JP2022512977A - ミニヌクレオソームコアタンパク質及び核酸送達における使用 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ミニヌクレオソームコアタンパク質及び／または核酸の送達に関する組成物及び方法を提供する。特に、本開示は、とりわけ、核酸の送達のための非ウイルスタンパク質性ビヒクルを含む。様々な実施形態において、本明細書で提供する非ウイルスタンパク質性ビヒクルには、（ａ）核酸結合ドメイン、（ｂ）標的化ドメイン、ならびに、任意選択的に、（ｃ）核酸放出ドメイン、安定性ドメイン、及び／またはオリゴマー化ドメイン、及び／またはリンカードメインが含まれる。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月８日に出願された米国仮出願第６２／７５７，６８３号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＡＡＶベクターは、現在の遺伝子療法のゴールドスタンダードと見なされ、例えば、肝臓、ＣＮＳ、及び／または他の組織における網膜遺伝子療法及び全身遺伝子療法のための臨床試験を含む多様な臨床試験において有望であることが示されている。少なくとも３つの異なる遺伝子療法の規制当局の承認により、この分野は、より多くの準備がされているため、患者はこれらの人生が変わるような治療にアクセスすることができる。しかしながら、業界のゴールドスタンダードであるにもかかわらず、ＡＡＶベクターには一定の制限がある。改善された及び／または代替の核酸送達技術が必要である。
本開示は、とりわけ、例えば、遺伝子療法を必要とする対象に核酸分子を送達する際に使用するために、核酸分子と会合することができるポリペプチドに関する組成物及び方法を提供する。したがって、本開示は、とりわけ、核酸分子と会合することができるポリペプチド、ならびに関連する核酸分子と一緒に本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物を含む。本開示は、任意の特定の科学理論に拘束されることを望むものではないが、核酸分子を本明細書に開示されるポリペプチドと会合させることにより、核酸を標的細胞、対象、または他の系に送達することを容易にすることができることを企図する。
特に、本開示は、とりわけ、核酸の送達のための「ミニヌクレオソームコアタンパク質」を含む。様々な実施形態において、本開示のミニヌクレオソームコアタンパク質は、（ａ）核酸結合ドメイン（「ＮＡＢＤ」）、（ｂ）標的化ドメイン、及び、任意選択的に、（ｃ）例えば、核酸放出ドメイン、安定性ドメイン、及び／またはオリゴマー化ドメインのうちの１つ以上を含むさらなるドメインを含むことができる。核酸カーゴと関連する１つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質は、「負荷ミニヌクレオソーム（ｌｏａｄｅｄ ｍｉｎｉ－ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ）」と称され得る。核酸の標的への送達のための充填されたミニヌクレオソームが非ウイルスであるため、ミニヌクレオソームは核酸送達のための非ウイルスビヒクルの一例である。
本開示は、本明細書に記載の少なくとも特定の組成物及び方法が、以下に挙げられる、ＡＡＶベクターに関連する１つ以上の欠陥を修復するという認識を含む：
１）ＡＡＶが、４．５ｋｂのＤＮＡ長のペイロード制限に関連して、この制限により、４ｋｂを超える核酸により通常コードされる遺伝子産物（例えば、ＣＦＴＲ、ＨＴＴ、Ｆ８、ＤＭＤ、ＡＢＣＡ４等の遺伝子はＡＡＶベクターに適合できない）の発現の欠陥によって少なくとも部分的に引き起こされる疾患の治療におけるＡＡＶの使用が妨げられる（ＬａｉＹ．ｅｔ ａｌ，２０１０）。
２）ＡＡＶが、低い割合で及び／または部位非特異的に組み込まれることが知られている（Ｓｍｉｔｈ Ｒ．Ｈ．，２００８）。組み込みが腫瘍抑制遺伝子または細胞機能にとって重要な遺伝子を破壊する可能性がある、または破壊する場合、ランダムまたは部位非特異的組み込みは有害であり得る。
３）ＡＡＶの血清型に応じて、２５～７０％のヒトがＡＡＶに対する中和抗体を既に有し、すなわち、ＡＡＶ療法で利益を得る可能性が低い（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ Ｚ．，ｅｔ ａｌ ２０１８）。
４）患者が注射されると、患者はウイルスに対する多数の抗体を産生するため、ＡＡＶによる複数の治療が効果的である可能性は非常に低い。細胞の代謝回転が高いいくつかの疾患（例えば、肝細胞または気道上皮細胞の代謝回転において）については、複数の治療が必要であり得る。したがって、最初の治療後のＡＡＶに対する抗体の増加により、同じベクターがフォローアップ治療または投与において有用ではない場合がある。
５）いくつかの疾患の効果的な治療は、インビボで細胞を形質導入するために、静脈内注射によって投与される巨大なペイロードの粒子の送達を必要とし得る。高用量のＡＡＶには独自の毒性があり、これまでにも多く記載されている（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ．ｅｔ ａｌ，２０１８）。
６）ほとんどの疾患はまた、多臓器の不全と関連しており、ＡＡＶは同じ体内の様々な臓器に適用されない場合がある。ある部位での１回の適用は、抗体を上昇させ、したがって、後続の治療または投与で注入されるときに体内の他の位置での形質導入がブロックされる可能性がある。
