RS57601B1 - Nove signalne sekvence za poboljšanje eksprimiranja proteina i lučenje rekombinantnih enzima i drugih proteina - Google Patents

Nove signalne sekvence za poboljšanje eksprimiranja proteina i lučenje rekombinantnih enzima i drugih proteina

Info

Publication number
RS57601B1
RS57601B1 RS20180986A RSP20180986A RS57601B1 RS 57601 B1 RS57601 B1 RS 57601B1 RS 20180986 A RS20180986 A RS 20180986A RS P20180986 A RSP20180986 A RS P20180986A RS 57601 B1 RS57601 B1 RS 57601B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
protein
seq
signal sequence
bip
expression
Prior art date
Application number
RS20180986A
Other languages
English (en)
Inventor
Hung Do
Original Assignee
Amicus Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amicus Therapeutics Inc filed Critical Amicus Therapeutics Inc
Publication of RS57601B1 publication Critical patent/RS57601B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0002—Antibodies with enzymatic activity, e.g. abzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01045—Glucosylceramidase (3.2.1.45), i.e. beta-glucocerebrosidase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
POZIVANJE NA POVEZANE PRIJAVE
[0001] Poziva se na prioritet provizornom SAD patentnom prijavom No.61/415,926, podnesenom 22. novembra 2010., koji je ovde u celini uključena referencom.
TEHNIČKA OBLAST
[0002] Eksprimiranje i lučenje rekombinantnih enzima i drugih proteina za terapeutske i druge upotrebe.
STANJE TEHNIKE
[0003] Kod eukariota, sinteza proteina za skoro sve proteine započinje u citoplazmi preko mega-proteinskih kompleksa koji se nazivaju ribozomi. Različiti proteini završavaju sintezu i savijanje u citoplazmi i ostaju na mestu gde funkcionišu. Međutim, mnogi drugi se izvoze iz citoplazme u endoplazmatični retikulum (ER), gde stiču potrebne post-translacijske modifikacije (npr. disulfidne veze, glikozilaciju itd.) kako bi se postigla njihova pravilna struktura proteina i biološka aktivnost pre izvoza na njihove namenjene ćelijske lokacije (npr. Godlžijevi, peroksizomski i lizozomski proteini) ili na površinu ćelije (npr. receptori, jonski kanali itd.) ili izlučene izvan ćelija (npr. antitela, faktori koagulacije, hormoni itd.). Proteini namenjeni za izvoz iz citoplazme razlikuju se od citoplazmatičnih proteina po specijalizovanom proteinskim elementu na amino (N-) terminusu koji se naziva signalna sekvenca.
[0004] Signalne sekvence (takođe nazvane signalni peptidi) nemaju konsenzus sekvencu aminokiseline ili dužinu, ali obično sadrže početne 15-40 ostataka na N-terminusu sa 7-20 susednih hidrofobnih aminokiselinskih ostataka koji formiraju α-heličnu sekundarnu strukturu koja je često okružena naelektrisanim ostacima. Signalne sekvence su identifikovane u citoplazmi specijalizovanog multi-podjediničnog proteina: RNK kompleks nazvan čestica za prepoznavanje signala (SRP) koji usmerava ove nove proteine u specijalizovane pore unutar ER membrane, zvane translokoni, gde se ti proteini transportuju preko ER membrane u ER lumen - proces poznat kao translokacija proteina.
[0005] Translokacija proteina se istovremeno odvija tokom sinteze proteina (tj. kotranslatorno) kod sisara, dok kod drugih eukariota (npr. kvasci) ovaj proces može biti ili ko-ili post-translatorni. Translokacija proteina posredovana signalnom sekvencom takođe se koristi u bakterijama za usmeravanje proteina iz citoplazme i u periplazmu. Kod sisara, signalne sekvence su identifikovane od strane SRP, jer iz njih nastaju ribozomi koji privremeno zaustavljaju translaciju proteina kako bi omogućili ciljanje čitavog SRP-novi proteiniribozom kompleksa na translokone putem pridruženog receptora SRP-a. Sinhronizacija proteina se nastavlja nakon što se SRP oslobodi i ribozom-novi protein kompleks pravilno je priključen na translokon.
[0006] Većina enzimskih i drugih proteinskih terapija se proizvode rekombinantnom tehnologijom koja je dizajnirana da luči ove rekombinantne proteine iz ćelija i u ćelijsku kulturu kako bi pojednostavilo nizvodno prečišćavanje. Zbog toga ovi rekombinantni enzimi i drugi proteini moraju da koriste signalne sekvence i ovaj isti ćelijski put za lučenje. Zbog toga je za proizvodnju ovih proteina na visokom nivou potrebna signalna sekvenca koja može posredovati efikasnom ER ciljanju i translokaciji proteina preko ER membrane. Međutim, signalne sekvence nisu ekvivalentne za olakšavanje ciljanja ER i translokacije. Veruje se da se identifikacija signalnih sekvenci SRP-om javlja brzo i efikasno, ali sledeći koraci ER ciljanja i translokacija su veoma različiti među proteinima. S obzirom na to da su signalne sekvence prepoznate dvaput, prvo od SRP-a za ciljanje novi proteina-ribozom kompleksa do ER, i potom od strane translokon proteina (tj. Sec61 proteini) i drugih proteina ER-a povezanih sa translokonom da iniciraju translokaciju, obe su potencijalne lokacije za regulaciju. Ovaj drugi korak se pokazao mnogo strožijim i manje efikasnim, i time predstavlja značajno usko grlo u ovom procesu. Iznenađujuće, većina signalnih sekvenci su suštinski neefikasne za olakšavanje translokacije proteina. Shodno tome, mnogi ER-ciljani novi protein-ribozom kompleksi disociraju iz ER membrane i sinteza proteina se prekida, čime se smanjuje eksprimiranje i lučenje proteina.
REZIME
[0007] Ovaj pronalazak pruža polipeptidnu signalnu sekvencu, koja sadrži modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip), gde modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20 ; aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21; aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22; ili aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23.
[0008] Ovaj pronalazak takođe pruža fuzioni protein koji sadrži ovu polipeptidnu signalnu sekvencu koja je operativno povezana sa heterolognim polipeptidom.
[0009] Heterologni polipeptid može sadržati jedan ili više enzima, jedan ili više modifikatora biološkog odgovora, jedan ili više toksina, jedno ili više antitela, jedan ili više fragmenata heterolognog polipeptida ili bilo koje njihove kombinacije.
[0010] Heterologni polipeptid može sadržati jedno ili više od sledećeg: kisela βglukocerebrozidaza, kisela α-glukozidaza, proinsulin, hormon rasta nalik insulinu-2 (IGF-2), interferon, terapeutsko antitelo i hormon rasta nalik insulinu-1 (IGF-1).
[0011] Predmetni pronalazak takođe sadrži vektor eksprimiranja proteina koji sadrži: (a) promoter operativno vezan za prvu DNK sekvencu gde pomenuta prva DNK sekvenca kodira sekvencu polipeptidnog signala, i (b) drugu DNK sekvencu koja je spojena u okvir sa pomenutom prvom DNK sekvencom, gde pomenuta druga DNK sekvenca kodira heterologni polipeptid.
[0012] Druga DNK sekvenca može kodirati kiselu β-glukocerebrozidazu, kiselu αglukozidazu, proinsulin, hormon rasta nalik insulinu-2 (IGF-2)., interferon, terapijsko antitelo ili hormon rasta nalik insulinu-1 (IGF-1).
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0013] Gore navedeni i drugi aspekti ovog pronalaska su očigledni iz sledećeg detaljnog opisa pronalaska kada se razmatra u vezi sa pratećim crtežima. U svrhu ilustracije ovog pronalaska, na crtežima su prikazana otelotvorenja koja su trenutno poželjna, iako se podrazumeva da pronalazak nije ograničen na specifične instrumente koji su obelodanjeni. Crteži nužno nisu dati u razmeri. U crtežima:
Slika 1 prikazuje funkcionalni efekat signalnih sekvenci za eksprimiranje i lučenje rekombinantne ljudske kisele β-glukocerebrozidaze divljeg tipa tokom perioda od oko 72 sata.
Slika 2 pokazuje poželjno eksprimiranje i lučenje rekombinantne ljudske kisele βglukocerebrozidaze divljeg tipa u periodu od oko 63 sata pri visokoj gustini ćelija i osiromašenim hranljivim materijama.
Slika 3 prikazuje funkcionalni efekat signalnih sekvenci za eksprimiranje i lučenje rekombinantne ljudske kisele β-glukocerebrozidaze divljeg tipa u periodu od oko 43 sata.
