TW201927825A - Cdkl5 表現變體和cdkl5 融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

提供了新穎的CDKL5酶變體、以及包含全長CDKL5多肽或CDKL5變體的融合蛋白。此類融合蛋白可以包括細胞穿透多肽和視需要包含前導訊號多肽和/或標籤。還提供了產生此類CDKL5變體和融合蛋白之方法、以及此類重組蛋白的藥物組成物、治療方法和用途。

Description

CDKL5表現變體和CDKL5融合蛋白
本發明總體上涉及激酶缺陷障礙的治療，特別是用於治療涉及CDKL5缺乏症的新穎重組蛋白。
CDKL5係絲胺酸/蘇胺酸激酶，之前被稱為STK9。該基因突變最近與許多神經障礙相關聯，例如精神發育遲緩、溝通和運動技能喪失、嬰兒痙攣和癲癇、非典型雷特氏症候群和X-連鎖West綜合症。X-連鎖基因細胞周期蛋白依賴激酶樣5（CDKL5）的突變或缺失已顯示引起伴隨早發型嚴重神經損害和難治性癲癇發作的癲癇性腦病。
目前，醫學文獻中描述的已知患有CDKL5缺陷的年齡最大的人已經達到41歲。其他許多人都是二十幾歲和十幾歲，但由於這種疾病係在過去15年才被發現的，大多數新確診的是幼兒或嬰兒。被診斷患有CDKL5缺陷的個體通常患有神經發育遲緩，並且癲癇發作風險高，發病年齡中位數為6周。一項針對111名參與者的研究發現，85.6%的個體患有癲癇發作每日出現的癲癇，且平均每日癲癇發作6次。
當前的治療方法包括癲癇發作藥物、生酮飲食、迷走神經刺激和手術。通常給予的抗癲癇藥物包括氯巴占（clobazam）、丙戊酸和托吡酯（topiramate），並且在許多情況下，同時使用兩種或多種藥物方案。個體似乎具有“蜜月期”，在開始一種新型的藥物後一段時間，他們的癲癇不發作，但最終癲癇會復發。觀察到的蜜月期的持續時間範圍從2個月到7年，中位數為6個月。例如，該研究發現111名參與者中有16人目前沒有癲癇發作，其中一人從未出現癲癇發作。
致病表現的確切機制尚不清楚。一些實驗數據表明，C-末端某些無義突變導致蛋白組成性地定位至細胞核，而其他錯義突變在細胞質中具有高度代表性。核定位訊號和出核訊號均在蛋白C-末端被鑒定。
一些突變酶變體導致磷酸化功能的部分或全部喪失，而其他突變和截短導致磷酸化能力的增加，這表明功能的喪失和獲得都可能是致病的。由於酶活性喪失/功能增加和酶核定位以及酶在細胞質中的停留而引起的相互作用和致病作用尚不清楚。患有廣泛CDKL5突變且呈現臨床症狀的患者的分析表明，導致臨床症狀的突變更容易在C-末端或激酶活性結構域中發現，這表明CDKL5的激酶活性和蛋白易位能力均可能影響症狀的臨床表現。
因此，本發明的各個方面涉及新穎的CDKL5變體和CDKL5融合蛋白，其可用於治療CDKL5-介導的神經障礙，例如CDKL5缺陷或由CDKL5突變或缺陷引起的非典型雷特氏症候群。本發明的其他方面涉及產生此類CDKL5變體和融合蛋白之方法，以及此類重組蛋白的藥物組成物、治療方法以及用途。
本發明的一個方面涉及如本文所述的CDKL5多肽。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有至少98%的序列一致性的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有至少99%的序列一致性的序列。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽包含與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有100%的序列一致性的序列。
本發明的另一個方面涉及缺乏出核訊號（NES）的CDKL5多肽。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽含有核定位訊號（NLS）。
本發明的另一個方面涉及缺乏核定位訊號（NLS）和含有出核訊號（NES）的CDKL5多肽。
本發明的另一個方面涉及包含如本文所述的CDKL5多肽和細胞穿透多肽的融合蛋白。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有至少90%的序列一致性。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有至少95%的序列一致性。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有100%的序列一致性。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18具有至少90%的序列一致性。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18具有至少95%的序列一致性。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18具有100%的序列一致性。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18具有至少90%的序列一致性。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18具有至少95%的序列一致性。在一個或多個實施方式中，該細胞穿透多肽與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18具有100%的序列一致性。在各種實施方式中，該CDKL5多肽係全長CDKL5多肽（例如，如在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 47中示出的）。在其他實施方式中，該CDKL5多肽係如本文所述的變體（例如，如在SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12中示出的）。
本發明的另一個方面涉及包含如本文所述的CDKL5多肽或如本文所述的融合蛋白以及藥學上可接受的載體的藥物配製物。
本發明的另一個方面涉及治療CDKL5-介導的神經障礙之方法，該方法包括給予包含如本文所述的CDKL5多肽或如本文所述的融合蛋白；以及藥學上可接受的載體的配製物。在一個或多個實施方式中，該配製物係鞘內給予。在一個或多個實施方式中，該配製物係靜脈內給予。在一個或多個實施方式中，該配製物係腦池內給予。在一個或多個實施方式中，該配製物係腦室內（intracerebroventrically）給予。在一個或多個實施方式中，該配製物係實質內（intraparenchymally）給予。在一個或多個實施方式中，該CDKL5-介導的神經障礙係CDKL5缺陷或由CDKL5突變或缺陷引起的非典型雷特氏症候群中的一種或多種。
本發明的另一個方面涉及產生如本文所述的CDKL5多肽或如本文所述的融合蛋白之方法。在一個或多個實施方式中，該方法包括表現該CDKL5多肽或該融合蛋白；以及純化該CDKL5多肽或該融合蛋白。在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽或該融合蛋白表現於中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、人胚腎（HEK）細胞或大腸桿菌細胞。
本發明的另一個方面涉及編碼如本文所述的CDKL5多肽或如本文所述的融合蛋白的多核苷酸。本發明的另一個方面涉及包含此類多核苷酸的載體
