KR20130121878A - 재조합 효소 및 다른 단백질의 단백질 발현 및 분비를 개선시키기 위한 신규 신호 서열 - Google Patents

재조합 효소 및 다른 단백질의 단백질 발현 및 분비를 개선시키기 위한 신규 신호 서열 Download PDF

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Abstract

인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편의 폴리펩티드 신호 서열을 개시한다. 또한, 이종 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 융합 단백질을 개시한다. 또한, 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 신호 서열을 코딩하는 제1 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 이종 폴리펩티드를 코딩하며 프레임 내에서 제1 DNA 서열에 융합되어 있는 제2 DNA 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터를 개시한다. 추가로, 이종 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편의 폴리펩티드 신호 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및 상기 이종 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법을 개시한다.

Description

재조합 효소 및 다른 단백질의 단백질 발현 및 분비를 개선시키기 위한 신규 신호 서열 {NOVEL SIGNAL SEQUENCES TO IMPROVE PROTEIN EXPRESSIONS AND SECRETION OF RECOMBINANT ENZYMES AND OTHER PROTEINS}
관련 출원의 상호 참조
2010년 11월 22일에 출원된 미국 가특허출원 번호 61/415,926을 우선권 주장하며, 이 출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
치료 용도 및 다른 용도를 위한 재조합 효소 및 다른 단백질의 발현 및 분비에 관한 것이다.
진핵 생물에서, 거의 모든 단백질에 대한 단백질 합성은 리보솜이라 불리는 메가(mega) 단백질 복합체를 통해 세포질에서 시작된다. 다양한 단백질이 세포질에서 그의 합성 및 폴딩을 완료하고, 그가 작용하는 그 위치에 그대로 남아 있는다. 그러나, 다수의 다른 것들은 세포질 밖으로 외수송되어, 그의 의도된 세포 위치로 (예컨대 골지, 퍼옥시좀 및 리소좀 단백질), 또는 세포 표면으로 (예컨대 수용체, 이온 채널 등) 외수송되기 이전에 또는 세포 밖으로 분비되기 이전에 (예컨대 항체, 응고 인자, 호르몬 등) 그의 적절한 단백질 구조 및 생물학적 활성을 얻는 데 필요한 번역 후 변형 (예컨대 이황화 결합, 당화 등)을 획득하게 되는 곳인 소포체 (ER) 내로 수송된다. 세포질 밖으로 외수송될 운명인 단백질은 아미노 (N-) 말단에 신호 서열이라고 불리는 분화된 단백질 요소에 의해 세포질 단백질과 구별된다.
(신호 펩티드로도 불리는) 신호 서열은 컨센서스 아미노산 서열 또는 길이를 가지지는 않지만, 전형적으로는 대개 하전된 잔기가 그 측면에 위치하는 α-나선형 2차 구조를 형성하는 7-20개의 연속하는 소수성 아미노산 잔기를 포함하는 N-말단에 처음 15-40개의 잔기를 포함한다. 신호 서열은, 이들 초기 단백질을 트랜스로콘이라 불리는 ER 막 내의 분화된 세공으로 인도하여 여기서 단백질이 ER 막을 통해 ER 루멘 내로 수송되도록 하는 것인 단백질 전좌로 알려져 있는 과정에서 인도하는 역할을 하는, 신호 인식 입자 (SRP)로 불리는 분화된 다중 서브유닛 단백질:RNA 복합체에 의해 세포질에서 확인된다.
단백질 전좌는 포유동물에서 단백질 합성 동안에 함께 동시에 이루어지는 반면 (즉, 공번역 전좌 방식인 반면), 다른 진핵생물 (예컨대 효모)에서 상기 과정은 공번역 또는 번역 후 방식일 수 있다. 박테리아에서는 단백질을 세포질 밖으로 및 주변세포질 내로 인도하기 위해 신호 서열 매개 단백질 전좌가 또한 사용된다. 포유동물에서, 신호 서열은, 단백질 번역을 일시적으로 중단함으로써 SRP 수용체를 통해 전체 SRP-초기 단백질-리보솜 복합체가 트랜스로콘으로 표적화될 수 있도록 하는 리보솜으로부터 나오기 때문에, 이는 SRP에 의해 확인된다. 단백질 합성은 SRP가 유리되고, 리보솜-초기 단백질 복합체가 트랜스로콘에 적절하게 도킹된 이후에 재개된다.
대부분의 효소 및 다른 단백질 치료제는 하류 정제 과정을 간소화시키기 위해 상기 재조합 단백질이 세포 밖 및 세포 배양물 내로 분비될 수 있도록 디자인된 재조합 기술에 의해 제조된다. 따라서, 이러한 재조합 효소 및 다른 단백질은 분비를 위해 신호 서열 및 상기와 같은 세포 경로를 이용하여야 한다. 그러므로, 상기 단백질을 고수준으로 제조하기 위해서는 효율적인 ER 표적화 및 ER 막을 통한 단백질 전좌를 매개할 수 있는 신호 서열이 요구된다. 그러나, ER 표적화 및 전좌를 촉진시키기 위한 신호 서열은 등가의 것이 아니다. SRP에 의해 신호 서열을 확인하는 것은 신속하게 효율적으로 이루어질 수 있다고 여겨지지만, 이후 ER 표적화 및 전좌 단계는 단백질 중에서 고도로 이질적이다. 신호 서열이 2회에 걸쳐 인식되기 때문에, 먼저 SRP에 의해 초기 단백질-리보솜 복합체를 ER로 표적화한 후, 이어서, 트랜스로콘 단백질 (즉, Sec61 단백질) 및 다른 트랜스로콘-결합 ER 단백질에 의해 전좌를 개시하는 것, 이 둘 모두 조절에 대한 잠재적인 영역이 된다. 상기 중 후자의 단계는 더욱더 엄격하고, 덜 효율적인 것으로 나타났는 바, 이에 상기 과정에서 주된 장애 요소가 된다. 놀랍게도, 대부분의 신호 서열은 단백질 전좌을 촉진함에 있어 본질적으로 비효율적이다. 결과적으로, 다수의 ER로 표적화되는 초기 단백질-리보솜 복합체는 ER 막으로부터 해리되고, 단백질 합성은 중단되어 그의 단백질 발현 및 분비는 감소하게 된다.
개요
본 발명은 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열을 제공한다.
본 발명은 또한 이종 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열을 코딩하는 제1 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 이종 폴리펩티드를 코딩하며 프레임 내에서 제1 DNA 서열에 융합되어 있는 제2 DNA 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터를 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 이종 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)로부터 유도된 폴리펩티드 신호 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및 상기 이종 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.
이종 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및 상기 이종 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법 또한 개시한다.
본 발명은 추가로 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열을 코딩하는 제1 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 이종 폴리펩티드를 코딩하며 프레임 내에서 상기 제1 DNA 서열에 융합되어 있는 제2 DNA 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터를 제공한다.
인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편 및 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및 이종 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 단백질 발현을 증가시키는 방법 또한 개시한다.
본 개시된 발명은 또한 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편 및 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및 이종 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 단백질 분비를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 측면 및 다른 것은 첨부된 도면과 함께 고찰해 볼 때, 하기 기술되는 본 발명의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 본 발명에서 바람직한 실시양태를 도면으로 제시한 것이나, 본 발명을 개시된 구체적인 수단으로 제한하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다. 도면이 반드시 일정 비율로 도시화된 것은 아니다. 도면에서,
도 1은 약 72시간 동안에 걸친 재조합 야생형 인간 산성 β-글루코세레브로시다제의 발현 및 분비에 대한 신호 서열의 기능적 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 높은 세포 밀도 및 영양 고갈에서의 약 63시간 동안에 걸친 재조합 야생형 인간 산성 β-글루코세레브로시다제의 우선적 발현 및 분비를 나타낸 것이다.
도 3은 약 43시간 동안에 걸친 재조합 야생형 인간 산성 α-글루코시다제의 발현 및 분비에 대한 신호 서열의 기능적 효과를 나타낸 것이다.
예시적인 실시양태에 관한 상세한 설명
본원에서 사용되는 바, "이종 폴리펩티드"는 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편이 아닌 임의의 폴리펩티드이다.
본원에서 사용되는 바, "Bip"는 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질의 약칭이다.
적합한 폴리펩티드 신호 서열은 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함할 수 있다. 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
적합한 융합 단백질은 이종 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다. 세포 배양물은 또한 비-최적 세포 배양 조건에 있을 수 있다. 비-최적 세포 배양 조건은 높은 세포 밀도 및 영양 고갈일 수 있다. 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 다른 적합한 융합 단백질은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이들 융합 단백질도 모두 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다. 세포 배양물은 또한 비-최적 세포 배양 조건에 있을 수 있다. 비-최적 세포 배양 조건은 높은 세포 밀도 및 영양 고갈일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 하나 이상의 효소, 하나 이상의 생물학적 반응 개질제, 하나 이상의 독소, 하나 이상의 항체, 이종 폴리펩티드의 하나 이상의 단편, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 산성 β-글루코세레브로시다제일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 또한 산성 α-갈락토시다제일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 또한 산성 α-글루코시다제일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 또한 프로인슐린일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 또한 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2)일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 또한 인터페론일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 또한 치료 항체일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 또한 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1)일 수 있다.
