JP2024029097A - ミニヌクレオソームコアタンパク質及び核酸送達における使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】ミニヌクレオソームコアタンパク質及び核酸送達における使用の提供。【解決手段】本開示は、ミニヌクレオソームコアタンパク質及び/または核酸の送達に関する組成物及び方法を提供する。特に、本開示は、とりわけ、核酸の送達のための非ウイルスタンパク質性ビヒクルを含む。様々な実施形態において、本明細書で提供する非ウイルスタンパク質性ビヒクルには、(a)核酸結合ドメイン、(b)標的化ドメイン、ならびに、任意選択的に、(c)核酸放出ドメイン、安定性ドメイン、及び/またはオリゴマー化ドメイン、及び/またはリンカードメインが含まれる。【選択図】図1
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関連出願の相互参照
本出願は、2018年11月8日に出願された米国仮出願第62/757,683号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2018年11月8日に出願された米国仮出願第62/757,683号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
AAVベクターは、現在の遺伝子療法のゴールドスタンダードと見なされ、例えば、肝臓、CNS、及び/または他の組織における網膜遺伝子療法及び全身遺伝子療法のための臨床試験を含む多様な臨床試験において有望であることが示されている。少なくとも3つの異なる遺伝子療法の規制当局の承認により、この分野は、より多くの準備がされているため、患者はこれらの人生が変わるような治療にアクセスすることができる。しかしながら、業界のゴールドスタンダードであるにもかかわらず、AAVベクターには一定の制限がある。改善された及び/または代替の核酸送達技術が必要である。
本開示は、とりわけ、例えば、遺伝子療法を必要とする対象に核酸分子を送達する際に使用するために、核酸分子と会合することができるポリペプチドに関する組成物及び方法を提供する。したがって、本開示は、とりわけ、核酸分子と会合することができるポリペプチド、ならびに関連する核酸分子と一緒に本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物を含む。本開示は、任意の特定の科学理論に拘束されることを望むものではないが、核酸分子を本明細書に開示されるポリペプチドと会合させることにより、核酸を標的細胞、対象、または他の系に送達することを容易にすることができることを企図する。
特に、本開示は、とりわけ、核酸の送達のための「ミニヌクレオソームコアタンパク質」を含む。様々な実施形態において、本開示のミニヌクレオソームコアタンパク質は、(a)核酸結合ドメイン(「NABD」)、(b)標的化ドメイン、及び、任意選択的に、(c)例えば、核酸放出ドメイン、安定性ドメイン、及び/またはオリゴマー化ドメインのうちの1つ以上を含むさらなるドメインを含むことができる。核酸カーゴと関連する1つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質は、「負荷ミニヌクレオソーム(loaded mini-nucleosome)」と称され得る。核酸の標的への送達のための充填されたミニヌクレオソームが非ウイルスであるため、ミニヌクレオソームは核酸送達のための非ウイルスビヒクルの一例である。
本開示は、本明細書に記載の少なくとも特定の組成物及び方法が、以下に挙げられる、AAVベクターに関連する1つ以上の欠陥を修復するという認識を含む:
1)AAVが、4.5kbのDNA長のペイロード制限に関連して、この制限により、4kbを超える核酸により通常コードされる遺伝子産物(例えば、CFTR、HTT、F8、DMD、ABCA4等の遺伝子はAAVベクターに適合できない)の発現の欠陥によって少なくとも部分的に引き起こされる疾患の治療におけるAAVの使用が妨げられる(LaiY.et al,2010)。
2)AAVが、低い割合で及び/または部位非特異的に組み込まれることが知られている(Smith R.H.,2008)。組み込みが腫瘍抑制遺伝子または細胞機能にとって重要な遺伝子を破壊する可能性がある、または破壊する場合、ランダムまたは部位非特異的組み込みは有害であり得る。
3)AAVの血清型に応じて、25~70%のヒトがAAVに対する中和抗体を既に有し、すなわち、AAV療法で利益を得る可能性が低い(Fitzpatrick Z.,et al 2018)。
4)患者が注射されると、患者はウイルスに対する多数の抗体を産生するため、AAVによる複数の治療が効果的である可能性は非常に低い。細胞の代謝回転が高いいくつかの疾患(例えば、肝細胞または気道上皮細胞の代謝回転において)については、複数の治療が必要であり得る。したがって、最初の治療後のAAVに対する抗体の増加により、同じベクターがフォローアップ治療または投与において有用ではない場合がある。
5)いくつかの疾患の効果的な治療は、インビボで細胞を形質導入するために、静脈内注射によって投与される巨大なペイロードの粒子の送達を必要とし得る。高用量のAAVには独自の毒性があり、これまでにも多く記載されている(Hinderer C.et
al,2018)。
al,2018)。
6)ほとんどの疾患はまた、多臓器の不全と関連しており、AAVは同じ体内の様々な臓器に適用されない場合がある。ある部位での1回の適用は、抗体を上昇させ、したがって、後続の治療または投与で注入されるときに体内の他の位置での形質導入がブロックされる可能性がある。
少なくとも部分的には上述のAAVの欠陥のために、AAVの代替物が切実に必要とされている。少なくとも特定の実施形態では、本明細書に開示される非ウイルスベクターは、上記で論じたAAVの欠陥のうちの1つ以上を克服する。
さらに、以前の非ウイルスベクターは、i)低いトランスフェクション/形質導入効率(Guerra-Crespo M et al,2003)ii)血液、体液、及び他の組織における低い粒子安定性(Barua and Mitragotri,2014);iii)受容体媒介性エンドサイトーシスまたは細胞融合を介した低い細胞侵入;iv)エンドソーム及びリソソームコンパートメントにおける低い安定性、及びそれらからの低いエスケープ;v)細胞質における低い拡散速度;vi)低い核膜孔輸送;及びvii)核における生物学的機能を可能にするDNAの低い放出(Zabner J.et al,1995)を含む、治療有効性に対するいくつかの障壁とも関連付けられる。いくつかの刊行物は、有糸分裂後細胞をトランスフェクトするための以前の非ウイルスベクターの無能力または低効率を記録している(Wilke M.et al,1996)。特定の以前の非ウイルスベクターは、発現の長寿命を欠き、及び/または治療的に十分ではなく、かつ効率的に特定の細胞型を標的にすることができない低量のタンパク質を産生する。
したがって、非ウイルスベクターの分野における最先端の研究にもかかわらず、多くの以前の非ウイルスベクターは、臨床使用に最適ではない。とりわけ臨床的有用性に寄与する、本明細書で論じられる少なくとも特定の実施形態の特定の特徴には、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
サイズ及び分子量:DNA分子を担持する多くの以前の非ウイルスベクターは、直径10~200nmのサイズを有する(Konstan M.W.et. al,2004)。それらの分子量は、300kDa超または500kDa超であり得る。本開示は、とりわけ、直径が<20nmであり、<500kDaの分子量を有する非ウイルスタンパク質性ビヒクル、及び/または負荷ミニヌクレオソームを提供する。特定の実施形態では、本明細書に開示される非ウイルス性タンパク質性ビヒクル、及び/または負荷ミニヌクレオソームは、典型的な核孔が直径わずか20nmであり、<20nmのサイズが通過を可能にし得るため、少なくとも部分的には、おそらく受動拡散によって、より効率的に核内に通過することができる。
体液における安定性:多くの以前の非ウイルスベクターは、それらが標的細胞に送達される前に、血液またはCSFなどの体液中で分解される(Barua and Mitragotri,2014)。本開示は、とりわけ、生理学的に安定であり、及び/または標的細胞に入るまで及び入った後にそれらが血液及び/または他の体液中で安定することを可能にする特性を有する、非ウイルス性タンパク質性ビヒクル、及び/または負荷ミニヌクレオソームを提供する。これらの粒子の少なくとも1つの目標は、所望の細胞の核に安全に到達することである。
核における粒子の放出:多くの以前の非ウイルスベクターは、標的細胞に入る前に関連核酸を放出することがほとんどであり、残りは、送達されたDNAがDNAを破壊するヌクレアーゼに遭遇する細胞質中で関連核酸を放出するため、非常に短い寿命を有する(Zabner,J.et al,1995)。特定の以前のベクターは、細胞核まで進み、仮に発現したとしても非常に低い発現レベルを提供する。本開示はまた、とりわけ、関連する核酸を一度に放出するのではなく、ゆっくりと放出することが有益であり得、これにより発現の寿命を長くする可能性があることを認識するものである。
細胞型特異性:以前の非ウイルスベクターは特定の細胞型を標的としておらず、形質導入レベルの低下、ひいては発現の低減と関連している。本開示は、とりわけ、細胞型特異性のために最適化された非ウイルスベクターを提供する。細胞型特異性を操作する特定の手段は、例えば、Templeton and Senzer,2011に記載されている。
まとめると、所望の持続時間の有効な発現レベルを提供し、非免疫原性及び非毒性であり、より制限の少ないペイロード容量を有する核酸送達技術に対する極めて大きな必要性が存在する。さらに、ハンチントン病、スターガルト病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、及び遺伝子療法によって治療可能な他の状態の何百万人もの患者の必要性は、これらの患者を治療するのに役立つ技術の必要性を明確に示している。
本開示は、核酸の送達のための安全かつ有効な非ウイルスタンパク質性ビヒクル(「ミニヌクレオソームコアタンパク質」)及び負荷ミニヌクレオソームを提供する。
様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、1つ以上の核酸と関連する。本明細書に開示されるように、1つ以上の核酸と会合するミニヌクレオソームコアタンパク質は、「負荷ミニヌクレオソーム」と称され得る。
様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、1つ以上の特定の細胞型内にまたはそこに、遺伝子などの核酸の送達及び/または標的化発現させるために、負荷ミニヌクレオソームを1つ以上の特定の細胞型を標的化する、標的化ドメインを含む。
様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質組成物(例えば、1つ以上の負荷ミニヌクレオソームを含む組成物)は、必要に応じて1回または繰り返し滴定(titer)及び/または投与され得る。さらに、様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質またはミニヌクレオソーム組成物(例えば、1つ以上の負荷ミニヌクレオソームを含む組成物)は、非免疫原性であり、非毒性である。
本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質は、ある特定の実施形態では、高分子取り込み、細胞へのウイルス侵入、真核細胞におけるヌクレオソーム形成、細胞内の特定の位置における特定のタンパク質の切断等に適用可能な原理を利用することができる。
本明細書に提供される組成物及び方法の様々な実施形態は、安定性の増強、特定の細胞型への標的指向化、及び遅い核酸放出による発現の増強された長寿命のうちの1つ以上を促進するドメインを含む。
様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質及び/またはミニヌクレオソームは、体液中で安定しており、及び/または核内または核への放出を可能にする及び/または核を標的にするドメインを含む。
少なくとも一態様では、本開示は、核酸結合ドメイン及び標的化ドメインを含む操作されたポリペプチドであって、ミニヌクレオソームコアタンパク質であり得る操作されたポリペプチドを提供する。負荷ミニヌクレオソームは、本明細書に記載される操作されたポリペプチド(例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質)及び本明細書に提供されるかもしくは別様に当技術分野で既知の少なくとも1つの核酸分子、を含む非ウイルスベクターであり得るか、または提供され得る。
いくつかの実施形態では、核酸結合ドメインであるか、またはそれを含む操作されたポリペプチド(例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質)は、アミノ酸配列KRHRKであるか、もしくはそれを含むヒストンポリペプチド配列及び/または核酸結合ドメインに由来した。ある特定の実施形態では、本開示の操作ポリペプチドは、KRHRK、RRRRR、RRLARR、KKAKAAAKPKK、KKDGKKRKR、KKKLK、KKRIRK、RKKSK、KKPKK、もしくはこれらの組み合わせを含むが、これに限定されないアミノ酸配列であるか、またはそれを含む核酸結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたポリペプチドは、任意のヒストンタンパク質配列、もしくは表3に記載されるもの、または本明細書に記載されるが、これに限定されない配列の組み合わせに由来する核酸結合ドメインを含む。これらの核酸結合ドメインは、様々なヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴う「NABD」を修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、「NABD」を逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作ポリペプチドは、細胞付着ドメイン、βガラクトース結合ドメイン、フコース結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、シアル酸結合ドメイン、糖タンパク質結合ドメイン、炭水化物結合ドメイン、リゾホスファチジン酸結合ドメイン、cAMP結合ドメイン、ヒアルロナン結合ドメイン、コンドロイチン硫酸塩結合ドメイン、インテグリン結合ドメイン、ヌクレオリン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、クラスリン結合ドメイン、Fc受容体結合ドメイン、アクチン結合ドメイン、エンドサイトーシスモチーフ、核局在化シグナル、またはこれらの組み合わせであるが、これに限定されない標的化ドメインを含む。これらのドメインのいくつかの例は、表5に記載されているが、これらに限定されない。これらのドメインは、任意のヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴う標的化ドメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、標的化ドメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、内在化ドメインである標的化ドメインを含み、内在化ドメインは、FXDXF、PPSY、FEDNFVP、YIRV、YADW、YTQV、KKRPKP、SSDDE、RRASS、(YXXL)2、LPLTG、LAFTG、もしくはそれらの組み合わせを含むが、それに限定されないアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。これらのドメインは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴う内在化ドメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、内在化ドメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
当業者であれば、本明細書全体を通してタンパク質配列で使用される場合、「X」は、別途指定されない限り、任意のアミノ酸を指し得ることを理解するであろう。したがって、別途指定されない限り、「X」は、単一のアミノ酸のプレースホルダであり、その位置は、当業者に既知の任意の単一のアミノ酸でうめることができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、WGREERQ、NTQIH、WNNKTPH、TPH、VNRWS、XBBBXXBX、ARKKAAKA、QRR、SRR、WEPSRPFPVD、HRRTRKAPKRIRLPHIR、KRTGQYKLGSKTGPGQK、KKTK、KLRSQLVKK、RRRCGQKKK、BX(7)B、RIQNLLKITNLRIKFVK、KKEKDIMKKTI、KGE、RGD、RGDS、TTVVNPKYEGK、ERMSQIKRLLS、WRHRARS、GFOGER、LFDLM、WGREERQ、QSTEKRG、LPNTG、及びそれらの組み合わせ(Xは、任意のアミノ酸であってよい)、から選択されるが、これに限定されない、アミノ酸配列であるか、またはそれらを含む、細胞付着標的ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、内在化ドメイン細胞型特異的標的化ドメインである標的化ドメインを含み、細胞型特異的標的化ドメインが、ASSLNIA、KKEEEKKEEEKKEEE、LIFHKEQ、KFNKPFVFLI、QPEHSST、EYHHYNK、NGR、GEKGEP、KTKKK、KALKKK、KGKKK、CSVTCG、LRE、YKYNLNGRES、YRSL、KGGK7、KKKQYTSIHHG、KDEL、LADQDYTKTA、もしくはこれらの組み合わせを含むが、これに限定されないアミノ酸配列であるか、またはこれらを含む。これらのドメインは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴う標的化ドメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、標的化ドメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、ポリペプチド配列全体にわたって様々な長さまたは複数のポリアルギニンドメインを有するポリアルギニンドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、核内在化シグナルまたは核内移行機構結合ドメインを含む。操作されたポリペプチド、核内在化シグナル、または核内移行機構結合ドメインは、KKKYKLK、KKRKLE、TRSK、HRKRKR、NKRKRK、AEKSKKK、RKSK、KRVK、KRK、LQQTPLHLAVI、RRPR、PRPR、RPPP、RKKRKGK、PAAKRVKLD、KLKIKRPVK、PKKKRKV、QRKRQK、DSPE、FQVT、QSTEKRG、RQGLID、環状RKKH、もしくはこれらの組み合わせを含むが、これに限定されないアミノ酸配列であり得るか、またはそれらを含むことができる。これらのドメインは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴う核内在化シグナルを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、核内在化シグナルを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、核酸放出ドメインを含む。核酸放出ドメインは、GRKKRRQRRRPQ、KRH、KSVKKRSVSEIQ、NRRKKRAL、KFERQ、VRGP、NKDS、NRDN、ANNR、もしくはそれらの組み合わせを含むが、これに限定されないアミノ酸配列であるか、またはそれらを含む。これらのドメインは、ヒトまたは他の生物に見られるペプチダーゼ、酵素または他のタンパク質の基質である様々なタンパク質に由来し得る。いくつかの核酸放出ドメインは、様々なタンパク質の自己分解部位にも由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列の変更を伴う核酸放出ドメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、核酸放出シグナルを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは安定性ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、YTRF、GDAY、LLEE、RKKRRQRRR、YKSL、YENF、FQDL、YIGSR、IKVAV、もしくはこれらの組み合わせを含むが、これに限定されないアミノ酸配列であるか、またはそれを含む安定性ドメインを含み得る。これらのドメインは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴う安定性ドメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、安定性ドメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、オリゴマー化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、表11のオリゴマー化ドメインから選択されるが、これに限定されないオリゴマー化ドメインを含むことができる。オリゴマー化ドメインの位置は、本開示の操作ポリペプチドのC末端に、または任意の他の位置に位置する。これらのドメインは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴うオリゴマー化ドメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、オリゴマー化ドメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、限定されないが、表12の例示的ドメインから選択されるリンカーを含むことができる。本開示の操作されたポリペプチドにおけるリンカーの位置は、他のドメインと任意の他の位置との間にあり得る。これらのリンカーは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴うリンカードメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、リンカードメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
様々な実施形態では、本開示の2つ以上の操作ポリペプチドは、オリゴマー化することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の操作されたポリペプチド(例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質)を少なくとも1つのポリヌクレオチドとともに含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、DNAまたはRNAポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、阻害性RNAであるか、または阻害性RNAを含み、阻害性RNAは、gRNA、siRNA、miRNA、またはshRNAである。様々な実施形態において、ポリペプチド(複数可)及びポリヌクレオチド(複数可)は、会合しないが、組成物、例えば、キットまたは溶液中で一緒になっている。様々な実施形態では、ポリペプチド(複数可)及びポリヌクレオチド(複数可)は、会合し、例えば、縮合され、例えば、負荷ミニヌクレオソームを形成する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド対操作されたポリペプチドの比は、1:3~1:2,000である。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド対操作されたポリペプチドの比は、1:3~1:1,000、1:3~1:500、1:3~1:200、1:3~1:100、または1:3~1:50である。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド対操作されたポリペプチドの比は、1:200~1:2,000、1:200~1:1000、または1:200~1:500である。当業者はまた、DNAまたはRNA分子に対する化学修飾を考慮してもよい。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質及び/または負荷ミニヌクレオソームを含む、本明細書に提供される組成物は、細胞、組織、または対象に投与され得るか、またはそれと接触され得る。適用条件は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。かかる操作された細胞は、例えば、治療材料(例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質及び/または負荷ミニヌクレオソームを含む本明細書に提供される組成物)のヒト体内の様々な部分、例えば、限定するものではないが、脳、網膜、腸、膵臓、肺等への送達に使用され得るか、またはそれと適合する薬学的担体を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを縮合する方法は、ポリヌクレオチドを本明細書に記載のミニヌクレオソームコアタンパク質と接触させることを含み得る。方法は、ポリヌクレオチドの電荷を中和するプロセス、またはポリヌクレオチドをナノサイズの粒子に縮合させるプロセスを含み得、これには、ポリヌクレオチドを本明細書に記載のミニヌクレオソームコアタンパク質と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、分岐ペプチドまたは環状ペプチドであってもよいが、これらの特徴に限定されない。当業者は、ミニヌクレオソームコアタンパク質の特徴を変更して、様々な細胞型への強化された指向性(tropism)を得ることを企図してもよい。
本開示は、本明細書に提供される操作されたポリペプチド(例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質)をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、DNAポリヌクレオチドまたはRNAポリヌクレオチドであり得る。いくつかの事例では、本開示は、本開示の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される操作されたポリペプチド(例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質)をコードするポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞、またはかかるポリヌクレオチドの配列を含む細胞を提供する。ある特定の実施形態において、本開示の操作されたポリペプチドは、1つ以上のかかる細胞から単離することができる。
様々な実施形態では、本開示の操作されたポリペプチド(例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質)の1つ以上のアミノ酸は、ペグ化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、アミド化、脂質付加化、プレニル化、リポイル化、アルキル化、アシル化、糖化、ニトロシル化、硫酸化、カルバミル化、カルボニル化、NEDD化(neddylated)、ビオチン化、またはリボシル化されている。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
核酸結合ドメインと、標的化ドメインと、を含む、操作されたポリペプチド。
(項目2)
前記核酸結合ドメインが、ヒストンポリペプチド配列に由来する、項目1に記載の操作されたポリペプチド。
(項目3)
前記核酸結合ドメインが、アミノ酸配列KRHRKであるか、またはそれを含む、項目1または2に記載の操作されたポリペプチド。
(項目4)
前記核酸結合ドメインが、KRHRK、RRRRR、RRLARR、KKAKAAAKPKK、KKDGKKRKR、KKKLK、KKRIRK、RKKSK、KKPKK、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目1に記載の操作されたポリペプチド。
(項目5)
前記標的化ドメインが、細胞付着ドメイン、βガラクトース結合ドメイン、フコース結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、シアル酸結合ドメイン、糖タンパク質結合ドメイン、炭水化物結合ドメイン、リゾホスファチジン酸結合ドメイン、cAMP結合ドメイン、ヒアルロナン結合ドメイン、コンドロイチン硫酸結合ドメイン、インテグリン結合ドメイン、ヌクレオリン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、クラスリン結合ドメイン、Fc受容体結合ドメイン、アクチン結合ドメイン、エンドサイトーシスモチーフ、核局在化シグナル、またはこれらの組み合わせである、項目1~4のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目6)
前記標的化ドメインが、細胞付着標的化ドメインである、項目1~5のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目7)
前記細胞付着標的化ドメインが、WGREERQ、NTQIH、WNNKTPH、TPH、VNRWS、XBBBXXBX、ARKKAAKA、QRR、SRR、WEPSRPFPVD、HRRTRKAPKRIRLPHIR、KRTGQYKLGSKTGPGQK、KKTK、KLRSQLVKK、RRRCGQKKK、BX(7)B、RIQNLLKITNLRIKFVK、KKEKDIMKKTI、KGE、RGD、RGDS、TTVVNPKYEGK、ERMSQIKRLLS、WRHRARS、GFOGER、LFDLM、WGREERQ、QSTEKRG、LPNTG、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目6に記載の操作されたポリペプチド。
(項目8)
前記標的化ドメインが、内在化ドメインである、項目1~5のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目9)
前記内在化ドメインが、FXDXF、PPSY、FEDNFVP、YIRV、YADW、YTQV、KKRPKP、SSDDE、RRASS、(YXXL)2、LPLTG、LAFTG、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目8に記載の操作されたポリペプチド。
(項目10)
前記標的化ドメインが、細胞型特異的標的化ドメインである、項目1~5のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目11)
前記細胞型特異的標的化ドメインが、ASSLNIA、KKEEEKKEEEKKEEE、LIFHKEQ、KFNKPFVFLI、QPEHSST、EYHHYNK、NGR、GEKGEP、KTKKK、KALKKK、KGKKK、CSVTCG、LRE、YKYNLNGRES、YRSL、KGGK7、KKKQYTSIHHG、KDEL、LADQDYTKTA、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目10に記載の操作されたポリペプチド。
(項目12)
ポリアルギニンドメインをさらに含む、項目1~11のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目13)
核内在化シグナルまたは核内移行機構結合ドメインをさらに含む、項目1~12のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目14)
前記核内在化シグナルまたは核内移行機構結合ドメインが、KKKYKLK、KKRKLE、TRSK、HRKRKR、NKRKRK、AEKSKKK、RKSK、KRVK、KRK、LQQTPLHLAVI、RRPR、PRPR、RPPP、RKKRKGK、PAAKRVKLD、KLKIKRPVK、PKKKRKV、QRKRQK、DSPE、FQVT、QSTEKRG、RQGLID、環状RKKH、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目11に記載の操作されたポリペプチド。
(項目15)
核酸放出ドメインをさらに含む、項目1~14のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目16)
前記核酸放出ドメインが、GRKKRRQRRRPQ、KRH、KSVKKRSVSEIQ、NRRKKRAL、KFERQ、VRGP、NKDS、NRDN、ANNR、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目15に記載の操作されたポリペプチド。
(項目17)
安定性ドメインをさらに含む、項目1~16のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目18)
前記安定性ドメインが、YTRF、GDAY、LLEE、RKKRRQRRR、YKSL、YENF、FQDL、YIGSR、IKVAV、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目17に記載の操作されたポリペプチド。
(項目19)
オリゴマー化ドメインをさらに含む、項目1~18のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目20)
前記オリゴマー化ドメインが、表11のオリゴマー化ドメインから選択され、任意選択的に、前記オリゴマー化ドメインが、前記操作されたポリペプチドのC末端に配置される、項目19に記載の操作されたポリペプチド。
(項目21)
前記ポリペプチドが、リンカーを含み、任意選択的に、前記リンカーが、配列番号154~250のうちのいずれか1つに対応するリンカーである、項目1~20のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目22)
項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(項目23)
前記ポリヌクレオチドが、DNAまたはRNAである、項目22に記載のポリヌクレオチド。
(項目24)
項目22または23に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
(項目25)
項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド、項目22もしくは23に記載のポリペプチド、または項目24に記載のベクターを含む、細胞。
(項目26)
項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドを作製する方法であって、細胞において、項目22または23に記載のポリヌクレオチドを発現させることを含む、前記方法。
(項目27)
前記細胞から前記操作されたポリペプチドを単離することをさらに含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
(i)少なくとも1つのポリヌクレオチドと、
(ii)少なくとも1つの項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドと、を含む、組成物。
(項目29)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、DNAもしくはRNAであるか、またはそれを含む、項目28に記載の組成物。
(項目30)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、項目28または29に記載の組成物。
(項目31)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、mRNAであるか、またはそれを含む、項目28~30のいずれか一項に記載の組成物。
(項目32)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、阻害性RNAを含む、項目28または29に記載の組成物。
(項目33)
前記阻害性RNAが、gRNA、siRNA、miRNA、またはshRNAである、項目32に記載の組成物。
(項目34)
項目1~21のいずれか一項に記載の少なくとも2つの操作されたポリペプチドを含み、項目1~21のいずれか一項に記載の第1の操作されたポリペプチドが、項目1~21のいずれか一項に記載の第2の操作されたポリペプチドとオリゴマー化し得る、項目28~33のいずれか一項に記載の組成物。
