CN108472337A

CN108472337A - 因子ix融合蛋白以及其制备和使用方法

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Publication number: CN108472337A
Application number: CN201680056331.4A
Authority: CN
Inventors: 刘志强; 阿尔然·范德弗利尔; 大卫·R·莱特; 埃克塔·赛斯·恰布拉; 刘童瑶; 罗伯特·T·彼得斯; 约翰·库曼; 艾曼·伊斯梅尔
Original assignee: Treatment Co
Current assignee: Treatment Co
Priority date: 2015-08-03
Filing date: 2016-08-03
Publication date: 2018-08-31
Anticipated expiration: 2036-08-03
Also published as: WO2017024060A1; MX2018001497A; JP2018522563A; PH12018500252A1; EA201890423A1; JP2021078526A; AU2016301303A1; CN108472337B; US10745680B2; HK1248162A1; US20180355341A1; TW201716433A; CO2018002196A2; UA126016C2; CA2994547A1; AU2016301303B2; CL2018000302A1; KR20180029262A; KR102659212B1; IL257231A

Abstract

本发明提供因子IX(FIX)融合蛋白，其包含至少一个异源部分，诸如XTEN。本发明还公开制备和使用所述FIX融合蛋白的方法。

Description

因子IX融合蛋白以及其制备和使用方法

对以电子方式提交的序列表的参考

与本申请一起提交的ASCII文本文件(名称：2159_466PC03_SeqListing_ST25.txt；大小：688,154个字节；并且创建日期：2016年8月2日)中以电子方式提交的序列表的内容以引用的方式整体并入本文中。

背景

B型血友病(也称为克里斯马斯病(Christmas disease))为世界上最常见的遗传性出血病症之一。其导致体内和体外血液凝结活性降低并且需要受影响个体终生进行广泛的医学监测。在不存在干预的情况下，患病个体将罹患自发性关节出血，由此产生严重疼痛和逐渐衰弱而行动不便；肌肉内出血导致血液在那些组织中累积；咽喉和颈部自发性出血如果不立即治疗，则会引起窒息；肾出血；并且在手术、微小意外损伤或拔牙之后严重出血也相当普遍。

正常体内血液凝固最少需要丝氨酸蛋白酶因子II(凝血酶原)、因子VII、因子IX、因子X和因子XI(可溶血浆蛋白)；辅因子，包括跨膜蛋白组织因子和血浆蛋白因子V和因子VIII；纤维蛋白原、转谷氨酰胺酶因子XIII、磷脂(包括活化的血小板)以及钙。一些体外凝结测试需要包括血管舒缓素、高分子量激肽原和因子XII在内的其他蛋白质，并且其可在病理条件下在体内起作用。

就血友病而言，血液凝结由于缺乏某些血浆血液凝结因子而受到干扰。B型血友病由因子IX(FIX)的缺乏引起，因子IX的缺乏可由FIX蛋白合成减少或不存在，或者活性降低的缺陷分子导致。血友病通过用高度富含FIX之外源性因子浓缩物替代缺失的凝血因子进行治疗。然而，如下所述，由血液产生此类浓缩物存在技术难题。

从血浆纯化FIX(血浆源性FIX；pdFIX)几乎仅得到全-γ-羧基化的FIX。然而，此种从血浆纯化FIX极为困难，因为FIX仅以低浓度存在于血浆中(5μg/mL)。Andersson,Thrombosis Research 7:451 459(1975)。另外，从血液进行纯化需要将诸如HIV和HCV的感染源移除或灭活。此外，pdFIX的半衰期短并且因此需要频繁给药。重组因子IX(rFIX)也为可用的，但与pdFIX一样，其半衰期短并且需要频繁给药(例如就预防而言，每周2-3次)。

死亡率降低、关节损伤的预防和生活品质的改善已为由开发血浆源性FIX和重组FIX带来的重要成就。长期防止出血将代表治疗B型血友病受试者的另一关键进步。因此，仍需要具有较长半衰期同时保持有效活性的改进的重组FIX。

发明内容

公开包含至少一个XTEN的特定因子IX融合蛋白。在一方面，本发明提供一种因子IX(FIX)融合蛋白，其包含FIX多肽和至少一个XTEN，所述XTEN插入在所述FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:2的氨基酸103、SEQ ID NO:2的氨基酸105、SEQ ID NO:2的氨基酸142、SEQ ID NO:2的氨基酸149、SEQ ID NO:2的氨基酸162、SEQ ID NO:2的氨基酸166、SEQ ID NO:2的氨基酸174、SEQ ID NO:2的氨基酸224、SEQ IDNO:2的氨基酸226、SEQ ID NO:2的氨基酸228、SEQ ID NO:2的氨基酸413及其任何组合，并且其中所述FIX融合蛋白展现促凝血活性。

本发明还提供一种FIX融合蛋白，其包含FIX多肽和包含XTEN的异源部分，其中所述XTEN与所述FIX多肽的C末端融合并且包含长度长于42个氨基酸且短于144个氨基酸的氨基酸序列。

本发明的FIX融合蛋白具有若干用途，包括提供一种预防、治疗、改善或管理有需要患者的凝血疾病或病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括施用有效量的本文所描述的FIX融合蛋白(例如通过皮下施用)的步骤。

本发明还提供一种延长FIX多肽的半衰期的方法，其包括将XTEN插入在所述FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:2的氨基酸103、SEQ IDNO:2的氨基酸105、SEQ ID NO:2的氨基酸142、SEQ ID NO:2的氨基酸149、SEQ ID NO:2的氨基酸162、SEQ ID NO:2的氨基酸166、SEQ ID NO:2的氨基酸174、SEQ ID NO:2的氨基酸224、SEQ ID NO:2的氨基酸226、SEQ ID NO:2的氨基酸228、SEQ ID NO:2的氨基酸413及其任何组合，由此构建FIX融合蛋白，并且其中所述FIX融合蛋白展现促凝血活性。

由以下说明和附图将易于了解其他发明实施方案。

以引用方式并入

本文中公开的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文中，其引用程度就如同具体且个别地指示每个单独出版物、专利或专利申请以引用的方式并入本文中一般。

附图简述

图1为描绘FIX融合蛋白的活性的图，所述FIX融合蛋白包含插入在各种插入位点(例如，氨基酸52、氨基酸59、氨基酸66、氨基酸80、氨基酸85、氨基酸89、氨基酸103、氨基酸105、氨基酸113、氨基酸129、氨基酸142、氨基酸149、氨基酸162、氨基酸166、氨基酸174、氨基酸188、氨基酸202、氨基酸224、氨基酸226、氨基酸228、氨基酸230、氨基酸240、氨基酸257、氨基酸265、氨基酸277、氨基酸283、氨基酸292、氨基酸316、氨基酸341、氨基酸354、氨基酸392、氨基酸403以及氨基酸413，对应于SEQ ID NO:2的氨基酸)或与所述FIX多肽的C末端(C-terminus)(C末端(C-term))融合的具有42个氨基酸(例如AE42)的XTEN。C末端融合的XTEN在FIX与C末端融合物之间含有凝血酶可裂解位点。Y轴显示FIX活性，以通过发色测定获得的基础构建体(FIX-R338L)在条件培养基中的活性百分比表示。X轴以氨基酸编号(对应于SEQ ID NO:2)和单字母氨基酸缩写形式显示具体插入位点。FIX的相应结构域(例如，GLA、EGF1、EGF2、接头、AP和催化结构域)、接头区和C末端(C-terminus)(“C末端(C-term)”)在X轴下方指出。

图2为+描绘FIX融合蛋白的活性的图，所述FIX融合蛋白包含插入在各种插入位点(例如，氨基酸103、氨基酸105、氨基酸142、氨基酸149、氨基酸162、氨基酸166、氨基酸174、氨基酸224和氨基酸413，对应于SEQ ID NO:2的氨基酸)或与FIX多肽的C末端(C-terminus)(C末端(C-term)，氨基酸415)融合的具有42个氨基酸(AE42)、72个氨基酸(AE72)、144个氨基酸(AE144)、288个氨基酸(AE288)和864个氨基酸(AE864)的XTEN。Y轴显示FIX活性，以通过发色测定获得的基础构建体(FIX-R338L)在条件培养基中的活性百分比表示。X轴以氨基酸编号(对应于SEQ ID NO:2)形式显示每个插入位点的结构域(例如EGF2、AP和催化结构域)或区域(例如，接头和C末端)和具体插入位点。箭头指示选择用于进一步实验(参见图3A-3B)的插入位点。

图3A为R338L FIX变体的区域和结构域的示意性表示。突出显示作为潜在异源部分(例如XTEN)插入位点的特定氨基酸残基(例如N105、D166和E224)和C末端。图3B显示由三个不同角度得到的猪FIX(PDB:1PFX)的三维结构的图解。标出插入位点N105、D166和E224；C末端；以及R338L突变(例如在R338L FIX变体中)的位置。

图4概述包含一个或两个XTEN(例如，具有42个、72个、144个和288个氨基酸的XTEN)或包含一个XTEN和一个Fc结构域或FIXFc的FIX融合蛋白的相对活性。Y轴显示FIX活性，以通过发色测定获得的基础构建体(FIX-R338L)在条件培养基中的活性百分比表示。X轴显示构建体编号，并且X轴下方的表格显示所测试的每种构建体的XTEN和Fc的组成。EGF2(105)、AP(166)、60环(224)和C末端XTEN或Fc指示XTEN或Fc插入或融合的位置。X轴下方的表格中每一格中的数字(例如，42、72、144和288，指示XTEN的大小)和“Fc”指示哪一部分插入在FIX多肽内或与FIX多肽的C末端融合。

图5A提供描绘如在B型血友病小鼠中单次静脉内推注给药后所测量，与rFIX和rFIXFc相比具有各种长度的凝血酶可裂解C末端XTEN融合物的各种FIX融合蛋白(例如，FIX-CT.288(具有288个氨基酸的XTEN，例如AE288)和FIX-CT.864(具有864个氨基酸的XTEN，例如AE864)的给药的FIX凝血活性的血浆百分比随时间变化的图。图5B提供描绘如在B型血友病小鼠中单次静脉内推注给药之后所测量，与rFIX和rFIXFc相比具有在活化肽(AP)结构域中插入的各种长度的XTEN融合物的各种FIX融合蛋白(例如，FIX-AP.144、FIX-AP.72和FIX-AP.42)的给药的FIX凝血活性的血浆百分比随时间变化的图。图5C提供图5A和5B中所示的单次静脉内推注给药FIX融合蛋白的药物动力学参数计算值的图解编辑。Y轴上指示每一指定分子的血浆活性回收百分比含量。X轴显示平均滞留时间(MRT，以小时计)计算值，并且圆点区域表示在剂量曲线下面积的相对计算值(AUC/D，以h/kg/mL计)。

图6A提供描绘如在B型血友病小鼠中单次静脉内推注给药之后所测量，与rFIX和rFIXFc相比具有在活化肽(AP)结构域(例如FIXFc-AP.72和FIXFc-AP.42)或EGF2结构域(例如FIXFc-EGF.42)中插入的各种长度的XTEN融合物的各种FIX融合蛋白的给药的FIX凝血活性的血浆百分比随时间变化的图。图6B提供图6A中所示的单次静脉内推注给药的FIX融合蛋白的药物动力学参数计算值的图解编辑。Y轴上指示每一指定分子的血浆活性回收百分比含量。X轴指示平均滞留时间(MRT，以小时计)计算值。圆点区域表示在剂量曲线下面积的相对计算值(AUC/D，以h/kg/mL计)。

图7A提供描绘如在B型血友病小鼠中单次皮下推注给药之后所测量，与rFIX和rFIXFc相比包含与FIX多肽的C末端融合的具有288个氨基酸的凝血酶可裂解XTEN的FIX融合蛋白(rFIX-CT.288)、包含插入在FIX多肽的AP结构域内的具有72个氨基酸的XTEN的FIX融合蛋白(rFIXFc-AP.72)和包含插入在FIX多肽的EGF2结构域内的具有42个氨基酸的XTEN的FIX融合蛋白(rFIXFc-EGF2.42)的给药的FIX凝血活性的血浆百分比随时间变化的图。图7B提供图7A中所示的单次皮下推注给药的FIX融合蛋白的药物动力学参数计算值的图解编辑。Y轴上指示每一指定分子的生物利用率百分比。X轴指示平均滞留时间(MRT，以小时计)计算值。圆点区域表示在剂量曲线下面积的相对计算值(AUC/D，以h/kg/mL计)。

图8A提供在人B型血友病血液中通过旋转式血栓弹力测定法(rotationalthromboelastometry，ROTEM)测量的rFIXFc和包含插入在FIX的AP结构域内的具有72个氨基酸的XTEN的FIX融合蛋白(例如rFIXFc-AP-XTEN.72)的凝血时间(以秒计)的图解描绘。图8B提供在人B型血友病血液中rFIXFc和FIX融合蛋白(例如rFIXFc-AP-XTEN.72)的α角(以度计)的图解描绘。图8C提供在人B型血友病血液中rFIXFc和FIX融合蛋白(例如rFIXFc-AP-XTEN.72)的最大凝块硬度(MCF，以mm计)的图解描绘。

图9为示出rFIXFc-AP.72与rFIXFc相比在尾截割出血模型中的急性功效的图。呈现的结果为给药后5分钟、在30分钟治疗期内和所指示给药的个别和平均失血量(μl)。星号指示媒介物相对于所有其他治疗组的显著性p值。数据指示与rFIXFc相比在用rFIXFc-AP.72给药的小鼠中具有类似或改善的功效。

图10为示出HemB小鼠存活率百分比(Y轴)随尾静脉切断后的时间(以小时计；X轴)而变化的图。所有小鼠在尾静脉切断之前72小时以指定IU/kg在静脉内预先给予FIXFc(点划线)或皮下预先给予FIXFc-AP.72(FIXFc-AP.72：100IU/kg(实心黑色圆圈)、50IU/kg(实心灰色三角形)和15IU/kg(实心倒转灰色三角形)；rFIXFc：100IU/kg(空心圆圈)、50IU/kg(空心三角形)和15IU/kg(空心倒转三角形))；以及媒介物(实心灰色圆圈)。当与媒介物治疗的小鼠相比较时，给予rFIXFc或FIXFc-AP.72的小鼠的存活率曲线均显著不同(p<0.0001，对数秩(Mantel-Cox)测试。

图11A为示出在通过静脉内(虚线)或皮下注射(实线)给予单次推注(200IU/kg)的rFIX(灰色)或rFIXFc-AP.72融合蛋白(黑色)的B型血友病小鼠中针对时间作图的如通过一级血浆测定测量的血浆FX活性水平的图。图11B示出如使用非房室分析(NCA)、使用PhoenixWinNonLin 6.2.1软件(Pharsight,Certara)测定的药物动力学参数。

图12A为示出rFIXFc-AP.72单链Fc的结构域结构的示意图。图12B为示出rFIXFc-AP.72双链Fc的结构域结构的示意图。“FIX HC”是指FIX的重链；“FIX LC”是指FIX的轻链，其包括FIX的EGF和GLA结构域；并且AP是指FIX的活化肽。

图13为概述实施例中使用的FIX-XTEN构建体和相配的序列标识符、描述和质粒代码的表格。

详细描述

本发明提供一种包含FIX多肽和至少一个异源部分的FIX融合蛋白以及其制备和使用方法。在某些方面中，FIX融合蛋白包含插入在FIX多肽内、与FIX多肽的C末端融合或两者的至少一个异源部分，其中FIX融合蛋白展现促凝血活性。在一个特定方面中，所述异源部分为XTEN。

I.定义

在本公开通篇，术语“一个(种)”实体是指一个或多个(种)所述实体；举例而言，“一个多核苷酸”应理解为表示一个或多个多核苷酸。因此，术语“一个(种)”、“一个或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。

此外，“和/或”在本文中使用时应视为对两个指定特征或组分中的每一者在具有或不具有另一者的情况下的具体公开。因此，如本文中在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”意图涵盖以下方面中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

应理解，当在本文中用语言“包含”描述各方面时，还提供以“由...组成”和/或“基本上由...组成”的术语描述的其他相似方面。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语皆具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。举例而言，Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary ofCell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press，向技术人员提供本公开所使用的许多术语的通用词典。

单位、前缀和符号皆以其国际单位制(Système International de Unites,(SI))公认形式表示。数字范围包括界定所述范围的数字在内。除非另外指明，否则氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向书写。本文中提供的标题不限制本公开的各种方面，所述方面可通过参考整个说明书得出。因此，即将在下文定义的术语通过参照说明书全文进行更完整地定义。

术语“约”在本文中用于意指近似、大致、大约或在……左右。当术语“约”与数字范围结合使用时，其通过使边界扩展高于和低于所陈述的数字来修饰所述范围。一般而言，术语“约”可通过例如向上或向下(增大或降低)10％的变化来修饰高于或低于所述值的数值。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意图涵盖单个核酸以及复数个核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。在某些实施方案中，多核苷酸包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中所发现的酰胺键)。术语“核酸”是指多核苷酸中存在的任一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意图指已从其天然环境移出的核酸分子，即DNA或RNA。举例而言，出于本发明的目的，载体中所包含的编码FIX多肽的重组多核苷酸被视为分离的多核苷酸。分离的多核苷酸的其他实例包括维持在异源宿主细胞中或从溶液中的其他多核苷酸纯化(部分或基本上纯化)的重组多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括以合成方式产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可包括调控元件，诸如启动子、增强子、核糖体结合位点或转录终止信号。

如本文所用的“编码区”或“编码序列”为由可翻译成氨基酸的密码子组成的多核苷酸的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)通常不翻译成氨基酸，但其可被视为编码区的一部分，但是任何侧接序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子及其类似序列)不为编码区的一部分。编码区的边界通常由在5'末端处编码所得多肽的氨基末端的起始密码子和在3'末端处编码所得多肽的羧基末端的翻译终止密码子来确定。本发明的两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中，例如在单个载体上；或存在于独立的多核苷酸构建体中，例如在独立(不同)的载体上。然后可以推断单个载体可仅含有单个编码区，或包含两个或更多个编码区，例如单个载体可独立地编码如下文所描述的结合结构域A和结合结构域B。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码融合或未融合至编码本发明的结合结构域的核酸的异源编码区。异源编码区包括但不限于特殊元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。

哺乳动物细胞分泌的某些蛋白质与分泌信号肽缔合，一旦逐渐增长的蛋白质链开始跨粗内质网输出，所述信号肽即从成熟蛋白质裂解。本领域普通技术人员应明白，信号肽一般与多肽的N末端融合，并且从完整或“全长”多肽裂解以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中，使用天然信号肽或所述序列的保留引导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可使用异源哺乳动物信号肽，例如人类组织纤维蛋白溶酶原活化物(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶信号肽或其功能性衍生物。

术语“下游”是指位于参考核苷酸序列的3'方向的核苷酸序列。在某些实施方案中，下游核苷酸序列涉及在转录起始点之后的序列。举例而言，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。“下游”也可以是指位于参考肽序列的C末端的肽序列。

术语“上游”是指位于参考核苷酸序列的5'方向的核苷酸序列。在某些实施方案中，上游核苷酸序列涉及位于编码区或转录起始点的5'侧上的序列。举例而言，大多数启动子位于转录起始位点的上游。“上游”也可以是指位于参考肽序列的N末端的肽序列。

如本文所用，术语“调控区”是指位于编码区的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)，并且影响所缔合的编码区的转录、RNA加工、稳定性或翻译的核苷酸序列。调控区可包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎-环结构。如果编码区意图在真核细胞中表达，则聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码序列的3'方向。

编码基因产物(例如多肽)的多核苷酸可包含与一个或多个编码区可操作地缔合的启动子和/或其他转录或翻译控制元件。在可操作缔合中，基因产物(例如多肽)的编码区以将所述基因产物的表达置于调控区的影响或控制下的方式与一个或多个调控区缔合。举例而言，如果诱导启动子功能引起编码由编码区编码的基因产物的mRNA的转录，且如果启动子与编码区之间的键联的性质不干扰启动子引导基因产物表达的能力或不干扰转录DNA模板的能力，则编码区和启动子为“可操作地缔合”。除启动子之外的其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号，也可与编码区可操作地缔合以引导基因产物表达。

本领域技术人员已知多个转录控制区。这些转录控制区包括但不限于，在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于，来自巨细胞病毒(立即早期启动子与内含子A的组合)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(诸如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白)的那些控制区，以及能够控制真核细胞中的基因表达的其他序列。其他适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导性启动子(例如可由干扰素或介白素诱导的启动子)。

类似地，本领域普通技术人员已知多种翻译控制元件。这些元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和源自于细小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。

如本文所用，术语“表达”是指多核苷酸借以产生基因产物(例如RNA或多肽)的过程。其包括但不限于将多核苷酸转录成信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物，以及将mRNA翻译成多肽。表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可为核酸(例如通过基因转录产生的信使RNA)或由转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰(例如聚腺苷酸化或剪接)的核酸或具有翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白质亚基缔合或蛋白水解裂解)的多肽。

