KR100467751B1 - 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 - Google Patents

생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 에리스로포이에틴(erythropoietin)의 카르복시 말단에 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin) β 서브유닛의 카르복시 말단 펩타이드 단편(carboxy terminal peptide)의 변이체가 융합된, 인간 에리스로포이에틴의 생체내(in vivo) 활성이 증진된 융합단백질(fusion protein)에 관한 것으로서, 상기 융합단백질은 에리스로포이에틴의 고유활성 자체는 그대로 보유하면서, 당쇄 함량의 증가 없이도 생체내 반감기가 획기적으로 증가된다.

Description

생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질{Fusion protein having the enhanced in vivo erythropoietin activity}
본 발명은 신성 빈혈치료제인 에리스로포이에틴(erythropoietin: 이하, "EPO"라 함)의 생체내(in vivo) 활성이 증진된 융합단백질(fusion protein)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 당쇄 함량 증가 없이 그 아미노산 서열 자체로 EPO 분자의 반감기 증가활성을 갖는, 생체내 유래의 특정 펩타이드가 융합됨으로써, 생체내 반감기가 증가되어 에리스로포이에틴 활성이 획기적으로 증진된 융합단백질에 관한 것이다.
EPO는 분자량 30,000∼34,000의 당단백질로서, 적혈구의 생성 및 분화를 촉진하는 조혈인자이다. 이 단백질은 적혈구 전구세포의 수용체에 결합하여 작용을 시작하며 세포내 칼슘이온 농도의 증가, DNA 생합성의 증가 및 헤모글로빈 생성 자극 등을 일으킨다. 이 자극인자 EPO는 신장병 환자의 빈혈, 미숙아의 빈혈, 갑상선기능부전(hypothyroidism)으로 인한 빈혈, 영양실조로 인한 빈혈 등의 치료제로서 사용될 수 있다. 한편, 인간 천연형 EPO의 임상적 이용은 계속 확대되고 있는 추세이나, 짧은 반감기로 인해 평균 매주 3회 정도의 투여를 필요로 하므로 불편함과 고비용을 유발한다. 따라서, 이들의 생체내 활성을 장기간 유지시키면 그 이용빈도를 훨씬 감소시킬 수 있다.
EPO의 생체내 활성도는 생체내 반감기와 비례한다. 생체내에서의 반감기는 EPO가 갖는 당쇄의 말단에 위치하는 사이알릭산(sialic acid)의 함량과 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, EPO의 생체내 활성은 당쇄의 존재에 의해 크게 좌우된다. 그런데, 당쇄의 형태는 세포의 종류에 따라 각각 다르게 나타나므로, 동일한 당단백질을 서로 다른 종류의 세포에서 발현시키면 각기 독특한 당쇄 형태를 나타낸다. 박테리아, 예를 들어 대장균(E. coli)은 단백질에 당쇄를 붙이지 못하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 대장균에서 발현되는 단백질에는 당이 첨가되어 있지 아니하므로, 대장균에서 발현된 EPO는 당쇄를 포함하지 않고, 이 경우 시험관내(in vitro)에서는 활성이 확인되지만 생체내에서는 전혀 활성을 갖지 못한다. 그 이유는 당쇄가 결여된 EPO는 당쇄를 갖는 것에 비해 체내에서 급속히 제거되어 그 반감기가 극히 짧기 때문이다. 결국, 당쇄의 존재 유무는 EPO의 활성에 매우 중요한 역할을 담당한다.