少なくとも部分的には上述のＡＡＶの欠陥のために、ＡＡＶの代替物が切実に必要とされている。少なくとも特定の実施形態では、本明細書に開示される非ウイルスベクターは、上記で論じたＡＡＶの欠陥のうちの１つ以上を克服する。
さらに、以前の非ウイルスベクターは、ｉ）低いトランスフェクション／形質導入効率（Ｇｕｅｒｒａ－Ｃｒｅｓｐｏ Ｍ ｅｔ ａｌ，２００３）ｉｉ）血液、体液、及び他の組織における低い粒子安定性（Ｂａｒｕａ ａｎｄ Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，２０１４）；ｉｉｉ）受容体媒介性エンドサイトーシスまたは細胞融合を介した低い細胞侵入；ｉｖ）エンドソーム及びリソソームコンパートメントにおける低い安定性、及びそれらからの低いエスケープ；ｖ）細胞質における低い拡散速度；ｖｉ）低い核膜孔輸送；及びｖｉｉ）核における生物学的機能を可能にするＤＮＡの低い放出（Ｚａｂｎｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ，１９９５）を含む、治療有効性に対するいくつかの障壁とも関連付けられる。いくつかの刊行物は、有糸分裂後細胞をトランスフェクトするための以前の非ウイルスベクターの無能力または低効率を記録している（Ｗｉｌｋｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ，１９９６）。特定の以前の非ウイルスベクターは、発現の長寿命を欠き、及び／または治療的に十分ではなく、かつ効率的に特定の細胞型を標的にすることができない低量のタンパク質を産生する。
したがって、非ウイルスベクターの分野における最先端の研究にもかかわらず、多くの以前の非ウイルスベクターは、臨床使用に最適ではない。とりわけ臨床的有用性に寄与する、本明細書で論じられる少なくとも特定の実施形態の特定の特徴には、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
サイズ及び分子量：ＤＮＡ分子を担持する多くの以前の非ウイルスベクターは、直径１０～２００ｎｍのサイズを有する（Ｋｏｎｓｔａｎ Ｍ．Ｗ．ｅｔ． ａｌ，２００４）。それらの分子量は、３００ｋＤａ超または５００ｋＤａ超であり得る。本開示は、とりわけ、直径が＜２０ｎｍであり、＜５００ｋＤａの分子量を有する非ウイルスタンパク質性ビヒクル、及び／または負荷ミニヌクレオソームを提供する。特定の実施形態では、本明細書に開示される非ウイルス性タンパク質性ビヒクル、及び／または負荷ミニヌクレオソームは、典型的な核孔が直径わずか２０ｎｍであり、＜２０ｎｍのサイズが通過を可能にし得るため、少なくとも部分的には、おそらく受動拡散によって、より効率的に核内に通過することができる。
体液における安定性：多くの以前の非ウイルスベクターは、それらが標的細胞に送達される前に、血液またはＣＳＦなどの体液中で分解される（Ｂａｒｕａ ａｎｄ Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，２０１４）。本開示は、とりわけ、生理学的に安定であり、及び／または標的細胞に入るまで及び入った後にそれらが血液及び／または他の体液中で安定することを可能にする特性を有する、非ウイルス性タンパク質性ビヒクル、及び／または負荷ミニヌクレオソームを提供する。これらの粒子の少なくとも１つの目標は、所望の細胞の核に安全に到達することである。
核における粒子の放出：多くの以前の非ウイルスベクターは、標的細胞に入る前に関連核酸を放出することがほとんどであり、残りは、送達されたＤＮＡがＤＮＡを破壊するヌクレアーゼに遭遇する細胞質中で関連核酸を放出するため、非常に短い寿命を有する（Ｚａｂｎｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ，１９９５）。特定の以前のベクターは、細胞核まで進み、仮に発現したとしても非常に低い発現レベルを提供する。本開示はまた、とりわけ、関連する核酸を一度に放出するのではなく、ゆっくりと放出することが有益であり得、これにより発現の寿命を長くする可能性があることを認識するものである。
細胞型特異性：以前の非ウイルスベクターは特定の細胞型を標的としておらず、形質導入レベルの低下、ひいては発現の低減と関連している。本開示は、とりわけ、細胞型特異性のために最適化された非ウイルスベクターを提供する。細胞型特異性を操作する特定の手段は、例えば、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓｅｎｚｅｒ，２０１１に記載されている。
まとめると、所望の持続時間の有効な発現レベルを提供し、非免疫原性及び非毒性であり、より制限の少ないペイロード容量を有する核酸送達技術に対する極めて大きな必要性が存在する。さらに、ハンチントン病、スターガルト病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、及び遺伝子療法によって治療可能な他の状態の何百万人もの患者の必要性は、これらの患者を治療するのに役立つ技術の必要性を明確に示している。
本開示は、核酸の送達のための安全かつ有効な非ウイルスタンパク質性ビヒクル（「ミニヌクレオソームコアタンパク質」）及び負荷ミニヌクレオソームを提供する。
様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、１つ以上の核酸と関連する。本明細書に開示されるように、１つ以上の核酸と会合するミニヌクレオソームコアタンパク質は、「負荷ミニヌクレオソーム」と称され得る。
