator VIII ou do fator IX, as quais são necessárias para a coagulação do sangue eficaz. Em hemofílicos graves, mesmo uma pequena lesão pode resultar em perda de sangue que continua por dias ou semanas, e cura completa pode não ocorrer, levando ao potencial para danos permanentes debilitantes nas articulações e outros órgãos, e morte prematura.

[003] Um tipo de hemofilia, hemofilia B, é um problema hemorrágico ligado ao X causado por uma mutação no gene do fator IX (FIX), resultando numa deficiência da atividade pró-coagulante de FIX. Pacientes com hemofilia B têm hemorragias espontâneas dos tecidos moles e hemartroses recorrentes que muitas vezes levam a uma controle dos episódios de hemorragias que ameaçam a vida. Muitos pacientes recebem a terapia profilática, o que reduz o risco de hemorragia e as suas complicações associadas. No entanto, uma proporção significativa de pacientes (10-30%) desenvolve anticorpos inibidores de FVIII e FIX administrado exogenamente. A administração de FVIIa, que é um produto de bypass, pode induzir a homeostase e proporcionar um tratamento eficaz para pacientes com Abs inibitórios.

[005] Recombinante FVIIa (NovoSeven) está disponível comercialmente e foi aprovado em 1996 para o tratamento de episódios de sangramento em pacientes hemofílicos com inibidores. No entanto, o rFVIIa é rapidamente eliminado com uma meia-vida terminal de 2,5 horas. Como resultado, os pacientes geralmente requerem múltiplas, infusões frequentes (2-3 doses administradas em intervalos de 2-3 horas) para atingir a homeostase adequada após um leve sangramento moderado. Consequentemente, há muito interesse em desenvolver uma forma de ação prolongada de FVIIa que iria prolongar a duração da atividade hemostática após uma dose única e permitindo a administração muito menos frequente. Um FVIIa de ação prolongada também aumentaria a possibilidade de terapia profilática de longo prazo.

[006] Várias tecnologias estão sendo desenvolvidas para o prolongamento da semivida de FVIIa. No entanto, o desafio consiste em obter uma meia-vida prolongada desta proteína, preservando a sua atividade biológica e assegurando que as modificações não induzem a imunogenicidade significativa.

RESUMO DA INVENÇÃO

[007] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo Fator IX (FIX) modificado por CTP, que consiste em um polipeptídeo FIX e três peptídeos carboxi-terminais da gonadotrofina (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX modificado por CTP.

[008] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo modificado por CTP Fator IX (FIX), que consiste em um polipeptídeo FIX e três peptídeos carboxi-terminais da gonadotrofina (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX modificado por CTP.

[009] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado por CTP que consiste de um Polipeptídeo Fator IX (FIX) e três peptídeos carboxi- terminais da gonadotrofina (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX.

[010] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado por CTP que consiste de um Polipeptídeo Fator IX (FIX) e três peptídeos carboxi-terminais da gonadotrofina (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX.

[011] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona uma célula compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado por CTP que consiste de um Polipeptídeo Fator IX (FIX) e três peptídeos carboxi- terminais da gonadotrofina (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX.

[012] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado por CTP que consiste de um Polipeptídeo Fator IX (FIX) e três peptídeos carboxi- terminais da gonadotrofina (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX.

[013] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prolongar a meia-vida biológica de um polipeptídeo fator IX (FIX), compreendendo o passo de fixação de três peptídeos carboxi- terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX, assim estendendo-se a meia-vida biológica do referido polipeptídeo FIX.

[014] Numa outra modalidade, a presente invenção fornece um método de melhorar a área sob a curva (AUC) de um polipeptídeo fator IX (FIX), compreendendo o passo de fixação de três peptídeos carboxi- terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ao carboxi-terminal do referido Polipeptídeo FIX, melhorando assim a AUC do referido polipeptídeo FIX.

[015] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para reduzir a frequência de administração de um polipeptídeo fator IX (FIX), compreendendo o passo de fixação de três peptídeos carboxi- terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX, reduzindo, assim, a frequência de administração do referido polipeptídeo FIX.

[016] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para reduzir a taxa de depuração de um Fator IX (FIX) polipeptídeo, compreendendo o passo de fixação de três peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX, reduzindo, assim, a taxa de depuração do referido polipeptídeo FIX.

[017] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de produção de uma versão polipeptídeo Fator IX (FIX) modificado por CTP, compreendendo o passo de fixação de três peptídeos carboxi- terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX, produzindo, assim, uma polipeptídeo FIX modificado por CTP.

[018] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende administrar um polipeptídeo Fator IX (FIX) modificado por CTP, que compreende um polipeptídeo FIX e três peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido Polipeptídeo FIX ao dito sujeito, tratando assim hemofilia no referido sujeito.

[019] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção da coagulação do sangue ou a um distúrbio de coagulação num sujeito, o método compreendendo o passo de administração ao sujeito de um fator de coagulação modificado por CTP, compreendendo 3-5 peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofina coriônica (CTP) ligado ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVII, impedindo assim a hemofilia no referido sujeito.

[020] Numa outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de um distúrbio da coagulação do sangue ou a coagulação num sujeito, o método compreendendo o passo de administração ao sujeito de um fator de coagulação modificado por CTP, compreendendo 3-5 peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido fator de coagulação, assim evitando a hemofilia no dito sujeito.

[021] Outras características e vantagens da presente invenção irão tornar-se aparentes a partir dos seguintes exemplos de descrição detalhada e figuras. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando modalidades preferidas da invenção são dados a título de ilustração apenas, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e âmbito da invenção se tornarão evidentes para os peritos na técnica a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[022] Figura 1A. mostra um gráfico de barras que mostra as coletas limitadas, diluídas, transfectadas, e as células selecionadas com FIX e FIX- CTP-CTP variantes na presença de 5 ug/ml de vitamina K3. O nível de FIX foi quantificado usando Kit ELISA FIX humano (Afinidade Biologicals; Cat. No. FIX-AG RUO), e a concentração de proteína calculada (ug/ml) representa a média de dois ensaios independentes. A Figura 1B mostra micrografias gel SDS-PAGE de reconhecimento FIX Ab. A Micrografia A mostra reconhecimento do anticorpo anti-FIX no Western-blot; Micrografia B representa o reconhecimento do anticorpo anti-Y carboxilação no Western-blot. A faixa 1 em A-B foi carregado com uma amostra contendo FIX recombinante Faixa 2 em A-B foi carregada com uma amostra contendo coletas FIX-CTP. Faixa 3, em A-B foi carregada com uma amostra coleta contendo FIX (CTP)2.

[023] Figura 2. Mostra um gráfico que mostra atividade cromogênica comparativa de coletas FIX-CTP e FIX (CTP)2 (medida por uma Concentração CE50) em comparação com rhFIX (American Diagnostica).

[024] Figura 3. Mostra um gráfico que mostra o perfil PK de rhFIX, coleta de FIX-CTP, e coleta de FIX-CTP.

[025] Figura 4. Mostra um gráfico de barras mostrando coletas de FIX-CTP e coletas FIX-CTP- CTP e proteína FIX-CTP-CTP purificada nível antígeno FIX como determinado usando kit ELISA FIX Humano (Affinity Biologicals; CAT. No. FIX-AG RUO). A concentração de proteína calculada (ug/ml) representa a média de dois ensaios independentes.

[026] Figura 5. Mostra Micrografias gel SDS-PAGE de Reconhecimento Ab FIX. A micrografia A descreve uma coloração com azul de Coomassie; Micrografia B representa o reconhecimento do anticorpo anti-FIX no Western-blot; Micrografia C representa o reconhecimento do anticorpo anti-Y carboxilação no Western-blot. Faixa 1 em A-C foi carregado com uma amostra contendo FIX (CTP)2. A faixa 2 em A-C foi carregada com uma amostra contendo a FIX não ligada (CTP)2. Faixa 3 em A-C foi carregada com uma amostra contendo um concentrado de eluição de FIX (CTP)2.

[027] Figura 6. Mostra um gráfico que mostra a concentração de FIX (CTP)2 da amostra/DO) em comparação com o plasma humano grupo normal e rhFIX (American Diagnostica).

[028] Figura 7. Mostra um gráfico que mostra o perfil de PK purificado FIX-CTP, rhFIX, coleta de FIX-CTP, e coleta de FIX-CTP.

[029] Figura 8. Mostra anticorpos de carboxilação anti-CTP e antigama Western blot de Fix fundido com três, quatro ou cinco CTPs. FIX- CTP3, FIX-CTP4 e FIX-CTP5 coletas foram carregadas em 12% gel TrisGlycine usando Precision Plus Dual Color Protein Marker (Bio-Rad). A análise de SDS-PAGE foi realizada por Western imuno-blot utilizando anticorpos anti-CTP Ab policlonal (Adar Biotech Production) ou Ab anti-Gla (American Diagnostica).

[030] Figura 9. Mostra ac detecção azul de Coomassie FIX-CTP3, FIX-CTP4 e FIX-CTP5. Depois de um processo de purificação utilizando uma coluna de jacalina (purificação por imunoafinidade de proteínas glicosiladas), FIX-CTP3, FIX-CTP4, e FIX-CTP5 foram carregadas em gel a 12% Tris-glicina usando Precision Plus Dual Color Protein Marker (BioRad). A SDS-PAGE foi corada pelo corante azul de Coomassie para detecção da amostra.

[031] Figura 10. Mostra atividade Cromogênica FIX. A avaliação comparativa da potência in vitro de FIX-CTP3 FIX-CTP4 e FIX-CTP5 totalmente purificada (coluna HA) versus plasma humano de grupo normal foi realizado usando um kit de teste de atividade cromogênica comercialmente disponível, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Todas as amostras foram diluídas em série e a potência foi avaliada por comparação de uma curva de resposta à dose de uma preparação de referência consistindo em plasma humano normal.

[032] Figura 11. Mostra o perfil farmacocinético comparativo (PK) de FIX-CTP3 FIX-CTP4 e FIX-CTP5. A concentração de FIX em amostras de plasma foram quantificadas utilizando kits Elisa FIX humano (Affinity Biologicals). O perfil farmacocinético foi calculado e representa a média de três animais em cada ponto de tempo. Semi-vidas terminais foram calculadas usando software PK Solutions 2.0.

[033] Figura 12. Mostra a análise de FIX-CTP3 SDS-PAGE -. Coomassie SDS-PAGE FIX-CTP3 proteína Y—carboxilada enriquecida, e rhFIX rFIXa (FIX ativada) foram carregadas em gel a 12% Tris-glicina usando Precision Plus Dual Color Protein Marker (Bio-Rad). A análise de SDS-PAGE Coomassie foi realizada por coloração do gel com azul Commasie reagente (800 ng de proteína) (Figura 12A). Um Western blot foi realizado utilizando 100 ng de proteína com anticorpo policlonal anti-FIX humano A-B (Figura 12B), um anticorpo monoclonal gama-carboxilação de anti-humano (American Diagnostica Cat # 499, 3570) (Figura 12C), anti-FIX policlonal pró-peptídeo Ab (Figura 12E), e anti-CTP Ab policlonal (Figura 12E).

[034] Figura 13: Mostra a atividade cromogênica FIX-CTP3. Uma avaliação comparativa da potência in vitro de coleta FIX-CTP3 e FIX-CTP3 proteína Y-carboxilada enriquecida, contra plasma humano de grupo normal foi realizada usando um kit de teste de atividade cromogênica disponível comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). FIX-CTP3 e a coleta da proteína foram diluídas em série, e a potência foi avaliada por comparação de uma curva de dose-resposta para uma preparação de referência consistindo em plasma humano normal.

[035] Figura 14: Mostra o tempo de coagulação comparativo. Um aPTT (Ensaio de Tempo de Trombina Parcial) in vitro foi realizado comparando a atividade de coagulação de FIX-CTP3 a BeneFIX. As proteínas foram diluídas em série e cravadas no plasma empobrecido-FIX humano, e o tempo de coagulação foi avaliado.

[036] Figura 15. Mostra perfil PK comparativo FIX-CTP3. Concentração FIX foi quantificada usando Kits ELISA FIX humano (Affinity Biologicals; Cat # FIX-AG RUO.). O perfil farmacocinético foi calculado para cada proteína e é a média de três animais em cada ponto de tempo.

[037] Figura 16. Mostra os parâmetros do perfil de uma atividade. Em paralelo à amostragem PK, animais com deficiência de FIX administrados com BeneFIX® ou FIX-CTP3, amostras de plasma citratadas, foram avaliadas quanto à sua atividade de coagulação por ensaio aPTT, que foi traduzido para % de atividade. A % de atividade, em cada ponto de recolha foi calculado como o tempo de coagulação de corrente/tempo de coagulação do plasma de camundongos de grupo normal * 100.

[038] Figura 17. Mostra um primeiro parâmetro de sangramento desafiante. Camundongos com deficiência de FIX foram administrados uma única injeção intravenosa de 100 UI/Kg de BeneFIX® ou rFIX-CTP3. A veia da cauda foi ligeiramente cortada 48 horas após a administração e o tempo de sangramento da veia da cauda (TVBT) e de intensidade de sangramento (hemoglobina OD) foram avaliados. Um segundo desafio de sangramento foi realizado 15 minutos depois de atingir a homeostase, e os mesmos parâmetros foram medidos.

[039] Figura 18. Mostra um segundo parâmetro de sangramento desafiante. Uma vez que o primeiro sangramento descrito na legenda da Figura 19 foi espontaneamente ou manualmente parado, um segundo desafio de sangramento foi realizado 15 minutos após o primeiro, e o tempo e intensidade da hemorragia foram remedidos.

[040] Figura 19. Mostra um diagrama que ilustra a construção de rFVII-CTP (A), construção rFVII-CTP (B), rFIX-CTP construção (C), e construção rFIX-CTP (D).

[041] Figura 20A. Mostra um gráfico de barras mostrando células selecionadas e transfectadas diluídas de clone limitadas de coletas com FVII-CTP variantes na presença de 5 ug/ml de vitamina K3. O nível de fator VII foi quantificada através de ELISA de FVII (AssayPro).

[042] Figura 20B. Mostra um gráfico de barras que mostra as coletas de células transfectadas e selecionadas diluído limitados com FVII-CTP variantes na presença de 5 ug de vitamina K3. A atividade FVII foi quantificada usando ensaio de FVII atividade cromogênica (AssayPro).

[043] Figura 20C. Mostra um gráfico de barras que mostra as coletas de células transfectadas e selecionadas diluídas limitados com FVII-CTP variantes na presença de 5 ug de vitamina K3. A atividade específica do fator VII foi calculada para cada versão, dividindo o valor de atividade na concentração de coleta de FVII.

[044] Figura 20D. Mostra um gráfico que mostra o perfil PK de FVII, FVII-CTP, e coletas de FVII-CTP.

[045] Figura 21. Mostra western blots de FVII fundido com três, quatro e cinco PTC, detectados utilizando anticorpos anti-FVII, anti-CTP, e anticorpos anti-carboxilação gama. Coletas FVII-CTP3, FVII-CTP4, e FVII- CTP5 foram carregadas em gel de 12% de Tris-glicina (expedeon) usando mais Precision plus dual color protein marker (Bio-Rad). A análise de SDS- PAGE foi realizada por Western blot utilizando anti-FVII Ab anti-CTP Ab policlonal (Adar Biotech Production) ou Ab anti-Gla (American Diagnostica).

[046] . Figura 22 mostra a atividade FVII - atividade Cromogênica. Uma avaliação comparativa da potência in vitro de HA purificado (fração altamente gama carboxilada) FVII-CTP3, FVII-CTP4, e FVII-CTP5 versus plasma humano de grupo normal foi realizada usando um kit de teste de atividade cromogênica comercialmente disponível, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221.304). Todas as amostras foram diluídas em série e a potência foi avaliada por comparação de uma curva de resposta à dose de uma preparação de referência consistindo em plasma humano normal.

[047] Figura 23 mostra um primeiro perfil-FVII 3, 4 farmacocinético comparativo (PK) e 5 CTPs. FVII-CTP3, FVII-CTP4, e FVII-CTP5 (grupo A, B e C, respectivamente) foram administradas numa única injeção intravenosa em camundongos Sprague Dawley (seis camundongos por tratamento) numa dose de 250 ug/kg de peso corporal. As amostras de sangue foram retiradas retro-orbital de 3 camundongos alternadamente em 0,083, 0,5 2, 5, 8, 24, 48, 72 e 96 horas após a administração. Plasma tratado com citrato (0,38%) foi preparado imediatamente após a coleta e armazenadas a -20 ° C até análise. FVII-CTP5 demonstrou um perfil superior, em comparação com as outras duas versões.

[048] Figura 24. Mostra um segundo perfil-FVII 3, 4 PK comparativo e 5 CTPs. FVII-CTP3, FVII-CTP4, e FVII-CTP5 após seleção de FVII e o processo de purificação de HA (Grupo A, B e C, respectivamente) foram administradas numa única injeção intravenosa em camundongos Sprague Dawley (três camundongos por substância) em uma dose de 29,45 mg/kg de peso corporal. As amostras de sangue foram retiradas retro-orbital em 0.083, 0,5 2, 8, 24, 48 e 72 horas após a administração. Plasma tratado com citrato (0,38%) foi preparado imediatamente após a coleta e armazenado a -20 ° C até análise.

[049] Figura 25. Mostra um diagrama esquemático de processo de purificação FVII-CTP3. Lote 31 foi produzido para o estudo PK/PD. Lote 38 foi produzido para o estudo de sobrevivência.

[050] Figura 26. Mostra um SDS - PAGE e Western blot de FVII e FVIIa Final. 10 mg (Lote 31) ou 5 mg (Lote 38) foram carregados em cada faixa de corado com Coomassie SDS-PAGE. 1 ug de proteína foi carregada em cada faixa de Western blot. 1. Polipeptídeo FVII-CTP3; 2. Cadeia pesada, incluindo 3x CTP; 3. Cadeia leve. Todos os três anticorpos detectam FVII. Cadeia pesada de FVIIa foi detectada por α-CTP, e a cadeia leve é detectada tanto com α-FVII e α-Gla.

[051] Figura 27. Mostra que FVII-CTP3 atividade cromogênica é aumentada como resultado de purificação em coluna de hidroxiapatite cerâmica (HA). A avaliação comparativa da potência in vitro de coleta FVII- CTP3, frações em processo, e FVII-CTP3 purificada versus plasma humano de grupo normal foi realizado usando um kit de teste de atividade cromogênico comercialmente disponível, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221.304). Coleta FVII-CTP3 e a proteína foram diluídas em série e a potência foi avaliada por comparação de uma curva de dose-resposta a uma preparação de referência de plasma humano normal.

[052] A Figura 28 mostra o perfil PK de FVIIa-CTP3 vs NovoSeven em camundongos com deficiência de FVIII. FVIIa-CTP3 foi produzido após a seleção FVII, processo de purificação HA e ativação. FVIIa-CTP3 ou NovoSeven foi administrado numa única injeção intravenosa de FVIII -/camundongos hemofílicos. As amostras de sangue foram retiradas retro- orbital em 0.083, 0,5 2, 8, 24, 48 e 72 horas após a administração. De plasma tratado com citrato (0,38%) foi preparado imediatamente após a coleta e armazenadas a -20 ° C até análise, e um perfil de PK foi estabelecido com base na atividade de coagulação do FVIIa usando um kit comercial STACLOT.

[053] Figura 29. Mostra que FVIIa-CTP3 foi produzido após a seleção FVII, processo de purificação HA e ativação. FVIIa-CTP3 ou NovoSeven foi administrado numa única injeção intravenosa de FVIII -/camundongos hemofílicos. As amostras de sangue foram retiradas retro- orbital em 0.083, 0,5 2, 8, 24, 48 e 72 horas após a administração. De plasma tratado com citrato (0,38%) foi preparado imediatamente após a coleta e armazenadas a -20 °C até análise. Parâmetros de geração de trombina foram avaliados durante o experimento PK, e os parâmetros, incluindo o montante máximo de pico, a quantidade de trombina para ponto de tempo e taxa de geração de trombina foram avaliados.

[054] Figura 30. Mostra curvas de sobrevida de camundongos hemofílicos postar cauda transecção de veia (TVT). TVT foi realizada (A) 15 min, (B) 24 horas ou (C) 48 horas após a administração. A sobrevivência de camundongos foi observada durante 24 horas após a TVT e registrada a cada hora durante as primeiras 12 horas, e após 24 horas. Figura 33D resume sobrevivência do camundongo como registrado 24 horas após TVT. Dados do grupo de controle (veículo) é a soma das 3 experiências com 5 camundongos/experiência.

[055] Figura 31. Mostra FVII - 3 CTP e FVII- 5 CTP imuno-blots. A) detectado para GLA. B) detectado para FVIIa. C) detectado para CTP.

[056] Figura 32 mostra um perfil PK comparativo FVII 3 e 5 CTP- de selecionar e HA purificação em coluna (vs. FVIIS FVII HA).

[057] Figura 33. Mostra perfil comparativo PK -FVII 3 e 5 CTP-O segundo estudo (IV vs SC).

[058] Figura 34. Mostra curvas de sobrevivência de camundongos hemofílicos após transecção de cauda (TVT). TVT foi realizado 12 horas após a administração SC. A sobrevivência de camundongos foi observada durante 24 horas após a TVT e registrada a cada hora durante as primeiras 12 horas, e após 24 horas.

[059] Figura 35. Mostra o perfil PK de MOD-5014 contra NovoSeven após administração IV ou de SC. A) mostra a administração IV; B) mostra administração SC.

[060] Figura 36. Mostra o perfil PK de MOD-5014 (Clone 61 # 75, # 81) contra NovoSeven, após administração única de SC.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[061] Numa modalidade, a presente invenção proporciono fatores de coagulação, de ação prolongada e de métodos de produção e utilização da mesma. Numa outra modalidade, de ação prolongado fatores de coagulação compreendem um peptídeo do carboxi-terminal (CTP, também referida como unidade de CTP). Noutra modalidade, os polipeptídeos que compreendem um fator de coagulação mais compreendem um peptídeo do carboxi-terminal (CTP) da gonadotrofina coriônica humana (hCG), de ação prolongada. Numa outra modalidade, a CTP atua como um protetor contra a degradação de um fator de coagulação. Numa outra modalidade, CTP estende Cmax de um fator de coagulação. Numa outra modalidade, CTP estende Tmax de um fator de coagulação. Numa outra modalidade, a CTP prolonga a meia-vida em circulação de um fator de coagulação. Em algumas modalidades, a CTP aumenta a potência de um fator de coagulação.

[062] Numa outra modalidade, aqui fornecido é um método de prolongar a meia-vida biológica de um fator de coagulação, incluindo a etapa de fixação 9:59 PTC ao carboxi-terminal do fator de coagulação, prolongando assim a sua meia-vida biológica do fator de coagulação. Numa outra modalidade, aqui fornecido é um método de prolongar a meia-vida biológica de um fator de coagulação, incluindo a etapa de fixação 4:59 PTC ao carboxi-terminal do fator de coagulação, prolongando assim a sua meia- vida biológica do fator de coagulação. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para prolongar a meia-vida em circulação de um fator de coagulação. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para aumentar a meia-vida de um fator de coagulação. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para prolongar a meia-vida de um fator de coagulação.

[063] Fator de Coagulação VII (FVII) é uma glicoproteína ácida 444 amino (50 kDa) secretada pelos hepatócitos para a corrente sanguínea como uma pró-enzima inativa. Após a lesão do tecido e para a exposição de sangue em circulação, FVII forma um complexo com o fator tecidual (TF), o que é uma proteína do receptor verdadeiro para FVII e é expressa por diversas células localizadas nas camadas mais profundas da parede do vaso. A formação deste complexo FVII-TF leva à ativação de FVII. FVII ativado (FVIIa) inicia a via extrínseca da coagulação ativando Fator IX e Fator X.

[064] FVII pertencem a um grupo de glicoproteínas da vitamina K- dependente associados com o sistema de coagulação. Além FVII, esse grupo é constituído por Fator IX, o Fator X, Proteína C e protrombina. Estas proteínas têm organizações domínio semelhantes e são sintetizadas como precursores com um pró-peptídeo N-terminal seguido de uma sequência de aminoácidos madura. O pró-peptídeo contém um local de ancoragem para gama-carboxilase que converte os ácidos glutâmico (Glu) no ácido gama carboxiglutâmicos (Gla). Este domínio é seguido por dois domínios (EGF) de fator de crescimento epidérmico semelhante, uma região de ligação (CR) e de um domínio de protease de serina C-terminal. Antes de secreção, FVII propeptídeo é clivada formando um único aminoácido 406 do zimogênio de cadeia FVII glicoproteína. Após a secreção, a proteína pode ser ativada em uma cadeia de dois heterodímero ligado por dissulfureto, FVIIa, por clivagem no CR. A concentração plasmática de FVII é de 10 nm e cerca de 1% circula na forma ativa em sujeitos saudáveis.

[065] Fator IX (FIX) é um ácido amino 415 (55 kDa), glicoproteína; que pertence a um grupo de glicoproteínas da vitamina K dependentes associados com o sistema de coagulação. FIX tem uma organização semelhante ao domínio de fator de FVII, o Fator X, Proteína C e protrombina, que são sintetizados como precursores com um pró-peptídeo N-terminal seguido de uma sequência de aminoácidos madura.

[066] FIX é segregado como uma molécula de cadeia simples que sofre modificações pós-transcricionais complexos, muitos dos quais são críticos para as suas propriedades bioquímicas e farmacocinéticas. Entre todas as modificações pós-transcricional, resíduos de ácido glutâmico 12 perto do terminal amino de FIX que são gama-carboxilada pela vitamina K- dependente carboxilase gama são as mais importantes. Carboxilação é necessário para a interação de FIX com as superfícies de fosfolipídios e para a atividade FIX ideal. O pró-peptídeo amino terminal serve como um local de reconhecimento para a gama carboxilase e, assim, após carboxilação gama, é clivada pela protease de serina conhecido como aparelho de Golgi emparelhados básico de aminoácidos Cleave Enzima (PACE/Furina). Quatro modificações pós-transcricionais adicionais podem ocorrer no aparelho de Golgi: sulfatação da tirosina 155, a fosforilação da serina 158 de glicosilação O- em Ser 63 e 61 e finalmente em, N- glicosilação em Asn 157 e 16, mas não foram mostrados para ser necessária para a atividade adequada de FIX.

[067] FIX circula no plasma (concentração média de 5 ug/ml) como um zimogênio de cadeia simples inativa. Após a clivagem proteolítica a duas ligações peptídicas: Arg 145 e Arg 180 por um ou dois ativadores fisiológicos, complexo FVIIa-TF ou FIXa, o peptídeo de ativação é removido, a conversão de FIX com uma enzima totalmente ativa que consiste de uma cadeia leve e pesada unidas por uma única ligação dissulfureto. A cadeia leve N-terminal contém o ácido não-catalítico gama carboxiglutâmico (Gla) e dois domínios de fator de crescimento epidérmico semelhante, enquanto que a cadeia pesada C-terminal contém o domínio catalítico do tipo tripsina da molécula. Sozinho FIXa é caracterizada pela má atividade catalítica. No entanto, quando complexado com FVIII, o aumento da atividade proteolítica por 4-5 ordens de magnitude para com o seu FX substcamundongo natural.

[068] Numa outra modalidade, aqui fornecido é um método de prolongar a semivida biológica, ou um método de melhorar a área sob a curva (AUC) de um fator de coagulação, incluindo a etapa de fixação 9:59 PTC ao carboxi-terminal do fator de coagulação, estendendo assim a sua meia-vida biológica ou melhorar a AUC do fator de coagulação. Numa outra modalidade, aqui fornecido é um método de prolongar a semivida biológica, ou um método de melhorar a área sob a curva (AUC) de um fator de coagulação, incluindo a etapa de fixação 4:59 PTC ao carboxi-terminal do fator de coagulação, estendendo assim a sua meia-vida biológica ou melhorar a AUC do fator de coagulação. Numa outra modalidade, aqui fornecido é um método de prolongar a semivida biológica, ou um método de melhorar a área sob a curva (AUC) de FIX, que compreende o passo de ligar 1-5 PTC ao carboxi-terminal do FIX, assim estendendo-se a meia-vida biológica ou melhorar a AUC do FIX. Numa outra modalidade, aqui fornecido é um método de prolongar a semivida biológica, ou um método de melhorar a área sob a curva (AUC) de FVII ou FVIIa, que compreende o passo de ligar 1-5 PTC ao carboxi-terminal ou de FVII FVIIa, estendendo assim a sua meia-vida biológica ou melhorar a AUC de FVII ou FVIIa.

[069] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prolongar a meia-vida biológica de um polipeptídeo fator IX (FIX), compreendendo o passo de fixação de três peptídeos carboxi- terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX, assim estendendo-se a meia-vida biológica do referido polipeptídeo FIX. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona ainda um método de prolongamento da semivida biológica de um fator VIIa (FVIIa), polipeptídeo, compreendendo o passo de fixar até cinco peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ao carboxi-terminal do referido FVIIa polipeptídeo, estendendo assim a sua meia-vida biológica do referido polipeptídeo FVIIa. Numa modalidade, três peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) estão ligados ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVIIa. Numa outra modalidade, quatro peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) estão ligados ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVIIa. Numa outra modalidade, cinco peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) estão ligados ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVIIa.

[070] Numa outra modalidade, a presente invenção fornece um método de melhorar a área sob a curva (AUC) de um polipeptídeo fator IX (FIX), compreendendo o passo de fixação de três peptídeos carboxi- terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ao carboxi-terminal do referido Polipeptídeo FIX, melhorando assim a AUC do referido polipeptídeo FIX. Numa outra modalidade, a presente invenção fornece um método de melhorar a área sob a curva (AUC) de um fator VIIa (FVIIa), polipeptídeo, compreendendo o passo de fixar até cinco peptídeos carboxi- terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ao carboxi-terminal de FVIIa dito polipeptídeo, melhorando assim a AUC do referido polipeptídeo FVIIa. Numa modalidade, três peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) estão ligados ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVIIa. Numa outra modalidade, quatro peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) estão ligados ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVIIa. Numa outra modalidade, cinco peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) estão ligados ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVIIa.

[071] Numa outra modalidade, um fator de coagulação da presente invenção é uma proteína. Numa outra modalidade, um fator de coagulação da presente invenção é um peptídeo. Numa outra modalidade, um fator de coagulação da presente invenção é um polipeptídeo. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é uma enzima. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é uma serina-protease. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é uma glicoproteína. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é uma transglutaminase. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um zimogênio inativo. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é de qualquer fator de coagulação do conhecimento de um perito na técnica.

[072] Numa outra modalidade, o fator de coagulação é o fator VIII (FVIII). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é o fator V (FV). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é o Fator XIII (FXIII). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é fator X (FX). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é de fibrina.

[073] Numa outra modalidade, o fator de coagulação é o Fator Vila (FVIIa). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é o Fator VII (FVII). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é o Fator IX (FIX). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é fator X (FX). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é de Fator Xla (FXIa). Numa outra modalidade, o fator de coagulação do Fator XII é (FXII). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é o fator Xa (FXa). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é o Fator Va (FVa). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é de protrombina. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é de trombina. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é fator XI (FXI). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é o fator de von Willebrand (vWF). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é de Fator Vllla (FVIIIa). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é suprimido-Domínio B de FVIII (FVIIIBDD). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é de domínio B eliminado FVIII (FVIIIBDD). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é Beta FVIII excluído do domínio (FVIIIBDD). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é o Fator IXa (FIXa). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é a pré-calicreína. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é a calicreína. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é fator Xlla (FXIIa). Numa outra modalidade, o fator de coagulação é fibrinogénio. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é de trombomodulina. Numa outra modalidade, o fator de coagulação do Fator II é (FII).

[074] Numa outra modalidade, o fator de coagulação é uma glicoproteína. Numa outra modalidade, o fator de coagulação dependente é uma glicoproteína de vitamina K-. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um independente-glicoproteína vitamina K.

[075] Numa outra modalidade, o fator de coagulação é uma proteína recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é uma glicoproteína recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é uma glicoproteína recombinante FV. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FVI recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um fator VII recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FVIII recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação IX recombinante é um. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FX recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FXI recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FXII recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FvW recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FII recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FIXa recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FXIa recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação de fibrina é um recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FVIIa recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FXa recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FVa recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação a protrombina é um recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é uma trombina recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FVIIIa recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um pré-calicreína recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um calicreína recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um FXIIa recombinante. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é de qualquer fator de coagulação recombinante conhecida. Numa outra modalidade, o fator de coagulação que compreende um peptídeo de sinal é qualquer fator de coagulação recombinante conhecida.

[076] Numa outra modalidade, um fator de coagulação compreende 1-10 repetições CTP ligados ao C-terminal e os PTC não ligados ao N- terminal. Numa outra modalidade, um fator de coagulação compreende pelo menos uma CTP ligado ao C-terminal e os PTC não ligados ao N- terminal. Numa outra modalidade, um fator de coagulação, compreendendo 1-10 repetições CTP ligados ao C-terminal e não CTPs ligados ao N- terminal é um fator de coagulação de engenharia. Numa outra modalidade, um fator de coagulação que compreende pelo menos um CTP ligado ao C- terminal e não CTPs ligados ao N-terminal é um fator de coagulação de engenharia. Numa outra modalidade, um fator de coagulação, compreendendo 1-10 repetições CTP ligados ao C-terminal e não CTPs ligados ao N-terminal é um fator de coagulação do conjugado. Numa outra modalidade, um fator de coagulação que compreende pelo menos um CTP ligado ao C-terminal e não CTPs ligados ao N-terminal é um fator de coagulação do conjugado.

[077] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo Fator IX (FIX) modificado por CTP, que consiste em um polipeptídeo FIX e três peptídeos carboxi-terminais da gonadotropina (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX modificado por CTP.

[078] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona ainda um polipeptídeo modificado CTP-Fator Vila (FVIIa) que consiste em um polipeptídeo de FVIIa e cinco gonadotropina peptídeos carboxi- terminais (CTP) ligado ao carboxi-terminal do referido FVIIa.

[079] Numa outra modalidade, o fator de coagulação é um fator de coagulação que compreende uma organização de domínio semelhante ou idêntica à organização do domínio de FIX, FVII, o Fator X, Proteína C, protrombina ou. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é sintetizado como um precursor com um propeptídeo de terminal-N. Numa outra modalidade, o fator de coagulação, tal como aqui utilizado é de uma forma pró-enzima inativa. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é produzido em hepatócitos. Numa outra modalidade, o fator de coagulação compreende um local de ancoragem para gama-carboxilase que converte os ácidos glutâmico (Glu) no ácido gama carboxiglutâmico (Gla). Numa outra modalidade, o fator de coagulação como aqui utilizado, é um fator de coagulação disponíveis comercialmente.

[080] Numa modalidade, o sequência de ácido nucleico que codifica o Fator VII compreende a seguinte sequência de ácido nucleico: ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgca gtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctgg aggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggccc gggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtg cctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccct gccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcg gctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactct ctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaa aaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtc catggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtg gtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagca cgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagca cgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcact gaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctc attggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgt gccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacg gagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggccc acatgccacccactaccggggcacgtggtacctgacgggcatcgtcagctggggccagggctgcgca accgtgggccactttggggtgtacaccagggtctcccagtacatcgagtggctgcaaaagctcatgcgct cagagccacgcccaggagtcctcctgcgagccccatttccctgaggatgcggccgc (SEQ ID NO: 11).

[081] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos do Fator VII compreende a seguinte sequência de aminoácidos: MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGS LERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCK DQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRS CRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPK GECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEH DLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLC LPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQ QSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGI VSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP (SEQ ID NO: 9).

[082] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos do Fator VII compreende a seguinte sequência de aminoácidos: MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGS LERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCK DQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRS CRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPK GECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEH DLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLC LPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQ QSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGI VSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP*GCG R (SEQ ID NO: 10).

[083] Numa outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica o Fator VII-CTP (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte composição de ácido nucleico ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgca gtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctgg aggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggccc gggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtg cctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccct gccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcg gctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactct ctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaa aaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtc catggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtg gtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagca cgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagca cgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcact gaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctc attggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgt gccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacg gagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggccc acatgccacccactaccggggcacgtggtacc tgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtg tcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagag cccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctggg cccagcgacacccccatcctgccccagtgaggatccgcggccgc (SEQ ID NO: 12).

[084] Numa outra modalidade, o aminoácido da sequência do Fator VII-CTP (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de aminoácidos: MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGS LERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCK DQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRS CRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPK GECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEH DLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLC LPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQ QSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGI VSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSS KAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ*(SEQ ID NO: 13).

[085] Numa outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica o Fator VII-CTP (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de ácido nucleico: ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgca gtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctgg aggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggccc gggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtg cctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccct gccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcg gctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactct ctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaa aaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtc catggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtg gtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagca cgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagca cgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcact gaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctc attggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgt gccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacg gagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggccc acatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgcc accgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgaga agcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctcccc ctagcctgcccagccctagcagactgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcc tctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgccaggcccctctgacacccctatcctgcct cagtgatgaaggtctggatccgcggccgc (SEQ ID NO: 14).

[086] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos do Fator VII-CTP (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte composição de aminoácidos: MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGS LERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCK DQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRS CRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPK GECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEH DLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLC LPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQ QSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGI VSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSS KAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILP Q** (SEQ ID NO: 15).

[087] Numa outra modalidade, a sequência de ácido nucleico do Fator VII que codifica-CTP-CTP (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de ácido nucleico: ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgca gtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctgg aggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggccc gggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtg cctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccct gccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcg gctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactct ctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaa aaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtc catggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtg gtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagca cgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagca cgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcact gaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctc attggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgt gccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacg gagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggccc acatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgcc accgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgaga agcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctcccc ctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctcca gcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccc cagtcctccagcagtaaggctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgata cacccatcctcccacagtgatgaggatccgcggccgcttaattaa (SEQ ID NO: 24).