그동안 EPO의 활성을 증가시키기 위하여 많은 연구가 이루어져 왔다. 그중 주류를 이룬 것은 돌연변이 유발방법(mutagenesis)을 이용하여 EPO 유전자에 돌연변이를 유발시킴으로써 몇몇 아미노산을 치환시켜 그 목적을 달성하는 방법이다. 예를 들어, PCT/US94/09257(명칭: 에리스로포이에틴 유사체, 출원인: 암젠)에는 돌연변이 유발에 의해 EPO의 당 함량을 증가시킴으로써 체내 반감기를 증가시키는 방법이 개시되어 있다. 또한, EPO의 이합체(dimer) 형성에 의해 생체내 반감기를 증가시키려는 시도도 있었다(A.J. Sytkowskiet al.,J.B.C .vol. 274, No. 35, pp24773-24778). 그밖에도, 유전공학적 방법을 이용하여 EPO 분자에 새로운 아미노산, 펩타이드 또는 단백질 단편을 융합시켜 EPO의 당쇄 함량, 구체적으로는, 사이알릭산의 함량을 증가시킴으로써 생체내 활성도를 증진시키는 방법이 알려져 있다. 그러나, 이때 사용되는 아미노산, 펩타이드 또는 이종의 단백질 단편으로 아무 것이나 사용할 수는 없다. 대부분의 경우, 이러한 변형은 단백질 고유의 활성을 저하 또는 상실시키는 결과를 초래하며 체내에 사용될 때 통상 발생할 수 있는 항원성의 문제를 일으킬 수 있기 때문이다.
EPO에 대한 것은 아니지만 융합단백질 또는 키메라 단백질(chimeric protein) 등이 연구되고 있으며, 잘 알려진 예로는 성호르몬의 일종인 난포형성호르몬에 대한 것이 있다(Furuhashiet al., 1995,Mol.Endocrinol.). 그러나, 실제 산업상 이용가능한 적용 예는 없었다. 그 이유는 유전공학을 이용한 단백질의 변형 시도는 많은 위험을 내포하는데, 일단 그 목적단백질 자체를 얻는 것도 쉽지 않은 전문성을 요구하는데다가, 새로운 아미노산 등이 첨가되거나 치환됨으로써 단백질 고유의 활성 자체가 상실되거나 감소되는 정반대의 결과를 가져오는 경우가 거의 대부분이기 때문이다.
이에, 본 발명자들은 EPO 분자에 새로운 아미노산, 펩타이드 또는 단백질 단편을 융합시켜 EPO의 생체내 활성도를 증진시킬 수 있는 새로운 방법을 개발해내기 위하여 지속적인 연구를 수행하던중, 체내에 이미 존재하는 단백질인 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin, 이하, "HCG"라 함)의 β 서브유닛(subunit)의 카르복시 말단에 위치하는 펩타이드 단편(carboxy terminal peptide, 이하 "CTP"라 함)을 EPO의 카르복시 말단에 융합시켜 얻은 융합단백질이 EPO의 고유활성 자체는 그대로 보유하면서 당쇄(glycosylation site)를 증가시키는 아미노산을 다량 함유함으로써 생체내 반감기가 획기적으로 증가된다는 사실을 발견하고, 상기 융합단백질에 대한 특허출원을 완료한 바 있다(한국 출원번호 제10-2000-0075230호).
나아가, 본 발명자들은 예기치 않게 CTP의 당쇄 부위를 제거한 변이체 또한 생체내 반감기를 획기적으로 증가시킨다는 놀라운 사실을 발견하였다. 이로부터, EPO의 당 함량을 증가시키는 것과 무관하게 그 아미노산 서열 자체로 EPO의 체내 안정성을 증가시키는 성질을 갖는 CTP의 변이체를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
CTP의 당쇄 부위가 제거된 변이체를 이용하는 본 발명은 EPO의 당 함량 증가에 의해 체내 반감기를 증가시키는 종래의 방법과는 차별화되는 것으로서, 그 자체로 EPO의 체내 안정성을 증가시키는 성질을 갖는 CTP 변이체의 발견에 기초한 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간 EPO의 카르복시 말단에 HCG β 서브유닛의 CTP 변이체가 융합된, 인간 EPO의 생체내 활성이 증진된 융합단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 증진된 인간 EPO 활성을 갖는 융합단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 인간 융모성 성선자극호르몬(HCG)의 변형된 카르복시 말단 펩타이드(ATP)의 염기 및 아미노산 서열을 나타내는 도면;
도 2는 에리스로포이에틴(EPO)과 ATP의 융합단백질(EATP)의 염기 및 아미노산 서열을 나타내는 도면;
도 3은 발현벡터 pcDNA3.1-EATP의 제작과정을 나타내는 모식도;
도 4는 정제된 EATP의 전기영동 사진; 및,
도 5는 EATP와 EPO의 약동력학 결과를 나타내는 그래프.