인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 다른 적합한 융합 단백질은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이종 폴리펩티드는 β-글루코세레브로시다제를 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 야생형 β-글루코세레브로시다제 (천연 β-글루코세레브로시다제 신호 서열을 포함하는 β-글루코세레브로시다제)와 비교하였을 때, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다. 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 β-글루코세레브로시다제 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다. 세포 배양물은 또한 비-최적 세포 배양 조건에 있을 수 있다. 비-최적 세포 배양 조건은 높은 세포 밀도 및 영양 고갈일 수 있다. 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 β-글루코세레브로시다제 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다.
인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 다른 적합한 융합 단백질은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이종 폴리펩티드는 산성 α-갈락토시다제를 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 야생형 α-갈락토시다제 (천연 α-갈락토시다제 신호 서열을 포함하는 α-갈락토시다제)와 비교하였을 때, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다. 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 α-갈락토시다제 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다. 세포 배양물은 또한 비-최적 세포 배양 조건에 있을 수 있다. 비-최적 세포 배양 조건은 높은 세포 밀도 및 영양 고갈일 수 있다. 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 α-갈락토시다제 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다.
인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 다른 적합한 융합 단백질은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이종 폴리펩티드는 산성 α-글루코시다제를 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 야생형 산성 α-글루코시다제 (천연 산성 α-글루코시다제 신호 서열을 포함하는 산성 α-글루코시다제)와 비교하였을 때, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다. 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 산성 α-글루코시다제 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다. 세포 배양물은 또한 비-최적 세포 배양 조건에 있을 수 있다. 비-최적 세포 배양 조건은 높은 세포 밀도 및 영양 고갈일 수 있다. 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 산성 α-글루코시다제 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다.
인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 다른 적합한 융합 단백질은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이종 폴리펩티드는 프로인슐린을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 야생형 프로인슐린 (천연 프로인슐린 신호 서열을 포함하는 프로인슐린)과 비교하였을 때, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다. 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 프로인슐린 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다. 세포 배양물은 또한 비-최적 세포 배양 조건에 있을 수 있다. 비-최적 세포 배양 조건은 높은 세포 밀도 및 영양 고갈일 수 있다. 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 프로인슐린 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다.
인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 다른 적합한 융합 단백질은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이종 폴리펩티드는 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2)를 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 야생형 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2) (천연 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2) 신호 서열을 포함하는 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2))와 비교하였을 때, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다. 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2) 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다. 세포 배양물은 또한 비-최적 세포 배양 조건에 있을 수 있다. 비-최적 세포 배양 조건은 높은 세포 밀도 및 영양 고갈일 수 있다. 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2) 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다.
인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 다른 적합한 융합 단백질은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이종 폴리펩티드는 인터페론을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 야생형 인터페론 (천연 인터페론 신호 서열을 포함하는 인터페론)과 비교하였을 때, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다. 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 인터페론 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다. 세포 배양물은 또한 비-최적 세포 배양 조건에 있을 수 있다. 비-최적 세포 배양 조건은 높은 세포 밀도 및 영양 고갈일 수 있다. 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 인터페론 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다.
인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 다른 적합한 융합 단백질은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이종 폴리펩티드는 치료 항체를 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 야생형 치료 항체 (천연 치료 항체 신호 서열을 포함하는 치료 항체)와 비교하였을 때, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다. 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 치료 항체 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다. 세포 배양물은 또한 비-최적 세포 배양 조건에 있을 수 있다. 비-최적 세포 배양 조건은 높은 세포 밀도 및 영양 고갈일 수 있다. 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 치료 항체 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다.
인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 다른 적합한 융합 단백질은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이종 폴리펩티드는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1)을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 야생형 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1) (천연 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1) 신호 서열을 포함하는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1))와 비교하였을 때, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 할 수 있다. 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1) 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다. 세포 배양물은 또한 비-최적 세포 배양 조건에 있을 수 있다. 비-최적 세포 배양 조건은 높은 세포 밀도 및 영양 고갈일 수 있다. 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 세포 배양물 중에서의 발현 증가는 약 3일 동안의 기간에 걸쳐 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1) 활성에 대하여 검정함으로써 측정될 수 있다.
적합한 단백질 발현 벡터는 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열을 코딩하는 제1 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 이종 폴리펩티드를 코딩하며 프레임 내에서 제1 DNA 서열에 융합되어 있는 것인 제2 DNA 서열을 포함할 수 있다. 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제2 DNA 서열은 β-글루코세레브로시다제를 코딩할 수 있다.
적합한 단백질 발현 벡터는 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열을 코딩하는 제1 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 이종 폴리펩티드를 코딩하며 프레임 내에서 제1 DNA 서열에 융합되어 있는 것인 제2 DNA 서열을 포함할 수 있다. 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제2 DNA 서열은 α-글루코시다제를 코딩할 수 있다.
적합한 단백질 발현 벡터는 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열을 코딩하는 제1 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 이종 폴리펩티드를 코딩하며 프레임 내에서 제1 DNA 서열에 융합되어 있는 것인 제2 DNA 서열을 포함할 수 있다. 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제2 DNA 서열은 다른 이종 단백질, 예컨대 산성 α-갈락토시다제를 코딩할 수 있다. 이종 폴리펩티드는 또한 프로인슐린일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 또한 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2) 또는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1)일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 또한 인터페론일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 또한 치료 항체일 수 있다. 이종 폴리펩티드는 또한 세포 밖으로 분비되는 임의의 다른 단백질일 수 있다.
폴리펩티드를 제조하는 데 적합한 방법은 이종 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및 상기 이종 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 폴리펩티드를 제조하는 방법은 배양 세포에서 수행될 수 있다. 배양 세포는 효모 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다. 폴리펩티드를 제조하는 방법은 트랜스제닉 시스템에서 수행될 수 있다. 트랜스제닉 시스템은 소, 염소, 양, 토끼, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 트랜스제닉 시스템으로부터의 회수는 유즙으로부터의 회수일 수 있다. 트랜스제닉 시스템은 또한 닭을 포함할 수 있다. 트랜스제닉 시스템으로부터의 회수는 난으로부터의 회수일 수 있다.
단백질 발현 벡터를 제조하는 데 적합한 방법은 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열을 코딩하는 제1 DNA 서열에 프로모터를 작동가능하게 연결시키는 단계, 및 이종 폴리펩티드를 코딩하는 제2 DNA 서열을 프레임 내에서 제1 DNA 서열에 융합시키는 단계를 포함할 수 있다. 단백질 발현 벡터를 제조하는 방법은 또한 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 코딩하는 제1 DNA 서열을 가질 수 있다. 단백질 발현 벡터를 제조하는 방법은 또한 산성 β-글루코세레브로시다제, 산성 α-갈락토시다제, 산성 α-글루코시다제, 프로인슐린, 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2), 인터페론, 치료 항체 또는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1) 또는 세포 밖으로 분비되는 다른 단백질을 코딩하는 제2 DNA 서열을 가질 수 있다.
단백질 발현을 증가시키는 데 적합한 방법은 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편 및 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및 이종 단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
단백질 분비를 증가시키는 데 적합한 방법은 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편 및 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및 이종 단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
실시예 1
시약
야생형 인간 β-글루코세레브로시다제 ("GlcCerase") cDNA (NM_000157.3), 야생형 인간 산성 α-갈락토시다제 A (GLA) cDNA (NM_000169.2), 야생형 인간 산성 α-글루코시다제 (GAA) cDNA (NM_000152.2) 및 야생형 인간 인슐린-유사 성장 인자-2 (IGF-2) cDNA (NM_000612.4) 모두 오리진(Origene)™ (미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 구입한 반면, 모든 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 합성 미니유전자는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies)™ (IDT™; 미국 아이오와주 코랄빌)로부터 입수하였다. pEF6/V5-HisA 포유동물 발현 벡터, 둘베코스 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium: DMEM), 우태아 혈청 (FBS) 및 다른 조직 배양 시약은 인비트로겐(Invitrogen)™ (미국 캘리포니아주 칼즈배드)으로부터 입수하였다. 제한 엔도뉴클레아제, 퓨전-HF DNA(Phusion-HF DNA) 폴리머라제™, T4 DNA 리가제, 앤탁틱(Antarctic) 포스파타제, 화학상 적격인 E. 콜라이(E. coli) (DH5α 세포) 모두 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)™ (미국 매사추세츠주 입스위치)로부터 구입하였다. 각종 글리코시다제에 대한 형광 기질은 리서치 프로덕츠 인터내셔널(Research Products International)™ (미국 일리노이주 마운트 프로스펙트)로부터 구입하고, DNA 겔 추출 및 미니프렙 DNA 키트(DNA Gel Extraction and Miniprep DNA kit)는 퀴아젠(QIAGEN)™ (미국 캘리포니아주 발렌시아)으로부터, 퓨어일드 맥시프렙 DNA™ 키트(PureYield Maxiprep DNA™ kit)는 프로메가(Promega)™ (미국 위스콘신주 매디슨)로부터 입수하였다. 달리 언급되지 않는 한, 화학물질은 시그마(Sigma)™ (미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 입수하고, 퓨젠-HD(Fugene-HD)™ 형질감염 시약은 로슈(Roche)™ (미국 미국 인디애나주 인디애나폴리스)로부터 입수하고, T-항원 (HEK293T)으로 형질전환된 인간 배아 신장 세포는 ATCC™로부터 입수하였다.