“载体”是指用于将核酸克隆和/或转移至宿主细胞中的任何媒介物。载体可为可与另一核酸区段连接以使所连接区段复制的复制子。“复制子”是指在体内充当自主复制单元，即，能够在自身控制下复制的任何遗传元件(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”包括用于在体外、离体或在体内将核酸引入细胞中的病毒载体和非病毒载体。本领域中已知并使用许多载体，包括例如质粒、修饰的真核病毒或修饰的细菌病毒。将多核苷酸插入到适合载体中可通过将适当多核苷酸片段连接至具有互补粘性末端的所选载体中来达成。

载体可被工程改造以编码提供对已并入载体的细胞的选择或鉴别的可选择标记物或报导蛋白。可选择标记或报导蛋白的表达允许鉴别和/或选择并入并表达载体上含有的其他编码区的宿主细胞。本领域中已知并使用的可选择标记物基因的实例包括：提供对氨苄青霉素(ampicillin)、链霉素(streptomycin)、庆大霉素(gentamycin)、卡那霉素(kanamycin)、潮霉素(hygromycin)、新霉素(neomycin)、嘌呤霉素(puromycin)、双丙氨膦(bialaphos)除草剂、磺酰胺及其类似物的抗性的基因；以及用作表型标记物的基因，即，花青素(anthocyanin)调控基因、异戊基转移酶基因及其类似物。本领域中已知并使用的报导蛋白的实例包括：荧光素酶(luciferase，Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、-半乳糖苷酶(galactosidase，LacZ)、-葡糖醛酸酶(glucuronidase，Gus)及其类似物。可选择标记物也可视为报导蛋白。

术语“质粒”是指染色体外元件，其常携带并非细胞的重要代谢部分的基因，并且通常呈环状双链DNA分子形式。此类元件可为源于任何来源的具有单链或双链DNA或RNA的线性、环状或超螺旋自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已连接或重组成能够将启动子片段和所选基因产物的DNA序列连同适当3'非翻译序列一起引入细胞中的独特构造。

可使用的真核病毒载体包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体和痘病毒(例如牛痘病毒)载体、杆状病毒载体或疱疹病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电荷脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白质复合物和生物聚合物。

“克隆载体”是指一种“复制子”，其为依次复制并包含复制起点的单位长度的核酸(诸如质粒、噬菌体或粘粒)，另一核酸区段可与其连接以达成所连接区段的复制。某些克隆载体能够在一种细胞类型(例如细菌)中复制并且在另一种细胞类型(例如真核细胞)中表达。克隆载体通常包含一种或多种可用于选择包含载体的细胞的序列和/或一个或多个用于插入感兴趣核酸序列的多克隆位点。

术语“表达载体”是指设计成使插入的核酸序列能够在插入到宿主细胞中之后表达的媒介物。插入的核酸序列以与如上所述的调控区可操作缔合的方式置放。

通过本领域中熟知的方法将载体引入宿主细胞中，所述方法例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体转染(溶酶体融合)、使用基因枪或DNA载体转运蛋白。

如本文所用的“培养(Culture/to culture/culturing)”意指在允许细胞生长或分裂的体外条件下孵育细胞或意指使细胞维持存活状态。如本文所用的“培养的细胞”意指在体外繁殖的细胞。

如本文所用，术语“多肽”意图涵盖单数个“多肽”以及复数个“多肽”，并且是指由酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)所组成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不指代特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于表示具有两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其他术语均包括在“多肽”的定义内并且术语“多肽”可替代任何这些术语使用或可与任何这些术语互换使用。术语“多肽”也意图是指具有多肽的表达后修饰的产物，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/封闭基团达成的衍生化、蛋白水解裂解或由非天然存在的氨基酸达成的修饰。多肽可源于天然生物来源或通过重组技术产生，但未必自指定核酸序列翻译。其可以任何方式产生，包括通过化学合成产生。

“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指不在天然环境中的多肽。不要求特定纯化水平。举例而言，分离的多肽可仅从其原生或天然环境移除。出于本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被视为分离的，已通过任何适合技术分离、分馏或部分地或基本上纯化的天然或重组多肽也视为分离的。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指带有或能够带有重组核酸的细胞或细胞群体。宿主细胞可为原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli))，或者宿主细胞可为真核细胞，例如真菌细胞(例如酵母细胞，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))，以及各种动物细胞，诸如昆虫细胞(例如Sf-9)或哺乳动物细胞(例如HEK293F、CHO、COS-7、NIH-3T3)。

本发明中还包括多肽的片段或变体及其任何组合。术语“片段”或“变体”在提及本发明的多肽结合结构域或结合分子时包括保留参照多肽的至少一些特性(例如对FcRn结合结构域或Fc变体的FcRn结合亲和力或FIX变体的凝血活性)的任何多肽。除在本文中其他位置讨论的特定抗体片段之外，多肽的片段还包括蛋白水解片段以及缺失片段，但不包括天然存在的全长多肽(或成熟多肽)。本发明的多肽结合结构域或结合分子的变体包括如上所述的片段以及氨基酸序列归因于氨基酸取代、缺失或插入而改变的多肽。变体可为天然存在的或非天然存在的。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可包含保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。本文所公开的一个特定FIX变体为R338L FIX(Padua)变体(SEQ ID NO:2)。参见例如，Simioni,P.等人,“X-LinkedThrombophilia with a Mutant Factor IX(Factor IX Padua),”NEJM 361:1671-75(2009年10月)，其以引用的方式整体并入本文中。

“保守性氨基酸取代”为用具有相似侧链的氨基酸残基置换氨基酸残基的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中加以定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸用来自同一侧链家族的另一种氨基酸置换，则取代视为保守的。在另一个实施方案中，一连串氨基酸可用侧链家族成员的顺序和/或组成不同的结构上相似的氨基酸串保守地置换。

两个多核苷酸或多肽序列之间的术语“序列同一性百分比”是指在比较窗口上由所述序列共用的相同匹配位置数，其考虑到为进行两个序列的最佳比对而必须引入的添加或缺失(即间隙)。匹配位置为靶序列和参考序列二者中存在相同核苷酸或氨基酸的任何位置。靶序列中存在的间隙不做计数，因为间隙不为核苷酸或氨基酸。同样，参考序列中存在的间隙不做计数，因为对靶序列核苷酸或氨基酸计数，而不对来自参考序列的核苷酸或氨基酸计数。

通过以下方式来计算序列同一性百分比：测定两个序列中存在相同氨基酸残基或核酸碱基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。两个序列之间的序列比较和序列同一性百分比测定可使用供在线上使用和下载两者的可易于得到的软件来完成。适合的软件程序可从各种来源获得，并且可用于比对蛋白质和核苷酸序列。一种适于测定序列同一性百分比的程序为bl2seq，其为可从美国政府的国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他适合程序为例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其为生物信息程序的EMBOSS套件的一部分，并且也可获自欧洲生物信息研究所(EBI)的www.ebi.ac.uk/Tools/psa。

与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区可各自具有其自身的序列同一性百分比。应注意，将序列同一性百分比值舍入至最接近的十分位。举例而言，将80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入至80.1，而将80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入至80.2。还注意，长度值将始终为整数。

本领域技术人员将理解，用于计算序列同一性百分比的序列比对的产生不限于唯一地由原始序列数据驱动的二进制序列-序列比较。序列比对可来源于多重序列比对。一种产生多序列比对的适合程序为ClustalW2，其可获自www.clustal.org。另一种适合程序为MUSCLE，其可获自www.drive5.com/muscle/。ClustalW2和MUSCLE可替代地获自例如EBI。

还应了解，序列比对可通过将序列数据与异质来源的数据整合来产生，所述异质来源的数据诸如结构数据(例如结晶蛋白结构)、功能数据(例如突变位置)或谱系学数据。整合异质数据以产生多重序列比对的适合程序为T-Coffee，其获自www.tcoffee.org并且可替代地获自例如EBI。还应了解用于计算序列同一性百分比的最终比对可自动或手动验证。

如本文所用，在因子IX蛋白质序列中“对应于……的氨基酸”、“对应于……的位点”或“等效氨基酸”通过对准以使第一FIX序列与第二FIX序列之间的同一性或相似性最大来鉴别。用于鉴别第二FIX序列中的等效氨基酸的编号为基于用于鉴别第一FIX序列中的相应氨基酸的编号。

如本文所用，术语“插入位点”是指aFIX多肽(通常为成熟FIX多肽)或其片段、变体或衍生物中紧靠可插入异源部分的位置上游的氨基酸残基编号。以编号指定“插入位点”，所述编号为R388L FIX(Padua)变体(SEQ ID NO:2)中由插入位点所对应的氨基酸的编号，所述氨基酸紧靠插入位置的N末端。举例而言，短语“EGF2结构域在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸105的插入位点处包含XTEN”指示异源部分位于对应于SEQ ID NO:2的氨基酸105和氨基酸106的两个氨基酸之间。然而，本领域技术人员将能够容易地鉴别任何FIX变体中的相应位置，并且本发明不局限于仅在R338L FIX(Padua)变体中进行的插入。相反，本文所公开的插入可在任何FIX变体或其具有促凝血活性的片段中对应于R338L FIX变体的位置处进行。

如本文所用，短语“紧靠氨基酸的下游”是指紧接于氨基酸的末端羧基的位置。类似地，短语“紧靠氨基酸的上游”是指紧接于氨基酸的末端胺基的位置。因此，如本文所用，短语“在插入位点的两个氨基酸之间”是指XTEN或任何其他多肽插入在两个相邻氨基酸之间所处的位置。

如本文所用，术语“插入”、“被插入”、“插入到…中”或语法相关术语是指相对于R338L FIX(Padua)变体(SEQ ID NO:2)中的类似位置的XTEN在融合多肽中的位置。本领域技术人员应理解如何鉴别相对于其他FIX多肽序列(诸如SEQ ID NO:1所示的序列)的相应插入位置。如本文所用，所述术语是指重组FIX多肽相对于R338L FIX(Padua)变体的特征，并且不指示、暗示或意指制备融合多肽的任何方法或过程。举例而言，对于本文提供的融合多肽，短语“将XTEN插入到紧邻FIX多肽的残基105下游的EGF2结构域中”意指所述融合多肽紧邻对应于R338L FIX变体(SEQ ID NO:2)中的氨基酸105的氨基酸的下游包含XTEN，其例如由对应于R338L FIX变体的氨基酸105和106的氨基酸所界定。

“融合”或“嵌合”蛋白包含第一氨基酸序列连接至在自然界中未天然连接的第二氨基酸序列。通常存在于单独蛋白质中的氨基酸序列可集合在一起形成融合多肽，或通常存在于同一蛋白质中的氨基酸序列可以新排列安置在融合多肽中，所述融合多肽例如为本发明的FIX结构域与Ig Fc结构域的融合物。融合蛋白例如通过化学合成或通过产生并翻译以所需关系编码肽区域的多核苷酸来产生。融合蛋白还可包含通过共价非肽键或非共价键与第一氨基酸序列缔合的第二氨基酸序列。

术语“异源”和“异源部分”意指多核苷酸、多肽或其他部分来源于与其所比较的实体不同的实体。举例而言，异源多肽可为合成多肽，或来源于不同物种、个体的不同细胞类型或不同个体的相同或不同类型的细胞。在一方面，异源部分为与另一种多肽融合以产生融合多肽或蛋白质的多肽。在另一方面，异源部分为与多肽或蛋白质缀合的非多肽部分，诸如PEG。

如本文所用，术语“半衰期”是指特定多肽在体内的生物半衰期。半衰期可由向个体施用的一半数量从动物中的循环和/或其他组织清除所需的时间表示。当构建给定多肽随时间而变的清除曲线时，曲线通常为双相的，即快速α相和较长β相。α相通常表示施用的多肽在血管内空间与血管外空间之间达到平衡并且部分地由多肽的尺寸决定。β-相通常表示多肽于血管内空间中的分解代谢。在一些实施方案中，FIX和包含FIX的融合蛋白为单相的，并且因此不具有α相，而仅具有单一β相。因此，在某些实施方案中，如本文所用，术语半衰期是指多肽在β相中的半衰期。人体中人类抗体的典型β相半衰期为21日。

如本文所用，术语“连接”和“融合”是指第一氨基酸序列或核苷酸序列分别共价或非共价连接至第二氨基酸序列或核苷酸序列。第一氨基酸或核苷酸序列可直接连接或相邻于第二氨基酸或核苷酸序列，或者可替代地介入序列可将第一序列共价连接至第二序列。术语“连接”不仅意指第一氨基酸序列在C末端或N末端融合于第二氨基酸序列，而且包括将整个第一氨基酸序列(或第二氨基酸序列)插入到第二氨基酸序列(或相应地第一氨基酸序列)中的任何两个氨基酸中。在一个实施方案中，第一氨基酸序列通过肽键或接头连接至第二氨基酸序列。第一核苷酸序列可通过磷酸二酯键或接头连接至第二核苷酸序列。接头可为肽或多肽(用于多肽链)或者核苷酸或核苷酸链(用于核苷酸链)或任何化学部分(用于多肽和多核苷酸链两者)。术语“连接”也通过连字符(-)加以指示。

如本文所用，术语“与…缔合”是指第一条氨基酸链与第二条氨基酸链之间形成的共价键或非共价键。在一个实施方案中，术语“与…缔合”意指共价非肽键或非共价键。此缔合可由冒号，即(:)指示。在另一个实施方案中，其意指除肽键之外的共价键。举例而言，氨基酸半胱氨酸包含可与第二半胱氨酸残基上的硫醇基形成二硫键或二硫桥的硫醇基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1区和CL区通过二硫键缔合并且两个重链通过两个二硫键在对应于239和242的位置处缔合，所述位置使用Kabat编号系统(位置226或229，EU编号系统)。共价键的实例包括但不限于肽键、金属键、氢键、二硫键、ζ键、π键、δ键、糖苷键、抓氢键(agnostic bond)、弯曲键、偶极键、π反向键、双键、三键、四键、五键、六键、共轭、超共轭、芳香性、哈普托数(hapticity)或反键结。非共价键的非限制性实例包括离子键(例如阳离子π键或盐键)、金属键、氢键(例如二氢键、二氢复合物、低障壁氢键或对称氢键)、范德华力(van der Walls force)、伦敦分散力(London dispersion force)、机械键、卤素键、亲金作用、嵌入、堆积作用、熵力或化学极性。

如本文所用，术语“裂解位点”或“酶促裂解位点”是指由酶识别的位点。某些酶促裂解位点包括细胞内加工位点。在一个实施方案中，多肽具有由在凝结级联期间活化的酶裂解的酶促裂解位点，以使得此类位点的裂解发生在凝块形成的部位处。示例性此类位点包括例如由凝血酶、因子XIa或因子Xa识别的那些位点。示例性FXIa裂解位点包括例如TQSFNDFTR(SEQ ID NO:166)和SVSQTSKLTR(SEQ ID NO:167)。示例性凝血酶裂解位点包括例如DFLAEGGGVR(SEQ ID NO:168)、TTKIKPR(SEQ ID NO:169)、LVPRG(SEQ ID NO:170)和ALRPR(SEQ ID NO:171)。其他酶促裂解位点在本领域中为已知的。

如本文所用，术语“加工位点”或“细胞内加工位点”是指多肽中的一种类型的酶促裂解位点，其为在所述多肽翻译之后起作用的酶的靶标。在一个实施方案中，这些酶在从高尔基体腔转运至高尔基体外侧区室期间起作用。细胞内加工酶在蛋白质从细胞分泌之前裂解多肽。这些加工位点的实例包括例如由内肽酶的PACE/弗林蛋白酶(其中PACE为成对碱性氨基酸裂解酶(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)的首字母缩写词)家族所靶向的那些位点。这些酶定位于高尔基体膜并且在序列基序Arg-[任何残基]-(Lys或Arg)-Arg的羧基端侧上裂解蛋白质。如本文所用，“弗林蛋白酶”酶家族包括例如PCSK1(也称为PC1/Pc3)、PCSK2(也称为PC2)、PCSK3(也称为弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4(也称为PC4)、PCSK5(也称为PC5或PC6)、PCSK6(也称为PACE4)、或PCSK7(也称为PC7/LPC、PC8或SPC7)。其他加工位点为本领域中已知的。本文中提及的术语“可加工接头”意指包含细胞内加工位点的接头。

在包含超过一个加工或裂解位点的构建体中，应理解这些位点可以是相同或不同的。

如本文所用，“可加工接头”是指包含至少一个在本文其他位置描述的细胞内加工位点的接头。

如本文所用，“基线”为在施用剂量之前受试者中的最低测量血浆FIX水平。FIX血浆水平可在给药之前的两个时间点测量：在筛选访问时和即将给药之前。或者，(a)治疗前FIX活性<1％、不具有可检测FIX抗原并且具有无意义基因型的受试者的基线可定义为0％，(b)治疗前FIX活性<1％并且具有可检测FIX抗原的受试者的基线可设置为0.5％，(c)治疗前FIX活性在1-2％之间的受试者的基线为Cmin(在整个PK研究期间的最低活性)，并且(d)治疗前FIX活性≥2％的受试者的基线可设置为2％。

如本文所用的“受试者”意指人类。如本文所用的受试者包括以下个体：已知发生过至少一次不受控制的出血事件；已诊断有与不受控制的出血事件相关的疾病或病症，例如出血疾病或病症，例如B型血友病；易患不受控制的出血事件，例如血友病；或其任何组合。受试者也可包括在某一活动例如手术、运动活动或任何剧烈活动之前处于一种或多种不可控制出血事件的危险中的个体。受试者的基线FIX活性可小于1％、小于0.5％、小于2％、小于2.5％、小于3％或小于4％。受试者还包括儿童。儿童受试者的年龄为出生至20岁、优选为出生至18岁、出生至16岁、出生至15岁、出生至12岁、出生至11岁、出生至6岁、出生至5岁、出生至2岁以及2至11岁。

如本文所用的治疗(Treat/treatment/treating)是指例如减轻疾病或病状的严重性；降低疾病病程的持续时间；改善与疾病或病状相关的一种或多种症状；向患有疾病或病状的个体提供有益效应，未必治愈所述疾病或病状；或防治与疾病或病状相关的一种或多种症状。在一个实施方案中，术语“治疗(treating/treatment)”意指通过施用本发明的融合蛋白来使受试者的FIX谷水平维持在至少约1IU/dL、2IU/dL、3IU/dL、4IU/dL、5IU/dL、6IU/dL、7IU/dL、8IU/dL、9IU/dL、10IU/dL、11IU/dL、12IU/dL、13IU/dL、14IU/dL、15IU/dL、16IU/dL、17IU/dL、18IU/dL、19IU/dL或20IU/dL。在另一个实施方案中，治疗(treating/treatment)意指将FIX谷水平维持在以下之间：约1与约20IU/dL、约2与约20IU/dL、约3与约20IU/dL、约4与约20IU/dL、约5与约20IU/dL、约6与约20IU/dL、约7与约20IU/dL、约8与约20IU/dL、约9与约20IU/dL或约10与约20IU/dL。治疗(treatment/treating)疾病或病状也可包括将受试者体内的FIX活性维持在相当于非血友病受试者体内FIX活性的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％下。治疗所需的最小谷水平可通过一种或多种已知方法加以测量并且可针对每个人加以调整(增加或减少)。

如本文所用的止血障碍意指特征在于由于形成纤维蛋白凝块的能力受损或不能形成纤维蛋白凝块而有自发出血或由创伤引起出血的倾向的基因遗传性或获得性病状。这些病症的实例包括血友病。三种主要形式为A型血友病(因子VIII缺乏)、B型血友病(因子IX缺乏或“克雷司马斯病(Christmas disease)”)和C型血友病(因子XI缺乏，轻度出血倾向)。其他止血障碍包括例如血管性血友病(Von Willebrand disease)；因子XI缺乏症(PTA缺乏症)；因子XII缺乏症；纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII缺乏症或结构异常；伯纳德-苏里尔综合症(Bernard-Soulier syndrome)，其为一种GPIb缺陷症或缺乏症。VWF的受体GPIb可为有缺陷的并且导致缺乏初级凝块形成(初级止血)和流血倾向增加、以及格兰茨曼(Glanzman)和内格利(Naegeli)血小板无力症(thrombasthenia)(格兰茨曼血小板无力症)。在肝衰竭(急性和慢性形式)中，由肝产生的凝血因子存在不足；这可增加流血风险。

如本文所用，术语“急性流血”是指无论潜伏原因如何的流血事件。举例而言，受试者可患有创伤、尿毒症、遗传性出血病症(例如因子VII缺乏症)、血小板病症或由于产生针对凝血因子的抗体而产生的抗性。

II.FIX融合蛋白

本发明涉及一种包含FIX多肽和至少一个异源部分的FIX融合蛋白，所述至少一个异源部分插入在所述FIX多肽内、与所述FIX多肽的C末端融合或两者。在插入异源部分或与异源部分融合之后，FIX融合蛋白可保持一种或多种FIX活性。在一个实施方案中，FIX活性为促凝血活性。术语“促凝血活性”意指本发明的FIX蛋白替代原生FIX参与血液中的凝血级联的能力。举例而言，本发明的重组FIX蛋白当可以在因子VIII(FVIII)存在下将因子X(FX)转化成活化因子X(FXa)时具有促凝血活性，如例如在发色测定中所测试。在另一个实施方案中，FIX活性为产生因子X活化酶(tenase)复合体的能力。在其他实施方案中，FIX活性为产生凝血酶(或凝块)的能力。

