JP2021505135A

JP2021505135A - Ｃｄｋｌ５発現変異体及びｃｄｋｌ５融合タンパク質

Info

Publication number: JP2021505135A
Application number: JP2020529748A
Authority: JP
Inventors: シーンクラーク，
Original assignee: アミカスセラピューティックスインコーポレイテッド
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2021-02-18
Also published as: KR20200090889A; MX2020005670A; US20200299654A1; CN111936624A; WO2019108924A2; TW201927825A; CA3083951A1; EP3717642A2; AU2018375754A1; WO2019108924A3

Abstract

新規なＣＤＫＬ５酵素変異体、及び完全長ＣＤＫＬ５ポリペプチド又はＣＤＫＬ５変異体を含む融合タンパク質が提供される。そのような融合タンパク質は、細胞透過性ポリペプチドを含み得、且つ任意選択によりリーダーシグナルポリペプチド及び／又はタグを含む。そのようなＣＤＫＬ５変異体及び融合タンパク質を製造する方法、並びに医薬組成物、処置方法、及びそのような組換えタンパク質の使用も提供される。【選択図】図１Ａ

Description

本発明は一般に、キナーゼ欠損症の処置、特にＣＤＫＬ５の欠損が関与する障害の処置のための新規な組換えタンパク質に関する。

ＣＤＫＬ５は、セリン／トレオニンキナーゼであり、以前はＳＴＫ９として知られていた。この遺伝子の変異は、最近、精神遅滞、コミュニケーション及び運動技能の低下、乳児のけいれん及び発作、非定型レット症候群、並びにＸ連鎖性ウエスト症候群などのいくつかの神経障害と関連している。Ｘ連鎖遺伝子サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）の変異又は欠失は、早期発症の重度神経障害及び難治性発作を伴うてんかん性脳症を引き起こすことが示されている。

現在、医学文献に記載されている最高齢として知られているＣＤＫＬ５欠損症の人は、４１歳の年齢に達している。他の多くは２０代及び１０代であるが、この疾患はここ１５年間に特定されたのみであるため、新たに診断された大多数は幼児又は乳児である。ＣＤＫＬ５欠損症と診断された個人は、一般に、神経学発達の遅延に苦しみ、発作のリスクが高く、発症年齢の中央値は６週間である。参加者が１１１人のある研究により、個人の８５．６％が毎日発作を起こすてんかんを有し、１日あたりの発作の回数は平均６回であることが分かった。

現在の処置は、発作薬から、ケトン食療法、迷走神経刺激、及び外科手術に及ぶ。一般的に投与される抗てんかん薬には、クロバザム、バルプロ酸、及びトピラメートが含まれ、多くの場合、２つ以上の投薬レジメンが同時に使用される。個人は、新しいタイプの薬物治療を開始してから一定期間にわたって発作が起きない「ハネムーン期間」を有するようであるが、最終的には発作が再発する。観察されたハネムーン期間は２ヶ月から７年間であり、中央値は６ヶ月である。例えば、調査では、１１１人の参加者のうち１６人が現在発作を起こしておらず、１人がこれまで発作を一切起こしていないことが分かった。

病原性発現の正確なメカニズムは依然として不明である。いくつかの実験データは、Ｃ末端の特定のナンセンス変異がタンパク質を構成的に核に局在化させる一方で、他のミスセンス変異は細胞質で高度に表れることを示唆している。核局在化シグナル及び核外輸送シグナルの両方が、タンパク質のＣ末端で同定されている。

いくつかの変異酵素変異体は、リン酸化機能の部分的又は完全な喪失をもたらす一方、他の変異及び切断は、リン酸化能力の増大をもたらし、機能の喪失及び獲得の両方が病原性であり得ることを示唆する。酵素活性機能の喪失／獲得から、及び酵素の細胞質内での滞留であるか核局在化であるかから生じる相互作用及び病原性の影響は依然として不明である。広範囲のＣＤＫＬ５変異を有し、且つ臨床症状を示す患者の分析は、臨床症状を引き起こす変異がＣ末端又はキナーゼ活性ドメインのいずれかで見つかる可能性が高いことを示唆しており、ＣＤＫＬ５のキナーゼ活性及びタンパク質移動能力の両方が症状の臨床的発現に影響を与え得ることを示唆している。

従って、本発明の様々な態様は、新規なＣＤＫＬ５変異体及びＣＤＫＬ５融合タンパク質に関し、これらは、ＣＤＫＬ５欠損症又はＣＤＫＬ５変異若しくは欠損によって引き起こされる非定型レット症候群などのＣＤＫＬ５媒介性神経障害を処置するために使用することができる。本発明の他の態様は、そのようなＣＤＫＬ５変異体及び融合タンパク質を産生する方法、並びにそのような組換えタンパク質の医薬組成物、処置方法、及び使用に関する。

本発明の一態様は、本明細書に記載されるＣＤＫＬ５ポリペプチドに関する。１つ又は複数の実施形態では、ＣＤＫＬ５ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。１つ又は複数の実施形態では、ＣＤＫＬ５ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。１つ又は複数の実施形態では、ＣＤＫＬ５ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に対して１００％の配列同一性を有する配列を含む。

本発明の別の態様は、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を欠くＣＤＫＬ５ポリペプチドに関する。１つ又は複数の実施形態では、ＣＤＫＬ５ポリペプチドは核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。

本発明の別の態様は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を欠き、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を含むＣＤＫＬ５ポリペプチドに関する。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されるＣＤＫＬ５ポリペプチド及び細胞透過性ポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。１つ又は複数の実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。１つ又は複数の実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。１つ又は複数の実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して１００％の配列同一性を有する。１つ又は複数の実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。１つ又は複数の実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。１つ又は複数の実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８に対して１００％の配列同一性を有する。１つ又は複数の実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、又は配列番号１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。１つ又は複数の実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、又は配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。１つ又は複数の実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、又は配列番号１８に対して１００％の配列同一性を有する。様々な実施形態では、ＣＤＫＬ５ポリペプチドは、（例えば、配列番号１又は配列番号４７に示されるように）完全長ＣＤＫＬ５ポリペプチドである。他の実施形態では、ＣＤＫＬ５ポリペプチドは、（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に示されるような）本明細書に記載される変異体である。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されるＣＤＫＬ５ポリペプチド又は本明細書に記載される融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬製剤に関する。

本発明の別の態様は、ＣＤＫＬ５媒介性神経障害を処置する方法に関し、この方法は、本明細書に記載されるＣＤＫＬ５ポリペプチド又は本明細書に記載される融合タンパク質；及び薬学的に許容される担体を含む製剤を投与することを含む。１つ又は複数の実施形態では、製剤はくも膜下腔内に投与される。１つ又は複数の実施形態では、製剤は静脈内投与される。１つ又は複数の実施形態では、製剤は大槽内に投与される。１つ又は複数の実施形態では、製剤は脳室内に投与される。１つ又は複数の実施形態では、製剤は実質内に投与される。１つ又は複数の実施形態では、ＣＤＫＬ５媒介性神経障害は、ＣＤＫＬ５欠損症又はＣＤＫＬ５変異若しくは欠損によって引き起こされる非定型レット症候群の１つ又は複数である。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されるＣＤＫＬ５ポリペプチド又は本明細書に記載される融合タンパク質を製造する方法に関する。１つ又は複数の実施形態では、この方法は、ＣＤＫＬ５ポリペプチド又は融合タンパク質を発現させること；及びＣＤＫＬ５ポリペプチド又は融合タンパク質を精製することを含む。１つ又は複数の実施形態では、ＣＤＫＬ５ポリペプチド又は融合タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞で発現される。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されるＣＤＫＬ５ポリペプチド又は本明細書に記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の別の態様は、そのようなポリヌクレオチドを含むベクターに関する。

