BR112021008832A2 - Proteínas de núcleo de mininucleossoma e uso em distribuição de ácido nucleico - Google Patents

Proteínas de núcleo de mininucleossoma e uso em distribuição de ácido nucleico Download PDF

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Abstract

proteínas de núcleo de mininucleossoma e uso em distribuição de ácido nucleico. a presente invenção refere-se a composições e métodos relacionados a proteínas de núcleo de mininucleossoma e/ou distribuição de ácidos nucleicos. em particular, a presente divulgação inclui, entre outras coisas, veículos proteináceos não virais para a distribuição de ácidos nucleicos. em várias modalidades, veículos proteináceos não virais fornecidos no presente documento incluem (a) um domínio de ligação de ácido nucleico; (b) um domínio de alvejamento; e, opcionalmente, (c) um domínio de liberação de ácido nucleico, domínio de estabilidade e/ou um domínio de oligomerização e/ou um domínio ligante.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNAS
DE NÚCLEO DE MININUCLEOSSOMA E USO EM DISTRIBUIÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO". REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US nº 62/757.683, depositado em 8 de novembro de 2018, cuja divulgação é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES
[0002] Os vetores de AAV são considerados o padrão de ouro atual de terapia genética e se mostraram promissores em diversos tes- tes clínicos, incluindo testes clínicos para, por exemplo, terapia genéti- ca retinal e terapia genética sistêmica no fígado, SNC e/ou outros teci- dos. Com a aprovação reguladora de pelo menos três terapias genéti- cas diferentes, o campo é preparado para muito mais, de modo que pacientes possam acessar estes tratamentos que mudam a vida. En- tretanto, apesar de ser o padrão de ouro da indústria, os vetores de AAV têm certas limitações. São necessárias tecnologias de entrega de ácido nucleico aprimoradas e/ou alternativas.
SUMÁRIO
[0003] A presente divulgação fornece composições e métodos re- lacionados, entre outras coisas, a polipeptídeos que são capazes de se associar com moléculas de ácido nucleico, por exemplo, para uso na entrega das moléculas de ácido nucleico a indivíduos que precisam de terapia genética. Consequentemente, a presente divulgação inclui, entre outras coisas, polipeptídeos capazes de se associar a moléculas de ácido nucleico, assim como composições incluindo polipeptídeos divulgados no presente documento juntamente com moléculas de áci- do nucleico associadas. A presente divulgação contempla, sem dese- jar se ater a qualquer teoria científica particular, tal associação de uma molécula de ácido nucleico com um polipeptídeo divulgado no presen- te documento pode facilitar a entrega de ácido nucleico a uma célula-
alvo, indivíduo ou outro sistema.
[0004] Em particular, a presente divulgação inclui, entre outras coisas, "proteínas de núcleo de mininucleossoma" para entrega de ácidos nucleicos. Em várias modalidades, uma proteína de núcleo de mininucleossoma da presente divulgação pode incluir (a) um domínio de ligação de ácido nucleico ("NABD'"); (b) um domínio de alvejamento; e, opcionalmente, (c) domínios adicionais incluindo, por exemplo, um ou mais dentre um domínio de liberação de ácido nucleico, um domí- nio de estabilidade e/ou um domínio de oligomerização. Uma ou mais proteínas de núcleo de mininucleossoma associadas a uma carga de ácido nucleico podem ser chamadas de uma "mininucleossoma carre- gada". Visto que uma mininucleossoma carregada que é para entrega de um ácido nucleico a um alvo é não viral, uma mininucleossoma é um exemplo de um veículo não viral para entrega de ácido nucleico.
[0005] A presente divulgação inclui o reconhecimento de que pelo menos certas composições e métodos descritos no presente docu- mento remediam uma ou mais deficiências associadas a vetores de AAV, incluindo que:
[0006] 1) AAV é associada a uma limitação de carga útil de 4,5 kb de comprimento de DNA, limitação a qual previne o uso de AAV no tratamento de doenças causadas pelo menos em parte por deficiência na expressão de um produto genético tipicamente codificado por um ácido nucleico maior que 4 kb (por exemplo, genes como CFTR, HTT, F8, DMD, ABCA4 etc. não podem se encaixar em vetores de AAV) (Lai Y. et al, 2010).
[0007] 2) AAV é conhecido por integrar em baixa porcentagem e/ou de uma maneira não específica de sítio (Smith R.H., 2008). A in- tegração aleatória ou não específica de sítio pode ser deletéria se a integração puder ou de fato perturbar um gene supressor de tumor ou gene importante para funções celulares.
[0008] 3) Dependendo do serótipo de AAV, 25 a 70% de seres humanos têm anticorpos neutralizantes pré-existentes a AAV, o que significa, eles seriam menos propensos a se beneficiar com a terapia de AAV (Fitzpatrick Z., et al 2018).
[0009] 4) Múltiplos tratamentos com AAV são altamente não pro- pensas a serem efetivos visto que uma vez que um paciente for injeta- do, o paciente produz um alto número de antibióticos contra o vírus. Para algumas doenças em que a rotatividade celular é alta (por exem- plo, se a rotatividade de células do fígado ou células epiteliais das vias aéreas) múltiplos tratamentos podem ser necessários. Portanto, devi- do a antibióticos aumentados contra AAVs após um primeiro tratamen- to, o mesmo vetor pode não ser útil em tratamentos ou doses de acompanhamento.
[0010] 5) O tratamento eficaz de algumas doenças pode exigir a entrega de uma carga útil enorme de partículas administradas por inje- ção intravenosa a fim de transduzir células in vivo. Uma alta dose de AAV vem com suas próprias toxicidades, que são bem documentadas (Hinderer C. et al, 2018).
[0011] 6) A maioria das doenças também são associadas a falhas de múltiplos órgãos e AAV pode não ser aplicado a vários órgãos no mesmo corpo. Uma aplicação em um sítio elevará antibióticos e, por- tanto, pode bloquear a transdução em outras localizações no corpo quando injetada em um tratamento ou dose subsequente.
[0012] Devido pelo menos em parte às deficiências de AAV discu- tidas acima, há uma extrema necessidade das alternativas a AAV. Em pelo menos certas modalidades, vetores não virais divulgados no pre- sente documento superam uma ou mais das deficiências de AAV dis- cutidas acima.
[0013] Ademais, vetores não virais anteriores também são associ- ados a várias barreiras para eficácia terapêutica incluindo: i) eficiência baixa de transfecção/transdução (Guerra-Crespo M et al, 2003) ii) bai- xa estabilidade de partícula no sangue, fluidos corporais e outros teci- dos (Barua e Mitragotri, 2014) ; iii) entrada celular baixa por meio de endocitose mediada por receptor ou fusão celular; iv) estabilidade bai- xa em, e escape baixo de compartimentos endossômicos e lisosso- mais; v) taxa de difusão baixa no citoplasma; vi) trânsito por poro nu- clear baixo; e vii) liberação baixa de DNA para permitir função biológi- ca no núcleo (Zabner J. et al, 1995). Várias publicações documenta- ram a incapacidade ou baixa eficiência de vetores não virais anteriores para transfectar células pós-mitóticas (Wilke M. et a/, 1996). Certos vetores não virais anteriores são desprovidos de longevidade de ex- pressão e/ou produzem baixa quantidade de proteínas que não são terapêuticos o suficiente e não podem ser alvejados a tipos de célula específica de uma maneira eficiente.
[0014] Portanto, apesar da pesquisa de estado da técnica no cam- po de vetores não virais, muitos vetores não virais anteriores não são ideais para uso clínico. Certas características de pelo menos certas modalidades discutidas no presente documento que contribuem para, entre outras coisas, utilidade clínica, podem incluir, sem limitação:
[0015] Tamanho e peso molecular: muitos vetores não virais ante- riores que portam molécula de DNA têm um tamanho de 10-200 nm de diâmetro (Konstan M.W. et. al, 2004). Seus pesos moleculares podem ser maiores que 300 kDa ou maiores que 500 kDa. A presente divul- gação fornece, entre outras coisas, veículos proteináceos não virais e/ou mininucleossomas carregadas, que são < 20 nm de diâmetro e têm um peso molecular de < 500 kDa. Em modalidades particulares, veículos proteináceos não virais e/ou mininucleossomas carregadas, divulgados no presente documento, podem passar para dentro do nú- cleo mais eficientemente, talvez, por difusão passiva, pelo menos em parte porque um poro nuclear típico tem apenas 20 nm de diâmetro,
de modo que < 20 nm de tamanho possa permitir a passagem.
[0016] A estabilidade em fluidos corporais: muitos vetores não vi- rais anteriores são degradados em fluidos corporais como sangue ou CSF antes que possam ser entregues a células-alvo (Barua e Mitrago- tri, 2014). A presente divulgação, fornece, entre outras coisas, veículos proteináceos não virais e/ou mininucleossomas carregadas, que são fisiologicamente estáveis e/ou têm propriedades que permitem que sejam estáveis no sangue e/ou outros fluidos corporais até e após a entrada em uma célula-alvo. Pelo menos um objetivo destas partículas para alcançar seguramente o núcleo de células desejadas.
[0017] A liberação de partículas no núcleo: muitos vetores não vi- rais anteriores têm um tempo de vida muito curto, visto que a maioria libera ácidos nucleicos associados antes de entrar em células-alvo, e o restante libera ácidos nucleicos associados no citoplasma, onde o DNA entregue encontra nucleases que destroem DNA (Zabner, J. et al, 1995). Certos vetores anteriores que chegam a entrar no núcleo celular e fornecem níveis de expressão são muito baixos, se chegarem a expressar. A presente divulgação também reconhece, entre outras coisas, que pode ser benéfico liberar ácidos nucleicos associados a uma taxa baixa, em vez de todos de uma vez, o que pode permitir a longevidade de expressão.
[0018] Especificidade de tipo celular: vetores não virais anteriores não são alvejados a tipos de célula específica, são associados a níveis reduzidos de transdução e, portanto, expressão reduzida. A presente divulgação fornece, entre outras coisas, vetores não virais otimizados para especificidade de tipo celular. Certos meios de modificação gené- tica de especificidade de tipo celular são descritos, por exemplo, em Templeton e Senzer, 2011.
[0019] Em conjunto, há uma enorme necessidade de tecnologias de entrega de ácido nucleico que fornecem níveis eficazes de expres-
são por uma duração desejada, são não imunogênicas e não tóxicas e têm menos capacidade de carga útil limitada. Ademais, a necessidade de milhões de pacientes de Huntington, Stargardt, distrofia muscular de Duchenne, Fibrose Cística e outras condições tratáveis por terapia genética claramente apresentam uma necessidade de tecnologia que pode ajudar a tratar estes pacientes.
[0020] A presente divulgação fornece veículos proteináceos não virais seguros e eficazes ("proteínas de núcleo de mininucleossoma") e mininucleossomas carregadas para entrega de ácidos nucleicos.
[0021] Em várias modalidades, uma proteína de núcleo de mininu- cleossoma está associada a um ou mais ácidos nucleicos. Conforme divulgado no presente documento, uma proteína de núcleo de mininu- cleossoma associada a um ou mais ácidos nucleicos pode ser chama- da de uma "mininucleossoma carregada".
[0022] Em várias modalidades, uma proteína de núcleo de mininu- cleossoma inclui um domínio de alvejamento que alveja uma mininu- cleossoma carregada a um ou mais tipos de célula específica para en- trega e/ou expressão alvejada de um ácido nucleico, como um gene, em ou para um ou mais tipos de célula específica.
[0023] Em várias modalidades, uma composição de proteína de núcleo de mininucleossoma (por exemplo, uma composição incluindo uma ou mais mininucleossomas carregadas) pode ser titulada e/ou administrada uma vez ou repetidamente com base na necessidade. Ademais, em várias modalidades, uma proteína de núcleo de mininu- cleossoma ou composição de mininucleossoma (por exemplo, uma composição incluindo uma ou mais mininucleossomas carregadas) é não imunogênica e não tóxica.
[0024] As proteínas de núcleo de mininucleossoma divulgadas no presente documento podem, em certas modalidades, utilizar princípios aplicáveis à absorção de macromolécula, entrada viral em células,
formação de nucleossoma em células eucarióticas, clivagem de certas proteínas em certa localização nas células, etc.
[0025] Várias modalidades das composições e métodos fornecidos no presente documento incluem domínios que facilitam um ou mais dentre estabilidade aprimorada, alvejamento a tipos de célula específi- ca e longevidade aprimorada de expressão por liberação ácido nuclei- co lenta.
[0026] Em várias modalidades, uma proteína de núcleo de mininu- cleossoma e/ou uma mininucleossoma é estável em fluidos corporais e/ou inclui domínios que permitem e/ou alvejam a liberação no ou para o núcleo.
[0027] Em pelo menos um aspecto, a presente divulgação fornece um polipeptídeo geneticamente modificado que inclui um domínio de ligação de ácido nucleico e um domínio de alvejamento, polipeptídeo geneticamente modificado o qual pode ser uma proteína de núcleo de mininucleossoma. Uma mininucleossoma carregada pode ser ou for- necer um vetor não viral que inclui um polipeptídeo geneticamente modificado (por exemplo, uma proteína de núcleo de mininucleosso- ma) conforme descrito no presente documento e pelo menos uma mo- lécula de ácido nucleico conforme fornecido no presente documento ou, de outro modo conhecido na técnica.
[0028] Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado (por exemplo, uma proteína de núcleo de mininucleosso- ma) que é ou inclui um domínio de ligação de ácido nucleico foi deri- vado de uma sequência de polipeptídeo de histona e/ou um domínio de ligação de ácido nucleico que é ou inclui a sequência de aminoáci- dos KRHRK. Em certas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação inclui um domínio de ligação de ácido nucleico que é ou inclui uma sequência de aminoácidos que in- clui KRHRK, RRRRR, RRLARR, KKAKAAAKPKK, KKDGKKRKR,
KKKLK, KKRIRK, RKKSK, KKPKK ou uma combinação das mesmas, mas sem limitações.
[0029] Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação inclui um domínio de ligação de ácido nucleico derivado de qualquer sequência de proteína de histona ou daquelas descritas na Tabela 3 ou uma combinação das sequên- cias descritas no presente documento, mas sem limitações. Estes do- mínios de ligação ao ácido nucleico podem ser derivados de várias proteínas humanas ou outros organismos. Uma pessoa versada na técnica pode contemplar modificar ou modificar geneticamente o "NABD" com alterações na sequência de aminoácidos. Alguém versa- do na técnica também pode contemplar colocar o "NABD" em sequên- cia inversa, pela comutação de posições de aminoácido dentro do do- mínio ou adição de modificações pós-traducionais nos aminoácidos.
[0030] Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação inclui um domínio de alvejamento que é um domínio de fixação de célula, um domínio de ligação de beta galactose, a fucose domínio de ligação, um domínio de ligação de he- parina, um domínio de ligação de ácido siálico, um domínio de ligação de glicoproteína, um domínio de ligação de carboidrato, um domínio de ligação de ácido lisofosfatídico, um domínio de ligação de CAMP, um domínio de ligação de hialuronano, um domínio de ligação de sulfato de condroitina, um domínio de ligação de integrina, um domínio de |i- gação de nucleolina, um domínio de ligação de colágeno, um domínio de ligação de clatrina, um domínio de ligação de receptor Fc, um do- mínio de ligação de actina, um motivo de endocitose, um sinal de loca- lização nuclear ou uma combinação dos mesmos, mas sem limitações. Alguns exemplos de tais domínios são descritos na Tabela 5, mas sem limitações aos mesmos. Estes domínios podem ser derivados de quaisquer proteínas humanas ou outros organismos. Uma pessoa ver-
sada na técnica pode contemplar modificar ou modificar geneticamen- te o domínio de alvejamento com alterações na sequência de aminoá- cidos. Alguém versado na técnica também pode contemplar colocar o domínio de alvejamento em sequência inversa, pela comutação de po- sições de aminoácido dentro do domínio ou adição de modificações pós-traducionais nos aminoácidos.
[0031] Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação inclui um domínio de alvejamento que é um domínio de internalização, em que o domínio de internaliza- ção é ou inclui uma sequência de aminoácidos que inclui FXDXF, PPSY, FEDNFVP, YIRV, YADW, YTQV, KKRPKP, SSDDE, RRASS, (YXXL)2, LPLTG, LAFTG ou uma combinação dos mesmos, mas sem limitações. Estes domínios podem ser derivados de proteínas huma- nas ou outros organismos. Uma pessoa versada na técnica pode con- templar modificar ou modificar geneticamente o domínio de internali- zação com alterações na sequência de aminoácidos. Alguém versado na técnica também pode contemplar colocar o domínio de internaliza- ção em sequência inversa, pela comutação de posições de aminoáci- do dentro do domínio ou adição de modificações pós-traducionais nos aminoácidos.
[0032] Aqueles versados na técnica observarão que, como usado em sequências de proteína ao longo do presente relatório descritivo, um "X" pode se referir a qualquer aminoácido, exceto se especificado de outro modo. Portanto, exceto se especificado de outro modo, um "X" é um substituto para um aminoácido único, posição a qual pode ser preenchida por um aminoácido único conhecido por aqueles versados na técnica.
[0033] Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação inclui um domínio de alvejamento de fixação celular que é ou inclui uma sequência de aminoácidos sele-
cionada a partir de WGREERQ, NTQIH, WNNKTPH, TPH, VNRWS, XBBBXXBX, ARKKAAKA, QORR, SRR, WEPSRPFPVD, HRRTR- KAPKRIRLPHIR, KRTGQYKLGSKTGPGQK, KKTK, KLRSQLVKK, RRRCGQKKK, BX(7)B, RIQNLLKITNLRIKFVK, KKEKDIMKKTI, KGE, RGD, RGDS, TTVVNPKYEGK, ERMSQIKRLLS, WRHRARS, GFO- GER, LFDLM, WGREERQ, QSTEKRG, LPNTG e uma combinação dos mesmos, em que X pode ser qualquer aminoácido, mas sem limi- tações.
[0034] Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação inclui um domínio de alvejamento que é um domínio de alvejamento específico de tipo de célula de domínio de internalização em que o domínio de alvejamento específico de tipo de célula é ou inclui uma sequência de aminoácidos que inclui ASSLNIA, KKEEEKKEEEKKEEE, LIFHKEQ, KFNKPFVFLI, QPEHSST, EYH- HYNK, NGR, GEKGEP, KTKKK, KALKKK, KGKKK, CSVTCG, LRE, YKYNLNGRES, YRSL, KGGK7,, KKKQYTSIHHG, KDEL, LADQDYT- KTA ou uma combinação das mesmas, mas sem limitações. Estes domínios podem ser derivados de proteínas humanas ou outros orga- nismos. Uma pessoa versada na técnica pode contemplar modificar ou modificar geneticamente o domínio de alvejamento com alterações na sequência de aminoácidos. Alguém versado na técnica também pode contemplar colocar o domínio de alvejamento em sequência inversa, pela comutação de posições de aminoácido dentro do domínio ou adi- ção de modificações pós-traducionais nos aminoácidos.
[0035] Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação inclui um domínio de poliarginina com comprimento variável ou múltiplos domínios de poliarginina ao longo da sequência de polipeptídeos.
[0036] Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação inclui um sinal de internalização nuclear ou um domínio de ligação de mecanismo de importação nu- clear. O polipeptídeo geneticamente modificado, o sinal de internaliza- ção nuclear ou um domínio de ligação de mecanismo de importação nuclear pode ser ou incluir uma sequência de aminoácidos que inclui KKKYKLK, KKRKLE, TRSK, HRKRKR, NKRKRK, AEKSKKK, RKSK, KRVK, KRK, LOQTPLHLAVI, RRPR, PRPR, RPPP, RKKRKGK, PAAKRVKLD, KLKIKRPVK, PKKKRKV, QRKROQK, DSPE, FQVT, QSTEKRG, RQGLID, RKKH Cíclica ou uma combinação das mesmas, mas sem limitações. Estes domínios podem ser derivados de proteínas humanas ou outros organismos. Uma pessoa versada na técnica pode contemplar modificar ou modificar geneticamente o sinal de internali- zação nuclear com alterações na sequência de aminoácidos. Alguém versado na técnica também pode contemplar colocar o sinal de inter- nalização nuclear em sequência inversa, pela comutação de posições de aminoácido dentro do domínio ou adição de modificações pós- traducionais nos aminoácidos.
[0037] Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação inclui um domínio de liberação de ácido nucleico. O domínio de liberação de ácido nucleico é ou inclui uma sequência de aminoácidos que inclui GRRKKRRQORRRPOQ, KRH, KSVKKRSVSEIQ, NRRKKRAL, KFERQ, VRGP, NKDS, NRDN, ANNR ou uma combinação das mesmas, mas sem limitações. Estes domí- nios podem ser derivados de várias proteínas que são substratos de peptidases, enzimas ou outras proteínas encontradas em seres huma- nos ou outros organismos. Alguns domínios de liberação de ácido nu- cleico também podem ser derivados de sítios de autólise de várias pro- teínas. Uma pessoa versada na técnica pode contemplar modificar ou modificar geneticamente o domínio de liberação de ácido nucleico com alterações na sequência de aminoácidos. Alguém versado na técnica também pode contemplar colocar o sinal de liberação de ácido nuclei-
co em sequência inversa, pela comutação de posições de aminoácido dentro do domínio ou adição de modificações pós-traducionais nos aminoácidos.
[0038] Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação inclui ainda um domínio de estabili- dade. Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modi- ficado da presente divulgação pode incluir um domínio de estabilidade que é ou inclui uma sequência de aminoácidos que inclui YTRF, GDAY, LLEE, RKKRRQRRR, YKSL, YENF, FQDL, YIGSR, IKVAV ou uma combinação das mesmas, mas sem limitações. Estes domínios podem ser derivados de proteínas humanas ou outros organismos. Uma pessoa versada na técnica pode contemplar modificar ou modifi- car geneticamente o domínio de estabilidade com alterações na se- quência de aminoácidos. Alguém versado na técnica também pode contemplar colocar o domínio de estabilidade em sequência inversa, pela comutação de posições de aminoácido dentro do domínio ou adi- ção de modificações pós-traducionais nos aminoácidos.
[0039] Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação inclui um domínio de oligomeriza- ção. Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modi- ficado da presente divulgação pode incluir um domínio de oligomeriza- ção selecionado dos domínios de oligomerização da Tabela 11, mas sem limitações. A posição de domínio de oligomerização é posiciona- da na terminação C de um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação ou em quaisquer outras localizações. Estes domí- nios podem ser derivados de proteínas humanas ou outros organis- mos. Uma pessoa versada na técnica pode contemplar modificar ou modificar geneticamente o domínio de oligomerização com alterações na sequência de aminoácidos. Alguém versado na técnica também pode contemplar colocar o domínio de oligomerização em sequência inversa, pela comutação de posições de aminoácido dentro do domínio ou adição de modificações pós-traducionais nos aminoácidos.
[0040] Em algumas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação inclui um ligante. Em algumas mo- dalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente di- vulgação pode incluir um ligante selecionado, sem limitação, a partir dos domínios exemplificativos da Tabela 12. A posição do ligante em um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação pode ser entre outros domínios e quaisquer outras localizações. Estes ligantes podem ser derivados de proteínas humanas ou outros orga- nismos. Uma pessoa versada na técnica pode contemplar modificar ou modificar geneticamente o domínio ligante com alterações na sequên- cia de aminoácidos. Alguém versado na técnica também pode con- templar colocar o domínio ligante em sequência inversa, pela comuta- ção de posições de aminoácido dentro do domínio ou adição de modi- ficações pós-traducionais nos aminoácidos.
[0041] Em várias modalidades, dois ou mais polipeptídeos geneti- camente modificados da presente divulgação podem oligomerizar.
[0042] Em algumas modalidades, a presente divulgação inclui uma composição que inclui um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação (por exemplo, uma proteína de núcleo de mininu- cleossoma) juntamente com pelo menos um polinucleotídeo. Em al- gumas modalidades, o polipeptídeo é um polinucleotídeo de DNA ou RNA. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um ou inclui um RNA inibidor, em que o RNA inibidor é um gRNA, siRNA, miRNA ou shRNA. Em várias modalidades, o(s) polipeptídeo(s) e polinucleotídeo(s) não são associados, mas estão juntos em uma composição, por exemplo, um kit ou solução. Em várias modalidades, o(s) polipeptídeo(s) e poli- nucleotídeo(s) são associados, por exemplo, condensados, por exem- plo, para formar uma mininucleossoma carregada. Em certas modali-
dades, uma razão de polinucleotídeos para polipeptídeos genetica- mente modificados é entre 1:3 e 1:2000. Em certas modalidades, a razão de polinucleotídeos para polipeptídeos geneticamente modifica- dos é entre 1:3 e 1:1000, entre 1:3 e 1:500, entre 1:3 e 1:200, entre 1:3 e 1: 100 ou entre 1:3 e 1:50. Em certas modalidades, a razão de poli- nucleotídeos para polipeptídeos geneticamente modificados é entre 1:200 e 1:2000, entre 1:200 e 1:1000 ou entre 1:200 e 1:500. Uma pessoa versada na técnica também pode contemplar modificações químicas nas moléculas de DNA ou RNA.
[0043] Em algumas modalidades, uma composição fornecida no presente documento, que inclui uma proteína de núcleo de mininu- cleossoma e/ou uma mininucleossoma carregada) pode ser adminis- trada a ou colocada em contato com uma célula, tecido ou indivíduo. As condições de aplicação podem ser em in vitro, ex vivo ou in vivo. Tal célula geneticamente modificada pode incluir um carreador farma- cêutico, por exemplo, que pode ser usado em, ou é compatível com entrega de materiais terapêuticos (por exemplo, uma composição for- necida no presente documento que inclui uma proteína de núcleo de mininucleossoma e/ou uma mininucleossoma carregada) a várias par- tes do corpo humano, por exemplo, cérebro, retina, intestino, pân- creas, pulmão etc. sem quaisquer limitações.
[0044] Em algumas modalidades, um método para condensar um polinucleotídeo pode incluir colocar um polinucleotídeo em contato com uma proteína de núcleo de mininucleossoma conforme descrito no presente documento. O método pode incluir o processo de neutrali- zação da carga de um polinucleotídeo ou condensação do polinucleo- tídeo em partículas nanodimensionadas, incluindo colocar o polinucle- otídeo em contato com uma proteína de núcleo de mininucleossoma descrita no presente documento.
[0045] Em algumas modalidades, a proteína de núcleo de mininu-
cleossoma pode ser um peptídeo ramificado ou um peptídeo cíclico, mas não limitada a estas características. Uma pessoa versada na téc- nica pode contemplar alterar as características de proteína de núcleo de mininucleossoma para obter tropismo aprimorado a vários tipos de célula.
[0046] A presente divulgação fornece ainda um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo geneticamente modificado (por exemplo, uma proteína de núcleo de mininucleossoma) conforme fornecido no presente documento. O polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ge- neticamente modificado pode ser um polinucleotídeo de DNA ou um polinucleotídeo de RNA. Em algumas ocorrências, a presente divulga- ção fornece um vetor incluindo um polinucleotídeo que codifica um po- lipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação. Em al- gumas modalidades, a presente divulgação fornece uma célula que inclui um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo geneticamente modificado (por exemplo, uma proteína de núcleo de mininucleosso- ma) como fornecido no presente documento, um vetor incluindo tal po- linucleotídeo, ou inclui a sequência de tal polinucleotídeo. Em certas modalidades, um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação pode ser isolado de uma ou mais de tais células.
[0047] Em várias modalidades, um ou mais aminoácidos de um polipeptídeo geneticamente modificado da presente divulgação (por exemplo, uma proteína de núcleo de mininucleossoma) são peguila- dos, acetilados, metilados, glicosilados, fosforilados, sumoilados, ami- dados, lipidados, prenilados, lipoilados, alquilados, acilados, glicados, nitrosilados, sulfatados, carbamilados, carbonilados, nedilados, biotini- lados ou ribosilados
DEFINIÇÕES
[0048] Cerca de: O termo "cerca de", quando usado no presente documento em referência a um valor, se refere a um valor que é simi-
lar, em contexto ao valor mencionado. Em geral, aqueles versados na técnica, familiares com o contexto, observarão o grau relevante de va- riância englobado por "cerca de" em tal contexto. Por exemplo, em al- gumas modalidades, o termo "cerca de" pode englobar uma faixa de valores que dentro 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, T%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos que o valor mencionado.
[0049] Administração: Como usado no presente documento, o termo "administração" tipicamente se refere à administração de uma composição a um indivíduo ou sistema para alcançar a entrega de um agente que é, ou é incluído na composição. Aqueles de habilidade comum na técnica estarão cientes de uma variedade de vias que po- dem, em circunstâncias apropriadas, ser utilizadas para administração a um indivíduo, por exemplo, um ser humano. Por exemplo, em algu- mas modalidades, a administração pode ser ocular, oral, parenteral, tópica, etc. Em algumas modalidades particulares, a administração pode ser bronqueal (por exemplo, por instilação bronqueal), bucal, dérmica (que pode ser ou incluir, por exemplo, uma ou mais dentre tópica à derme, intradérmica, interdérmica, transdérmica, etc.), enteral, intra-arterial, intradérmica, intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intraventricular, den- tro de um órgão específico (por exemplo, intra-hepática), mucosal, na- sal, oral, retal, subcutânea, sublingual, tópica, traqueal (por exemplo, por instilação intratraqueal), vaginal, vitreal, etc. Em algumas modali- dades, a administração pode envolver apenas uma dose única. Em algumas modalidades, a administração pode envolver aplicação de um número fixo de doses. Em algumas modalidades, a administração po- de envolver dosagem que é intermitente (por exemplo, uma pluralida- de de doses separadas no tempo) e/ou periódica (por exemplo, doses individuais separadas por um período de tempo comum) dosagem. Em algumas modalidades, a administração pode envolver dosagem contí- nua (por exemplo, perfusão) por pelo menos um período de tempo se- lecionado.