[088] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos do Fator VII-CTP-CTP-CTP (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de aminoácidos: MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGS LERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCK DQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRS CRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPK GECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEH DLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLC LPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQ QSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGI VSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSS KAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILP QSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ** (SEQ ID NO: 25).

[089] Numa outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica o Fator VII (CTP)4 (ligada ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de ácido nucleico: ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgca gtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctgg aggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggccc gggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtg cctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccct gccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcg gctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactct ctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaa aaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtc catggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtg gtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagca cgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagca cgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcact gaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctc attggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgt gccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacg gagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggccc acatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgcc accgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgaga agcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctcccc ctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctcca gcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccc cagtcctccagcagtaaggctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgata cacccatcctcccacagtgatgaggatccgc (SEQ ID NO: 26).

[090] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos do Fator VII (CTP)4 (ligada ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de aminoácidos: LEDMVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELR PGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNG GSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTG TKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKV CPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLG EHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVP LCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDC LQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYL TGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPS SSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTP ILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**G (SEQ ID NO: 27).

[091] Numa outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica o Fator VII (CTP)5 (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de ácido nucleico: ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgca gtcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctgg aggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggccc gggagatcttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtg cctcaagtccatgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccct gccttcgagggccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcg gctgtgagcagtactgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactct ctgctggcagacggggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaa aaagaaatgccagcaaaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtc catggcaggtcctgttgttggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtg gtctccgcggcccactgtttcgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagca cgacctcagcgagcacgacggggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagca cgtacgtcccgggcaccaccaaccacgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcact gaccatgtggtgcccctctgcctgcccgaacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctc attggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgt gccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacg gagtacatgttctgtgccggctactcggatggcagcaaggactcctgcaagggggacagtggaggccc acatgccacccactaccggggcacgtggtacctgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgcc accgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtcccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgaga agcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctcccc ctagcctgcccagccctagcagactgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctct aaggctccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgcccc agtcctccagcagcaaggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgatac cccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtctgccctctccaagcagactccct ggcccttcagacactccaatcctcccacagtcctctagctctaaagctccacctcccagcctgcccagcc ctagtagactccccggaccttctgatacccccatcttgccccagtgatgaggatccgc (SEQ ID NO: 28).

[092] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos do Fator VII (CTP)5 (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de aminoácidos: LEDMVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELR PGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNG GSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTG TKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKV CPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLG EHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVP LCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDC LQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYL TGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPS SSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTP ILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPG PSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**GS (SEQ ID NO: 29).

[093] Numa outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica o Fator IX compreende a seguinte sequência de ácido nucleico: gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccattgccttttagg atatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaa gaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaa gtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtat gttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctat gaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggc agatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgactt gcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttc taagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttgg ataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaacc aggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaa aatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatat tgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatg cagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctac gttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtg gctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttctccagtaccttagagttccacttgttgacc gagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggag gtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaac tggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccgg tatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcacttgaacgcggccgc (SEQ ID NO: 16).

[094] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos do Fator IX compreende o seguinte aminoácido: MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKL EEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESN PCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSA DNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPD VDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKV DAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIP HHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVS GWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGG RDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVN WIKEKTKLT (SEQ ID NO: 17).

[095] Numa outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica o Fator IX-CTP (Anexo ao carboxi-terminal) compreende a seguinte sequência de ácido nucleico: gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttag gatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaa agaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaa agtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagta tgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctat gaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggc agatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgactt gcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttc taagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttgg ataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaacc aggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaa aatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatat tgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatg cagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctac gttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtg gctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgacc gagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggag gtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaac tggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccgg tatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcct gccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagtgatgaaggtctggat ccgcggccgc (SEQ ID NO: 18).

[096] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos do Fator IX-CTP (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de aminoácidos: MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKL EEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESN PCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSA DNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPD VDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKV DAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIP HHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVS GWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGG RDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVN WIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ** (SEQ ID NO: 1 9).

[097] Numa outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica o Fator IX-CTP (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de ácido nucleico: gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttag gatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaa agaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaa agtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagta tgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctat gaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggc agatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgactt gcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttc taagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttgg ataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaacc aggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaa aatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatat tgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatg cagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctac gttacacctatttgcattgctacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtgg ctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccg agccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggt agagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactg gaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggta tgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgc cctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcc cctcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatga aggtctggatccgcggccgc (SEQ ID NO: 20).

[098] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos do Fator IX-CTP (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de aminoácidos: MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKL EEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESN PCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSA DNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPD VDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKV DAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIP HHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVS GWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGG RDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVN WIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSP SRLPGPSDTPILPQ** (SEQ ID NO: 21).

[099] Numa outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica o Fator IX (CTP)3 (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de ácido nucleico: tctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatc tgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaat cggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatg gaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttgg aagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacat taattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacatta agaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgaggga tatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttca caaacttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaa ccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatg ccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgtt aatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaa cataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaac tacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaa cagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctat gtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccactt gttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatg aaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagt ttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggt atcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccc cgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctcca gcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccc cagtcctccagcagtaaggctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgata cacccatcctcccacagtgatgaggatccgcggccgc (SEQ ID NO: 30).

[0100] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos do Fator IX (CTP)3 (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de aminoácidos: MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKL EEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESN PCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSA DNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPD VDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKV DAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIP HHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVS GWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGG RDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVN WIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSP SRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ** (SEQ ID NO: 31).

[0101] Numa outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica o Fator IX (CTP)4 (ligada ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de ácido nucleico: tctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatc tgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaat cggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatg gaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttgg aagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacat taattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacatta agaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgaggga tatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttca caaacttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaa ccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatg ccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgtt aatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaa cataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaac tacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaa cagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctat gtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccactt gttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatg aaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagt ttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggt atcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccc cgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctct aaggccccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccc cagtcctccagcagcaaggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgata ccccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtctgccctctccaagcagactccc tggcccttcagacactcccattctgccacagtgatgaggatccgcggccgc (SEQ ID NO: 32).

[0102] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos do Fator IX (CTP)4 (ligada ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de aminoácidos: SRVDPAMQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGD QCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQF CKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAE AVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVV LNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKR NVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFG SGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGF HEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVS RYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPS LPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSK APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**GSAA (SEQ ID NO: 33).

[0103] Numa outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica o Fator IX (CTP)5 (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de ácido nucleico: ctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatct gccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaat cggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatg gaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttgg aagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacat taattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacatta agaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgaggga tatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttca caaacttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaa ccattttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatg ccaaaccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgtt aatgaaaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaa cataatattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaac tacaatgcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaa cagctacgttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctat gtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccactt gttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatg aaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagt ttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggt atcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccc cgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctct aaggctccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgcccc agtcctccagcagcaaggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgatac cccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtctgccctctccaagcagactccct ggcccttcagacactccaatcctcccacagtcctctagctctaaagctccacctcccagcctgcccagcc ctagtagactccccggaccttctgatacccccatcttgccccagtgatgaggatccgcggccgc (SEQ ID NO: 34).

[0104] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos do Fator IX (CTP)5 (ligado ao carboxi-terminal) tem a seguinte sequência de aminoácidos: RVDPAMQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRY NSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQ CESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFC KNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEA VFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVL NGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRN VIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGS GYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGF HEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVS RYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPS LPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSK APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ* *GSAA (SEQ ID NO: 35).

[0105] Numa outra modalidade, furina é adicionada a uma célula que expressa o fator de coagulação-CTP da invenção. Numa outra modalidade, furina aumenta a eficiência da produção de um fator de coagulação-CTP da invenção numa célula. Numa outra modalidade, furina é co-transfectado com o vetor que compreende a sequência de codificação do fator de coagulação-CTP da invenção. Numa outra modalidade, furina é codificado por um vetor separado. Em outra modalidade, a furina e um fator de coagulação-CTP são codificados por um vetor. Numa outra modalidade, a sequência de codificação de furina é inserido pCI-DHFR. Numa outra modalidade, a sequência de codificação de furina foi concebido em pCI- dhfr/Smal+Notl, Furina/Asisi FI + NotI.

[0106] Numa outra modalidade, a furina sequência de ácido nucleico que codifica compreende a seguinte sequência de ácido nucleico: tctagagtcgaccccgccatggagctgaggccctggttgctatgggtggtagcagcaacaggaaccttg gtcctgctagcagctgatgctcagggccagaaggtcttcaccaacacgtgggctgtgcgcatccctgga ggcccagcggtggccaacagtgtggcacggaagcatgggttcctcaacctgggccagatcttcgggga ctattaccacttctggcatcgaggagtgacgaagcggtccctgtcgcctcaccgcccgcggcacagccg gctgcagagggagcctcaagtacagtggctggaacagcaggtggcaaagcgacggactaaacggg acgtgtaccaggagcccacagaccccaagtttcctcagcagtggtacctgtctggtgtcactcagcggg acctgaatgtgaaggcggcctgggcgcagggctacacagggcacggcattgtggtctccattctggacg atggcatcgagaagaaccacccggacttggcaggcaattatgatcctggggccagttttgatgtcaatga ccaggaccctgacccccagcctcggtacacacagatgaatgacaacaggcacggcacacggtgtgc gggggaagtggctgcggtggccaacaacggtgtctgtggtgtaggtgtggcctacaacgcccgcattgg aggggtgcgcatgctggatggcgaggtgacagatgcagtggaggcacgctcgctgggcctgaacccc aaccacatccacatctacagtgccagctggggccccgaggatgacggcaagacagtggatgggcca gcccgcctcgccgaggaggccttcttccgtggggttagccagggccgaggggggctgggctccatcttt gtctgggcctcggggaacgggggccgggaacatgacagctgcaactgcgacggctacaccaacagt atctacacgctgtccatcagcagcgccacgcagtttggcaacgtgccgtggtacagcgaggcctgctcgt ccacactggccacgacctacagcagtggcaaccagaatgagaagcagatcgtgacgactgacttgcg gcagaagtgcacggagtctcacacgggcacctcagcctctgcccccttagcagccggcatcattgctct caccctggaggccaataagaacctcacatggcgggacatgcaacacctggtggtacagacctcgaag ccagcccacctcaatgccaacgactgggccaccaatggtgtgggccggaaagtgagccactcatatg gctacgggcttttggacgcaggcgccatggtggccctggcccagaattggaccacagtggccccccag cggaagtgcatcatcgacatcctcaccgagcccaaagacatcgggaaacggctcgaggtgcggaag accgtgaccgcgtgcctgggcgagcccaaccacatcactcggctggagcacgctcaggcgcggctca ccctgtcctataatcgccgtggcgacctggccatccacctggtcagccccatgggcacccgctccaccct gctggcagccaggccacatgactactccgcagatgggtttaatgactgggccttcatgacaactcattcct gggatgaggatccctctggcgagtgggtcctagagattgaaaacaccagcgaagccaacaactatgg gacgctgaccaagttcaccctcgtactctatggcaccgcccctgaggggctgcccgtacctccagaaag cagtggctgcaagaccctcacgtccagtcaggcctgtgtggtgtgcgaggaaggcttctccctgcacca gaagagctgtgtccagcactgccctccaggcttcgccccccaagtcctcgatacgcactatagcaccga gaatgacgtggagaccatccgggccagcgtctgcgccccctgccacgcctcatgtgccacatgccagg ggccggccctgacagactgcctcagctgccccagccacgcctccttggaccctgtggagcagacttgct cccggcaaagccagagcagccgagagtccccgccacagcagcagccacctcggctgcccccggag gtggaggcggggcaacggctgcgggcagggctgctgccctcacacctgcctgaggtggtggccggcc tcagctgcgccttcatcgtgctggtcttcgtcactgtcttcctggtcctgcagctgcgctctggctttagttttcgg ggggtgaaggtgtacaccatggaccgtggcctcatctcctacaaggggctgccccctgaagcctggca ggaggagtgcccgtctgactcagaagaggacgagggccggggcgagaggaccgcctttatcaaaga ccagagcgccctctgaacgcggccgc (SEQ ID NO: 22).

[0107] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos de furina compreende a seguinte sequência de aminoácidos: MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVA RKHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLE QQVAKRRTKRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGH GIVVSILDDGIEKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRH GTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRMLDGEVTDAVEARSLGLN PNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWA SGNGGREHDSCNCDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYS SGNQNEKQIVTTDLRQKCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDM QHLVVQTSKPAHLNANDWATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNW TTVAPQRKCIIDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLS YNRRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDP SGEWVLEIENTSEANNYGTLTKFTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQ ACVVCEEGFSLHQKSCVQHCPPGFAPQVLDTHYSTENDVETIRASVCAPC HASCATCQGPALTDCLSCPSHASLDPVEQTCSRQSQSSRESPPQQQPPR LPPEVEAGQRLRAGLLPSHLPEVVAGLSCAFIVLVFVTVFLVLQLRSGFSF RGVKVYTMDRGLISYKGLPPEAWQEECPSDSEEDEGRGERTAFIKDQSA L* (SEQ ID NO: 23).

[0108] Numa modalidade, o termo fator de coagulação inclui ainda um homólogo de um fator de coagulação conhecido. Numa modalidade, o homólogo possui uma atividade coagulante. Em algumas modalidades, a homologia de acordo com a presente invenção também engloba deleção, inserção, substituição ou variantes, incluindo uma substituição de aminoácido, derivados e fragmentos biologicamente ativos polipeptídicos dos mesmos. Numa modalidade, a variante compreende as substituições conservadoras ou eliminações, inserções ou substituições que não alteram significativamente a estrutura do fator de coagulação tridimensional. Numa outra modalidade, a deleção, inserção ou substituição não altere a função de interesse do fator de coagulação, a qual numa modalidade, é a ligação a um parceiro de ligação específico.

[0109] Numa outra modalidade, a invenção inclui um homólogo de um fator de coagulação. Numa outra modalidade, a invenção inclui um homólogo de um fator de coagulação, com uma atividade de coagulação. Numa outra modalidade, a invenção inclui um homólogo de um fator de coagulação que tem ligação funcional. Numa outra modalidade, a invenção inclui homólogos de um fator de coagulação como aqui descrito, com uma atividade de coagulação. Numa outra modalidade, a invenção inclui homólogos de um fator de coagulação como aqui descrito, que tem ligação funcional. Numa outra modalidade, por exemplo, homólogos, polipeptídeos que são pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 87%, pelo menos 89%, pelo menos 91%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% homóloga a um fator de coagulação conforme determinado usando software BlastP do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI), utilizando os parâmetros padrão.

[0110] Numa outra modalidade, a invenção inclui homólogos de furina. Numa outra modalidade, a invenção inclui homólogos de furina mantendo uma função de interesse, o qual numa modalidade é a clivagem de uma proteína precursora. Numa outra modalidade, por exemplo, homólogos, polipeptídeos que são pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 87%, pelo menos 89%, pelo menos 91%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% homóloga a uma furina quanto determinado utilizando software BlastP do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI), utilizando os parâmetros padrão.

[0111] Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 1-10 gonadotrofinas peptídeos do carboxi-terminal (CTP) ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 1-3 gonadotrofinas peptídeos do carboxi-terminal (CTP) ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo compreendendo uma o fator de coagulação e 1-5 gonadotrofinas peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação que tem pelo menos uma CTP no seu carboxi-terminal.

[0112] Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 1-5 gonadotrofinas peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação.

[0113] Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 1-5 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação.

[0114] É para ser entendido que as composições e os métodos da presente invenção, que compreende os elementos ou passos como descrito aqui pode, em uma outra modalidade, consistem nos elementos ou passos, ou em uma outra modalidade, consistem essencialmente de tais elementos ou etapas. Em algumas modalidades, o termo "compreender" refere-se à inclusão de agente ativo indicada, tal como o fator de coagulação-CTP modificada, bem como a inclusão de outros agentes ativos, e veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, emolientes, estabilizadores, etc. como são conhecidos na indústria farmacêutica. Em algumas modalidades, o termo "consistindo essencialmente de" refere-se a uma composição, cujo ingrediente ativo é o único ingrediente ativo indicado, no entanto, outros compostos que podem ser incluídos são a agentes estabilizantes, conservantes, etc. da formulação, mas não estão envolvidos diretamente no efeito terapêutico da substância ativa indicada. Em algumas modalidades, o termo "consistindo essencialmente de" pode referir-se aos componentes que facilitam a libertação do ingrediente ativo. Em algumas modalidades, o termo "composto" refere-se a uma composição, que contém o ingrediente ativo e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0115] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e duas gonadotrofinas peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 2-3 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 24 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 2-5 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 2-6 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 27 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 2-8 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 2-9 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 210 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação.

[0116] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e gonadotrofina três peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 3-4 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 35 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 3-6 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 3-7 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 38 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 3-9 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 3-10 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação.

[0117] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e quatro peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofina (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 4-5 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo compreendendo um fator de coagulação e 4-6 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 4-7 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 4-8 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 4- 9 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 4-10 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação.

[0118] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e cinco peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofina (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 5-6 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 57 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 5-8 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 5-9 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e 510 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação.

[0119] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e duas gonadotrofinas peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 2-3 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 2-4 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 2-5 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 2-6 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 2-7 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 2-8 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 2-9 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 2-10 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação.

[0120] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e gonadotrofina três peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 3-4 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 3-5 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 3-6 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 3-7 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 3-8 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 3-9 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 3-10 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação.

[0121] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e quatro peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofina (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 4-5 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 4-6 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 4-7 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 4-8 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 4-9 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 4-10 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação.

[0122] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e cinco peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofina (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 5-6 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 5-7 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 5-8 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 5-9 CTPs ligado ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e 5-10 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação.

[0123] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e duas gonadotrofinas peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 2-3 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 2-4 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 2-5 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 2-6 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 2-7 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 2-8 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 2-9 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 2-10 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação.

[0124] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e gonadotrofina três peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi- terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 3-4 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 3-5 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 3-6 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 3-7 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 3-8 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 3-9 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 3-10 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação.

[0125] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e quatro peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofina (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 4-5 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 4-6 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 4-7 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 4-8 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 4-9 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 4-10 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação.

[0126] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e cinco peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofina (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 5-6 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 5-7 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 5-8 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 5-9 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e 5-10 CTPs ligado ao carboxi-terminal do fator de coagulação.

[0127] Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um fator de coagulação não tendo PTC no seu terminal amino. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um fator de coagulação que falta um CTP no seu terminal amino. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um fator de coagulação que tem pelo menos uma CTP no seu carboxi-terminal e não PTC no seu terminal amino. Numa outra modalidade, é aqui proporcionado um polipeptídeo que compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um fator de coagulação que tem o número de CTPs no seu carboxi-terminal, tal como aqui descrito e não PTC no seu terminal amino.

[0128] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tal como descrito acima.

[0129] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona ainda uma composição que compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado por CTP que consiste de um Polipeptídeo Fator IX (FIX) e três peptídeos carboxi-terminais da gonadotropina (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido Polipeptídeo FIX.

[0130] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona ainda um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado por CTP que consiste de um polipeptídeo de Fator VIIa (FVIIa) e gonadotropina três peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi- terminal do referido polipeptídeo FVIIa.

[0131] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um fator de coagulação recombinante tal como descrito acima. Numa modalidade, a presente invenção proporciona um fator de coagulação de engenharia tal como descrito acima. Numa modalidade, o fator de coagulação de engenharia tal como descrito acima é conhecida como um fator de coagulação modificado por CTP.

[0132] Numa modalidade, o PTC que estão ligados ao carboxi- terminal do fator de coagulação estão ligados em conjunto ao carboxi- terminal.

[0133] Numa modalidade, um fator de coagulação de engenharia, como aqui descrito tem equivalente ou melhor atividade biológica em comparação com o fator de coagulação não-modificado por CTP. Numa outra modalidade, um fator de coagulação de engenharia, como aqui descrito tem medições farmacológicos equivalentes ou melhores em comparação com o fator de coagulação não modificado por CTP. Numa outra modalidade, um fator de coagulação de engenharia, como aqui descrito tem uma farmacocinética equivalentes ou melhores em comparação com o fator de coagulação não modificado por CTP. Numa outra modalidade, um fator de coagulação de engenharia, como aqui descrito tem farmacodinâmica equivalentes ou melhores em comparação com o fator de coagulação não modificado por CTP.

[0134] Numa modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de uma desordem de coagulação. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende administrar um fator de coagulação modificado por CTP da presente invenção. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenir e tratar a hemofilia num paciente compreendendo a administração de um fator de coagulação modificado por CTP da presente invenção. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração de uma modificação do Fator VII-CTP da presente invenção.

[0135] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração de uma modificação CTP-Fator IX da presente invenção. Numa modalidade, a hemofilia é hemofilia B. Numa modalidade, a hemofilia B é conhecida como a deficiência de fator IX ou de doença de Natal. Numa modalidade, a hemofilia é hemofilia A grave, o qual numa modalidade, descreve hemofilia em que os níveis dos fatores de coagulação são de 0-1%. Numa outra modalidade, a hemofilia é hemofilia moderada, que, numa modalidade, descreve hemofilia em que os níveis dos fatores de coagulação são de 1-5. Numa outra modalidade, a hemofilia é hemofilia leve, que, numa modalidade, descreve hemofilia em que os níveis dos fatores de coagulação são de 5-50%.

[0136] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de um distúrbio de coagulação em um sujeito, que compreende a administração de um polipeptídeo Fator IX (FIX) modificado por CTP, que compreende um polipeptídeo FIX e três peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX ao referido sujeito, evitando, assim, o tratamento de uma desordem de coagulação no referido sujeito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de uma desordem de coagulação ou de coagulação num sujeito, que compreende a administração de uma modificação do Fator VII-CTP polipeptídeo (FVII), compreendendo um polipeptídeo de FVII e três gonadotrofina coriônica peptídeos carboxi-terminais (CTP) ligado o carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVII ao referido sujeito, evitando assim ou o tratamento de uma desordem de coagulação ou de coagulação no referido sujeito.

[0137] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenir ou tratar a hemofilia num paciente compreendendo a administração de um polipeptídeo Fator IX (FIX) modificado por CTP, que compreende um polipeptídeo FIX e três peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ligado ao carboxi- terminal do referido polipeptídeo F IX para o referido sujeito, a prevenção ou o tratamento de hemofilia, assim, no referido sujeito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenir ou tratar a hemofilia num paciente compreendendo a administração de uma modificação CTP-Fator Vila (FVIIa) polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo de FVIIa e três peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVIIa para o referido objeto, evitando deste modo ou tratamento de hemofilia no referido sujeito.

[0138] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende administrar um ou mais fatores de coagulação modificado por CTP, tal como aqui descritos para os referidos sujeitos. Assim, numa modalidade, a presente invenção proporciona um método de tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração de um polipeptídeo Fator IX (FIX) modificado por CTP, que compreende um polipeptídeo FIX e três peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do o referido polipeptídeo FIX e um Fator VIIa (FVIIa) CTP-polipeptídeo modificado compreendendo um polipeptídeo de FVIIa e três peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVIIa ao referido sujeito, tratando assim a hemofilia no referido sujeito. Numa modalidade, o FIX modificado por CTP e o FVIIa modificado por CTP são administrados na mesma composição ao mesmo tempo. Numa outra modalidade, o FIX modificado por CTP e o FVIIa modificado por CTP são administrados em composições separadas, ao mesmo tempo. Numa outra modalidade, o FIX modificado por CTP e o FVIIa modificado por CTP são administrados em composições separadas em momentos diferentes.

[0139] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenir ou tratar a hemofilia num paciente compreendendo a administração de um fator IX modificado por CTP (FIX) ou uma modificação do Fator VII-CTP polipeptídeo compreendendo uma FIX ou um polipeptídeo de FVII e três coriônica gonadotrofinas peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido FIX ou o referido polipeptídeo FVII ao referido sujeito, evitando, assim, o tratamento de hemofilia ou no referido sujeito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração de uma modificação do Fator IX-CTP (FIX) ou uma modificação do Fator VII-CTP polipeptídeo compreendendo uma FIX ou um polipeptídeo de FVII e quatro gonadotrofina coriônica do carboxi-terminal peptídeos (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido FIX ou o referido polipeptídeo FVII ao referido sujeito, evitando, assim, o tratamento de hemofilia ou no referido sujeito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração de uma modificação do Fator IX-CTP (FIX) ou uma modificação do Fator VII-CTP polipeptídeo compreendendo uma FIX ou um polipeptídeo de FVII e cinco gonadotrofina coriônica do carboxi-terminal peptídeos (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido FIX ou o referido polipeptídeo FVII ao referido sujeito, evitando, assim, o tratamento de hemofilia ou no referido sujeito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração de uma modificação do Fator IX-CTP (FIX) ou uma modificação do Fator VII-CTP polipeptídeo compreendendo uma FIX ou um polipeptídeo de FVII e 3-5 gonadotrofina coriônica peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido FIX ou o referido polipeptídeo FVII ao referido sujeito, evitando, assim, o tratamento de hemofilia ou no referido sujeito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração de uma modificação do Fator IX-CTP (FIX) e uma versão polipeptídeo Fator VII modificado por CTP compreendendo uma FIX e um polipeptídeo de FVII e três gonadotrofina coriônica do carboxi-terminal peptídeos (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido FIX e o referido polipeptídeo de FVII ao referido sujeito, evitando, assim, o tratamento de hemofilia ou no referido sujeito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração de uma modificação do Fator IX-CTP (FIX) e uma versão polipeptídeo Fator VII modificado por CTP compreendendo uma FIX e um polipeptídeo de FVII e 3-5 gonadotrofina coriônica peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido FIX e o referido polipeptídeo de FVII ao referido sujeito, evitando, assim, o tratamento de hemofilia ou no referido sujeito.

[0140] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração por via subcutânea ou por via intravenosa, uma modificação do Fator IX-CTP (FIX) ou uma modificação do Fator VII-CTP polipeptídeo compreendendo uma FIX ou um polipeptídeo de FVII e três peptídeos gonadotrofinas coriônicos carboxi terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido FIX ou o referido polipeptídeo FVII ao referido sujeito, evitando, assim, o tratamento de hemofilia ou no referido sujeito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração por via subcutânea ou por via intravenosa um Fator IX modificado por CTP (FIX) ou uma modificação do Fator VII-CTP polipeptídeo compreendendo uma FIX ou um polipeptídeo de FVII e quatro coriônica gonadotrofinas peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido FIX ou o referido polipeptídeo FVII ao referido sujeito, evitando, assim, o tratamento de hemofilia ou no referido sujeito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração por via subcutânea ou por via intravenosa um Fator IX modificado por CTP (FIX) ou uma modificação do Fator VII-CTP polipeptídeo compreendendo uma FIX ou um polipeptídeo de FVII e cinco coriônica gonadotrofinas peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido FIX ou o referido polipeptídeo FVII ao referido sujeito, evitando, assim, o tratamento de hemofilia ou no referido sujeito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração por via subcutânea ou por via intravenosa um Fator IX modificado por CTP (FIX) ou uma modificação do Fator VII-CTP polipeptídeo compreendendo uma FIX ou um polipeptídeo de FVII e de três gonadotrofinas cinco peptídeos coriônicos carboxi terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido FIX ou o referido polipeptídeo FVII ao referido sujeito, evitando, assim, o tratamento de hemofilia ou no referido sujeito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração por via subcutânea ou por via intravenosa um Fator IX modificado por CTP (FIX) e uma versão polipeptídeo Fator VII modificado por CTP compreendendo uma FIX e um polipeptídeo de FVII e três coriônica gonadotrofinas peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido FIX e o referido polipeptídeo de FVII ao referido sujeito, evitando, assim, o tratamento de hemofilia ou no referido sujeito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de hemofilia num sujeito, que compreende a administração por via subcutânea ou por via intravenosa um Fator IX modificado por CTP (FIX) e uma versão polipeptídeo Fator VII modificado por CTP compreendendo uma FIX e um polipeptídeo de FVII e de três gonadotrofinas cinco peptídeos coriônicos carboxi terminais (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido FIX e o referido polipeptídeo de FVII ao referido sujeito, evitando, assim, o tratamento de hemofilia ou no referido sujeito.

[0141] Em algumas modalidades, é fornecido aqui o método para prevenir ou tratar uma hemofilia num sujeito, o método compreendendo o passo de administração ao sujeito de um fator de coagulação modificado por CTP, compreendendo 3-5 peptídeos do carboxi- terminal da gonadotropina coriônicas (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo fator de coagulação, em que a sequência do referido fator de coagulação modificado por CTP é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, 27, ou 29, evitando assim a hemofilia no referido sujeito.

[0142] Em algumas modalidades, fornecidas neste documento é um método de prevenção ou tratamento de uma hemofilia num sujeito, o método compreendendo o passo de administrar subcutaneamente a um objeto do Fator VII modificado por CTP, compreendendo 3-5 peptídeos do carboxi-terminal da gonadotropina coriônicas (CTPs) ligado ao carboxi- terminal do referido polipeptídeo de FVII, na qual a sequência da referida FVII modificado por CTP é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, 27, ou 29, evitando assim a hemofilia no referido sujeito.

[0143] Em outras modalidades, o fator de coagulação engenharia é para o tratamento de pacientes com hemofilia B. Numa modalidade, o Fator IX de coagulação, compreendendo os PTC 3 em conjunto no seu carboxi-terminal é para o tratamento de pacientes com hemofilia B. Numa modalidade, o Fator IX de coagulação, compreendendo 4 PTC em conjunto no seu carboxi-terminal é para o tratamento de pacientes com hemofilia B. Numa modalidade, o Fator IX de coagulação, compreendendo 5 PTC em conjunto no seu carboxi-terminal é para o tratamento de pacientes com hemofilia B. Numa outra modalidade, o Fator IX de coagulação, compreendendo dois CTPs em conjunto no seu carboxi- terminal é para o tratamento de pacientes com hemofilia B. Numa outra modalidade, o Fator IX de coagulação, compreendendo um CTP repetição no seu carboxi-terminal é para o tratamento de pacientes com hemofilia B. Em outras modalidades, o fator de coagulação engenharia pode reduzir o número de infusões necessários para um doente, reduzir as doses necessárias para um paciente, ou uma combinação dos mesmos.

[0144] Em uma modalidade, fator IX de coagulação que compreende três CTPs em conjunto no seu carboxi-terminal apresenta um perfil PK melhorada, mantendo a sua atividade coagulante versus FIX-CTP coleta, FIX-CTP coleta ou rhFIX. Numa modalidade, a meia-vida de eliminação de rFIX-CTP3 é de 2,5 a 4 vezes mais longa do que rFIX em camundongos e em camundongos deficientes em FIX. Numa modalidade, a administração de rFIX-CTP3 prolongou significativamente o efeito pró- coagulante em camundongos deficientes em FIX para, pelo menos, 76 h depois da dosagem. Numa modalidade, a administração de rFIX-CTP3 produziu um pico de atividade mais elevado do que em camundongos rFIX Com deficiência de FIX. Numa outra modalidade, o Fator IX de coagulação, compreendendo dois CTPs em conjunto no seu carboxi-terminal apresenta um perfil de PK melhorada enquanto mantém a sua atividade de coagulação vs coleta FIX-CTP ou de rhFIX. Numa outra modalidade, o Fator IX de coagulação, compreendendo dois CTPs em conjunto no seu carboxi-terminal apresenta aumento de 3 vezes na meia-vida e 4,5 vezes mais elevadas em comparação com a AUC de rhFIX.

[0145] Numa outra modalidade, a administração SC resulta em maior biodisponibilidade do FVII modificado por CTP em relação ao recombinante de FVII. Numa outra modalidade, a semivida é mais longa e biodisponibilidade (AUC SC/AUC IV) é mais elevada após administração de FVIIa-CTP3 e 5 SC quando comparada com a administração subcutânea de NovoSeven. Numa outra modalidade, MOD-5014 e MOD-5019 subcutaneamente injetado mostra a sobrevivência melhorada de camundongos em comparação com FVII recombinante (NovoSeven®) (ver o Exemplo 8 abaixo).

[0146] Numa outra modalidade, os termos "de peptídeos CTP," "de peptídeos do carboxi-terminal" e "sequência de CTP" são aqui utilizadas indiferentemente. Numa outra modalidade, o peptídeo do carboxi- terminal é um CTP de comprimento completo. Cada possibilidade representa uma modalidade separado da invenção.

[0147] Numa outra modalidade, um peptídeo de sinal está ligado ao terminal amino da CTP, conforme descrito no documento US 7.553.940, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[0148] Em outras modalidades, o fator de coagulação engenharia termo refere-se à sequência de aminoácidos de um fator de coagulação amadurecido. Em outras modalidades, o fator de coagulação termo refere-se a engenharia de a sequência de aminoácidos do fator de coagulação, incluindo a sua sequência de sinal ou peptídeo de sinal.

[0149] Numa outra modalidade, "sequência de sinal" e "peptídeo de sinal" são aqui utilizadas indiferentemente. Numa outra modalidade, "sequência" quando em referência a uma molécula de polinucleotídeo pode referir-se a uma porção de codificação. Cada possibilidade representa uma modalidade separado da presente invenção.

[0150] Numa outra modalidade, um fator de coagulação de engenharia que compreende pelo menos uma CTP, conforme aqui descrito tem melhorado in vivo a atividade biológica em relação ao mesmo fator de coagulação sem pelo menos uma CTP. Numa modalidade, a atividade biológica aumentada deriva da semivida mais longa do fator de coagulação engenharia, mantendo pelo menos alguma da atividade biológica. Numa outra modalidade, a maior atividade biológica decorre atividade biológica melhorada resultante da modificação de CTP. Noutra modalidade, a atividade biológica melhorada advém tanto uma semivida mais longa e a partir de uma funcionalidade melhorada do fator de coagulação modificado por CTP.

[0151] Em algumas modalidades, pelo menos uma sequência de CTP na extremidade carboxi-terminal do fator de coagulação fornece uma maior proteção contra a degradação de um fator de coagulação. Em algumas modalidades, pelo menos uma sequência de CTP na extremidade carboxi-terminal do fator de coagulação fornece maior proteção contra a depuração. Em algumas modalidades, pelo menos uma sequência de CTP na extremidade carboxi-terminal do fator de coagulação do tempo proporciona alívio prolongado. Em algumas modalidades, pelo menos uma sequência de CTP na extremidade carboxi-terminal do fator de coagulação aumenta a sua Cmax. Em algumas modalidades, pelo menos uma sequência de CTP na extremidade carboxi-terminal do fator de coagulação aumenta o seu Tmax. Em algumas modalidades, pelo menos uma sequência de CTP na extremidade carboxi-terminal do fator de coagulação prolonga a sua TV.

[0152] Numa outra modalidade, um fator de coagulação do conjugado desta invenção é usado da mesma maneira como um fator de coagulação conjugada não modificada. Numa outra modalidade, um fator de coagulação conjugado desta invenção tem uma maior semivida de circulação e tempo de residência no plasma, uma depuração diminuída, e uma maior atividade clínica in vivo. Numa outra modalidade, devido às propriedades melhoradas do fator de coagulação como aqui descrito conjugado, este conjugado é administrado menos frequentemente do que a forma não modificada do mesmo fator de coagulação.

[0153] Numa outra modalidade, a diminuição da frequência de administração resultará numa melhor estratégia de tratamento, que, numa modalidade, irá conduzir a uma melhor aceitação pelo paciente que conduz a melhores resultados de tratamento, bem como uma melhoria da qualidade de vida do paciente. Numa outra modalidade, em comparação com os conjugados de fatores de coagulação convencionais, verificou-se que os conjugados com o peso molecular e estrutura de ligação dos conjugados da presente invenção têm uma potência melhorada, uma estabilidade melhorada, níveis elevados de AUC, e reforçada semivida em circulação.

[0154] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo Fator IX (FIX) modificado por CTP, que consiste em um polipeptídeo FIX e de gonadotropina três peptídeos carboxi-terminais (CTP) ligado ao carboxi-terminal do referido modificado por CTP polipeptídeo FIX.

[0155] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo modificado CTP-Fator Vila (FVIIa) que consiste em um polipeptídeo de FVIIa e cinco gonadotropina peptídeos carboxi-terminais (CTP) ligado ao carboxi-terminal do referido FVIIa.

[0156] Numa outra modalidade, é aqui proporcionada uma composição compreendendo um conjugado de fator de coagulação, tal como aqui descrito. Numa outra modalidade, aqui proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo o fator de coagulação, tal como aqui descrito conjugado. Numa outra modalidade, aqui proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do fator de coagulação do conjugado como aqui descrito. Numa modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fator de coagulação do conjugado é determinada de acordo com fatores tais como a condição específica a ser tratada, a condição do paciente a ser tratado, bem como os outros ingredientes na composição.

[0157] Numa outra modalidade, um fator de coagulação conjugado como aqui descrito é útil no tratamento de sujeitos afetados com hemofilia. Numa outra modalidade, um fator de coagulação, tal como aqui descrito conjugado é útil no tratamento profilático da hemofilia, reduzindo assim o risco de hemorragia e as complicações associadas. Numa outra modalidade, um fator de coagulação, tal como aqui descrito conjugado é útil no tratamento de sujeitos afetados com hemofilia, reduzindo o risco de desenvolvimento de anticorpos inibidores para administrada exogenamente fatores de coagulação. Numa outra modalidade, um fator de coagulação, tal como aqui descrito conjugado é útil no tratamento de sujeitos que sofrem com Hemofilia induzindo assim a homeostase.

[0158] Numa modalidade, um fator de coagulação modificado por CTP da presente invenção possui utilizações terapêuticas. Numa outra modalidade, um fator de coagulação modificado por CTP da presente invenção tem usos profiláticos.