図１Ａは、ＣＤＫＬ５_１０７のポリペプチドマップを示す。このマップは、ＡＴＰ結合部位、キナーゼドメイン及びキナーゼ活性部位、２つの核局在化シグナル、並びに核外輸送シグナルを含むポリペプチドの重要な特徴を明らかにする。図１Ｂ及び図１Ｃは、合成されたＣＤＫＬ５構成物変異体を描いたグラフ（図１Ｂ）を示し、説明文は、構成物がどのように合成されたかを説明する関連アミノ酸欠失情報と共にポリペプチドの長さ（図１Ｃ）を示す。図２Ａ〜図２ＡＤは、ＣＨＯ細胞又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞などの細胞において様々な融合タンパク質を発現するための例示的なプラスミドを示す。

本発明のいくつかの例示的な実施形態を説明する前に、本発明は、以下の説明に記載される構成又はプロセスステップの詳細に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、且つ様々な方法で実施又は実行することができる。

本発明の様々な態様は、新規なＣＤＫＬ５変異体及びＣＤＫＬ５融合タンパク質に関する。本発明の他の態様は、そのようなＣＤＫＬ５変異体及び融合タンパク質を産生する方法、並びに医薬組成物、処置方法、及びそのような組換えタンパク質の使用に関する。

いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、機能的活性を保持するより短いＣＤＫＬ５変異体は、特にＣＤＫＬ５ポリペプチドを含む融合タンパク質に組み込まれた場合、完全長ＣＤＫＬ５ポリペプチドよりも優れた利点を提供し得ると信じられている。１つ又は複数の実施形態では、そのような利点には、タンパク質産生中の宿主細胞からの分泌の改善、溶解性の改善、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力の増強、及び／又は標的細胞に侵入する能力の増強が含まれ得る。

定義
本明細書で使用される「ＣＤＫＬ５媒介性神経障害」は、ＣＤＫＬ５タンパク質の発現又は過剰発現によって処置され得る任意の疾患又は障害を指す。

本明細書で使用される「ＣＤＫＬ５欠損」は、タンパク質の生物学的機能におけるあらゆる欠損を指す。欠損は、タンパク質をコードするＤＮＡ又はＤＮＡ関連調節領域のあらゆるＤＮＡ変異、或いは限定されるものではないがＤＮＡメチル化若しくはヒストン修飾を含むエピジェネティックなＤＮＡ修飾のあらゆる変化、ＣＤＫＬ５タンパク質の２次構造、３次構造、若しくは４次構造のあらゆる変化、又は野生型若しくは正常な対象と比較したその生物学的機能を果たすＣＤＫＬ５タンパク質の能力の変化によるタンパク質の機能のあらゆる変化から生じ得る。欠損には、完全に機能するタンパク質のヌル変異又は過少発現などのＣＤＫＬ５タンパク質の欠乏も含まれ得る。

本明細書で使用される「ＣＤＫＬ５変異又は欠損によって引き起こされる非定型レット症候群」は、レット症候群と類似の臨床徴候を有する非定型形態のレット症候群を指すが、ＣＤＫＬ５変異又は欠損によって引き起こされる。

ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、又は非定型レット症候群の症状又はマーカーとしては、限定されるものではないが、発作、認知障害、筋緊張低下、並びに自律神経障害、睡眠障害、及び胃腸障害が挙げられる。

本明細書で使用される「担体」という用語は、化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指すものとする。適切な医薬担体は、当技術分野で公知であり、少なくとも１つの実施形態では、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版又は他の版に記載されている。

本明細書で使用される「酵素補充療法」又は「ＥＲＴ」という用語は、そのような酵素に欠損している個体への外因性の精製酵素の導入を指すものとする。投与されるタンパク質は、天然源から、又は組換え発現によって得ることができる。この用語はまた、そうでない場合は、精製酵素の投与を必要とする、又はその投与から恩恵を受ける個体への精製酵素の導入も指す。少なくとも１つの実施形態では、そのような個体は酵素不全に罹患している。導入される酵素は、インビトロで生成された精製組換え酵素、或いは、例えば胎盤若しくは動物の乳などの単離された組織若しくは体液から、又は植物から精製されたタンパク質であり得る。

本明細書で使用される「対象」又は「患者」という用語は、ヒト又は非ヒト動物を指すものとする。少なくとも１つの実施形態では、対象は哺乳動物である。少なくとも１つの実施形態では、対象はヒトである。

本明細書で使用される「治療有効用量」及び「有効量」は、対象に治療応答をもたらすのに十分な組換えタンパク質（例えば、ＣＤＫＬ５変異体又は融合タンパク質）の量を指すものとする。治療応答は、本明細書に記載され、当技術分野で公知の任意の代理臨床マーカー又は症状を含む、使用者（例えば、臨床医）が治療に対する有効な応答として認識する任意の応答であり得る。従って、少なくとも１つの実施形態では、治療応答は、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、又は当技術分野で知られているような非定型レット症候群の１つ又は複数の症状又はマーカーの改善又は阻害であり得る。

ＣＤＫＬ５タンパク質の機能
ヒトＣＤＫＬ５遺伝子は、２４個のエクソンから構成され、そのうち最初の３個は（エクソン１、１ａ、及び１ｂ）は翻訳されていない。

当初発見されたヒトＣＤＫＬ５変異体は、１１５ｋＤａの分子量を有する１，０３０個のアミノ酸であった（ＣＤＫＬ５_１１５）。選択的スプライシングは、ＣＤＫＬ５_１１５変異体とは異なるエクソンを組み合わせるため、別の代表的な変異体であるＣＤＫＬ５_１０７には、変更されたＣ末端領域が含まれている。ＣＤＫＬ５_１０７（１０７ｋＤａ）は、エクソン１９の代替型を有し、且つＣＤＫＬ５_１１５変異体に存在するエクソン２０〜２１を含まないため、より短くなっている。ｈＣＤＫＬ５_１０７ｍＲＮＡは、ヒトの脳においてｈＣＤＫＬ５_１１５転写物よりも３７倍多く、マウスＣＤＫＬ５_１０７は、マウスの脳においてマウスＣＤＫＬ５_１０５変異体よりも１６０倍多いことが分かっている。ヒト及びマウスのＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームの両方は、ヒトＣＤＫＬ５_１１５変異体と比較して、より長い半減期及び耐分解性を実証した。