在描述本發明若干示例性實施方式之前，應當理解的是，本發明不限於以下描述中列出的構建或製程步驟的細節。本發明能夠有其他的實施方式，並且能夠以不同的方式被實施或進行。
本發明的各個方面涉及新穎的CDKL5變體和CDKL5融合蛋白。本發明的其他方面涉及產生此類CDKL5變體和融合蛋白之方法，以及此類重組蛋白的藥物組成物、治療方法以及用途。
不希望受任何特定理論的束縛，據信與全長CDKL5多肽相比，保留功能活性的較短的CDKL5變體可以提供益處，尤其是當摻入包含CDKL5多肽的融合蛋白時。在一個或多個實施方式中，這類益處可以包括蛋白產生期間來自宿主細胞的改善的分泌、改善的溶解性、增強的穿過血腦障壁（BBB）的能力和/或增強的穿透靶細胞的能力。
定義
如本文中所使用，“CDKL5缺陷”係指蛋白質的生物學功能的任何缺陷。該缺陷可以產生自編碼蛋白質的DNA或DNA相關調節區中的任何DNA突變，或由於表觀遺傳DNA修飾的任何變化導致的蛋白質功能的任何變化，包括但不限於DNA甲基化或組蛋白修飾、CDKL5蛋白的二級、三級或四級結構的任何變化，或CDKL5蛋白相比於野生型或正常受試者執行其生物學功能的能力的任何變化。這種缺陷還包括CDKL5蛋白的缺乏，例如無效突變或完全功能的蛋白的低表現。
如本文中所使用，“由CDKL5突變或缺陷引起的非典型雷特氏症候群”係指雷特氏症候群的非典型形式，其與雷特氏症候群具有類似的臨床徵象，但由CDKL5突變或缺陷引起。
CDKL5缺陷、雷特氏症候群、或非典型雷特氏症候群的症狀或標記包括但不限於癲癇發作、認知失能、張力減退以及自調、睡眠和胃腸紊亂。
如本文中所使用，術語“載體”旨在指代與化合物一起給予的稀釋劑、助劑、賦形劑、或運載體。適合的藥物載體係本領域已知的，並且在至少一個實施方式中，其描述於“Remington's Pharmaceutical Sciences [雷明頓藥物科學]”，E. W. Martin，第18版，或其他版本。
如本文中所使用，術語“酶替代療法”或“ERT”旨在指代將外源的、經純化的酶引入具有這種酶缺乏的個體中。給予的蛋白質可以從自然來源或藉由重組表現而獲得。該術語也指將經純化的酶引入個體，該個體在其他情況下需要或受益於給予的經純化的酶。在至少一個實施方式中，這樣的個體患有酶缺乏症。該引入的酶可以是在體外產生的經純化的重組酶，或從離體組織或體液例如像胎盤或動物奶，或從植物純化的蛋白質。
如本文中所使用，術語“受試者”或“患者”旨在係指人類或非人類動物。在至少一個實施方式中，受試者係哺乳動物。在至少一個實施方式中，受試者係人類。
如本文中所使用，該“治療有效劑量”和“有效量”旨在係指足夠導致受試者治療反應的重組蛋白（例如，CDKL5變體或融合蛋白）的量。治療反應可以是使用者（例如，臨床醫生）將會識別為對治療的有效響應的任何反應，包括本文所述和本領域已知的任何替代性臨床標記物或症狀。因此，在至少一個實施方式中，治療反應可以是CDKL5缺陷、雷特氏症候群、或非典型雷特氏症候群的一個或多個症狀或標記（例如本領域已知的那些）的改善或抑制。
CDKL5 蛋白的功能
人類CDKL5基因由24個外顯子組成，其中前三個外顯子（外顯子1、1a和1b）係不翻譯的。
最初發現的人類CDKL5變體係1030個胺基酸，分子量為115 kDa（CDKL5115 ）。另一個顯著的變體CDKL5107 含有改變的C-末端區域，因為與CDKL5115 變體中的相比，可替代的選擇性剪接結合不同的外顯子。CDKL5107 （107 kDa）較短，因為它具有外顯子19的替代版本，並且不含有CDKL5115 變體中存在的外顯子20-21。已經發現在人腦中hCDKL5107 mRNA的豐度係hCDKL5115 轉錄物的37倍，並且已經發現在鼠腦中鼠CDKL5107 的豐度係鼠CDKL5105 變體的160倍。與鼠CDKL5115 變體相比，人和鼠CDKL5107 同種型均顯示較長的半衰期和對降解的抵抗性。
使用Lox-Cre重組系統產生了CDKL5敲除小鼠模型，並且這些小鼠表現出自閉症樣社會互動中的缺陷、運動控制障礙的損害和恐懼記憶喪失等症狀（Wang等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A [美國國家科學院院刊] 109(52), 21516-21521）。例如，敲除CDKL5的小鼠在反復暴露於刺激物時，其具有運動協調降低的症狀並顯示出受損的記憶和恐懼應答。這些變化使得科學家們假設CDKL5激酶活性的喪失會導致神經網路發育受損。先前數據已經提示，CDKL5磷酸化甲基-CpG結合蛋白2（MeCP2）和MeCP2中獨立的失功能突變可導致雷特氏症候群表型。CDKL5的其他底物包括Netrin G1配位基（NGL-1）、Shootin1（SHTN1）、Mindbomb 1（MIB1）、DNA (胞嘧啶-5)-甲基轉移酶1（DNMT1）、雙載蛋白1（AMPH1）和HDAC4。雖然CDKL5的確切作用尚未被確定，但這些數據表明，CDKL5在下游靶點磷酸化中發揮作用，這些靶點對包括MeCP2在內的正確的神經元發育至關重要。在人類中，CDKL5中的突變與以下表型有關，該表型與雷特氏症候群重疊而且另外與早發型癲癇發作一起出現。雖然CDKL5 KO小鼠沒有表現出任何早發型癲癇發作症狀，但它們確實表現出運動缺陷、社交能力下降和學習和記憶受損（Chen等人，CDKL5，一種與雷特氏症候群相關的蛋白，經由Rac1訊號傳導調控神經元形態發生，J Neurosci [神經科學雜誌] 30: 12777-12786）。
在大鼠體內發現兩種CDKL5同種型，一種標記為CDKL5a，並且另一種標記為CDKL5b（Chen等人）。一般來說，除了C-末端附近的最後100-150個胺基酸外，在人、大鼠和小鼠物種的CDKL5基因中存在高水平序列保守性。西方墨點轉漬法數據顯示出這兩種變體都存在於大鼠的發育過程中，但成年大鼠似乎主要表現單一變體。此外，CDKL5在腦、肝和肺中以可鑒定的數量存在。
CDKL5在細胞核中起作用，但也可在培養的神經元的樹突中發現，這表明它可能在細胞質中起著替代作用。藉由培養的皮層神經元中RNAi（RNA干擾）下調CDKL5的表現，抑制神經突生長和樹突分枝（分支），而CDKL5的過表現則具有相反的作用（Chen等人）。為了表徵CDKL5的核作用和胞質作用，在培養的皮層神經元RNAi模型中表現了具有核輸出序列（NES）的CDKL5a的變體。該NES-CDKL5a變體對使野生型基因表現緘默的RNAi具有抗性，並且因此當僅在細胞質中表現時，NES-CDKL5a被用於創建CDKL5a模型。使用GFP標籤確認該CDKL5變體僅存在於細胞質中後，可看出神經突長度和神經突分支數量均有所增加。NES-GFP-CDKL5a能夠部分挽救RNAi用於敲低內源性CDKL5表現時觀察到的疾病表型，說明CDKL5在細胞質中的表現係神經突發育和生長中的重要因素。