실시예 2
플라스미드 구축
그의 천연 신호 서열을 포함하거나, 변형된 인간 Bip 신호 서열로 치환된 다양한 모델 단백질을 코딩하는 DNA 플라스미드를 구축하여 상기 신호 서열이 시험 단백질의 발현 및 분비에 미치는 효과를 평가하였다.
인간 산성 β-글루코세레브로시다제 (GlcCerase, EC 3.2.1.45)를 평가하기 위하여, 그의 천연 신호 서열 또는 인간 Bip 신호 서열 또는 변형된 Bip 신호 서열을 포함하는 야생형 GlcCerase를 코딩하는 수개의 상이한 DNA 플라스미드를 구축하였다. 그의 천연 신호 서열을 포함하는 야생형 인간 GlcCerase를 생성하기 위해, 프라이머 1 & 2 (하기 표 I) 및 GlcCerase cDNA 클론 (NM_000157.3, 오리진)을 사용하여 퓨전-HF DNA 폴리머라제™을 통해 PCR에 의해서 전체 인간 GlcCerase cDNA를 증폭시켰다. 프라이머 1은 천연 GlcCerase 코작(Kozak) 서열 바로 앞에 5' Bgl II 및 내부 EcoRI 제한 부위를 함유하도록 구축한 반면, 프라이머 2는 PCR 생성물이 포유동물 발현 벡터로 클로닝될 수 있도록 하기 위해 종결 코돈 다음에 3' NheI 및 NotI 제한 부위를 함유하였다. ~1.6 킬로베이스 (kb)의 PCR 생성물 (A)을 분리하고, 1% (w/v) 아가로스 분취용 겔로부터 잘라내고, 퀴아젠 겔 추출용 키트™를 사용하여 단리시켰다. 이어서, PCR 생성물 A를 37℃에서 밤새도록 제한 엔도뉴클레아제 Bgl II 및 NotI로 분해하고, 다시 정제하고, 앞서 BamHI 및 NotI로 분해되고 앤탁틱 포스파타제로 탈인산화된 pEF6/V5-HisA 포유동물 발현 벡터 (인비트로겐™)로 T4 DNA 리가제를 이용하여 결찰시켰다. Bgl II 제한 부위를 프라이머 1 내로 도입하여 Bgl II로 분해된 GlcCerase PCR 생성물의, pEF6/V5-HisA 벡터의 화합성 BamHI 부위로의 결찰을 통해 다중 클로닝 부위 내의 BamHI 제한 부위를 제거하였고, 이와 같이 변형된 발현 벡터는 이하 pEF6'으로 지칭하는 것으로 하였다. pHD101로 지정된 상기 DNA 구축물을 사용하여 화학상 적격인 E. 콜라이 세포를 형질전환시키고, 개별 앰피실린-내성 박테리아 콜로니를 확장시키고, 각각 EcoRI & NheI 및 BamHI를 이용하여 제한 분해 반응에 의해 스크리닝하였다. (pHD101.4로 지정된) 클론 4로부터의 올바른 플라스미드 DNA는 DNA 서열 분석을 통해 추가로 확인하고, 야생형 GlcCerase의 발현에 대해 선별하였다. pHD101.4를 사용하여, 천연 GlcCerase 신호 서열 대신 인간 Bip 신호 서열 또는 변형된 버전의 상기 Bip 신호 서열을 포함하는 야생형 GlcCerase를 코딩하는 다른 플라스미드를 구축하였다. 간략하면, 전체 18개의 잔기로 된 천연 인간 Bip 신호 서열에 대한 유전자인 효모 알콜 옥시다제 1 (AOX1) 유전자로부터의 천연 코작 서열 (그의 천연 신호 펩티다제 인식 서열: Ser-Ala-Ala-Arg-Ala; SAARA (서열 번호 24) 포함), 및 성숙한 야생형 인간 GlcCerase의 N-말단의 123개의 아미노산 잔기 (뉴클레오티드 118-490)를 포함하는 (하기 표 II에서 미니유전자 1로 지정된) 이중 가닥 DNA 미니유전자를 구축하였다 (그리고, 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스™, IDT™에 의해 합성하였다). 미니유전자 1은 또한 AOX1 코작 서열 앞에 5' EcoRI 제한 부위, 및 천연 GlcCerase 신호 서열을 인간 Bip 신호 서열로 치환하기 위해 pHD101.4로 클로닝될 수 있도록 GlcCerase 유전자 내의 3' 말단에 천연 NcoI 부위를 함유하였다. 또한, 상기 전략법을 통해 (유도성 AOX1 프로모터의 제어하에) 포유동물 또는 효모 시스템에서 (Bip 신호 서열을 포함하는) 야생형 GlcCerase의 발현을 위한 DNA 플라스미드를 구축할 수 있었다. 상기 융합 단백질 및 다른 것의 디자인을 통해 시그널P 4.0™(SignalP 4.0)™ 분석 프로그램을 사용함으로써 Bip 신호 서열이 시험 단백질로부터 절단되었는지 여부를 예측하였다.
신호 서열 절단을 촉진시키기 위해, 필요에 따라 추가의 아미노산 잔기를 구축물에 부가하였고, 상기 융합 시험 단백질을 생성하기 위해 오직 적절한 신호 서열 절단을 가지는 것으로 예측된 서열만을 선별하였다. 포유동물 시스템에서의 발현을 위해, 프라이머 3 & 4 및 미니유전자 1 DNA 주형을 사용하여 PCR을 통해 천연 인간 Bip 코작 서열을 함유하는 Bip-GlcCerase DNA 단편을 합성하였다. 이러한 ~440 bp의 PCR 생성물 (B)를 분리하고, 1% (w/v) 아가로스 분취용 겔로부터 잘라내고, 퀴아젠 겔 추출용 키트™를 사용하여 단리시켰다. PCR 생성물 B를 밤새도록 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 NcoI로 분해하고, 다시 정제하고, (천연 GlcCerase 신호 서열이 존재하지 않는) 성숙한 야생형 GlcCerase의 아미노산 잔기 124-497을 코딩하는 pHD101.4로부터의 NcoI→NotI DNA 단편, 및 앞서 기술된 것과 같은 ~5.8 kb EcoRI→NotI pEF6' 벡터 DNA 단편과 결찰시켰다. pHD201로 지정된 상기 DNA 구축물을 EcoRI-XbaI를 사용하는 제한 분해에 의해 체크하고, 올바른 클론 (pHD201.2)은 DNA 서열 분석을 통해 확인한 후, 이어서, 이를 이용하여 인간 Bip 신호 서열이 야생형 GlcCerase의 발현 및 분비에 미치는 효과에 대하여 평가하였다. 유사하게, AOX1 효모 유전자로부터의 천연 코작 서열, 천연 인간 Bip 신호 서열의 처음 13개의 잔기, 이어서, 아미노산 잔기 4-13의 반복부, 천연 Bip 신호 펩티다제 인식 서열 (잔기 14-18) 및 성숙한 야생형 인간 GlcCerase의 N-말단의 123개의 잔기 (뉴클레오티드 118-490)를 포함하는, 변형된 버전의 Bip 신호 서열 (미니유전자 2)을 구축하고, IDT™에 의해 합성하였다. (변형된 Bip 신호 서열-1로 지정된) Bip 신호 서열의 상기와 같은 변형을 통해 소수성 도메인은 확장되었고, 이로써 ER 막 전체에 걸쳐져 있게 되고, 신호 서열은 18개에서 28개의 잔기로 신장되었다. 포유동물 시스템에서의 발현을 위해, 프라이머 3 & 4 및 미니유전자 2 DNA 주형을 사용하여 PCR을 통해 천연 인간 Bip 코작 서열 단편을 포함하는 변형된 Bip 신호 서열-1-GlcCerase DNA를 합성하였다. 이러한 ~470 bp의 PCR 생성물 (C)를 1% (w/v) 아가로스 분취용 겔로부터 단리시키고, EcoRI 및 NcoI로 분해하고, 다시 정제하고, (천연 GlcCerase 신호 서열이 존재하지 않는) 성숙한 야생형 GlcCerase의 아미노산 잔기 124-497을 코딩하는 pHD101.4로부터의 NcoI→NotI DNA 단편, 및 상기와 같은 ~5.8 kb EcoRI→NotI pEF6' 벡터 DNA 단편과 결찰시켰다. pHD204로 지정된 상기 DNA 구축물을 EcoRI 및 XbaI를 사용하는 제한 분해에 의해 체크하고, 올바른 클론 (pHD204.1)은 DNA 서열 분석을 통해 확인한 후, 이어서, 이를 이용하여 상기 변형된 Bip 신호 서열이 야생형 GlcCerase의 발현 및 분비에 미치는 효과에 대하여 평가하였다.