本发明的重组FIX蛋白无需展现原生成熟人类FIX的100％促凝血活性。实际上，在某些方面中，插入到本发明的FIX多肽中的异源部分可显著增加蛋白质的半衰期或稳定性，以使得较低活性为完全可接受的。因此，在某些方面中，本发明的FIX融合蛋白具有原生FIX的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％促凝血活性。然而，在本发明的一些实施方案中，对于含有FIX Padua R338L高活性变体的蛋白质，本发明的重组FIX蛋白可具有超过100％的原生FIX活性，例如所述活性的至少约105％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％或更大。

促凝血活性可通过任何适合的体外或体内测定加以测量。FIX的活性可在凝血级联的下游通过监测凝块产生(凝血分析)或在上游通过直接测量FX在通过FVIII-FIX复合物活化之后的酶活性(发色测定)来加以测量(参见例如Barrowcliffe等人,Semin.Thromb.Haemost.28:247-56(2002)；Lee等人,Thromb.Haemost.82:1644-47(1999)；Lippi等人,Clin.Chem.Lab.Med.45:2-12(2007)；Matsumoto等人,J.Thromb.Haemost.4:377-84(2006))。因此，促凝血活性可使用发色底物测定、凝血测定(例如单级或两级凝血测定)或两者加以测量。发色测定机制是基于凝血级联的原理，其中活化的FIX在FVIII、磷脂和钙离子存在下将FX转化成FX_a。通过使针对FX_a具有特异性的对硝基苯胺(pNA)底物水解来评估FX_a活性。在405nM下测量的对硝基苯胺的初始释放速率与FX_a活性成正比并且因此与样品中的FIX活性成正比。发色测定由国际血栓和止血学会(ISTH)的科学和标准化委员会(SSC)的因子VIII和因子IX小组委员会所推荐。

适用于测定促凝血活性的其他适合测定包括例如Scheiflinger和Dockal的美国申请公布号2010/0022445中所公开的那些，所述申请公布以引用的方式整体并入本文中。

在某些方面中，将本发明的重组FIX蛋白的促凝血活性与原生成熟FIX相比较，在某些方面中，将其与国际标准相比较。

所述至少一个异源部分(如以下更详细地描述)可包含任何异源部分，或可为能使FIX蛋白具有改善的特性的部分。举例而言，在一方面，适用于本发明的异源部分可为能够延长FIX蛋白的半衰期的部分或能够改善FIX蛋白的稳定性的部分。本发明的FIX融合蛋白可具有插入在FIX多肽中或与FIX多肽融合的超过一个异源部分。在一个实施方案中，所述超过一个异源部分为相同的。在另一个实施方案中，所述超过一个异源部分为不同的。在其他实施方案中，所述异源部分选自由以下组成的组：XTEN、白蛋白、白蛋白结合肽、白蛋白小结合分子、Fc结构域、FcRn结合配偶体、PAS、CTP、PEG、HES、PSA或其任何组合。

在一些实施方案中，将至少一个异源部分插入在FIX多肽的一个结构域内，而非多个结构域之间。FIX多肽包含多个结构域，例如，γ-羧基谷氨酸(GLA)结构域、类表皮生长因子1(EGF1)结构域、类表皮生长因子2(EGF2)结构域、活化肽(AP)结构域、在EGF2结构域与AP结构域之间的接头以及催化结构域(例如，丝氨酸蛋白酶结构域)。FIX酶原包含461个氨基酸：氨基酸1-28(对应于SEQ ID NO:3)为信号肽；氨基酸29-46(对应于SEQ ID NO:3)为前肽；随后为415个氨基酸的FIX蛋白质序列。此415个氨基酸的加工的FIX包含氨基酸1-145(对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)为FIX轻链；氨基酸146-180为活化肽；并且氨基酸181至415(对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)为催化性FIX重链。在轻链和重链内，GLA结构域对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸1至46；EGF1结构域对应于SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的氨基酸47至84；EGF2结构域对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸85至127；在EGF2结构域与AP结构域之间的接头对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸128至145；AP结构域对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸146至180；并且催化结构域对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸181至415。

在某些实施方案中，将至少一个异源部分插入在FIX多肽的一个或多个结构域内。举例而言，至少一个异源部分(例如XTEN)可插入在选自由以下组成的组的结构域内：GLA结构域、EGF1结构域、EGF2结构域、AP结构域、在EGF2结构域与AP结构域之间的接头、催化结构域及其任何组合。在一个特定实施方案中，将所述至少一个异源部分(例如XTEN)插入在GLA结构域内，例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸1至46内。在一个特定实施方案中，将所述至少一个异源部分(例如XTEN)插入在EGF1结构域内，例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸47至83内。在一个特定实施方案中，将所述至少一个异源部分(例如XTEN)插入在EGF2结构域内，例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸84至125内。在一些实施方案中，将所述至少一个异源部分(例如XTEN)插入在EGF2结构域与AP结构域之间的接头内，例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸132至145内。在一个特定实施方案中，将所述至少一个异源部分(例如XTEN)插入在AP结构域内，例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸146至180内。在一些实施方案中，将所述至少一个异源部分(例如XTEN)插入在催化结构域内，例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸181至415内。

在一些实施方案中，可将一个或多个异源部分插入在各种插入位点内。在某些实施方案中，在这些位点中的一个或多个处插入至少一个异源部分(例如XTEN)不会引起FIX活性的损失和/或诱导FIX蛋白质特性的改善。举例而言，可将至少一个异源部分插入在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点处：SEQ ID NO:2的氨基酸103(即，紧靠对应于SEQ ID NO:2的氨基酸103的氨基酸的下游)、SEQ ID NO:2的氨基酸105(即，紧靠对应于SEQ ID NO:2的氨基酸105的氨基酸的下游)、SEQ ID NO:2的氨基酸142(即，紧靠对应于SEQ ID NO:2的氨基酸142的氨基酸的下游)、SEQ ID NO:2的氨基酸149(即，紧靠对应于SEQ ID NO:2的氨基酸149的氨基酸的下游)、SEQ ID NO:2的氨基酸162(即，紧靠对应于SEQ ID NO:2的氨基酸162的氨基酸的下游)、SEQ ID NO:2的氨基酸166(即，紧靠对应于SEQ ID NO:2的氨基酸166的氨基酸的下游)、SEQ ID NO:2的氨基酸174(即，紧靠对应于SEQID NO:2的氨基酸174的氨基酸的下游)、SEQ ID NO:2的氨基酸224(即，紧靠对应于SEQ IDNO:2的氨基酸224的氨基酸的下游)、SEQ ID NO:2的氨基酸226(即，紧靠对应于SEQ ID NO:2的氨基酸226的氨基酸的下游)、SEQ ID NO:2的氨基酸228(即，紧靠对应于SEQ ID NO:2的氨基酸228的氨基酸的下游)、SEQ ID NO:2的氨基酸413(即，紧靠对应于SEQ ID NO:2的氨基酸413的氨基酸的下游)及其任何组合，其中FIX融合蛋白展现促凝血活性。

在一个实施方案中，将异源部分(例如XTEN)插入在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸149、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸162、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸166、SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的氨基酸174及其任何组合。在另一个实施方案中，将异源部分(例如XTEN)插入在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸224、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸226、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸228、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸413及其任何组合。在其他实施方案中，将异源部分(例如XTEN)插入在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸103、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸105和二者。在另一个实施方案中，将异源部分(例如XTEN)插入在FIX多肽内对应于SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的氨基酸142的插入位点。

如以下更详细地讨论，异源部分可为可具有不同长度的XTEN。举例而言，XTEN可包含至少约42个氨基酸、至少约72个氨基酸、至少约144个氨基酸、至少约288个氨基酸或至少约864个氨基酸。在一些实施方案中，XTEN选自由以下组成的组：AE42、AG42、AE72、AG72、AE144、AG144、AE288、AG288、AE864以及AG864。可插入在FIX多肽中或与FIX多肽融合的XTEN的非限制性实例包括在本文其他位置处。

在一些实施方案中，将包含42个氨基酸(例如AE42或AG42)的XTEN插入在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:1或2的氨基酸103、SEQ IDNO:1或2的氨基酸105、SEQ ID NO:1或2的氨基酸142、SEQ ID NO:1或2的氨基酸149、SEQ IDNO:1或2的氨基酸162、SEQ ID NO:1或2的氨基酸166、SEQ ID NO:1或2的氨基酸174、SEQ IDNO:1或2的氨基酸224、SEQ ID NO:1或2的氨基酸226、SEQ ID NO:1或2的氨基酸228、SEQ IDNO:1或2的氨基酸413及其任何组合，其中FIX融合蛋白展现促凝血活性。

在一些实施方案中，将包含72个氨基酸(例如AE72或AG72)的XTEN插入FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:1或2的氨基酸149、SEQ IDNO:1或2的氨基酸162、SEQ ID NO:1或2的氨基酸166、SEQ ID NO:1或2的氨基酸174、SEQ IDNO:1或2的氨基酸224、SEQ ID NO:1或2的氨基酸226、SEQ ID NO:1或2的氨基酸228、SEQ IDNO:1或2的氨基酸413及其任何组合，或者XTEN与C末端融合，其中FIX融合蛋白展现促凝血活性。

在一些实施方案中，将包含144个氨基酸(例如AE144或AG144)的XTEN插入在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:1或2的氨基酸149、SEQID NO:1或2的氨基酸162、SEQ ID NO:1或2的氨基酸166、SEQ ID NO:1或2的氨基酸174、SEQID NO:1或2的氨基酸224、SEQ ID NO:1或2的氨基酸226、SEQ ID NO:1或2的氨基酸228、SEQID NO:1或2的氨基酸413及其任何组合，其中FIX融合蛋白展现促凝血活性。

在一些实施方案中，将包含288个氨基酸(例如AE288或AG288)的XTEN插入在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:1或2的氨基酸149、SEQID NO:1或2的氨基酸162、SEQ ID NO:1或2的氨基酸166、SEQ ID NO:1或2的氨基酸174、SEQID NO:1或2的氨基酸224、SEQ ID NO:1或2的氨基酸226、SEQ ID NO:1或2的氨基酸228、SEQID NO:1或2的氨基酸413及其任何组合，其中FIX融合蛋白展现促凝血活性。

又在其他实施方案中，将包含864个氨基酸(例如AE864或AG8648)的XTEN插入在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:1或2的氨基酸149、SEQ ID NO:1或2的氨基酸162、SEQ ID NO:1或2的氨基酸166、SEQ ID NO:1或2的氨基酸174、SEQ ID NO:1或2的氨基酸224、SEQ ID NO:1或2的氨基酸224、SEQ ID NO:1或2的氨基酸226、SEQ ID NO:1或2的氨基酸228、SEQ ID NO:1或2的氨基酸413及其任何组合，其中FIX融合蛋白展现促凝血活性。

本发明的FIX融合蛋白可还包含插入在FIX内、与FIX的C末端融合或两者的第二异源部分，例如第二XTEN。所述第二异源部分可插入在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:1或2的氨基酸103、SEQ ID NO:1或2的氨基酸105、SEQ IDNO:1或2的氨基酸142、SEQ ID NO:1或2的氨基酸149、SEQ ID NO:1或2的氨基酸162、SEQ IDNO:1或2的氨基酸166、SEQ ID NO:1或2的氨基酸174、SEQ ID NO:1或2的氨基酸224、SEQ IDNO:1或2的氨基酸226、SEQ ID NO:1或2的氨基酸228、SEQ ID NO:1或2的氨基酸413及其任何组合，或者其中所述第二XTEN与FIX多肽的C末端融合。在一些实施方案中，将第一XTEN和第二XTEN分别插入在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的SEQ ID NO:1或2的氨基酸的插入位点和/或与FIX多肽的C末端融合：SEQ ID NO:1或2的氨基酸105和SEQ ID NO:1或2的氨基酸166；SEQ ID NO:1或2的氨基酸105和SEQ ID NO:1或2的氨基酸224；SEQ ID NO:1或2的氨基酸105和与C末端融合；SEQ ID NO:1或2的氨基酸166和SEQ ID NO:1或2的氨基酸224；SEQ ID NO:1或2的氨基酸166和与C末端融合；以及SEQ ID NO:1或2的氨基酸224和与C末端融合。在一个实施方案中，将第一XTEN插入在FIX多肽内对应于SEQ ID NO:1或2的氨基酸166的插入位点，并且第二XTEN与FIX多肽的C末端融合。

所述第二XTEN可包含至少约6个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约36个氨基酸、至少约42个氨基酸、至少约72个氨基酸、至少约144个氨基酸或至少约288个氨基酸。在一些实施方案中，所述第二XTEN包含6个氨基酸、12个氨基酸、36个氨基酸、42个氨基酸、72个氨基酸、144个氨基酸或288个氨基酸。所述第二XTEN可选自由以下组成的组：AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144及其任何组合。在一特定实施方案中，所述第二XTEN为AE72或AE144。

在一个特定实施方案中，所述第二XTEN包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53及其任何组合。

在一些实施方案中，FIX融合蛋白还包含第三、第四、第五和/或第六XTEN。

在一些实施方案中，FIX融合蛋白包含与选自由不含信号肽和前肽序列的SEQ IDNO:54至SEQ ID NO:153组成的组的序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，FIX融合蛋白包含选自由不含信号肽和前肽序列的SEQ ID NO:54至SEQID NO:153组成的组的氨基酸序列。在一个实施方案中，FIX融合蛋白包含与选自由不含信号肽和前肽序列的SEQ ID NO:119、120、121和123组成的组的序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在另一个实施方案中，FIX融合蛋白包含选自由不含信号肽和前肽序列的SEQ ID NO:119、120、123、121和226或122组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，FIX融合蛋白选自由以下组成的组：不含信号肽和前肽序列的FIX-AP.72、FIX-AP.144、FIX-CT.72、FIX-CT.144、FIX-AP.288以及FIX-CT.288。

在一些实施方案中，FIX融合蛋白包含两种不同类型的异源部分。在一些实施方案中，FIX融合蛋白包含FIX多肽、XTEN和Fc结构域(或FcRn结合配偶体)或其片段。在一些实施方案中，XTEN插入在FIX内，并且Fc结构域(或FcRn结合配偶体)或其片段与FIX的C末端融合。在一些实施方案中，XTEN插入在FIX多肽内选自表3中所列插入位点的一个或多个插入位点处。在一个实施方案中，XTEN插入在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:1或2的氨基酸103、SEQ ID NO:1或2的氨基酸105、SEQ ID NO:1或2的氨基酸142、SEQ ID NO:1或2的氨基酸149、SEQ ID NO:1或2的氨基酸162、SEQ ID NO:1或2的氨基酸166、SEQ ID NO:1或2的氨基酸174、SEQ ID NO:1或2的氨基酸224、SEQ ID NO:1或2的氨基酸226、SEQ ID NO:1或2的氨基酸228、SEQ ID NO:1或2的氨基酸413及其任何组合；并且Fc结构域(或FcRn结合配偶体)或其片段与FIX的C末端融合。在某些实施方案中，XTEN插入在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点处：SEQ ID NO:1或2的氨基酸105、SEQ ID NO:1或2的氨基酸166和SEQ ID NO:1或2的氨基酸224；并且Fc结构域(或FcRn结合配偶体)或其片段与FIX的C末端融合。在一些实施方案中，XTEN选自AE42、AE72和AE144。

在本发明的某些方面中，FIX融合蛋白包含一条或两条多肽链。在一个实施方案中，FIX融合蛋白包含两条多肽链，其中第一多肽链包含与Fc结构域(或FcRn结合配偶体)融合的FIX多肽，并且第二多肽链包含第二Fc结构域，其中第一Fc结构域(或FcRn结合配偶体)与第二Fc结构域(或FcRn结合配偶体)通过共价键缔合。

在另一个实施方案中，FIX融合蛋白包含单一多肽链，所述多肽链包含FIX多肽和Fc结构域(或FcRn结合配偶体)。在一个特定实施方案中，FIX融合蛋白还包含接头，所述接头连接FIX多肽和Fc结构域(或FcRn结合配偶体)。在另一个实施方案中，FIX融合蛋白包含FIX多肽、Fc结构域和第二Fc结构域(或FcRn结合配偶体)。在一个特定实施方案中，FIX融合蛋白还包含接头，所述接头连接Fc结构域(或FcRn结合配偶体)与第二Fc结构域(或FcRn结合配偶体)。在另一个实施方案中，FIX融合蛋白包含FIX多肽、Fc结构域(或FcRn结合配偶体)和第二Fc结构域(或FcRn结合配偶体)，其中FIX多肽通过接头连接至Fc结构域(或FcRn结合配偶体)。在另一个实施方案中，FIX融合蛋白包含FIX多肽、Fc结构域(或FcRn结合配偶体)和第二Fc结构域(或FcRn结合配偶体)，其中FIX多肽通过第一接头连接至Fc结构域(或FcRn结合配偶体)，并且其中所述Fc结构域(或FcRn结合配偶体)通过接头连接至第二Fc结构域(或FcRn结合配偶体)。在某些实施方案中，FIX融合蛋白包含选自由以下组成的组的式：

(i)FIX(X)-F1；

(ii)FIX(X)-L1-F1；

(iii)FIX(X)-F1-F2；

(iv)FIX(X)-L1-F1-F2；

(v)FIX(X)-L1-F1-L2-F2；

(vi)FIX(X)-F1-L1-F2；

(vii)FIX(X)-F1:F2；

(viii)FIX(X)-L1-F1:F2；以及

(ix)其任何组合，

其中FIX(X)为具有插入一个或多个本文所描插入位点的XTEN的FIX多肽；L1和L2各自为接头；F1为Fc结构域或FcRn结合配偶体；F2为第二Fc结构域或第二FcRn结合配偶体；(-)为肽键或者一个或多个氨基酸；并且(:)为共价键，例如二硫键。

所述接头(L1和L2)可为相同或不同的。接头可为可裂解或不可裂解接头，并且接头可包含一个或多个细胞内加工位点。接头的非限制性实例在本文其他位置进行描述。可使用任何接头将FIX与异源部分(例如XTEN或Fc)组合或将第一异源部分(例如第一Fc)与第二异源部分(例如第二Fc)组合。

在某些实施方案中，接头包含凝血酶裂解位点。在一个特定实施方案中，凝血酶裂解位点包含XVPR，其中X为任何脂族氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)。在一个特定实施方案中，凝血酶裂解位点包含LVPR。在一些实施方案中，接头包含PAR1外结合位点相互作用基序，其包含SFLLRN(SEQ ID NO:190)。在一些实施方案中，PAR1外结合位点相互作用基序还包含选自以下的氨基酸序列：P、PN、PND、PNDK(SEQ ID NO:191)、PNDKY(SEQ ID NO:192)、PNDKYE(SEQ ID NO:193)、PNDKYEP(SEQ ID NO:194)、PNDKYEPF(SEQ ID NO:195)、PNDKYEPFW(SEQ ID NO:196)、PNDKYEPFWE(SEQ ID NO:197)、PNDKYEPFWED(SEQ ID NO:198)、PNDKYEPFWEDE(SEQ ID NO:199)、PNDKYEPFWEDEE(SEQ IDNO:200)、PNDKYEPFWEDEES(SEQ ID NO:201)或其任何组合。在其他实施方案中，接头包含FXIa裂解位点LDPR。

在一个特定实施方案中，FIX融合蛋白包含FIX多肽和异源部分，所述异源部分包含XTEN，其中XTEN在具有或不具有接头(所述接头可为可裂解或不可裂解的)的情况下与FIX多肽的C末端融合，并且包含长度长于42个氨基酸且短于864个氨基酸，优选长度短于144个氨基酸的氨基酸序列。XTEN包含的氨基酸序列可长于42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或71个氨基酸且短于140、139、138、137、136、135、134、133、132、131、130、129、128、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、114、113、112、111、110、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、76、75、74或73个氨基酸等，或其任何组合。在一些实施方案中，XTEN的长度为72个氨基酸。在一个特定实施方案中，XTEN为AE72。在另一个实施方案中，XTEN包含与SEQ ID NO:35至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，FIX融合蛋白包含含有至少一个插入的XTEN序列的FIX多肽和包含XTEN的异源部分，其中XTEN在具有或不具有接头(所述接头可为可裂解或不可裂解的)的情况下与FIX多肽的C末端融合。在一些实施方案中，XTEN的长度短于864个氨基酸，优选长度短于144个氨基酸。在其他实施方案中，XTEN包含长度短于244、140、130、120、110、100、90、80或75个氨基酸的氨基酸序列。

在其他实施方案中，FIX融合蛋白包含选自由以下组成的组的式：

(i)FIX-X

(ii)FIX-L1-X

(iii)FIX(X)-X

(iv)FIX(X)-L1-X

(v)FIX(X)-L1:X

(vi)其任何组合，

其中FIX为FIX多肽；FIX(X)为具有插入到一个或多个本文所述插入位点的至少一个XTEN的FIX多肽；(X)为长于42个氨基酸且短于144个氨基酸的XTEN；X为长于42个氨基酸且短于864个氨基酸，诸如288个氨基酸，优选短于144个氨基酸的XTEN(例如具有72个氨基酸的XTEN)；L1为接头；(-)为肽键或者一个或多个氨基酸；并且(:)为共价键，例如二硫键。

