CN100516225C - 人血清蛋白与促红细胞生成素的融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人血清白蛋白与促红细胞生成素的融合蛋白，编码融合蛋白的DNA序列，携带该DNA序列的细菌、动物细胞等。本发明的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少85%序列同源的第一区和与人促红细胞生成素至少85%序列同源的第二区，并且在第一区和第二区之间设有连接肽。连接肽是具有10-20个相同或不同的氨基酸连接顺序，主要由甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸组成。本发明的融合蛋白既具有人促红细胞生成素的活性，并且延长了半衰期，有较好的应用价值。

Description

人血清蛋白与促红细胞生成素的融合蛋白

技术领域：

本发明属于生物化学技术领域。具体涉及一种人血清白蛋白与促红细胞生成素的融合蛋白。

背景技术：

血清蛋白是血浆的重要成分，也是许多内源因子和外源药物的载体，正常情况下不易透过肾小球。人血清蛋白(HSA，序列1)是一种585个氨基酸组成的蛋白质(A.Dugaiczyk et al.，PNAS，1982，79：71-75)，其分子量约为66.5KD，血浆半衰期长达2周以上。HSA在细胞中是以一种含18个氨基酸残基的信号肽和6个前肽的原肽形式合成的，信号肽和前肽在转运和分泌过程被切除。HSA已成功地在多种宿主中表达(EP330451和EP361991)。

促红细胞生成素(EPO)是30.4千道尔顿的糖蛋白细胞因子，其促进红细胞祖细胞的增生并维持它们分化成成熟的红细胞(Kranta，Blood，77：419-434，1991)。EPO在成年人的肾和胎儿的肝中产生。在成年人中，EPO主要是肾细胞应答缺氧或贫血而产生的，并在血液中循环。EPO几乎只与骨髓祖细胞表面上的66KDa的特异性受体(EPO-Rc)结合。EPO-Rc与EPO结合后，受体被激活，并发生同源二聚化，之后，发生酪氨酸磷酸化。随后，又发生一系列细胞内的信号转导，从而增加祖细胞的数量，并促进祖细胞分化成成熟红细胞(Lodish et al.，Cold Spring Harbor Syamp.Bio.，60：93-104，1995)。

重组人EPO(rHuEPO)已广泛应用于治疗肾脏疾病引起的贫血，肿瘤病人化疗后引起的贫血，外伤引起的大出血，以及骨髓发育不良综合症所引起的贫血，即可以刺激患者自身的造血功能，弥补各种原因引起的红细胞减少。因EPO只是造血因子的一种，另有其他造血因子能刺激血细胞的生长发育(如粒细胞和淋巴细胞等)，因此，世界上已有几种构建复合性刺激因子的例子，如IL3-EPO，EPO-GM-CSF(Antonio M et al，US Patent 5916773)。复合因子的构建是根据其自身功能，同时又具有双重协调作用。

正常人血清中的EPO浓度约为0.01-0.03U/ml。补充EPO是一种理想的对EPO产生减少的肾衰竭的治疗方法。静脉内注射的rHuEPO的血清清除半衰期约为4到13小时。皮下注射rHuEPO的血清最高浓度为注射后的5到25小时，清除半衰期为17小时。因此，相同剂量皮下注射比静脉注射在血液中具有更长的保留时间。

尽管利用生物工程技术生产的EPO已广泛应用于临床，但仍有不足之处。EPO产生于肾脏，作用于骨髓，然而它的分子量较低，由肾脏产生进入血液循环后，可很快由肾脏经尿液排除，半衰期比较短，需要比较频繁用药。这种长期频繁用药不久增加了病人的痛苦和治疗费用，而且易产生毒副反应。为了提高EPO分子的半衰期，增长其在血液中的停留时间以发挥更长功效，研究人员进行了各方面的实验，如用聚乙二醇修饰蛋白，用化学方法将蛋白连接成二聚体及多聚体，用基因工程方法生产二聚体及三聚体等，其结果均是为增大分子量，延长其体内循环时间。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计能延长EPO的半衰期的融合蛋白。