様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、１つ以上の特定の細胞型内にまたはそこに、遺伝子などの核酸の送達及び／または標的化発現させるために、負荷ミニヌクレオソームを１つ以上の特定の細胞型を標的化する、標的化ドメインを含む。
様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質組成物（例えば、１つ以上の負荷ミニヌクレオソームを含む組成物）は、必要に応じて１回または繰り返し滴定（ｔｉｔｅｒ）及び／または投与され得る。さらに、様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質またはミニヌクレオソーム組成物（例えば、１つ以上の負荷ミニヌクレオソームを含む組成物）は、非免疫原性であり、非毒性である。
本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質は、ある特定の実施形態では、高分子取り込み、細胞へのウイルス侵入、真核細胞におけるヌクレオソーム形成、細胞内の特定の位置における特定のタンパク質の切断等に適用可能な原理を利用することができる。
本明細書に提供される組成物及び方法の様々な実施形態は、安定性の増強、特定の細胞型への標的指向化、及び遅い核酸放出による発現の増強された長寿命のうちの１つ以上を促進するドメインを含む。
様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質及び／またはミニヌクレオソームは、体液中で安定しており、及び／または核内または核への放出を可能にする及び／または核を標的にするドメインを含む。
少なくとも一態様では、本開示は、核酸結合ドメイン及び標的化ドメインを含む操作されたポリペプチドであって、ミニヌクレオソームコアタンパク質であり得る操作されたポリペプチドを提供する。負荷ミニヌクレオソームは、本明細書に記載される操作されたポリペプチド（例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質）及び本明細書に提供されるかもしくは別様に当技術分野で既知の少なくとも１つの核酸分子、を含む非ウイルスベクターであり得るか、または提供され得る。
いくつかの実施形態では、核酸結合ドメインであるか、またはそれを含む操作されたポリペプチド（例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質）は、アミノ酸配列ＫＲＨＲＫであるか、もしくはそれを含むヒストンポリペプチド配列及び／または核酸結合ドメインに由来した。ある特定の実施形態では、本開示の操作ポリペプチドは、ＫＲＨＲＫ、ＲＲＲＲＲ、ＲＲＬＡＲＲ、ＫＫＡＫＡＡＡＫＰＫＫ、ＫＫＤＧＫＫＲＫＲ、ＫＫＫＬＫ、ＫＫＲＩＲＫ、ＲＫＫＳＫ、ＫＫＰＫＫ、もしくはこれらの組み合わせを含むが、これに限定されないアミノ酸配列であるか、またはそれを含む核酸結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本開示の操作されたポリペプチドは、任意のヒストンタンパク質配列、もしくは表３に記載されるもの、または本明細書に記載されるが、これに限定されない配列の組み合わせに由来する核酸結合ドメインを含む。これらの核酸結合ドメインは、様々なヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴う「ＮＡＢＤ」を修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、「ＮＡＢＤ」を逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作ポリペプチドは、細胞付着ドメイン、βガラクトース結合ドメイン、フコース結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、シアル酸結合ドメイン、糖タンパク質結合ドメイン、炭水化物結合ドメイン、リゾホスファチジン酸結合ドメイン、ｃＡＭＰ結合ドメイン、ヒアルロナン結合ドメイン、コンドロイチン硫酸塩結合ドメイン、インテグリン結合ドメイン、ヌクレオリン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、クラスリン結合ドメイン、Ｆｃ受容体結合ドメイン、アクチン結合ドメイン、エンドサイトーシスモチーフ、核局在化シグナル、またはこれらの組み合わせであるが、これに限定されない標的化ドメインを含む。これらのドメインのいくつかの例は、表５に記載されているが、これらに限定されない。これらのドメインは、任意のヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴う標的化ドメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、標的化ドメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、内在化ドメインである標的化ドメインを含み、内在化ドメインは、ＦＸＤＸＦ、ＰＰＳＹ、ＦＥＤＮＦＶＰ、ＹＩＲＶ、ＹＡＤＷ、ＹＴＱＶ、ＫＫＲＰＫＰ、ＳＳＤＤＥ、ＲＲＡＳＳ、（ＹＸＸＬ）２、ＬＰＬＴＧ、ＬＡＦＴＧ、もしくはそれらの組み合わせを含むが、それに限定されないアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。これらのドメインは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴う内在化ドメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、内在化ドメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