接头(L1)可为相同或不同的。必要时，接头可为可裂解或不可裂解接头，并且接头可包含一个或多个细胞内加工位点。接头的非限制性实例在本文其他位置描述。可使用任何接头将FIX与异源部分(例如XTEN或Fc)组合。以下为适用于许多发明实施方案的接头的非限制性实例：

a)GPEGPSKLTRAETGAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHHHH(SEQ ID NO:219，凝血酶)；

b)GAGSPGAETALVPRGAGSPGAETAG(SEQ ID NO:220，凝血酶-PAR1)；

c)GAGSPGAETALVPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEESGAGSPGAETA(SEQ ID NO:221)；

d)GPEGPSKLTRAETGAGSPGAETA(SEQ ID NO:222)

e)GGGGALRPRVVGGAGSPGAETA(SEQ ID NO:223)

f)GGGGTLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEKGGAGSPGAETA(SEQ ID NO:224)

g)GGAGSPGAETA(SEQ ID NO:225)

在某些实施方案中，接头包含凝血酶裂解位点。在一个特定实施方案中，凝血酶裂解位点包含XVPR，其中X为任何脂族氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)。在一个特定实施方案中，凝血酶裂解位点包含LVPR。在一些实施方案中，接头包含PAR1外结合位点相互作用基序，其包含SFLLRN(SEQ ID NO:190)。在一些实施方案中，PAR1外结合位点相互作用基序还包含选自以下的氨基酸序列：P、PN、PND、PNDK(SEQ ID NO:191)、PNDKY(SEQ ID NO:192)、PNDKYE(SEQ ID NO:193)、PNDKYEP(SEQ ID NO:194)、PNDKYEPF(SEQ ID NO:195)、PNDKYEPFW(SEQ ID NO:196)、PNDKYEPFWE(SEQ ID NO:197)、PNDKYEPFWED(SEQ ID NO:198)、PNDKYEPFWEDE(SEQ ID NO:199)、PNDKYEPFWEDEE(SEQ IDNO:200)、PNDKYEPFWEDEES(SEQ ID NO:201)或其任何组合。在某些其他实施方案中，接头包括含有LDPR的FXIa裂解位点，其可与PAR1外结合位点相互作用基序组合。

在某些实施方案中，在C末端与XTEN融合的FIX多肽可还包含第二XTEN。所述第二XTEN可融合至或插入在FIX融合蛋白的任何部分，包括但不限于本文所公开的插入位点。FIX融合蛋白可还包含第三XTEN、第四XTEN、第五XTEN或第六XTEN。

本发明的FIX融合蛋白保持与原生FIX相当的活性水平。在一些实施方案中，FIX融合蛋白具有原生FIX的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或100％的促凝血活性。促凝血活性可通过本领域中已知的任何方法测量，所述方法包括但不限于发色底物测定、一级凝结分析或两者。

II.A.因子IX

人因子IX(FIX)为一种丝氨酸蛋白酶，其为血液凝固级联的固有路径中的重要组分。如本文所用，“因子IX”或“FIX”是指凝血因子蛋白质及其种类和序列变体，并且包括但不限于人FIX前体多肽的461个氨基酸的单链序列(“前原”)、成熟人FIX的415个氨基酸的单链序列(SEQ ID NO:1)和R338L FIX(Padua)变体(SEQ ID NO:2)。FIX包括具有凝血FIX的典型特征的任何形式的FIX分子。如本文所用，“因子IX”和“FIX”意图涵盖包含结构域Gla(含有γ-羧基谷氨酸残基的区域)、EGF1和EGF2(含有与人表皮生长因子同源的序列的区域)、活化肽(“AP”，由成熟FIX的残基R136-R180形成)和C末端蛋白酶结构域(“Pro”)，或本领域中已知的那些结构域的同义词，或者可为保持原生蛋白质的至少一部分生物活性的截短片段或序列变体。FIX或序列变体已经克隆，如美国专利号4,770,999和7,700,734中所描述，并且编码人因子IX的cDNA已经分离、表征并被克隆至表达载体中(参见例如，Choo等人,Nature 299:178-180(1982)；Fair等人,Blood64:194-204(1984)；以及Kurachi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.79:6461-6464(1982))。一个特定FIX变体为由Simioni等人,2009表征的R338L FIX(Padua)变体(SEQ ID NO:2)，其包含功能获得突变，所述突变与Padua变体相对于原生FIX的近8倍活性增加相关(表1)。FIX变体也可包括具有一个或多个保守行氨基酸取代的任何FIX多肽，所述一个或多个取代不会影响FIX多肽的FIX活性。

表1：示例性FIX序列

FIX多肽为55kDa，以由以下三个区域构成的前体多肽原链(SEQ ID NO:1)形式合成：具有28个氨基酸的信号肽(SEQ ID NO:3的氨基酸1至28)、谷氨酸残基γ-羧基化所需的具有18个氨基酸的前肽(氨基酸29至46)和具有415个氨基酸的成熟因子IX(SEQ ID NO:1或2)。前肽为在γ-羧基谷氨酸结构域N末端的18个氨基酸残基的序列。前肽结合维生素K依赖性γ羧化酶，并且接着通过内源蛋白酶，最可能是PACE(成对碱性氨基酸裂解酶，又称为弗林蛋白酶或PCSK3)由FIX的前体多肽裂解。在不发生γ羧基化的情况下，Gla结构域无法结合钙以呈现将蛋白质锚定于带负电磷脂表面所需的正确构象，从而使因子IX没有功能。即使其被羧基化，Gla结构域也取决于前肽的裂解而获得适当功能，因为保留的前肽干扰Gla结构域与钙和磷脂最佳结合所需的构象变化。在人体中，所得成熟因子IX由肝细胞以无活性酶原形式分泌至血流中，所述酶原为含有按重量计约17％碳水化合物的具有415个氨基酸残基的单链蛋白质(Schmidt,A.E.等人(2003)Trends Cardiovasc Med,13:39)。

成熟FIX由若干结构域构成，所述结构域在N末端至C末端配置中为：GLA结构域、EGF1结构域、EGF2结构域、活化肽(AP)结构域和蛋白酶(催化)结构域。短接头将EGF2结构域与AP结构域相连接。FIX含有分别由R145-A146和R180-V181形成的两个活化肽。在活化后，单链FIX变为2条链的分子，其中所述两条链通过二硫键连接。凝血因子可通过置换其活化肽引起活化特异性改变来进行工程改造。在哺乳动物中，成熟FIX必须由活化因子XI活化以得到因子IXa。在FIX活化成FIXa之后，蛋白酶结构域提供FIX的催化活性。活化因子VIII(FVIIIa)为完整表达FIXa活性的特定辅因子。

在其他实施方案中，FIX多肽包含血浆源性因子IX的Thr148等位基因形式并且具有与内源因子IX类似的结构和功能特征。

已知许多功能性FIX变体。国际公布号WO 02/040544 A3在第4页第9-30行和第15页第6-31行公开了对肝素抑制作用展现增加的抗性的突变体。国际公布号WO 03/020764A2在表2和表3(第14-24页)中以及在第12页第1-27行公开了T细胞免疫原性降低的FIX突变体。国际公布号WO 2007/149406 A2在第4页第1行至第19页第11行公开了展现增加的蛋白质稳定性、增加的体内和体外半衰期以及增加的对蛋白酶的抗性的功能性突变体FIX分子。WO 2007/149406 A2也在第19页第12行至第20页第9行公开了嵌合和其他变体FIX分子。国际公布号WO 08/118507 A2在第5页第14行至第6页第5行公开了展现增加的凝血活性的FIX突变体。国际公布号WO 09/051717 A2号在第9页第11行至第20页第2行公开了具有使半衰期和/或回收率增加的增加数目的N-连接和/或O-连接糖基化位点的FIX突变体。国际公布号WO 09/137254 A2也在第2页第[006]段至第5页第[011]段和第16页第[044]段至第24页第[057]段公开了糖基化位点数增加的因子IX突变体。国际公布号WO 09/130198 A2在第4页第26行至第12页第6行公开了具有使半衰期增加的增加数目的糖基化位点的功能性突变体FIX分子。国际公布号WO 09/140015 A2在第11页第[0043]段至第13页第[0053]段公开了可用于聚合物(例如PEG)缀合的Cys残基数目增加的功能性FIX突变体。2011年7月11日提交并在2012年1月12日以WO 2012/006624公布的国际申请号PCT/US2011/043569中所述的FIX多肽也以引用的方式整体并入本文中。

此外，已在血友病受试者中鉴别出数百种FIX非功能性突变，其中许多公开于国际公布号WO 09/137254 A2第11-14页的表5中。这些非功能性突变不包括在本发明中，但提供有关哪些突变或多或少可能产生功能性FIX多肽的额外指导。

在一个实施方案中，FIX多肽(或融合多肽的因子IX部分)包含与SEQ ID NO:1或2中所陈述的序列(SEQ ID NO:1或2的氨基酸1至415)至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，或者具有前肽序列，或具有前肽和信号序列(全长FIX)。在另一各实施方案中，FIX包含与SEQ IDNO:2中所陈述的序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

因子IX凝血活性以国际单位(IU)表示。一个IU的FIX活性近似对应于一毫升正常人类血浆中FIX的量。若干测定可用于测量因子IX活性，包括一级凝结测定(部分活化促凝血酶原激酶时间；aPTT)、凝血酶产生时间(TGA)和旋转式血栓弹力分析仪本发明涵盖与FIX序列具有同源性的序列、天然序列片段(诸如来自人类、非人类灵长类动物、哺乳动物(包括家养动物))以及保持FIX的至少一部分生物活性或生物功能和/或适用于预防、治疗、介导或改善凝血因子相关疾病、缺乏症、病症或病状(例如与外伤、手术或凝血因子缺乏症相关的出血事件)的非天然序列变体。与人FIX同源的序列可通过标准同源性搜索技术(诸如NCBI BLAST)发现。

II.B.异源部分

本发明的FIX融合蛋白可包含插入到FIX多肽内的一个或多个位点、与C末端融合或两者的至少一个异源部分，其中FIX融合蛋白具有促凝血活性并且可在宿主细胞中在体内或体外表达。“异源部分”可包含异源多肽或非多肽部分或两者。在某些方面中，异源部分为XTEN。在一些方面中，本发明的FIX融合蛋白包含插入在FIX多肽内的一个或多个位点的至少一个XTEN。在其他方面中，FIX融合蛋白包含插入到FIX多肽内的一个或多个位点的至少一个异源部分，其中所述异源部分为半衰期延长部分(例如体内半衰期延长部分)。

据信FIX保留至少一些促凝血活性的插入位点的发现也将允许将具有与当融合至FIX蛋白时延长半衰期相关的非结构化或结构化特征的其他肽和多肽插入于那些位点中的一个或多个位点中。异源部分(例如半衰期延长部分)的非限制性实例包括白蛋白；白蛋白片段；免疫球蛋白的Fc片段；FcRn结合配偶体；人类绒毛膜促性腺素β亚基的C末端肽(CTP)；HAP序列；转铁蛋白(transferrin)；美国专利申请号20100292130的PAS多肽；聚甘氨酸接头；聚丝氨酸接头；具有6-40个选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的两种类型氨基酸的氨基酸并且具有小于50％至大于50％的不同程度的二级结构的肽和短多肽，将尤其适用于插入于所鉴别的FIX活性插入位点中。

在某些方面中，异源部分增加FIX融合蛋白的体内或体外半衰期。在其他方面中，异源部分有助于可视化或定位FIX融合蛋白。FIX融合蛋白的可视化和/或定位可在体内、体外、离体或以其组合方式进行。在其他方面中，异源部分增加FIX融合蛋白的稳定性。如本文所用，术语“稳定性”是指FIX融合蛋白响应于环境条件(例如温度升高或降低)而保持一种或多种物理特性的本领域公认的量度。在某些方面中，物理特性为维持FIX融合蛋白的共价结构(例如不存在蛋白水解裂解、不必要的氧化或脱酰胺)。在其他方面中，物理特性也可为呈适当折叠状态的FIX融合蛋白的存在(例如不存在可溶性或不溶性聚集物或沉淀物)。在一方面，通过测定FIX融合蛋白的生物物理特性，例如热稳定性、pH展开曲线、聚糖的稳定移除、溶解性、生物化学功能(例如结合至另一种蛋白质的能力)等和/或其组合来测量FIX融合蛋白的稳定性。在另一方面，生物化学功能通过相互作用的结合亲和力来说明。在一方面，蛋白质稳定性的量度为热稳定性，即，对热激发的抗性。稳定性可使用本领域中已知的方法测量，所述方法诸如HPLC(高效液相色谱)、SEC(尺寸排阻色谱)、DLS(动态光散射)等。测量热稳定性的方法包括但不限于差示扫描量热法(DSC)、差示扫描荧光测定法(DSF)、圆形二色性(CD)和热激发测定。

在一个特定方面中，插入在FIX融合蛋白中的一个或多个插入位点中的异源部分保留FIX融合蛋白的生物化学活性。在某些实施方案中，异源部分为XTEN。在一个实施方案中，生物化学活性为可通过发色测定测量的FIX活性。

在一些实施方案中，至少一个异源部分通过位于异源部分的N末端、C末端或N末端和C末端两者处的接头间接插入于插入位点中。在异源部分的N末端和C末端处的接头可以是相同或不同的。在一些实施方案中，多个接头可串联侧接异源部分的一个或两个末端。在一些实施方案中，接头为“Gly-Ser肽接头”。术语“Gly-Ser肽接头”是指包含甘氨酸和丝氨酸残基的肽。

示例性Gly/Ser肽接头包括但不限于氨基酸序列(Gly₄Ser)_n(SEQ ID NO:161)，其中n为等于或高于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、46、50、55、60、70、80、90或100的整数。在一个实施方案中，n＝1，即，接头为(Gly₄Ser)(SEQ ID NO:161)。在一个实施方案中，n＝2，即，接头为(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO:162)。在另一个实施方案中，n＝3，即，接头为(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO:172)。在另一个实施方案中，n＝4，即，接头为(Gly₄Ser)₄(SEQ IDNO:173)。在另一个实施方案中，n＝5，即，接头为(Gly₄Ser)₅(SEQ ID NO:174)。在另一个实施方案中，n＝6，即，接头为(Gly₄Ser)₆(SEQ ID NO:175)。在另一个实施方案中，n＝7，即，接头为(Gly₄Ser)₇(SEQ ID NO:176)。在另一个实施方案中，n＝8，即，接头为(Gly₄Ser)₈(SEQID NO:177)。在另一个实施方案中，n＝9，即，接头为(Gly₄Ser)₉(SEQ ID NO:178)。在另一实施方案中，n＝10，即，接头为(Gly₄Ser)₁₀(SEQ ID NO:179)。

另一个示例性Gly/Ser肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly₄Ser)_n(SEQ ID NO:180)，其中n为等于或高于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、46、50、55、60、70、80、90或100的整数。在一个实施方案中，n＝1，即，接头为Ser(Gly₄Ser)(SEQ ID NO:180)。在一个实施方案中，n＝2，即，接头为Ser(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO:181)。在另一个实施方案中，n＝3，即，接头为Ser(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO:182)。在另一个实施方案中，n＝4，即，接头为Ser(Gly₄Ser)₄(SEQ ID NO:183)。在另一个实施方案中，n＝5，即，接头为Ser(Gly₄Ser)₅(SEQID NO:184)。在另一个实施方案中，n＝6，即，接头为Ser(Gly₄Ser)₆(SEQ ID NO:185)。在另一个实施方案中，n＝7，即，接头为Ser(Gly₄Ser)₇(SEQ ID NO:186)。在另一个实施方案中，n＝8，即，接头为Ser(Gly₄Ser)₈(SEQ ID NO:187)。在另一个实施方案中，n＝9，即，接头为Ser(Gly₄Ser)₉(SEQ ID NO:188)。在另一个实施方案中，n＝10，即，接头为Ser(Gly₄Ser)₁₀(SEQID NO:189)。

在某些方面中，FIX融合蛋白包含插入在表7中所列的插入位点处的一个异源部分。在其他方面中，FIX融合蛋白包含插入在表7中所列的两个插入位点中的两个异源部分。在一个特定实施方案中，所述两个异源部分插入在表8中所列的两个插入位点中。在某些方面中，FIX融合蛋白包含插入在表7中所列的三个插入位点中的三个异源部分。在某些方面中，FIX融合蛋白包含插入在表7中所列的四个插入位点中的四个异源部分。在某些方面中，FIX融合蛋白包含插入在表7中所列的五个插入位点中的五个异源部分。在某些方面中，FIX融合蛋白包含插入在表7中所列的六个插入位点中的六个异源部分。在一些方面中，所有插入的异源部分都是相同。在其他方面中，至少一个插入的异源部分不同于其余插入的异源部分。

FIX多肽与至少一个异源部分(例如XTEN)融合可影响本发明的融合蛋白的物理或化学特性，例如药物动力学。在一个特定实施方案中，连接至FIX蛋白的异源部分增加至少一种药物动力学特性，诸如增加的终末半衰期或增加的曲线下面积(AUC)，以使得本文所述的融合蛋白在体内停留的时间与野生型FIX或缺乏异源部分的相应FIX相比有所增加。在其他实施方案中，用于本发明中的XTEN序列增加至少一种药物动力学特性，例如增加的终末半衰期、增加的回收率和/或增加的皮下给药的生物利用率、增加的曲线下面积(AUC)，以使得FIX蛋白在体内停留的时间与野生型FIX或缺乏异源部分的相应FIX相比有所增加。

在某些方面中，增加本发明的FIX融合蛋白的半衰期的异源部分包括但不限于异源多肽，诸如白蛋白、免疫球蛋白Fc区、XTEN序列、人类绒毛膜促性腺素β亚基的C末端肽(CTP)、PAS序列、HAP序列、转铁蛋白、白蛋白结合部分或这些多肽的任何片段、衍生物、变体或组合。在某些方面中，本发明的FIX融合蛋白包含增加半衰期的异源多肽，其中所述异源多肽为XTEN序列。在其他相关方面中，异源部分可包括非多肽部分(诸如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、聚唾液酸或这些部分的任何衍生物、变体或组合)的连接位点。

在其他实施方案中，本发明的FIX融合蛋白与一种或多种聚合物缀合。聚合物可为水溶性的或非水溶性的。聚合物可共价或非共价连接至FIX或连接至与FIX缀合的其他部分。聚合物的非限制性实例可为聚(氧化烯)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉或聚(丙烯酰基吗啉)。

在某些方面中，本发明的FIX融合蛋白包含一个、两个、三个或更多个异源部分，所述异源部分可各自为相同或不同的分子。在一些实施方案中，FIX融合蛋白包含一个或多个XTEN。在其他实施方案中，FIX融合蛋白包含一个或多个XTEN和一个或多个Fc结构域。在一个特定实施方案中，FIX融合蛋白可包含插入在FIX内的XTEN和与FIX的C末端融合的Fc。

本发明的FIX融合蛋白与原生FIX、rFIXFc或FIX R338L相比可具有增加的体内半衰期。在一些实施方案中，所述FIX融合蛋白可具有与缺乏异源部分的原生FIX相比或与缺乏异源部分的FIX R338L相比至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍的体内半衰期。在一个特定实施方案中，FIX融合蛋白具有与不含异源部分的FIX多肽相比超过2倍大的体内半衰期。

在其他实施方案中，FIX融合蛋白的体内半衰期可比缺乏异源部分的FIX多肽的体内半衰期长至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时、至少约12小时、至少约13小时、至少约14小时、至少约15小时、至少约16小时、至少约17小时、至少约18小时、至少约19小时、至少约20小时、至少约21小时、至少约22小时、至少约23小时、至少约24小时、至少约25小时、至少约26小时、至少约27小时、至少约28小时、至少约29小时、至少约30小时、至少约31小时、至少约32小时、至少约33小时、至少约小时或至少约34小时。

II.B.1.XTEN

在一些实施方案中，至少一个异源部分为XTEN。如此处所用，“XTEN序列”是指具有非天然存在、基本上非重复、主要由小亲水性氨基酸组成的序列的长度延长的多肽，所述序列在生理条件下具有较低程度的二级或三级结构或不具有二级或三级结构。作为融合蛋白配偶体，XTEN可充当载体，以在连接至本发明的FIX序列以产生融合蛋白时，赋予某些合乎需要的药物动力学、物理化学和医药特性。此类合乎需要的特性包括但不限于增强的药物动力学参数和溶解性特征。如本文所用，“XTEN”明确排除抗体或抗体片段，诸如单链抗体或者轻链或重链的Fc片段。

在某些方面中，本发明的FIX融合蛋白包含至少一个插入到FIX中的XTEN或其片段、变体或衍生物，其中所述FIX融合蛋白具有促凝血活性并且可在宿主细胞中在体内或体外表达。在某些方面中，所述异源部分中的两个为XTEN序列。在一些方面中，所述异源部分中的三个为XTEN序列。在一些方面中，所述异源部分中的四个为XTEN序列。在一些方面中，所述异源部分中的五个为XTEN序列。在一些方面中，所述异源部分中的六个或更多为XTEN序列。