본원에서 DNA 구축물을 제조하는 데 사용된 프라이머는 하기 표 1에 요약되어 있다.
Figure pct00001
이어서, 변형된 Bip 신호-1을 다른 단백질에 부가하여 이것이 상기 단백질의 발현 및 분비에 미치는 효과를 평가하였다. 간략하면, 천연 인간 Bip 신호 서열의 처음 13개의 잔기, 이어서, 아미노산 잔기 4-13의 반복부, 및 천연 Bip 신호 펩티다제 인식 서열의 잔기 14-17을 포함하는 미니유전자 3 (표 II)을 구축하였다. 미니유전자 3은 인간 Bip로부터의 천연 코작 서열 뿐만 아니라, 5' EcoRI 및 3' StuI 및 NotI 제한 부위를 포함하였다. StuI 제한 효소가 천연 Bip 신호 펩티다제 절단 서열로부터의 잔기 17에서 천연 Arg로서의 역할을 하는 (아르기닌, Arg; R에 대한 코돈) AGG 다음의 3' 블런트 말단을 생성하기 때문에, 상기 제한 효소를 미니유전자 3 내로 도입하였다. 그러므로, 단, 추가의 알라닌의 N-말단의 단백질 서열 내로의 부가를 통해 천연 SAARA (서열 번호 24) 신호 펩티다제 인식 서열이 완성된다면, 임의의 단백질을 상기 변형된 Bip 신호 서열 단편에 결찰시킬 수 있었다.
Bip 및 변형된 Bip 신호 서열에 대한 미니유전자의 DNA 뉴클레오티드 서열은 하기 표 2에 요약되어 있다.
Figure pct00002
산성 α-갈락토시다제 A (GLA, EC 3.2.1.22)를 평가하기 위해, 그의 천연 신호 서열을 포함하는 야생형 효소를 GLA cDNA 클론 (NM_000169.2, 오리진™) 주형 DNA와 함께 프라이머 5 & 6을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 이러한 ~1.3 kb의 PCR 생성물을 아가로스 분취용 겔에 의해 단리시키고, EcoRI 및 NotI로 분해하고, EcoRI-NotI로 분해되고 탈인산화된 pEF6'에 결찰시켰다. 상기 DNA 구축물을 pHD214로 지정하고, 이를 사용하여 GLA 발현에 대하여 평가하였다. 변형된 Bip 신호 서열-1을 포함하는 GLA를 구축하기 위해, GLA cDNA 클론 주형 DNA와 함께 프라이머 6 & 7을 사용하여 PCR에 의해 성숙한 GLA 효소를 합성하였다. 이러한 ~1.2 kb의 PCR 생성물 (D)을 NotI로 분해하고, 아가로스 분취용 겔로부터 단리시키고, EcoRI→StuI 미니유전자 3 DNA 단편 및 상기와 같은 EcoRI→NotI로 분해된 pEF6' 벡터에 결찰시켰다. 상기 DNA 구축물을 pHD215로 지정하고, 이를 사용하여 상기 변형된 Bip 신호 서열이 야생형 GLA의 발현 및 분비에 미치는 효과를 평가하였다.
산성 α-글루코시다제 (GAA, EC 3.2.1.0)를 평가하기 위해, (그의 천연 신호 서열을 포함하는) 전체 야생형 GAA 효소를 GAA cDNA 클론 (NM_000152.2, 오리진) 주형 DNA와 함께 프라이머 8 & 9를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 이러한 ~3 kb의 PCR 생성물 (E)을 아가로스 분취용 겔에 의해 단리시키고, EcoRI 및 NotI로 분해하고, EcoRI-NotI로 분해되고 탈인산화된 pEF6'에 결찰시켰다. 상기 DNA 구축물을 pHD217로 지정하고, 이를 사용하여 그의 천연 신호 서열을 포함하는 GAA 발현에 대하여 평가하였다. GAA는 성숙한 효소 앞에 다중 프로서열과 함께 발현되기 때문에 (문헌 [Moreland et al, 2005]), 다양한 길이의 상이한 GAA 단백질을 합성하고, 시험을 위해 변형된 Bip 신호 서열-1에 부가하였다. 프라이머 9 & 10를 사용하여 PCR에 의해, 그의 천연 신호 서열은 존재하지 않지만 잔기 24-952는 포함하는 GAA DNA 단편을 합성하였다. 이러한 ~3 kb의 PCR 생성물 (F)을 아가로스 분취용 겔로부터 단리시키고, NotI로 분해하고, EcoRI→StuI 미니유전자 3 DNA 단편 및 EcoRI→NotI로 분해된 pEF6' 벡터에 결찰시켰다. 변형된 Bip 신호 서열-1 및 GAA (24-952)를 포함하는 상기 DNA 구축물을 pHD218로 지정하였다. 유사하게, 프라이머 9 & 11을 사용하여 PCR에 의해, 그의 천연 신호 서열은 존재하지 않지만 잔기 57-952는 포함하는 GAA DNA 단편을 합성하였다. 이러한 ~2.9 kb의 PCR 생성물 (G)을 아가로스 분취용 겔로부터 단리시키고, NotI로 분해하고, EcoRI→StuI 미니유전자 3 DNA 단편 및 상기와 같은 EcoRI→NotI로 분해된 pEF6' 벡터에 결찰시켰다. 변형된 Bip 신호 서열-1 및 GAA (57-952)를 포함하는 상기 DNA 구축물을 pHD219로 지정하였다. 프라이머 9 & 12를 사용하여 PCR에 의해 그의 천연 신호 서열은 존재하지 않지만, 잔기 78-952는 포함하는 GAA DNA 단편을 합성하였다. 이러한 ~2.8 kb의 PCR 생성물 (H)을 아가로스 분취용 겔로부터 단리시키고, NotI로 분해하고, EcoRI→StuI 미니유전자 3 DNA 단편 및 EcoRI→NotI로 분해된 pEF6' 벡터에 결찰시켰다. 변형된 Bip 신호 서열-1 및 GAA (78-952)를 포함하는 상기 DNA 구축물을 pHD220으로 지정하였다. 이에, DNA 구축물 pHD217-220을 사용하여 상기 변형된 Bip 신호 서열-1 뿐만 아니라, 프로서열이 GAA 발현 및 분비에 미치는 효과를 면밀하게 조사할 수 있었다.
변형된 Bip 신호 서열-1로부터 유도되는 다른 변형된 Bip 신호 서열 (표 III)을 디자인하였고, 상기와 같은 추가의 변형이 단백질 발현 및 분비를 추가로 개선시킬 수 있는지 여부를 사정 평가하는 것으로 하였다. 이러한 변형은 14 & 15번 위치의 세린 및 류신 잔기를 단일 트립토판 잔기로 치환하고, 소수성 도메인 내의 18 & 19번 위치의 알라닌 및 메티오닌 잔기를 결실시키는 것 (이는 변형된 Bip 신호 서열-2로 지정), 소수성 도메인 내의 18 & 19번 위치의 알라닌 및 메티오닌 잔기를 결실시키는 것 (이는 변형된 Bip 신호 서열-3으로 지정), 14번 위치의 세린 잔기를 알라닌으로 치환하고, 소수성 도메인 내의 18 & 19번 위치의 알라닌 및 메티오닌 잔기를 결실시키는 것 (이는 변형된 Bip 신호 서열-4로 지정)을 포함하였다. 이러한 변형은 소수성 도메인의 소수성을 증가시킴으로써 상기 신호 서열과 중요한 리보솜 및 ER 트랜스로콘 단백질의 상호작용을 추가로 증진시키고, 재조합 단백질의 단백질 전좌 및 분비 개선을 위해 더욱 효율적인 신호 펩티다제 절단 부위를 생성하고자 하는 것이었다.
인간 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자-2 (IGF-2), 항체, 인터페론, 아포지단백질 등을 비롯한 다른 시험 단백질 또한 상기와 같은 변형된 Bip 신호 서열이 그의 발현 및 분비를 개선시킬 수 있는지 여부를 측정함으로써 평가하는 것으로 하였다.
변형된 Bip 신호 서열에 대한 아미노산 서열은 하기 표 3에 요약되어 있다.