[0050] Associado com: Dois eventos ou entidades são "associa- das" uma com a outra, visto que tal termo é usado no presente docu- mento, se a presença, nível e/ou forma de uma for correlacionada com aquele da outra. Por exemplo, uma entidade particular (por exemplo, polipeptídeo, assinatura genética, metabólito, micróbio, etc.) é conside- rado como estando associado a uma doença, distúrbio ou afecção par- ticular, se sua presença, nível e/ou forma se correlacionar com a inci- dência de e/ou suscetibilidade à doença, distúrbio ou afecção (por exemplo, através de uma população relevante). Em algumas modali- dades, duas ou mais entidades são fisicamente "associadas" uma à outra se interagirem, direta ou indiretamente, de modo que sejam e/ou permaneçam em proximidade física uma com a outra. Em algumas modalidades, duas ou mais entidades que são fisicamente associadas uma com a outra são covalentemente ligadas uma à outra; em algu- mas modalidades, duas ou mais entidades que são fisicamente asso- ciadas uma à outra não são covalentemente ligadas uma à outra, mas são associadas não covalentemente, por exemplo, por meio de liga- ções de hidrogênio, interação de van der Waals, interações hidrofóbi- cas, magnetismo e combinações dos mesmos.
[0051] Agente: Como usado no presente documento, o termo "agente", pode se referir a um composto, molécula ou entidade de qualquer classe química incluindo, por exemplo, uma molécula peque- na, polipeptídeo, ácido nucleico, sacarídeo, lipídeo, metal ou uma combinação ou complexo dos mesmos. Em algumas modalidades, o termo "agente" pode se referir a um composto, molécula ou entidade que inclui um polímero. Em algumas modalidades, o termo pode se referir a um composto ou entidade que inclui uma ou mais porções químicas poliméricas. Em algumas modalidades, o termo "agente" po- de se referir a um composto, molécula ou entidade que é substancial- mente livre de um polímero particular ou porção química polimérica. Em algumas modalidades, o termo pode se referir a um composto, mo- lécula ou entidade desprovido ou é substancialmente livre de qualquer polímero ou porção química polimérica.
[0052] Aminoácido: Em seu sentido mais amplo, como usado no presente documento, "aminoácido" se refere a qualquer composto e/ou substância que pode ser incorporada em uma cadeia de polipeptídeo, por exemplo, através de formação de uma ou mais ligações de peptí- deo. Em algumas modalidades, um aminoácido tem a estrutura geral H2N-C(H)(R)-COOH. Em algumas modalidades, um aminoácido é um aminoácido de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um ami- noácido é um aminoácido não natural; em algumas modalidades, um aminoácido é um D-aminoácido; em algumas modalidades, um amino- ácido é um L-aminoácido. "Aminoácido padrão" se refere a qualquer um dentre os vinte L-aminoácidos padrão comumente encontrados em peptídeos de ocorrência natural. "Aminoácido não padrão" se refere a qualquer aminoácido, diferente dos aminoácidos padrão, independen- temente de ser preparado sinteticamente ou obtido a partir de uma fonte natural. Em algumas modalidades, um aminoácido, incluindo um aminoácido carbóxi- e/ou amino-terminal em um polipeptídeo, pode conter uma modificação estrutural em comparação com a estrutura geral acima. Por exemplo, em algumas modalidades, um aminoácido pode ser modificado por metilação, amidação, acetilação, peguilação, glicosilação, fosforilação e/ou substituição (por exemplo, do grupo amino, o grupo ácido carboxílico, um ou mais prótons e/ou o grupo hi- droxila) em comparação com a estrutura geral. Em algumas modalida- des, tal modificação pode, por exemplo, alterar a meia vida de circula- ção de um polipeptídeo contendo o aminoácido modificado em compa-
ração com um contendo um aminoácido não modificado, de outro mo- do, idêntico. Em algumas modalidades, tal modificação não altera sig- nificativamente uma atividade relevante de um polipeptídeo contendo o aminoácido modificado, em comparação com um contendo um amino- ácido não modificado, de outro modo, idêntico. Como será claro a par- tir do contexto, em algumas modalidades, o termo "aminoácido" pode ser usado para se referir a um aminoácido livre; em algumas modali- dades, pode ser usado para se referir a um resíduo de aminoácido de um polipeptídeo.
[0053] Entre: Como usado no presente documento, o termo "entre" se refere ao teor que cai entre limites indicados superior e inferior, ou primeiro e segundo, incluindo os limites.
[0054] Correspondente a: Como usado no presente documento, o termo "correspondente a" pode ser usado para designar a posi- ção/identidade de um elemento estrutural em um composto ou compo- sição através da comparação com um composto ou composição de referência apropriada. Por exemplo, em algumas modalidades, um re- síduo monomérico em um polímero (por exemplo, um resíduo de ami- noácido em um polipeptídeo ou um resíduo de ácido nucleico em um polinucleotídeo) pode ser identificado como "correspondente a" um re- síduo em um polímero de referência apropriado. Por exemplo, aqueles de habilidade comum observarão que, para os propósitos de simplici- dade, resíduos em um polipeptídeo são frequentemente designados usando um sistema de numeração canônica com base em um polipep- tídeo relacionado à referência, de modo que um aminoácido "corres- pondente a" um resíduo na posição 190, por exemplo, não precisa ser, de fato, o 190º aminoácido em uma cadeia de aminoácido particular, mas, em vez disso, corresponde ao resíduo encontrado em 190 no po- lipeptídeo de referência; aqueles de habilidade comum na técnica ob- servam prontamente como identificar aminoácidos "correspondentes".
Por exemplo, aqueles versados na técnica estarão cientes de várias es- tratégias de alinhamento de sequência, incluindo programas de software como, por exemplo, BLAST, CS-BLAST, CUDASW++, DIAMOND, FAS- TA, GGESEARCH/GLSEARCH, Genoogle, HMMER, HHpred/HHsearch, IDF, Infernal, KLAST, USEARCH, parasail, PSI-BLAST, PSI-Search, ScalaBLAST, Sequilab, SAM, SSEARCH, SWAPHI, SWAPHI-LS, SWIMM ou SWIPE que podem ser utilizados, por exemplo, para identi- ficar resíduos "correspondentes" em polipeptídeos e/ou ácidos nuclei- cos de acordo com a presente divulgação.
[0055] Domínio: O termo "domínio" como usado no presente do- cumento se refere a uma seção ou porção de uma entidade. Em algu- mas modalidades, um "domínio" está associado a um recurso estrutu- ral e/ou funcional particular da entidade, de modo que, quando o do- mínio é fisicamente separado do restante de sua entidade parental, ele retém substancial ou inteiramente o recurso estrutural e/ou funcional particular. Alternativa ou adicionalmente, um domínio pode ser ou in- cluir uma porção de uma entidade que, quando separada de tal enti- dade (parental) e ligada com uma entidade (recipiente) diferente, re- tém substancialmente e/ou confere à entidade recipiente um ou mais recursos estruturais e/ou funcionais que caracterizaram o mesmo na entidade parental. Em algumas modalidades, um domínio é uma seção ou porção de uma molécula (por exemplo, uma molécula pequena, carboidrato, lipídeo, ácido nucleico ou polipeptídeo). Em algumas mo- dalidades, um domínio é uma seção de um polipeptídeo; em algumas de tais modalidades, um domínio é caracterizado por um elemento es- trutural particular (por exemplo, uma particular sequência de aminoáci- dos ou motivo de sequência particular, caractere de a-hélice, caractere de B-folha, caractere de bobina bobinada, caractere de bobina aleató- ria, etc.) e/ou por um recurso funcional particular (por exemplo, ativida- de de ligação, atividade enzimática, atividade de dobra, atividade de sinalização, etc.). Em algumas modalidades, um domínio é ou inclui uma porção característica ou elemento de sequência de característica.
[0056] Geneticamente modificada: Em geral, o termo "genetica- mente modificado" se refere ao aspecto de ter sido manipulado pela mão do homem. Por exemplo, um polinucleotídeo é considerado como sendo "geneticamente modificado" quando duas ou mais sequências, que não são ligadas em conjunto em tal ordem na natureza, são mani- puladas pela mão do homem para serem diretamente ligadas uma à outra no polinucleotídeo geneticamente modificado. Aqueles versados na técnica observarão que um ácido nucleico ou sequência de amino- ácidos "geneticamente modificada" pode ser um ácido nucleico ou se- quência de aminoácidos recombinante. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo geneticamente modificado inclui uma sequência regu- ladora de sequência de codificação de domínio que é encontrada na natureza em associação operativa com uma primeira sequência, mas não em associação operativa com uma segunda sequência, é ligada pela mão do homem, de modo que seja operacionalmente associada à segunda sequência. Comparavelmente, uma célula ou organismo é considerado como sendo "geneticamente modificado" se tiver sido manipulado, de modo que suas informações genéticas sejam alteradas (por exemplo, novo material genético não presente anteriormente foi introduzido, por exemplo, por transformação, acoplamento, hibridiza- ção somática, transfecção, transdução ou outro mecanismo ou materi- al genético presente anteriormente é alterado ou removido, por exem- plo, por mutação por substituição ou deleção, ou por protocolos de acoplamento). Como é a prática comum e é entendido por aqueles na técnica, progênie de um polinucleotídeo ou célula geneticamente modi- ficados tipicamente ainda é chamada de "geneticamente modificada" embora a manipulação real tenha sido realizada em uma entidade an- terior.
[0057] Gene: Como usado no presente documento, o termo "gene" se refere a uma sequência de DNA que codifica para um produto (por exemplo, um produto de RNA e/ou um produto de polipeptídeo). Em algumas modalidades, um gene inclui sequência de codificação (isto é, sequência que codifica um produto particular); em algumas modalida- des, um gene inclui sequência de não codificação. Em algumas moda- lidades particulares, um gene pode incluir sequências tanto de codifi- cação (por exemplo, exônicas) quanto de não codificação (por exem- plo, intrônicas). Em algumas modalidades, um gene pode incluir um ou mais elementos reguladores que, por exemplo, podem controlar ou impactar um ou mais aspectos de expressão genética (por exemplo, um promotor). Um gene pode ser endógeno ou não endógeno em um contexto particular, por exemplo, uma célula. Um gene pode ser um transgene.
[0058] Produto genético ou Produto de expressão: Como usado no presente documento, o termo "produto genético" ou "Produto de ex- pressão" geralmente se refere a um RNA transcrito a partir do gene (pré- e/ou pós-processamento) ou um polipeptídeo (pré- e/ou pós- modificação) codificado por um RNA transcrito a partir do gene.
[0059] "Aprimorar", "aumentar", "inibir" ou "reduzir": Como usado no presente documento, os termos "aprimorar", "aumentar", "inibir", "reduzir" ou equivalentes gramaticais dos mesmos, indicam valores que são relativos a uma linha de base ou outra medição de referência. Em algumas modalidades, uma medição de referência apropriada po- de ser ou incluir uma medição em um sistema particular (por exemplo, em um indivíduo único) sob condições de outro modo, comparáveis ausência de (por exemplo, antes de e/ou após) um agente ou trata- mento particular, ou na presença de um agente de referência compa- rável apropriado. Em algumas modalidades, uma medição de referên- cia apropriada pode ser ou incluir uma medição no sistema compará-
vel conhecido ou que se espera que responda de uma forma particu- lar, na presença do agente ou tratamento relevante.
[0060] Ácido nucleico: Como usado no presente documento, em seu sentido mais amplo, "ácido nucleico" se refere a qualquer compos- to e/ou substância que é ou pode ser incorporada em uma cadeia oli- gonucleotídica. Em algumas modalidades, um ácido nucleico é um composto e/ou substância que é ou pode ser incorporada a uma ca- deia oligonucleotídica por meio de uma ligação de fosfodiéster. Como será claro a partir do contexto, em algumas modalidades, "ácido nu- cleico" se refere a um resíduo de ácido nucleico individual (por exem- plo, um nucleotídeo e/ou nucleosídeo); em algumas modalidades, "ácido nucleico" se refere a uma cadeia oligonucleotídica incluindo re- síduos de ácido nucleico individuais. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é ou inclui RNA; em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é ou inclui DNA. Em algumas modalidades, um ácido nuclei- co é, inclui ou consiste em um ou mais resíduos de ácido nucleico na- turais. Em algumas modalidades, um ácido nucleico é, inclui, ou con- siste em um ou mais análogos de ácido nucleico. Em algumas modali- dades, um análogo de ácido nucleico difere de um ácido nucleico no sentido de que não utiliza uma cadeia principal de fosfodiéster. Por exemplo, em algumas modalidades, um ácido nucleico é, inclui ou consiste em um ou mais "ácidos nucleicos de peptídeo", que são co- nhecidos na técnica e têm ligações de peptídeo em vez de ligações de fosfodiéster na cadeia principal, são considerados dentro do escopo da presente divulgação. Alternativa ou adicionalmente, em algumas mo- dalidades, um ácido nucleico tem uma ou mais ligações de fosforotioa- to e/ou 5'-N-fosforoamidita em vez de ligações de fosfodiéster. Em al- gumas modalidades, um ácido nucleico é, inclui, ou consiste em um ou mais nucleosídeos naturais (por exemplo, adenosina, timidina, guano- sina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxi guano-
sina e desoxicitidina). Em algumas modalidades, um ácido nucleico é, inclui, ou consiste em um ou mais análogos de nucleosídeo (por exemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3- metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-iodouridina, Co5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoade- nosina, 7-desaza-adenosina, 7-desazaguanosina, 8-0xoadenosina, 8- oxoguanosina, 0(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas e combinações das mesmas). Em algumas modalidades, um ácido nucleico inclui um ou mais açúcares modificados (por exem- plo, 2'-fluororribose, ribose, 2'-desoxirribose, arabinose e hexose) em comparação com aqueles em ácidos nucleicos naturais.
Em algumas modalidades, um ácido nucleico tem uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto genético funcional como um RNA ou proteína.
Em algumas modalidades, um ácido nucleico inclui um ou mais ín- trons.
Em algumas modalidades, ácidos nucleicos são preparados por um ou mais dentre isolamento de uma fonte natural, síntese enzimáti- ca por polimerização com base em um modelo complementar (in vivo ou in vitro), reprodução em uma célula ou sistema recombinante e sín- tese química.
Em algumas modalidades, um ácido nucleico tem pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ou mais resíduos de comprimento.
Em algumas modalidades, um ácido nucleico é parcial ou totalmente de filamento único; em algumas modalidades, um ácido nucleico é parcial ou totalmente de filamento du- plo.
Em algumas modalidades, um ácido nucleico tem uma sequência de nucleotídeos incluindo pelo menos um elemento que codifica, ou é o complemento de uma sequência que codifica um polipeptídeo.
Em al-
gumas modalidades, um ácido nucleico tem atividade enzimática.
[0061] Ligado operacionalmente: Como usado no presente docu- mento, "ligado operacionalmente" se refere a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação permitindo que funcionem de sua maneira pretendida. Por exemplo, a elemento de controle "ligado operacionalmente" a um elemento funcional é associ- ado de tal modo que a expressão e/ou atividade do elemento funcional seja alcançada sob condições compatíveis com o elemento de contro- le. Em algumas modalidades, elementos de controle "ligados operaci- onalmente" são contíguos (por exemplo, ligados covalentemente) com os elementos de codificação de interesse; em algumas modalidades, os elementos de controle atuam em trans a ou de outro modo em a do elemento funcional de interesse.
[0062] Composição farmacêutica: Como usado no presente docu- mento, o termo "composição farmacêutica" se refere a uma composi- ção em que um agente ativo é formulado junto com um ou mais carre- adores farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, o agente ativo está presente em quantidade de dose unitária apropriada para administração em um regime terapêutico que mostra uma proba- bilidade estatisticamente significativa de alcançar um efeito terapêutico predeterminado quando administrado a uma população relevante. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode ser espe- cialmente formulada para administração em forma sólida ou líquida, incluindo aquelas adaptadas para o seguinte: administração oral, por exemplo, pulverizações (soluções ou suspensões aquosas ou não aquosas), comprimidos, por exemplo, aqueles alvejados para absor- ção bucal, sublingual e sistêmica, bolos, pós, granules, pastas para aplicação à língua; administração parenteral, por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural como, por exem- plo, uma solução ou suspensão estéril ou formulação de liberação sus-
tentada; aplicação tópica, por exemplo, como um creme, pomada ou um emplastro de liberação controlada ou aspersão aplicada à pele, pulmões ou cavidade oral; de modo intravaginal ou intrarretal, por exemplo, como um pessário, creme ou espuma; de modo sublingual; de modo ocular; de modo transdérmico; ou de modo nasal, de modo pulmonar, e a outras superfícies mucosais.
[0063] Polipeptídeo: Como usado no presente documento, "poli- peptídeo" se refere a qualquer cadeia polimérica de aminoácidos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo tem uma sequência de amino- ácidos que ocorre na natureza. Em algumas modalidades, um polipep- tídeo tem uma sequência de aminoácidos que não ocorre na natureza. Em algumas modalidades, um polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos que é geneticamente modificada no sentido de que é de- signada e/ou produzida através da ação da mão do homem. Em algu- mas modalidades, um polipeptídeo pode incluir ou consistir em amino- ácidos naturais, aminoácidos não naturais ou ambos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode incluir ou consistir em apenas aminoácidos naturais ou apenas aminoácidos não naturais. Em algu- mas modalidades, um polipeptídeo pode incluir D-aminoácidos, L- aminoácidos ou ambos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode incluir apenas D-aminoácidos. Em algumas modalidades, um po- lipeptídeo pode incluir apenas L-aminoácidos. Em algumas modalida- des, um polipeptídeo pode incluir um ou mais grupos pendentes ou outras modificações, por exemplo, modificando ou fixados a uma ou mais cadeias laterais de aminoácido, na terminação N do polipeptídeo, na terminação C do polipeptídeo, ou qualquer combinação das mes- mas. Em algumas modalidades, tais grupos pendentes ou modifica- ções podem ser selecionados a partir do grupo consistindo em acetila- ção, amidação, lipidação, metilação, fosforilação, glicosilação, glica- ção, sulfação, manosilação, nitrossilação, acilação, palmitoilação, pre-
nilação, peguilação, etc., incluindo combinações das mesmas.
Em al- gumas modalidades, um polipeptídeo pode ser cíclico e/ou pode incluir uma porção cíclica.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo não é cíclico e/ou não inclui nenhuma porção cíclica.
Em algumas modalida- des, um polipeptídeo é linear.
Em algumas modalidades, um polipeptí- deo pode ser ou incluir um polipeptídeo grampeado.
Em algumas mo- dalidades, o termo "polipeptídeo" pode ser anexado a um nome de um polipeptídeo, atividade ou estrutura de referência; em tais ocorrências, é usado no presente documento para se referir a polipeptídeos que compartilham a atividade ou estrutura relevante e, portanto, podem ser considerados como sendo membros da mesma classe ou família de polipeptídeos.
Para cada uma de tais classes, o presente relatório descritivo fornece e/ou aqueles versados na técnica estarão cientes de polipeptídeos exemplificativos dentro da classe cujos sequências de aminoácido e/ou funções são conhecidas; em algumas modalidades, tais polipeptídeos exemplificativos são polipeptídeos de referência pa- ra a classe ou família de polipeptídeo.
Em algumas modalidades, um membro de uma classe ou família de polipeptídeo mostra similaridade de sequência significativa (por exemplo, homologia) ou identidade com, compartilha um motivo de sequência comum (por exemplo, um elemento de sequência de característica) com e/ou compartilha uma atividade comum (em algumas modalidades em um nível comparável ou dentro de uma faixa designada) com um polipeptídeo de referência da classe; em algumas modalidades, com todos os polipeptídeos den- tro da classe). Por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptí- deo membro mostra um grau geral de similaridade de sequência (por exemplo, homologia) ou identidade com um polipeptídeo de referência que é pelo menos cerca de 30-40%, e é frequentemente maior que cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais e/ou inclui pelo menos uma região (por exemplo, uma região conservada que pode, em algumas modalidades, ser ou incluir um elemento de sequência de característica) que mostra identidade de sequência muito alta, frequentemente maior que 90% ou até mesmo 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Tal região conservada ge- ralmente engloba pelo menos 3-4 e frequentemente até 20 ou mais aminoácidos; em algumas modalidades, uma região conservada en- globa pelo menos um trecho de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos. Em algumas moda- lidades, um polipeptídeo útil pode incluir ou consistir em um fragmento de um polipeptídeo parental. Em algumas modalidades, um polipeptí- deo útil pode incluir ou consistir em uma pluralidade de fragmentos, cada um dos quais é encontrado no mesmo polipeptídeo parental em uma disposição espacial diferente em relação um ao outro do que é encontrado no polipeptídeo de interesse (por exemplo, fragmentos que são diretamente ligados no parental podem ser espacialmente separa- dos no polipeptídeo de interesse ou vice-versa e/ou fragmentos podem estar presentes em uma ordem diferente no polipeptídeo de interesse do que no parental), de modo que o polipeptídeo de interesse seja um derivado de seu polipeptídeo parental.
[0064] Prevenir ou prevenção: Como usado no presente documen- to, "prevenir" ou "prevenção", quando usado em conexão com a ocor- rência de uma doença, distúrbio e/ou afecção, se refere a reduzir o risco de desenvolver a doença, distúrbio e/ou afecção e/ou a retardar o início de uma ou mais características ou sintomas da doença, distúrbio ou afecção. A prevenção pode ser considerada completa quando o início de uma doença, distúrbio ou afecção tiver sido retardado por um período de tempo predefinido.
[0065] Promotor: Como usado no presente documento, um "pro- motor" ou "sequência promotora" pode ser uma região reguladora de DNA que participa direta ou indiretamente (por exemplo, através de proteínas ou substâncias ligadas ao promotor) na iniciação e/ou pro- cessividade de transcrição de uma sequência de codificação.
Um pro- motor pode, sob condições adequadas, iniciar a transcrição de uma sequência de codificação mediante a ligação de um ou mais fatores de transcrição e/ou porções químicas reguladoras com o promotor.
Um promotor que participa da iniciação de transcrição de uma sequência de codificação pode ser "ligado operacionalmente" à sequência de co- dificação.
Em certas ocorrências, um promotor pode ser ou incluir uma região reguladora de DNA que se estende a partir de um sítio de inici- ação de transcrição (em sua terminação 3') a uma posição a montante (direção 5'), de modo que a sequência assim designada inclua um ou ambos dentre um número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar um evento de transcrição.
Um promotor pode ser, incluir ou ser operacionalmente associado a ou ligado operacionalmente a se- quências de controle de expressão como sequências aprimoradoras e repressoras.
Em algumas modalidades, um promotor pode ser induzí- vel.
Em algumas modalidades, um promotor pode ser um promotor constitutivo.
Em algumas modalidades, um promotor condicional (por exemplo, induzível) pode ser unidirecional ou bidirecional.
Um promo- tor pode ser ou incluir uma sequência idêntica a uma sequência co- nhecida por ocorrer no genoma de espécies particulares.
Em algumas modalidades, um promotor pode ser ou incluir um promotor híbrido, em que uma sequência contendo uma região reguladora transcricional po- de ser obtida a partir de uma fonte e uma sequência contendo uma região de iniciação de transcrição pode ser obtida a partir da uma se- gunda fonte.
Sistemas para ligar elementos de controle à sequência de codificação dentro de um transgene são bem-conhecidos na técnica (técnicas de DNA recombinante e biológico molecular gerais são des- critas em Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning: A Labora- tory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, 1989).
[0066] Recombinante: Como usado no presente documento, "re- combinante" se destina a fazer referência a polipeptídeos que são pro- jetados, geneticamente modificados, preparados, expressos, criados, fabricados e/ou isolados por meios recombinantes, como polipeptídeos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira; polipeptídeos isolados de uma biblioteca de polipeptídeos humanos combinatórios recombinantes; polipeptídeos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo, coelho, ovelha, peixe, etc.) que é transgênico para ou, de outro modo, foi manipulado para expressar um gene ou genes, ou componentes de gene que codi- ficam e/ou direcionam a expressão do polipeptídeo ou um ou mais componentes, porções, elementos ou domínios do mesmo; e/ou poli- peptídeos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem splicing ou ligação de elementos de se- quência de ácidos nucleicos selecionados um ao outro, sintetizar qui- micamente elementos de sequência selecionados e/ou, de outro mo- do, gerar um ácido nucleico que codifica e/ou direciona a expressão do polipeptídeo ou um ou mais componentes, porções, elementos ou do- mínios do mesmo. Em algumas modalidades, um ou mais de tais ele- mentos de sequência selecionados é encontrado na natureza. Em al- gumas modalidades, um ou mais de tais elementos de sequência se- lecionados é projetado in silico. Em algumas modalidades, um ou mais de tais elementos de sequência selecionados resulta de mutagênese (por exemplo, in vivo ou in vitro) de um elemento de sequência conhe- cido, por exemplo, de uma fonte natural ou sintética como, por exem- plo, na linha germinativa de um organismo-fonte de interesse (por exemplo, de um ser humano, um camundongo, etc.).
[0067] Referência: Como usado no presente documento, descreve um padrão ou controle em relação ao qual uma comparação é realiza-
da. Por exemplo, em algumas modalidades, um agente, animal, indiví- duo, população, amostra, sequência ou valor de interesse é compara- do com um agente, animal, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de referência ou controle. Em algumas modalidades, uma re- ferência ou controle é testado e/ou determinado de modo substancial- mente simultâneo com o teste ou determinação de interesse. Em al- gumas modalidades, uma referência ou controle é uma referência ou controle histórico, opcionalmente incorporado em um meio tangível. Tipicamente, como seria entendido por aqueles versados na técnica, uma referência ou controle é determinado ou caracterizado sob condi- ções ou circunstâncias comparáveis com aquele sob avaliação. Aque- les versados na técnica observarão quando similaridades suficientes estiverem presentes para justificar dependência de e/ou comparação com uma referência ou controle possível particular.
[0068] Indivíduo: Como usado no presente documento, o termo "indivíduo" se refere a um organismo, tipicamente um mamífero (por exemplo, um ser humano, em algumas modalidades incluindo formas humanas pré-natais). Em algumas modalidades, um indivíduo está so- frendo com uma doença, distúrbio ou afecção relevante. Em algumas modalidades, um indivíduo é suscetível a uma doença, distúrbio ou afecção. Em algumas modalidades, um indivíduo exibe um ou mais sintomas ou características de uma doença, distúrbio ou afecção. Em algumas modalidades, um indivíduo não exibe nenhum sintoma ou ca- racterística de uma doença, distúrbio ou afecção. Em algumas modali- dades, um indivíduo é alguém com um ou mais recursos característi- cos de suscetibilidade a ou risco de uma doença, distúrbio ou afecção. Em algumas modalidades, um indivíduo é um paciente. Em algumas modalidades, um indivíduo é um indivíduo a qual o diagnóstico e/ou terapia é e/ou foi administrado.
[0069] Similaridade de sequência substancial: A frase "similaridade de sequência substancial" é usada no presente documento para se referir a uma comparação entre sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos.
Como será observado por aqueles de habilidade comum na técnica, duas sequências são geralmente consideradas como sendo "substancialmente similares" se contiverem uma substituição de ami- noácido conservadora em posições correspondentes.
Uma substitui- ção conservadora é uma em que um aminoácido foi substituído por um resíduo não idêntico tendo adequadamente características estruturais e/ou funcionais similares.
Por exemplo, como é bem-conhecido por aqueles de habilidade comum na técnica, certos aminoácidos são tipi- camente classificados como aminoácidos "hidrofóbicos" ou "hidrofíli- cos" e/ou como tendo cadeias laterais "polares" ou "não polares". Substituição de um aminoácido por outro do mesmo tipo pode ser fre- quentemente considerada uma substituição conservadora.
Categoriza- ções de aminoácido típicas são resumidas nas Tabelas 1 e 2 abaixo: TABELA 1
PoE Eee e E pm ss pe ee esse ls po fe ee es ss E fe ee 5 sem e e ee ee 5 pe e o fes ee e pe fe fes es e Bm e Eee ee e E e e eee ee es TABELA 2 Asparagina ou ácido aspártico | ax | e | Glutamina ou ácido glutâmico Aminoácido não especificado ou desco- Xaa x nhecido
[0070] Como é bem conhecido na técnica, sequências de aminoá- cidos ou ácidos nucleicos podem ser comparadas usando qualquer uma dentre uma variedade de algoritmos, incluindo aqueles disponí- veis em programas de computador comerciais como BLASTN para se- quências de nucleotídeo e BLASTP, BLAST com vão e PSI-BLAST para sequências de aminoácido. Tais programas exemplificativos são descritos em Altschul, et a/., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al/., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et a/l., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analy- sis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; e Misener, et a/., (eds.), Bioin-
formatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Além de identificar sequências similares, os programas mencionados acima tipicamente fornecem uma indica- ção do grau de similaridade. Em algumas modalidades, duas sequên- cias são consideradas como sendo substancialmente similares se pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pe- lo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pe- lo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pe- lo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pe- lo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de seus resíduos correspon- dentes forem similares e/ou idênticos por um trecho relevante de resí- duos. Em algumas modalidades, o trecho relevante é uma sequência completa. Em algumas modalidades, o trecho relevante consiste em pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 55, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70, pelo menos 75, pelo menos 80, pelo menos 85, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, pelo menos 300, pelo menos 325, pelo menos 350, pelo menos 375, pelo menos 400, pelo menos 425, pelo menos 450, pelo menos 475, pelo menos 500 ou mais resíduos. Como seria observado por alguém de habilidade comum na técnica, sequências com similaridade de se- quência substancial podem ser homólogas uma da outra.
[0071] Identidade de sequência substancial: Como usado no pre- sente documento, a frase "identidade de sequência substancial" se re- fere a uma comparação entre sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos. Como será observado por aqueles de habilidade comum na técnica, duas sequências são geralmente consideradas como sendo "substancialmente idênticas" se contiverem resíduos idênticos em po-
sições correspondentes. Como é bem conhecido na técnica, sequên- cias de aminoácidos ou ácidos nucleicos podem ser comparadas usando qualquer uma dentre uma variedade de algoritmos, incluindo aqueles disponíveis em programas de computador comerciais como BLASTN para sequências de nucleotídeo e BLASTP, BLAST com vão e PSI-BLAST para sequências de aminoácido. Tais programas exem- plificativos são descritos em Altschul et a/l., Basic local alignment se- arch tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul et a/., Methods in Enzymology; Altschul et a/., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; e Misener, et a/, (eds.), Bioinformat- ics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Além de identificar sequências idênticas, os programas mencionados acima tipicamente fornecem uma indicação do grau de identidade. Em algumas modalidades, duas sequências são consideradas como sendo substancialmente idênticas se pelo me- nos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de seus resíduos cor- respondentes forem idênticos por um trecho relevante de resíduos. Em algumas modalidades, o trecho relevante é uma sequência completa. Em algumas modalidades, o trecho relevante consiste em pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ou mais resíduos.