[0159] Numa outra modalidade, um fator de coagulação conjugado como aqui descrito é útil no tratamento de sujeitos que experimentam hemorragias excessivas ou nódoas negras ou com um tempo de protrombina prolongado (PT), ou tempo de tromboplastina parcial (PTT). Numa outra modalidade, um fator de coagulação, tal como aqui descrito conjugado é útil no tratamento de sujeitos que têm uma condição que é adquirida causando hemorragia, tais como a deficiência de vitamina K ou doença hepática. Numa outra modalidade, um fator de coagulação, tal como aqui descrito conjugado é útil no tratamento de sujeitos com deficiências em fatores de coagulação que são adquiridas (devido a outras doenças) ou herdados, moderada ou grave, permanente ou temporária. Numa outra modalidade, um fator de coagulação, tal como aqui descrito conjugado é útil no tratamento de sujeitos afetados com hemofilia A. Em outra modalidade, um fator de coagulação conjugado como aqui descrito é útil no tratamento de pacientes afligidos com hemofilia B. Em outra modalidade, um fator de coagulação conjugado como aqui descrito é útil no tratamento de sujeitos com deficiências adquiridas devido a doenças crónicas, tais como a doença do fígado ou do cancro; para uma condição aguda, tais como a coagulação intravascular disseminada (DIC), o qual utiliza-se fatores de coagulação a uma velocidade rápida; ou a uma deficiência de vitamina K, ou o tratamento com um antagonista da vitamina K como da varfarina (a produção de fatores II, VII, IX, X e precisam de vitamina K). Numa outra modalidade, um fator de coagulação, tal como aqui descrito conjugado é útil no tratamento de sujeitos afetados com uma doença em que faz com que os desequilíbrios de coagulação, tais como, mas não limitados a: a doença hepática, uremia, um cancro, um distúrbio da medula óssea, uma exposição de veneno de cobra, uma deficiência de vitamina K, uma terapia de anticoagulação, uma ingestão acidental do anticoagulante varfarina, múltiplas transfusões sanguíneas (unidades de sangue armazenadas perder alguns de seus fatores de coagulação), ou uma combinação destes. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de tratamento da veia profunda trombose num sujeito, que compreende administrar um fator de coagulação modificado por CTP da presente invenção. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção da hemorragia descontrolada num sujeito com hemofilia que compreende a administração de um fator de coagulação modificado por CTP da presente invenção. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de prevenção de episódios de sangramento num sujeito com hemofilia que compreende a administração de um fator de coagulação modificado por CTP da presente invenção. Numa outra modalidade, a presente invenção fornece um método de controlar sangramentos num sujeito com hemofilia B (fator IX deficiência congénita).

[0160] Numa outra modalidade, as composições e métodos da presente invenção são para o tratamento de episódios hemorrágicos em doentes de hemofilia A ou B, com inibidores de FVIII ou FIX e em pacientes com hemofilia adquirida; prevenção de hemorragias em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em pacientes com hemofilia A ou B com inibidores de FVIII ou FIX para e em pacientes com hemofilia adquirida; tratamento de episódios hemorrágicos em doentes com deficiência congénita de FVII e prevenção de hemorragias em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em pacientes com deficiência congênita FVII. Numa outra modalidade, as composições e métodos da presente invenção são para o tratamento ou prevenção de músculo sangra. Numa outra modalidade, as composições e métodos da presente invenção são para o tratamento ou a prevenção de hemorragias nas articulações. Numa outra modalidade, as composições e os métodos da presente invenção proporcionar um tratamento terapêutico ou profilático de epistaxe e sangramento gengival, sangramento da membrana mucosa, hemorragia no sistema nervoso central. Numa outra modalidade, as composições e os métodos da presente invenção proporcionar um tratamento terapêutico ou profilático de hemorragia gastrointestinal ou cerebral. Numa outra modalidade, as composições e os métodos da presente invenção proporcionar um tratamento terapêutico ou profilático de baixa frequência de sangramentos leves. Numa outra modalidade, as composições e os métodos da presente invenção proporcionar um tratamento terapêutico ou profilático de baixa frequência de sangramentos moderadas. Numa outra modalidade, as composições e os métodos da presente invenção proporcionar um tratamento terapêutico ou profilático de alta frequência hemorragias suaves. Numa outra modalidade, as composições e os métodos da presente invenção proporcionar um tratamento terapêutico ou profilático de alta frequência hemorragias moderadas.

[0161] Numa modalidade, as composições e os métodos da presente invenção proporcionar um tratamento terapêutico ou profilático de hemofilia assintomática. Numa outra modalidade, as composições e os métodos da presente invenção proporcionar um tratamento terapêutico ou profilático de ligeira a hemofilia moderada. Numa outra modalidade, as composições e os métodos da presente invenção proporcionar um tratamento terapêutico ou profilático de hemofilia grave.

[0162] Numa modalidade, as composições e os métodos da presente invenção proporcionar um tratamento terapêutico ou profilático de hemorragia, que, numa modalidade, é hemorragia incontrolável, e, numa outra modalidade, a hemorragia intracerebral. Numa outra modalidade, as composições e os métodos da presente invenção proporcionar um tratamento terapêutico ou profilático de coagulopatias neonatais; doença hepática grave; de alto risco de procedimentos cirúrgicos; perda de sangue traumático; O transplante de medula óssea; trombocitopenias e distúrbios da função plaquetária; reversão urgente da anticoagulação oral; deficiências congênitas dos fatores V, VII, X, XI e; ou doença de von Willebrand, numa modalidade, a doença de von Willebrand, com inibidores para o fator de von Willebrand.

[0163] Numa modalidade, um fator de coagulação modificado por CTP da presente invenção é para o tratamento de hemofilia ou uma doença relacionada, tal como aqui descrito num sujeito. Numa modalidade, o sujeito é humano. Em outra modalidade, o sujeito é um animal domesticado. Em outra modalidade, o sujeito é um mamífero. Em outra modalidade, o sujeito é um animal agrícola. Numa outra modalidade, o sujeito é um macaco. Numa outra modalidade, o sujeito é um cavalo. Numa outra modalidade, o sujeito é uma vaca. Numa outra modalidade, o sujeito é um camundongo. Numa outra modalidade, o sujeito é um camundongo. Numa outra modalidade, o sujeito é canino. Numa outra modalidade, o sujeito é felino. Numa outra modalidade, o sujeito é bovina, ovina, porcina, equina, murina, ou cervine. Numa modalidade, o sujeito é macho. Numa outra modalidade, o sujeito é fêmea. Numa modalidade, o sujeito é uma criança, numa outra modalidade, um adolescente, em outra modalidade, um adulto ou, Em outra modalidade, um sujeito idoso. Numa outra modalidade, o sujeito é um sujeito pediátrico, em outra modalidade, um sujeito geriátrico.

[0164] Numa outra modalidade, um [(CTP) n>1-fator de coagulação], tal como descrito neste documento compreende um fator de coagulação de comprimento completo ou um seu fragmento ativo ligado através de uma ligação peptídica no seu carboxi-terminal, pelo menos, uma unidade de CTP sem PTC no seu terminal amino. Numa outra modalidade, um [(CTP) n>1-fator de coagulação], tal como aqui descrito compreende um fator de coagulação ou um seu fragmento ativo ligado através de uma ligação peptídeo a pelo menos uma unidade de CTP que se encontra ligado a uma unidade de CTP adicional através de uma ligação peptídica com não há PTC no seu terminal amino. Numa outra modalidade, uma molécula de ácido nucleico que codifica um fator de coagulação de engenharia que compreende pelo menos uma CTP ligado ao seu C-terminal e não PTC no seu terminal amino.

[0165] Numa outra modalidade, o CTP está ligado ao fator de coagulação por meio de um ligante. Numa outra modalidade, o elemento de ligação que liga a sequência de CTP com o fator de coagulação é uma ligação covalente. Numa outra modalidade, o elemento de ligação que liga a sequência de CTP com o fator de coagulação é uma ligação peptídica. Numa outra modalidade, o elemento de ligação que liga a sequência de CTP com o fator de coagulação é uma ligação peptídica substituído. Numa outra modalidade, a sequência de CTP compreende: DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (SEQ ID NO: 1). Numa outra modalidade, a sequência de CTP compreende: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 2). Numa outra modalidade, a sequência de CTP compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre as sequências expostas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

[0166] Numa outra modalidade, o peptídeo carboxi-terminal (CTP) peptídeo da presente invenção compreende a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 112 a 145 de posicionar a gonadotrofina coriônica humana, como apresentada na SEQ ID NO: 1 Em uma outra modalidade, a sequência de CTP a presente invenção compreende a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 118 a 145 da posição de gonadotrofina coriônica humana, como apresentada na SEQ ID NO: 2 Em uma outra modalidade, a sequência de CTP também começa a partir de qualquer posição entre as posições 112- 118 e termina na posição 145 de gonadotrofina coriônica humana. Em algumas modalidades, a sequência peptídica de CTP é de 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34 aminoácidos de comprimento e começa na posição 112, 113, 114, 115, 116, 117 ou 118 da sequência de aminoácidos de CTP.

[0167] Numa outra modalidade, o peptídeo de CTP é uma variante de gonadotrofina coriônica CTP que difere da CTP nativa por 1-5 substituições de aminoácidos conservativas, tal como descrito na Pat. N ° 5.712.122, que é aqui incorporada por referência. Numa outra modalidade, o peptídeo de CTP é uma variante de gonadotrofina coriônica CTP que difere da CTP nativa por uma substituição de aminoácido conservador. Numa outra modalidade, o peptídeo de CTP é uma variante de gonadotrofina coriônica CTP que difere da CTP nativa por duas substituições de aminoácidos conservativas. Numa outra modalidade, o peptídeo de CTP é uma variante de gonadotrofina coriônica CTP que difere da CTP nativa por três substituições de aminoácidos conservativos. Numa outra modalidade, o peptídeo de CTP é uma variante de gonadotrofina coriônica CTP que difere da CTP nativa por quatro substituições de aminoácidos conservativas. Numa outra modalidade, o peptídeo de CTP é uma variante de gonadotrofina coriônica CTP que difere da CTP nativa por cinco substituições de aminoácidos conservativos.

[0168] Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos de peptídeos de CTP da presente invenção é, pelo menos, 70% homóloga à sequência de ácido amino CTP nativa, ou um seu peptídeo. Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos de peptídeos de CTP da presente invenção é, pelo menos, 80% homóloga à sequência de ácido amino CTP nativa ou um seu peptídeo. Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos de peptídeos de CTP da presente invenção é, pelo menos, 90% homóloga à sequência de ácido amino CTP nativa ou um seu peptídeo. Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos de peptídeos de CTP da presente invenção é, pelo menos, 95% homóloga à sequência de ácido amino CTP nativa ou um seu peptídeo. Numa outra modalidade, a sequência de aminoácidos de peptídeos de CTP da presente invenção é, pelo menos, 98% homóloga à sequência de ácido amino CTP nativa ou um seu peptídeo.

[0169] Numa outra modalidade, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo de CTP da presente invenção é, pelo menos, 70% homóloga à sequência de ADN de CTP nativa humana ou um seu peptídeo. Numa outra modalidade, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo de CTP da presente invenção é, pelo menos, 80% homóloga à sequência de ADN de CTP nativa humana ou um seu peptídeo. Numa outra modalidade, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo de CTP da presente invenção é, pelo menos, 90% homóloga à sequência de ADN de CTP nativa, ou um seu peptídeo. Numa outra modalidade, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo de CTP da presente invenção é, pelo menos, 95% homóloga à sequência de ADN de CTP nativa, ou um seu peptídeo. Numa outra modalidade, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo de CTP da presente invenção é, pelo menos, 98% homóloga à sequência de ADN de CTP nativa, ou um seu peptídeo.

[0170] Numa modalidade, pelo menos uma das sequências de aminoácidos gonadotrofina coriônica CTP é truncado. Numa outra modalidade, tanto as sequências de ácidos CTP amino gonadotrofina coriônica são truncados. Numa outra modalidade, duas das sequências de ácido CTP amino gonadotrofina coriônica são truncados. Numa outra modalidade, três das sequências de ácido CTP amino gonadotrofina coriônica são truncados. Numa outra modalidade, quatro das sequências de ácido CTP amino gonadotrofina coriônica são truncados. Numa outra modalidade, 5 das sequências de ácido CTP amino gonadotrofina coriônica são truncados. Numa outra modalidade, duas ou mais das sequências de ácido amino CTP gonadotrofina coriônica são truncados. Numa outra modalidade, todas as sequências de ácidos CTP amino gonadotrofina coriônica são truncados. Numa modalidade, o CTP truncada compreende os primeiros 10 aminoácidos de SEQ ID NO: 3 Numa outra modalidade, a SEQ ID NO: 3, compreende a seguinte sequência de aminoácidos (AA): SSSSKAPPPSLP.

[0171] Numa modalidade, o CTP truncada compreende os primeiros 10 aminoácidos de SEQ ID NO: 4 Em outra modalidade, a SEQ ID NO: 4 compreende a seguinte sequência de aminoácidos (AA): SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.

[0172] Numa modalidade, o CTP truncada compreende os primeiros 11 aminoácidos de SEQ ID NO: 4 Numa modalidade, o CTP truncada compreende os primeiros 12 aminoácidos de SEQ ID NO: 4 Numa modalidade, o CTP truncado compreende os primeiros oito aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 3 Numa modalidade, o CTP truncada compreende os primeiros 13 aminoácidos de SEQ ID NO: 4 Numa modalidade, o CTP truncada compreende os primeiros 14 aminoácidos de SEQ ID NO: 4 Numa modalidade, o CTP truncada compreende os primeiros 6 aminoácidos da ID SEQ NO: 4 ou SEQ ID NO: 3 Numa modalidade, o CTP truncada compreende os primeiros cinco aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 3.

[0173] Numa modalidade, pelo menos uma das sequências de aminoácidos gonadotrofina coriônica CTP é glicosilada. Numa outra modalidade, tanto as sequências de ácidos CTP amino gonadotrofina coriônica são glicosiladas. Numa outra modalidade, duas das sequências de ácido CTP amino gonadotrofina coriônica são glicosiladas. Numa outra modalidade, três das sequências de ácido CTP amino gonadotrofina coriônica são glicosiladas. Numa outra modalidade, quatro das sequências de ácido CTP amino gonadotrofina coriônica são glicosiladas. Numa outra modalidade, 5 das sequências de ácido CTP amino gonadotrofina coriônica são glicosiladas. Numa outra modalidade, duas ou mais das sequências de ácido CTP amino gonadotrofina coriônica são glicosiladas. Numa outra modalidade, todas as sequências de ácidos CTP amino gonadotrofina coriônica são glicosiladas.

[0174] Numa modalidade, a sequência de CTP da presente invenção compreende pelo menos um local de glicosilação. Numa modalidade, a sequência de CTP da presente invenção compreende dois locais de glicosilação. Numa modalidade, a sequência de CTP a presente invenção compreende três locais de glicosilação. Numa modalidade, a sequência de CTP a presente invenção compreende quatro locais de glicosilação. Numa modalidade, uma ou mais das sequências de aminoácidos gonadotrofina coriônica CTP está totalmente glicosilada. Numa outra modalidade, uma ou mais das sequências de aminoácidos gonadotrofina coriônica CTP está parcialmente glicosilada. Numa modalidade, parcialmente glicosiladas indica que um dos locais de glicosilação CTP é glicosilada. Numa outra modalidade, dois dos locais de glicosilação CTP são glicosiladas. Numa outra modalidade, três dos locais de glicosilação CTP são glicosiladas.

[0175] Em algumas modalidades, a modificação da sequência de CTP é vantajoso em que permite a utilização de dosagens mais baixas. Em algumas modalidades, a modificação de sequências de CTP é vantajosa ao permitir dosagens menos. Em algumas modalidades, as sequências de modificação de CTP é vantajosa ao permitir um efeito seguro, de ação prolongada.

[0176] Em algumas modalidades, "polipeptídeo", "fator de coagulação de engenharia", ou "proteína", tal como aqui usado engloba polipeptídeos nativos (quer os produtos de degradação, polipeptídeos sintetizados por via sintética ou polipeptídeos recombinantes) e pepeptídeomiméticos (tipicamente, polipeptídeos sintetizados por via sintética), como bem como peptoides e semipeptoides que são análogos polipeptídicos, que têm, em algumas modalidades, modificações que tornem os polipeptídeos que compreendem um fator de coagulação, mesmo mais estável enquanto em um órgão ou mais capazes de penetrar nas células.

[0177] Em algumas modalidades, modificações incluem, mas estão limitados a modificação terminal C, polipeptídeo modificação ligação, incluindo, mas não limitado a,-CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2- O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH ou CF=CH, modificações, e modificação da espinha dorsal resíduo. Os métodos para a preparação de compostos peptídicos são bem conhecidos na técnica e são especificados, por exemplo, em Quantitative Drug Design, CA Ramsden Gd., Capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992), que é incorporado por referência como se fosse completamente apresentada aqui. Mais detalhes a este respeito são fornecidos aqui a seguir.

[0178] Em algumas modalidades, as ligações polipeptídicas (CO-NH) dentro do polipeptídeo são substituídos. Em algumas modalidades, as ligações de polipeptídeos são substituídos por ligações N- metilados (-N(CH3)-CO-). Em algumas modalidades, as ligações de polipeptídeos são substituídos por ligações éster (-C(R)HCOOC(R)-N-). Em algumas modalidades, as ligações de polipeptídeos são substituídos por ligações cetometileno (CO-CH2). Em algumas modalidades, as ligações de polipeptídeos são substituídos por títulos -aza (-NH-N(R)-CO-), em que R é qualquer grupo alquilo, ex., metilo, ligações carba (-CH2-NH-). Em algumas modalidades, as ligações de polipeptídeos são substituídos por ligações hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-). Em algumas modalidades, as ligações de polipeptídeos são substituídos por ligações tioamida (-CS-NH). Em algumas modalidades, as ligações de polipeptídeos são substituídos por ligações duplas olefínicas (CH=CH). Em algumas modalidades, as ligações de polipeptídeos são substituídos por retro ligações amida (-NH-CO). Em algumas modalidades, as ligações de polipeptídeos são substituídos por derivados polipeptídicos (-N(R)-CH2-CO), em que R é a cadeia lateral do "normal", naturalmente apresentados no átomo de carbono. Em algumas modalidades, estas modificações ocorrem em qualquer uma das ligações ao longo da cadeia polipeptídica e em uma modalidade em várias (2-3 ligações), ao mesmo tempo.

[0179] Em algumas modalidades, os aminoácidos aromáticos naturais do polipeptídeo, tais como Trp, Tir e Fen, são substituídos por ácido não natural sintético, tais como fenilglicina, TIC, naftilalanina (Nol), RING- derivados metilados de Phe, derivados halogenados de Phe ou o- metil-Tir. Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção incluem um ou mais aminoácidos modificados ou de um ou mais monómeros de ácido não-amino (por exemplo, ácidos gordos, hidratos de carbono complexos, etc.).

[0180] Numa modalidade, "aminoácido" ou "sequência de aminoácidos" é entendida para incluir a ocorrência natural de 20 aminoácidos; os aminoácidos frequentemente modificados pós- translacionalmente in vivo, incluindo, por exemplo, hidroxiprolina, fosfosserina e fosfotreonina; e outro aminoácido invulgar, incluindo, mas não limitado a, o ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, norvalina, leucina e nor-ornitina. Numa modalidade, "aminoácido" inclui ambos D e L-aminoácidos.

[0181] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção são utilizados em terapêutica, a qual requer que os polipeptídeos que compreendem um fator de coagulação para estar numa forma solúvel. Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção incluem um ou mais não-naturais ou amino ácido natural polar, incluindo mas não se limitando a serina e treonina, que são capazes de aumentar a solubilidade do polipeptídeo, devido à sua cadeia lateral contendo hidroxilo.

[0182] Em algumas modalidades, o fator de coagulação engenharia da presente invenção é utilizado em uma forma linear, embora possa ser apreciado por um perito na técnica que, em casos em que não ciclicização severamente interferir com a coagulação por engenharia fatores características, formas cíclicas dos fatores de coagulação modificadas podem também ser utilizados.

[0183] Em algumas formas de realização, os fatores de coagulação por engenharia da presente invenção são sintetizados bioquimicamente por exemplo, usando técnicas de fase sólida padrão. Em algumas modalidades, estes métodos bioquímicos incluem síntese exclusiva em fase sólida, síntese em fase sólida parcial, condensação de fragmentos, ou síntese em solução clássica.

[0184] Em algumas modalidades, as técnicas de proteínas recombinantes são utilizadas para gerar os fatores de coagulação modificadas da presente invenção. Em algumas modalidades, as técnicas de proteínas recombinantes são utilizadas para a geração de polipeptídeos relativamente grandes (por exemplo, mais do que 18-25 aminoácidos). Em algumas modalidades, as técnicas de proteínas recombinantes são utilizadas para a geração de grandes quantidades de fatores de coagulação por engenharia da presente invenção. Em algumas modalidades, as técnicas recombinantes são descritas por Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153: 516-544, Studier et al. (1990) Methods in Enzymol.185: 6089, Brisson et al. (1984) Nature 310: 511-514, Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6: 307-311, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680 e Brogli et al, (1984) Science 224:. 838-843, Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 559-565 e Weissbach e Weissbach, 1988, Methods de Plant Molecular Biology, Academic Press, Nova Iorque, Seção VIII, págs. 421-463, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[0185] Numa outra modalidade, a invenção proporciona uma molécula polinucleotídica compreendendo a parte codificante de um gene que codifica um polipeptídeo compreendendo um fator de coagulação e peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofina ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação, tal como descrito acima. Numa outra modalidade, a invenção proporciona uma molécula de polinucleotídeo que consiste da porção de codificação de um gene que codifica um polipeptídeo compreendendo um fator de coagulação e peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofina ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação, tal como descrito acima. Numa outra modalidade, a invenção proporciona uma molécula de polinucleotídeo consistindo essencialmente na parte codificante de um gene que codifica um polipeptídeo compreendendo um fator de coagulação e peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofina ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação, tal como descrito acima.

[0186] Numa outra modalidade, a invenção proporciona um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e gonadotrofina três peptídeos carboxi-terminais ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação, tal como descrito acima. Numa outra modalidade, a invenção fornece um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que consiste de um fator de coagulação e três peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofina ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação, tal como descrito acima. Numa outra modalidade, a invenção fornece um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que consiste essencialmente de um fator de coagulação e três peptídeos carboxi- terminais de gonadotrofina ligados ao carboxi-terminal do fator de coagulação, tal como descrito acima. Numa modalidade, o polinucleotídeo é uma sequência polinucleotídica. Numa modalidade, o polinucleotídeo é uma molécula de polinucleotídeo.

[0187] Numa outra modalidade, a invenção proporciona um vetor de expressão compreendendo uma molécula de polinucleotídeo como aqui descrito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado por CTP que consiste de um Polipeptídeo Fator IX (FIX) e três peptídeos carboxi-terminais da gonadotropina (CTPs) ligados ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado por CTP que consiste de um polipeptídeo de Fator VIIa (FVIIa) e três peptídeos carboxi- terminais da gonadotropina (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVIIa.

[0188] Numa outra modalidade, a invenção proporciona uma célula compreendendo o vetor de expressão, tal como aqui descrito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona uma célula compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado por CTP que consiste de um Polipeptídeo Fator IX (FIX) e três peptídeos carboxi- terminais da gonadotropina (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona uma célula compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado por CTP que consiste de um Fator Vila (FVIIa) e polipeptídeo três peptídeos carboxi- terminais da gonadotropina (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVIIa.

[0189] Numa outra modalidade, a invenção proporciona uma composição que compreende o vetor de expressão, tal como aqui descrito. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado por CTP que consiste de um Polipeptídeo Fator IX (FIX) e três peptídeos carboxi- terminais da gonadotropina (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo modificado por CTP que consiste de um Fator Vila (FVIIa) e polipeptídeo três peptídeos carboxi- terminais da gonadotropina (CTPs) ligado ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVIIa.

[0190] Numa outra modalidade, a invenção proporciona uma composição compreendendo a célula, tal como aqui descrito. Numa outra modalidade, a célula é uma célula eucariótica. Numa outra modalidade, a célula é uma célula procariótica.

[0191] Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de produção de um fator de coagulação modificado por CTP, compreendendo a etapa de fixação 9:59 gonadotrofina coriônica peptídeos carboxi-terminais (CTPs) ao carboxi-terminal do referido fator de coagulação, produzindo, assim, um modificado por CTP fator de coagulação. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de produção de um fator de coagulação modificado por CTP, compreendendo o passo de fixação 9:59 sequências polinucleotídicas que codificam para um peptídeo da gonadotrofina coriônica carboxi-terminal (CTP) ao carboxi-terminal de uma sequência de polinucleotídeo que codifica disse fator de coagulação, produzindo, assim, um fator de coagulação modificado por CTP. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de produção de uma versão polipeptídeo Fator IX (FIX) modificado por CTP, compreendendo o passo de fixação de três peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FIX, produzindo, assim, uma polipeptídeo FIX modificado por CTP. Numa outra modalidade, a presente invenção proporciona um método de produção de um polipeptídeo modificado por CTP Fator VIIa (FVIIa), que compreende o passo de fixação de três peptídeos carboxi-terminais de gonadotrofinas coriônicas (CTPs) ao carboxi-terminal do referido polipeptídeo FVIIa, produzindo, assim, uma CTP polipeptídeo modificado por FVIIa.

[0192] Numa outra modalidade, os fatores de coagulação por engenharia da presente invenção são sintetizados utilizando uma molécula de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Em algumas modalidades, a molécula de polinucleotídeo que codifica para os fatores de coagulação por engenharia da presente invenção é ligado num vetor de expressão, que compreende um controle de transcrição de uma sequência reguladora cis-(por exemplo, sequência de promotor). Em algumas modalidades, a sequência reguladora cis- é apropriada para dirigir a expressão constitutiva de um fator de coagulação de engenharia da presente invenção. Em algumas modalidades, a sequência reguladora cis- é apropriada para dirigir a expressão específica de tecido dos fatores de coagulação modificadas da presente invenção. Em algumas modalidades, a sequência reguladora cis- é apropriada para dirigir a expressão induzível de engenharia dos fatores de coagulação da presente invenção.

[0193] Em algumas modalidades, os promotores específicos de tecidos adequados para utilização com a presente invenção incluem sequências que são funcionais em uma ou mais populações de células específicas. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, promotores, tais como a albumina, que é específico do fígado [Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1: 268-277], promotores específicos de linfoides [Calame et al, (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275]; em promotores particulares de receptores de células T [Winoto et al, (1989) EMBO J. 8: 729- 733] e imunoglobulinas; [Banerji et al. (1983) Cell 33729-740], promotores específicos de neurónios tal como o promotor do neurofilamento [Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 86: 5473-5477], promotores específicos do pâncreas [Edlunch et al. (1985) Science 230: 912-916] ou promotores específicos das glândulas mamarias, tais como o promotor de soro de leite (Patente dos EUA No. 4.873.316 e Pedido de Patente Europeia Publicação No. 264166.). Os promotores indutíveis adequados para utilização com a presente invenção incluem, por exemplo, o promotor induzível por tetraciclina (Srour, MA, et ai, 2003, Thromb Haemost 90: 398-405).

[0194] Numa modalidade, a frase "uma molécula de polinucleotídeo" refere-se a uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples ou dupla, que é isolado e fornecida sob a forma de uma sequência de RNA, uma sequência polinucleotídica complementar (cDNA), uma sequência de polinucleotídeo genômica e/ou de sequências polinucleotídicas compostos (por exemplo, uma combinação do acima).

[0195] Numa modalidade, uma "sequência polinucleotídica complementar" refere-se a uma sequência, que resulta da transcrição inversa do RNA mensageiro utilizando uma transcriptase reversa, ou qualquer outro RNA polimerase dependente de ADN. Numa modalidade, a sequência pode ser subsequentemente amplificada in vivo ou in vitro utilizando uma polimerase de ADN.

[0196] Numa modalidade, uma "sequência de polinucleotídeo genômica" refere-se a uma sequência derivada (isolados) a partir de um cromossoma e, assim, ela representa uma porção contígua de um cromossoma.

[0197] Numa modalidade, uma "sequência polinucleotídica composto" refere-se a uma sequência que é pelo menos parcialmente complementar e, pelo menos, parcialmente genômica. Numa modalidade, uma sequência composta podem incluir algumas sequências exonal necessários para codificar o polipeptídeo da presente invenção, bem como algumas sequências intrônicas de interposição entre as mesmas. Numa modalidade, as sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, incluindo a de outros genes e, normalmente, incluem sequências de sinal de splicing conservadas. Numa modalidade, as sequências intrônicas que atuam em cis incluem elementos reguladores de expressão.

[0198] Numa modalidade, após a expressão e secreção, os peptídeos de sinal são clivadas a partir dos precursores de fatores de coagulação resultantes engenharia nos fatores de coagulação maduros modificadas.

[0199] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos da presente invenção são preparados utilizando técnicas de PCR, ou qualquer outro método ou processo conhecido para um perito na técnica. Em algumas modalidades, o procedimento envolve a ligação de duas sequências diferentes de DNA (ver, por exemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992).

[0200] Numa modalidade, os polinucleotídeos da presente invenção, que codificam os fatores de coagulação modificadas são inseridos em vetores de expressão (isto é, uma construção de ácido nucleico), para permitir a expressão do polipeptídeo recombinante. Numa modalidade, o vetor de expressão da presente invenção inclui sequências adicionais que tornam este vetor adequado para a replicação e integração em procariontes. Numa modalidade, o vetor de expressão da presente invenção inclui sequências adicionais que tornam este vetor adequado para a replicação e integração em eucariotas. Numa modalidade, o vetor de expressão da presente invenção inclui um vetor de transporte que torna este vetor adequado para a replicação e integração em procariontes e eucariontes. Em algumas modalidades, os vetores de clonagem compreendem sequências de iniciação da transcrição e da tradução (por exemplo, promotores, aumenta) e os terminadores de transcrição e de tradução (por exemplo, sinais de poliadenilação).

[0201] Numa modalidade, uma variedade de células procarióticas ou eucarióticas podem ser utilizadas como sistemas de hospedeiro de expressão para expressar os fatores de coagulação da presente invenção. Em algumas modalidades, estes incluem, mas não estão limitados a, microrganismos, tais como bactérias transformadas com um ADN recombinante de bacteriófagos, ADN plasmídico ou ADN cosmídico vetor de expressão contendo a sequência de codificação de polipeptídeo; levedura transformada com vetores de expressão de levedura recombinante contendo a sequência de codificação de polipeptídeo; sistemas de células vegetais infectadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão de plasmídeos recombinantes, tais como o plasmídeo Ti, contendo a sequência de codificação de polipeptídeo.

[0202] Em algumas modalidades, os sistemas de expressão bacterianos não são utilizados (por exemplo, sistemas de expressão de mamíferos, tais como células CHO) para expressar os fatores de coagulação da presente invenção. Numa modalidade, o vetor de expressão utilizado para expressar os polinucleotídeos da presente invenção em células de mamíferos é vetor pCI-DHFR que compreende um promotor de CMV e um gene de resistência à neomicina. Construção do vetor pCI-dhfr é descrito, de acordo com uma modalidade, no Exemplo 1.

[0203] Em algumas modalidades, em sistemas bacterianos da presente invenção, um número de vetores de expressão pode ser vantajosamente selecionado dependendo da utilização pretendida para o polipeptídeo expresso. Numa modalidade, as grandes quantidades de polipeptídeo são desejados. Numa modalidade, os vetores que dirigem a expressão de elevados níveis do produto de proteína, possivelmente como uma fusão com uma sequência de sinal hidrofóbica, que dirige o produto expressa para o periplasma das bactérias ou o meio de cultura em que o produto da proteína é prontamente purificado são desejados. Numa modalidade, determinadas proteínas de fusão são concebidos com um sítio de clivagem específico para ajudar na recuperação do polipeptídeo. Numa modalidade, os vetores adaptáveis para tal manipulação incluem, mas não estão limitados a, a série pET de vetores de expressão de E. coli [Studier et al., Methods in Enzymol. 185: 60-89 (1990)].

[0204] Numa modalidade, são usados sistemas de expressão de levedura. Numa modalidade, um número de vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis podem ser usados em levedura tal como descrito na Pat. Aplicação. No: 5.932.447, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Numa outra modalidade, os vetores que promovem a integração de sequências de ADN estranho no cromossoma de levedura são utilizados.

[0205]Numa modalidade, o vetor de expressão da presente invenção pode ainda incluir sequências de polinucleotídeos complementares, que permitem, por exemplo, a tradução de várias proteínas de um único mRNA, tais como um local de entrada de ribossoma interno (IRES) e sequências para integração genômica o promotor de polipeptídeo quimérico.

[0206] Em algumas modalidades, os vetores de expressão de mamíferos incluem, mas não estão limitados a, pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pGL3, pZeoSV2 (+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, que estão disponíveis a partir de Invitrogen, pCI que está disponível na Promega, PMBAC, pPbac, pBK-RSV e pBK-CMV que estão disponíveis a partir de Stratagene, pTRES que está disponível a partir de Clontech, e seus derivados.

[0207] Em algumas modalidades, os vetores de expressão contendo elementos reguladores de vírus eucariotas, tais como os retrovírus são utilizados na presente invenção. Vetores SV40 incluem pSVT7 e pMT2. Em algumas modalidades, os vetores derivados do vírus de papiloma bovino incluem PBV-1MTHA, e vetores derivados de vírus Epstein Bar incluem pHEBo, e P2O5. Outros exemplos de vetores incluem pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, baculovírus pDSVE e qualquer outro vetor que permita a expressão de proteínas sob a direção do SV-40 promotor inicial de SV-40 promotor mais tarde, promotor de metalotioneína, murina promotor do vírus do tumor mamário, o vírus do sarcoma de Rous promotor, promotor da poliedrina ou outros promotores eficazes para a expressão mostrada em células eucarióticas.

[0208] Em algumas modalidades, os vetores virais recombinantes são úteis para a expressão in vivo dos fatores de coagulação da presente invenção, uma vez que oferecem vantagens tais como a infecção lateral e especificidade de alvo. Numa modalidade, a infecção lateral é inerente ao ciclo de vida de, por exemplo, um retrovírus, e é o processo pelo qual uma célula infectada produz muitos vírions de progenia que brotam e infectam as células vizinhas. Numa modalidade, o resultado é que uma grande área se torna rapidamente infectada, a maioria das quais não foi inicialmente infectada pelas partículas virais originais. Numa modalidade, os vetores virais que são produzidos não são capazes de se espalhar lateralmente. Numa modalidade, esta característica pode ser útil se o efeito pretendido é o de introduzir um gene específico em apenas um número localizado de células-alvo.

[0209] Numa modalidade, vários métodos podem ser utilizados para introduzir o vetor de expressão da presente invenção às células. Tais métodos são geralmente descritos em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nova Iorque (1989, 1992), em Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1989), Chang et al, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Michigan (1995), Vega et al, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Michigan (1995), vetores: um levantamento Clonagem Molecular de Vetores e seus usos, Butterworths, Boston Mass. (1988) e Gilboa et al. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986], e incluem, por exemplo, transfeção estável ou transiente, lipofeção, electroporação e infecção com vetores virais recombinantes. Além disso, veja-se Pat. N° 5.464.764 e 5.487.992, aqui incorporada por referência, para os métodos de seleção positiva- negativa.

[0210] Em algumas modalidades, a introdução do ácido nucleico por uma infecção viral oferece várias vantagens sobre outros métodos, tais como lipofecção e electroporação, uma vez que uma maior eficiência da transfecção pode ser obtida devido ao carácter infecioso do vírus.

[0211] Numa modalidade, deve notar-se que os fatores de coagulação por engenharia da presente invenção também podem ser expressos a partir de uma construção de ácido nucleico administrado ao sujeito empregando qualquer modo adequado de administração, descrito acima (ou seja, em terapia gênica in vivo). Numa modalidade, a construção de ácido nucleico é introduzida numa célula adequada através de um veículo de entrega de genes e/ou método apropriado (de transfecção, transdução, recombinação homóloga, etc.) e um sistema de expressão, conforme necessário e em seguida, as células modificadas são expandidas em cultura e devolvido para o sujeito (isto é, a terapia gênica ex vivo).

[0212] Numa modalidade, os vetores de expressão de plantas são usados. Numa modalidade, a expressão de uma sequência de codificação de polipeptídeo é acionado por um número de promotores. Em algumas modalidades, os promotores virais tais como os promotores 35S RNA e 19S RNA de CaMV [Brisson et al, Nature 310: 511-514 (1984)], ou o promotor da proteína de revestimento de TMV [Okayama et al, EMBO J. 6: 307-311 (1987)] são utilizados. Numa outra modalidade, os promotores de plantas são usados, tais como, por exemplo, a subunidade pequena de RUBISCO [Coruzzi et ai, EMBO J. 3: 1671-1680 (1984); Brogli e et ai, Science 224: 838-843 (1984)] ou os promotores de choque de calor, por exemplo, soja, hsp17.5-E ou hsp17.3-B [Gurley et ai, Mol. Cell. Biol. 6: 559565 (1986)]. Numa modalidade, as construções são introduzidas em células de plantas utilizando o plasmídeo Ti, plasmídeo Ri, vetores virais de plantas, transformação direta de ADN, microinjeção, electroporação e outras técnicas bem conhecidas dos peritos na técnica. Veja, por exemplo, Weissbach e Weissbach [Métodos de Biologia Molecular de Plantas, Academic Press, NY, Seção VIII, pp 421-463 (1988)]. Outros sistemas de expressão, tais como insetos e sistemas de células hospedeiras de mamífero, que são bem conhecidos na técnica, também podem ser utilizados na presente invenção.