Figure pct00003
실시예 3
시험 단백질의 일시적 발현
일시적인 발현 실험을 위해, HEK293T 세포를 10% FBS로 보충된 1 ml의 DMEM 배지를 포함하는 12-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 5% CO2 대기하에 37℃에서 인큐베이션시켰다. HEK293T 세포가 70-100% 컨플루언시에 도달하였을 때, 폐 배지를 1 ml의 신선한 DMEM/10% FBS 배지로 대체하고, 각 웰을 각 개개의 시험 단백질에 대한 1 ㎍ 플라스미드 DNA로, 또는 (모의-형질감염된 음성 대조군의 경우) PBS로 형질감염시키고, 제조사의 프로토콜에 따라 3 ㎕의 퓨젠™-HD 형질감염 시약으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 24-72시간 동안 인큐베이션시키고, 효소 활성 검정법 및/또는 웨스턴 블롯팅 및 ELISA에 의해 (배지로 분비된) 각 개개의 재조합 효소의 발현에 대해 매일 체크하였다.
실시예 4
효소 활성 검정법
24, 48 hr 경과 후, 또는 약 72 hr째에 일시적 형질감염 실험으로부터의 컨디셔닝된 배지 및 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드 (4-MU-β-Glc) 형광 기질을 사용하여 효소 활성 검정법에 의해 재조합 인간 산성 β-글루코세레브로시다제 (GlcCerase) 발현 및 세포 배양 배지로의 분비를 평가하였다. 간략하면, 각 샘플로부터의 컨디셔닝된 배지 20 ㎕를 명시된 시점에 수거하고, 0.5 ml 마이크로원심분리관에서 80 ㎕ McIlvane 완충제 (MI 완충제: 50 mM 시트르산나트륨/인산나트륨 (pH 5.2)/0.25% (v/v) 트리톤 X-100/0.25% (w/v) 나트륨 타우로콜레이트)로 희석하였다. 각각의 희석된 샘플 25 ㎕씩을 96-웰 투명 바닥형의 검은색 플레이트의 각 개개의 웰에 분취하고 (3중으로 수행), (MI 완충제 중에서 제조된) 6 mM 4-MU-β-Glc 기질 50 ㎕를 다중-채널 피펫터를 통해 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 커버 테이프로 밀봉하고, 37℃에서 1 hr 동안 인큐베이션시켰다. 125 ㎕의 0.1 M NaOH를 첨가하여 효소 반응을 중단시키고, 각각 355 nm 여기 및 460 nm 방출 파장을 사용하여 유리된 4-MU의 형광을 형광 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 모의-형질감염된 샘플로부터의 4-MU 형광이 "배경" 대조군으로서의 역할을 하였고, 상기 값을 GlcCerase 샘플 모두에서 감산하였다.
24, 48 또는 72 hr 경과 후에 일시적 형질감염 실험으로부터의 컨디셔닝된 배지 및 4-메틸움벨리페릴-α-D-글루코피라노시드 (4-MU-α-Glc) 형광 기질을 사용하여 효소 활성 검정법에 의해 재조합 인간 산성 α-글루코시다제 (GAA) 발현 및 분비를 측정하였다. 구체적으로, 각 샘플로부터의 컨디셔닝된 배지 20 ㎕를 상이한 시점에 수거하고, 0.5 ml 마이크로원심분리관에서 80 ㎕ 50 mM 아세트산나트륨 완충제 (pH 4.0)로 희석하였다. 각각의 희석된 샘플 25 ㎕씩을 96-웰 투명 바닥형의 검은색 플레이트의 각 개개의 웰에 분취하고 (3중으로 수행), (50 mM 아세트산나트륨 완충제 (pH 4.0) 중에서 제조된) 6 mM 4-MU-α-Glc 기질 50 ㎕를 다중-채널 피펫터를 통해 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 커버 테이프로 밀봉하고, 37℃에서 1 hr 동안 인큐베이션시켰다. 125 ㎕의 0.1 M NaOH를 첨가하여 효소 반응을 중단시키고, 각각 355 nm 여기 및 460 nm 방출 파장을 사용하여 유리된 4-MU의 형광을 형광 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 모의-형질감염된 샘플로부터의 4-MU 형광이 "배경" 대조군으로서의 역할을 하였고, 상기 값을 GAA 샘플 모두에서 감산하였다.
24, 48 또는 72 hr 경과 후에 일시적 형질감염 실험으로부터의 컨디셔닝된 배지 및 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라노시드 (4-MU-α-Gal) 형광 기질을 사용하여 효소 활성 검정법에 의해 재조합 인간 산성 α-갈락토시다제 (GLA) 발현 및 분비를 측정하는 것으로 하였다. 구체적으로, 각 샘플로부터의 컨디셔닝된 배지 20 ㎕를 상이한 시점에 수거하고, 0.5 ml 마이크로원심분리관에서 80 ㎕ 50 mM 시트르산나트륨/인산나트륨 완충제 (pH 4.6)로 희석하였다. 각각의 희석된 샘플 25 ㎕씩을 96-웰 투명 바닥형의 검은색 플레이트의 각 개개의 웰에 분취하고 (3중으로 수행), (50 mM 시트르산나트륨/인산나트륨 완충제 (pH 4.6) 중에서 제조된) 8 mM 4-MU-α-Gal 기질 50 ㎕를 다중-채널 피펫터를 통해 각 웰에 첨가하는 것으로 하였다. 이어서, 플레이트를 커버 테이프로 밀봉하고, 37℃에서 1 hr 동안 인큐베이션시키는 것으로 하였다. 125 ㎕의 0.1 M NaOH를 첨가하여 효소 반응을 중단시키고, 각각 355 nm 여기 및 460 nm 방출 파장을 사용하여 유리된 4-MU의 형광을 형광 플레이트 판독기 상에서 판독하는 것으로 하였다. 모의-형질감염된 샘플로부터의 4-MU 형광이 "배경" 대조군으로서의 역할을 하였고, 상기 값을 GLA 샘플 모두에서 감산하였다.
실시예 5
특정 단백질은 천연적으로 매우 높은 수준으로 발현되는 반면, 다른 것은 충분히 발현되지 못하는 것으로 알려져 있다. 전사 수준에서는 mRNA 존재량 및 안정성이 단백질 발현에 영향을 줄 수 있는 중요한 인자이지만, 신호 서열 또한 단백질 수준에서 중요한 역할을 하고, 이러한 이질적인 단백질 발현에 기여한다는 것이 갈수록 더 명확해지고 있다. 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)은 재조합 단백질의 단백질 발현 및 분비를 개선시키기 위해 우수한 신호 서열을 개발함에 있어 특히 유익할 수 있는 구체적인 특징들을 가지고 있다. 이러한 비천연 신호 서열이 모델 단백질에 대한 단백질 발현 및 분비를 개선시킬 수 있는지 여부를 측정하기 위해 변형된 Bip 신호 서열을 제조하고, 이를 모델 단백질에 부가하였다. 구체적으로, 소수성 코어를 연장시켜 보다 긴 장쇄의 α-나선형 구조를 형성하였다. 변형된 Bip 신호 서열-1에서 소수성 도메인을 연장시키는 것이 여러 가지 이점을 가질 것으로 예측되었다. 첫번째로, 변형된 (보다 긴 장쇄의) 소수성 도메인은 보다 긴 장쇄의 α-나선을 형성하고, 리보솜 단백질 Rpl17에 의해 쉽게 확인될 수 있는 전체 리보솜 출구 터널에 걸쳐 있음으로써 다른 중요한 ER 단백질, 예컨대 Sec61 서브유닛, 및 RAMP4와의 상호작용이 보다 잘 일어날 수 있도록 촉진시킬 수 있을 것으로 예상되었다. 두번째로, 보다 긴 장쇄의 α-나선형 소수성 도메인을 통해 상기 변형된 Bip 신호 서열은 중요한 트랜스로콘 단백질, 예컨대 TRAM 및 Sec61 서브유닛과 상호작용함으로써 트랜스로콘 세공에서 초기 폴리펩티드가 효율적으로 지향될 수 있도록 도움을 줌으로써 필요한 단백질 전좌 가능 루프 배향을 촉진시킬 것으로 예상되었다. 세번째로, 보다 긴 장쇄의 α-나선형 소수성 도메인을 통해 상기 변형된 Bip 신호 서열은 수성 트랜스로콘 세공 밖으로 나가 지질 이중층 내로 이동함으로써 보다 효율적으로 신호 펩티다제에 의해 보다 신속하게 절단될 수 있을 것으로 예상되었다. 네번째로는, 변형된 Bip 신호 서열이 트랜스로콘으로부터 보다 신속하게 이동함으로써 재조합 단백질은 그가 합성되는 동안 빠르게 다른 중요한 단백질, 예컨대 올리고사카릴 트랜스퍼라제, ER 샤페론 단백질, 예컨대 Bip, 단백질 이황화 이소머라제 및 칼넥신과 상호작용함으로써 단백질 폴딩을 개선시킬 수 있을 것으로 예상되었다. 이러한 잠재적인 이점 중 임의의 것 또는 그들 모두가 단백질 발현, 폴딩, 및 세포 밖으로의 외수송 속도를 개선시킬 것으로 예상되었다.