在一些实施方案中，适用于本发明的XTEN序列为具有超过约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000个氨基酸残基的肽或多肽。在某些实施方案中，XTEN为具有超过约20至约3000个氨基酸残基、超过30至约2500个残基、超过40至约2000个残基、超过50至约1500个残基、超过60至约1000个残基、超过70至约900个残基、超过80至约800个残基、超过90至约700个残基、超过100至约600个残基、超过110至约500个残基或超过120至约400个残基的肽或多肽。在一个特定实施方案中，XTEN包含长度长于42个氨基酸且短于144个氨基酸的氨基酸序列。

本发明的XTEN序列可包含一个或多个具有5至14个(例如9至14个)氨基酸残基的序列基序或与所述序列基序至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中所述基序包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自由甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)组成的组的4至6种类型的氨基酸(例如5个氨基酸)。参见US2010-0239554A1。

在一些实施方案中，XTEN包含不重叠序列基序，其中约80％、或至少约85％、或至少约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％或约100％的序列由选自从表2A选择的单一基序家族的不重叠序列的多个单元组成，从而产生家族序列。如本文所用，“家族”意指XTEN具有仅选自表2A中的单一基序类别的基序；即，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD XTEN，并且选择XTEN中的并非来自家族基序的任何其他氨基酸以达成所需特性，诸如允许编码核苷酸并入限制位点、并入裂解序列，或达成与FIX的更佳连接。在XTEN家族的一些实施方案中，XTEN序列包含以下的非重叠序列基序的多个单元：AD基序家族、或AE基序家族、或AF基序家族、或AG基序家族、或AM基序家族、或AQ基序家族、或BC家族、或BD家族，所得XTEN显示上文所述的同源性范围。在其他实施方案中，XTEN包含来自表2A的两个或更多个基序家族的多个基序序列单元。这些序列可被选择以达成所需物理/化学特征，包括诸如净电荷、亲水性、缺乏二级结构或缺乏重复性的特性，那些特性由基序的氨基酸组成赋予，下文将更全面地描述。在本段落以上描述的实施方案中，并入到XTEN中的基序可使用本文所述的方法选择和组装以获得具有约36至约3000个氨基酸残基的XTEN。

表2A.具有12个氨基酸的XTEN序列基序和基序家族

*表示当以各种排列一起使用时产生“家族序列」”的个别基序序列

XTEN可具有不同长度以用于插入到FIX中或与FIX连接。在一个实施方案中，基于待在融合蛋白中达成的特性或功能选择XTEN序列的长度。根据预期特性或功能，XTEN可为可充当载体的短或中等长度序列或较长序列。在某些实施方案中，XTEN包含具有约6至约99个氨基酸残基的短区段、具有约100至约399个氨基酸残基的中等长度区段以及具有约400至约1000个且高达约3000个氨基酸残基的长度较长的区段。因此，插入到FIX中或连接至FIX的XTEN的长度可为约6、约12、约36、约40、约42、约72、约96、约144、约288、约400、约500、约576、约600、约700、约800、约864、约900、约1000、约1500、约2000、约2500或多至约3000个氨基酸残基长。在其他实施方案中，XTEN序列的长度为约6至约50、约50至约100、约100至150、约150至250、约250至400、约400至约500、约500至约900、约900至1500、约1500至2000或约2000至约3000个氨基酸残基。插入到FIX中或连接至FIX的XTEN的精确长度可以发生改变，而不会不利地影响FIX的活性。在一个实施方案中，本文使用的一个或多个XTEN具有42个氨基酸、72个氨基酸、144个氨基酸、288个氨基酸、576个氨基酸或864个氨基酸长度并且可选自一个或多个XTEN家族序列；即，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD。

在一些实施方案中，本发明中使用的XTEN序列与选自由以下组成的组的序列至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同：AE42、AG42、AE48、AM48、AE72、AG72、AE108、AG108、AE144、AF144、AG144、AE180、AG180、AE216、AG216、AE252、AG252、AE288、AG288、AE324、AG324、AE360、AG360、AE396、AG396、AE432、AG432、AE468、AG468、AE504、AG504、AF504、AE540、AG540、AF540、AD576、AE576、AF576、AG576、AE612、AG612、AE624、AE648、AG648、AG684、AE720、AG720、AE756、AG756、AE792、AG792、AE828、AG828、AD836、AE864、AF864、AG864、AM875、AE912、AM923、AM1318、BC864、BD864、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、AG948、AG1044、AG1140、AG1236、AG1332、AG1428、AG1524、AG1620、AG1716、AG1812、AG1908、AG2004及其任何组合。参见US 2010-0239554 A1。在一个特定实施方案中，XTEN包含AE42、AE72、AE144、AE288、AE576、AE864、AG42、AG72、AG144、AG288、AG576、AG864或其任何组合。

在一个实施方案中，XTEN序列与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同：AE36(SEQ ID NO:217)、AE42(SEQ ID NO:34)、AE72(SEQ ID NO:35)、AE78(SEQ ID NO:218)、AE144(SEQ ID NO:36)、AE144_2A(SEQ ID NO:37)、AE144_3B(SEQ ID NO:38)、AE144_4A(SEQ ID NO:39)、AE144_5A(SEQ ID NO:40)、AE144_6B(SEQ ID NO:41)、AG144(SEQ ID NO:42)、AG144_A(SEQ ID NO:43)、AG144_B(SEQ ID NO:44)、AG144_C(SEQ ID NO:45)、AG144_F(SEQ ID NO:46)、AE288(SEQ ID NO:47)、AE288_2(SEQ ID NO:48)、AG288(SEQ ID NO:49)、AE576(SEQ ID NO:50)、AG576(SEQ ID NO:51)、AE864(SEQ ID NO:52)、AG864(SEQ ID NO:53)、XTEN_AE72_2A_1(SEQ ID NO:202)、XTEN_AE72_2A_2(SEQ ID NO:203)、XTEN_AE72_3B_1(SEQ ID NO:204)、XTEN_AE72_3B_2(SEQ ID NO:205)、XTEN_AE72_4A_2(SEQ ID NO:206)、XTEN_AE72_5A_2(SEQ ID NO:207)、XTEN_AE72_6B_1(SEQ ID NO:208)、XTEN_AE72_6B_2(SEQ ID NO:209)、XTEN_AE72_1A_1(SEQ ID NO:210)、XTEN_AE72_1A_2(SEQ ID NO:211)、XTEN_AE144_1A(SEQID NO:212)、AE150(SEQ ID NO:213)、AG150(SEQ ID NO:214)、AE294(SEQ ID NO:215)、AG294(SEQ ID NO:216)及其任何组合。

在一些实施方案中，XTEN中少于100％的氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)，或者少于100％的序列由来自表2A的序列基序或表2B的XTEN序列组成。在此类实施方案中，XTEN的其余氨基酸残基选自其他14个天然L-氨基酸中的任一个，但可优先选自亲水性氨基酸，以使得XTEN序列含有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％的亲水性氨基酸。缀合构建体中使用的XTEN中的疏水性氨基酸含量可低于5％，或低于2％，或低于1％的疏水性氨基酸含量。较少用于构建XTEN的疏水性残基包括色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸。另外，XTEN序列可含有少于5％、或少于4％、或少于3％、或少于2％、或少于1％、或无以下氨基酸：甲硫氨酸(例如以避免氧化)、或天冬酰胺和谷氨酰胺(以避免脱酰胺)。

在另一实施方案中，XTEN序列选自由以下组成的组：AE36(SEQ ID NO:217)、AE42(SEQ ID NO:34)、AE72(SEQ ID NO:35)、AE78(SEQ ID NO:218)、AE144(SEQ ID NO:36)、AE144_2A(SEQ ID NO:37)、AE144_3B(SEQ ID NO:38)、AE144_4A(SEQ ID NO:39)、AE144_5A(SEQ ID NO:40)、AE144_6B(SEQ ID NO:41)、AG144(SEQ ID NO:42)、AG144_A(SEQ ID NO:43)、AG144_B(SEQ ID NO:44)、AG144_C(SEQ ID NO:45)、AG144_F(SEQ ID NO:46)、AE288(SEQ ID NO:47)、AE288_2(SEQ ID NO:48)、AG288(SEQ ID NO:49)、AE576(SEQ ID NO:50)、AG576(SEQ ID NO:51)、AE864(SEQ ID NO:52)、AG864(SEQ ID NO:53)、XTEN_AE72_2A_1(SEQ ID NO:202)、XTEN_AE72_2A_2(SEQ ID NO:203)、XTEN_AE72_3B_1(SEQ ID NO:204)、XTEN_AE72_3B_2(SEQ ID NO:205)、XTEN_AE72_4A_2(SEQ ID NO:206)、XTEN_AE72_5A_2(SEQ ID NO:207)、XTEN_AE72_6B_1(SEQ ID NO:208)、XTEN_AE72_6B_2(SEQ ID NO:209)、XTEN_AE72_1A_1(SEQ ID NO:210)、XTEN_AE72_1A_2(SEQ ID NO:211)、XTEN_AE144_1A(SEQID NO:212)、AE150(SEQ ID NO:213)、AG150(SEQ ID NO:214)、AE294(SEQ ID NO:215)、AG294(SEQ ID NO:216)及其任何组合。在一个特定实施方案中，XTEN序列选自由以下组成的组：AE72、AE144和AE288。本发明的某些XTEN序列的氨基酸序列示出于表2B中。

表2B.XTEN序列

在其他实施方案中，本发明中使用的XTEN序列影响本发明的融合蛋白的物理或化学特性，例如药物动力学特性。用于本发明中的XTEN序列可展现以下一种或多种有利特性：构象柔性、增强的水溶解性、高程度的蛋白酶抗性、低免疫原性、对哺乳动物受体的较低结合或增加的流体动力学(或Stokes)半径。在一个特定实施方案中，连接至本发明中的FIX蛋白的XTEN序列增加药物动力学特性，诸如较长的终末半衰期、增加的生物利用度或增加的曲线下面积(AUC)，以使得本文所述的蛋白质在体内停留的时间段与野生型FIX相比有所增加。在其他实施方案中，本发明中使用的XTEN序列增加药物动力学特性，诸如较长的终末半衰期或增加的曲线下面积(AUC)，以使得FIX蛋白质在体内停留的时间段与野生型FIX相比有所增加。

在一些实施方案中，FIX蛋白质展现的体内半衰期比原生FIX、rFIXFc、FIX R338L或缺乏XTEN的相应FIX蛋白质大至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。在一个特定实施方案中，FIX融合蛋白的体内半衰期可比不含异源部分的FIX多肽大超过2倍。

在其他实施方案中，FIX融合蛋白展现的体内半衰期比缺乏异源部分的FIX多肽的体内半衰期长至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时、至少约12小时、至少约13小时、至少约14小时、至少约15小时、至少约16小时、至少约17小时、至少约18小时、至少约19小时、至少约20小时、至少约21小时、至少约22小时、至少约23小时、至少约24小时、至少约25小时、至少约26小时、至少约27小时、至少约28小时、至少约29小时、至少约30小时、至少约31小时、至少约32小时、至少约33小时、至少约小时或至少约34小时。

多种方法和测定可用于测定包含XTEN序列的蛋白质的物理/化学特性。此类方法包括但不限于分析性离心、EPR、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻、反相HPLC、光散射、毛细管电泳、圆形二色性、差示扫描量热法、荧光、HPLC-离子交换、HPLC-尺寸排阻、IR、NMR、拉曼光谱、折射测量法以及UV/可见光谱学。其他方法公开于Amau等人,Prot Expr and Purif 48,1-13(2006)中。

可根据本发明使用的XTEN序列的其他实例公开于美国专利公布号2010/0239554A1、2010/0323956 A1、2011/0046060 A1、2011/0046061 A1、2011/0077199 A1或2011/0172146 A1；或国际专利公布号WO 2010091122 A1、WO 2010144502 A2、WO 2010144508A1、WO 2011028228 A1、WO 2011028229 A1、WO 2011028344 A2、WO 2014/011819 A2或WO2015/023891中。

在一些方面中，FIX融合蛋白包含插入在FIX内、与FIX的C末端融合或两者的一个或多个XTEN序列。在一个实施方案中，一个或多个XTEN序列插入在GLA结构域内。在另一个实施方案中，一个或多个XTEN序列插入在EGF1结构域内。在其他实施方案中，一个或多个XTEN序列插入在EGF2内。又在其他实施方案中，一个或多个XTEN序列插入在AP内。还在其他实施方案中，一个或多个XTEN序列插入在催化结构域内。在一些实施方案中，一个或多个XTEN序列与FIX的C末端融合。

在某些方面中，FIX融合蛋白包含插入在表7中所列的插入位点处的一个XTEN序列。在其他方面中，FIX融合蛋白包含插入在表7中所列的两个插入位点中的两个XTEN序列。在一个特定实施方案中，两个XTEN序列插入在表8中所列的两个插入位点中。在某些方面中，FIX融合蛋白包含插入在表7中所列的三个插入位点中的三个XTEN序列。在某些方面中，FIX融合蛋白包含插入在表7中所列的四个插入位点中的四个XTEN序列。在某些方面中，FIX融合蛋白包含插入在表7中所列的五个插入位点中的五个XTEN序列。在某些方面中，FIX融合蛋白包含插入在表7中所列的六个插入位点中的六个XTEN序列。在一些方面中，所有插入的XTEN序列都相同。在其他方面中，至少一个插入的XTEN序列不同于其余插入的XTEN序列。

在一些方面中，FIX融合蛋白包含插入在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点的一个XTEN序列：SEQ ID NO:2的氨基酸103、SEQ ID NO:2的氨基酸105、SEQ ID NO:2的氨基酸142、SEQ ID NO:2的氨基酸149、SEQ ID NO:2的氨基酸162、SEQ IDNO:2的氨基酸166、SEQ ID NO:2的氨基酸174、SEQ ID NO:2的氨基酸224、SEQ ID NO:2的氨基酸226、SEQ ID NO:2的氨基酸228、SEQ ID NO:2的氨基酸413及其任何组合，其中所述FIX融合蛋白展现促凝血活性。在一些方面中，FIX融合蛋白包含在FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点的第二XTEN序列：SEQ ID NO:2的氨基酸103、SEQ ID NO:2的氨基酸105、SEQ ID NO:2的氨基酸142、SEQ ID NO:2的氨基酸149、SEQ ID NO:2的氨基酸162、SEQ ID NO:2的氨基酸166、SEQ ID NO:2的氨基酸174、SEQ ID NO:2的氨基酸224、SEQID NO:2的氨基酸226、SEQ ID NO:2的氨基酸228、SEQ ID NO:2的氨基酸413及其任何组合，或者其中所述第二XTEN与FIX多肽的C末端融合，其中所述FIX融合蛋白展现促凝血活性。在一个特定方面中，FIX融合蛋白包含与FIX的C末端融合的一个XTEN序列，其中XTEN包含长度长于42个氨基酸且短于144个氨基酸的氨基酸序列。

II.B.2 Fc区或FcRn结合配偶体

在一些实施方案中，所述至少一个异源部分为Fc区(例如FcRn结合配偶体)或其片段。在某些方面中，本发明的FIX融合蛋白包含插入于FIX内、与FIX的C末端融合或两者的至少一个Fc区(例如FcRn结合配偶体)，其中所述FIX融合蛋白具有促凝血活性并且可在宿主细胞中在体内或体外表达。除非另外规定，否则如本文所用，“Fc”或“Fc区”可为包含Fc结构域、其变体或片段的功能性新生儿Fc受体(FcRn)结合配偶体。FcRn结合配偶体为可由FcRn受体特异性结合，从而通过FcRn结合配偶体的FcRn受体主动运输的任何分子，包括但不限于白蛋白。因此，术语Fc包括IgG Fc的任何功能性变体。IgG的Fc部分中结合至FcRn受体的区域已基于X-射线结晶学进行描述(Burmeister等人,Nature 372:379(1994)，其以引用的方式整体并入本文中)。Fc与FcRn的主要接触区域接近CH2结构域与CH3结构域的连接点。Fc-FcRn接触区全部在单一Ig重链内。FcRn结合配偶体包括但不限于完整IgG、IgG的Fc片段和IgG中包含FcRn的完整结合区的其他片段。Fc可包含免疫球蛋白中具有或不具有免疫球蛋白铰链区的CH2域和CH3域。还包括融合蛋白中维持Fc区的所需特性(例如增加半衰期，例如体内半衰期)的Fc片段、变体或衍生物。许多突变体、片段、变体和衍生物描述于例如PCT公布号WO 2011/069164 A2、WO 2012/006623 A2、WO 2012/006635 A2或WO 2012/006633A2中，所有这些公布均以引用的方式整体并入本文中。

所述一个或多个Fc结构域可插入在FIX多肽内、与所述多肽的C末端融合或两者。在一些实施方案中，Fc结构域与FIX多肽融合。在一些实施方案中，Fc结构域与另一异源部分(诸如XTEN)融合，Fc结构域插入在FIX内或与XTEN的C末端融合。在一些实施方案中，FIX融合蛋白包含第二Fc结构域。所述第二Fc结构域可例如通过一个或多个共价键与第一Fc结构域缔合。

II.B.3.白蛋白

在一些实施方案中，所述至少一个异源部分为白蛋白、白蛋白结合结构域或白蛋白结合小分子，或者其变体、衍生物或片段。在某些方面中，本发明的FIX融合蛋白包含至少一个插入在FIX内、与FIX的C末端融合或两者的白蛋白多肽或其片段、变体或衍生物，其中所述FIX融合蛋白具有促凝血活性并且可在宿主细胞中在体内或体外表达。人血清白蛋白(HAS或HA)为呈全长形式的具有609个氨基酸的蛋白质，其负责显著比例的血清渗透压并且也充当内源性和外源性配体的载体。如本文所用，术语“白蛋白”包括全长白蛋白或其功能性片段、变体、衍生物或类似物。白蛋白或其片段或变体的实例公开于美国专利公布号2008/0194481A1、2008/0004206 A1、2008/0161243 A1、2008/0261877 A1或2008/0153751A1或PCT申请公布号2008/033413 A2、2009/058322 A1或2007/021494 A2中，所述公布以引用的方式整体并入本文中。

白蛋白结合多肽(ABP)可包括但不限于可结合至白蛋白的细菌白蛋白结合结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合抗体片段。如Kraulis等人,FEBS Lett.378:190-194(1996)和Linhult等人,Protein Sci.11:206-213(2002)所公开的来自链球菌蛋白质G的结构域3为细菌白蛋白结合结构域的一个实例。白蛋白结合肽的实例包括一系列具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:163)的肽。参见例如Dennis等人,J.Biol.Chem.2002,277:35035-35043(2002)。白蛋白结合抗体片段的实例公开于Muller和Kontermann,Curr.Opin.Mol.Ther.9:319-326(2007)；Roovers等人,Cancer Immunol.Immunother.56:303-317(2007)；以及Holt等人,Prot.Eng.Design Sci.,21:283-288(2008)中，所述文献以引用的方式整体并入本文中。

在某些方面中，本发明的FIX融合蛋白包含可结合至插入在FIX中、与FIX的C末端融合或两者的白蛋白的非多肽小分子、其变体或衍生物(例如白蛋白结合小分子)的至少一个连接位点，其中所述FIX融合蛋白具有促凝血活性并且可在宿主细胞中在体内或体外表达。举例而言，本发明的FIX融合蛋白可包含连接在FIX内的一个或多个插入位点中、或与FIX的C末端融合、或两者的一个或多个有机白蛋白结合部分，其中所述FIX融合蛋白具有促凝血活性并且可在宿主细胞中在体内或体外表达。这些白蛋白结合部分的实例为如由Trussel等人,Bioconjugate Chem.20:2286-2292(2009)所公开的2-(3-顺丁烯二酰亚胺基丙酰胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁酰胺基)己酸酯(“Albu”标签)。

在一些实施方案中，白蛋白结合多肽序列通过Gly-Ser肽接头序列侧接在C末端、N末端或两端处。在一些实施方案中，Gly-Ser肽接头为Gly₄Ser(SEQ ID NO:161)。在其他实施方案中，Gly-Ser肽接头为(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO:162)。

II.B.4.CTP

在一些实施方案中，至少一个异源部分为人类绒毛膜促性腺素β亚基的C末端肽(CTP)或其片段、变体或衍生物。在某些方面中，本发明的FIX融合蛋白包含至少一个插入到FIX中、与FIX的C末端融合或两者的CTP或其片段、变体或衍生物，其中所述FIX融合蛋白具有促凝血活性并且可在宿主细胞中在体内或体外表达。已知一种或多种插入到重组蛋白中的CTP肽会增加该蛋白质的半衰期。参见例如美国专利号第5,712,122，所述专利以引用的方式整体并入本文中。示例性CTP肽包括DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO:164)或SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:165)。参见例如，美国专利申请公布号US 2009/0087411 A1，所述专利以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，CTP序列通过Gly-Ser肽接头序列侧接在C末端、N末端或两个末端处。在一些实施方案中，Gly-Ser肽接头为Gly₄Ser(SEQ ID NO:161)。在其他实施方案中，Gly-Ser肽接头为(Gly₄Ser)₂(SEQ IDNO:162)。