人CDKL5中的突變與類似於雷特氏症候群的表型有關，並且CDKL5突變的個體也表現為早發型癲癇發作。該癲癇發作與典型的雷特氏症候群表型不同，典型的雷特氏症候群表型在Rett症狀發作之前有一個早期的正常發展期。典型的雷特氏症候群（RTT）患者在6-18個月之前似乎發育正常，然後開始出現神經症狀，包括喪失語言和運動能力。對RTT大腦的解剖顯示，在運動皮層和額葉皮層中，神經元更小更緻密，樹突更短，這表明神經元發育受損。大多數典型的RTT病例係由於MECP2基因中的突變引起的，MECP2基因係編碼核蛋白的X-連鎖基因，所述核蛋白選擇性地與哺乳動物基因組中的CpG二核苷酸結合，並藉由複合物的募集調控轉錄。雖然在這方面還知之甚少，但一般認為MECP2中的突變導致的基因表現失調係雷特氏症候群的根本原因。約20%的典型的雷特氏症候群病例和60%-80%的其他雷特氏症候群變體在MECP2中沒有突變，這表明了發病機制的替代的遺傳原因。最近，在患有某些RTT的變體和其他嚴重腦病的患者中鑒定出了一些CDKL5突變，且CDKL5顯示在體內和體外都與MeCP2相互作用。在MeCP2之外，CDKL5已經顯示與許多下游靶點（包括NGL-1）相互作用並磷酸化許多下游靶點（包括NGL-1）。磷酸化後，NGL-1與PSD95相互作用，且NGL-1對樹突棘和突觸形成的正確發生和發育至關重要（Ricciardi S等人，“CDKL5 ensures excitatory synapse stability by reinforcing NGL-1-PSD95 interaction in the postsynaptic compartment and is impaired in patient iPSC-derived neurons. [CDKL5藉由加強突觸後室（postsynaptic compartment）NGL-1-PSD95的相互作用，確保了興奮性突觸的穩定性，並損害了患者的iPSC來源的神經元。]”Nat Cell Biol [自然細胞生物學] 14(9): 911-923）。
CDKL5還已顯示磷酸化蛋白質DNA甲基轉移酶1（DNMT1）（Kameshita I等人，“Cyclin-dependent kinase-like 5 binds and phosphorylates DNA methyltransferase 1. [細胞周期蛋白依賴激酶樣5結合並磷酸化DNA甲基轉移酶1。]”Biochem Biophys Res Commun [生物化學與生物物理學研究通訊] 377: 1162-1167）。這種磷酸化導致DNMT1的活化，DNMT1係一種維持型甲基化蛋白，優先甲基化半甲基化的DNA。這個過程對於DNA複製過程中DNA甲基化模式的維持係有用的，這樣新合成的子DNA鏈就能夠維持它所取代的親本鏈的甲基化模式。由於DNA甲基化通常被認為係一種使基因表現緘默的表觀遺傳機制，DNMT1的這種維持功能在跨細胞代保存基因表現模式中至關重要。
當前模型表明CDKL5激酶結構域磷酸化GSK-3β，以及表明GSK-3β的磷酸化導致其失活。缺乏CDKL5活性的個體因此似乎表現出增加的GSK-3β活性。以前的研究已經顯示GSK-3β調節海馬神經發生，以及顯示增加的GSK-3β的活性嚴重損害新生海馬神經元的樹突形態。此外，GSK-3β似乎作為關鍵發育事件（例如神經元生存和成熟）的負調節物。使用CDKL5 KO小鼠進行的研究表明，用GSK-3β抑制劑治療幾乎可以完全挽救缺乏CDKL5活性的小鼠中的海馬發育和行為缺陷（Fuchs等人，“Inhibition of GSK3β Rescues Hippocampal Development and Learning in a Mouse Model of CDKL5 Disorder. [CDKL5障礙的小鼠模型中GSK3β的抑制挽救海馬發育和學習。]”Neurobiology of Disease [疾病的神經生物學] 82: 298-310.）。這種發育挽救似乎也在治療之外持續存在。
CDKL5107 多肽構建體
圖1A顯示了CDKL5107 的多肽圖譜。SEQ ID NO: 1中提供了野生型全長人CDKL5107 同種型的胺基酸序列。CDKL5107 蛋白由960個胺基酸組成，且其激酶結構域包含於約前300個胺基酸中。960個胺基酸中的殘基42係一個關鍵的賴胺酸殘基，其位於激酶結構域中，在磷酸化反應中參與ATP結合，而這個殘基的突變通常會導致激酶活性的喪失（“激酶死亡”）。此外，還存在兩個核定位訊號跨殘基312-315（NLS1）核定位訊號和跨殘基784-789（NLS2）核定位訊號，以及存在一個跨殘基836-845出核訊號（NES）。在C-末端跨殘基905到960的胺基酸係CDKL5107 所特有的，且在CDKL5115 中不存在。CDKL5115 和CDKL5107 之間的胺基酸殘基1-904相同。SEQ ID: 47中提供了野生型全長人CDKL5115 同種型的胺基酸序列。
本發明的各種實施方式提供了新穎的CDKL5變體。圖1B和1C顯示了全長人CDKL5107 同種型（構建體1）和新穎的CDKL5構建體（指定為構建體2-12）的多肽。這些CDKL5構建體通常分為兩類：C-末端缺失一定數量的胺基酸（構建體2-7）的那些和多肽鏈中間缺失一定數量的胺基酸（構建體8-12）的那些。此外，在這些構建體中，CDKL5被C-末端融合到另外的N-末端胺基酸序列，CDKL5的初始蛋胺酸被除去。在這些構建體中，CDKL5多肽從第二個胺基酸賴胺酸開始。構建體1包含全長人CDKL5107 同種型的全部960個胺基酸。構建體2，其含有全部960個胺基酸的鏈的前851個胺基酸，構建體2代表一個縮短的CDKL5多肽，除去CDKL5107 和CDKL5115 之間不同的尾巴序列但激酶結構域、核定位訊號（NLS1和NLS2）和出核訊號（NES）保持不變。進一步縮短構建體3，其中另外將核定位訊號（NLS2）和出核訊號（NES）除去。構建體4-7被進一步縮短，如圖1B和1C所示。構建體2-7均包含活性激酶結構域，而構建體3-7不包含NLS2或NES序列。構建體7進一步縮短為NLS1序列。剩餘的構建體（構建體8-12）均在多肽鏈的中部具有缺失，同時保留CDKL5107 特有的C-末端胺基酸。在這些構建體中，構建體12缺少NES和NLS2序列。在SEQ ID NO: 1-12中分別提供了構建體1-12的胺基酸序列。
在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%的序列一致性。該CDKL5多肽相對於SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12可以包含缺失、取代和/或插入，如相對於由SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12描述的胺基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代和/或插入。
在一個或多個實施方式中，該CDKL5多肽與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 47具有至少98%、至少98.5%、至少99%或至少99.5%的序列一致性。該CDKL5多肽相對於SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 47可以包含缺失、取代和/或插入，如相對於由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 47述的胺基酸序列，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代和/或插入。