当業者であれば、本明細書全体を通してタンパク質配列で使用される場合、「Ｘ」は、別途指定されない限り、任意のアミノ酸を指し得ることを理解するであろう。したがって、別途指定されない限り、「Ｘ」は、単一のアミノ酸のプレースホルダであり、その位置は、当業者に既知の任意の単一のアミノ酸でうめることができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、ＷＧＲＥＥＲＱ、ＮＴＱＩＨ、ＷＮＮＫＴＰＨ、ＴＰＨ、ＶＮＲＷＳ、ＸＢＢＢＸＸＢＸ、ＡＲＫＫＡＡＫＡ、ＱＲＲ、ＳＲＲ、ＷＥＰＳＲＰＦＰＶＤ、ＨＲＲＴＲＫＡＰＫＲＩＲＬＰＨＩＲ、ＫＲＴＧＱＹＫＬＧＳＫＴＧＰＧＱＫ、ＫＫＴＫ、ＫＬＲＳＱＬＶＫＫ、ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ、ＢＸ（７）Ｂ、ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ、ＫＫＥＫＤＩＭＫＫＴＩ、ＫＧＥ、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＴＴＶＶＮＰＫＹＥＧＫ、ＥＲＭＳＱＩＫＲＬＬＳ、ＷＲＨＲＡＲＳ、ＧＦＯＧＥＲ、ＬＦＤＬＭ、ＷＧＲＥＥＲＱ、ＱＳＴＥＫＲＧ、ＬＰＮＴＧ、及びそれらの組み合わせ（Ｘは、任意のアミノ酸であってよい）、から選択されるが、これに限定されない、アミノ酸配列であるか、またはそれらを含む、細胞付着標的ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、内在化ドメイン細胞型特異的標的化ドメインである標的化ドメインを含み、細胞型特異的標的化ドメインが、ＡＳＳＬＮＩＡ、ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥ、ＬＩＦＨＫＥＱ、ＫＦＮＫＰＦＶＦＬＩ、ＱＰＥＨＳＳＴ、ＥＹＨＨＹＮＫ、ＮＧＲ、ＧＥＫＧＥＰ、ＫＴＫＫＫ、ＫＡＬＫＫＫ、ＫＧＫＫＫ、ＣＳＶＴＣＧ、ＬＲＥ、ＹＫＹＮＬＮＧＲＥＳ、ＹＲＳＬ、ＫＧＧＫ７、ＫＫＫＱＹＴＳＩＨＨＧ、ＫＤＥＬ、ＬＡＤＱＤＹＴＫＴＡ、もしくはこれらの組み合わせを含むが、これに限定されないアミノ酸配列であるか、またはこれらを含む。これらのドメインは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴う標的化ドメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、標的化ドメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、ポリペプチド配列全体にわたって様々な長さまたは複数のポリアルギニンドメインを有するポリアルギニンドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、核内在化シグナルまたは核内移行機構結合ドメインを含む。操作されたポリペプチド、核内在化シグナル、または核内移行機構結合ドメインは、ＫＫＫＹＫＬＫ、ＫＫＲＫＬＥ、ＴＲＳＫ、ＨＲＫＲＫＲ、ＮＫＲＫＲＫ、ＡＥＫＳＫＫＫ、ＲＫＳＫ、ＫＲＶＫ、ＫＲＫ、ＬＱＱＴＰＬＨＬＡＶＩ、ＲＲＰＲ、ＰＲＰＲ、ＲＰＰＰ、ＲＫＫＲＫＧＫ、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ、ＰＫＫＫＲＫＶ、ＱＲＫＲＱＫ、ＤＳＰＥ、ＦＱＶＴ、ＱＳＴＥＫＲＧ、ＲＱＧＬＩＤ、環状ＲＫＫＨ、もしくはこれらの組み合わせを含むが、これに限定されないアミノ酸配列であり得るか、またはそれらを含むことができる。これらのドメインは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴う核内在化シグナルを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、核内在化シグナルを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、核酸放出ドメインを含む。核酸放出ドメインは、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ、ＫＲＨ、ＫＳＶＫＫＲＳＶＳＥＩＱ、ＮＲＲＫＫＲＡＬ、ＫＦＥＲＱ、ＶＲＧＰ、ＮＫＤＳ、ＮＲＤＮ、ＡＮＮＲ、もしくはそれらの組み合わせを含むが、これに限定されないアミノ酸配列であるか、またはそれらを含む。これらのドメインは、ヒトまたは他の生物に見られるペプチダーゼ、酵素または他のタンパク質の基質である様々なタンパク質に由来し得る。いくつかの核酸放出ドメインは、様々なタンパク質の自己分解部位にも由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列の変更を伴う核酸放出ドメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、核酸放出シグナルを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは安定性ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、ＹＴＲＦ、ＧＤＡＹ、ＬＬＥＥ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＹＫＳＬ、ＹＥＮＦ、ＦＱＤＬ、ＹＩＧＳＲ、ＩＫＶＡＶ、もしくはこれらの組み合わせを含むが、これに限定されないアミノ酸配列であるか、またはそれを含む安定性ドメインを含み得る。