DETALJNI OPIS ILUSTRATIVNIH OTELOTVORENJA
[0014] Kad se ovde koristi, „heterologni polipeptid“ je bilo koji polipeptid koji nije modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip).
[0015] Kad se ovde koristi, „Bip“ je skraćenica za vezujućeg proteina teškog lanca imunoglobulina.
[0016] Odgovarajuće sekvence polipeptidnih signala sadrže modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23.
[0017] Pogodni fuzioni proteini sadrže modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) koji je operativno povezan sa heterolognim polipeptidom. Modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23. Svi ovi fuzioni proteini mogu se okarakterisati time što imaju povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi. Ćelijske kulture takođe mogu biti pri neoptimalnim uslovima ćelijske kulture. Neoptimalni uslovi ćelijske kulture mogu biti velika gustina ćelija i osiromašenost hranljivim materijama. Heterologni polipeptid može biti jedan ili više enzima, jedan ili više modifikatora biološkog odgovora, jedan ili više toksina, jedno ili više antitela, jedan ili više fragmenata heterolognog polipeptida ili bilo koja njihova kombinacija. Heterologni polipeptid može biti kisela β-glukocerebrozidaza. Heterologni polipeptid može takođe biti kisela α-galaktozidaza. Heterologni polipeptid može takođe biti kisela α-glukozidaza. Heterologni polipeptid može takođe biti proinsulin. Heterologni polipeptid može takođe biti hormon rasta-2 nalik insulinu (IGF-2). Heterologni polipeptid može takođe biti interferon. Heterologni polipeptid takođe može biti terapeutsko antitelo. Heterologni polipeptid može takođe biti hormon rasta-1 nalik insulinu (IGF-1).
[0018] Drugi pogodni fuzioni proteini sa modifikovanim fragmentom vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) mogu sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23 i heterologni polipeptid može sadržati β-glukocerebrozidazu. Ti fuzioni proteini se mogu okarakterisati time što imaju povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi u poređenju sa divljim tipom βglukocerebrozidaze (β-glukocerebrozidaza sa prirodnom signalnom sekvencom βglukocerebrozidaze). Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi može se meriti testiranjem aktivnosti β-glukocerebrozidaze tokom oko 3 dana. Ćelijska kultura takođe može biti u neoptimalnim uslovima ćelijske kulture. Neoptimalni uslovi ćelijske kulture mogu biti visoka gustina ćelija i osiromašenost hranljivim materijama. Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi sa visokom ćelijskom gustinom i osiromašenim hranljivim materijama može se meriti testiranjem aktivnosti β-glukocerebrozidaze tokom oko 3 dana.
[0019] U drugim pogodnim fuzionim proteinima sa modifikovanim fragmentom vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23, heterologni polipeptid može sadržati kiselu α-galaktozidazu. Ovi fuzioni proteini mogu se okarakterisati time što imaju povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi u poređenju sa divljom αgalaktozidazom (a-galaktozidaza sa prirodnom signalnom sekvencom α-galaktozidaze). Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi može se meriti testiranjem aktivnosti αgalaktozidaze tokom oko 3 dana. Ćelijska kultura takođe može biti u neoptimalnim uslovima ćelijske kulture. Neoptimalni uslovi ćelijske kulture mogu biti visoka gustina ćelija i osiromašenost hranljivim materijama. Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi sa visokom gustinom ćelija i osiromašenim hranljivim materijama može se meriti testiranjem aktivnosti α-galaktozidaze tokom perioda oko 3 dana.
[0020] U drugim pogodnim fuzionim proteinima sa modifikovanim fragmentom vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23, heterologni polipeptid može sadržati kiselu α-glukozidaza. Ovi fuzioni proteini mogu se okarakterisati time što imaju povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi u poređenju sa divljom kiselom αglukozidazom (kisela α-glukozidaza sa prirodnom signalnom sekvencom kisele αglukozidaze). Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi može se meriti testiranjem aktivnosti kisele α-glukozidaze tokom oko 3 dana. Ćelijska kultura takođe može biti u neoptimalnim uslovima ćelijske kulture. Neoptimalni uslovi ćelijske kulture mogu biti visoka gustina ćelija i osiromašenost hranljivim materijama. Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi sa visokom gustinom ćelija i osiromašenim hranljivim materijama može se meriti testiranjem aktivnosti kisele α-glukozidaze tokom perioda oko 3 dana.
[0021] U drugim pogodnim fuzionim proteinima sa modifikovanim fragmentom vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23, heterologni polipeptid može sadržati proinsulin. Ovi fuzioni proteini mogu se okarakterisati time što imaju povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi u poređenju sa divljom proinsulinom (proinsulin sa prirodnom signalnom sekvencom proinsulina). Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi može se meriti testiranjem aktivnosti proinsulina tokom perioda oko 3 dana. Ćelijska kultura takođe može biti u neoptimalnim uslovima ćelijske kulture. Neoptimalni uslovi ćelijske kulture mogu biti visoka gustina ćelija i osiromašenost hranljivim materijama. Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi sa visokom gustinom ćelija i osiromašenim hranljivim materijama može se meriti testiranjem aktivnosti proinsulina tokom perioda oko 3 dana.
[0022] U drugim pogodnim fuzionim proteinima sa modifikovanim fragmentom vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23, heterologni polipeptid može sadržati hormon rasta-2 nalik insulinu (IGF-2). Ovi fuzioni proteini mogu se okarakterisati time što imaju povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi u poređenju sa divljim hormonom rasta-2 nalik insulinu (IGF-2) (hormon rasta-2 nalik insulinu (IGF-2) sa prirodnom signalnom sekvencom hormona rasta-2 nalik insulinu (IGF-2)). Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi može se meriti testiranjem aktivnosti hormona rasta-2 nalik insulinu (IGF-2) tokom oko 3 dana. Ćelijska kultura takođe može biti u neoptimalnim uslovima ćelijske kulture. Neoptimalni uslovi ćelijske kulture mogu biti visoka gustina ćelija i osiromašenost hranljivim materijama. Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi sa visokom gustinom ćelija i osiromašenim hranljivim materijama može se meriti testiranjem aktivnosti hormona rasta-2 nalik insulinu (IGF-2) tokom perioda oko 3 dana.
[0023] U drugim pogodnim fuzionim proteinima sa modifikovanim fragmentom vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23, heterologni polipeptid može sadržati interferon. Ovi fuzioni proteini mogu se okarakterisati time što imaju povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi u poređenju sa divljom interferonom (interferon sa prirodnom signalnom sekvencom interferona). Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi može se meriti testiranjem aktivnosti interferona tokom perioda oko 3 dana. Ćelijska kultura takođe može biti u neoptimalnim uslovima ćelijske kulture. Neoptimalni uslovi ćelijske kulture mogu biti visoka gustina ćelija i osiromašenost hranljivim materijama. Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi sa visokom gustinom ćelija i osiromašenim hranljivim materijama može se meriti testiranjem aktivnosti interferona tokom perioda oko 3 dana.
[0024] Drugi pogodni fuzioni proteini sa modifikovanim fragmentom vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) mogu da se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23 i heterologni polipeptid može sadržati terapeutsko antitelo. Ovi fuzioni proteini mogu se okarakterisati time što imaju povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi u poređenju sa divljim terapeutskim antitelom (terapeutsko antitelo sa prirodnom signalnom sekvencom terapeutskog antitela). Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi može se meriti testiranjem aktivnosti a terapeutsko antitelo tokom perioda oko 3 dana. Ćelijska kultura takođe može biti u neoptimalnim uslovima ćelijske kulture. Neoptimalni uslovi ćelijske kulture mogu biti visoka gustina ćelija i osiromašenost hranljivim materijama. Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi sa visokom gustinom ćelija i osiromašenim hranljivim materijama može se meriti testiranjem aktivnosti terapeutskog antitela tokom perioda oko 3 dana.
[0025] U drugim pogodnim fuzionim proteinima sa modifikovanim fragmentom vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23, heterologni polipeptid može sadržati hormon rasta-1 nalik insulinu (IGF-1). Ovi fuzioni proteini mogu se okarakterisati time što imaju povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi u poređenju sa divljim hormonom rasta-1 nalik insulinu (IGF-1) (hormon rasta-1 nalik insulinu (IGF-1) sa prirodnom signalnom sekvencom hormona rasta-1 nalik insulinu (IGF-1)). Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi može se meriti testiranjem aktivnosti hormona rasta-1 nalik insulinu (IGF-1) tokom oko 3 dana. Ćelijska kultura takođe može biti u neoptimalnim uslovima ćelijske kulture. Neoptimalni uslovi ćelijske kulture mogu biti visoka gustina ćelija i osiromašenost hranljivim materijama. Povećano eksprimiranje u ćelijskoj kulturi sa visokom gustinom ćelija i osiromašenim hranljivim materijama može se meriti testiranjem aktivnosti hormona rasta-1 nalik insulinu (IGF-1) tokom perioda oko 3 dana.