첫째, 본 발명은 인간 EPO의 카르복시 말단에 HCG β 서브유닛의 CTP 변이체(ATP)가 융합된, 생체내 인간 EPO 활성이 증진된 융합단백질에 관한 것이다. 상기 CTP는 서열번호 1에 기재된 HCG β 서브유닛의 112 내지 145번 위치 아미노산 또는 그 일부, 특히 118 내지 145번 위치 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다.
CTP의 변이체인 ATP는 EPO의 당쇄 함량을 증가시키지 않으면서 그 아미노산 서열 자체로 EPO의 생체내 반감기를 증가시켜, 생체내 EPO 활성을 증진시키는 활성을 갖는 것이다. 따라서, 상기 위치내에서 치환이 일어나는 아미노산의 특정 위치 및 종류는 목적 융합단백질의 생체내 에리스로포이에틴 활성 증진작용에 부정적인 영향을 미치지 않는 한, 특별히 제한되는 것은 아니다. 즉, 융합단백질이 에리스로포이에틴의 생체내 활성을 증진시키는 활성을 보유하는 한, 해당 위치 범위내의 아미노산은 어느 위치에서 어느 아미노산으로도 치환이 가능하다.
예를 들어, ATP는 상기 아미노산 서열중 121, 127, 132 및 138번 위치의 아미노산중 하나 이상이 치환된 것이며, 가장 바람직하게는, 121, 127, 132 및 138번 위치의 Ser이 Ala으로 치환된 것이다(도 1 참조). 이 경우, 본 발명에 따른 융합단백질은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 상기 위치의 Ser이 Ala으로 치환될 수 있는 사실로부터, Ala과 유사한 크기 및 전하(charge)를 갖는 아미노산, 예를 들어, Gly으로도 치환이 가능함은 당업자에게 자명하다.
둘째, 본 발명은 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 바람직하게는 CHO(chinese hamster ovary) 세포에 관한 것이다.
셋째, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 증진된 인간 EPO의 활성을 갖는 융합단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 목적하는 융합단백질의 유전자 확보 및 클로닝, 목적 유전자의 발현벡터 제작, 동물세포의 형질전환, 발현, 분리 및 활성도 측정의 단계를 거친다.
(1) 유전자 확보
EPO의 cDNA는 인간유래 태아 간의 cDNA 라이브러리(인비트로젠(Invitrogen)사)에서 미리 제작된 EPO cDNA의 양 말단과 상보적인 프라이머(EP1, EC2)를 사용한 통상의 RT-PCR(바이오니아(Bioneer)사, RT-PCR 프리믹스 키트(PreMix Kit))을 수행함으로써 얻을 수 있다:
EP1: ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG(서열번호 3)
EC2: GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT(서열번호 4)
EPO cDNA를 클로닝 벡터인 pGEM-T(프로메가(Promega)사)에 클로닝하고(pGEMT-EPO로 명명) 염기서열을 확인한 후 이후 작업의 주형으로 이용한다.
본 발명에서 이용되는 HCG β 서브유닛의 CTP 유전자 변이체는 합성 및 PCR 셔플링(shuffling)에 의해 얻는다. 합성된 유전자 단편은 EA1, A2, A3 및 A4이다:
EA1: AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACTCCTCTTCCG(서열번호 5)
A2: GGAAGGGCGGGGGGAGGGGCCTTGGCGGAAGAGGA(서열번호 6)
A3: CCGCCCTTCCAAGCCCAGCCCGACTCCCGGGGCCC(서열번호 7)
A4: TTATTGTGGGAGGATCGGGGTGTCGGCGGGCCCCG(서열번호 8)
(굵게 표시한 부분이 아미노산 치환을 유도하기 위한 부분임)
이들 4 가지 유전자를 1 ㎕씩 취하고(50 pmole/㎕) BM사의 고정확도 태그 (high fidelity Taq) 시스템을 사용하여 PCR을 수행한다.