ＣＤＫＬ５ノックアウトマウスモデルは、Ｌｏｘ−Ｃｒｅ組換え系を使用して作製され、これらのマウスは、社会的相互作用における自閉症様欠損、運動制御の障害、及び恐怖記憶の喪失の症状を示す（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵ．Ｓ．Ａ，１０９（５２），２１５１６−２１５２１）。例えば、ノックアウトＣＤＫＬ５マウスは、運動協調の低下の症状を有し、刺激に繰り返しさらされたときに記憶障害及び恐怖反応を示す。これらの変化により、科学者たちは、ＣＤＫＬ５キナーゼ活性の喪失が神経回路網の発達障害につながるという仮説を立てた。以前のデータは、ＣＤＫＬ５が、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）をリン酸化し、ＭｅＣＰ２の独立した機能喪失型変異がレット症候群の表現型につながることを示唆している。ＣＤＫＬ５の他の基質には、ＮｅｔｒｉｎＧ１リガンド（ＮＧＬ−１）、Ｓｈｏｏｔｉｎ１（ＳＨＴＮ１）、Ｍｉｎｄｂｏｍｂ１（ＭＩＢ１）、ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、アンフィフィシン１（ＡＭＰＨ１）、微小管結合タンパク質ＥＢ２、微小管関連タンパク質１Ｓ（ＭＡＰ１Ｓ）、及びヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）が含まれる。ＣＤＫＬ５の正確な役割はまだ特定されていないが、これらのデータは、ＣＤＫＬ５が、ＭｅＣＰ２を含む正しいニューロンの発達に重要である下流の標的のリン酸化において役割を果たすことを示唆している。ヒトでは、ＣＤＫＬ５の変異は、レット症候群と重複する表現型に関連し、さらに早期けいれん発作（ｅａｒｌｙ−ｏｎｓｅｔｓｅｉｚｕｒｅ）を示す。ＣＤＫＬ５ＫＯマウスは、いかなる早期けいれん発作の症状を示さなかったが、運動障害、社会性の低下、並びに学習障害及び記憶障害を示した（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．ＣＤＫＬ５，ａｐｒｏｔｅｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＲｅｔｔＳｙｎｄｒｏｍｅ，ｒｅｇｕｌａｔｅｓｎｅｕｒｏｎａｌｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓｖｉａＲａｃ１ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ３０：１２７７７−１２７８６）。

ラットでは２つのＣＤＫＬ５アイソフォームが見られ、一方にはＣＤＫＬ５ａという名称が付され、他方にはＣＤＫＬ５ｂという名称が付されている（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．）。一般に、Ｃ末端付近の最後の１００〜１５０個のアミノ酸を除いて、ＣＤＫＬ５遺伝子には、ヒト、ラット、及びマウスの種全体にわたって高レベルの配列保存が存在する。ウェスタンブロットのデータは、ラットの発生中は両方の変異体が存在することを示しているが、成体は、主に単一の変異体を発現しているようである。さらに、ＣＤＫＬ５は、脳、肝臓、及び肺に特定可能な量で存在する。

ＣＤＫＬ５は、核で機能するが、培養ニューロンの樹状突起にも見られ、細胞質の別の役割の可能性を示唆している。培養皮質ニューロンにおけるＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）によるＣＤＫＬ５発現のダウンレギュレーションは、神経突起の成長及び樹状突起分枝（分岐）を阻害し、ＣＤＫＬ５の過剰発現が反対の効果をもたらした（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．）。ＣＤＫＬ５の核及び細胞質の両方の効果を特徴付けるために、核外輸送配列（ＮＥＳ）を有するＣＤＫＬ５ａの変異体が培養皮質ニューロンＲＮＡｉモデルで発現された。このＮＥＳ−ＣＤＫＬ５ａ変異体は、野生型遺伝子発現をサイレンシングするために使用されるＲＮＡｉに耐性があり、従って、細胞質でのみ発現される場合、ＣＤＫＬ５ａをモデル化するために使用された。ＧＦＰタグを使用して、このＣＤＫＬ５変異体が細胞質にのみ存在することを確認した後、神経突起の長さ及び神経突起分岐の数の両方の増加が見られた。ＲＮＡｉを使用して内因性ＣＤＫＬ５の発現をノックダウンしたときに観察された疾患の表現型を部分的に救済するＮＥＳ−ＧＦＰ−ＣＤＫＬ５ａの能力は、神経突起の発生及び成長の重要な因子における細胞質でのＣＤＫＬ５の発現を示唆している。

ヒトのＣＤＫＬ５の変異は、レット症候群と同様の表現型と関連し、ＣＤＫＬ５変異を有する個体はまた、早期けいれん発作を示す。この発作の発症は、レット症状の発症前に発達初期の正常期間がある古典的なレット症候群の表現型とは異なる。古典的レット症候群（ＲＴＴ）の患者は、生後６〜１８か月までは正常に成長し、その後、言語障害及び運動障害を含む神経症状が現れ始める。ＲＴＴの脳の剖検により、運動皮質及び前頭皮質において短い樹状突起を有するより小さく密度の高いニューロンが示され、ニューロンの発達が阻害されていることを示唆している。古典的なＲＴＴ症例の大部分は、ＭＥＣＰ２遺伝子の変異によるものであり、このＭＥＣＰ２遺伝子は、哺乳動物のゲノムのＣｐＧジヌクレオチドに選択的に結合し、複合体の動員により転写を調節する核タンパク質をコードするＸ連鎖遺伝子である。あまり理解されていないが、一般的に、ＭＥＣＰ２の変異によって引き起こされる遺伝子発現の調節異常が、レット症候群の根本的な原因であると考えられている。古典的レット症候群の症例の約２０％及び他のレット症候群の変異型の６０〜８０％は、ＭＥＣＰ２に変異がなく、発症の別の遺伝的原因を示唆している。最近、一部のＣＤＫＬ５変異は、ＲＴＴの特定の変異型及びその他の重症脳症の患者で確認されており、ＣＤＫＬ５は、インビボ及びインビトロの両方でＭｅＣＰ２と相互作用することが示されている。ＭｅＣＰ２の他に、ＣＤＫＬ５は、ＮＧＬ−１を含むいくつかの下流の標的と相互作用してこれらの標的をリン酸化することが示されている。リン酸化されると、ＮＧＬ−１は、ＰＳＤ９５と相互作用し、樹状突起スパインの正しい発生及び発達並びにシナプス形成に重要である（ＲｉｃｃｉａｒｄｉＳ，ｅｔａｌ． “ＣＤＫＬ５ｅｎｓｕｒｅｓｅｘｃｉｔａｔｏｒｙｓｙｎａｐｓｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｂｙｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｇＮＧＬ−１−ＰＳＤ９５ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｎｄｉｓｉｍｐａｉｒｅｄｉｎｐａｔｉｅｎｔｉＰＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｎｓ．” ＮａｔＣｅｌｌＢｉｏｌ１４（９）：９１１−９２３）。

ＣＤＫＬ５はまた、タンパク質ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）をリン酸化することも示されている（ＫａｍｅｓｈｉｔａＩ，ｅｔａｌ． “Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ５ｂｉｎｄｓａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓＤＮＡｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１．” ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ３７７：１１６２−１１６７）。このリン酸化は、ＤＮＭＴ１の活性化をもたらし、このＤＮＭＴ１は、ヘミメチル化ＤＮＡを優先的にメチル化する維持型メチル化タンパク質である。このプロセスは、ＤＮＡ複製中のＤＮＡメチル化パターンの維持に有用であり、そのため、新しく合成された娘ＤＮＡ鎖が、置換された親鎖のメチル化パターンを維持することができる。ＤＮＡのメチル化は、一般に、遺伝子発現をサイレンシングするエピジェネティックなメカニズムであると考えられているため、ＤＮＭＴ１のこの維持機能は、細胞世代にわたって遺伝子発現パターンを維持する上で重要である。