[0026] Odgovarajući vektor eksprimiranja proteina može da obuhvata promoter operativno vezan za prvu DNK sekvencu koja kodira polipeptidnu signalnu sekvencu, i obuhvata modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23 i druge DNK sekvence koja kodira heterologni polipeptid, koji je fuzionisan u okviru za prvu DNK sekvencu. Druga DNK sekvenca može da kodira βglukocerebrozidazu.
[0027] Odgovarajući vektor eksprimiranja proteina može da obuhvata promoter operativno vezan za prvu DNK sekvencu koja kodira polipeptidnu signalnu sekvencu, i obuhvata modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23 i druge DNK sekvence koja kodira heterologni polipeptid, koji je fuzionisan u okviru za prvu DNK sekvencu. Druga DNK sekvenca može da kodira kiselu α-glukozidazu.
[0028] Odgovarajući vektor eksprimiranja proteina može da obuhvata promoter operativno vezan za prvu DNK sekvencu koja kodira polipeptidnu signalnu sekvencu, i obuhvata modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23 i druge DNK sekvence koja kodira heterologni polipeptid, koji je fuzionisan u okviru za prvu DNK sekvencu. Druga DNK sekvenca može da kodira druge heterologne proteine kao što je kisela α-galaktozidaza. Heterologni polipeptid takođe može biti proinsulin. Heterologni polipeptid takođe može biti hormon rasta-2 nalik insulinu (IGF-2) ili hormon rasta-1 nalik insulinu (IGF-1). Heterologni polipeptid takođe može biti interferon.
Heterologni polipeptid takođe može biti a terapeutsko antitelo. Heterologni polipeptid takođe može biti bilo koji drugi protein izlučen iz ćelija.
[0029] Odgovarajući postupak za proizvodnju polipeptida može sadržati eksprimiranje fuzionog proteina sa modifikovanim fragmentom vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) koji je operativno vezan za heterologni polipeptid i uzimanje navedenog heterolognog polipeptida. Postupak za proizvodnju polipeptida može se izvesti u kultivisanim ćelijama. Kultivisane ćelije mogu biti ćelije kvasca ili ćelije sisara. Postupak za proizvodnju polipeptida može se izvesti u transgenom sistemu. Taj transgeni sistem može da sadrži krave, koze, ovce, zečeve ili bilo koju njihovu kombinaciju. Uzimanje iz transgenih sistema može biti putem mleka. Transgeni sistem može sadržati i kokoške. Uzimanje iz transgenih sistema može biti putem jaja.
[0030] Pogodan postupak izrade vektora eksprimiranja proteina može sadržati povezivanje promotera operativno sa prvom DNK sekvencom koja kodira polipeptidnu signalnu sekvencu koja sadrži modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) i fuzioniše u okvir drugu DNK sekvencu koja kodira heterologne polipeptide do prve DNK sekvence. Postupak stvaranja vektora eksprimiranja proteina takođe može imati prvu DNK sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 23. Postupak stvaranja vektora eksprimiranja proteina takođe može imati drugu DNK sekvencu koja kodira kiselu β-glukocerebrozidazu, kiselu αgalaktozidazu, kiselu α-glukozidazu, proinsulin, hormon rasta-2 nalik insulinu (IFG-2), interferon, terapeutsko antitelo ili hormon rasta-1 nalik insulinu (IFG-1) ili druge proteine koji su izlučeni iz ćelija.
[0031] Pogodan postupak povećanja eksprimiranja proteina može sadržati eksprimiranje fuzionog proteina koji sadrži modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) i heterologni proteina i uzimanje heterolognog proteina.
[0032] Pogodan postupak povećanja lučenja proteina može sadržati eksprimiranje fuzionog proteina koji sadrži modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) i heterologni proteina i uzimanje heterolognog proteina.
PRIMER 1
Reagensi
[0033] Divlja ljudska β-glukocerebrozidaza („GlcCeraza“) cDNK (NM_000157.3), divlja αgalaktozidaza A (GLA) cDNK (NM_000169.2), divlja ljudska kisela α-glukozidaza (GAA) cDN (NM_000152.2) i divlji ljudski faktor rasta-2 nalik insulinu (IGF-2) cDNK (NM_000612.4) su svi nabavljeni od Origene™ (Rockville, MD) dok su svi oligonukleotidni prajmeri i sintetički Minigenni nabavljeni od Integrated DNA Technologies™ (IDT™;
Coralville, IA). pEF6/V5-HisA sisarski vektor eksprimiranja, modifikovani Dulbekov Iglov medijum (DMEM), fetalni goveđi serum (FBS) i drugi reagensi kulture tkiva nabavljeni su od Invitrogen™ (Carlsbad, CA). Restriktivne endonukleaze, Phusion-HF DNK polimeraza™, T4 DNK ligaza, Antarktička fosfataza, hemijski kompetentna E. coli (DH5α ćelije) su svi nabavljeni od New England Biolabs™ (Ipswich, MA). Fluorogeni supstrati za različite glikozidaze su nabavljeni od Research Products International™ (Mt. Prospect, IL), DNA Gel Ekstrakcionog i Miniprep DNA kompleti nabavljeni su od QIAGEN™ (Valencia, CA), PureYield Maxiprep DNA™ kit je dobijen iz Promega™ (Madison, WI ). Ukoliko nije drugačije naznačeno, hemikalije su nabavljeni od Sigma™ (St. Louis, MO), Fugene-HD™ reagens transfekcije od Roche™ (Indianapolis, IN), ljudske embrionalne bubrežne ćelije transformisane sa T-antigenom (HEK293T) su nabavljeni od ATCC™ .
PRIMER 2
Konstrukcija plazmida
[0034] DNK plazmidi su konstruisani tako da kodiraju različite proteinske modele koji sadrže ili svoje prirodne signalne sekvence ili su zamenjeni sa modifikovanim ljudskim Bip signalnim sekvencama kako bi procenili efekat ovih signalnih sekvenci na eksprimiranje i lučenje test proteina.
[0035] Kako bi se procenila ljudska kisela β-glukocerebrozidaza (GlcCeraza, EC 3.2.1.45), napravljeno je nekoliko različitih DNK plazmida za kodiranje GlcCeraza divljeg tipa sa bilo kojom njenom prirodnom signalnom sekvencom ili sa ljudskom Bip signalnom sekvencom ili modifikovanom Bip signalnom sekvencom. Kako bi se generisala ljudska GlcCeraza divljeg tipa sa prirodnom signalnom sekvencom, celokupna ljudska GlcCeraza cDNK je amplifikovana pomoću PCR-a putem Phusion-HF DNK polimeraze™ pomoću Prajmera 1 i 2 (Tabela I) i GlcCeraza cDNK klona (NM_000157.3, Origene). Prajmer 1 je konstruisan tako da sadrži 5 'Bgl II i interno mesto za restrikciju EcoRI koji je odmah preteklo prirodnu GlcCeraza Kozak sekvencu, dok je prajmer 2 sadržao 3' Nhel i NotI mesta ograničenja koja su uspela da zaustave kodon da omoguće kloniranje proizvoda PCR u sisarske vektore eksprimiranja. ~1,6 kilobauno(kb) PCR proizvod (A) je odvojen i izrezan iz preparatnog gela agaroze od 1% (W/v) i izolovan pomoću QIAGEN™ Gel Ekstrakcionog kit™. PCR proizvod A je naknadno digestiran preko noći sa restrikcionim endonukleazama Bgl II i NotI na 37°C, ponovo prečišćen i ligiran u pEF6/V5-HisA sisarski vektor eksprimiranja (Invitrogen™) koji je ranije bio razblažen sa BamHI i Not I i defosforilizovan je sa sa antarktičnom fosfatazom koristeći T4 DNK ligazu. Mesto restrikcije Bgl II je ugrađeno u prajmer 1, tako da je ligacija Bgl II-digestiranog GlcCeraza PCR proizvoda u kompatibilnu BamHI lokaciju pEF6/V5-HisA vektora eliminisala mesto restrikcije BamHI na mestu višestrukog kloniranja i ovaj modifikovani vektor eksprimiranja u daljem tekstu će se nazvati pEF6'. Ovaj DNK konstrukt, označen kao pHD101, korišćen je za transformaciju hemijski kompetentnih E. coli ćelija i pojedinačne bakterijske kolonije otporne na ampicilin su proširene i prikazane restrikcionim reakcijama digestije sa EcoRI & Nhel i sa BamHI, respektivno. Ispravna plazmidna DNK iz klona 4 (naznačena kao pHD101.4) dodatno je potvrđena sekvenciranjem DNK i odabrana je za eksprimiranje GlcCeraze divljeg tipa. pHD101.4 je korišćen za izgradnju drugih plazmida koji kodiraju divlje tipove GlcCeraza bilo sa ljudskom Bip signalnom sekvencom ili sa modifikovanim verzijama ove Bip signalne sekvence umesto prirodne signalne sekvence GlcCeraze. Ukratko, dvolančani DNK minigen (naznačen kao minigen 1 u Tabeli II) je konstruisan (i sintetisan od strane Integrated DNK Technologies™, IDT™) kako bi se zadržala prirodna Kozak sekvenca iz gena alkohola oksidaze 1 (AOX1) kvasca, gena za celokupnu prirodnu ljudsku Bip signalnu sekvencu sa 18-ostataka (uključujući njenu sekvencu prepoznavanja prirodnog signala peptidaze: Ser-Ala-Ala-Arg-Ala; SAARA (SEQ ID NO: 24)) i N-terminal 123 aminokiselinskih ostatke zrele divlje ljudske GlcCeraze (nukleotidi 118-490). Minigen 1 takođe sadrži 5' EcoRI restrikcionu lokaciju koja je prethodila AOX1 Kozak sekvenci i prirodnom NcoI mestu unutar gena GlcCeraze na 3' kraju kako bi se omogućilo kloniranje u pHD101.4 za zamenu prirodne signalne sekvence GlcCeraze sa ljudskom Bip signalnom sekvencom. Štaviše, ova strategija omogućava izgradnju DNK plazmida za eksprimiranje GlcCeraze divljeg tipa (sa Bip signalnom sekvencom) u sistemima sisara ili kvasca (koji su pod kontrolom inducibilnog AOX1 promotera). Dizajn ovog i drugih fuzionih proteina koristio je program za analizu SignalP 4.0™ kako bi predvideo da li se sekvenca Bip signala može razdvojiti iz test proteina.