可以使用不同比對演算法和/或程式來計算兩個序列之間的一致性，包括可用作GCG序列分析包（威斯康辛大學，麥迪森市，威斯康辛州）的一部分的FASTA或BLAST，並且可以與例如，默認設置一起使用。例如，考慮與本文所述的特定多肽具有至少98%、98.5%、99%或99.5%一致性，並且較佳的是表現出基本相同功能的多肽，連同編碼此類多肽的多核苷酸。除非另有說明，相似性分數將基於BLOSUM62的使用。當使用BLASTP時，相似性百分比係基於BLASTP陽性得分，並且序列一致性百分比係基於BLASTP一致性得分。BLASTP“一致性”示出相同的高分序列對中總殘基的數量和分數；並且BLASTP“陽性”示出具有正值的比對分數並且彼此相似的殘基的數量和分數。本揭露考慮和涵蓋具有與本文揭露的胺基酸序列具有這些程度的一致性或相似性或任何中間程度的一致性或相似性的胺基酸序列。使用遺傳密碼推導出的相似多肽的多核苷酸序列，並且可以藉由常規手段（具體地藉由使用遺傳密碼來逆轉錄其胺基酸序列）獲得。
熟悉該項技術者可以很容易地推導出編碼特定多肽序列的多核苷酸序列。此類多核苷酸序列可以使用可商購的產品，例如使用OptimumGeneTM 密碼子優化工具（金斯瑞公司（Genscript），皮斯卡塔韋，新澤西州），針對靶細胞中的表現進行密碼子優化。
細胞穿透肽（ CPP ）
多種病毒和細胞蛋白具有介導跨細胞膜易位的鹼性多肽序列。跨細胞膜易位的能力已成為跨膜遞送高分子量多肽的重要工具。短語“蛋白質轉導結構域”（PTD）和“細胞穿透肽”（CPP）通常用於指短肽（＜ 30個胺基酸），這些短肽可以穿過許多哺乳動物細胞（如果不是全部的話）的質膜。在鑒定了允許其共同地跨質膜的結構域特性的研究後，研究人員發現這些結構域含有大量的鹼性胺基酸殘基，如賴胺酸和精胺酸。因此，細胞穿透肽可分為兩類：第一類由含有賴胺酸殘基的兩親性螺旋肽組成，這些賴胺酸殘基導致正電荷；而第二類包括富含精胺酸的肽。這些多肽如果與其他難以遞送到細胞內靶標的蛋白質結合使用，可能具有治療潛力。PTD最常見的實驗用途係TAT、觸角足素（Antennapedia，Antp）和其他多精胺酸肽。
到目前為止，TAT已經成為最具特徵性的PTD，並已被用於成功地將小型載物，例如短肽和寡核苷酸，遞送到細胞內靶標。HIV-TAT（HIV反式激活的激活因子）係涉及人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的複製的86個胺基酸蛋白質，並且許多研究表明，TAT能夠藉由質膜易位並到達細胞核，從而激活病毒基因組的轉錄。研究還表明，TAT在與幾種不同的蛋白質連接時仍能保持其穿透性質。為了瞭解TAT蛋白的哪些區域對易位特性至關重要，我們進行了實驗，合成了不同長度的TAT的肽片段，並對其穿透能力進行了評估。（Lebleu等人，“A Truncated HIV-1 TAT Protein Basic Domain Rapidly Translocates through the Plasma Membrane and Accumulates in the Cell Nucleus. [截短的HIV-1 TAT蛋白質的鹼性結構域迅速藉由質膜易位並在細胞核內積累。]”J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 1997, 272:16010-16017）。鹼性胺基酸的區域被認為係保持這種穿透性的TAT的方面，並且在沒有這種鹼性胺基酸簇的TAT蛋白質的實驗中，無法穿透細胞質膜。在一些情況下，較短的序列細胞穿透肽已經被修飾，以防止在分泌過程中被內切蛋白酶（如弗林蛋白酶（furin））裂解。這些修飾將縮短的細胞穿透TAT胺基酸序列由YGRKKRRQRRR改變至YARKAARQARA，並且這種短肽被稱為TATκ。
TAT能夠跨質膜易位的確切機制仍不確定。最近的研究已經探索了一種特殊類型的內吞作用與TAT攝取有關的可能性，並且已經鑒定出一些似乎對TAT穿透有抗性的細胞系。藉由TAT遞送的特定載物也可能對遞送的有效性發揮作用。先前的研究數據表明，TAT融合蛋白在變性條件下製備時具有更好的細胞攝取能力，因為由於結構限制，正確折疊的蛋白載物可能需要更多的能量（ΔG）以穿過質膜。
細胞內蛋白伴侶對TAT貨物進行再折疊的能力可能會根據將要再折疊的蛋白載物的身份和大小而有所不同。在一些情況下，TAT-融合蛋白當置於水性環境中時沈澱，因此不能以變性的方式製備，也不能以天然構象長時間保持穩定性。TAT-融合蛋白的設計還必須針對要遞送的特定載物進行定製。如果載物蛋白緊密結合在N-末端，且TAT結構域也在N-末端發現，則TAT易位結構域可能埋藏在載物蛋白中，且轉導可能較差。
許多TAT-載物變體已經成功地遞送到各種細胞類型，包括初級培養細胞、轉化的細胞和小鼠組織中存在的細胞。在培養過程中，TAT-融合蛋白通常很容易擴散進入細胞內或擴散至細胞外，導致濃度非常迅速地達到一致。
許多藥物製劑，例如酶、抗體、其他蛋白質，或甚至載藥載體顆粒，都需要在細胞內遞送，以在細胞質、細胞核或其他特定細胞器內發揮其治療作用。因此，這些不同類型的大分子的遞送代表了生物製劑發展中的一個重大挑戰。目前的數據表明TAT能夠藉由多於一種的機制穿過質膜。
TAT轉導結構域也已經與超氧化物歧化酶（SOD）融合。（Torchilin，“Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. [細胞內遞送蛋白質和肽療法]”Protein Therapeutics. [蛋白質療法] 2008. 5(2-3): e95-e103）。該融合蛋白用於證明它可以跨細胞膜易位以遞送SOD酶至細胞內環境，並且因此在這裡融合蛋白在治療酶缺乏症障礙方面具有治療潛力，可導致活性氧類的更高積累和對宿主細胞的氧化應激。
TAT融合蛋白也已被證明可以通過血腦障壁進行轉導。與神經保護性蛋白Bcl-xL融合的TAT結構域在培養過程中能夠快速穿透細胞，並且當向患有腦缺血的小鼠給藥時，融合蛋白在1-2小時內轉導腦細胞。轉導後，腦梗死灶的大小以劑量依賴性的方式減小（Cao, G.等人，“In Vivo Delivery of a Bcl-xL Fusion Protein Containing the TAT Protein Transduction Domain Protects against Ischemic Brain Injury and Neuronal Apoptosis. [在體內遞送含有TAT蛋白質轉導結構域的Bcl-xL融合蛋白防止缺血性腦損傷和神經元細胞凋亡]”J. Neurosci. [神經科學雜誌] 22, 5423, 2002）。
本文所述的CDKL5變體可操作地連接至CPP，例如TAT、修飾的TAT（TATκ）、轉運素、觸角足素或P97。如在此所使用的，TAT可以指具有11個胺基酸的原始TAT肽（指定TAT11），也可以指具有另外的16個N-末端胺基酸的TAT肽（指定為TAT28），這些N-末端胺基酸來源於用於選殖的質粒的多接頭。類似地，TATκ可以是指TAT11的修飾版本（指定TATκ11）或TAT28的修飾版本（指定TATκ28）。CPP TAT28、TATκ28、TAT11、TATκ11、轉運素、觸角足素和P97的胺基酸序列分別提供於SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 50。