現在のモデルは、ＣＤＫＬ５キナーゼドメインがＧＳＫ−３βをリン酸化すること、及びＧＳＫ−３βのリン酸化がその不活性化をもたらすことを示唆している。従って、ＣＤＫＬ５活性が不十分な個体は、ＧＳＫ−３β活性の増加を示すようである。以前の研究では、ＧＳＫ−３βが海馬の神経発生を調節すること、及びＧＳＫ−３βの活性の増大が、新生海馬ニューロンの樹状形態を著しく損なうことを示した。さらに、ＧＳＫ−３βは、ニューロンの生存及び成熟などの主要な発生事象の負の調節因子として機能するようである。ＣＤＫＬ５ＫＯマウスを使用して行われた研究により、ＧＳＫ−３β阻害剤による処置が、ＣＤＫＬ５活性を欠くマウスの海馬発達及び行動障害をほぼ完全に救済できることが実証された（Ｆｕｃｈｓｅｔａｌ． “ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＧＳＫ３β ＲｅｓｃｕｅｓＨｉｐｐｏｃａｍｐａｌＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＬｅａｒｎｉｎｇｉｎａＭｏｕｓｅＭｏｄｅｌｏｆＣＤＫＬ５Ｄｉｓｏｒｄｅｒ．” ＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆＤｉｓｅａｓｅ８２：２９８−３１０）。この発達の救済はまた、処置とは別に持続するようであった。

ＣＤＫＬ５_１０７ポリペプチド構成物
図１Ａは、ＣＤＫＬ５_１０７のポリペプチドマップを示す。野生型全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームのアミノ酸配列は、配列番号１で示されている。ＣＤＫＬ５_１０７タンパク質は、９６０個のアミノ酸からなり、キナーゼドメインは、最初の約３００個のアミノ酸に含まれている。９６０のうちの残基４２は、リン酸化反応中にＡＴＰ結合に関与するキナーゼドメイン内にある重要なリジン残基であり、この残基の変異は、一般にキナーゼ活性の喪失（「キナーゼデッド（Ｋｉｎａｓｅｄｅａｄ）」）をもたらす。さらに、２つの核局在化シグナルが、残基３１２〜３１５（ＮＬＳ１）と７８４〜７８９（ＮＬＳ２）にまたがって存在し、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）が、残基８３６〜８４５にまたがって存在する。残基９０５〜９６０にまたがったＣ末端のアミノ酸は、ＣＤＫＬ５_１０７に固有であり、ＣＤＫＬ５_１１５には存在しない。アミノ酸残基１〜９０４は、ＣＤＫＬ５_１１５とＣＤＫＬ５_１０７との間で同一である。野生型完全長ヒトＣＤＫＬ５_１１５アイソフォームのアミノ酸配列は、配列番号４７で示されている。

本発明の様々な実施形態は、新規なＣＤＫＬ５変異体を提供する。図１Ｂ及び図１Ｃは、完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォーム（構成物１）及び新規ＣＤＫＬ５構成物（構成物２〜１２として示される）のポリペプチドを示す。これらのＣＤＫＬ５構成物は、一般に２つのカテゴリ：Ｃ末端のいくつかのアミノ酸を喪失しているもの（構成物２〜７）と、ポリペプチド鎖の中央にあるいくつかのアミノ酸を喪失しているもの（構成物８〜１２）とに分類される。さらに、ＣＤＫＬ５が、追加のＮ末端アミノ酸配列にＣ末端で融合している構成物では、ＣＤＫＬ５の最初のメチオニンが除去されている。これらの構成物では、ＣＤＫＬ５ポリペプチドは、２番目のアミノ酸であるリジンで始まる。構成物１は、完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームの９６０個のアミノ酸すべてを含む。全９６０個のアミノ酸鎖の最初の８５１個のアミノ酸を含む構成物２は、短縮されたＣＤＫＬ５ポリペプチドを表し、このＣＤＫＬ５ポリペプチドは、ＣＤＫＬ５_１０７とＣＤＫＬ５_１１５の間で異なるテール配列が除去されているが、キナーゼドメイン、核局在化シグナル（ＮＬＳ１及びＮＬＳ２）、及び核外輸送シグナル（ＮＥＳ）はそのまま残存している。構成物３は、さらに短縮され、核局在化シグナル（ＮＬＳ２）及び核外輸送シグナル（ＮＥＳ）がさらに除去されている。構成物４〜７は、図１Ｂ及び図１Ｃに示されているようにさらにもっと短縮されている。構成物２〜７はすべて、活性キナーゼドメインを含むが、構成物３〜７は、ＮＬＳ２配列もＮＥＳ配列も含まない。構成物７は、ＮＬＳ１配列までさらに短縮されている。残りの構成物（構成物８〜１２）はすべて、ＣＤＫＬ５_１０７に固有のＣ末端アミノ酸を保持しながら、ポリペプチド鎖の中央部分に欠失を有する。これらの構成物のうち、構成物１２は、ＮＥＳ配列及びＮＬＳ２配列が欠失している。構成物１〜１２のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１〜１２で示されている。

１つ又は複数の実施形態では、ＣＤＫＬ５ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に対して少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。ＣＤＫＬ５ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２によって示されるアミノ酸配列に対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上の欠失、置換、及び／又は挿入を有するなど、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に対して欠失、置換、及び／又は挿入を含み得る。

１つ又は複数の実施形態では、ＣＤＫＬ５ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号４７に対して少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。ＣＤＫＬ５ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号４７によって示されるアミノ酸配列に対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上の欠失、置換、及び／又は挿入を有するなど、配列番号１又は配列番号４７に対して欠失、置換、及び／又は挿入を含み得る。

ＧＣＧ配列分析パッケージ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の一部として入手可能なＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴを含む様々なアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを使用して、２つの配列間の同一性を計算することができ、例えば、デフォルト設定を用いて使用することができる。例えば、本明細書に記載される特定のポリペプチドに対して少なくとも９８％、９８．５％、９９％、又は９９．５％の同一性を有し、且つ好ましくは実質的に同じ機能を示すポリペプチド、及びそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図される。特段の記載がない限り、類似性スコアはＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、パーセント類似性はＢＬＡＳＴＰ正スコアに基づき、パーセント配列同一性はＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一である高スコアの配列ペアにおける全残基の数及び割合を示し；ＢＬＡＳＴＰ「正」は、アラインメントスコアが正の値を有し、且つ互いに類似している残基の数及び割合を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列に対してこれらの程度の同一性若しくは類似性又は任意の中程度の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列が企図され、本開示により包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードを使用して推定され、従来の手段によって、特に遺伝子コードを使用してそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって得ることができる。

当業者であれば、特定のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を容易に導き出すことができる。そのようなポリヌクレオチド配列は、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）コドン最適化ツール（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔｗａｙ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）を使用するなど、市販の製品を使用して標的細胞での発現用にコドン最適化することができる。

細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
様々なウイルス及び細胞タンパク質は、細胞膜を通過する移動を媒介する塩基性ポリペプチド配列を有する。細胞膜を通過して移動する能力は、膜を通過して高分子量ポリペプチドを送達するための重要なツールとなっている。「タンパク質形質導入ドメイン」（ＰＴＤ）及び「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ）という語句は、通常は、すべてではないにしても、多くの哺乳動物細胞の原形質膜を通過できる短いペプチド（３０アミノ酸未満）を指すために使用される。それらが原形質膜を集団で通過するのを可能にするドメインの特定の特性を特定する研究の後、研究者らは、これらのドメインがリジン及びアルギニンなどの塩基性アミノ酸残基を多数含むことを観察した。従って、細胞透過性ペプチドは、２つのクラスに分類され：第１のクラスは、正の電荷に寄与するリジン残基を含む両親媒性ヘリックスペプチドからなるが、第２のクラスは、アルギニンリッチペプチドを含む。これらのペプチドは、細胞内標的に送達するのが難しい他のタンパク質と組み合わせて使用される場合、治療の可能性を有し得る。ＰＴＤの最も頻繁な実験的使用は、ＴＡＴ、アンテナペディア（Ａｎｔｐ）、及び他のポリ−アルギニンペプチドである。