[0072] Agente terapêutico: Como usado no presente documento, a frase "agente terapêutico" em geral se refere a qualquer agente que confira um efeito farmacológico desejado quando administrado a um organismo. Em algumas modalidades, um agente é considerado como sendo um agente terapêutico se demonstrar um efeito significativo es- tatisticamente através de uma população apropriada. Em algumas modalidades, a população apropriada pode ser uma população de or- ganismos modelos. Em algumas modalidades, uma população apro- priada pode ser definida por vários critérios, como um certo grupo de idade, gênero, fundamentos genéticos, afecções clínicas pré- existentes, etc. Em algumas modalidades, um agente terapêutico é uma substância que pode ser usada para aliviar, melhorar, atenuar, inibir, prevenir, retardar o início de, reduzir a gravidade de e/ou reduzir a incidência de um ou mais sintomas ou recursos de uma doença, dis- túrbio e/ou afecção. Em algumas modalidades, um "agente terapêuti- co" é um agente que foi ou precisa ser aprovado por uma agência go- vernamental antes de poder ser comercializado para administração a seres humanos. Em algumas modalidades, um "agente terapêutico" é um agente para o qual uma prescrição médica é necessária para ad- ministração a seres humanos.
[0073] Regime terapêutico: Um "regime terapêutico", como tal ter- mo é usado no presente documento, se refere a um regime de dosa- gem cuja administração através de uma população relevante pode ser correlacionada com um resultado terapêutico desejado ou benéfico.
[0074] Quantidade terapeuticamente eficaz: Como usado no pre- sente documento, significa uma quantidade que produz o efeito dese- jado para o qual é administrada. Em algumas modalidades, o termo se refere a uma quantidade que é suficiente, quando administrada a uma população sofrendo com ou suscetível a uma doença, distúrbio e/ou afecção de acordo com um regime de dosagem terapêutico, para tratar a doença, distúrbio e/ou afecção. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é a que reduz a incidência e/ou gravidade e/ou atrasa o início de um ou mais sintomas da doença, dis- túrbio e/ou afecção. Aqueles versados na técnica apreciarão que o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" não requer, de fato, que um tratamento bem-sucedido seja alcançado em um indivíduo em par-
ticular. Em vez disso, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser aquela quantidade que fornece uma determinada resposta farma- cológica desejada em um número significativo de indivíduos quando administrada a pacientes em necessidade de tal tratamento. Em algu- mas modalidades, a referência a uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma referência a uma quantidade medida em um ou mais tecidos específicos (por exemplo, um tecido afetado pela doença, distúrbio ou afecção) ou fluidos (por exemplo, sangue, saliva, soro, su- or, lágrimas, urina, etc.). As pessoas de habilidade comum na técnica compreenderão que, em algumas modalidades, uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um agente ou terapia em particular pode ser formulada e/ou administrada em uma dose única. Em algumas modali- dades, um agente terapeuticamente eficaz pode ser formulado e/ou administrado em uma pluralidade de doses, por exemplo, como parte de um regime de dosagem.
[0075] Tratamento: Conforme usado aqui, o termo "tratamento" (também "tratar" ou "tratando") se refere a qualquer administração de uma terapia que alivia parcial ou completamente, melhora, alivia, inibe, retarda o início de, reduz a gravidade e/ou reduz a incidência de um ou mais sintomas, características e/ou causas de uma determinada doen- ça, distúrbio e/ou afecção. Em algumas modalidades, tal tratamento pode ser de um indivíduo que não exibe sinais da doença, distúrbio e/ou afecção relevante e/ou de um indivíduo que exibe apenas sinais precoces da doença, distúrbio e/ou afecção. Alternativa ou adicional- mente, esse tratamento pode ser de um indivíduo que apresenta um ou mais sinais estabelecidos da doença em causa, distúrbio e/ou afec- ção. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser de um indivíduo que foi diagnosticado como sofrendo da doença, distúrbio e/ou afec- ção relevante. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser de um indivíduo que se sabe que tem um ou mais fatores de suscetibilidade que são estatisticamente correlacionados com risco aumentado de de- senvolvimento da doença, distúrbio e/ou afecção relevante.
[0076] Variante: Como usado no presente documento no contexto de moléculas, por exemplo, ácidos nucleicos, proteínas ou moléculas pequenas, o termo "variante" se refere a uma molécula que mostra identidade estrutural significativa com uma molécula de referência, mas difere estruturalmente da molécula de referência, por exemplo, na presença ou ausência ou no nível de uma ou mais porções químicas em comparação com a entidade de referência. Em algumas modalida- des, uma variante também difere funcionalmente de sua molécula de referência. Em geral, a possibilidade de a molécula particular ser apro- priadamente considerada como uma "variante" de uma molécula de referência é baseada em seu grau de identidade estrutural com a mo- lécula de referência. Como será observado por aqueles versados na técnica, qualquer molécula de referência biológica ou química tem cer- tos elementos estruturais característicos. Uma variante, por definição, é uma molécula distinta que compartilha um ou mais de tais elementos estruturais característicos, mas difere em pelo menos um aspecto da molécula de referência. Para fornecer apenas alguns exemplos, um polipeptídeo pode ter um elemento de sequência característico incluí- do em uma pluralidade de aminoácidos tendo posições designadas em relação um ao outro em espaço linear ou tridimensional e/ou contribu- indo para um motivo estrutural particular e/ou função biológica; um ácido nucleico pode ter um elemento de sequência de característica incluindo uma pluralidade de resíduos de nucleotídeo tendo posições designadas em relação um ao outro em espaço linear ou tridimensio- nal. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico vari- ante pode diferir de um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência como um resultado de uma ou mais diferenças em sequência de ami- noácidos ou nucleotídeos e/ou uma ou mais diferenças em porções químicas (por exemplo, carboidratos, lipídios, grupos fosfato) que são covalentemente componentes do polipeptídeo ou ácido nucleico (por exemplo, que são fixados à cadeia principal de polipeptídeo ou ácido nucleico). Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nuclei- co variante mostra uma identidade de sequência geral com uma se- quência de aminoácidos ou nucleotídeos que é de pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 99%. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante não compartilha pelo menos um elemento de sequência de característica com um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico de refe- rência tem uma ou mais atividades biológicas.
Em algumas modalida- des, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante compartilha uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo ou ácido nucleico de referência.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nu- cleico variante é desprovido de uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo ou ácido nucleico de referência.
Em algumas modali- dades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante mostra um nível re- duzido de uma ou mais atividades biológicas em comparação com o polipeptídeo ou ácido nucleico de referência.
Em algumas modalida- des, um polipeptídeo ou ácido nucleico de interesse é considerado como sendo uma "variante" de um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência, se o mesmo tiver uma sequência de aminoácidos ou nucle- otídeos que é idêntica àquela da referência, exceto por um número pequeno de alterações de sequência em posições particulares.
Tipi- camente, menos de cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 9%, cerca de 8%, cerca de 7%, cerca de 6%, cerca de 5%, cerca de 4%, cerca de 3% ou cerca de 2% dos resíduos em uma variante são substituídos, inseridos ou deletados, em comparação com a refe- rência.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante inclui cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2 ou cerca de 1 re- síduos substituídos em comparação com uma referência. Frequente- mente, um polipeptídeo ou ácido nucleico variante inclui um número muito pequeno (por exemplo, menos de cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2 ou cerca de 1) de resíduos substituídos, inseridos ou deletados, resíduos funcionais (isto é, resíduos que participam de uma atividade biológica particular) em relação à referência. Em algumas modalidades, a polipeptídeo ou ácido nucleico variante inclui não mais de cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2, ou cerca de 1 adição ou deleção, e, em algumas modalidades, não inclui nenhuma adição ou deleções, em comparação à referência. Em algumas modalidades, a polipeptídeo ou ácido nucleico variante inclui menos que cerca de 25, cerca de 20, cerca de 19, cerca de 18, cerca de 17, cerca de 16, cerca de 15, cerca de 14, cerca de 13, cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, e comumente menos que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, ou cerca de 2 adições ou deleções em compa- ração à referência. Em algumas modalidades, a polipeptídeo ou ácido nucleico de referência é encontrado na natureza. Em algumas modali- dades, um polipeptídeo ou ácido nucleico de referência é um polipep- tídeo ou ácido nucleico humanos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0077] A Figura 1 inclui o painel A e o painel B. O painel A é uma apresentação esquemática de como uma proteína de núcleo de mini- nucleossoma modificada com PEG12, mostrada no Painel B, em um resíduo de lisina pode sofrer uma reação de condensação com uma molécula de DNA para produzir uma mininucleossoma carregada. Ca- da molécula de ácido nucleico pode exigir várias (1 a 1000) proteínas do núcleo de mininucleossoma para neutralizar as cargas negativas no DNA para formar uma mininucleossoma carregada. O esquema é ape-
nas um diagrama de desenho e não pretende ser representativo da estrutura real dos mininucleossomas carregadas, exceto na medida em que as mininucleossomas carregadas incluem ácidos nucleicos associados às proteínas do núcleo.
[0078] A Figura 2 é um gráfico que mostra os dados obtidos a par- tir de análises de espectrometria de massa após a formulação da pro- teína do núcleo da mininucleossoma modificada com PEG12 no pri- meiro resíduo de lisina na sequência.
[0079] A Figura 3 é uma apresentação esquemática de como uma proteína de núcleo de mininucleossoma modificada com PEG de 1 kDa em um resíduo de lisina pode sofrer uma reação de condensação com uma molécula de DNA para produzir uma mininucleossoma car- regada. A Figura 3 inclui o painel A e o painel B. O painel A é uma apresentação esquemática de como uma proteína de núcleo de mini- nucleossoma modificada com PEG de 1 kDa, mostrada no painel B, em um resíduo de lisina pode ser submetida a uma reação de conden- sação com uma molécula de DNA para produzir uma mininucleossoma carregada. Cada molécula de ácido nucleico pode exigir várias (1 a 1000) proteínas do núcleo de mininucleossoma para neutralizar as cargas negativas no DNA para formar uma mininucleossoma carrega- da. O esquema é apenas um diagrama de desenho e não pretende ser representativo da estrutura real das mininucleossomas carregadas, exceto na medida em que as mininucleossomas carregadas incluem ácidos nucleicos associados às proteínas do núcleo.
[0080] A Figura 4 inclui o painel A e o painel B. O painel A é uma apresentação esquemática de como uma proteína de núcleo de mini- nucleossoma modificada com PEG de 2 kDa, mostrada no painel B, em um resíduo de lisina pode ser submetida a uma reação de conden- sação com uma molécula de DNA para produzir uma mininucleossoma carregada. Cada molécula de ácido nucleico pode exigir várias (1 a
1000) proteínas do núcleo de mininucleossoma para neutralizar as cargas negativas no DNA para formar uma mininucleossoma carrega- da. O esquema é apenas um diagrama de desenho e não pretende ser representativo da estrutura real das mininucleossomas carregadas, exceto na medida em que as mininucleossomas carregadas incluem ácidos nucleicos associados às proteínas do núcleo.
[0081] A Figura 5 inclui o painel A e o painel B. O painel A é uma apresentação esquemática de como uma proteína de núcleo de mini- nucleossoma modificada com PEG de 5 kDa, mostrada no painel B, em um resíduo de lisina pode ser submetida a uma reação de conden- sação com uma molécula de DNA para produzir uma mininucleossoma carregada. Cada molécula de ácido nucleico pode exigir várias (1 a 1000) proteínas do núcleo de mininucleossoma para neutralizar as cargas negativas no DNA para formar uma mininucleossoma carrega- da. O esquema é apenas um diagrama de desenho e não pretende ser representativo da estrutura real das mininucleossomas carregadas, exceto na medida em que as mininucleossomas carregadas incluem ácidos nucleicos associados às proteínas do núcleo.
[0082] A Figura 6 inclui o painel A e o painel B. O painel A é uma apresentação esquemática de como uma proteína de núcleo de mini- nucleossoma modificada com PEG de 10 kDa, mostrada no painel B, em um resíduo de lisina pode ser submetida a uma reação de conden- sação com uma molécula de DNA para produzir uma mininucleossoma carregada. Cada molécula de ácido nucleico pode exigir várias (1 a 1000) proteínas do núcleo de mininucleossoma para neutralizar as cargas negativas no DNA para formar uma mininucleossoma carrega- da. O esquema é apenas um diagrama de desenho e não pretende ser representativo da estrutura real das mininucleossomas carregadas, exceto na medida em que as mininucleossomas carregadas incluem ácidos nucleicos associados às proteínas do núcleo.
[0083] A Figura 7 é um conjunto de imagens que inclui os painéis A, Be C, cada um dos quais apresenta uma imagem da Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) de mininucleossomas carregadas.
[0084] A Figura 8 é um gráfico que mostra a concentração da pro- teína Fator 8 expressa medida por Elisa.
[0085] A Figura 9 é um conjunto de imagens incluindo os painéis A, B e C, cada um dos quais é uma imagem de microscopia fluores- cente que ilustra a expressão gênica no tecido do fígado de proteínas codificadas por ácidos nucleicos presentes em mininucleossomas car- regadas.
[0086] A Figura 10 é um conjunto de imagens incluindo os painéis A, B, Ce D, cada um dos quais é uma imagem de microscopia fluores- cente que ilustra a expressão gênica em tecido de EPR de camundon- gos de proteínas codificadas por ácidos nucleicos presentes em mini- nucleossomas carregadas. O painel A é uma seção retinal que de- monstra expressão específica de EPR. Os painéis B são uma monta- gem completa de EPR que demonstra a expressão específica de EPR. Os painéis B e D representam amostras de controle não tratadas de uma seção de retina e montagem completa EPR, respectivamente.
[0087] A Figura 11 é um conjunto de imagens incluindo os painéis A, B, Ce D, cada um dos quais é uma imagem de microscopia fluores- cente que ilustra a expressão gênica em tecido de retinal de rato de proteínas codificadas por ácidos nucleicos presentes em mininucleos- somas carregadas. Os painéis A e C são seções retinais que demons- tram a expressão específica de EPR e os painéis B e D apresentam amostras de controle injetadas com plasmídeo.
[0088] A Figura 12 é um conjunto de imagens incluindo os painéis A, B, Ce D, cada um dos quais é uma imagem de microscopia fluores- cente que ilustra a expressão gênica em tecido retinal de camundon- gos de proteínas codificadas por ácidos nucleicos presentes em mini-
nucleossomas carregadas. O painel A é uma seção da retina que de- monstra a expressão de GFP em neurônios da retina. O painel C é uma montagem retinal inteira que demonstra a expressão de GFP em fotorreceptores retinais. Os painéis B e D representam amostras de controle não tratadas de uma seção de retina e montagem completa EPR, respectivamente.
[0089] A Figura 13 é um conjunto de imagens incluindo os painéis A, B e C, cada um dos quais é uma imagem de microscopia fluores- cente que ilustra a expressão gênica no pulmão de camundongos de proteínas codificadas por ácidos nucleicos presentes em mininucleos- somas carregadas. O painel A demonstra a expressão de GFP em al- véolos e bronquíolos. O painel B demonstra a coloração CFTR. O pai- nel C é uma fusão para os painéis A e B demonstrando a colocaliza- ção da coloração GFP e CFTR.
[0090] A Figura 14 é um conjunto de imagens incluindo os painéis A, B e C, cada um dos quais é uma imagem de microscopia fluores- cente em ampliação superior que ilustra a expressão gênica no epitélio do pulmão de camundongos de proteínas codificadas por ácidos nu- cleicos presentes em mininucleossomas carregadas. O painel A de- monstra a expressão de GFP em alvéolos e bronquíolos. O painel B demonstra a coloração CFTR. O painel C é uma fusão para os painéis A e B demonstrando a colocalização da coloração GFP e CFTR inclu- indo DAPI.
[0091] A Figura 15 é um conjunto de imagens que ilustra a expres- são gênica em todo o tecido pulmonar de camundongos de proteínas codificadas por ácidos nucleicos presentes em mininucleossomas car- regadas.
[0092] A Figura 16 é um conjunto de imagens incluindo os painéis A, B & C que ilustra a expressão gênica no tecido do cérebro, intestino e pâncreas de camundongos de proteínas codificadas por ácidos nu-
cleicos presentes em mininucleossomas carregadas. O painel A de- monstra o padrão de expressão em neurônios olfatórios. O painel B e sua inserção abaixo demonstram o padrão de expressão no intestino delgado. O painel C e sua inserção abaixo demonstram o padrão de expressão no pâncreas.
[0093] A Figura 17 é um conjunto de imagens incluindo os painéis A, B & C que ilustra a expressão gênica no tecido traqueal de camun- dongos de proteínas codificadas por ácidos nucleicos presentes em mininucleossomas carregadas. O painel A demonstra a expressão de GFP no epitélio traqueal e no músculo traqueal interno. O painel B demonstra o padrão de coloração da distrofina na expressão no mús- culo traqueal interno e externo. O painel C é uma fusão dos painéis À e B que demonstra a colocalização do padrão de coloração da distrofi- na com GFP nas células musculares traqueais internas.
[0094] A Figura 18 é um conjunto de imagens incluindo os painéis A, B & C que ilustra a expressão gênica no tecido muscular de camun- dongos de proteínas codificadas por ácidos nucleicos presentes em mininucleossomas carregadas. O painel A demonstra a expressão de GFP em células musculares de camundongo. O painel B demonstra o padrão de coloração de distrofina na expressão em células musculares de camundongo. O painel C é uma fusão dos painéis A e B que de- monstra a colocalização do padrão de coloração da distrofina com GFP nas células musculares de camundongo.
[0095] A Figura 19 é um gráfico que mostra o aumento na concen- tração da proteína Fator 8 expressa conforme medido por Elisa após uma primeira dose e uma segunda dose, sugerindo falta de efeito neu- tralizante ou em outras palavras, falta de atividade de anticorpo neutra- lizante.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0096] A presente divulgação fornece, entre outras coisas, méto-
dos e composições relacionadas a proteínas de núcleo de mininu- cleossoma e seus usos. As proteínas de núcleo de mininucleossoma aqui divulgadas incluem, entre outras coisas, (a) um domínio de liga- ção de ácido nucleico (NABD), (b) um domínio de alvejamento e ou (c) um domínio de liberação de ácido nucleico, e/ou um domínio de esta- bilidade e/ou um domínio de oligomerização e/ou um domínio de ligan- te. Em várias modalidades, uma proteína de núcleo de mininucleos- soma está associada a uma ou mais moléculas de ácido nucleico para formar um mininucleossoma carregada. Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui duas ou mais proteínas de núcleo de mininucleossoma e uma ou mais moléculas de ácido nucleico. Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada é administrada a um indivíduo em necessidade.
[0097] As cadeias polinucleotídicas normalmente carregam fosfa- tos com carga negativa. Consequentemente, cargas positivas em pro- teínas como as histonas ajudam a condensar os ácidos nucléicos. À presente divulgação aprecia que domínios de ligação de ácido nuclei- co, derivados, por exemplo, de histonas, podem ser utilizados em pro- teínas de núcleo de mininucleossoma artificialmente construídas como um vetor proteináceo não viral.
[0098] A maioria das células de mamíferos possui frações de liga- ção à superfície celular ou receptores que reconhecem (e/ou são re- conhecidos por), ligam e internalizam moléculas ou entidades como vírus e bactérias. Várias composições e métodos aqui divulgados fa- zem uso de tais motivos de ligação à superfície celular em combinação com domínios de ligação de ácido nucleico e domínios de poliarginina em uma proteína de núcleo de mininucleossoma. Em várias modalida- des, uma proteína de núcleo de mininucleossoma é capaz de conden- sar, ou participar ou facilitar a condensação de um ou mais ácidos nu- cleicos. Em várias modalidades, uma proteína de núcleo de mininu-
cleossoma facilita a internalização de ácidos nucleicos associados, por exemplo, em uma mininucleossoma carregada, em tipos de células específicos, por exemplo, por meio de endocitose ou por meio de ou- tros mecanismos de entrada celular. Por conseguinte, em várias moda- lidades, a presente divulgação inclui proteínas de núcleo de mininu- cleossoma que incorporam porções de alvejamento capazes de se |i- gar a porções de superfície celular ou receptores que estão natural- mente presentes em células de um sistema, por exemplo, um sistema que é um ser humano, em que a célula porção de superfície ou recep- tor fornece um mecanismo de entrada na célula. Em vários casos, a porção ou receptor da superfície celular é específico do tipo de célula e, assim, facilita a entrega específica de ácidos nucleicos para tipos de células selecionados.
[0099] As moléculas de ácido nucleico contêm grande carga nega- tiva, são vulneráveis à degradação nos fluidos corporais e não podem entrar em uma célula por meio de simples injeções ou exposição à cé- lula. Essa grande carga negativa pode ser neutralizada por proteínas de núcleo de mininucleossoma para formar mininucleossomas carre- gadas de certa forma, tamanho e carga que permitem a entrada nas células por difusão passiva ou transporte ativo. Várias proteínas de núcleo de mininucleossoma aqui descritas permitem a ligação, con- densação e alvejamento adequados de ácidos nucleicos. Estes domí- nios aqui descritos, podem ser derivados de proteínas humanas ou outros organismos. Um versado na técnica pode contemplar a modifi- cação ou modificação genética dos domínios descritos neste docu- mento, com alterações na sequência de aminoácidos para intensificar certas funções, tais como fixação de células, internalização, etc., mas não se limitando a estas. Uma pessoa versada na técnica também po- de contemplar colocar o domínio em sequência inversa ou através da comutação de posições de aminoácido dentro do domínio ou da adi-
ção de várias modificações pós-traducionais como acetilação, glicação etc. a aminoácidos, mas sem limitações.
DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO
[00100] A presente divulgação inclui o reconhecimento de que do- mínios carregados positivamente se associam a ácidos nucleicos. À presente divulgação fornece domínios de ligação de ácido nucleico, por exemplo, domínios de ligação de DNA e RNA, que podem ser in- cluídos em uma proteína de núcleo de mininucleossoma. Em algumas ocorrências, um domínio de ligação ao DNA presente em uma proteína de núcleo de mininucleossoma é um domínio de ligação ao DNA divul- gado no presente documento. Em algumas ocorrências, um domínio de ligação de RNA presente em uma proteína de núcleo de mininu- cleossoma é um domínio de ligação de RNA divulgado no presente documento.
[00101] Em alguns casos particulares, um NABD que é um domínio de ligação de DNA presente em uma proteína de núcleo de mininu- cleossoma aqui divulgada pode ser derivado de uma sequência de po- lipeptídeo de histona. Vetores não virais, como nanopartículas de DNA utilizando peptídeos de polilisina para compactar DNA em partículas menores para entrega de genes (Liu G. et a/, 2003) têm sido usados, pelo menos em alguns casos, sem sucesso ou sem respostas signifi- cativas no tratamento de doenças (Konstan MW et a/, 2004). A presen- te divulgação fornece uma abordagem significativamente diferente que inclui, em várias modalidades, o uso do domínio de ligação ao DNA de histonas, por exemplo, a sequência de aminoácidos KRHRK. Essa se- quência de aminoácidos tem dois propósitos - primeiro, fornece a car- ga altamente positiva necessária para se associar aos ácidos nucléi- cos. Em segundo lugar, também dá estabilidade à estrutura da proteí- na do núcleo da mininucleossoma. Em terceiro lugar, a sequência de aminoácidos KRH neste NABD também é um local de clivagem para convertases de pró-proteína, portanto, permite a liberação eficiente da carga genética nas células.
[00102] Outros exemplos de NABDs são fornecidos na Tabela 3.
[00103] Um trato de poliarginina, como RRRRR, pode ser incluído em uma proteína de núcleo de mininucleossoma para aumentar a liga- ção do ácido nucleico, bem como para aumentar a carga positiva e/ou capacidade de penetração celular da composição. Um trato de poliar- ginina pode estar presente em uma proteína do núcleo da mininu- cleossoma em uma posição adequada para facilitar a penetração das células pela proteína do núcleo da mininucleossoma e/ou por mininu- cleossomas carregadas, incluindo a proteína do núcleo de mininu- cleossoma. Os versados na técnica estarão cientes dos métodos e técnicas que permitem a determinação de tal posição. A arginina inte- rage com os fosfolipídeos para formar ligações de hidrogênio bi- ou multidentadas a partir da associação simultânea com os fosfatos de mais de uma cabeça de lipídeo, portanto, interage com o fosfato em um único grupo de cabeça de lipídeo. Uma vez que apenas a arginina pode formar ligações de hidrogênio bidentadas, as poliargininas pode- riam se ligar com mais lipídios zwitteriônicos e aniônicos e, portanto, gerar curvatura positiva ao longo de seu comprimento de contorno, resultando em curvatura Gaussiana negativa (Rothbard, JB, et al. 2005). Um trato de poliarginina também pode ser modificado para in- cluir especificamente um ou mais aminoácidos Histidina (H) (ou qual- quer outro aminoácido) para melhorar a estabilidade da proteína do núcleo do mininucleossoma. A histidina (ou qualquer outro aminoáci- do) pode ser inserida em qualquer posição no trato da poliarginina, conforme mostrado na Tabela 3. Outros peptídeos ricos em arginina, como ANTP Penetratina e TAT, também mostraram impacto seme- lhante na penetração celular.
[00104] A presente divulgação inclui o reconhecimento de que a localização de uma proteína de núcleo de mininucleossoma em uma área de eucromatina do núcleo pode ser facilitada pela acetilação de lisinas em proteínas de núcleo de mininucleossoma. O mecanismo dessa estabilização pode estar relacionado, pelo menos em parte, a mecanismos que estabilizam histonas modificadas pós-tradução. As histonas metiladas empacotam-se mais firmemente. A metilação das histonas pode ser dinâmica. Outras modificações pós-tradução que podem ser aplicadas são: fosforilação, glicosilação, prenilação, lipoila- ção, alquilação, acilação, glicação, nitrosilação, sulfatação, carbamila- ção, carbonilação, sumoilação, nedilação, biotinilação, ribosilação, etc. As modificações podem não estar limitadas a estas aqui mencionadas. Outras modificações podem incluir a ligação de cofatores, coenzimas, grupos hidrofóbicos, grupos hidrofílicos, grupos químicos menores, peptídeos menores, etc. Tal modificação também pode ser aplicada a aminoácidos nestas proteínas de núcleo de mininucleossoma aqui descritas. Os domínios de ligação de ácido nucleico mencionados aqui, na Tabela 3 podem ser incorporados em polipeptídeos em qual- quer local para aumentar a ligação de ácido nucleico em combinação com outros domínios fornecidos nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11 e 12. TABELA 3: Domínios Utilidade Referência pais] E KRHRK 1 domínio de ligação Ligação de DNA |Bottomley M.J.,
PO EE RRR, RRRR, |2, 3, 4, 5 | Poliargininas: Penetração celu-|Mishra, A. et al, RRRRRR, (RR)X domínio de ligação lar aprimorada 2008 RRLARR Domínio de conden- |Ligação de DNA |John P. H. Th'ng et sação (parte de) aprimorada; al. 2005
Domínios Utilidade Referência Exemplificativos Exemplificativa sação (parte de) aprimorada e al. 2005 condensação KKDGKKRKR Domínio de conden- |Ligação de DNA |John P.
H.
Th'ng et sação (parte de) aprimorada e al. 2005 condensação KKKLK motivo de HTH (par- | Ligação de DNA | Uniprot te de) aprimorada KKRIRK, RKKSK |10, 11 ligação de RUNX1 | Ligação de DNA |Uniprot (parte de) aprimorada KKPKK 12 Domínio de conden- |Ligação de DNA |John P.
H.
Th'ng et sação (parte de) aprimorada e al. 2005 condensação RRHRR 13 Ligação ao ácido|Ligação ao ácido |Uniprot nucleico nucleico e esta- bilidade aprimo- radas RHRRR 14 Ligação ao ácido|Ligação ao ácido |Uniprot nucleico nucleico e esta- bilidade aprimo- radas RRRRHR 15 Ligação ao ácido|Ligação ao ácido |Uniprot nucleico nucleico e esta- bilidade aprimo- radas KRTVRK 16 Ligação ao ácido|Ligação ao ácido |Uniprot nucleico nucleico aprimo- rada KRORNR 17 Ligação ao ácido|Ligação ao ácido |Uniprot nucleico nucleico aprimo- rada RVCACPGR 18 interação de DNA de |Ligação ao ácido | Uniprot P53 nucleico aprimo- rada
Domínios Utilidade Referência Exemplificativos Exemplificativa (KKK)x 19 Ligação ao ácido|Ligação ao ácido |Uniprot nucleico nucleico aprimo- rada DEMGLGKT 20 Ligação ao ácidolLigação ao nu-|Uniprot nucleico cleotídeo ORE, HLSQHLN,/ 21, 22,/Ligação ao ácido Interação com | Uniprot KTOK, —“RFKW,|23, 24,|nucleico DNA RVY, NRRK 25, 26 TFF 27 Ligação ao ácidolligaçãodeRNA |Uniprot nucleico RPRGR- 28 Ligação ao ácido|Ligação ao ácido |Uniprot PRKHTVTS nucleico nucleico aprimo- rada
DOMÍNIOS DE ALVEJAMENTO
[00105] Proteínas de núcleo de mininucleossoma divulgadas neste documento incluem domínios de alvejamento que têm como alvo mini- nucleossomas para uma ou mais células ou tipos de células.
