KR20090008329A - 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법 - Google Patents

치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비변형된 모 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 생체내 회수율을 갖는 변형된 치료용 폴리펩타이드 분야에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 직접 연결되거나 또는 임의로 링커(linker) 펩타이드에 의해 연결된, 치료용 폴리펩타이드와 회수 향상용 폴리펩타이드와의 융합에 관한 것이다.
치료용 폴리펩타이드, 생체내 회수율, 회수 향상용 단백질, 링커 펩타이드, 비타민 K 의존성 단백질

Description

치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법{Method of increasing the in vivo recovery of therapeutic polypeptides}
본 발명은 비변형된 모 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 생체내 회수율을 갖는 변형된 치료용 폴리펩타이드 분야에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 직접 연결되거나 또는 임의로 링커(linker) 펩타이드에 의해 연결된, 치료용 폴리펩타이드와 회수 향상용 폴리펩타이드와의 융합에 관한 것이다.
본 발명의 요지는 특히 치료용 폴리펩타이드로서의 비타민 K 의존성 폴리펩타이드, 예를 들면, 사람 인자 VII, 사람 인자 VIIa, 사람 인자 IX 및 사람 단백질 C, 및 회수 향상용 폴리펩타이드로서의 알부민에 의해 증명된다. 그러므로, 특히, 본 발명은 임의의 비타민 K 의존성 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 서열, 및 개재(intervening) 펩타이드 링커를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드에 의해 연결될 수 있는 사람 혈청 알부민을 암호화하는 cDNA에 유전적으로 융합된 유도체, 향상된 생체내 회수율을 나타내는 이러한 암호화된 유도체, 이러한 cDNA 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 생물학적 활성은 비변형된 야생형 폴리펩타이드와 유사하지만 생체내 회수율은 향상된 재조합 폴리펩타이드 및 유도체, 및 이러한 재조합 폴리펩타이드 및 이의 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생체내 생성물 수준을 증가시키는데 유용한 이러한 변형된 DNA 서열을 포함하는, 사람 유전자 치료에 사용하기 위한 전달 벡터(transfer vector)에 관한 것이다.
치료용 폴리펩타이드
본 발명의 관점에서 치료용 폴리펩타이드는 사람 또는 동물에게 적용시 예방 효과 또는 치료 효과를 나타낼 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 이러한 치료용 폴리펩타이드는 경구, 국소, 비경구 또는 다른 경로를 통해 사람 또는 동물에게 적용된다. 본 발명에 포함되는, 즉 실시예에 의해 포함되는 치료용 폴리펩타이드의 구체적인 부류는 혈장 유래형 또는 재조합형으로 어느 정도 시판되는 비타민 K 의존성 폴리펩타이드이다.
회수 향상용 폴리펩타이드
본 발명의 관점에서 회수 향상용 폴리펩타이드는 치료용 폴리펩타이드에의 융합시 융합물의 생체내 회수율을 비변형된 치료용 폴리펩타이드에 비해 증가시키는 모든 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 이러한 회수 향상용 폴리펩타이드의 구체적인 예로는 알부민, 이의 변이체 또는 단편, 및 면역글로불린, 이의 변이체 또는 단편이 있다.
생체내 회수율
생체내 회수율은 투여된 치료용 폴리펩타이드의 총량 대비, 투여 후 짧은 시간 (5 내지 10분) 후에 순환에서 검출가능한 치료용 폴리펩타이드의 %로서 정의된다. 순환 중의 치료용 폴리펩타이드의 예상 농도를 계산하기 위한 기준으로서, 일반적으로 혈장 용적은 1kg당 40mL로 추정한다.
융합 단백질 또는 융합 폴리펩타이드
본 발명의 관점에서 융합 단백질 또는 융합 폴리펩타이드는 치료용 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산과 회수 향상용 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자 작제물로부터 발현될 수 있는 단백질로서, 상기 작제물에서 상기 두 핵산은, 상기 유전자 작제물이 도입된 숙주 세포에서의 발현에 의해 회수 향상용 폴리펩타이드에 치료용 폴리펩타이드가 펩타이드 결합을 통해 연결되어 있는 단백질이 생산되도록 프레임내(in frame) 연결되어 있다. 임의로 치료용 폴리펩타이드 및 회수 향상용 폴리펩타이드는 짧은 펩타이드 링커를 통해 연결될 수도 있다.
비타민 K 의존성 폴리펩타이드
감마 카복실화에 의해 해독후 변형되는 비타민 K 의존성 폴리펩타이드에는, 예를 들면, 혈액 응고 인자 II(프로트롬빈), VII, IX 및 X, 항응고 단백질 C 및 S, 트롬빈 표적화 단백질 Z, 골 단백질 오스테오칼신, 석회화 억제 기질 단백질, 세포 성장 조절성 성장 정지 특이적 유전자 6 단백질(Gas6), 및 기능이 현재 알려져 있지 않은 4가지 막관통 Gla 단백질(TMGP)이 포함된다. 이러한 폴리펩타이드 중에서 일부는 특정 종류의 혈우병 및 출혈 장애를 치료하는데 사용된다. 혈우병 A는 유전적 출혈 장애이다. 이는 혈액 응고 인자 VIII의 X 염색체 관련 결핍증에 의해 발생하고 임상 증상은 증가된 출혈 경향이다. 이 질병은 혈장이나 재조합 급원으로부터의 FVIII 농축물의 주사에 의해 치료된다. 혈우병 B는 비기능성 또는 결손성 인자 IX에 의해 유발되고 혈장 유래의 인자 IX 농축물 또는 인자 IX의 재조합 형태에 의해 치료된다. 혈우병 A와 혈우병 B 둘 모두에서, 이 질병을 치료하는데 있어서 가장 심각한 의학적 문제점은 대체 인자(replacement factor)에 대한 동종항체(alloantibody)의 발생이다. 혈우병 A 환자 중 최대 약 30%는 인자 VIII에 대한 항체를 발생시킨다. 인자 IX에 대한 항체의 발생 빈도는 이보다 낮다.
현재의 응고 모델에서, 응고의 생리적 유발인자는 일반적으로 혈관구조의 외부에 위치해 있는 조직 인자(TF) 발현 세포의 표면에서의 TF와 인자 VIIa (FVIIa) 사이의 복합체의 형성이라고 말한다. 이것은 인자 IX와 인자 X의 활성화를 유도하여, 결국 어느 정도의 트롬빈이 생성된다. 양성 피드백 루프에서, 트롬빈은 혈액 응고 캐스케이드(cascade)의 소위 "내인성(intrinsic)" 암(arm)인 인자 VIII와 인자 IX를 직접 또는 간접적으로 활성화시킴으로써, 충분한 트롬빈 증가의 발생에 필요한 인자 Xa의 발생을 증폭시켜 완전한 지혈을 달성한다. 생리적 농도 이상의 인자 VIIa의 투여에 의해, 인자 VIIIa 및 인자 IXa의 필요성을 우회하면서 지혈을 달성할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 인자 VII의 cDNA의 클로닝[참조: 미국특허 제 4,784,950]은 약제로서의 활성화된 인자 VII의 개발을 가능하게 하였다. 인자 VIIa는 1988년에 최초로 성공적으로 투여되었다. 이후, 인자 VIIa의 적용 횟수는 꾸준히 증가하여 출혈을 멈추게 하는 만능 지혈제가 될 가능성을 나타내었다[참조: Erhardtsen, 2002]. 하지만, 인자 VIIa의 대략 2시간의 짧은 반감기와 감소된 생체내 회수율은 이의 적용을 제한한다.
인자 VII 및 인자 VIIa
FVII은 분자량이 50kDa인 단쇄 당단백질이고, 406개 아미노산의 불활성 자이모겐(zymogen)으로서 간세포에 의해 혈류로 분비된다. 이는 폴리펩타이드의 N-말단 Gla 도메인에 위치한 10개의 γ-카복시-글루탐산 잔기를 함유한다. Gla 잔기는 그 생합성에 비타민 K를 필요로 한다. Gla 도메인의 C-말단에는 2개의 상피 성장 인자 도메인이 위치하고, 그 다음에는 트립신형 세린 프로테아제 도메인이 위치한다. FVII의 추가의 해독후 변형에는 하이드록실화(Asp 63), N-(Asn145 및 Asn322) 뿐만 아니라 O형 글리코실화(Ser52 및 Ser60)가 포함된다.
FVII은 Arg152-Ile153에서 하나의 펩타이드 결합의 단백분해에 의해 활성 형태인 인자 VIIa로 전환되어, 2개의 폴리펩타이드 쇄인 N-말단 경쇄(24kDa)와 C-말단 중쇄(28kDa)가 형성되며, 이들은 하나의 이황화 가교에 의해 결합되어 있다. 다른 비타민 K 의존성 응고 인자와 달리, 이러한 다른 비타민 K 의존성 응고 인자의 활성화 동안 절단되는 활성화 펩타이드는 FVII의 경우에는 기술된 바 없다. 인자 VIIa의 활성 형태가 달성되는데 있어서 Ile153과 Asp343 사이의 활성화 절단 후 염가교의 형성이 필수적이다. 인자 VII의 활성화 절단은 인자 Xa, 인자 XIIa, 인자 IXa, 인자 VIIa, 인자 VII 활성화 프로테아제(FSAP) 및 트롬빈에 의해 시험관내에서 달성될 수 있다. 문헌[참조: Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. (1995) 48: 501-505]에는 중쇄의 Arg290 및/또는 Arg315에서도 약간의 절단이 일어난다는 것이 보고되었다.