本发明提供了一种编码人血清蛋白与促红细胞生成素的融合蛋白HSA-L-EPO的DNA序列，该序列包括与人血清蛋白HSA氨基酸残基序列相同的第一区和与促红细胞生成素EPO氨基酸残基序列相同的第二区的融合蛋白的DNA序列，中间含有连接肽Linker的DNA。

序列1是HSA-L-EPO DNA序列

序列2是HSA DNA序列

序列3是EPO DNA序列

序列4是Linker DNA序列

序列1、2、3、4都是从5’端至3’端

本发明还提供了一种人血清蛋白HSA与促红细胞生成素EPO的融合蛋白，该融合蛋白包括与HSA 85％～95％序列同源的第一区和与EPO 85％～95％序列同源的第二区。其中优选的是包括与HSA至少95％序列同源的第一区与EPO至少95％序列同源的第二区。最优选的是包括与HSA序列相同的第一区和与EPO序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。

所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸的取代、缺失或加入得到的多肽。

在本发明的融合蛋白中，可以是HSA位于融合蛋白的N末端，EPO位于融合蛋白的C末端；也可以是EPO位于融合蛋白的N末端，HSA位于融合蛋白的C末端。其中主要以前者进行阐述。

为了使融合蛋白两部分有较大的间隔，EPO区域有最大的柔性，最大可能地与其受体结合，在HSA与EPO之间设有连接肽，所述的连接肽是具有10-20个相同或不同的氨基酸连接顺序，主要由甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸组成。

本发明利用HSA半衰期长的特点，用基因工程方法制造出人血清白蛋白与促红细胞生成素的融合蛋白。经过初步实验证明，该融合蛋白具有和EPO一样的生物功效，而且延长了EPO的半衰期，进而减少了用药次数。

本发明的又一目的是提供携带编码本发明融合蛋白的DNA序列的重组表达载体。该重组表达载体包括pcDNA3。

本发明的再一个目的是提供表达本发明融合蛋白编码基因的宿主，该宿主可以是被重组表达载体或表达载体的一部分转化，含有本发明融合蛋白编码基因的细菌、酵母、动物细胞或植物细胞，其中优选的是动物细胞。

本发明将血清白蛋白分子，或至少85％序列同源的类似物与EPO，或其至少85％序列同源的类似物融合，所形成的融合蛋白既保留了与EPO受体结合的活性，同时与EPO相比，又延长了其血浆半衰期。

编码HSA的多聚核苷酸和编码EPO的多聚核苷酸可以用本领域周知的方法，如聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA文库的方法等获得。用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞及文库等。也可以用人工合成的方法获得，人工合成时，可以选择宿主偏爱的密码子，这样往往可以提高产物的表达。

HSA基因和EPO基因的融合，在保持各自阅读框架不变的前提下，可以用本领域周知的方法，如通过PCR方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点，通过酶切产生粘性末端，HSA基因和EPO基因的粘性末端用DNA连接酶连接，从而获得编码融合蛋白的基因。

本发明还有一个目的是提供了用基因工程方法生产HSA-L-EPO融合蛋白的制备方法。该方法包括下列步骤：

1、获得HSA基因：从肝脏组织中提取信使核糖核酸(mRNA)利用RT-PCR方法制备单链和双链互补脱氧核糖核酸(cDNA)，经过分离纯化后，将HSA cDNA克隆到载体上，获得HSA基因重组子(图1)。

2、获得EPO基因：从工程菌中提取DNA，利用PCR方法获得EPO基因(图2)。

3、获得连接肽(Linker)编码基因：用固相合成法合成Linker编码基因。

4、获得Linker-EPO编码基因：设计引物，利用PCR搭桥的方式将Linker和EPO编码基因连接成一个完整的编码基因，并克隆到载体上获得重组子(图2)。

5、获得HSA-L-EPO编码基因：通过限制性内切酶分别酶切HSA重组子和Linker-EPO基因，然后再连接成HSA-L-EPO融合基因。

6、获得重组质粒，并将该质粒转化进入动物细胞株如中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)或猴的肾细胞(COS)细胞株(图3)。