II.B.5.PAS

在一些实施方案中，至少一个异源部分为PAS肽。在某些方面中，本发明的FIX融合蛋白包含至少一个插入到FIX中、与FIX的C末端融合或两者的PAS肽或其片段、变体或衍生物，其中所述FIX融合蛋白具有促凝血活性并且可在宿主细胞中在体内或体外表达。如本文所用，“PAS肽”或“PAS序列”意指主要包含丙氨酸和丝氨酸残基或主要包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列在生理条件下形成无规卷曲构形。因此，PAS序列为包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸；基本上由其组成或由其组成的构建嵌段、氨基酸聚合物或序列盒，其可用作融合蛋白中的异源部分的一部分。当除丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸以外的残基作为次要组分添加于PAS序列中时，氨基酸聚合物也可形成无规卷曲构形。“次要组分”意指除丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸以外的氨基酸可在某种程度上添加于PAS序列中，例如占所述氨基酸至多约12％，即PAS序列的100个氨基酸中有约12个所述氨基酸，至多约10％、至多约9％、至多约8％、约6％、约5％、约4％、约3％，即，约2％或约1％。不同于丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸的氨基酸可选自由以下组成的组：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr以及Val。在生理条件下，PAS肽形成无规卷曲构象并且由此可介导本发明的重组蛋白的体内和/或体外稳定性增强，并且具有促凝血活性。

PAS肽的非限制性实例包括ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO:154)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO:155)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO:156)、APSSPSPSAPSSPS PASPS(SEQ ID NO:157)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO:158)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO:159)、ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO:160)或其任何变体、衍生物、片段或组合。PAS序列的其他实例根据例如美国专利公布号2010/0292130 A1和PCT申请公布号WO 2008/155134 A1可知。欧洲颁布的专利EP2173890。

在一些实施方案中，PAS序列通过Gly-Ser肽接头序列侧接在C末端、N末端或两个末端处。在一些实施方案中，Gly-Ser肽接头为Gly₄Ser(SEQ ID NO:161)。在其他实施方案中，Gly/Ser肽接头为(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO:162)。

II.B.6 HAP

在一些实施方案中，所述至少一个异源部分为高氨基酸聚合物(HAP)肽或其片段、变体或衍生物。在某些方面中，本发明的FIX融合蛋白包含至少一个插入在FIX内、与FIX的C末端融合或两者的高氨基酸聚合物(HAP)肽或其片段、变体或衍生物，其中所述FIX融合蛋白具有促凝血活性并且可在宿主细胞中在体内或体外表达。HAP肽可包含甘氨酸重复序列，其长度为至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、120个氨基酸、140个氨基酸、160个氨基酸、180个氨基酸、200个氨基酸、250个氨基酸、300个氨基酸、350个氨基酸、400个氨基酸、450个氨基酸或500个氨基酸。HAP序列能够延长融合至或连接至HAP序列的部分的半衰期。HAP序列的非限制性实例包括但不限于(Gly)_n、(Gly₄Ser)_n或S(Gly₄Ser)_n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一个实施方案中，n为20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在一个实施方案中，n为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。参见例如Schlapschy M等人,Protein Eng.Design Selection,20:273-284(2007)。

II.B.7.有机聚合物

在一些实施方案中，所述至少一个异源部分为有机聚合物，例如聚乙二醇、聚唾液酸或羟乙基淀粉。在某些方面中，本发明的FIX融合蛋白包含插入到FIX中、与FIX的C末端融合或两者的非多肽异源部分或其片段、变体或衍生物的至少一个连接位点，其中所述FIX融合蛋白具有促凝血活性并且可在宿主细胞中在体内或体外表达。举例而言，本发明的FIX融合蛋白可包含连接于FIX序列内、连接至FIX的C末端或两者的一个或多个聚乙二醇(PEG)部分，其中所述FIX融合蛋白具有促凝血活性并且可在宿主细胞中在体内或体外表达。

聚乙二醇化FIX可以是指FIX与至少一个聚乙二醇(PEG)分子之间形成的缀合物。可购得在多种分子量和平均分子量范围内的PEG。PEG平均分子量范围的典型实例包括但不限于约200、约300、约400、约600、约1000、约1300-1600、约1450、约2000、约3000、约3000-3750、约3350、约3000-7000、约3500-4500、约5000-7000、约7000-9000、约8000、约10000、约8500-11500、约16000-24000、约35000、约40000、约60000以及约80000道尔顿。这些平均分子量仅作为实例提供并且不意图以任何方式限制。

本发明的FIX融合蛋白可被聚乙二醇化以包含单个或多个(例如2-4个)PEG部分。聚乙二醇化可通过本领域中已知的任何聚乙二醇化反应进行。用于制备聚乙二醇化蛋白质产物的方法一般将包括(i)使多肽与聚乙二醇(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)在使本发明的肽连接至一个或多个PEG基团的条件下反应；以及(ii)获得反应产物。一般而言，反应的最佳反应条件将基于已知参数和所需结果根据具体情况来确定。

存在许多可为本领域技术人员可利用的PEG连接方法，例如Malik F等人,Exp.Hematol.20:1028-35(1992)；Francis,Focus on Growth Factors 3(2):4-10(1992)；欧洲专利公布号EP0401384、EP0154316和EP0401384；以及国际专利申请公布号WO92/16221和WO95/34326。作为非限制性实例，FIX变体可在如本文所述的一个或多个插入位点处或其附近含有半胱氨酸取代，并且半胱氨酸可进一步与PEG聚合物缀合。参见Mei等人,Blood116:270-279(2010)和美国专利号7,632,921，所述文献以引用的方式整体并入本文中。

在其他实施方案中，有机聚合物为聚唾液酸(PSA)。PSA为由某些细菌菌株和在哺乳动物的某些细胞中产生的唾液酸的天然存在的未分支聚合物。参见例如，Roth J.等人(1993)Polysialic Acid:From Microbes to Man,Roth J.,Rutishauser U.,Troy F.A.编(Basel,Switzerland),第335–348页。PSA可通过有限酸水解或通过用神经氨酸苷酶(neuraminidase)消化或通过分馏聚合物的天然细菌源性形式来以从n＝约80个或更多个唾液酸残基至n＝2的各种聚合度产生。存在许多可为本领域技术人员可用的PSA连接方法，例如上述相同PEG连接方法。在某些方面中，活化PSA也可连接至FIX上的半胱氨酸氨基酸残基。参见例如美国专利号5846951。

在其他实施方案中，有机聚合物为羟乙基淀粉(HES)聚合物。在某些方面中，本发明的FIX融合蛋白包含至少一个缀合在FIX内的一个或多个位点、与FIX的C末端融合或两者的HES聚合物，其中所述重组FIX蛋白具有促凝血活性并且可在宿主细胞中在体内或体外表达。

III.多核苷酸、载体、宿主细胞和制备方法

本发明还提供一种编码本文所述的FIX融合蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的表达载体、包含所述多核苷酸或所述载体的宿主细胞或制备所述FIX融合蛋白的方法。

编码FIX融合蛋白的多核苷酸可为单一核苷酸序列、两个核苷酸序列、三个核苷酸序列或更多核苷酸序列。在一个实施方案中，单一核苷酸序列编码包含FIX多肽和异源部分(例如XTEN)的FIX融合蛋白，例如包含FIX多肽和插入在FIX多肽内的XTEN、与FIX多肽的C末端融合的Fc结构域和通过任选接头与FIX多肽融合的第二Fc结构域的FIX融合蛋白。在另一个实施方案中，多核苷酸包含两个核苷酸序列，第一核苷酸序列编码FIX多肽和插入在FIX多肽内的XTEN，并且第二核苷酸序列编码异源部分，例如Fc。在其他实施方案中，多核苷酸包含两个核苷酸序列，第一核苷酸序列编码FIX多肽、插入在FIX多肽内的XTEN和与FIX多肽融合的Fc结构域，并且第二核苷酸序列编码第二Fc结构域。编码的Fc结构域可在表达后形成共价键。

在一些实施方案中，编码FIX融合蛋白的多核苷酸被密码子优化。

如本文所用，表达载体是指含有在引入到适当宿主细胞中时插入的编码序列转录和翻译所必需的元件或在RNA病毒载体的情况下复制和翻译所必需的元件的任何核酸构建体。表达载体可包括质粒、噬菌粒、病毒及其衍生物。

如本文所用的基因表达控制序列为有助于可操作地连接的编码核酸的高效转录和翻译的任何调控性核苷酸序列，诸如启动子序列或启动子-增强子组合。基因表达控制序列可例如为哺乳动物或病毒启动子，诸如组成性或诱导性启动子。组成性哺乳动物启动子包括但不限于以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β-肌动蛋白启动子以及其他组成性启动子。在真核细胞中组成性起作用的示例性病毒启动子包括例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒(例如SV40)、乳头状瘤病毒、腺病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、巨细胞病毒、莫洛尼白血病病毒(Moloney leukemia virus)的长末端重复序列(LTR)以及其他逆转录病毒的启动子、以及单纯性疱疹病毒的胸苷激酶启动子。本领域普通技术人员已知其他组成性启动子。适用作本发明的基因表达序列的启动子还包括诱导性启动子。诱导性启动子在诱导剂存在下表达。举例而言，诱导金属硫蛋白启动子以促进在某些金属离子存在下的转录和翻译。其他诱导性启动子为本领域普通技术人员所已知。

出于本发明的目的，可采用众多表达载体系统。这些表达载体通常可在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整体部分复制。表达载体可包含表达控制序列，包括但不限于，启动子(例如天然缔合或异源启动子)、增强子、信号序列、剪接信号、增强子元件以及转录终止序列。优选地，表达控制序列为在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子。表达载体也可利用来源于动物病毒，诸如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)、巨细胞病毒(CMV)或SV40病毒的DNA元件。其他方面涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。

通常，表达载体含有选择标记物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以容许检测用所需DNA序列转化的细胞(参见例如，Itakura等人,美国专利号4,704,362)。将DNA整合至染色体中的细胞可通过引入一个或多个允许选择转染的宿主细胞的标记物来进行选择。标记物可向具有生物杀灭剂抗性(例如抗生素)或重金属(诸如铜)抗性的营养缺陷型宿主提供原营养。可选择标记物基因可直接连接至待表达的DNA序列或通过共转化引入所述细胞中。

适用于表达优化的FIX序列的载体的实例为NEOSPLA(美国专利号6,159,730)。此载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因以及前导序列。已发现此载体在并入可变区和恒定区基因、在细胞中转染、随后在含G418的培养基中选择并进行甲氨喋呤扩增后以极高水平表达抗体。载体系统也在美国专利号5,736,137和号5,658,570中教授，所述专利各自以引用的方式整体并入本文中。此系统提供高表达水平，例如>30皮克/细胞/天。其他示例性载体系统公开于例如美国专利号6,413,777中。

在其他实施方案中，本发明的多肽可使用多顺反子构建体表达。在这些表达系统中，可由单个多顺反子构建体产生多个感兴趣基因产物，诸如多聚体结合蛋白质的多种多肽。这些系统有利地使用内部核糖体入口位点(IRES)以在真核宿主细胞中提供相对较高水平的多肽。相容的IRES序列公开于美国专利号6,193,980，所述专利也并入本文中。

更一般而言，一旦制备出编码多肽的载体或DNA序列，即可将所述表达载体引入到适当宿主细胞中。即，宿主细胞可被转化。将质粒引入到宿主细胞中可通过如以上所讨论的本领域技术人员熟知的各种技术实现。转化的细胞在适于产生FIX多肽的条件下生长，并且针对FIX多肽合成进行测定。示例性测定技术包括酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光活化细胞分选器分析(FACS)、免疫组织化学及其类似技术。

在对用于从重组宿主分离多肽的方法进行的描述中，除非另外清楚地指明，否则术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以指示多肽的来源。换言之，从“细胞”回收多肽可意指从离心的完整细胞或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收。

用于表达蛋白质的宿主细胞系优选为哺乳动物来源；最优选为人类或小鼠来源。示例性宿主细胞系已于上文描述。在产生具有FIX活性的多肽的方法的一个实施方案中，宿主细胞为HEK293细胞。在产生具有FIX活性的多肽的方法的另一个实施方案中，宿主细胞为CHO细胞。

编码本发明多肽的基因也可在非哺乳动物细胞，诸如细菌或真菌或植物细胞中表达。就这一点而言，应了解，各种单细胞非哺乳动物微生物(诸如细菌)也可被转化；即，能够在培养物或发酵物中生长的那些微生物。易于转化的细菌包括肠杆菌科成员，诸如大肠杆菌或沙门氏菌属菌株；芽孢杆菌科，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌属；链球菌属，以及流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。还应了解，当在细菌中表达时，多肽通常变为包涵体的一部分。所述多肽必须加以分离、纯化并随后组装成功能性分子。

或者，本发明的多核苷酸序列可并入到转基因中以引入到转基因动物的基因组中并且随后在转基因动物的乳汁中表达(参见例如，Deboer等人,US 5,741,957；Rosen,US 5,304,489；以及Meade等人,US 5,849,992)。适合的转基因包括与来自乳腺特异性基因(诸如酪蛋白或β乳球蛋白)的启动子和增强子可操作连接的多肽编码序列。

体外产生允许按比例扩大以得到大量所需多肽。用于在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术为本领域中已知的，并且包括均匀悬浮培养，例如在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中的均匀悬浮培养；或者固定或截留的细胞培养，例如在中空纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷盒上的培养。在必要和/或需要时，可通过惯用色谱法，例如凝胶过滤、离子交换色谱法、经DEAE-纤维素色谱或(免疫)亲和力色谱法，例如在合成铰链区多肽的优先生物合成之后或者在本文所述的HIC色谱步骤之前或之后，纯化多肽的溶液。亲和力标签序列(例如His(6)标签)可任选地连接或包括在多肽序列内以促进下游纯化。

一旦表达，即可根据本领域的标准程序纯化FIX蛋白质，所述标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和力柱色谱、HPLC纯化、凝胶电泳及其类似方法(一般参见Scopes,ProteinPurification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))。对于医药应用，优选均匀性为至少约90％或95％的基本上纯的蛋白质，并且最优选98％至99％或更高均匀性。

在一个实施方案中，宿主细胞为真核细胞。如本文所用，真核细胞是指具有胚乳原核的任何动物或植物细胞。动物的真核细胞包括脊椎动物(例如哺乳动物)的细胞和无脊椎动物(例如昆虫)的细胞。植物的真核细胞特别地可包括而不限于酵母细胞。真核细胞不同于原核细胞(例如细菌)。

在某些实施方案中，真核细胞为哺乳动物细胞。哺乳动物细胞为源于哺乳动物的任何细胞。哺乳动物细胞特别地包括但不限于哺乳动物细胞系。在一个实施方案中，哺乳动物细胞为人类细胞。在另一个实施方案中，哺乳动物细胞为HEK 293细胞，其为一种人类胚肾细胞系。HEK 293细胞可以CRL-1533形式从Manassas,VA的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)并以293-H细胞(目录编号11631-017)或293-F细胞(目录编号11625-019)形式从Invitrogen(Carlsbad,Calif.)获得。在一些实施方案中，哺乳动物细胞为PER.细胞，其为一种源于视网膜的人类细胞系。PER.细胞可从Crucell(Leiden,The Netherlands)获得。在其他实施方案中，哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。CHO细胞可从美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA.)获得(例如CHO-K1；CCL-61)。还在其他实施方案中，哺乳动物细胞为幼仓鼠肾(BHK)细胞。BHK细胞可从美国典型培养物保藏中心(Manassas,Va.)获得(例如CRL-1632)。在一些实施方案中，哺乳动物细胞为HKB11细胞，其为HEK293细胞与人类B细胞系的杂交细胞系。Mei等人,Mol.Biotechnol.34(2):165-78(2006)。

还在其他实施方案中，所转染细胞被稳定转染。使用本领域技术人员已知的常规技术，这些细胞可被选择并维持为稳定细胞系。

含有蛋白质的DNA构建体的宿主细胞在适当生长培养基中生长。如本文所用，术语“适当生长培养基”意指含有细胞生长所需的营养素的培养基。细胞生长所需的营养素可包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、矿物质以及生长因子。任选地，培养基可含有一种或多种选择因子。任选地，培养基可含有小牛血清或胎牛血清(FCS)。在一个实施方案中，培养基基本上不含有IgG。生长培养基将通常通过例如药物选择或缺乏必需营养素来选择含有DNA构建体的细胞，所述必需营养素补充有DNA构建体上或与DNA构建体共转染的可选择标记。所培养哺乳动物细胞通常在可商购获得的含血清或不含血清培养基(例如MEM、DMEM、DMEM/F12)中生长。在一个实施方案中，培养基为CD293(Invitrogen,Carlsbad,CA.)。在另一个实施方案中，培养基为CD17(Invitrogen,Carlsbad,CA.)。对适于所用特定细胞系的培养基的选择属于本领域普通技术人员的水平。

在一些实施方案中，核酸、载体或宿主细胞还包含编码蛋白质转化酶的另一种核苷酸。蛋白质转化酶可选自由以下组成的组：前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 5型(PCSK5或PC5)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 7型(PCSK7或PC5)、酵母Kex 2、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 3型(PACE或PCSK3)及其两种或更多种组合。在一些实施方案中，蛋白质转化酶为PACE、PC5或PC7。在一个特定实施方案中，蛋白质转化酶为PC5或PC7。参见国际申请公布号WO 2012/006623，其以引用的方式并入本文中。在另一个实施方案中，蛋白质转化酶为PACE/弗林蛋白酶。

在某些方面中，本发明涉及通过本文所述的方法产生的FIX融合蛋白。

在某些方面中，本发明的宿主细胞可在体内或体外表达FIX融合蛋白。体外生产允许按比例扩大以得到大量本发明所需的改变的多肽。FIX融合蛋白可通过在表达FIX融合蛋白的条件下培养本文所述的宿主细胞来产生。用于在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术为本领域中已知的，并且包括均匀悬浮培养，例如在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中的均匀悬浮培养；或者固定或截留的细胞培养，例如在中空纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷盒上的培养。在必要和/或需要时，多肽的溶液可通过惯用色谱方法来纯化，所述色谱方法例如凝胶过滤、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱(HIC)、经DEAE-纤维素色谱或亲和力色谱。在其他方面中，宿主细胞在体内表达FIX融合蛋白。

在一个实施方案中，本发明包括一种制备FIX融合蛋白的方法，其包括如本文所述将异源部分插入于插入位点中、使异源部分与FIX的C末端融合或两者，其中所述FIX融合蛋白展现促凝血活性。

在另一个实施方案中，本发明包括一种增加FIX蛋白质的半衰期而不消除或降低FIX蛋白质的促凝血活性的方法，其包括如本文所述将异源部分插入于插入位点中、使异源部分与FIX的C末端融合或两者，其中所述FIX融合蛋白展现促凝血活性和与不含异源部分的FIX蛋白质相比有所增加的半衰期。

在其他实施方案中，本发明提供一种构建FIX融合蛋白的方法，其包括设计编码FIX融合蛋白的核苷酸序列，所述FIX融合蛋白包含如本文所述的在插入位点中、与FIX的C末端融合或二者的至少一个异源部分。

在某些实施方案中，本发明包括一种增加FIX融合蛋白的表达的方法，其包括如本文所述将异源部分插入于插入位点中、使异源部分与FIX的C末端融合或两者，其中所述FIX融合蛋白展现促凝血活性。

还在其他实施方案中，本发明提供一种保持FIX融合蛋白的促凝血活性的方法，其包括如本文所述将异源部分插入于插入位点中、使异源部分与FIX的C末端融合或两者，其中所述FIX融合蛋白展现促凝血活性。

IV.药物组合物和治疗方法

本发明还提供一种用于使用包含本发明的FIX融合蛋白的药物组合物预防、治疗、改善或管理有需要的人类受试者的凝血疾病或病状或者出血病状的方法。示例性方法包含括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含本发明的FIX融合蛋白的药物组合物/制剂。在其他方面中，可向有需要的受试者施用包含编码本发明的融合蛋白的DNA的组合物。在本发明的某些方面中，可向有需要的受试者施用表达本发明的FIX融合蛋白的细胞。在本发明的某些方面中，药物组合物包含(i)FIX融合蛋白、(ii)编码FIX融合蛋白的分离的核酸、(iii)包含编码FIX融合蛋白质的核酸的载体、(iv)包含编码FIX融合蛋白的分离的核酸和/或含有编码FIX融合蛋白的核酸的载体的细胞或(v)其组合，并且药物组合物还包含可接受的赋形剂或载剂。

本发明的FIX融合蛋白可静脉内、皮下或经口施用于患者。在某些实施方案中，FIX融合蛋白通过静脉内注射施用于受试者。在其他实施方案中，FIX融合蛋白系通过皮下注射施用于受试者。注射可包含单次推注。受试者可接受超过一次注射。

本发明的融合蛋白可用于预防目的。如本文所用，术语“预防性治疗”是指在流血事件之前施用分子。在一个实施方案中，需要一般性止血剂的受试者正经历或即将经历手术。本发明的融合蛋白可在手术之前或之后作为预防剂施用。本发明的融合蛋白可在手术期间或之后施用以控制急性出血事件。手术可包括但不限于肝移植、肝切除、牙科手术或干细胞移植。