これまでのところ、ＴＡＴは、ＰＴＤの中で最も特徴付けられており、短ペプチド及びオリゴヌクレオチドなどの小さなカーゴの細胞間標的への送達を成功させるために使用されてきた。ＨＩＶ−ＴＡＴ（転写のＨＩＶトランスアクチベーター）は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−ｌ）の複製に関与する８６個のアミノ酸のタンパク質であり、多くの研究により、ＴＡＴが原形質膜を通過することができ、ウイルスゲノムの転写を活性化するために核に到達することが示された。研究により、いくつかの異なるタンパク質に結合した場合、ＴＡＴはその透過特性を保持することも示されている。ＴＡＴタンパク質のどの領域が移動特性に重要であるかを理解しようとして、ＴＡＴの異なる長さのペプチド断片が合成され、それらの透過能力が評価される実験が行われた（Ｌｅｂｌｅｕｅｔａｌ． “ＡＴｒｕｎｃａｔｅｄＨＩＶ−１ＴＡＴＰｒｏｔｅｉｎＢａｓｉｃＤｏｍａｉｎＲａｐｉｄｌｙＴｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅＰｌａｓｍａＭｅｍｂｒａｎｅａｎｄＡｃｃｕｍｕｌａｔｅｓｉｎｔｈｅＣｅｌｌＮｕｃｌｅｕｓ．” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２：１６０１０−１６０１７）。塩基性アミノ酸の領域は、この透過特性を保持するＴＡＴの側面として識別されており、実験では、この塩基性アミノ酸クラスターのないＴＡＴタンパク質は、細胞の原形質膜に侵入することができない。ある場合には、より短い配列の細胞透過性ペプチドは、フリンなどのエンドプロテアーゼ酵素による分泌中の切断を防止するように修飾されている。これらの修飾により、短縮された細胞透過性ＴＡＴアミノ酸配列が、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲからＹＡＲＫＡＡＲＱＡＲＡに変化し、この短ペプチドはＴＡＴκと呼ばれる。

ＴＡＴが原形質膜を通過して移動することができる正確なメカニズムは依然として不明確である。最近の研究では、特殊なタイプのエンドサイトーシスがＴＡＴの取り込みに関与している可能性を調べており、ＴＡＴの透過に耐性があるように見える少数の細胞株が特定されている。ＴＡＴによって送達される特定のカーゴもまた、送達の有効性に役割を果たし得る。以前の研究データは、正しくフォールディングされたタンパク質カーゴが構造的制約により原形質膜を通過するのにはるかに多くのエネルギー（δ−Ｇ）を必要とする可能性が高いため、ＴＡＴ融合タンパク質が、変性状態で調製される場合、優れた細胞取り込みを有することを示唆している。

細胞内タンパク質シャペロンのＴＡＴカーゴをリフォールディングする能力は、リフォールディングされるタンパク質カーゴの同一性及びサイズに応じて変化する可能性が高い。場合によっては、ＴＡＴ融合タンパク質は、水性環境に置かれると沈殿するため、変性させて調製することも、未変性コンフォメーションで非常に長い間安定性を維持することもできない。ＴＡＴ融合タンパク質のデザインは、送達される特定のカーゴに合わせなければならない。カーゴタンパク質がＮ末端に強く結合し、且つＴＡＴドメインがＮ末端にも見つかる場合、ＴＡＴ移動ドメインがカーゴタンパク質に埋没することがあり、形質導入が不十分になり得る。

多数のＴＡＴカーゴ変異体が、初代培養細胞、形質転換細胞、及びマウス組織に存在する細胞を含む様々な細胞型への送達に成功している。培養では、ＴＡＴ融合タンパク質は、一般に、細胞内外に容易に拡散し、これにより、均一な濃度が非常に迅速に達成される。

例えば、酵素、抗体、他のタンパク質、又は薬物が充填された担体粒子までもの多くの医薬品は、細胞質、核、又は他の特定の細胞小器官内で治療効果を発揮するために細胞内に送達する必要がある。従って、これらの異なるタイプの巨大分子の送達は、生物学の発達における重要な課題となる。現在のデータは、ＴＡＴが２つ以上のメカニズムを介して原形質膜を通過できることを示唆している。

ＴＡＴ形質導入ドメインはまた、酵素スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）に融合されている（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ， “Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｐｅｐｔｉｄｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．” ＰｒｏｔｅｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２００８．５（２−３）：ｅ９５−ｅ１０３）。この融合タンパク質を使用して、この融合タンパク質が、ＳＯＤ酵素を細胞内環境に送達するために細胞膜を通過して移動することができ、従って、この融合タンパク質が、活性酸素種の蓄積の増加及び宿主細胞への酸化ストレスをもたらす酵素欠損症の処置に治療の可能性を有することを実証した。

ＴＡＴ融合タンパク質はまた、血液脳関門を通過して形質導入することが示されている。神経保護タンパク質Ｂｃｌ−ｘＬに融合したＴＡＴドメインは、培養中の細胞に迅速に侵入することができ、脳虚血のマウスに投与されると、この融合タンパク質は、１〜２時間以内に脳細胞に形質導入した。形質導入後、脳梗塞は、用量依存的にサイズが減少した（Ｃａｏ，Ｇ．ｅｔａｌ．， “ＩｎＶｉｖｏＤｅｌｉｖｅｒｙｏｆａＢｃｌ−ｘＬＦｕｓｉｏｎＰｒｏｔｅｉｎＣｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅＴＡＴＰｒｏｔｅｉｎＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＤｏｍａｉｎＰｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔＩｓｃｈｅｍｉｃＢｒａｉｎＩｎｊｕｒｙａｎｄＮｅｕｒｏｎａｌＡｐｏｐｔｏｓｉｓ．” Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２，５４２３，２００２）。

様々な実施形態では、本明細書に記載されるＣＤＫＬ５変異体は、ＴＡＴ、修飾ＴＡＴ（ＴＡＴκ）、トランスポータン、アンテナペディア、又はＰ９７などのＣＰＰに機能的に連結される。本明細書で使用される場合、ＴＡＴは、１１個のアミノ酸を有する元のＴＡＴペプチド（ＴＡＴ１１と呼ばれる）を指し得る、又はクローニングに使用されるプラスミドのポリリンカーに由来する追加の１６個のＮ末端アミノ酸（ＴＡＴ２８と呼ぶ）を有するＴＡＴペプチドを指し得る。同様に、ＴＡＴκは、ＴＡＴ１１の修飾型（ＴＡＴκ１１と呼ぶ）又はＴＡＴ２８の修飾型（ＴＡＴκ２８と呼ぶ）を指し得る。ＣＰＰであるＴＡＴ２８、ＴＡＴκ２８、ＴＡＴ１１、ＴＡＴκ１１、トランスポータン、アンテナペディア、及びＰ９７のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号５０で示される。