これらのドメインは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴う安定性ドメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、安定性ドメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、オリゴマー化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、表１１のオリゴマー化ドメインから選択されるが、これに限定されないオリゴマー化ドメインを含むことができる。オリゴマー化ドメインの位置は、本開示の操作ポリペプチドのＣ末端に、または任意の他の位置に位置する。これらのドメインは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴うオリゴマー化ドメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、オリゴマー化ドメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたポリペプチドは、限定されないが、表１２の例示的ドメインから選択されるリンカーを含むことができる。本開示の操作されたポリペプチドにおけるリンカーの位置は、他のドメインと任意の他の位置との間にあり得る。これらのリンカーは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、アミノ酸配列への変更を伴うリンカードメインを修飾または操作することを企図することができる。当業者であれば、また、リンカードメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはアミノ酸に翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
様々な実施形態では、本開示の２つ以上の操作ポリペプチドは、オリゴマー化することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の操作されたポリペプチド（例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質）を少なくとも１つのポリヌクレオチドとともに含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、阻害性ＲＮＡであるか、または阻害性ＲＮＡを含み、阻害性ＲＮＡは、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである。様々な実施形態において、ポリペプチド（複数可）及びポリヌクレオチド（複数可）は、会合しないが、組成物、例えば、キットまたは溶液中で一緒になっている。様々な実施形態では、ポリペプチド（複数可）及びポリヌクレオチド（複数可）は、会合し、例えば、縮合され、例えば、負荷ミニヌクレオソームを形成する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド対操作されたポリペプチドの比は、１：３～１：２，０００である。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド対操作されたポリペプチドの比は、１：３～１：１，０００、１：３～１：５００、１：３～１：２００、１：３～１：１００、または１：３～１：５０である。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド対操作されたポリペプチドの比は、１：２００～１：２，０００、１：２００～１：１０００、または１：２００～１：５００である。当業者はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に対する化学修飾を考慮してもよい。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質及び／または負荷ミニヌクレオソームを含む、本明細書に提供される組成物は、細胞、組織、または対象に投与され得るか、またはそれと接触され得る。適用条件は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボであり得る。かかる操作された細胞は、例えば、治療材料（例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質及び／または負荷ミニヌクレオソームを含む本明細書に提供される組成物）のヒト体内の様々な部分、例えば、限定するものではないが、脳、網膜、腸、膵臓、肺等への送達に使用され得るか、またはそれと適合する薬学的担体を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを縮合する方法は、ポリヌクレオチドを本明細書に記載のミニヌクレオソームコアタンパク質と接触させることを含み得る。方法は、ポリヌクレオチドの電荷を中和するプロセス、またはポリヌクレオチドをナノサイズの粒子に縮合させるプロセスを含み得、これには、ポリヌクレオチドを本明細書に記載のミニヌクレオソームコアタンパク質と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、分岐ペプチドまたは環状ペプチドであってもよいが、これらの特徴に限定されない。当業者は、ミニヌクレオソームコアタンパク質の特徴を変更して、様々な細胞型への強化された指向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を得ることを企図してもよい。