[0213] Deve notar-se que exceto contendo os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência de codificação inserida (que codifica o polipeptídeo), a construção da presente invenção também pode incluir sequências concebidas para otimizar a estabilidade, a produção, purificação de expressão, rendimento ou a atividade do polipeptídeo expresso.

[0214] Em algumas modalidades, as células transformadas são cultivadas em condições eficazes que permitam a expressão de grandes quantidades de fatores de coagulação por engenharia recombinante. Em algumas modalidades, as condições de cultura eficazes incluem, mas não estão limitados a, meios eficazes, biorreator, temperatura, pH e condições de oxigénio que permitam a produção da proteína. Numa modalidade, um meio eficaz refere-se a qualquer meio pelo qual uma célula é cultivada para produzir o polipeptídeo recombinante da presente invenção. Em algumas modalidades, um meio inclui tipicamente uma solução aquosa, tendo de carbono, azoto e fosfato, fontes assimiláveis e sais apropriados, minerais, metais e outros nutrientes, tais como vitaminas. Em algumas modalidades, as células da presente invenção podem ser cultivadas em biorreatores de fermentação convencionais, balões de agitação, tubos de ensaio, placas de microtitulação e as placas de petri. Em algumas modalidades, a cultura é realizada a um teor de temperatura, pH e oxigénio adequado para uma célula recombinante. Em algumas modalidades, a determinação de condições de cultura está dentro da perícia de um vulgar perito na técnica.

[0215] Em algumas modalidades, dependendo do sistema de vetor e hospedeiro utilizado para a produção, fatores de coagulação resultantes projetados da presente invenção, quer permanecem dentro da célula recombinante, são secretados para o meio de fermentação, são secretados para um espaço entre as duas membranas celulares, tais como o espaço periplasmático de E. coli; ou são retidas sobre a superfície externa de uma membrana celular ou viral.

[0216] Numa modalidade, após um tempo pré-determinado, em cultura, a recuperação do fator de coagulação recombinante concebida é efetuada.

[0217]Numa modalidade, a frase "a recuperação do fator de coagulação recombinante concebida" aqui utilizado refere-se a recolha de todo o meio de fermentação contendo o polipeptídeo e não implica necessariamente passos adicionais de separação ou purificação.

[0218] Numa modalidade, os fatores de coagulação por engenharia da presente invenção são purificados utilizando uma variedade de técnicas de purificação de proteínas convencionais, tais como, mas não se limitando a, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iónica, filtração, eletroforese, cromatografia de interação hidrófoba, filtração em gel cromatografia, cromatografia de fase reversa, cromatografia em concanavalina A, cromatofocagem e solubilização diferencial.

[0219] Numa modalidade, para facilitar a recuperação, a sequência de codificação de expresso pode ser manipulada para codificar o fator de coagulação engenharia da presente invenção e porção clivável fundido. Numa modalidade, uma proteína de fusão pode ser concebida de modo a que o polipeptídeo pode ser facilmente isolado por cromatografia de afinidade; por exemplo, por imobilização sobre uma coluna específica para a porção quebrável. Numa modalidade, um local de clivagem é desenvolvido entre o fator de coagulação engenharia e a porção quebrável e o polipeptídeo pode ser libertado a partir da coluna cromatográfica através de tratamento com uma enzima ou um agente adequado que cliva especificamente a proteína de fusão neste local [por exemplo, ver Booth et ai. Immunol. Lett. 19: 65-70 (1988); e Gardella et al., J. Biol. Chem. 265: 15854-15859 (1990)].

[0220] Numa modalidade, o fator de coagulação engenharia da presente invenção são recuperados em forma "substancialmente pura".

[0221] Numa modalidade, a frase "substancialmente puro" refere-se a uma pureza que permite a utilização eficaz da proteína nas aplicações aqui descritas.

[0222] Numa modalidade, o fator de coagulação engenharia da presente invenção podem também ser sintetizados utilizando sistemas de expressão in vitro. Numa modalidade, métodos de síntese in vitro são bem conhecidos na técnica e os componentes do sistema estão comercialmente disponíveis.

[0223] Em algumas formas de realização, os fatores de coagulação recombinante engenharia são sintetizados e purificados; a sua eficácia terapêutica pode ser avaliada in vivo ou in vitro. Numa modalidade, as atividades de ligação dos fatores de coagulação engenharia recombinante da presente invenção pode ser determinada utilizando vários ensaios, como é conhecido para um perito na técnica.

[0224] Numa outra modalidade, o fator de coagulação engenharia da presente invenção pode ser fornecida ao sujeito, por si só. Numa modalidade, o fator de coagulação engenharia da presente invenção pode ser fornecida ao sujeito como parte de uma composição farmacêutica, onde é misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0225] Numa outra modalidade, uma "composição farmacêutica" refere-se a uma preparação de um ou mais dos ingredientes ativos aqui descritos com outros componentes químicos, tais como veículos e excipientes fisiologicamente adequados. O efeito de uma composição farmacêutica é para facilitar a administração de um composto a um organismo.

[0226] Numa outra modalidade, "ingrediente ativo" refere-se à sequência do polipeptídeo de interesse, o qual é responsável pelo efeito biológico.

[0227] Numa outra modalidade, qualquer das composições da presente invenção irão incluir pelo menos uma sequência de CTP ligado apenas ao carboxi-terminal de um fator de coagulação de engenharia de interesse, em qualquer forma. Numa modalidade, a presente invenção proporciona preparações combinadas. Numa modalidade, "uma preparação combinada" define especialmente um "kit de partes" no sentido em que os parceiros de combinação como definido acima podem ser doseados independentemente ou por utilização de diferentes combinações fixas com quantidades distintas dos parceiros da combinação, ou seja, simultaneamente, concorrentemente, isoladamente ou em sequência. Em algumas modalidades, as partes do kit de partes podem então, por exemplo, ser administradas simultaneamente ou cronologicamente escalonadas, ou seja em diferentes pontos de tempo e com intervalos de tempo iguais ou diferentes para qualquer parte do kit de partes. A razão das quantidades totais dos parceiros de combinação, em algumas modalidades, pode ser administrada na preparação combinada. Numa modalidade, a preparação combinada pode ser variada, por exemplo, de modo a lidar com as necessidades de uma subpopulação de pacientes a ser tratada ou as necessidades do paciente individual, que as necessidades diferentes podem ser devidas a uma doença em particular, a gravidade de uma doença, idade, sexo, peso corporal, ou como pode ser facilmente feita por um perito na técnica.

[0228] Numa outra modalidade, as frases "transportador fisiologicamente aceitável" e "transportador farmaceuticamente aceitável", que são usados indiferentemente referem-se a um transportador ou um diluente que não provoca irritação significativa num organismo e não anula a atividade biológica e as propriedades dos o composto administrado. Um adjuvante é incluído nestas frases. Numa modalidade, um dos ingredientes incluídos no veículo farmaceuticamente aceitável pode ser, por exemplo, polietileno glicol (PEG), um polímero biocompatível com uma vasta gama de solubilidade em meios orgânicos e aquoso (Mutter et al. (1979)).

[0229] Numa outra modalidade, "excipiente" refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar ainda mais a administração de um ingrediente ativo. Numa modalidade, os excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietilenoglicóis.

[0230] As técnicas para a formulação e administração de drogas encontram-se em "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, edição mais recente, a qual é aqui incorporada por referência.

[0231] Diversas modalidades de gamas de dosagem são contempladas por esta invenção. A dosagem do fator de coagulação engenharia da presente invenção, numa modalidade, está na gama de 0,005-100 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 0,0055 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está no intervalo de 0,01-50 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 0,1-20 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 0,1-10 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 0,01-5 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 0,001-0,01 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 0,001-0,1 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 0,1-5 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 0,5-50 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 0,2-15 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 0,8-65 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 1-50 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 5-10 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 8-15 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem está numa gama de 10-20 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está no intervalo de 20-40 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem é em um intervalo de 60-120 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está no intervalo de 12-40 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está no intervalo de 40-60 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem está numa gama de 50-100 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem está numa gama de 1-60 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está no intervalo de 15-25 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está na gama de 5-10 mg/dia. Numa outra modalidade, a dose está no intervalo de 55-65 mg/dia.

[0232] Numa outra modalidade, a dosagem é em um intervalo de 50-500 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem é em um intervalo de 50-150 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem está numa gama de 100-200 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem está numa gama de 150-250 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem está numa gama de 200-300 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem está numa gama de 250-400 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem está numa gama de 300-500 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem está numa gama de 350-500 mg/dia.

[0233] Numa modalidade, a dosagem é de 20 mg/dia. Numa modalidade, a dosagem é de 30 mg/dia. Numa modalidade, a dosagem é de 40 mg/dia. Numa modalidade, a dosagem é de 50 mg/dia. Numa modalidade, a dosagem é de 0,01 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem é de 0,1 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem é de 1 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem é de 0,530 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem é de 0,05 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem é de 50 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem é de 10 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem é de 20-70 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem é de 5 mg/dia.

[0234] Numa modalidade, a dose do fator de coagulação modificado por CTP é de 1-5 mg/dia. Numa modalidade, a dosagem do fator de coagulação modificado por CTP é de 1-3 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem do fator de coagulação modificado por CTP é de 2 mg/dia.

[0235] Numa outra modalidade, a dosagem é de 1-90 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem é de 1-90 mg/2 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 1-90 mg/3 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 1-90 mg/4 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 190 mg/5 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 1-90 mg/6 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 1-90 mg/semana. Numa outra modalidade, a dosagem é de 1-90 mg/9 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 1-90 mg/11 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 1-90 mg/14 dias.

[0236] Numa outra modalidade, a dose de fator de coagulação é de 10-50 mg/dia. Numa outra modalidade, a dosagem é de 10-50 mg/2 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 10-50 mg/3 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 10-50 mg/4 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 10-50 microgramas mg/5 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 10-50 mg/6 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 10-50 mg/semana. Numa outra modalidade, a dosagem é de 10-50 mg/9 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 10-50 mg/11 dias. Numa outra modalidade, a dosagem é de 10-50 mg/14 dias.

[0237] Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é formulado numa forma de dosagem intranasal. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é formulado numa forma de dosagem injetável. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose variando entre 0,0001 mg a 0,6 mg. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose que varia de 0,001 mg a 0.005 mg. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose que varia de 0,005 mg a 0,01 mg. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose variando entre 0,01 mg e 0,3 mg. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose em uma dose que varia de 0,2 mg a 0,6 mg. Numa outra modalidade, o fator de coagulação é livre de CTPs no seu terminal amino.

[0238] Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose que varia de 1-100 microgramas. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose variando 10-80 microgramas. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose variando 20-60 microgramas. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose variando 10-50 microgramas. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose variando 40-80 microgramas. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose variando 10-30 microgramas. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose variando 30-60 microgramas.

[0239] Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose que varia de 0,2 mg a 2 mg. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose variando entre 2 mg e 6 mg. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose que varia de 4 mg a 10 mg. Numa outra modalidade, um polipeptídeo que compreende o fator de coagulação e, pelo menos, uma unidade de CTP é administrado a um sujeito numa dose que varia entre 5 mg e 15 mg.

[0240] Numa modalidade, a dosagem do FIX modificado por CTP compreende 50% da quantidade de FIX administrados na dosagem recomendada de FIX recombinante (por exemplo, Benefix®, Wyeth ou Mononine®, CSL Behring) para pacientes ao longo do mesmo período de tempo. Numa modalidade, a dosagem da CTP-FVIIa modificado compreende 50% da quantidade de FVIIa administrados na dosagem recomendada de FVIIa recombinante (por exemplo, NovoSeven) para os pacientes durante o mesmo período de tempo. Numa modalidade, a dosagem do FVII CTP-modificada compreende 50% da quantidade de FVII administrados na dosagem recomendada de FVII recombinante para pacientes durante o mesmo período de tempo. Por exemplo, se NovoSeven é administrado numa dose de 90 mcg/kg de duas em duas horas, para um paciente pré- ou pós-operatório (por exemplo, 7,65 mg a cada duas horas ou 45,9 mg em seis doses ao longo de um período de 12 horas, para uma 85 paciente kg), um fator de coagulação modificado por CTP da presente invenção pode ser administrada numa dose que é 50% da dose de 12 horas o paciente de FVIIa recombinante (isto é, a uma dose de 23 mg administrada uma vez ao longo de um 12 período de uma hora).

[0241] Numa outra modalidade, a dose de fator de coagulação é modificada por CTP de modo a conter 45% de montante do fator de coagulação do que a administrada usando o fator de coagulação não- modificado por CTP. Numa outra modalidade, a dose de fator de coagulação é modificada por CTP de modo a conter 10% do valor do fator de coagulação do que a administrada usando o fator de coagulação não modificado por CTP. Numa outra modalidade, a dose de fator de coagulação é modificada por CTP de modo a conter 25% do valor do fator de coagulação do que a administrada usando o fator de coagulação não modificado por CTP. Numa outra modalidade, a dose de fator de coagulação é modificada por CTP de modo a conter 35% do valor do fator de coagulação do que a administrada usando o fator de coagulação não modificado por CTP. Numa outra modalidade, a dose de fator de coagulação é modificada por CTP de modo a conter 75% do valor do fator de coagulação do que a administrada usando o fator de coagulação não modificado por CTP. Numa outra modalidade, a dose de fator de coagulação é modificada por CTP de modo a conter 100% do valor do fator de coagulação do que a administrada usando o fator de coagulação não modificado por CTP. No entanto, mesmo se a dosagem contenha a mesma quantidade de fator de coagulação (por exemplo, FIX) como o fator de coagulação não-modificado por CTP, é ainda vantajoso em sujeitos que irá ser administrada menos frequentemente devido à sua meia-vida aumentada em relação aos fatores de coagulação recombinantes.

[0242] Em outra modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fator coagulante conjugado está entre 50-500 IU por kg do peso corporal administrado uma vez ao dia para uma vez por semana para FIX ou 10μg/Kg-500 μg/Kg para FVIIa. Em outra modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fator coagulante conjugado é de 150-250 IU por kg de peso corporal, administrado uma vez ao dia. Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreendendo um fator coagulante conjugado é formulado em uma força eficaz para administração por diversos meios para um paciente humano.

[0243] Em uma modalidade, FIX é administrado em uma quantidade eficaz para trazer a atividade do Fator IX circulante para 20-30 IU/dL em um sujeito. Em outra modalidade, FIX é administrado em uma quantidade eficaz para trazer atividade do Fator IX circulante para 25-50 IU/dL em um sujeito. Em outra modalidade, FIX é administrado em uma quantidade eficaz para trazer atividades do Fator IX circulante para 50-100 IU/dL em um sujeito. Em outra modalidade, FIX é administrado em uma quantidade eficaz para trazer atividade do Fator IX circulante para 100-200 IU/dL em um sujeito. Em outra modalidade, FIX é administrado em uma quantidade eficaz para trazer atividade do Fator IX circulante para 10-50 IU/dL em um sujeito. Em outra modalidade, FIX é administrado em uma quantidade eficaz para trazer atividades do Fator IX circulante para 20-100 IU/dL em um sujeito.

[0244] Em uma modalidade, o fator coagulante CTP modificado é administrado a um sujeito em uma base semanal. Em outra modalidade, o fator coagulante CTP modificado é administrado, a um sujeito, duas vezes por semana. Em outra modalidade, o fator coagulante CTP modificado é administrado a um sujeito numa base quinzenal (uma vez a cada duas semanas). Em outra modalidade, o fator coagulante CTP modificado é administrado, a um sujeito, duas vezes por mês. Em outra modalidade, o fator coagulante CTP modificado é administrado, a um sujeito, uma vez por mês. Em outra modalidade, o fator coagulante CTP modificado é administrado a um sujeito em uma base diária. Em outra modalidade, o fator coagulante CTP modificado é administrado a um sujeito a cada dois dias.

[0245] Em outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e pelo menos uma unidade CTP é administrado a um sujeito uma vez a cada três dias. Em outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e pelo menos uma unidade CTP é administrado a um sujeito uma vez a cada quatro dias. Em outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e pelo menos uma unidade CTP é administrado a um sujeito uma vez a cada cinco dias. Em outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e pelo menos uma unidade CTP é administrado a um sujeito uma vez a cada seis dias. Em outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e pelo menos uma unidade CTP é administrado a um sujeito uma vez a cada 7-14 dias. Em outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e pelo menos uma unidade CTP é administrado a um sujeito uma vez a cada 10-20 dias. Em outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e pelo menos uma unidade CTP é administrado a um sujeito uma vez a cada 5-15 dias. Em outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e pelo menos uma unidade CTP é administrado a um sujeito uma vez a cada 15-30 dias.

[0246] Em outra modalidade, os métodos da invenção incluem aumentar a conformidade na utilização da terapia do fator coagulante, compreendendo o fornecimento a um sujeito em necessidade dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e pelo menos um peptídeo de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTP) anexado ao terminal carbóxi do fator coagulante, aumentando assim a respeito do uso da terapia do fator coagulante.

[0247] Em outra modalidade, os métodos da invenção incluem o aumento da conformidade dos pacientes afligidos com doenças crônicas que necessitam de uma terapia do fator coagulante. Em outra modalidade, os métodos da invenção permitem a redução da frequência de dosagem do fator coagulante pela modificação do fator de coagulação com CTPs como descrito acima.

[0248] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de reduzir a frequência de dosagem de um polipeptídeo do Fator IX (FIX), compreendendo a etapa de anexação de três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) para o terminal carbóxi do referido polipeptídeo FIX, reduzindo a frequência de dosagem do referido polipeptídeo FIX. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de reduzir a frequência de dosagem de um polipeptídeo do Fator VII (FVIIa), compreendendo a etapa de anexação de três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) para o terminal carbóxi do referido polipeptídeo FVIIa, reduzindo a frequência de dosagem do referido polipeptídeo FVIIa.

[0249] Em outra modalidade, o cumprimento do prazo compreende aderência. Em outra modalidade, os métodos da invenção incluem o aumento da conformidade dos pacientes que necessitam de uma terapia do fator coagulante, reduzindo a frequência de administração do fator coagulante. Em outra modalidade, a redução da frequência da administração do fator coagulante é conseguida devido as modificações de CTP que tornam o fator coagulante CTP modificado mais estável. Em outra modalidade, a redução da frequência de administração do fator coagulante é alcançada como resultado do aumento de T % do fator coagulante. Em outra modalidade, a redução da frequência de administração do fator coagulante é obtida como resultado de aumentar o tempo de eliminação ou redução da taxa de eliminação do fator coagulante.

[0250] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de reduzir a taxa de eliminação de um polipeptídeo do Fator IX (FIX), compreendendo a etapa de anexação de três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) para o terminal carbóxi do referido polipeptídeo FIX, reduzindo a taxa de eliminação do referido polipeptídeo FIX. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de reduzir a taxa de eliminação de um polipeptídeo do Fator VII (FVIIa), compreendendo a etapa de anexação de três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) para o terminal carbóxi do referido polipeptídeo FVIIa, reduzindo a taxa de eliminação do referido polipeptídeo FVIIa.

[0251] Em outra modalidade, a redução da frequência de administração do fator coagulante é alcançada como resultado para aumentar a medida AUC do fator coagulante.

[0252] Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de reduzir a frequência de dosagem de fator coagulante, compreendendo a etapa de anexação de um a dez CTPs para o terminal carbóxi do fator coagulante, desse modo reduzindo a uma frequência de dosagem do fator coagulante. Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de reduzir a frequência de dosagem do fator coagulante, compreendendo a etapa de anexação de um a cinco CTPs para o terminal carbóxi do fator coagulante, desse modo reduzindo a uma frequência de dosagem do fator coagulante. Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de reduzir a frequência de dosagem de fator coagulante, compreendendo a etapa de anexação de 3 CTPs para terminal carbóxi do fator coagulante, desse modo reduzindo a uma frequência de dosagem do fator coagulante. Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de reduzir a frequência de dosagem de fator coagulante, compreendendo a etapa de anexação de cinco CTPs para terminal carbóxi do fator coagulante, desse modo reduzindo a uma frequência de dosagem do fator coagulante.

[0253] Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de aumentar a conformidade na utilização da terapia de fator coagulante, compreendendo o fornecimento a um sujeito na necessidade dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e de um a dez peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexados ao terminal carbóxi do fator coagulante, aumentando assim a respeito do uso da terapia do fator coagulante. Em outra modalidade, desde que aqui é um método de aumentar a conformidade na utilização da terapia do fator coagulante, compreendendo o fornecimento a um sujeito com necessidade dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e de um a cinco peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexado ao terminal carbóxi de um fator coagulante, aumentando assim a respeito do uso da terapia do fator coagulante. Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de aumentar a conformidade na utilização da terapia de fator coagulante, compreendendo o fornecimento a um sujeito na necessidade dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexados ao terminal carbóxi do fator coagulante, aumentando assim a respeito do uso da terapia do fator coagulante. Em outra modalidade, desde que aqui é um método de aumentar a conformidade na utilização da terapia do fator coagulante, compreendendo o fornecimento a um sujeito com necessidade dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e de três a cinco peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexada ao terminal carbóxi de um fator coagulante, aumentando assim a respeito do uso da terapia do fator coagulante.

[0254] Em outra modalidade, aqui fornecido é um método de prevenção ou tratamento de uma coagulação do sangue ou um distúrbio de coagulação em um sujeito, compreendendo o fornecimento do referido sujeito de um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e de um a dez peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexados ao terminal carbóxi de um fator coagulante, tratando desse modo uma coagulação sanguínea ou um distúrbio da coagulação no referido sujeito. Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de prevenção ou tratamento de uma coagulação sanguínea ou distúrbio de coagulação em um sujeito, compreendendo o fornecimento para um sujeito com necessidade dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator de coagulação e de um a cinco peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexados ao terminal carbóxi de um fator coagulante, assim, prevenindo ou tratando uma coagulação do sangue ou distúrbio de coagulação no referido sujeito. Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de prevenção ou tratamento de uma coagulação sanguínea ou um distúrbio de coagulação em um sujeito, compreendendo o fornecimento para um sujeito com necessidade dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexados ao terminal carbóxi de um fator coagulante, assim, prevenindo ou tratando uma coagulação sanguínea ou distúrbio de coagulação no referido sujeito. Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de prevenção ou tratamento de uma coagulação sanguínea ou distúrbio de coagulação em um sujeito, compreendendo o fornecimento para um sujeito com necessidade dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator de coagulação e de três a cinco peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexada ao terminal carbóxi de um fator coagulante, assim, prevenindo ou tratando uma coagulação do sangue ou distúrbio de coagulação no referido sujeito.

[0255] Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de prevenção da hemofilia em um sujeito, compreendendo o fornecimento aos referidos sujeitos um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e de um a dez peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexados ao terminal carbóxi de um fator coagulante, evitando assim a hemofilia no referido sujeito. Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de prevenção da hemofilia em um sujeito, compreendendo o fornecimento ao sujeito com necessidades dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e de um a cinco peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexados ao terminal carbóxi de um fator coagulante, evitando assim a hemofilia no referido sujeito. Em outra modalidade, desde fornecida aqui é um método de prevenção da hemofilia em um sujeito, compreendendo o fornecimento para um sujeito com necessidade dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexados ao terminal carbóxi de um fator coagulante, evitando assim a hemofilia no referido sujeito. Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de prevenção da hemofilia em um sujeito, compreendendo o fornecimento ao sujeito com necessidades dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e de três a cinco peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexada ao terminal carbóxi de um fator coagulante, evitando assim a hemofilia no referido sujeito.

[0256] Em outra modalidade, a presente invenção mostra que as composições aqui fornecidas são surpreendentemente mais eficazmente absorvidas pela corrente sanguínea após a administração SC (ver Exemplos de 7-9 neste documento). Para ser capaz de administrar por via subcutânea o FVIIa serve como uma vantagem pode ser usada para pedidos profiláticos. Injeções subcutâneas também são muito mais fáceis para que os pacientes se autoinjetarem e são vantajosos quando os pacientes são muito jovens, e suas veias são pequenas e difíceis de encontrar.

[0257] Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de tratamento da hemofilia em um sujeito, compreendendo o fornecimento aos referidos sujeitos um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e de um a dez peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexados ao terminal carbóxi de um fator coagulante, tratando assim a hemofilia no referido sujeito. Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de tratamento da hemofilia em um sujeito, compreendendo o fornecimento ao sujeito com necessidades dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e de um a cinco peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexados ao terminal carbóxi de um fator coagulante, tratando assim a hemofilia no referido sujeito. Em outra modalidade, desde fornecida aqui é um método de tratamento da hemofilia em um sujeito, compreendendo o fornecimento para um sujeito com necessidade dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexados ao terminal carbóxi de um fator coagulante, tratando assim a hemofilia no referido sujeito. Em outra modalidade, aqui apresentada é um método de tratamento da hemofilia em um sujeito, compreendendo o fornecimento ao sujeito com necessidades dos mesmos, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e de três a cinco peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica anexada ao terminal carbóxi de um fator coagulante, tratando assim a hemofilia no referido sujeito.

[0258] Administração oral, em uma modalidade, compreende uma forma de dosagem única compreendendo comprimidos, cápsulas, pastilhas, comprimidos mastigáveis, suspensões, emulsões e afins. Essas formas de dosagem única compreendem uma quantidade segura e eficaz do fator coagulante desejado da invenção, cada um deles está em uma modalidade, de 0,7 ou 3,5 mg de cerca de 280 mg/70 kg, ou em outra modalidade, cerca de 0,5 ou 10 mg de cerca de 210 mg/70 kg. As transportadoras farmaceuticamente aceitáveis adequadas para a preparação de formas de dosagens únicas para administração peroral são bem conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, comprimidos normalmente compreendem adjuvantes convencional farmaceuticamente compatível como diluentes inertes, tais como o carbonato de cálcio, carbonato de sódio, manitol, lactose e celulose; ligantes como amido, gelatina e sacarose; desintegrantes tais como amido, ácido algínico e croscarmelose; lubrificantes como estearato de magnésio, ácido esteárico e talco. Em uma modalidade, glidantes como o dióxido de silício pode ser usado para melhorar as características de fluxo da mistura de pó. Em uma modalidade, agentes de coloração, tais como o FD&C corantes, podem ser adicionados para aparência. Adoçantes e agentes flavorizantes, como aspartame, sacarina, mentol, hortelã-pimenta, e sabores de frutas, são adjuvantes úteis para comprimidos mastigáveis. Cápsulas normalmente compreendem um ou mais sólidos diluentes divulgados acima. Em algumas modalidades, a seleção de componentes da transportadora depende de considerações secundárias como gosto, custo e estabilidade de prateleira, que não são críticos para efeitos da presente invenção e podem ser facilmente feitos por uma pessoa versada na técnica.

[0259] Em uma modalidade, a forma de dosagem oral compreende o perfil predefinido de lançamento. Em uma modalidade, a forma de dosagem oral da presente invenção compreende um lançamento prolongado, comprimidos, cápsulas, pastilhas ou comprimidos mastigáveis. Em uma modalidade, a forma de dosagem oral da presente invenção compreende um lento lançamento de comprimidos, cápsulas, pastilhas ou comprimidos mastigáveis. Em uma modalidade, a forma de dosagem oral da presente invenção compreende um lançamento imediato de comprimidos, cápsulas, pastilhas ou comprimidos mastigáveis. Em uma modalidade, a forma de dosagem oral é formulada de acordo com o perfil desejado de lançamento do ingrediente farmacêutico ativo como conhecido de um versado na técnica.

[0260] Composições perorais, em algumas modalidades, compreendem soluções líquidas, emulsões, suspensões e afins. Em algumas modalidades, as transportadoras farmaceuticamente aceitável adequadas para preparação de tais composições são bem conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, composições líquidas orais compreendem de cerca de 0,001% para cerca de 0,933% do composto desejado ou compostos, ou em outra modalidade, de cerca de 0,01% para cerca de 10%.

[0261] Em algumas modalidades, as composições para uso nos métodos desta invenção compreendem soluções ou emulsões, que em algumas modalidades são soluções aquosas ou emulsões que compreendem uma quantidade segura e eficaz dos compostos da presente invenção e, opcionalmente, outros compostos, destinados a administração intranasal tópica. Em algumas modalidades, h composições compreendem de cerca de 0,001% para cerca de 10,0% p/v de um sujeito composto, mais de preferência de cerca de 00,1% para cerca de 2,0, que é usado para entrega sistêmica dos compostos pela via intranasal.

[0262] Em outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e pelo menos uma unidade CTP é injetado no músculo (injeção intramuscular). Em outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e pelo menos uma unidade CTP é injetado abaixo da pele (injeção subcutânea). Em outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um fator coagulante e pelo menos uma unidade CTP é injetado no músculo. Em outra modalidade, um polipeptídeo compreende um fator coagulante e pelo menos uma unidade CTP é injetado na pele. Em outra modalidade, um fator coagulante, como descrito neste documento é administrado através de administração sistêmica. Em outra modalidade, um fator coagulante, como descrito neste documento é administrado por injeção intravenosa. Em outra modalidade, administração pode ser parenteral, pulmonar, oral, tópica, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, transnasal, transmucoso intraocular, oftalmologia, peridural, bucal, retal, entrega intestinal ou parenteral, incluindo injeções da haste intramedular, bem como intratecal ou administração direta intraventricular.

[0263] Em outra modalidade, a preparação é administrada de forma local, ao invés de sistêmica, por exemplo, através da injeção da preparação diretamente em uma região específica do corpo do paciente.

[0264] Em uma modalidade, a via de administração pode ser enteral. Em outra modalidade, a via pode ser conjuntival, transdermal, intradérmica, intra-arterial, vaginal, retal, intratumoral, parcanceral, transmucoso, intramuscular, intravascular, intraventricular, intracraniano, intranasal, sublingual ou uma combinação destes.

[0265] Em outra modalidade, as composições farmacêuticas são administradas por injeção intramuscular, intravenosa ou intra-arterial de uma preparação líquida. Em algumas modalidades, formulações líquidas incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões, óleos e afins. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas são administradas por via intravenosa, e, portanto, são formuladas em uma forma adequada para administração intravenosa. Em outra modalidade, as composições farmacêuticas são administradas intra-arterialmente, e, portanto, são formuladas em uma forma adequada para administração intra-arterial. Em outra modalidade, as composições farmacêuticas são administradas por via intramuscular, e, portanto, são formuladas em uma forma adequada para administração intramuscular.

[0266] Ainda, em outra modalidade, as composições farmacêuticas são administradas topicamente para superfícies do corpo, e, portanto, são formuladas em uma forma adequada para administração tópica. Formulações tópicas adequadas incluem géis, pomadas, cremes, loções, gotas e afins. Para administração tópica, os compostos da presente invenção são combinados com um agente terapêutico adequado adicional ou agente, preparado e aplicado como soluções, suspensões ou emulsões em um diluente fisiologicamente aceitável com ou sem um transportador farmacêutico.

[0267] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da presente invenção são fabricadas pelos processos conhecidos na técnica, por exemplo, por meio da mistura convencional, dissolução, granulação, fabricação de drageia, levigação, emulsionantes, encapsulando, aprisionamento ou processos de liofilização.

[0268] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas, para uso em conformidade com a presente invenção é formulado de forma convencional, usando um ou mais transportadores fisiologicamente aceitáveis, compreendendo excipientes e auxiliares, que facilitam a transformação dos ingredientes ativos nas preparações que, podem ser utilizados farmaceuticamente. Em uma modalidade, a formulação é dependente da via de administração escolhida.

[0269] Em uma modalidade, injetáveis da invenção são formulados em soluções aquosas. Em uma modalidade, injetáveis da invenção são formulados em tampões fisiologicamente compatíveis como solução de Hank, solução de Ringer ou tampão de sal fisiológico. Em algumas encarnações, para administração transmucosa, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeadas são utilizadas na formulação. Esses penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.

[0270] Em uma modalidade, os preparativos aqui descritos são formulados para administração parentérica, por exemplo, por injeção em bolus ou infusão contínua. Em algumas modalidades, formulações para injeção são apresentadas na forma de dosagem de unidade, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de doses múltiplas com opcionalmente, um conservante adicionado. Em algumas modalidades, composições são suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e contêm agentes formulatórios como suspensão, estabilização e/ou agentes de dispersão.

[0271] As composições também compreendem, em algumas modalidades, conservantes, tais como cloreto de benzalcônio e timerosal e afins; agentes quelantes, tais como sódio de edetato e outros; tampões como fosfato, citrato e acetato; agentes de tonicidade, como cloreto de sódio, cloreto de potássio, glicerina, manitol e outros; antioxidantes como o ácido ascórbico, acetilcistina, metabissulfito de sódio e outros; agentes aromáticos; ajustadores de viscosidade, tais como polímeros, incluindo celulose e seus derivados; e álcool polivinílico e ácido e bases para ajustar o pH dessas composições aquosas conforme necessário. As composições compreendem também, em algumas modalidades, anestésicos locais ou outros ativos. As composições podem ser usadas como sprays, névoas, gotas e afins.

[0272] Em algumas modalidades, composições farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas de preparação ativa na forma solúvel em água. Além disso, suspensões dos ingredientes ativos, em algumas modalidades, são preparados como óleo adequado ou suspensões de injeção com base de água. Solventes lipofílicos adequados ou veículos incluem, em algumas modalidades, óleos graxos, tais como o óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos como oleato de etil, triglicerídeos ou lipossomas. Suspensões de injeção aquosa contêm, em algumas modalidades, substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Em outra modalidade, a suspensão também contém estabilizadores apropriados ou agentes que aumentam a solubilidade dos ingredientes ativos para permitir altamente para a preparação de soluções concentradas.

[0273] Em outra modalidade, o composto ativo pode ser entregue em uma vesícula, num lipossoma particular (ver Langer, Science249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein andFidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; J. E. Diederichs and al., Pharm./nd. 56 (1994) 267- 275).

[0274] Em outra modalidade, a composição farmacêutica entregou em um sistema de liberação controlada é formulado para infusão intravenosa, bomba osmótica implantável, transdérmico, lipossomas ou outros modos de administração. Em uma modalidade, uma bomba é usada (ver Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados. Em outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado em proximidade com o alvo terapêutico, ou seja, o cérebro, exigindo apenas uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer (Science 249:1527-1533 (1990).

[0275] Em algumas modalidades, o ingrediente ativo é em forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pirogêneo, estéril, com base em solução, antes da utilização. Composições são formuladas, em algumas modalidades, para administração de atomização e inalação. Em outra modalidade, composições estão contidas em um recipiente com meio de atomização anexado.

[0276] Em uma modalidade, a preparação da presente invenção é formulada nas composições retais como supositórios ou enemas de retenção, utilizando, por exemplo, bases de supositório convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos.

[0277] Em algumas modalidades, composições farmacêuticas adequadas para uso no contexto da presente invenção incluem composições em que os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para atingir o objetivo pretendido. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de ingredientes ativos eficazes para prevenir, aliviar ou amenizar os sintomas da doença ou prolongar a sobrevivência do sujeito a ser tratado.

[0278] Em uma modalidade, a determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está dentro a capacidade das pessoas versadas na técnica.

[0279] Alguns exemplos de substâncias que podem servir como transportadores farmaceuticamente aceitáveis ou os seus componentes são açúcares, como glicose, lactose e de sacarose; amidos, tais como o amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e metilcelulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; lubrificantes sólidos, tais como o ácido esteárico e estearato de magnésio; sulfato de cálcio; óleos vegetais, como óleo de amendoim, óleo de girassol, óleo de gergelim, azeite de oliva, óleo de milho e óleo de theobroma; polióis como propileno glicol, glicerina, sorbitol, manitol e glicol de polietileno; ácido algínico; emulsionantes, tais como os emulsificantes de marca Tween™; agentes umectantes, como sulfato lauril de sódio; agentes de coloração; agentes aromatizantes; investiga agentes estabilizadores; antioxidantes; conservantes; água livre de pirogênio; sal isotônico; e soluções de tampão fosfato. A escolha de uma transportadora farmaceuticamente aceitável para ser usada em conjunto com o composto é basicamente determinado pela maneira que o composto é administrado. Se o sujeito composto é para ser injetado, em uma modalidade, a transportadora farmaceuticamente aceitável é estéril, sal fisiológico, com um agente de suspensão compatível com o sangue, o pH dos quais foi ajustado para cerca de 7,4.

[0280] Além disso, as composições ainda compreendem ligantes (por exemplo, acácia, amido de milho, gelatina, carbômero, etil celulose, goma guar, hidroxipropilmetilcelulose, povidona), agentes de desintegração (por exemplo, amido de milho, amido de batata, ácido algínico, dióxido de silício, sódio de croscarmelose, crospovidona, goma de guar, amido glicolato de sódio), tampões (por exemplo, Tris-HCI., acetato, fosfato) de diferentes pH e força iônica, aditivos tais como albumina ou gelatina para evitar a absorção de superfícies, detergentes (por exemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sais de ácidos biliares), inibidores da protease, surfactantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio) e realçadores de permeação, agentes solubizantes (por exemplo, o glicerol, o glicerol de polietileno), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfito de sódio, hidroxianisol butilado), estabilizadores (por exemplo, hidroxipropilcelulose, hiroxipropilmetilcelulose), viscosidade aumentando os agentes (por exemplo, carbômero, dióxido de silício coloidal, etilcelulose, goma de guar), adoçantes (por exemplo, aspartame, ácido cítrico), conservantes (por exemplo, Timerosal, álcool benzil, parabenos), lubrificantes (por exemplo, ácido esteárico, estearato de magnésio, polietilenoglicol, lauril sulfato de sódio), fluxo de aids (por exemplo, dióxido de silício coloidal), plastificantes (por exemplo, dietilftalato, citrato de trietil), emulsificantes (por exemplo, carbômero, hidroxipropil celulose, lauril sulfato de sódio), revestimentos de polímero (por exemplo, poloxameros ou poloxaminas), agente de formação de revestimento e película (por exemplo, etilcelulose, acrilatos, polimetacrilatos) e/ou adjuvantes.