인자 VII는 혈장 중에 약 500ng/ml의 농도로 존재한다. 인자 VII의 약 1% 또는 5ng/ml는 인자 VIIa로서 존재한다. 인자 VII의 혈장 반감기는 약 4시간이고 인자 VIIa의 혈장 반감기는 약 2시간인 것으로 밝혀졌다. 반감기가 2시간인 인자 VIIa는, 지혈을 달성하기 위해 수회의 정맥내 주사 또는 연속 주입을 필요로 하게 되므로, 인자 VIIa의 치료학적 사용에 있어서 심각한 단점으로 작용한다. 이는 매우 높은 치료비와 불편을 환자에게 초래한다. 혈장 반감기와 생체내 회수율 둘 모두의 개선은 환자에게 이로울 것이다. 현재까지, 생체내 회수율이 개선된 인자 VIIa의 약제는 시판된 적이 없고, 생체내 회수율이 향상된 FVII/FVIIa 변이체를 나타내는 어떠한 데이터도 공개된 적이 없다. 인자 VII/VIIa는 만능 지혈제로서 사용될 가능성이 있으므로, 생체내 회수율이 개선된 인자 VIIa의 형태의 의료상 개발 필요성은 여전히 높은 상태이다.
인자 IX
사람 FIX는 분자량이 57kDa인 단쇄 당단백질이고, 415개 아미노산의 불활성 자이모겐으로서 간세포에 의해 혈류로 분비된다. 이는 폴리펩타이드의 N-말단 Gla 도메인에 위치한 12개의 γ-카복시-글루탐산 잔기를 함유한다. Gla 잔기는 그 생합성에 비타민 K를 필요로 한다. Gla 도메인의 C-말단에는 2개의 상피 성장 인자 도메인 및 활성화 펩타이드가 위치하고, 그 다음에는 트립신형 세린 프로테아제 도메인이 위치한다. FIX의 추가의 해독후 변형에는 하이드록실화(Asp 64), N-(Asn157 및 Asn167) 뿐만 아니라 O형 글리코실화(Ser53, Ser61, Thr159, Thr169 및 Thr172), 황산화(Tyr155) 및 인산화(Ser158)가 포함된다.
FIX는 Arg145-Ala146 및 Arg180-Val181에서 활성화 펩타이드의 단백분해에 의해 활성 형태인 인자 IXa로 전환되어 2개의 폴리펩타이드 쇄인 N-말단 경쇄(18kDa)와 C-말단 중쇄(28kDa)가 형성되며, 이들은 하나의 이황화 가교에 의해 결합되어 있다. 인자 IX의 활성화 절단은, 예를 들면, 인자 XIa 또는 인자 VIIa/TF 인자에 의해 시험관내에서 달성될 수 있다.
인자 IX는 사람 혈장 중에 5 내지 10㎍/ml의 농도로 존재한다. 사람에서 인자 IX의 혈장 반감기는 약 15 내지 18시간인 것으로 밝혀졌다[참조: White GC et al. 1997. Thromb Haemost. 78: 2610265; Ewenstein BM et al. 2002. Transfusion 42: 190-197].
B형 혈우병 환자는 종종 자연 출혈을 방지하기 위해 인자 IX를 예방적 투여로서 격주로 받기 때문에, 투여된 인자 IX 산물의 생체내 회수율을 증가시켜 투여 간격을 감소시키는 것이 바람직하다. 혈장 반감기와 생체내 회수율 둘 모두의 개선은 환자에게 이로울 것이다. 현재까지, 혈장 반감기 또는 생체내 회수율이 개선된 인자 IX의 약제는 시판된 적이 없고, 연장된 생체내 반감기 및 향상된 생체내 회수율을 갖는 인자 IX 변이체를 나타내는 어떠한 데이터도 공개된 적이 없다. 따라서, 보다 긴 기능적 생체내 반감기 및/또는 향상된 생체내 회수율을 갖는 인자 IX의 형태의 의료상 개발 필요성은 여전히 높은 상태이다.
재조합 치료용 폴리펩타이드 약물은 보통 고가이며, 이러한 약물을 기초로 하는 고가의 치료법을 모든 국가에서 감당할 수는 없다. 이러한 약물의 생체내 회수율의 증가는 최신의 치료를 더욱 저렴한 상태로 만들 것이며, 이로 인해 더 많은 환자가 혜택을 받을 것이다.
문헌[참조: Ballance et al., 국제공개공보 제WO 01/79271호]에는 사람 혈청 알부민에의 융합시 증가된 기능적 생체내 반감기 및 연장된 보관수명을 가질 것으로 예상되는 다수의 상이한 치료용 단백질의 융합 폴리펩타이드가 기술되어 있다. 잠재적 융합 파트너의 많은 목록에서 거의 모든 단백질은 각각의 알부민 융합 폴리펩타이드가 실제로 생물학적 활성을 보유하고 향상된 특성을 나타낸다는 실험 데이터 없이 기술되어 있다. 상기 치료용 폴리펩타이드의 목록 중에는 인자 IX 및 인자 FVII/FVIIa도 발명의 예로서 언급되어 있다. 하지만, 상기 문헌에는 이러한 융합 단백질의 생체내 회수율에 대해서는 아무런 언급이 없다.
비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 생체내 회수율
B형 혈우병 환자에서, 재조합 FIX [베네픽스(BeneFIX), 판매원: Genetics Institute]의 생체내 회수율은 IU/kg당 0.84 내지 0.86IU/dL로서, 모노닌(Mononine)과 같은 혈장 유래 FIX의 생체내 회수율인 IU/kg당 1.17 내지 1.71 IU/dL보다 상당히 낮은 것으로 보고되었다[참조: White G et al., Semin Hematol 35(Suppl.2): 33-38(1998); Ewenstein B.M. et al., Transfusion 42(2): 190-197(2002)]. 따라서, 유사하게 효율적인 B형 혈우병 치료를 달성하기 위해서는 혈장 유래 FIX에 비해 20% 이상의 많은 양의 재조합 FIX를 투여해야 한다.
문헌[참조: Sheffield WP et al.(2004) Br. J. Haemotol. 126: 565-573]에는 사람 인자 IX 알부민 융합 폴리펩타이드가 발표되었고, FIX 녹아웃(knockout) 마우스에서 사람 FIX-알부민 융합 단백질의 생체내 회수율은 비융합된 사람 FIX 분자보다 상당히 낮다(절반 미만)는 것이 약동학적 실험에서 밝혀졌다.
재조합 FVIIa(NovoSeven, 판매원: Novo Nordisk)의 생체내 회수율은 FVII 결핍 환자에서 약 19 내지 22% [참조: Berrettini M et al. 2001. Baematologica 86: 640-645]이고, 혈우병 환자에서 약 46 내지 48% [참조: Lindley CM et al., 1994. Clin.Pharmacol. Ther. 55: 638-648]인 것으로 보고되었다. 마찬가지로, rFVIIa의 생체내 회수율은 A형 혈우병 개에서는 약 34%이고 B형 혈우병 개에서는 44%인 것으로 각각 기술되었다[참조: Brinkhous KM et al., 1989. Proc.Natl.Acad.Sci. 86: 1382-1386].
발명의 요지
일반적으로 치료용 폴리펩타이드는 고가의 제조 공정으로 인해 가격이 다소 높으므로, 생체내 회수율의 증가는 이러한 제품을 현재보다 더 저렴한 가격에 제공하여 더 많은 사람을 치료하는데 도움을 줄 것이다. 또한, 투여 빈도의 감소는 환 자의 편의를 개선시킬 것이다.
따라서, 본 발명의 기초가 되는 기술적 문제는, 증가된 생체내 회수율을 나타내어 제품의 투여 용량 또는 투여 빈도의 감소를 용이하게 하는 치료용 폴리펩타이드, 특히 비타민 K 의존성 폴리펩타이드를 개발하는 것이었다.
발명의 개요
놀랍게도, 비타민 K 의존성 폴리펩타이드는 알부민과의 융합 단백질로서 발현시 향상된 생체내 회수율을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 비제한적 예로서, 본 발명자들은 문헌[참조: Sheffield WP et al. (2004) Br. J. Haematol. 126: 565-573]에 공개된 인자 IX 알부민 융합 단백질에서 얻어진 결과와는 달리, 사람 FIX 알부민 융합 단백질은 비융합된 인자 IX에 비해 향상된 생체내 회수율을 나타낸다는 것을 밝혀내었다. 또한, 사람 혈청 알부민에의 인자 VII/VIIa의 융합에 의해, 인자 VII/FVIIa의 생물학적 활성을 보유하면서 증가된 생체내 회수율을 나타내는 인자 VII/FVIIa 융합 단백질이 생성된다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 하나의 양상은 알부민 또는 임의의 다른 회수 향상용 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 치료용 폴리펩타이드로서, 각각의 재조합적으로 생산된 비융합된 치료용 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 생체내 회수율의 110% 이상, 바람직하게는 125% 이상, 보다 바람직하게는 140% 이상을 나타내는 융합 단백질이다.
본 발명의 다른 양상은 알부민 또는 임의의 다른 회수 향상용 폴리펩타이드 의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드이다. 상기 융합 단백질은 각각의 재조합적으로 생산된 야생형 비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 생체내 회수율의 상당한 증가를 나타낸다.
본 발명의 추가의 양상은 인자 VII/VIIa 폴리펩타이드가 알부민의 N-말단에 융합되어, 비융합된 재조합적으로 생산된 인자 VII/VIIa에 비해 생체내 회수율의 상당한 증가를 나타내는 융합 단백질이다.
본 발명의 또 다른 양상은 인자 IX 폴리펩타이드가 알부민의 N-말단에 융합되어, 비융합된 인자 IX에 비해 생체내 회수율의 상당한 증가를 나타내는 융합 단백질이다.
따라서, 본 발명의 하나의 양상은 상응하는 비융합된 재조합 폴리펩타이드에 비해 생체내 회수율을 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상 증가시키는, 알부민의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드이다.