다른 변형도 이루어질 수 있으며, 그러한 변형으로는 하전된 잔기를 연장된 소수성 도메인의 측면 영역에 부가하여 그의 소수성을 추가로 증진시키고, 트랜스로콘에서 신호 서열이 적절하게 지향될 수 있도록 도움을 주는 것을 포함한다. 이러한 변형은 특정 리보솜 단백질, 특히 Rpl17과 신호 서열의 상호작용을 증진시킴으로써 결국에는 트랜스로콘 단백질 Sec61β, RAMP4 및 TRAM과의 상호작용을 증가시켜 단백질 전좌, 단백질 발현 및 분비를 개선시키고자 하는 것이었다.
천연 GlcCerase 신호 서열 (WT GlcCerase) 또는 인간 Bip 신호 서열 (CBP201 GlcCerase) 또는 신규의 변형된 Bip 신호 서열-1 (CBP204 GlcCerase)을 포함하는 야생형 인간 GlcCerase를 코딩하는 수개의 상이한 DNA 구축물을 생성하였다. ~80% 컨플루언시된 인간 세포주 (HEK293T)에서의 일시적인 발현 실험을 통해 상기 구축물 (1 ㎍)을 시험하였다. 컨디셔닝된 세포 배양 배지 (20 ㎕)를 72 hr의 시간이 경과하는 동안 매일 수거하고, 4-MU-β-글루코스 형광 기질을 사용하여 GlcCerase 효소 활성에 대하여 검정함으로써 신호 서열이 GlcCerase 발현 및 분비에 미치는 효과를 평가하였다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 두 신호 서열 모두 GlcCerase의 발현 및 세포 배양 배지로의 분비를 촉진시킬 수 있었다. 그러나, 형질감염 후 72 hr 경과하였을 때 (CBP204 GlcCerase에서의) 조작된 변형된 Bip 신호 서열-1을 통해 GlcCerase 활성은 WT GlcCerase에 비하여 2배 더 높은 것으로 관찰되었다. 모의-형질감염된 (공 벡터) 음성 대조군에 대한 기준 활성도 관찰하였고, 효소 활성의 증가는 재조합 GlcCerase 발현의 결과인 것으로 확인되었다. 다회 실시된 형질감염 실험 (n >3회)을 통해 신규의 신호 서열이 GlcCerase 발현 및 분비를 증가시켰다는 것을 확인하였다.
실시예 6
단백질 합성은 영양 (즉, ATP, 아미노산, 탄수화물 등)의 가용성 뿐만 아니라, 다른 필수 세포 성분 (즉, 개시 및 신장 인자, tRNA, 단백질 샤페론 등)에 의해 크게 영향을 받는다. 전자의 것은 재공급시에 증가될 수 있거나, 세포 배양 배지에 보충될 수 있는 반면, 후자의 성분은 세포에서 제한되고, 단백질이 생산되는 동안 보충될 수 없다. 이러한 중요한 성분이 고갈되면 현저한 세포 스트레스가 유발되고, 이로써 대부분의 단백질에 대한 새로운 단백질 합성은 감소되거나, 또는 심지어 중단된다. 흥미롭게도, 항상성을 위해 세포를 회복시키는 데 도움이 되는 적응 세포 반응의 일부로서 상기와 같은 스트레스 기간 동안 일부 단백질의 발현은 유지되고, 실제로는 증가된다. 이들 엄선된 단백질은 그의 우선 발현을 가능하게 하는 세포 단백질 합성 기구에 의해 어떻게 구별되는지에 관해서는 완전히 명확하게 밝혀지지는 않았지만, 신호 서열이 상기 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. Bip는 세포 항상성을 재확립하는 데 도움이 되는 상기 스트레스 기간 동안에 그의 발현이 유지되는 것인 중요한 ER 샤페론 단백질인 바, 본 발명자들은 상기 변형된 Bip 신호 서열이 다른 단백질의 발현이 감소 또는 억제된 조건하에서도 이종 재조합 단백질의 우선 발현이 유지될 수 있도록 한다고 예측하였다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 높은 세포 밀도 (~100% 컨플루언트)의 KEK293T 세포 배양물을 WT GlcCerase 및 CBP204 GlcCerase로 형질감염시키고, 63 hr의 기간 동안 그의 발현 및 분비에 관해 모니터링하였다. 추가로, 영양 고갈에 대한 반응으로 WT GlcCerase 및 CBP204 GlcCerase의 발현에 변화가 있는지 여부를 측정하기 위한 목적으로 영양을 고갈시키기 위해 실험하는 동안 (재공급 이전 배치 적용시 저 영양 기간을 모방하는 후기 실험 기간 동안) 세포 배양 배지를 교체하지 않았다.
본 발명자들의 결과를 통해 본 바, 도 2에 제시되어 있는 것과 같이 변형된 Bip 신호 서열-1을 포함하는 CBP204 GlcCerase는 63 hr의 전 기간 동안에 걸쳐 상기 실험 조건하에서 그의 천연 신호 서열을 포함하는 WT GlcCerase보다 더 잘 발현된 것으로 나타났다. CBP204 GlcCerase 수준은 24 hr 경과 후 WT GlcCerase보다 1.9배 더 높았고, 48 hr 경과 후 2.1배 더 높았고, 63 hr 경과 후 2.5배 더 높았다. 72 hr의 것에 대해 외삽하였을 때, CBP204 GlcCerase는 WT GlcCerase보다 3.3배 더 높을 것으로 예상되었다. 분비된 단백질이 매일 매일 배가된 양으로 존재하는 것인 거의 일정한 속도로 CBP204 GlcCerase 발현이 유지되었다는 점이 중요하다. 대조적으로, WT GlcCerase에 대한 발현 속도는 후기 시점에는 현저히 저속화되었다. 발현 속도는 후기 시점에는 평원 상태인 바(leveled off), 상기와 같은 차이는 CBP204 GlcCerase의 경우 거의 선형인 곡선 및 WT GlcCerase의 경우 비선형 곡선인 상기 두 효소의 발현 곡선의 형상을 비교하였을 때 가장 분명하게 나타났다. 상기 데이터를 통해 볼 때, CBP204 GlcCerase 및 WT GlcCerase의 발현은 예측컨대, 영양 고갈에 대한 반응으로 차별적으로 나타난 것으로 밝혀졌으며, 이러한 차이는 더 장기간 동안 인큐베이션시킬 경우에 추가로 증가될 것으로 예상되었다. CBP204 GlcCerase와 WT GlcCerase 사이의 유일한 차이는 신호 서열인 바, 상기 데이터가 변형된 Bip 신호 서열-1을 통해 비-최적 세포 배양 조건 동안 우선적으로 발현될 수 있었다는 가설을 뒷받침하였다.
실시예 7
변형된 Bip 신호 서열-1이 상이한 모델 단백질의 발현 및 분비에 미치는 효과를 시험하기 위해, 그의 천연 GAA 신호 서열 (WT GAA) 또는 조작된 Bip 신호 서열-1 및 GAA의 아미노산 잔기 24-952 (CBP218 GAA 로 지정) 포함하는 야생형 인간 산성 α-글루코시다제 (GAA)를 코딩하도록 DNA 플라스미드를 구축하였다. ~2일 동안에 걸쳐 HEK293T에서 일시적으로 발현시킴으로써 상기 신호 서열이 야생형 GAA의 발현 및 분비에 미치는 효과를 직접 비교함으로써 상기 DNA 구축물을 시험하였다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 형질감염 후 43 hr 경과하였을 때, 배지 중에 분비된 GAA 활성은 CBP218 GAA가 WT GAA보다 2.5배 더 높았다. 모의-형질감염된 (공 벡터) 음성 대조군에 대한 기준 활성도 관찰하였고, 배지 중에서의 효소 활성에 대하여 관찰된 결과는 재조합 GAA 발현의 결과인 것으로 확인되었다. CBP218 GAA와 WT GAA 사이의 유일한 차이는 그의 각각의 신호 서열인 바, 같은 실험 조건하에서 (CBP218 GAA에서의) 변형된 Bip 신호 서열-1이 GAA 발현 및 분비를 현저하게 증가시켰다는 것이 상기 결과를 통해 밝혀졌다.