(項目35)
前記ポリヌクレオチド対項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドの比が、1:3~1:2,000である、項目28~34のいずれか一項に記載の組成物。
(項目36)
前記ポリヌクレオチド対項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドの比が、1:3~1:1,000、1:3~1:500、1:3~1:200、1:3~1:100、または1:3~1:50である、項目35に記載の組成物。
(項目37)
前記ポリヌクレオチド対項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドの比が、1:200~1:2,000、1:200~1:1000、または1:200~1:500である、項目28~36のいずれか一項に記載の組成物。
(項目38)
薬学的担体を含む、項目28~37のいずれか一項に記載の組成物。
(項目39)
項目28~38のいずれか一項に記載の組成物を、細胞、組織、または対象に投与することを含む、方法。
(項目40)
ポリヌクレオチドを縮合する方法であって、前記ポリヌクレオチドを項目1~21のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含む、前記方法。
(項目41)
ポリヌクレオチドの電荷を中和する方法であって、前記ポリヌクレオチドを項目1~21のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含む、前記方法。
(項目42)
前記ポリペプチドの1つ以上のアミノ酸が、ペグ化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、アミド化、脂質付加化、プレニル化、リポイル化、アルキル化、アシル化、糖化、ニトロシル化、硫酸化、カルバミル化、カルボニル化、NEDD化(neddylated)、ビオチン化、またはリボシル化されている、項目1~20のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
核酸結合ドメインと、標的化ドメインと、を含む、操作されたポリペプチド。
(項目2)
前記核酸結合ドメインが、ヒストンポリペプチド配列に由来する、項目1に記載の操作されたポリペプチド。
(項目3)
前記核酸結合ドメインが、アミノ酸配列KRHRKであるか、またはそれを含む、項目1または2に記載の操作されたポリペプチド。
(項目4)
前記核酸結合ドメインが、KRHRK、RRRRR、RRLARR、KKAKAAAKPKK、KKDGKKRKR、KKKLK、KKRIRK、RKKSK、KKPKK、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目1に記載の操作されたポリペプチド。
(項目5)
前記標的化ドメインが、細胞付着ドメイン、βガラクトース結合ドメイン、フコース結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、シアル酸結合ドメイン、糖タンパク質結合ドメイン、炭水化物結合ドメイン、リゾホスファチジン酸結合ドメイン、cAMP結合ドメイン、ヒアルロナン結合ドメイン、コンドロイチン硫酸結合ドメイン、インテグリン結合ドメイン、ヌクレオリン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、クラスリン結合ドメイン、Fc受容体結合ドメイン、アクチン結合ドメイン、エンドサイトーシスモチーフ、核局在化シグナル、またはこれらの組み合わせである、項目1~4のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目6)
前記標的化ドメインが、細胞付着標的化ドメインである、項目1~5のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目7)
前記細胞付着標的化ドメインが、WGREERQ、NTQIH、WNNKTPH、TPH、VNRWS、XBBBXXBX、ARKKAAKA、QRR、SRR、WEPSRPFPVD、HRRTRKAPKRIRLPHIR、KRTGQYKLGSKTGPGQK、KKTK、KLRSQLVKK、RRRCGQKKK、BX(7)B、RIQNLLKITNLRIKFVK、KKEKDIMKKTI、KGE、RGD、RGDS、TTVVNPKYEGK、ERMSQIKRLLS、WRHRARS、GFOGER、LFDLM、WGREERQ、QSTEKRG、LPNTG、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目6に記載の操作されたポリペプチド。
(項目8)
前記標的化ドメインが、内在化ドメインである、項目1~5のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目9)
前記内在化ドメインが、FXDXF、PPSY、FEDNFVP、YIRV、YADW、YTQV、KKRPKP、SSDDE、RRASS、(YXXL)2、LPLTG、LAFTG、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目8に記載の操作されたポリペプチド。
(項目10)
前記標的化ドメインが、細胞型特異的標的化ドメインである、項目1~5のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目11)
前記細胞型特異的標的化ドメインが、ASSLNIA、KKEEEKKEEEKKEEE、LIFHKEQ、KFNKPFVFLI、QPEHSST、EYHHYNK、NGR、GEKGEP、KTKKK、KALKKK、KGKKK、CSVTCG、LRE、YKYNLNGRES、YRSL、KGGK7、KKKQYTSIHHG、KDEL、LADQDYTKTA、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目10に記載の操作されたポリペプチド。
(項目12)
ポリアルギニンドメインをさらに含む、項目1~11のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目13)
核内在化シグナルまたは核内移行機構結合ドメインをさらに含む、項目1~12のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目14)
前記核内在化シグナルまたは核内移行機構結合ドメインが、KKKYKLK、KKRKLE、TRSK、HRKRKR、NKRKRK、AEKSKKK、RKSK、KRVK、KRK、LQQTPLHLAVI、RRPR、PRPR、RPPP、RKKRKGK、PAAKRVKLD、KLKIKRPVK、PKKKRKV、QRKRQK、DSPE、FQVT、QSTEKRG、RQGLID、環状RKKH、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目11に記載の操作されたポリペプチド。
(項目15)
核酸放出ドメインをさらに含む、項目1~14のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目16)
前記核酸放出ドメインが、GRKKRRQRRRPQ、KRH、KSVKKRSVSEIQ、NRRKKRAL、KFERQ、VRGP、NKDS、NRDN、ANNR、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目15に記載の操作されたポリペプチド。
(項目17)
安定性ドメインをさらに含む、項目1~16のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目18)
前記安定性ドメインが、YTRF、GDAY、LLEE、RKKRRQRRR、YKSL、YENF、FQDL、YIGSR、IKVAV、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目17に記載の操作されたポリペプチド。
(項目19)
オリゴマー化ドメインをさらに含む、項目1~18のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目20)
前記オリゴマー化ドメインが、表11のオリゴマー化ドメインから選択され、任意選択的に、前記オリゴマー化ドメインが、前記操作されたポリペプチドのC末端に配置される、項目19に記載の操作されたポリペプチド。
(項目21)
前記ポリペプチドが、リンカーを含み、任意選択的に、前記リンカーが、配列番号154~250のうちのいずれか1つに対応するリンカーである、項目1~20のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
(項目22)
項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(項目23)
前記ポリヌクレオチドが、DNAまたはRNAである、項目22に記載のポリヌクレオチド。
(項目24)
項目22または23に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
(項目25)
項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド、項目22もしくは23に記載のポリペプチド、または項目24に記載のベクターを含む、細胞。
(項目26)
項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドを作製する方法であって、細胞において、項目22または23に記載のポリヌクレオチドを発現させることを含む、前記方法。
(項目27)
前記細胞から前記操作されたポリペプチドを単離することをさらに含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
(i)少なくとも1つのポリヌクレオチドと、
(ii)少なくとも1つの項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドと、を含む、組成物。
(項目29)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、DNAもしくはRNAであるか、またはそれを含む、項目28に記載の組成物。
(項目30)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、項目28または29に記載の組成物。
(項目31)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、mRNAであるか、またはそれを含む、項目28~30のいずれか一項に記載の組成物。
(項目32)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、阻害性RNAを含む、項目28または29に記載の組成物。
(項目33)
前記阻害性RNAが、gRNA、siRNA、miRNA、またはshRNAである、項目32に記載の組成物。
(項目34)
項目1~21のいずれか一項に記載の少なくとも2つの操作されたポリペプチドを含み、項目1~21のいずれか一項に記載の第1の操作されたポリペプチドが、項目1~21のいずれか一項に記載の第2の操作されたポリペプチドとオリゴマー化し得る、項目28~33のいずれか一項に記載の組成物。
(項目35)
前記ポリヌクレオチド対項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドの比が、1:3~1:2,000である、項目28~34のいずれか一項に記載の組成物。
(項目36)
前記ポリヌクレオチド対項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドの比が、1:3~1:1,000、1:3~1:500、1:3~1:200、1:3~1:100、または1:3~1:50である、項目35に記載の組成物。
(項目37)
前記ポリヌクレオチド対項目1~21のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドの比が、1:200~1:2,000、1:200~1:1000、または1:200~1:500である、項目28~36のいずれか一項に記載の組成物。
(項目38)
薬学的担体を含む、項目28~37のいずれか一項に記載の組成物。
(項目39)
項目28~38のいずれか一項に記載の組成物を、細胞、組織、または対象に投与することを含む、方法。
(項目40)
ポリヌクレオチドを縮合する方法であって、前記ポリヌクレオチドを項目1~21のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含む、前記方法。
(項目41)
ポリヌクレオチドの電荷を中和する方法であって、前記ポリヌクレオチドを項目1~21のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含む、前記方法。
(項目42)
前記ポリペプチドの1つ以上のアミノ酸が、ペグ化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、アミド化、脂質付加化、プレニル化、リポイル化、アルキル化、アシル化、糖化、ニトロシル化、硫酸化、カルバミル化、カルボニル化、NEDD化(neddylated)、ビオチン化、またはリボシル化されている、項目1~20のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
定義
約:本明細書で値に関して使用される場合、「約」という用語は、参照される値に関連して類似する値を指す。一般に、その文脈に精通している当業者は、その文脈における、「約」に包含される関連する程度の分散を理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、用語「約」は、参照値の25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%またはそれ未満の範囲の値を包含し得る。
約:本明細書で値に関して使用される場合、「約」という用語は、参照される値に関連して類似する値を指す。一般に、その文脈に精通している当業者は、その文脈における、「約」に包含される関連する程度の分散を理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、用語「約」は、参照値の25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%またはそれ未満の範囲の値を包含し得る。
投与:本明細書で使用される場合、「投与」という用語は、典型的には、組成物であるか、または組成物に含まれる薬剤の送達を達成するために、対象または系への組成物の投与を指す。当業者は、適切な状況において、対象、例えばヒトへの投与に利用され得る様々な経路を認識するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、眼、経口、非経口、局所などであってもよい。いくつかの特定の実施形態では、投与は、気管支(例えば、気管支滴下による)、口腔、皮膚(例えば、真皮に対する局所、皮内(intradermal)、皮内(interdermal)、経皮などのうちの1つ以上であってもよく、またはこれらを含んでもよい)、腸内、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、髄腔内、静脈内、脳室内、特定の器官内(例えば、肝臓内)、粘膜、鼻腔、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管(例えば、気管内滴下による)、膣内、硝子体内などであってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、単回用量のみを含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、一定数の用量の適用を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、断続的(例えば、時間的に分けられた複数の用量)及び/または定期的(例えば、共通の期間によって分けられた個々の用量)な投与を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間の連続投与(例えば、灌流)を含んでもよい。
と関連する:2つの事象または実体は、一方の存在、レベル、及び/または形態が他方の存在、レベル、及び/または形態と相関する場合、その用語は本明細書で使用されるように、互いに「関連する」。例えば、特定の実体(例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝産物、微生物など)の存在、レベル、及び/または形態が、(その関連する集団にわたって)その疾患、障害、または状態の発生率及び/またはその疾患、障害、または状態に対する感受性と相関する場合、その実体は、その特定の疾患、障害、または状態と関連していると見なされる。いくつかの実施形態では、2つ以上の実体が、それらが直接的または間接的に相互作用する場合、互いに物理的に「会合する」ので、それらは互いに物理的に近接している、及び/または物理的に近接したままである。いくつかの実施形態では、互いに物理的に会合する2つ以上の実体は、互いに共有結合しており、いくつかの実施形態では、互いに物理的に会合する2つ以上の実体は、互いに共有結合しないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、及びそれらの組み合わせによって非共有結合的に会合している。
薬剤:本明細書で使用される場合、「薬剤」という用語は、例えば、小分子、ポリペプチド、核酸、糖類、脂質、金属、またはそれらの組み合わせもしくは複合体を含む、任意の化学クラスの化合物、分子、または実体を指し得る。いくつかの実施形態において、「薬剤」という用語は、ポリマーを含む化合物、分子、または実体を指し得る。いくつかの実施形態では、この用語は、1つ以上のポリマー部分を含む化合物または実体を指し得る。いくつかの実施形態では、「薬剤」という用語は、特定のポリマーまたはポリマー部分を実質的に含まない化合物、分子、または実体を指し得る。いくつかの実施形態では、この用語は、任意のポリマーまたはポリマー部分を欠くか、または実質的に含まない化合物、分子、または実体を指し得る。
アミノ酸:本明細書で使用されるその最も広い意味で、「アミノ酸」は、例えば、1つ以上のペプチド結合の形成を通じてポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物及び/または物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造H2N-C(H)(R)-COOHを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、非天然アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、D-アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、L-アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然に存在するペプチドに一般的に見られる20種の標準的なL-アミノ酸のうちのいずれかを指す。「非標準アミノ酸」とは、合成的に調製されるか、または天然源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中のカルボキシ末端及び/またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、上記の一般構造と比較して、構造修飾を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造と比較して、メチル化、アミド化、アセチル化、ペグ化、グリコシル化、リン酸化、及び/または置換(例えば、アミノ基、カルボン酸基、1つ以上のプロトン、及び/またはヒドロキシル基の)によって修飾され得る。いくつかの実施形態では、このような修飾は、例えば、それ以外では同一の非修飾アミノ酸を含有するものと比較して、修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの循環半減期を変更し得る。いくつかの実施形態では、このような修飾は、それ以外では同一の非修飾アミノ酸を含有するものと比較して、修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの関連する活性を有意に変化させない。文脈から明らかになるように、いくつかの実施形態では、「アミノ酸」という用語は、遊離アミノ酸を指すために使用され得、いくつかの実施形態では、それは、ポリペプチドのアミノ酸残基を指すために使用され得る。
間:本明細書で使用される場合、「間」という用語は、境界を含む、示される上限と下限、または第1及び第2の境界との間に入る内容物を指す。
に対応する:本明細書で使用される場合、「に対応する」という用語は、適切な参照化合物または組成物との比較を通じて、化合物または組成物中の構造要素の位置/同一性を指定するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ポリマー中のモノマー残基(例えば、ポリペプチド中のアミノ酸残基またはポリヌクレオチド中の核酸残基)は、適切な参照ポリマー中の残基として「対応する」ものとして識別されてもよい。例えば、単純化の目的のために、ポリペプチド中の残基は、多くの場合、参照関連ポリペプチドに基づく標準的な番号付けシステムを使用して指定されることが多く、その結果、例えば、190位の残基に「対応する」アミノ酸は、実際に特定のアミノ酸鎖中の190番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ参照ポリペプチド中の190位に見出される残基に対応する必要があることを当業者は理解するであろうし、当業者は、「対応する」アミノ酸を識別する方法を容易に理解するであろう。例えば、当業者は、例えば、本開示に従って、ポリペプチド及び/または核酸中の「対応する」残基を同定するために利用され得る、例えば、BLAST、CS-BLAST、CUDASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAST、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM、またはSWIPE等のソフトウェアプログラムを含む、様々な配列アラインメント戦略を認識するであろう。
ドメイン:本明細書で使用する場合、用語「ドメイン」は実体のセクションまたは一部を指す。いくつかの実施形態では、「ドメイン」は、実体の特定の構造的及び/または機能的特徴と関連付けられているので、ドメインがその親実体の残りの部分から物理的に分離される場合、特定の構造的及び/または機能的特徴を実質的にまたは完全に保持する。代替的または追加的に、ドメインは、その(親)実体から分離され、別の(受容体)実体と連結されるとき、実質的に、受容体実体に、親実体内でそれを特徴付ける1つ以上の構造的及び/または機能的特徴を保持及び/または付与する、実体の一部であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、ドメインは、分子(例えば、小分子、炭水化物、脂質、核酸、またはポリペプチド)の切片または一部である。いくつかの実施形態では、ドメインは、ポリペプチドの切片であり、いくつかのそのような実施形態では、ドメインは、特定の構造要素(例えば、特定のアミノ酸配列もしくは配列モチーフ、α-ヘリックス特性、β-シート特性、コイル状コイル特性、ランダムコイル特性等)、及び/または特定の機能特徴(例えば、結合活性、酵素活性、折り畳み活性、シグナル伝達活性等)によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ドメインは、特徴的な部分もしくは特徴的な配列要素であるか、またはそれらを含む。
操作された:一般に、「操作された(engineered)」という用語は、人間の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリヌクレオチドは、自然界においてその順序で一緒に連結されていない2つ以上の配列が、人の手によって操作されて、操作されたポリヌクレオチドにおいて互いに直接連結される場合、「操作された」と見なされる。当業者であれば、「操作された」核酸またはアミノ酸配列が、組換え核酸またはアミノ酸配列であり得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、第1の配列と作動可能に会合しているが、第2の配列と作動可能に会合していない自然に見出されるドメインコード配列調節配列を含み、それが第2の配列と動作可能に会合するように、人間の手によって連結される。同様に、細胞または生物は、その遺伝情報が変化するように操作された場合(例えば、以前に存在しなかった新しい遺伝物質が、例えば、形質転換、交配、体細胞ハイブリダイゼーション、トランスフェクション、形質導入、または他の機構によって導入されているか、または以前に存在した遺伝物質が、例えば、置換もしくは欠失変異によって、または交配プロトコルによって変化または除去される)、「操作された」と見なされる。一般的な実践であり、当業者には理解されている通り、操作されたポリヌクレオチドまたは細胞の子孫は、実際の操作が以前の実体に対して行われたとしても、通常、依然として「操作された」と称される。
遺伝子:本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、産物(例えば、RNA産物及び/またはポリペプチド産物)をコードするDNA配列を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子は、コード配列(すなわち、特定の産物をコードする配列)を含み、いくつかの実施形態では、遺伝子は、非コード配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、遺伝子は、コード配列(例えば、エクソン性)配列及び非コード(例えば、イントロン性)配列の両方を含んでもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子は、例えば、遺伝子発現の1つ以上の態様(例えば、プロモーター)を制御し得るか、またはそれに影響を与え得る1つ以上の調節要素を含んでいてもよい。遺伝子は、特定の状況、例えば、細胞において、内在性または非内在性であり得る。遺伝子は導入遺伝子であり得る。
遺伝子産物または発現産物:本明細書で使用される場合、「遺伝子産物」または「発現産物」という用語は、一般に、遺伝子から転写されたRNA(プレプロセッシング及び/またはポストプロセッシング)または遺伝子から転写されたRNAによってコードされるポリペプチド(前修飾及び/または後修飾)を指す。
「改善する」、「増加する」、「阻害する」、または「減少する」:本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加する」、「阻害する」、「減少する」という用語、またはそれらの文法的等価物は、ベースラインまたは他の基準測定値に対する値を示す。いくつかの実施形態では、適切な基準測定値は、特定の薬剤もしくは処置の比存在下で(例えば、前及び/または後に)、または適切な同等の基準薬剤の存在下で、他の点では同等の条件下で、特定の系内(例えば、単一の個体内)の測定値であってもよく、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、適切な基準測定値は、関連する薬剤または治療薬の存在下で、特定の方法で応答することが知られているか、または応答すると予想される同等の系における測定値であってもよく、またはそれを含んでもよい。
核酸:本明細書で使用される場合、その最も広い意味で、「核酸」は、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込まれ得る任意の化合物及び/または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込まれ得る化合物及び/または物質である。文脈から明らかになるように、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基(例えば、ヌクレオチド及び/またはヌクレオシド)を指し、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、RNAであるか、またはRNAを含み、いくつかの実施形態では、「核酸」は、DNAであるか、またはDNAを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、1つ以上の天然核酸残基であるか、1つ以上の天然核酸残基を含むか、または1つ以上の天然核酸残基からなる。いくつかの実施形態では、核酸は、1つ以上の核酸類似体であるか、1つ以上の核酸類似体を含むか、または1つ以上の核酸類似体からなる。いくつかの実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しない点において核酸と異なる。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、1つ以上の「ペプチド核酸」であるか、1つ以上の「ペプチド核酸」を含むか、または1つ以上の「ペプチド核酸」からなり、当該技術分野で既知であり、骨格内のホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有し、本開示の範囲内であると見なされる。代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、1つ以上のホスホチオエート結合及び/または5’-N-ホスホラミダイト結合を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、1つ以上の天然ヌクレオシド(例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン及びデオキシシチジン)であるか、1つ以上の天然ヌクレオシドを含むか、または1つ以上の天然ヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、1つ以上のヌクレオシド類似体(例えば、2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロ-ピリミジン、3-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、C-5プロピニルシチジン、C-5プロピニル-ウリジン、2-アミノアデノシン、C5-ブロモウリジン、C5-フルオロウリジン、C5-ヨードウリジン、C5-プロピニル-ウリジン、C5-プロピニル-シチジン、C5-メチルシチジン、2-アミノアデノシン、7-デアザアデノシン、7-デアザグアノシン、8-オキソアデノシン、8-オキソグアノシン、0(6)-メチルグアニン、2-チオシチジン、メチル化塩基、インターカレーションされた塩基、及びこれらの組み合わせ)であるか、1つ以上のヌクレオシド類似体を含むか、1つ以上のヌクレオシド類似体からなる。いくつかの実施形態では、核酸は、天然核酸中の糖類と比較して、1つ以上の修飾された糖(例えば、2’-フルオロリボース、リボース、2’-デオキシリボース、アラビノース及びヘキソース)を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、RNAまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、1つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、相補的テンプレートに基づく重合による酵素合成(インビボまたはインビトロで)、組換え細胞または系における複製及び化学合成のうちの1つ以上によって調製される。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、またはそれを超える残基の長さである。いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または完全に一本鎖であり、いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または完全に二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコードする配列の相補である少なくとも1つの要素を含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。
作動可能に連結された:本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、記載される構成要素が、それらがそれらの意図される様式で機能することを可能にする関係にある並立を指す。例えば、機能要素に「作動可能に連結された」制御要素は、機能要素の発現及び/または活性が、制御要素と互換性のある条件下で達成されるように関連付けられる。いくつかの実施形態では、「作動可能に連結された」制御要素は、目的とするコード要素と隣接しており(例えば、共有結合されている)、いくつかの実施形態では、制御要素は、目的とする機能要素に対してトランスに作用するか、またはそれ以外の場合、目的とする機能エレメントから作用する。
薬学的組成物:本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、活性剤が1つ以上の薬学的に許容される担体とともに製剤化される組成物を指す。いくつかの実施形態では、活性剤は、関連する集団に投与されるときに所定の治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンでの投与に適切な単位用量の量で存在する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、以下に適合したものを含む、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化することができる。経口投与、例えば、水薬(水性または非水性の溶液または懸濁液)、錠剤、例えば、口腔内、舌下、及び全身吸収を目的としたもの、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペースト;非経口投与、例えば滅菌溶液もしくは懸濁液、もしくは徐放性製剤としての皮下、筋肉内、静脈内、または硬膜外注射による;局所適用、例えば、クリーム、軟膏、または皮膚、肺、もしくは口腔に適用される制御放出パッチまたはスプレーとして;膣内もしくは直腸内、例えばペッサリー、クリーム、もしくはフォームとして;舌下;眼内;経皮的;または経鼻的、肺的、及び他の粘膜表面へ。