본 발명은 알부민과 같은 회수 향상용 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 연결된 치료용 폴리펩타이드, 특히 비타민 K 의존성 폴리펩타이드, 이의 조성물, 약학제적 조성물, 제형 및 키트를 포함한다. 또한, 본 발명은 비융합된 치료용 폴리펩타이드의 적용도 가능한 특정 의학적 징후에서의 상기 회수 향상용 폴리펩타이드에 연결된 치료용 폴리펩타이드의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 회수 향상용 폴리펩타이드에 연결된 치료용 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 및 상기 핵산을 함유하는 벡터, 상기 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 이 러한 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포를 사용하여 본 발명의 회수 향상용 폴리펩타이드에 연결된 치료용 폴리펩타이드의 제조 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 비타민 K 의존성 폴리펩타이드, 또는 이의 단편 또는 변이체, 임의로 펩타이드 링커, 및 알부민, 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적은 출혈 장애이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 비타민 K 의존성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 비타민 K 의존성 폴리펩타이드, 또는 이의 단편 또는 변이체, 임의로 펩타이드 링커, 및 알부민, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자, 뿐만 아니라 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 비타민 K 의존성 폴리펩타이드, 또는 이의 단편 또는 변이체, 펩타이드 링커, 및 알부민, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 폴리펩타이드의 제조 방법으로서,
(a) 포유동물 세포에서 발현가능한 알부민 폴리펩타이드에 연결된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공하는 단계;
(b) 상기 핵산을 유기체에서 발현시켜 알부민 폴리펩타이드에 연결된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드를 형성시키는 단계; 및
(c) 알부민 폴리펩타이드에 연결된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 알부민 융합 폴리펩타이드는 바람직하게는 적어도 비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 단편 또는 변이체 및 적어도 사람 혈청 알부민의 단편 또는 변이체를 포함하고, 이들은 유전자 융합에 의해서와 같이 서로 결합되어 있다 (즉, 비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 전체 또는 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 알부민의 전체 또는 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 프레임내 연결되고, 임의로 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 부분과 알부민 부분 사이에 링커 펩타이드를 도입시키는 링커 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 연결된 핵산의 해독에 의해 알부민 융합 폴리펩타이드가 생성된다).
하나의 양태에서, 본 발명은 혈청 알부민 폴리펩타이드의 N-말단에 융합된 생물학적 활성형 또는 활성화형 및/또는 치료학적 활성형 또는 활성화형 비타민 K 의존성 폴리펩타이드를 포함하거나, 또는 이로 이루어진 비타민 K 의존성 폴리펩타이드-알부민 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 생물학적 활성형 또는 활성화형 및/또는 치료학적 활성형 또는 활성화형 단편, 및 혈청 알부민의 N-말단에 융합된 펩타이드 링커를 포함하거나, 또는 이들로 이루어진 알부민 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 혈청 알부민 폴리펩타이드의 N-말단에 융합된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 생물학적 활성형 또는 활성화형 및/또는 치료학적 활성형 또는 활성화형 변이체 및 임의로 펩타이드 링커를 포함하거나, 또는 이들로 이루어진 비타민 K 의존성 폴리펩타이드-알부민 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 혈청 알부민의 단편 또는 변이체의 N-말단에 융합된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 생물학적 활성형 또는 활성화형 및/또는 치료학적 활성형 또는 활성화형 단편 또는 변이체 및 임의로 펩타이드 링커를 포함하거나, 또는 이들로 이루어진 비타민 K 의존성 폴리펩타이드-알부민 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 혈청 알부민의 성숙 부분의 N-말단에 융합된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 성숙 부분 및 임의로 펩타이드 링커를 포함하거나, 또는 이들로 이루어진 알부민 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 융합 단백질은 비융합된 폴리펩타이드 또는 단백질이 적용될 수 있는 모든 징후에 치료상으로 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 사람 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체와 같은 회수 향상용 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에의 융합에 의해, 비융합된 치료용 폴리펩타이드에 비해 치료용 폴리펩타이드, 특히 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 생체내 회수율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 비제한적 예로서, 혈청 알부민의 N-말단에의 치료용 폴리펩타이드, 특히 비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 융합은 임의로 상기 비타민 K 의존성 폴리펩타이드와 알부민 사이의 개재 펩타이드 링커에 의해 제공된다.
사람 혈청 알부민(HSA) 및 사람 알부민(HA)이란 용어는 본원에서 교환가능하게 사용된다. "알부민" 및 "혈청 알부민"이란 용어는 더 광범위하여, 사람 혈청 알부민(및 이의 단편 및 변이체) 및 다른 종 유래의 알부민(및 이의 단편 및 변이체)을 포함한다.
본원에서 사용되는 "알부민"은 알부민 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 또는 알부민의 하나 이상의 기능적 활성(예: 생물학적 활성)을 갖는 알부민 단편 또는 변이체를 총칭한다. 특히, "알부민"은 사람 알부민 또는 이의 단편, 특히 본원에서 서열번호 20으로 제시된 사람 알부민의 성숙 형태, 또는 다른 척추동물 유래의 알부민 또는 이의 단편, 또는 이러한 분자들의 유사체 또는 변이체 또는 이의 단편을 말한다.
알부민이 연결된 폴리펩타이드의 알부민 부분은 상기한 바와 같은 전장(full length)의 HA 서열을 포함하거나, 또는 치료적 활성을 안정화 또는 연장할 수 있는 상기 서열의 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 길이가 10개 이상의 아미노산이거나, 또는 HA 서열 유래의 약 15개, 20개, 25개, 30개, 50개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하거나, 또는 HA의 특정 도메인의 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.
본 발명의 알부민 연결된 폴리펩타이드의 알부민 부분은 정상 HA의 변이체일 수 있다. 본 발명의 알부민 연결된 폴리펩타이드의 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 부분은 본 명세서에 기술된 바와 같은 비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 변이체일 수도 있다. "변이체"란 용어는 보존적 또는 비보존적인 삽입, 결실 및 치환을 포함하고, 이러한 변화는 비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 치료적 활성을 부여하는 활성 부위 또는 활성 도메인을 실질적으로 변경시키지 않는다.
특히, 본 발명의 알부민 연결된 폴리펩타이드는 사람 알부민의 천연 다형성 변이체 및 사람 알부민의 단편을 포함할 수 있다. 알부민은 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 양 또는 돼지로부터 유래될 수 있다. 비포유동물에는 암탉 및 연어가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 알부민 연결된 폴리펩타이드의 알부민 부분은 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 부분과 상이한 동물로부터 유래될 수 있다.
일반적으로, 알부민 단편 또는 변이체는 아미노산 길이가 20개 이상, 바람직하게는 40개 이상, 가장 바람직하게는 70개 초과일 것이다. 알부민 변이체는 바람직하게는 알부민의 하나 이상의 전체 도메인 또는 상기 도메인의 단편, 예를 들면 도메인 1(서열번호 20의 아미노산 1-194), 도메인 2(서열번호 20의 아미노산 195-387), 도메인 3(서열번호 20의 아미노산 388-585), 도메인 1+2(서열번호 20의 1-387), 도메인 2+3(서열번호 20의 195-585) 또는 도메인 1+3(서열번호 20의 아미노산 1-194 + 서열번호 20의 아미노산 388-585)으로 이루어지거나, 또는 이들을 포함할 수 있다. 각 도메인 자체는 2개의 상동 서브도메인, 즉 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 및 512-585와 함께 잔기 Lys106 내지 Glu119, Glu292 내지 Val315 및 Glu492 내지 Ala511을 포함하는 유연성 서브도메인간 링커 영역으로 구성되어 있다.
본 발명의 알부민 융합 폴리펩타이드의 알부민 부분은 HA의 하나 이상의 서브도메인 또는 도메인 또는 이의 보존적 변형을 포함할 수 있다.
본 발명은 변형된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체를 알부민 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 N-말단 또는 C-말단에, 변형된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드와 알부민 사이에 개재 펩타이드 링커가 임의로 도입되게 하여 연결시켜, 이와 같이 변형된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 생체내 회수율이 알부민에 연결되지 않은 비타민 K 의존성 폴리펩타이드에 비해 증가되게 함을 포함하여, 변형된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본원에서 사용된 "비타민 K 의존성 폴리펩타이드"에는 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 IX, 인자 IXa, 인자 X, 인자 Xa, 인자 II(프로트롬빈), 단백질 C, 활성화된 단백질 C, 단백질 S, 활성화된 단백질 S, GAS6, 활성화된 GAS6, 단백질 Z, 활성화된 단백질 Z 등으로 이루어진 치료용 폴리펩타이드가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 유용한 비타민 K 의존성 폴리펩타이드는 야생형이거나 또는 돌연변이를 함유할 수 있다. 글리코실화 또는 다른 해독후 변형의 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 숙주 세포 환경의 성질에 따라서 달라질 수 있다. 특정 아미노산 서열이 언급되는 경우, 이 서열의 해독후 변형물도 본 발명에 포함된다.
상기 정의에 속하는 "비타민 K 의존성 폴리펩타이드"에는 천연 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 포함된다. 또한, 약간 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 예를 들면, 이러한 폴리펩타이드가 각각의 비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 활성을 실질적으로 보유하는 한, 말단 아미노산 결실 또는 부가를 포함하는 변형된 N-말단 또는 C-말단 끝을 갖는 폴리펩타이드도 포함된다. 상기 정의에 속하는 "비타민 K 의존성 폴리펩타이드"에는 개체마다 존재할 수 있고 일어날 수 있는 자연적인 대립유전자 변이도 포함된다. 상기 정의에 속하는 "비타민 K 의존성 폴리펩타이드"에는 비타민 K 의존성 폴리펩타이드의 변이체도 포함된다. 이러한 변이체는 야생형 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이하다. 이러한 차이의 예에는 N-말단 및/또는 C-말단에서의 하나 이상의 아미노산 잔기(예: 1 내지 10개의 아미노산 잔기)의 절두, 또는 N-말단 및/또는 C-말단에서의 하나 이상의 추가 잔기의 첨가뿐만 아니라, 보존적 아미노산 치환, 즉 유사한 특성을 갖는 아미노산 그룹, 예를 들면 (1) 크기가 작은 아미노산, (2) 산성 아미노산, (3) 극성 아미노산, (4) 염기성 아미노산, (5) 소수성 아미노산 및 (6) 방향족 아미노산 내에서 수행되는 치환이 포함될 수 있다. 이러한 보존적 치환의 예를 표 1에 제시한다.