실시예 8
웨스턴 블롯팅 및 ELISA 검정법
시험 단백질의 발현 및 분비를 웨스턴 블롯 분석법으로 평가하는 것으로 하였다. 간략하면, 24, 48 또는 72 hr 경과 후에 일시적 형질감염 실험으로부터의 컨디셔닝된 세포 배양 배지를 수집하고, 나트륨 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 한 후, 니트로셀룰로스 막으로 옮겨 놓는 것으로 하였다. 막을 진탕시키면서 실온에서 1 hr 동안 TRIS로 완충처리된 염수/0.1% (v/v) 트윈-20 (TBST) 중에서 4% (w/v) 무지방 우유로 차단시키는 것으로 하였다. 이어서, 진탕시키면서 실온에서 1 hr 동안 또는 4℃에서 밤새도록 TBST 중 4% (w/v) 무지방 우유에서 적절하게 희석된 (예컨대 1:5,000) 1차 항체 (예컨대 토끼 항-인간 IGF-2)와 함께 막을 인큐베이션시키는 것으로 하였다. 이어서, 1 hr 동안에 걸쳐 진탕시키면서, 및 다회에 걸쳐 완충제를 교체하면서, 블롯을 실온에서 TBST으로 세척하는 것으로 하였다. 이어서, 진탕시키면서 실온에서 1 hr 동안 TBST 중 4% (w/v) 무지방 우유에서 적절하게 희석된 (예컨대 1:20,000) 효소 결합 2차 항체 (예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합된 염소 항-토끼 항체)와 함께 블롯을 인큐베이션시키는 것으로 하였다. 이어서, 1 hr 동안에 걸쳐 진탕시키면서, 및 다회에 걸쳐 완충제를 교체하면서, 블롯을 실온에서 TBST으로 세척하는 것으로 하였다. 이어서, 블롯을 실온에서 5 min 동안 화학발광 기질과 함께 인큐베이션시키고, 영상화 시스템에 의해 또는 필름에 의해 시각화하여 시험 단백질의 발현 수준을 평가하는 것으로 하였다.
유사하게, 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)에 의해 시험 단백질의 발현을 평가할 수 있었다. 간략하면, 96-웰 면역흡착 플레이트를 TRIS로 완충처리된 염수 (TBS) 중에서 단백질 농도 5 ㎍/ml로 50 ㎕의 1차 항체 (예컨대 토끼 항-인간 IGF-2)를 이용하여 코팅시키는 것으로 하였다. 이어서, 상기 플레이트를 실온에서 1 hr 동안 TBST 중에서 200 ㎕의 4% (w/v) 무지방 우유로 차단하는 것으로 하였다. 24, 48 또는 72 hr 경과 후에 일시적 형질감염 실험으로부터의 컨디셔닝된 세포 배양 배지를 수집하고, 실온에서 1 hr 동안 상기 플레이트에서 인큐베이션시키는 것으로 하였다. 이어서, 1 hr 동안에 걸쳐 진탕시키면서, 및 다회에 걸쳐 완충제를 교체하면서, 상기 플레이트를 실온에서 200 ㎕ TBST으로 세척하는 것으로 하였다. 이어서, 실온에서 1 hr 동안 TBST 중 적절하게 희석된 (예컨대 1:20,000) 효소 결합 2차 항체 (예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합된 염소 항-토끼 항체)와 함께 상기 플레이트를 인큐베이션시키는 것으로 하였다. 이어서, 1 hr 동안에 걸쳐 실온에서 다회에 걸쳐 완충제를 교체하면서, 상기 플레이트를 TBST으로 세척하는 것으로 하였다. 실온에서 5-15 min 동안 비색 기질 (예컨대 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, TMB)과 함께 상기 플레이트를 인큐베이션시키고, 0.1 M 황산으로 중단시키고, 적절한 파장 (예컨대 450 nm)하에 플레이트 판독기에서 판독함으로써 시험 단백질의 발현을 평가하였다.
SEQUENCE LISTING <110> DO, Hung <120> NOVEL SIGNAL SEQUENCES TO IMPROVE PROTEIN EXPRESSION AND SECRETION OF RECOMBINANT ENZYMES AND OTHER PROTEINS <130> CALL-0014 <150> US 61/415,926 <151> 2010-11-22 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 1 ggcaagatct gaattcggga tggagttttc aagtccttcc agag 44 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 2 tcgagcggcc gcaagctagc ttatcactgg cgacgccaca ggtag 45 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 3 ccacgaattc caagatgaag ctctccctgg tggc 34 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 4 ctggccatgg gtacccggat gatgttatat c 31 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 5 ccacgaattc gacaatgcag ctgaggaacc 30 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 6 ctcgaagcgg ccgcttaaag taagtctttt aatgacatct gcat 44 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <220> <221> misc_feature <223> Phosphorylated primer <400> 7 gcactggaca atggattgg 19 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 8 ccacgaattc aaccatggga gtgaggc 27 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 9 ctcgaagcgg ccgcctaaca ccagctgacg agaaac 36 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <220> <221> misc_feature <223> Phosphorylated primer <400> 10 gctgcactcc tgggg 15 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <220> <221> misc_feature <223> Phosphorylated primer <400> 11 gctcagcagg gagccagc 18 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <220> <221> misc_feature <223> Phosphorylated primer <400> 12 gcagtgccca cacagtg 17 <210> 13 <211> 441 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Minigene 1 (native human Bip-GlcCerase) <400> 13 acggaattcg aaacgatgaa gctctccctg gtggccgcga tgctgctgct gctcagcgcg 60 gcgcgggccg cccgcccctg catccctaaa agcttcggct acagctcggt ggtgtgtgtc 120 tgcaatgcca catactgtga ctcctttgac cccccgacct ttcctgccct tggtaccttc 180 agccgctatg agagtacacg cagtgggcga cggatggagc tgagtatggg gcccatccag 240 gctaatcaca cgggcacagg cctgctactg accctgcagc cagaacagaa gttccagaaa 300 gtgaagggat ttggaggggc catgacagat gctgctgctc tcaacatcct tgccctgtca 360 ccccctgccc aaaatttgct acttaaatcg tacttctctg aagaaggaat cggatataac 420 atcatccggg tacccatggc c 441 <210> 14 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minigene 2 (modified Bip signal sequence-1-GlcCerase) <400> 14 acggaattcg aaacgatgaa gctctccctg gtggccgcga tgctgctgct gctcagcctg 60 gtggccgcga tgctgctgct gctcagcgcg gcgcgggccg cccgcccctg catccctaaa 120 agcttcggct acagctcggt ggtgtgtgtc tgcaatgcca catactgtga ctcctttgac 180 cccccgacct ttcctgccct tggtaccttc agccgctatg agagtacacg cagtgggcga 240 cggatggagc tgagtatggg gcccatccag gctaatcaca cgggcacagg cctgctactg 300 accctgcagc cagaacagaa gttccagaaa gtgaagggat ttggaggggc catgacagat 360 gctgctgctc tcaacatcct tgccctgtca ccccctgccc aaaatttgct acttaaatcg 420 tacttctctg aagaaggaat cggatataac atcatccggg tacccatggc c 471 <210> 15 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minigene 3 (Modified Bip signal sequence-1) <400> 15 acggaattcg caagatgaag ctctccctgg tggccgcgat gctgctgctg ctcagcctgg 60 tggccgcgat gctgctgctg ctcagcgcgg cgaggcctgc ggccgc 106 <210> 16 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minegene 4 (Modified Bip signal sequence-2) <400> 16 ggtaccgaat tcgctggcaa gatgaagctc tccctggtgg ccgcgatgct gctgctgctc 60 tgggtggcac tgctgctgct cagcgcggcg aggccttcta ga 102 <210> 17 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minegene 5 (Modified Bip signal sequence-3) <400> 17 ggtaccgaat tcgctggcaa gatgaagctc tccctggtgg ccgcgatgct gctgctgctc 60 tccctggtgg ccctgctgct gctcagcgcg gcgaggcctt ctaga 105 <210> 18 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minegene 6 (Modified Bip signal sequence-4) <400> 18 ggtaccgaat tcgctggcaa gatgaagctc tccctggtgg ccgcgatgct gctgctgctc 60 gcactggtgg ccctgctgct gctcagcgcg gcgaggcctt ctaga 105 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Native human Bip signal sequence <400> 19 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Ala <210> 20 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Bip ss-1 <400> 20 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Leu Val 1 5 10 15 Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala Arg Ala 20 25 <210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Bip ss-2 <400> 21 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala Arg Ala 20 25 <210> 22 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Bip ss-3 <400> 22 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Leu Val 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala Arg Ala 20 25 <210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Bip ss-4 <400> 23 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Leu Arg Ser Ala Ala Arg Ala 20 25 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Signal peptidase recognition sequence for native human Bip <400> 24 Ser Ala Ala Arg Ala 1 5

Claims (71)

  1. 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열.
  2. 제1항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편이 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드 신호 서열.
  3. 제1항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편이 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드 신호 서열.
  4. 제1항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편이 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드 신호 서열.
  5. 제1항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편이 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드 신호 서열.
  6. 이종 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편을 포함하는 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 세포 배양물이 비-최적 세포 배양 조건에 있는 것인 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 비-최적 세포 배양 조건이 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 융합 단백질.