ポリペプチド:本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、自然界に生じるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、自然界に存在しないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、それが人の手の作用によって設計及び/または産生されるという点で操作されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはその両方を含んでいてもよく、またはそれらからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸のみまたは非天然アミノ酸のみを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、D-アミノ酸、L-アミノ酸、またはその両方を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、D-アミノ酸のみを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、L-アミノ酸のみを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、1つ以上のペンダント基または他の修飾、例えば、1つ以上のアミノ酸側鎖を修飾または付着すること、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態において、かかるペンダント基または修飾は、これらの組み合わせを含む、アセチル化、アミド化、脂質化、メチル化、リン酸化、グリコシル化、糖化、硫酸化、マンノシル化、ニトロシル化、アシル化、パルミトイル化、プレニル化、ペグ化等からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは環状であってもよく、及び/または環状部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、環状ではなく、及び/または任意の環状部分を含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、直鎖状である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ステープル(stapled)ポリペプチドであってもよいか、またはステープルポリペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、「ポリペプチド」という用語は、参照ポリペプチド、活性、または構造の名前に付加されてもよく、そのような場合、本明細書では、関連する活性または構造を共有し、したがって、同じクラスまたはポリペプチドのファミリーのメンバーであると見なされ得るポリペプチドを指すために使用される。かかるクラスごとに、本明細書は、アミノ酸配列及び/または機能が既知であるクラス内の例示的なポリペプチドを提供し、及び/または当業者は認識するであろう。いくつかの実施形態では、かかる例示的なポリペプチドは、ポリペプチドクラスまたはファミリーのための参照ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドクラスまたはファミリーのメンバーは、クラスの基準ポリペプチドと、(いくつかの実施形態では、クラス内のすべてのポリペプチドと、)有意な配列類似性(例えば、相同性)もしくは同一性を示し、共通の配列モチーフ(例えば、特徴的な配列要素)を共有し、及び/または共通の活性(いくつかの実施形態では、同等レベルまたは指定された範囲内)を共有する。例えば、いくつかの実施形態では、メンバーポリペプチドは、少なくとも約30~40%である、しばしば、約50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える、基準ポリペプチドとの全体的な配列類似性(例えば、相同性)または同一性の程度を示し及び/またはしばしば、90%を超える、さらには95%、96%、97%、98%、または99%を超える、非常に高い配列同一性を示す、少なくとも1つの領域(例えば、いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素であり得るか、またはそれを含み得る保存領域)を含む。かかる保存領域は、通常、少なくとも3~4個、多くの場合、最大20個またはそれよりも多くのアミノ酸を包含し、いくつかの実施形態では、保存領域は、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個またはそれよりも多くの連続するアミノ酸の少なくとも1つのストレッチを包含する。いくつかの実施形態では、有用なポリペプチドは、親ポリペプチドの断片を含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、それぞれ目的のポリペプチドで見出されるものとは異なる空間配置で互いに同じ親ポリペプチドに見出される、複数の断片を含んでもよく、またはそれらからなることができる有用なポリペプチド(例えば、親に直接結合した断片は、目的のポリペプチドで空間的に分離されてもよく、またその逆であり得、及び/または断片は、目的のポリペプチドにおいて、親とは異なる順序で存在してもよい)により、目的のポリペプチドは、その親ポリペプチドの誘導体である。
予防するまたは予防:本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」は、疾患、障害、及び/または状態の発生と関連して使用される場合、疾患、障害、及び/もしくは状態を発症するリスクを減少させること、及び/または疾患、障害、もしくは状態の1つ以上の特徴もしくは症状の発症を遅らせることを指す。ある疾患、障害または状態の発症が所定の期間遅れた場合、予防は完全と見なされ得る。
プロモーター:本明細書で使用される場合、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、コード配列の転写の開始及び/または処理能力に直接または間接的に(例えば、プロモーター結合タンパク質または物質を通じて)関与するDNA調節領域であり得る。プロモーターは、好適な条件下で、1つ以上の転写因子及び/または調節部分のプロモーターとの結合時に、コード配列の転写を開始し得る。コード配列の転写の開始に関与するプロモーターは、コード配列に「作動可能に連結」することができる。ある特定の事例において、プロモーターは、そのように指定された配列が、転写イベントを開始するのに必要な最小数の塩基または要素の一方または両方を含むように、転写開始部位(その3’末端)から上流(5’方向)位置に伸長するDNA調節領域であるか、またはそれを含むことができる。プロモーターは、エンハンサー配列及びリプレッサー配列などの発現制御配列であり得るか、それらを含むか、それらに作動可能に関連し得るか、またはそれらと作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性であってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、条件的(例えば、誘導性)プロモーターは、一方向性または双方向性であってもよい。プロモーターは、特定の種のゲノム中で発生することが知られている配列と同一の配列であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、転写調節領域を含有する配列を1つの源から得ることができ、転写開始領域を含有する配列を第2の源から得ることができるハイブリッドプロモーターであってもよいか、またはハイブリッドプロモーターを含んでいてもよい。導入遺伝子内のコード配列に制御要素を連結するためのシステムは、当該技術分野で周知である(一般的な分子生物学的及び組換えDNA技法は、Sambrook,Fritsch,and Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989に記述されている)。
組換え:本明細書で使用される場合、「組換え」は、組換え手段によって設計、操作、調製、発現、作製、製造、及び/または単離されたポリペプチド、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されたポリペプチド;組換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリから単離されたポリペプチド;トランスジェニックであるか、そうでなければ操作されて、遺伝子もしくは複数の遺伝子、またはポリペプチドもしくはその1つ以上の成分(複数可)、部分(複数可)、要素(複数可)、もしくはドメイン(複数可)をコードする及び/またはそれらの発現を指示する遺伝子成分を発現する、動物(例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、魚等)から単離されたポリペプチド;及び/または選択された核酸配列要素を互いにスプライシング若しくはライゲーションすること、選択された配列要素を化学的に合成すること、及び/またはそれ以外の場合、ポリペプチドもしくはその1つ以上の成分(複数可)、部分(複数可)、要素(複数可)、もしくはドメイン(複数可)をコードする及び/またはそれらの発現を指示する核酸を生成すること、を含む、他の手段によって調整、発現、作製、または単離されたポリペプチド、を指すことが意図される。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素のうちの1つ以上が、自然界に見出される。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素のうちの1つ以上が、インシリコで設計される。いくつかの実施形態では、1つ以上のそのような選択された配列要素は、既知の配列要素の突然変異誘発(例えば、インビボまたはインビトロ)から、例えば、天然または合成供給源、例えば、目的の供給源生物(例えば、ヒト、マウス等)の生殖細胞系から生じる。
基準:本明細書で使用される場合、比較が行われる標準または対照を指す。例えば、いくつかの実施形態では、目的の、薬剤、動物、個体、集団、試料、配列または値が、参照または対照の、薬剤、動物、個体、集団、試料、配列または値と、比較される。いくつかの実施形態では、基準または対照は、目的物の試験または決定と実質的に同時に試験され、及び/または決定される。いくつかの実施形態では、基準または対照は、歴史的な基準または対照であり、任意選択的に、有形媒体で具体化される。典型的には、当業者に理解されるように、基準または対照は、評価されるものと同等の条件もしくは状況下で決定されるか、または特徴付けられる。当業者であれば、特定の可能な基準もしくは対照に対する信頼及び/または比較を正当化するのに十分な類似性が存在することを理解するだろう。
対象:本明細書で使用される場合、用語「対象」は、生物、典型的には哺乳動物(例えば、ヒト、いくつかの実施形態では、出生前のヒト形態を含む)を指す。いくつかの実施形態では、対象は、関連する疾患、障害または状態に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、ある疾患、障害または状態にかかりやすい。いくつかの実施形態では、対象は、ある疾患、障害または状態の、1つ以上の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態では、対象は、ある疾患、障害または状態の、症状または特徴を何ら示さない。いくつかの実施形態では、対象は、ある疾患、障害もしくは状態に対するかかりやすさ、またはある疾患、障害もしくは状態のリスクに特徴的な1つ以上の特徴を有する人である。いくつかの実施形態では、対象は、患者である。いくつかの実施形態では、対象は、診断及び/または治療が実施されているか、及び/または実施されていた個体である。
実質的な配列類似性:「実質的な配列類似性」という句は、本明細書では、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を指すために使用される。当業者よって理解されるように、2つの配列は、それらが対応する位置に保存的アミノ酸置換を含有する場合、一般に「実質的に類似している」と見なされる。保存的置換とは、アミノ酸が、適切に類似した構造的及び/または機能的特徴を有する非同一の残基によって置き換えられたものである。例えば、当業者に周知のように、ある特定のアミノ酸は、典型的には、「疎水性」もしくは「親水性」アミノ酸として、及び/または「極性」もしくは「非極性」側鎖を有するものとして分類される。同じタイプの別のアミノ酸に対するあるアミノ酸の置換は、しばしば保存的置換と見なされ得る。典型的なアミノ酸分類を、以下の表1及び2に要約する。
本技術分野で周知であるように、アミノ酸配列または核酸配列は、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較されてもよく、例えば、ヌクレオチド配列についてのBLASTN、及びアミノ酸配列についてのBLASTP、gapped BLAST、及びPSI-BLAST等の市販コンピュータプログラムにおいて利用可能なものを含む。そのようなプログラムの例は、Altschul,et al.,Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990、Altschul,et al.,Methods in Enzymology、Altschul,et al.,“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs,”Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997、Baxevanis,et
al.,Bioinformatics:A Practical Guide to
the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998、及びMisener,et al.,(eds.)、Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,Vol.132)、Humana Press,1999に記載されている。類似の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、通常、類似性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、2つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%またはそれ以上が、残基の関連するストレッチにわたって類似及び/または同一である場合、実質的に類似していると見なされる。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは、完全な配列である。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、少なくとも250、少なくとも275、少なくとも300、少なくとも325、少なくとも350、少なくとも375、少なくとも400、少なくとも425、少なくとも450、少なくとも475、少なくとも500以上の残基である。当業者によって理解されるように、実質的な配列類似性を有する配列は、互いの相同体であり得る。
al.,Bioinformatics:A Practical Guide to
the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998、及びMisener,et al.,(eds.)、Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,Vol.132)、Humana Press,1999に記載されている。類似の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、通常、類似性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、2つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%またはそれ以上が、残基の関連するストレッチにわたって類似及び/または同一である場合、実質的に類似していると見なされる。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは、完全な配列である。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも150、少なくとも175、少なくとも200、少なくとも225、少なくとも250、少なくとも275、少なくとも300、少なくとも325、少なくとも350、少なくとも375、少なくとも400、少なくとも425、少なくとも450、少なくとも475、少なくとも500以上の残基である。当業者によって理解されるように、実質的な配列類似性を有する配列は、互いの相同体であり得る。
実質的配列同一性:本明細書で使用される場合、「実質的な配列同一性」という表現は、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を指す。当業者によって理解されるように、2つの配列は、それらが対応する位置に同一の残基を含有する場合、一般に、「実質的に同一である」と見なされる。本技術分野で周知であるように、アミノ酸配列または核酸配列は、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較されてもよく、例えば、ヌクレオチド配列についてのBLASTN、及びアミノ酸配列についてのBLASTP、gapped BLAST、及びPSI-BLAST等の市販コンピュータプログラムにおいて利用可能なものを含む。そのようなプログラムの例は、Altschul et al.,Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990、Altschul et al.,Methods in Enzymology、Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997、Baxevanis et al.,Bioinformatics: A Practical
Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998、及びMisener,et al,(eds.),Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,Vol.132),Humana
Press,1999に記載されている。同一の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、通常、同一性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、2つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上が、残基の関連するストレッチにわたって同一である場合、2つの配列は、実質的に同一であると見なされる。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは、完全な配列である。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500以上の残基である。
Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998、及びMisener,et al,(eds.),Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,Vol.132),Humana
Press,1999に記載されている。同一の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、通常、同一性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、2つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上が、残基の関連するストレッチにわたって同一である場合、2つの配列は、実質的に同一であると見なされる。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは、完全な配列である。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500以上の残基である。
治療薬:本明細書で使用される場合、「治療薬」という句は、一般に、生物に投与されたときに所望の薬理学的効果を引き起こす任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、薬剤は、適切な集団にわたって統計的に有意な効果を示す場合、治療剤であると見なされる。いくつかの実施形態では、適切な集団は、モデル生物の集団であってもよい。いくつかの実施形態では、適切な集団は、ある特定の年齢層、性別、遺伝的背景、既存の臨床状態などの様々な基準によって定義され得る。いくつかの実施形態では、治療薬は、ある疾患、障害、及び/または状態の1つ以上の症状または特徴を軽減し、改善し、緩和し、阻害し、予防し、発症を遅延させ、重症度を低減し、及び/またはその発生率を低減するために使用することができる物質である。いくつかの実施形態では、「治療薬」は、ヒトへの投与のために市販される前に政府機関によって承認されているか、または承認される必要がある薬剤である。いくつかの実施形態では、「治療薬」は、ヒトへの投与に処方箋が必要とされる薬剤である。
治療レジメン:「治療レジメン」は、この用語が本明細書で使用される場合、関連集団全体にわたる投与が所望のまたは有益な治療転帰と相関し得る投薬レジメンを指す。
治療上有効量:本明細書で使用される場合、それが投与される所望の効果をもたらす量を意味する。いくつかの実施形態では、この用語は、治療投薬レジメンに従って、疾患、障害、及び/または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい集団に投与される場合に、疾患、障害、及び/または状態を治療するのに十分な量を指す。いくつかの実施形態では、治療上有効量は、ある疾患、障害、及び/または状態の1つ以上の症状の発生及び/または重症度を低減し、及び/またはそれらの発症を遅らせる量である。当業者は、「治療上有効量」という用語が、特定の個体で達成される成功した治療を実際には必要としないことを理解するであろう。むしろ、治療上有効量は、そのような治療を必要とする患者に投与される場合に、有意な数の対象において特定の所望の薬理学的応答を提供する量であり得る。いくつかの実施形態では、治療有効量への言及は、1つ以上の特定の組織(例えば、疾患、障害または状態に影響を受ける組織)または流体(例えば、血液、唾液、血清、汗、涙、尿など)で測定される量への言及であってもよい。当業者は、いくつかの実施形態では、治療有効量の特定の薬剤または療法が単回投与で処方及び/または投与され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、治療上有効な薬剤は、例えば、投薬レジメンの一部として、複数の用量で処方されてもよく、及び/または投与されてもよい。
治療:本明細書で使用される場合、「治療」(「治療する」または「治療すること」も含む)という用語は、特定の疾患、障害、及び/または状態の1つ以上の症状、特徴、及び/または原因を部分的または完全に軽減し、改善し、緩和し、阻害し、その発症を遅延させ、その重症度を低減し、及び/またはその発生率を低減する療法の任意の投与を指す。いくつかの実施形態では、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び/または状態の兆候を示さない対象、及び/または疾患、障害、及び/または状態の初期兆候のみを示す対象のものであってもよい。代替的または追加的に、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び/または状態の1つ以上の確立された兆候を示す対象のものであり得る。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び/または状態に罹患していると診断された対象のものであってもよい。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び/または状態の発症リスクの増加と統計的に相関する1つ以上の感受性因子を有することが知られている対象のものであり得る。
バリアント:分子、例えば、核酸、タンパク質、または小分子との関係で、本明細書で使用される場合、「バリアント(variant)」という用語は、基準分子と有意な構造同一性を示すが、例えば、基準実体と比較して、1つ以上の化学部分の存在もしくは非存在、またはレベルにおいて、基準分子とは構造的に異なる分子を指す。いくつかの実施形態では、バリアントはまた、その基準分子と機能的に異なる。一般に、特定の分子が基準分子の「バリアント」であると適切に見なされるかどうかは、基準分子との構造的同一性の程度に基づく。当業者によって理解されるように、任意の生物学的または化学的基準分子は、特定の特徴的な構造要素を有する。バリアントは、定義上、1つ以上のそのような特徴的な構造要素を共有するが、基準分子と少なくとも1つの態様で異なる別個の分子である。ほんの数例を挙げると、ポリペプチドは、線形または三次元空間中の互いに対して指定された位置を有する、及び/または特定の構造モチーフ及び/または生物学的機能に寄与する、複数のアミノ酸を含む特徴的な配列要素を有し得、核酸は、線形または三次元空間中の互いに対して、指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基を含む特徴的な配列要素を有し得る。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、アミノ酸もしくはヌクレオチド配列の1つ以上の差異、及び/またはポリペプチドもしくは核酸(例えば、ポリペプチドもしくは核酸骨格に付着される)の共有結合成分である化学部分(例えば、炭水化物、脂質、リン酸基)の1つ以上の差異の結果として、基準ポリペプチドまたは核酸とは異なり得る。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、または99%である基準ポリペプチドまたは核酸との全体的な配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準ポリペプチドまたは核酸と少なくとも1つの特徴的配列要素を共有しない。いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドまたは核酸は、1つ以上の生物学的活性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準ポリペプチドまたは核酸の生物学的活性のうちの1つ以上を共有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準ポリペプチドまたは核酸の生物学的活性のうちの1つ以上を欠く。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準ポリペプチドまたは核酸と比較して、1つ以上の生物学的活性のレベルの低下を示す。いくつかの実施形態では、基準のアミノ酸またはヌクレオチド配列と同一であるが、特定の位置での少数の配列変化を有する場合、目的のポリペプチドまたは核酸が、基準のポリペプチドまたは核酸の「バリアント」と見なされる。典型的には、バリアント中の残基の約20%未満、約15%未満、約10%未満、約9%未満、約8%未満、約7%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、または約2%未満が、基準と比較して、置換、挿入、または欠失している。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準と比較して、約10、約9、約8、約7、約6、約5、約4、約3、約2、または約1個の置換残基を含む。多くの場合、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準と比較して、非常に少数(例えば、約5未満、約4未満、約3未満、約2未満、または約1未満)の置換、挿入、または欠失された機能性残基(すなわち、特定の生物学的活性に関与する残基)を含む。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準と比較して、約5以下、約4以下、約3以下、約2以下、または約1以下の付加または欠失を含むが、いくつかの実施形態では、付加または欠失を含まない。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準と比較して、約25未満、約20未満、約19未満、約18未満、約17未満、約16未満、約15未満、約14未満、約13未満、約10未満、約9未満、約8未満、約7未満、約6未満の付加または欠失を含み、一般に、約5未満、約4未満、約3未満、または約2未満の付加または欠失を含む。いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドまたは核酸は、天然に見られるものである。いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドまたは核酸は、ヒトポリペプチドまたは核酸である。
本開示は、とりわけ、ミニヌクレオソームコアタンパク質及びその使用に関する方法及び組成物を提供する。本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質には、とりわけ、(a)核酸結合ドメイン(NABD)、(b)標的化ドメイン、及び/または(c)核酸放出ドメイン、及び/またはもしくは安定性ドメイン、及び/またはオリゴマー化ドメイン、及び/またはリンカードメインが含まれる。様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、1つ以上の核酸分子と会合して、負荷ミニヌクレオソームを形成する。様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、2つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質及び1つ以上の核酸分子を含む。様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、それを必要とする対象に投与される。
ポリヌクレオチド鎖は、典型的には、負電荷を有するリン酸塩を担持する。したがって、ヒストン等のタンパク質中の正電荷は、核酸を縮合するのに役立つ。本開示は、例えば、ヒストンに由来する核酸結合ドメインが、非ウイルス性タンパク質ベクターとして人工的に構築されたミニヌクレオソームコアタンパク質において利用され得ることを理解する。
ほとんどの哺乳類細胞は、ウイルス及び細菌のような分子または実体を認識(及び/またはそれらにより認識される)、結合、及び内在化する細胞表面結合部分または受容体を有する。本明細書に開示される様々な組成物及び方法は、そのような細胞表面結合モチーフを、ミニヌクレオソームコアタンパク質における核酸結合ドメイン及びポリアルギニンドメインと組み合わせて使用する。様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、1つ以上の核酸を縮合することができるか、または1つ以上の核酸の縮合に関与することができるか、または縮合を促進することができる。様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、例えば、負荷ミニヌクレオソーム内の関連する核酸の、特定の細胞型への、例えば、エンドサイトーシスを介して、または他の細胞侵入機構を介して内在化を促進する。したがって、様々な実施形態では、本開示は、細胞表面部分または受容体が細胞侵入機構を提供する、系、例えば、ヒトである系の細胞上に自然に存在する細胞表面部分または受容体と結合することができる標的化部分を組み込むミニヌクレオソームコアタンパク質を含む。様々な事例では、細胞表面部分または受容体は細胞型特異的であり、したがって、選択された細胞型への核酸の特異的送達を容易にする。
核酸分子は大きな負電荷を含有し、体液中の分解に脆弱であり、単純な注射または細胞への曝露を介して細胞に入ることはできない。その大きな負電荷は、ミニヌクレオソームコアタンパク質によって中和され、受動拡散または能動輸送によって細胞への侵入を可能にする特定の形状、サイズ、及び電荷の負荷ミニヌクレオソームを形成することができる。本明細書に記載される様々なミニヌクレオソームコアタンパク質は、核酸の適切な結合、縮合、及び標的化を可能にする。本明細書に記載のこれらのドメインは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、細胞付着、内在化などの特定の機能を増強するためのアミノ酸配列を変更して、本明細書に記載のドメインを修飾または操作することを企図することができるが、これらに限定されない。当業者はまた、ドメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはこれらに限定されないが、アミノ酸にアセチル化、糖化などの様々な翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
核酸結合ドメイン
本開示は、正荷電ドメインが核酸と会合するという認識を含む。本開示は、ミニヌクレオソームコアタンパク質に含まれ得る核酸結合ドメイン、例えば、DNA及びRNA結合ドメインを提供する。いくつかの事例では、ミニヌクレオソームコアタンパク質に存在するDNA結合ドメインは、本明細書に開示されるDNA結合ドメインである。いくつかの事例では、ミニヌクレオソームコアタンパク質に存在するRNA結合ドメインは、本明細書に開示されるRNA結合ドメインである。
本開示は、正荷電ドメインが核酸と会合するという認識を含む。本開示は、ミニヌクレオソームコアタンパク質に含まれ得る核酸結合ドメイン、例えば、DNA及びRNA結合ドメインを提供する。いくつかの事例では、ミニヌクレオソームコアタンパク質に存在するDNA結合ドメインは、本明細書に開示されるDNA結合ドメインである。いくつかの事例では、ミニヌクレオソームコアタンパク質に存在するRNA結合ドメインは、本明細書に開示されるRNA結合ドメインである。
いくつかの特定の事例では、本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質に存在するDNA結合ドメインであるNABDは、ヒストンポリペプチド配列に由来し得る。遺伝子送達のためにDNAをより小さな粒子にコンパクト化するためにポリリジンペプチドを利用するDNAナノ粒子等の非ウイルスベクター(Liu G.et al,2003)が使用されており、少なくともいくつかの事例では、疾患の治療において成功または有意な応答はない(Konstan M.W.et al,2004)。本開示は、様々な実施形態において、ヒストンのDNA結合ドメイン、例えばアミノ酸配列KRHRKの使用を含む、著しく異なるアプローチを提供する。このアミノ酸配列は、2つの目的を果たし、第1に、核酸と会合するのに必要な強い正電荷を与えること、第2に、ミニヌクレオソームコアタンパク質構造にも安定性を与えることである。第3に、このNABD中のアミノ酸配列KRHは、プロタンパク質転換酵素の切断部位でもあるため、細胞内の遺伝子カーゴの効率的な放出を可能にする。
NABDの他の例を表3に提供する。
RRRRR等のポリアルギニントラクトをミニヌクレオソームコアタンパク質に含めることにより、核酸結合を増加させるとともに、組成物の正電荷及び/または細胞浸透能力を増強することができる。ポリアルギニントラクトは、ミニヌクレオソームコアタンパク質による、及び/またはミニヌクレオソームコアタンパク質を含む負荷ミニヌクレオソームによる細胞の浸透を促進するのに好適な位置で、ミニヌクレオソームコアタンパク質に存在し得る。当業者であれば、そのような位置の決定を可能にする方法及び技術を認識するであろう。アルギニンは、リン脂質と相互作用して、2つ以上の脂質頭部のリン酸塩と同時に会合することから、二座または多座水素結合を形成するため、単一の脂質頭部基上のリン酸塩と相互作用する。アルギニンのみが二座水素結合を形成することができるため、ポリアルギニンはより多くの双性イオン性及び陰イオン性脂質と結合し得、したがってその輪郭長に沿って正曲率を生成し、したがって負のガウス曲率をもたらす(Rothbard,J.B.,et al.2005)。ポリアルギニントラクトはまた、ミニヌクレオソームコアタンパク質の安定性を改善するために、特異的に1つ以上のヒスチジン(H)アミノ酸(または任意の他のアミノ酸)を含むように修飾され得る。ヒスチジン(または任意の他のアミノ酸)は、表3に示すように、ポリアルギニントラクトの任意の位置に挿入され得る。ANTPペネトラチン、及びTAT等の他のアルギニンに富むペプチドもまた、細胞浸透に同様の影響を示している。
本開示は、ミニヌクレオソームコアタンパク質の核のユークロマチン領域への局在化が、ミニヌクレオソームコアタンパク質中のリジンのアセチル化によって促進され得るという認識を含む。この安定化の機構は、少なくとも部分的に、翻訳後修飾されたヒストンを安定化させる機構に関連し得る。メチル化ヒストンはより密に詰まる。ヒストンメチル化は、動的であり得る。適用され得る他の翻訳後修飾は、リン酸化、グリコシル化、プレニル化、リポイル化、アルキル化、アシル化、糖化、ニトロシル化、硫酸化、カルバミル化、カルボニル化、SUMO化、NEDD化、ビオチン化、リボシル化等である。修飾は、本明細書で言及したものに限定されるものではない。他の修飾は、補因子、補酵素、疎水性基、親水性基、より小さい化学基、より小さいペプチド等の付着を含み得る。かかる修飾は、本明細書に記載のこれらのミニヌクレオソームコアタンパク質中のアミノ酸にも適用され得る。本明細書で言及される、表3の核酸結合ドメインは、表4、5、6、7、9、10、11、及び12に提供される他のドメインと組み合わせて、核酸結合を強化するために、任意の位置でポリペプチドに組み込むことができる。
標的化ドメイン
本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質としては、ミニヌクレオソームを1つ以上の細胞または細胞型に標的化する標的ドメインが挙げられる。