Figure 112008077743202-PCT00001
본 발명의 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 알부민 융합체는 비융합된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드에 비해 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상 증가된 생체내 회수율을 갖는다.
본 발명의 인자 VII 알부민 연결된 폴리펩타이드의 생체내 회수율은 사람 인자 VII의 야생형 형태의 생체내 회수율보다 일반적으로 약 10% 이상, 바람직하게는 약 25% 이상, 보다 바람직하게는 약 40% 이상 더 높다.
본 발명의 인자 VIIa 알부민 연결된 폴리펩타이드의 생체내 회수율은 사람 인자 VIIa의 야생형 형태의 생체내 회수율보다 일반적으로 약 10% 이상, 바람직하게는 약 25% 이상, 보다 바람직하게는 약 40% 이상 더 높다.
본 발명의 인자 IX 알부민 연결된 폴리펩타이드의 생체내 회수율은 사람 인자 IX의 야생형 형태의 생체내 회수율보다 일반적으로 약 10% 이상, 바람직하게는 약 25% 이상, 보다 바람직하게는 약 40% 이상 더 높다.
본 발명에 따르면, 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 부분은 펩타이드 링커에 의해 알부민 부분에 연결된다. 링커는 유연성이고 비면역원성이어야 한다. 대표적인 링커에는 (GGGGS)n 또는 (GGGS)n 또는 (GGS)n이 포함되고, 여기서 n은 1 이상의 정수이고 G는 글리신을 나타내며 S는 세린을 나타낸다.
본 발명의 다른 양태에서, 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 부분과 알부민 부분 사이의 펩타이드 링커는 해독후 변형의 첨가를 위한 컨센서스(consensus) 부위를 함유한다. 바람직하게는, 이러한 변형은 글리코실화 부위로 이루어진다. 보다 바람직하게는, 이러한 변형은 구조 Asn-X-Ser/Thr(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산을 나타낸다)의 하나 이상의 N-글리코실화 부위로 이루어진다. 보다 바람직하게는, 이러한 N-글리코실화 부위는 펩타이드 링커의 아미노 말단 및/또는 카복시 말단에 가깝게 삽입되어 있어, 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 부분이 펩타이드 링커로 이행되는 서열 및 펩타이드 링커가 알부민 부분으로 이행되는 서열 각각에서 발생할 수도 있는 잠재적 네오에피토프(neoepitope)를 차단할 수 있게 된다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 알부민 융합체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. "폴리뉴클레오타이드(들)"란 용어는 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 말한다. 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄 또는 이본쇄 DNA, 일본쇄 또는 이본쇄 RNA일 수 있다. 본원에서 사용되는 "폴리뉴클레오타이드(들)"에는 하나 이상의 변형된 염기 및/또는 비표준 염기, 예를 들면 이노신을 포함하는 DNA 또는 RNA도 포함된다. 당업자에게 공지된 많은 유용한 목적을 제공하는 DNA 및 RNA에는 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것이 인식될 것이다. 본원에서 사용되는 "폴리뉴클레오타이드(들)"이란 용어는 이러한 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라 바이러스 및 세포, 예를 들면 단순 세포 및 복잡한 세포의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태도 포함한다.
당업자라면, 유전자 코드의 축퇴(degeneracy)로 인해, 주어진 폴리펩타이드는 상이한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 "변이체"는 본 발명에 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 분리된 폴리뉴클레오타이드이다. "분리된" 폴리뉴클레오타이드란 용어는 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA와 같은 비제한적인, 다른 핵산 서열이 실질적으로 없는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 분리된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 당업자에게 공지된 통상적인 핵산 정제 방법은 분리된 폴리뉴클레오타이드를 수득하는데 사용될 수 있다. 상기 용어는 또한 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드도 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터이다. 바람직하게는, 상기 플라스미드 또는 벡터는 발현 벡터이다. 특정 양태에 있어서, 벡터는 사람 유전자 치료에 사용하기 위한 전달 벡터이다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 일부인 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 알부민 융합체를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은
- 본 발명의 숙주 세포를 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 알부민 융합체가 발현되게 하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
- 임의로, 상기 배양 배지로부터 상기 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 알부민 융합체를 회수하는 단계를 포함한다.
제안된 폴리펩타이드의 발현
적당한 숙주 세포에서 재조합 단백질의 높은 수준의 생산에는 당업자에게 공지된 방법에 따라 다양한 발현 시스템에서 증식될 수 있는 재조합 발현 벡터에, 상기한 변형된 cDNA를 적당한 조절 요소와 함께 효율적인 전사 단위 내로 어셈블리(assembly)하는 것이 필요하다. 효율적인 전사 조절 요소는 천연 숙주가 동물 세포인 바이러스로부터 유래되거나, 동물 세포의 염색체 DNA로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 시미안 바이러스(Simian Virus) 40, 아데노바이러스(adenovirus), BK 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 사람 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 또는 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)의 긴 말단 반복부 유래의 프로모터-인핸서 조합체, 또는 베타 액틴 또는 GRP78과 같이 동물 세포에서 강력하게 구성적으로 전사되는 유전자를 포함하는 프로모터-인핸서 조합체가 사용될 수 있다. cDNA로부터 전사된 mRNA를 안정한 높은 수준으로 달성하기 위해, 전사 단위는 이의 3' 근위부에 전사 종결-폴리아데닐화 서열을 암호화하는 DNA 영역을 함유해야 한다. 바람직하게는, 상기 서열은 시미안 바이러스 40 초기 전사 영역, 토끼 베타-글로빈 유전자 또는 사람 조직 플라스미노겐 활성인자 유전자로부터 유래된다.
이어서, cDNA를 치료용 폴리펩타이드 알부민 융합 폴리펩타이드의 발현을 위해 적당한 숙주 세포주의 게놈 내에 통합시킨다. 바람직하게는, 상기 세포주는 척추동물 기원의 동물 세포주이어야만 정확한 폴딩(folding), Gla 도메인 내의 글루탐산 잔기의 감마 카복실화, 이황화 결합 형성, 아스파라긴 연결된 글리코실화, O-연합된 글리코실화 및 다른 해독후 변형뿐만 아니라 배양 배지로의 분비가 확보된다. 다른 해독후 변형의 예에는 타이로신 O-황산화, 하이드록실화, 인산화, 발생기 폴리펩타이드 쇄의 단백질분해 프로세싱 및 프로펩타이드 영역의 절단이 있다. 사용될 수 있는 세포주의 예에는 원숭이 COS 세포, 마우스 L 세포, 마우스 C127 세포, 햄스터 BHK-21 세포, 사람 배아 신장 293 세포 및 햄스터 CHO 세포가 있다.
상응하는 cDNA를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 다수의 상이한 방식으로 동물 세포주 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 재조합 발현 벡터는 상이한 동물 바이러스를 기초로 한 벡터로부터 생성될 수 있다. 이의 예로는 배큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 바람직하게는 소 파필로마 바이러스를 기초로 한 벡터가 있다.
상응하는 DNA를 암호화하는 전사 단위는, 재조합 DNA가 게놈 내로 통합된 특정 세포 클론의 분리를 용이하게 하기 위하여 이러한 세포 내에서 우성 선별 마커로서 작용할 수 있는 다른 재조합 유전자와 함께 동물 세포 내로 도입될 수도 있다. 이러한 종류의 우성 선별 마커 유전자의 예에는, 제네티신(G418)에 대한 내성을 부여하는 Tn5 아미노 글리코사이드 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 및 퓨로마이신에 대한 내성을 부여하는 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제가 있다. 이러한 선별 마커를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 목적하는 폴리펩타이드의 cDNA를 암호화하는 벡터와 동일한 벡터 상에 존재하거나, 또는 숙주 세포의 게놈에 동시에 도입 및 통합되어, 종종 상이한 전사 단위 사이에 단단한 물리적 결합을 초래하기도 하는 별도의 벡터 상에서 암호화될 수 있다.
목적하는 단백질의 cDNA와 함께 사용될 수 있는 선별 마커 유전자의 다른 종류는 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr)를 암호화하는 다양한 전사 단위를 기초로 한다. 이러한 종류의 유전자는, 내인성 dhfr 활성이 결여된 세포, 바람직하게는 CHO-세포(DUKK-B11, DG-44) 내로 도입된 후, 뉴클레오사이드 결여 배지에서 이러한 세포가 성장할 수 있게 할 것이다. 이러한 배지의 예로는 하이포크산틴, 티미딘 및 글리신이 부재하는 햄(Ham) F12가 있다. 이러한 dhfr-유전자를 응고 인자 cDNA 전사 단위와 함께, 동일 벡터 상에 결합된 상태로 또는 상이한 벡터 상에서, 상기한 종류의 CHO 세포 내로 도입시켜, 재조합 단백질을 생산하는 dhfr 양성 세포주를 생성할 수 있다.
상기 세포주가 세포독성 dhfr 억제제 메토트렉세이트의 존재 하에서 성장시키는 경우, 메토트렉세이트에 대해 내성인 신규 세포주가 나타날 것이다. 이러한 세포주는 연결된 dhfr과 목적하는 단백질의 전사 단위의 증폭된 수로 인하여 재조합 단백질을 증가된 비로 생산할 수 있다. 이러한 세포주를 증가하는 농도의 메토트렉세이트(1 내지 10000nM) 중에서 증식시키는 경우, 목적하는 단백질을 매우 높은 비로 생산하는 신규 세포주가 수득될 수 있다.