[0036] Dodatni aminokiselinski ostaci dodati su u konstrukt kao što je potrebno za olakšavanje cepanja signalne sekvence i odabrane su samo sekvence koje su predviđene da imaju odgovarajuće cepanje signalne sekvence za generisanje ovih fuzija test proteina. Za eksprimiranje u sisarskim sistemima, DNK fragment Bip-GlcCeraze koji sadrži prirodnu ljudsku Bip Kozak sekvencu sintetisan je putem PCR koristeći Prajmeri 3 i 4 i minigen 1 DNK obrazac. Ovaj ~440 bp PCR proizvod (B) je odvojen i izrezan iz pripremnog gela agaroze od 1% (w/v) i izolovan pomoću kit QIAGEN Gel Ekstrakcionog kompleta. PCR proizvod B je digestiran preko noći sa restrikcionim endonukleazama EcoRI i Nco I, ponovo prečišćen i ligiran pomoću NcoI→Not I DNK fragmenta iz pHD101.4 koji kodira aminokiselinske ostatke 124-497 zrele GlcCeraze divljeg tipa (bez prirodne GlcCeraza signalne sekvence) i ~5,8 kb EcoRI→Not I pEF6' vektorski DNK fragment kao što je prethodno opisano. Ovaj DNK konstrukt, označen kao pHD201, proveren je pomoću restrikcionog digestiranja korišćenjem EcoRI-Xba I, i ispravan klon (pHD201.2) su verifikovani sekvenciranjem DNK, i zatim se koriste za procenu efekata ljudske Bip signalne sekvenca na eksprimiranje i lučenje GlcCeraze divljeg tipa. Slično tome, modifikovana verzija Bip signalne sekvence (minigen 2) je konstruisana i sintetisana pomoću IDT™ kako bi se zadržala prirodna Kozak sekvenca iz AOX1 gena kvasca, prvih 13 ostataka prirodne ljudske Bip signalne sekvence praćene ponavljanjem aminokiselinskih ostataka 4-13, prirodna Bip signalna sekvenca prepoznavanja peptidaze (ostaci 14-18) i N-terminalni 123 ostaci zrele ljudske GlcCeraze (nukleotidi 118-490). Ova modifikacija Bip signalne sekvence (označena kao modifikovana Bip signalna sekvenca-1) proširila je hidrofobni domen tako da se proteže duž cele ER membrane i produžila je signalnu sekvencu sa 18 na 28 ostataka. Za eksprimiranje u sisarskim sistemima modifikovana Bip signalna sekvenca-1-GlcCeraza DNK koja sadrži prirodni ljudski Bip Kozak fragment sekvence sintetisana je putem PCR koristeći Prajmere 3 i 4 i minigen 2 DNK obrazac. Ovaj ~470 bp PCR proizvod (C) je izolovan od 1% (w/v) agaroznog pripremnog gela, razblažen sa EcoRI i Nco I, ponovo prečišćen i ligiran sa Nco I→Not I DNK fragmentom iz pHD101.4 koji kodira aminokiselinske ostatke 124-497 zrele GlcCeraze divljeg tipa (nedostaje prirodna signalna sekvenca GlcCeraze) i - 5,8 kb EcoRI→Not I pEF6 vektor DNK fragment kao i ranije. Ovaj DNK konstrukt, označen kao pHD204, proveren je pomoću restrikcionog digestiranja pomoću EcoRI i Xba I, i tačan klon (pHD204.1) je potvrđen sekvenciranjem DNK, i zatim se koristi za procenu efekata ove modifikovane Bip signalne sekvence na eksprimiranje i lučenje GlcCeraze divljeg tipa.
Tabela 1
[0038] Modifikovani Bip signal-1 je naknadno dodat drugim proteinima kako bi se procenili njegovi efekti na njihovo eksprimiranje i lučenje. Ukratko, minigen 3 (Tabela II) je konstruisan tako da sadrži prvih 13 ostataka prirodne ljudske Bip signalne sekvence, praćene ponavljanjem aminokiselinskih ostataka 4-13 i ostataka 14-17 prirodne Bip signalne sekvence prepoznavanja peptidaze. Minigen 3 sadrži prirodnu Kozak sekvencu iz ljudskog Bip, kao i 5' EcoRI i 3' Stu I i Not I restrikcije. Stu I je inkorporiran u minigen 3, jer ovaj restrikcioni enzim proizvodi tup 3' kraj nakon AGG (kodon za arginin, Arg; R) koji služi kao prirodni Arg na ostatku 17 iz prirodne Bip signalne sekvence cepanja peptidaze. Prema tome, svaki protein može biti ligiran za ovaj modifikovani fragment Bip signalne sekvence pod uslovom da se dodaju dodatni alanin proteinskoj sekvenci na N-terminusu kako bi se dovršila prirodna SAARA (SEQ ID NO: 24) signala sekvenca prepoznavanja peptidaze.
[0039] DNK nukleotidne sekvence minigena za Bip i modifikovane Bip signalne sekvence su rezimirane u Tabeli 2.
Tabela 2
[0040] Za procenu kisele α-galaktozidaze A (GLA, EC 3.2.1.22), enzim divljeg tipa sa svojom prirodnom signalnom sekvencom je amplifikovan pomoću PCR koristeći Prajmere 5 i 6 sa GLA cDNK klon (NM_000169.2, Origene™) šablonom DNK . Taj ~1.3Kb PCR proizvod je izolovan preparatnim gelom agaroze, digestiran sa EcoRI i Not I i ligiran u EcoRI-Not I, digestiran, defosforilizovan pEF6'. Ovaj DNK konstrukt je označen kao pHD214 i korišćen je za procenu GLA eksprimiranja. Za konstrukciju GLA sa modifikovanom Bip signalnom sekvencom-1, zreli GLA enzim je sintetisan PCR pomoću prajmera 6 i 7 sa GLA cDNK klon DNK šablonom. Ovaj ~1.2Kb PCR proizvod (D) je razblažen sa Not I, izolovanim od agarznog pripremnog gela i ligiran do EcoRI→Stu I minigen 3 DNK fragmenta i EcoRI→Not I-digestiran pEF6' vektor kao i ranije. Ovaj DNK konstrukt je označen kao pHD215 i korišćen je za procenu efekata ove modifikovane sekvence Bip signala na eksprimiranje i lučenje GLA divljeg tipa.