1% 아가로스 젤에서 약 100 bp의 유전자 단편(변형 CTP 유전자)을 확인한다.이 유전자는 HCG β 서브유닛의 카르복시 말단 28개의 아미노산(118 내지 145 위치 아미노산)중 121, 127, 132 및 138번 위치에 있는 4 개의 Ser을 Ala으로 치환하여 코딩하는 것이다(도 1).
pGEMT-EPO를 주형으로 이용하고 프라이머 EP1과 EC2를 사용하여 PCR을 수행하여 EPO 유전자만을 얻는다. 이 EPO 유전자와 변형 CTP 유전자를 동시에 주형으로 이용하고 프라이머 EP11과 EP22를 이용하여 BM사의 고정확도 태그 시스템을 사용하여 PCR을 수행함으로써 약 630 bp의 원하는 융합유전자(EATP 유전자라 명명함)를 얻는다:
EP11: TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT(서열번호 9)
EP22: TGGATCCTTATTGTGGGAGGATCGGGGT(서열번호 10)
이 유전자를 클로닝 벡터인 pGEM-T에 클로닝한 후 염기서열을 확인한다(pGEMT-EATP라 명명함, 도 3).
(2) 발현벡터의 제작
발현벡터는 인비트로젠(Invitrogen)사의 pcDNA3.1 벡터를 이용한다. pGEMT-EATP의 EATP 유전자의 양 말단은 프라이머 EP11과 EP22에서 유래된 제한효소HindⅢ 및BamHⅠ 위치를 갖는다. 이를 이용하여, pcDNA3.1과 위에서 얻은 pGEMT-EATP를 제한효소HindⅢ와BamHⅠ으로 각각 처리한다. 아가로스 젤상에서 선형화된 pcDNA3.1과 EATP 유전자를 퀴아젠(Qiagen) 용출 키트를 이용하여 얻은 후 결찰(ligation)시켜 대장균 NM522를 형질전환시킨다. LB-암피실린 고체배지에서 하룻밤 키운 후 나타난 콜로니로부터 플라스미드를 분리하고 제한효소HindⅢ와BamHⅠ을 처리하여 1% 아가로스 젤 전기영동으로 EATP 유전자가 삽입된 콜로니만을 선별한다. 이 플라스미드를 pcDNA3.1-EATP로 명명한다(도 3).
(3) CHO 세포의 형질전환 및 EATP 발현
60 ㎜ 세포배양 디쉬(dish)에서 CHO 세포(DG44)를 키워 40∼80% 컨플루언트(confluent)하게(1∼4×105세포/60 ㎜ 디쉬) 준비한다. BM사의 슈퍼펙션 시약(superfection reagent) 3 ㎕와 세포배지(α-MEM with media, 무혈청, 무항생제) 97 ㎕을 잘 혼합하고 플라스미드 pcDNA3.1-EATP DNA(0.1 ㎍/㎕ 이상, 약 2 ㎍)와 dhfr 유전자가 포함된 벡터 pLTRdhfr26(ATCC37295, 0.2 ㎍)를 첨가하여 실온에서 5∼10 분간 반응시킨 후 준비된 상기 세포에 가한다. 1 일 경과 후 G418을 500 ㎍/㎖되게 첨가한 배지(α-MEM without media, 10% FBS)로 교환한다. 약 7∼10 일간 G418이 500 ㎍/㎖되게 첨가된 배지로 갈아주면 G418 저항성 유전자를 갖지 않는 세포와 음성 대조군의 세포들은 모두 사멸한다. G418 배지에서 선별된 세포들을 충분히 배양한 후 BM사의 EPO ELISA 키트를 이용하여 배양액으로부터 발현된 EATP 단백질을 확인한다.
(4) 발현된 EATP의 정제
R&D사의 항-EPO 모노클로날 항체(anti-EPO monoclonal antibody)를 이용하여 분리정제용 친화성 수지(affinity resin)을 아래와 같이 제작한다.