[0281] Componentes típicos das transportadoras para xaropes, elixires, suspensões e emulsões incluem etanol, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol, sacarose líquida, sorbitol e água. Para uma suspensão, suspensão de agentes típicos incluem metil celulose, carboximetilcelulose de sódio, celulose (por exemplo, Avicel™, RC-591), tragacanto e alginato de sódio; agentes umectantes típicos incluem óxido de lecitina e polietileno sorbitano (por exemplo, polissorbato 80). Conservantes típicos incluem parabeno metílico e benzoato de sódio. Em outra modalidade, composições líquidas peroral também contêm um ou mais componentes como adoçantes, agentes aromatizantes e corantes divulgados acima.

[0282] As composições também incluem a incorporação do material ativo em, ou nas preparações das partículas de compostos poliméricos, tais como, ácido polilático, ácido poliglicólico, hidrogel, etc., ou em lipossomas, microemulsões, micelas, vesículas unilamelares ou multilamelares, fantasmas de eritrócitos ou esferoplastos). Tais composições irão influenciar o estado físico, solubilidade, estabilidade, taxa de afastamento in vivo e a taxa de afastamento in vivo.

[0283] Também compreendida pela invenção são as composições das partículas revestidas com polímeros (por exemplo, poloxaminas ou poloxaminas) e o composto juntamente com anticorpos direcionados contra os receptores específicos do tecido, ligantes ou antígenos ou acoplado a ligantes de receptores específicos do tecido.

[0284] Em algumas modalidades, compostos modificados pela ligação covalente dos polímeros solúveis em água como o polietileno glicol, copolímeros de glicol de polietileno e polipropileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona ou poliprolina. Em outra modalidade, os compostos modificados apresentam meia vida consideravelmente mais tempo no sangue após a injeção intravenosa do que os compostos correspondentes não modificados. Em uma modalidade, modificações também aumentam a solubilidade do composto na solução aquosa, eliminam a agregação, melhoram a estabilidade física e química do composto em reduzem a imunogenicidade e a reatividade do composto. Em outra modalidade, a atividade biológica in vivo desejada é alcançada pela administração de tais raptos dos polímeros compostos menos frequentemente ou em doses mais baixas do que com o composto não modificado.

[0285] Em algumas modalidades, a preparação da quantidade efetiva ou a dose pode ser estimada inicialmente a partir dos ensaios in vitro. Em uma modalidade, uma dose pode ser formulada nos modelos animais e tais informações podem ser usadas para determinar com mais precisão as doses úteis em seres humanos.

[0286] Em uma modalidade, a toxicidade e eficácia terapêutica dos ingredientes ativos descritos neste documento podem ser determinadas pelos procedimentos farmacêuticos padrão in vitro, nas culturas de células ou animais experimentais. Em uma modalidade, os dados obtidos a partir destes ensaios de cultura in vitro e células e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma variedade de dosagem para uso em humanos. Em uma modalidade, as doses variam dependendo da forma de dosagem empregada e a através da administração utilizada. Em uma modalidade, a composição exata, através da administração e dosagem pode ser escolhida pelo médico individual tendo em conta as condições do paciente. [Ver, por exemplo, Fingl, et al., (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1].

[0287] Em uma modalidade, dependendo da gravidade e capacidade de resposta da condição a ser tratada, a dosagem pode ser de um único ou uma pluralidade de administrações, com curso de tratamento que dura desde vários dias a várias semanas ou até a cura ser efetuada ou diminuição do estado da doença ser conseguido.

[0288] Em uma modalidade, a quantidade de uma composição para ser administrada, claro, será dependente do sujeito a ser tratada, a severidade da aflição, da forma de administração, o julgamento da prescrição médica, etc.

[0289] Em uma modalidade, composições, incluindo a preparação da presente invenção formulada em uma transportadora farmacêutica compatível são também preparadas, colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para tratamento de uma condição indicada.

[0290] Em outra modalidade, um fator coagulante, como descrito neste documento é liofilizado (ou seja, liofilizado) preparação na combinação com excipientes orgânicos complexos e estabilizadores como agentes ativos de superfície não iônica (ou seja, surfactantes), diversos açúcares, polióis orgânicos e/ou albumina de soro humano. Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreende um fator coagulante liofilizado, conforme descrito na água estéril para injeção. Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreende um fator coagulante liofilizado, conforme descrito em PBS estéril para injeção. Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreende um fator coagulante liofilizado, conforme descrito na estéril 0,9% NaCl para injeção.

[0291] Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um fator coagulante, como descrito neste documento e complexos transportadores tais como albumina de soro humano, açúcares, polióis e agentes estabilizadores ativos de superfície aniônica. Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um fator coagulante, como descrito neste documento e ácido lactobiônico e um tampão de acetato/glicina. Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um fator coagulante, como descrito neste documento e aminoácidos, como arginina ou glutamato que aumentam a solubilidade de composições de interferon em água. Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um fator coagulante liofilizado, conforme descrito neste documento e glicina ou albumina de soro humano (HSA), um tampão (e g. acetato) e um agente isotônico (por exemplo, NaCl). Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um fator coagulante liofilizado conforme descrito neste documento e tampão fosfato, glicina e HSA.

[0292] Em outra modalidade, a composição farmacêutica, compreende um fator coagulante, como descrito neste documento é estabilizada quando colocadas em soluções tampão tendo um pH entre 4 e 7,2. Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante está numa solução tamponada com um pH entre 4 e 8,5. Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante está numa solução tamponada com um pH entre 6 e 7. Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante está numa solução tamponada com um pH de cerca de 6,5. Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito neste documento é estabilizada com um aminoácido como agente estabilizador e em alguns casos um sal (se o aminoácido não contém uma cadeia lateral carregada).

[0293] Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito neste documento é uma composição líquida que compreendendo um agente estabilizador entre cerca de 0,3% e 5% em peso, que é um aminoácido.

[0294] Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito neste documento fornece precisão da dosagem e segurança do produto. Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito aqui fornece uma formulação líquida estável, biologicamente ativa para uso em pedidos injetáveis. Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um fator coagulante não liofilizado conforme descrito neste documento.

[0295] Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito aqui fornece uma formulação líquida, permitindo o armazenamento por um longo período de tempo em um estado líquido, facilitando o armazenamento e o transporte antes da administração.

[0296] Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito neste documento compreende lipídios sólidos como material de matriz. Em outra modalidade, a composição farmacêutica injetável que compreende um fator coagulante, como descrito neste documento compreende lipídios sólidos como material de matriz. Em outra modalidade, a produção de micropartículas de lipídios por congelamento de pulverização foi descrita por Speiser (Speiser and al., Pharm. Res. 8 (1991) 47-54) seguido por nanopeletes de lipídios para administração peroral (Speiser EP 0167825 (1990)).). Em outra modalidade, lipídios, que são usados, são bem tolerados pelo organismo (por exemplo, compostos glicéridos de ácidos graxos que estão presentes nas emulsões para nutrição parenteral).

[0297] Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito neste documento compreende micropartículas poliméricas. Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito neste documento compreende nanopartículas. Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito neste documento compreende os lipossomas. Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito neste documento compreende emulsão lipídica. Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito neste documento compreende microesferas. Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito neste documento compreende nanopartículas de lipídeos. Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito neste documento compreende nanopartículas de lipídios, compreendendo lipídios anfifílicos. Em outra modalidade, a composição farmacêutica que compreende um fator coagulante, como descrito neste documento compreende nanopartículas de lipídios, compreendendo uma droga, uma matriz lipídica e um surfactante. Em outra modalidade, a matriz lipídica tem um teor de monoglicerídeo que é de pelo menos 50% p/p.

[0298] Em uma modalidade, as composições da presente invenção são apresentadas em um pacote ou dispositivo dispensador, tais como um kit aprovado de FDA, que contêm uma ou mais formas de dosagens únicas que contém o ingrediente ativo. Em uma modalidade, o pacote, por exemplo, compreende uma folha metálica ou plástica, tal como uma embalagem blister. Em uma modalidade, a embalagem ou dispositivo dispensador é acompanhado de instruções para a administração. Em uma modalidade, o pacote ou dispensador é acomodado por aviso associado com o recipiente em uma forma prescrita por uma agência governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, que o aviso é o reflexo de aprovação pelo órgão da forma das composições ou humano ou administração veterinária. Tal aviso, em uma modalidade, é a rotulagem aprovada pela U.S. Food and Drug Administration para prescrição de medicamentos ou de uma bula do produto aprovado.

[0299] Em uma modalidade, isto será apreciado que os fatores coagulantes da presente invenção podem ser fornecidos para o indivíduo com agentes ativos adicionais para alcançar um efeito terapêutico melhorado em comparação com o tratamento com cada agente por si só. Em outra modalidade, são tomadas medidas (por exemplo, dosagem e seleção do agente complementar) para evitar efeitos colaterais adversos, que são associados com terapias de combinação.

[0300] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo de Fator VII (FVIIa) CTP modificado consistindo de um polipeptídeo FVIIa e cinco peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina (CTPs) anexados ao carbóxi terminal do referido FVIIa.

[0301] Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo de Fator VII (FVIIa) CTP modificado consistindo de um polipeptídeo FVIIa e cinco peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina (CTPs) anexados ao terminal carbóxi do referido FVIIa.

[0302] Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma codificação de polinucleotídeo um polipeptídeo CTP modificado, consistindo de um polipeptídeo de Fator VII (FVIIa) e três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina (CTPs) anexados ao terminal carbóxi do referido polipeptídeo FVIIa.

[0303] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um vetor de expressão, compreendendo uma codificação depolinucleotídeos um polipeptídeo CTP modificado, consistindo de um polipeptídeo de Fator VII (FVIIa) e três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina (CTPs) anexados ao terminal carbóxi do referido polipeptídeo FVIIa.

[0304] Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma célula compreendendo um vetor de expressão compreendendo uma codificação depolinucleotídeos um polipeptídeo CTP modificado, consistindo de um polipeptídeo de Fator VIIa (FVIIa) e três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina (CTPs) anexados ao terminal carbóxi do referido polipeptídeo FVIIa.

[0305] Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma composição compreendendo um vetor de expressão compreendendo uma codificação depolinucleotídeos um polipeptídeo CTP modificado, consistindo de um polipeptídeo de Fator VIIa (FVIIa) e três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina (CTPs) anexados ao terminal carbóxi do referido polipeptídeo FVIIa.

[0306] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de extensão de meia vida biológica de um polipeptídeo de Fator VIIa (FVIIa), compreendendo a etapa de anexar três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina (CTPs) para o terminal carbóxi terminal do referido polipeptídeo FVIIa, estendendo assim a meia vida biológica do referido polipeptídeo FVIIa.

[0307] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de melhorar a área sob a curva (AUC) de um polipeptídeo de Fator VIIa (FVIIa), compreendendo a etapa de anexar três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) para o terminal carbóxi do referido polipeptídeo FVIIa, melhorando assim a AUC do referido polipeptídeo FVIIa.

[0308] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de reduzir a frequência de dosagem de um polipeptídeo do Fator VII (FVIIa), compreendendo a etapa de anexação de três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) para o terminal carbóxi do referido polipeptídeo FVIIa, reduzindo a frequência de dosagem do referido polipeptídeo FVIIa.

[0309] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de reduzir a taxa de eliminação de um polipeptídeo do Fator VII (FVIIa), compreendendo a etapa de anexação de três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) para o terminal carbóxi do referido polipeptídeo FVIIa, reduzindo a taxa de eliminação do referido polipeptídeo FVIIa.

[0310] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de produzir um polipeptídeo do Fator VII (FVIIa) CTP modificado, compreendendo a etapa de anexar três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) para o terminal carbóxi do referido polipeptídeo FVIIa, produzindo assim um polipeptídeo FVIIa CTP modificado.

[0311] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento de hemofilia em um sujeito compreendendo a administração de um polipeptídeo do Fator VII (FVIIa) CTP modificado compreendendo um polipeptídeo FVIIa e três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) anexados ao terminal carbóxi do referido polipeptídeo FVIIa ao referido sujeito, assim, tratando a hemofilia no referido sujeito.

[0313] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo do Fator IX (FIX) CTP modificado, consistindo de um polipeptídeo FIX e três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina (CTPs) anexados ao terminal carbóxi do referido polipeptídeo FIX CTP modificado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo FIX CTP modificado, em que a sequência do referido polipeptídeo FIX CTP modificado é a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 31. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo FIX CTP modificado, em que pelo menos um CTP é codificado pela sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo FIX CTP modificado, em que pelo menos um CTP é glicosilado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo FIX CTP modificado, em que pelo menos um CTP é truncado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo FIX CTP modificado, em que pelo menos um que CTP é anexado ao referido polipeptídeo FIX através de um ligador. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo FIX CTP modificado, em que o referido ligador é uma ligação peptídica.

[0314] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo FIX CTP modificado.

[0315] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma codificação de polinucleotídeo de um polipeptídeo CTP modificado, consistindo de um polipeptídeo de Fator IX (FIX) e três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina (CTPs) anexados ao terminal carbóxi do referido polipeptídeo FIX. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinucleotídeo, em que a sequência do referido polinucleotídeo está estabelecido na SEQ ID NO: 30. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo, em que pelo menos um CTP é codificado pela sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinucleotídeo, em que pelo menos um CTP é glicosilado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polinucleotídeo, em que pelo menos um CTP é truncado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo, em que pelo menos um que CTP é anexado ao referido polipeptídeo FIX através de um ligador. Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma polinucleotídeo, em que o referido ligador é uma ligação peptídica. Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo.

[0316] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma célula compreendendo o vetor de expressão.

[0317] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição compreendendo o vetor de expressão.

[0318] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de estender a meia vida biológica de um polipeptídeo de Fator IX (FIX), compreendendo a etapa de anexar três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) para o terminal carbóxi do referido polipeptídeo FIX, estendendo assim a meia vida biológica do referido polipeptídeo FIX. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é codificado pela sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é glicosilado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é truncado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um que CTP é anexado ao referido polipeptídeo FIX através de um ligador. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que o referido ligador é uma ligação peptídica.

[0319] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de melhorar a área sob a curva (AUC) de um polipeptídeo de Fator IX (FIX), compreendendo a etapa de anexar três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) para o terminal carbóxi do referido polipeptídeo FIX, melhorando assim a AUC do referido polipeptídeo FIX. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é codificado pela sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é glicosilado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é truncado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um que CTP é anexado ao referido polipeptídeo FIX através de um ligador. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que o referido ligador é uma ligação peptídica.

[0320] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de reduzir a frequência de dosagem de um polipeptídeo do Fator IX (FIX), compreendendo a etapa de anexação de três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) para o terminal carbóxi do referido polipeptídeo FIX, reduzindo a frequência de dosagem do referido polipeptídeo FIX. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é codificado pela sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é glicosilado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é truncado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um que CTP é anexado ao referido polipeptídeo FIX através de um ligador. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que o referido ligador é uma ligação peptídica.

[0321] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de reduzir a taxa de eliminação de um polipeptídeo do Fator IX (FIX), compreendendo a etapa de anexação de três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) para o terminal carbóxi do referido polipeptídeo FIX, reduzindo a taxa de eliminação do referido polipeptídeo FIX. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é codificado pela sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é glicosilado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é truncado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um que CTP é anexado ao referido polipeptídeo FIX através de um ligador. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que o referido ligador é uma ligação peptídica.

[0322] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de produzir um polipeptídeo do Fator IX (FIX) CTP modificado, compreendendo a etapa de anexar três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) para o terminal carbóxi do referido polipeptídeo FIX, produzindo assim um polipeptídeo FIX CTP modificado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que a sequência do referido polipeptídeo FIX CTP modificado é a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 31. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é codificado pela sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é glicosilado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é truncado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um que CTP é anexado ao referido polipeptídeo FIX através de um ligador. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que o referido ligador é uma ligação peptídica.

[0323] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento de hemofilia em um sujeito compreendendo a administração de um polipeptídeo do Fator IX (FIX) pelo CTP modificado compreendendo um polipeptídeo FIX e três peptídeos de terminal carbóxi da gonadotrofina coriônica (CTPs) anexados ao terminal carbóxi do referido polipeptídeo FIX ao referido sujeito, assim, tratando hemofilia no referido sujeito. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que a sequência do referido polipeptídeo FIX CTP modificado é a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 31. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é codificado pela sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído de: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é glicosilado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um CTP é truncado. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que pelo menos um que CTP é anexado ao referido polipeptídeo FIX através de um ligador. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método, em que o referido ligador é uma ligação peptídica.

[0324] Como é geralmente conhecido na técnica, os peptídeos e proteínas modificados da invenção podem ser acoplados aos marcadores, drogas, agentes, transportadoras, suportes sólidos, e assim, dependendo da aplicação desejada. As formas rotuladas dos produtos biológicos modificados podem ser usadas para rastrear seu destino metabólico; rótulos apropriados para esta finalidade incluem, especialmente, marcadores radioisótopos como iodo 131, tecnécio 99, índio 111 e afins. Os rótulos também podem ser utilizados para mediar a detecção das proteínas modificadas ou peptídeos nos sistemas de ensaio; nesta instância, radioisótopos podem também ser utilizados bem como marcadores de enzima, marcadores fluorescentes, marcadores cromogênico e afins. O uso de tais rótulos é particularmente útil se o peptídeo ou uma proteína em si é um agente de direcionamento como um anticorpo ou um ligante-receptor.

[0325] As técnicas de ligação semelhantes, juntamente com outros, podem ser empregadas para acoplar os peptídeos e proteínas modificados da invenção para suportes sólidos. Quando acoplado, estes peptídeos e proteínas modificados então podem ser usados como reagentes de afinidade para a separação dos componentes desejados, com os quais está exposta a reação específica.

[0326] Finalmente, os peptídeos e proteínas modificados da invenção podem ser usados para gerar anticorpos especificamente imunorreativos com estes novos compostos. Estes anticorpos são úteis em uma variedade de aplicações diagnósticas e terapêuticas, dependendo da natureza da atividade biológica do peptídeo ou proteína não modificados. É para ser entendido que a invenção fornece anticorpos que são imunorreativos com FIX-CTP modificado, FVII, ou FVIIa conforme descrito neste documento. Em uma modalidade, tais anticorpos podem ser usados para distinguir ou identificar fatores coagulantes de CTP modificado que foram administrados dos fatores coagulantes endógenos. Em outra modalidade, os anticorpos podem ser usados para localizar os fatores coagulantes administrados por CTP modificado.

[0327] Objetos, vantagens, e novas características adicionais da presente invenção se tornarão aparentes para uma pessoa versada na técnica ao examinar os seguintes exemplos, que não se destinam a ser limitantes. Além disso, cada uma das várias modalidades e aspectos da presente invenção como delineado acima e como reivindicado na seção de reivindicações abaixo encontra suporte experimental nos seguintes exemplos.

EXEMPLOS

[0328] Em geral, a nomenclatura utilizada neste documento e os procedimentos de laboratório utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, de DNA recombinantes, bioquímicas e microbiológicas. Tais técnicas são exaustivamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias conforme estabelecidas em Pat. Nos. U.S. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); disponíveis imunoensaios exaustivamente descritos na literatura cientifica e patentes, ver, por exemplo, Pat. Nos. U.S. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 e 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas as quais são incorporadas por referência. Outras referências genéricas são fornecidas ao longo deste documento.

EXEMPLO 1 Geração e Utilização do Fator IX Coagulante

[0329] Clonagem e expressão da molécula recombinante FIX:

[0330] Clones de Fator IX foram construídos em nosso vetor de expressão eucarióticos pCI-neo (Promega, catálogo no. E1841). Clone ORF do Homo sapiens de Fator IX coagulante foi encomendado da "OriGene" (RC219065). Primers foram encomendados da Sigma-Genosys.

[0331] Construção de 301-1-pCI-neo-p200-11 (Fator IX-ctp x2):

[0332] Primer 101: 5' GTTTAGTGAACCGTCAGAAT 3' (SEQ ID NO: 36)

[0333] Primer 103R: 5' TTGAGGAAGATGTTCGTGTA 3' (contém o sítio SspI de Fator IX) (SEQ ID NO: 37)

[0334] A reação PCR foi realizada com primer 101 e primer 103R e plasmídeo DNA, clone de cDNA do Fator IX (OriGene" RC219065) como um modelo; como resultado para a amplificação por PCR, um produto ~1085 bp (pcr 10) foi formado e purificado a partir do gel (o fragmento contendo o terminal amino da sequência do Fator IX).

[0335] Primer 98: 5' ATTACAGTTGTCGCAGGTGA 3' (SEQ ID NO: 38)

[0336] Primer 99R : 5' GCTGGAGCTAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTT 3' (SEQ ID NO: 39)

[0337] Primer 100: 5' GCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCC 3' (SEQ ID NO: 40)

[0338] Primer 27R: 5' TTTTCACTGCATTCTAGTTGTGG 3' (SEQ ID NO: 41)

[0339] Foram realizadas três reações de PCR. A primeira reação foi conduzida com primer 98 e primer 99R e plasmídeo DNA, clone de cDNA do Fator IX (OriGene", RC219065) como um modelo; como resultado para amplificação por PCR, um produto ~540 bp foi formado.

[0340] A segunda reação foi conduzida com primer 100 e primer 27R e plasmídeo DNA de 402-2-p72-3 (hGH-CTP-CTP) como um modelo; como resultado para amplificação por PCR, um ~ 258 produto bp foi formado.

[0341] A última reação (pcr 3) foi realizada com primers 98 e 27R e uma mistura dos produtos das duas reações anteriores como um modelo; como resultado para amplificação por PCR, um produto ~790 bp foi formado e ligados no vetor de clonagem TA (Invitrogen, catálogo K2000- 01). SspI EcoRI - fragmento foi isolado (TA-3-3).

[0342] Outra reação de PCR foi conduzida (pcr 12) com primer 101 e primer 27R e uma mistura dos produtos de pcr 10 e SspI-EcoRI fragmento de pcr 3 como um modelo; como resultado para amplificação por PCR, um produto ~ 1700 bp foi formado (Fator IX-ctp-ctp) e ligados no vetor de clonagem TA (Invitrogen, catálogo K2000-01) (lig. 180).

[0343] Um erro foi encontrado na sequência do Fator IX para que fragmentos foram substituídos a fim de formar uma inserção do Fator IX-ctp-ctp, com a correta sequência de DNA.

[0344] TA-pcr 3-3 foi digerido com SspI e XbaI e o fragmento foi isolado (vector). TA 180-4 foi digerido com SspI e XbaI e o pequeno fragmento (inserir) foi isolado e ligado ao fragmento isolado do TA-pcr-3-3 digerido com SspI e XbaI. O plasmídeo novo TA-183-2 foi digerido com Sal I e NotI, e a inserção do Fator IX-CTP-CTP foi isolado (~ 1575 bp). Este fragmento foi inserido no vetor de expressão eucarióticos pCI-neo (digerido com Sal I e Not I) para produzir o clone de 301-2-p200-11.

[0345] pCI-dhfr - Fator de construção 9-ctpx2 (p223-4): Vector pCI-dhfr (p6-1) foi digerido com SmaI e NotI. Fator IX-CTP-CTP (p200-11) foi digerido com ASisI F.I. e NotI. Os dois fragmentos estavam ligados.

[0346] Construção dhfr-pCI do Fator 9-ctp x3 (p225-7): Vetor pCI-dhfr OXM-CTPD3 (4-p216) foi digerido com Xbal e Apal. Fator IX-CTP- CTP (223-4) foi digerido com XbaI e ApaI. Os dois fragmentos estavam ligados.

[0347] Construção pCI-dhfr do Fator 9-ctp 3 x T148A (p2432): Plasmídeo p225-7 Treonina contida na posição 148, desde a versão mais comum do FIX contém Alanina nessa posição, Thr foi substituído para Ala usando método de mutagênese direcionado ao sítio.

[0348] Primer 75: ctcccagttcaattacagct (SEQ ID NO: 42)

[0349] Primer 122r: ggaaaaactgcctcagcacgggtgagc (SEQ ID NO: 43)

[0350] Primer 123: gtgctgaggcagtttttcctgatgtggactat (SEQ ID NO: 44)

[0351] Primer 124r: caacacagtgggcagcag (SEQ ID NO: 45)

[0352] Foram realizadas três reações de PCR. A primeira reação foi conduzida com primer 75 e primer 122r e plasmídeo DNA p225-7 como um modelo; como resultado para amplificação por PCR, um produto ~ 692 bp foi formado e purificado do gel. Uma segunda reação de PCR foi realizada com primer 123 e primer 124r e plasmídeo DNA p225-7 como um modelo; como resultado para amplificação por PCR, um produto de bp ~ 237 foi formado e purificado do gel. A terceira - reação de sobreposição PCR da reação foi conduzida com primers 75 124r e uma mistura dos produtos das duas reações anteriores como um modelo; como resultado para amplificação por PCR, um produto ~ 910 bp foi formado. Este produto PCR de sobreposição foi digerido com XbaI e NsiI e re ligado em plasmídeo p225-7 (digerido com XbaI e NsiI) para produzir o Fator IX-ctpx3 T148A designado p243-2.

[0353] Construção de FIX-4CTP (p259-4): 3,5CTP fragmento foi isolado de oxym-4CTP (p254-3) pelas enzimas de restrição Apa1 e Xba1. FIX + 0,5CTP fragmento foi isolado a partir do FIX-3CTP (p243-2) com enzimas de restrição Apa1 e Xba1. Os dois fragmentos estavam ligados.

[0354] Construção do FIX-5CTP (p260-18): 4,5CTP fragmento foi isolado de oxym-5CTP (255 -1) por enzimas de restrição Apa1 e Xba1. FIX+0,5CTP fragmento foi isolado a partir do FIX-3CTP (p243-2) usando enzimas Apa1 e Xba1. Os dois fragmentos estavam ligados.

[0355] Células Dg44 foram banhadas em placas de cultura de tecidos de 100mm e crescidas a confluência de 50-60%. Um total de 2 μg (microgramas) de FIX do cDNA foi usado para o transfecção de uma placa de 100mm, utilizando o reagente FuGene (Roche) em meio livre de proteína (Invitrogene CD Dg44). A mídia foi removida 48 horas depois da transfecção e substituída com um produto livre de proteína (Invitrogene CD Dg44) sem nucleosídeos e na presença de 800 μg/ml de G418 (Neomicina). Após 14 dias, a população de células transfectadas foi transferida para frascos de cultura de tecido T25, e a seleção continuou por 10-14 dias adicionais até que as células começassem a crescer bem como clones estáveis. Clones de expressão elevados foram selecionados. Aproximadamente células de 2x107 foram usadas para inocular 300 ml do meio de crescimento em 1700 cm2 garrafa de rolo (Corning, NY Corning) suplementado com 5 ng/ml da Vitamina K3 (bissulfato de sódio menadiona; Sigma). O meio de produção (coleta) foi coletado após uma rápida diminuição da viabilidade celular a cerca de 70%. O meio de produção foi primeiro clarificado e depois concentrado aproximadamente 20 vezes e diálise com PBS usando cassete de filtração de fluxo (10KDa MWCO; Millipore Corp.).

[0356] Determinação do nível de antígeno de FIX: Os níveis de antígeno de coleta FIX-CTP foram determinados utilizando o kit de AssayMax humano FIX ELISA (AssayPro-EF1009-1). A concentração de proteína calculada é a média de três diferentes diluições em duas corridas independentes (Figura 1A, Tabela 1). Tabela 1: Concentração da proteína calculada

[0357] FIX SDS-PAGE - immunoblot: FIX-CTP coletas ou rhFIX purificado (American Diagnostics), 100 ng de proteína, foram carregados em 12% gel de Tris-Glicina usando Precision Plus Dual Color Protein Marker (Bio-Rad). A análise de SDS-PAGE foi realizada por immunoblot Western utilizando anticorpo policlonal anti-FIX humano e de anticorpo monoclonal de carboxilação gama de anti-humano (American Diagnostics). Como relatado anteriormente, rhFIX migrado no 55KDa, enquanto FIX fundidos para duas CTPs migradas no 75KDa. Ambas as variantes de proteínas de FIX-CTP foram mostradas para ser carboxilada gama, uma modificação de pós-translacional essencial para a atividade de FIX e função (Figura 1B).

[0358] Determinação da atividade cromogênica FIX: Uma avaliação comparativa da potência in vitro de coletas de FIX-CTP vs. proteína rhFIX (American Diagnostics) foi realizada utilizando o kit de teste da atividade cromogênica disponível comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Na presença de trombina, fosfolipídios, cálcio, quantidades excessivas de FXIa ativa a amostra FIX no FIXa. FIXa forma um complexo enzimático com trombina, FVIII:C ativado (fornecido em uma quantidade em excesso), fosfolipídios e cálcio e ativa o Fator X, presente no sistema de ensaio no FXa. A atividade correlaciona diretamente com a quantidade de FIX, que é o fator limitante. O FXa gerado é então medido por sua atividade específica no FXa substrato cromogênico (pNA). A quantidade de pNA gerado é diretamente proporcional à atividade FIXa. rhFIX e coletas FIX-CTP foram diluídas em série, e a potência foi avaliada comparando-se uma curva de resposta da dose das coletas FIX para uma preparação de referência consistindo de rhFIX ou plasma humano. O EC50 médio de FIX foi 21 ng/ml, enquanto o FIX-) CTP2(coleta calculada EC50 foi 382 ng/ml, e a coleta FIX-CTP calculado EC50 foi 1644 ng/ml. Uma redução de aproximadamente 15 vezes na atividade enzimática do FIX-) CTP2(coleta foi observada (Figura 2).

[0359] Atividade Coagulante FIX(aPTT): O tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) é uma medida da integridade das vias intrínsecas e comuns da cascata coagulante. A aPTT é o tempo, em segundos, de coagulação do plasma após a adição de um ativador da via intrínseca, fosfolipídios e cálcio. O reagente aPTT é chamado uma tromboplastina parcial porque o fator tecidual não é incluído com os fosfolípidos como é com o protime reagente (PT). O ativador inicia o sistema e em seguida as etapas restantes da via intrínseca ocorrem na presença de fosfolipídios. Referência da gama aPTT varia de laboratório para laboratório, mas é geralmente na faixa de 27-34 segundos.

[0360] O ponto principal do ensaio foi quantificar a capacidade de coleta FIX-CTP para restaurar a atividade de coagulação do plasma humano FIX-depletado pela adição de rhFIX. 300 μl de plasma humano deficiente FIX foi misturado com 100 μl de rhFIX ou coletas de FIX-CTP e diluída serialmente. Após uma segunda incubação 60 a 37°C, tromboplastina, CaCl2, e fosfolipídios foram adicionados à mistura, e tempo em segundos coagulantes foi determinado (interpretada pelo American Medical Laboratories). A potência foi avaliada comparando-se uma curva de reposta da dose das coletas FIX para uma preparação de referência consistindo de rhFIX ou plasma humano. Uma unidade de atividade de FIX corresponde à concentração de FIX que é igual a atividade do plasma humano normal de 1 ml. Os resultados do aPTT apresentados indicam que exposição de FIX-(CTP)2 exibem uma redução de 5,7 vezes na sua atividade coagulante específicos em relação ao rhFIX (Tabela 2). Além disso, dos resultados do aPTT juntamente com o ensaio da atividade cromogênica in vitro sugerem que a coleta de FIX-(CTP)2 tem uma maior atividade enzimática vs. coleta FIX-CTP (Tabela 2). Uma atividade melhorada das proteínas FIX-CTP pode ser obtida após a otimização do sistema de expressão (ou seja, co- transfecção com Furina e otimização da concentração média de vitamina K3), que foi reforçada após a super- transfecção com Furina (dados não mostrados). Tabela 2: Atividade coagulante de FIX

[0361] Estudo farmacocinético:rhFIX (American Diagnostics) e coletas FIX-CTP foram administradas em uma única injeção intravenosa de ratos Sprague-Dawley (seis camundongos por substância) na dose de 75 μg/kg de peso corporal (Tabela 3). Tabela 3: estudar plano de operação PK

[0362] Amostras de sangue foram retirados do retro-orbital de 3 camundongos alternadamente em 0,083, 0,5 1,5, 4, 8, 24, 48 e 72 horas após a dosagem. Plasma foi preparado imediatamente após a amostragem e armazenado a -20 °C até análise. Concentração FIX foi quantificada pelo ensaio de ELISA FIX específico (AssayPro). Um perfil farmacocinético foi calculado para cada proteína e representa a média de 3 animais em cada ponto do tempo (Figura 3). As meias vidas terminais foram calculadas usando soluções de PK de software 2.0. A tabela 4 resume as concentrações FIX observadas nos pontos de tempo de amostragem diferentes. Tabela 4: Concentrações de FIX observadas

[0363] PK o perfil e Resumo da meia-vida terminal estão resumidos na tabela 5. Coletas FIX-CTP exibem um melhorado valor de T^β em comparação com rhFIX (2 e 5 vezes aumentam, respectivamente). Desde na coleção de dosagem FIX, as concentrações de soro animal de FIX em 24h estavam abaixo do limite de quantificação (BLQ), não foram calculados os parâmetros adicionais de PK. Tabela 5: Resumo dos parâmetros PK

[0364] Neste estudo, uma nova abordagem foi descrita para prolongar a meia vida FIX, mantendo a potência terapêutica. Adicionar um peptídeo CTP para uma proteína ativa tem um potencial prejudicial em interferir com a atividade da proteína. Portanto, a geração de um FIX-CTP recombinante ativo pela adição de uma sequência CTP no C-terminal do FIX é inesperado.

Caracterização de uma imunoafinidade purificada FIX-CTP-CTP FIX-CTP-CTP purificação

[0365] Para avaliar uma proteína no conteúdo de alta qualidade com o aumento da atividade cujo perfil PK imita e podem ser extrapolados para a prática clínica, FIX-CTP-CTP é um FIX modificado com 2 unidades CTP em conjunto no seu terminal carbóxi. FIX-CTP-CTP foi purificado utilizando o anticorpo monoclonal ligados à matriz contra resíduos de carboxiglutamil Y (Gla) presentes na região N-terminal do FIX (American Diagnostics Cat. # 3570MX). O anticorpo monoclonal foi ligado a Sepharose CL-4B. A coleta de FIX-CTP-CTP em uma concentração de 88 μg/ml fez diálise contra 20mM Tris, 150Mm NaCl e 10mM EDTA em PH =7,4. A taxa de carregamento foi de 0,5 ml/min, a eluição foi realizada usando 20Mm Tris-HCl, 350 mM de NaCl e 50 mM CaCl, e a fração não acoplada foi reciclado em cinco vezes. Finalmente, a fração de eluição foi dialisada com PBS, puxada e concentrada.

[0366] Determinação do nível de antígeno de FIX: coletas FIX-CTP, FIX-(CTP)2 coletas, e FIX-(CTP)2 níveis de proteína purificada foram determinados utilizando o kit de ELISA FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. #FIX-AG RUO). A concentração de proteína calculada (μg/ml) é a média de duas corridas independentes (Figura 4, Tabela 6). Tabela 6: Concentração da proteína calculada

[0367] Adicionalmente, FIX-CTP-CTP foi quantificado pelo ensaio de Bradford. A concentração calculada foi 202 μg/ml, que é semelhante à concentração obtidas pela ELISA FIX humana.

[0368] SDS-PAGE blots: Coleta de FIX-CTP-CTP, fração não acoplada e proteína purificada, foram carregadas em um 12% de gel Tris- glicina usando Precision Plus Dual Color Protein Marker (Bio-Rad). A análise de Coomassie SDS-PAGE foi realizada pela coloração do gel com o reagente azul Coomassie (800 ng de proteína). Um immunoblot Western foi realizada com 100 ng de proteínas, anticorpos policlonais do FIX anti- humano (Ab), e monoclonal carboxilação Ab gama anti-humana (Diagnósticos Americanos Cat #499 e #3570). O procedimento de purificação imunoafinidade significativamente enriquecido a parte de FIX- CTP-CTP enquanto impureza reduzida (Figura 5).

[0369] N-terminal de sequenciamento: Proteína purificada FIX-CTP-CTP foi separada por 12% Tris-glicina SDS-PAGE e posteriormente eletro-manchados à membrana PVDF. A banda de interesse foi cortada e colocada num filtro da fibra de vidro tratada Biobrana purificada. A análise da sequência do N-terminal foi realizada pela degradação Edmann usando um sequenciador da proteína líquida pulsada equipada com um sistema de micro-gradiente HPLC de 140 C. Sequenciamento do N-terminal revelou que FIX-CTP-CTP é uma mistura de proteínas clivadas pro-peptídeos incompletos e completos. A clivagem pro-peptídeo inadequado foi mostrada para reduzir a atividade coagulante FIX. Pela co-transfecção com Furina, o processo de clivagem de pro- peptídeo pode ser uma melhoria.

[0370] Determinação da atividade cromogênica FIX: Uma avaliação comparativa da potência in vitro da proteína purificada FIX-CTP- CTP vs rhFIX (American Diagnostics) e um pool de plasma humano normal foi realizado utilizando o kit de teste de atividade cromogênica disponível comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Na presença de trombina, fosfolipídios e cálcio, quantidades excessivas de FXIa ativa a amostra FIX no FIXa. As formas FIXa num complexo enzimático com trombina (fornecida em quantidades excessivas), fosfolipídios e cálcio ativa o Fator X, presente no sistema de ensaio, no FXa. A atividade correlaciona diretamente com a quantidade de FIX, que é o fator limitante. O FXa gerado foi medido por sua atividade específica no FXa substrato cromogênico (pNA). A quantidade de pNA gerado foi diretamente proporcional à atividade FIXa. rhFIX, plasma humano e FIX-CTP-CTP foram diluídas em série, e a potência foi avaliada comparando-se uma curva da resposta da dose (Figura 6). A média EC50 de rhFIX foi 68,74 ng/ml, enquanto FIX-CTP- CTP calculados EC50 foi 505 ng/ml. Observou-se uma diminuição de aproximadamente 7 vezes na atividade enzimática de FIX-CTP-CTP vs FIX recombinante e uma diminuição de 16,5 vezes vs. plasma puxado de humano normal. Essa atividade reduzida poderia ser explicada por clivagem inadequada do N-terminal de pro-peptídeo, que foi identificado pela análise do N-terminal.