いくつかの実施形態では、ＣＰＰは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＰＰは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＰＰは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＰＰは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＰＰは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＰＰは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８に対して１００％の配列同一性を有する。様々な実施形態では、ＣＰＰは、配列番号１６の配列を有していない。

様々な実施形態では、ＣＰＰは、付加されたＮ末端グリシンを有し得る。例えば、ＴＡＴκ２８及びＴＡＴ２８は、そうでない場合は、安定性の低いＮ末端アスパラギン酸残基を有する。Ｎ末端グリシンを配列に追加して、Ｎ末端ルールによってタンパク質の安定性を高めることができる。従って、いくつかの実施形態では、リーダーシグナルポリペプチドを有するいずれの融合タンパク質も、リーダーシグナルポリペプチドのＣ末端に付加されたグリシンを有することができ、このため、リーダーシグナルポリペプチドの切断時に融合タンパク質の新しいＮ末端がグリシンで始まることになる。同様の方法で、リーダーシグナルポリペプチドを欠くこれらの融合タンパク質もまた、この融合タンパク質のＮ末端メチオニンと残りの部分との間に付加されたグリシンを有し得る。また同様の方法で、ＴＡＴ２８又はＴＡＴκ２８以外のＣＰＰを有する融合タンパク質もまた、リーダーシグナルポリペプチドとＣＰＰとの間に付加されたグリシンを有し得る。

ＣＤＫＬ５変異体を含む融合タンパク質
上記のように、ＣＤＫＬ５変異体は、ＣＰＰも含むタンパク質などの融合タンパク質に使用することができる。タンパク質分泌を増強するためのリーダーシグナルポリペプチド又は融合タンパク質を検出及び／又は精製するためのタグ、並びに機能的ポリペプチドを連結するために使用できるリンカーポリペプチドなどの他のポリペプチドもまた、そのような融合タンパク質に組み込むことができる。

リーダーシグナルポリペプチドの例としては、限定されるものではないが、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質の修飾断片（修飾ＢｉＰ、例えば、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５２、又は配列番号５３）又はマウスＩｇκ鎖リーダーポリペプチド（配列番号４９、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのベクターからのｐＳｅｃＴａｇ２）が挙げられる。修飾ＢｉＰシグナルポリペプチドの例には、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第９，２７９，００７号明細書に記載されているものが含まれる。

融合タンパク質に付加することができるタグの例としては、限定されるものではないが、エピトープタグ（例えば、ＭＹＣ、ＨＡ、Ｖ５、ＮＥ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧ（登録商標）、３ｘＦＬＡＧ（登録商標）、及びポリヒスチジンが挙げられる。

製剤化、処置の方法、及び使用
組換えタンパク質（例えば、ＣＤＫＬ５変異体又は融合タンパク質）は、ヒトへの投与に適合された医薬組成物として通常の手順に従って製剤化することができる。例えば、１つ又は複数の実施形態では、静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、この組成物は、可溶化剤及び注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔剤も含み得る。一般に、成分は、個別に、又は単位剤形中に一緒に混合されて、例えば、活性物質の量を表示するアンプル又は小袋などの密閉容器内の乾燥凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、医薬品グレードの滅菌水、生理食塩水、又はデキストロース／水を含む点滴ボトルで注入することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合できるように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。

組換えタンパク質（例えば、ＣＤＫＬ５変異体若しくは融合タンパク質）（又は組換えタンパク質を含む組成物若しくは薬剤）は、適切な経路によって投与される。１つ又は複数の実施形態では、組換えタンパク質は静脈内投与される。他の実施形態では、組換えタンパク質は、心臓又は骨格筋（例えば、筋肉内；脳室内）又は神経系（例えば、脳への直接注射；くも膜下腔）などの標的組織への直接投与によって投与される。所望に応じて、２つ以上の経路を同時に使用することができる。

組換えタンパク質（例えば、ＣＤＫＬ５変異体若しくは融合タンパク質）（又は組換えタンパク質を含む組成物若しくは薬剤）は、治療有効量（例えば、規則的な間隔で投与された場合、疾患に関連する症状を改善すること、疾患の発症を予防又は遅延すること、及び／又は疾患の症状の重症度又は頻度を軽減することなどにより疾患を処置するのに十分な投与量）で投与される。疾患の治療において治療上有効である量は、疾患の影響の性質及び程度に依存するであろう。さらに、最適な投与量範囲の特定を支援するために、インビトロ又はインビボのアッセイを任意選択により使用することができる。利用される正確な用量は、投与経路及び疾患の重症度にも依存し、開業医の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から推定することができる。

治療有効量の組換えタンパク質（例えば、ＣＤＫＬ５変異体若しくは融合タンパク質）（又は組換えタンパク質を含む組成物若しくは医薬品）は、疾患の影響の性質及び程度に応じて、一定間隔で、且つ／又は継続的に投与することができる。本明細書で使用される「一定間隔」での投与は、治療的有効量が定期的に投与されることを示す（単回投与とは異なる）。一個人の投与間隔は、固定間隔である必要はないが、個人の必要性に応じて時間と共に変化し得る。

組換えタンパク質（例えば、ＣＤＫＬ５変異体又は融合タンパク質）は、単位用量のバイアル若しくはシリンジ、又は静脈内投与用のボトル若しくはバッグなどで後の使用のために調製することができる。組換えタンパク質（例えば、ＣＤＫＬ５変異体又は融合タンパク質）、及び任意選択の賦形剤又は他の薬物などの他の有効成分を含むキットは、包装材料で包装し、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、又はレット症候群変異型を有する患者などの処置を必要とする対象の処置のための再構成、希釈、又は投与についての説明書を添付することができる。

製造方法
組換えタンパク質（例えば、ＣＤＫＬ５変異体又は融合タンパク質）は、適切なベクターを使用して宿主細胞で発現させ、分泌させることができる。例えば、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、若しくはＨＥＫ細胞）又は細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ若しくはＰ．ハロプランクティス（Ｐ．ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）ＴＡＣ１２５細胞）を使用することができる。例示的なプラスミドは、以下の実施例に記載されており、図２Ａ〜図２ＡＤに示されている。当業者であれば、細胞の形質転換、トランスフェクション、又は形質導入に適した代替ベクターを選択して、本明細書に記載のＣＤＫＬ５変異体及び融合タンパク質を産生させることができる。

発現及び分泌後、組換えタンパク質は、標準的な技術を使用して、周囲の細胞培地から回収し、精製することができる。別法では、組換えタンパク質は、培地ではなく、細胞から直接単離し、精製することができる。

実施例１−ＣＤＫＬ５融合タンパク質
図２Ａ〜図２ＡＤは、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）又は細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）などの適切な細胞において融合タンパク質を発現させるためのプラスミドを示す。これらのタンパク質は、配列番号１９〜４６に示されるアミノ酸配列を有する。欠失又は切断の付番は、完全長ＣＤＫＬ５_１０７ポリペプチド（１〜９６０）に関連している。ＣＤＫＬ５が追加のＮ末端アミノ酸配列にＣ末端で融合している構成物では、ＣＤＫＬ５の最初のメチオニン（アミノ酸１）が除去されている。これらの構成物では、ＣＤＫＬ５ポリペプチドは、２番目のアミノ酸であるリジンで始まる。図２Ａ〜図２ＡＤ並びに配列番号１９〜４６及び５４〜５５で使用される略語は、以下の表１に要約されている：