CNBr 활성화된 세파로스(Sepharose) 4B 0.3 g을 1 mM HCl에서 20 분간 팽윤시키고(swelling) 수지를 칼럼으로 옮긴 후 1 mM HCl로 세척한다. 수지를 4 ㎖의커플링 완충액(0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3)으로 세척한 후 바로 4 ㎖ 커플링 완충액에 들어 있는 항-EPO 모노클로날 항체(500 ㎍/바이알)와 튜브내에서 섞어주고 상온에서 2 시간 반응시킨다. 이때 튜브를 잘 흔들어 준다. 블록킹 완충액(0.2 M 글리신, pH 8.0)으로 바꾸어 준 후 상온에서 2 시간 동안 흔들면서 반응시킨다. 6.5 ㎖ 커플링 완충액, 6.5 ㎖ 아세테이트 완충액(0.1 M 아세트산, 0.5 M NaCl, pH 4) 및 6.5 ㎖ 커플링 완충액으로 차례로 세척한다. 이렇게 제작된 수지를 이용하여 칼럼을 제작하고 다음과 같이 정제를 실시한다.
세포를 무혈청 배양액에서 하루 동안 키운 후 배양액만을 밀리포어사의 센트리프렙(컷오프 10,000)을 이용하여 약 5 배로 농축시킨다. 약 20 ㎖/hr의 유속으로 PBS로 평형시킨 칼럼에 로딩하고 다시 PBS로 세척한다. 용출 완충액(0.1 M 글리신, pH 2.8)으로 용출시킨 후 즉시 1 M 트리스(Tris)로 pH 7.5되게 적정한다. SDS-PAGE 및 은(silver) 염색으로 확인할 때 순도는 최소 97% 이상이다(도 4).
(5) 바이오어세이(Bioassay)법에 의한 활성측정 및 생화학적 분석
페닐하이드라진이 처리된 마우스의 비장세포를 이용하는 바이오어세이 시험에서 발현 및 적당히 정제된 EPO 및 EATP의 활성을 측정하면 EATP의 활성이 EPO 보다 높게 나타난다. 이로부터 EATP에서 첨가된 카르복시 말단의 존재는 EPO의 활성 자체를 방해하지 않음을 확인할 수 있다.
(6) 약동력학 시험
제조된 후보 물질이 실제 생체내에서 더 긴 반감기를 갖는지 여부를 확인하기 위하여, 약동력학 시험을 마우스를 대상으로 실시한다. 이때 후보 물질을 총 4마리의 마우스에 대해 1 마리당 20 유닛의 투여량으로 정맥내(iv) 투여한다. 경시적 혈중 농도를 확인하기 위하여, 채혈한 후 베링거만하임(Boehringer Mannheim)사의 EIA 키트를 사용하여 농도를 결정한다. 마우스 약동력학 시험에서 후보 물질 EATP는 대조 약물인 EPO 보다 훨씬 긴 반감기를 가짐을 알 수 있다(도 5).
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하나, 이들은 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 유전자 확보
EPO의 cDNA는 인간유래 태아 간의 cDNA 라이브러리(인비트로젠)에서 미리 제작된 EPO cDNA의 양 말단과 상보적인 프라이머(EP1, EC2)를 사용한 통상의 RT-PCR(바이오니아, RT-PCR 프리믹스 키트)을 수행하여 얻었다. PCR을 55 ℃에서 아닐링(annealing) 35 초, 72 ℃에서 40 초, 94 ℃에서 20 초의 조건으로 총 30 사이클 수행하고 얻은 EPO cDNA를 클로닝 벡터인 pGEM-T(프로메가)에 클로닝하였다. 즉, PCR 산물을 1% 아가로스 젤로부터 용출하여 pGEM-T에 결찰시킨 후, 대장균 NM522를 형질전환시켰다. X-gal/IPTG를 도말한 LB-암피실린 고체배지에서 하룻밤 키운 후, 흰색 콜로니들로부터 플라스미드 DNA를 정제하고 제한효소(SacⅠ,SacⅡ)와 반응시켜 EPO cDNA가 삽입되어 있는 콜로니를 선별하였다. 이때 얻은 벡터를 pGEMT-EPO로 명명하고 염기서열을 확인한 후 이후 작업의 주형으로 이용하였다.