목적하는 단백질을 생산하는 상기 세포주를 현탁 배양 또는 다양한 고체 지지체 상에서 대량으로 성장시킬 수 있다. 이러한 지지체의 예에는 덱스트란 또는 콜라겐 기질을 바탕으로 한 마이크로 캐리어(micro carrier), 또는 중공 섬유 형태의 고체 지지체 또는 다양한 세라믹 재료가 있다. 세포 현탁 배양 또는 마이크로 캐리어 상에서 성장시키는 경우, 상기 세포주의 배양은 연장된 시간 기간 동안 조정 배지(conditioned medium)의 연속적인 생산 하에 관류 배양으로서 또는 회분식 배양으로서 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 상기 세포주는 목적하는 재조합 단백질의 생산을 위한 산업적 공정의 개발에 매우 적합하다.
상기한 종류의 분비 세포의 배지 중에 축적되는 재조합 단백질은 다양한 생화학적 방법 및 크로마토그래피 방법, 예를 들면 세포 배양 배지 중의 목적하는 단백질과 다른 물질 사이의 크기, 전하, 소수성, 용해성, 특이적 친화성 등의 차이를 사용하는 방법에 의해 농축 및 정제할 수 있다.
이러한 정제의 예로는 고체 지지체 상에 고정된 결합 펩타이드 또는 모노클로날 항체에 대한 재조합 단백질의 흡착이 있다. 이러한 단백질은 탈착 후, 상기한 성질을 기초로 한 다양한 크로마토그래피 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다.
본 발명의 치료용 단백질, 예를 들면 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 알부민 융합체는 오염 거대분자, 특히 다른 단백질 및 핵산 대비, 80% 초과의 순도, 보다 바람직하게는 95% 초과의 순도, 특히 바람직하게는 99.9% 초과의 순도인 약제학적 순수 상태로 정제되고, 감염원 및 발열원이 없는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 분리 또는 정제된 치료용 폴리펩타이드, 예를 들면 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 알부민 융합체는 다른 폴리펩타이드가 실질적으로 없다.
본 발명에 기술된 치료용 폴리펩타이드, 각각 비타민 K 의존성 폴리펩타이드 알부민 융합체는 치료용 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 정제된 단백질은 통상의 생리적 상용성 수성 완충 용액에 용해될 수 있고, 여기에 임의로 약제학적 제제를 제공하기 위한 약제학적 부형제가 첨가될 수 있다.
이러한 약제학적 담체 및 부형제뿐만 아니라 적당한 약제학적 제형은 당업계에 익히 공지되어 있다[참조: "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Fracis (2000) 또는 "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)]. 특히, 본 발명의 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 약제학적 조성물은 동결건조 형태 또는 안정한 가용성 형태로 제형화될 수 있다. 치료용 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 동결건조될 수 있다. 동결건조 제형은 주사용 멸균수 또는 멸균 생리적 식염수와 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제를 첨가하여 사용 전에 재구성시킨다.
조성물의 제형은 약제학적으로 적당한 임의의 투여 수단에 의해 개체에게 전달된다. 다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 이를 사용하여 임의의 편리한 경로로 조성물을 투여할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 전신 투여된다. 전신용인 경우, 본 발명의 알부민 연결된 융합 단백질은 통상의 방법에 따라 비경구 (예: 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 비강내 또는 경피) 또는 장관내 (예: 경구, 질 또는 직장) 전달용으로 제형화된다. 가장 바람직한 투여 경로는 정맥내 투여이다. 제형은 주입에 의해 연속적으로 또는 일시 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 제형은 서방형 시스템을 포함한다.
본 발명의 치료용 폴리펩타이드, 각각 본 발명의 알부민 연결된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드는, 목적하는 효과를 나타내는데 충분하고, 과도한 부작용을 나타내는 용량에 도달하지 않으면서, 치료받는 상태 또는 징후의 중증도 또는 확산을 예방 또는 감소시키는데 충분한 용량을 의미하는 치료학적 유효량으로 환자에게 투여된다. 정확한 용량은 다수의 요인, 예를 들면, 징후, 제형 및 투여 방식에 따라 달라지며, 각 징후마다 전임상 시험 및 임상 시험을 통해 결정되어야 한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 제제는 동일한 약제의 일부로서 혼입될 수 있다.
본 발명의 다양한 산물은 약제로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 알부민 연결된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 변형된 DNA는 사람 유전자 치료에 사용하기 위한 전달 벡터 내에 통합될 수도 있다.
본 발명의 다른 양상은 출혈 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한, 본 발명의 치료용 폴리펩타이드, 예를 들면, 본원에 기술된 알부민 연결된 비타민 K 의존성 폴리펩타이드, 본 발명의 폴리펩타이드, 본 발명의 플라스미드 또는 벡터, 또는 본 발명의 숙주 세포의 용도이다. 출혈 장애에는 A형 혈우병이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 양태에 있어서, 치료는 사람 유전자 치료를 포함한다.
또한, 본 발명은 다음의 징후 중 하나 이상에서 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다: "A형 또는 B형 혈우병", "선천적 또는 후천적 응고 결핍증이 있는 환자의 출혈 에피소드", "선천적 또는 후천적 인자 결핍증이 있는 환자의 혈전증과 같은 혈관 폐색 에피소드", "패혈증", "응고 인자(FVIII 또는 FIX)에 대한 억제제를 사용한 선천적 또는 후천적 혈우병 환자의 출혈 에피소드 및 수술", "항혈소판 약물 또는 항응고 약물과 같은 약물 치료의 결과로서 발생된 지혈 결핍의 반전", "2차 지혈의 개선", "비타민 K 결핍증 또는 중증 간 질환과 같은 질병 또는 감염 동안 발생한 지혈 결핍", "간 절제", "뱀교상의 결과로서 발생된 지혈 결핍", "위장관 출혈". 또한, 바람직한 징후로는 "외상", "대량 수혈(희석성 응고병증)의 결과", "FVIII 및 FIX 이외의 응고 인자 결핍증", "VWD", "FI 결핍증", "FV 결핍증", "FVII 결핍증", FX 결핍증", "FXIII 결핍증", "HUS", "선천적 또는 후천적 혈소판 질환 및 장애, 예를 들면 저혈소판증, ITP, TTP, HELLP 증후군, 버나드-소울리어(Bernard-Soulier) 증후군, 글란즈만(Glanzmann) 혈소판무력증, HIT", "체디아크-히가시(Chediak-Higashi) 증후군", "허만스키-푸드락(Hermansky-Pudlak) 증후군", "렌두-오슬러(Rendu-Osler) 증후군", "헤노흐-쉔라인(Henoch-schonlein) 자반증", "상처 치유" 및 "패혈증"이 있다. 상기 방법은 본원에 기술된 비타민 K 의존성 알부민 연결된 폴리펩타이드의 유효량을 상기 개체에게 투여함을 포함한다. 다른 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터의 유효량을 상기 개체에게 투여함을 포함한다. 또는, 상기 방법은 본원에 기술된 본 발명의 숙주 세포의 유효량을 개체에게 투여함을 포함할 수 있다.
도 1:
TAG를 TCG로 치환하여 천연 FVII 종결 코돈 부위에 도입된 XhoI 제한 부위. 돌연변이된 염기를 굵은 문자로 표시하였다. 추가의 작제를 위해 사용된 NotI 부위는 이중 밑줄로 표시하였다. 인자 VII C-말단의 아미노산 서열은 3문자 코드로 제시하였다(박스 표시 부분).
도 2:
다양한 pFVII 작제물에서 인자 VII의 C-말단과 알부민의 N-말단 사이에 삽입된 링커 서열의 개요. N-글리코실화 부위의 아스파라긴은 이중 밑줄로 표시하였다.
도 3:
다양한 pFIX 작제물에서 인자 IX의 C-말단과 알부민의 N-말단 사이에 삽입된 링커 서열의 개요. N-글리코실화 부위의 아스파라긴은 이중 밑줄로 표시하였다.
실시예 1: FVII 및 FVII -알부민 융합 단백질을 암호화하는 cDNA 의 제조
인자 VII 암호화 서열은 프라이머 We1303 및 We1304(서열번호 1 및 2)를 사용하여 사람 간 cDNA 라이브러리로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 프라이머 We1286 및 We1287(서열번호 3 및 4)을 사용한 2차 PCR 라운드 후, 수득된 단편을 pCR4TOPO[판매원: Invitrogen] 내에 클로닝하였다. 이로부터 FVII cDNA를, 내부 XhoI 부위를 미리 결실시킨 pIRESpuro3[판매원: BD Biosciences]의 EcoRI 부위 내로 EcoRI 단편으로서 이동시켰다. 수득된 플라스미드를 pFVII-659로 명명하였다.
이어서, XhoI 제한 부위를 올리고뉴클레오타이드 We1643 및 We1644(서열번호 5 및 6)를 사용하여 표준 프로토콜(QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, 판매원: Stratagene)에 따라 부위 지시된 돌연변이유발에 의해 pFVII-659의 천연 FVII 종결 코돈 부위에 도입시켰다 (도 1). 수득된 플라스미드를 pFVII-700으로 명명하였다.