[0041] Za procenu kisele α-glukozidaze (GAA, EC 3.2.1.0), čitav GAA enzim divljeg tipa (sa svojom prirodnom signalnom sekvencom) je amplifikovan pomoću PCR koristeći Prajmere 8 i 9 sa GAA cDNK klon (NM_000152.2, Origene) šablonom DNK. Ovaj ~3 kb PCR proizvod (E) je izolovan preparatnim gelom agaroze, digestiran sa EcoRI i Not I i ligiran je do EcoRI-Not I digestiran, defosforilizovan pEF6'. Ovaj DNK konstrukt je označen kao pHD217 korišćen za procenu eksprimiranja GAA sa svojom prirodnom signalnom sekvencom. Pošto se GAA eksprimira sa višestrukim pro-sekvencama koje prethode zrelom enzimu (Moreland et al., 2005), različiti GAA proteini sa različitim dužinama su sintetisani i dodati modifikovanoj Bip signalnoj sekvenci-1 za testiranje. GAA DNK fragment koji nema svoju prirodnu signalnu sekvencu, ali koji sadrži ostatke 24-952 je sintetisan saPCR pomoću Prajmera 9 i 10. Ovaj ~3 kb PCR proizvod (F) je izolovan iz agaroznog pripremnog gela i digestiran sa Not I i ligiran na EcoRI→Stu I minigen 3 DNK fragment i EcoRI→Not I-digestiran pEF6' vektor. Ovaj DNK konstrukt koji sadrži modifikovanu Bip signalnu sekvencu-1 i GAA (24-952) označen je kao pHD218. Slično tome, GAA DNK fragment kom nedostaje njegovu prirodna signalnu sekvencu, ali koji sadrži ostatke 57-952 je sintetisan pomoću PCR koristeći Prajmere 9 i 11. Ovaj ~2,9 kb PCR proizvod (G) je izolovan iz agaroznog pripremnog gela i razblažen sa Not I i ligiran na EcoRI→Stu I minigen 3 DNK fragment i EcoRI→Not I-digestiran pEF6' vektor kao i ranije. Ovaj DNK konstrukt koji sadrži modifikovanu Bip signalnu sekvencu-1 i GAA (57-952) označen je kao pHD219. GAA DNK fragment koji nema svoju prirodnu signalnu sekvencu, ali koji sadrži ostatke 78-952 je sintetisan sa PCR pomoću Prajmera 9 i 12. Ovaj ~2,8 kb PCR proizvod (H) je izolovan iz agaroznog pripremnog gela i digestiran sa Not I i ligiran na EcoRI→Stu I minigen 3 DNK fragment i EcoRI→Not I-digestiran pEF6' vektor. Ovaj DNK konstrukt koji sadrži modifikovanu Bip signalnu sekvencu-1 i GAA (78-952) označen je kao pHD220. Efekti ove modifikovane Bip signalne sekvence-1, kao i pro-sekvence na GAA eksprimiranje i lučenje, mogu se tako pažljivo ispitati pomoću DNK konstrukata pHD217-220.
[0042] Druge modifikovane sekvence Bip signala (Tabela III) izvedene iz modifikovane Bip signalne sekvence-1 su dizajnirane i biće ocenjene kako bi se procenilo da li ove dodatne modifikacije mogu dodatno poboljšati eksprimiranje i lučenje proteina. Ove modifikacije uključuju zamenu ostataka serina i leucina na položajima 14 i 15 sa jednim triptofanskim ostatkom i brisanjem ostataka alanina i metonina na položajima 18 i 19 u okviru hidrofobnog domena (naznačenog kao modifikovana Bip signalna sekvenca-2), čime se brišu ostaci alanina i metonina na položajima 18 i 19 unutar hidrofobnog domena (naznačenog kao modifikovana Bip signalna sekvenca-3) i menja se serinski ostatak na položaju 14 sa alaninom i brišu se ostaci alanina i metonina na položajima 18 i 19 unutar hidrofobnog domena (modifikovana Bip signalna sekvenca-4 ). Ove modifikacije su imale za cilj povećanje hidrofobnosti hidrofobnog domena što može dodatno povećati interakcije ovih signalnih sekvenci sa ključnim ribozomalnim i ER translokon proteinima i stvaranjem efikasnije lokacije za cepanje signalne peptidaze radi poboljšanja translokacije proteina i lučenja proteina za rekombinantne proteine.
[0043] Ostali test proteini, uključujući ljudski insulin, faktor rasta nalik insulinu-2 (IGF-2), antitela, interferone, apolipoproteine i slično, takođe će se proceniti kako bi se utvrdilo da li ove modifikovane sekvence Bip signala poboljšavaju njihovo eksprimiranje i lučenje.
[0044] Sekvence aminokiselina za modifikovane sekvence Bip signala su rezimirane u Tabeli 3.
Tabela 3
PRIMER 3
Tranzijentno eksprimiranje test proteina
[0045] Za eksperimente tranzijentnog eksprimiranja, HEK293T ćelije su stavljene na ploče za kulturu tkiva sa 12 komorica sa 1 ml DMEM medijuma dopunjenog sa 10% FBS i inkubirane na 37°C sa 5% CO2 atmosferom. Kada su HEK293T ćelije dostigle 70-100% konfluentnosti, potrošeni medijum je zamenjen sa 1 ml svežeg DMEM/10% FBS medijuma i svaka komorica je transfektovana sa 1 μg plazmidne DNK za pojedine test proteine ili PBS (za lažno transfektovanu negativanu kontrolu) i 3 μl Fugene™-HD transfekcionog reagensa prema protokolu proizvođača. Transfektovane ćelije su inkubirane u trajanju od 24-72 sata i svakodnevno se kontrolišu za eksprimiranje individualnog rekombinantnog enzima (izlučenog u medijum) pomoću analize aktivnosti enzima i/ili Western blotovanjem i ELISA.
PRIMER 4
Analize aktivnosti enzima
[0046] Eksprimiranje i lučenje rekombinantne ljudske kisele β-glukocerebrozidaze (GlcCeraza) u medijum ćelijske kulture procenjeni su pomoću analiza aktivnosti enzima koristeći kondicionirani medijum od eksperimenata tranzijentne transfekcije posle 24, 48 ili oko 72 sata i 4-metilumbeliferil-pD-glukopiranozida (4 -MU-β-Glc) fluorogeni supstrat. Ukratko, 20 μl kondicioniranog medijuma iz svakog uzorka je sakupljeno u navedenim vremenskim tačkama i razblaženo sa 80 μl McIlvane pufera (MI pufer: 50 mM natrijum citrat/natrijum fosfat (pH 5.2)/0,25% (v/v) Triton X- 100/0,25% (w/v) natrijum turoholat) u 0,5 ml cevi za mikrocentrifugu. Dvadeset pet μl svakog razblaženog uzorka alikotovano je u pojedinačne komorice 96-komoričnih crnih ploča sa bistrim dnom (izvedeno u triplikatu) i 50 μl 6 mM 4-MU-β-Glc supstrata (pripremljen u MI puferu) je dodato u svaku komoricu preko višekanalnog pipetora. Ploče su zatim zatvorene trakom i inkubirane na 37°C u trajanju od 1 sata. Enzimske reakcije su zaustavljene dodavanjem 125 μl 0,1 M NaOH i oslobođena 4-MU fluorescencija pročitana je na čitaču fluorescentnih ploča uz pomoć 355 nm eksitacije i 460 nm talasne dužine emisije, respektivno.4-MU fluorescencija iz uzorka koji su lažno transfektovani služi kao „pozadinska“ kontrola i oduzeta je od svih GlcCeraza uzoraka.
[0047] Eksprimiranje i lučenje rekombinantne ljudske kisele α-glukozidaze (GAA) mereno je aktivacijom enzimske aktivnosti korišćenjem kondicioniranog medijuma od eksperimenata tranzijentne transfekcije posle 24, 48 ili 72-sati i 4-metilumbeliferil-α-D-glukopiranozid (4-MU-α -Glc) fluorogenog supstrata. Konkretno, 20 μl kondicioniranog materijala iz svakog uzorka je sakupljeno u različitim vremenskim tačkama i razblaženo je sa 80 μl 50 mM natrijum-acetatnim puferom (pH 4,0) u 0,5 ml cevi za mikrocentrifugu. Dvadeset pet μl svakog razblaženog uzorka alikotovano je u pojedinačne komorice 96-komoričnih crnih ploča sa bistrim dnom (izvedeno u triplikatu) i 50 μl od 6 mM 4-MU-β-Glc supstrata (pripremljen u 50 mM puferu natrijum acetata, pH 4,0) je dodato u svaku komoricu preko višekanalnog pipetora. Ploče su zatim zatvorene trakom i inkubirane na 37°C u trajanju od 1 sata.