[00106] Em algumas modalidades, um domínio de alvejamento de uma proteína central de mininucleossoma é um domínio de aminoáci- do que permite a ligação e entrar em uma ou mais células ou tipos de células. Deve ser entendido que os domínios de alvejamento podem ser específicos para certos tipos de células, mas também podem inclu- ir domínios que facilitam a entrada nas células em geral. Em geral, um domínio de alvejamento de uma proteína de núcleo de mininucleos- soma pode contribuir para um ou mais de ligação, ligação específica do tipo de célula e internalização. Um domínio de alvejamento pode ser, por exemplo, um domínio de ligação de célula, domínio de ligação de beta galactose, domínio de ligação de fucose, domínio de ligação de heparina, domínio de ligação de ácido siálico, domínio de ligação de glicoproteína, domínio de ligação de carboidrato, ligação de ácido lisofosfatídico, domínio de ligação de cAMP, ligação de hialuronano domínio, domínio de ligação de sulfato de condroitina, domínio de liga- ção de integrina, domínio de ligação de nucleolina, domínio de ligação de colágeno, domínio de ligação de clatrina, domínio de ligação de re- ceptor Fc, domínio de ligação de actina, motivo de endocitose ou um sinal de localização nuclear. Em algumas modalidades, um domínio de alvejamento de uma proteína de núcleo de mininucleossoma é um domínio de aminoácido que permite a ligação e a entrada em uma ou mais células ou tipos de células e que é derivado de um mamífero, ví- rus, partícula viral, príon, bactéria ou fungo sequência de aminoácidos. DOMÍNIOS DE SEGMENTAÇÃO DE ANEXOS DE CÉLULAS:
[00107] A fixação de células é um meio pelo qual uma proteína de núcleo de mininucleossoma, ou mininucleossoma carregada inclui a proteína de núcleo de mininucleossoma, pode aderir à célula e, em vários casos, facilitar a entrada na célula. Vários vírus têm moléculas de adesão ou domínios que permitem a ligação às células hospedeiras e aumentam a entrada nelas. Por exemplo, o vírus da gripe tem he- madglutinina em sua superfície que permite que ele se ligue ao ácido siálico na superfície celular. A presente divulgação fornece, entre ou- tras coisas, vários desses domínios que permitem a ligação da proteí- na de núcleo de mininucleossoma ao ácido siálico, galactose, fucose, ácido hialurônico e sulfato de condroitina, bem como glicoproteínas que aumentam a ligação celular para internalização. Uma proteína de núcleo de mininucleossoma aqui divulgada pode incluir um ou mais domínios de alvejamento de ligação de células. Os domínios de alvejamento de liga- ção celular incluem os domínios mostrados na Tabela 4. Um domínio de ligação celular da presente divulgação pode estar presente em uma pro- teína de núcleo de mininucleossoma em qualquer posição e/ou em combinação com qualquer um ou mais outros domínios aqui forneci- dos, por exemplo, nas Tabelas 3, 5, 6, 78, 9, 10, 11 e 12.
TABELA 4: Domínios Exempli- Utilidade Exemplificativa | Referên- ficativos cia WGREERQ 29 Sítio de fixação |Fixação de superfície celu- | Uniprot celular em |lar aprimorada por meio de LGALS3 ligação de beta-galactose NTQIH e WNNKTPH |30, 31 Domínio de | Fixação de superfície celu- | Uniprot CTxB lar aprimorada por meio de ligação de galactose TPH 32 Domínio de | Fixação de superfície celu- | Uniprot CTxB lar aprimorada por meio de ligação de Fucose VNRWS 33 Domínio de | Fixação de superfície celu- | Uniprot ligação de áci-llar de músculo aprimorada do siálico por meio de ligação de ácido siálico XBBBXXBX, 34,35 Domínio de | Fixação de superfície celu- |/Cardin e ARKKAAKA ligação de he-|lar aprimorada por meio de | Weintraub, parina ligação de heparina. 1989 ORR, SRR 36, 37 motivo de CPC |Fixação de superfície celu- | Torrent M. lar aprimorada por meio de | et. al, 2012 ligação de heparina WEPSRPFPVD 38 motivo de | Fixação de superfície celu- | Uniprot B3GAT3 lar aprimorada por meio de ligação de galactose HRRTRKAPKRIRL- |39 motivo de gD|Fixação de superfície celu- | Uniprot PHIR glicoproteína de |lar aprimorada por meio de Herpes ligação de glicoproteína KRTGQYKL- 40 Domínio de | Fixação de superfície celu- | Uniprot GSKTGPGOK ligação de he-|lar aprimorada por meio de parina em |ligação de heparina FGF2 KKTK 41 Ligação de | Fixação de superfície celu- [Nelson C. sulfato de hepa- |lar aprimorada por meio de | Di Paolo et rina domínio de ligação de sul- | a/, 2007 fato de heparina KLRSQLVKK 42 Motivo de liga-|Fixação de superfície celu- | Uniprot ção de hialuro- lar aprimorada por meio de nano ligação de hialuronano RRRCGQKKK 43 Motivo de liga-|Fixação de superfície celu- | Uniprot ção de hialuro- lar aprimorada por meio de nano ligação de hialuronano
Domínios Exempli- Utilidade Exemplificativa | Referên- ficativos cia BX(7)B 44 domínio de |Fixação de superfície celu- |Jean L. et BX7B lar aprimorada por meio de | a/, 2001 ligação de hialuronano RIQNLLKITNLRIK- j45 domínio de | Fixação de superfície celu- | Kokona FVK AC15 lar aprimorada por meio de | Kouzi-K. et ligação de heparina al. 1989 KKEKDIMKKTI 46 MOTIVO —Sg1| Fixação de superfície celu- |Joji |. et al, de integrina lar aprimorada por meio de [1998 motivo de ligação de sulfa- to de condroitina HGSRFTFHRGSM, |47, 48, ligação de lecti-| Fixação de superfície celu- | Uniprot HRPH, DVAR, [49, — 50,|na lar aprimorada por meio de HFNPR, WGTE 51 domínio de ligação de liga- ção de Beta-galactosídeo KKQFGAEC 52 Ligação de | Fixação de superfície celu- | Uniprot sulfato de con-/llar aprimorada droitina RRPRPGTGPGRR- |53 ligação de sul-|Fixação de superfície celu- | Uniprot PRPRPRP fato de hepara- lar aprimorada no
[00108] Fixação celular também pode ser alcançada por domínios como RGD, RGDS etc. (D'Souza SE et a/, 1991). A ligação a proteínas da superfície celular, como integrinas, nucleolina, colágeno, clatrinas e receptores Fc, também ajuda os vírus e outras partículas a entrarem na célula. A presente divulgação fornece, entre outras coisas, domí- nios que permitem a ligação como a integrinas, nucleolina, colágeno, clatrinas, receptores Fc para aumento da absorção celular. Os domí- nios de fixação celular incluem os domínios mostrados na Tabela 5. Um domínio de fixação celular fornecido na Tabela 5 pode estar pre- sente em uma proteína de núcleo de mininucleossoma em qualquer posição e/ou em combinação com qualquer um ou mais outros domí- nios fornecidos no presente documento, por exemplo, nas Tabelas 3, 4,6,7,8,9,10,11 e 12.
TABELA 5: Domínios Utilidade Exemplifi- | Referência Exemplificativos cativa KGE 54 motivo de fixação |Fixação celular apri-|Maginnis celular morada por meio deiM.S. et al, ligação de integrina 2006 RGD, RGDS 55, 56 motivo de fixação |Pode ser usado para |D'Souza SE celular bloquear transdução | et a/, 1991 de EPR.
TTVVNPKYEGK, |57, 58 Domínio de fixa- Fixação celular apri-|Reszka A.A.
ERMSQIKRLLS ção celular delmorada por meio de|etal, 1992 Beta1 integrina ligação de integrina WRHRARS 59 domínio de NS5B |Fixação celular apri-| Kusakawa morada por meio de|T. et àal, ligação de nucleolina //2007 GFOGER domínios A de|Fixação celular apri-| Knight C.G. integrinas morada por meio de |/et al, 2000 ligação de colágeno | e IV a integrinas LFDLM 61 domínio de [Fixação celular apri-|Kalthoff et ENTH morada por meio deal, 2002 ligação de domínio de terminal de clatrina WGREERQ 62 Motivo de ligação [Fixação celular apri-|Uniprot de galactose morada por meio de sítio de ligação de galactose em LGALS3 QSTEKRG 63 motivo de [Fixação celular apri-| Uniprot Cclec6A morada por meio de associação com ca- deia gama de receptor Fc (FCERIG) LPNTG 64 motivo de LPXTG |Fixação celular apri-|Dramsi et morada al, 2008 DSPE, FOVT 65, 65 domínio Popeye |Ligação de CAMP Brand, T. 2016 QSTEKRG motivo de |ligação de carboidrato | Uniprot CLEC6a RQOGLID 67 domínio em [ligação de ácido liso- | Uniprot LPAR1 fosfatídico RKKH les = motvo de Midas |motivo de ligação de | Pentikainen |
Domínios Utilidade Exemplifi- | Referência Exemplificativos cativa Echo vírus 1 e integri- |O. et àal, na. ligação de coláge- | 1999 no. YPK, YNOYT 69, 70 domínio de sialo- |glicoproteína associa- Kelm S. et adesão da a Mielina al, 1994 KWNYK TI Domínio de liga- |Siglec7 Uniprot ção de ácido siálico GPQSVKFKSP- |72 domínio de ade-|Citoaderência Uniprot DQ! são RVGENWWY, 73, 74, 75, Ligação de sulfa- | Fixação de superfície | Uniprot RTLQAHHDR, 76, 77, 78, 79 |to de condroitina |celular RESPFSGSSR, REEIQERMR, QDSSSFHHQA, KKQFGAEC,
KRALHNAEC KQKIKHVVKLK, |80, 81 Ligação de ácido [Fixação de superfície | Uniprot KLRCQLAKKK hialurônico celular DOMÍNIOS DE ALVEJAMENTO DE INTERNALIZAÇÃO:
[00109] Certos domínios em proteínas virais e de mamíferos podem impactar diretamente a internalização celular. Por exemplo, domínios de certas proteínas e arranjo sequencial são descritos em Oleson et al., 2008. Por exemplo, um motivo PPxY é necessário para a entrada do adenovírus nas células (Wodrich et a/, 2010), em que x pode ser qualquer aminoácido. Outro exemplo de um domínio de alvejamento de internalização é o motivo GTALL - um domínio de resíduo de cinco aminoácidos, na cauda do terminal carboxila do receptor do hormônio leutinizante (LH) que direciona os complexos ligante-receptor de uma via degradativa para a de reciclagem (Pandey, 2009). O motivo GTALL também mostra homologia de sequência com o motivo da sequência tetrapeptídica do terminal carboxila DSLL, que foi sugerido para parti- cipar na internalização dos receptores B-adrenérgicos. Pandey tam- bém discute que a carga dependente de clatrina geralmente contém um motivo de sequência curta, como YXXQ (onde X pode ser qualquer aminoácido), reconhecido pela proteína adaptadora-2 (AP-2) e pode conter sequência Asn-Pro-X-Tyr (NPXY) motivos, que são reconheci- dos pelas proteínas adaptadoras de clatrina acessórias. Transferrina O motivo NPXY também foi discutido por Kirchhausen, 1999. NPTY tam- bém é o motivo de endocitose de APP. Outro exemplo de domínio de ligação à clatrina que permite a internalização é FXDXF (em que X po- de ser qualquer aminoácido) (Lene E. Oleson. 2008). Os domínios de segmentação de internalização incluem os domínios fornecidos na Ta- bela 6.
[00110] Outras características fornecidas pela presente divulgação incluem um ou mais resíduos de leucina e isoleucina, cujos resíduos são de natureza altamente hidrofóbica. Na verdade, a leucina é o se- gundo aminoácido mais hidrofóbico. Em várias modalidades, os resí- duos de leucina podem servir a múltiplas funções na composição de proteínas de núcleo de mininucleossoma. Primeiro, a hidrofobicidade da face apolar de uma molécula anfipática desempenha um papel im- portante na estabilização da estrutura secundária do peptídeo (Chen Y. et al, 2007). Em segundo lugar, os motivos de sinal do tipo dileucina mostraram ser essenciais para a internalização e o tráfego de recepto- res de membrana e proteínas de membrana em compartimentos sub- celulares. Por exemplo, GLUTA4 (transportador de glicose 4), LDL (lipo- proteína de baixa densidade); LH (hormônio leutinizante), TGN (rede Trans-Golgi) todos têm motivos de dileucina que ajudam na internali- zação nas células. O motivo dileucina do receptor Fc também sinaliza para endocitose (Wu Z. e Simister NE, 2001). Um domínio de alveja- mento de internalização fornecido na Tabela 4 pode estar presente em uma proteína de núcleo de mininucleossoma em qualquer posição e/ou em combinação com qualquer um ou mais outros domínios forne- cidos neste documento, por exemplo, nas Tabelas 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10,
11e12. TABELA 6: Domínios = Exem- Utilidade Exempli-| Referência plificativos ficativa FXDXF 82 motivo de FXDXF |Motivo de ligação de Lene E. Ole- clatrina facilita —a/son JBC. 2008 internalização PPSY 83 Motivo de PPxY Facilita a Entrada de! H Wodrich et Adenovírus. No final |al, 2010 da sequência.
FEDNFVP 84 peptídeo 7-mer allnternalização Apri-|Lene E. Ole- partir de anfifisina. |morada son JBC. 2008 YIRV, YADW, |85, 86, | Motivo de internali- |Internalização Apri- |Zrarate et al, YTQV 87, zação morada 2007 KKRPKP 88 Motivo de internali- |É suficiente para |(Sunyach, zação de prion direcionar a interna- 2003). lização.
SSDDE, RRASS — j89,90 Motivo de CCN Transporte e locali- (David A Jans. zação nucleares [1995 JBC) eficientes (YXXL)2 91 Motivo de internali- | Para entrada viral e/Inabe K et al, zação de vírus de incorporação de | 1999 leucemia bovina proteína de envelo- pe viral em virons. LPLTG, LAFTG 92, 93 Sinal de classifica- entrada dependente | Ton-That, H., e ção de sortase. O. Schnee- wind. 2003 L, 1, LI, IL 94, 95, Leucinas, Isoleuci-|Hidrofobicidade au-|Chen Y. et al, 96, 97 na mentada para esta- 2007 bilidade de polipep- tídeo Lu Dileucina Internalização celu- |Wu Z. e Simis- lar aprimorada ter N.E., 2001 KRRHPKK e motivo de Cardin- ligação de sulfato de
Domínios = Exem- Utilidade Exempli-| Referência plificativos ficativa EPS, —EPNLPEE, 100, 101, | Domínio de ligação |Internalização celu- |Uniprot ND 102, de manose lar aprimorada NFR 103 ligação de N-acetil- |Internalização celu- |Uniprot D-glucosamina lar aprimorada YWV 104 ligação de PDZ Internalização celu- |Uniprot lar aprimorada AICKRIPNKK- 105 ligação de hepari- |Internalização celu-|Uniprot PGKRT na lar aprimorada VAR, KIL 106 Ligação de recep- |Internalização celu-|Uniprot tor (CXCL12) lar aprimorada RCPCR, RAN- | 107, 108, [ligação de hepari- |Internalização celu-|Uniprot VKHLKILN, VAR- 109, na lar aprimorada
LKNNNRQV VRKKP, 110, 111 ligação de PDGFA |Internalização celu- |Uniprot YVRKKPKLK ao seu receptor lar aprimorada ISRRLI 112 ligação de PDGFB | Internalização celu- |Uniprot ao seu receptor lar aprimorada LTKRSRO, 113, 114 ligação de Gag Internalização celu- |Uniprot NRKISVORL lar aprimorada YYKORLI 115 transporte nucleo- |Internalização celu- |Uniprot citoplásmico lar aprimorada DOMÍNIOS DE ALVEJAMENTO DE NÚCLEO.
[00111] Em várias modalidades, é importante que, após a entrada celular, uma carga de ácido nucleico alcance o núcleo. Sinais de inter- nalização nuclear ou vinculação ao mecanismo de importação nuclear são fundamentais para a localização nuclear. Sinais de localização nu- clear de eucariotos funcionais são comuns em proteínas terminais de bacteriófagos (Redrejo-Rodríguez et. Al, 2012). Chan e Jans mostra-
ram que a polilisina por si só não funciona como um sinal de localiza- ção nuclear. Assim, adicionar sinais de alvejamento nuclear para au- mentar a transferência de genes não virais é uma abordagem lógica (Chan e Jans, 1999). A localização do NLS no polipeptídeo também é fundamental para sua função. Listamos as sequências NLS na Tabela 7 para a entrada nuclear aprimorada e fornecemos a localização ideal do sinal NLS para a entrada nuclear mais eficiente na Tabela 13. Os domínios mencionados aqui, na Tabela 7 podem ser incorporados na proteína do núcleo do mininucleossoma em qualquer local para au- mentar a ligação do ácido nucleico em combinação com outros domí- nios fornecidos na Tabela 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e 12.
TABELA: 7 Domínios Exem- proteína — de Utilidade Exemplifi-| Referência plificativos fonte cativa KKKYKLK 116 Gag pol sinal de localização |Uniprot nuclear KKRKLE 1107 LMNA sinal de localização |Uniprot nuclear TRSK 118 VP22 sinal de localização |Uniprot nuclear HRKRKR 119 Aprataxina sinal de localização |Uniprot nuclear NKRKRK 120 SAP30L sinal de localização |Uniprot nuclear AEKSKKK 121 HMGB1 sinal de localização |Uniprot nuclear RKSK, KRVK 122,123 |HIPK2 sinal de localização |Uniprot nuclear KRK 124 NFATC1 sinal de localização |Uniprot nuclear LQQTPLHLAVI 125 inibidor de [Sinal de localização | Uniprot NFKB alfa nuclear contém repe- tições de anquirina RRPR, — PRPR,|126, 127, |lvírus de Her-|sinal de localização Unipror — |
Domínios Exem- proteína — de Utilidade Exemplifi-| Referência plificativos fonte cativa RPPP 128, pes Bovina nuclear para herpes bovina.
RKKRKGK 129 DAG1 (distroglicano). No c-|Uniprot terminal PAAKRVKLD 130 c-Myc sinal de localização |Uniprot nuclear KLKIKRPVK 131 TUS sinal de localização |Uniprot nuclear PKKKRKV 132 SV40 sinal de localização |Uniprot nuclear QRKRQK 133 NFKB sinal de localização |Uniprot nuclear KRPR 134 TOPBP1 sinal de localização |Uniprot nuclear RKRRRP 135 DEDD2 sinal de localização |Uniprot nuclear KKGRRNRFK 136 HNF1A sinal de localização |Uniprot nuclear RHRDRLNTEL- 137 AHR sinal de localização |Uniprot DRLASLL- nuclear
PFPQDVINKLDK KRGRKP 138 CBX2 sinal de localização |Uniprot nuclear KKRAGRRIF- 139 DREBE1 sinal de localização |Uniprot KETR nuclear DOMÍNIOS DE SEGMENTAÇÃO ESPECÍFICOS DO TIPO DE CÉLULA:
[00112] Em várias modalidades, é mais desejável que uma concen- tração maior das partículas se alojem no tipo de célula desejado. Isso permite maior captação e expressão aumentada - dois resultados favo- ráveis da terapia gênica. Na literatura, existem muito poucos motivos que foram descobertos para tais propriedades. A maioria deles vem de experimentos que mostraram que o tropismo viral é diferente de cap- sídeos diferentes. A presente divulgação inclui, em várias modalida-
des, o uso de alguns desses motivos definidos, para aumentar a ex- pressão em neurônios, músculos, fígado, pulmão, rim, células endote- liais ou locais de tumor.
Os domínios de alvejamento específicos do tipo de célula incluem os domínios mostrados na Tabela 8. Um domí- nio de alvejamento específico do tipo de célula da Tabela 8 pode estar presente em uma proteína de núcleo de mininucleossoma em qualquer posição e/ou em combinação com qualquer um ou mais outros motivos aqui fornecidos, por exemplo, nas Tabelas 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11 e 12. TABELA: 8 Domínios Exemplificativos =. Utilidade Exemplificativa ASSLNIA [140 — Javejamento demúsculo —|Yu C-Y. et al. 2009 SKTFNTHPOSTP [141 — Javejamento demúsculo —|Y Seow et al. 2010 YKQCHKKGGHCFPKEK [1422 — Javejamento de músculo LGKMDCRWKWKCCKKGSG [143 — Javejamento de músculo HGSRFTFHRGSM [144 — Javejamento de músculo KKEEEKKEEEKKEEE 145 Alvejamento renal Wischnjow A, et al, 2016 LIFHKEQ 146 — Javejamento de FÍGADO KFNKPFVFLI 147 Alvejamento de puimão Buning H. et al, 2003 QPEHSST 148 Alvejamento de célula en- |Work, L.
M. et. al, dotelial 2006 EYHHYNK 149 Alvejamento de célula mo- |Work, L.
M, et. al, le vascular 2004 NGR 150 Alojamento tumoral Arap W, et al, 1998 GEKGEP 151 Facilita a fagocitose por|Uniprot monócitos KTKKK, KALKKK, KGKKK 152, 153, |Fagocitose das partículas. |Caberoy N.B. et al, 154, 2010 CSVTCG 155 Interação com CD36; lic|jAsch A.S., et. al gam-se às células cance-|1992 rosas. re ss [aveiamento de neurônios |Hunter D.
D. et al,
Domínios Exemplificativos = Utilidade Exemplificativa por ligação neuronal apri-/ 1989 morada. YKYNLNGRES 157 Alvejamento de puimão Asokan A, et al, 2006 YRSL 158 Alvejamento basolateral Anderson E,., et al, 2005 KGGK7 159 Ligação à actina Dahlin-Huppe K. et al., 1997 KKKQYTSIHHG 160 Classificação basolateral! [Zheng P. et al, 1998 KDEL 161 Alvejamento do retículo|Chinnapen D.J. et endossômico al, 2007 LADQDYTKTA 162 Transporte retrógrado Tervo D.G.R,, et. al, 2016 163 Alvejamento de superfície | Uniprot Corina SAVTTVVN 164 Interação de ITGB1 com |Uniprot ITGB1BP1 DOMÍNIOS DE LIBERAÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO:
[00113] Em algumas modalidades, um "domínio de liberação de ácido nucleico" ("'NARD") de um mininucleossoma é um domínio de aminoácido que permite a liberação e entrada no núcleo das células.
[00114] É altamente desejável que as partículas não se libertem antes de entrar na célula. Na célula, a liberação de carga de ácido nu- cleico no citoplasma ou núcleo pode ser preferida. Existem proteases e endopeptidases que podem auxiliar na liberação dentro das células. As pró-proteínas convertases e endopeptidases clivam em certos do- mínios de aminoácidos e tal fenômeno está sendo utilizado aqui para projetar proteínas de núcleo de mininucleossoma que podem liberar a carga de ácido nucleico uma vez dentro da célula ou núcleo. KRH é o sítio de clivagem para Pesk1 e Pesk2. O proglucagon é pós- translacionalmente processado de uma maneira específica do tecido em células A pancreáticas e células intestinais por Pesk1 ou Pesk2.
NRRKKRAL é um sítio de clivagem de Furina para TGFB1. KSVK- KRSVSEIQ é um sítio de clivagem de Furina em hormônio paratireoi- de.
Os sítios de clivagem também podem ser previstos in silico usando plataformas de bioinformática, como Expasy, OmicX, PROSPEROus, Prop1.0, SignalP-5.0, MEROPS, CutDB, Peptide Cutter etc.
São forne- cidos exemplos de como incorporar esses locais de clivagem para libe- rar as partículas para liberação de DNA no citoplasma ou núcleo.
Os domínios mencionados no presente documento, na Tabela 9, podem ser incorporados em proteína de núcleo de mininucleossoma em qual- quer localização para aprimorar a liberação de ácido nucleico em combinação com outros domínios mencionados na Tabela 3, 4, 5, 6,7, 8,10, 11 e 12. TABELA: 9 Domínios Exempli- Utilidade Exemplificativa Referência ficativos GRKKRRORRRPQ |165 Liberação em sítios extracelula- Tian e Huang et res ou intracelulares dependendo | a/, 2011 dos tecidos que expressam furi-
na.
KRH 166 Liberação em sítios extracelula- | Uniprot res ou intracelulares dependendo dos tecidos que expressam
Pecsk1 e Pesk2. KSVKKRSVSEIQ 167 Liberação em sítios extracelula- | Uniprot res ou intracelulares dependendo dos tecidos que expressam
Pecsk1 e Pesk2. NRRKKRAL 168 Liberação em sítios extracelula- Tian e Huang et res ou intracelulares dependendo | a/, 2011 dos tecidos que expressam furi-
na.
KFERQ 169 Repartição nos lisossomos.
Park J.S. et al.,
2016 VRGP Clivagem por Trombina NKDS, NRDN Clivagem por Plasmina ANNR Clivagem por Hementina
Domínios Exempli- Utilidade Exemplificativa Referência ficativos RI, ET, GQ, RS, RD, | 174, 175, 176, | Clivagem por autólise Uniprot RN, RC, RG, RL, |177, 178, 179, DA, RA, GS, LT, FS, [180, 181, 182, GL, SA, DP, GT,/183, 184, 185, GC, RO, LS, HA 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195 FV, QH, EA, AL, LY, 196, 197, 198, | Clivagem por Pepsina Uniprot YL, GF, PS, RE, DP, [199, 200, 201, PI, OS 202, 203, 204, 205, 206, 207 DOMÍNIOS DE ESTABILIDADE:
[00115] Em algumas modalidades, um "domínio de estabilidade" de uma mininucleossoma é um domínio de aminoácido que permite que as mininucleossomas carregadas permaneçam estáveis em fluidos corporais, citoplasma e núcleo.
[00116] A estabilidade das partículas é importante para uma passa- gem segura para as células e longevidade da expressão. Existem vá- rias razões para as partículas perderem estabilidade. Primeiro, as par- tículas devem ser estáveis no sangue e outros fluidos corporais. Em segundo lugar, as partículas precisam atravessar com segurança a entrada endossômica e escapar com segurança para chegar ao cito- plasma. Partículas virais ou receptores reciclados usam vários domí- nios para entrar no endossomo e escapar dele. São fornecidos exem- plos de proteínas de núcleo de mininucleossoma que incorporam do- mínios de entrada e escape endossômicos para aumentar a estabili- dade. Os domínios aqui mencionados, na Tabela 10 podem ser incor- porados na proteína do núcleo do mininucleossoma, de preferência no terminal C, mas também em qualquer local para aumentar a estabili-
dade da proteína do núcleo da mininucleossoma quando combinada com outros domínios fornecidos na Tabela 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 e 12. Uma pessoa versada na técnica também pode contemplar a fluoração de aminoácidos hidrofóbicos nos peptídeos para fornecer meios de aumentar a estabilidade da proteína, montagem aprimorada, etc. e pa- ra fortalecer as interações ligante-receptor. Uma pessoa versada na técnica também pode contemplar outras modificações pós-traducionais em aminoácidos nos peptídeos para fornecer meios para aumentar a estabilidade de proteína, montagem aprimorada etc. e para fortalecer interações de aglutinante-receptor. TABELA: 10 incanco Too PTE et é plificativos de transferrina citose de NPRA da fixação celular Celular, fixação celular
FRQOTRGYKSL DOMÍNIOS DE OLIGOMERIZAÇÃO:
[00117] —Oligomerização é um processo químico pelo qual monôme- ros se associam para formar multímeros, incluindo dímeros e comple-
xos macromoleculares de ordem superior. A oligomerização de molé- culas proteicas é frequentemente facilitada por domínios que promo- vem a associação de monômeros.
[00118] Em algumas modalidades, um "domínio de oligomerização" de uma mininucleossoma é um domínio de aminoácido que permite que proteínas de núcleo de mininucleossoma ou mininucleossomas carregadas se associem em estruturas de ordem superior, como ho- modímero, heterodímero, tetrâmero, octâmeros ou outras estruturas de ordem superior. A oligomerização pode reduzir o tamanho de uma mi- ninucleossoma carregada. Um multímero de proteínas de núcleo de mininucleossoma pode incluir dois ou mais da mesma proteína de nú- cleo de mininucleossoma (por exemplo, duas proteínas de núcleo de mininucleossoma tendo a mesma sequência de aminoácidos) e/ou po- de incluir mais duas proteínas de núcleo de mininucleossoma distintas (por exemplo, duas proteínas de núcleo de mininucleossoma com se- quências de aminoácidos diferentes). Exemplos de domínios de oligo- merização fornecidos neste documento não são de forma alguma limi- tantes e um versado na técnica pode apreciar que tais domínios po- dem ser reconhecidos ou identificados por vários métodos, incluindo triagem de dois híbridos de levedura, purificação de afinidade acopla- da a espectrometria de massa, mineração de texto ou por aplicação de inteligência artificial e aprendizado de máquina. Um versado na técnica também pode criar um sistema induzível de formação de mininucleos- somas carregadas usando um sistema de homodimerização induzível e/ou dimerização induzida quimicamente.
[00119] Em algumas modalidades, um domínio de oligomerização pode incluir 3 ou mais aminoácidos. Os domínios de oligomerização divulgados neste documento, por exemplo, na Tabela 11, podem ser incorporados na proteína do núcleo do mininucleossoma em qualquer posição de uma proteína do núcleo de mininucleossoma, por exemplo,
em combinação com outros domínios fornecidos neste documento, por exemplo, na Tabela 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 12. Em certas modalidades particulares, um domínio de oligomerização é posicionado no terminal C de uma proteína de núcleo de mininucleossoma. TABELA: 11 Domínios Exemplifi- Utilidade Exemplificativa Referência cativos LIRERTE 220 Dimerização Tucker C.L., et al, 1999 LVEERTOQ 221 Dimerização Tucker C.L., et al, 1999 UTFTK 222 O domínio de PTB humano aju- |Markovtsov, V et da a dimerização al, 2000 ILFNK 223 O domínio de PTB humano aju- |Markovtsov, V et da a dimerização al, 2000 PIRTLSK 224 O domínio de PTB humano aju- |Markovtsov, V et da a dimerização al, 2000 YGNSPLHRFK 225 O domínio de PTB humano aju- |Markovtsov, V et da a dimerização al, 2000 FFQOKDR 226 O domínio de PTB humano aju- |Markovtsov, V et da a dimerização al, 2000 KSRP 227 O domínio de PTB humano aju- |Markovtsov, V et da a dimerização al, 2000 YVM 228 Interação mediada por domínio | Uniprot GRB2 YMKM 229 Domínio YXXL ajuda a oligome- | Uniprot rização RSSSFG Interação proteína-proteína LKIRGRER, 231,232 |Oligomerização P53 (parte de) |Uniprot
LKIRGRKR HVIFKKVSR 233 Heterodimerização de SAG com | Uniprot Rho RGPRV Polimerização de Fibrina RANVKHLK Polimerização de CXCL12 YPKAG, YPRTG 236, 237 Dimerização de DPP-IV Tang, H-K et. al, 2011
LIGANTES:
[00120] Sabe-se na técnica de criação de proteínas de fusão que as proteínas podem, em alguns casos, se beneficiar da inclusão de um ligante. A presente divulgação inclui proteínas de núcleo de mininu- cleossoma que incluem um ou mais ligantes, por exemplo, entre dois domínios de uma proteína de núcleo de mininucleossoma. Os ligantes podem contribuir para a estabilidade da estrutura da proteína. Em al- guns casos, os ligantes funcionam como uma separação entre domí- nios e, em outros, podem afetar diretamente a função das proteínas. Alguns ligantes aumentam a rigidez, permitindo assim a separação eficaz dos domínios da proteína. Os ligantes também podem ser im- plementados para introduzir locais de clivagem. Os ligantes têm sido usados por essas razões no campo da engenharia de proteínas. No entanto, no contexto da transferência de genes não virais, essa estra- tégia não foi utilizada. É mostrado aqui que os ligantes podem ser usados com sucesso para projetar domínios para fins funcionais, como transdução seletiva, entrega de genes e expressão do transgene em tipos de células desejados (Figura 10).