올리고뉴클레오타이드 We1731 및 We1732(서열번호 7 및 8)를 표준 PCR 조건 하에서 등몰 농도(10pmol)로 어닐링(annealing)하여, 필링업(filling up)하고, 94℃에서 초기 변성 2분 후, 94℃에서 변성 15초, 55℃에서 어닐링 15초 및 72℃에서 연장 15초의 7회 사이클, 마지막으로 72℃에서 연장 단계 5분으로 이루어진 PCR 프로토콜을 이용하여 증폭시켰다. 수득된 단편을 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 및 NotI으로 분해하고, 동일한 효소로 분해된 pFVII-700에 연결시켰다. 수득된 플라스미드를 FVII 암호화 서열 및 트롬빈 절단성 글리신/세린 링커의 C-말단 연장부를 함유하는 pFVII-733으로 명명하였다.
pFVII-733을 기초로 하여, 트롬빈 절단 부위 및 추가적인 N-글리코실화 부위가 없는 다른 링커를 삽입하였다. 프라이머 쌍 We2148 및 We2149(서열번호 9 및 10) 대신에, We2148 및 We2151(서열번호 9 및 11), We2152 및 We2154(서열번호 12 및 13), We2152 및 We2155(서열번호 12 및 14), 및 We2156 및 We2157(서열번호 15 및 16)을 각각 상기한 바와 같이 어닐링 및 증폭시켰다. 각각의 PCR 단편을 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 및 BamH1으로 분해하고, 동일한 효소로 분해된 pFVII-733에 삽입하였다. 수득된 플라스미드의 BamH1 부위뿐만 아니라 pFVII-744의 BamH1 부위에, 성숙 사람 알부민의 cDNA를 함유하는 BamH1 단편을 삽입하였다. 이 단편은 알 부민 cDNA 서열 상에서 프라이머 We1862 및 We1902(서열번호 17 및 18)를 사용하여 표준 조건 하에 PCR에 의해 제조하였다. 최종 플라스미드를 각각 pFVII-935, pFVII-937, pFVII-939, pFVII-940, pFVII-941 및 pFVII-834로 명명하였다.
링커 없이 FVII 알부민 융합 단백질을 제조하기 위하여, 프라이머 We2181 및 We2182(서열번호 25 및 26)를 사용하여 플라스미드 pFVII-935 상에 상기한 바와 같이 결실 돌연변이유발을 적용하였다. 수득된 플라스미드를 pFVII-974로 명명하였다. 상기 플라스미드의 링커 서열 및 C-말단 FVII 및 N-말단 알부민 서열은 도 2에 제시되어 있다.
실시예 2: FIX 및 FIX -알부민 융합 단백질을 암호화하는 cDNA 의 제조
인자 IX 암호화 서열은 프라이머 We1403 및 We1404(서열번호 27 및 28)를 사용하여 사람 간 cDNA 라이브러리(ProQuest, 판매원: Invitrogen]로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 프라이머 We1405 및 We1406(서열번호 29 및 30)을 사용한 2차 PCR 라운드 후, 수득된 단편을 pCR4TOPO[판매원: Invitrogen] 내에 클로닝하였다. 이로부터 FIX cDNA를, 내부 XhoI 부위를 미리 결실시킨 pIRESpuro3[판매원: BD Biosciences]의 EcoRI 부위 내로 EcoRI 단편으로서 이동시켰다. 수득된 플라스미드를 pFIX-496으로 명명하였고, 이는 인자 IX 야생형의 발현 벡터였다.
알부민 융합 작제물의 제조를 위하여, 종결 코돈을 결실시키고 대신에 XhoI 부위를 도입시키는 프라이머 We2610 및 We2611(서열번호 31 및 32)을 사용하여, FIX cDNA를 표준 조건 하에서 PCR에 의해 재증폭시켰다. 수득된 FIX 단편을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 XhoI로 분해하고, 이하에 기술되는 하나의 XhoI/BamH1 분해된 링커 단편과 함께 EcoRI/BamHI 분해된 pIRESpuro3 내에 연결시켰다.
2개의 상이한 글리신/세린 링커 단편을 제조하였다: 올리고뉴클레오타이드 We2148 및 We2150(서열번호 9 및 33)을 표준 PCR 조건 하에 등몰 농도(10pmol)로 어닐링하여, 필링업하고, 94℃에서 초기 변성 2분 후, 94℃에서 변성 15초, 55℃에서 어닐링 15초 및 72℃에서 연장 15초의 7회 사이클, 마지막으로 72℃에서 연장 단계 5분으로 이루어진 PCR 프로토콜을 이용하여 증폭시켰다. 올리고뉴클레오타이드 We2156 및 We2157(서열번호 15 및 16)을 사용하여 동일한 절차를 수행하였다.
수득된 링커 단편을 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 및 NotI로 분해하고, 상기한 연결 반응에 각각 사용하였다. 따라서, 수득된 2개의 플라스미드는 FIX의 암호화 서열 및 글리신/세린 링커의 C-말단 연장부를 함유하였다. 다음 클로닝 단계에서, 이 플라스미드들을 BamH1으로 분해하고, 성숙 사람 알부민의 cDNA를 함유하는 BamH1 단편을 삽입하였다. 이 단편은 프라이머 We1862 및 We1902(서열번호 17 및 18)를 사용하여 알부민 cDNA 서열 상에서 표준 조건 하에 PCR로 제조하였다. 최종 플라스미드를 pFIX-980 및 pFIX-986으로 각각 명명하였다. 이들의 링커 서열 및 C-말단 FIX 및 N-말단 알부민 서열은 도 3에 제시되어 있다.
FIX를 많은 양으로 발현하는 세포에서 프로펩타이드의 효율적인 프로세싱을 위하여, 푸린(furin)의 공동발현이 요구된다[참조: Wasley LC et al., 1993. PACE/Furin can process the vitamin K-dependent pro-factor IX precusor within the secretory pathway. J. Biol. Chem. 268: 8458-8465]. 푸린은 프라이머 We1791 및 We1792(서열번호 34 및 35)를 사용하여 간 cDNA 라이브러리[판매원: Ambion]로부터 증폭시켰다. 프라이머 We1808 및 We1809(서열번호 36 및 37)를 이용한 2차 PCR 라운드 결과, 카복시말단 막관통 도메인(TM)이 결실되고 종결 코돈이 도입된 푸린 단편이 수득되었고, 이 단편을 pCR4TOPO[판매원: Invitrogen]에 클로닝하였다. 이로부터 furin△TM cDNA를, 내부 XhoI 부위를 미리 결실시킨 pIRESpuro3[판매원: BD Biosciences]의 EcoRI/NotI 부위 내로 EcoRI/NotI 단편으로서 이동시켰다. 수득된 플라스미드를 pFu-797로 명명하였다. pFu-797에 의해 암호화된 분비형 푸린의 아미노산 서열은 서열번호 38에 제시되어 있다.
실시예 3: FVII , FIX 및 각각의 알부민 융합 단백질의 형질감염 및 발현
플라스미드를 이.콜라이(E. coli) TOP10[판매원: Invitrogen]에서 성장시키고, 표준 프로토콜[판매원: Quiagen]을 사용하여 정제하였다. HEK-293 세포를 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 시약[판매원: Invitrogen]을 사용하여 형질감염시키고 무혈청 배지(Invitrogen 293 Express)에서 50ng/ml 비타민 K 및 4㎍/ml 퓨로마이신의 존재 하에 성장시켰다. furin△TM cDNA의 공동형질감염을 1:5 (pFu-797: 각각의 pFIX 작제물) 몰 비로 수행하였다. 형질감염된 세포 집단을 롤러 병(roller bottle) 또는 소규모 발효기 내로 T 플라스크를 통해 접종하고, 정제를 위하여 이로부터 상청액을 수거하였다.
실시예 4: FVII 및 FVII -알부민 융합 폴리펩타이드의 정제
FVII 또는 FVII 알부민 융합 단백질을 함유하는 세포 배양 수거물을, 20mM Hepes 완충액(pH 7.4)으로 미리 평형화시킨 2.06mL Q-세파로스 FF 칼럼 상에 공급하였다. 이어서, 칼럼을 10 용적의 소위 Hepes 완충액으로 세척하였다. 결합된 FVII 분자의 용출은 20 칼럼 용적 내에서 20mM Hepes 완충액 중의 0 내지 1.0M NaCl의 선형 구배를 전개시켜 달성하였다. 용출액은 공급된 FVII 항원의 약 85 내지 90%를 0.5 내지 1g/L의 단백질 농도로 함유하였다.
또는, FVII는 유럽 특허원 제EP 0770625B1호에 기술된 바와 같은 고정된 조직 인자를 사용한 크로마토그래피를 통해 정제하였다.
FVII 항원 및 활성은 실시예 5에 기술된 바와 같이 측정하였다.
실시예 5: FVII 활성 및 항원의 측정
FVII 활성은 시판되는 발색 검사 키트(Chromogenix Coaset FVII)를 사용하여 문헌[참조: Seligsohn et al. Blood (1978) 52:978-988]에 기술된 방법을 기초로 하여 측정하였다.
FVIIa 활성은 시판되는 검사 키트((STACLOT®) VIIa-rTF, 판매원: Diagnostica Stago)를 사용하여 문헌[참조: Morissey et al. (1993) Blood 81:734-744]에 기술된 방법을 기초로 하여 측정하였다.