在一些實施方式中，該CPP與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有至少90%的序列一致性。在一些實施方式中，該CPP與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有至少95%的序列一致性。在一些實施方式中，該CPP與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有100%的序列一致性。在一些實施方式中，該CPP與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18具有至少90%的序列一致性。在一些實施方式中，該CPP與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18具有至少95%的序列一致性。在一些實施方式中，該CPP與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18具有100%的序列一致性。在各種實施方式中，該CPP不具有SEQ ID NO: 16的序列。
在各種實施方式中，CPP可以添加N-末端甘胺酸。例如，TATκ28和TAT28另外具有N-末端天冬胺酸殘基，其具有較低的穩定性。向序列中添加N-末端甘胺酸可以經由N-末端規則增加蛋白質的穩定性。因此，在一些實施方式中，任何具有前導訊號多肽的融合蛋白都可以具有在前導訊號多肽的C-末端添加甘胺酸，這樣當前導訊號多肽的裂解後，融合蛋白的新N-末端將以甘胺酸開始。以類似的方式，那些缺乏前導訊號多肽的融合蛋白也可以具有在N-末端蛋胺酸和融合蛋白的其餘部分之間添加的甘胺酸。也以類似的方式，那些具有CPP而不是TAT28或TATκ28的融合蛋白也可以具有在前導訊號多肽和CPP之間添加的甘胺酸。
包含 CDKL5 變體的融合蛋白
如上所述，CDKL5變體可以用於融合蛋白，例如也包含CPP的蛋白。其他多肽也可以被摻入到此類融合蛋白中，例如用於增強蛋白分泌的前導訊號多肽，或用於檢測和/或純化融合蛋白的標籤，以及用於連接功能性多肽的接頭多肽。
前導訊號多肽的實例包括但不限於，人免疫球蛋白重鏈結合蛋白的修飾的片段（修飾的BiP，例如SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53）或鼠Igκ鏈前導多肽（SEQ ID NO: 49，例如pSecTag2，來自賽默飛世爾公司（ThermoFisher）載體）。修飾的BiP訊號多肽的實例包括美國專利案號9,279,007中描述的那些，其全部內容藉由引用結合在此。
可以添加到融合蛋白的標籤的實例包括但不限於，表位標籤（例如MYC、HA、V5、NE）、麩胱甘肽S-轉移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）、鈣調蛋白結合肽（CBP）、FLAG®、3xFLAG®和多組胺酸。
配製物、治療方法與用途
可以根據常規程序將該重組蛋白（例如CDKL5變體或融合蛋白）配製為適合向人類給予的藥物組成物。例如，在一個或多個實施方式中，用於靜脈內給予的組成物係在無菌等滲水緩衝液中的溶液。必要時，該組成物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑以緩解注射部位的疼痛。通常，成分以單位劑量形式分開或混合在一起提供，例如，作為在氣密容器中的乾燥凍乾粉或無水濃縮物，氣密容器如指明活性劑的量的安瓿或小藥囊。在藉由輸注給予組成物時，可以用包含無菌藥用級的水、鹽水或右旋糖/水的輸液瓶進行分配。在藉由注射給予組成物時，可以提供無菌注射用水或鹽水的安瓿，這樣使得可以在給予前將這些成分混合。
藉由適當的途徑給予重組蛋白（例如，CDKL5變體或融合蛋白）（或包含重組蛋白的組成物或藥物）。在一個或多個實施方式中，該重組蛋白係靜脈內給予。在其他實施方式中，藉由直接給予至靶組織（如至心臟或骨骼肌（例如，肌內；心室內））或神經系統（例如，直接注射到腦中；鞘內）來給予重組蛋白。如果需要，可以同時使用多於一個途徑。
將該重組蛋白（例如，CDKL5變體或融合蛋白）（或包含重組蛋白的組成物或藥物）以治療有效量給予（例如，當以規律間隔給予時，足以治療疾病的劑量，例如藉由減輕與疾病相關的症狀，預防或延遲疾病的發作，和/或減輕疾病的症狀的嚴重性或頻率實現的）。在治療疾病中治療有效的量將取決於疾病影響的性質和程度。另外，可以視需要採用體外或體內測定來幫助鑒定最佳劑量範圍。待採用的確切劑量還取決於給予途徑和疾病的嚴重程度，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況來決定。可以從源自體外或動物模型測試系統的劑量-反應曲線外推有效劑量。
以規律的間隔給予的重組蛋白（例如，CDKL5變體或融合蛋白）（或包含重組蛋白的組成物或藥物）的治療有效量取決於疾病影響的性質和程度，和/或持續進行的基礎。如本文中所使用，以“規律的間隔”給予表示，將該治療有效量定期地給予（如區別於一次性劑量）。單個個體的給予間隔不需要係固定的間隔，但是可以是隨時間變化的，其取決於該個體的需要。
可以製備該重組蛋白（例如，CDKL5變體或融合蛋白）用於以後使用，例如在單位劑量小瓶或注射器中，或在用於靜脈給予的瓶或袋中。包含重組蛋白（例如，CDKL5變體或融合蛋白）連同視需要的賦形劑或其他活性成分例如其他藥物的套組（kit），可以封裝在包裝材料中，並且附有用於複水、稀釋或給藥的說明書，用於治療對其有需要的受試者，如患有CDKL5缺陷、雷特氏症候群或雷特氏症候群變體的患者。
產生方法
重組蛋白（例如CDKL5變體或融合蛋白）可以使用適當載體在宿主細胞中表現和從宿主細胞中分泌。例如，可以使用哺乳動物細胞（例如CHO細胞或HEK細胞）或細菌細胞（例如大腸桿菌或假交替單胞菌（P. haloplanktis）TAC 125細胞）。示例性質粒描述於下面的實例中，並示於圖2A-2AD中。熟悉該項技術者可以選擇適合於轉化、轉染或轉導細胞的替代載體，從而產生本文所述的CDKL5變體和融合蛋白。
表現和分泌後，使用標準技術從周圍細胞培養基中回收和純化重組蛋白。可替代地，重組蛋白可以直接從細胞中分離和純化，而不是從培養基中。
實例
實例 1 - CDKL5 融合蛋白
圖2A-2AD示出了合適細胞中表現融合蛋白的質粒，例如哺乳動物細胞（例如CHO細胞）或細菌細胞（例如大腸桿菌細胞）。這些蛋白質具有SEQ ID NO: 19-46中所示的胺基酸序列。缺失或截短的編號與全長CDKL5107 多肽（1 - 960）有關。在這些構建體中，CDKL5被C-末端融合到另外的N-末端胺基酸序列，CDKL5的初始蛋胺酸（胺基酸1）被除去。在這些構建體中，CDKL5多肽從第二個胺基酸賴胺酸開始。圖2A-2AD和SEQ ID NO: 19-46和54-55中使用的縮寫匯總於下表1中：
表1
圖2A顯示了在CHO細胞中用於表現SEQ ID NO: 19的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含經修飾的BiP前導訊號多肽、TATκ28和全長人CDKL5107 同種型。
圖2B顯示了在CHO細胞中用於表現SEQ ID NO: 20的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含鼠Igκ鏈前導多肽、TATκ28和全長人CDKL5107 同種型。
圖2C顯示了在CHO細胞中用於表現SEQ ID NO: 21的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含經修飾的BiP前導訊號多肽、TATκ28和全長人CDKL5115 同種型。