以下详细描述制备方法，其中所使用的材料包括：

一、细胞株：包括CHO细胞株、COS细胞株。

菌株：包括大肠杆菌菌株DH5α、TOP10；

质粒：pBlueScript(PBS)、pUC18、

真核细胞表达质粒：pcDNA3

二、酶类(TaKaRa公司)：限制性内切酶、DAN聚合酶、T4DAN连接酶、RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒。

三、主要生化试剂和材料：EPO标准品(地奥)、dNTP(TaKaRa)、琼脂糖(TaKaRa)、氨卞青霉素(Sigma)、G418(Sigma)、蛋白质分子量标准(Sigma)、DNA分子量标准(TaKaRa)、EPO ELISAKit(R&D)

附图说明：

图1是HSA cDNA的合成及重组质粒的构建。

图2是Linker-EPO cDNA的合成及重组质粒的构建。

图3是获得HSA-L-EPO编码基因

图4是构建融合基因的DNA电泳示意图

图5是纯化的融合蛋白电泳图

图6是HSA-L-EPO融合蛋白与EPO血清清除时间图

具体实施方式：

实施例1HSA cDNA的克隆

取正常人肝脏组织，用RNA提取试剂盒(TaKaRa公司)分离总RNA，用通用RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)一步法合成HSA的cDNA。所用的引物为：

hsa1：5’-GACAAGCTTATGAAGTGGGTAACCTTTATTTC-3’

hsa2：5’-GAAGGATCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-3’

引物hsa1 5’端含有HindIII位点，hsa2 3’端含有BamHI位点。

RT-PCR一步法为：

100μl反应体系中加入2μl逆转录酶、2μlTaq酶，10μmol/L的hsa1和hsa2引物各4μl，2.5mmol/LdNTP 10μl，25mmol/LMgcl₂ 20μl，10x反应缓冲液10μl，RNA2μl。用Eppendorf Mastercycler PersonalPCR仪，RT-PCR条件为：50℃逆转录30分钟；94℃预变性2分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸3分钟；30个循环后，再72℃延伸10分钟。通过凝胶电泳分析反应物显示出预期大小(1.8KB)的条带，PCR产物电泳纯化，用DNA片段胶回收试剂盒(OMIGA公司)回收纯化约1.8KB的目标带。用HindIII和BamHI酶切纯化的HSA cDNA，以试剂盒纯化后，克隆到HindIII/BamHI酶切的PBS质粒上。采用常规的碱裂解方法提取质粒对重组子进行鉴定，并测序进一步确认。

实施例2连接肽cDNA和EPO cDNA的融合

取本公司的EPO工程菌，用DNA提取试剂盒(TaKaRa公司)提取DNA，PCR扩增EPO的cDNA。所用的引物为：

epo1：5’-GCCCCACCACGCCTCATCTG-3’

epo2：5’-GTTGCGGCCGCTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAAG-3’

引物epo2 5’端含有NotI位点，便于克隆到表达载体中。

PCR反应：

100μl反应体系中加入0.5μl pfu酶，10μmol/L的epo1和epo2引物各4μl，2.5mmol/LdNTP 8μl，10x反应缓冲液10μl，DNA 2μl，H₂O补足100μl。用Eppendorf Mastercycler Personal，RT-PCR条件为：94℃预变性2分钟；94℃变性45秒，57℃退火45秒，72℃延伸1分钟，30个循环后，再72℃延伸5分钟。通过凝胶电泳分析反应物显示出一预期大小(约500bp)的条带，PCR产物电泳纯化，用DNA片段胶回收试剂盒(OMIGA公司)回收纯化约500bp的目标带。