FVII 항원은 당업자에게 성능이 공지된 ELISA에 의해 측정하였다. 간략히 설명하면, 마이크로플레이트에 포획 항체(양(sheep) 항-사람 FVII IgG, Cedarlane CL20030AP, 완충액 A(Sigma C3041) 중에 1:1000으로 희석함)를 웰당 120㎕씩 주입 하여 주위 온도에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 플레이트를 완충액 B(Sigma P3563)로 3회 세척한 후, 각각의 웰을 완충액 C(Sigma P3688) 200㎕와 함께 주위 온도에서 1시간 동안 항온처리하였다. 다시 완충액 B로 3회 세척한 후, 검사 시료를 완충액 B 중에 연속 희석한 희석물과 표준 사람 혈장(판매원: Dade Behring; 50 - 0.5mU/mL)을 완충액 B 중에 연속 희석한 희석물(웰당 용적: 100㎕)을 주위 온도에서 2시간 동안 항온처리하였다. 완충액 B로 3회 세척한 후, 검출 항체(양 항-사람 FVII IgG, Cedarlane CL20030K, 퍼옥시다제 표지됨)를 완충액 B 중에 1:5000 희석한 희석물 100㎕를 각 웰에 첨가하고, 주위 온도에서 다시 2시간 동안 항온처리하였다. 완충액 B로 3회 세척한 후, 기질 용액(TMB, 판매원: Dade Behring, OUVF)을 웰당 100㎕씩 첨가하고, 주위 온도에서 암실에서 30분 동안 항온처리하였다. 미희석 정지 용액(판매원: Dade Behring, OSFA) 100㎕를 첨가하여, 450nm 파장에서 적당한 마이크로플레이트 판독기에서 판독하기 위한 시료를 준비하였다. 이어서, 기준으로서 표준 사람 혈장을 사용하여 작성된 표준 곡선을 사용하여, 검사 시료의 농도를 계산하였다.
실시예 6: FIX 및 FIX -알부민 융합 폴리펩타이드의 정제
FIX 또는 FIX 알부민 융합 단백질을 함유하는 세포 배양 수거물을 50mM TrisxHCl/100mM NaCl 완충액(pH 8.0)으로 미리 평형화시킨 Q-세파로스 FF 칼럼에 공급하였다. 이어서, 칼럼을 200mM NaCl을 함유하는 평형 완충액으로 세척하였다. 결합된 FIX 또는 FIX 융합 폴리펩타이드의 용출은 염구배를 전개하여 달성하였다. 용출물은 칼럼 크로마토그래피에 의해 하이드록시아파타이트 상에서 추가로 정제하였다. 이를 위하여, Q-세파로스 FF 칼럼의 용출물을 50mM TrisxHCl/100mM NaCl 완충액(pH 7.2)으로 평형화시킨 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼을 동일한 완충액으로 세척하고, FIX 또는 FIX-HAS를 인산염 염구배를 사용하여 용출시켰다. 용출물은 염 농도를 감소시키기 위해 투석하고, 생화학적 분석뿐만 아니라 생체내 회수율 측정에 사용하였다. FIX 항원 및 활성은 실시예 7에 기술된 바와 같이 측정하였다.
실시예 7: FIX 항원 및 활성의 측정
FIX 활성은 시판되는 aPTT 시약(판매원: Dade Behring, Pathromtin SL 및 FIX 고갈된 혈장)을 사용하여 응고 활성으로써 측정하였다.
FIX 항원은 당업자에게 공지된 표준 프로토콜에 따라 ELISA에 의해 측정하였다. 간략히 설명하면, 마이크로플레이트에 포획 항체(FIX ELISA용 쌍을 이룬 항체 1:200, 판매원: Cedarlane)를 웰당 100㎕씩 주입하여 주위 온도에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 플레이트를 차단 완충액 B(Sigma P3563)로 3회 세척한 후, 각 웰을 완충액 C(Sigma P3688) 200㎕와 함께 주위 온도에서 1시간 동안 항온처리하였다. 다시 완충액 B로 3회 세척한 후, 검사 시료를 완충액 B 중에 연속 희석한 희석물과 준표준물(SHP)을 완충액 B 중에 연속 희석한 희석물(웰당 용적: 100㎕)을 주위 온도에서 2시간 동안 항온처리하였다. 완충액 B로 3회 세척 후, 검출 항체(FIX ELISA용 쌍을 이룬 항체, 퍼옥시다제 표지됨, 1:200, 판매원: Cedarlane)를 완충액 B 중에 1:200배 희석한 희석물 100㎕를 각 웰에 첨가하고, 주위 온도에서 추가로 2시간 동안 항온처리하였다. 완충액 B로 3회 세척한 후, 기질 용액(TMB, 판매원: Dade Behring, OUVF)을 웰당 100㎕씩 각 웰에 첨가하고, 주위 온도에서 암실에서 30분 동안 항온처리하였다. 미희석 정지 용액(판매원: Dade Behring, OSFA) 100㎕를 첨가하여, 450nm 파장에서 적당한 마이크로플레이트 판독기에서 판독하기 위한 시료를 준비하였다. 이어서, 기준으로서 표준 사람 혈장을 사용하여 작성된 표준 곡선을 사용하여, 검사 시료의 농도를 계산하였다.
실시예 8: 생체내 회수율과 관련한 FVII 및 FVII -알부민 융합 단백질의 비교
상기한 재조합 FVII 야생형 및 FVII 알부민 융합 폴리펩타이드를 마취시킨 CD/Lewis 래트(물질당 래트 6마리)에게 100㎍/체중kg의 용량으로 정맥내로 투여하였다. 검사 물질을 투여한 후 5분부터 시작하여 적당한 간격으로 혈액 시료를 경동맥에서 채혈하였다. 이어서, FVII 항원 함량을 사람 인자 VII에 대해 특이적인 ELISA 분석에 의해 정량하였다(상기 참조). 각각의 래트 그룹의 평균값을 사용하여 생체내 회수율을 계산하였다.
생체내 회수율은 산물 투여 5분 후에 측정하였다 (표 2). 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여한 후 5분 후에 혈장 1ml당 측정된 FVII 각 FVIIa 항원 수준을 1kg당 투여된 산물의 양과 연관시켰다. 또는, 주입 5분 후에 측정한 항원 수준(IU/ml)을 100% 회수율에서 예상되는 이론적 산물 수준과 연관시켜 %를 계산하였다 (kg당 투여된 산물을 이론적 혈장 용적 40mL/kg으로 나눔).
이와 같이 래트에서 측정된 FVII 융합 단백질의 생체내 회수율은 비융합된 재조합 야생형 FVII에 비해 유의적으로 증가된 것으로 밝혀졌다. 사용된 작제물에 따라 야생형 FVII에 비해 2.3 내지 7.9배 증가하였다.
Figure 112008077743202-PCT00002
실시예 9: 생체내 회수율과 관련한 FIX 및 FIX -알부민 융합 폴리펩타이드의 비교
시판되는 재조합 FIX [베네픽스(BeneFIX), 판매원: Wyeth ; rFIX 야생형] 및 상기한 FIX-알부민 융합 폴리펩타이드(rFIX-L-HSA 980/797 및 rFIX-L-HSA 986/797)를 마취시킨 토끼(물질당 토끼 4마리) 및 CD/Lewis 래트(물질당 래트 6마리)에게 각각 50IU/체중kg의 용량으로 투여하였다. 검사 물질을 투여한 후 5분부터 시작하여 적당한 간격으로 혈액 시료를 경동맥에서 채혈하였다. 이어서, FIX 항원 함량을 사람 인자 IX에 대해 특이적인 ELISA 검정에 의해 정량하였다(상기 참조). 각각의 그룹의 평균값을 사용하여 5분 후 생체내 회수율을 계산하였다.
주입 5분 후에 계산된 생체내 회수율을 표 3에 요약하였다. 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여한 후 5분 후에 혈장 1ml당 측정된 FIX 항원 수준을 1kg당 투여된 산물의 양과 연관시켰다. 또는, 주입 5분 후에 측정한 항원 수준(IU/ml)을 100% 회수율에서 예상되는 이론적 산물 수준과 연관시켜 %를 계산하였다 (kg당 투여된 산물을 이론적 혈장 용적 40mL/kg으로 나눔).
토끼뿐만 아니라 래트에서도, FIX 융합 단백질의 생체내 회수율은 놀랍게도, 사내에서 제조한 비융합된 재조합 FIX 또는 시판되는 FIX 산물(베네픽스)에 비해 유의적으로 증가된 것으로 밝혀졌다. 사용된 동물 종 또는 작제물에 따라, 베네픽스 대비 증가율은 49.7%, 69.4% 또는 87.5%였다. 상응하는 야생형 FIX에 비해, FIX 융합 단백질의 회수율 증가는 더 높았다.