圖2D顯示了在CHO細胞中用於表現SEQ ID NO: 22的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含鼠Igκ鏈前導多肽、TATκ28和全長人CDKL5115 同種型。
圖2E顯示了在CHO細胞中用於表現SEQ ID NO: 23的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和全長人CDKL5107 同種型。
圖2F顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 24的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和全長人CDKL5107 同種型。
圖2G顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 25的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體2的CDKL5107 變體。
圖2H顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 26的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體3的CDKL5107 變體。
圖2I顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 27的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體4的CDKL5107 變體。
圖2J顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 28的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體5的CDKL5107 變體。
圖2K顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 29的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體6的CDKL5107 變體。
圖2L顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 30的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體7的CDKL5107 變體。
圖2M顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 31的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體8的CDKL5107 變體。
圖2N顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 32的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體9的CDKL5107 變體。
圖2O顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 33的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體10的CDKL5107 變體。
圖2P顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 34的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體11的CDKL5107 變體。
圖2Q顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 35的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和構建體12的CDKL5107 變體。
圖2R顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 36的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TAT28和全長人CDKL5107 同種型。
圖2S顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 37的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ28和增強的綠色螢光蛋白（eGFP）。
圖2T顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 38的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含不含CPP的eGFP。
圖2U顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 39的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含人雙載蛋白1（AMPH1）。
圖2V顯示了在CHO細胞中用於表現SEQ ID NO: 40的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含人雙載蛋白1（AMPH1）。
圖2W顯示了在CHO細胞中用於表現SEQ ID NO: 41的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含經修飾的BiP前導訊號多肽、TATκ11和全長人CDKL5107 同種型。
圖2X顯示了在CHO細胞中用於表現SEQ ID NO: 42的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含鼠Igκ鏈前導多肽、TATκ11和全長人CDKL5107 同種型。
圖2Y顯示了在CHO細胞中用於表現SEQ ID NO: 43的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ11和不含前導訊號多肽的全長人CDKL5107 同種型。
圖2Z顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 44的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TATκ11和不含前導訊號多肽的全長人CDKL5107 同種型。
圖2AA顯示了在大腸桿菌細胞中用於表現SEQ ID NO: 45的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TAT11和不含前導訊號多肽的全長人CDKL5107 同種型。
圖2AB顯示了在CHO細胞中用於表現SEQ ID NO: 46的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含TAT11和不含前導訊號多肽的全長人CDKL5107 同種型。