Enzimske reakcije su zaustavljene dodavanjem 125 μl 0,1 M NaOH i oslobođena 4-MU fluorescencija pročitana je na čitaču fluorescentnih ploča uz pomoć 355 nm eksitacije i 460 nm talasne dužine emisije, respektivno. 4-MU fluorescencija iz uzorka koji su lažno transfektovani služi kao „pozadinska“ kontrola i oduzeta je od svih GlcCeraza uzoraka.
[0048] Eksprimiranje i lučenje rekombinantne ljudske kisele α-galaktozidaze (GLA) će se izmeriti analizama aktivnosti enzima koristeći kondicionirani medijum od eksperimenata tranzijentne transfekcije posle 24, 48 ili 72-sati i 4-metilumbeliferil-α-D-galaktopiranozid (4-MU- α-Gal) fluorogenog supstrata. Konkretno, 20 μl kondicioniranog materijala iz svakog uzorka je sakupljeno u različitim vremenskim tačkama i razblaženo je sa 80 μl 50 mM natrijum-acetatnim puferom (pH 4,0) u 0,5 ml cevi za mikrocentrifugu. Dvadeset pet μl svakog razblaženog uzorka alikotovano je u pojedinačne komorice 96-komoričnih crnih ploča sa bistrim dnom (izvedeno u triplikatu) i 50 μl od od 8 mM 4-MU-α-Gal supstrata (pripremljen u 50 mM natrijum-citrat/natrijum-fosfatnom puferi, pH 4,6) će biti dodati u svaku komoricu preko višekanalnog pipetora. Ploče će biti zatvorene trakom i inkubirane na 37°C u trajanju od 1 sata. Enzimske reakcije će biti zaustavljene dodavanjem 125 μl 0,1 M NaOH i oslobođena 4-MU fluorescencija će biti pročitana na čitaču fluorescentnih ploča uz pomoć 355 nm eksitacije i 460 nm talasne dužine emisije, respektivno. 4-MU fluorescencija iz uzorka koji su lažno transfektovani služi kao „pozadinska“ kontrola i biće oduzeta od svih GLA uzoraka.
PRIMER 5
[0049] Prepoznato je da su određeni proteini prirodno eksprimirani na veoma visokim nivoima, dok su drugi slabo eksprimirani. Dok su obilje i stabilnost mRNK važni faktori na nivou transkripcije koji mogu uticati na eksprimiranje proteina, postaje sve jasnije da signalne sekvence takođe igraju kritične uloge na nivou proteina i doprinose ovom disparitetnom eksprimiranju proteina. Vezujući protein teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) ima specifične karakteristike koje bi bile posebno pogodne za razvoj superiornih signalnih sekvenci radi poboljšanja eksprimiranja i lučenja proteina za rekombinantne proteine. Jedna modifikovana Bip signalna sekvenca je napravljena i dodata model proteinu kako bi se utvrdilo da li bi ova neprirodna signalna sekvenca poboljšala eksprimiranje i lučenje proteina za model protein. Konkretno, hidrofobno jezgro je produženo kako bi se formirala duža α-heliks struktura. Predviđeno je da produžavanje hidrofobnog domena u modifikovanoj Bip signal sekvenci-1 ima nekoliko prednosti. Prvo, modifikovani (duži) hidrofobni domen bi formirao duži α-heliks i obuhvatao ceo ribozomni izlazni tunel koji se lako može identifikovati od strane ribozomnog proteina Rpl17 kako bi se olakšale bolje interakcije sa drugim ključnim ER proteinom kao što su Sec61 podjedinici i RAMP4. Drugo, duži α-heliksni hidrofobni domen može omogućiti da ova modifikovana Bip signalna sekvenca interakuje sa ključnim translokonskim proteinima kao što su TRAM i Sec61 podjedinice kako bi se efikasno orijentisali na novi polipeptid na translokon pori kako bi promovisao neophodnu protein translokacija-kompetentna petlja orijentaciju. Treće, duži αheliksni hidrofobni domen može omogućiti ovoj modifikovanoj Bip signalnoj sekvenci da se kreće iz vodene transokonske pore i efikasnije u lipidni dvosloj tako da se može brzo prekinuti signalnom peptidazom. Četvrto, modifikovana Bip signalna sekvenca može se pomeriti daleko od translokona sa bržom većom brzinom kako bi omogućila rekombinantnom proteinu da interakuje sa drugim važnim proteinima kao što su oligosahariltransferaze, ER haperon proteini kao što su Bip, protein disulfid izomeraza i kalneksin pre sinteze radi poboljšanja savijanja proteina. Svaka od, ili sve ove potencijalne koristi bi poboljšale brzinu eksprimiranja proteina, preklapanje i izvoz iz ćelija.
[0050] Mogu se izvršiti i druge modifikacije uključujući dodavanje naelektrisanih ostataka u bokove regiona proširenog hidrofobnog domena kako bi se dodatno povećala njegova hidrofobnost i pomogla pravilna orijentacija signalne sekvence na translokonu. Ove modifikacije imaju za cilj poboljšanje interakcije signalne sekvence sa određenim ribozomalnim proteinima, naročito Rpl17, što zauzvrat povećava interakcije sa translokon proteinom Sec61β, RAMP4 i TRAM radi poboljšanja translokacije proteina, eksprimiranja i lučenja proteina.
[0051] Nekoliko različitih DNK konstrukata koji kodiraju ljudsku GlcCerazu divljeg tipa proizvedeni su da sadrže bilo prirodnu sekvencu GlcCeraza signala (WT GlcCeraza) ili ljudsku Bip signalnu sekvencu (CBP201 GlcCeraza) ili novu modifikovanu Bip signalnu sekvencu-1 (CBP204 GlcCeraza). Ovi konstrukti (1 μg) su testirani eksperimentima tranzijentnog eksprimiranja u ljudskoj ćelijskoj liniji (HEK293T) koji su bili na ~80% konfluentnosti. Kondicionirani medijumi ćelijske kulture (20 μl) se sakupljaju dnevno tokom 72-satnog perioda vremena i analiziraju se za enzimsku aktivnost GlcCeraze koristeći fluorogeni supstrat 4-MU-β-glukoze za procenu efekata signalnih sekvenci na eksprimiranje i lučenje GlcCeraze. Kao što se može videti na Slici 1, obe signalne sekvence mogu promovisati eksprimiranje i lučenje GlcCeraze u medijum ćelijske kulture. Međutim, dizajnirana modifikovana Bip signalna sekvenca-1 (u CBP204 GlcCeraza) je primećena da daje dvostruko veću aktivnost GlcCeraze u odnosu na WT GlcCerazu 72 sata posle transfekcije. Bazalna aktivnost je zabeležena za negativnu kontrolu transfektovanog (praznog vektora) i potvrdila je da povećana aktivnost enzima rezultuje iz eksprimiranja rekombinantne GlcCeraze. Eksperimenti višestruke transfekcije (n> 3) su potvrdili da je novi niz signala povećao eksprimiranje i lučenje GlcCeraze.
PRIMER 6
[0052] Sinteza proteina je veoma pogođena dostupnošću hranljivih materija (tj. ATP, aminokiseline, ugljeni hidrati itd.), kao i drugih esencijalnih ćelijskih komponenti (npr. faktori inicijacije i elongacije, tRNK, proteinski haperoni itd.). Prvi se može povećati ili dopuniti medijumom ćelijske kulture tokom ponovnog hranjenja, dok su druge komponente ograničene u ćelijama i ne mogu se dopunjavati tokom proizvodnje proteina. Iscrpljivanje ovih vitalnih komponenti uzrokuje značajan ćelijski stres koji rezultira smanjenjem ili čak suspenzijom nove sinteze proteina za većinu proteina. Zanimljivo je da se eksprimiranje nekih proteina održava i zapravo povećava tokom ovih stresnih perioda kao deo adaptivnog ćelijskog odgovora kako bi se pomoglo ćelijama da se vrate u homeostazu. Nije sasvim jasno kako se ovi odabrani proteine razlikuju pomoću mehanizama sinteze ćelijskih proteina kako bi se omogućilo njihovo poželjno eksprimiranje, ali se veruje da se signalne sekvence igraju važnim ulogom u ovom procesu. Budući da je Bip važan ER haperon protein čije se eksprimiranje održava tokom ovog stresnog perioda kako bi se pomoglo ponovno uspostavljanje ćelijske homeostaze, predviđamo da će ova modifikovana Bip signalna sekvenca omogućiti održavanje poželjno eksprimiranje heterolognog rekombinantnog proteina pod uslovima u kojima je eksprimiranje ostalih proteina smanjeno ili potisnuto. Kako bi testirali ovu hipotezu, transfekovali smo KEK293T ćelijske kulture sa visokom gustinom ćelija (~100% konfluentne) sa WT GlcCerazom i CBP204 GlcCerazom i pratili smo njihovo eksprimiranje i lučenje tokom perioda od 63 časa. Osim toga, medijum za kulturu ćelije nije se tokom eksperimenta promenio kako bi iscrpeo hranljive materije (u kasnim fazama eksperimenta, kako bi se imitirali periodi niskih hranljivih materija u toku serijskih primena pre ponovnog hranjenja) kako bi se utvrdilo da li se eksprimiranje WT GlcCeraze i CBP204 GlcCeraze menja kao odgovor na iscrpljivanje hranljivih materija.