[0371] Atividade Coagulante FIX (aPTT): O tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) é uma medida da integridade das vias intrínsecas e comuns da cascata coagulante. O aPTT é o tempo (medido em segundos) que leva o plasma a coagular após a adição de um ativador da via intrínseca, fosfolípidos e cálcio.

[0372] O ensaio quantificado da capacidade da proteína FIX- CTP-CTP para restaurar a atividade coagulante do plasma humano de FIX empobrecido pela adição de rhFIX. 300 μl de plasma humano deficiente de FIX foi misturado com 100 μl de rhFIX, FIX-CTP-CTP (FIX-CTP-CTP (o CTP está em conjunto no C-terminal)), ou pool de plasma humano normal, que era ainda mais diluído. Após uma incubação de 60 segundos a 37°C, foram adicionados Fator de Tecido (TF), CaCl2e fosfolipídios à mistura. Determinou-se o tempo de coagulação em segundos. Potência foi avaliada comparando uma curva da resposta de dose do FIX-CTP-CTP para uma preparação de referência de rhFIX ou do plasma humano. Uma unidade de FIX foi definida como a quantidade de FIX que é igual à atividade do plasma normal humano de 1 ml.

[0373] Os resultados do aPTT indicam que atividade coagulante FIX-CTP-CTP é apenas 1,4 menos então pool de plasma humano normal e semelhante do rhFIX. Os resultados do aPTT juntamente com a atividade cromogênica in vitro ensaio sugerem que purificação FIX-CTP-CTP não causou danos a sua atividade.

[0374] Atividades farmacocinéticas de FIX-CTP-CTP: Purificado FIX-CTP-CTP, rhFIX (American Diagnostics) e coletas contendo FIX-CTP-CTP e FIX-CTP e foram administrados em uma única injeção intravenosa de camundongos Sprague-Dawley (oito ratos por substância) em uma dose de 100μg/kg de peso corporal (Tabela 7). Tabela 7: Resumo de estudo de PK

[0375] Amostras de sangue foram retirados retro-orbitalmente de 4 camundongos alternadamente em 0,083, 0,5, 2, 4, 7 10, 24, 48, e 72 horas após a dosagem. Plasma citratado (0,32%) foi preparado imediatamente após a amostragem e armazenado a - 20°C até análise. Concentração FIX foi quantificada usando um kit humano de FIX ELISA (Afinidades Biológicas). O perfil farmacocinético foi calculado para cada proteína, enquanto a média dos 4 animais em cada ponto do tempo (Figura 7). A meia vida terminal foi calculada usando Soluções PK de Software 2.0. A tabela 8 resume as concentrações FIX observadas nos pontos de tempo de amostragem diferentes. Tabela 8: Concentrações de FIX observadas

[0376] Um resumo dos parâmetros PK é apresentado na Tabela 9. Tabela 9: Resumo dos parâmetros PK

[0377] A coleta do FIX-CTP-CTP demonstrou uma melhoria do perfil PK comparado a coleta FIX-CTP. Além disso, FIX-CTP-CTP purificado exibiu um aumento de 3 vezes no valor de T^β e um aumento de 4,5 vezes no AUC em comparação com rhFIX.

[0378] A quantidade reduzida de FIX secretado fundido a moléculas CTP em conjunto contra fusão de um único CTP parece ser devido à adição de um CTP extra e não para reduzir a detecção por ELISA, porque o Bradford purificado da concentração FIX-CTP-CTP calculada era similar à concentração calculada de ELISA.

[0379] A atividade coagulante de FIX-CTP-CTP foi semelhante ao plasma humano em pool; no entanto, sua atividade cromogênica in vitro foi significativamente menor quando comparado com rhFIX ou pool de plasma humano. O ensaio da atividade cromogênico foi relatado como um ensaio muito sensível em relação ao ensaio coagulante. A razão para a reduzida atividade de FIX-CTP-CTP pode variar. Adição de CTP pode diminuir a afinidade de FIX para FXIa ou reduzir as modificações pós- transcricional (por exemplo, resíduos GLA 12-10 e clivagem de pro- peptídeo). A análise N-terminal revelou que a clivagem proteolítica de pro- peptídeo FIX-CTP-CTP não foi totalmente concluída antes da secreção. Desde que essa modificação pós-transcricional é crucial para a atividade enzimática normal da proteína, co-transfecção com plasmídeo de Furina- PACE é favorável e pode melhorar a atividade de FIX-CTP-CTP.

[0380] Finalmente, estudo de PK comparativo FIX-CTP-CTP em camundongos demonstrou que a fusão de duas CTPs em conjunto para o C-terminal de FIX gerou um FIX com uma meia vida prolongada.

[0381] FIX modelo empobrecido de camundongo: Para avaliar a atividade in vivo, camundongos FIX knockout são obtidos, e uma colônia de procriação é estabelecida. 10μg de ambos hFIX recombinante comercial (BeneFIX®) ou rFIX-(CTP)2 (FIX-CTP-CTP) são injetados na veia da cauda de um camundongo de knockout FIX anestesiado (22-28g). A quantidade de proteína injetada é igual à concentração necessária de FIX em plasma normal (5μg/ml). São colhidas amostras de sangue da cauda cortada em tubos capilares heparinizados em pontos específicos de tempo. Amostras de plasma são avaliadas para os níveis de FIX por ELISA e eficácia é medida pelo ensaio coagulante de aPTT.

[0382] Aumentar a eficácia de clivagem do pró-peptídeo FIX: CTP do peptídeo cDNA foi fundido à extremidade 3' do cDNA de FIX humano. O correspondente rFIX e Furina expressando construções foram co-transfectadas em células de Dg44; um cDNA rFIX humano foi também co- transfectado com o plasmídeo Furina como um controle. Secreção de elevado nível de FIX leva à secreção de uma mistura de pro-fator e um maduro fator de FIX, devido à quantidade limitada da protease Furina na célula. A co-transfecção de uma Furina expressando vetor com um vetor de expressão pro-fator aumenta a recuperação e resultado na secreção de FIX totalmente transformada ao meio.

[0383] Seguindo a co-transfecção FIX-(CTP)2 e Furina, clones estáveis são gerados e a coleta é coletada para avaliação da clivagem de pro-peptídeo. 100 ng de proteínas são carregadas em 12% de gel Tris- glicina usando Precision Plus Dual Color Protein Marker (Bio-Rad). A análise de SDS-PAGE é executada pelo immunoblot Western usando anti- humano FIX policlonal Ab (American Diagnostics) e anticorpo policlonal de anti-pro-peptídeo. Como relatado anteriormente, rhFIX migrado no 55KDa, enquanto FIX fundidos para duas CTPs migradas no 75 kDa. Ambas as variantes das proteínas FIX são mostradas para se submeter a uma clivagem adequada, cheia de pro-peptídeo.

[0384] Para determinar se a clivagem de pro-peptídeo adequada melhora FIX-(CTP)2 atividade enzimática, uma avaliação comparativa de cromogênico e atividade coagulante da coleta FIX-(CTP)2 co-transfecatada com Furina é executada. Observa-se uma melhoria significativa na atividade específica FIX-(CTP)2, que é semelhante ao rhFIX.

[0385] Em conclusão, os resultados aqui descritos sugerem que o FIX-CTP-CTP pode ser usado eficientemente para tratamento de pacientes com Hemofilia B. FIX fundidos em benefício de construções CTP de desempenho farmacológico in vivo que supera a desvantagem em certas medidas in vitro. Esta proposta de tratamento é vantajosa sobre tratamentos anteriores como a taxa de infusões e a quantidade de doses necessárias são reduzidas.

[0386] Isto é importante para notar que quando uma estratégia de molécula fundida de albumina foi usada para melhorar meia vida do FIX, o FIX recombinante tornou-se inativo. A presente abordagem nova conduz para o design e a purificação de um novo recombinante de proteína fundida FIX que apresenta uma atividade duradoura melhorada. Desde que as modificações de tamanho não melhorarem a farmacocinética de FIX injetado, a conclusão de que o CTP fundido para o FIX facilita parâmetros farmacocinéticos foi inesperado. A presença de resíduos de ácido siálico de peptídeo glicosilado altamente estabilizado a proteína e protegido das interações com os receptores vasculares sem anular as principais determinantes da função de FIX.

[0387] FIX-CTP tem um efeito terapêutico semelhante ao rFIX em pacientes com Hemofilia B e dosagem necessária menos frequente. Uma única injeção de FIX-CTP é suficiente para o controle de episódios de sangramento e reduzir o número de injeções necessárias durante uma intervenção cirúrgica em pacientes com Hemofilia B.

[0388] A tecnologia CTP the foi utilizada para o desenvolvimento de um FIX de ação prolongada. Especificamente, estender a meia vida da molécula recombinante rFIX foi realizada pela fusão de pelo menos um CTP humano para FIX. O FIX-CTP recombinante foi expresso em células de mamíferos e caracterizado in vitro e in vivo. Foi demonstrado que a atividade in vitro do rFIX-CTP foi comparável ao rFIX. Estudos de farmacocinética e eficácia em camundongos demonstraram as propriedades melhoradas do rFIX-CTP. Os resultados deste estudo demonstram que é possível desenvolver uma molécula estendida de rFIX de meia vida tendo propriedades hemostáticas similares a enzima de tipo selvagem.

EXEMPLO 2 Avaliação Comparativa de FIX-CTP purificado3 vs FIX-CTP4 e FIX-CTP5

[0389] 2.1 Objetivo do estudo

[0390] A avaliação comparativa dos parâmetros farmacocinéticos de FIX-CTP4 e FIX-CTP5 vs. FIX-CTP3, seguindo um processo de purificação parcial.

[0391] 2.2 Produção de FIX-CTP4 e coletasFIX-CTP5

[0392] FIX de cDNA (OriGene RC219065) fundido no C-terminal para quatro ou cinco sequências CTP em conjunto foi expressa nas células Dg44 usando o sistema de expressão Excellgene na presença de 10 ng/L de vitamina K3 (Sigma, Mennadion). As coletas foram coletadas (300ml), filtradas e congeladas.

[0393] 2.3 Produção da coletade FIX-CTP3

[0394] FIX-CTP3 foi expressa internamente nas células CHO usando o vetor pCI-DHFR, clone 196, BR-9 na presença de 25 ng/L de vitamina K3 (Sigma). As coletas foram coletadas e filtradas.

[0395] Todas as amostras de FIX-CTP (CTP 3, 4 e 5) foram purificadas apenas pela coluna Jacalin devido à falta de material.

[0396] 2.4 Determinação do nível de antígeno de FIX

[0397] Nível de antígeno FIX foi determinada utilizando um kit Humano de ELISA FIX (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). A concentração da proteína calculada é a média de quatro corridas independentes. Concentração FIX-CTP3 foi ligeiramente superior em comparação com as duas versões adicionais (Tabela 10). Tabela 10: Nível de antígeno de FIX

[0398] 2.5 mancha de Coomassie FIX-CTP e immunoblot

[0399] FIX-CTP3, FIX-CTP4, e FIX-CTP5 coletas foram carregadas em 12% de gel Tris-glicina usando Precision Plus DualColor Protein Marker (Bio-Rad). A análise de SDS-PAGE foi realizada por Western immuno-blot usando anti-CTP policlonal Ab (Produção de Biotecnologia Adar) ou anti-Gla Ab (American Diagnostics).

[0400] Como anteriormente relatado, FIX fundido a três CTPs migrado em 80 kDa enquanto FIX fundido para quatro ou cinco CTPs migrado em 85 KDa ou 90 KDa, respectivamente. Como esperado, coletas deFIX-CTP4 e FIX-CTP5 a partir do Excellgene mostrou níveis muito baixos de carboxilação gama e FIX-CTP4 comparado com coleta FIX-CTP3 que foi produzido no Prolor (Figura 8).

[0401] Após um processo de purificação utilizando a coluna Jacalin (purificação imunoafinidade de proteínas glicosiladas), FIX-CTP3, FIX-CTP4, e FIX-CTP5 foram carregados em 12% gel de Tris-glicina usando Precision Plus Dual Color Protein Marker (Bio-Rad). O SDS-PAGE foi manchado pelo Corante Coomassie azul para a detecção de amostras. Todas as variantes apresentaram perfis de banda muito mais limpas (Figura 9), sugerindo uma maior pureza.

[0402] 2.6 Determinação da atividade cromogênica FIX

[0403] Uma avaliação comparativa da potência in vitro de totalmente purificada (coluna HA) FIX-CTP3, FIX-CTP4, e FIX-CTP5 vs. pool de plasma humano normal foi realizado usando um kit de teste da atividade cromogênica disponível comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Todas as amostras foram diluídas em série, e a potência foi avaliada comparando-se uma curva de resposta da dose para uma preparação de referência do plasma humano normal. A reduzida atividade cromogênica de FIX-CTP4 e FIX-CTP5 (Figura 10), em comparação com o plasma pode ser consequência das modificações pós-transcricional indevida das proteínas FIX, por exemplo, carboxilação gama inadequada e clivagem de pro-peptídeo ou, alternativamente, devido à adição de cassetes de CTP. A flutuação no FIX-CTP4 e atividade FIX-CTP5 (Tabela 11) pode ser causada por capacidades de quantificação inadequada do FIX ELISA devido ao mascaramento de CTP do sítio do antígeno. Tabela 11: Relação amostra/plasma EC50

[0404] 2.7 Estudo farmacocinético

[0405] FIX-CTP3 purificado por Jacalin, FIX-CTP4, e FIX-CTP5 (Grupo A, B e C, respectivamente) foram administrados em uma única injeção intravenosa de camundongos Sprague-Dawley (seis ratos por grupo de tratamento), na dose de 250 μg/kg de peso corporal. Amostras de sangue foram retirados do retro-orbital de 3 camundongos alternadamente em 0,083, 0,5 2, 5, 8, 24, 48, 72 e 96 horas após a dosagem. Plasma citratado (0,38%) foi preparado imediatamente após a amostragem e armazenado à -20°C até análise. Tabela 12: Estudar plano de operação PK

[0406] Concentração FIX nas amostras de plasma foram quantificados usando kits de ELISA FIX humanos (Biológicas Afinidades). O perfil farmacocinético foi calculado e é a média de 3 animais em cada ponto de tempo. As meias vidas terminais foram calculadas usando Soluções de PK de Software 2.0. Tabela 13 abaixo resume as concentrações FIX calculadas em pontos de tempo de amostragem diferentes. Tabela 13: Concentrações de FIX calculado

[0407] O perfil PK e um resumo dos parâmetros PK são apresentados na Tabela 14 abaixo e na Figura 11. Um perfil completo de análise de PK em todos os pontos de tempo sugeriu que a adição de 4 ou 5 cassetes CTP para FIX não aumentam a sua meia vida em comparação ao FIX-CTP3. O AUC após administração do FIX-CTO5 aumentada por 1,4 a 1,6 vezes vs. FIX-CTP3, que não foi estatisticamente significativo. Tabela 14: Perfil de PK e um resumo de parâmetros de PK

[0408] Desde 96h das amostras pós-dosagem foram mos para terem concentrações muito baixas de FIX, que estavam no limite inferior de quantificação do ensaio, a meia vida terminal foi recalculada fornecendo um cálculo mais preciso e cientificamente adequado (Tabela 15). De acordo com este cálculo, obtiveram-se diferenças ainda menores entre a meia vida de FIX-CTP3, FIX-CTP4, e FIX-CTP5. Tabela 15: Meia-vida terminal recalculada

[0409] 2.8 Conclusões:

[0410] No presente estudo, parâmetros farmacocinéticos e potencial atividade de FIX-CTP3, FIX-CTP4, e FIX-CTP5 da coagulação foram avaliados. Fusão de 4 e 5 CTPs para o FIX não forneceu uma extensão de meia vida superior ou melhorados, em comparação ao FIX- CTP3, e observou-se a redução da atividade cromogênica. Tabela 16 abaixo resume a melhoria percentual da meia vida para as diferentes variantes de FIX-CTP fundidos (1 a 5 CTPs). Fusão de CTP para FIX melhorou seu comportamento farmacocinético, mas, imprevisivelmente, esta melhoria foi limitada. Surpreendentemente, após a fusão de 3, 4 ou 5 CTPs em conjunto para FIX, foi calculado um valor similar de meia vida. Tabela 16: Resumo da melhoria da porcentagem de Meia Vida

[0411] Esses dados sugerem que a fusão de 3 CTPs para FIX produz uma melhoria máxima em meia vida da proteína, confirmando que o FIX-CTP3 é a variante ideal nos termos de meia vida, estrutura e potencial de atividade para o desenvolvimento clínico de coagulação.

EXEMPLO 3 FIX-CTP3 TRATAMENTO DE FIX-/- MODELO DE CAMUNDONGO HEMOFÍLICO

[0412] Como descrito acima, um estudo de teste FIX-CTP, FIX- CTP2 e FIX-CTP3 coletas do perfil PK e atividade coagulante vs rhFIX foi realizada. FIX-CTP3 exibiu um perfil PK melhorado, mantendo sua atividade coagulante vs FIX-CTP1 e coletas FIX-CTP2ou rhFIX. Para avaliar ainda este resultado, a proteína de Y-Carboxiglutamato FIX-CTP3 foi purificada. FIX-CTP3 apresenta um aumento de 3 vezes na meia vida e 4,5 vezes mais elevadas de AUC em comparação com o rhFIX em camundongos normais após uma única administração IV. FIX-CTP3 demonstrou uma redução in vitro cromogênica e atividade coagulante, provavelmente devido à clivagem insuficiente do pro-peptídeo de N-terminal e na modificação pós- transcricional apropriada (PTMs), tais como carboxilação de gama apropriado.

[0413] No estudo atual, as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas do humano recombinante FIX fundidos para três conjuntos CTPs foram testados nos camundongos deficientes FIX.

[0414] Finalidade do estudo:

[0415] Para determinar os parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos de rFIX-(CTP)3 vs. rhFIX comercial (BeneFIX®) em camundongos deficientes FIX após uma única administração IV de FIX- (CTP) 3 em uma atividade específica semelhante e dose (semelhante atividade específica para PD e semelhante constante FIX para PK).

[0416] Coleta de Produção de FIX-CTP3:

[0417] FIX de cDNA (OriGene RC219065-Thr 148) fundido no C-terminal para três conjuntos de sequências CTP foi expresso em células Dg44 usando sistema expressando Excellgene na presença de 25 ng/ml de vitamina K3 (Sigma, Mennadion). Cinco lotes separados contendo 5 litros de suspensão de células cultivadas (total de vinte e cinco litros) e coleta após o declínio de viabilidade para 60-70%. A coleta foi filtrada e congelada a -70°C.

[0418] Determinação da coleta nível de antígeno de FIX:

[0419] Coleta de nível de antígeno FIX foi determinada utilizando um kit humano de ELISA FIX (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). O nível de antígeno foi calculado por cada lote. A concentração FIX foi mantida através dos lotes diferentes (Tabela 17). Tabela 17: Nível de antígeno de FIX

[0420] Processo de purificação FIX-CTP3:

[0421] Realizou-se um estudo de purificação curto, um processo de purificação, usando as seguintes 3 colunas seguintes foi realizada: DEAE-Sepharose, Heparina Sepharose e HA Bio Rad Cerâmica de Hidroxiapatite tipo 1 (40 μm), FIX-CTP3. Proteína Y—carboxilada enriquecida foi purificada. Em breve: Cinco litros de coleta esclareceram foi descongelado no 4°C durante um período de 4 dias. Para cada lote de purificação, da coleta esclareceu (2 litros) estava concentrada 4 vezes e diálise contra 20 mM Tris-HCl pH 8,2 usando um cartucho de fibra oca descartável com um tamanho de corte de peso molecular nominal de 10 KDa. Este processo (UFDF1) foi realizado duas vezes, e um litro de UFDF1 foi carregado na coluna DEAE Sepharose, e Fator IX foi eluída com 20mm de Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl2 de pH 8,2. O produto foi diluído 1:1 com 20 mM de Tris-HCl, 10 mM CaCl2 de pH 7,5, e o pH foi ajustado para 7,5 antes do carregamento na coluna de Heparina Sepharose. A eluição foi realizada com 20 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, e 10 mM CaCl2 de pH 7,5. O produto eluído foi concentrado e diálise contra 10 mM de fosfato pH 6,8 usando um cassete Pellicon XL de 10 KDa corte da membrana (UFDF2). O produto foi carregado em uma coluna HA, e a fração ativada do Fator IX foi eluída com 150 mM de fosfato pH 6,8. O produto da purificação concentrava-se a uma concentração alvo de 2 mg/ml e diálise contra TBS de pH 7,45, dividido em alíquotas e armazenado a - 70°C.

[0422] O processo de purificação foi repetido cinco vezes, semanalmente, a fim de purificar o volume total (25 litros). Os processos de purificação foram nomeados HA# 6-10. Cada produto da purificação foi separadamente avaliado (App # 1-5). No final do processo de purificação, os diferentes lotes foram agrupados e concentrados ainda a uma concentração alvo de 4 mg/ml.

[0423] FIX-CTP3 propriedades analíticas:

[0424] Determinação do nível de antígeno de FIX

[0425] O nível de antígeno de proteína enriquecida FIX-CTP3 Y- carboxilada foi determinado utilizando um kit de FIX ELISA humano (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). A concentração de proteína calculada é a média de duas execuções independentes (Tabela 18). Tabela 18: FIX-CTP3 Nível de antígeno

[0426] SDS-PAGE blots:

[0427] FIX-CTP3 Y-carboxilada proteína enriquecida, rhFIX e rFIXa (FIX ativado) foram carregados em gel de Tris-glicina 12% usando Precision Plus Dual Color Protein Marker (Bio-Rad). A análise de SDS- PAGE Coomassie foi realizada pela coloração do gel com o reagente azul Coomassie (800 ng de proteína) (Figura 12). Um immunoblot Western foi realizado utilizando 100 ng de proteína com FIX policlonal Ab anti-humano (Figura 12B), anticorpo monoclonal anti-humano de carboxilação gama (American Diagnostics Cat #499, 3570) (Figura 12), anti-FIX pro-peptídeo policlonal Ab (Figura 12D) e anti-CTP policlonal Ab (Figura 12E). Como já relatado, FIX-CTP3 migrou em 75KDa.

[0428] O procedimento de purificação enriqueceu significativamente a porção FIX-CTP 3 enquanto reduzia as impurezas. O rendimento do processo de purificação foi muito baixo, variando em torno de 2-3% (dados não mostrados) devido a necessidade de coletar apenas as frações de FIX-CTP3 Y-carboxilada, conforme demonstrado no anti-Gla immunoblot (Figura 12B). Com base no immunoblot Coomassie e FIX, a porção FIX-CTP3 é de, somente, cerca de 60-70%, e faixas de peso molecular inferiores adicionais, presumivelmente com formas inferiores de glicosilação, também foram detectadas.

[0429] FIX-CTP3 atividade coagulante:

[0430] FIX-CTP3 atividade cromogênica:

[0431] Uma avaliação comparativa da potência in vitro da coleta de FIX-CTP3 e proteína enriquecida FIX-CTP3 Y-carboxilada, versus pool de plasma humano normal foi realizada usando um kit teste de atividade cromogênica disponível comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). A coleta e proteína de FIX-CTP3 foram diluídas em série, e a potência foi avaliada comparando-se uma curva de dose-resposta para uma preparação de referência consistindo de plasma humano normal. Como demonstrado anteriormente, a coleta de FIX-CTP3 foi 50 vezes menos ativa do que o pool de plasma humano (Tabela 19, Figura 13). Após a purificação de FIX-CTP 3, a atividade cromogênica foi significativamente melhorada e foi apenas 4,72 vezes menos ativa do que o pool de plasma humano (Tabela 19, Figura 13). A atividade cromogênica reduzida da coleta pode ser consequência de modificações pós-traducionais impróprias de variantes de proteína FIX, por exemplo, carboxilação gama inadequada e clivagem pro-peptídeo. Após a purificação e enriquecimento da fração de FIX-CTP3 Y-carboxilada, a atividade foi melhorada, demonstrando a importante contribuição da Y-carboxilação para a atividade FIX. Tabela 19: FIX-CTP3 atividade cromogênica

[0432] Ensaio de coagulação de uma fase (aPTT):

[0433] O tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) é uma medida da integridade das vias intrínsecas e comuns da cascata de coagulação. A aPTT é o tempo, em segundos, de coagulação do plasma após a adição de um ativador da via intrínseca, fosfolipídios e cálcio. O ponto principal do ensaio foi quantificar a capacidade de FIX-CTP3 para restaurar a atividade de coagulação do plasma humano FIX empobrecido pela adição de rhFIX. 200 μl de plasma humano deficiente em FIX foi misturado com 25 μg/ml de FIX-CTP3 e diluído adicionalmente em TBS. Após uma incubação de 60 segundos a 37°C, 50 μl de ativador PTT (Actin FS) e 50 μl de cálcio 25 mM foram adicionados à mistura, e determinou-se o tempo de coagulação em segundos usando um Coagulador Sysmex® CA 1500 (realizado pelo hospital Sheba, Naional Coagulation Center usando ensaio aPTT validados). A potência foi avaliada pela comparação de FIX- CTP3 para a curva de dose-resposta de uma preparação de referência de pool de plasma humano normal. Os resultados são expressos em percentagem de atividade interpolada a partir da curva padrão, cobrindo os níveis de FIX de <1-110%. FIX-CTP3 apresentou uma redução de 15-20 vezes em sua atividade de coagulação versus pool de plasma humano normal uma vez que a atividade a 5 μg/ml, que é o valor normal de FIX no corpo, demonstrou ser de 6,5% (Tabela 20). Tabela 20: FIX-CTP3 atividade coagulante

[0434] FIX-CTP3 também apresentou aumento do tempo de coagulação em comparação com BeneFIX® (Tabela 21 e Figura 14). Tabela 21: Comparativo de coagulação (aPTT) de tempo

[0435] Um ensaio de coagulação adicional foi executado independentemente em camundongos deficientes em FIX pelo Dr. Paul Monahan na Universidade da Carolina do Norte antes do início do estudo PK-PD. Os resultados do aPTT sugeriram que a atividade de coagulação FIX-CTP3 é 40 vezes menor que o pool de plasma humano normal como demonstrado pelo período mais longo (como medido em segundos) e concentrações mais elevadas que são necessárias para a atividade de coagulação adequada (Tabela 22). Tabela 22: Comparativo de atividade de coagulação

[0436] A atividade específica (u/ml), que foi baseada no nível de antígeno FIX calculado por ELISA para FIX-CTP3 e BeneFIX®, foi 4.46 e 198.9, respectivamente.

[0437] A inconsistência na atividade de FIX-CTP3 calculada conforme demonstrado no ensaio cromogênico VS ensaio aPTT pode ser explicada pela sensibilidade superior do ensaio aPTT e relevância in vivo. No ensaio de atividade cromogênico, uma quantidade adicional de reagentes e as enzimas estão presentes, o que pode ativar versões de correção menos potentes. A diferença entre os valores de atividade específica de FIX-CTP pode ser explicada pela utilização de diferentes reagentes e máquinas automatizadas. O valor de atividade calculado pela Universidade da Carolina do Norte foi usado para o projeto de estudo de PK-PD.

Detecção de proteínas FIXa:

[0438] Para confirmar que, após o processo de purificação, não ocorreu ativação de FIX (FIXa), um ensaio de detecção de FIXa foi realizado usando FIXa Biophen Chromogenic Assay (Cat. # Ref. 221812). O ensaio mede a quantidade de FIXa presente em uma amostra específica usando a cascata de atividade cromogênica, conforme descrito anteriormente. FIX-CTP3 e rhFIX foram diluídos e os níveis de FIXa foram avaliados. FIX-CTP3 não foi ativado através da purificação ou armazenamento (Tabela 23). Tabela 23: Detecção de FIXa

[0439] Estudo de PK-PD em FIX-CTP3: FIX-CTP3 e rhFIX (BeneFIX ®) foram administrados em uma única injeção intravenosa em camundongos deficientes em C57BI FIX em uma dose de 625 μg/kg de peso corporal contendo 100 IU FIX/kg de peso corporal. Amostras de sangue foram retiradas de retro-orbital de 3 camundongos alternadamente em 0.25, 4, 24, 48, 72 e 96 horas após a dosagem. Plasma citratado (0.32%) foi preparado imediatamente após a amostragem e armazenado em - 20'1 C até análise. O nível de antígeno hFIX foi avaliado, e realizou-se uma análise detalhada de PK. Para avaliar a capacidade do FIX-CTP3 de prolongar a atividade de coagulação dos animais deficientes em FIX em comparação com BeneFIX®, a atividade de FXI em amostras de plasma citratado, coletadas em camundongos tratados com FIX, foi calculado utilizando um ensaio automatizado de atividade FIX (Tabela 24). Tabela 24: Descrição de estudo * Somente pontos de coleta PK * * Veia da cauda sangrando em T=48 pós-dosagem; Coortes 1 e 3

[0440] FIX-CTP3 Perfil farmacocinético em FIX-/- camundongos

[0441] Concentração de FIX foi quantificada usando kits de FIX ELISA humano (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). O perfil farmacocinético foi calculado para cada proteína e é a média de três animais em cada ponto de tempo. A Tabela 25 abaixo e a Figura 15 resumem as concentrações de FIX calculadas em pontos de tempo de amostragem diferentes para os Coortes 1 e 3. O perfil de PK e um resumo dos parâmetros PK são apresentados a seguir (Tabelas 26 e 27). A análise PK foi também realizada na Coorte #2 para verificar a exposição (dados não mostrados). Tabela 25: Concentrações de FIX

[0442] Um módulo com dois compartimentos foi usado (software WinLin) para determinar a AUC0-inf, Tterminal e afastamento (CL). Os parâmetros de PK são descritos abaixo na Tabela 26. Tabela 26: Propriedades PK

[0443] A adição das três "cassetes" CTP para FIX com rhFIX alongado de meia-vida in vivo em, pelo menos, 2.5 vezes. AUC após administração de FIX-CTP3 in vivo aumentou 2 vezes versus rhFIX. Os camundongos injetados com FIX-CTP3 demonstraram um perfil PK melhorado em comparação com os camundongos injetados com BeneFIX®.

[0444] Perfil farmacocinético de FIX-CTP3 em camundongos com deficiência de FIX:

[0445] Em paralelo a amostragem de PK, os animais com deficiência de FIX administrados com BeneFIX ® ou FIX-CTP3, amostras de plasma citratado, tiveram a sua atividade coagulação avaliada por um ensaio aPTT, que foi interpretado em % de atividade. A % de atividade em cada ponto de coleta foi calculada como tempo de coagulação atual / tempo de coagulação de pool de plasma de camundongo normal*100. A Tabela 27 resume os valores de atividade após a administração de BeneFIX® ou FIX- CTP3.

[0446] Após a administração de FIX-CTP 3, atividade de coagulação significativa foi detectada uma hora após administração, atingindo 96% de atividade em quatro horas após a dosagem, enquanto o valor mais alto de atividade de BeneFIX® foi de 40% (Tabela 27, Figura 16). A atividade de coagulação de FIX-CTP3 foi mantida por um maior período de tempo, demonstrando atividade prolongada. A atividade de coagulação para os camundongos tratados com BeneFIX ® foi indetectável em pontos de tempo após 36 horas, enquanto os camundongos tratados com FIX-CTP3 continuaram a manter atividade mensurável em 72 horas pós-dosagem (Tabela 27, Figura 16). A análise da % do perfil farmacocinético de coagulação sugere que a atividade de coagulação do FIX-CTP3 é mantida por um período significativamente maior e sua meia- vida é quase duas vezes superior a Benefix ® (Tabela 28). Tabela 27: % de atividade de FIX Tabela 28: Atividade de Coagulação

[0447] 9.3 Desafio de sangramento dos camundongos deficientes em FIX

[0448] Foi administrada uma única injeção intravenosa de 100 IU/kg de BeneFIX ® ou rFIX-CTP 3 em camundongos deficientes em FIX. A veia da cauda foi ligeiramente clipped 48 horas após a dosagem e o tempo de sangramento da veia da cauda (TVBT) e a intensidade de sangramento (hemoglobina OD) foram avaliados. Um segundo desafio de sangramento foi realizado 15 minutos depois de atingir a homeostase, e os mesmos parâmetros foram medidos. Após o primeiro desafio de sangramento, o sangramento dos animais administrados com FIX-CTP3 foi significativamente menos intenso do que o sangramento BeneFIX ® como demonstrado pelo valores de Hemoglobina OD (Figura 17).

[0449] Uma vez que foi previamente relatado que durante o primeiro desafio de sangramento em camundongos hemofílicos, o tempo de sangramento não está necessariamente correlacionado com a eficácia do tratamento, e recomenda-se avaliar a homeostase após o sangramento adicional. Uma vez que o primeiro sangramento foi espontaneamente ou manualmente parado, um segundo desafio de sangramento foi realizado 15 minutos após o primeiro, e o tempo e intensidade de sangramento foram remedidos. Durante o segundo episódio de sangramento animais administrado com FIX-CTP3 tiveram o tempo e a intensidade de sangramento reduzidos, demonstrando que FIX-CTP3 estava ativo em pontos de tempo posterior (Figura 18).

[0450] Finalmente, os animais foram observados posteriormente nas 12 horas após o segundo desafio de sangramento, e todos os eventos recorrentes de sangramento foram documentados. Os animais administrados com FIX-CTP3 foram capazes de manter a homeostase do sangue pelas próximas 12 horas com nenhuma recorrência de episódios hemorrágicos. Em contraste, 50% dos camundongos tratados com BeneFIX® tiveram episódios de sangramento espontâneo da cauda (Tabela 29). Tabela 29: Resultado 12 horas depois da transecção da cauda

[0451] FIX-CTP3 recombinante, uma proteína de fusão composta de uma única molécula de FIX fundida em três "cassetes" CTP em conjunto foi desenvolvido para abordar a meia-vida curta dos produtos FIX atualmente disponíveis, utilizados para tratar pacientes com hemofilia B. Nós demonstramos que a meia-vida de eliminação do rFIX-CTP3 foi consistentemente de 2.5 a 4 vezes maior do que a rFIX em ratos (como anteriormente relatado) e em camundongos com deficiência em FIX.

[0452] Sem estar vinculado pela teoria, a proteína de fusão reduz a liberação de FIX e protege o FIX da atividade de protease, degradação por mascaramento e reduz a afinidade do FIX pelos receptores hepáticos. Em conjunto, estas características do domínio do CTP estendem a meia-vida do FIX.

[0453] Além da análise farmacocinética de rFIX-CTP3, examinamos as propriedades farmacodinâmicas do FIX-CTP3 em camundongos com deficiência de FIX. rFIX-CTP3 e rFIX foram administradas em doses comparáveis (em unidades) para compensar os níveis de deficiência de coagulação em camundongos com deficiência em FIX. Entretanto, o efeito do rFIX-CTP3 em camundongos com deficiência de FIX foi prolongado significativamente pelo menos 76 hr após a dose, atingindo um pico de atividade maior. A atividade de coagulação FIX-CTP3 começou após um atraso de 1 hora em relação ao BeneFIX ®. Ativação de FIX pode ser necessária uma vez que a adição de três CTPs em conjunto teoricamente pode mascarar o local de ativação e atrasar o início da cascata. Após a administração de FIX-CTP3, foi observada uma atividade de pico de 100%, enquanto a atividade BeneFIX ® foi de apenas 40%. A atividade inicial superior é um parâmetro muito importante e demonstra que a adição de 3 CTPs tem potencial para melhorar a recuperação.

[0454] A terapia de reposição de FIX profilática para pacientes com Hemofilia B visa manter os níveis plasmáticos em 1-2% de atividade de coagulação normal. O ensaio de sangramento da veia da cauda é um teste in vivo sensível que mede a capacidade de manter a homeostase de sangramento com valores de atividade baixos imitando o modelo de homeostase de sangramento humano. Em resposta ao desafio de sangramento de veia da cauda 48 horas pós-dosagem, os animais administrados com rFIX-CTP3 mantiveram a homeostase de sangue com episódios de sangramento mais curtos e menos graves, demonstrando uma atividade continuada de coagulação.

[0455] FIX é uma proteína complexa que contém um número de domínios funcionais que se submetem a extensas modificações pós- traducionais. Uma das principais modificações pós-traducionais para a atividade de FIX é a gama-carboxilação dos primeiros 12 ácidos glutâmicos no domínio Gla por carboxilase Y-glutamil dependente de vitamina K. Esta modificação facilita a ligação de FIX nas membranas fosfolipídicas e, assim, é fundamental para sua função. FIX quando não é gama-carboxilado não é funcional, e, portanto, a gama-carboxilação é uma etapa limitante de velocidade.

[0456] Este estudo este PK-PD foi realizado utilizando células transfectadas transitoriamente. Uma ampla avaliação analítica das modificações pós-traducionais é executada na proteína FIX-CTP3 estável produzida e secretada por um clone otimizado estável.

[0457] Com base nos dados apresentados, o fator de coagulação FIX-CTP3 tem o potencial de reduzir a frequência das injeções em pacientes recebendo doses profiláticas de rotina de terapia de reposição de FIX. Prevê-se que rFIX-CTP 3 pode conferir proteção prolongada de sangramento após cada dose de fator, diminuindo as unidades totais de fator necessário para tratar episódios de sangramento e/ou manter a hemostasia durante procedimentos cirúrgicos com menos injeções.

EXEMPLO 4 Geração e utilização de Fator de Coagulação FVII

[0458] A versão de ação prolongada do fator de coagulação ativado Fator VII (FVIIa) será útil para o tratamento de pacientes com hemofilia A e B. A proteína recombinante FVIIa-CTP3 tem o potencial clínico para melhorar o tratamento de pacientes com hemofilia, reduzindo a frequência de infusões e mesmo reduzindo a carga de droga, permitindo uma abordagem de tratamento profilático que pode melhorar significativamente a qualidade de vida de um paciente, evitando episódios de sangramento espontâneos e danos acumulados a articulação e outros órgãos.

