JP2014503198A - 組換え酵素および他のタンパク質のタンパク質発現および分泌を改善する新規シグナル配列 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
[0001]本明細書中にそのまま援用される2010年11月22日出願の米国仮特許出願第61/415,926号に優先権を主張する。
[0002]治療的用途および他の用途のための組換え酵素および他のタンパク質の発現および分泌。
[0007]本発明は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列を提供する。
[0009]更に提供するのは、第一DNA配列に作動可能に連結されたプロモーターであって、該第一DNA配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、プロモーター;および第一DNA配列にインフレームで融合している第二DNA配列であって、異種ポリペプチドをコードしている第二DNA配列、を含むタンパク質発現ベクターである。
[0015]本発明の前述のおよび他の側面は、添付の図面と合わせて考慮された場合、以下の発明の詳細な説明から明らかである。本発明を説明するために、現在のところ好適である態様を図面に示しているが、しかしながら、本発明が、開示されている特定の手段に制限されないということは理解される。図面は、必ずしも、一定尺度で描かれていない。図面においては、以下である。
[0021]適切なポリペプチドシグナル配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントを含むことができる。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列は、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22またはSEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含むことができる。
試薬
[0038]野生型ヒトβ−グルコセレブロシダーゼ(「GlcCerase」)cDNA(NM_000157.3)、野生型ヒト酸性α−ガラクトシダーゼA(GLA)cDNA(NM_000169.2)、野生型ヒト酸性α−グルコシダーゼ(GAA)cDNA(NM_000152.2)および野生型ヒトインスリン様成長因子−2(IGF−2)cDNA(NM_000612.4)は全て、OrigeneTM(Rockville, MD)より購入したが、オリゴヌクレオチドプライマーおよび合成ミニジーンは全て、Integrated DNA TechnologiesTM(IDTTM;Coralville, IA)からであった。pEF6/V5−HisA哺乳動物発現ベクター、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s modified Eagle medium)(DMEM)、ウシ胎仔血清(FBS)および他の組織培養試薬は、InvitrogenTM(Carlsbad, CA)より入手した。制限エンドヌクレアーゼ、Phusion−HF DNA polymeraseTM、T4 DNAリガーゼ、Antarctic ホスファターゼ、化学的コンピテント大腸菌(E. coli)(DH5α細胞)は全て、New England BiolabsTM(Ipswich, MA)より購入した。いろいろなグリコシダーゼの蛍光発生基質は、Research Products InternationalTM(Mt. Prospect, IL)より購入し、DNA Gel Extraction キットおよび Miniprep DNAキットは、QIAGENTM(Valencia, CA)からであり、PureYield Maxiprep DNATMキットは、PromegaTM(Madison, WI)からであった。特に断らない限り、化学薬品は、SigmaTM(St. Louis, MO)からであり、Fugene−HDTMトランスフェクション試薬は、RocheTM(Indianapolis, IN)からであり、T抗原で形質転換済みのヒト胚性腎細胞(HEK293T)は、ATCCTMからであった。
プラスミド構築
[0039]DNAプラスミドを、それらの天然のシグナル配列を含有するかまたは改変ヒトBipシグナル配列で置き換えられたいろいろなモデルタンパク質をコードするように構築して、試験タンパク質の発現および分泌へのこれらシグナル配列の効果を評価した。
試験タンパク質の一過性発現
[0050]一過性発現実験のために、HEK293T細胞を、10%FBSを補充した1mlのDMEM培地を含む12ウェル組織培養プレート中にプレーティングし、そして37℃において5%CO2雰囲気でインキュベートした。HEK293T細胞が、70〜100%密集に達した時点で、消費された培地を、1mlの新鮮DMEM/10%FBS培地と交換し、そして各々のウェルを、個々の試験タンパク質またはPBS(模擬トランスフェクション陰性対照用)について1μgのプラスミドDNAおよび3μlの FugeneTM−HDトランスフェクション試薬で、製造者のプロトコルにしたがってトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、24〜72時間インキュベートし、そして(培地中に分泌された)個々の組換え酵素の発現について、酵素活性検定で、ならびに/またはウェスタンブロッティングおよびELISAによって、毎日検査した。
酵素活性検定
[0051]組換えヒト酸性β−グルコセレブロシダーゼ(GlcCerase)の細胞培養培地中への発現および分泌を、酵素活性検定によって、一過性トランスフェクション実験による24時間後、48時間後または約72時間における馴化培地および4−メチルウンベリフェリル−β−D−グルコピラノシド(4−MU−β−Glc)蛍光発生基質を用いて評価した。簡単にいうと、各々の試料からの20μlの馴化培地を、指定の時点で採取し、そして0.5mlミクロ遠心管中において80μlの McIlvane 緩衝液(MI緩衝液:50mMクエン酸ナトリウム/リン酸ナトリウム(pH5.2)/0.25%(v/v)Triton X−100/0.25%(w/v)タウロコール酸ナトリウム)で希釈した。25μlの各希釈試料を、(三連で行った)96ウェル透明底黒色プレートの個々のウェル中に小分けし、そして50μlの6mM 4−MU−β−Glc基質(MI緩衝液中で調製)を、マルチチャンネルピペッターによって各々のウェルに加えた。次に、それらプレートを、カバーテープで密封し、37℃で1時間インキュベートした。酵素反応は、125μlの0.1M NaOHを加えることによって止め、そして遊離した4−MU蛍光を、蛍光プレートリーダーにおいて355nm励起波長および460nm発光波長をそれぞれ用いて読み取った。模擬トランスフェクションした試料からの4−MU蛍光は、「バックグラウンド」対照として役立ち、全ての GlcCerase 試料から差し引いた。