本发明的融合蛋白也用于按需治疗。术语“按需治疗”是指响应于出血事件的症状或在可能导致出血的活动之前施用融合蛋白。在一方面，按需治疗在出血开始时(诸如在损伤之后)或在预期会出血时(诸如在手术之前)给与个体。在另一方面中，按需治疗在增加出血风险的活动(诸如接触性运动)之前给与。

在其他实施方案中，使用融合蛋白控制、改善或治疗急性出血事件。在其他实施方案中，与不含异源部分的相应FIX蛋白质相比，FIX融合蛋白展现一个或多个药物动力学参数。PK参数可基于FIX抗原水平(本文中常附带表示为“抗原”)或FIX活性水平(本文中常附带表示为“活性”)。由于一些受试者血浆中存在内源性无活性FIX，其干扰使用针对FIX的抗体测量所施用的(即外源性)FIX的能力，故在文献中，PK参数常基于FIX活性水平。然而，当将FIX作为如本文所提供的Fc融合蛋白的一部分施用时，所施用的(即外源性)FIX抗原可使用异源性多肽的抗体准确地测量。此外，某些PK参数可基于模型预测的数据(在本文中常附带表示为“模型预测的”)或观测的数据(在本文中常附带表示为“观测的”)，并且优选基于观测的数据。

FIX融合蛋白可通过本领域中已知的任何方式施用于受试者。举例而言，FIX融合蛋白可通过局部(例如经皮或眼部)、经口、经颊、经鼻、经阴道、经直肠或胃肠外(例如皮下、皮内、血管内/静脉内、肌肉内、经脊椎、经颅内、经鞘内、经眼内、眼周、眶内、滑膜内以及腹膜内注射)施用。在一个特定实施方案中，FIX融合蛋白通过皮下注射施用。皮下注射可包括一或多次推注，包括例如单次推注一个剂量的FIX融合蛋白。或者，FIX融合蛋白可通过静脉内注射施用。

FIX融合蛋白的剂量可根据特定融合蛋白的性质和受试者病状的性质而变化。在一些实施方案中，FIX融合蛋白的剂量可包含介于1与1000IU/kg之间的FIX融合蛋白。

出血病状可由凝血病症引起。凝血病症也可称为凝血病。在一个实例中，可用本发明的药物组合物治疗的凝血病症为血友病。在另一个实例中，可用本发明的药物组合物治疗的凝血病症为B型血友病。

在一些实施方案中，与出血病状相关的出血类型选自关节积血、肌肉出血、口腔出血、失血、肌肉内失血、口腔失血、创伤、头创伤、胃肠出血、颅内失血、腹内失血、胸内失血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙中出血、腹膜后间隙中出血以及髂腰肌鞘中出血。

在其他实施方案中，罹患出血病状的受试者需要手术治疗，包括例如手术预防或围手术期管理。在一个实例中，手术选自小手术和大手术。示例性手术程序包括拔牙、扁桃体切除术、腹股沟疝切开术、滑膜切除术、开颅术、骨缝合术、创伤手术、颅内手术、腹内手术、胸内手术、关节置换手术(例如全膝关节置换术、髋关节置换术及其类似置换手术)、心脏手术以及剖腹生产术。

在其他实例中，受试者用因子VIII并行治疗。因为本发明的化合物能够活化FIXa，所以其可用于在向受试者施用FIXa之前将FIXa多肽预活化。

本发明的方法可对需要预防性治疗或按需治疗的受试者实施。

包含本发明的FIX融合蛋白的药物组合物可被配制以用于任何适当施用方式，包括例如局部(例如经皮或眼部)、经口、经颊、经鼻、经阴道、经直肠或胃肠外施用。

如本文所用，术语胃肠外包括皮下、皮内、血管内(例如静脉内)、肌肉内、经脊椎、颅内、鞘内、眼内、眼周、眶内、滑膜内和腹膜内注射以及任何类似注射或输注技术。特定而言，包含本发明的FIX融合蛋白的药物组合物可被配制以用于皮下施用。组合物也可为例如悬浮液、乳液、持续释放制剂、乳膏剂、凝胶剂或散剂。组合物可用传统粘合剂和载剂(诸如三酸甘油酯)配制成栓剂。

在一个实例中，药物制剂为液体制剂，例如缓冲等张水溶液。在另一个实例中，药物组合物具有生理性或接近于生理性的pH值。在其他实例中，水性制剂具有生理性或接近于生理性的摩尔渗透压浓度和盐度。其可含有氯化钠和/或乙酸钠。在一些实例中，本发明的组合物被冻干。

本发明的融合蛋白可在哺乳动物(例如人类患者)体内体内产生，使用基因疗法方法来治疗由以下组成的组的出血疾病或病症将具有治疗上的益处：出血凝血病症、关节积血、肌肉出血、口腔出血、失血、肌肉内失血、口腔失血、创伤、头创伤、胃肠出血、颅内失血、腹内失血、胸内失血、骨折、中枢神经系统出血、咽后间隙中出血、腹膜后间隙中出血以及髂腰肌鞘中出血。在一个实施方案中，出血疾病或病症为血友病。在另一个实施方案中，出血疾病或病症为B型血友病。此方法涉及施用可操作地连接至适合表达控制序列的适合融合蛋白编码核酸。在某些实施方案中，这些序列并入到病毒载体中。适用于此基因疗法的病毒载体包括腺病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、艾伯斯坦巴尔病毒载体、乳多泡病毒载体(papovaviral vector)、牛痘病毒载体、单纯性疱疹病毒载体以及腺相关病毒(AAV)载体。病毒载体可为复制缺陷型病毒载体。在其他实施方案中，腺病毒载体在其E1基因或E3基因中具有缺失。当使用腺病毒载体时，哺乳动物可不暴露于编码可选择标记基因的核酸。在其他实施方案中，序列并入到本领域技术人员已知的非病毒载体中。

除非另外指示，否则本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，此类技术属于本领域的技能范围内。此类技术完整解释于文献中。参见例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版,Sambrook等人编,Cold Spring Harbor Laboratory Press:(1989)；MolecularCloning:A Laboratory Manual,Sambrook等人编,Cold Springs Harbor Laboratory,NewYork(1992),DNA Cloning,D.N.Glover编,第I和II卷(1985)；OligonucleotideSynthesis,M.J.Gait ed.,(1984)；Mullis等人,美国专利号4,683,195；Nucleic AcidHybridization,B.D.Hames&S.J.Higgins编(1984)；Transcription And Translation,B.D.Hames&S.J.Higgins编(1984)；Culture Of Animal Cells,R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,(1987)；Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press,(1986)；B.Perbal,APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；论文Methods In Enzymology,AcademicPress,Inc.,N.Y.；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,J.H.Miller和M.P.Calos编,Cold Spring Harbor Laboratory(1987)；Methods In Enzymology,第154和155卷(Wu等人编)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology,Mayer和Walker编,Academic Press,London(1987)；Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷,D.M.Weir和C.C.Blackwell编(1986)；Manipulating the Mouse Embryo,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；以及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)。

陈述免疫学的基本原理的参考文献包括Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York；Klein,J.,Immunology:The Science of Self-NonselfDiscrimination,John Wiley&Sons,New York(1982)；Roitt,I.,Brostoff,J.和Male D.,Immunology,第6版,London:Mosby(2001)；Abbas A.,Abul,A.和Lichtman,A.,Cellularand Molecular Immunology,第5版,Elsevier Health Sciences Division(2005)；以及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988)。

现已详细描述本发明，通过参考以下实施例将更明确地理解本发明，所述实施例仅出于说明目的包括于此且不意图限制本发明。

实施例

实施例1：鉴别活性FIX-XTEN变体

构建FIX融合蛋白，其包含FIX多肽和一个或多个XTEN插入以改善FIX蛋白质的活性。不过，可容易地改变XTEN修饰的位置、长度、组成和数量，并且可评价这些修饰对FIX活性和清除率的影响。

本实施例旨在鉴别FIX中可允许引入XTEN而不消除FIX活性的位点并且将此方法应用于其他未修饰的FIX和重组FIX-Fc融合蛋白。

方法

在紧邻编码起始Met残基的ATG密码子5'端引入Kozak翻译起始序列(GCCGCCACC)之后，将FIX多肽编码序列连接至表达载体pcDNA4/myc-His C(INVITROGEN^TM,Carlsbad,CA)中的BsiWI与PmeI位点之间。

使用聚乙烯亚胺(PEI,Polysciences Inc.,Warrington,PA)，用质粒转染HEK293F细胞(INVITROGEN^TM,Carlsbad,CA)。使瞬时转染的细胞在FREESTYLE^TM 293培养基或FREESTYLE^TM 293与CDOPTICHO^TM培养基(INVITROGEN^TM,Carlsbad,CA)的混合物中生长。在转染5天后，收集细胞培养基并通过发色测定或aPTT FIX活性测定来分析FIX活性。

使用来自Aniara的BIOPHEN因子IX试剂盒测量发色FIX活性且在震荡下在37℃板加热器上进行所有孵育。使用Tris-BSA稀释缓冲液(R4)将从6孔板中含FIX-XTEN变体的瞬时转染培养基收集的细胞培养物稀释至所需FIX活性范围。也在Tris-BSA稀释缓冲液中制备FIX标准物。将标准物、稀释的细胞培养物样品和合并的正常人类血浆测定对照物(50微升/孔)一式两份添加至2HB 96孔培养板中。将人类因子X、FVIII:C和纤维蛋白聚合抑制剂(50μL)、50μL的因子XIa与凝血酶、磷脂和钙的混合物以及50μL因子Xa特异性发色底物(SXa-11)依次添加至每一孔中，其中在每次添加之间孵育2分钟。在与底物一起孵育之后，添加50μL 20％乙酸以终止显色反应，并且用plus(MOLECULAR)仪器测量在405nm下的吸光度。使用Pro软件(5.2版)进行数据分析。

采用一级部分活化促凝血酶原激酶时间(aPTT)凝固测定来评估FIX活性。使用CA-1500仪器(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.,Tarrytown,NY)测量FIX-XTEN aPTT活性。为了建立所述测定的标准曲线，用具有匹配的培养基浓度的模拟转染培养基作为测试样品稀释WHO因子IX标准物。使用模拟转染培养基将从6孔板中含FIX-XTEN变体的瞬时转染培养基收集的细胞培养物稀释至所需FIX活性范围。在稀释之后，使用Sysmex仪器如下进行aPTT分析：将50μl稀释的标准物和样品与50μl Siemens人类FIX清除的血浆混合并且接着与50μl Siemens Actin FSL(鞣花酸)活化剂混合。孵育混合物1分钟。随后，将50μl Siemens CaCl₂添加至混合物中并孵育所述混合物240秒。在此孵育之后立即测量凝结时间。为了测定测试样品的FIX活性，使用log标度绘制标准物的凝结时间曲线以外推凝结时间与FIX活性之间的等式，并且接着针对所述标准曲线计算FIX-XTEN活性。

选择插入位点

分析来自Protein Data Bank的FIX结构1PFX、1IXA、1CFI、1CFH,1EDM、3LC3、3LC5、1RFN、1X7A以及3KCG，以选出FIX中供XTEN插入的位点。由于GLA结构域在将FIX锚定于磷脂表面和内皮下IV型胶原蛋白方面的重要作用，避免将XTEN插入在GL A结构域内。通过结合以下标准分析Protein Data Bank中的可用FI X结构来选择XTEN插入位点：1)通过算法软件ASA View(http://www.abren.net/asaview/)和Get Area(http://curie.utmb.edu/getarea.htm l)计算的可及表面积；2)通过氢/氘交换质谱法(H/DX-MS)评估的溶剂可及性；3)排除确定的二级结构元件内的位点；4)优先选择具有显著物种间蛋白质序列变化性的位置；以及5)排除邻近已知B型血友病突变的位点。

选出EGF1结构域中的四个位点、EGF2结构域中的5个位点、在AP结构域与EGF2结构域之间的接头区中的2个位点、AP(活化肽)结构域中的4个位点以及催化结构域中的18个位点以插入XTEN(表6)。

表6：供XTEN插入到FIX中的可能位点(插入在指定残基的c末端)

42个氨基酸的XTEN插入和C末端融合的活性筛选

使用高活性FIX Padua变体(R338L)作为支架以计算由引入XTEN引起的活性降低导致的潜在FIX活性损失。将42个残基的XTEN元件(AE42)插入在使用以上标准选择的位点或融合在FIX的C末端。在含转染的HEK293细胞的条件培养基中评价如以上所描述的这些变体的FIX活性。FIX-AE42的FIX活性以不含XTEN的基础构建体FIX-R338L的百分比示出(图1)。

如通过FIX发色测定所测定，在有限位点处容许插入XTEN(图1和表7)。选出FIX中总计33个位点并通过插入AE-42进行评价。其中，EGF2结构域中的两个、在EGF2结构域与AP结构域之间的接头区中的一个、AP结构域中的四个和催化结构域中的四个(包括C末端在内)通过FIX活性测定鉴别为容许的位点(图1和表7)。

表7：示例性FIX插入位点

注意：ND＝未检测到活性；(+)＝检测到低于30％的活性；(++)＝检测到介于30％与70％之间的活性；并且(+++)＝检测到大于70％活性，均以基础构建体的百分比计，通过发色测定检测(参见图5A-5C和6A-6B)。

较长XTEN插入和C末端融合的活性

接着，以类似方式测试在显示容许AE42插入的位点处的较长XTEN(AE-72、AE-144和AE-288)。如先前所描述测定FIX活性并且以不含XTEN的基础构建体FIX-R338L的百分比显示(图2)。

仅AP中的位点以及在FIX的C末端处或其附近的位点容许较长XTEN(AE144、AE288或AE864)(图2)。在条件培养基中检测到的FIX活性与引入的XTEN的长度反相关(图2，表7)。选出FIX的不同结构域中的四个容许插入位点以产生组合文库。

多个XTEN插入

基于用单一XTEN变体得到的结果，通过aPTT测定，在含转染的HEK293细胞的条件培养基中评价在四个不同位置(参见图4和表8)插入多个长度不同的XTEN的FIX变体的FIX活性(表8-10)。FIX活性以不含XTEN的基础构建体FIX-R338L的百分比显示(图4)。

表8：示例性FIX双插入

注意：ND＝未检测到活性；(+)＝检测到低于30％的活性；(++)＝检测到介于30％与70％之间的活性；并且(+++)＝检测到超过70％活性，均以基础构建体的百分比计，通过发色测定检测(参见图8A-8C)。

表9：插入到每个结构域中的XTEN元件

表10：以单个、两个、三个和四个的组合形式插入的构建体的总数

组合	#构建体
		单个	9
两个	27
		三个	31
四个	12
			总计79

三个组，即具有单一XTEN的FIX、插入两个XTEN的FIX和插入单个XTEN的FIX-Fc，显示可检测的活性，而在三个或更多个位点处插入/融合的组合消除FIX活性(图4)。

总之，在FIX中存在若干容许XTEN插入的位点并且选定的XTEN插入变体组合保持FIX活性。此处鉴别的活性FIX-XTEN变体为在B型血友病小鼠中进行药物动力学表征的候选物。

实施例2：FIX融合蛋白以及其血浆回收率和AUC/D

因子IX缺陷型(HemB,B6.129P2-F9tm1Dws/J,MGI:1932297)小鼠(Lin.等人,1997)最初从Dr.Darrel Stafford(University of North Carolina,Chapel Hill)得到。在t＝0小时，以10mL/kg的剂量体积通过单次静脉内推注对雄性/雌性HemB小鼠分别静脉内注射50或200IU/kg FIX融合蛋白(例如FIX-CT.288(AE288XTEN与FIX多肽的C末端融合)、FIX-CT.864(AE864 XTEN与FIX多肽的C末端融合)、FIX-AP.144(AE144 XTEN插入在FIX多肽的AP结构域内的D166后)、FIX-AP.72(AE72 XTEN插入在FIX多肽的AP结构域内的D166后)、FIX-AP.42(AE42 XTEN插入在FIX多肽的AP结构域内的D166后)、FIXFc以及FIX)。在给药后5分钟至给药后168小时(7天)，收集血液。对于每一指定时间点，通过眶后或末段大静脉抽血每一时间点从3-4只小鼠收集约100μl柠檬酸盐血液。每只小鼠产生最多3个时间点。通过以5000rpm离心8分钟来分离血浆，并且在干冰乙醇浴中速冻血浆样品，并在-80℃下储存，直至在Sysmex-CA1500凝固分析仪上，使用Dade Behring试剂和肌动蛋白FSL作为活化剂并适应给药物质作为活性标准物，利用一级部分活化促凝血酶原激酶时间(aPTT)测定对其进行分析。在图5A-5B中，将血浆活性随注射剂量％变化作图。使用非房室模型，利用PhoenixWinNonlin 6.2.1(Pharsight,Certera by NCA analysis)计算平均滞留时间(MRT)和其他药物动力学(PK)参数。图5C描绘相对血浆回收率(Y轴)相对于MRT(X轴)的变化。加点区域表示剂量曲线下面积(AUC/D，以h/kg/mL计)并且显示，FIX血浆活性回收率和AUC/D随XTEN长度增加而增加(图5C)。所述图显示，具有增加的XTEN长度(在C末端处288和864或者在AP结构域中144、72和42)的FIX融合蛋白在静脉内推注给药后展现血浆回收率最多达60％的尺寸依赖性增加和AUC/D增加。

实施例3：FIX融合蛋白及其半衰期

对FIX缺陷型小鼠静脉内给与50或200IU/kg以下FIX融合蛋白：FIX与具有288个氨基酸的XTEN(例如AE288)的融合物；其中具有72个氨基酸的XTEN(例如AE72)插入在AP结构域的D166后的FIX-Fc；其中具有42个氨基酸的XTEN(例如AE42)插入在AP结构域的D166后的FIX-Fc；以及对照物(FIXFc和FIX)。收集血浆并以与实施例5所述的方法相同的方式进行FIX活性和PK分析。图6A绘出血浆活性随注射剂量％的变化。使用WinNonlin 6.2.1(Pharsight,Certera by NCA analysis)计算药物动力学(PK)参数并且图6B描绘相对血浆回收率(Y轴)相对于MRT(X轴)的变化。加点区域表示剂量曲线下面积(AUC/D，以h/kg/mL计)并且显示与FIX相比，在FIXFc的活化肽(AP)结构域中插入XTEN序列延长平均滞留时间使其长于单独的rFIXFc(图6B)。此外，血浆活性回收率和AUC/D随XTEN长度增加而提高(图6A-6B)。与rFIXFc相比，rFIX-CT.288(SEQ ID NO:226)和rFIXFc-AP.72(SEQ ID NO:151)的AUC/D分别提高3.4倍和4.5倍(图6A-6B)。这分别等效于当与静脉内给与的rFIX相比的8.5倍和14.5倍AUC/D提高(图6A-6B)。因此，与rFIX和rFIXFc相比，AP结构域中XTEN的插入与rFIXFc-R338L中Fc介导的半衰期延长的组合延长了半衰期并增加血浆回收率和AUC/剂量。

实施例4：通过皮下递送改善FIX融合蛋白的药物动力学。

在t＝0时，对FIX缺陷型小鼠皮下给与50或200IU/kg的以下FIX融合蛋白：FIX与288个氨基酸的XTEN(例如AE288)在C末端的融合物(FIX-CT.288)；在AP结构域中具有72个氨基酸的XTEN(例如AE72)的FIXFc(FIXFc-AP.72)；在EGF2结构域中具有42个氨基酸的XTEN(例如AE42)的FIXFc(例如FIXFc-EGF.42)；以及对照物(FIXFc和FIX)。收集血浆并以与实施例1中所述的方法相同的方式进行FIX活性和PK分析。图7A绘出血浆活性随注射剂量％的变化。使用WinNonlin 6.2.1(Pharsight,Certera by NCA analysis)计算药物动力学(PK)参数并且图7B描绘相对生物利用率(Y轴)相对于MRT(X轴)的变化。加点区域表示剂量曲线下面积(AUC/D，以h/kg/mL计)并且显示在rFIX的羧基末端融合XTEN多肽序列或在FIXFc的活化肽(AP)结构域或EGF2结构域中插入XTEN序列极大地改善FIX融合蛋白的皮下给药曲线(图7B)。在皮下给药的HemB小鼠中，与rFIXFc相比，rFIXFc-AP.72和rFIX-CT.288具有6至9倍的AUC/D改善、1.5至2倍的生物利用率改善和3至10倍的C_max/D改善。当与rFIX相比较时，FIXFc-AP.72和rFIX-CT.288与rFIX相比的药物动力学参数改善分别为28至40倍的AUC/D改善、3倍的生物利用率增加和15至30倍的C_max/D改善(图7A-7B)。

总体而言，当与静脉内给与rFIXFc相比较时，FIX融合蛋白(例如rFIX-CT.288和rFIXFc-AP.72)对于皮下给与显示2.6倍和1.9倍的AUC/D改善，rFIXFc在人类中支持每周一次或更不频繁的静脉内给药以用于预防目的。