[0053] Naši rezultati pokazuju da je pod ovim eksperimentalnim uslovima, CBP204 GlcCeraza koja sadrži modifikovanu Bip signalnu sekvencu-1 eksprimirana bolje od WT GlcCeraze sa svojim prirodnim signalnim sekvencama tokom perioda od 63 sata, kao što je prikazano na Slici 2. Nivoi CBP204 GlcCeraze su 1,9 puta veći od WT GlcCeraze nakon 24 sata, 2,1 puta veći posle 48 sati i 2,5 puta veći nakon 63 sata. Kada se ekstrapolira do 72 sata, CBP204 GlcCeraza bila bi 3,3 puta veća od WT GlcCeraze. Značajno, eksprimiranje CBP204 GlcCeraze je održavano u skoro konstantnoj stopi gde je nakon svakog dana bilo udvostručavanje izlučenog proteina. Nasuprot tome, stopa eksprimiranja za WT GlcCerazu značajno je usporena kasnije. Ova razlika je najočiglednija kada se poredi oblik krive eksprimiranja za ova dva enzima - blizu linearne krive CBP204 GlcCeraze i nelinearna kriva za WT GlcCerazu jer je stopa eksprimiranja poravnata na kasnijim tačkama. Ovi podaci pokazuju diferencijalno eksprimiranje CBP204 GlcCeraze i WT GlcCeraze, verovatno u reakciji sa iscrpljivanjem hranljivih materija, i ova divergencija bi se dodatno povećala sa dužim inkubacijama. S obzirom da je jedina razlika između CBP204 GlcCeraze i WT GlcCeraze signalna sekvenca, ovi podaci podržavaju hipotezu da modifikovana Bip signalna sekvenca-1 omogućuje poželjno eksprimiranje tokom neoptimalnih uslova ćelijske kulture.
PRIMER 7
[0054] Kako bi se testirali efekti modifikovane Bip signalne sekvence-1 na eksprimiranje i lučenje drugog modela proteina, DNK plazmidi su konstruisani za kodiranje divlje ljudske kisele α-glukozidaze (GAA) koji sadrži ili njenu prirodnu GAA signalnu sekvencu (WT GAA) ili dizajniranu Bip signalnu sekvencu-1 i aminokiselinske ostatke 24-952 GAA (označene kao CBP218 GAA). Ovi DNK konstrukti su testirani tranzijentnim eksprimiranjem u HEK293T u periodu od ~2 dana kako bi se direktno uporedili efekti ovih signalnih sekvenci na eksprimiranje i lučenje GAA. Kao što se vidi na Slici 3, CBP218 GAA je imala 2,5-puta veću koncentraciju GAA aktivnosti u medijumu nego WT GAA 43 sata posle-transfekcije. Bazalna aktivnost je zabeležena za lažno transfekovanu (praznim vektorom) negativnu kontrolu i potvrdila da je posmatrana enzimska aktivnost u medijumu rezultat dobijanja rekombinantne GAA. Ovi rezultati pokazuju da je modifikovana Bip signalna sekvenca-1 (u CBP218 GAA) značajno povećala eksprimiranje i lučenje GAA pod istim uslovima eksperimenta, jer su jedina razlika između CBP218 GAA i WT GAA njihove odgovarajuće signalne sekvence.
PRIMER 8
Western blotovanje i ELISA testovi
[0055] Eksprimiranje i lučenje test proteina će se procenjivati Western blot analizom.
Ukratko, kondicionirani medijum za kulturu ćelija iz tranzijentnih transfekcionih eksperimenata posle 24, 48 ili 72 sata biće sakupljen i podvrgnut elektroforezi natrijum docecilsulfata poliakrilamidnim gelom (SDS-PAGE) i naknadno prenesenom nitroceluloznom membranom. Membrana će biti blokirana sa 4% (w/v) nemasnog mleka u TRIS-puferisanom fiziološkom rastvoru/0,1% (v/v) Tween-20 (TBST) u trajanju od 1 sata na sobnoj temperaturi. Membrana će zatim biti inkubirana sa primarnim antitelima (npr., zečji anti-ljudsk IGF-2) koji su adekvatno razblaženi (npr.1:5000) u 4% (w/v) nemasnog mleka u TBST u trajanju od 1 sata na sobnoj temperaturi ili preko noći na 4°C uz mešanje. Zatim se blot ispira sa TBST-om na sobnoj temperaturi, uz mešanje i više promena pufera u trajanju od 1 sata. Blot će zatim biti inkubiran pomoću antitela povezanog sa enzimom (npr. kozja antizečija antitela konjugovana sa peroksidazom rena), koja su adekvatno razblažena (npr.
1:20,000) u 4% (w/v) nemasnog mleka u TBST-u 1 sat na sobnoj temperaturi sa mešanjem. Zatim se blot ispira sa TBST-om na sobnoj temperaturi, uz mešanje i više promena pufera u trajanju od 1 sata. Blot će zatim biti inkubiran sa supstratom za hemiluminiscenciju 5 minuta na sobnoj temperaturi i vizuelizovati sistemom slikanja ili filmom kako bi se procenio nivo eksprimiranja test proteina.
[0056] Slično tome, eksprimiranje test proteina može se proceniti pomoću imunosorbentnih testova povezanih sa enzimima (ELISA). Ukratko, 96-imunosorbentne ploče biće obložene sa 50 μl primarnih antitela (npr., zečji anti-ljudski IGF-2) u koncentraciji proteina od 5 μg/ml u TRIS-puferisanom fiziološkom rastvoru (TBS). Ove ploče će zatim biti blokirane sa 200 μl 4% (w/v) nemasnog mleka u TBST tokom 1 sata pri sobnoj temperaturi. Kondicionirani medijum ćelijske kulture od tranzijentnih transfekcionih eksperimenata posle 24, 48 ili 72-sati će se sakupljati i inkubirati u ovim pločama 1 sat na sobnoj temperaturi. Ove ploče će se zatim oprati sa 200 μl TBST na sobnoj temperaturi sa mešanjem i promenama više pufera u trajanju od 1 sata. Ove ploče će zatim biti inkubirane pomoću sekundarnog antitela povezanog sa enzimom (npr. kozja anti-zečija antitela konjugovana sa peroksidazom rena) koje je adekvatno razblaženo (npr., 1:20,000) u TBST tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ove ploče će se zatim ispirati sa TBST sa više promena pufera tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ove ploče će se zatim inkubirati kolorimetrijskim supstratom (npr. 3,3 ',5,5 '-tetrametilbenzidin, TMB) tokom 5-15 minuta na sobnoj temperaturi i zaustaviti sa 0,1 M sumpornom kiselinom i čitati u čitaču ploča na odgovarajućoj talasnoj dužini (npr.450 nm) za procenu eksprimiranja test proteina``.

Claims (6)

Patentni zahtevi
1. Polipeptidna signalna sekvenca, koja sadrži modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip), gde modifikovani fragment vezujućeg proteina teškog lanca ljudskog imunoglobulina (Bip) čine aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 20; aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 21; aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 22; ili aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 23.
2. Fuzioni protein koji sadrži polipeptidnu signalnu sekvencu prema patentnom zahtevu 1, operativno vezan za heterologni polipeptid.
3. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 2, gde heterologni polipeptid sadrži jedan ili više enzima, jedan ili više modifikatora biološkog odgovora, jedan ili više toksina, jedno ili više antitela, jedan ili više fragmenata heterolognog polipeptida, ili bilo koje njihove kombinacije.
4. Fuzioni protein prema patentnom zahtevu 2, gde heterologni polipeptid sadrži jedno ili više od sledećeg: kisela β-glukocerebrozidaza, kisela α-glukozidaza, proinsulin, hormon rasta nalik insulinu-2 (IGF-2), interferon, terapeutsko antitelo i hormona rasta nalik insulinu-1 (IGF-1).
5. Vektor eksprimiranja proteina koji sadrži: (a) promoter operativno povezan sa prvom DNK sekvencom gde pomenuta prva DNK sekvenca kodira polipeptidnu signalnu sekvencu prema patentnom zahtevu 1, i (b) drugu DNK sekvencu koja je fuzionisana u okvir za pomenutu prvu DNK sekvencu, gde pomenuta druga DNK sekvenca kodira heterologni polipeptid.