HCG β 서브유닛의 변형된 CTP 유전자는 합성 및 PCR 셔플링을 이용하여 얻었다. 합성된 유전자 단편은 EA1, A2, A3 및 A4였다. 이들 4 가지 유전자를 1 ㎕씩 취하고(50 pmole/㎕) BM사의 고정확도 태그 시스템을 사용하여 55 ℃에서 아닐링 40 초, 72 ℃에서 40 초, 94 ℃에서 20 초의 조건으로 총 15 사이클의 PCR을 수행하였다. 1% 아가로스 젤에서 약 100 bp의 유전자 단편을 확인하였다(변형된 CTP 유전자). 이 유전자는 HCG의 카르복시 말단 28 개의 아미노산에서 121, 127, 132 및 138번 위치에 있는 4 개의 Ser이 Ala으로 치환된 펩타이드를 코딩하는 것이다(도 1).
pGEMT-EPO를 주형으로 이용하고 프라이머 EP1과 EC2를 사용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 수행하여 EPO 유전자만을 얻었다. 이 EPO 유전자와 위에서 얻은 변형된 CTP 유전자를 동시에 주형으로 이용하고 프라이머 EP11과 EP22를 이용하여 BM사의 고정확도 태그 시스템을 사용하여 57 ℃에서 아닐링 42 초, 72 ℃에서 1 분, 94 ℃에서 20 초의 조건으로 총 30 사이클의 PCR을 수행함으로써 약 630 bp의 융합유전자(EATP 유전자라 명명함)를 얻었다. 이 유전자를 클로닝 벡터인 pGEM-T에 상기와 동일한 방법으로 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다(pGEMT-EATP라 명명함, 도 3).
실시예 2: 발현벡터 pcDNA 3.1- EATP 의 제작
발현벡터는 인비트로젠사의 pcDNA3.1 벡터를 이용하였다. pGEMT-EATP에 클로닝된 EATP 유전자 말단은 프라이머 EP11과 EP22에서 각각 유래된 제한효소HindⅢ 및BamHⅠ 위치를 갖는다.
pcDNA3.1과 pGEMT-EATP를 제한효소HindⅢ와BamHⅠ으로 각각 처리하였다. 아가로스 젤상에서 선형화된 pcDNA3.1과 EATP 유전자를 퀴아젠 용출 키트를 이용하여 얻은 후 결찰시켜 대장균 NM522를 형질전환시켰다. LB-암피실린 고체배지에서 하룻밤 키운 후 나타난 콜로니로부터 플라스미드를 분리하고 제한효소HindⅢ와BamHⅠ을 처리하여 1% 아가로스 젤 전기영동으로 EATP 유전자가 삽입된 콜로니만을 선별하였다. 이 플라스미드를 pcDNA3.1-EATP로 명명하였다(도 3).
실시예 3: CHO 세포의 형질전환 및 EATP 발현
60 ㎜ 세포배양 디쉬(dish)에서 CHO 세포(DG44)를 키워 40∼80% 컨플루언트 하게(1∼4×105세포/60 ㎜ 디쉬) 준비하였다. BM사의 슈퍼펙션 시약 3 ㎕와 세포배지(α-MEM with media, 무혈청, 무항생제) 97 ㎕를 잘 혼합하고 플라스미드 pcDNA3.1-EATP DNA(0.1 ㎍/㎕ 이상, 약 2 ㎍)와 dhfr 유전자가 포함된 벡터 pLTRdhfr26(ATCC37295, 0.2 ㎍)를 첨가하여 실온에서 5∼10 분간 반응시킨 후 준비된 상기 세포에 가한다. 1 일 경과 후 G418을 500 ㎍/㎖되게 첨가한 배지(α-MEM without media, 10% FBS)로 교환하였다. 약 7∼10 일간 G418이 500 ㎍/㎖되게 첨가된 배지로 갈아주면 G418 저항성 유전자를 갖지 않는 세포와 음성 대조군의 세포들은 모두 사멸한다. G418 배지에서 선별된 세포들을 충분히 배양한 후 BM사의 EPO ELISA 키트를 이용하여 배양액으로부터 발현된 EATP 단백질을 확인하였다.