図２Ａは、ＣＨＯ細胞において配列番号１９の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、修飾ＢｉＰリーダーシグナルポリペプチド、ＴＡＴκ２８、及び完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームを含む。

図２Ｂは、ＣＨＯ細胞において配列番号２０の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、マウスＩｇκ鎖リーダーポリペプチド、ＴＡＴκ２８、及び完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームを含む。

図２Ｃは、ＣＨＯ細胞において配列番号２１の融合タンパク質を発現するための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、修飾ＢｉＰリーダーシグナルポリペプチド、ＴＡＴκ２８、及び完全長ヒトＣＤＫＬ５_１１５アイソフォームを含む。

図２Ｄは、ＣＨＯ細胞において配列番号２２の融合タンパク質を発現するための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、マウスＩｇκ鎖リーダーポリペプチド、ＴＡＴκ２８、及び完全長ヒトＣＤＫＬ５_１１５アイソフォームを含む。

図２Ｅは、ＣＨＯ細胞において配列番号２３の融合タンパク質を発現するための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームを含む。

図２Ｆは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号２４の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームを含む。

図２Ｇは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号２５の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び構成物２のＣＤＫＬ５_１０７変異体を含む。

図２Ｈは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号２６の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び構成物３のＣＤＫＬ５_１０７変異体を含む。

図２Ｉは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号２７の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び構成物４のＣＤＫＬ５_１０７変異体を含む。

図２Ｊは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号２８の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び構成物５のＣＤＫＬ５_１０７変異体を含む。

図２Ｋは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号２９の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び構成物６のＣＤＫＬ５_１０７変異体を含む。

図２Ｌは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号３０の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び構成物７のＣＤＫＬ５_１０７変異体を含む。

図２Ｍは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号３１の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び構成物８のＣＤＫＬ５_１０７変異体を含む。

図２Ｎは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号３２の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び構成物９のＣＤＫＬ５_１０７変異体を含む。

図２Ｏは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号３３の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び構成物１０のＣＤＫＬ５_１０７変異体を含む。

図２Ｐは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号３４の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び構成物１１のＣＤＫＬ５_１０７変異体を含む。

図２Ｑは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号３５の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び構成物１２のＣＤＫＬ５_１０７変異体を含む。

図２Ｒは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号３６の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴ２８及び完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームを含む。

図２Ｓは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号３７の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ２８及び高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を含む。

図２Ｔは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号３８の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＣＰＰを含まないｅＧＦＰを含む。

図２Ｕは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号３９の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ヒトアンフィフィシン１（ＡＭＰＨ１）を含む。

図２Ｖは、ＣＨＯ細胞において配列番号４０の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ヒトアンフィフィシン１（ＡＭＰＨ１）を含む。

図２Ｗは、ＣＨＯ細胞において配列番号４１の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、修飾ＢｉＰリーダーシグナルポリペプチド、ＴＡＴκ１１、及び完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームを含む。

図２Ｘは、ＣＨＯ細胞において配列番号４２の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、マウスＩｇκ鎖リーダーポリペプチド、ＴＡＴκ１１、及び完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームを含む。

図２Ｙは、ＣＨＯ細胞において配列番号４３の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ１１、及びリーダーシグナルポリペプチドを含まない完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームを含む。

図２Ｚは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号４４の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴκ１１、及びリーダーシグナルポリペプチドを含まない完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームを含む。

図２ＡＡは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞において配列番号４５の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴ１１、及びリーダーシグナルポリペプチドを含まない完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームを含む。

図２ＡＢは、ＣＨＯ細胞において配列番号４６の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、ＴＡＴ１１、及びリーダーシグナルポリペプチドを含まない完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームを含む。

図２ＡＣは、ＣＨＯ細胞において配列番号５４の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、アンテナペディアＣＰＰ、及びリーダーシグナルポリペプチドを含まない完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームを含む。

図２ＡＤは、ＣＨＯ細胞において配列番号５５の融合タンパク質を発現させるための例示的なプラスミドを示す。この融合タンパク質は、トランスポータンＣＰＰ、及びリーダーシグナルポリペプチドを含まない完全長ヒトＣＤＫＬ５_１０７アイソフォームを含む。

配列番号１９〜３６及び４１〜４６のＣＤＫＬ５融合タンパク質をそれぞれ、図２Ａ〜図２Ｒ及び図２Ｗ〜図２ＡＢのプラスミドを使用して発現させ、活性について評価する。ヒトアンフィフィシン１（ＡＭＰＨ１）は、ＣＤＫＬ５キナーゼアッセイにおける基質となる。図２Ｕ及び図２Ｖのプラスミドは、ＣＤＫＬ５キナーゼアッセイのための親和性標識ＡＭＰＨ１（配列番号３９及び４０）を発現させるために使用する。親和性標識ｅＧＦＰのみ（配列番号３８）及び親和性標識ＴＡＴｋ２８−ｅＧＦＰ（配列番号３７）はそれぞれ、図２Ｓ及び図２Ｔのプラスミドを使用して発現されるＣＤＫＬ５融合タンパク質の対照として役立つ。

様々なＣＤＫＬ５融合タンパク質を、ＨｅＬａ細胞溶解物によるインビトロ転写／翻訳を使用して、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ細胞で発現させた。簡単に述べると、ＣＨＯ−Ｓ細胞（２０×１０^∧６個の細胞）を、ＭａｘｃｙｔｅＳＴＸ及び８つのプラスミド：（１）ｐＯｐｔｉＶｅｃ空ベクター；（２）ＴＡＴｋ２８−ＣＤＫＬ５−ｌ０７−３ｘＦｌａｇＨｉｓ；（３）ＴＡＴｋ１１−ＣＤＫＬ５−ｌ０７−３ｘＦｌａｇＨｉｓ；（４）ＴＡＴ１１−ＣＤＫＬ５−１０７−３ｘＦｌａｇＨｉｓ；（５）ＴＡＴ２８−ＣＤＫＬ５−ｌ０７−３ｘＦｌａｇＨｉｓ；（６）ＡＮＴＰ−ＣＤＫＬ５−１０７−３ｘＦｌａｇＨｉｓ；（７）ＴＲＡＮＳＰ−ＣＤＫＬ５−１０７−３ｘＦｌａｇＨｉｓ、及び（８）ＭＢｉＰ−ＴＡＴＫ２８−ＣＤＫＬ５−ｌ０７−３ｘＦｌａｇＨｉｓ（コーディング配列はＣＨＯコドン最適化されている）を用いてエレクトロポレーションした。細胞を培地に戻し、１日培養した。細胞を採取して溶解した。トランスフェクションごとに、２０μｇの溶解物を４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ｉＢｌｏｔ２システムを使用してニトロセルロースブロットに移した。ブロットを、１×ＴＢＳ−Ｔ中、５％ミルクでブロックした。ブロットを、１：２０００希釈のウサギ抗Ｈｉｓ抗体と共に一晩インキュベートすることによってウェスタンブロットにかけた。一連の洗浄後、ブロットを１：１００００の抗ウサギＩｇＧＤｙａＬｉｇｈｔ６８０二次抗体と共にインキュベートした。追加の洗浄を行った。ブロットを、ＬｉｃｏｒＯｄｙｓｓｅｙスキャナーで画像化した。ブロットにより、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の発現が確認された。

ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（８ｘｌ０^∧６個の細胞）を、ＦｕＧｅｎｅＨＤ（２４μｌのＦｕＧｅｎｅＨＤ：８μｇのＤＮＡ比）及び７つのプラスミド：（１）空のｐＯｐｔｉＶｅｃ；（２）ＴＡＴｋ１１−ＣＤＫＬ５＿ｌ０７−３ｘＦｌａｇＨｉｓ；（３）ＴＡＴｌｌ−ＣＤＫＬ５＿ｌ−ＦＨ；（４）ＴＡＴ２８−ＣＤＫＬ５＿ｌ−ＦＨ；（５）ＡＮＴＰ−ＣＤＫＬ５＿ｌ０７−３ｘＦｌａｇＨｉｓ；（６）ＴＲＡＮＳＰ−ＣＤＫＬ５＿ｌ０７−３ｘＦｌａｇＨｉｓ、及び（７）ＴＡＴｋ２８−ＣＤＫＬ５＿ｌ０７−３ｘＦｌａｇＨｉｓ（コード配列はヒトのコドン最適化されている）を用いてトランスフェクトした。細胞をインキュベートし、トランスフェクションの２日後に回収した。細胞を溶解し、２０μｇの溶解物を４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ｉＢｌｏｔ２システムを使用してニトロセルロースブロットに移した。ブロットを、１×ＴＢＳ−Ｔ中、５％ミルクでブロックした。ブロットを、１：２０００希釈のウサギ抗Ｈｉｓ抗体と共に一晩インキュベートすることによってウェスタンブロットにかけた。一連の洗浄後、ブロットを、１：１００００の抗ウサギＩｇＧＤｙａＬｉｇｈｔ６８０二次抗体と共にインキュベートした。追加の洗浄を行った。ブロットを、ＬｉｃｏｒＯｄｙｓｓｅｙスキャナーで画像化した。ブロットにより、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の発現が確認された。

本明細書全体を通じて「一実施形態（ｏｎｅｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「特定の実施形態」、「様々な実施形態」、「１つ又は複数の実施形態」、又は「一実施形態（ａｎｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」への言及は、実施形態に関連して説明された特定の特徴、構造、材料、又は特性が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書全体の様々な場所での「１つ又は複数の実施形態では」、「特定の実施形態では」、「様々な実施形態では」、「一実施形態（ｏｎｅｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）では」、又は「一実施形態（ａｎｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）では」などの語句の出現は、必ずしも本開示の同じ実施形態を指すものではない。さらに、特定の特徴、構造、材料、又は特性は、１つ又は複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせてもよい。

本明細書の開示を、特定の実施形態を参照して説明したが、これらの実施形態は、本開示の原理及び用途の単なる例示であることを理解されたい。当業者には、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、本開示に様々な修正及び変更を加えることができることは明らかであろう。従って、本開示は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内にある修正及び変形を含むものとする。

Claims

配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むＣＤＫＬ５ポリペプチド。
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のＣＤＫＬ５ポリペプチド。
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に対して１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のＣＤＫＬ５ポリペプチド。
核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を欠くＣＤＫＬ５ポリペプチド。
核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項４に記載のＣＤＫＬ５ポリペプチド。
核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含まない、請求項４に記載のＣＤＫＬ５ポリペプチド。
核局在化シグナル（ＮＬＳ）を欠き、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を含むＣＤＫＬ５ポリペプチド。
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＤＫＬ５ポリペプチド、及び前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに機能的に結合されたリーダーシグナルポリペプチドを含む融合タンパク質。
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＤＫＬ５ポリペプチド、及び前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに機能的に結合された細胞透過性ポリペプチドを含む融合タンパク質。
前記細胞透過性ポリペプチドが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
前記細胞透過性ポリペプチドが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質に機能的に結合されているリーダーシグナルポリペプチドをさらに含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
前記リーダーシグナルポリペプチドが、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、又は配列番号５３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８又は１２に記載の融合タンパク質。
前記リーダーシグナルポリペプチドが、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、又は配列番号５３に対して１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８又は１２に記載の融合タンパク質。
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＤＫＬ５ポリペプチド又は請求項８〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質；及び
薬学的に許容される担体を含む、医薬製剤。
請求項１５に記載の製剤を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、ＣＤＫＬ５媒介性神経障害を処置する方法。
前記製剤が、くも膜下腔内、静脈内、大槽内、脳室内、又は実質内に投与される、請求項１６に記載の方法。
前記製剤が、くも膜下腔内又は静脈内に投与される、請求項１６又は１７に記載の方法。
前記ＣＤＫＬ５媒介性神経障害が、ＣＤＫＬ５欠損症又はＣＤＫＬ５変異若しくは欠損によって引き起こされる非定型レット症候群の１つ又は複数である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＤＫＬ５ポリペプチド又は請求項８〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって：
前記ＣＤＫＬ５ポリペプチド又は前記融合タンパク質を発現させるステップ；及び
前記ＣＤＫＬ５ポリペプチド又は前記融合タンパク質を精製するステップを含む、方法。
前記ＣＤＫＬ５ポリペプチド又は前記融合タンパク質が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞で発現される、請求項２０に記載の方法。
請求項１〜７のいずれか一項のＣＤＫＬ５ポリペプチド又は請求項８〜１４のいずれか一項の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
共に機能的に結合されたＣＤＫＬ５ポリペプチド及び細胞透過性ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドが、配列番号１又は配列番号４７に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含み、前記細胞透過性ポリペプチドが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、融合タンパク質。
前記細胞透過性ポリペプチドが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２４に記載の融合タンパク質。
前記細胞透過性ポリペプチドが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２５に記載の融合タンパク質。
リーダーシグナルポリペプチドをさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
前記リーダーシグナルポリペプチドが、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、又は配列番号５３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２７に記載の融合タンパク質。
前記リーダーシグナルポリペプチドが、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、又は配列番号５３に対して１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２８に記載の融合タンパク質。
共に機能的に結合されたＣＤＫＬ５ポリペプチド及びリーダーシグナルポリペプチドを含む融合タンパク質であって、前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドが、配列番号１又は配列番号４７に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含み、前記リーダーシグナルポリペプチドが、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５２、又は配列番号５３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、融合タンパク質。
前記リーダーシグナルポリペプチドが、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５２、又は配列番号５３に対して１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
細胞透過性ポリペプチドをさらに含む、請求項３０又は３１に記載の融合タンパク質。
前記細胞透過性ポリペプチドが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３２に記載の融合タンパク質。
前記細胞透過性ポリペプチドが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３３に記載の融合タンパク質。
前記細胞透過性ポリペプチドが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号５０に対して１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３４に記載の融合タンパク質。
請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質；及び薬学的に許容される担体を含む医薬製剤。
ＣＤＫＬ５媒介性神経障害を処置する方法であって、請求項３６に記載の製剤を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、方法。
前記製剤が、くも膜下腔内、静脈内、大槽内、脳室内、又は実質内に投与される、請求項３７に記載の方法。
前記製剤が、くも膜下腔内又は静脈内に投与される、請求項３７又は３８に記載の方法。
前記ＣＤＫＬ５媒介性神経障害が、ＣＤＫＬ５欠損症又はＣＤＫＬ５変異若しくは欠損によって引き起こされる非定型レット症候群の１つ又は複数である、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって：
前記融合タンパク質を発現させるステップ；及び
前記融合タンパク質を精製するステップを含む、方法。
前記融合タンパク質が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）細胞で発現される、請求項４１に記載の方法。
請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
請求項４３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。