采用固相合成法合成一段DNA序列，其中5’端设计为BamHI酶切位点，并带有三个酶切位点保护碱基，便于和HSA基因融合；3’端和EPO编码基因的5’端有20bp的互补区，便于通过PCR搭桥方式和EPO基因进行融合。中间是Linler的序列，以下横线标出。合成的DNA序列为：

GAAGGATCCGGCGGAGGTGGAAGCGGCGGTGGAGGCTCCGGA GGCGGAGGTTCAGCCCCACCACGCCTCATCTG

以EPO和合成的DNA片段为混合模板，用引物lin1和epo2进行搭桥PCR扩增Linker-EPO DNA片段

lin1：5’-GAAGGATCCGGCGGAGGTG-3’

搭桥PCR反应：

100μl反应体系中加入0.5μl pfu酶，10μmol/L的lin1和epo2引物各4μl，2.5mmol/L dNTP 8μl，10x反应缓冲液10μl，合成DNA片段1μl，EPO cDNA片段1μl。用Eppendorf Mastercycler Personal，PCR条件为：94℃预变性2分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环后，再72℃延伸10分钟。通过凝胶电泳分析反应物显示出一预期大小(约600bp)的条带，PCR产物电泳纯化，用DNA片段胶回收试剂盒(OMIGA公司)回收纯化约600bp的目标带，BamHI/NotI酶切后，克隆到pBlueScript质粒上。采用常规的碱裂解方法提取质粒对重组子进行鉴定，并测序进一步确认。重组子命名为pBS-LEPO

实施例3 HSA cDNA与EPO cDNA的融合

采用常规的DNA重组法将HSA基因和带有Linker的EPO基因进行融合：

以BamHI和NotI双酶切pBS-LEPO质粒，切下Linker-EPO片段，酶切产物进行凝胶电泳，切割下600bp的片段，用DNA片段胶回收试剂盒(OMIGA公司)回收纯化，然后克隆到pBS-HSA质粒中，这样HSA基因和Linker以及EPO基因融合成了一个完整的基因。采用常规的碱裂解方法提取质粒对重组子进行鉴定，得到的重组子命名为pBS-HLE。然后将编码HSA-L-EPO融合蛋白的完整基因插入到哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen)的HindIII和NotI位点。最终的表达质粒(称为pcDNA3-HLE)含有在哺乳动物细胞高水平表达所需要的巨细胞病毒早期基因启动子-增强子。该质粒还含有可选择性标记基因，从而在细菌中具有氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中具有G418抗性。另外，当宿主细胞DHFR基因表达缺陷时，pcDNA3-HLE表达载体含有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，从而能在氨甲蝶呤(MTX)存在下共扩增HSA-L-EPO融合基因和DHFR基因(美国专利No.4399216)。

实施例4 在转染的细胞系中融合蛋白的表达

将重组pcDNA3-HLE表达质粒转入哺乳动物宿主细胞系，以表达HSA-L-EPO融合蛋白。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷的CHO细胞(美国专利No.4818679)。转染的方法可以是电转化、脂质体转化、原生质融合等方法。本发明采用脂质体(GeneTherapy Systems，Inc.)转染，8μg线性化的DNA加入200μl DNA稀释液，混匀后，室温静置5分钟，再加入无血清培养基稀释的脂质体200μl，混匀后再室温静置5分钟，然后滴加到细胞覆盖度为50-70％的培养瓶中继续培养。转染2天后，将培养基改成含0.4mg/mlG418的生长培养基进行筛选培养，对重组细胞进行富集培养。用人EPO抗体进行ELISA检测，判断富集后的重组子是否分泌融合蛋白。同时取部分细胞，提取DNA进行PCR检测，判断融合基因是否重组入CHO细胞基因组中。通过ELISA和PCR检测证明，融合基因成功转入CHO细胞中。