실시예 4: 발현된 EATP 의 정제
R&D사의 항-EPO 모노클로날 항체를 이용하여 분리 정제용 친화성 수지를 아래와 같이 제작하였다.
CNBr 활성화된 세파로스 4B 0.3 g을 1 mM HCl에서 20 분간 팽윤시키고 수지를 칼럼으로 옮긴 후 1 mM HCl로 세척하였다. 수지를 4 ㎖의 커플링 완충액(0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3)으로 세척한 후 바로 4 ㎖ 커플링 완충액에 들어 있는 항-EPO 모노클로날 항체(500 ㎍/바이알)와 튜브내에서 섞어주고 상온에서 2 시간 반응시켰다. 이때 튜브를 잘 흔들어 주었다. 블록킹 완충액(0.2 M 글리신, pH 8.0)으로 바꾸어준 후 상온에서 2 시간 동안 흔들면서 반응시켰다. 6.5 ㎖ 커플링 완충액, 6.5 ㎖ 아세테이트 완충액(0.1 M 아세트산, 0.5 M NaCl, pH 4), 6.5 ㎖ 커플링 완충액으로 차례로 세척하였다. 제작된 수지를 이용하여 칼럼을 제작하고 다음과 같이 정제하였다.
세포를 무혈청 배양액에서 하루 키운 후 배양액만을 밀리포어사의 센트리프렙(컷오프 10,000)을 이용하여 약 5 배로 농축시켰다. 약 20 ㎖/hr의 유속으로 PBS로 평형시킨 칼럼에 로딩하고 다시 PBS로 세척하였다. 용출 완충액(0.1 M 글리신, pH 2.8)으로 용출시킨 후 즉시 1 M 트리스로 pH 7.5로 적정하였다. 정제된 EATP의 SDS-PAGE 결과를 도 4에 나타내었다. SDS-PAGE 및 은 염색으로 확인할 때 순도는 97% 이상이었다.
실시예 5: 바이오어세이법에 의한 활성측정
페닐하이드라진을 마우스에 1 일 1 회 2 일간 60 ㎎/㎏씩 주사하였다. 3 일경과후 확대된 비장을 분리하고 호모게나이저(homogenizer)로 파쇄하여 비장세포를 얻었다. 비장세포를 6×106세포/㎖로 희석하여 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하였다. 분주된 각 웰에 표준 EPO(0∼500 mU/㎖)와 발현된 EPO 및 EATP를 100 mU/㎖의 농도로 각각 가한 후 플레이트를 37 ℃ CO2인큐베이터에서 22 시간 동안 방치하였다. 각 웰에 디메틸3[H]-티미딘(20 μCi/㎖)을 50 ㎕씩 분주한 후 동일한 인큐베이터에서 2 시간 더 반응시켜 각 웰별로 글래스 필터(Nunc 1-73164)에 흡착시켰다. 생리식염수로 3 회 세척하고 β 카운터를 이용하여 각 필터의 방사능량을 측정하였다. 적당히 정제된 EPO 및 EATP의 활성을 측정하였을 때 EATP의 활성이 EPO와 유사하거나 약간 높게 나타났다. 이로부터 EPO에 첨가된 카르복시 말단의 존재는 EPO의 활성 자체를 방해하지 않음을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 약동력학 시험
제조된 후보 물질이 실제 생체내에서 더 긴 반감기를 갖는지 여부를 확인하기 위하여, 약동력학 시험을 마우스를 대상으로 실시하였다. 실시예 5에 기재된 방법에 의해 정제된 융합단백질을 총 4 마리의 마우스에 대해 1 마리당 20 유닛으로 정맥내(iv) 투여하였다. 경시적 혈중 농도를 확인하기 위하여, 처음에는 30 분 간격, 2 시간 이후에는 2 시간 간격으로 채혈한 후 베링거만하임사의 EIA 키트를 사용하여 농도를 결정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 후보 물질 EATP는 대조 약물인 EPO 보다 약 2.5 배 이상의 훨씬 긴 반감기를가짐을 알 수 있다).