6. Vektor eksprimiranja proteina prema patentnom zahtevu 5, gde druga DNK sekvenca kodira kiselu β-glukocerebrozidazu, kiselu α-glukozidazu, proinsulin, hormon rasta nalik insulinu-2 (IGF-2), interferon, terapeutsko antitelo i hormona rasta nalik insulinu-1 (IGF-1).
RS20180986A 2010-11-22 2011-11-22 Nove signalne sekvence za poboljšanje eksprimiranja proteina i lučenje rekombinantnih enzima i drugih proteina RS57601B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41592610P 2010-11-22 2010-11-22
EP11843849.8A EP2643468B1 (en) 2010-11-22 2011-11-22 Novel signal sequences to improve protein expressions and secretion of recombinant enzymes and other proteins
PCT/US2011/061862 WO2012071422A2 (en) 2010-11-22 2011-11-22 Novel signal sequences to improve protein expressions and secretion of recombinant enzymes and other proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57601B1 true RS57601B1 (sr) 2018-11-30

Family

ID=46146394

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180986A RS57601B1 (sr) 2010-11-22 2011-11-22 Nove signalne sekvence za poboljšanje eksprimiranja proteina i lučenje rekombinantnih enzima i drugih proteina

Country Status (19)

Country Link
US (1) US9279007B2 (sr)
EP (2) EP3461905B1 (sr)
JP (1) JP2014503198A (sr)
KR (2) KR20190060888A (sr)
CN (1) CN103328649B (sr)
BR (1) BR112013012671B1 (sr)
CA (1) CA2818689C (sr)
CY (1) CY1121049T1 (sr)
DK (2) DK3461905T3 (sr)
ES (2) ES2687415T3 (sr)
HR (1) HRP20181315T1 (sr)
HU (1) HUE039070T2 (sr)
LT (1) LT2643468T (sr)
PL (1) PL2643468T3 (sr)
PT (1) PT2643468T (sr)
RS (1) RS57601B1 (sr)
SI (1) SI2643468T1 (sr)
SM (1) SMT201800466T1 (sr)
WO (1) WO2012071422A2 (sr)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI3164492T1 (sl) * 2014-07-03 2020-02-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Sistem polipeptidne ekspresije
WO2017180587A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
JP7341900B2 (ja) 2017-03-03 2023-09-11 オブシディアン セラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫療法のためのｃｄ１９組成物及び方法
EP3635009B1 (en) 2017-06-07 2026-02-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
WO2019108924A2 (en) 2017-11-30 2019-06-06 Amicus Therapeutics, Inc. Cdkl5 expression variants and cdkl5 fusion proteins
IL276464B2 (en) 2018-02-07 2026-01-01 Regeneron Pharma Methods and compositions for administering therapeutic protein
BR112020021962A2 (pt) * 2018-04-30 2021-01-26 Amicus Therapeutics, Inc. construtos para terapia gênica e métodos de uso
MA52626A (fr) 2018-05-17 2021-03-24 Regeneron Pharma Anticorps anti-cd63, conjugués et leurs utilisations
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
WO2020077114A2 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Amicus Therapeutics, Inc. Disulfide bond stabilized polypeptide compositions and methods of use
EP3870600A1 (en) 2018-10-24 2021-09-01 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
CN113454227B (zh) * 2018-12-19 2025-05-23 维萨梅布有限公司 编码蛋白质的rna
MX2021010840A (es) 2019-03-08 2022-01-19 Obsidian Therapeutics Inc Composiciones de anhidrasa carbónica 2 (ca2) humana y métodos de regulación ajustable.
KR20220004696A (ko) * 2019-04-30 2022-01-11 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 폼페병의 치료에 유용한 조성물
US20220267398A1 (en) 2019-06-12 2022-08-25 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2 compositions and methods for tunable regulation
KR20220044266A (ko) 2019-06-12 2022-04-07 옵시디안 테라퓨틱스, 인크. 조정 가능한 조절을 위한 ca2 조성물 및 방법
WO2021046451A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
CN112342247B (zh) * 2020-11-10 2022-03-11 江苏科技大学 一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法
KR20230128001A (ko) 2020-12-01 2023-09-01 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 엔젤만 증후군의 치료를 위한 조성물 및 이의 용도
WO2023086939A1 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Amicus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating mucopolysaccharidosis iiia
WO2025264978A2 (en) 2024-06-20 2025-12-26 Amicus Therapeutics, Inc. Recombinant alpha-galactosidase a proteins and gene therapy

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2352286C (en) * 1998-11-24 2011-07-12 Bristol-Myers Squibb Company Intracellular targeted delivery of compounds by 70 kd heat shock protein
JP4834554B2 (ja) * 2003-11-06 2011-12-14 ジェネンコー・インターナショナル・インク 糸状菌におけるプロテアーゼ抑制剤及びその変異体の発現
DK2007885T3 (da) * 2006-04-11 2010-11-08 Csl Behring Gmbh Fremgangsmåde til forøgelse af in vivo-genvindingen af terapeutiske polypeptider

Also Published As

Publication number Publication date
EP3461905A1 (en) 2019-04-03
PT2643468T (pt) 2018-10-11
JP2014503198A (ja) 2014-02-13
US20140045216A1 (en) 2014-02-13
SMT201800466T1 (it) 2018-11-09
KR20190060888A (ko) 2019-06-03
BR112013012671A2 (pt) 2016-10-11
EP2643468A4 (en) 2014-12-24
LT2643468T (lt) 2018-09-10
WO2012071422A2 (en) 2012-05-31
DK3461905T3 (da) 2020-11-02
KR20130121878A (ko) 2013-11-06
SI2643468T1 (sl) 2018-10-30
ES2687415T3 (es) 2018-10-25
EP2643468B1 (en) 2018-07-04
HUE039070T2 (hu) 2018-12-28
PL2643468T3 (pl) 2018-11-30
CA2818689A1 (en) 2012-05-31
DK2643468T3 (en) 2018-09-24
EP2643468A2 (en) 2013-10-02
HRP20181315T1 (hr) 2018-10-19
US9279007B2 (en) 2016-03-08
KR101984318B1 (ko) 2019-05-31
CN103328649A (zh) 2013-09-25
EP3461905B1 (en) 2020-08-05
CN103328649B (zh) 2016-06-22
CA2818689C (en) 2021-09-21
WO2012071422A3 (en) 2012-08-02
BR112013012671B1 (pt) 2022-03-03
ES2829199T3 (es) 2021-05-31
CY1121049T1 (el) 2019-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS57601B1 (sr) Nove signalne sekvence za poboljšanje eksprimiranja proteina i lučenje rekombinantnih enzima i drugih proteina
Bae et al. A novel fusion partner for enhanced secretion of recombinant proteins in Saccharomyces cerevisiae
US7741075B2 (en) Pichia pastoris PIR1 secretion signal peptide for recombinant protein expression and Pichia pastoris PIR1 and PIR2 anchor domain peptides for recombinant surface display
US20240141363A1 (en) Signal peptides for increased protein secretion
JP6064915B2 (ja) 発現ベクターおよび蛋白質の製造方法
CN102659928B (zh) 一种人工合成的信号肽及其应用
EP0422049A4 (en) Vector for secretion of proteins directly into periplasm or culture medium
US20130244265A1 (en) Secretion of recombinant polypeptides in the extracellular medium of diatoms
US12331091B2 (en) Chimeric signal peptides for protein production
HK40006980A (en) Novel signal sequences to improve protein expression and secretion of recombinant enzymes and other proteins
CN103483423A (zh) 一种人工合成的信号肽及其应用
CN101921315A (zh) 一种人工合成的信号肽及其应用
HK1189913B (en) Novel signal sequences to improve protein expressions and secretion of recombinant enzymes and other proteins
Eskridge et al. The NH2 terminus of preproinsulin directs the translocation and glycosylation of a bacterial cytoplasmic protein by mammalian microsomal membranes.
Esposito et al. Gateway cloning is compatible with protein secretion from Pichia pastoris
CN102659927B (zh) 一种人工合成的信号肽及其应用
HK40102560A (zh) 用於增加蛋白质分泌的信号肽
CN104059128A (zh) 一种人工合成的信号肽及其应用
Chen et al. Regulated secretion of prolactin by the mouse insulinoma cell line βTC-3
Hartmann et al. Translocation of proteins through the endoplasmic reticulum membrane: investigation of their molecular environment by cross-linking
Rahmani Expression of Recombinant Genes in the Escherichia coli Using TorA Signal Peptide