为了实现融合蛋白较高水平的表达，用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，转染的融合蛋白基因与DHFA基因共扩增。能在高达1μg/ml MTX培养基中生长的转染子，再次通过极限稀释法进行亚克隆。通过测定分泌率，对亚克隆的细胞系进行进一步的分析。分泌率超过10(较佳递约30)μg/10⁶(即百万个)细胞/24小时的细胞系，适合使用无血清培养基的悬浮培养。然后用条件培养基纯化融合蛋白。

糖侧链结构对于EPO的体内活性是关键的。Asn-连接的碳水化合物的末端糖链含有唾液酸，重复的聚-N-乙酰乳糖酰胺和半乳糖。已知在一些哺乳动物细胞，例如NSO细胞中表达的重组EPO，得到的是具有低唾液酸含量的蛋白质。除去唾液酸会导致暴露次末的半乳糖残基，这提高了肝唾液酸糖蛋白质结合性凝集素的亲活力。该捕获途径导致在整个动物内测量的体内生物活性下降。在CHO细胞中产生的重组EPO显示与天然EPO中发现的非常相似的糖基化模式(PNAS，86：7812-22，1989)。根据本发明表达和生产的HSA-L-EPO融合蛋白，当与EPO基于摩尔比较时，显示出更长的半衰期。

实施例5 融合蛋白的纯化和定性

将培养的细胞上清液进行超滤，然后将超滤浓缩的样品以DEAESepharose Fast Flow进行纯化，以PBS(pH7.0)进行洗脱，收集样品峰，再以反相柱(Source15)进行纯化，收集乙醇浓度在50％-80％之间的样品峰，再上一次DEAE SepharoseFast Flow柱，去掉乙醇，浓缩样品体积后，以分子筛Superdex 200进行层析，最后得到纯品。图6为纯化后融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。

实施例6 体外生物活性分析

可测定转染子的上清夜或纯化蛋白刺激TF-1细胞的增殖能力(Kitamura等，J.Cell.Physiol.，140：323-334，1989)。TF-1细胞在细胞表面表达EPO-Rc，并对EPO反应。将细胞维持在生长培养基(RPMI-1640培养基，含有10％FCS和1-5ng/ml人IL-5)。收集对数期的TF-1细胞，并用分析培养基洗涤(不含IL-5的生长培养基)。将每份共1×10⁴个细胞的TF-1样品(50μl)加到96孔组织培育板的各孔中，用50μl含有0.01-100nM各种HSA-L-EPO融合蛋白或EPO对照的分析培养基培养这些细胞。在37℃、5％CO₂湿润培养箱中培养该平板4天，然后在各孔中添加10μlMTT(用PBS配制成2.5mg/ml)。4小时后，在每孔中加入100μl 10％SDS的0.01M HCl，以融解细胞和Formazan。然后在550对该平板进行读数，其中参考光束设为690nm。OD读数相对于EPO或融合蛋白作图。因此可以定量地比较融合蛋白相对于EPO的生物活性。较佳地按摩尔计，重组融合蛋白的活性应不低于EPO的活性。在本发明的一实施例中，HSA-L-EPO融合蛋白的比活力约为4-5×10⁴U/umol，而EPO约为3-4×10⁴U/umol。

实施例7 大鼠内体内生物活性动力学研究

通过尾静脉进行静脉注射或通过皮下注射，将100单位的EPO或HSA-L-EPO融合蛋白注射入小鼠。注射相同体积的PBS作为对照。分别在用药前和用药后不同时间点(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9天)取小鼠尾静脉血，常规测定每日的网织红细胞百分数，直到网织红细胞百分数低于用药前水平。将网织红细胞百分数对时间点作图(图6)，以计算循环时间。融合蛋白HSA-L-EPO在小鼠血浆中的代谢速度明显比EPO对照慢，表明小鼠中融合蛋白的半衰期更长。