[00121] Em algumas modalidades, uma sequência de ligante pode incluir 1 ou mais aminoácidos. As sequências de aminoácidos do ligan- te divulgadas neste documento, por exemplo, na Tabela 12, podem ser incorporadas na proteína do núcleo de mininucleossoma entre os do- mínios como mostrado na SEQ ID NOS: 238-335, em que um ligante pode ser um ligante tendo qualquer um dos aminoácidos ou aminoáci- dos sequências de ácido fornecidas na Tabela 1 e 12. Os ligantes po- dem conter outras sequências de aminoácidos não limitadas àquelas fornecidas na Tabela 12. Sequências de ligante também podem ser geradas por meio de um programa chamado LIGANTE, que pesquisa o banco de dados de sequências de ligante usando entradas escolhi- das pelo usuário e gera saída de sequências de ligante que se enqua-
dram nos critérios. Treonina, serina, glicina, prolina, arginina e alanina são resíduos perfeitos em ligantes naturais e, portanto, em proteínas de núcleo de mininucleossoma.
TABELA 12.
[ns MT san:
DE E EE da
[mes 7 ssanrno DR e DR a
[mes 7 ssanrno
[ms T ssairo: Ler as Lo RR |= as |
PROTEÍNAS DE NÚCLEO DE MININUCLEOSSOMA
[00122] A proteína de núcleo de mininucleossoma pode incluir um ou mais domínios fornecidos no presente documento.
[00123] As proteínas de mininucleossoma aqui divulgadas incluem pelo menos uma sequência de aminoácidos carregada positivamente que contém um domínio de ligação de ácido nucleico, um domínio de direcionamento e/ou um domínio de liberação de ácido nucleico e/ou um domínio de estabilidade. A proteína do núcleo de mininucleossoma pode ser sequências que têm, por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pe- lo menos 90%, ou pelo menos 95%, identidade de sequência com uma proteína de núcleo de mininucleossoma conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 336-387.
[00124] Em algumas modalidades, uma proteína de núcleo de mini- nucleossoma pode conter comprimento de sequência de aminoácidos de 10 a 100 aminoácidos. Aminoácidos, por exemplo, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 55, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 amino- ácidos. Em certas modalidades, uma proteína de núcleo de mininu- cleossoma pode ter um comprimento de, por exemplo, 15 a 90 amino- ácidos, 20 a 80 aminoácidos, 20 a 70 aminoácidos, 20 a 60 aminoáci- dos ou 30 a 40 aminoácidos.
[00125] Em certas modalidades, uma proteína central de mininu- cleossoma inclui um ou mais domínios divulgados neste documento e um ou mais aminoácidos que não estão presentes em um domínio di- vulgado neste documento. Em certos casos, os aminoácidos não pre- sentes em um domínio divulgado neste documento que são N-terminal ou C-terminal de um domínio divulgado neste documento podem ser referidos como "aminoácidos flanqueadores" e a soma de todos os aminoácidos presentes em uma mininucleossoma não presente em qualquer domínio divulgado neste documento pode ser referida como os "aminoácidos sem domínio".
[00126] Em várias modalidades, os aminoácidos sem domínio de uma proteína do núcleo de mininucleossoma podem ter uma sequên- cia que contribui para a carga da proteína do núcleo de mininucleos- soma. Em várias modalidades, os aminoácidos sem domínio de uma proteína de núcleo de mininucleossoma incluem pelo menos 10% de aminoácidos carregados positivamente, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo me- nos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou 100% de aminoácidos carregados positivamente.
[00127] Em algumas modalidades, em pH7, uma proteína de núcleo de mininucleossoma pode ter uma carga positiva total entre 10 e 100.
[00128] Em algumas modalidades, uma proteína de núcleo de mini- nucleossoma pode conter um ou mais domínios de ligação de ácido nucleico colocados em qualquer local da sequência de aminoácidos. Em alguns casos, a proteína do núcleo de mininucleossoma pode con- ter apenas os domínios de ligação do ácido nucleico. Em alguns ca- sos, a proteína do núcleo de mininucleossoma pode conter os domí- nios de ligação do ácido nucleico e os domínios da poliarginina. Em alguns casos, a proteína de núcleo de mininucleossoma pode conter os domínios de ligação ao ácido nucleico e os domínios de alvejamen- to. Em alguns casos, a proteína de núcleo de mininucleossoma pode conter apenas os domínios de polirginina e os domínios de alvejamen- to. Em alguns casos, a proteína de núcleo de mininucleossoma pode conter apenas os domínios de polirginina, domínios de liberação de ácido nucleico e os domínios de alvejamento.
[00129] Em algumas modalidades, uma proteína de núcleo de mini- nucleossoma pode conter uma ou mais poliargininas colocadas em qualquer local da sequência de aminoácidos. A sequência de poliargi- nina pode conter 4-30 Argininas.
[00130] Em algumas modalidades, uma proteína de núcleo de mini- nucleossoma pode conter um ou mais domínios de alvejamento. O domínio de alvejamento pode ser colocado em qualquer local na se- quência de aminoácidos da proteína do núcleo de mininucleossoma.
[00131] Em algumas modalidades, uma proteína de núcleo de mini- nucleossoma pode conter um ou mais domínios de liberação de ácido nucleico. De preferência, os domínios de liberação de ácido nucleico são colocados no meio da sequência de aminoácidos da proteína do núcleo de mininucleossoma. De preferência, os domínios de liberação de ácido nucleico são colocados após 6 aminoácidos do terminal N ou antes de 6 aminoácidos do terminal C.
[00132] Em algumas modalidades, uma proteína de núcleo de mini- nucleossoma pode conter um ou mais domínios de estabilidade. De preferência, os domínios de estabilidade são colocados no terminal C da sequência de aminoácidos da proteína do núcleo de mininucleos- soma. Em alguns casos, os domínios de estabilidade são colocados no terminal N da sequência de aminoácidos da proteína de núcleo de mininucleossoma.
[00133] Em algumas modalidades, uma proteína central de mininu- cleossoma pode incluir um ou mais domínios de oligomerização. Em certas modalidades particulares, os domínios de oligomerização são posicionados no terminal C da sequência de aminoácidos de uma pro- teína de núcleo de mininucleossoma. Em alguns casos, o domínio de oligomerização é posicionado no terminal N da sequência de aminoá- cidos de uma proteína central de mininucleossoma.
[00134] Assim, para evitar dúvidas, uma proteína de núcleo de mi- ninucleossoma, conforme estabelecido neste documento, pode incluir (a) um domínio de ligação de ácido nucleico (NABD) e (b) um domínio de alvejamento. Aqueles versados na técnica apreciarão a partir da presente divulgação que um polipeptídeo incluindo estes componentes constituirá uma proteína de núcleo de mininucleossoma conforme di- vulgado neste documento, opcionalmente sujeito a limitações adicio-
nais estabelecidas neste documento e/ou incluindo, sem limitação, um ou mais domínios adicionais fornecidos aqui ou, de outra forma, co- nhecidos na técnica.
Em algumas modalidades, uma proteína de nú- cleo de mininucleossoma pode incluir um domínio de ligação de ácido nucleico com pelo menos 65% de identidade de sequência com um domínio de ligação de ácido nucleico conforme estabelecido em qual- quer uma das SEQ ID NOs: 1-28 (por exemplo, conforme estabelecido em Tabela 3), por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pe- lo menos 95%, e/ou que difere de um domínio de ligação de ácido nu- cleico conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-28 por não mais do que alterações de dois aminoácidos (por exemplo, uma deleção, adição ou substituição, por exemplo, uma substituição conservadora) ou não mais do que alterações de um aminoácido.
Em algumas modalidades, uma proteína de núcleo de mininucleossoma pode incluir um domínio de alvejamento que é um domínio de alveja- mento de fixação de célula tendo pelo menos 65% de identidade de sequência com um domínio de alvejamento de fixação de célula con- forme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-53 (por exemplo, conforme estabelecido na Tabela 4), por exemplo, pelo me- nos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, e/ou que difere de um domínio de alvejamento de fixação celular conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-53 por alterações de não mais do que dois aminoácidos (por exemplo, uma deleção, adição ou substitui- ção, por exemplo, uma substituição conservativa) ou alterações de não mais do que um aminoácido.
Em algumas modalidades, uma proteína de núcleo de mininucleossoma pode incluir um domínio de alvejamen- to que é um domínio de alvejamento de fixação celular com pelo me- nos 65% de identidade de sequência com um domínio de alvejamento de fixação celular conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 54-81 (por exemplo, conforme estabelecido na Tabela 5), por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e/ou que difere de um domínio de alvejamento de fixação celular conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 54-81 por alterações de não mais que dois aminoácidos (por exemplo, uma deleção, adição ou substituição, por exemplo, uma substituição conservadora) ou alte- rações de não mais que um aminoácido.
Em algumas modalidades, uma proteína de núcleo de mininucleossoma pode incluir um domínio de alvejamento que é um domínio de alvejamento de internalização tendo pelo menos 65% de identidade de sequência com um domínio de alvejamento de internalização conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 82-115 (por exemplo, conforme estabelecido na Tabela 6), por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e/ou que difere de um domínio de alvejamento de interna- lização conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 82- 115 por alterações de não mais que dois aminoácidos (por exemplo, uma deleção, adição ou substituição, por exemplo, uma substituição conservadora) ou alterações de não mais que um aminoácido.
Em al- gumas modalidades, uma proteína de núcleo de mininucleossoma po- de incluir um domínio de alvejamento que é um domínio de alvejamen- to de núcleo tendo pelo menos 65% de identidade de sequência com um domínio de alvejamento de núcleo conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 116-139 (por exemplo, conforme es- tabelecido na Tabela 7), por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, pelo menos 95% e/ou que difere de um domínio de alveja- mento de núcleo conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID
NOs: 116-139 por alterações de não mais que dois aminoácidos (por exemplo, uma deleção, adição ou substituição, por exemplo, uma substituição conservadora) ou alterações de não mais que um amino- ácido.
Em algumas modalidades, uma proteína de núcleo de mininu- cleossoma pode incluir um domínio de alvejamento que é um domínio de alvejamento específico de tipo de célula tendo pelo menos 65% de identidade de sequência com um domínio de alvejamento específico de tipo de célula conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 140-164 (por exemplo, conforme estabelecido na Tabela 8), por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e/ou que difere de um domínio de alvejamento específico de tipo de célula conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 140-164 por alterações de não mais que dois aminoácidos (por exemplo, uma deleção, adição ou substituição, por exemplo, uma substituição con- servadora) ou alterações de não mais que um aminoácido.
Em algu- mas modalidades, uma proteína de núcleo de mininucleossoma pode incluir um domínio de liberação de ácido nucleico tendo pelo menos 65% de identidade de sequência com um domínio de liberação de áci- do nucleico conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 165-208 (por exemplo, conforme estabelecido na Tabela 9), por exem- plo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e/ou que difere de um domínio de liberação de ácido nucleico conforme estabe- lecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 165-208 por alterações de não mais que dois aminoácidos (por exemplo, uma deleção, adição ou substituição, por exemplo, uma substituição conservadora) ou altera- ções de não mais que um aminoácido.
Em algumas modalidades, uma proteína de núcleo de mininucleossoma pode incluir um domínio de estabilidade tendo pelo menos 65% de identidade de sequência com um domínio de estabilidade conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 209-219 (por exemplo, conforme estabelecido na Tabela 10), por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e/ou que difere de um domínio de estabilidade conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 209-219 por altera- ções de não mais que dois aminoácidos (por exemplo, uma deleção, adição ou substituição, por exemplo, uma substituição conservadora) ou alterações de não mais que um aminoácido.
Em algumas modali- dades, uma proteína de núcleo de mininucleossoma pode incluir um domínio de oligomerização tendo pelo menos 65% de identidade de sequência com um domínio de oligomerização conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 220-237 (por exemplo, conforme estabelecido na Tabela 11), por exemplo, pelo menos 65%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e/ou que difere de um domínio de oli- gomerização conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 220-237 por alterações de não mais que dois aminoácidos (por exemplo, uma deleção, adição ou substituição, por exemplo, uma substituição conservadora) ou alterações de não mais que um amino- ácido.
Em algumas modalidades, uma proteína de núcleo de mininu- cleossoma pode incluir um domínio de ligante tendo pelo menos 65% de identidade de sequência com um domínio de ligante conforme es- tabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 238-335 (por exemplo, conforme estabelecido na Tabela 12), por exemplo, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e/ou que difere de um domí- nio de ligante conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 238-335 por alterações de não mais que dois aminoácidos (por exemplo, uma deleção, adição ou substituição, por exemplo, uma substituição conservadora) ou alterações de não mais que um amino- ácido.
[00135] Aqueles versados na técnica observarão que os domínios de uma proteína de núcleo de mininucleossoma fornecida neste do- cumento podem ser dispostos em qualquer ordem, orientação ou se- quência conforme fornecida neste documento ou como será entendido a partir da presente divulgação por aqueles versados na técnica. Por exemplo, aqueles versados na técnica apreciarão o uso pretendido de ligantes, por exemplo, como sequências opcionais que podem ser in- cluídas individualmente ou em uma pluralidade em tandem entre qual- quer par de domínios ou adjacente a qualquer domínio, com ou sem um ou mais intermediários aminoácidos não especificamente divulga- dos aqui. Assim, por exemplo, um NABD pode ser C-terminal ou N- terminal de um domínio de direcionamento. Domínios adicionais forne- cidos aqui, incluindo, sem limitação, NABDs adicionais ou domínios de alvejamento adicionais, podem ser C-terminal ou N-terminal de NABD e C-terminal ou N-terminal de um domínio de alvejamento. Além disso, para cada domínio presente na proteína do núcleo de mininucleosso- ma, incluindo um ligante, um ou mais domínios ligantes podem ser in- cluídos no terminal C do domínio ou no terminal N do domínio. Proteí- nas de mininucleossoma exemplificativas são fornecidas aqui. Como será prontamente aparente para aqueles versados na técnica a partir da presente divulgação, os domínios fornecidos neste documento são modulares e podem ser incluídos com sua função pretendida em qual- quer ordem e/ou assim, fornecem à mininucleossoma a utilidade ou funcionalidade pretendida, independentemente da ordem em que es- tão presentes.
[00136] Aqueles versados na técnica apreciarão ainda que as prote- ínas de núcleo de mininucleossoma da presente divulgação podem incluir qualquer número ou tipo de modificações (por exemplo, modifi-
cações pós-tradução) conhecidas na técnica. Tais modificações inclu- em, sem limitação, peguilação, acetilação, metilação, glicosilação, fos- forilação, sumoilação, amidação, lipidação e/ou metilação. Em várias modalidades, uma proteína de núcleo de mininucleossoma pode ser peguilada.
[00137] Em algumas modalidades, uma proteína do núcleo de mini- nucleossoma é modificada pela associação da proteína do núcleo de mininucleossoma com polietilenoglicol (PEG). PEG são polímeros não iônicos, não tóxicos, biocompatíveis e altamente hidrofílicos. O PEG é usado principalmente para a modificação covalente de macromolécu- las e superfícies biológicas. A conjugação de PEG aumenta o tamanho aparente do polipeptídeo, reduzindo, assim, a filtração renal e alteran- do a biodistribuição. A PEGuilação de peptídeos pode aumentar as propriedades terapêuticas devido à sua maior solubilidade (para peptí- deos hidrofóbicos), meia-vida prolongada por meio de depuração renal reduzida e antigenicidade mascarada para resposta imunológica míií- nima no hospedeiro. PEGs de vários comprimentos de cadeia de PEG foram usados em fármacos aprovados pela FDA com pesos molecula- res variando de 5-40 kDa. Nas Figuras 1, 3, 4, 5 e 6, mostramos es- quemas de como PEGs de vários comprimentos de cadeia de PEG podem ser utilizados para fornecer proteínas de núcleo de mininu- cleossoma de tamanho variável.
[00138] Muitas partículas atuais usam PEG de tamanho de 10 kDa ou maior, no entanto, uma desvantagem de usar PEG de tamanho maior é que também aumenta o tamanho de partícula. (Feuz L. et al. 2007). A presente divulgação fornece, entre outras coisas, partículas com comprimento variável de PEG para formular mininucleossomas com tamanho variável - de preferência menores do que 20 nm de dià- metro. Na Figura 1, é mostrado um comprimento mínimo de PEG de 12 cadeias e como ele pode ser utilizado para modificar os aminoáci-
dos nas proteínas do núcleo de mininucleossoma. O tamanho final da mininucleossoma carregada também depende do tamanho do PEG usado para modificar as proteínas do núcleo de mininucleossoma. A Figura 2 mostra que ao anexar PEG12, o peso molecular do peptídeo aumenta em conformidade, no entanto, não altera as características físicas, como a solubilidade do peptídeo.
[00139] Em algumas modalidades, uma proteína de núcleo de mini- nucleossoma pode ter um peso molecular total entre 1700 g/mol e 20000 g/mol, por exemplo, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 10500, 11000, 11500 ou 20000 g/mol. Em várias modali- dades, uma proteína de núcleo de mininucleossoma pode ter um peso molecular total entre 100 Kda e 10000 kDa, por exemplo, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 8000 e 10000 kDa.
[00140] A sequência de aminoácidos pode ser usada na ordem in- versa ou em qualquer ordem. Pode-se também contemplar a mudança de um aminoácido ou aminoácido não essencial no domínio para obter a mesma carga ou outras propriedades do domínio.
TABELA 13. Sequências exemplificativas de proteínas de núcleo de mini- Carga líquida|Número delPeso molecular |Ponto isoelétri- nucleossoma em pH7 resíduos (g/mol) co (pH) KRHRKLREKRHRKLRRRRRLKRHRKKRHRKLREK 4773,77 12,72 KRHRKGSSLREKRHRKLRRRRRLKRHRKKRHRKLREGGSK 5206,16 12,72 KRHRKREGSSLREKRHRKNDLRRRRRLKRHRKKRHRKL- 338 21,4 44 5720,65 12,46
REGGSK KKPKKREGSSLREKRHRKNDLRRRRRLKRHRKKRHRKL- 339 21,3 44 5624,6 12,38
REGGSK oo RRLARRGSSLREKRHRKLRRRRRLKKPKKKRHRKLREGGSK 5213,23 12,72 q o KRHRKLREKRHRKLREKRHRKLKRHRKKRHRKLREK 4984 12,48 DX KRHRKRILREKRHRKLREARKRHRKLKRHRKKRHRKLREK 5480,61 12,56 KRHRKKGKKKKGEKGKKKLKGKKKLRRRRRRRORR 4507,55 12,78 KRHRKAPAPKGKKKKGEKGKKKLKGKKKLKPKPRRRRRRRORR 5294,51 12,79 KRHRKGGSGGKGKKKKGEKGKKKLKGKKKLARRRRRRRORR 4893,91 12,78 KRHRKLREKRHRKRRRRRRRKRHRKLREKRRORR 4906,85 12,84 KRHRKKRHRKKRVKKKRHRKRRRRRRDSLL 4141,02 12,86 KRHRKKRHRKYQKRVKKKRHRKSSSRRRRRRDSLL 4693,55 12,64
Sequências exemplificativas de proteínas de núcleo de mini- Carga líquida Número de/Peso molecular |Ponto isoelétri-
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Sequências exemplificativas de proteínas de núcleo de mini- Carga líquida Número de/Peso molecular |Ponto isoelétri-
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Sequências exemplificativas de proteínas de núcleo de mini- Carga líquida Número de/Peso molecular |Ponto isoelétri-
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CARGAS DE ÁCIDO NUCLEICO
[00141] — Mininucleossomas carregadas divulgadas neste documento podem ser carregadas com uma carga de ácido nucleico que é, por exemplo, RNA, DNA ou um análogo de ácido nucleico deste. Uma car- ga de ácido nucleico pode ser de filamento único ou de filamento du- plo. Uma carga de ácido nucleico pode ser linear ou circular. Uma car- ga de ácido nucleico pode codificar um ou mais de cada um dentre uma proteína, um RNA, um shRNA, um miRNA, um anticorpo, um na- nocorpo, uma Darpina, uma repetição de anquirina ou um polipeptí- deo. Por exemplo, uma carga de ácido nucleico pode ser uma molécu- la de cDNA que codifica pelo menos uma proteína funcional. Em várias modalidades, uma carga de ácido nucleico pode ser um RNA inibidor, por exemplo, um gRNA, siRNA, miRNA ou shRNA.
[00142] “Uma carga de ácido nucleico pode codificar, por exemplo, um RNA, proteína, polipeptídeo, anticorpo, nanocorpo, miRNA, shR- NA, gRNA, Cas9, RNA não codificante quando entregue em um núcleo de qualquer célula. A expressão não pode ser limitada às entidades aqui mencionadas.
MINIUCLEOSSOMAS CARREGADAS
[00143] Uma mininucleossoma carregada da presente divulgação pode incluir uma ou mais proteínas de núcleo de mininucleossoma da presente divulgação e um ou mais polinucleotídeos. Aqueles versados na técnica apreciarão a partir da presente divulgação que tais mininu- cleossomas carregadas podem ser geradas a partir da combinação de proteínas de núcleo de mininucleossoma e polinucleotídeos em uma variedade de maneiras. Os versados na técnica apreciarão que, em pelo menos uma modalidade, a montagem da mininucleossoma carre- gada ocorrerá simplesmente após a inclusão de uma ou mais proteí- nas do núcleo de mininucleossoma fornecidas neste documento e um ou mais polinucleotídeos em uma solução, por exemplo, sem limitação,
uma solução aquosa, por exemplo, a uma temperatura padrão e, por exemplo, agitada em vórtice a uma velocidade padrão. Métodos de geração de proteínas de núcleo de mininucleossoma carregadas, por- tanto, incluem abordagens fornecidas neste documento e outras que serão evidentes para aqueles versados na técnica. Os versados na técnica apreciarão que, em pelo menos uma modalidade, a montagem de mininucleossoma carregada ocorrerá após a inclusão de uma ou mais proteínas de núcleo de mininucleossoma fornecidas neste docu- mento e um ou mais polinucleotídeos em uma solução, por exemplo, sem limitação, uma solução aquosa, por exemplo, a uma temperatura padrão na presença de catalisadores que ajudam a aumentar a con- densação de ácidos nucleicos.
[00144] Uma mininucleossoma carregada da presente divulgação pode estar em um estado não condensado e em um estado conden- sado. Uma mininucleossoma carregada está em um estado condensa- do, em que pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% das cargas negativas na molécula de ácido nu- cleico foram neutralizadas. Uma mininucleossoma carregada é consi- derada em um estado não condensado quando menos de 90% das cargas negativas na molécula de ácido nucleico foram neutralizadas. À menos que especificado, as referências a mininucleossomas na pre- sente divulgação abrangem pelo menos estados condensados e não condensados e, quando aplicável, suas características.
[00145] — Uma mininucleossoma pode incluir, por exemplo, 1 a 10000 proteínas do núcleo de mininucleossoma. Uma mininucleossoma pode incluir, por exemplo, 1 a 100 moléculas de carga de ácido nucleico.
[00146] Em algumas modalidades, a mininucleossoma carregada pode ter um tamanho entre 0,5 a 50 nanômetros de diâmetro. As mini- nucleossomas podem incluir moléculas de carga de ácido nucleico que podem ter um comprimento de até 50 kb, mantendo um pequeno diâà-
metro entre 0,5 e 50 nm.
[00147] Em algumas modalidades, a mininucleossoma carregada pode ter um peso molecular entre 100 e 10000 kDa, por exemplo, 100, 200, 500, 1000, 3000, 5000, 8000, 10000 kDa.
[00148] Em várias modalidades, a mininucleossoma carregada po- de ter uma carga líquida de - 100 a 100. Em algumas modalidades, o potencial zeta da formulação de mininucleossoma carregada pode va- riar de - 10 miliVolts a 100 milivolts. Em alguns exemplos, um comple- xo de carga de ácido nucleico e proteína de núcleo de mininucleosso- ma é condensado a um tamanho mínimo em comparação com a molé- cula de ácido nucleico e moléculas de polipeptídeo usadas para cons- truir a partícula de mininucleossoma. A razão final de carga positiva para negativa é de aproximadamente 1:1, formando assim uma molé- cula não carregada, levemente carregada positivamente ou carregada ligeiramente negativamente. A partícula final pode se formar em várias formas, incluindo haste, esférica ou circular, mas não se limitando a estas.
[00149] Em várias modalidades, a proteína do núcleo de mininu- cleossoma pode ser modificada com uma ou mais moléculas de polieti- lenoglicol de peso molecular de 5 Daltons a 20 kDa. Uma porção de polietilenoglicol (PEG) pode ser ligada a qualquer resíduo de aminoá- cido no polipeptídeo.
[00150] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregado inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú- cleo de mininucleossoma que está entre 1 molécula de ácido nucleico para 3 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:3) e 1 molécula de ácido nucleico para 3000 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:3000), ou dentro de qualquer faixa entre as mesmas.
[00151] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú-
cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico a 3 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:3) e 1 molécula de ácido nucleico a 2000 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:2000).
[00152] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú- cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico pa- ra 3 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:3) e 1 molécula de ácido nucleico para 1000 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:1000).
[00153] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú- cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico a 3 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:3) e 1 molécula de ácido nucleico a 500 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:500).
[00154] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú- cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico pa- ra 3 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:3) e 1 molécula de ácido nucleico para 200 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:200).
[00155] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú- cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico a 3 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:3) e 1 molécula de ácido nucleico a 100 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:100).
[00156] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú- cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico pa- ra 3 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:3) e 1 molécula de ácido nucleico para 50 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:50).
[00157] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú- cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico a 50 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:50) e 1 molécula de ácido nucleico a 2000 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:2000).
[00158] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú- cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico pa- ra 50 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:50) e 1 molécula de ácido nucleico para 1000 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:1000).
[00159] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú- cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico pa- ra 50 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:50) e 1 molécula de ácido nucleico para 500 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:500).
[00160] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú- cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico a 50 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:50) e 1 molécula de ácido nucleico a 200 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:200).
[00161] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú- cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico a 50 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:50) e 1 molécula de ácido nucleico a 100 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:100).
[00162] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú-
cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico a 200 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:200) e 1 molécula de ácido nucleico a 2000 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:2000).
[00163] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú- cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico pa- ra 200 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:200) e 1 molécula de ácido nucleico para 1000 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:1000).
[00164] Em várias modalidades, uma mininucleossoma carregada inclui uma razão de moléculas de ácido nucleico para proteínas de nú- cleo de mininucleossoma que é entre 1 molécula de ácido nucleico pa- ra 200 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:200) e 1 molécula de ácido nucleico para 500 proteínas de núcleo de mininucleossoma (1:500).
[00165] O versado na técnica apreciará que moléculas de proteína de núcleo de mininucleossoma podem ser produzidas e/ou constituído por vários meios, incluindo, sem limitação, várias condições de sal di- ferentes, incluindo acetato, trifluoroacetato, bicarbonato e cloreto. À formulação final da mininucleossoma carregada pode ser constituída em solução salina normal, água ou quaisquer outros tampões farma- ceuticamente aceitáveis. ENTREGA DE MININUCLEOSSOMAS CARREGADAS PARA CÉ- LULAS OU TECIDOS-ALVO
[00166] Em certas modalidades, uma mininucleossoma pode entre- gar um ácido nucleico em que a célula-alvo é o epitélio pigmentar da retina (EPR). Para uma terapia gênica eficiente, algumas modalidades incluem a entrega de um grande número de cópias de carga genética, como DNA ou RNA, em um tipo de célula. Por exemplo, na degenera-
ção macular relacionada à idade úmida, a expressão de anti-VEGF no EPR pode fornecer níveis terapêuticos de proteínas necessárias para inibir a proliferação de células endoteliais e vazamento vascular. São fornecidos aqui, exemplos de proteínas de núcleo de mininucleosso- mas (SEQ ID NO. 392) que permitem a absorção aprimorada no EPR (Figuras 10, 11).
[00167] Em certas modalidades, uma mininucleossoma pode entre- gar um ácido nucleico em que a célula-alvo é um neurônio na retina. Foi descrito que o domínio de aminoácido LRE (SEQ ID NO. 156) pode ser usado para fixação neuronal intensificada (Dale D, et al, 1989). Foi feito o uso de tal domínio em um vetor não viral usando um construto GFP (SEQ ID NO. 395) com a proteína do núcleo de mininucleossoma (SEQ ID NO. 388) para expressar GFP para células neuronais-alvo na retina (Figura 12). Isto pode ser particularmente útil para entregar DNA ou RNA para tratar a degeneração da retina causada por mutações genéticas em genes expressos em neurônios da retina.
[00168] Em várias modalidades, uma mininucleossoma pode entre- gar um ácido nucleico em que a célula-alvo é, por exemplo, uma célula muscular, uma célula hepática, uma célula endotelial, célula-tronco hematopoiética, epitelial pulmonar, célula, um periícito, uma célula be- ta, epitelial intestinal célula, uma célula microglial, uma célula de ma- crófago, uma célula neuronal, uma célula da pele, uma célula do san- gue, etc., mas não se limitando a estas. Várias combinações de domí- nios aqui descritos (Tabelas 3-12), podem permitir a entrega de mini- nucleossomas carregadas a certo tipo de célula-alvo para efeitos tera- pêuticos em outras partes do corpo, incluindo cérebro, retina, intestino, fígado, pulmão, rim, músculo, pâncreas, mas sem limitações.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[00169] A presente divulgação contempla uma "mininucleossoma terapêutica carregada" que inclui uma mininucleossoma carregada e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável. As formula- ções de soluções transportadoras farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidas dos especialistas na técnica, assim como o desenvol- vimento de dosagens e regimes de tratamento adequados. Normal- mente, essas formulações podem conter 10º cópias do genoma ou mais dos transgenes desejados. Outros fatores, tais como solubilidade, biodisponibilidade, meia-vida, prazo de validade, serão contemplados por um versado na técnica. Como tal, várias doses e regimes de tra- tamento podem ser desejáveis. Agente terapêutico de mininucleosso- ma carregada pode ser usado para entregar nucleotídeos a uma vari- edade de tipos de células, tipos de tecidos ou órgãos em um corpo humano, incluindo retina, fígado, SNC, intestino, etc., mas não se limi- tando a eles.