  10. 제6항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편이 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 세포 배양물이 비-최적 세포 배양 조건에 있는 것인 융합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 비-최적 세포 배양 조건이 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 융합 단백질.
  14. 제6항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편이 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 세포 배양물이 비-최적 세포 배양 조건에 있는 것인 융합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 비-최적 세포 배양 조건이 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 융합 단백질.
  18. 제6항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편이 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 세포 배양물이 비-최적 세포 배양 조건에 있는 것인 융합 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 비-최적 세포 배양 조건이 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 융합 단백질.
  22. 제6항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편이 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  23. 제22항에 있어서, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  24. 제23항에 있어서, 세포 배양물이 비-최적 세포 배양 조건에 있는 것인 융합 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 비-최적 세포 배양 조건이 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 융합 단백질.
  26. 제6항에 있어서, 이종 폴리펩티드가 하나 이상의 효소, 하나 이상의 생물학적 반응 개질제, 하나 이상의 독소, 하나 이상의 항체, 이종 폴리펩티드의 하나 이상의 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 융합 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 효소가 산성 β-글루코세레브로시다제를 포함하는 것인 융합 단백질.
  28. 제26항에 있어서, 효소가 산성 α-갈락토시다제를 포함하는 것인 융합 단백질.
  29. 제26항에 있어서, 효소가 산성 α-글루코시다제를 포함하는 것인 융합 단백질.
  30. 제26항에 있어서, 생물학적 반응 개질제가 프로인슐린을 포함하는 것인 융합 단백질.
  31. 제26항에 있어서, 생물학적 반응 개질제가 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2)를 포함하는 것인 융합 단백질.
  32. 제26항에 있어서, 생물학적 반응 개질제가 인터페론을 포함하는 것인 융합 단백질.
  33. 제26항에 있어서, 생물학적 반응 개질제가 치료 항체를 포함하는 것인 융합 단백질.
  34. 제26항에 있어서, 생물학적 반응 개질제가 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1)을 포함하는 것인 융합 단백질.
  35. 제6항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편이 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하고, 이종 폴리펩티드가 산성 β-글루코세레브로시다제, 산성 α-갈락토시다제, 산성 α-글루코시다제, 프로인슐린, 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2), 인터페론, 치료 항체 및 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1) 중 하나 이상을 포함하는 것인 융합 단백질.
  36. 제6항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편이 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, 이종 폴리펩티드가 산성 β-글루코세레브로시다제, 산성 α-갈락토시다제, 산성 α-글루코시다제, 프로인슐린, 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2), 인터페론, 치료 항체 또는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1) 중 하나 이상을 포함하는 것인 융합 단백질.
  37. 제6항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편이 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하고, 이종 폴리펩티드가 산성 β-글루코세레브로시다제, 산성 α-갈락토시다제, 산성 α-글루코시다제, 프로인슐린, 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2), 인터페론, 치료 항체 또는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1) 중 하나 이상을 포함하는 것인 융합 단백질.
  38. 제6항에 있어서, 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편이 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고, 이종 폴리펩티드가 산성 β-글루코세레브로시다제, 산성 α-갈락토시다제, 산성 α-글루코시다제, 프로인슐린, 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2), 인터페론, 치료 항체 또는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1) 중 하나 이상을 포함하는 것인 융합 단백질.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물 중에서의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  40. 제39항에 있어서, 세포 배양물 중에서의 발현 증가가 3일간의 시간 경과에 걸쳐 효소 활성에 대해 검정함으로써 측정되는 것인 융합 단백질.
  41. 제39항에 있어서, 세포 배양물이 비-최적 세포 배양 조건에 있는 것인 융합 단백질.
  42. 제41항에 있어서, 비-최적 세포 배양 조건이 높은 세포 밀도 및 영양 고갈인 융합 단백질.
  43. (a) 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편을 코딩하는 제1 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 (b) 이종 폴리펩티드를 코딩하며 프레임 내에서 상기 제1 DNA 서열에 융합되어 있는 제2 DNA 서열을 포함하는 단백질 발현 벡터.
  44. 제43항에 있어서, 제1 DNA 서열이 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편을 코딩하는 것인 단백질 발현 벡터.
  45. 제44항에 있어서, 제2 DNA 서열이 산성 β-글루코세레브로시다제, 산성 α-갈락토시다제, 산성 α-글루코시다제, 프로인슐린, 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2), 인터페론, 치료 항체 또는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1)을 코딩하는 것인 단백질 발현 벡터.
  46. 제43항에 있어서, 제1 DNA 서열이 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편을 코딩하는 것인 단백질 발현 벡터.
  47. 제46항에 있어서, 제2 DNA 서열이 산성 β-글루코세레브로시다제, 산성 α-갈락토시다제, 산성 α-글루코시다제, 프로인슐린, 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2), 인터페론, 치료 항체 또는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1)을 코딩하는 것인 단백질 발현 벡터.
  48. 제43항에 있어서, 제1 DNA 서열이 서열 번호 22의 1차 아미노산 서열을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편을 코딩하는 것인 단백질 발현 벡터.
  49. 제48항에 있어서, 제2 DNA 서열이 산성 β-글루코세레브로시다제, 산성 α-갈락토시다제, 산성 α-글루코시다제, 프로인슐린, 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2), 인터페론, 치료 항체 또는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1)을 코딩하는 것인 단백질 발현 벡터.
  50. 제43항에 있어서, 제1 DNA 서열이 서열 번호 23의 1차 아미노산 서열을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편을 코딩하는 것인 단백질 발현 벡터.
  51. 제50항에 있어서, 제2 DNA 서열이 산성 β-글루코세레브로시다제, 산성 α-갈락토시다제, 산성 α-글루코시다제, 프로인슐린, 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2), 인터페론, 치료 항체 또는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1)을 코딩하는 것인 단백질 발현 벡터.
  52. (a) 이종 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip) 폴리펩티드 신호 서열의 변형된 단편을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및
    (b) 상기 이종 폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 제조를 배양 세포에서 수행하는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 배양 세포가 효모 세포를 포함하는 것인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 배양 세포가 포유동물 세포를 포함하는 것인 방법.
  56. 제52항에 있어서, 상기 제조를 트랜스제닉 시스템에서 수행하는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 트랜스제닉 시스템이 소, 염소, 양, 토끼, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 회수가 유즙으로부터의 회수인 방법.
  59. 제56항에 있어서, 상기 트랜스제닉 시스템이 닭을 포함하는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 회수가 난으로부터의 회수인 방법.
  61. (a) 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열을 코딩하는 제1 DNA 서열에 프로모터를 작동가능하게 연결시키는 단계, 및
    (b) 이종 폴리펩티드를 코딩하는 제2 DNA 서열을 프레임 내에서 상기 제1 DNA 서열에 융합시키는 단계
    를 포함하는, 단백질 발현 벡터를 제조하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 제1 DNA 서열이 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열을 코딩하는 것인, 단백질 발현 벡터를 제조하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 제2 DNA 서열이 산성 β-글루코세레브로시다제, 산성 α-갈락토시다제, 산성 α-글루코시다제, 프로인슐린, 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2), 인터페론, 치료 항체 또는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1)을 코딩하는 것인, 단백질 발현 벡터를 제조하는 방법.
  64. 제61항에 있어서, 상기 제1 DNA 서열이 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열을 코딩하는 것인, 단백질 발현 벡터를 제조하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 제2 DNA 서열이 산성 β-글루코세레브로시다제, 산성 α-갈락토시다제, 산성 α-글루코시다제, 프로인슐린, 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2), 인터페론, 치료 항체 또는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1)을 코딩하는 것인, 단백질 발현 벡터를 제조하는 방법.
  66. 제61항에 있어서, 상기 제1 DNA 서열이 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열을 코딩하는 것인, 단백질 발현 벡터를 제조하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 제2 DNA 서열이 산성 β-글루코세레브로시다제, 산성 α-갈락토시다제, 산성 α-글루코시다제, 프로인슐린, 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2), 인터페론, 치료 항체 또는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1)을 코딩하는 것인, 단백질 발현 벡터를 제조하는 방법.
  68. 제61항에 있어서, 상기 제1 DNA 서열이 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편을 포함하는 폴리펩티드 신호 서열을 코딩하는 것인, 단백질 발현 벡터를 제조하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 제2 DNA 서열이 산성 β-글루코세레브로시다제, 산성 α-갈락토시다제, 산성 α-글루코시다제, 프로인슐린, 인슐린-유사 성장 호르몬-2 (IGF-2), 인터페론, 치료 항체 또는 인슐린-유사 성장 호르몬-1 (IGF-1)을 코딩하는 것인, 단백질 발현 벡터를 제조하는 방법.
  70. (a) 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편 및 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및
    (b) 이종 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하는, 단백질 발현을 증가시키는 방법.
  71. (a) 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (Bip)의 변형된 단편 및 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및
    (b) 이종 단백질을 회수하는 단계
    를 포함하는, 단백질 분비를 증가시키는 방법.
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