[0459] A geração de uma molécula de FVIIa-CTP recombinante com uma meia-vida prolongada com base na fusão de FVII com um CTP humano é descrita neste documento. O FVIIa-CTP recombinante foi expresso em células de mamíferos e caracterizado in vitro e in vivo. Foi demonstrado que a atividade de rFVII-CTP foi comparável ao rFVII. Estudos farmacocinéticos e de eficácia em ratos demonstraram propriedades melhoradas de rFVII-CTP. Os resultados deste estudo demonstraram que é possível desenvolver uma molécula de rFVIIa com meia-vida estendida com propriedades hemostáticas muito semelhantes à enzima do tipo-selvagem.

[0460] Clonagem e expressão de molécula FVII recombinante: Vários clones de Fator VII foram construídos em nosso vetor de expressão eucariótica (pCI-dhfrr) (Figura 19). FL cDNA clone com MGC humano verificado (IRCM), contendo a sequência de coagulação homo sapiens Fator VII foi encomendado da "Open Biosystems" (OB- MHS4426). Os seguintes primers foram sintetizados por Sigma-Genosys na seguinte sequência: Primer 67: 5'CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCC3' (contém a extremidade 5' do Fator VII DNA e o sítio de restrição de XhoI) (SEQ ID NO: 5); Primer 68R: 5' TCTAGAATAGGTATTTTTCCACATG3' (contém o sítio de restrição de XbaI) (SEQ ID NO: 6); Primer 69: 5' TCTAGAAAAAAGAAATGCCAGC3' (contém o sítio de restrição de XbaI) (SEQ ID NO: 7); e Primer 70R: 5'GCGGCCGCATCCTCAGGGAAATGGGGCTCGCA3' (contém a extremidade 3' Fator VII DNA e o sítio de restrição de NotI) (SEQ ID NO: 8).

[0461] A clonagem foi realizada em dois conjuntos de reações PCR. A primeira reação foi conduzida com primer 67 e primer 68R usando um plasmídeo de cDNA com a sequência de Fator VII (OB-MHS4426) como um modelo; como resultado da amplificação por PCR, um produto de ~534 bp foi formado, isolado e ligado em um vetor de clonagem de TA (Invitrogen, Catálogo N°: K2000-01). Um fragmento de XhoI - Xbal contendo o terminal amino da sequência do Fator VII foi isolado. A segunda reação foi conduzida com primer 69 e primer 70 R e mais uma vez, um plasmídeo de cDNA com a sequência do Fator VII (OB-MHS4426) foi usado como um modelo. Como resultado da amplificação por PCR, um produto de ~813 bp foi formado e ligado em um vetor de clonagem TA (Invitrogen, Catálogo N°: K2000-01). Um fragmento de XhoI - Xbal contendo o terminal carbóxi da sequência do Fator VII foi isolado. Os dois fragmentos foram inseridos em nosso vetor de expressão eucariótica pCI-dhfr (ligação tripla) para produzir o clone 501-0-p136-1.

[0462] O plasmídeo 501-p136-1 (Fator VII em vetor pCI-dhfr) foi digerido com enzimas de restrição XhoI e KpnI. Um fragmento de ~1186 bp foi isolado. Um clone de Fator VII parcial (1180bp -1322bp) seguido por uma sequência CTP, sequência de terminação e a sequência de NotI que foi sintetizada por GeneArt (0721543) foi digerido com enzimas de restrição KpnI e NotI. Um fragmento de ~253 bp foi isolado. Os dois fragmentos foram inseridos em nosso vetor de expressão eucariótica pCI-dhfr (ligação tripla) para produzir o clone 501-1-p137-2. O pCI-dhfr-701-2-p24-2 foi digerido com enzimas de restrição XhoI e ApaI, e o grande fragmento (vetor) foi isolado.

[0463] pCI-dhfr-501-2-p137-2 (Fator VII-ctp x1) foi digerido com enzimas de restrição XhoI e ApaI, e uma inserção ~1200 bp foi isolada. O vetor e a inserção foram ligados para render 501-2-p139-2. As células Dg44 foram banhadas em pratos de cultura com 100mm de tecidos e crescidas a confluência de 50-60%. Um total de 2g deμ DNA foi usado para transfecção de uma placa de 100 mm, utilizando o reagente FuGene (Roche) em meio livre de proteína (Invitrogen CD Dg44). O meio foi removido 48 horas pós- transfecção e substituídas com um meio livre de proteína (Invitrogen CD Dg44) sem nucleosídeos. Após 14 dias, a população de células transfectadas foi transferida para frascos de cultura de tecido T25, e a seleção foi continuada por 10-14 dias até que as células começaram a crescer bem como um clone estável. Clones com alta expressão foram selecionados e cerca de 2x107 células foram usadas para inocular 300 ml do meio de crescimento em uma garrafa rolante de 1700cm2 (Corning, NY Corning) suplementada com 5 ng/ml de vitamina K3 (bissulfato de sódio menadiona; Sigma). O meio de produção (coleta) foi coletado após uma rápida diminuição da viabilidade celular a cerca de 70%. O meio de produção foi primeiro clarificado e, depois, concentrado aproximadamente 20 vezes e dialisado para PBS usando cassete de filtração de fluxo (10KDaMWCO; Millipore Corp, Billerica, MA).

[0464] Determinação do nível de antígeno de FVII

[0465] A codificação cDNA do peptídeo CTP foi fundido à extremidade de 3' da codificação cDNA de FVII humana. A construção de rFVII correspondente foi transfectada em células Dg44. Como um controle, foi utilizado um cDNA de rFVII humana. O meio de produção (coleta) foi coletado, concentrado e o FVII recombinante secretado foi posteriormente avaliado. rFVII, rFVII-CTP e os níveis de antígeno rFVII-CTP-CTP foram determinados pelo kit AssayMax Human FVII ELISA (AssayPro) (Figura 20A). Não houve diferença significativa ao nível de secreção de rFVII-CTP e rFVII-(CTP)2 em comparação com rFVII nativo.

[0466] SDS-PAGE blots

[0467] A análise de SDS-PAGE foi feita através do carregamento de 50 ng de proteína de rFVII coletada, purificada ou ativada. As amostras foram carregadas em gel Tris-glicina a 12% usando Precision Plus Dual Color Protein Marker (Bio-Rad). A análise de SDS-PAGE foi feita através da realização de um immunoblot Western usando um anticorpo monoclonal FVII anti-humano (Ab) (sistemas de R&D) ou anticorpo policlonal anti-CTP, gerado em Coelho.

[0468] O nível de antígeno rFVII correlacionado com o nível de proteína detectada em um SDS-PAGE imunotransferido com anti-FVII Ab. rFVII-CTP migrado como uma única fita enquanto o peso molecular correspondente do controle FVII foi de aproximadamente 52 KDa (dados não mostrados). Ambas as proteínas reagiram com anticorpos específicos para FVII em immunoblots. O rFVII-CTP também reagiu com anticorpos específicos para CTP. rFVII foi segregado na forma zymogene, sem vestígios de proteína ativada.

[0469] Atividade Cromogênica de FVII:

[0470] As atividades de coleta de rFVII, rFVII-CTP e rFVII- (CTP)2 foram determinadas utilizando um kit de teste cromogênico disponível comercialmente (AssaySense Human FVII Chromogenic Activity Assay Kit (AssayPro). Para a caracterização funcional de rFII-CTP e sua capacidade de ser ativado (FVIIa) posteriormente, rFVII-CTP concentrado (coletas) foram colocados em um kit de teste cromogênico disponível comercialmente disponível que medem a capacidade de TF/FVIIa para ativar o Fator X para Fator Xa que, na presença de substrato específico FXa, libera um sinal quantificado (AssayPro). A adição do peptídeo CTP no terminal C da proteína rFVII não prejudiquem a atividade de protease de serina FVII (Figura 20B, 20C).

[0471] Atividade de coagulação FVII:

[0472] O tempo de protrombina (PT) mede a via extrínseca da coagulação. O PT é o tempo (medido em segundos) do plasma coagular após a adição de um ativador da via extrínseca, fosfolipídios e cálcio. É usado para determinar a tendência de coagulação do sangue, especificamente na medida de dosagem do estado de varfarina, danos ao fígado e vitamina K. A faixa de referência para tempo de protrombina é geralmente em torno de 12 a 15 segundos. Especificamente, o ensaio quantifica a capacidade de coleta de FVII-CTP e FVII-(CTP)2 para restaurar a atividade de coagulação do plasma humano pobre em FVII pela adição de rhFVII. 300 μl de plasma humano deficiente em FVII foi misturada com 100 μl de coletas de FVII, FVII-CTP e FVII-(CTP)2 em concentrações específicas, ou pool de plasma humano normal e foi diluído adicionalmente. Após uma incubação de 60 segundos a 37° c, foram adicionados Fator de TECIDO (TF), CaCl2e fosfolipídios à mistura. Determinou-se o tempo de coagulação em segundos. A potência foi avaliada comparando-se uma curva de dose-resposta de coletas de FVII-CTP e FVII-(CTP)2 para uma preparação de referência consistindo de rhFVII ou de pool de plasma humano. Uma unidade de FVII ativo foi definida como a quantidade de FVII que é igual à atividade de um ml de plasma humano normal. A atividade de coagulação do PT de rFVII e rFVII-CTP foi medida em um Coagulômetro (Instrumentation Laboratory).

[0473] Como anteriormente demonstrado, a adição de um peptídeo CTP no terminal C da proteína rFVII não danifica a sua atividade de protease de serina e leva à iniciação e a ativação de um Fator X e Fator IX nativo em plasma humano. Após a inserção de um CTP adicional no terminal C, houve uma redução tripla da atividade de protease de serina (dados não mostrados).

[0474] Estudos farmacocinéticos:

[0475] As coletas de rFVII, rFVII-CTP e rFVII-(CTP)2 foram administradas por via intravenosa aos ratos Sprague-Dawley (seis ratos por substância) com uma dose de 100μg/kg de peso corporal. Para todos os experimentos in vivo, a quantidade da respectiva proteína foi determinada com base em um kit FVII ELISA. Para cada substância de teste FVII, a quantidade injetada foi calculada considerando as diferenças em relação ao peso molecular de rFVII versus rFVII-CTP, o que leva a uma concentração molar diferente.

[0476] Amostras de sangue foram desenhados retro- orbitalmente usando um esquema de amostragem alternante para minimizar a interferência dos níveis de procedimento de amostragem a serem quantificados: de 3 ratos em 30 e 90 min e em 2, 6 e 48 horas e os três ratos restantes em 15 e 60 min e no 1.5, 4 e 24 hrs alternadamente. Plasma foi preparado imediatamente após a amostragem e armazenado a - 20 °C até análise. A concentração de FVII foi quantificada pelo ensaio específico de FVII ELISA. A meia-vida e a área sob a curva (AUC) foram calculados usando uma regra trapezoidal linear. A comparação desses parâmetros de afastamento revelou que a meia-vida in vivo e rFVII-(CTP)2 AUC são significativamente superiores àquelas de rFVII (tabela 30). Tabela 30: Parâmetros de estudo PK

[0477] Caracterização de recombinantes FVIIa-CTP:

[0478] Durante a ativação, FVII é clivado em R152 resultando em domínios de cadeia leve e pesada que são mantidos juntos por uma ponte dissulfeto simples. rFVIIa-(CTP)2 é purificado e ativado por um processo de purificação de coluna de troca iônica. Para avaliar plenamente rFVIIa-(CTP)2, a proteína é carregada em SDS-PAGE sob condições de redução de FVIIa comercial (NovoSeven®). Os domínios de cadeia pesada e leve são separados e migram como faixas separadas de pesos molecular de 55 e 25 KDa. Ambas as proteínas reagem com anticorpos específicos para FVII, mas a cadeia pesada do rFVIIa-CTP reage especificamente com anticorpos específicos anti-CTP, indicando que esta faixa representa a cadeia pesada de FVII fundida a CTP. A cadeia leve reage especificamente com carboxilase anti-gama Ab. A concentração de proteína FVIIa é determinada pelo kit de ELISA específicos para FVIIa.

[0479] Sequenciamento de terminal FVIIa:

[0480] rFVII-CTP-CTP em proteínas purificadas ativadas ou zymogene foi separado por SDS-PAGE (em 12% Tris-glicina) e subsequentemente analisado por electroblotting para uma membrana PVDF. As fitas de interesse foram cortadas e colocadas em um filtro da fibra de vidro tratado com Biobrana purificada. A análise da sequência do terminal N foi realizada pela degradação Edmann usando um sequenciador da proteína líquida pulsada equipada com um sistema de micro-gradiente HPLC de 140C. A identidade da proteína recombinante e clivagem pro- peptídeo adequada é verificada adicionalmente pelo sequenciamento do terminal N.

[0481] Atividade de coagulação FVIIa:

[0482] Para avaliar a atividade de coagulação FVII-(CTP)2, é realizado um ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT). Amostra de plasma deficiente em FVII é substituída com rFVIIa (NovoSeven ®) ou rFVIIa-(CTP)2. 300 μl de plasma humano deficiente em FVII foi misturado com 100 μl de FVIIa ou rFVIIa-(CTP)2 em concentrações específicas, ou pool de plasma humano normal que foi diluído adicionalmente. Após incubação de 60 segundos a 37° C foram adicionados à mistura Fator de tecido (TF), CaCl2e fosfolipídios. Determinou-se o tempo de coagulação em segundos. A potência foi avaliada comparando-se uma curva de dose-resposta de rFVIIa-(CTP)2 para uma preparação de referência consistindo de rhFVIIa ou de pool de plasma humano normal. Uma unidade de FVIIa foi definida como a quantidade de FVIIa que é igual à atividade de 1 ml de plasma normal humano. A atividade de coagulação do aPTT de rFVIIa e rFVIIa-CTP )2 foi medida em um Coagulômetro (Instrumentation Laboratory). A atividade de coagulação aPTT de rFVIIa e rFVIIa-(CTP)2 é semelhante.

[0483] Estudos farmacocinéticos em ratos:

[0484] Para caracterizar a influência da adição de CTP ao rFVIIa em seu potencial de longevidade, um estudo farmacocinético comparativo em ratos foi executado. NovoSeven ® (rFVIIa) e rFVIIa-(CTP)2 em TBS são injetados IV em 6 ratos SD. Os níveis de FVIIa ao longo do tempo são detectados usando um kit de ELISA FVIIa. A meia-vida e AUC são calculados para cada proteína. A comparação desses parâmetros de afastamento revela que as medições de meia-vida, recuperação e AUC in vivo da rFVIIa-(CTP)2 são superiores aos de NovoSeven ®.

[0485] FVIIa-CTP in vivo eficácia do modelo (modelo de hemofilia do camundongo deficiente em FVIII):

[0486] Para avaliar o modelo de atividade in vivo, obtêm-se camundongos knockout FVIII, e uma colônia de procriação é estabelecida. 10 μg de recombinante comercial hFVIIa (NovoSeven ®) ou rFVIIa-(CTP)2 são injetados na veia da cauda de um camundongo knockout FVIII anestesiado (22-28g). A quantidade de proteína injetada é igual à concentração necessária de FVIII em plasma normal (5μg/ml). São colhidas amostras de sangue da cauda cortada em tubos capilares heparinizados em pontos específicos de tempo. Amostras de plasma são avaliadas para níveis FVIIa por ELISA, e a eficácia é medida por um ensaio de coagulação PTT.

[0487] Neste estudo, uma construção de fusão de FVII com CTP é gerado. Esta proteína recombinante é a base para um tratamento que fornece uma meia-vida prolongada e retenção de potência terapêutica.

[0488] Estes resultados sugerem que rFVIIa-(CTP)2 tem um efeito terapêutico semelhante ao rFVIIa em pacientes com hemofilia. Além disso, esta tecnologia exige dosagem menos frequente. Parece que uma única injeção de rFVIIa-(CTP)2 é suficiente para controlar os episódios de sangramento e reduzir o número de injeções necessárias durante a intervenção cirúrgica. Esta proteína recombinante pode ser usada como um tratamento profilático a longo prazo.

EXEMPLO 5 Avaliação comparativa de FVII-CTP3, FVII-CTP4e FVII-CTP5 purificado

[0489] 5.1 Estudo objetivo

[0490] Avaliação comparativa dos parâmetros farmacocinéticos e atividade de coagulação de FVII-CTP4 e FVII-CTP5 versus FVII-CTP3.

[0491] 5.2 Produção de coletas de FVII-CTP4 e FVII-CTP 5coletas

[0492] FVII de cDNA fundido no terminal C para quatro ou cinco conjuntos de sequências CTP foi expresso em células Dg44 usando sistema de expressão Excellgene na presença de 20 μg/L de vitamina K3 (Sigma, Mennadion). A coleta foi coletada (300ml), filtrada e congelada.

[0493] 5.3 Produção de FVII-CTP3 coleta

[0494] FVII-CTP3 foi expressa internamente no sistema de expressão mamífera, células CHO, usando vetor pCI-DHFR. Pool transfectado estável #71 foi cultivado em frascos de agitação, na presença de 25 ng/L de vitamina K3 (Sigma). As coletas foram coletadas e filtradas.

[0495] Todas as coletas de FVII-CTP (3, 4 e 5 CTPs) foram concentradas e dialisadas contra TBS (50 mM Tris, 150mM NaCl, pH 7,4) usando Pellicon XL MWCO 10kDa.

[0496] 5.4 Determinação do nível de antígeno de FVII

[0497] O nível de antígeno FVII foi determinado utilizando o kit FVII ELISA Humano (Zymotest hífen) (tabela 31). A concentração de proteína calculada é a média de duas execuções independentes. Tabela 31: Nível de antígeno FVII

[0498] 5.5 FVII-CTP immunoblot

[0499] As coletas de FVII-CTP3, FVII-CTP4, e FVII-CTP5 coletas foram carregadas em 12% de gel Tris-glicina (expedeon) usando Precision Plus DualColor Protein Marker (Bio-Rad). A análise de SDS-PAGE foi realizada por immunoblot Western usando anti-CTP policlonal Ab (Adar Biotech Production) ou anti-Gla Ab (American Diagnostica).

[0500] FVII fundidos a três, quatro e cinco CTP migrou em 80, 90 e 100kDa, respectivamente. Como esperado, as coletas de FVII-CTP4 e FVII-CTP 5 da Excellgene contem baixo teor de carboxilação gama em comparação com a coleta de FVII-CTP 3 que foi produzido no Prolor uma vez que o processo de produção não foi otimizado (Figura 21).

[0501] 5.6 Avaliação comparativa de FVII in vitro potência

[0502] Uma avaliação comparativa da potência in vitro de FVII- CTP3, FVII-CTP4, e FVII-CTP5 com HA purificado (fração altamente gama- carboxilada) versus pool de plasma humano normal foi realizada usando um kit teste de atividade cromogênica disponível comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). Todas as amostras foram diluídas em série, e a potência foi avaliada comparando-se uma curva de resposta da dose para uma preparação de referência consistindo de plasma humano normal. FVII-CTP3 e FVII-CTP5 demonstraram atividade cromogênica inferior ao pool de plasma normal (Figura 22). FVII-CTP4 demonstrou maior atividade como refletido pelas relações EC50, comparados ao FVII-CTP3 e FVII-CTP 5 (Tabela 32). Tabela 32: FVII In Vitro Atividade de Coagulação

[0503] 5.7 FVII In Vitro Atividade de Coagulação:

[0504] Ensaio da atividade de Fator VII (FVII), que foi realizado no Sheba Medical Center, Centro de Coagulação Nacional de Israel, é um ensaio baseado em protrombina (PT) usando plasma imuno-adsorvido deficiente em fator VII (Siemens). O reagente de PT é innovin, e o ensaio é realizado no instrumento Sysmex ® CA 1500. Intervalo normal de FVII é 55145%. Tabela 33: FVII In Vitro Atividade Cromogênica

[0505] Uma vez que o nível normal de FVII em circulação no corpo é em torno de 0,5 μg/ml, as coletas de FVII-CTP3 e FVII-CTP 5 apresentam uma redução de 3 vezes em sua atividade de coagulação versus pool de plasma humano normal; este resultado se correlaciona com a atividade cromogênica obtida (Tabela 33).

[0506] A coleta de FVII-CTP4 apresenta um aumento de 3 vezes em sua atividade de coagulação potencial versus pool de plasma humano normal, como observado no ensaio de atividade cromogênica (Tabela 33). O percentual de atividade de FVII-CTP4 é muito mais alto em comparação ao percentual de atividade de FVII-CTP3 e FVII-CTP5. As imitações metodológicas do método ELISA podem limitar a precisão dos cálculos de nível de Ag um FVII-CTP4.

[0507] 5.8 Estudo farmacocinético

[0508] Dois estudos farmacocinéticos foram realizados para determinar os parâmetros de farmacocinética (PK) do FVII-CTP3, FVII- CTP4e FVII-CTP5. Durante o primeiro estudo, FVII-CTP3, FVII-CTP4, e FVII- CTP5 (Grupo A, B e C, respectivamente) foram administrados em uma única injeção intravenosa de ratos Sprague-Dawley (seis ratos por grupo de tratamento), na dose de 250 μg/kg de peso corporal. Amostras de sangue foram retiradas retro-orbitalmente de 3 ratos alternadamente em 0.083, 0.5, 2, 5, 8, 24, 48, 72 e 96 horas após a dosagem. (Tabela 34). Plasma citratado (0,38%) foi preparado imediatamente após a amostragem e armazenado à -20°C até análise. Tabela 34: Design de Estudo Farmacocinético - Coleta Concentrada

[0509] A concentração de FVII em amostras de plasma foram quantificados usando kits de FVII Elisa humanos (Zymutest FVII-Biophen). O perfil farmacocinético foi calculado e é a média de 3 animais em cada ponto de tempo. Os valores de meias vidas terminais foram calculadas usando Soluções de PK de Software 2.0. Tabela 35 abaixo resume as concentrações FVII calculadas em pontos de tempo de amostragem diferentes. O perfil de PK (Figuras 23-24) e um resumo dos parâmetros PK também são apresentados a seguir (Tabela 36). FVII-CTP5 demonstrou um perfil superior em comparação com o FVII-CTP3 e FVII-CTP4 (Tabela 36). Tabela 35: Primeiro Estudo Farmacocinético - Concentrações de FVII Tabela 36: Análise farmacocinética

[0510] A adição de quatro ou cinco CTPs prolonga significativamente a meia-vida do FVII em comparação com 3 CTPs em 2 e 3 vezes, respectivamente (Tabela 36). Esta superioridade foi mais significativa na parte inicial do estudo (0.083-8 hr), sugerindo uma potencial recuperação de proteína melhorada e afastamento extra vascular reduzido. A administração de AUC após administração de FVII-CTP 4 e FVII-CTP5 aumentou, respectivamente, 3- e 4- vezes e, comparação ao FVII-CTP3. Afastamento também foi reduzido ao adicionar 4 e 5 CTPs de FVII (tabela 36).

[0511] , Como observado no estudo, a adição de quatro e cinco CTPs prolonga significativamente a meia-vida do FVII em comparação com 3 CTPs, tanto a meia-vida inicial quanto a terminal. Os valores da meia-vida no primeiro e no segundo estudo são diferentes devido a uma abordagem de análise diferente da que foi efetuada pela dose e duração de estudo, no entanto, a tendência geral foi mantida. A administração de AUC após administração de FVII-CTP 4 e FVII-CTP5 aumentou, respectivamente, 2.5- e 7- vezes e, comparação ao FVII-CTP3.

[0512] 5.9 Conclusões:

[0513] No presente estudo, parâmetros PK e atividade de coagulação potencial de FVII-CTP3, FVII-CTP4, e FVII-CTP5 foram avaliados. A Fusão de CTPs 4 e 5 em FVII fornece uma superior e melhorada meia-vida, exposição e redução do afastamento em relação ao FVII-CTP3, mantendo uma atividade cromogênica e in vitro semelhante. Estes resultados foram observados em diferentes concentrações de proteína e foram consistentes tanto para coleta de proteína e proteína purificada. Ao avaliar o efeito global da fusão do CTP no terminal C de FVII, a fusão de 1-5 CTPs aumentou consideravelmente a meia-vida e AUC de FVII de modo proporcional ao CTP, sugerindo que, conforme a porção de CTP da molécula aumenta, a longevidade e estabilidade do FVII são significativamente melhoradas, mantendo sua atividade de coagulação in vitro, como resumidos na Tabela 37 adiante. Tabela 37:

[0514] Como anteriormente relatados, a meia vida de FVII correlaciona-se com a meia vida da forma ativada de FVII (FVIIa) tanto em seres humanos quanto em animais. Portanto, prevê-se que uma melhoria similar na meia-vida será obtida pelas versões ativadas após a fusão de CTP.

EXEMPLO 6 Estudos de viabilidade de FVII-CTP3 em camundongos hemofílicos deficientes em FVIII

[0515] Foram realizados estudos descrevendo os testes acima de perfil de PK da coleta e atividade de coagulação de FVII-CTP, FVII-CTP2 e FVII-CTP3vs um FVII comercialmente disponível. FVII-CTP3 exibiu um perfil PK melhorado, mantendo sua atividade de coagulação vs e coletas de FVII-CTP e FVII-CTP2 ou rhFVII. Para caracterizar ainda mais o FVII-CTP3 in vitro e as propriedades in vitro, um mini pool estável expressando e secretando a proteína foi gerado, e desenvolveram-se processos de purificação e ativação.

[0516] No estudo atual, as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas de FVIIa-CTP3 foram testados em camundongos deficientes em FVIII. Avaliou-se o perfil PK da proteína. Um FVIIa específico baseado na atividade do perfil PK foi estabelecido e em relação ao produto comercial NovoSeven ®. Além disso, as capacidades hemostáticas in vivo de longa duração de FVIIa-CTP3 para induzir a coagulação em camundongos deficientes em FVIII após uma transecção de veia da cauda (estudo de sobrevivência) foram testados.

[0517] Objetivos do estudo:

[0518] Avaliar os parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos de FVIIa-CTP3 vs rhFVIIa comercial (NovoSeven ®) em camundongos deficientes em FVIII após uma única administração IV em uma dose de atividade semelhante.

[0519] Determinar a capacidade in vivo de FVIIa-CTP3 manter a homeostase em camundongos deficientes em FVIII com uma única administração IV de FVIIa-CTP3 e NovoSeven ® em uma dose de atividade semelhante, seguida de um desafio de transecção de veia de cauda (estudo de sobrevivência).

[0520] Produção de coleta de FVII-CTP3:

[0521] FVII-CTP3 foi expressa internamente nas células Dg44 usando um vetor pCI-DHFR. Um pool transfectado estável #71 foi cultivado em frascos de agitação, na presença de 25 ng/L de Vitamina K3 (Sigma). Suspensão de células foi cultivada e colhida após o declínio de viabilidade para 60-80%. A coleta foi filtrada e congelada a -70°C.

[0522] Determinação do nível de antígeno da coleta de FVII:

[0523] O nível de antígeno FVII foi determinado utilizando o kit FVII ELISA Humano (Zymotest HyPhen) (Tabela 38). O nível de antígeno foi calculado por cada lote de coleta pooled. Tabela 38: FVII-CTP3 Nível de antígeno

[0524] Processo de purificação de FVII-CTP3 (Figura 25)

[0525] Esboço do processo

[0526] Realizou-se um estudo de purificação curto, o processo de purificação seguinte usando 1 colunas foi realizado: Coluna de afinidade VlI-Select (GE) e Hidroxiapatita Cerâmica tipo 1 (HA), 40 μm (Bio-Rad), proteína enriquecida FVII-CTP3 Y-carboxilada foi purificada. Auto ativação foi induzida pela incubação de FVII-CTP3 purificado na presença de CaCl2 durante a noite em 2-8oC. O processo de purificação está em fase final de desenvolvimento e está sendo otimizado, assim, parte das etapas de purificação não são idênticos em dois lotes.

[0527] Ultra-filtração/ diafiltração (UFDF) usando 10kDa fibra oca ou cassetes Pellicon

[0528] A coleta clarificada foi descongelada a 4oC no fim de semana (2-3 dias).

[0529] No lote 31, a coleta clarificada (12 litros) foi concentrada em 4 vezes (em duas execuções sucessivas) usando um cartucho de fibra oca (GE Healthcare catálogo # UFP-10-C-4X2MA) com um corte de peso molecular de 10 KDa. Coleta concentrada foi diafiltrada contra 1-2 volumes de TBS (50mM Tris 150mM NaCl pH 7,4).

[0530] No lote 38, a coleta clarificada (8,5 litros) foi concentrada 4 vezes usando um cassete Pellicon 2 (Millipore) com um de corte de peso molecular de 10 KDa. Coleta concentrada foi carregada diretamente na coluna VII-Select.

[0531] Ambas ultra-filtrações foram realizadas no gelo com tampões de gelo frio. UFDF amostras foram filtradas a 0,22 μm antes do carregamento.

[0532] Captura em coluna FVII-Select

[0533] O UFDF ou coleta concentrada foi carregada na coluna VII-Select (XK16/20, CV 18ml), previamente incubada com TBS pH 7,4. A coluna foi lavada com 50 mM Tris-HCl, 0.5M NaCl pH 7.5, e FVII-CTP3 foi eluído com 50 mM Tris-HCl, 1M NaCl 50% (v/v), Propileno Glicol pH 7.5. O processo foi realizado em dois ciclos sucessivos, utilizando a mesma coluna.

[0534] Separação baseada em gama-carboxilação em uma coluna de hidroxiapatita cerâmica

[0535] O produto eluído foi diluído 1:10 com 10 mM de fosfato de sódio pH 6,8 e carregado em colunas de hidroxiapatita cerâmica (XK16/20, CV 24 ml). A coluna foi lavada com 59 mM de fosfato de sódio depH 6,8 e a fração rica Y-carboxilada de Fator VII foi eluída com 500 mM de fosfato de sódio pH 6,8. Este processo foi realizado em dois ciclos sucessivos, utilizando a mesma coluna. Em cada lote, os eluídos dos dois ciclos foram agrupados e concentrados a 1.7-2 mg/ml e filtrados por dia com 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl ph 8.2 para reduzir o volume e preparar o material para a etapa de ativação.

[0536] Ativação de FVII

[0537] FVII-CTP3 purificado foi diluído a 1 mg/ml e incubado em 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl e 1mM CaCl2 pH 8.2 em 2-8oC por 24 horas. Ativação foi terminada por troca de tampão (UFDF) para o tampão de formulação preliminar (20mM de Citrato, 240 mM NaCl, 13,3 mM glicina, pH 6,9).

[0538] Propriedades analíticas de FVII-CTP3 e FVIIa-CTP3:

[0539] SDS-PAGE e Western blots

[0540] FVII-CTP3, e FVIIa-CTP3 purificados foram carregadas em 12% de gel Tris-glicina usando Precision Plus DualColor Protein Marker (Bio-Rad). A análise de Coomassie SDS-PAGE foi realizada pela coloração do gel com o reagente azul brilhante Coomassie (5 ou 10 μg de proteína /pista). Realizou-se análise Western blot (1 μg de proteína / pista) usando FVII policlonal Ab anti-humano (R&D systems; AF2338), anticorpo monoclonal anti-humano gama carboxilação (American Diagnostics Catálogo #499, 3570), e Ab policlonal anti-CTP. Sob condições reduzidas, FVII-CTP3 migrou no 75KDa e FVIIa-CTP3 migrou como duas bandas principais: uma cadeia pesada em 50 kDa e uma cadeia leve em 25 kDa, representada na Figura 26 como fitas 2 e 3, respectivamente.

[0541] O procedimento de purificação enriqueceu significativamente a porção FVII-CTP 3 enquanto reduzia as impurezas. O rendimento do processo de purificação foi de 25-30% FVII (de acordo com ELISA). A maioria da proteína perdida durante a purificação tinha baixa atividade cromogênica FVII ou nenhuma atividade. Com base na SDS- PAGE de coloração Coomassie, o FVIIa-CTP3 reduzido contém mais do que as fitas previstas. Uma fita migrando para cerca de ~75 kDa representa FVII não-ativado (Figura 26, Fita 1). Essa fita é composta por duas fitas com pequenas diferenças MW, que podem refletir teor de Y-carboxilação diferente. Fitas adicionais com MW inferior a 20 kDa foram observadas. Isto foi relatado anteriormente como degradação de produtos da cadeia pesada.

[0542] Atividade cromogênica de FVII-CTP3:

[0543] Uma avaliação comparativa da potência in vitro da coleta de FVII-CTP3, frações durante o processo, e FVII-CTP3 purificado versus pool de plasma humano normal foi realizada usando um kit teste de atividade cromogênica disponível comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). A coleta e proteína de FVII-CTP3 foram diluídas em série, e a potência foi avaliada comparando-se uma curva de dose-resposta para uma preparação de referência de plasma humano normal. Após a purificação de FVII-CTP3, a atividade cromogênica foi significativamente melhorada, e frações inativas foram separadas principalmente por coluna HA (Figura 27). Observou-se uma forte correlação entre atividade cromogênica FVII e detecção de FVII com anticorpos monoclonais anti-Gla no Western blot. A potência da atividade cromogênica de FVII como refletido pelo valor de EC50 na coleta é afetada tanto por frações de FVII carboxiladas quanto por não-carboxiladas. Após a purificação e enriquecimento da fração de FVII-CTP3 Y-carboxilada, a atividade foi melhorada, demonstrando a importante contribuição da Y-carboxilação para a atividade FVII. (Figura 27) Este parâmetro é crucial para a atividade FVII in vivo adequada e será abordado adicionalmente em um programa de desenvolvimento de clone.

[0544] Determinação de proteína por A280

[0545] O coeficiente de extinção teórica de FVIIa-CTP3 e NovoSeven ® foi calculado usando o algoritmo de ProtParam (http://web.expasy.org/ protparam). O cálculo é baseado na sequência de aminoácidos. Os coeficientes de extinção calculados para FVII-CTP3 e NovoSeven ® é 1.186 e 1.406, respectivamente. Estes valores representam a absorvância de 1 g/L em 280 nm.

[0546] A diferença do coeficiente de extinção entre as duas proteínas deriva exclusivamente do aumento de peso molecular de FVIIa- CTP3 comparado com NovoSeven ®, uma vez que o CTP carece de resíduos aromáticos e de cisteína, assim, não contribui para a absorção.

[0547] Determinação de proteína por A280 é usada para FVII final, e para amostras purificadas no processo, a partir da eluição de coluna VII-Select.

[0548] Determinação do nível de antígeno de FVIIa

[0549] O nível de antígeno FVIIa foi determinada utilizando o kit de ELISA de FVIIa humana (IMUBIND, American Diagnostic). O nível de antígeno foi calculado por cada lote. No entanto, esta ferramenta não foi útil para a determinação da dose por injeção, uma vez que isso não representava a quantidade de produto ativo.

[0550] Ensaio de coagulação de FVIIa-Staclot ® VIIa-rTF

[0551] FVIIa é derivado de uma clivagem intra-cadeia de FVII de cadeia única. Fator tecidual nativo (TF) é um cofator de FVIIa. Mediante ligação de TF, FVII media a ativação do Fator X a Xa, enquanto o próprio é transformado em FVIIa. O fator de tecido solúvel é a parte extracelular do fator tecidual nativo. Ele já não pode ativar FVII por auto-ativação, mas o FVIIa vinculado ao fator tecidual pode ativar FX para FXa.

[0552] O fator de tecido solúvel recombinante (rsTF) usado neste ensaio utiliza a FVIIa especificidade para construir um teste de coagulação FVIIa. O rsTF, na presença de FVIIa, cálcio e fosfolipídios leva à coagulação do plasma, sem ativar o FVII para FVIIa.

[0553] O tempo de coagulação observado neste sistema tem uma relação inversa com o teor de FVIIa na amostra testada, sem interferência da presença FVII na amostra.

[0554] O ensaio foi realizado pelo Omri Laboratories (Nes- Ziona, Israel). A atividade de FVIIa foi avaliada para NovoSeven ® após reconstituição e FVIIa-CTP3 antes de cada estudo. A atividade NovoSeven® não se correlacionam com a atividade antecipada conforme relatado no rótulo do frasco, mas a discrepância pode ser devido a uma abordagem diferente para a avaliação da atividade. A Tabela 39 resume a atividade de coagulação de FVIIa por volume, sem considerar a concentração de proteína. Tabela 39: Atividade de coagulação de FVIIa de produtos do lote

[0555] Atividade específica de FVIIa-CTP3

[0556] A atividade específica de FVIIa (que é calculada como a atividade/ml dividida pela concentração de proteína) foi calculado com base na A280 e é apresentada na tabela 40. Ao comparar a atividade específica das duas moléculas, que diferem em MW, deve ser feita a compensação para normalizar a atividade (ou seja, por causa da diferença de peso molecular, o número de sites ativos em 1 mg de NovoSeven ® é 1.185- vezes superior que em FVIIa-CTP3). Cálculo do fator de conversão é apresentado na seguinte equação: Tabela 40: Atividade específica de FVIIa-CTP3 em comparação com

[0557] Estudo de PK-PD de FV Ia-CTPs:

[0558] Descrição de estudo

[0559] FVIIa-CTP3 e rhFVIIa (NovoSeven ®, NS) foram administrados em uma única injeção intravenosa em camundongos deficientes em FVIII C57B na dose de 6.4E6 U/kg de peso corporal (160.000 U/animal). Amostras de sangue foram retirados do retro-orbital de 4 camundongos alternadamente em 0.166, 0.5, 2, 4, 8, 12, 24, 34, 48, 58, e 72 horas após a dosagem (Tabela 41). Plasma citratado (0.32%) foi preparado imediatamente após a amostragem e armazenado a - 20°C até análise. Nível de atividade de coagulação de FVIIa foi avaliada, e realizou- se uma análise detalhada de PK. O estudo foi realizado pelo Omri Laboratories (Nes-Ziona, Israel). Tabela 41: Descrição de estudo

[0560] Perfil PK de FVIIa-CTP3 em camundongos deficientes em FVIII

[0561] Atividade FVIIa usando um kit Staclot® VIIa-r Ia-CT em a TF (S P3 em camundongos deficientes mostras de sangue foi quantificada tago, Parsippany, NJ). O perfil farmacocinético foi calculado para cada proteína e representa a média dos 4 animais em cada ponto de tempo. Figura 28 apresenta o perfil PK de FVIIa durante todo o experimento. Recuperação de FVIIa é apresentada na tabela 42. Um resumo dos parâmetros PK é apresentado na Tabela 42.