[00170] Um agente terapêutico de mininucleossoma carregada po- de ser formulado de modo que seja farmaceuticamente aceitável para administração a células ou animais. O agente terapêutico de mininu- cleossoma carregada pode ser administrado in vitro, ex vivo ou in vivo. Um agente terapêutico de mininucleossoma carregada pode ser admi- nistrado a um indivíduo sozinho ou em combinação com uma ou mais outras modalidades terapêuticas, por exemplo, anticorpos, esteroides, vitaminas, AAVs, etc.
[00171] Em certos casos, uma mininucleossoma terapêutica carre- gada pode incluir uma ou mais cargas de ácido nucleico que, cada uma ou em conjunto, codificam um ou mais produtos de expressão distintos.
[00172] Em certas circunstâncias, será desejável entregar as formu- lações de mininucleossoma carregada em composições farmacêuticas adequadamente formuladas divulgadas neste documento por via sub- cutânea, intraocular, intravítrea, parenteral, intravenosa, intramuscular, intratecal, tópica, oral, injeções intraperitoneais ou por inalação nasal,
mas sem limitação a essas técnicas. As soluções das formulações de mininucleossoma carregada podem ser preparadas em água estéril, solução salina estéril e também podem ser adequadamente mistura- das com um ou mais tensoativos, como ácido plurônico. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol, glicóis de polietileno líqui- dos e misturas dos mesmos. As preparações de armazenamento po- dem conter conservantes para evitar o crescimento de microrganis- mos.
[00173] Um meio adequado de administração de um agente tera- pêutico de mininucleossoma carregada pode ser selecionado com ba- se na afecção ou doença a ser tratada e na idade e condição de um indivíduo. A dose e o método de administração podem variar depen- dendo do peso, idade, afecção e semelhantes de um paciente e po- dem ser adequadamente selecionados conforme necessário pelos ver- sados na técnica.
[00174] Em vários casos, uma composição de agente terapêutico de mininucleossoma carregada pode ser formulada para incluir um car- reador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Exemplos de carre- adores farmaceuticamente aceitáveis incluem, sem limitação, qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis. As composições da presente invenção podem incluir um sal farmaceuti- camente aceitável, por exemplo, um sal de adição de ácido ou um sal de adição de base.
[00175] Em várias modalidades, uma composição incluindo um agente terapêutico de mininucleossoma carregada como aqui descrito, por exemplo, uma formulação estéril para injeção, pode ser formulado de acordo com as práticas farmacêuticas convencionais usando água destilada para injeção como um veículo. Por exemplo, soro fisiológico ou uma solução isotônica contendo glicose e outros suplementos, tais como D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio podem ser usados como uma solução aquosa para injeção, opcionalmente em combinação com um agente solubilizante adequado, por exemplo, ál- cool, como etanol e poliálcool, como propilenoglicol ou polietilenoglico!l e um tensoativo não iônico, como polissorbato 80 "M, HCO-50 e seme- lhantes.
[00176] Conforme divulgado no presente documento, uma compo- sição de agente terapêutico de mininucleossoma carregada pode ser em qualquer forma conhecida na técnica. Tais formas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semissólidas e sólidas, como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dis- persões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e su- positórios.
[00177] A seleção ou uso de qualquer forma particular pode depen- der, em parte, do modo pretendido de administração e aplicação tera- pêutica. Por exemplo, as composições contendo uma composição des- tinada à distribuição sistêmica ou local podem estar na forma de solu- ções injetáveis ou infusíveis. Consequentemente, uma composição de agente terapêutico de mininucleossoma carregada pode ser formulada para administração por um modo parenteral (por exemplo, injeção in- travenosa, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular). Como usado no presente documento, administração parenteral se refere a modos de administração diferentes de administração enteral e tópica, geral- mente por injeção e incluem, sem limitação, injeção e infusão intrave- nosas, intranasais, intraoculares, pulmonares, intramusculares, intra- arteriais, intratecais, intracapsulares, intraorbitais, intracardíacas, intra- dérmicas, intrapulmonares, intraperitoneais, transtraqueais, subcutã- neas, subcuticulares, intra-articulares, subcapsulares, subaracnoideas, intraespinhais, epidurais, intracerebrais, intracranianas, intracarotidas e intrasternais.
[00178] Uma via de administração parenteral pode ser, por exem- plo, administração por injeção, administração transnasal, administra- ção transpulmonar ou administração transcutânea. A administração pode ser sistêmica ou local por injeção intravenosa, injeção intramus- cular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea.
[00179] Em várias modalidades, uma composição de agente tera- pêutico de mininucleossoma carregada da presente invenção pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomo ou outra estrutura ordenada adequada para armazenamento estável em alta concentração. As soluções injetáveis estéreis podem ser prepara- das, incorporando uma composição descrita no presente documento na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, conforme necessá- rio, seguido pela esterilização de filtro. Geralmente, as dispersões são preparadas, incorporando a composição descrita no presente docu- mento em um excipiente estéril que contém um meio de dispersão bá- sico e os outros ingredientes necessários daqueles acima enumera- dos. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, métodos para preparação incluem secagem a vácuo e seca- gem por congelamento que produzem um pó de uma composição des- crita no presente documento mais qualquer ingrediente desejado adi- cional (ver abaixo) a partir de uma solução esterilizada por filtração an- teriormente da mesma. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso da dispersão e pelo uso de tensoativos. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pela inclusão, na composição de um reagente de retardamento da absorção, por exemplo, sais de monoes- tearato e gelatina.
[00180] Uma composição de agente terapêutico de mininucleosso- ma carregada pode ser administrada parenteralmente na forma de uma formulação injetável compreendendo uma solução ou suspensão estéril em água ou outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, a composição de agente terapêutico de mininucleossoma carregada pode ser formulada combinando adequadamente a molécu- la terapêutica com veículos ou meios farmaceuticamente aceitáveis, tais como água estéril e soro fisiológico, óleo vegetal, emulsificante, agente de suspensão, surfactante, estabilizador, excipiente, aromati- zante, diluente, veículo, conservante, aglutinante, seguido de mistura em uma forma de dosagem unitária necessária para práticas farma- cêuticas geralmente aceitas. A quantidade de agente terapêutico de mininucleossoma carregada incluída nas preparações farmacêuticas é tal que uma dose adequada dentro da faixa designada é fornecida. Exemplos não limitativos de líquido oleoso incluem óleo de gergelim e óleo de soja, e pode ser combinado com benzoato de benzila ou álcool benzílico como agente solubilizante. Outros itens que podem ser inclu- ídos são um tampão, como um tampão de fosfato ou tampão de aceta- to de sódio, um agente calmante como o cloridrato de procaína, um estabilizador como o álcool benzílico ou fenol e um antioxidante. A in- jeção formulada pode ser embalada em uma ampola adequada.
[00181] Em algumas modalidades, uma composição de agente te- rapêutico de mininucleossoma carregada pode ser formulada para ar- mazenamento a uma temperatura abaixo de O ºC (por exemplo, -20 ºC ou - 80 ºC). Em algumas modalidades, a composição pode ser formu- lada para armazenamento por até 2 anos (por exemplo, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete me- ses, oito meses, nove meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 11/2 anos, ou 2 anos) a 2-8 ºC (por exemplo, 4 ºC). Assim, em algumas modali- dades, as composições aqui descritas são estáveis em armazenamen-
to por pelo menos 1 ano a 2-8 ºC (por exemplo, 4 ºC).
[00182] Em casos particulares, uma composição de agente terapêu- tico de mininucleossoma carregada pode ser formulada como uma so- lução. Em algumas modalidades, uma composição pode ser formula- da, por exemplo, como uma solução tamponada em uma concentração adequada e adequada para armazenamento a 2-8 ºC (por exemplo, 4 ºC).
[00183] As composições incluindo um agente terapêutico de mini- nucleossoma carregada, conforme descrito neste documento, podem ser formuladas em composições de imunolipossoma. Essas formula- ções podem ser preparadas por métodos conhecidos na técnica. Os lipossomos com tempo de circulação melhorado são divulgados, por exemplo, na Patente US nº 5.013.556.
[00184] Em certas modalidades, composições podem ser formula- das com um carreador que protegerá o composto contra liberação rá- pida, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implan- tes e sistemas de entrega microencapsulados. Podem ser usados po- límeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como etileno-acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e áci- do polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, JR Robinson (1978) "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", Marcel Dekker, Inc., New York.
[00185] Em algumas modalidades, as composições podem ser for- muladas em uma composição adequada para administração intrapul- monar (por exemplo, para administração por meio de um inalador ou nebulizador) a um mamífero, como um ser humano. Os métodos para formular tais composições são bem conhecidos na técnica. As formu- lações para inalador de pó seco e os sistemas adequados para admi- nistração das formulações também são conhecidos na técnica. A ad-
ministração pulmonar pode ser oral e/ou nasal. Exemplos de dispositi- vos farmacêuticos para distribuição pulmonar incluem inaladores de dose medida, inaladores de pó seco (DPIs) e nebulizadores. Por exemplo, uma composição aqui descrita pode ser administrada aos pulmões de um indivíduo por meio de um inalador de pó seco. Esses inaladores são dispositivos sem propulsor que fornecem aos pulmões formulações de pó seco dispersíveis e estáveis. Os inaladores de pó seco são bem conhecidos na arte da medicina e incluem, sem limita- ção: o TURBOHALERO (AstraZeneca; Londres, Inglaterra) o inalador AIRO (ALKERMESO; Cambridge, Massachusetts); ROTAHALERO (GlaxoSmithKline; Londres, Inglaterra); e ECLIPSETM (Sanofi-Aventis; Paris, França). Ver também, por exemplo, Publicações PCT nº WO 04/026380, nº WO 04/024156 e nº WO 01/78693. Dispositivos DPI têm sido usados para administração pulmonar de polipeptídeos, como insu- lina e hormônio do crescimento. Em algumas modalidades, uma com- posição aqui descrita pode ser administrada por via intrapulmonar por meio de um inalador de dose calibrada. Esses inaladores dependem de um propelente para fornecer uma dose discreta de um composto aos pulmões. Dispositivos adicionais e métodos de administração in- trapulmonar são apresentados, por exemplo, nas Publicações do Pe- dido de Patente US nº 20050271660 e US nº 20090110679, as divul- gações de cada um dos quais são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.
[00186] Em algumas modalidades, as composições de agente tera- pêutico de mininucleossoma carregada podem ser formuladas para entrega ao olho, por exemplo, na forma de uma solução, suspensão ou pomada farmaceuticamente aceitável. Uma preparação para uso no tratamento de um olho pode estar na forma de uma solução aquosa estéril contendo, por exemplo, ingredientes adicionais, tais como, mas não se limitando a, conservantes, tampões, agentes de tonicidade, an-
tioxidantes e estabilizantes, agentes umectantes ou clarificantes não iônicos e agentes de aumento da viscosidade. Uma preparação como aqui descrita pode ser administrada topicamente ao olho do indivíduo em necessidade de tratamento (por exemplo, um sujeito que sofre de DMRI) por métodos convencionais, por exemplo, na forma de gotas ou banhando o olho em uma solução terapêutica, contendo uma ou mais composições.
[00187] Uma variedade de dispositivos para a introdução de fárma- cos na cavidade vítrea do olho pode ser apropriada, em certas modali- dades, para a administração de uma composição como aqui descrito. Por exemplo, a Publicação US nº 2002/0026176 descreve um tampão contendo produtos farmacêuticos que pode ser inserido através da es- clera de modo que se projete na cavidade vítrea para entregar o agen- te farmacêutico na cavidade vítrea. Em outro exemplo, a Patente US nº 5.443.505 descreve um dispositivo implantável para introdução em um espaço supracoroidal ou uma região avascular para liberação sus- tentada de fármaco no interior do olho. As patentes US nº 5.773.019 e US nº 6.001.386, cada uma, divulgam um dispositivo de administração de fármaco implantável que pode ser fixado à superfície escleral de um olho. Métodos e dispositivos adicionais (por exemplo, um adesivo tran- sescleral e entrega por meio de lentes de contato) para a entrega de um agente terapêutico de mininucleossoma carregada ao olho são descritos em, por exemplo, Ambati e Adamis (2002) Prog Retin Eye Res 21(2):145-151; Ranta e Urtti (2006) Adv Drug Delivery Rev 58(11):1164-1181; Barocas e Balachandran (2008) Expert Opin Drug Delivery 5(1):1-10(10); Gulsen e Chauhan (2004) Invest Opthalmo!l Vis Sci 45:2342-2347; Kim et al. (2007) Ophthalmic Res 39:244-254; e pu- blicação PCT nº WO 04/073551, cujas divulgações são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.
[00188] Em várias modalidades, a administração subcutânea pode ser realizada por meio de um dispositivo, como uma seringa, uma se- ringa pré-cheia, um autoinjetor (por exemplo, descartável ou reutilizá- vel), um injetor de caneta, um injetor de remendo, um injetor vestível, um ambulatório bomba de infusão de seringa com conjuntos de infu- são subcutânea ou outro dispositivo para injeção subcutânea.
[00189] Em algumas modalidades, uma composição de agente te- rapêutico de mininucleossoma carregada aqui descrita pode ser admi- nistrada terapeuticamente a um indivíduo por meio de administração local. Tal como aqui utilizado, "administração local" ou "entrega local" pode se referir à entrega que não depende do transporte da composi- ção de agente terapêutico de mininucleossoma carregada ou agente terapêutico de mininucleossoma carregada para seu tecido ou local- alvo pretendido através do sistema vascular sistema. Por exemplo, a composição de agente terapêutico de mininucleossoma carregada po- de ser distribuída por injeção ou implantação da composição ou agen- te ou por injeção ou implantação de um dispositivo contendo a compo- sição ou agente. Em certas modalidades, após a administração local na adjacência de um tecido ou local-alvo, a composição ou agente, ou um ou mais componentes dos mesmos, pode se difundir para um teci- do ou local alvo pretendido que não é o local de administração.
[00190] Em algumas modalidades, as composições aqui fornecidas estão presentes na forma de dosagem unitária, cuja forma de dosa- gem unitária pode ser adequada para autoadministração. Tal forma de dosagem unitária pode ser fornecida dentro de um recipiente, tipica- mente, por exemplo, um frasco, cartucho, seringa pré-cheia ou caneta descartável. Um dosador, tal como o dispositivo dosador descrito na Pat. US nº 6.302.855, também pode ser usado, por exemplo, com um sistema de injeção como aqui descrito.
[00191] Uma dose adequada de uma composição de agente tera- pêutico de mininucleossoma carregada aqui descrita, cuja dose é ca-
paz de tratar ou prevenir um distúrbio em um indivíduo, pode depender de uma variedade de fatores, incluindo, por exemplo, a idade, sexo e peso de um sujeito a ser tratada, a condição ou doença a ser tratada e o agente terapêutico de mininucleossoma carregada particular usado. Outros fatores que afetam a dose administrada ao indivíduo incluem, por exemplo, o tipo ou gravidade da afecção ou doença. Outros fatores podem incluir, por exemplo, outros distúrbios médicos concomitante ou previamente afetando o indivíduo, a saúde geral do indivíduo, a dispo- sição genética do indivíduo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de drogas e qualquer outra terapêutica adicio- nal que são administradas ao indivíduo. Também deve ser entendido que uma dosagem específica e um regime de tratamento para qual- quer indivíduo em particular também podem ser ajustados com base no julgamento de um médico.
[00192] Uma solução de agente terapêutico de mininucleossoma carregada pode incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição aqui descrita. Essas quantidades eficazes podem ser prontamente determinadas por um versado na técnica com base, em parte, no efeito da composição administrada ou no efeito combinatório da composição e um ou mais agentes ativos adicionais, se mais de um agente for usado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma quantidade em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da composição são superados por efeitos benéficos terapeuticamente.
[00193] As formas farmacêuticas de formulações terapêuticas de mininucleossoma carregadas adequadas para injeção podem incluir soluções ou dispersões aquosas estéreis. Uma formulação pode ser estéril e deve ser fluida para permitir o fluxo adequado para dentro e para fora de uma seringa. Uma formulação também pode ser estável soba s condições de fabricação e armazenamento. Um carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água e solução salina ou soluções aquosas tamponadas. Preferivelmente, agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio podem ser usados nas formulações. Para administração humana, as prepara- ções e composições finais devem atender aos níveis gerais de endoto- xina, padrões de segurança e pureza de esterilidade, pirogenicidade e pureza, conforme exigido pelo FDA dos EUA e pelos padrões regulató- rios da UE. A temperatura e a exposição a outras proteínas podem al- terar as propriedades das mininucleossomas carregadas. As prepara- ções e composições finais devem ser armazenadas em temperaturas apropriadas, preferencialmente de 2-8 graus Celsius ou em temperatu- ra ambiente (20-25 graus Celsius).
[00194] Além disso, um versado na técnica também pode contem- plar o método de entrega adicional pode ser via eletroporação, sonofo- rese, métodos de injeção intraóssea ou usando biolística. Os vetores também podem ser implantados em microchips, nanochips ou nano- partículas.
[00195] Em certas modalidades, as composições descritas no pre- sente documento podem ser formuladas em um kit. Esses kits podem ser usados para fins terapêuticos ou de diagnóstico. A presente divul- gação fornece, entre outras coisas, uma ou mais composições junta- mente com um ou mais excipientes, carreadores, diluentes, adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, e/ou outros componentes, como podem ser empregados na formulação de uma composição que consiste em proteínas de núcleo de mininucleossoma e ácidos nucleicos, e na pre- paração de agentes terapêuticos para administração a um mamífero e, em particular, a um humano, para uma ou mais doenças aqui descri- tas. Em particular, tais kits podem incluir uma ou mais das composi- ções de proteína de núcleo de mininucleossoma divulgadas em com- binação com instruções para o uso de ácidos nucleicos no tratamento de vários distúrbios em um mamífero e podem incluir tipicamente reci-
pientes preparados para embalagem comercial conveniente.
[00196] As composições aqui descritas podem ser administradas a um animal que é um mamífero, por exemplo, um ser humano. As com- posições aqui descritas também são aplicáveis a animais de interesse comercial, gado e animais domésticos, como cães e gatos. As compo- sições em kits podem incluir composições de mininucleossomas carre- gadas parcial ou significativamente purificadas, sozinhas ou em com- binação com um ou mais ingredientes ou fármacos para uso terapêuti- co ou de diagnóstico. Os kits terapêuticos também podem ser prepa- rados, os quais incluem pelo menos um componente de mininucleos- soma carregada com base em composições de terapia gênica divulga- das neste documento e instruções para usar a composição como um agente terapêutico. O recipiente para tais kits pode incluir tipicamente pelo menos um frasco, tubo de ensaio, frasco, garrafa, seringa ou ou- tro recipiente, no qual a(s) composição(ões) de mininucleossomas di- vulgadas podem ser colocadas e, de preferência, aliquotadas adequa- damente.
APLICAÇÕES
[00197] As mininucleossomas fornecidas neste documento podem, em várias modalidades, ser caracterizadas por tamanho pequeno, ca- pacidade de entrar nas células por processos de difusão passiva ou mediada por receptor, precisão na localização da expressão gênica, precisão na duração da expressão gênica e/ou retenção até a libera- ção de ácidos nucléicos no citoplasma do núcleo de uma célula-alvo. Algumas das aplicações desejadas da tecnologia de mininucleossoma são descritas neste documento:
TERAPIA GÊNICA
[00198] Em várias modalidades, mininucleossomas fornecidos no presente documento podem ser usados em métodos de terapia genéti- ca. Os princípios gerais de terapia genética são bem conhecidos na técnica e incluem a entrega de um polinucleotídeo a um indivíduo que precisa do mesmo para fornecer um produto de expressão (por exem- plo, um mRNA, proteína ou RNA inibidor) de valor terapêutico. Em al- gumas modalidades, a terapia gênica pode incluir terapia de reposição de genes ou proteínas (por exemplo, terapia de reposição enzimática), aumento ou inibição do alvo. Em várias modalidades, as mininucleos- somas fornecidas neste documento podem ser aplicadas para resgatar efeitos deletérios de quaisquer mutações que causam doenças, inclu- indo, sem limitação, fibrose cística, distrofia muscular de Duchenne, doença de Stargardt, degeneração macular relacionada à idade, Hun- tington, Hemofilia A, Musculatura espinhal atrofia, síndrome de Usher etc. Em tais doenças, uma mutação genética torna um gene não funci- onal ou não disponível. Nesses casos, a substituição do gene mutado por uma cópia funcional pode ser benéfico para os pacientes. Ao in- corporar um cDNA funcional ou gene completo em uma mininucleos- soma carregada e entregá-la às células ou tecidos desejados, é possí- vel receber, em várias modalidades, um benefício terapêutico.
[00199] Em algumas modalidades, as mininucleossomas fornecidas neste documento podem ser aplicadas para inibir genes que são regu- lados positivamente e causam doenças. Por exemplo, a superexpres- são de P53 foi descrita em várias doenças. Em alguns casos, também é benéfico derrubar genes em células ou tecidos específicos para di- minuir a regulação de genes que causam inflamação, hipóxia etc. para terem efeitos terapêuticos. CÉLULAS GENETICAMENTE MODIFICADAS EX-VIVO
[00200] As mininucleossomas da presente divulgação podem ser usadas para modificar geneticamente células ex vivo. As células po- dem ser geneticamente modificadas para expressar a terapêutica de várias maneiras. Uma dessas células é a célula imune, por exemplo, a célula T. As células imunológicas podem ser geneticamente modifica-
das para expressar novas proteínas ou receptores que podem permitir o reconhecimento imunológico de células cancerosas ou outros tipos de células prejudiciais para eliminação e depuração. Essa modificação genética pode ser realizada ex vivo. Em várias modalidades, as mini- nucleossomas fornecidas neste documento podem ser usadas em mé- todos de modificação genética células ex vivo. A combinação de domí- nios fornecidos neste documento pode permitir a entrada de mininu- cleossomas carregadas em uma variedade de células T e entregar uma carga genética ao núcleo em tais células. A carga genética pode codificar e/ou permitir a expressão de receptores quiméricos, knock- down de genes ou outra entidade terapêutica. Essas células podem então ser infundidas em pacientes para terapia. Um versado na técnica pode contemplar o uso de mininucleossomas carregadas para a cria- ção de células T receptoras de antígeno quiméricas (células T CAR) para uso em imunoterapia.
[00201] Em algumas modalidades, as mininucleossomas fornecidas neste documento podem ser aplicadas para manipular células-tronco ex vivo para expressar novas proteínas ou receptores para fins tera- pêuticos. A combinação de domínios fornecidos no presente documen- to, pode permitir a entrada de mininucleossoma carregada a uma vari- edade de células-tronco para entregar uma carga genética ao nú- cleo/citoplasma em tais células. A carga genética pode permitir a ex- pressão de receptores quiméricos, knockdown de genes ou outra enti- dade terapêutica. Essas células podem então ser infundidas em paci- entes para terapia. Um versado na técnica pode contemplar o uso de mininucleossomas carregadas para a criação de células-tronco quimé- ricas ou células-tronco hematopoiéticas quiméricas para uso em imu- noterapia.
EDIÇÃO DE GENES E REPARO DE EXCISÃO DE BASE
[00202] A edição de genes, edição e manipulação de base também são áreas aplicáveis para esta tecnologia de mininucleossoma aqui descrita. A edição de genes e o reparo de excisão de bases são tecno- logias do estado da técnica que permitem corrigir uma mutação gené- tica ou editar os genes no nível do DNA ou RNA. Para esta aplicação, uma mininucleossoma carregada pode incorporar ácidos nucleicos que codificam para gRNA, saRNA, spCas9, saCas9, dCas9, citidina desa- minase e várias outras enzimas que ajudam a clivar o DNA ou conver- ter uma base em outra. Um especialista na técnica pode apreciar que a incorporação de múltiplos gRNAs e Cas9 ou enzimas de edição se- melhantes em um AAV é um processo complicado e muitas vezes ine- ficiente. Portanto, usar o método e as composições aqui descritos, que permitem a fácil compactação de ácidos nucleicos em mininucleosso- mas carregadas, permite a incorporação de vários gRNAs e até mes- mo o maior dos genes Cas9 para entregar às células desejadas.
ENTREGA DE ANTICORPOS
[00203] Os anticorpos são uma classe de medicamentos que muda- ram a vida de milhões de pacientes em todo o mundo. No entanto, uma grande desvantagem desta terapia é a necessidade de repetir a administração, o que representa um fardo imenso para os pacientes, médicos e cuidadores. Um especialista na técnica pode apreciar que uma molécula de DNA pode ser usada para expressar anticorpos. À tecnologia de mininucleossoma aqui descrita fornece uma oportunida- de de vetorizar o anticorpo e entregar às células desejadas nos paci- entes para criar um depósito de longo prazo em seus corpos para re- duzir a carga de administração múltipla. Essas moléculas de DNA que expressam parte ou a totalidade de domínios de anticorpos podem ser incorporadas em mininucleossomas carregadas para criar uma opção terapêutica de longo prazo para pacientes que tomam fármacos de anticorpos. Um versado na técnica também pode vetorizar e distribuir outras moléculas semelhantes a anticorpos, tais como nanocorpo, mi-
méticos de anticorpo, peptídeos de fusão, fragmentos de anticorpo, fragmentos de anticorpo de camelídeo ou camelídeo de domínio único usando proteínas de núcleo de mininucleossoma.
ENTREGA DE VACINA
[00204] O DNA ou RNA geneticamente modificado pode produzir um antígeno para fornecer uma resposta imunológica protetora. As vacinas de ácido nucléico têm várias vantagens potenciais, como am- pla resposta imunológica em relação às vacinas convencionais. A tec- nologia de mininucleossoma aqui descrita pode incorporar e entregar tais construções de DNA ou RNA às células ou tecidos desejados em animais, incluindo seres humanos, para proteger de várias infecções virais, bacterianas ou parasitárias.
COSMÉTICOS
[00205] O DNA ou RNA geneticamente modificado pode ser desen- volvido para várias aplicações cosméticas, por exemplo, para aumen- tar a massa muscular, reparar a pele em vítimas de queimaduras, para perda de peso, para melhorar a função imunológica, para retardar o envelhecimento e muitas outras aplicações. A tecnologia de mininu- cleossoma aqui descrita pode incorporar e distribuir DNA ou RNA de construção aplicáveis às células ou tecidos desejados em animais, in- cluindo seres humanos, para o efeito cosmético desejado.
[00206] Em várias modalidades, a presente divulgação fornece ain- da vetores relacionados à prevenção ou tratamento de uma doença em seres humanos ou outros animais. Uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de uma composição pode ser administrada por via intravenosa, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, subcutâ- nea, intracerebral, sub-retinal, intravítrea, via punção lombar, tópica, retal ou entrega direta a órgãos locais ou tumores, mas não se limitan- do a essas técnicas. A composição inclui complexos de ácido nucleico, cada complexo consistindo essencialmente em uma ou mais molécu-
las de ácido nucleico e uma ou mais moléculas de proteína de núcleo de mininucleossoma.
[00207] A presente divulgação fornece, entre outras coisas, méto- dos melhorados de condensação de DNA, RNA e seus análogos, etc. para entrega eficiente em células humanas para tratar certas doenças e/ou aplicações cosméticas. O ácido nucleico entregue também pode ter aplicações para entregar vacinas.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: PROJETO E SÍNTESE DE PROTEÍNAS DE NÚCLEO
DE MININUCLEOSSOMA
[00208] Este Exemplo é representativo de métodos e composições relacionados a proteínas do núcleo mininucleossoma. Neste exemplo, sequências de aminoácidos de peptídeos (que podem condensar áci- dos nucleicos em mininucleossomas carregadas) e seu processo de síntese são descritos.
[00209] —Mininucleossomas carregadas do presente Exemplo são produzidos para transferência e liberação de genes eficientes da carga de ácido nucleico carregada para vários tipos de células. Mininucleos- somas carregadas do presente Exemplo são projetadas para se enga- tar ativamente com a superfície celular por meio da ligação a proteínas de superfície celular, para serem translocados para o citoplas- ma/núcleo nas células, e para permitir a liberação da carga de ácido nucléico. Essas características podem ser alcançadas por proteína do núcleo de mininucleossoma e mininucleossomas carregadas projeta- das com base em interação de proteína/DNA. Consequentemente, o presente Exemplo inclui proteínas de núcleo de mininucleossoma que incluem um ou mais domínios de aminoácidos que aumentam um ou mais dentre ligação celular, absorção aprimorada, estabilidade aprimo- rada, transporte ativo para o núcleo de uma célula-alvo e liberação por meio de peptidases.
[00210] No presente Exemplo, proteínas de núcleo de mininucleos- soma sintetizadas podem incluir, sem limitação, uma sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 388-393, ou outras se- quências derivadas de domínios divulgados neste documento na Ta- bela 3-12, ou qualquer combinação das mesmas. Proteínas de núcleo de mininucleossoma do presente Exemplo são peptídeos com carga líquida positiva >8 em pH 7 e ponto isoelétrico >9. Por exemplo, SEQ ID NO: 388 é uma sequência de proteína de núcleo de mininucleos- soma incluindo múltiplos domínios de ligação de DNA (KRHRK) com- binados com múltiplos domínios de ligação neuronal (LRE) e um do- mínio de poliarginina (RRRRR). Nesta mesma construção, as leucinas (L) circundam o domínio poliarginina para separar os domínios carre- gados com aminoácidos hidrofóbicos, permitindo que o domínio de |i- gação da célula se ligue à superfície da célula. Neste construto, a pro- teína do núcleo de mininucleossoma (SEQ ID NO: 388) é projetada para ligação aprimorada aos neurônios por meio do domínio LRE, en- quanto o domínio poliarginina ajudaria na entrada na célula. O presen- te Exemplo também inclui proteínas de núcleo de mininucleossoma com vários ligantes posicionados entre certos domínios, e exemplos de ligantes incluem aqueles fornecidos em SEQ ID NOS: 388-393. Por projeto, KRH em SEQ ID NO: 388 também serve como um local de corte para POSK1 para liberação aprimorada de ácidos nucleicos. Ou- tros domínios de liberação de ácido nucleico ou domínios de clivagem que podem ser incluídos em proteínas de núcleo de mininucleossoma incluem, sem limitação, aqueles descritos na Tabela 9. Os domínios para inclusão em proteínas de núcleo de mininucleossoma também podem ser derivados para outras peptidases, incluindo, sem limitação, aquelas na Tabela 9.