圖2AC顯示了在CHO細胞中用於表現SEQ ID NO: 54的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含觸角足素CPP和不含前導訊號多肽的全長人CDKL5107 同種型。
圖2AD顯示了在CHO細胞中用於表現SEQ ID NO: 55的融合蛋白的示例性質粒。該融合蛋白包含轉運素CPP和不含前導訊號多肽的全長人CDKL5107 同種型。
分別使用圖2A-2R和2W-2AB的質粒表現SEQ ID NO: 19-36和41-46的CDKL5融合蛋白並評價其活性。人雙載蛋白1（AMPH1）將作為CDKL5激酶測定的底物。圖2U和2V的質粒將用於表現用於CDKL5激酶測定的親和力標籤化的AMPH1（SEQ ID NO: 39和40）。親和力標籤化的eGFP（SEQ ID NO. 38）單獨以及親和力標籤化的TATk28-eGFP（SEQ ID NO. 37）作為CDKL5融合蛋白的對照，其分別使用圖2S和2T的質粒表現。
CHO和HEK細胞中表現了各種CDKL5融合蛋白。簡言之，使用Maxcyte STX和如下八種質粒電穿孔CHO-S細胞（20 x 10^6個細胞）：(1) pOptiVec空載體；2) TATk28-CDKL5-107-3xFlagHis；3) TATk11-CDKL5-107-3xFlagHis；4) TAT11-CDKL5-107-3xFlagHis；5) TAT28-CDKL5-107-3xFlagHis；6) ANTP-CDKL5-107-3xFlagHis；7) TRANSP-CDKL5-107-3xFlagHis和8) MBiP-TATK28-CDKL5-107-3xFlagHis（編碼序列係經CHO密碼子優化的）。在培養基中回收細胞，並培養1天。收集細胞並裂解。對於每個轉染，將20 µg的裂解物經受4%-12% BisTris SDS-PAGE，並使用iBlot2系統轉移到硝酸纖維素印漬。在1xTBS-T的5%牛奶中，阻斷印漬。藉由用1:2000稀釋的兔抗-His抗體孵育過夜，將印漬進行西方墨點轉漬法。經一系列洗滌後，用1 : 10000抗兔IgG DyaLight 680二抗孵育印漬。進行了另外的洗滌。在Licor Odyssey掃描器上成像印漬。印漬證實CDKL5融合蛋白的表現。
使用FuGeneHD（24 µl FuGeneHD : 8 µg DNA比率）和如下7種質粒轉染HEK293F細胞（8 x 10^6個細胞）：1) 空pOptiVec；2) TATk11-CDKL5_107-3xFlagHis；3) TAT11-CDKL5_1-FH；4) TAT28-CDKL5_1-FH；5) ANTP- CDKL5_107-3xFlagHis；6) TRANSP-CDKL5_107-3xFlagHis和7) TATk28- CDKL5_107-3xFlagHis（編碼序列係經人密碼子優化的）。孵育細胞並在轉染後2天收穫細胞。裂解細胞，並且將20 µg的裂解物經受4%-12% BisTris SDS-PAGE，並使用iBlot2系統轉移到硝酸纖維素印漬。在1xTBS-T的5%牛奶中，阻斷印漬。藉由用1 : 2000稀釋的兔抗-His抗體孵育過夜，將印漬進行西方墨點轉漬法。經一系列洗滌後，用1 : 10000抗兔IgG DyaLight 680二抗孵育印漬。進行了另外的洗滌。在Licor Odyssey掃描器上成像印漬。印漬證實CDKL5融合蛋白的表現。
在整篇說明書中對“一個實施方式”、“某些實施方式”、“各種實施方式”、“一個或多個實施方式”、或“實施方式”的引用意指與實施方式相聯繫地描述的具體的特徵、結構、材料、或特性係包括在本揭露的至少一個實施方式中的。因此，在整篇說明書中多個位置中出現的短語如“在一個或多個實施方式中”、“在某些實施方式中”、“在各種實施方式中”、“在一個實施方式中”、或“在實施方式中”不一定係指本揭露中的相同實施方式。此外，在一個或多個實施方式中，具體的特徵、結構、材料、或特性可以是以任何適合的方式進行組合。
儘管此處的揭露已參照具體實施方式提供了說明，應理解這些實施方式對於本揭露的原理和應用僅僅是說明性的。對熟悉該項技術者而言將明顯地是，在不偏離本揭露的範圍和精神的情況下，可以對本揭露進行多種修改和變化。因此，意圖係本揭露包括在所附的申請專利範圍及其等效物的範圍內的修改和變化。
無
[圖1A]顯示了CDKL5107 之多肽圖譜。該圖譜識別了多肽的重要特徵，包括ATP結合位點、激酶結構域和激酶活性位點、兩個核定位訊號和出核訊號。
[圖1B和1C]顯示了描繪合成的CDKL5構建體變體之圖（1B），並且圖例描述了多肽的長度，以及相關胺基酸缺失資訊，以描述如何合成這些構建體（1C）。
[圖2A-2AD]顯示了用於在細胞（例如CHO細胞或大腸桿菌細胞）內表現各種融合蛋白的示例性質粒。
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無
國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記)
無

Claims (44)

  1. 一種CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有至少98%的序列一致性的序列。
  2. 如請求項1所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有至少99%的序列一致性的序列。
  3. 如請求項1所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽包含與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12具有100%的序列一致性的序列。
  4. 一種缺乏出核訊號（NES）的CDKL5多肽。
  5. 如請求項4所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽含有核定位訊號（NLS）。
  6. 如請求項4所述之CDKL5多肽，其中該CDKL5多肽不含有核定位訊號（NLS）。
  7. 一種缺乏核定位訊號（NLS）且含有出核訊號（NES）的CDKL5多肽。
  8. 一種融合蛋白，該融合蛋白包含如請求項1至7中任一項所述之CDKL5多肽和可操作地連接至該CDKL5多肽的前導訊號多肽。
  9. 一種融合蛋白，該融合蛋白包含如請求項1至7中任一項所述之CDKL5多肽和可操作地連接至該CDKL5多肽的細胞穿透多肽。
  10. 如請求項9所述之融合蛋白，其中該細胞穿透多肽包含與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有至少90%的序列一致性的序列。
  11. 如請求項9所述之融合蛋白，其中該細胞穿透多肽包含與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有100%的序列一致性的序列。
  12. 如請求項9至11中任一項所述之融合蛋白，其進一步包含可操作地連接至如請求項9至11中任一項所述的融合蛋白的前導訊號多肽。
  13. 如請求項8至12所述之融合蛋白，其中該前導訊號多肽包含與SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53具有至少90%的序列一致性的序列。
  14. 如請求項8至12所述之融合蛋白，其中該前導訊號多肽包含與SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53具有100%的序列一致性的序列。