实施例5：FIX融合蛋白的体外功效

向人B型血友病血液中加入指定剂量3、10和30IU/dL的rFIXFc(空心圆圈、点划线)或FIX融合蛋白(例如rFIXFc-AP.72)(实心点、实线)或媒介物(空心三角形)(图8A-8C)。使用旋转式血栓弹力测定法(ROTEM)测定全血凝结特征并且通过使血液再钙化(NATEM)来开始凝固。在B型血友病血液中，rFIXFc-AP.72在凝结时间(CT，以秒计)、α角(以度计)和最大凝块强度(MCF，以mm计)方面显示与rFIXFc相比类似的活性(图8A-8C)。每一时间点的数据为4至5个重复样品的平均值+/-标准差(图8A-8C)。

与rFIX和rFIXFc相比，rFIXFc-AP.72和rFIX-CT.288在HemB小鼠中显示皮下药物动力学的极大改善。正在进行其他研究以了解在临床前动物模型中的功效和异速生长尺度规律。

实施例6：rFIXFc-AP.72在急性鼠类尾截割出血模型中的体内功效

如先前所描述(Dumont等人,Blood,119(13):3024–3030,2012)，在失明鼠类尾截割出血模型中研究急性功效，其中在尾尖切断术后测量给药小鼠的总失血量。简言之，用50mg/kg克他命(ketamine)和0.5mg/kg右美托咪定(dexmedetomidine)的混合液麻醉8-15周龄雄性B型血友病小鼠(Lin等人,Blood(1997)90:3962-3966)。将尾部浸入在37℃生理盐水中10分钟，以使侧静脉扩张，随后对尾静脉静脉内注射50、100和200IU/kg的媒介物(3.88g/L L-组氨酸、23.8g/L甘露糖醇、11.9g/L蔗糖、3.25g/L氯化钠、0.01％(w/v)聚山梨醇酯20(pH7.1)、3％人血清白蛋白)、rFIXFc-AP.72或rFIXFc。给药后5分钟，截割尾部远端5mm的尾尖，并将其浸没于含有13mL生理盐水的预先称重的管中，保持30分钟的时间段。通过重量定量失血量。使用非成对双尾t检验，在GraphPad Prism 6中计算统计学显著性。此类双尾t检验显示，50、100和200IU/kg剂量的rFIXFc-AP.72与媒介物显著不同(p值<0.0001)。此外，数据显示，较低剂量(例如50IU/kg)的rFIXFc-AP.72使失血量与相同低剂量(即50IU/kg)的rFIXFc相比显著降低。这些结果证实，在此出血模型中，与rFIXFc相比，rFIXFc-AP.72具有相同或改善的急性功效。

实施例7：FIXFc-AP.72在预防性鼠类尾静脉切断出血模型中的体内

功效

如先前所描述(Toby等人,PLOS One,DOI:10.1371/journal.pone.0148255,2016；Pan等人,Blood 114:2802-2822(2009))，在失明鼠类尾静脉切断(TVT)出血模型中研究长期功效，其中在切断单侧尾静脉之后测量给药的B型血友病小鼠的存活时间。简言之，对8-15周龄雄性B型血友病小鼠(Lin等人,Blood 90:3962-3966(1997))静脉内预先给与含15、50、100IU/kg FIX活性的rFIXFc或相配皮下剂量的FIXFc-AP.72，并与接受推注剂量媒介物的小鼠相比较。给药后72小时，将所有小鼠麻醉，并在2.7mm尾直径处切断单侧尾静脉。紧接着TVT后9至11小时期间并且随后在24小时的隔夜时间点，监测并每小时记录定性终点，包括再出血和死亡时间(定义为实施安乐死的时间，如在动物濒死时测定)。在24小时研究结束时，对所有小鼠实施安乐死，同时确定未死亡或濒死的动物在24小时后存活。

使用GraphPad Prism 6将数据对在TVT之后的存活率百分比作图。向小鼠皮下给与媒介物(点划线)、皮下给与FIXFc-AP.72(实线，实心符号)或静脉内给与FIXFc(虚线，空心符号)(15IU/kg、50IU/kg、100IU/kg；n＝20只/剂，媒介物剂量除外；n＝30)(图10)。用相配IU/kg剂量皮下给与FIXFc-AP.72相对于静脉内给与rFIXFc进行治疗的小鼠的存活曲线显示，皮下给与FIXFc-AP.72的HemB小鼠在所有测试剂量下的存活率与等效静脉内给与rFIXFc相比有所改善(图10)。

实施例8：在HemB小鼠中FIXFc-AP.72(FIX-216，双链Fc)与rFIX相比的静脉内和皮下药物动力学参数改善。

向B型血友病小鼠给与200IU/kg FIXFc-AP.72(FIX-216，双链Fc)或rFIX。在指定时间，通过眶后出血来收集血液。使用给药物质作为活性标准物，通过一级凝血测定活性来测定血浆FIX水平。在图11A中，将血浆活性对注射剂量％作图。图11B显示使用PhoenixWinNonLin 6.2.1(Pharsight,Certara)，通过NCA(非房室)分析计算的药物动力学参数的表格。对于FIX-216相对于rFIX所示出的药物动力学参数的改善包括平均滞留时间(MRT)、AUC/剂量和其他参数。

皮下给与FIXFc-AP.72显示在小鼠中给药后约20小时为t_max，并且血浆活性剂水平与类似(IU/kg)静脉内给与的rFIX或rFIXFc相比有所改善。在HemB小鼠中使用TVT出血模型显示，在给药后72小时，皮下给与FIXFc-AP.72在所有测试剂量下的体内功效与静脉内给与rFIXFc相比有所改善。类似地，在HemB小鼠尾截割出血模型中进行的急性功效测试显示，静脉内给与FIXFc-AP.72的功效与rFIXFc相比有所改善。这些数据支持在人类中每周一次或更不频繁的皮下预防性给与FIXFc-AP.72的潜力。

具体实施方案的前文描述将充分地揭露本发明的一般性质，以使得其他人通过应用本领域中的知识，在无不当实验且不背离本发明的一般概念的情况下，可轻易地针对各种应用修改和/或改变这些特定实施方案。因此，基于本文呈现的教导和指导，这些改变和修改意图处于所公开实施方案的等效物的含义和范围内。应理解，本文的措辞或术语出于描述而非限制的目的，以使得本说明书的术语或措辞应由本领域技术人员根据教导和指导进行解释。

由本文所公开的本发明的说明书和实践的考虑，本发明的其他实施方案对本领域技术人员而言将为显而易见的。意图仅将说明书和实施例视为示例性的，并且本发明的真实范围和精神通过以下权利要求书指示。

本申请要求2015年8月3日提交的美国临时申请号62/200,590和2016年1月22日提交的62/281,993的权益，其以引用的方式整体并入本文中。

实施方案

E1.一种因子IX(FIX)融合蛋白，其包含FIX多肽和至少一个XTEN，所述XTEN插入在所述FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:2的氨基酸103、SEQ ID NO:2的氨基酸105、SEQ ID NO:2的氨基酸142、SEQ ID NO:2的氨基酸149、SEQID NO:2的氨基酸162、SEQ ID NO:2的氨基酸166、SEQ ID NO:2的氨基酸174、SEQ ID NO:2的氨基酸224、SEQ ID NO:2的氨基酸226、SEQ ID NO:2的氨基酸228、SEQ ID NO:2的氨基酸413及其任何组合，并且其中所述FIX融合蛋白展现促凝血活性。

E2.如E1所述的FIX融合蛋白，其中所述插入位点对应于选自由以下组成的组的氨基酸：SEQ ID NO:2的氨基酸149、SEQ ID NO:2的氨基酸162、SEQ ID NO:2的氨基酸166、SEQID NO:2的氨基酸174及其任何组合。

E3.如E1或E2所述的FIX融合蛋白，其中所述插入位点对应于选自由以下组成的组的氨基酸：SEQ ID NO:2的氨基酸224、SEQ ID NO:2的氨基酸226、SEQ ID NO:2的氨基酸228、SEQ ID NO:2的氨基酸413及其任何组合。

E4.如E1至E3中任一项所述的FIX融合蛋白，其中所述插入位点对应于选自由以下组成的群的氨基酸：SEQ ID NO:2的氨基酸103、SEQ ID NO:2的氨基酸105和二者。

E5.如E1至E4中任一项所述的FIX融合蛋白，其中所述插入位点对应于SEQ ID NO:2的氨基酸142。

E6.如E1至E5中任一项所述的FIX融合蛋白，其中所述XTEN包含至少约6个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约36个氨基酸、至少约42个氨基酸、至少约72个氨基酸、至少约144个氨基酸或至少约288个氨基酸。

E7.如E1至E6中任一项所述的FIX融合蛋白，其中所述XTEN包含AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144或其任何组合。

E8.如E1至E7中任一项所述的FIX融合蛋白，其中所述XTEN包含与选自由以下组成的组的氨基酸至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53及其任何组合。

E9.如E7或E8所述的FIX融合蛋白，其中所述XTEN包含AE72或AE144。

E10.如E1至E9中任一项所述的FIX融合蛋白，其还包含第二XTEN。

E11.如E10所述的FIX融合蛋白，其中所述第二XTEN插入在所述FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:2的氨基酸103、SEQ ID NO:2的氨基酸105、SEQ ID NO:2的氨基酸142、SEQ ID NO:2的氨基酸149、SEQ ID NO:2的氨基酸162、SEQ ID NO:2的氨基酸166、SEQ ID NO:2的氨基酸174、SEQ ID NO:2的氨基酸224、SEQ IDNO:2的氨基酸226、SEQ ID NO:2的氨基酸228、SEQ ID NO:2的氨基酸413及其任何组合，或者其中所述第二XTEN与所述FIX多肽的C末端融合或融合至与所述FIX多肽的C末端融合的接头。

E12.如E10或E11所述的FIX融合蛋白，其中所述XTEN和所述第二XTEN分别插入在所述FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点和/或与所述FIX多肽的C末端融合：

i.SEQ ID NO:2的氨基酸105和SEQ ID NO:2的氨基酸166；

ii.SEQ ID NO:2的氨基酸105和SEQ ID NO:2的氨基酸224；

iii.SEQ ID NO:2的氨基酸105和与所述C末端融合；

iv.SEQ ID NO:2的氨基酸166和SEQ ID NO:2的氨基酸224；

v.SEQ ID NO:2的氨基酸166和与所述C末端融合；以及

vi.SEQ ID NO:2的氨基酸224和与所述C末端融合。

E13.如E10或E11所述的FIX融合蛋白，其中所述XTEN插入在所述FIX多肽内对应于SEQ ID NO:2的氨基酸166的插入位点，并且其中所述第二XTEN与所述FIX多肽的C末端融合。

E14.如E10至E13中任一项所述的FIX融合蛋白，其中所述第二XTEN包含至少约6个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约36个氨基酸、至少约42个氨基酸、至少约72个氨基酸、至少约144个氨基酸或至少约288个氨基酸。

E15.如E10至E14中任一项所述的FIX融合蛋白，其中所述第二XTEN选自由以下组成的组：AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144及其任何组合。

E16.如E15所述的FIX融合蛋白，其中所述第二XTEN为AE72或AE144。

E17.如E10至E16中任一项所述的FIX融合蛋白，其中所述第二XTEN包含与选自由以下组成的组的氨基酸至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53及其任何组合。

E18.如E10至E17中任一项所述的FIX融合蛋白，其还包含第三、第四、第五或第六XTEN。

E19.一种FIX融合蛋白，其包含FIX多肽和包含XTEN的异源部分，其中所述XTEN与所述FIX多肽的C末端融合并且包含长度长于42个氨基酸且短于144个氨基酸的氨基酸序列。

E20.如E19所述的FIX融合蛋白，其中所述XTEN包含长于50、55、60、65或70个氨基酸且短于140、130、120、110、100、90或80个氨基酸或其任何组合的氨基酸序列。

E21.如E20所述的FIX融合蛋白，其中所述XTEN的长度为72个氨基酸。

E22.如E21所述的FIX融合蛋白，其中所述XTEN为AE72。

E23.如E19所述的FIX融合蛋白，其中所述XTEN包含与SEQ ID NO:35至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。

E24.如E1至E23中任一项所述的FIX融合蛋白，其还包含Fc结构域。

E25.如E24所述的FIX融合蛋白，其中所述Fc结构域与所述FIX多肽或所述XTEN融合。

E26.如E24或E25所述的FIX融合蛋白，其包含第二Fc结构域。

E27.如E26所述的FIX融合蛋白，其中所述第二Fc结构域与所述第一Fc结构域缔合。

E28.如E26或E27所述的FIX融合蛋白，其包含两条多肽链，其中所述第一多肽链包含与所述Fc结构域融合的所述FIX多肽，并且所述第二多肽链包含所述第二Fc结构域，其中所述第一Fc结构域与所述第二Fc结构域通过共价键缔合。

E29.如E26或E27所述的FIX融合蛋白，其为单一多肽链，所述多肽链包含所述FIX多肽、所述Fc结构域、所述第二Fc结构域以及连接所述Fc结构域与所述第二Fc结构域的接头。

E30.如E29所述的FIX融合蛋白，其中所述接头还包含一个或多个细胞内加工位点。

E31.如E29或E30所述的FIX融合蛋白，其中所述接头包含(Gly₄Ser)_n，其中n为选自1至100的整数。

E32.如E1至E31所述的FIX融合蛋白，其包含与选自由不含信号肽和前肽序列的SEQ ID NO:54至SEQ ID NO:153组成的组的序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。

E33.如E1至E32中任一项所述的FIX融合蛋白，其具有原生FIX的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或100％的促凝血活性。

E34.如E33所述的FIX融合蛋白，其中所述促凝血活性通过发色底物测定、单极凝血测定或两者测量。

E35.如E1至E34中任一项所述的FIX融合蛋白，其中所述FIX多肽为R338L FIX变体。

E36.如E35所述的FIX融合蛋白，其中所述R338L FIX变体包含与SEQ ID NO:2至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列。

E37.一种分离的多核苷酸，其包含编码如E1至E36中任一项所述的FIX融合蛋白的序列。

E38.一种表达载体，其包含如E37所述的多核苷酸。

E39.一种宿主细胞，其包含如E37所述的多核苷酸或如E38所述的载体。

E40.如E39所述的宿主细胞，其中所述FIX融合蛋白在体内表达。

E41.如E39所述的宿主细胞，其中所述FIX融合蛋白在体外表达。

E42.一种产生FIX融合蛋白的方法，其包括在使所述FIX融合蛋白表达的条件下培养如E39所述的宿主细胞。

E43.一种组合物，其包含如E1至E36中任一项所述的FIX融合蛋白、如E37所述的多核苷酸、如E38所述的表达载体或如E39至E41中任一项所述的宿主细胞以及医药学上可接受的载剂。

E44.一种预防、治疗、改善或管理有需要患者的凝血性疾病或病状的方法，其包括施用有效量的如E1至E36中任一项所述的FIX融合蛋白、如E37所述的多核苷酸、如E38所述的表达载体、如E39至E41中任一项所述的宿主细胞或如E43所述的组合物。

E45.如E44所述的方法，其中所述施用包括向所述患者皮下施用。

E46.一种用于对受试者的凝血性疾病或病状进行诊断或成像的方法，其包括使如E1至E36中任一项所述的FIX融合蛋白、如E37所述的多核苷酸、如E38所述的表达载体或如E39至E41中任一项所述的宿主细胞与所述受试者的样品接触。

E47.一种延长FIX多肽的半衰期的方法，其包括将XTEN插入在所述FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:2的氨基酸103、SEQ ID NO:2的氨基酸105、SEQ ID NO:2的氨基酸142、SEQ ID NO:2的氨基酸149、SEQ ID NO:2的氨基酸162、SEQ ID NO:2的氨基酸166、SEQ ID NO:2的氨基酸174、SEQ ID NO:2的氨基酸224、SEQ IDNO:2的氨基酸226、SEQ ID NO:2的氨基酸228、SEQ ID NO:2的氨基酸413及其任何组合，由此构建FIX融合蛋白，其中所述FIX蛋白展现促凝血活性。

E48.一种因子IX(FIX)融合蛋白，其包含第一链和第二链，其中：

a.所述第一链包含：

i.FIX多肽；

ii.至少一个XTEN，其中所述至少一个XTEN插入在所述FIX多肽内对应于SEQ IDNO:2的氨基酸166的插入位点，并且其中所述至少一个XTEN包含具有至少约72个氨基酸的氨基酸序列；以及

iii.第一Fc结构域，其中所述第一Fc结构域与所述FIX多肽中的所述至少一个XTEN融合；并且

b.所述第二链包含第二Fc结构域

其中所述第一Fc结构域与所述第二Fc结构域通过共价键缔合；并且其中所述FIX融合蛋白展现促凝血活性。

E49.如E48所述的FIX融合蛋白，其中所述至少一个XTEN包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。

E50.如E48或E49所述的FIX融合蛋白，其中所述FIX融合蛋白的所述第一链包含与SEQ ID NO:227的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列；并且其中所述FIX融合蛋白的所述第二链包含与SEQ ID NO:228的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。

E51.如E48至E50中任一项所述的FIX融合蛋白，其中所述FIX融合蛋白的所述第一链包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列；并且其中所述FIX融合蛋白的所述第二链包含SEQ IDNO:228的氨基酸序列。

前述实施例和本申请其他位置提及以下载体序列。以下关键词将有助于理解信息：

关键词：

信号肽(前肽)

前肽

具有或不具有蛋白质标签的接头

裂解位点

XTEN和/或Fc的插入或融合

Claims

1.一种因子IX(FIX)融合蛋白，其包含FIX多肽和至少一个XTEN，所述XTEN插入在所述FIX多肽内对应于选自由以下组成的组的氨基酸的插入位点：SEQ ID NO:2的氨基酸103、SEQ ID NO:2的氨基酸105、SEQ ID NO:2的氨基酸142、SEQ ID NO:2的氨基酸149、SEQ IDNO:2的氨基酸162、SEQ ID NO:2的氨基酸166、SEQ ID NO:2的氨基酸174、SEQ ID NO:2的氨基酸224、SEQ ID NO:2的氨基酸226、SEQ ID NO:2的氨基酸228、SEQ ID NO:2的氨基酸413及其任何组合，并且其中所述FIX融合蛋白展现促凝血活性。

2.如权利要求书1所述的FIX融合蛋白，其中所述插入位点对应于选自由以下组成的组的氨基酸：SEQ ID NO:2的氨基酸149、SEQ ID NO:2的氨基酸162、SEQ ID NO:2的氨基酸166、SEQ ID NO:2的氨基酸174及其任何组合。

3.如权利要求书1或2所述的FIX融合蛋白，其中所述XTEN包含至少约5个氨基酸、至少约6个氨基酸、至少约12个氨基酸、至少约36个氨基酸、至少约42个氨基酸、至少约72个氨基酸、至少约144个氨基酸或至少约288个氨基酸。

4.如权利要求书1至3中任一项所述的FIX融合蛋白，其还包含第二XTEN。

5.如权利要求书4所述的FIX融合蛋白，其中所述XTEN插入在所述FIX多肽内对应于SEQID NO:2的氨基酸166的插入位点，并且其中所述第二XTEN与所述FIX多肽的C末端融合。

6.如权利要求书1至5中任一项所述的FIX融合蛋白，其还包含Fc结构域。

7.如权利要求书6所述的FIX融合蛋白，其包含第二Fc结构域。

8.如权利要求书7所述的FIX融合蛋白，其包含两条多肽链，其中所述第一多肽链包含所述FIX多肽与所述Fc结构域的融合物，并且所述第二多肽链包含所述第二Fc结构域，其中所述第一Fc结构域与所述第二Fc结构域通过共价键缔合。

9.如权利要求书1至8中任一项所述的FIX融合蛋白，其中所述FIX多肽为R338L FIX变体。

10.一种分离的多核苷酸，其包含编码如权利要求书1至9中任一项所述的FIX融合蛋白的序列。

11.一种表达载体，其包含如权利要求书10所述的多核苷酸。

12.一种宿主细胞，其包含如权利要求书10所述的多核苷酸或如权利要求书11所述的载体。

13.一种组合物，其包含如权利要求书1至9中任一项所述的FIX融合蛋白、如权利要求书10所述的多核苷酸、如权利要求书11所述的表达载体或如权利要求书12所述的宿主细胞以及医药学上可接受的载剂。

14.一种预防、治疗、改善或管理有需要患者的凝血性疾病或病状的方法，其包括施用有效量的如权利要求书1至9中任一项所述的FIX融合蛋白、如权利要求书10所述的多核苷酸、如权利要求书11所述的表达载体、如权利要求书12所述的宿主细胞或如权利要求书13所述的组合物。

15.一种因子IX(FIX)融合蛋白，其包含第一链和第二链，其中：

a.所述第一链包含：

i.FIX多肽；

ii.至少一个XTEN，其中所述至少一个XTEN插入在所述FIX多肽内对应于SEQ ID NO:2的氨基酸166的插入位点，并且其中所述至少一个XTEN包含具有至少约72个氨基酸的氨基酸序列；以及

iii.第一Fc结构域，其中所述第一Fc结构域与所述FIX多肽中所述至少一个XTEN融合；并且

b.所述第二链包含第二Fc结构域