本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質としては、ミニヌクレオソームを1つ以上の細胞または細胞型に標的化する標的ドメインが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質の標的ドメインは、1つ以上の細胞または細胞型への付着を可能にし、1つ以上の細胞または細胞型に侵入するアミノ酸ドメインである。標的化ドメインは、特定の細胞型に特異的であり得るが、一般的に細胞への侵入を容易にするドメインも含み得ることが理解されるべきである。一般に、ミニヌクレオソームコアタンパク質の標的化ドメインは、付着、細胞型特異的結合、及び内在化のうちの1つ以上に寄与し得る。標的ドメインは、例えば、細胞付着ドメイン、βガラクトース結合ドメイン、フコース結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、シアル酸結合ドメイン、糖タンパク質結合ドメイン、炭水化物結合ドメイン、リゾホスファチジン酸結合ドメイン、cAMP結合ドメイン、ヒアルロナン結合ドメイン、コンドロイチン硫酸結合ドメイン、インテグリン結合ドメイン、ヌクレオリン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、クラスリン結合ドメイン、Fc受容体結合ドメイン、アクチン結合ドメイン、エンドサイトーシスモチーフ、または核局在化シグナルであり得る。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質の標的ドメインは、1つ以上の細胞または細胞型への結合及び侵入を可能にし、哺乳動物、ウイルス、ウイルス粒子、プリオン、細菌、または真菌のアミノ酸配列に由来するアミノ酸ドメインである。
細胞付着標的ドメイン:
細胞付着は、ミニヌクレオソームコアタンパク質、または負荷ミニヌクレオソームがミニヌクレオソームコアタンパク質を含み、細胞に付着し、様々な事例では、細胞への侵入を促進することができる手段である。様々なウイルスは、宿主細胞への結合を可能にし、それらへの侵入を強化する付着分子またはドメインを有する。例えば、インフルエンザウイルスは、細胞表面上のシアル酸に結合することを可能にする血球凝集素をその表面上に有する。本開示は、とりわけ、シアル酸、ガラクトース、フコース、ヒアルロン酸、及び硫酸コンドロイチンへのミニヌクレオソームコアタンパク質の結合を可能にするいくつかのかかるドメイン、ならびに内在化のための細胞付着を強化する糖タンパク質を提供する。本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質は、1つ以上の細胞付着標的ドメインを含み得る。細胞付着標的ドメインとしては、表4に示すドメインが挙げられる。本開示の細胞付着ドメインは、任意の位置で、及び/または本明細書、例えば、表3、5、6、7、8、9、10、11、及び12で提供する、1つ以上の他のドメインのうちのいずれかと組み合わせて、ミニヌクレオソームコアタンパク質中に存在することができる。
細胞付着は、ミニヌクレオソームコアタンパク質、または負荷ミニヌクレオソームがミニヌクレオソームコアタンパク質を含み、細胞に付着し、様々な事例では、細胞への侵入を促進することができる手段である。様々なウイルスは、宿主細胞への結合を可能にし、それらへの侵入を強化する付着分子またはドメインを有する。例えば、インフルエンザウイルスは、細胞表面上のシアル酸に結合することを可能にする血球凝集素をその表面上に有する。本開示は、とりわけ、シアル酸、ガラクトース、フコース、ヒアルロン酸、及び硫酸コンドロイチンへのミニヌクレオソームコアタンパク質の結合を可能にするいくつかのかかるドメイン、ならびに内在化のための細胞付着を強化する糖タンパク質を提供する。本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質は、1つ以上の細胞付着標的ドメインを含み得る。細胞付着標的ドメインとしては、表4に示すドメインが挙げられる。本開示の細胞付着ドメインは、任意の位置で、及び/または本明細書、例えば、表3、5、6、7、8、9、10、11、及び12で提供する、1つ以上の他のドメインのうちのいずれかと組み合わせて、ミニヌクレオソームコアタンパク質中に存在することができる。
細胞付着はまた、RGD、RGDSなどのドメインによって達成され得る(D’Souza SE et al,1991)。インテグリン、ヌクレオリン、コラーゲン、クラスリン、Fc受容体等の細胞表面タンパク質への結合も、ウイルス及び他の粒子が細胞に侵入するのを助ける。本開示は、とりわけ、細胞取り込みを増加させるためのインテグリン、ヌクレオリン、コラーゲン、クラスリン、Fc受容体としての結合を可能にするドメインを提供する。細胞付着ドメインとしては、表5に示すドメインが挙げられる。表5に提供される細胞付着ドメインは、任意の位置で、及び/または本明細書例えば、表3、4、6、7、8、9、10、11、及び12で提供する1つ以上の他のドメインのうちのいずれかと組み合わせて、ミニヌクレオソームコアタンパク質中に存在することができる。
内在化標的化ドメイン:
ウイルス及び哺乳類タンパク質におけるある特定のドメインは、細胞内在化に直接影響を及ぼし得る。例えば、ある特定のタンパク質のドメイン及び連続配列は、Oleson
et al.,2008に記載されている。例えば、PPxY-モチーフは、アデノウイルスの細胞への侵入に必要である(Wodrich et al,2010)(xは任意のアミノ酸であり得る)。内在化標的化ドメインの別の例は、黄体形成ホルモン(LH)受容体のカルボキシル末端テールにおいて、リガンド-受容体複合体を分解経路からリサイクル経路に誘導するGTALLモチーフ-5-アミノ酸残基ドメインである(Pandey,2009)。GTALLモチーフはまた、βアドレナリン受容体の内在化に関与することが示唆されているカルボキシル末端テトラペプチド配列モチーフDSLLとの配列相同性を示す。Pandeyはまた、クラスリン依存性カーゴが通常、アダプタータンパク質-2(AP-2)によって認識される、YXXQ(ここでXは任意のアミノ酸であり得る)などの短い配列モチーフを含み、アクセサリークラスリンアダプタータンパク質によって認識されるAsn-Pro-X-Tyr配列(NPXY)モチーフを含み得ることについても考察する。トランスフェリン。NPXYモチーフは、Kirchhausen,1999によっても論じられている。NPTYはまた、APPのエンドサイトーシスモチーフである。内在化を可能にするクラスリン結合ドメインの別の例は、FXDXF(Xは任意のアミノ酸であり得る)である(Lene E.Oleson.2008)。内在化標的化ドメインとしては、表6に提供されるドメインが挙げられる。
ウイルス及び哺乳類タンパク質におけるある特定のドメインは、細胞内在化に直接影響を及ぼし得る。例えば、ある特定のタンパク質のドメイン及び連続配列は、Oleson
et al.,2008に記載されている。例えば、PPxY-モチーフは、アデノウイルスの細胞への侵入に必要である(Wodrich et al,2010)(xは任意のアミノ酸であり得る)。内在化標的化ドメインの別の例は、黄体形成ホルモン(LH)受容体のカルボキシル末端テールにおいて、リガンド-受容体複合体を分解経路からリサイクル経路に誘導するGTALLモチーフ-5-アミノ酸残基ドメインである(Pandey,2009)。GTALLモチーフはまた、βアドレナリン受容体の内在化に関与することが示唆されているカルボキシル末端テトラペプチド配列モチーフDSLLとの配列相同性を示す。Pandeyはまた、クラスリン依存性カーゴが通常、アダプタータンパク質-2(AP-2)によって認識される、YXXQ(ここでXは任意のアミノ酸であり得る)などの短い配列モチーフを含み、アクセサリークラスリンアダプタータンパク質によって認識されるAsn-Pro-X-Tyr配列(NPXY)モチーフを含み得ることについても考察する。トランスフェリン。NPXYモチーフは、Kirchhausen,1999によっても論じられている。NPTYはまた、APPのエンドサイトーシスモチーフである。内在化を可能にするクラスリン結合ドメインの別の例は、FXDXF(Xは任意のアミノ酸であり得る)である(Lene E.Oleson.2008)。内在化標的化ドメインとしては、表6に提供されるドメインが挙げられる。
本開示によって提供される他の特徴は、1つ以上のロイシン及びイソロイシン残基を含み、これらの残基は、本質的に疎水性が高い。実際、ロイシンは、2番目に疎水性の高いアミノ酸である。様々な実施形態では、ロイシン残基は、ミニヌクレオソームコアタンパク質の組成物において複数の機能を果たすことができる。第1に、両親媒性分子の非極性面の疎水性は、ペプチド二次構造の安定化に重要な役割を果たす(Chen Y.et al,2007)。第2に、ジロイシン型シグナルモチーフは、膜受容体及び膜タンパク質の細胞内区画への内在化及び輸送に不可欠であることが示されている。例えば、GLUT4(グルコース輸送体4)、LDL(低密度リポタンパク質)、LH(黄体形成ホルモン)、TGN(トランスゴルジ網)はすべて、細胞への内在化を助けるジロイシンモチーフを有する。Fc受容体ジロイシンモチーフもまた、エンドサイトーシスをシグナル伝達する(Wu Z.and Simister N.E.,2001)。表4に提供される内在化標的化ドメインは、任意の位置で、及び/または本明細書で例えば、表3、4、5、7、8、9、10、11、及び12で、提供する1つ以上の他のドメインのうちのいずれかと組み合わせて、ミニヌクレオソームコアタンパク質中に存在することができる。
核標的化ドメイン。
様々な実施形態では、細胞侵入後、核酸カーゴが核に到達することが重要である。核内在化シグナルまたは核内移行機構への結合は、核局在化の鍵である。機能的な真核生物の核局在化シグナルは、バクテリオファージの末端タンパク質において広く存在する(Redrejo-Rodriguez et.al,2012)。ChanとJansは、ポリリジン自体が核局在化シグナルとして機能しないことを示している。したがって、非ウイルス遺伝子導入を強化するために核標的化シグナルを追加することは、論理的アプローチである(Chan and Jans,1999)。ポリペプチド中のNLSの位置も、その機能の鍵である。我々は、強化された核侵入のためのNLS配列を表7に列挙し、最も効率的な核侵入のためのNLSシグナルの最適な位置を表13に提供した。表7で、本明細書で言及される核酸結合ドメインは、任意の位置でミニヌクレオソームコアタンパク質に組み込まれて、表3、4、5、6、8、9、10、11、及び12に提供される他のドメインと組み合わせて、核酸結合を強化することができる。
様々な実施形態では、細胞侵入後、核酸カーゴが核に到達することが重要である。核内在化シグナルまたは核内移行機構への結合は、核局在化の鍵である。機能的な真核生物の核局在化シグナルは、バクテリオファージの末端タンパク質において広く存在する(Redrejo-Rodriguez et.al,2012)。ChanとJansは、ポリリジン自体が核局在化シグナルとして機能しないことを示している。したがって、非ウイルス遺伝子導入を強化するために核標的化シグナルを追加することは、論理的アプローチである(Chan and Jans,1999)。ポリペプチド中のNLSの位置も、その機能の鍵である。我々は、強化された核侵入のためのNLS配列を表7に列挙し、最も効率的な核侵入のためのNLSシグナルの最適な位置を表13に提供した。表7で、本明細書で言及される核酸結合ドメインは、任意の位置でミニヌクレオソームコアタンパク質に組み込まれて、表3、4、5、6、8、9、10、11、及び12に提供される他のドメインと組み合わせて、核酸結合を強化することができる。
細胞型特異的標的化ドメイン:
様々な実施形態では、より高濃度の粒子が所望の細胞型に帰還することが最も望ましい。これは、増加した取り込み及び増加した発現-2つの好ましい遺伝子治療結果を可能にする。文献では、そのような特性のために発見されたモチーフはほとんどない。これらのほとんどは、ウイルス親和性が異なるキャプシドで異なることを示す実験に由来する。本開示は、様々な実施形態において、ニューロン、筋肉、肝臓、肺、腎臓、内皮細胞または腫瘍部位における発現を増強するための、それらの定義されたモチーフのいくつかの使用を含む。細胞型特異的標的化ドメインとしては、表8に示すドメインが挙げられる。表8の細胞型特異的標的化ドメインは、任意の位置で、及び/または本明細書例えば、表3、4、5、6、7、9、10、11、及び12で提供する1つ以上の他のモチーフのうちのいずれかと組み合わせて、ミニヌクレオソームコアタンパク質中に存在することができる。
様々な実施形態では、より高濃度の粒子が所望の細胞型に帰還することが最も望ましい。これは、増加した取り込み及び増加した発現-2つの好ましい遺伝子治療結果を可能にする。文献では、そのような特性のために発見されたモチーフはほとんどない。これらのほとんどは、ウイルス親和性が異なるキャプシドで異なることを示す実験に由来する。本開示は、様々な実施形態において、ニューロン、筋肉、肝臓、肺、腎臓、内皮細胞または腫瘍部位における発現を増強するための、それらの定義されたモチーフのいくつかの使用を含む。細胞型特異的標的化ドメインとしては、表8に示すドメインが挙げられる。表8の細胞型特異的標的化ドメインは、任意の位置で、及び/または本明細書例えば、表3、4、5、6、7、9、10、11、及び12で提供する1つ以上の他のモチーフのうちのいずれかと組み合わせて、ミニヌクレオソームコアタンパク質中に存在することができる。
核酸放出ドメイン:
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームの「核酸放出ドメイン」(「NARD」)は、細胞核への放出及び侵入を可能にするアミノ酸ドメインである。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームの「核酸放出ドメイン」(「NARD」)は、細胞核への放出及び侵入を可能にするアミノ酸ドメインである。
粒子が細胞に侵入する前に放出されないことが非常に望ましい。細胞において、細胞質または核における核酸カーゴの放出が好ましい場合がある。細胞内での放出を補助し得るプロテアーゼ及びエンドペプチダーゼが存在する。プロタンパク質変換酵素及びエンドペプチダーゼは、ある特定のアミノ酸ドメインで切断され、そのような現象は、一旦細胞または核内に入ると核酸カーゴを放出することができるミニヌクレオソームコアタンパク質を設計するためにここで利用されている。KRHは、Pcsk1及びPcsk2の切断部位である。プログルカゴンは、Pcsk1またはPcsk2によって膵臓A細胞及び腸細胞において組織特異的な様式で翻訳後処理される。NRRKKRALは、TGFB1のフューリン切断部位である。KSVKKRSVSEIQは副甲状腺ホルモンのフューリン切断部位である。切断部位はまた、Expasy、OmicX、PROSPERous、Prop1.0、SignalP-5.0、MEROPS、CutDB、Peptide Cutter等のバイオインフォマティクスプラットフォームを使用してインシリコで予測することができる。細胞質または核中のDNA放出するために粒子を放出するため、これらの切断部位を組み込む方法の例を提供する。表9において、本明細書に言及されるドメインは、任意の位置でミニヌクレオソームコアタンパク質に組み込まれて、表3、4、5、6、7、8、10、11、及び12に言及される他のドメインと組み合わせて、核酸放出を強化することができる。
安定性ドメイン:
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームの「安定性ドメイン」は、負荷ミニヌクレオソームが体液、細胞質、及び核内で安定した状態を維持できるようにするアミノ酸ドメインである。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームの「安定性ドメイン」は、負荷ミニヌクレオソームが体液、細胞質、及び核内で安定した状態を維持できるようにするアミノ酸ドメインである。
粒子の安定性は、細胞への安全な通過及び発現の長寿命にとって重要である。粒子が安定性を失ういくつかの理由がある。第1に、粒子は、血液及びその他の体液中で安定している必要がある。第2に、粒子は、エンドソームの侵入を安全に横切って、安全に脱出して細胞質にそれを出す必要がある。ウイルス粒子またはリサイクル受容体は、いくつかのドメインを使用してエンドソームに侵入し、エンドソームから脱出する。安定性を高めるためにエンドソーム侵入及び脱出ドメインを組み込むミニヌクレオソームコアタンパク質の例を提供する。表10で、本明細書で言及されるドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質に、好ましくはC末端で組み込むことができるが、表3、4、5、6、7、8、9、11、及び12に提供される他のドメインと組み合わせる場合、任意の位置でも組み込まれて、ミニヌクレオソームコアタンパク質の安定性を高めることができる。当業者はまた、ペプチド中の疎水性アミノ酸のフッ素化を企図して、タンパク質安定性を高め、アセンブリを強化する等の手段を提供し、リガンド-受容体相互作用を強化することができる。当業者はまた、ペプチド中のアミノ酸に対する他の翻訳後修飾も企図して、タンパク質安定性を高め、アセンブリを強化する等の手段を提供し、リガンド-受容体相互作用を強化することができる。
オリゴマー化ドメイン:
オリゴマー化は、モノマーが会合して二量体及び高次巨大分子複合体を含む多量体を形成する化学的プロセスである。タンパク質性分子のオリゴマー化は、モノマーの会合を促進するドメインによって促進されることが多い。
オリゴマー化は、モノマーが会合して二量体及び高次巨大分子複合体を含む多量体を形成する化学的プロセスである。タンパク質性分子のオリゴマー化は、モノマーの会合を促進するドメインによって促進されることが多い。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームの「オリゴマー化ドメイン」は、ミニヌクレオソームコアタンパク質または負荷ミニヌクレオソームがホモ二量体、ヘテロ二量体、四量体、八量体、または他の高次構造などの高次構造で会合することを可能にするアミノ酸ドメインである。オリゴマー化は、負荷ミニヌクレオソームのサイズを減少させ得る。ミニヌクレオソームコアタンパク質の多量体は、同じミニヌクレオソームコアタンパク質(例えば、同じアミノ酸配列を有する2つのミニヌクレオソームコアタンパク質)のうちの2つ以上を含むことができ、及び/または2つ以上の異なるミニヌクレオソームコアタンパク質(例えば、異なるアミノ酸配列を有する2つのミニヌクレオソームコアタンパク質)を含むことができる。本明細書に提供されるオリゴマー化ドメインの例は、決して限定されず、当業者は、かかるドメインが、酵母-ツーハイブリッドスクリーニング、質量分析に結合された親和性精製、テキストマイニングを含む様々な方法によって、または人工知能及び機械学習の適用によって、認識または識別され得ることを理解することができる。当業者はまた、誘導性ホモ二量体化系及び/または化学的に誘導された二量体化を使用して負荷ミニヌクレオソームを形成する誘導性系を作成することができる。
いくつかの実施形態において、オリゴマー化ドメインは、3つ以上のアミノ酸を含み得る。本明細書で、例えば、表11に開示されるオリゴマー化ドメインは、例えば本明細書、例えば、表3、4、5、6、7、8、9,10、及び12で提供される他のドメインと組み合わせて、ミニヌクレオソームコアタンパク質の任意の位置でミニヌクレオソームコアタンパク質に組み込むことができる。特定の実施形態では、オリゴマー化ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のC末端に配置される。
リンカー:
融合タンパク質を作製する技術分野では、タンパク質は、いくつかの例では、リンカーを含めることから利益を得ることができることが知られている。本開示は、例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質の2つのドメイン間に1つ以上のリンカーを含むミニヌクレオソームコアタンパク質を含む。リンカーは、タンパク質構造の安定性に寄与し得る。いくつかの場合には、リンカーは、ドメイン間の分離として機能し、他の場合には、それらは、タンパク質の機能に直接影響を及ぼし得る。いくつかのリンカーは剛性を増加させるため、タンパク質ドメインの効果的な分離を可能にする。リンカーはまた、切断部位を導入するために実装され得る。リンカーは、これらの理由のためにタンパク質工学の分野で使用されている。しかしながら、非ウイルス遺伝子導入の関連では、この戦略は利用されていない。本明細書では、リンカーをうまく使用して、所望の細胞型における選択的形質導入、遺伝子送達及び導入遺伝子発現等の機能目的のためにドメインを操作できることを示す(図10)。
融合タンパク質を作製する技術分野では、タンパク質は、いくつかの例では、リンカーを含めることから利益を得ることができることが知られている。本開示は、例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質の2つのドメイン間に1つ以上のリンカーを含むミニヌクレオソームコアタンパク質を含む。リンカーは、タンパク質構造の安定性に寄与し得る。いくつかの場合には、リンカーは、ドメイン間の分離として機能し、他の場合には、それらは、タンパク質の機能に直接影響を及ぼし得る。いくつかのリンカーは剛性を増加させるため、タンパク質ドメインの効果的な分離を可能にする。リンカーはまた、切断部位を導入するために実装され得る。リンカーは、これらの理由のためにタンパク質工学の分野で使用されている。しかしながら、非ウイルス遺伝子導入の関連では、この戦略は利用されていない。本明細書では、リンカーをうまく使用して、所望の細胞型における選択的形質導入、遺伝子送達及び導入遺伝子発現等の機能目的のためにドメインを操作できることを示す(図10)。
いくつかの実施形態では、リンカー配列は、1つ以上のアミノ酸を含んでいてもよい。本明細書に開示される例えば、表12に開示されるリンカーアミノ酸配列は、配列番号238~335に示されるドメイン間のミニヌクレオソームコアタンパク質に組み込むことができ、リンカーは、表1及び表12に提供されるアミノ酸またはアミノ酸配列のうちのいずれかを有するリンカーであり得る。リンカーは、表12に提供されるものに限定されない他のアミノ酸配列を含有し得る。リンカー配列はまた、ユーザが選択した入力を使用してリンカー配列のデータベースを検索し、基準に適合するリンカー配列の出力を生成するLINKERと呼ばれるプログラムを介して生成することもできる。トレオニン、セリン、グリシン、プロリン、アルギニン、及びアラニンは、天然リンカー、したがって、ミニヌクレオソームコアタンパク質において好ましい残基である。
ミニヌクレオソームコアタンパク質
ミニヌクレオソームコアタンパク質は、本明細書で提供される1つ以上のドメインを含み得る。
ミニヌクレオソームコアタンパク質は、本明細書で提供される1つ以上のドメインを含み得る。
本明細書に開示されるミニヌクレオソームタンパク質は、核酸結合ドメイン、標的化ドメイン、及び/または核酸放出ドメイン、及び/または安定性ドメインを含有する、少なくとも正荷電アミノ酸配列を含む。ミニヌクレオソームコアタンパク質は、例えば、配列番号336~387のいずれかに記載のミニヌクレオソームコアタンパク質と少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有する配列であり得る。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、10~100個のアミノ酸のアミノ酸配列長を含み得る。アミノ酸は、例えば、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、55、70、75、80、85、90、95、または100個のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、例えば、15~90アミノ酸、20~80アミノ酸、20~70アミノ酸、20~60アミノ酸、または30~40アミノ酸の長さを有し得る。
ある特定の実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、本明細書に開示される1つ以上のドメインと、本明細書に開示されるドメインに存在しない1つ以上のアミノ酸とを含む。ある特定の事例では、本明細書に開示されるドメインのN末端またはC末端にある本明細書に開示されるドメインに存在しない、アミノ酸は、「隣接アミノ酸」と称され得、本明細書に開示される任意のドメインに存在しない、ミニヌクレオソームに存在する全てのアミノ酸の全体は、「非ドメインアミノ酸」と称され得る。
様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質の非ドメインアミノ酸は、ミニヌクレオソームコアタンパク質の電荷に寄与する配列を有し得る。様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質の非ドメインアミノ酸は、少なくとも10%の正荷電アミノ酸、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または100%の正荷電アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、pH7では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、10~100の間の全正電荷を有し得る。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、アミノ酸配列の任意の位置に配置された1つ以上の核酸結合ドメインを含有し得る。場合によっては、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、核酸結合ドメインのみを含有し得る。場合によっては、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、核酸結合ドメイン及びポリアルギニンドメインを含有し得る。場合によっては、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、核酸結合ドメイン及び標的化ドメインを含有し得る。場合によっては、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、ポリアルギニンドメイン及び標的化ドメインのみを含有し得る。場合によっては、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、ポリアルギニンドメイン、核酸放出ドメイン、及び標的化ドメインのみを含有し得る。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、アミノ酸配列の任意の位置に配置された1つ以上のポリアルギニンを含有していてもよい。ポリアルギニン配列は、4~30個のアルギニンを含有し得る。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、1つ以上の標的化ドメインを含有し得る。標的化ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ酸配列の任意の位置に配置され得る。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、1つ以上の核酸放出ドメインを含有し得る。好ましくは、核酸放出ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ酸配列の中央に配置される。好ましくは、核酸放出ドメインは、N末端からの6個のアミノ酸の後、またはC末端からの6個のアミノ酸の前に配置される。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、1つ以上の安定性ドメインを含有し得る。好ましくは、安定ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ酸配列のC末端に配置される。場合によっては、安定性ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ酸配列のN末端に配置される。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、1つ以上のオリゴマー化ドメインを含み得る。ある特定の実施形態では、オリゴマー化ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ酸配列のC末端に配置される。場合によっては、オリゴマー化ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ酸配列のN末端に配置される。
したがって、疑義を避けるために、本明細書に記載のミニヌクレオソームコアタンパク質は、(a)核酸結合ドメイン(NABD)、及び(b)標的化ドメインを含み得る。当業者であれば、これらの成分を含むポリペプチドが、本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質を構成し、任意選択で、本明細書に記載の追加の制限を受け、及び/または限定されないが、本明細書で提供される、または別様に当該技術分野で既知の、1つ以上のさらなるドメインを含むことを本開示から理解するであろう。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号1~28うちのいずれかに記載の核酸結合ドメイン(例えば、表3に記載の核酸結合ドメイン)と少なくとも65%の配列同一性、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列同一性を有し、及び/または、2つ以下のアミノ酸変化(例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換)または1つ以下のアミノ酸変化により、配列番号1~28のうちのいずれかに記載の核酸結合ドメインと異なる、核酸結合ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号29~53のうちのいずれかに記載の細胞付着標的化ドメイン(例えば、表4に記載の細胞付着標的化ドメイン)と少なくとも65%の配列同一性、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列同一性を有し、及び/または2つ以下のアミノ酸変化(例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換)または1つ以下のアミノ酸変化により、配列番号29~53のうちのいずれかに記載の細胞付着標的化ドメインと異なる、細胞付着標的化ドメインである標的化ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号54~81うちのいずれかに記載の細胞付着標的化ドメイン(例えば、表5に記載の細胞付着標的化ドメイン)と少なくとも65%の配列同一性、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列同一性を有し、及び/または2つ以下のアミノ酸変化(例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換)または1つ以下のアミノ酸変化により、配列番号54~81うちのいずれかに記載の細胞付着標的化ドメインと異なる、細胞付着標的化ドメインである標的化ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号82~115うちのいずれかに記載の内在化標的化ドメイン(例えば、表6に記載の内在化標的化ドメイン)と少なくとも65%の配列同一性、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列同一性を有し、及び/または2つ以下のアミノ酸変化(例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換)または1つ以下のアミノ酸変化により、配列番号82~115のうちのいずれかに記載の内部化標的化ドメインと異なる、内在化標的化ドメインである標的化ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号116~139のうちのいずれかに記載の核標的化ドメイン(例えば、表7に記載の核標的化ドメイン)と少なくとも65%の配列同一性、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列同一性を有し、及び/または2つ以下のアミノ酸変化(例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換)または1つ以下のアミノ酸変化により、配列番号116~139のうちのいずれかに記載の核標的化ドメインと異なる、核標的化ドメインである標的化ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号140~164のうちのいずれかに記載の細胞型特異的標的化ドメイン(例えば、表8に記載の細胞型特異的標的化ドメイン)と少なくとも65%の配列同一性、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列同一性を有し、及び/または2つ以下のアミノ酸変化(例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換)または1つ以下のアミノ酸変化により、配列番号140~164のうちのいずれかに記載の細胞型特異的標的化ドメインと異なる、細胞型特異的標的化ドメインである標的化ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号165~208のうちのいずれかに記載の核酸放出ドメイン(例えば、表9に記載の核酸放出ドメイン)と少なくとも65%の配列同一性、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列同一性を有し、及び/または2つ以下のアミノ酸変化(例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換)または1つ以下のアミノ酸変化により、配列番号165~208のうちのいずれかに記載の核酸放出ドメインと異なる、核酸放出ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号209~219のうちのいずれかに記載の安定性ドメイン(例えば、表10に記載の安定性ドメイン)と少なくとも65%の配列同一性、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列同一性を有し、及び/または2つ以下のアミノ酸変化(例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換)または1つ以下のアミノ酸変化により、配列番号209~219のうちのいずれかに記載の安定性ドメインと異なる、安定性ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号220~237のうちのいずれかに記載のオリゴマー化ドメイン(例えば、表11に記載のオリゴマー化ドメイン)と少なくとも65%の配列同一性、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列同一性を有し、及び/または2つ以下のアミノ酸変化(例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換)または1つ以下のアミノ酸変化により、配列番号220~237のうちのいずれかに記載のオリゴマー化ドメインと異なる、オリゴマー化ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号238~335のうちのいずれかに記載のリンカードメイン(例えば、表12に記載のリンカードメイン)と少なくとも65%の配列同一性、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%の配列同一性を有し、及び/または2つ以下のアミノ酸変化(例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換)または1つ以下のアミノ酸変化により、配列番号238~335のうちのいずれかに記載のリンカードメインと異なる、リンカードメインを含むことができる。
ミニヌクレオソームコアタンパク質のドメインが本明細書に提供される、当業者は、本明細書に提供されるように、または他の方法で当業者によって本開示から理解されるように、任意の順序、配向、または配列で配置することができる。例えば、当業者は、例えば、本明細書に具体的に開示されていない1つ以上の介在するアミノ酸を有するか否かにかかわらず、個別に、または任意の対のドメイン間でもしくは任意のドメインに隣接するタンデム型の複数に含まれ得る任意の配列として、リンカーの意図される使用を理解するであろう。したがって、例えば、NABDは、標的ドメインのC末端またはN末端であり得る。追加のNABDまたは追加の標的化ドメインを含むがこれらに限定されない、本明細書に提供される追加のドメインは、NABDのC末端またはN末端、ならびに標的化ドメインのC末端またはN末端であり得る。さらに、リンカーを含むミニヌクレオソームコアタンパク質中に存在する各ドメインについて、1つ以上のリンカードメインは、ドメインのC末端またはドメインのN末端を含むことができる。例示的なミニヌクレオソームタンパク質が本明細書で提供される。本開示から当業者には容易に明らかになるように、本明細書に提供されるドメインはモジュラーであり、任意の順序でそれらの意図される機能とともに含めることができ、及び/またはそれによって、それらが存在する順序に関係なく、意図される有用性または機能性を有するミニヌクレオソームを提供する。