序列1是HSA-L-EPO DNA序列

aagcttatga agtgggtaac ctttatttcc cttctttttc tctttagctc ggcttattcc   60

aggggtgtgt ttcgtcgaga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcggtt taaagatttg  120

ggagaagaaa atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt  180

ccatttgaag atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgtt  240

gctgatgagt cagctgaaaa ttgtgacaaa tcacttcata ccctttttgg agacaaatta  300

tgcacagttg caactcttcg tgaaacctat ggtgaaatgg ctgactgctg tgcaaaacaa  360

gaacctgaga gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga  420

ttggtgagac cagaggttga tgtgatgtgc actgcttttc atgacaatga agagacattt  480

ttgaaaaaat acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc  540

cttttctttg ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa  600

gctgcctgcc tgttgccaaa gctcgatgaa cttcgggatg aagggaaggt ttcgtctgcc  660

aaacagagac tcaagtgtgc cagtctccaa aaatttggag aaagagcttt caaagcatgg  720

gcagtagctc gcctgagcca gagatttccc aaagctgagt ttgcagaagt ttccaagtta  780

gtgacagatc ttaccaaagt ccacacggaa tgctgccatg gagatctgct tgaatgtgct  840

gatgacaggg cggaccttgc caagtatatc tgtgaaaatc aagattcgat ctccagtaaa  900

ctgaaggaat gctgtgaaaa acctctgttg gaaaaatccc actgcattgc cgaagtggaa  960

aatgatgaga tgcctgctga cttgccttca ttagctgctg attttgttga aagtaaggat 1020

gtttgcaaaa actatgctga ggcaaaggat gtcttcctgg gcatgttttt gtatgaatat  1080

gcaagaaggc atcctgatta ctctgtcgtg ctgctgctga gacttgccaa gacatatgaa  1140

accactctag agaagtgctg tgccgctgca gatcctcatg aatgctatgc caaagtgttc  1200

gatgaattta aacctcttgt ggaagagcct cagaatttaa tcaaacaaaa ttgtgagctt  1260

tttgagcagc ttggagagta caaattccag aatgcgctat tagttcgtta caccaagaaa  1320

gtaccccaag tgtcaactcc aactcttgta gaggtctcaa gaaacctagg aaaagtgggc  1380

agcaaatgtt gtaaacatcc tgaagcaaaa agaatgccct gtgcagaaga ctatctatcc  1440

gtggtcctga accagttatg tgtgttgcat gagaaaacgc cagtaagtga cagagtcacc  1500

aaatgctgca cagaatcctt ggtgaacagg cgaccatgct tttcagctct ggaagtcgat  1560

gaaacatacg ttcccaaaga gtttaatgct gaaacattca ccttccatgc agatatatgc  1620

acactttctg agaaggagag acaaatcaag aaacaaactg cacttgttga gcttgtgaaa  1680

cacaagccca aggcaacaaa agagcaactg aaagctgtta tggatgattt cgcagctttt  1740

gtagagaagt gctgcaaggc tgacgataag gagacctgct ttgccgagga gggtaaaaaa  1800

cttgttgctg caagtcaagc tgccttaggc ttaggatccg gcggaggtgg aagcggcggt  1860

ggaggctccg gaggcggagg ttcagcccca ccacgcctca tctgtgacag ccgagttctg  1920

gagaggtacc tcttggaggc caaggaggcc gagaatatca cgacgggctg tgctgaacac  1980

tgcagcttga atgagaatat cactgtccca gacaccaaag ttaatttcta tgcctggaag  2040

aggatggagg tcgggcagca ggccgtagaa gtctggcagg gcctggccct gctgtcggaa  2100

gctgtcctgc ggggccaggc cctgttggtc aactcttccc agccgtggga gcccctgcag  2160

ctgcatgtgg ataaagccgt cagtggcctt cgcagcctca ccactctgct tcgggctctg  2220

ggagcccaga aggaagccat ctcccctcca gatgcggcct cagctgctcc actccgaaca  2280

atcactgctg acactttccg caaactcttc cgagtctact ccaatttcct ccggggaaag  2340

ctgaagctgt acacagggga ggcctgcagg acaggggaca gatgagcggc cgc         2393

序列2是HSA DNA序列

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt   60

gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa  120

gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt  180

gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat  240

gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca  300

gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct  360

gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg  420

agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa  480

aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc  540

tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc  600

tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggtttcgtc tgccaaacag  660

agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta  720

gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca   780

gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac   840

agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag   900

gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat   960

gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc  1020

aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatft ttttgtatga atatgcaaga  1080

aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact  1140

ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa  1200

tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag  1260

cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc  1320

caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa  1380

tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc  1440

ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc  1500

tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca  1560

tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt  1620

tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagcttgt gaaacacaag  1680

cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag  1740

aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt  1800

gctgcaagtc aagctgcctt aggcttataa                                  1830

序列3是EPO DNA序列

gccccaccac gcctcatctg tgacagccga gttctggaga ggtacctctt ggaggccaag   60

gaggccgaga atatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcttgaatga gaatatcact  120

gtcccagaca ccaaagttaa tttctatgcc tggaagagga tggaggtcgg gcagcaggcc  180

gtagaagtct ggcagggcct ggccctgctg tcggaagctg tcctgcgggg ccaggccctg  240

ttggtcaact cttcccagcc gtgggagccc ctgcagctgc atgtggataa agccgtcagt  300

ggccttcgca gcctcaccac tctgcttcgg gctctgggag cccagaagga agccatctcc  360

cctccagatg cggcctcagc tgctccactc cgaacaatca ctgctgacac tttccgcaaa  420

ctcttccgag tctactccaa tttcctccgg ggaaagctga agctgtacac aggggaggcc  480

tgcaggacag gggacagatg a                                            501

序列4是Linker DNA序列

ggatccggcg gaggtggaag cggcggtgga ggctccggag gcggaggttc a            51

Claims (3)

1、一种人血清白蛋白与促红细胞生成素融合蛋白的DNA，其特征在于该融合蛋白的DNA序列如下：

aagcttatga agtgggtaac ctttatttcc cttctttttc tctttagctc ggcttattcc    60

aggggtgtgt ttcgtcgaga tgcacacaag agtgaggttg ctcatcggtt taaagatttg   120

ggagaagaaa atttcaaagc cttggtgttg attgcctttg ctcagtatct tcagcagtgt   180

ccatttgaag atcatgtaaa attagtgaat gaagtaactg aatttgcaaa aacatgtgtt   240

gctgatgagt cagctgaaaa ttgtgacaaa tcacttcata ccctttttgg agacaaatta   300

tgcacagttg caactcttcg tgaaacctat ggtgaaatgg ctgactgctg tgcaaaacaa   360

gaacctgaga gaaatgaatg cttcttgcaa cacaaagatg acaacccaaa cctcccccga   420

ttggtgagac cagaggttga tgtgatgtgc actgcttttc atgacaatga agagacattt   480

ttgaaaaaat acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccggaactc   540