[00211] Proteínas de núcleo de mininucleossoma do presente Exemplo, incluindo proteínas de núcleo de mininucleossoma de acordo com SEQ ID NOS: 388-393, incluem várias combinações de caracte- rísticas de sequência que permitem a condensação eficiente com mo- léculas de ácido nucleico e entrega de mininucleossomas carregadas aos tipos de célula desejados, por exemplo, células e tecidos animais. Em certas proteínas de núcleo de mininucleossoma do presente Exemplo, um domínio de oligomerização é incluído em uma proteína de núcleo de mininucleossoma a fim de fazer com que uma proteína de núcleo de mininucleossoma carregada formada por associação da proteína de núcleo de mininucleossoma com uma carga de ácido nu- cleico tenha um tamanho relativamente menor em comparação com uma proteína de núcleo de mininucleossoma carregada de referência, por exemplo, em comparação com uma mininucleossoma carregada incluindo proteínas de núcleo de mininucleossoma que não possui o(s) domínio(s) de oligomerização, mas de outra forma é idêntica na se- quência de aminoácidos. Domínios de oligomerização exemplificativos incluem aqueles fornecidos na Tabela 11. Da mesma forma, os sinais de entrada e escape endossômico também podem ser incluídos em proteínas de núcleo de mininucleossoma para maior estabilidade e |li- beração.
[00212] As proteínas do núcleo do mininucleossoma do presente Exemplo podem ser sintetizadas por vários métodos. Um método de sintetizar proteínas do núcleo do mininucleossoma é a síntese de pep- tídeos. A síntese de peptídeos permite a ligação de aminoácidos por meio de ligações amida. Por exemplo, proteínas de núcleo de mininu- cleossomas podem ser sintetizadas quimicamente por meio de uma reação de condensação entre o grupo carboxila de um aminoácido pa- ra o grupo amino do próximo aminoácido desejado, na ordem da se- quência de uma proteína de núcleo de mininucleossoma. Um método estabelecido de síntese de peptídeos é conhecido na técnica como síntese de peptídeos em fase sólida.
[00213] Várias estratégias podem ser aplicadas opcionalmente para proteger o amino (terminal N) e o terminal carbóxi (terminal C) de pro- teínas de núcleo de mininucleossoma da presente divulgação. Se a proteína do núcleo do mininucleossoma for liofilizada, o peptídeo liofili- zado pode conter vestígios de sais usados durante o processo de sín- tese. Outros métodos de produção de proteína de núcleo de mininu- cleossoma incluem a expressão da proteína de núcleo de mininucleos- soma em um sistema celular ou in vivo de construções de DNA que codificam a proteína de núcleo de mininucleossoma. As proteínas de núcleo de mininucleossoma produzidas podem ser purificadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, várias re- sinas podem ser utilizadas durante o processo. Proteínas do núcleo de mininucleossomas, em vários casos do presente Exemplo, são >90% puras. No entanto, uma proteína de núcleo < 90% menos pura também pode ser usada para formar uma mininucleossoma carregada. As pro- teínas de núcleo mininucleossomas, em vários casos do presente Exemplo, são >90% conjugadas com PEG. No entanto, uma proteína de núcleo menos conjugada (< 90%) ou não conjugada também pode ser usada para formar uma mininucleossoma carregada. A pureza da proteína do núcleo das mininucleossomas pode ser determinada por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e a identidade confirma- da por espectrometria de massa, no mínimo.
EXEMPLO 2. PRODUÇÃO DE MININUCLEOSSOMAS CARREGA-
DAS
[00214] Este Exemplo descreve técnicas relacionadas à produção de um mininucleossoma carregada, incluindo, sem limitação, uma mi- ninucleossoma carregada do Exemplo 1. As mininucleossomas carre- gadas do presente Exemplo incluem uma carga de ácido nucleico (DNA ou RNA) condensada com proteínas de núcleo de mininucleos- soma com cargas líquidas positivas. A carga líquida positiva da proteí-
na do núcleo da mininucleossoma neutraliza as cargas negativas da carga de ácido nucleico, resultando em partículas de tamanho nano- métrico.
A conjugação das referidas proteínas de núcleo de mininu- cleossomas e DNA ou RNA pode ocorrer em pequenas ou grandes quantidades.
Existem 2 fosfatos que significam 2 cargas negativas as- sociadas a cada base.
O presente Exemplo proporciona que pelo me- nos 90% das cargas negativas de DNA sejam neutralizadas por uma carga positiva de proteína de núcleo de nucleossoma.
Por exemplo, 90-95 por cento das cargas negativas de DNA precisam ser neutrali- zadas para a condensação eficiente dos ácidos nucléicos com uma proteína de núcleo de mininucleossoma.
Várias proteínas de núcleo de mininucleossoma do presente Exemplo podem incluir domínios de aminoácidos que aumentam um ou mais dentre ligação celular, absor- ção celular, estabilidade de proteína, transporte ativo para o núcleo de uma célula alvo e liberação de carga de ácido nucleico.
Assim, certas proteínas de núcleo de mininucleossoma fornecidas neste documento podem ser particularmente úteis em certos contextos.
Durante o pro- cesso de mistura dos ácidos nucleicos e proteínas do núcleo da mini- nucleossoma para produzir uma mininucleossoma carregada, a mistu- ra de ácidos nucleicos e proteínas do núcleo de mininucleossoma po- de ser misturada ou agitada entre 100 roms a 4000 rpms.
No processo de conjugação de ácidos nucleicos, certos catalisadores, como NaOH e espermidinas, que aumentam a reação de condensação podem ser adicionados.
Estes catalisadores podem ser adicionados ao reator an- tes da adição dos polipeptídeos e ácidos nucleicos.
Os ácidos nuclei- cos podem ser adicionados em concentrações que variam de 0,1 mi- crograma/microlitro para 100 gramas/litro.
As proteínas do núcleo de mininucleossomas podem ser adicionadas a uma concentração de 0,1 micrograma/microlitro para 100 gramas/litro.
Os ácidos nucleicos po- dem ser adicionados de uma só vez ou podem ser adicionados gradu-
almente, por exemplo, de forma constante ou sequencialmente em go- tas a uma solução de vórtice.
Assim que a mistura terminar, os materi- ais condensados, isto é, mininucleossomas carregadas, podem ser equilibradas por um período de vários minutos a várias horas, por exemplo, um período de 2 minutos a um período de 6 horas, antes da purificação.
A diálise pode ser realizada para remover as impurezas e trocar os tampões nesta fase.
Mininucleossomas carregadas podem ser purificadas usando várias técnicas.
Uma dessas técnicas é centri- fugar as partículas em alta velocidade em uma coluna com parâmetros de corte de peso molecular de 1 kiloDalton ou superior.
A velocidade de centrifugação pode variar de 7000 xg a 10000 xg dependendo do volume da amostra.
Da mesma forma, a duração da centrifugação po- de variar de 20 minutos à temperatura ambiente a uma hora, depen- dendo do volume da amostra.
Outra técnica disponível para purificar as mininucleossomas é a diálise.
A técnica de purificação pode não estar limitada a estas duas técnicas e aqueles versados na técnica es- tarão cientes de várias outras técnicas de purificação da literatura que podem ser usadas para purificar complexos de proteína/ácido nucleico.
Finalmente, as mininucleossomas carregadas podem ser eluídas ou coletadas em água livre de endotoxinas, solução salina normal ou qualquer outra solução tamponada, mas não se limitando a estes.
À recuperação esperada de DNA é —-30-70%. Mininucleossomas carre- gadas também podem sofrer centrifugação adicional em colunas de corte de peso molecular para concentrar ainda mais a quantidade de genoma do vetor na solução.
No presente exemplo, a mininucleosso- ma carregada é formulada para minimizar a presença de endotoxina.
Fontes típicas de endotoxinas são conhecidas por incluir plasmídeos, síntese de peptídeos ou de materiais usados na preparação.
Portanto, podem ser usados plasmídeos livres de endotoxina, e podem ser usa- dos materiais e equipamentos que foram depurados de endotoxina,
durante as preparações descritas neste Exemplo.
[00215] Um biorreator também pode ser usado para formular mini- nucleossomas carregadas para mistura consistente de ácidos nuclei- cos e peptídeos para produzir partículas para uso comercial e clínico. EXEMPLO 3: FORMATOS/TAMANHOS E FORMULAÇÕES FAVO-
RÁVEIS PARA MININUCLEOSSOMAS CARREGADAS
[00216] São fornecidas neste exemplo técnicas para produzir mini- nucleossomas carregadas em várias formulações, incluindo formula- ções úteis para administração a células e a indivíduos mamíferos, por exemplo, seres humanos. Mininucleossomas carregadas podem ser formuladas em parâmetros de formato e/ou tamanhos diferentes com base na sequência de aminoácidos da proteína do núcleo de mininu- cleossoma e nas condições de tampão em que ocorre a síntese. Mini- nucleossomas carregadas podem ser formuladas em diferentes condi- ções, por exemplo, com solubilidade adequada para uso terapêutico. Solubilidade de mininucleossomas carregadas em água e/ou solução salina normal é um meio para permitir a formulação não tóxica de composições para administração a pacientes e para facilitar a entrega aos pacientes. Para formar mininucleossomas carregadas representa- das na Figura 7, as proteínas do núcleo foram sintetizadas por síntese em fase sólida usando tampões de trifluoroacetato. 200 microgramas de DNA (SEQ ID NO: 396) foram adicionados a 1 miligrama de proteí- nas de núcleo liofilizadas e agitadas juntas, e purificadas para produzir mininucleossomas carregadas (Figura 7). A troca do tampão foi reali- zada e a formulação final da mininucleossoma foi feita em água estéril, livre de endotoxinas. 1 micrograma de cada tipo de mininucleossomas foi diluído em água e, em seguida, colocado em grades que foram manchadas com 0,75% de acetato de uranila em solução de metanol recém-preparado por dois minutos. As grades foram mergulhadas em etanol 100% e, em seguida, manchadas em papel absorvente de len-
tes.
As grades foram então secas ao ar por alguns minutos com o filme voltado para cima e tiradas para imageamento com a câmera Ham- matsu ORCA HR (Figura 7). O polinucleotídeo utilizado na geração de proteínas de núcleo de mininucleossoma carregada da presente divul- gação como um plasmídeo que codifica luciferase, mas aqueles ver- sados na técnica apreciarão que o presente Exemplo é amplamente demonstrativo da capacidade geral de proteínas de núcleo de mininu- cleossoma da presente divulgação para se associar a polinucleotídeos e formar mininucleossomas carregadas.
O plasmídeo da luciferase é representativo do ácido nucleico em geral, incluindo, sem limitação, plasmídeos, ácidos nucleicos lineares, RNA e DNA de todos os tipos.
Em outros casos, por exemplo, RNA ou DNA de outras sequências ou estruturas podem ser usados na produção de mininucleossomas car- regadas.
O plasmídeo da luciferase condensado com a proteína do núcleo da SEQ ID NO: 393, levou a mininucleossoma carregada em formato espiral/helicoidal (Figura 7A). O plasmídeo da luciferase con- densado com a proteína do núcleo com SEQ ID NO: 390, levou a mi- ninucleossomas carregadas em forma de haste/lobular (Figura 7B). Uma mistura de moléculas circulares e semelhantes a hastes foi ob- servada para a mininucleossoma carregada produzida por condensa- ção do plasmídeo de luciferase com a proteína do núcleo SEQ ID NO: 391 (Figura 7C). Existem outras condições de tampão e sequência de aminoácidos com carga variável e ponto isoelétrico que podem produ- zir mininucleossomas com carga esférica ou circular.
Moléculas de di- ferentes formas e tamanhos podem aumentar o tropismo para certos tipos de células.
Os vírus de formatos diferentes transduzem diferentes tipos de células com mais eficácia.
Por exemplo, o vírus do mosaico do tabaco é uma estrutura do nucleocapsídeo em forma de espi- ral/helicoidal que transduz as células da planta do tabaco, o HIV é re- dondo ou em forma de bola que infecta os glóbulos brancos e o AAV2 é uma forma icosaédrica que transduz as células do fígado de forma eficaz. Observamos melhor tropismo de transdução de mininucleos- somas em forma de espiral em comparação com aqueles em forma de haste em células musculares (Figura 18). Foi possível formular mininu- cleossomas carregadas com formas diferentes, conforme descrito nes- te documento. Mininucleossomas distintas também podem ser purifi- cadas com base em formas e tamanhos exclusivos.
EXEMPLO 4: VIA DE ADMINISTRAÇÃO- INTRAVENOSA (SISTÊ- MICA) E APLICAÇÃO EM DOENÇAS SISTÊMICAS COMO HEMO- FILIA A.
[00217] Este exemplo demonstra que mininucleossomas carrega- das podem ser entregues por vias intravenosas para expressar proteí- nas no fígado e outros órgãos. Camundongos Balb/c foram contidos usando técnicas padrão e seringas de insulina foram usadas para en- tregar mininucleossomas carregadas e controles de plasmídeo por meio de injeções na veia da cauda. Construtos de plasmídeo expres- sando F8 ("plasmídeo F8"; ver, por exemplo, MN nº 1 e MN nº 2, figura 8) foram preparados por condensação de SEQ ID NO: 390 e SEQ ID NO: 391, respectivamente, com DNA de plasmídeo F8 (SEQ ID NO: 394). A sequência de plasmídeo para o construto que expressa GFP é fornecida na SEQ ID NO: 8. No presente exemplo, para direcionar mi- ninucleossomas carregadas para células do fígado, foram incorpora- dos 2 domínios de aminoácidos NGR ao lado de domínios de ligação de ácido nucleico (SEQ ID NO: 3). Foi demonstrado que os domínios NGR em AAV2 promovem a ligação da integrina aVB5. Os domínios NGR estão implicados na ligação do sulfato de heparano, conhecido como receptor para AAV2. AAV?2 é conhecido por alto tropismo hepáti- co. O motivo de aminoácidos KRH também incorporado nessas proteí- nas centrais serve como um local de corte para POSK1 para liberação aprimorada de ácidos nucleicos. A inclusão de múltiplas sequências de aminoácidos de KRH deve aumentar a liberação de mininucleossomas carregadas. Cada camundongo recebeu uma dose de 40 microgramas de qualquer MN nº 1, MN nº 2 ou plasmídeo nu F8 (SEQ ID NO: 394). Para testar a expressão da proteína F8, -150 ul do sangue foi coletado pela técnica de sangramento da bochecha antes (1 dia antes) e após os tratamentos (pós-tratamento - 3 dias, 1 semana, 2 semanas, 1 mês, 3 meses e 4 meses). O soro foi preparado a partir de sangue usando técnicas padrão. Elisa de F8 (Aviva Systems Biology) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante usando diluições de soro de 1:6. Mininucleossomas carregadas nº 1 (MN nº 1 inclui SEQ ID NO: 390 + Plasmídeo F8) e MN nº 2 (MN nº 2 inclui SEQ ID NO: 391 + Plasmídeo F8) expressou aproximadamente seis vezes mais F8 em comparação com o nível de F8 detectado por ELISA em amostras de pré-tratamento. MN nº 1 manteve níveis de expressão significativa- mente elevados em 3 meses e 4 meses após uma única injeção de mininucleossoma carregada (Figura 8). Os camundongos de controle tratados com plasmídeo nu que codifica F8 (não complexado com pro- teínas do núcleo de mininucleossoma) não demonstraram aumento significativo na expressão de F8 em nenhum dos pontos de tempo (Fi- gura 8).
[00218] Em outro experimento, a fluorescência direta de GFP foi observada em tecidos coletados de camundongos que foram submeti- dos à injeção intravenosa de mininucleossomas carregadas com plas- mídeo que expressa GFP (SEQ ID NO: 390 + Plasmídeo GFP, SEQ ID NO: 395) (Figura 9). Resumidamente, os camundongos foram perfun- didos com 1x PBS e sacrificados. O fígado inteiro foi coletado após a dissecção. Os tecidos do fígado foram fixados em 4% de paraformal- deído durante a noite, em seguida, lavado em 1xPBS, imerso em saca- rose 15% por algumas horas e, em seguida, em solução de sacarose a 30% durante a noite para criopreservação. Os tecidos foram, então,
colocados em um frasco de plástico e congelados usando composto de OCT para seccionamento. Cortes de tecido com espessura de 10 mícrons foram obtidos usando um criotomo. As seções de fígado fo- ram montadas com meios de montagem com ou sem DAP, lamela e seladas. As imagens foram adquiridas por escopos confocal e epifluo- rescente Leica SP5.
[00219] Os resultados demonstraram que, quando administrados por via intravenosa, as mininucleossomas atingiram com sucesso o fígado e os genes codificados por carga das mininucleossomas foram expressas nas células do fígado (Figura 9). Foi observada expressão em vários tipos de células do fígado. As observações do presente Exemplo sugerem que a entrega de mininucleossomas carregadas ao fígado não depende dos domínios de direcionamento. Um versado na técnica, em vista dos dados fornecidos nos presentes Exemplos, en- tenderia que mininucleossomas carregadas podem ser entregues às células no rim e baço por meio de administração intravenosa, uma vez que, como o fígado, esses órgãos normalmente funcionam na elimina- ção de, por exemplo, fármacos.
[00220] Um exemplo de uma afecção que, tendo em vista a presen- te divulgação, pode ser tratada pelo uso de um agente terapêutico de mininucleossoma carregada é a hemofilia A. A hemofilia A é um distúr- bio hemorrágico grave causado pela mutação no fator 8, um fator de coagulação. É herdado de forma recessiva alinhada a X. Ocorre em aproximadamente 1 em 5000 nascidos vivos. As implicações mais sé- rias são hemorragias internas que podem levar à morte. A gravidade depende da quantidade de F8 circulando no corpo. 75% dos pacientes com hemofilia tomam um produto F8 recombinante como terapia. Os indivíduos que recebem a terapia F8 são repetidamente infundidos por via intravenosa, causando uma grande sobrecarga para os pacientes, médicos e cuidadores ao longo do tempo. Atualmente, os ensaios de terapia genética estão em andamento para entregar a expressão de F8 a longo prazo por meio de AAVs. No entanto, F8 é um grande gene que não pode ser totalmente incorporado no AAV. Assim, mini-F8 foi utilizado para entregar domínios funcionais de F8 para tratar esta do- ença. É bem sabido que o mini-F8 não tem a mesma capacidade fun- cional e estabilidade do F8 completo. Além disso, 20-40% da popula- ção já tem anticorpos neutralizantes contra o AAV que tornarão uma grande população de pacientes hemofílicos incapazes de receber o medicamento baseado no AAV. Além disso, se um tratamento adicio- nal fosse necessário após um primeiro curso descontinuado de trata- mento com AAV, os vetores AAV não podem ser redoseados devido à imunogenicidade. Por ser capaz de entregar o tamanho total do gene F8 (Figura 8) e por causa de sua natureza redosável (Figura 17), as mininucleossomas carregadas resolvem esses dois problemas da te- rapia gênica de AAV. Assim, a presente divulgação fornece técnicas para entregar mininucleossomas carregadas em diferentes tipos de células no espaço sistêmico, como fígado, rim, baço, etc. usando o modo de entrega intravenosa, para uso em muitas condições das quais a hemofilia A é exemplar.
[00221] Outras doenças sistêmicas que frequentemente resultam de defeitos nas proteínas secretadas também podem ser tratadas com agentes terapêuticos de mininucleossomas carregadas. O presente Exemplo (Figura 8) demonstrou que mininucleossomas carregadas, administradas por via intravenosa (administração sistêmica), produzem proteínas em níveis mais elevados do que o limite terapêutico que é aproximadamente 10% dos níveis endógenos determinados por vários ensaios clínicos demonstrando, entre outras coisas, potencial terapêu- tico de mininucleossomas como agentes terapêuticos para o tratamen- to de, por exemplo, doenças sistêmicas em que uma proteína secreta- da pode ser expressa por vários tipos de células. Em alguns casos, a expressão pode ser restrita a certos tipos de células usando um pro- motor específico do tipo de célula. Um versado na técnica também en- tenderia a partir da presente divulgação que outros tecidos, como cé- rebro, coração, músculos, etc., também podem ser acessados e trans- duzidos por meio de administração intravenosa. O mecanismo de alve- jamento embutido nas proteínas do núcleo de mininucleossoma deve ajudar nesse contexto.
[00222] “Quando injetados por via intravenosa, as mininucleossomas carregadas podem ser administradas em uma dose superior a 1e5 có- pias do genoma por kg e até uma dose de 1625 cópias por kg de peso corporal (por exemplo, em cerca de 1e5, 1e6, 1e7, 1e8, 1e9, 1e10, 1615, 1620 ou 1625 cópias por kg de peso corporal ou qualquer inter- valo entre). O volume do material pode variar de 1 a 900 mililitros (por exemplo, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ou 900 mililitros). As mininucleossomas carregadas também po- dem ser administrados repetidamente (por exemplo, um volume sele- cionado e/ou número de cópias do genoma pode ser administrado vá- rias vezes ou dividido entre dois ou mais faz). EXEMPLO 5: VIA DE ADMINISTRAÇÃO - INTRAOCULAR
[00223] Este exemplo demonstra que as mininucleossomas carre- gadas podem ser entregues por via intraocular para expressar proteí- nas no epitélio pigmentar da retina (EPR) ou em outros neurônios da retina, como fotorreceptores, células bipolares e células ganglionares. No presente exemplo, camundongos Balb/c foram anestesiados por injeção IP com Cetamina/Xilazina (90-100 mg/kg + 10 mg/kg) e posici- onado sob um microscópio. Os olhos dos camundongos foram dilata- dos com tropicamida tópica (1%) e 1 ul de mininucleossomas carrega- das (dose total de 1,5 microgramas em camundongos) foram injetados na cavidade vítrea usando agulha sem ponta de gaze 32 passando pela incisão feita por uma agulha de gaze 25 abaixo do limbo. Em vá-
rios pontos de tempo, os camundongos foram perfundidos com 10 ml! de 1xPBS e, em seguida, sacrificados usando técnicas padrão. Os camundongos foram enucleados e as oculares foram coletadas e incu- badas em 4% de paraformaldeído durante a noite. As oculares foram lavadas com 1xPBS, a seguir imersas em sacarose 15% por algumas horas e depois em solução de sacarose a 30% durante a noite para criopreservação. As oculares foram, então, colocadas em um frasco de plástico e congeladas usando composto de OCT para criosseciona- mento. Seções de tecido de 10 mícrons de espessura foram obtidas para coloração. As seções retinais foram montadas com meios de montagem com ou sem DARPI, lamela e seladas. As imagens foram adquiridas pela Leica SP5. Para imagens de montagem inteira, as ocu- lares foram fixadas em 4% de paraformaldeído durante a noite. As oculares foram lavadas em 1xPBS, a retina foi removida e a ocular res- tante ou contagem total de EPR foi processada para coloração. O teci- do EPR foi totalmente montado com meios de montagem, lamela e se- lado. As imagens foram adquiridas pela Leica SP5. A fluorescência de GFP nativa foi observada na retina e nas células EPR (Figura 10, 11 e 12).
[00224] Para direcionar as células EPR, o presente Exemplo utilizou uma proteína de núcleo de mininucleossoma (SEQ ID NO: 392) que poderia se ligar às proteínas fagocíticas como MERTK. EPR são célu- las fagocíticas, que estendem suas microvilosidades ao fotorreceptor junção do segmento interno/externo. MERTK é expresso nessas mi- crovilosidades. Na SEQ ID NO: 392, foram incorporados os sinais "coma-me" conforme descrito na Tabela 8. Na literatura, os sinais "coma-me" são descritos como domínios expostos em fragmentos ce- lulares que são preparados para fagocitose (Wei Li, Journal of Cell physiology, 2016, que é aqui incorporado por referência). Até onde o presente inventor sabe, esses sinais de "coma-me" nunca foram utili-
zados antes no contexto de vetores não virais. Esses domínios de si- nal "coma-me" não foram aplicados anteriormente para vetores não virais para direcionar as células EPR.
[00225] Para transduzir seletivamente fotorreceptores, o presente Exemplo utilizou proteínas de núcleo como aquelas de SEQ ID NO:388. SEQ ID NO:388 incluiu um elemento de fixação neuronal (LRE) aqui descrito na Tabela 8, que poderia permitir a transdução em células ganglionares, células bipolares e fotorreceptores que são todos neurônios na retina (Figura 12). Este domínio de fixação neuronal não foi aplicado anteriormente para vetores não virais para alvejar os neu- rônios. A presente divulgação prevê que este vetor neuronal alvejado pode transduzir neurônios no cérebro por meio de administração local ou sistêmica. A presente divulgação fornece ainda o alvejamento da ligação e internalização de fotorreceptores através da incorporação de domínios de ligação de lectina (descritos na Tabela 4) em mininu- cleossomas para fixação à matriz extracelular de fotorreceptores para aumentar a absorção. Um domínio de ligação de integrina incorporado na proteína do núcleo de mininucleossoma (SEQ ID NO: 390) também pode transduzir células EPR em olhos de rato exclusivamente quando administrado intraocular (Figura 11). Além disso, mais de um domínio pode ser utilizado para transduzir seletivamente uma pluralidade de diversos tipos de células. Esta proteína do núcleo (SEQ ID NO: 390) com propriedades de ligação a integrina pode também ser utilizada para a entrega de ácidos nucleicos de outros tipos de células que ex- pressam níveis elevados de aVB5 integrina. A presente divulgação for- nece ainda o uso de outras técnicas de injeção intraocular, como ad- ministração sub-retiniana, supracoroidal, intracameral ou tópica para alvejar fotorreceptores, EPR, células de Mueller ou outros tipos de cé- lulas na retina.
[00226] São fornecidas aqui técnicas para entregar mininucleosso-
mas carregadas em diferentes tipos de células na retina usando o mo- do de entrega intravítreo ou sub-retinal. Doenças como degeneração retinal são causadas principalmente por mutações em genes expres- sos nos fotorreceptores. A degeneração macular relacionada à idade (DMRI), é uma doença do epitélio pigmentar da retina (EPR) e corio- capilares, que afeta >10 milhões de americanos e >100. Atualmente, a tecnologia predominante para entregar vetores de terapia genética a fotorreceptores e EPR é uma técnica cirúrgica em que os vírus são in- jetados sub-retina na retina. No entanto, o procedimento sub-retiniano é uma cirurgia complexa realizada na sala de operação por um cirur- gião oftálmico treinado. Existe uma necessidade não atendida, pelo menos, nos Estados Unidos, há apenas poucos cirurgiões treinados para realizar esta cirurgia. Uma maneira de reduzir a carga para paci- entes e médicos é desenvolver vetores que possam ser injetados in- travitreamente, que possam passar pela retina para transduzir os fotor- receptores e o EPR. A injeção intravítrea pode ser realizada por todos os oftalmologistas em uma visita ao paciente. A terapia de mininu- cleossoma carregada resolve esse problema, pois as injeções intraví- treas podem transduzir fotorreceptores e EPR seletivamente (Figura 10, 11 e 12). Isso torna as mininucleossomas altamente adequadas para o tratamento da maioria das doenças da retina com defeitos ge- néticos.
[00227] “Quando injetados de modo intraocular, as mininucleosso- mas carregadas podem ser entregues a uma dose maior que 1e5 có- pias de genoma por olho e até uma dose de 1e25 cópias por olho (por exemplo, a cerca de 1e5, 1e6, 1e7, 1e8, 1e9, 1610, 1615, 1620 ou 1625 cópias por, ou qualquer fixa entre as mesmas). O volume do ma- terial pode variar de 10 a 500 microlitros quando injetado sub-retiniana (por exemplo, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 ou 500 mi- crolitros) e 10-250 microlitros quando a injeção é intravítrea, supraco-
roidal ou intracameral (por exemplo, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200 ou 250 microlitros). O agente terapêutico de mininucleossoma car- regada também pode ser administrado repetidamente (por exemplo, um volume selecionado e/ou número de cópias do genoma pode ser administrado várias vezes ou dividido entre dois ou mais faz). EXEMPLO 6: VIA DE ADMINISTRAÇÃO - INTRANASAL
[00228] Este exemplo demonstra que mininucleossomas carrega- das podem ser entregues por via intranasal para expressar proteínas nas células do pulmão, traqueia e intestino. No presente exemplo, para alvejar células epiteliais no epitélio pulmonar, 2 domínios de aminoáci- dos NGR foram incluídos em uma proteína de núcleo de mininucleos- soma ao lado de domínios de ligação de ácido nucleico (ver uso de domínios de aminoácidos NGR SEQ ID NO: 390). Tanto quanto é do conhecimento do presente inventor, os domínios NGR nunca foram utilizados para criar e entregar complexos de DNA/proteína não virais para células da retina, conforme divulgado aqui. Foi demonstrado que os domínios NGR em AAV2 promovem a ligação de integrina aVB5. Os domínios NGR estão implicados na ligação do sulfato de heparano, conhecido como receptor para AAV2.
[00229] No presente exemplo, camundongos Balb/c foram aneste- siados por injeção IP com Cetamina/Xilazina (90-100 mg/kg + 10 mg/kg) e os camundongos anestesiados foram posicionados sob um microscópio para visualização da área nasal para entrega intranasal. 1 ul de solução de mininucleossoma carregada (SEQ ID NO: 390 + plasmídeo de GFP) foi entregue na cavidade nasal a cada poucos se- gundos até que 12 microlitros fossem entregues em cada lado nasal. A dose total de 25 microgramas foi administrada. Após o sacrifício, o pulmão dos camundongos foi processado para obter seções de 10 mí- crons de espessura. As seções foram lavadas em PBS e incubadas em tampão de bloqueio (0,1% TritonX-100, 1% BSA, 3% de soro de burro) por 1 hora e depois incubadas em tampão de bloqueio de anti- corpo CFTR (preparado em tampão de bloqueio) durante a noite a 4 graus Celsius. No dia seguinte, lavado em PBS 3x5 min e incubado em AlexaFlour-555 (IgG secundária anticoelho de burro) em tampão de bloqueio à temperatura ambiente por 1 hora e lavado em PBS 3x5 min. O meio de montagem foi adicionado e a lamela foi aplicada e selada. A fluorescência nativa de GFP foi obtida no canal de 486 nm do escopo Leica SP5 no comprimento de onda de 486 nm e a expressão de CFTR no canal de 555 nm. Foi observada a expressão de mininu- cleossomas carregadas já em 3 dias e em PI-3 meses também (Figura 13). Foi observada a expressão no epitélio de ambos os alvéolos e bronquíolos (Figura 13A e 13C) representada por fluorescência verde nítida juntamente com a coloração CFTR. A colocalização de CFTR e GFP (Figura 13C) demonstra a expressão de genes codificados por mininucleossomas no epitélio pulmonar. Imagens de maior ampliação tiradas de um anel de alvéolo (Figuras 14 A, B e C) também exibem claramente um anel verde brilhante de fluorescência de GFP no epité- lio juntamente com fluorescência vermelha em células coradas com CFTR.