当業者であれば、本開示のミニヌクレオソームコアタンパク質は、当該技術分野で既知の任意の数または種類の修飾(例えば、翻訳後修飾)を含むことができることをさらに理解するであろう。そのような修飾には、ペグ化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、アミド化、脂質化、及び/またはメチル化が挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態において、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、ペグ化され得る。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、ミニヌクレオソームコアタンパク質とポリエチレングリコール(PEG)との会合によって修飾される。PEGは、非イオン性、非毒性、生体適合性、及び高度親水性ポリマーである。PEGは、主に、生物学的巨大分子及び表面の共有結合修飾に使用される。PEGコンジュゲーションは、ポリペプチドの見かけのサイズを増加させるため、腎濾過を減少させ、生体内分布を変化させる。ペプチドのペグ化は、それらの溶解度の増加(疎水性ペプチドの場合)、腎クリアランスの減少による半減期の延長、及び宿主における最小免疫応答のためのマスクされた抗原性によって、治療特性を強化することができる。様々なPEG鎖長のPEGが、5~40kDaの範囲の分子量を有するFDAの認可を受けた薬物で使用されている。図1、3、4、5、及び6において、様々なPEG鎖長のPEGを利用して、様々なサイズのミニヌクレオソームコアタンパク質を提供する方法の概略図を示す。
現在の粒子の多くは、10kDa以上のサイズのPEGを使用するが、より大きなPEGサイズを使用する欠点は、粒子サイズも増加することである。(Feuz L.et al.2007)。本開示は、とりわけ、様々なサイズ、好ましくは直径20nm未満のミニヌクレオソームを製剤化するために、様々なPEG長を有する粒子を提供する。図1において、12鎖の最小PEG長、及びそれを利用してミニヌクレオソームコアタンパク質中のアミノ酸を修飾することができる方法を示す。負荷ミニヌクレオソームの最終的なサイズは、ミニヌクレオソームコアタンパク質を修飾するために使用されるPEGサイズにも依存する。図2は、PEG12を付着させることによって、ペプチドの分子量がそれに応じて増加するが、ペプチドの溶解度などの物理的特徴を変化させないことを示す。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、1700g/mol~20000g/molの間の総分子量、例えば、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、10500、11000、11500、または20000g/molの総分子量を有することができる。様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、例えば、100Kda~10,000kDaの間の総分子量、例えば、100、200、500、1000、2,000、3000、5000、8000、及び10000kDaの総分子量を有し得る。
核酸カーゴ
本明細書で開示された負荷ミニヌクレオソームは、例えば、RNA、DNA、またはその核酸類似体である核酸カーゴで負荷され得る。核酸カーゴは、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸カーゴは、直鎖状であっても環状であってもよい。核酸カーゴは、タンパク質、RNA、shRNA、miRNA、抗体、ナノボディ、ダーピン(Darpin)、アンキリンリピート、またはポリペプチドのそれぞれの1つ以上をコードすることができる。例えば、核酸カーゴは、少なくとも1つの機能的タンパク質をコードするcDNA分子であり得る。様々な実施形態において、核酸カーゴは、阻害性RNA、例えば、gRNA、siRNA、miRNA、またはshRNAであり得る。
本明細書で開示された負荷ミニヌクレオソームは、例えば、RNA、DNA、またはその核酸類似体である核酸カーゴで負荷され得る。核酸カーゴは、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸カーゴは、直鎖状であっても環状であってもよい。核酸カーゴは、タンパク質、RNA、shRNA、miRNA、抗体、ナノボディ、ダーピン(Darpin)、アンキリンリピート、またはポリペプチドのそれぞれの1つ以上をコードすることができる。例えば、核酸カーゴは、少なくとも1つの機能的タンパク質をコードするcDNA分子であり得る。様々な実施形態において、核酸カーゴは、阻害性RNA、例えば、gRNA、siRNA、miRNA、またはshRNAであり得る。
核酸カーゴは、任意の細胞の核に送達されたときに、例えば、RNA、タンパク質、ポリペプチド、抗体、ナノボディ、miRNA、shRNA、gRNA、Cas9、非コードRNAをコードすることができる。発現は、本明細書で言及される実体に限定されない場合がある。
負荷ミニヌクレオソーム
本開示の負荷ミニヌクレオソームは、本開示の1つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質と、1つ以上のポリヌクレオチドとを含み得る。当業者であれば、かかる負荷ミニヌクレオソームが、様々な方法でミニヌクレオソームコアタンパク質及びポリヌクレオチドを組み合わせることから生成され得ることを本開示から理解するであろう。当業者は、少なくとも1つの実施形態において、負荷ミニヌクレオソームアセンブリが、本明細書に提供される1つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質及び1つ以上のポリヌクレオチドを、溶液中、例えば、限定されないが、水溶液中に、例えば、標準温度で、例えば、標準速度でのボルテックスで、含めると、単純に生じることを理解するであろう。したがって、負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質を生成する方法は、本明細書に提供されるアプローチ及び当業者に明らかであろう他のアプローチを含む。当業者は、少なくとも1つの実施形態では、負荷ミニヌクレオソームアセンブリが、本明細書に提供される1つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質及び1つ以上のポリヌクレオチドを、溶液中、例えば、限定されないが、水溶液中に、例えば、核酸の縮合を強化するのに役立つ触媒の存在下で、標準温度で含めると生じることを理解するであろう。
本開示の負荷ミニヌクレオソームは、本開示の1つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質と、1つ以上のポリヌクレオチドとを含み得る。当業者であれば、かかる負荷ミニヌクレオソームが、様々な方法でミニヌクレオソームコアタンパク質及びポリヌクレオチドを組み合わせることから生成され得ることを本開示から理解するであろう。当業者は、少なくとも1つの実施形態において、負荷ミニヌクレオソームアセンブリが、本明細書に提供される1つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質及び1つ以上のポリヌクレオチドを、溶液中、例えば、限定されないが、水溶液中に、例えば、標準温度で、例えば、標準速度でのボルテックスで、含めると、単純に生じることを理解するであろう。したがって、負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質を生成する方法は、本明細書に提供されるアプローチ及び当業者に明らかであろう他のアプローチを含む。当業者は、少なくとも1つの実施形態では、負荷ミニヌクレオソームアセンブリが、本明細書に提供される1つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質及び1つ以上のポリヌクレオチドを、溶液中、例えば、限定されないが、水溶液中に、例えば、核酸の縮合を強化するのに役立つ触媒の存在下で、標準温度で含めると生じることを理解するであろう。
本開示の負荷ミニヌクレオソームは、非縮合状態及び縮合状態にあり得る。負荷ミニヌクレオソームは、核酸分子の負電荷の少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%が中和された縮合状態にある。核酸分子中の負の電荷の90%未満が中和されたとき、負荷ミニヌクレオソームは、縮合されていない状態と見なされる。特に明記されない限り、本開示におけるミニヌクレオソームへの言及は、少なくとも縮合及び非縮合状態、ならびに該当する場合、それらの特徴を包含する。
ミニヌクレオソームは、例えば、1~10,000個のミニヌクレオソームコアタンパク質を含み得る。ミニヌクレオソームは、例えば、1~100個の核酸カーゴ分子を含み得る。
いくつかの実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、直径0.5~50ナノメートルのサイズであり得る。ミニヌクレオソームは、0.5~50nmの小径を維持しながら、最大50kbの長さを有することができる核酸カーゴ分子を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、100~10000kDaの、例えば、100、200、500、1000、3000、5,000、8000、10000kDaの分子量を有することができる。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、-100~100の正味電荷を有し得る。いくつかの実施形態では、負荷ミニヌクレオソーム製剤のゼータ電位は、-10ミリボルト~100ミリボルトの範囲であり得る。いくつかの例では、核酸カーゴ及びミニヌクレオソームコアタンパク質の複合体は、ミニヌクレオソーム粒子を構築するために使用される核酸分子及びポリペプチド分子と比較して最小サイズに縮合される。最終的な正電荷対負電荷比は、およそ1:1であり、それによって、無電荷、わずかに正電荷、またはわずかに負電荷の分子を形成する。最終粒子は、棹状、球状または円形を含むいくつかの形状で形成され得るが、これらに限定されない。
様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、5ダルトン~20kDaの分子量の1つ以上のポリエチレングリコール分子で修飾され得る。ポリエチレングリコール(PEG)部分は、ポリペプチド内の任意のアミノ酸残基に付着し得る。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対3つのミニヌクレオソームコアタンパク質(1:3)と、1つの核酸分子対3,000のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:3,000)との間に、またはそれらの間の任意の範囲内に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対3つのミニヌクレオソームコアタンパク質(1:3)と、1つの核酸分子対2,000のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:2,000)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対3つのミニヌクレオソームコアタンパク質(1:3)と、1つの核酸分子対1,000のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:1,000)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対3つのミニヌクレオソームコアタンパク質(1:3)と、1つの核酸分子対500のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:500)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対3つのミニヌクレオソームコアタンパク質(1:3)と、1つの核酸分子対200のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:200)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対3つのミニヌクレオソームコアタンパク質(1:3)と、1つの核酸分子対100のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:100)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対3つのミニヌクレオソームコアタンパク質(1:3)と、1つの核酸分子対50のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:50)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対50のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:50)と、1つの核酸分子対2,000のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:2,000)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対50のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:50)と、1つの核酸分子対1,000のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:1,000)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対50のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:50)と、1つの核酸分子対500のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:500)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対50のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:50)と、1つの核酸分子対200のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:200)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対50のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:50)と、1つの核酸分子対100のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:100)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対200のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:200)と、1つの核酸分子対2,000のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:2,000)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対200のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:200)と、1つの核酸分子対1,000のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:1,000)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、1つの核酸分子対200のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:200)と、1つの核酸分子対500のミニヌクレオソームコアタンパク質(1:500)との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
当業者であれば、ミニヌクレオソームコアタンパク質分子が、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、重炭酸塩、及び塩化物を含むいくつかの異なる塩条件を含むが、これらに限定されない、様々な手段によって生成及び/または構成され得ることを理解するであろう。負荷ミニヌクレオソームの最終製剤は、通常の生理食塩水、水、または任意の他の薬学的に許容される緩衝液中で構成され得る。
負荷ミニヌクレオソームの標的細胞または組織への送達
ある特定の実施形態では、ミニヌクレオソームは、標的細胞が網膜色素上皮(RPE)である核酸を送達することができる。効率的な遺伝子療法のために、いくつかの実施形態は、DNAまたはRNA等の多量のコピー数の遺伝子カーゴを1つの細胞型に送達することを含む。例えば、滲出型加齢黄斑変性において、RPE中で抗VEGFを発現することは、内皮細胞増殖及び血管漏出を阻害するために必要な治療レベルのタンパク質を提供し得る。本明細書では、RPEへの取り込みの増強を可能にするミニヌクレオソームコアタンパク質(配列番号392)の例を提供する(図10、11)。
ある特定の実施形態では、ミニヌクレオソームは、標的細胞が網膜色素上皮(RPE)である核酸を送達することができる。効率的な遺伝子療法のために、いくつかの実施形態は、DNAまたはRNA等の多量のコピー数の遺伝子カーゴを1つの細胞型に送達することを含む。例えば、滲出型加齢黄斑変性において、RPE中で抗VEGFを発現することは、内皮細胞増殖及び血管漏出を阻害するために必要な治療レベルのタンパク質を提供し得る。本明細書では、RPEへの取り込みの増強を可能にするミニヌクレオソームコアタンパク質(配列番号392)の例を提供する(図10、11)。
ある特定の実施形態では、ミニヌクレオソームは、標的細胞が網膜のニューロンである核酸を送達することができる。アミノ酸ドメインLRE(配列番号156)は、ニューロンの付着を増強するために使用され得ることが記載されている(Dale D,et al,1989)。ミニヌクレオソームコアタンパク質(配列番号388)を有するGFP構築物(配列番号395)を使用して、非ウイルスベクターでこのようなドメインを使用し、網膜中の標的ニューロン細胞にGFPを発現させた(図12)。これは、網膜ニューロンで発現される遺伝子の遺伝子突然変異によって引き起こされる網膜変性を治療するためにDNAまたはRNAを送達するのに特に有用である可能性がある。
様々な実施形態において、ミニヌクレオソームは、例えば、筋肉細胞、肝臓細胞、内皮細胞、造血幹細胞、肺上皮細胞、末梢細胞、β細胞、腸上皮細胞、ミクログリア細胞、マクロファージ細胞、神経細胞、皮膚細胞、血液細胞等であるがこれらに限定されない標的細胞に、核酸を送達することができる。本明細書に記載のドメインの様々な組み合わせ(表3-12)は、脳、網膜、腸、肝臓、肺、腎臓、筋肉、膵臓を含むが、これらに限定されない身体の他の部分における治療効果のために、負荷ミニヌクレオソームを特定の標的細胞型に送達することを可能にし得る。
薬学的組成物
本開示は、負荷ミニヌクレオソーム及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む「負荷ミニヌクレオソーム治療薬」を企図する。薬学的に許容される担体溶液の製剤は、好適な投薬及び治療レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。典型的には、これらの製剤は、所望の導入遺伝子の102個ゲノムコピー以上を含み得る。溶解度、バイオアベイラビリティ、半減期、保存期間などの他の要因は、当業者によって企図されるであろう。したがって、様々な用量及び治療レジメンが望ましい場合がある。負荷ミニヌクレオソーム治療薬は、網膜、肝臓、CNS、腸管などを含むが、これらに限定されないヒト体内の様々な細胞型、組織型または臓器にヌクレオチドを送達するために使用することができる。
本開示は、負荷ミニヌクレオソーム及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体を含む「負荷ミニヌクレオソーム治療薬」を企図する。薬学的に許容される担体溶液の製剤は、好適な投薬及び治療レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。典型的には、これらの製剤は、所望の導入遺伝子の102個ゲノムコピー以上を含み得る。溶解度、バイオアベイラビリティ、半減期、保存期間などの他の要因は、当業者によって企図されるであろう。したがって、様々な用量及び治療レジメンが望ましい場合がある。負荷ミニヌクレオソーム治療薬は、網膜、肝臓、CNS、腸管などを含むが、これらに限定されないヒト体内の様々な細胞型、組織型または臓器にヌクレオチドを送達するために使用することができる。
負荷ミニヌクレオソーム治療薬は、細胞または動物への投与に薬学的に許容されるように製剤化することができる。負荷ミニヌクレオソーム治療薬は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで投与され得る。負荷ミニヌクレオソーム治療薬は、単独で、または1つ以上の他の治療様式、例えば、抗体、ステロイド、ビタミン、AAVなどと組み合わせて、対象に投与することができる。
ある特定の事例において、負荷ミニヌクレオソーム治療薬は、それぞれまたは一緒に1つ以上の異なる発現産物をコードする1つ以上の核酸カーゴを含み得る。
ある特定の状況では、皮下、眼内、硝子体内、非経口、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、局所、経口、腹腔内注射による、または鼻腔吸入によるいずれかであるが、これらに限定されない技法によって、本明細書に開示される適切に製剤化された薬学的組成物で負荷ミニヌクレオソーム製剤を送達することが望ましいであろう。負荷ミニヌクレオソーム製剤の溶液は、滅菌水、滅菌生理食塩水中で調製され得、また、プルロニック酸(pluronic acid)などの1つ以上の界面活性剤と好適に混合され得る。分散液をまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で調製することができる。保管調製物は、微生物の増殖を防止するための保存料を含有し得る。
負荷ミニヌクレオソーム治療薬の好適な投与手段は、治療される病態または疾患に基づいて、ならびに対象の年齢及び状態に基づいて選択され得る。投与の用量及び方法は、患者の体重、年齢、状態等に応じて変化し得、当業者に必要に応じて適切に選択され得る。
様々な事例では、負荷ミニヌクレオソーム治療薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含むように製剤化され得る。薬学的に許容される担体の例としては、生理学的に適合性のある、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含むことができる。
様々な実施形態では、本明細書に記載の負荷ミニヌクレオソーム治療剤、例えば、注射用滅菌製剤を含む組成物は、ビヒクルとして注射用蒸留水を使用して、従来の医薬慣行に従って製剤化され得る。例えば、生理食塩水またはグルコース、ならびにD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、及び塩化ナトリウム等の他のサプリメントを含有する等張溶液は、任意選択で、好適な可溶化剤、例えば、エタノール等のアルコール、及びプロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール等のポリアルコール、ならびにポリソルベート80(商標)、HCO-50等の非イオン性界面活性剤、と組み合わせて、注射用水溶液として使用することができる。
本明細書に開示されるように、負荷ミニヌクレオソーム治療薬組成物は、当該技術分野で既知である任意の形態であり得る。そのような形態には、例えば、液体溶液(例えば、注射可能及び注入可能な溶液)、分散液または懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソーム、及び坐剤などの液体、半固体及び固体剤形が含まれる。
任意の特定の形態の選択または使用は、意図される投与様式及び治療用途に部分的に依存し得る。例えば、全身または局所送達を意図する組成を含有する組成物は、注射液または注入液の形態であり得る。したがって、負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、非経口モード(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射)による投与のために製剤化することができる。本明細書で使用される場合、非経口投与は、通常は注射による経腸及び局所投与以外の投与様式を指し、静脈内、鼻内、眼内、肺、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、肺内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、脳内、頭蓋内、頸動脈内ならびに胸骨内の注射及び注入を含むが、これらに限定されない。
非経口投与経路は、例えば、注射による投与、経鼻投与、経肺投与、または経皮投与であってもよい。投与は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射による全身または局所であり得る。
様々な実施形態において、本発明の負荷ミニヌクレオソーム治療薬組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、または高濃度での安定した保管に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。滅菌注射液は、本明細書に記載される組成物を、必要量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙される成分のうちの1つまたは組み合わせとともに組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、本明細書に記載の組成物を、塩基性分散媒及び上に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、本明細書に記載の組成物に加えて、その以前に滅菌濾過された溶液由来の任意の追加の所望の成分(以下を参照)の粉末を産生する、真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延させる試薬、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含めることによって達成することができる。
負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、水または別の薬学的に許容される液体中の無菌溶液または懸濁液を含む注射用製剤の形態で非経口投与することができる。例えば、負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、治療分子を、薬学的に許容されるビヒクルまたは媒体、例えば、滅菌水及び生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味賦形剤、希釈剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤と好適に組み合わせ、続いて、一般に許容される薬学的慣行に必要な単位用量形態で混合することによって製剤化することができる。薬学的製剤に含まれる負荷ミニヌクレオソーム治療剤の量は、指定された範囲内の好適な用量が提供されるような量である。油性液体の非限定的な例としては、ゴマ油及び大豆油が挙げられ、可溶化剤として安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと組み合わせることができる。含まれ得る他の項目は、リン酸緩衝液、または酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、塩酸プロカインなどの鎮静剤、ベンジルアルコールまたはフェノールなどの安定剤、及び抗酸化剤である。製剤化された注射は、好適なアンプル内にパッケージングされ得る。
いくつかの実施形態では、負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、0℃未満の温度(例えば、-20℃または-80℃)で保管するために製剤化することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、2~8℃(例えば、4℃)で最大2年(例えば、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、1年、1年半、または2年)間保管するために製剤化され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、2~8℃(例えば、4℃)で少なくとも1年間安定して保管される。
特定の事例では、負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、溶液として製剤化することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、好適な濃度で2~8℃(例えば、4℃)での保管に適した緩衝溶液として製剤化され得る。
本明細書に記載される負荷ミニヌクレオソーム治療薬を含む組成物は、免疫リポソーム組成物に製剤化され得る。このような製剤は、当該技術分野で既知の方法によって調製され得る。循環時間が増強されたリポソームは、例えば、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特定の実施形態では、組成物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤等の、急速な放出から化合物を保護する担体とともに製剤化され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーが使用され得る。かかる製剤の調製のための多くの方法は当該技術分野で知られている。例えば、J.R.Robinson(1978)“Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,”Marcel Dekker,Inc.,New York.を参照されたい。
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒトなどの哺乳動物への肺内投与(例えば、吸入器またはネブライザーを介した投与)に好適な組成物に製剤化することができる。そのような組成物の製剤化方法は、当該技術分野において周知である。乾燥粉末吸入剤製剤及び製剤の投与に適した系もまた、当該技術分野において知られている。肺への投与は、経口及び/または鼻腔であり得る。肺送達のための薬学的デバイスの例としては、定量噴霧式吸入器、乾燥粉末吸入器(DPI)、及びネブライザーが挙げられる。例えば、本明細書に記載の組成物は、乾燥粉末吸入器によって対象の肺に投与することができる。これらの吸入器は、分散性で安定した乾燥粉末製剤を肺に送達する推進剤を含まないデバイスである。乾燥粉末吸入器は、医学分野で周知であり、これらに限定されないが、以下が含まれる:TURBOHALER(登録商標)(AstraZeneca;London,England)、AIR(登録商標)吸入器(ALKERMES(登録商標);Cambridge,Mass.)、ROTAHALER(登録商標)(GlaxoSmithKline;London,England)、及びECLIPSETM(Sanofi-Aventis;Paris,France)。また、例えば、PCT公開第WO 04/026380号、第WO 04/024156号、及び第WO 01/78693号を参照されたい。DPIデバイスは、インスリン及び成長ホルモン等のポリペプチドの肺投与に使用されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、定量噴霧式吸入器によって肺内投与され得る。これらの吸入器は、推進剤に依存して個別的用量の化合物を肺に送達する。追加のデバイス及び肺内投与方法は、例えば、米国特許出願公開第20050271660号及び第20090110679号に記載されており、これらのそれぞれの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、眼への送達のために、例えば、薬学的に許容される溶液、懸濁液、または軟膏の形態で製剤化することができる。眼の治療で使用するための調製物は、例えば、防腐剤、緩衝液、張性剤、酸化防止剤及び安定剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、ならびに増粘剤などであるが、これらに限定されない追加の成分を含有する滅菌水溶液の形態であり得る。本明細書に記載される調製物は、従来の方法によって、例えば、1つ以上の組成物を含有する、点滴剤の形態で、または眼を治療溶液に浸すことによって、治療を必要とする対象(例えば、AMDに罹患している対象)の眼に局所投与することができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与に、眼の硝子体腔に薬物を導入するための様々なデバイスが適切であり得る。例えば、米国公開第2002/0026176号は、それが硝子体腔に突出して、医薬剤を硝子体腔に送達するように、強膜を通して挿入され得る薬学的含有プラグを記載する。別の例では、米国特許第5,443,505号は、眼の内部への薬物の持続的な放出のため、脈絡膜上腔または無血管領域に導入するための移植可能なデバイスを記載している。米国特許第5,773,019号及び同第6,001,386号はそれぞれ、眼の強膜表面に取り付け可能な移植可能な薬物送達デバイスを開示している。負荷ミニヌクレオソーム治療薬を眼に送達するための追加の方法及びデバイス(例えば、経胸膜パッチ及びコンタクトレンズを介する送達)は、例えば、Ambati and Adamis(2002)Prog Retin Eye Res
21(2):145-151、Ranta and Urtti(2006)Adv Drug Delivery Rev 58(11):1164-1181、Barocas and Balachandran(2008)Expert Opin Drug Delivery 5(1):1-10(10)、Gulsen and Chauhan(2004)Invest Opthalmol Vis Sci 45:2342-2347、Kim et al.(2007)Ophthalmic Res 39:244-254、ならびにPCT公開第WO 04/073551号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
21(2):145-151、Ranta and Urtti(2006)Adv Drug Delivery Rev 58(11):1164-1181、Barocas and Balachandran(2008)Expert Opin Drug Delivery 5(1):1-10(10)、Gulsen and Chauhan(2004)Invest Opthalmol Vis Sci 45:2342-2347、Kim et al.(2007)Ophthalmic Res 39:244-254、ならびにPCT公開第WO 04/073551号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態では、皮下投与は、シリンジ、プレフィルドシリンジ、オートインジェクタ(例えば、使い捨てまたは再利用可能)、ペンインジェクタ、パッチインジェクタ、ウエアラブルインジェクタ、皮下注入セットを備えた携帯型シリンジ注入ポンプ、または皮下注入のための他のデバイスなどのデバイスによって、達成することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の負荷ミニヌクレオソーム治療薬組成物は、局所投与によって治療的に対象に送達され得る。本明細書で使用される場合、「局所投与」または「局所送達」は、負荷ミニヌクレオソーム治療薬組成物または負荷ミニヌクレオソーム治療薬の血管系を介した意図される標的組織または部位への輸送に依存しない送達を指すことができる。例えば、負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、組成物または薬剤の注射または移植によって、または組成物または薬剤を含有するデバイスの注射または移植によって送達されてもよい。ある特定の実施形態では、標的組織または部位の近傍での局所投与後、組成物または薬剤、またはその1つ以上の成分は、投与部位ではない意図される標的組織または部位に拡散し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物は、単位剤形で存在し、その単位剤形が自己投与に好適であり得る。そのような単位剤形は、容器、典型的には、例えば、バイアル、カートリッジ、プレフィルドシリンジ、または使い捨てペン内に提供されてもよい。米国特許第6,302,855号に記載される投薬デバイス等の投薬器(doser)も、例えば本明細書に記載される注射システムとともに使用され得る。