[0054]特定のタンパク質は、極めて高レベルで天然に発現するが、他のものは不十分にしか発現しないということを確認した。mRNAの存在量および安定性は、タンパク質発現に影響することがありうる転写レベルで重要な因子であるが、シグナル配列も、タンパク質レベルで決定的な役割を果たし、この本質的に異なる(disparate)タンパク質発現に貢献するということが次第に明らかになっている。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)は、組換えタンパク質のためのタンパク質発現および分泌を改善する優れたシグナル配列を開発するのに特に好都合であると考えられるという具体的な特徴を有する。一つの改変Bipシグナル配列を作成し、モデルタンパク質に付加して、この非天然のシグナル配列が、モデルタンパク質についてのタンパク質発現および分泌を改善するかどうかを決定した。具体的には、疎水性コアを延長して、より長いαヘリックス構造を形成させた。改変Bipシグナル配列−1中の疎水性ドメインの延長は、いくつかの利点を有するであろうと予想される。第一に、改変された(より長い)疎水性ドメインは、より長いαヘリックスを形成し、リボソーム出口トンネル全体に広がると考えられ、それが、リボソームタンパク質Rpl17によって容易に識別されて、Sec61サブユニットなどの他の重要なERタンパク質およびRAMP4とのより良い相互作用を容易にすることができる。第二に、より長いαヘリックス疎水性ドメインは、この改変Bipシグナル配列が、トランスロコン細孔において新生ポリペプチドを効率よく配向させるTRAMおよびSec61サブユニットなどの重要なトランスロコンタンパク質と相互作用することを可能にして、必要なタンパク質トランスロケーション適格ループ配向を促進することができる。第三に、より長いαヘリックス疎水性ドメインは、この改変Bipシグナル配列が、シグナルペプチダーゼによってより速い速度で切断されうるように、水性トランスロコン細孔から脂質二重層中へより効率よく移動することを可能にすることができる。第四に、改変Bipシグナル配列は、トランスロコンからより速い速度で離れて移動して、組換えタンパク質が、その合成の際により早く、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、BipなどのERシャペロンタンパク質、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびカルネキシンなどの他の重要なタンパク質と相互作用することを可能にして、タンパク質フォールディングを改善することができる。これら可能性のある利点のいずれかまたは全てが、タンパク質の発現、フォールディングおよび細胞からの輸出の速度を改善すると考えられる。
[0057]タンパク質合成は、栄養素(すなわち、ATP、アミノ酸、炭水化物等)並びに他の必須細胞成分(例えば、開始因子および伸長因子、tRNA、タンパク質シャペロン等)の利用可能性によって大きく影響される。前者は、再供給の際に増加させるかまたは細胞培養培地で補給することができるが、後者成分は、細胞中で限られており、タンパク質生産の際に補充することができない。これら生命に必要な成分の枯渇は、顕著な細胞ストレスを引き起こし、それが、大部分のタンパク質の新しいタンパク質合成の減少または停止状態さえももたらす。興味深いことに、いくつかのタンパク質の発現は、これらストレスの多い期間中に適応細胞応答の一部として維持され、そして実際は増加して、ホメオスタシスへ細胞を復帰させている。これら選ばれたタンパク質が、それらの選択的発現を可能にする細胞タンパク質合成機構によってどのように区別されるかは、完全に明らかではないが、シグナル配列は、この過程において重要な役割を果たしていると考えられる。Bipは、このストレスの多い期間中にその発現が維持されて、細胞ホメオスタシスを再確立させる重要なERシャペロンタンパク質であるので、本発明者は、この改変Bipシグナル配列が、異種組換えタンパク質の選択的発現を、他のタンパク質の発現が減少するかまたは停止される条件下において維持することを可能にするであろうと考えている。この仮説を調べるために、本発明者は、KEK293T細胞培養物を、高細胞密度(約100%密集)においてWT GlcCerase およびCBP204 GlcCerase でトランスフェクションし、そしてそれらの発現および分泌を63時間にわたって監視した。更に、栄養素を枯渇させる実験中(再供給前のバッチ適用中の低栄養素期間を模擬する実験の後期段階中)に、細胞培養培地を変えないで、WT GlcCerase およびCBP204 GlcCerase の発現が、栄養素の枯渇に応答して変化するかどうかを決定した。
[0059]異なったモデルタンパク質の発現および分泌への改変Bipシグナル配列−1の効果を調べるために、DNAプラスミドを、野生型ヒト酸性α−グルコシダーゼ(GAA)であって、その天然のGAAシグナル配列を含有するもの(WT GAA)かまたは、操作されたBipシグナル配列−1およびGAAのアミノ酸残基24−952を含有するもの(CBP218GAAと命名した)をコードするように構築した。これらDNAコンストラクトを、HEK293Tにおける一過性発現によって約2日間にわたって調べて、野生型GAAの発現および分泌へのこれらシグナル配列の効果を直接的に比較した。図3で理解されうるように、CBP218GAAは、培地中においてトランスフェクション後43時間のWT GAAより2.5倍高い分泌GAA活性を有した。基底活性は、模擬トランスフェクションした(エンプティーベクター)陰性対照について認められ、そして培地中の観測酵素活性が、組換えGAAの発現によって生じたことを確かめた。これら結果は、CBP218 GAAとWT GAAとの間の唯一の違いが、それらのそれぞれのシグナル配列であるので、改変Bipシグナル配列−1(CBP218 GAAの場合)が、同じ実験条件下においてGAA発現および分泌を有意に増加させたということを示している。
ウェスタンブロッティングおよびELISA検定
[0060]試験タンパク質の発現および分泌を、ウェスタンブロット分析によって評価する。簡単にいうと、一過性トランスフェクション実験による24時間後、48時間後または72時間後の馴化細胞培養培地を集め、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)に供した後、ニトロセルロースメンブランに移す。そのメンブランを、TRIS緩衝生理食塩水/0.1%(v/v)Tween−20(TBST)中の4%(w/v)脱脂乳で、室温において振とうしながら1時間ブロッキングする。次に、メンブランを、TBST中の4%(w/v)脱脂乳中で適当に希釈した(例えば、1:5000)一次抗体(例えば、ウサギ抗ヒトIGF−2)と一緒に、室温で1時間または4℃で一晩振とうしながらインキュベートする。次に、そのブロットを、TBSTで、室温において振とうおよび複数回の緩衝液交換を伴って1時間にわたって洗浄する。次に、ブロットを、TBST中の4%(w/v)脱脂乳中で適当に希釈した(例えば、1:20,000)酵素結合二次抗体(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体)と一緒に、室温で1時間振とうしながらインキュベートする。次に、そのブロットを、TBSTで、室温において振とうおよび複数回の緩衝液交換を伴って1時間にわたって洗浄する。次に、ブロットを、化学発光基質と一緒に室温で5分間インキュベートし、そして画像化システムによってまたはフィルムによって可視化して、試験タンパク質の発現レベルを評価する。
Claims (71)
- ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列。
- ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントが、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチドシグナル配列。
- ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントが、SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチドシグナル配列。
- ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントが、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチドシグナル配列。
- ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントが、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチドシグナル配列。
- 異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントを含む融合タンパク質。
- 細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項7に記載の融合タンパク質。
- 非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項8に記載の融合タンパク質。
- ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項10に記載の融合タンパク質。
- 細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項11に記載の融合タンパク質。
- 非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項12に記載の融合タンパク質。
- ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項14に記載の融合タンパク質。
- 細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項15に記載の融合タンパク質。
- 非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項16に記載の融合タンパク質。
- ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項18に記載の融合タンパク質。
- 細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項19に記載の融合タンパク質。
- 非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項20に記載の融合タンパク質。
- ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項22に記載の融合タンパク質。
- 細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項23に記載の融合タンパク質。
- 非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項24に記載の融合タンパク質。
- 異種ポリペプチドが、一つ以上の酵素、一つ以上の生物学的応答修飾物質、一つ以上の毒素、一つ以上の抗体、一つ以上の異種ポリペプチドのフラグメント、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 酵素が、酸性β−グルコセレブロシダーゼを含む、請求項26に記載の融合タンパク質。
- 酵素が、酸性α−ガラクトシダーゼを含む、請求項26に記載の融合タンパク質。
- 酵素が、酸性α−グルコシダーゼを含む、請求項26に記載の融合タンパク質。
- 生物学的応答修飾物質が、プロインスリンを含む、請求項26に記載の融合タンパク質。
- 生物学的応答修飾物質が、インスリン様成長ホルモン−2(IGF−2)を含む、請求項26に記載の融合タンパク質。
- 生物学的応答修飾物質が、インターフェロンを含む、請求項26に記載の融合タンパク質。
- 生物学的応答修飾物質が、治療的抗体を含む、請求項26に記載の融合タンパク質。
- 生物学的応答修飾物質が、インスリン様成長ホルモン−1(IGF−1)を含む、請求項26に記載の融合タンパク質。
- ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含み、そして異種ポリペプチドが、次のもの:酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−2(IGF−2)、インターフェロン、治療的抗体およびインスリン様成長ホルモン−1(IGF−1)の一つ以上を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
- ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含み、そして異種ポリペプチドが、次のもの:酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−2(IGF−2)、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−1(IGF−1)の一つ以上を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
- ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含み、そして異種ポリペプチドが、次のもの:酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−2(IGF−2)、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−1(IGF−1)の一つ以上を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
- ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含み、そして異種ポリペプチドが、次のもの:酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−2(IGF−2)、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−1(IGF−1)の一つ以上を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項35〜38に記載の融合タンパク質。
- 細胞培養において増加した発現が、酵素活性について3日の時間経過にわたって検定することによって測定される、請求項39に記載の融合タンパク質。
- 細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項39に記載の融合タンパク質。
- 非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項41に記載の融合タンパク質。
- タンパク質発現ベクターであって、(a)第一DNA配列に作動可能に連結されたプロモーターであって、ここで前記第一DNA配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、プロモーター、および(b)前記第一DNA配列にインフレームで融合している第二DNA配列であって、異種ポリペプチドをコードしている該第二DNA配列、を含むタンパク質発現ベクター。
- 第一DNA配列が、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、請求項43に記載のタンパク質発現ベクター。