[0562] A Tabela 41 resume os valores de atividade de coagulação após a administração tanto de NovoSeven® quanto FVIIa- CTP3. FVIIa-CTP3 e NovoSeven ® atingiram a atividade máxima meia-hora após a dosagem. Valor mais alto de atividade do NovoSeven ® alcançou apenas 43% do valor de atividade máxima do FVIIa-CTP3. A atividade de coagulação de FVIIa-CTP3 foi mantida por um maior período de tempo, demonstrando atividade prolongada. A atividade de coagulação para os camundongos tratados com NovoSeven® foi indetectável em pontos de tempo após 12 horas, enquanto os camundongos tratados com FVII-CTP3 continuaram a manter atividade mensurável em 48 horas pós-dosagem (Tabela 41 e Figura 28).

[0563] A adição de três cópias do CTP em conjunto ao FVIIa elevou a recuperação em 100% (tabela 42), como medido pela a mais alta atividade pós-dosagem em comparação com a atividade antecipada com base na análise in vitro e aumentou a meia-vida e o tempo de residência médio (MRT) em 5 vezes. O tempo de exposição (AUC) foi aumentado 3 vezes (tabela 43). Tabela 41: Atividade de coagulação de FVIIa após uma única injeção IV Tabela 42: Recuperação d e FVIIa-CTP3 * Cmax antecipado é derivado da dose administrada dividida em volume de sangue Tabela 43: Parâmetros de PK de FVIIa-CTP3 vs NovoSeven ®

[0564] Ensaio de geração de trombina (TGA)

[0565] A geração de trombina é uma parte fundamental da cascata de coagulação, e como tal uma estimativa de quanto um determinado indivíduo pode gerar trombina pode correlacionar com qualquer um risco de hemorragia ou trombose. As variáveis comumente medidas quando se analisa a geração de trombina Incluem: o tempo de retardo, o tempo até o pico de geração de trombina, o pico, o potencial de trombina endógena [ETP] (isto é, a área sob a curva e a cauda), o curso do tempo do trombograma ("TG"). Depois de um tempo de retardo, observa-se uma explosão de trombina. No entanto, coagulação ocorre no final do tempo de retardo, quando mais de 95% de toda trombina não foi ainda formada. O ensaio de geração de trombina foi realizado no Omri Laboratories, usando reagentes trombinoscópicos suplementados com plasma humano hemofílico. O TGA reflete a capacidade de coagulação no plasma de camundongos, derivado de injeção de NovoSeven ® e FVIIa- CTP3. A figura 29 apresenta valores de parâmetro TGA para plasma dos camundongos após a administração de FVIIa-CTP3 ou NovoSeven ®. Após a administração de FVIIa-CTP3, todos os três parâmetros (taxa de geração de trombina, quantidade máxima de trombina gerada e Klla) demonstram uma vantagem de FVII-CTP3 sobre tratamento com NovoSeven ®. Isso reforça ainda mais a noção de superioridade de ação prolongada potencial de FVII-CTP3 em comparação com NovoSeven ®.

[0566] Estudo de Transecção (TVT) da Veia da Cauda FVIIa- CTP3:

[0567] Descrição de estudo

[0568] Os dados obtidos a partir do teste PK/PD para FVIIa- CTP3 forneceram insights sobre a funcionalidade do FVIIa-CTP3 e demonstrou que o FVIIa-CTP3 tinha uma vantagem farmacocinética quando comparado com NovoSeven ®. No entanto, a capacidade da proteína para induzir um coágulo in vivo, após um evento traumático ainda não foi demonstrada. A fim de avaliar a capacidade de FVIIa-CTP3 para parar o sangramento, o mesmo modelo de camundongos deficientes em FVIII foi utilizado para um desafio de sangramento.

[0569] Foi administrados uma única injeção intravenosa de FVIIa-CTP3 ou NovoSeven ® em camundongos deficientes em FVIII. Os camundongos foram tratados com drogas em quantidades que forneceram atividade de FVIIa equivalente (1.6E05 unidades, 200 μl), calculada de acordo com a potência de cada droga, avaliada no ensaio de atividade de coágulo do FVIIa (tabela 44). As doses administradas foram 9 mg/kg de NovoSeven ® e 40 mg/kg de FVII-CTP3 devido a atividade reduzida de FVIIa-CTP3. Em um grupo de controle foi injetado 200 μl veículo.

[0570] A veia da cauda foi transfectada 2,7 cm a partir da ponta da cauda 15 min (injeção 1), 24 horas (injeção 2) ou 48 horas (injeção 3) pós-administração, e sobrevivência de ratos foi gravada por 24 horas. Tabela 44: Avaliação de amostras injetadas

[0571] Concentração de proteína foi determinada por A280.

[0572] Resultados

[0573] Dados de grupos de controle injetado com veículo para as três injeções (5 animais x 3 injeções), foram resumidas e são apresentadas na figura 30. Sobrevivência de 30% foi observada 24 horas depois da transecção da veia da cauda.

[0574] Os camundongos tratados com NovoSeven® e FVIIa- CTP3 demonstraram atividade hemostática adequada após a transecção de veia de cauda 15 min após a administração de FVIIa. Observou-se uma taxa de sobrevivência de 100% em animais tratados com FVIIa-CTP3 e NovoSeven ® (Figura 30).

[0575] A taxa de liberação reduzida de FVII-CTP3, que foi demonstrada no estudo PK/PD é mais claramente apreciado após a transecção de veia uma cauda pós-administração de 24 horas. Observa-se um declínio na taxa de sobrevivência de NovoSeven ®. Semelhante ao grupo controle, a morte de 50% é observada dentro de 10 horas. Entretanto, 90% dos camundongos tratados com FVIIa-CTP3 sobreviveram (Figura 30). Este resultado enfatiza a eficácia de longa duração do tratamento com FVIIa-CTP3.

[0576] 48 horas após a administração, um declínio na taxa de sobrevivência é demonstrada nos grupos tratados com FVIIa-CTP3 ou NovoSeven ® (Figura 30). Observou-se uma ligeira melhoria em camundongos com FVIIa-CTP, mas a diferença não alcançou significância estatística.

[0577] Discussão:

[0578] Fusão de CTP com proteínas recombinantes estende a meia-vida circulatória de proteínas, mantendo atividade comparável. Enquanto o mecanismo por trás do afastamento reduzido de proteína acima de um tamanho limite de 70 KDa é bem compreendido em relação ao afastamento renal, proteção adicional é conseguida após a fusão do CTP. Acredita-se que a fusão de CTP faça uma varredura do escudo da proteína e o protege de clivagem proteolítica, para aumentar o seu peso molecular radial devido a carga altamente negativa e reduzir sua afinidade aos receptores de liberação hepática.

[0579] O presente estudo objetivou-se a fornecer uma visão específica sobre o impacto da fusão do CTP de FVII no afastamento e a meia-vida da proteína e também abordar o paradigma de sua atividade específica após essa modificação. Camundongos deficientes em FVIII foram administrados com uma única injeção IV de FVIIa-CTP3 ou FVIIa comercial recombinante (NovoSeven ®) na dose semelhante (unidade baseada) e realizou-se uma análise baseada em atividade de PK. FVIIa- CTP3 demonstrou uma longevidade superior, como refletido por um aumento de 5 e 3.5 vezes de sua meia-vida e AUC, respectivamente. A atividade específica (U/mg) de FVIIa-CTP, como calculado pelo kit de atividade Staclot ® dividido pela concentração da proteína medida pelo A280 foi mostrada sendo 4 - 5 vezes menor do que a atividade específica do NovoSeven ®.

[0580] Para construir a compreensão de como o CTP afeta os efeitos hemostáticos de FVIIa in vivo, a capacidade de FVIIa-CTP3 para reduzir o sangramento foi investigada. No modelo de sangramento por transecção de veia da cauda em modelos de camundongos hemofílicos, administração do rFVIIa pode melhorar a sobrevida dos animais deficientes e evitar que sangrem até a morte. No estudo descrito neste documento, os animais foram administrados com FVIIa-CTP3 ou NovoSeven ®. Ambas as moléculas foram capazes de manter a homeostase, quando realizou-se a transecção 0,25 horas pós-dosagem. Uma duração da atividade prolongada significativamente foi demonstrada pelo grupo tratado com FVIIa-CTP3- quando a transecção da cauda foi realizada 24 hr após dosagem. A taxa de sobrevivência do grupo tratados com veículo foi maior do que o antecipado e maior do que o obtido em estudos anteriores (50% vs. 20% em estudos anteriores, dados não mostrados). A porcentagem de sobrevivência dos animais tratados é avaliada adicionalmente em pontos de tempo anteriores, incluindo 36 hrs pós-dosagem.

[0581] Concluindo, foi demonstrado que o FVIIa-CTP3 tem uma duração maior da atividade em camundongos hemofílicos, que se traduz em uma maior duração do efeito hemostático, quando comparado com NovoSeven ®. Os dados coletados sugerem que a fusão de CTP de FVII é uma tecnologia com potencial para melhorar significativamente o tratamento profilático em pacientes com hemofilia.

EXEMPLO 7. AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO PERFIL DE FVII-CTP3 PURIFICADO vs. FVII-CTP5 APÓS ÚNICA INJEÇÃO IV ou INJEÇÃO SC EM RATOS SD Objetivos do estudo:

[0582] Foram realizados dois estudos:

[0583] O primeiro objetivo do estudo foi determinar os parâmetros farmacocinéticos de rFVII-CTP3 versus rFVII-CTP5 após seleção de FVII e de purificação de coluna HA em ratos Sprague Dawley machos, após uma única administração intravenosa de 50μg/animal.

[0584] No segundo estudo, os parâmetros farmacocinéticos rFVII-CTP3-HA versus rFVII-CTP5-HA, foram examinados em ratos Sprague Dawley machos após uma única administração intravenosa ou subcutânea de 100 μ g/animal.

RESULTADOS

[0585] Determinação de nível de antígeno FVII-CTP3 e de FVII-CTP 5

[0586] O nível de antígeno FVII foi determinado utilizando o kit FVII ELISA Humano (Zymotest HyPhen) (ver Tabela 45). T

[0587] Tabela 45. Resume a concentração de proteína calculada que é a média de três execuções independentes.

Análise Western blot das amostras examinadas

[0588] Amostras de FVII-CTP3, 5 foram carregadas em 4-12% bisTrisgel (NuPage, invitrogene) usando Precision Plus dual color marker (Bio-Rad). A análise de SDS-PAGE foi realizada por immunoblot Western usando anti FVII policlonal Ab (R&D systems) ou anti CTP policlonal Ab (Adar biotech production) ou anti Gla Ab (American diagnostica). Resumindo, FVII fundido a três e cinco CTP migrou em 80, e 100kDa, respectivamente (ver Figura 31).

Avaliação comparativa de potência de FVII in vitro

[0589] Ensaio da atividade de FVII, que foi realizado no Sheba Medical Center, o centro de coagulação nacional, é um ensaio baseado em PT usando plasma imuno-adsorvido deficiente em fator VII (Siemens). O reagente de PT é innovin, e o ensaio é realizado no instrumento Sysmex CA 1500. Intervalo normal de FVII é 55-145%. Exemplos de atividades estão resumidos na Tabela 46. Tabela 46: Atividade da amostra

[0590] O nível normal de FVII em circulação no corpo é cerca de 0.5μg / ml. Ambos, FVII-CTP3 e FVII-CTP5 exibem reduções de cerca de 5 vezes na sua atividade de coagulação versus pool de plasma humano normal.

Estudos farmacocinéticos:

[0591] Dois estudos farmacocinéticos foram realizados para determinar os parâmetros e perfis farmacocinéticos (PK) de FVII-CTP3e FVII-CTP5 (após seleção de coluna HA de FVII). No primeiro estudo, FVII- CTP3, e FVII-CTP5 após seleção de FVII / purificação de HA foram administrados em uma única injeção intravenosa em ratos Sprague Dawley (seis ratos por substância) em uma dose de 50 μg/rato.

[0592] Amostras de sangue foram retirados retro-orbital de 3 ratos alternadamente em 0.083, 0.52, 5, 8, 24, 48, 72, 96 e 120 horas após a dosagem. Plasma citratado (0,38%) foi preparado imediatamente após a amostragem e armazenado à -20°C até análise.

[0593] No segundo estudo, somente as amostras após a coluna HA foram testadas. Estas amostras foram administradas em uma única injeção intravenosa ou subcutânea nos ratos Sprague Dawley (seis ratos por substância) usando uma dose de 100 μg/rato. Amostras de sangue foram coletadas nos mesmos pontos de tempo e condições que os do primeiro estudo acima descrito.

[0594] Tabela 47. Design do primeiro estudo (seleção de FVII vs FVII HA).

[0595] Tabela 18. Design do segundo estudo (IV vs SC)

[0596] As principais diferenças entre estes dois estudos são as doses e a via de administração. No primeiro estudo, os ratos foram injetados IV com 50 μg\rato, enquanto no segundo estudo, os ratos foram injetados IV ou SC com 100 μg\rato (total 500 μg/kg; peso dos ratos 200 g). O aumento da dosagem é devido à mudança no tipo de administração; Administração SC requer quantidades mais elevadas para obter efeitos semelhantes para administração IV.

Análise de estudo de PK

[0597] A concentração de FVII em amostras de plasma foram quantificados usando kits de FVII Elisa humano (Zymutest FVII-Biophen). Os perfis farmacocinéticos foram calculados e refletem a média para 3 animais em cada ponto de tempo. Os valores de meias vidas terminais foram calculadas usando Soluções de PK de Software 2.0. A Tabela abaixo resume as concentrações FVII calculadas em pontos de tempo de amostragem diferentes. O perfil de PK e um resumo dos parâmetros PK são apresentados na tabela a seguir.

[0598] Tabela 49. Primeiro estudo farmacocinético (seleção de FVII vs. FVII HA) -Concentrações de FVII (ng\ml).

[0599] Tabela 50. Segundo Estudo farmacocinético (IV vs SC) - Concentrações de FVII (ng\ml).

[0600] Tabela 51 Análise de PK - primeiro estudo farmacocinético (FVII S vs HA).

[0601] A adição de cinco CTP prolonga a meia-vida de FVII em comparação a 3 CTPs. Ambas as formas de CTP 5 (ou seja, FVIIS e FVII HA) foram detectadas ao longo dos pontos de tempo (96 e 120 h), enquanto FVII-3 CTP HA e CTP FVIIS -3 foram detectados até 72 horas e 96 hr, respectivamente. Com base neste fato, a meia-vida de FVII-5 CTPs é maior do que as variantes de 3 CTPs (ver Fig. 32). Comparando a meia- vida de todos os materiais examinados (CTPs de 3 e 5) com os mesmos pontos de tempo (8-72 hr) mostrou que a meia-vida são semelhantes, embora com 5 CTP seja bem mais longa (Fig. 32).

[0602] Tabela 52: Análise de PK - segundo estudo

[0603] Novamente, como observado no primeiro estudo, a adição de 5 CTPs prolongou a meia-vida de FVII em comparação com a adição de 3 CTP, tanto na meia-vida inicial quanto no terminal e em ambas as formas de administração (IV e SC, ver Fig. 33). Como esperado, após a administração SC, FVII foi detectado primeiramente no sangue em um momento posterior de tempo comparado a quando foi administrado IV.

[0604] No exemplo acima, dois estudos de PK foram resumidos. O objetivo principal do primeiro estudo foi verificar a diferença entre FVII- 3CTP e FVII-5 CTP depois de 2 colunas diferentes: Seleção de FVII e FVII HA. Em nossos estudos anteriores, foi verificado a coleta vs proteínas purificadas e descobriu-se que a diferença entre 3 e 5 CTP de FVII é maior quando a coleta foi injetada nos ratos.

[0605] Não havia nenhuma diferença significativa entre os resultados de FVII 3\5 CTP após ambas as colunas, portanto, foi decidido injetar FVII HA 3\5 CTP no segundo estudo.

EXEMPLO 8 ESTUDO DE SOBREVIVÊNCIA FVIIa-CTP3EM CAMUNDONGOS COM DEFICIÊNCIA DE FVIII APÓS INJEÇÃO SUBCUTÂNEA (MOD-5014) Objetivo do Estudo

[0606] Avaliar a eficácia do NovoSeven ®, MOD-5014 (FVIIA- CTP3) e MOD-5019 (FVIIA-CTP5) em um estudo de transecção de veia de cauda, após a administração subcutânea.

PROPRIEDADES ANALÍTICAS DE FVIIa-CTP3 (MOD-5014) e FVIIa-CTP5 (MOD 5019): Determinação de proteína por A280

[0607] O coeficiente de extinção teórica de NovoSeven® foi calculado usando o algoritmo de ProtParam (http://web.expasy.org/protparam). O cálculo é baseado na sequência de aminoácidos. O coeficiente de extinção calculada para NovoSeven ® é de 1.406 e para MOD-5019 é 1.075 (valores representam a absorvância de 1 g/L em 280 nm). Coeficiente de extinção de MOD-5014 foi determinado pela análise de aminoácidos em Mscan. Os coeficientes de extinção para MOD-5014 é 1,27.

Ensaio de coagulação de FVIIA-STACLOT VIIa-rTF

[0608] FVIIa é derivado de uma clivagem intra-cadeia de FVII de cadeia única. O Fator Tecidual Nativo (TF) é um co-fator de FVII, mediante ligação ao TF, FVII media a ativação do Fator X para Xa, enquanto o próprio é transformado em FVIIa. O fator de tecido solúvel é a parte extracelular do fator tecidual nativo. Ele já não pode ativar FVII por auto- ativação, mas o FVIIa vinculado ao fator tecidual pode ativar FX para FXa.

[0609] O fator tecidual solúvel recombinante (rsTF) usado neste ensaio é utilizando a especificidade de FVIIa para construir um teste de coagulação FVIIa. O Fator tecidual solúvel recombinante (rsTF), na presença de FVIIa, cálcio e fosfolipídios, produz a coagulação do plasma sem ativar FVII para FVIIa.

[0610] O tempo de coagulação observado neste sistema tem uma relação inversa com o teor de FVIIa na amostra testada, sem interferência da presença FVII na amostra.

[0611] A atividade de FVIIa foi avaliada para NovoSeven® reconstituído e para MOD-5014 e MOD-5019antes de cada estudo.

[0612] A atividade específica de FVIIa (que é calculada como a atividade/ml dividida pela concentração de proteína) foi calculado com base na A280 e é apresentada na Tabela53. Ao comparar a atividade específica das duas moléculas, que diferem em peso molecular, deve ser feita a compensação para normalizar a atividade (ou seja, por causa da diferença de peso molecular, o número de sites ativos em 1 mg de NovoSeven ® é 1.185 vezes superior que em MOD-5014 e 11.307 vezes superior que MOD-5019). Portanto, o cálculo do fator de conversão é apresentado na seguinte fórmula: Tabela 53 - atividade específica de MOD-5014 em comparação com NovoSeven ®

Descrição de estudo

[0613] A medida mais significativa é a capacidade da proteína para induzir um coágulo in vivo, após um evento traumático. Para avaliar a capacidade de MOD-5014 em parar o sangramento, o mesmo modelo de camundongos deficientes em FVIII foi utilizado para um desafio de sangramento.

[0614] Camundongos deficientes em FVIII foram administrados com uma única injeção subcutânea de MOD-5014, MOD-5019 ou NovoSeven ®. Grupo A e B foram dosados com NovoSeven ® e MOD-5014 respectivamente, em quantidades equivalentes conforme atividade FVIIa. Grupo C foi dosado com MOD-5019 no montante equivalente de proteína FVIIa como MOD-5014, para avaliar o fator crítico (atividade ou quantidade de proteína). As doses administradas foram 4,2 mg/kg de NovoSeven ® e 8,6 mg/kg de MOD-5014 e MOD-5019. A veia da cauda foi transfectada 2,7 cm a partir da ponta da cauda 12 horas após administração e sobrevivência dos camundongos foi gravada por 24 horas.

[0615] Tabela 54 - designação de grupo T

[0616] RESULTADOS

[0617] Os dados do experimento estão resumidos na Tabela 55 e na Figura 34.

[0618] Tabela 55. Resultados do estudo TVT

[0619] 24 horas pós TVT, apenas 11% dos camundongos injetados com NovoSeven ® sobreviveram. 30% de MOD-5014 e 40% de MOD-5019 sobreviveram até este ponto de tempo. MOD-5014 e MOD-5019 injetadas de forma subcutânea mostram melhores sobrevivências de camundongos em comparação com NovoSeven ®. No entanto, os resultados não são ideais, uma vez que mais de 50% dos animais morreram durante o experimento.

[0620] Fator VIIa, como outros fatores de coagulação, normalmente é injetado por via intravenosa, para estar diretamente disponível na corrente sanguínea. Entretanto, a presente invenção mostra que as composições fornecidas neste documento são surpreendentemente absorvidas de forma mais eficaz pela corrente sanguínea após a administração SC. Para ser capaz de administrar por via subcutânea o FVIIa serve como uma vantagem pode ser usada para pedidos profiláticos. Injeções subcutâneas também são muito mais fáceis para que os pacientes se auto-injetarem e são vantajosos quando os pacientes são muito jovens, e suas veias são pequenas e difíceis de encontrar.

[0621] Desta forma, a aplicação subcutânea pode ser usada para tratamento profilático,

EXEMPLO 9: ESTUDO COMPARATIVO de PK-PD DE MOD-5014 RECOMBINANTE VS. NOVOSEVEN® APÓS ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA EM RATOS SD Objetivos do estudo:

[0622] Para determinar os parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos de MOD-5014 versus rFVIIa comercialmente disponível em ratos SD após uma única administração de SC.

[0623] Comparar dois experimentos independentes (05010 & 05034) que contenham produtos de MOD-5014 originados de dois clones diferentes (clone N°. 28 vs N° 61) por seus parâmetros de farmacocinética.

[0624] Métodos experimentais

Animais

[0625] 24 ratos SD machos provenientes do Harlan Laboratories Israel, Ltd, pelo menos 4 dias antes de começarem as injeções. Os animais eram adultos jovens saudáveis, com ~200 gr no início do estudo. A variação de peso corporal dos animais no momento do início do tratamento não deve exceder ± 20% do peso médio de cada sexo. O estado de saúde dos animais utilizados neste estudo é examinado na chegada. Apenas os animais de boa saúde são aclimatados às condições laboratoriais e são utilizados no estudo.

Ensaio de coagulação de FVIIA - STACLOT VIIa-Rtf

[0626] O fator de tecido solúvel recombinante (rsTF) usado neste ensaio utiliza a especificidade de FVIIa para construir um teste de coagulação FVIIa. O rsTF, na presença de FVIIa, cálcio e fosfolipídios produz a coagulação do plasma, sem ativar o FVII para FVIIa.

[0627] O tempo de coagulação observado neste sistema tem uma relação inversa com o teor de FVIIa na amostra testada, sem interferência da presença FVII na amostra.

[0628] A atividade de FVIIa foi avaliada para NovoSeven ® após reconstituição e MOD-5014 antes de cada estudo. A atividade específica de FVIIa foi calculada com base no A280. Ao comparar a atividade específica das duas moléculas, que diferem em MW, deve ser feita a compensação para normalizar a atividade (ou seja, por causa da diferença de peso molecular, o número de sites ativos em 1 mg de NovoSeven ® é 1.185- vezes superior que em MOD-5014).

Software de solver PK

[0629] Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados utilizando o software solver de PK. A curva de administração IV analisada como dois bolus de CA compartimentais e a administração de SC como análise de trapezoidal linear NCA Extravascular - Log. Especificações de meia-vida, AUC, afastamento e distribuição de volume foram calculadas e os parâmetros de saída foram estudados em comparação entre grupos de experimentos.

Materiais experimentais

[0630] Experimento n° 05010: A. NovoSeven ® RT: (Lote # AU61553 preparado em 31.7.12*) concentração de FVIIa por A280: 0.86 mg/ml. Ensaio de atividade FVIIa Staclot: 56,867 U/mg. Dose injetada: 946μg/kg. *Pool de alíquotas de NovoSeven®, todas do mesmo Lote n° B. Clone 28: MOD-5014 RS12-001: 0.77 mg/ml** baseado em A280. Ensaio de atividade FVIIa Staclot: 34,162 U/mg. Dose injetada: 850μg FVIIa/kg.

[0631] Experimento n° 05034: A. NovoSeven ® RT: (Lote #AU61347 preparado em 1.1.13) concentração de FVIIa por A280: 0,82 mg/ml, diluído para 0,4 mg/ml com tampão estéril de NS. Ensaio de atividade FVIIa Staclot: 55.688 U/mg. Dose injetada: 360μg/kg e 20.047,7 U/kg. B. Clone 61: MOD-5014, Lote 75: 1,9 mg / ml * * baseado no A280, diluído para 0,89 mg/ml com tampão de formulação. Dose injetada: 20.047,7 U/kg. Atividade de coagulação FVIIa: 25.002 * U/mg baseado no ensaio de atividade de FVIIa Staclot. C. Clone 61: MOD-5014, Lote 81A: 2,36 mg/ml baseado em A280 (filtrado na manhã do dia de estudo e remedido em 280nm), diluído a 0,4 mg/ml com tampão de formulação. Dose injetada: 360μgFVIIa/kg. Atividade de coagulação FVIIa: 24943U/mg baseado no ensaio de atividade de FVIIa Staclot. D. Clone 61: MOD-5014, Lote 81A: 2.36 mg/ml baseado no A280, diluído para 0,89 mg/ml com tampão de formulação. Dose injetada: 20.047,7 U/kg. Atividade de coagulação FVIIa: 24,943U/mg baseado no ensaio de atividade de FVIIa Staclot.

[0632] Descrição de estudo

[0633] Experimento n° 05010

[0634] MOD-5014 e NovoSeven ® foram administrados em uma única injeção intravenosa ou subcutânea em Ratos SD em uma dose de 0,9 mg/kg de peso corporal. Amostras de sangue foram retiradas a partir do sinus orbital dos olhos de 3 ratos alternadamente em 0.5, 4, 8, 12, 24, 34, 48 e 58 horas após a dosagem. Plasma citratado (0,32%) foi preparado imediatamente após a amostragem e armazenado à -20o até análise. O estudo foi realizado em "Science in Action", Nes-Ziona. Nível de atividade de coagulação de FVIIa foi avaliado, e realizou-se uma análise detalhada de PK na Prolor-Biotech. Tabela 55: Design do Estudo 05010

[0635] Experimento Nº. 05034

[0636] MOD-5014 e NovoSeven ® foram administrados em uma única injeção subcutânea em Ratos SD em uma dose de 0,9 mg/kg de peso corporal. Amostras de sangue foram retiradas a partir do sinus orbital dos olhos de 3 ratos alternadamente em 0.5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48 e 72 horas após a dosagem. Plasma citratado (0,32%) foi preparado imediatamente após a amostragem e armazenado à -20°C até análise. O estudo foi realizado em "Science in Action", Nes-Ziona.

[0637] Nível de atividade de coagulação de FVIIa foi avaliado, e realizou-se uma análise detalhada de PK na Prolor-Biotech. Tabela 56: Design do Estudo 05034

RESULTADOS

[0638] Atividade FVIIa em amostras de sangue foi quantificada usando um kit STACLOT® VIIa-rTF (Stago). O perfil farmacocinético foi calculado para cada proteína e é a média de 3 animais em cada ponto de tempo.

[0639] Experimento N°. 05010

[0640] Após a redução do fundo: 15 mU/ml.

[0641] Figura 35 apresenta o perfil PK de FVIIa após administração IV e SC tanto de NovoSeven ® quanto MOD-5014. Resumo dos valores de atividade FVIIa para cada ponto de tempo é apresentado na Tabela 57. Administração IV e SC têm padrão PK diferente (ver Fig. 35; após redução de fundo: 15 mU/ml). A Cmax após injeção IV é maior do que aquela obtida após a injeção SC, devido à presença da droga imediatamente após a administração no sangue (medido a 0,5 h, Tabela 57 e Tabela 58). No entanto, depois da administração SC as moléculas de drogas se transferem para a matriz intracelular e tecidos, assim, Cmax pode ser medido somente após 2 horas de injeção. A recuperação total da droga após a administração SC é inferior ao valor de Cmax após injeção IV.

[0642] 8 h após a injeção, NovoSeven ® se manifesta um padrão PK igual quando injetado por IV ou SC, (após a redução do fundo: 15mU/ml, Fig. 35). Além disso, a atividade de coagulação para os camundongos tratados com NovoSeven® foi indetectável em pontos de tempo após 12 horas, enquanto os camundongos tratados com MOD-5014 continuaram a manter atividade mensurável em 58 horas pós-dosagem (Tabela 57; após redução de fundo: 15 mU/ml; Fig. 35).

[0643] Tabela 57. Atividade de coagulação FVIIa de MOD-5014 vs NovoSeven® após administração IV ou SC

Após a redução do fundo: 15mU/ml.

[0644] Tabela 58: Parâmetros de PK de MOD-5014 vs NovoSeven ® após administração IV ou SC

Experimento n° 05034

[0645] A Figura 36 apresenta o perfil PK de FVIIa após administração SC tanto de NovoSeven® quanto de MOD-5017. Dois lotes diferentes do clone N° 61 (#75 e #81) foram examinados na mesma concentração ou as mesmas unidades de atividade, em comparação com NovoSeven®. Resumo dos valores de atividade FVIIa para cada ponto de tempo é apresentado na Tabela 59.

[0646] Os resultados indicam um padrão semelhante de PK após a administração SC correspondente a experimentos anteriores. Além disso, a atividade de coagulação para os camundongos tratados com NovoSeven® foi indetectável em pontos de tempo após 12 horas, enquanto os camundongos tratados com MOD-5014 continuaram a manter atividade mensurável em 24 horas pós-dosagem (Tabela 59 e Figura 36; após redução de fundo: 56 mU/ml (8, 12 hr) ou 32 mU/ml (0.5, 2, 6, 14 hr)).

[0647] Clone N° 61 lote #81 (D) Cmax (1, 301mU/ml) foi menor que os valores de Cmax do clone N° 61 lote #75 (B) e NovoSeven ® (A) (3, 521mU/ml e 5, 908mU/ml respectivamente), embora todos eles tenham sido injetados pela mesma unidade de atividade (Tabela 6). Entretanto, os lotes #75 (B) e #81 (D) têm as mesma unidades de atividade (559 mU/ml e 478 mU/ml respectivamente) medidas 8h após a injeção (Figura 36 e Tabela 59; e após a redução do fundo: 56 mU/ml (8, 12 hr) ou 32 mU/ml (0.5, 2, 6, 14 hr)).

[0648] Tabela 59: Atividade de coagulação FVIIa de MOD-5014 (Clone 61 #75, #81) vs NovoSeven® após administração única SC. Após a redução do fundo: 56mU/ml (8,12hr) ou 32mU/ml (0.5, 2, 6, 14hr).

[0649] Tabela 60: Parâmetros de PK de MOD-5014 (Clone 61 #75, #81) vs NovoSeven® após administração única SC.

[0650] Este relatório resume dois estudos de PK; 05010 & 05034. Objetivamos fornecer uma visão específica sobre o impacto da fusão do CTP ao FVII no afastamento e a meia-vida da proteína em administração subcutânea e também abordar o paradigma de sua atividade específica após essa modificação. Nestes estudos, os ratos SD foram administrados com uma única injeção SC de MOD-5014 originado de dois clones, e dois lotes diferentes, em comparação com FVIIa recombinante comercialmente disponível (NovoSeven ®). Os componentes foram injetados em semelhante concentração FVIIa (μ g/Kg) ou no mesmo nível de atividade (U/Kg) e a análise com base em atividade PK foi realizada.

[0651] O objetivo principal do primeiro estudo foi verificar os diferentes parâmetros PK após administração IV e SC. Com base neste estudo podemos concluir que há uma diferença entre o padrão PK medido após a administração IV ou SC. Um t1/2 de 7.78 hrs medido após a injeção SC de MOD-5014 e apenas 4.2 hr após injeção IV. Valores AUC eram os mesmos (Tabela 58).

[0652] O segundo estudo, no entanto, centra-se sobre as diferenças entre dois lotes de MOD-5014 clone N° 61, que foram injetados pela mesma concentração FVIIa ou em uma unidade de atividade igual, comparando com NovoSeven ®. Para este estudo, mostramos que o clone 61 lote #75 manifestou parâmetros PK melhores do que o lote #81. Lote #81, que foi injetado com o mesmo nível de unidade de atividade, teve menor Cmax por uma razão desconhecida. Além disso, a mesma Cmax foi medida quando injetando clone 61 lote #81 em duas diferentes doses (pela concentração FVIIa ou pela atividade da unidade), em vez de 2.5 vezes entre os valores de duas atividades. Após a análise de ambos os estudos juntos, podemos concluir que clone 28 manifestou o parâmetro t1/2 mais prolongado que o clone 61 #75 (o melhor lote) após a injeção SC (7,78 hr e 5,7 hr respectivamente, Tabela 60). Podemos também concluir que amostras de diferentes tipos de ponto de tempo criam um padrão PK diferente, o que leva a variação nas curvas PK. Os padrões das curvas podem nos ensinar mais sobre o comportamento da droga no sangue. Por isso, decidimos determinar os pontos de tempo semelhantes aos detectados por Baxter (0, 0.5, 2, 6, 8, 12, 24, 34, 48, 72 horas). Além disso, a concentração de FVIIa no experimento 05010 era demasiado elevada e foi revisada no experimento SC seguinte (05034). Para estudos PK futuros, nós decidimos injetar o componente a 360μg FVIIa/kg para uma dose.

[0653] Considerando o todo, podemos aprender mais sobre nosso produto MOD-5014 após a administração SC para determinar o máximo de qualidade de clone e lote e decidir o melhor método para quantidade de injeção para MOD-5014 por unidades de concentração ou atividade de FVIIa.

[0654] Enquanto certas características da invenção foram ilustradas e descritas neste documento, muitas modificações, substituições, alterações e equivalentes agora irão ocorrer àqueles versados na técnica. Portanto, deve ser entendido que as reivindicações anexas destinam-se a cobrir todas tais modificações e alterações conforme se encontram dentro do verdadeiro espírito da invenção.

Claims (13)

1. Fator de coagulação modificado por peptídeos carbóxi- terminais da gonadotrofina coriônica (CTP) caracterizado por consistir em um fator de coagulação e três CTPs anexados ao carbóxi-terminal do referido fator de coagulação, em que o referido Fator de coagulação modificado por CTP é: (a) um polipeptídeo Fator IX (FIX) modificado por CTP consistindo de uma sequência de amino ácidos da SEQ ID NO: 31 ou dos amino ácidos 47-545 da SEQ ID NO: 31; (b) um polipeptídeo Fator VII (FVII) modificado por CTP consistindo na sequência de amino ácido da SEQ ID NO: 25 ou dos amino ácidos 39528 da SEQ ID NO: 25; ou (c) um Fator VIIa ativo (FVIIa) modificado por CTP consistindo na sequência de amino ácido da SEQ ID NO: 25 ou dos amino ácidos 39528 da SEQ ID NO: 25.

2. Fator de coagulação modificado por CTP, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos um CTP ser glicosilado.

3. Fator de coagulação modificado por CTP, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o referido fator de coagulação modificado por CTP ser um polipeptídeo FIX modificado por CTP que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31 ou dos aminoácidos 47-545 da SEQ ID NO: 31.

4. Fator de coagulação modificado por CTP, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por ser um polipeptídeo FVII modificado por CTP que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25 ou dos aminoácidos 39-528 da SEQ ID NO: 25, ou em que o fator de coagulação modificado por CTP é um FVIIa modificado com CTP que consiste na sequência de aminoácidos dos aminoácidos 39-528 da SEQ ID NO: 25.

5. Polinucleotídeo, que codifica o Fator de coagulação modificado por CTP conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela sequência de ácido nucleicos do referido polinucleotídeo ser definida na SEQ ID NO: 30.

6. Polinucleotídeo, que codifica o Fator de coagulação modificado por CTP conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela sequência de ácido nucleicos do referido polinucleotídeo ser definida na SEQ ID NO: 24.

7. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um fator de coagulação modificado por CTP, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 7, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser para administração subcutânea.

9. Uso de um fator de coagulação modificado por CTP, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar uma coagulação de sangue ou um distúrbio de coagulação em um sujeito.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o distúrbio da coagulação do sangue ou da coagulação ser a hemofilia.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado por o sujeito ser uma criança.

12. Método para estender a meia-vida biológica de um fator de coagulação caracterizado por compreender a etapa de anexação de três peptídeos carbóxi-terminais da gonadotrofina coriônica (CTPs) ao carbóxi-terminal de um polipeptídeo FXI, ou compreender a etapa de anexação de três peptídeos carbóxi-terminais da gonadotrofina coriônica (CTPs) ao carbóxi-terminal de um polipeptídeo FVII ou FVIIa, produzindo assim um fator de coagulação modificado por CTP, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o fator de coagulação possui uma meia-vida biológica estendida.

13. Método para produzir o fator de coagulação modificado por CTP, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender a etapa de anexação de três peptídeos carbóxi-terminais da gonadotrofina coriônicos (CTPs) ao carbóxi-terminal de um polipeptídeo FIX, ou compreender a etapa de anexação de três peptídeos carbóxi-terminais da gonadotrofina coriônicos (CTPs) ao carbóxi-terminal de um polipeptídeo FVII ou FVIIa, produzindo assim o fator de coagulação modificado por CTP.