cttttctttg ctaaaaggta taaagctgct tttacagaat gttgccaagc tgctgataaa   600

gctgcctgcc tgttgccaaa gctcgatgaa cttcgggatg aagggaaggt ttcgtctgcc   660

aaacagagac tcaagtgtgc cagtctccaa aaatttggag aaagagcttt caaagcatgg   720

gcagtagctc gcctgagcca gagatttccc aaagctgagt ttgcagaagt ttccaagtta   780

gtgacagatc ttaccaaagt ccacacggaa tgctgccatg gagatctgct tgaatgtgct   840

gatgacaggg cggaccttgc caagtatatc tgtgaaaatc aagattcgat ctccagtaaa   900

ctgaaggaat gctgtgaaaa acctctgttg gaaaaatccc actgcattgc cgaagtggaa   960

aatgatgaga tgcctgctga cttgccttca ttagctgctg attttgttga aagtaaggat  1020

gtttgcaaaa actatgctga ggcaaaggat gtcttcctgg gcatgttttt gtatgaatat  1080

gcaagaaggc atcctgatta ctctgtcgtg ctgctgctga gacttgccaa gacatatgaa  1140

accactctag agaagtgctg tgccgctgca gatcctcatg aatgctatgc caaagtgttc  1200

gatgaattta aacctcttgt ggaagagcct cagaatttaa tcaaacaaaa ttgtgagctt  1260

tttgagcagc ttggagagta caaattccag aatgcgctat tagttcgtta caccaagaaa  1320

gtaccccaag tgtcaactcc aactcttgta gaggtctcaa gaaacctagg aaaagtgggc  1380

agcaaatgtt gtaaacatcc tgaagcaaaa agaatgccct gtgcagaaga ctatctatcc  1440

gtggtcctga accagttatg tgtgttgcat gagaaaacgc cagtaagtga cagagtcacc  1500

aaatgctgca cagaatcctt ggtgaacagg cgaccatgct tttcagctct ggaagtcgat  1560

gaaacatacg ttcccaaaga gtttaatgct gaaacattca ccttccatgc agatatatgc  1620

acactttctg agaaggagag acaaatcaag aaacaaactg cacttgttga gcttgtgaaa  1680

cacaagccca aggcaacaaa agagcaactg aaagctgtta tggatgattt cgcagctttt  1740

gtagagaagt gctgcaaggc tgacgataag gagacctgct ttgccgagga gggtaaaaaa  1800

cttgttgctg caagtcaagc tgccttaggc ttaggatccg gcggaggtgg aagcggcggt  1860

ggaggctccg gaggcggagg ttcagcccca ccacgcctca tctgtgacag ccgagttctg  1920

gagaggtacc tcttggaggc caaggaggcc gagaatatca cgacgggctg tgctgaacac  1980

tgcagcttga atgagaatat cactgtccca gacaccaaag ttaatttcta tgcctggaag  2040

aggatggagg tcgggcagca ggccgtagaa gtctggcagg gcctggccct gctgtcggaa  2100

gctgtcctgc ggggccaggc cctgttggtc aactcttccc agccgtggga gcccctgcag  2160

ctgcatgtgg ataaagccgt cagtggcctt cgcagcctca ccactctgct tcgggctctg  2220

ggagcccaga aggaagccat ctcccctcca gatgcggcct cagctgctcc actccgaaca  2280

atcactgctg acactttccg caaactcttc cgagtctact ccaatttcct ccggggaaag  2340

ctgaagctgt acacagggga ggcctgcagg acaggggaca gatgagcggc cgc         2393。

2、根据权利要求1所述的DNA，其特征在于该DNA编码的融合蛋白中的第一区人血清白蛋白和第二区人促红细胞生成素之间设有连接肽，该连接肽的DNA序列如下：

ggatccggcg gaggtggaag cggcggtgga ggctccggag gcggaggttc a    51。

3、一种制备如权利要求1所述的人血清白蛋白与人促红细胞生成素融合蛋白的DNA的方法，该方法包括下列步骤：

①获得HSA基因：从肝脏组织中提取信使核糖核酸mRNA利用RT-PCR方法制备单链和双链互补脱氧核糖核酸cDNA，经过分离纯化后，将HSA cDNA克隆到载体上，获得HSA基因重组子；

②获得EPO基因：从工程菌中提取DNA，利用PCR方法获得EPO基因；

③获得连接肽Linker编码基因：用固相合成法合成Linker编码基因；

④获得Linker-EPO编码基因：设计引物，利用PCR搭桥的方式将Linker和EPO编码基因连接成一个完整的编码基因，并克隆到载体上获得重组子；

⑤获得HSA-L-EPO编码基因：通过限制性内切酶分别酶切HSA重组子和Linker-EPO基因，然后再连接成融合蛋白DNA。

Images