- 第二DNA配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−2(IGF−2)、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−1(IGF−1)をコードしている、請求項44に記載のタンパク質発現ベクター。
- 第一DNA配列が、SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、請求項43に記載のタンパク質発現ベクター。
- 第二DNA配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−2(IGF−2)、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−1(IGF−1)をコードしている、請求項46に記載のタンパク質発現ベクター。
- 第一DNA配列が、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、請求項43に記載のタンパク質発現ベクター。
- 第二DNA配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−2(IGF−2)、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−1(IGF−1)をコードしている、請求項48に記載のタンパク質発現ベクター。
- 第一DNA配列が、SEQ ID NO:23の一次アミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、請求項43に記載のタンパク質発現ベクター。
- 第二DNA配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−2(IGF−2)、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−1(IGF−1)をコードしている、請求項50に記載のタンパク質発現ベクター。
- ポリペプチドの製造方法であって、
(a)異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)ポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントを含む融合タンパク質を発現させること;および
(b)前記異種ポリペプチドを回収すること
を含む方法。 - 前記製造が、培養細胞中で行なわれる、請求項52に記載の方法。
- 前記培養細胞が、酵母細胞を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記培養細胞が、哺乳動物細胞を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記製造が、トランスジェニックシステム中で行われる、請求項52に記載の方法。
- 前記トランスジェニックシステムが、雌牛、ヤギ、ヒツジ、ウサギまたはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項56に記載の方法。
- 回収が、乳からである、請求項57に記載の方法。
- 前記トランスジェニックシステムが、ニワトリを含む、請求項56に記載の方法。
- 回収が、卵からである、請求項59に記載の方法。
- タンパク質発現ベクターの作製方法であって、
(a)ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている第一DNA配列に、プロモーターを作動可能に連結すること、および
(b)第二DNA配列であって、異種ポリペプチドをコードしている該第二DNA配列を、前記第一DNA配列にインフレームで融合すること
を含む方法。 - 前記第一DNA配列が、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、請求項61に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
- 前記第二DNA配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−2(IGF−2)、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−1(IGF−1)をコードしている、請求項62に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
- 前記第一DNA配列が、SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、請求項61に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
- 前記第二DNA配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−2(IGF−2)、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−1(IGF−1)をコードしている、請求項64に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
- 前記第一DNA配列が、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、請求項61に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
- 前記第二DNA配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−2(IGF−2)、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−1(IGF−1)をコードしている、請求項66に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
- 前記第一DNA配列が、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、請求項61に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
- 前記第二DNA配列が、酸性β−グルコセレブロシダーゼ、酸性α−ガラクトシダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン−2(IGF−2)、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン−1(IGF−1)をコードしている、請求項68に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。
- タンパク質発現を増加させる方法であって、
(a)ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、および
(b)該異種タンパク質を回収すること
を含む方法。 - タンパク質分泌を増加させる方法であって、
(a)ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(Bip)の改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、および
(b)該異種タンパク質を回収すること
を含む方法。
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