その用量が対象の障害を治療または予防することができる、本明細書に記載の負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物の好適な用量は、例えば、治療される対象の年齢、性別、及び体重、治療される状態または疾患、ならびに使用される特定の負荷ミニヌクレオソーム治療剤、を含む様々な要因に依存し得る。対象に投与される用量に影響を及ぼす他の要因としては、例えば、状態または疾患の種類または重症度が挙げられる。他の要因としては、例えば、同時にまたは以前に対象に影響を与える他の医学的障害、対象の一般的な健康、対象の遺伝子素因、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、ならびに対象に投与される任意の他の追加の治療法が挙げられる。また、任意の特定の対象に対する特定の用量及び治療レジメンは、医師の判断に基づいて調整することもできることも理解されたい。
負荷ミニヌクレオソーム治療剤溶液は、治療有効量の本明細書に記載の組成物を含み得る。かかる有効量は、投与された組成物の効果、または複数の薬剤が使用される場合は組成物と1つ以上の追加の活性剤の組み合わせ効果に部分的に基づいて、当業者によって容易に決定することができる。治療上有効量は、組成物の任意の毒性または有害な作用を治療的に有益な作用が上回る量であり得る。
注射に好適な負荷ミニヌクレオソーム治療製剤の薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液が含まれ得る。製剤は無菌であってもよく、シリンジに出入する適切な流れを可能にするために流動性でなければならない。製剤はまた、製造及び保管条件下で安定であり得る。担体は、例えば、水及び生理食塩水または緩衝水溶液を含有する溶媒または分散媒であり得る。好ましくは、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを、製剤に使用することができる。ヒト投与の場合、最終的な調製物及び組成物は、米国FDA及びEU規制基準で要求される無菌性、発熱性、及び一般的なエンドトキシンレベル、安全性及び純度基準を満たす必要がある。温度及び他のタンパク質への曝露は、負荷ミニヌクレオソームの特性を変化させ得る。最終調製物及び組成物は、適切な温度、好ましくは2~8℃または室温(20~25℃)で保管しなければならない。
加えて、当業者であれば、エレクトロポレーション、ソノフォレーシス、骨内注射方法を介するものであるか、または遺伝子銃を使用することによるものであり得る追加の送達方法もまた企図し得る。ベクターはまた、マイクロチップ、ナノチップ、またはナノ粒子に移植され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、キットに製剤化されてもよい。かかるキットは、治療目的または診断目的のために使用され得る。本開示は、とりわけ、ミニヌクレオソームコアタンパク質及び核酸からなる組成物の製剤化に使用され得る、ならびに本明細書に記載の1つ以上の疾患のために哺乳動物、特にヒトに投与するための治療薬の調製に用いられ得る、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、アジュバント、及び/または他の成分とともに、1つ以上の組成物を提供する。具体的には、かかるキットは、開示されたミニヌクレオソームコアタンパク質組成物のうちの1つ以上を、哺乳動物の様々な障害の治療に核酸を使用するための説明書と組み合わせて含んでよく、典型的には、便宜的な市販の包装のために調製された容器を含んでよい。
本明細書に記載の組成物は哺乳動物である動物、例えばヒトに投与され得る。本明細書に記載の組成物はまた、商業的に関心のある動物、家畜、ならびにイヌ及びネコなどの家庭用ペットにも適用可能である。キット中の組成物は、単独で、または治療用もしくは診断用の1つ以上の他の成分もしくは薬物と組み合わせて、部分的にまたは有意に精製された負荷ミニヌクレオソーム組成物を含むことができる。本明細書に開示される少なくとも1つの負荷のミニヌクレオソーム成分に基づく遺伝子治療組成物、及び組成物を治療剤として使用するための説明書を含む治療キットも調製することができる。かかるキットの容器手段は、典型的には、開示されたミニヌクレオソーム組成物(複数可)が入れられ、好ましくは適切に分注され得る、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含み得る。
用途
本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、様々な実施形態において、小さいサイズ、受容体媒介または受動的拡散プロセスによって細胞に入る能力、遺伝子発現の位置の精度、遺伝子発現の持続時間の精度、及び/または標的細胞の核の細胞質に核酸が放出されるまでの保持を特徴とすることができる。ミニヌクレオソーム技術の望ましい用途のいくつかを、本明細書に記載する:
本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、様々な実施形態において、小さいサイズ、受容体媒介または受動的拡散プロセスによって細胞に入る能力、遺伝子発現の位置の精度、遺伝子発現の持続時間の精度、及び/または標的細胞の核の細胞質に核酸が放出されるまでの保持を特徴とすることができる。ミニヌクレオソーム技術の望ましい用途のいくつかを、本明細書に記載する:
遺伝子療法
様々な実施形態では、本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、遺伝子療法の方法で使用することができる。遺伝子療法の一般原理は、当該技術分野で周知であり、治療値の発現産物(例えば、mRNA、タンパク質、または阻害性RNA)を提供するためのそれを必要とする対象へのポリヌクレオチドの送達を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子療法は、遺伝子またはタンパク質補充療法(例えば、酵素補充療法)、増強、または標的阻害を含むことができる。様々な実施形態では、本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、シュタルガルト病、加齢黄斑変性、ハンチントン、血友病A、脊髄性筋萎縮、アッシャー症候群等を含むが、これらに限定されない疾患を引き起こす任意の突然変異の有害な影響を救済するために適用され得る。かかる疾患において、遺伝子変異は、遺伝子が機能しないか、または利用できなくなる。そのような場合、機能的コピーによって変異遺伝子を置き換えることは、患者に有益であり得る。機能性cDNAまたは全遺伝子を負荷ミニヌクレオソームに組み込み、それを所望の細胞または組織に送達することによって、様々な実施形態において、治療上の利益を受けることができる。
様々な実施形態では、本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、遺伝子療法の方法で使用することができる。遺伝子療法の一般原理は、当該技術分野で周知であり、治療値の発現産物(例えば、mRNA、タンパク質、または阻害性RNA)を提供するためのそれを必要とする対象へのポリヌクレオチドの送達を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子療法は、遺伝子またはタンパク質補充療法(例えば、酵素補充療法)、増強、または標的阻害を含むことができる。様々な実施形態では、本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、シュタルガルト病、加齢黄斑変性、ハンチントン、血友病A、脊髄性筋萎縮、アッシャー症候群等を含むが、これらに限定されない疾患を引き起こす任意の突然変異の有害な影響を救済するために適用され得る。かかる疾患において、遺伝子変異は、遺伝子が機能しないか、または利用できなくなる。そのような場合、機能的コピーによって変異遺伝子を置き換えることは、患者に有益であり得る。機能性cDNAまたは全遺伝子を負荷ミニヌクレオソームに組み込み、それを所望の細胞または組織に送達することによって、様々な実施形態において、治療上の利益を受けることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、アップレギュレートされ、疾患を引き起こす遺伝子を阻害するために適用することができる。例えば、P53過剰発現は、様々な疾患において説明されている。場合によっては、特定の細胞または組織で遺伝子をノックダウンして、炎症、低酸素症などを引き起こす遺伝子をダウンレギュレートして治療効果もたらすこともまた有益である。
エクスビボで操作された細胞
本開示のミニヌクレオソームは、エクスビボで細胞を操作するためを使用することができる。細胞は、様々な方法で治療薬を発現するように操作することができる。そのような細胞の1つは、免疫細胞、例えば、T細胞である。免疫細胞は、殺傷及びクリアランスのためにがん細胞または他の有害な細胞型の免疫認識を可能にし得る新しいタンパク質または受容体を発現するように遺伝子操作することができる。かかる遺伝子操作は、エクスビボで実施され得る。様々な実施形態では、本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、エクスビボで細胞を遺伝子操作する方法で使用することができる。本明細書に提供されるドメインの組み合わせは、負荷ミニヌクレオソームが様々なT細胞に侵入し、かかる細胞内の核に遺伝子カーゴを送達することを可能にし得る。遺伝子カーゴは、キメラ受容体の発現、遺伝子または他の治療エンティティのノックダウンをコード及び/または可能にし得る。次に、そのような細胞を、治療のために患者に注入してもよい。当業者は、免疫療法で使用するためのキメラ抗原受容体T細胞(CAR T細胞)を作製するために、負荷ミニヌクレオソームを使用することを企図し得る。
本開示のミニヌクレオソームは、エクスビボで細胞を操作するためを使用することができる。細胞は、様々な方法で治療薬を発現するように操作することができる。そのような細胞の1つは、免疫細胞、例えば、T細胞である。免疫細胞は、殺傷及びクリアランスのためにがん細胞または他の有害な細胞型の免疫認識を可能にし得る新しいタンパク質または受容体を発現するように遺伝子操作することができる。かかる遺伝子操作は、エクスビボで実施され得る。様々な実施形態では、本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、エクスビボで細胞を遺伝子操作する方法で使用することができる。本明細書に提供されるドメインの組み合わせは、負荷ミニヌクレオソームが様々なT細胞に侵入し、かかる細胞内の核に遺伝子カーゴを送達することを可能にし得る。遺伝子カーゴは、キメラ受容体の発現、遺伝子または他の治療エンティティのノックダウンをコード及び/または可能にし得る。次に、そのような細胞を、治療のために患者に注入してもよい。当業者は、免疫療法で使用するためのキメラ抗原受容体T細胞(CAR T細胞)を作製するために、負荷ミニヌクレオソームを使用することを企図し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるミニヌクレオソームをエクスビボで幹細胞を操作して、治療目的のために新しいタンパク質または受容体を発現させるために適用できる。本明細書に提供されるドメインの組み合わせは、負荷ミニヌクレオソームが様々な幹細胞に侵入して、かかる細胞内の核/細胞質に遺伝子カーゴを送達することを可能にし得る。遺伝子カーゴは、キメラ受容体の発現、遺伝子または他の治療実体のノックダウンを可能にし得る。次に、そのような細胞を、治療のために患者に注入してもよい。当業者は、免疫療法で使用するためのキメラ幹細胞またはキメラ造血幹細胞を作製するために、負荷ミニヌクレオソームを使用することを企図し得る。
遺伝子編集及び塩基除去修復
遺伝子編集、塩基編集、及び操作は、本明細書に記載のこのミニヌクレオソーム技術にも適用可能な領域である。遺伝子編集及び塩基除去修復は、DNAまたはRNAレベルでの遺伝子変異の修正または遺伝子の編集を可能にする最先端の技術である。本出願に向けて、負荷ミニヌクレオソームは、gRNA、sgRNA、spCas9、saCas9、dCas9、シチジンデアミナーゼ、及びDNAの切断または1つの塩基を別の塩基に変換するのを助けるいくつかの他の酵素をコードする核酸を組み込むことができる。当業者は、AAVに複数のgRNA及びCas9または類似の編集酵素を組み込むことは煩雑であり、しばしば非効率的なプロセスであることを理解することができる。したがって、負荷ミニヌクレオソームへの核酸の容易な圧縮を可能にする本明細書に記載の方法及び組成物を使用することにより、いくつかのgRNA、さらには最大のCas9遺伝子さえも組み込みが所望の細胞に送達されることが可能になる。
遺伝子編集、塩基編集、及び操作は、本明細書に記載のこのミニヌクレオソーム技術にも適用可能な領域である。遺伝子編集及び塩基除去修復は、DNAまたはRNAレベルでの遺伝子変異の修正または遺伝子の編集を可能にする最先端の技術である。本出願に向けて、負荷ミニヌクレオソームは、gRNA、sgRNA、spCas9、saCas9、dCas9、シチジンデアミナーゼ、及びDNAの切断または1つの塩基を別の塩基に変換するのを助けるいくつかの他の酵素をコードする核酸を組み込むことができる。当業者は、AAVに複数のgRNA及びCas9または類似の編集酵素を組み込むことは煩雑であり、しばしば非効率的なプロセスであることを理解することができる。したがって、負荷ミニヌクレオソームへの核酸の容易な圧縮を可能にする本明細書に記載の方法及び組成物を使用することにより、いくつかのgRNA、さらには最大のCas9遺伝子さえも組み込みが所望の細胞に送達されることが可能になる。
抗体送達
抗体は、世界中の何百万人もの患者の生活を変化させてきた薬物の一種である。しかしながら、この療法の大きな欠点の1つは、患者、医師、及び介護者に多大な負担をかける、繰り返し投与する必要があることである。当業者は、DNA分子が抗体を発現するために使用され得ることを理解することができる。本明細書に記載のミニヌクレオソーム技術は、抗体をベクター化し、患者の所望の細胞に送達して、患者の体内に長期デポーを作製し、複数回投与の負担を軽減する機会を提供する。抗体ドメインの一部または全体を発現するこれらのDNA分子は、負荷ミニヌクレオソームに組み込まれて、抗体薬を服用する患者に長期的な治療選択肢を作成することができる。当業者はまた、ミニヌクレオソームコアタンパク質を使用して、ナノボディ、抗体模倣物、融合ペプチド、抗体断片、ラクダ科動物(camelid)もしくはラクダ科動物単一ドメイン抗体断片などの他の抗体様分子をベクター化し、送達することもできる。
抗体は、世界中の何百万人もの患者の生活を変化させてきた薬物の一種である。しかしながら、この療法の大きな欠点の1つは、患者、医師、及び介護者に多大な負担をかける、繰り返し投与する必要があることである。当業者は、DNA分子が抗体を発現するために使用され得ることを理解することができる。本明細書に記載のミニヌクレオソーム技術は、抗体をベクター化し、患者の所望の細胞に送達して、患者の体内に長期デポーを作製し、複数回投与の負担を軽減する機会を提供する。抗体ドメインの一部または全体を発現するこれらのDNA分子は、負荷ミニヌクレオソームに組み込まれて、抗体薬を服用する患者に長期的な治療選択肢を作成することができる。当業者はまた、ミニヌクレオソームコアタンパク質を使用して、ナノボディ、抗体模倣物、融合ペプチド、抗体断片、ラクダ科動物(camelid)もしくはラクダ科動物単一ドメイン抗体断片などの他の抗体様分子をベクター化し、送達することもできる。
ワクチン送達
遺伝子操作されたDNAまたはRNAは、抗原を産生して、防御免疫学的応答を提供することができる。核酸ワクチンは、従来のワクチンよりも広範囲の免疫学的応答等のいくつかの潜在的な利点を有する。本明細書に記載されるミニヌクレオソーム技術は、かかるDNAまたはRNA構築物を組み込んで、ヒトを含む動物の所望の細胞または組織に送達し、いくつかのウイルス、細菌または寄生虫感染から保護することができる。
遺伝子操作されたDNAまたはRNAは、抗原を産生して、防御免疫学的応答を提供することができる。核酸ワクチンは、従来のワクチンよりも広範囲の免疫学的応答等のいくつかの潜在的な利点を有する。本明細書に記載されるミニヌクレオソーム技術は、かかるDNAまたはRNA構築物を組み込んで、ヒトを含む動物の所望の細胞または組織に送達し、いくつかのウイルス、細菌または寄生虫感染から保護することができる。
化粧品
遺伝子操作されたDNAまたはRNAは、例えば、筋肉量を増強するため、火傷の被害者の皮膚を修復するため、体重減少のため、免疫機能を改善するため、老化を遅らせるため、及び多くの他の用途のために開発することができる。本明細書に記載されるミニヌクレオソーム技術は、所望の美容効果のために、適用可能なDNAまたはRNA構築物を組み込み、ヒトを含む動物における所望の細胞または組織に送達することができる。
遺伝子操作されたDNAまたはRNAは、例えば、筋肉量を増強するため、火傷の被害者の皮膚を修復するため、体重減少のため、免疫機能を改善するため、老化を遅らせるため、及び多くの他の用途のために開発することができる。本明細書に記載されるミニヌクレオソーム技術は、所望の美容効果のために、適用可能なDNAまたはRNA構築物を組み込み、ヒトを含む動物における所望の細胞または組織に送達することができる。
様々な実施形態では、本開示は、ヒトまたは他の動物における疾患を予防または治療することに関連するベクターをさらに提供する。予防的または治療的に有効な量の組成物は、静脈内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、脳内、網膜下、硝子体内に、腰椎穿刺、局所、直腸、または局所器官もしくは腫瘍への直接送達を介して投与され得るが、これらの技術に限定されずに投与され得る。組成物は、核酸複合体の組成物を含み、各複合体は、単一もしくはそれ以上の核酸分子及び1つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質分子から本質的になる。
本開示は、とりわけ、特定の疾患を治療するため及び/または美容用途のため、ヒト細胞への効率的な送達のために、DNA、RNA及びそれらの類似体等を縮合する改良された方法を提供する。送達される核酸はまた、ワクチンを送達するための用途を有し得る。
実施例1ミニヌクレオソームコアタンパク質の設計及び合成
この実施例は、ミニヌクレオソームコアタンパク質に関する方法及び組成物を表す。この実施例では、(核酸を負荷ミニヌクレオソームに縮合することができる)ペプチドのアミノ酸配列及びそれらの合成プロセスを記載する。
この実施例は、ミニヌクレオソームコアタンパク質に関する方法及び組成物を表す。この実施例では、(核酸を負荷ミニヌクレオソームに縮合することができる)ペプチドのアミノ酸配列及びそれらの合成プロセスを記載する。
本実施例の負荷ミニヌクレオソームは、効率的な遺伝子導入及び負荷核酸カーゴの様々な細胞型への放出のために産生される。本実施例の負荷されたミニヌクレオソームは、細胞表面タンパク質への結合を介して細胞表面と積極的に関わって、細胞内の細胞質/核に移行され、核酸カーゴの放出を可能にするように設計される。これらの特徴は、構造化タンパク質/DNA相互作用に基づいて設計されたミニヌクレオソームコアタンパク質及び負荷ミニヌクレオソームによって達成され得る。したがって、本実施例は、細胞付着、増強された取り込み、増強された安定性、標的細胞の核への能動輸送、及びペプチダーゼを介した放出のうちの1つ以上を増強する1つ以上のアミノ酸ドメインを含むミニヌクレオソームコアタンパク質を含む。
本実施例において、合成ミニヌクレオソームコアタンパク質は、これらに限定されないが、配列番号388~393のいずれか1つに記載の配列、または表3~12に開示のドメインに由来する他の配列、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。本実施例のミニヌクレオソームコアタンパク質は、pH7で正味正電荷が>8、等電点が>9のペプチドである。例えば、配列番号388は、複数のニューロン付着ドメイン(LRE)及びポリアルギニンドメイン(RRRRR)と組み合わせた複数のDNA結合ドメイン(KRHRK)を含むミニヌクレオソームコアタンパク質配列である。この同じ構築物において、ロイシン(L)はポリアルギニンドメインを取り囲み、疎水性アミノ酸で荷電ドメインを分離し、細胞付着ドメインが細胞表面に結合することを可能にする。この構築物では、ミニヌクレオソームコアタンパク質(配列番号388)が、LREドメインを介したニューロンへの付着を強化するように設計され、一方、ポリアルギニンドメインは、細胞侵入を助ける。本実施例は、ある特定のドメイン間に配置された様々なリンカーを有するミニヌクレオソームコアタンパク質も含み、リンカーの例は、配列番号388~393に提供されるものを含む。設計により、配列番号388のKRHはまた、核酸の放出を増強するためのPCSK1の切断部位としても機能する。ミニヌクレオソームコアタンパク質に含まれ得る他の核酸放出ドメインまたは切断ドメインには、表9に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。ミニヌクレオソームコアタンパク質に含まれるためのドメインはまた、表9にあるものを含むがこれに限定されない他のペプチダーゼについても誘導することができる。
配列番号388~393によるミニヌクレオソームコアタンパク質を含む、本実施例のミニヌクレオソームコアタンパク質は、核酸分子との効率的な縮合、及び負荷ミニヌクレオソームの所望の細胞型、例えば、動物細胞及び組織への送達を可能にする配列特徴の様々な組み合わせを含む。本実施例の特定のミニヌクレオソームコアタンパク質では、基準負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質と比較して、例えば、オリゴマー化ドメイン(複数可)を欠くがそれ以外の場合アミノ酸配列において同一であるミニヌクレオソームコアタンパク質を含む負荷ミニヌクレオソームと比較して、ミニヌクレオソームコアタンパク質と核酸カーゴとの会合によって形成される負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質を、比較的小さいサイズを有するようにさせるために、オリゴマー化ドメインがミニヌクレオソームコアタンパク質に含まれる。例示的なオリゴマー化ドメインには、表11に提供されるものが挙げられる。同様に、エンドソーム侵入シグナル及び脱出シグナルもまた、安定性及び放出の増強のためにミニヌクレオソームコアタンパク質に含まれ得る。
本実施例のミニヌクレオソームコアタンパク質は、様々な方法によって合成され得る。ミニヌクレオソームコアタンパク質を合成する1つの方法はペプチド合成である。ペプチド合成は、アミド結合を介したアミノ酸の連結を可能にする。例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、ミニヌクレオソームコアタンパク質の配列の順序で、1つのアミノ酸のカルボキシル基と次の所望のアミノ酸のアミノ基との間の縮合反応を介して化学的に合成され得る。ペプチド合成の確立された方法は、固相ペプチド合成として当該技術分野で知られている。
任意選択で、本開示のミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ(N末端)及びカルボキシ末端(C末端)を保護するために、いくつかの戦略を適用することができる。ミニヌクレオソームコアタンパク質が凍結乾燥される場合、凍結乾燥ペプチドは、合成プロセス中に使用される微量の塩を含 んでもよい。ミニヌクレオソームコアタンパク質の産生の他の方法は、細胞系において、またはミニヌクレオソームコアタンパク質をコードするインビボ形態DNA構築物において、ミニヌクレオソームコアタンパク質を発現することを含む。産生されたミニヌクレオソームコアタンパク質は、当該技術分野で既知の様々な方法によって精製され得る。例えば、プロセス中にいくつかの樹脂を利用することができる。本実施例の様々な例では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は>90%の純度である。しかしながら、<90%のより低純度のコアタンパク質もまた、負荷ミニヌクレオソームを形成するために使用され得る。本実施例の様々な例では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、>90%でPEGとコンジュゲートする。しかしながら、コンジュゲートより少ない(<90%)または非コンジュゲートコアタンパク質もまた、負荷ミニヌクレオソームを形成するために使用され得る。ミニヌクレオソームコアタンパク質の純度は、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)によって決定することができ、同一性は、質量分析によって最小限まで確認することができる。
実施例2.負荷ミニヌクレオソームの産生
本実施例は、実施例1の負荷ミニヌクレオソームを含むがこれに限定されない、負荷ミニヌクレオソームの産生に関する技術を記載する。本実施例の負荷されたミニヌクレオソームは、正味の正電荷を有するミニヌクレオソームコアタンパク質と縮合された核酸カーゴ(DNAまたはRNA)を含む。ミニヌクレオソームコアタンパク質正味の正電荷は、核酸カーゴの負電荷を中和し、ナノメートルサイズの粒子をもたらす。前記ミニヌクレオソームコアタンパク質及びDNAまたはRNAのコンジュゲーションは、少量または大量に起こり得る。全ての塩基に関連する2つの負の電荷を意味する2つのリン酸塩が存在する。本実施例は、DNA負電荷の少なくとも90%がヌクレオソームコアタンパク質の正電荷によって中和されることを提供する。例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質との核酸の効率的な縮合のために、DNA負電荷の90~95%を中和する必要がある。本実施例の様々なミニヌクレオソームコアタンパク質は、細胞付着、細胞取り込み、タンパク質安定性、標的細胞の核への能動輸送、及び核酸カーゴの放出のうちの1つ以上を増強するアミノ酸ドメインを含み得る。したがって、本明細書で提供される特定のミニヌクレオソームコアタンパク質は、特定の状況において特に有用であり得る。核酸とミニヌクレオソームコアタンパク質とを混合して負荷ミニヌクレオソームを産生するプロセス中、核酸とミニヌクレオソームコアタンパク質との混合物は、100rpms~4000rpmsの間で混合またはボルテックスすることができる。核酸のコンジュゲーションのプロセスにおいて、縮合反応を増強する特定の触媒、例えば、NaOH及びスペルミジンが添加され得る。これらの触媒は、ポリペプチド及び核酸を添加する前に、反応器に添加することができる。核酸は、0.1マイクログラム/マイクロリットル~100グラム/リットルの範囲の濃度で添加され得る。ミニヌクレオソームコアタンパク質は、0.1マイクログラム/マイクロリットル~100グラム/リットルの濃度で添加され得る。核酸は、一度に添加されてもよく、または徐々に、例えば、着実にもしくは連続的してボルテックスしている溶液に滴下して添加されてもよい。混合が終了したら、縮合材料、すなわち、負荷ミニヌクレオソームを、精製の前に、数分間~数時間、例えば、2分間~6時間の期間にわたって平衡化させることができる。この段階で不純物を除去し、緩衝液を交換するために透析を行うことができる。負荷ミニヌクレオソームは、いくつかの技術を使用して精製され得る。かかる技法の1つは、1キロダルトン以上の分子量カットオフパラメータを有するカラムで粒子を高速で遠心分離することである。遠心分離速度は、試料体積に応じて、7000×g~10,000×gの範囲であってもよい。同様に、遠心分離の持続時間は、試料体積に応じて室温で20分~1時間まで変化し得る。ミニヌクレオソームを精製するために利用可能な別の技法は、透析である。精製技術は、これら2つの技術に限定され得ず、当業者は、タンパク質/核酸複合体を精製するために使用することができる文献からの様々なさらなる精製技術を認識するであろう。最後に、負荷ミニヌクレオソームは、これらに限定されないが、エンドトキシンを含まない水、通常生理食塩水、または任意の他の緩衝溶液で溶出または収集され得る。DNAの予想される回収率は約30~70%である。負荷されたミニヌクレオソームはまた、分子量カットオフカラム中でさらに遠心分離を受けて、溶液中のベクターゲノムの量をさらに濃縮してもよい。本実施例において、負荷ミニヌクレオソームは、エンドトキシンの存在を最小限に抑えるように製剤化される。エンドトキシンの典型的な供給源には、プラスミド、ペプチド合成、または調製物で使用される材料が含まれることが知られている。したがって、本実施例に記載の調製中に、エンドトキシンを含まないプラスミドを使用することができ、エンドトキシンをスクラブした材料及び装置を使用することができる。
本実施例は、実施例1の負荷ミニヌクレオソームを含むがこれに限定されない、負荷ミニヌクレオソームの産生に関する技術を記載する。本実施例の負荷されたミニヌクレオソームは、正味の正電荷を有するミニヌクレオソームコアタンパク質と縮合された核酸カーゴ(DNAまたはRNA)を含む。ミニヌクレオソームコアタンパク質正味の正電荷は、核酸カーゴの負電荷を中和し、ナノメートルサイズの粒子をもたらす。前記ミニヌクレオソームコアタンパク質及びDNAまたはRNAのコンジュゲーションは、少量または大量に起こり得る。全ての塩基に関連する2つの負の電荷を意味する2つのリン酸塩が存在する。本実施例は、DNA負電荷の少なくとも90%がヌクレオソームコアタンパク質の正電荷によって中和されることを提供する。例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質との核酸の効率的な縮合のために、DNA負電荷の90~95%を中和する必要がある。本実施例の様々なミニヌクレオソームコアタンパク質は、細胞付着、細胞取り込み、タンパク質安定性、標的細胞の核への能動輸送、及び核酸カーゴの放出のうちの1つ以上を増強するアミノ酸ドメインを含み得る。したがって、本明細書で提供される特定のミニヌクレオソームコアタンパク質は、特定の状況において特に有用であり得る。核酸とミニヌクレオソームコアタンパク質とを混合して負荷ミニヌクレオソームを産生するプロセス中、核酸とミニヌクレオソームコアタンパク質との混合物は、100rpms~4000rpmsの間で混合またはボルテックスすることができる。核酸のコンジュゲーションのプロセスにおいて、縮合反応を増強する特定の触媒、例えば、NaOH及びスペルミジンが添加され得る。これらの触媒は、ポリペプチド及び核酸を添加する前に、反応器に添加することができる。核酸は、0.1マイクログラム/マイクロリットル~100グラム/リットルの範囲の濃度で添加され得る。ミニヌクレオソームコアタンパク質は、0.1マイクログラム/マイクロリットル~100グラム/リットルの濃度で添加され得る。核酸は、一度に添加されてもよく、または徐々に、例えば、着実にもしくは連続的してボルテックスしている溶液に滴下して添加されてもよい。混合が終了したら、縮合材料、すなわち、負荷ミニヌクレオソームを、精製の前に、数分間~数時間、例えば、2分間~6時間の期間にわたって平衡化させることができる。この段階で不純物を除去し、緩衝液を交換するために透析を行うことができる。負荷ミニヌクレオソームは、いくつかの技術を使用して精製され得る。かかる技法の1つは、1キロダルトン以上の分子量カットオフパラメータを有するカラムで粒子を高速で遠心分離することである。遠心分離速度は、試料体積に応じて、7000×g~10,000×gの範囲であってもよい。同様に、遠心分離の持続時間は、試料体積に応じて室温で20分~1時間まで変化し得る。ミニヌクレオソームを精製するために利用可能な別の技法は、透析である。精製技術は、これら2つの技術に限定され得ず、当業者は、タンパク質/核酸複合体を精製するために使用することができる文献からの様々なさらなる精製技術を認識するであろう。最後に、負荷ミニヌクレオソームは、これらに限定されないが、エンドトキシンを含まない水、通常生理食塩水、または任意の他の緩衝溶液で溶出または収集され得る。DNAの予想される回収率は約30~70%である。負荷されたミニヌクレオソームはまた、分子量カットオフカラム中でさらに遠心分離を受けて、溶液中のベクターゲノムの量をさらに濃縮してもよい。本実施例において、負荷ミニヌクレオソームは、エンドトキシンの存在を最小限に抑えるように製剤化される。エンドトキシンの典型的な供給源には、プラスミド、ペプチド合成、または調製物で使用される材料が含まれることが知られている。したがって、本実施例に記載の調製中に、エンドトキシンを含まないプラスミドを使用することができ、エンドトキシンをスクラブした材料及び装置を使用することができる。
核酸とペプチドの一貫した混合のため、バイオリアクターを使用して、負荷ミニヌクレオソームを製剤化して、商業的使用及び臨床的使用のための粒子を生成することもできる。
実施例3負荷ミニヌクレオソームの好ましい形状/サイズ及び製剤
この実施例では、細胞及び哺乳動物対象、例えば、ヒトへの投与に有用な製剤を含む、様々な製剤化で負荷ミニヌクレオソームを産生するための技術が提供される。負荷ミニヌクレオソームは、ミニヌクレオソームコアタンパク質アミノ酸配列及び合成が行われる緩衝液の条件に基づいて、異なる形状及び/またはサイズのパラメータに製剤化することができる。負荷ミニヌクレオソームは、異なる条件、例えば、治療的使用に好適な溶解度で製剤化することができる。負荷ミニヌクレオソームの水及び/または通常生理食塩水中の溶解性は、患者への投与のための組成物の非毒性製剤化を可能にし、患者への送達を容易にするための1つの手段である。図7に示される負荷ミニヌクレオソームを形成するために、トリフルオロ酢酸緩衝液を使用して固相合成によってコアタンパク質を合成した。200マイクログラムのDNA(配列番号396)を1ミリグラムの凍結乾燥コアタンパク質に添加し、一緒にボルテックスし、精製して、負荷ミニヌクレオソームを産生した(図7)。緩衝液交換を行い、ミニヌクレオソームの最終製剤を滅菌されたエンドトキシンを含まない水中で作製した。各種類のミニヌクレオソーム1ミリグラムを水で希釈し、次いでグリッド上に配置し、メタノール溶液中の0.75%酢酸ウラニル中で新鮮に調製したもので2分間染色した。グリッドを100%エタノールに浸し、次いでレンズ吸収紙で吸い取った。その後、グリッドを、フィルム側を上にして数分間風乾させ、Hammatsu ORCA HRカメラで画像化するために撮影した(図7)。ルシフェラーゼをコードするプラスミドとして本開示の負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質を生成する際にポリヌクレオチドが利用されるが、当業者は、本実施例が、本開示のミニヌクレオソームコアタンパク質がポリヌクレオチドと会合し、負荷ミニヌクレオソームを形成する一般的な能力を広く実証することを理解するであろう。ルシフェラーゼプラスミドは、限定されないが、あらゆる種類のプラスミド、直鎖核酸、RNA、及びDNAを含む、一般的な核酸を代表する。他の場合、例えば、他の配列または構造のRNAまたはDNAを、負荷ミニヌクレオソームの産生に使用することができる。配列番号393のコアタンパク質と縮合したルシフェラーゼプラスミドは、スパイラル/ヘリカル形状の負荷ミニヌクレオソームをもたらした(図7A)。配列番号390を有するコアタンパク質と縮合したルシフェラーゼプラスミドは、棹状/小葉形状の負荷ミニヌクレオソームをもたらした(図7B)。ルシフェラーゼプラスミドとコアタンパク質配列番号391との縮合によって産生される負荷ミニヌクレオソームについて、環状分子と棹状分子の混合物が観察された(図7C)。球状または環状の負荷されたミニヌクレオソームを産生し得る、様々な電荷及び等電点を有する他の緩衝液の条件及びアミノ酸配列が存在する。異なる形状及びサイズの分子は、特定の細胞型への指向性を増強することができる。異なる形状のウイルスは、異なる細胞型をより効果的に形質導入する。例えば、タバコモザイクウイルスは、タバコ植物細胞を形質導入する棹状/ヘリカル形状のヌクレオキャプシド構造であり、HIVは、白血球細胞に感染する丸形またはボール状であり、AAV2は、肝臓細胞を効果的に形質導入する正二十面体形である。我々は、筋肉細胞における棹状のものと比較して、スパイラル形のミニヌクレオソームのより良好な形質導入指向性を観察した(図18)。本明細書に記載の異なる形状の負荷ミニヌクレオソームを製剤化することができた。個々のミニヌクレオソームは、独自の形状及びサイズに基づいて精製することもできる。