[00230] No presente exemplo, o tecido pulmonar total e a biodistri- buição via mininucleossoma também foram avaliados (Figura 15). To- do o tecido pulmonar foi extraído de camundongos após perfusão e sacrifício. O tecido pulmonar foi fixado em 4% de PFA e lavado com 1xPBS. Tecidos inteiros foram colocados no imageador Odyssey para detectar fluorescência nativa GFP. O controle não injetado não exibiu qualquer fluorescência (Figura 15). Mininucleossomas carregadas, in- cluindo carga de ácido nucleico de plasmídeo que codifica GFP, de- monstraram fluorescência de GFP em todo o tecido pulmonar em amostras de 5 semanas após a injeção (Figura 15).
[00231] São fornecidas aqui técnicas para entregar mininucleosso-
mas carregadas em diferentes tipos de células em tecidos do espaço pulmonar, como epitélio pulmonar, e/ou traqueia usando o modo de entrega intranasal. As doenças genéticas, como a fibrose cística, afe- tam o pulmão e outros órgãos. Para entregar genes ao pulmão, a via intranasal é uma das vias de escolha. Observa-se que as mininucleos- somas carregadas, quando administrados por via intranasal, expres- sam proteínas nos alvéolos e bronquíolos (Figura 13). Estes são teci- dos que normalmente expressariam a proteína CFTR implicada na fi- brose cística. Em outras doenças, esta via de administração pode ser usada para produzir proteínas terapêuticas que poderiam aliviar outras doenças. A rota intranasal também pode fornecer acesso a outros ór- gãos, como intestino e cérebro (Figura 16). A inclusão de domínios NGR nas proteínas do núcleo de mininucleossoma (SEQ ID NO: 390), permitiu a captação e liberação aprimoradas de moléculas de DNA no núcleo para altos níveis de expressão sustentada. Isto é evidenciado na Figura 16 pela fluorescência verde brilhante observada a partir de mininucleossomas carregadas vs nenhum padrão nos animais não tra- tados (imagem do pulmão na primeira linha na Figura 16) em 5 sema- nas após o tratamento. Também é observada a transdução da expres- são de GFP no epitélio traqueal e músculo traqueal após a entrega intranasal de mininucleossomas carregados (Figura 17).
[00232] “Quando injetadas por via intranasal, as mininucleossomas carregadas podem ser administradas em uma dose superior a 1e5 có- pias do genoma por kg e até uma dose de 1625 cópias por kg de peso corporal (por exemplo, em cerca de 1e5, 1e6, 1e7, 1e8, 1e9, 1e10, 1615, 1620 ou 1625 cópias por kg de peso corporal ou qualquer inter- valo entre). O volume do material pode variar de 1 a 200 mililitros (por exemplo, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100 ou 200 mililitros). As mininu- cleossomas carregadas também podem ser administradas repetida- mente. As mininucleossomas carregadas também podem ser adminis-
tradas por via oral para acessar o intestino, o pâncreas, etc. EXEMPLO 7: VIA DE ADMINISTRAÇÃO - INTRAMUSCULAR
[00233] Este exemplo demonstra que mininucleossomas carrega- das podem ser entregues por via intramuscular para expressar proteí- nas nas células musculares. Camundongos Balb/c foram anestesiados por injeção IP com Cetamina/Xilazina (90-100 mg/kg + 10 mg/kg) e várias mininucleossomas carregadas foram injetadas em ambos os músculos da perna em doses de 17,5 ug por perna usando uma serin- ga de insulina (dose total de 35 microgramas por camundongo). Os camundongos foram sacrificados em vários pontos de tempo e os músculos da perna foram obtidos para seções de tecido. Construtos que continham proteínas de núcleo, como polilisina (SEQ ID NO: 393) ou mininucleossoma com outras combinações de domínio (SEQ ID NO: 389) não exibiram fluorescência de GFP no ponto de tempo de 3 meses. Surpreendentemente, em seções de tecido muscular obtidas a partir de 3 meses após as injeções, observamos fluorescência verde nítida em células de músculo esquelético injetadas com mininucleos- somas carregadas contendo galactose e domínio de ligação de fucose como mostrado em SEQ ID NO: 391 (Figuras 18 A, B e C). Isso de- monstra que alguns domínios têm uma maior propensão de fixação e internalização em células musculares e podem ser utilizados para transferência eficiente de genes para células musculares. Um especia- lista na técnica pode contemplar a combinação de tais domínios com outros domínios conhecidos para tropismo muscular.
[00234] Para validar a especificidade muscular da expressão de genes codificados pela carga de ácido nucleico, utilizamos a imuno- marcação da distrofina como um marcador secundário endógeno. Re- giões de fluorescência verde nítida (painel A) circundadas por fluores- cência vermelha (painel B; fundidos no painel C) de coloração com dis- trofina demonstra claramente que mininucleossomas carregadas inje-
tadas por via intramuscular podem entregar genes às células muscula- res (Figura 18). A fluorescência nativa de GFP foi obtida no canal de 486 nm do escopo Leica SP5. A distrofina em vermelho é o canal RFP (555 nm). As células musculares não transduzidas na Figura também servem como controle interno para a diferenciação entre o sinal GFP e a autofluorescência.
[00235] São fornecidas aqui técnicas para entregar mininucleosso- mas carregadas em células musculares por modo de entrega intra- muscular. Muitas distrofias musculares genéticas levam à atrofia das células musculares. Para entregar genes funcionais a essas células musculares, a via intramuscular fornece vias diretas de administração. Demonstramos o tropismo muscular e a capacidade das mininucleos- somas carregadas de expressar genes nas células do músculo esque- lético (Figura 18). A expressão foi observada nas células musculares já no dia 2 após o parto. São fornecidos aqui os domínios musculares trópicos que podem aumentar a absorção do vetor e a expressão do gene, no entanto, não se limitam a isso. Também observamos que mi- ninucleossomas carregadas em forma de espiral entregues por via in- tramuscular, transduzem células musculares de forma eficaz e por pe- ríodos mais longos - neste caso, 3 meses (Figura 18) em comparação com a molécula de forma lobular (dados não mostrados). A forma dos vetores não foi descrita antes no contexto da entrega de genes às cé- lulas musculares. Um versado na técnica pode contemplar a utilização de outras estruturas para aumentar o tropismo celular para células musculares. No geral, a expressão de GFP em células musculares que expressam distrofina demonstra a capacidade de mininucleossomas carregadas para resgatar doenças como distrofia muscular de Du- chenne ou outras distrofias musculares. O tropismo muscular também pode ser aumentado pela inclusão de outros domínios descritos na Tabela 4. O tropismo muscular também pode ser obtido por adminis-
tração intravenosa.
[00236] Quando injetadas por via intramuscular, as mininucleosso- mas carregadas podem ser administradas em uma dose superior a 1e5 cópias do genoma por kg e até uma dose de 1625 cópias por kg de peso corporal (por exemplo, em cerca de 1e5, 1e6, 1e7, 1e8, 1e9, 1610, 1615, 1620 ou 1625 cópias por kg de peso corporal ou qualquer intervalo entre). O volume do material pode variar de 1 a 900 mililitros (por exemplo, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ou 900 mililitros). As mininucleossomas carregadas também podem ser administradas repetidamente (por exemplo, um volume se- lecionado e/ou número de cópias do genoma pode ser administrado várias vezes ou dividido entre dois ou mais faz). As mininucleossomas carregadas também podem ser administradas de modo intravenoso para acessar células musculares. EXEMPLO 8: MININUCLEOSSOMAS CARREGADAS SÃO REDO-
SÁVEIS
[00237] Este exemplo demonstra que as mininucleossomas podem ser administradas novamente sem qualquer efeito neutralizante na ex- pressão de proteínas (Figura 19). Camundongos Balb/c foram sim- plesmente contidos usando técnicas de restrição padrão e seringa de insulina foi usada para entregar as mininucleossomas carregadas MN nº 1 (SEQ ID NO: 390 + Plasmídeo F8) e MN nº 2 (SEQ ID NO: 391 + Plasmídeo F8, SEQ ID NO: 393) via injeção na veia da cauda. Cada camundongo recebeu 20 microgramas na 1º dose e 40 microgramas na 2º de dose (30 dias após 1º dose). Soro foi recolhido pela técnica de sangramento na bochecha no dia 3 1º e 2º doses. -150 ul do san- gue foi coletado a cada vez e o soro foi coletado do sangue usando técnicas padrão. Elisa de F8 foi realizado para determinar os níveis de expressão de F8 no soro em camundongos Balb/c após a entrega in- travenosa de mininucleossomas carregadas. O Elisa de F8 foi realiza-
do de acordo com as instruções do fabricante (Aviva Systems Biology). Diluições de soro de 1:6 foram feitas para todos os ensaios. Observa- mos que, quando entregue uma segunda vez, não houve efeito neutra- lizante nos níveis de expressão, conforme evidenciado pelo aumento nos níveis de proteína de F8 (Figura 19).
[00238] São fornecidos aqui exemplos de proteínas de núcleo de mininucleossoma e mininucleossoma carregada que podem ser entre- gues repetidamente para aumentar os níveis de expressão das proteí- nas desejadas. A capacidade de redefinição de dose é um recurso muito importante para qualquer medicamento que requeira administra- ção repetida. Na terapia gênica, atualmente uma das características mais indesejáveis dos vetores virais é a incapacidade de readministrar medicamentos. O vetor viral, uma vez injetado no paciente, leva à for- mação de anticorpos neutralizantes. Isso causa imunogenicidade e inexpressibilidade quando são administrados pela segunda vez. É mostrado aqui que a entrega de genes mediada por mininucleossomas resolve esse problema. A natureza não imunogênica da mininucleos- soma é geneticamente modificada por projeto: pela combinação de autopeptídeos ou sequências de aminoácidos derivadas de seres hu- manos e aprimorada por peguilação. Na literatura, foi demonstrado que as proteínas peguiladas evitam o sistema imunológico. Neste ca- so, em camundongos, a falta de imunogenicidade para proteínas nu- cleares derivadas de seres humanos artificiais, valida ainda mais o ca- so de peguilação. Este recurso de redosabilidade permitirá vários tra- tamentos aos pacientes quando necessário. Em caso de diminuição dos níveis de expressão ao longo do tempo, este recurso redosável permitirá repetir o tratamento para aumentar a expressão para os ní- veis desejados. Esses dados também mostram que, em alguns pacien- tes que precisam de injeções em vários órgãos, a transferência de ge- nes mediada por mininucleossomas será mais desejável. Um versado na técnica também pode contemplar a dosagem repetida por meio de muitas outras vias de administração, tais como tópica, oral, vaginal, intraperitoneal, intraocular, intratecal, intracerebral, subcutânea etc. ou via encapsulamento em lipossomos ou outros materiais sintéticos.
[00239] “Doses de repetição podem ser entregues a uma concentra- ção maior que 1e5 cópias de genoma por kg e até uma a dose de 1e25 cópias por kg de peso corporal (por exemplo, a cerca de 1e5, 166, 167, 168, 169, 1010, 1615, 1020 ou 1e25 cópias por kg de peso corporal, ou qualquer faixa entre as mesmas). O volume do material pode variar de 1-900 mililitros (por exemplo, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ou 900 mililitros). As mininu- cleossomas carregadas também podem ser administradas repetida- mente (por exemplo, um volume selecionado e/ou número de cópias do genoma pode ser administrado várias vezes ou dividido entre dois ou mais faz). EXEMPLO 9: TÉCNICAS GEAIS
[00240] Este exemplo descreve técnicas gerais para clonagem, en- trega de mininucleossomas nas células. Algumas das técnicas de clo- nagem que podem ser aplicadas para construir esses vetores podem incluir - síntese de construtos de transgene, clonagem de TOPO PCR, clonagem de ponta cega, clonagem contínua, clonagem de fragmento longo, digestão com enzimas de restrição e ligação, mas não se limi- tando a essas técnicas. As moléculas de DNA ou RNA podem expres- sar um ou mais marcadores de expressão, como GFP, YFP e Lucife- rase, mas não se limitando a eles. As moléculas de DNA ou RNA po- dem expressar um ou mais RNA terapêutico ou proteínas, mas não se limitando a eles.
[00241] — Mininucleossomas carregadas podem ser testadas quanto à sua função e caracterizadas in vitro, expressando as mesmas em células HEK ou outras linhas de células animais. Capacidade de mini-
nucleossomas carregadas sintetizadas e/ou purificadas para transduzir células-tronco hematopoiéticas ou células mononucleares de sangue periférico diferenciadas pode ser testada expondo as células às mini- nucleossomas carregadas em cultura. Mininucleossomas carregadas também podem ser testadas quanto à sua função e capacidade de formar células T quiméricas in vitro por exposição a mininucleossomas ou por meio de técnicas de transfecção ou outros métodos físicos para inserções. Mininucleossomas carregadas podem ser testadas quanto à sua função e caracterizadas in vivo pela distribuição em camundongos ou qualquer outro modelo animal, mas não se limitando neste sentido.
SEQUÊNCIAS: SEQ ID NO:388 KKRHRK-[LIGANTE]-LRE-[LIGANTE] KRHRKLRRRRRLKRHRKKRHRK-[LIGANTE]-LRE-[LIGANTE]-K (Onde [LIGANTE] poderia ser qualquer sequência de aminoácidos descrita na Tabela 12, mas não limitada a ela) SEQ ID NO:389 KKKRHRKRKRKRKRRRRKKK-[LIGANTE]-ASSLNIAK-[LIGANTE]-
RRRR (Onde [LIGANTE] poderia ser qualquer sequência de aminoácidos descrita na Tabela 12, mas não limitada a ela) SEQ ID NO:390 KKKRK-[LIGANTE]-NGR-[LIGANTE] - KRKRKKRHRKKKKRRRRKRHRK-[LIGANTE] -NGR-[LIGANTE]-KKK (Onde [LIGANTE] poderia ser qualquer sequência de aminoácidos descrita na Tabela 12, mas não limitada a ela) SEQ ID NO:391 KKKRHRKKKKK-[LIGANTE] -RGD-ILIGANTE] -KKKK-[LIGANTE] - NTQIH-[LIGANTE] -RRRRR-[LIGANTE] -TPH-[LIGANTE] -KK (Onde [LIGANTE] poderia ser qualquer sequência de aminoácidos descrita na Tabela 12, mas não limitada a ela) SEQ ID NO:392 KKKRK-[LIGANTE]-KTKKK-[LIGANTE]-AK-[LIGANTE] —KALKKK- [LIGANTE]-K-KGKKKKRRRRKAAPKK (Onde [LIGANTE] poderia ser qualquer sequência de aminoácidos descrita na Tabela 12, mas não limitada a ela) SEQ ID NO:393
CKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK SEQ ID NO:394 Plasmídeo CBA-F8
TCGCGCGTTTCGGTGATCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACT CTCCCCATOETOECocococcotvoocccACCCCCAATTTTGTATTTATTTA
TTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCEGEGGGGGGGGGGGÇ GGGCGCGCGCCAGECEGEGGCEGEGCEGGGCGAGGEGGCEGESEG
CGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGC GCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCG6
GCCCTATAAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGÇ ACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCcoGoTtooGcoGcCoGcoToGCOGC CGCCCGCCceGesceTtoetvegACTGACCOGCGTTACTCCCACAGGTGAG
CGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCEGGGCTGTAATTAGCOGCTTGG TTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGA GGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGÇ
GGGGTGCGTGCGEGTEGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTECGGÇ CCCEGCGCTGCCeGGCGGCTETGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCG6
GGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCG GGGGCGGTGCCCCGCGEGTEGCEGEGGGGGCTEGCGAGGGGAACA
AAGGCTGCGTGCGGGGTEGTEGTGCGTSGGGGGGGTGAGCAGGGGG TGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCccoTGCACCOCCCCT CCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCeGGCTTEGGGTGCGGGGCTCC
GTACGGGGCGTGGCGCEGGGGCTCGCCGTECCGGGCGGGGGGST
GGCGGCAGGTGGGGECTECCGGGCSGGGEGCEGGEGCCGCCTCGEGS CCGGGGAGGGCTCEGEGGAGGGGCGCSGGCGGCCCcessAGEGS
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CGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGEGCGCCGGCAGGAAGGAAAT GGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTEGCOGCGCOGCesToOCOTT
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ATGGATTCTGCATCTGCTAGAGACTGGCCTAAAATGCACACAGTC AATGGCTATGTAAACAGGTCTCTTCCAGGTCTGATTGGATGCCATA GGAAATCAGTCTACTGGCACGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTG AAATACACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTTTTGTGAGGAA CCACCGTCAAGCTTCATTGGAGATATCACCAATAACTTTCCTTACT GCTCAAACACTCTTGATAGATCTTGGGCAGTTCCTACTATTITGTC ATATCTCTTCCCATAAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGT AGATAGCTGCCCTGAGGAATCCCAATGGCAAAAGAAAAATAATAA TGAGGAAATGGAAGATTATGATGATGATCTTTATTCAGAAATGGAT ATGTTCACATTGGATTATGACAGCTCTCCTTTTATCCAAATTCOGCT CGGTTGCTAAAAAGTACCCTAAAACTTGGATACATTATATTTCTGC TGAGGAGGAAGACTGGGACTATGCACCTTCAGTTCCTACCTCGGA TAATGGAAGTTATAAAAGCCAGTATCTGAGCAATGGTCCTCATCG GATTGGTAGGAAATATAAAAAAGTCAGATTTATAGCATACACAGAT GAAACCTTTAAGACTCGTGAAACTATTCAGCATGAATCAGGACTCT TGGGACCTTTACTTTATGGAGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTAT TTTTAAGAATCAAGCAAGCCGACCATATAACATTTACCCTCATGGA ATCACTGATGTCAGTCCTCTACATGCAAGGAGATTGCCAAGAGGT ATAAAGCACGTGAAGGATTTGCCAATTCATCCAGGAGAGATATTCA AGTACAAGTGGACAGTTACAGTAGAAGATGGACCAACTAAATCAG ATCCACGGTGCCTGACCCGCTATTATTCAAGTTTCATTAACCCTGA GAGAGATCTAGCTTCAGGACTGATTGGCCCTCTTCTCATCTGCTA CAAAGAATCTGTAGATCAAAGGGGAAACCAGATGATGTCAGACAA AAGAAATGTCATCCTGTTTTCTATATTTGATGAGAACCAAAGCTGG TACATCACAGAGAACATGCAACGCTTCCTCCCCAATGCAGCTAAA ACACAGCCCCAGGACCCTGGGTTCCAGGCCTCCAACATCATGCA CAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGCTTGGAGTTGACAGTTTGT TTGCATGAGGTGGCATACTGGCACATTCTCAGTGTTGGAGCACAG ACAGACTTCTTATCTATCTTCTTCTCTGGATATACTTTCAAACACAA AATGGTCTATGAAGATACACTTACCCTGTTCCCATTCTCAGGAGAA ACTGTCTTTATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGGTCTTGGGG TGTCATAATTCAGACTTTCGGAAGAGAGGTATGACAGCATTGCTG AAAGTTTCTAGTTGTGACAAGAGCACTAGTGATTATTATGAAGAAA TATATGAAGATATTCCAACACAGTTGGTGAATGAGAACAATGTCAT TGATCCCAGAAGCTTCTTCCAGAATACAAATCATCCTAATACTAGG AAAAAGAAATTCAAAGATTCCACAATTCCAAAAAATGATATGGAGA AGATTGAGCCTCAGTTTGAAGAGATAGCAGAGATGCTTAAAGTAC AGAGTGTCTCAGTTAGTGACATGTTGATGCTCTTGGGACAGAGTC ATCCTACTCCACATGGCTTATTTITTATCAGATGGCCAAGAAGCCAT CTATGAGGCTATTCATGATGATCATTCACCAAATGCAATAGACAGC AATGAAGGCCCATCTAAAGTGACCCAACTCAGGCCAGAATCCCAT CACAGTGAGAAAATAGTATTTACTCCTCAGCCCGGCCTCCAGTTA 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GGGCCAGAGCTGCA SEQ ID NO:395 Plasmídeo CBA-GFP
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GGCGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGT CGCTGCGACGCTGCCTTEGCCCCGTGCCCeGCTCEGCCGCCGC CTCGCGCCGCceGcocoeGGcTETGACTGACCGCGTTACTCCCAC
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TGAGACACGGGCCAGAGCTGCA SEQ ID NO:396 Plasmídeo CBA-luciferase
TCGCGCGTTTCEGGTGATGACGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTG CTTCACTCTCCCCATOTOCCcoccocoTcCCCACCCCCAATTTTGTAT
TTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGÇ GGGGGEGGGGCGCEGCEGCCAGECEGGEGGCEGGGCGGGGCGAGGEG GCGGGGCEGEGCGAGEGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCA GAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGC
GGCGGCGGCCCTATAMAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGT CGCTGCGACGCTGCCTTEGCCCCGTGCCCeGCTCEGCCGCCGC CTCGCGCCGCceGcocoeGGcTETGACTGACCGCGTTACTCCCAC
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[00242] As publicações e patentes referenciadas neste pedido foram in- corporadas em sua totalidade.
[00243] Literatura não patentária citada:
1. Lai, Y, Yue, Y e Duan, D Evidence for the failure of adeno- associated virus serotype 5 to package a viral genome 28.2 kb. (2010).
Mol Ther 18: 75-79.
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Claims (43)

U7 REIVINDICAÇÕES
1. Polipeptídeo modificado caracterizado pelo fato de que compreende (i) um domínio de ligação de ácido nucleico e (ii) pelo menos um de um domínio de liberação de ácido nucleico, um sinal de localização nuclear, um domínio de estabilidade, um domínio de oli- gomerização e um domínio de direcionamento.
2. Polipeptídeo modificado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo modificado compre- ende um domínio de direcionamento.
3. Polipeptídeo modificado de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o domínio de liga- ção de ácido nucleico foi derivado de uma sequência polipeptídica de histona.
4. Polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de ácido nucleico é ou compreende a sequência de amino- ácidos KRHRK.
5. Polipeptídeo modificado de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o domínio de liga- ção de ácido nucleico é ou compreende uma sequência de aminoáci- dos que compreende KRHRK, RRRRR, RRLARR, KKAKAAAKPKK, KKDGKKRKR, KKKLK, KKRIRK, RKKSK, KKPKK, ou uma combina- ção dos mesmos.
6. Polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 5, caracterizado pelo fato de que o domínio de direcionamento é um domínio de fixação de célula, um domínio de ligação de beta galactose, um domínio de ligação de fucose, um domí- nio de ligação de heparina, um domínio de ligação de ácido siálico, um domínio de ligação de glicoproteína, um domínio de ligação de carboi- drato, um domínio de ligação de ácido lisofosfatídico, um domínio de ligação de CAMP, um domínio de ligação de hialuronano, um domínio de ligação de sulfato de condroitina, um domínio de ligação de integri- na, um domínio de ligação de nucleolina, um domínio de ligação de colágeno, um domínio de ligação de clatrina, um domínio de ligação de receptor Fc, um domínio de ligação de actina, um motivo de endocito- se, um sinal de localização nuclear ou uma combinação dos mesmos.
7. Polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 5, caracterizado pelo fato de que o domínio de direcionamento é um domínio de direcionamento de fixação celular.
8. Polipeptídeo modificado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o domínio de direcionamento de fixação celular é ou compreende uma sequência de aminoácidos que compreen- de WGREERQ, NTQIH, WNNKTPH, TPH, VNRWS, XBBBXXBX, ARK- KAAKA, ORR, SRR, WEPSRPFPVD, HRRTRKAPKRIRLPHIR, KRTG QYKLGSKTGPGQK, KKTK, KLRSQLVKK, RRRCGQKKK, BX(7)B, RIQNLLKITNLRIKFVK, KKEKDIMKKTI, KGE, RGD, RGDS, TTVVN- PKYEGK, ERMSQIKRLLS, WRHRARS, GFOGER, LFDLM, WGRE- ERQ, OSTEKRG, LPNTG ou uma combinação dos mesmos.
9. Polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 5, caracterizado pelo fato de que o domínio de direcionamento é um domínio de internalização.
10. Polipeptídeo modificado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o domínio de internalização é ou compreende uma sequência de aminoácidos que compreende FXDXF, PPSY, FEDNFVP, YIRV, YADW, YTQV, KKRPKP, SSDDE, RRASS, (YXXL)2, LPLTG, LAFTG ou uma combinação dos mesmos.
11. Polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 5, caracterizado pelo fato de que o domínio de direcionamento é um domínio de direcionamento específico do tipo de célula.
12. Polipeptídeo modificado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o domínio de direcionamento es- pecífico do tipo de célula é ou compreende uma sequência de aminoá- cidos que compreende ASSLNIA, KKEEEKKEEEKKEEE, LIFHKEQ, KFNKPFVFLI, QPEHSST, EYHHYNK, NGR, GEKGEP, KTKKK, KALKKK, KGKKK, CSVTCG, LRE, YKYNLNGRES, YRSL, KGGK,;, KKKQYTSIHHG, KDEL, LADQDYTKTA ou uma combinação dos mesmos.
13. Polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo modificado compreende um domínio de poliarginina.
14. Polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo modificado compreende um sinal de internalização nuclear ou um domínio de ligação de mecanismo de importação nuclear.
15. Polipeptídeo modificado de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o sinal de internalização nuclear ou um domínio de ligação de mecanismo de importação nuclear é ou compreende uma sequência de aminoácidos que compreende KKKYKLK, KKRKLE, TRSK, HRKRKR, NKRKRK, AEKSKKK, RKSK, KRVK, KRK, LOQTPLHLAVI, RRPR, PRPR, RPPP, RKKRKGK, PAAKRVKLD, KLKIKRPVK, PKKKRKV, QRKROQK, DSPE, FQVT, QSTEKRG, RQGLID, RKKH cíclico ou uma combinação dos mesmos.
16. Polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo modificado compreende um domínio de liberação de ácido nucleico.
17. Polipeptídeo modificado de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o domínio de liberação de ácido nucleico é ou compreende uma sequência de aminoácidos que com-
preende GRKKRRQRRRPQ, KRH, KSVKKRSVSEIQO, NRRKKRAL, KFERQ, VRGP, NKDS, NRDN, ANNR ou uma combinação dos mes- mos.
18. Polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo modificado compreende um domínio de estabilidade.
19. Polipeptídeo modificado de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o domínio de estabilidade é ou compreende uma sequência de aminoácidos que compreende YTRF, GDAY, LLEE, RKKRRORRR, YKSL, YENF, FQDL, YIGSR, IKVAV ou uma combinação dos mesmos.
20. Polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo modificado compreende um domínio de oligomerização.
21. Polipeptídeo modificado de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o domínio de oligomerização é se- lecionado dos domínios de oligomerização da Tabela 11, opcionalmen- te em que o domínio de oligomerização é posicionado no C-terminal do polipeptídeo modificado.
22. Polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o poli- peptídeo compreende um ligante, opcionalmente em que o ligante é um ligante de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 154 a 250.
23. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que codifica o polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 22.
24. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 23, ca- racterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é DNA ou RNA.
25. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 23 ou 24.
26. Célula caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 22, um polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 23 ou 24 ou um vetor de acordo com a reivindicação 25.
27. Método para produzir um polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22, caracterizado pelo fato de que compreende expressar um polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 23 ou 24 ou um vetor de acordo com a reivindica- ção 25 em uma célula.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracteriza- do pelo fato de que ainda compreende isolar o polipeptídeo modificado da célula.
29. Composição caracterizada pelo fato de que compreen- de: (i) pelo menos um polinucleotídeo, e (ii) pelo menos um polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22.
30. Composição de acordo com a reivindicação 29, carac- terizada pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo é ou com- preende DNA ou RNA.
31. Composição de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo com- preende uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo.
32. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações de 29 a 31, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo é ou compreende mRNA.
33. Composição de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo com- preende um RNA inibidor.
34. Composição de acordo com a reivindicação 33, carac-
terizada pelo fato de que o RNA inibidor é um gRNA, siRNA, miRNA ou shRNA.
35. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações de 29 a 34, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois polipeptídeos modificados de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22, em que um primeiro polipeptídeo modifi- cado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22 é ca- paz de oligomerizar com um segundo polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22.
36. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações de 29 a 35, caracterizada pelo fato de que a relação de poli- nucleotídeos para polipeptídeos modificados de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22 está entre 1:3 e 1:2.000.
37. Composição de acordo com a reivindicação 36, carac- terizada pelo fato de que a relação de polinucleotídeos para polipeptí- deos modificados de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22 está entre 1:3 e 1:1.000, entre 1:3 e 1:500, entre 1:3 e 1:200, entre 1:3 e 1:100 ou entre 1:3 e 1:50.
38. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações de 29 a 37, caracterizada pelo fato de que a relação de poli- nucleotídeos para polipeptídeos modificados de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22 está entre 1:200 e 1:2.000, entre 1:200 e 1:1.000 ou entre 1:200 e 1:500.
39. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações de 29 a 38, caracterizada pelo fato de que compreende um carreador farmacêutico.
40. Método caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma composição de acordo com qualquer uma das reivin- dicações de 29 a 39 a uma célula, um tecido ou um indivíduo.
41. Método para condensar um polinucleotídeo, caracteri-
zado pelo fato de que compreende colocar o polinucleotídeo em con- tato com um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 22.
42. Método para neutralizar a carga de um polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende colocar o polinucleotídeo em contato com um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações de 1 a 22.
43. Polipeptídeo modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o um ou mais aminoácidos do polipeptídeo são peguilados, acetilados, metila- dos, glicosilados, fosforilados, sumoilados, amidados, lipidados, preni- lados, lipoilados, alquilados, acilados, glicados, nitrosilados, sulfata- dos, carbamilados, carbonilados, nedilados, biotinilados ou ribosilados.
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