Figure 112008077743202-PCT00003
<110> CSL Behring GmbH <120> Method of increasing the in vivo recovery of therapeutic polypeptides <130> 2006.M003-A114-EP <150> EP 06007552.0 <151> 2006-04-11 <160> 38 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 1 ggcaggggca gcactgcag 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 2 cacaggccag ggctgctgg 19 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 3 gcggctagca tggtctccca ggccctc 27 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 4 gcggcggccg cctagggaaa tggggctcgc 30 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis primer <400> 5 gagccccatt tccctcgagg gccgccgcaa ggg 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutagenesis primer <400> 6 cccttgcggc ggccctcgag ggaaatgggg ctc 33 <210> 7 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 7 gtggtgctcg agcgtgcccc gcgccgtggg cggctccggc ggctccggcg gctccggatc 60 c 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Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 20 <211> 585 <212> PRT <213> human <400> 20 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 21 <211> 415 <212> PRT <213> human <400> 21 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30 Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80 Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95 Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr 100 105 110 Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val 115 120 125 Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr 130 135 140 Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn 165 170 175 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe 180 185 190 Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly 195 200 205 Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu 210 215 220 Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu 225 230 235 240 Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His 245 250 255 His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile 275 280 285 Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser 290 295 300 Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala 305 310 315 320 Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys 325 330 335 Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly 340 345 350 Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 355 360 365 His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser 370 375 380 Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys 385 390 395 400 Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 405 410 415 <210> 22 <211> 1335 <212> DNA <213> human <400> 22 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60 gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac 120 gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc 180 tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt 240 tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag 300 gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag 360 acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420 agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480 gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540 aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggccga attgtggggg gcaaggtgtg ccccaaaggg 600 gagtgtccat ggcaggtcct gttgttggtg aatggagctc agttgtgtgg ggggaccctg 660 atcaacacca tctgggtggt ctccgcggcc cactgtttcg acaaaatcaa gaactggagg 720 aacctgatcg cggtgctggg cgagcacgac ctcagcgagc acgacgggga tgagcagagc 780 cggcgggtgg cgcaggtcat catccccagc acgtacgtcc cgggcaccac caaccacgac 840 atcgcgctgc tccgcctgca ccagcccgtg gtcctcactg accatgtggt gcccctctgc 900 ctgcccgaac ggacgttctc tgagaggacg ctggccttcg tgcgcttctc attggtcagc 960 ggctggggcc agctgctgga ccgtggcgcc acggccctgg agctcatggt gctcaacgtg 1020 ccccggctga tgacccagga ctgcctgcag cagtcacgga aggtgggaga ctccccaaat 1080 atcacggagt acatgttctg tgccggctac tcggatggca gcaaggactc ctgcaagggg 1140 gacagtggag gcccacatgc cacccactac cggggcacgt ggtacctgac gggcatcgtc 1200 agctggggcc agggctgcgc aaccgtgggc cactttgggg tgtacaccag ggtctcccag 1260 tacatcgagt ggctgcaaaa gctcatgcgc tcagagccac gcccaggagt cctcctgcga 1320 gccccatttc cctag 1335 <210> 23 <211> 1386 <212> 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cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140 ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200 tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260 cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320 caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380 tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440 ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500 tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560 tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620 tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag 1680 cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740 aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800 gctgcaagtc aagctgcctt aggcttataa 1830 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Mutagenesis primer <400> 25 ccccatttcc cgatgcacac aagagtg 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Mutagenesis primer <400> 26 cactcttgtg tgcatcggga aatgggg 27 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 27 ccactttcac aatctgctag c 21 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 28 caattccaat gaattaacct tgg 23 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 29 atgcagcgcg tgaacatgat c 21 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 30 tcattaagtg agctttgttt tttcc 25 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 31 gattcgaatt cgcccttatg c 21 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 32 cgctcgaggt gagctttgtt ttttccttaa tc 32 <210> 33 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 33 ggatccagat cccccagagc ctccagagcc tcccgaccct ccagag 46 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 34 caaggagacg ggcgctcc 18 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 35 gcccaaggag gggattggc 19 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 36 gtggaattca tggagctgag gccctggttg 30 <210> 37 <211> 38 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 37 cacgcggccg ctcactacag ccgttgcccc gcctccac 38 <210> 38 <211> 704 <212> PRT <213> human <400> 38 Met Glu Leu Arg Pro Trp Leu Leu Trp Val Val Ala Ala Thr Gly Thr 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Ala Ala Asp Ala Gln Gly Gln Lys Val Phe Thr Asn 20 25 30 Thr Trp Ala Val Arg Ile Pro Gly Gly Pro Ala Val Ala Asn Ser Val 35 40 45 Ala Arg Lys His Gly Phe Leu Asn Leu Gly Gln Ile Phe Gly Asp Tyr 50 55 60 Tyr His Phe Trp His Arg Gly Val Thr Lys Arg Ser Leu Ser Pro His 65 70 75 80 Arg Pro Arg His Ser Arg Leu Gln Arg Glu Pro Gln Val Gln Trp Leu 85 90 95 Glu Gln Gln Val Ala Lys Arg Arg Thr Lys Arg Asp Val Tyr Gln Glu 100 105 110 Pro Thr Asp Pro Lys Phe Pro Gln Gln Trp Tyr Leu Ser Gly Val Thr 115 120 125 Gln Arg Asp Leu Asn Val Lys Ala Ala Trp Ala Gln Gly Tyr Thr Gly 130 135 140 His Gly Ile Val Val Ser Ile Leu Asp Asp Gly Ile Glu Lys Asn His 145 150 155 160 Pro Asp Leu Ala Gly Asn Tyr Asp Pro Gly Ala Ser Phe Asp Val Asn 165 170 175 Asp Gln Asp Pro Asp Pro Gln Pro Arg Tyr Thr Gln Met Asn Asp Asn 180 185 190 Arg His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Val Ala Ala Val Ala Asn Asn 195 200 205 Gly Val Cys Gly Val Gly Val Ala Tyr Asn Ala Arg Ile Gly Gly Val 210 215 220 Arg Met Leu Asp Gly Glu Val Thr Asp Ala Val Glu Ala Arg Ser Leu 225 230 235 240 Gly Leu Asn Pro Asn His Ile His Ile Tyr Ser Ala Ser Trp Gly Pro 245 250 255 Glu Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Gly Pro Ala Arg Leu Ala Glu Glu 260 265 270 Ala Phe Phe Arg Gly Val Ser Gln Gly Arg Gly Gly Leu Gly Ser Ile 275 280 285 Phe Val Trp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Arg Glu His Asp Ser Cys Asn 290 295 300 Cys Asp Gly Tyr Thr Asn Ser Ile Tyr Thr Leu Ser Ile Ser Ser Ala 305 310 315 320 Thr Gln Phe Gly Asn Val Pro Trp Tyr Ser Glu Ala Cys Ser Ser Thr 325 330 335 Leu Ala Thr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Gln Asn Glu Lys Gln Ile Val 340 345 350 Thr Thr Asp Leu Arg Gln Lys Cys Thr Glu Ser His Thr Gly Thr Ser 355 360 365 Ala Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly Ile Ile Ala Leu Thr Leu Glu Ala 370 375 380 Asn Lys Asn Leu Thr Trp Arg Asp Met Gln His Leu Val Val Gln Thr 385 390 395 400 Ser Lys Pro Ala His Leu Asn Ala Asn Asp Trp Ala Thr Asn Gly Val 405 410 415 Gly Arg Lys Val Ser His Ser Tyr Gly Tyr Gly Leu Leu Asp Ala Gly 420 425 430 Ala Met Val Ala Leu Ala Gln Asn Trp Thr Thr Val Ala Pro Gln Arg 435 440 445 Lys Cys Ile Ile Asp Ile Leu Thr Glu Pro Lys Asp Ile Gly Lys Arg 450 455 460 Leu Glu Val Arg Lys Thr Val Thr Ala Cys Leu Gly Glu Pro Asn His 465 470 475 480 Ile Thr Arg Leu Glu His Ala Gln Ala Arg Leu Thr Leu Ser Tyr Asn 485 490 495 Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ile His Leu Val Ser Pro Met Gly Thr Arg 500 505 510 Ser Thr Leu Leu Ala Ala Arg Pro His Asp Tyr Ser Ala Asp Gly Phe 515 520 525 Asn Asp Trp Ala Phe Thr Thr Thr His Ser Trp Asp Glu Asp Pro Ser 530 535 540 Gly Glu Trp Val Leu Glu Ile Glu Asn Thr Ser Glu Ala Asn Asn Tyr 545 550 555 560 Gly Thr Leu Thr Lys Phe Thr Leu Val Leu Tyr Gly Thr Ala Pro Glu 565 570 575 Gly Leu Pro Val Pro Pro Glu Ser Ser Gly Cys Lys Thr Leu Thr Ser 580 585 590 Ser Gln Ala Cys Val Val Cys Glu Glu Gly Phe Ser Leu His Gln Lys 595 600 605 Ser Cys Val Gln His Cys Pro Pro Gly Phe Ala Pro Gln Val Leu Asp 610 615 620 Thr His Tyr Ser Thr Glu Asn Asp Val Glu Thr Ile Arg Ala Ser Val 625 630 635 640 Cys Ala Pro Cys His Ala Ser Cys Ala Thr Cys Gln Gly Pro Ala Leu 645 650 655 Thr Asp Cys Leu Ser Cys Pro Ser His Ala Ser Leu Asp Pro Val Glu 660 665 670 Gln Thr Cys Ser Arg Gln Ser Gln Ser Ser Arg Glu Ser Pro Pro Gln 675 680 685 Gln Gln Pro Pro Arg Leu Pro Pro Glu Val Glu Ala Gly Gln Arg Leu 690 695 700

Claims (15)

  1. 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법으로서,
    a) 상기 치료용 폴리펩타이드가 회수 향상용 단백질에 직접 또는 링커(linker) 펩타이드를 통해 융합되고,
    b) 상기 생체내 회수율이 비융합된 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율의 110% 이상으로 증가되는,
    사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 회수 향상용 폴리펩타이드가 알부민, 이의 변이체 또는 단편인, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료용 폴리펩타이드가 비타민 K 의존성 단백질을 포함하는, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료용 폴리펩타이드가 인자 IX, 인자 VII 또는 인자 VIIa, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 치료용 폴리펩타이드 부분이 알부민 부분의 N-말단에 융합된, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 치료용 폴리펩타이드가 인자 VII 또는 인자 VIIa인, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 펩타이드 링커가 인자 VII 또는 인자 VIIa 부분을 알부민 부분으로부터 분리시킴을 특징으로 하는, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 펩타이드 링커가 해독후 변형을 위한 부위의 삽입에 의해 변형됨을 특징으로 하는, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 해독후 변형이 구조 Asn-X-Ser/Thr (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산을 나타낸다)의 하나 이상의 N-글리코실화 부위를 포함함을 특징으로 하는, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 인자 VII 폴리펩타이드 부분이 응고촉진(procoagulant) 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  11. 제5항에 있어서, 치료용 폴리펩타이드가 인자 IX인, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 펩타이드 링커가 인자 IX 부분을 알부민 부분으로부터 분리시킴을 특징으로 하는, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 펩타이드 링커가 해독후 변형을 위한 부위의 삽입에 의해 변형됨을 특징으로 하는, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 해독후 변형이 구조 Asn-X-Ser/Thr (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산을 나타낸다)의 하나 이상의 N-글리코실화 부위를 포함함을 특징으로 하는, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 인자 IX 폴리펩타이드 부분이 응고촉진 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 사람 또는 동물에서 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법.
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