この実施例では、細胞及び哺乳動物対象、例えば、ヒトへの投与に有用な製剤を含む、様々な製剤化で負荷ミニヌクレオソームを産生するための技術が提供される。負荷ミニヌクレオソームは、ミニヌクレオソームコアタンパク質アミノ酸配列及び合成が行われる緩衝液の条件に基づいて、異なる形状及び/またはサイズのパラメータに製剤化することができる。負荷ミニヌクレオソームは、異なる条件、例えば、治療的使用に好適な溶解度で製剤化することができる。負荷ミニヌクレオソームの水及び/または通常生理食塩水中の溶解性は、患者への投与のための組成物の非毒性製剤化を可能にし、患者への送達を容易にするための1つの手段である。図7に示される負荷ミニヌクレオソームを形成するために、トリフルオロ酢酸緩衝液を使用して固相合成によってコアタンパク質を合成した。200マイクログラムのDNA(配列番号396)を1ミリグラムの凍結乾燥コアタンパク質に添加し、一緒にボルテックスし、精製して、負荷ミニヌクレオソームを産生した(図7)。緩衝液交換を行い、ミニヌクレオソームの最終製剤を滅菌されたエンドトキシンを含まない水中で作製した。各種類のミニヌクレオソーム1ミリグラムを水で希釈し、次いでグリッド上に配置し、メタノール溶液中の0.75%酢酸ウラニル中で新鮮に調製したもので2分間染色した。グリッドを100%エタノールに浸し、次いでレンズ吸収紙で吸い取った。その後、グリッドを、フィルム側を上にして数分間風乾させ、Hammatsu ORCA HRカメラで画像化するために撮影した(図7)。ルシフェラーゼをコードするプラスミドとして本開示の負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質を生成する際にポリヌクレオチドが利用されるが、当業者は、本実施例が、本開示のミニヌクレオソームコアタンパク質がポリヌクレオチドと会合し、負荷ミニヌクレオソームを形成する一般的な能力を広く実証することを理解するであろう。ルシフェラーゼプラスミドは、限定されないが、あらゆる種類のプラスミド、直鎖核酸、RNA、及びDNAを含む、一般的な核酸を代表する。他の場合、例えば、他の配列または構造のRNAまたはDNAを、負荷ミニヌクレオソームの産生に使用することができる。配列番号393のコアタンパク質と縮合したルシフェラーゼプラスミドは、スパイラル/ヘリカル形状の負荷ミニヌクレオソームをもたらした(図7A)。配列番号390を有するコアタンパク質と縮合したルシフェラーゼプラスミドは、棹状/小葉形状の負荷ミニヌクレオソームをもたらした(図7B)。ルシフェラーゼプラスミドとコアタンパク質配列番号391との縮合によって産生される負荷ミニヌクレオソームについて、環状分子と棹状分子の混合物が観察された(図7C)。球状または環状の負荷されたミニヌクレオソームを産生し得る、様々な電荷及び等電点を有する他の緩衝液の条件及びアミノ酸配列が存在する。異なる形状及びサイズの分子は、特定の細胞型への指向性を増強することができる。異なる形状のウイルスは、異なる細胞型をより効果的に形質導入する。例えば、タバコモザイクウイルスは、タバコ植物細胞を形質導入する棹状/ヘリカル形状のヌクレオキャプシド構造であり、HIVは、白血球細胞に感染する丸形またはボール状であり、AAV2は、肝臓細胞を効果的に形質導入する正二十面体形である。我々は、筋肉細胞における棹状のものと比較して、スパイラル形のミニヌクレオソームのより良好な形質導入指向性を観察した(図18)。本明細書に記載の異なる形状の負荷ミニヌクレオソームを製剤化することができた。個々のミニヌクレオソームは、独自の形状及びサイズに基づいて精製することもできる。
実施例4投与経路-静脈内(全身)及び血友病Aなどの全身疾患への適用。
この実施例は、負荷ミニヌクレオソームが、静脈内経路によって送達され、肝臓及び他の臓器においてタンパク質を発現できることを実証する。標準技術を使用してBalb/cマウスを拘束し、インスリン注射器を使用して、負荷ミニヌクレオソーム及びプラスミド対照を尾静脈注射で送達した。F8発現プラスミド構築物(「F8プラスミド」、例えば、図8、MN#1及びMN#2、を参照)を、それぞれ配列番号390及び配列番号391をF8プラスミドDNA(配列番号394)と縮合させることによって調製した。GFP発現構築物のプラスミド配列を配列番号8に提供する。本実施例では、負荷ミニヌクレオソームを肝細胞に標的化するために、核酸結合ドメイン(配列番号3)と一緒に2つのNGRアミノ酸ドメインを組み込んだ。AAV2のNGRドメインは、αVβ5インテグリン結合を促進することが示されている。NGRドメインは、AAV2の受容体として知られるヘパラン硫酸結合に関与する。AAV2は、高い肝臓指向性で知られている。これらのコアタンパク質に組み込まれたKRHアミノ酸モチーフはまた、核酸の放出を増強するためのPCSK1の切断部位として機能する。複数のKRHアミノ配列を含めることは、負荷されたミニヌクレオソームの放出を増強するはずである。各マウスは、40マイクログラム用量のMN#1、MN#2、またはネイキッドプラスミドF8(配列番号394)のいずれかを受けた。F8タンパク質の発現を試験するために、治療前(1日前)及び治療後(治療後-3日、1週間、2週間、1カ月、3カ月、及び4カ月)に頬出血技術(cheek bleed technique)によって約150μlの血液を収集した。血清を、標準技術を使用して血液から調製した。F8 Elisa(Aviva Systems Biology)を、1:6の血清希釈液を用いて製造業者の指示に従って行った。負荷ミニヌクレオソーム#1(MN#1には、配列番号390+F8プラスミドが含まれる)及びMN#2(MN#2には、配列番号391+F8プラスミドが含まれる)は、前処理試料中のELISAによって検出されるF8のレベルと比較して、約6倍多くのF8を発現した。MN#1は、負荷ミニヌクレオソームの単回注射の3ヶ月及び4ヶ月後に有意に上昇した発現レベルを維持した(図8)。F8をコードするネイキッドプラスミド(ミニヌクレオソームコアタンパク質と複合体形成していない)で処置した対照マウスは、いずれの時点でもF8発現の有意な増加を示さなかった(図8)。
この実施例は、負荷ミニヌクレオソームが、静脈内経路によって送達され、肝臓及び他の臓器においてタンパク質を発現できることを実証する。標準技術を使用してBalb/cマウスを拘束し、インスリン注射器を使用して、負荷ミニヌクレオソーム及びプラスミド対照を尾静脈注射で送達した。F8発現プラスミド構築物(「F8プラスミド」、例えば、図8、MN#1及びMN#2、を参照)を、それぞれ配列番号390及び配列番号391をF8プラスミドDNA(配列番号394)と縮合させることによって調製した。GFP発現構築物のプラスミド配列を配列番号8に提供する。本実施例では、負荷ミニヌクレオソームを肝細胞に標的化するために、核酸結合ドメイン(配列番号3)と一緒に2つのNGRアミノ酸ドメインを組み込んだ。AAV2のNGRドメインは、αVβ5インテグリン結合を促進することが示されている。NGRドメインは、AAV2の受容体として知られるヘパラン硫酸結合に関与する。AAV2は、高い肝臓指向性で知られている。これらのコアタンパク質に組み込まれたKRHアミノ酸モチーフはまた、核酸の放出を増強するためのPCSK1の切断部位として機能する。複数のKRHアミノ配列を含めることは、負荷されたミニヌクレオソームの放出を増強するはずである。各マウスは、40マイクログラム用量のMN#1、MN#2、またはネイキッドプラスミドF8(配列番号394)のいずれかを受けた。F8タンパク質の発現を試験するために、治療前(1日前)及び治療後(治療後-3日、1週間、2週間、1カ月、3カ月、及び4カ月)に頬出血技術(cheek bleed technique)によって約150μlの血液を収集した。血清を、標準技術を使用して血液から調製した。F8 Elisa(Aviva Systems Biology)を、1:6の血清希釈液を用いて製造業者の指示に従って行った。負荷ミニヌクレオソーム#1(MN#1には、配列番号390+F8プラスミドが含まれる)及びMN#2(MN#2には、配列番号391+F8プラスミドが含まれる)は、前処理試料中のELISAによって検出されるF8のレベルと比較して、約6倍多くのF8を発現した。MN#1は、負荷ミニヌクレオソームの単回注射の3ヶ月及び4ヶ月後に有意に上昇した発現レベルを維持した(図8)。F8をコードするネイキッドプラスミド(ミニヌクレオソームコアタンパク質と複合体形成していない)で処置した対照マウスは、いずれの時点でもF8発現の有意な増加を示さなかった(図8)。
別の実験では、GFP発現プラスミド(配列番号390+GFPプラスミド、配列番号395)を担持する負荷ミニヌクレオソームの静脈内注射を受けたマウスから収集された組織において、直接GFP蛍光が観察された(図9)。簡単に説明すると、マウスを1×PBSで灌流し、屠殺した。解剖後、肝臓全体を収集した。肝臓組織を4%パラホルムアルデヒド中に一晩固定し、その後1×PBS中で洗浄し、15%スクロース中に数時間浸漬し、その後、凍結保存のために30%スクロース溶液中に一晩浸漬した。次いで、組織をプラスチックバイアルに入れ、切片作成のためにOCT化合物を使用して凍結した。クリオトームを用いて10ミクロン厚の組織切片を得た。肝臓切片を、DAPIの有りもしくは無しで、封入剤、カバースリップで取り付け、密封した。画像を、Leica SP5共焦点及び落射蛍光スコープによって取得した。
結果は、静脈内経路によって送達された場合、ミニヌクレオソームは正常に肝臓に到達し、ミニヌクレオソームカーゴにコードされた遺伝子は肝臓細胞で発現されたことを示した(図9)。複数の肝細胞型における発現が観察された。本実施例の観察は、負荷ミニヌクレオソームの肝臓への送達が標的ドメインに依存しないことを示唆している。当業者は、本実施例で提供されるデータを鑑みて、肝臓と同様に、これらの臓器が通常、例えば、薬物のクリアランスで機能するため、負荷ミニヌクレオソームが、静脈内送達を介して腎臓及び脾臓中の細胞に送達され得ることを理解するであろう。
本開示を鑑みて、負荷ミニヌクレオソーム治療薬の使用によって治療することができる状態の一例は、血友病Aである。血友病Aは、凝固因子である第8因子の変異によって引き起こされる重篤な出血障害である。X連鎖劣性遺伝性様式で受け継がれる。これは、約5,000人に1人の出生において発生する。最も深刻な影響は、死に至る可能性のある内出血である。重症度は、体内で循環するF8の量に依存する。血友病患者の75%は、治療として組換えF8製品を服用する。F8療法を受ける対象は、静脈内に繰り返し注入され、経時的に患者、医師、及び介護者にとって大きな負担につながる。現在、AAVを介してF8の長期発現を提供するための遺伝子治療治験が進行中である。しかしながら、F8は、AAVに完全に組み込むことができない大型遺伝子である。したがって、この疾患を治療するためにF8の機能ドメインを送達するために、mini-F8が利用されてきた。Mini-F8は、完全長のF8と同じ機能能力及び安定性を有さないことがよく知られている。さらに、集団の20~40%は、AAVに対する中和抗体を既に有しており、これにより、大規模な血友病患者集団がAAVベースの医薬品を受けることができなくなる。加えて、AAV治療の最初の中止された経過の後にさらなる治療が必要になった場合、免疫原性のためにAAVベクターを再投与することはできない。フルサイズのF8遺伝子を送達できること(図8)、及びその再投与可能な(redosable)性質のため(図17)、負荷ミニヌクレオソームは、AAV遺伝子治療のこれらの2つの問題を解決する。したがって、本開示は、血友病Aが例示的である多くの状態で使用するために、静脈内送達モードを使用して、肝臓、腎臓、脾臓等の全身空間の異なる細胞型に、負荷ミニヌクレオソームを送達するための技術を提供する。
分泌されたタンパク質の欠陥にしばしば起因する他の全身性疾患も、負荷ミニヌクレオソーム治療薬を使用して治療することができる。本実施例(図8)は、静脈内に送達された負荷ミニヌクレオソーム(全身投与)が、治療閾値を上回るレベルでタンパク質を産生することを実証し、これは、様々な臨床試験によって決定される内在性レベルのおよそ10%であり、とりわけ、分泌タンパク質が様々な細胞型によって発現することができる全身性疾患の治療のための治療薬としてのミニヌクレオソームの治療可能性を実証する。いくつかの場合には、発現は、細胞型特異的プロモーターを使用することによって、ある特定の細胞型に限定され得る。当業者は、本開示から、脳、心臓、筋肉などの他の組織もまた、静脈内送達を介してアクセス及び形質導入され得ることを理解するであろう。ミニヌクレオソームコアタンパク質に組み込まれた標的化機構は、その状況で役立つはずである。
静脈内注射される場合、負荷ミニヌクレオソームは、体重1kg当たり1e5ゲノムコピーを超える用量、及び体重1kg当たり1e25コピーまでの用量で(例えば、体重1kg当たり約1e5、1e6、1e7、1e8、1e9、1e10、1e15、1e20、もしくは1e25コピー、またはそれらの間の任意の範囲で)送達され得る。材料の体積は、1~900ミリリットル(例えば、1、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、または900ミリリットル)の範囲であり得る。負荷ミニヌクレオソームはまた、繰り返し投与され得る(例えば、選択された体積及び/または数のゲノムコピーを、複数回投与できるか、または2回以上の投与に分割され得る)。
実施例5投与経路-眼内
この実施例は、負荷ミニヌクレオソームが、眼内経路によって送達され、網膜色素上皮(RPE)または光受容体、双極細胞、及び神経節細胞などの他の網膜ニューロン内でタンパク質を発現できることを実証する。本実施例では、Balb/cマウスを、ケタミン/キシラジン(90~100mg/kg+10mg/kg)でのIP注射により麻酔し、顕微鏡の下に配置した。マウスの眼を局所トロピカミド(1%)で拡張し、1ulの負荷ミニヌクレオソーム(マウスでの総用量1.5マイクログラム)を、角膜輪部下で25ガーゼ針によって作製された切開部を通過する32ガーゼ鈍針(blunt needle)を使用して硝子体腔に注射した。様々な時点で、マウスを10mlの1×PBSで灌流し、次いで標準技術を使用して屠殺した。マウスを眼球摘出し、アイカップを収集し、4%パラホルムアルデヒド中で一晩インキュベートした。アイカップを1×PBSで洗浄した後、15%スクロース中に数時間浸漬し、次いで、凍結保存のために30%スクロース溶液中に一晩浸漬した。次いで、アイカップをプラスチックバイアルに入れ、凍結切片作成のためにOCT化合物を使用して凍結した。染色のため、10ミクロンの厚さの組織切片を得た。網膜切片は、DAPIの有りもしくは無しで封入剤、カバースリップで取り付けて、密封した。画像をLeica SP5によって取得した。全載標本画像化のために、アイカップを4%パラホルムアルデヒド中で一晩固定した。アイカップを1×PBSで洗浄し、網膜を除去し、残りのアイカップまたはRPE全載標本を染色のために処理した。RPE組織を封入剤、カバースリップで全体を取り付けて、密封した。画像をLeica SP5によって取得した。網膜及びRPE細胞において、ネイティブGFP蛍光が観察された(図10、11及び12)。
この実施例は、負荷ミニヌクレオソームが、眼内経路によって送達され、網膜色素上皮(RPE)または光受容体、双極細胞、及び神経節細胞などの他の網膜ニューロン内でタンパク質を発現できることを実証する。本実施例では、Balb/cマウスを、ケタミン/キシラジン(90~100mg/kg+10mg/kg)でのIP注射により麻酔し、顕微鏡の下に配置した。マウスの眼を局所トロピカミド(1%)で拡張し、1ulの負荷ミニヌクレオソーム(マウスでの総用量1.5マイクログラム)を、角膜輪部下で25ガーゼ針によって作製された切開部を通過する32ガーゼ鈍針(blunt needle)を使用して硝子体腔に注射した。様々な時点で、マウスを10mlの1×PBSで灌流し、次いで標準技術を使用して屠殺した。マウスを眼球摘出し、アイカップを収集し、4%パラホルムアルデヒド中で一晩インキュベートした。アイカップを1×PBSで洗浄した後、15%スクロース中に数時間浸漬し、次いで、凍結保存のために30%スクロース溶液中に一晩浸漬した。次いで、アイカップをプラスチックバイアルに入れ、凍結切片作成のためにOCT化合物を使用して凍結した。染色のため、10ミクロンの厚さの組織切片を得た。網膜切片は、DAPIの有りもしくは無しで封入剤、カバースリップで取り付けて、密封した。画像をLeica SP5によって取得した。全載標本画像化のために、アイカップを4%パラホルムアルデヒド中で一晩固定した。アイカップを1×PBSで洗浄し、網膜を除去し、残りのアイカップまたはRPE全載標本を染色のために処理した。RPE組織を封入剤、カバースリップで全体を取り付けて、密封した。画像をLeica SP5によって取得した。網膜及びRPE細胞において、ネイティブGFP蛍光が観察された(図10、11及び12)。
RPE細胞を標的とするために、本実施例は、MERTK等の食作用タンパク質に結合し得るミニヌクレオソームコアタンパク質(配列番号392)を利用した。RPEは、それらの微絨毛を光受容体内側/外側セグメント接合部に伸長する食細胞である。MERTKは、それらの微絨毛で発現する。配列番号392において、表8に記載されるように、「イート・ミー(eat me)」シグナルを組み込んだ。文献では、「イート・ミー」シグナルは、食作用のために準備された細胞破片に露出したドメインとして記載される(Wei Li,Journal of Cell physiology,2016、参照により本明細書に組み込まれる)。本発明者の知る限り、これらの「イート・ミー」シグナルは、これまで非ウイルスベクターの関連では利用されたことがない。これらの「イート・ミー」シグナルドメインは、RPE細胞を標的にする非ウイルスベクターにこれまでに適用されていなかった。
光受容体を選択的に形質導入するために、本実施例は、配列番号388のコアタンパク質のようなコアタンパク質を利用した。配列番号388は、網膜内のすべてのニューロンである神経節細胞、双極細胞、及び光受容体への形質導入を可能にし得る、本明細書の表8に記載のニューロン付着要素(LRE)を含んでいた(図12)。このニューロン付着ドメインは、これまで、標的ニューロンへの非ウイルスベクターに対して適用されていない。本開示は、このニューロン標的化ベクターが、局所投与または全身投与を介して脳内のニューロンを形質導入することができることを提供する。本開示はさらに、取り込みを増強するために光受容体細胞外マトリックスに付着するためのミニヌクレオソームにレクチン結合ドメイン(表4に記載)を組み込むことによって、光受容体結合及び内在化を標的化することを提供する。ミニヌクレオソームコアタンパク質(配列番号390)に組み込まれたインテグリン結合ドメインはまた、眼内送達時にラット眼内でのみRPE細胞を形質導入することができる(図11)。さらに、2つ以上のドメインを利用して、複数の多様な細胞型を選択的に形質導入することができる。インテグリン結合特性を有するこのコアタンパク質(配列番号390)もまた、高レベルのαVβ5インテグリンを発現する他の細胞型への核酸の送達に利用され得る。本開示はさらに、網膜内の光受容体、RPE、ミュラー細胞、または他の細胞型を標的とする網膜下、脈絡膜上、髄腔内、または局所投与などの他の眼内注射技術の使用を提供する。
本明細書に提供されるのは、硝子体内または網膜下送達モードを使用して、負荷ミニヌクレオソームを網膜内の異なる細胞型に送達するための技術である。網膜変性のような疾患は、主に、光受容体で発現する遺伝子の突然変異によって引き起こされる。加齢黄斑変性症(AMD)は、網膜色素上皮(RPE)及び脈絡毛細血管の疾患であり、1000万人超えるアメリカ人及び世界中で1億人超える人々に影響を及ぼす。現在、遺伝子治療ベクターを光受容体及びRPEに送達するための主な技術は、網膜内で網膜下にウイルスを注射する外科的手法である。しかし、網膜下手術は、訓練を受けた眼科外科医によって手術室で行われる複雑な手術である。少なくともアメリカでは、この手術を行うために訓練を受けた外科医はほんの一握りであるという点で、満たされていないニーズがある。患者及び医師の負担を軽減する1つの方法は、網膜を通過して、光受容体及びRPEを形質導入することができる硝子体内注射可能なベクターを開発することである。硝子体内注射は、入院中にすべての眼科医によって行うことができる。負荷ミニヌクレオソーム療法は、硝子体内注射が光受容体及びRPEを選択的に形質導入する可能性があるため、この問題を解決する(図10、11、及び12)。これにより、ミニヌクレオソームは遺伝的欠陥を有するほとんどの網膜疾患の治療に非常に適している。
眼内注射される場合、負荷ミニヌクレオソームは、1眼当たり1e5ゲノムコピーを超える用量で、及び1眼当たり1e25コピーまでの用量で(例えば、1眼当たり約1e5、1e6、1e7、1e8、1e9、1e10、1e15、1e20、もしくは1e25コピー、またはそれらの間の任意の範囲で)送達され得る。材料の体積は、網膜下に注射される場合、10~500マイクロリットルの範囲(例えば、1、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、または500マイクロリットル)にあり、注射が硝子体内、脈絡膜上、または前房内にされる場合、10~250マイクロリットル(例えば、1、5、10、20、30、40、50、100、150、200、または250マイクロリットル)の範囲であり得る。負荷ミニヌクレオソーム治療薬はまた、繰り返し投与され得る(例えば、選択された体積及び/または数のゲノムコピーは、複数回投与され得るか、または2回以上の投与に分割され得る)。
実施例6投与経路-鼻腔内
この実施例は、負荷ミニヌクレオソームが、鼻腔内経路によって送達され、肺、気管、及び腸細胞内のタンパク質を発現できることを実証する。本実施例では、肺上皮の上皮細胞を標的とするために、2つのNGRアミノ酸ドメインを、核酸結合ドメインとともにミニヌクレオソームコアタンパク質に含めた(配列番号390のNGRアミノ酸ドメインの使用を参照されたい)。本発明者の知る限り、NGRドメインは、本明細書に開示されるように、非ウイルスDNA/タンパク質複合体を作製し、網膜細胞に送達するために利用されたことはない。AAV2のNGRドメインは、αVβ5インテグリン結合を促進することが示されている。NGRドメインは、AAV2の受容体として知られるヘパラン硫酸結合に関与する。
この実施例は、負荷ミニヌクレオソームが、鼻腔内経路によって送達され、肺、気管、及び腸細胞内のタンパク質を発現できることを実証する。本実施例では、肺上皮の上皮細胞を標的とするために、2つのNGRアミノ酸ドメインを、核酸結合ドメインとともにミニヌクレオソームコアタンパク質に含めた(配列番号390のNGRアミノ酸ドメインの使用を参照されたい)。本発明者の知る限り、NGRドメインは、本明細書に開示されるように、非ウイルスDNA/タンパク質複合体を作製し、網膜細胞に送達するために利用されたことはない。AAV2のNGRドメインは、αVβ5インテグリン結合を促進することが示されている。NGRドメインは、AAV2の受容体として知られるヘパラン硫酸結合に関与する。
本実施例では、Balb/cマウスを、ケタミン/キシラジン(90~100mg/kg+10mg/kg)でのIP注射により麻酔し、麻酔したマウスを鼻腔内送達のための鼻領域を視覚化するために顕微鏡の下に配置してした。1ulの負荷ミニヌクレオソーム(配列番号390+GFPプラスミド)溶液を、12マイクロリットルが各鼻側に送達されるまで、数秒ごとに鼻腔に送達した。25マイクログラムの総用量が送達された。屠殺後、マウス肺を処理して、10ミクロンの厚さの切片を得た。切片をPBS中で洗浄し、ブロッキング緩衝液(0.1%TritonX-100、1%BSA、3%ロバ血清)中で1時間インキュベート後、CFTR抗体(ブロッキング緩衝液上で調製)ブロッキング緩衝液中で、4℃で一晩インキュベートした。翌日、PBS中で3×5分間洗浄し、ブロッキング緩衝液中、AlexaFlour-555(ロバ抗ウサギIgG二次)中で、室温で1時間インキュベートし、PBS中で3×5分間洗浄した。封入剤を添加し、カバースリップを適用し、密封した。GFPのネイティブ蛍光は、486nm波長のLeicaSP5スコープの486nmチャネルで及びCFTR発現が555nmチャネルで得られた。負荷ミニヌクレオソーム発現は、早くも3日で、及びPI-3ヶ月でも観察された(図13)。CFTR染色とともに鮮明な緑色の蛍光によって示される肺胞及び細気管支の両方の上皮における発現を観察した(図13A及び13C)。CFTR及びGFPの共局在化(図13C)は、肺上皮のミニヌクレオソームによってコードされる遺伝子の発現を示す。肺胞リング(alveoli ring)から撮影したより高倍率画像(図14A、B、及びC)も、CFTR染色細胞における赤色蛍光とともに、上皮におけるGFP蛍光の明るい緑色の環を明確に示す。
本実施例では、ミニヌクレオソームを介した全肺組織及び生体分布も評価した(図15)。全肺組織を、灌流及び屠殺後にマウスから抽出した。肺組織を4%PFAで固定し、1×PBSで洗浄した。GFPネイティブ蛍光を検出するために、全組織をOdysseyイメージャーに配置した。注入されていない対照は、蛍光を示さなかった(図15)。GFPをコードするプラスミド核酸カーゴを含む負荷ミニヌクレオソームは、注入後5週間の試料において、全肺組織でGFPの蛍光を示した(図15)。
本明細書では、負荷ミニヌクレオソームを、鼻腔内送達モードを使用して、肺上皮、及び/または気管等の肺空間の組織中の異なる細胞型に送達するための技術が提供される。嚢胞性線維症等の遺伝的疾患は、肺及び他の臓器に影響を及ぼす。遺伝子を肺に送達するために、鼻腔内は選択経路の1つである。負荷ミニヌクレオソームが鼻腔内に送達されると、肺胞及び細気管支でタンパク質を発現することが観察された(図13)。これらは、通常、嚢胞性線維症に関与するCFTRタンパク質を発現する組織である。他の疾患において、この投与経路を使用して、他の疾患を軽減し得る治療用タンパク質を産生することができる。鼻腔内経路はまた、腸及び脳などの他の臓器へのアクセスを提供し得る(図16)。NGRドメインをミニヌクレオソームコアタンパク質(配列番号390)に含めることにより、高レベルの持続発現のために、核へのDNA分子の取り込み及び放出を強化することが可能になった。これは、図16における、処置後5週間での、負荷ミニヌクレオソームから観察される鮮やかな緑色の蛍光と、未処置動物でのかかるパターンがないことによって証明される(図16の最初の列の肺画像)。負荷ミニヌクレオソームの鼻腔内送達後に、気管上皮及び気管筋におけるGFPの発現の形質導入も観察した(図17)。
鼻腔内注入される場合、負荷ミニヌクレオソームは、体重1kg当たり1e5ゲノムコピーを超える用量、及び体重1kg当たり1e25コピーまでの用量で(例えば、体重1kg当たり1e5、1e6、1e7、1e8、1e9、1e10、1e15、1e20もしくは1e25コピー、またはそれらの間の任意の範囲で)送達され得る。材料の体積は、1~200ミリリットル(例えば、1、5、10、20、30、40、50、100、または200ミリリットル)の範囲であり得る。負荷ミニヌクレオソームはまた、繰り返し投与されてもよい。負荷ミニヌクレオソームはまた、腸、膵臓等にアクセスするために経口送達し得る。
実施例7投与経路-筋肉内
この実施例は、負荷ミニヌクレオソームが、筋肉内経路によって送達され、筋肉細胞においてタンパク質を発現できることを実証する。Balb/cマウスをケタミン/キシラジン(90~100mg/kg+10mg/kg)のIP注射で麻酔し、インスリン注射器を使用して、脚あたり17.5ugの用量で、いくつかの負荷ミニヌクレオソームを両脚の筋肉に注射した(マウス当たり35マイクログラムの総用量)。マウスを様々な時点で屠殺し、組織切片のため脚部筋肉を得た。ポリリジン(配列番号393)または他のドメイン組み合わせを有するミニヌクレオソーム(配列番号389)などのコアタンパク質を含有した構築物は、3ヶ月時点でGFP蛍光を示さなかった。驚くべきことに、注射から3ヶ月後に得られた筋肉組織切片では、配列番号391に示されるように、ガラクトース及びフコース結合ドメインを含有する負荷ミニヌクレオソームを注射した骨格筋細胞において鮮明な緑色の蛍光を観察した(図18A、B及びC)。これは、いくつかのドメインが、筋肉細胞への付着及び内在化の傾向がより高く、筋肉細胞への効率的な遺伝子導入に利用され得ることを示している。当業者は、そのようなドメインを筋肉指向性で知られている他のドメインと組み合わせることを企図することができる。
この実施例は、負荷ミニヌクレオソームが、筋肉内経路によって送達され、筋肉細胞においてタンパク質を発現できることを実証する。Balb/cマウスをケタミン/キシラジン(90~100mg/kg+10mg/kg)のIP注射で麻酔し、インスリン注射器を使用して、脚あたり17.5ugの用量で、いくつかの負荷ミニヌクレオソームを両脚の筋肉に注射した(マウス当たり35マイクログラムの総用量)。マウスを様々な時点で屠殺し、組織切片のため脚部筋肉を得た。ポリリジン(配列番号393)または他のドメイン組み合わせを有するミニヌクレオソーム(配列番号389)などのコアタンパク質を含有した構築物は、3ヶ月時点でGFP蛍光を示さなかった。驚くべきことに、注射から3ヶ月後に得られた筋肉組織切片では、配列番号391に示されるように、ガラクトース及びフコース結合ドメインを含有する負荷ミニヌクレオソームを注射した骨格筋細胞において鮮明な緑色の蛍光を観察した(図18A、B及びC)。これは、いくつかのドメインが、筋肉細胞への付着及び内在化の傾向がより高く、筋肉細胞への効率的な遺伝子導入に利用され得ることを示している。当業者は、そのようなドメインを筋肉指向性で知られている他のドメインと組み合わせることを企図することができる。
核酸カーゴによってコードされる遺伝子の発現の筋肉特異性を検証するために、内在性二次マーカーとしてジストロフィン免疫標識を利用した。ジストロフィン染色の赤色蛍光(パネルB;パネルCに併合)で囲まれた鮮明な緑色蛍光(パネルA)の領域は、筋肉内に注射された負荷ミニヌクレオソームが筋肉細胞に遺伝子を送達することができることを明確に実証している(図18)。GFPのネイティブ蛍光は、LeicaSP5スコープの486nmチャネルで得られた。赤色のジストロフィンは、RFPチャネル(555nm)である。図中の形質導入されていない筋肉細胞はまた、GFPシグナルと自己蛍光との間の鑑別のための内部対照としても機能する。
本明細書に提供されるのは、筋肉内送達モードによって負荷ミニヌクレオソームを筋肉細胞に送達するための技術である。多くの遺伝的筋ジストロフィーは、筋肉細胞の萎縮を引き起こす。これらの筋肉細胞に機能的遺伝子を送達するために、筋肉内経路は直接的な投与経路を提供する。負荷ミニヌクレオソームの筋肉指向性及び骨格筋細胞で遺伝子を発現す能力を実証した(図18)。発現は、早ければ送達後2日目に筋肉細胞で観察された。本明細書に提供されるのは、ベクター取り込み及び遺伝子発現を増強し得る筋肉指向性のドメインであるが、これらに限定されない。また、筋肉内経路を介して送達されるスパイラル形状の負荷ミニヌクレオソームが、筋肉細胞を効果的にかつより長期間、この場合、小葉形状分子(データ図示せず)と比較して3ヶ月間形質導入する(図18)ことも観察した。ベクターの形状は、遺伝子を筋肉細胞に送達する関連で以前に説明されていなかった。当業者は、筋肉細胞の細胞指向性を高めるために他の構造を利用することも考えられ得る。全体的に、ジストロフィン発現筋肉細胞におけるGFPの発現は、負荷ミニヌクレオソームが、デュシェンヌ筋ジストロフィーまたは他の筋ジストロフィー等の疾患を救済する能力を示している。筋肉指向性はまた、表4に記載される他のドメインを含めることによって強化され得る。筋肉指向性はまた、静脈内送達によって達成され得る。
筋肉内経路を介して注入される場合、負荷ミニヌクレオソームは、体重1kg当たり1e5ゲノムコピーを超える用量、及び体重1kg当たり1e25コピーまでの用量で(例えば、体重1kg当たり約1e5、1e6、1e7、1e8、1e9、1e10、1e15、1e20もしくは1e25コピー、またはそれらの間の任意の範囲で)送達され得る。材料の体積は、1~900ミリリットル(例えば、1、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、または900ミリリットル)の範囲であり得る。負荷ミニヌクレオソームはまた、繰り返し投与され得る(例えば、選択された体積及び/または数のゲノムコピーを、複数回投与できるか、または2回以上の投与に分割され得る)。負荷ミニヌクレオソームはまた、筋肉細胞にアクセスするために、静脈内に投与されてもよい。
実施例8負荷ミニヌクレオソームは、再投与可能である
この実施例は、ミニヌクレオソームがタンパク質の発現に中和効果を与えることなく再投与することができることを実証する(図19)。Balb/cマウスを、標準的な拘束技術を使用して単純に拘束し、インスリンシリンジを使用して、負荷ミニヌクレオソームMN#1(配列番号390+F8プラスミド)、及びMN#2(配列番号391+F8プラスミド、配列番号393)を、尾静脈注射を介して送達した。各マウスは、20マイクログラムの初回投与及び40マイクログラムの2回目投与(初回投与の30日後)を受けた。初回及び2回目の投与後3日目に頬出血技術によって血清を収集した。毎回約150ulの血液を収集し、標準の技法を使用して血液から血清を収集した。F8Elisaを実行して、負荷ミニヌクレオソームの静脈内送達後のBalb/cマウスにおける血清中のF8の発現レベルを決定した。F8 Elisaを製造業者(Aviva Systems Biology)の指示に従って実行した。すべてのアッセイについて1:6の血清希釈を行った。F8のタンパク質レベルの増加によって証明されるように、2回目の送達では、発現レベルに中和効果がないことを観察した(図19)。
この実施例は、ミニヌクレオソームがタンパク質の発現に中和効果を与えることなく再投与することができることを実証する(図19)。Balb/cマウスを、標準的な拘束技術を使用して単純に拘束し、インスリンシリンジを使用して、負荷ミニヌクレオソームMN#1(配列番号390+F8プラスミド)、及びMN#2(配列番号391+F8プラスミド、配列番号393)を、尾静脈注射を介して送達した。各マウスは、20マイクログラムの初回投与及び40マイクログラムの2回目投与(初回投与の30日後)を受けた。初回及び2回目の投与後3日目に頬出血技術によって血清を収集した。毎回約150ulの血液を収集し、標準の技法を使用して血液から血清を収集した。F8Elisaを実行して、負荷ミニヌクレオソームの静脈内送達後のBalb/cマウスにおける血清中のF8の発現レベルを決定した。F8 Elisaを製造業者(Aviva Systems Biology)の指示に従って実行した。すべてのアッセイについて1:6の血清希釈を行った。F8のタンパク質レベルの増加によって証明されるように、2回目の送達では、発現レベルに中和効果がないことを観察した(図19)。
本明細書で提供されるのは、所望のタンパク質の発現レベルを増強するために繰り返し送達され得るミニヌクレオソームコアタンパク質及び負荷ミニヌクレオソームの例である。再投与可能性は、繰り返し投与を必要とする可能性のある任意の薬物にとって非常に重要な特徴である。遺伝子療法において、現在、ウイルスベクターの最も望ましくない特徴のうちの1つは、医薬品を再投与できないことである。注射されるウイルスベクターを患者に一度注射すると、中和抗体の形成を引き起こす。これは、それらが2回目に投与されるとき、免疫原性及び非発現性(inexpressibility)を引き起こす。本明細書では、ミニヌクレオソーム介した遺伝子送達がこの問題を解決することを示す。ミニヌクレオソームの非免疫原性は、自己ペプチドまたはヒト由来アミノ酸配列を組み合わせ、ペグ化によって増強するという設計によって操作される。文献では、ペグ化タンパク質は免疫系を回避することが示されている。この場合、マウスでは、人工ヒト由来コアタンパク質に対する免疫原性の欠如が、ペグ化の場合をさらに検証する。この再投与可能な特性は、必要に応じて患者に複数の治療を可能にする。発現レベルが経時的に低下する場合、この再投与可能な特性により、繰り返し治療をして発現を所望のレベルに高めることが可能である。このデータはまた、多臓器注入を必要とする一部の患者において、ミニヌクレオソーム媒介遺伝子導入が最も望ましいことを示す。当業者はまた、局所、経口、膣、腹腔内、眼内、髄腔内、脳内、皮下等の多くの他の投与経路を介して、またはリポソームもしくは他の合成材料へのカプセル封入を介して繰り返し投与を企図することもできる。
繰り返し投与は、体重1kg当たり1e5ゲノムコピーを超える濃度、及び体重1kg当たり1e25コピーまでの用量で(例えば、体重1kg当たり約1e5、1e6、1e7、1e8、1e9、1e10、1e15、1e20もしくは1e25コピー、またはそれらの間の任意の範囲で)送達され得る。材料の体積は、1~900ミリリットル(例えば、1、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、または900ミリリットル)の範囲であり得る。負荷ミニヌクレオソームはまた、繰り返し投与され得る(例えば、選択された体積及び/または数のゲノムコピーを、複数回投与できるか、または2回以上の投与に分割され得る)。
実施例9一般的な技術
この実施例は、クローニング、ミニヌクレオソームの細胞への送達のための一般的な技法を記載する。これらのベクターの構築に適用され得るクローニング技法のいくつかは、導入遺伝子構築物の合成、TOPO PCRクローニング、平滑末端クローニング、シームレスクローニング、ロングフラグメントクローニング、制限酵素消化及びライゲーションを含み得るが、これらの技法に限定されない。DNAまたはRNA分子は、GFP、YFP、及びルシフェラーゼなどであるがこれらに限定されない、1つ以上の発現マーカーを発現し得る。DNAまたはRNA分子は、1つ以上の治療用RNAまたはタンパク質を発現してもよいが、これらに限定されない。