  15. 一種藥物配製物，該藥物配製物包含： 如請求項1至7中任一項所述之CDKL5多肽或如請求項8至14中任一項所述之融合蛋白；以及藥學上可接受的載體。
  16. 一種治療CDKL5介導的神經障礙之方法，該方法包括將如請求項15所述之配製物給予至對其有需要的患者。
  17. 如請求項16所述之方法，其中該配製物係鞘內、靜脈內、腦池內、腦室內或實質內給予。
  18. 如請求項16或17所述之方法，其中該配製物係鞘內或靜脈內給予。
  19. 如請求項16至18中任一項所述之方法，其中該CDKL5介導的神經障礙係CDKL5缺陷或由CDKL5突變或缺陷引起的非典型雷特氏症候群中的一種或多種。
  20. 一種產生如請求項1至7中任一項所述之CDKL5多肽或如請求項8至14中任一項所述的融合蛋白的方法，該方法包括： 表現該CDKL5多肽或該融合蛋白；以及純化該CDKL5多肽或該融合蛋白。
  21. 如請求項20所述之方法，其中該CDKL5多肽或該融合蛋白在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、人胚腎（HEK）細胞或大腸桿菌細胞中表現。
  22. 一種多核苷酸，該多核苷酸編碼如請求項1至7中任一項所述之CDKL5多肽或如請求項8至14中任一項所述的融合蛋白。
  23. 一種載體，該載體包含如請求項22所述之多核苷酸。
  24. 一種融合蛋白，該融合蛋白包含CDKL5多肽和可操作地連接在一起的細胞穿透多肽，其中該CDKL5多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 47具有至少98%的序列一致性的序列且該細胞穿透多肽包含與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有至少90%的序列一致性的序列。
  25. 如請求項24所述之融合蛋白，其中該細胞穿透多肽包含與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有至少95%的序列一致性的序列。
  26. 如請求項25所述之融合蛋白，其中該細胞穿透多肽包含與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有100%的序列一致性的序列。
  27. 如請求項24至26中任一項所述之融合蛋白，該融合蛋白進一步包含前導訊號多肽。
  28. 如請求項27所述之融合蛋白，其中該前導訊號多肽包含與SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53具有至少90%的序列一致性的序列。
  29. 如請求項28所述之融合蛋白，其中該前導訊號多肽包含與SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53具有100%的序列一致性的序列。
  30. 一種融合蛋白，該融合蛋白包含CDKL5多肽和可操作地連接在一起的前導訊號多肽，其中該CDKL5多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 47具有至少98%的序列一致性的序列且該前導訊號多肽包含與SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53具有至少90%的序列一致性的序列。
  31. 如請求項30所述之融合蛋白，其中該前導訊號多肽包含與SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53具有100%的序列一致性的序列。
  32. 如請求項30或31所述之融合蛋白，該融合蛋白進一步包含細胞穿透多肽。
  33. 如請求項32所述之融合蛋白，其中該細胞穿透多肽包含與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有至少90%的序列一致性的序列。
  34. 如請求項33所述之融合蛋白，其中該細胞穿透多肽包含與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有至少95%的序列一致性的序列。
  35. 如請求項34所述之融合蛋白，其中該細胞穿透多肽包含與SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 50具有100%的序列一致性的序列。
  36. 一種藥物配製物，該藥物配製物包含如請求項24至35中任一項所述之融合蛋白；以及藥學上可接受的載體。
  37. 一種治療CDKL5介導的神經障礙之方法，該方法包括將如請求項36所述之配製物給予至對其有需要的患者。
  38. 如請求項37所述之方法，其中該配製物係鞘內、靜脈內、腦池內、腦室內或實質內給予。
  39. 如請求項37或38所述之方法，其中該配製物係鞘內或靜脈內給予。
  40. 如請求項37至39中任一項所述之方法，其中該CDKL5介導的神經障礙係CDKL5缺陷或由CDKL5突變或缺陷引起的非典型雷特氏症候群中的一種或多種。
  41. 一種產生如請求項24至35中任一項所述之融合蛋白之方法，該方法包括： 表現該融合蛋白；以及純化該融合蛋白。
  42. 如請求項41所述之方法，其中該融合蛋白在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、人胚腎（HEK）細胞或大腸桿菌細胞中表現。
  43. 一種多核苷酸，該多核苷酸編碼如請求項24至35中任一項所述之融合蛋白。
  44. 一種載體，該載體包含如請求項43所述之多核苷酸。
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CN116377050A (zh) * 2022-12-16 2023-07-04 湖南家辉生物技术有限公司 一种发育性癫痫性脑病2型致病基因cdkl5突变位点的应用及其检测试剂和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005072470A2 (en) * 2004-01-28 2005-08-11 Exelixis, Inc Mbms as modifiers of branching morphogenesis and methods of use
EP3461905B1 (en) * 2010-11-22 2020-08-05 Amicus Therapeutics, Inc. Novel signal sequences to improve protein expression and secretion of recombinant enzymes and other proteins
SI3110837T1 (sl) * 2014-02-28 2019-12-31 Alma Mater Studiorum - Universita Di Bologna Fuzijski proteini TATK-CDKL5, sestavki, formulacije in njihova uporaba

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