본 발명에 따르면, EPO의 고유활성 자체에는 영향을 주지 않으면서, 당쇄 함량의 증가 없이도 EPO의 생체내 반감기를 획기적으로 증가시킴으로써, 생체내 EPO 활성을 증진시킬 수 있다.
<110> Cheil Jedang Corporation <120> Fusion protein having the enhanced in vivo activity of erythropoietin <130> PC01-0367-JIJD <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> Amino acids in the positions of 112 to 145 of human chorionic gonadotropin(HCG) beta subunit <400> 1 Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu 20 25 30 Pro Gln <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein(EATP) of erythropoietin(EPO) and a variant of carboxy terminal peptide(ATP) of human chorionic gonadotropin(HCG) beta subunit <400> 2 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Ser Ser Ser Ala Lys Ala Pro Pro Pro Ala Leu Pro Ser Pro Ala Arg 195 200 205 Leu Pro Gly Pro Ala Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 210 215 220 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EP1 having the nucleotide sequence complementary to the terminal sequence of EPO cDNA <400> 3 atgggggcac gaatgtcctg cctggctgg 29 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EC2 having the nucleotide sequence complementary to the terminal sequence of EPO cDNA <400> 4 gtcccctgtc ctgcaggcct 20 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of HCG beta subunit CTP gene fragment EA1 <400> 5 aggggaggcc tgcaggacag gggactcctc ttccg 35 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of HCG beta subunit CTP gene fragment A2 <400> 6 ggaagggcgg ggggaggggc cttggcggaa gagga 35 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of HCG beta subunit CTP gene fragment A3 <400> 7 ccgcccttcc aagcccagcc cgactcccgg ggccc 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of HCG beta subunit CTP gene fragment A4 <400> 8 ttattgtggg aggatcgggg tgtcggcggg ccccg 35 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EP11 for PCR to obtain the desired fusion gene EATP <400> 9 taagcttatg ggggtgcacg aatgt 25 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EP22 for PCR to obtain the desired fusion gene EATP <400> 10 tggatcctta ttgtgggagg atcggggt 28 <210> 11 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein(EATP) of erythropoietin(EPO) and a variant of carboxy terminal peptide(ATP) of human chorionic gonadotropin(HCG) beta subunit <400> 11 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Ser Ser Ser Gly Lys Ala Pro Pro Pro Gly Leu Pro Ser Pro Gly Arg 195 200 205 Leu Pro Gly Pro Gly Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 210 215 220 <210> 12 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein(EATP) of erythropoietin(EPO) and a variant of carboxy terminal peptide(ATP) of human chorionic gonadotropin(HCG) beta subunit <400> 12 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ala Lys Ala Pro Pro Pro Ala 195 200 205 Leu Pro Ser Pro Ala Arg Leu Pro Gly Pro Ala Asp Thr Pro Ile Leu 210 215 220 Pro Gln 225 <210> 13 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein(EATP) of erythropoietin(EPO) and a variant of carboxy terminal peptide(ATP) of human chorionic gonadotropin(HCG) beta subunit <400> 13 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Gly Lys Ala Pro Pro Pro Gly 195 200 205 Leu Pro Ser Pro Gly Arg Leu Pro Gly Pro Gly Asp Thr Pro Ile Leu 210 215 220 Pro Gln 225

Claims (6)

  1. 서열번호 2, 11, 12 및 13으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는, 인간 에리스로포이에틴(EPO)과 인간 융모성 성선자극호르몬(HCG) β 서브유닛 카르복시 말단 펩타이드 변이체(ATP)의 융합단백질.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 따른 융합단백질을 코딩하는 핵산.
  6. 제5항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하여 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질을 제조하는 방법.
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