この実施例は、クローニング、ミニヌクレオソームの細胞への送達のための一般的な技法を記載する。これらのベクターの構築に適用され得るクローニング技法のいくつかは、導入遺伝子構築物の合成、TOPO PCRクローニング、平滑末端クローニング、シームレスクローニング、ロングフラグメントクローニング、制限酵素消化及びライゲーションを含み得るが、これらの技法に限定されない。DNAまたはRNA分子は、GFP、YFP、及びルシフェラーゼなどであるがこれらに限定されない、1つ以上の発現マーカーを発現し得る。DNAまたはRNA分子は、1つ以上の治療用RNAまたはタンパク質を発現してもよいが、これらに限定されない。
負荷ミニヌクレオソームは、HEK細胞または他の動物細胞株で発現させることによってそれらの機能について試験することができ、インビトロで特性評価することができる。合成及び/または精製された負荷ミニヌクレオソームの、造血幹細胞または分化した末梢血単核細胞を形質導入する能力は、細胞を培養物中の負荷ミニヌクレオソームに曝露することによってアッセイすることができる。負荷ミニヌクレオソームは、ミニヌクレオソームへの曝露によって、またはトランスフェクション技法、または挿入のための他の物理的方法を介して、インビトロでキメラT細胞を形成するそれらの機能及び能力についても試験することができる。負荷ミニヌクレオソームは、それらの機能について試験することができ、それに限定されないが、マウスまたは任意の他の動物モデルで送達することによってインビボで特性評価される。
配列:
配列番号388
KKRHRK-[リンカー]-LRE-[リンカー]KRHRKLRRRRRLKRHRKKRHRK-[リンカー]-LRE-[リンカー]-K
(式中、[リンカー]は、表12に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない)
配列番号389
KKKRHRKRKRKRKRRRRKKK-[リンカー]-ASSLNIAK-[リンカー]-RRRR
(式中、[リンカー]は、表12に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない)
配列番号390
KKKRK-[リンカー]-NGR-[リンカー]-KRKRKKRHRKKKKRRRRKRHRK-[リンカー]-NGR-[リンカー]-KKK
(式中、[リンカー]は、表12に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない)
配列番号391
KKKRHRKKKKK-[リンカー]-RGD-[リンカー]-KKKK-[リンカー]-NTQIH-[リンカー]-RRRRR-[リンカー]-TPH-[リンカー]-KK
(式中、[リンカー]は、表12に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない)
配列番号392
KKKRK-[リンカー]-KTKKK-[リンカー]-AK-[リンカー]-KALKKK-[リンカー]-KKGKKKKRRRRKAAPKK
(式中、[リンカー]は、表12に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない)
配列番号393
CKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK
配列番号394
CBA-F8プラスミド
TCGCGCGTTTCGGTGATCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCGCCACCATGCAAATAGCACTCTTCGCTTGCTTCTTTCTGAGCCTTTTCAATTTCTGCTCTAGTGCCATCAGAAGATACTACCTTGGTGCAGTGGAATTGTCCTGGAACTATATTCAGAGTGATCTGCTCAGTGTGCTGCATACAGACTCAAGATTTCTTCCTAGAATGTCAACATCTTTTCCATTCAACACCTCCATCATGTATAAAAAGACTGTGTTTGTAGAGTACAAGGACCAGCTTTTCAACATTGCCAAGCCCAGGCCACCCTGGATGGGTTTGCTAGGTCCTACCATTTGGACTGAGGTTCATGACACAGTGGTCATTACACTTAAAAACATGGCTTCTCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTGTCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGATGAATATGAAGATCAGACAAGCCAAATGGAGAAGGAAGATGATAAAGTTTTCCCTGGTGAAAGTCATACTTATGTTTGGCAAGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCTCCATGTCTCACTTACTCATATATGTCTCATGTGGATCTGGTGAAAGATTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCTCTGCTAGTATGTAAAGAAGGCAGTCTCTCCAAAGAAAGAACACAGATGTTGTACCAATTTGTACTGCTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAGAGCTGGCACTCAGAAACAAACGACTCTTATACACAGTCTATGGATTCTGCATCTGCTAGAGACTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGCTATGTAAACAGGTCTCTTCCAGGTCTGATTGGATGCCATAGGAAATCAGTCTACTGGCACGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAATACACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTTTTGTGAGGAACCACCGTCAAGCTTCATTGGAGATATCACCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATAGATCTTGGGCAGTTCCTACTATTTTGTCATATCTCTTCCCATAAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGATAGCTGCCCTGAGGAATCCCAATGGCAAAAGAAAAATAATAATGAGGAAATGGAAGATTATGATGATGATCTTTATTCAGAAATGGATATGTTCACATTGGATTATGACAGCTCTCCTTTTATCCAAATTCGCTCGGTTGCTAAAAAGTACCCTAAAACTTGGATACATTATATTTCTGCTGAGGAGGAAGACTGGGACTATGCACCTTCAGTTCCTACCTCGGATAATGGAAGTTATAAAAGCCAGTATCTGAGCAATGGTCCTCATCGGATTGGTAGGAAATATAAAAAAGTCAGATTTATAGCATACACAGATGAAACCTTTAAGACTCGTGAAACTATTCAGCATGAATCAGGACTCTTGGGACCTTTACTTTATGGAGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATTTTTAAGAATCAAGCAAGCCGACCATATAACATTTACCCTCATGGAATCACTGATGTCAGTCCTCTACATGCAAGGAGATTGCCAAGAGGTATAAAGCACGTGAAGGATTTGCCAATTCATCCAGGAGAGATATTCAAGTACAAGTGGACAGTTACAGTAGAAGATGGACCAACTAAATCAGATCCACGGTGCCTGACCCGCTATTATTCAAGTTTCATTAACCCTGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTGATTGGCCCTCTTCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGGGGAAACCAGATGATGTCAGACAAAAGAAATGTCATCCTGTTTTCTATATTTGATGAGAACCAAAGCTGGTACATCACAGAGAACATGCAACGCTTCCTCCCCAATGCAGCTAAAACACAGCCCCAGGACCCTGGGTTCCAGGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGCTTGGAGTTGACAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGCACATTCTCAGTGTTGGAGCACAGACAGACTTCTTATCTATCTTCTTCTCTGGATATACTTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGATACACTTACCCTGTTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTTATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGGTCTTGGGGTGTCATAATTCAGACTTTCGGAAGAGAGGTATGACAGCATTGCTGAAAGTTTCTAGTTGTGACAAGAGCACTAGTGATTATTATGAAGAAATATATGAAGATATTCCAACACAGTTGGTGAATGAGAACAATGTCATTGATCCCAGAAGCTTCTTCCAGAATACAAATCATCCTAATACTAGGAAAAAGAAATTCAAAGATTCCACAATTCCAAAAAATGATATGGAGAAGATTGAGCCTCAGTTTGAAGAGATAGCAGAGATGCTTAAAGTACAGAGTGTCTCAGTTAGTGACATGTTGATGCTCTTGGGACAGAGTCATCCTACTCCACATGGCTTATTTTTATCAGATGGCCAAGAAGCCATCTATGAGGCTATTCATGATGATCATTCACCAAATGCAATAGACAGCAATGAAGGCCCATCTAAAGTGACCCAACTCAGGCCAGAATCCCATCACAGTGAGAAAATAGTATTTACTCCTCAGCCCGGCCTCCAGTTAAGATCCAATAAAAGTTTGGAGACAACTATAGAAGTAAAGTGGAAGAAACTTGGTTTGCAAGTTTCTAGTTTGCCAAGTAATCTAATGACTACAACAATTCTGTCAGACAATTTGAAAGCAACTTTTGAAAAGACAGATTCTTCAGGATTTCCAGATATGCCAGTTCACTCTAGTAGTAAATTAAGTACTACTGCATTTGGTAAGAAAGCATATTCCCTTGTTGGGTCTCATGTACCTTTAAACGTGAGTGAAGAAAATAGTGATTCCAACATATTGGATTCAACTTTAATGTATAGTCAAGAAAGTTTACCAAGAGATAATATATTATCAATGGAGAATGATAGATTACTCAGAGAGAAGAGGTTTCATGGAATTGCTTTATTGACCAAAGATAATACTTTATTCAAAGACAATGTCTCCTTAATGAAAACAAACAAAACATATAATCATTCAACAACTAATGAAAAACTACACACTGAGAGCCCAACATCAATTGAGAATAGTACAACAGACTTGCAAGATGCCATATTAAAGGTCAATAGTGAGATTCAAGAAGTAACAGCTTTGATTCATGATGGAACACTTTTAGGCAAAAATTCTACATATTTGAGACTAAACCATATGCTAAATAGAACTACCTCAACAAAAAATAAAGACATATTTCATAGAAAAGATGAAGATCCTATTCCACAAGATGAAGAGAATACAATCATGCCATTTTCCAAGATGTTGTTCTTGTCAGAATCTTCAAATTGGTTTAAAAAGACCAATGGAAATAATTCCTTGAACTCTGAGCAAGAACATAGTCCAAAGCAATTAGTATATTTAATGTTTAAAAAATATGTAAAAAATCAAAGTTTCTTGTCAGAGAAAAATAAAGTCACAGTAGAACAGGATGGATTTACAAAGAACATAGGACTTAAAGACATGGCTTTTCCACATAATATGAGCATATTTCTTACCACT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TGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACGGGCCAGAGCTGCA
配列番号395
CBA-GFPプラスミド
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATCCATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGTTAACTCGAGGGATCCATCGATGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGTGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAGCCCAATCTGAATAATGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACGGGCCAGAGCTGCA
配列番号396
CBA-ルシフェラーゼプラスミド
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATTGCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCGCTCCCCTCTCTAAGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGTGGCTCCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGCAGGTGTCGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAATCCATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGTTAACTCGAGGGATCCATCGATGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGTGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAGCCCAATCTGAATAATGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCT
TCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACGGGCCAGAGCTGCA
配列:
配列番号388
KKRHRK-[リンカー]-LRE-[リンカー]KRHRKLRRRRRLKRHRKKRHRK-[リンカー]-LRE-[リンカー]-K
(式中、[リンカー]は、表12に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない)
配列番号389
KKKRHRKRKRKRKRRRRKKK-[リンカー]-ASSLNIAK-[リンカー]-RRRR
(式中、[リンカー]は、表12に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない)
配列番号390
KKKRK-[リンカー]-NGR-[リンカー]-KRKRKKRHRKKKKRRRRKRHRK-[リンカー]-NGR-[リンカー]-KKK
(式中、[リンカー]は、表12に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない)
配列番号391
KKKRHRKKKKK-[リンカー]-RGD-[リンカー]-KKKK-[リンカー]-NTQIH-[リンカー]-RRRRR-[リンカー]-TPH-[リンカー]-KK
(式中、[リンカー]は、表12に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない)
配列番号392
KKKRK-[リンカー]-KTKKK-[リンカー]-AK-[リンカー]-KALKKK-[リンカー]-KKGKKKKRRRRKAAPKK
(式中、[リンカー]は、表12に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない)
配列番号393
CKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK
配列番号394
CBA-F8プラスミド
TCGCGCGTTTCGGTGATCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCGCCACCATGCAAATAGCACTCTTCGCTTGCTTCTTTCTGAGCCTTTTCAATTTCTGCTCTAGTGCCATCAGAAGATACTACCTTGGTGCAGTGGAATTGTCCTGGAACTATATTCAGAGTGATCTGCTCAGTGTGCTGCATACAGACTCAAGATTTCTTCCTAGAATGTCAACATCTTTTCCATTCAACACCTCCATCATGTATAAAAAGACTGTGTTTGTAGAGTACAAGGACCAGCTTTTCAACATTGCCAAGCCCAGGCCACCCTGGATGGGTTTGCTAGGTCCTACCATTTGGACTGAGGTTCATGACACAGTGGTCATTACACTTAAAAACATGGCTTCTCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTGTCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGATGAATATGAAGATCAGACAAGCCAAATGGAGAAGGAAGATGATAAAGTTTTCCCTGGTGAAAGTCATACTTATGTTTGGCAAGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCTCCATGTCTCACTTACTCATATATGTCTCATGTGGATCTGGTGAAAGATTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCTCTGCTAGTATGTAAAGAAGGCAGTCTCTCCAAAGAAAGAACACAGATGTTGTACCAATTTGTACTGCTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAGAGCTGGCACTCAGAAACAAACGACTCTTATACACAGTCTATGGATTCTGCATCTGCTAGAGACTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGCTATGTAAACAGGTCTCTTCCAGGTCTGATTGGATGCCATAGGAAATCAGTCTACTGGCACGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAATACACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTTTTGTGAGGAACCACCGTCAAGCTTCATTGGAGATATCACCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATAGATCTTGGGCAGTTCCTACTATTTTGTCATATCTCTTCCCATAAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGATAGCTGCCCTGAGGAATCCCAATGGCAAAAGAAAAATAATAATGAGGAAATGGAAGATTATGATGATGATCTTTATTCAGAAATGGATATGTTCACATTGGATTATGACAGCTCTCCTTTTATCCAAATTCGCTCGGTTGCTAAAAAGTACCCTAAAACTTGGATACATTATATTTCTGCTGAGGAGGAAGACTGGGACTATGCACCTTCAGTTCCTACCTCGGATAATGGAAGTTATAAAAGCCAGTATCTGAGCAATGGTCCTCATCGGATTGGTAGGAAATATAAAAAAGTCAGATTTATAGCATACACAGATGAAACCTTTAAGACTCGTGAAACTATTCAGCATGAATCAGGACTCTTGGGACCTTTACTTTATGGAGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATTTTTAAGAATCAAGCAAGCCGACCATATAACATTTACCCTCATGGAATCACTGATGTCAGTCCTCTACATGCAAGGAGATTGCCAAGAGGTATAAAGCACGTGAAGGATTTGCCAATTCATCCAGGAGAGATATTCAAGTACAAGTGGACAGTTACAGTAGAAGATGGACCAACTAAATCAGATCCACGGTGCCTGACCCGCTATTATTCAAGTTTCATTAACCCTGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTGATTGGCCCTCTTCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGGGGAAACCAGATGATGTCAGACAAAAGAAATGTCATCCTGTTTTCTATATTTGATGAGAACCAAAGCTGGTACATCACAGAGAACATGCAACGCTTCCTCCCCAATGCAGCTAAAACACAGCCCCAGGACCCTGGGTTCCAGGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGCTTGGAGTTGACAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGCACATTCTCAGTGTTGGAGCACAGACAGACTTCTTATCTATCTTCTTCTCTGGATATACTTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGATACACTTACCCTGTTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTTATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGGTCTTGGGGTGTCATAATTCAGACTTTCGGAAGAGAGGTATGACAGCATTGCTGAAAGTTTCTAGTTGTGACAAGAGCACTAGTGATTATTATGAAGAAATATATGAAGATATTCCAACACAGTTGGTGAATGAGAACAATGTCATTGATCCCAGAAGCTTCTTCCAGAATACAAATCATCCTAATACTAGGAAAAAGAAATTCAAAGATTCCACAATTCCAAAAAATGATATGGAGAAGATTGAGCCTCAGTTTGAAGAGATAGCAGAGATGCTTAAAGTACAGAGTGTCTCAGTTAGTGACATGTTGATGCTCTTGGGACAGAGTCATCCTACTCCACATGGCTTATTTTTATCAGATGGCCAAGAAGCCATCTATGAGGCTATTCATGATGATCATTCACCAAATGCAATAGACAGCAATGAAGGCCCATCTAAAGTGACCCAACTCAGGCCAGAATCCCATCACAGTGAGAAAATAGTATTTACTCCTCAGCCCGGCCTCCAGTTAAGATCCAATAAAAGTTTGGAGACAACTATAGAAGTAAAGTGGAAGAAACTTGGTTTGCAAGTTTCTAGTTTGCCAAGTAATCTAATGACTACAACAATTCTGTCAGACAATTTGAAAGCAACTTTTGAAAAGACAGATTCTTCAGGATTTCCAGATATGCCAGTTCACTCTAGTAGTAAATTAAGTACTACTGCATTTGGTAAGAAAGCATATTCCCTTGTTGGGTCTCATGTACCTTTAAACGTGAGTGAAGAAAATAGTGATTCCAACATATTGGATTCAACTTTAATGTATAGTCAAGAAAGTTTACCAAGAGATAATATATTATCAATGGAGAATGATAGATTACTCAGAGAGAAGAGGTTTCATGGAATTGCTTTATTGACCAAAGATAATACTTTATTCAAAGACAATGTCTCCTTAATGAAAACAAACAAAACATATAATCATTCAACAACTAATGAAAAACTACACACTGAGAGCCCAACATCAATTGAGAATAGTACAACAGACTTGCAAGATGCCATATTAAAGGTCAATAGTGAGATTCAAGAAGTAACAGCTTTGATTCATGATGGAACACTTTTAGGCAAAAATTCTACATATTTGAGACTAAACCATATGCTAAATAGAACTACCTCAACAAAAAATAAAGACATATTTCATAGAAAAGATGAAGATCCTATTCCACAAGATGAAGAGAATACAATCATGCCATTTTCCAAGATGTTGTTCTTGTCAGAATCTTCAAATTGGTTTAAAAAGACCAATGGAAATAATTCCTTGAACTCTGAGCAAGAACATAGTCCAAAGCAATTAGTATATTTAATGTTTAAAAAATATGTAAAAAATCAAAGTTTCTTGTCAGAGAAAAATAAAGTCACAGTAGAACAGGATGGATTTACAAAGAACATAGGACTTAAAGACATGGCTTTTCCACATAATATGAGCATATTTCTTACCACT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配列番号395
CBA-GFPプラスミド
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATCCATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGTTAACTCGAGGGATCCATCGATGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGTGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAGCCCAATCTGAATAATGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACGGGCCAGAGCTGCA
配列番号396
CBA-ルシフェラーゼプラスミド
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATTGCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCGCTCCCCTCTCTAAGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGTGGCTCCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGCAGGTGTCGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAATCCATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGTTAACTCGAGGGATCCATCGATGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGTGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAGCCCAATCTGAATAATGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAA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Claims (20)
- 核酸結合ドメインを含む、操作されたポリペプチドであって、
核酸放出ドメインをさらに含み、
前記核酸結合ドメインが、アミノ酸配列KRHRKを含み、
前記核酸放出ドメインが、アミノ酸配列KRHを含む、操作されたポリペプチド。 - 前記操作されたポリペプチドが、標的化ドメインを含む、請求項1に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記標的化ドメインが、細胞付着ドメイン、βガラクトース結合ドメイン、フコース結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、シアル酸結合ドメイン、糖タンパク質結合ドメイン、炭水化物結合ドメイン、リゾホスファチジン酸結合ドメイン、cAMP結合ドメイン、ヒアルロナン結合ドメイン、コンドロイチン硫酸結合ドメイン、インテグリン結合ドメイン、ヌクレオリン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、クラスリン結合ドメイン、Fc受容体結合ドメイン、アクチン結合ドメイン、エンドサイトーシスモチーフ、核局在化シグナル、またはこれらの組み合わせである、請求項2に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記標的化ドメインが、細胞付着標的化ドメイン、内在化ドメイン、または細胞型特異的標的化ドメインを含む、請求項2または3に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記細胞付着標的化ドメインが、WGREERQ、NTQIH、WNNKTPH、TPH、VNRWS、XBBBXXBX、ARKKAAKA、QRR、SRR、WEPSRPFPVD、HRRTRKAPKRIRLPHIR、KRTGQYKLGSKTGPGQK、KKTK、KLRSQLVKK、RRRCGQKKK、BX(7)B、RIQNLLKITNLRIKFVK、KKEKDIMKKTI、KGE、RGD、RGDS、TTVVNPKYEGK、ERMSQIKRLLS、WRHRARS、GFOGER、LFDLM、WGREERQ、QSTEKRG、もしくはLPNTGを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含み、
前記内在化ドメインが、FXDXF、PPSY、FEDNFVP、YIRV、YADW、YTQV、KKRPKP、SSDDE、RRASS、(YXXL)2、LPLTG、もしくはLAFTGを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含み、および/あるいは、
前記細胞型特異的標的化ドメインが、ASSLNIA、KKEEEKKEEEKKEEE、LIFHKEQ、KFNKPFVFLI、QPEHSST、EYHHYNK、NGR、GEKGEP、KTKKK、KALKKK、KGKKK、CSVTCG、LRE、YKYNLNGRES、YRSL、KGGK7、KKKQYTSIHHG、KDEL、もしくはLADQDYTKTAを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、請求項4に記載の操作されたポリペプチド。 - 前記操作されたポリペプチドが、ポリアルギニンドメイン、核内在化シグナル、または核内移行機構結合ドメインを含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記核内在化シグナルまたは核内移行機構結合ドメインが、KKKYKLK、KKRKLE、TRSK、HRKRKR、NKRKRK、AEKSKKK、RKSK、KRVK、KRK、LQQTPLHLAVI、RRPR、PRPR、RPPP、RKKRKGK、PAAKRVKLD、KLKIKRPVK、PKKKRKV、QRKRQK、DSPE、FQVT、QSTEKRG、RQGLID、環状RKKH、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、請求項6に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記操作されたポリペプチドが、安定性ドメイン、またはオリゴマー化ドメインを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記安定性ドメインが、YTRF、GDAY、LLEE、RKKRRQRRR、YKSL、YENF、FQDL、YIGSR、もしくはIKVAVを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含み、あるいは、
前記オリゴマー化ドメインが、表11のオリゴマー化ドメインから選択されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、請求項8に記載の操作されたポリペプチド。 - 前記オリゴマー化ドメインが、前記操作されたポリペプチドのC末端に配置される、請求項8または9に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、リンカーを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記リンカーが、配列番号154~250のうちのいずれか1つに対応するリンカーである、請求項11に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記ポリペプチドの1つ以上のアミノ酸が、ペグ化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、アミド化、脂質付加化、プレニル化、リポイル化、アルキル化、アシル化、糖化、ニトロシル化、硫酸化、カルバミル化、カルボニル化、NEDD化(neddylated)、ビオチン化、またはリボシル化されている、請求項1~12のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
- 請求項1~13のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1~13のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド、または請求項14に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
- (i)少なくとも1つのポリヌクレオチドと、
(ii)少なくとも1つの請求項1~13のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドとを含む組成物であって、
必要に応じて、
(a)前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、DNAもしくはRNAであるか、またはそれを含む;
(b)前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であるか、またはそれを含む;
(c)前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、mRNAであるか、またはそれを含む;および/または、
(d)前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、阻害性RNAであるか、またはそれを含み、さらに、必要に応じて、前記阻害性RNAが、gRNA、siRNA、miRNA、もしくはshRNAである、組成物。 - 前記ポリヌクレオチド対請求項1~13のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドの比が、1:3~1:2,000である、請求項16に記載の組成物。
- 薬学的担体を含む、請求項16または17に記載の組成物。
- 細胞、組織、または対象への投与のための、請求項16~18のいずれか一項に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドを縮合し、または、ポリヌクレオチドの電荷を中和する方法であって、前記ポリヌクレオチドを請求項1~13のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含む、方法。
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