本開示は、本明細書に提供される操作されたポリペプチド（例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質）をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドであり得る。いくつかの事例では、本開示は、本開示の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で提供される操作されたポリペプチド（例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質）をコードするポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞、またはかかるポリヌクレオチドの配列を含む細胞を提供する。ある特定の実施形態において、本開示の操作されたポリペプチドは、１つ以上のかかる細胞から単離することができる。
様々な実施形態では、本開示の操作されたポリペプチド（例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質）の１つ以上のアミノ酸は、ペグ化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化、ＳＵＭＯ化、アミド化、脂質付加化、プレニル化、リポイル化、アルキル化、アシル化、糖化、ニトロシル化、硫酸化、カルバミル化、カルボニル化、ＮＥＤＤ化（ｎｅｄｄｙｌａｔｅｄ）、ビオチン化、またはリボシル化されている。
定義
約：本明細書で値に関して使用される場合、「約」という用語は、参照される値に関連して類似する値を指す。一般に、その文脈に精通している当業者は、その文脈における、「約」に包含される関連する程度の分散を理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、用語「約」は、参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満の範囲の値を包含し得る。
投与：本明細書で使用される場合、「投与」という用語は、典型的には、組成物であるか、または組成物に含まれる薬剤の送達を達成するために、対象または系への組成物の投与を指す。当業者は、適切な状況において、対象、例えばヒトへの投与に利用され得る様々な経路を認識するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、眼、経口、非経口、局所などであってもよい。いくつかの特定の実施形態では、投与は、気管支（例えば、気管支滴下による）、口腔、皮膚（例えば、真皮に対する局所、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、皮内（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）、経皮などのうちの１つ以上であってもよく、またはこれらを含んでもよい）、腸内、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、髄腔内、静脈内、脳室内、特定の器官内（例えば、肝臓内）、粘膜、鼻腔、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（例えば、気管内滴下による）、膣内、硝子体内などであってもよい。いくつかの実施形態では、投与は、単回用量のみを含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、一定数の用量の適用を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、断続的（例えば、時間的に分けられた複数の用量）及び／または定期的（例えば、共通の期間によって分けられた個々の用量）な投与を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間の連続投与（例えば、灌流）を含んでもよい。
と関連する：２つの事象または実体は、一方の存在、レベル、及び／または形態が他方の存在、レベル、及び／または形態と相関する場合、その用語は本明細書で使用されるように、互いに「関連する」。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝産物、微生物など）の存在、レベル、及び／または形態が、（その関連する集団にわたって）その疾患、障害、または状態の発生率及び／またはその疾患、障害、または状態に対する感受性と相関する場合、その実体は、その特定の疾患、障害、または状態と関連していると見なされる。いくつかの実施形態では、２つ以上の実体が、それらが直接的または間接的に相互作用する場合、互いに物理的に「会合する」ので、それらは互いに物理的に近接している、及び／または物理的に近接したままである。いくつかの実施形態では、互いに物理的に会合する２つ以上の実体は、互いに共有結合しており、いくつかの実施形態では、互いに物理的に会合する２つ以上の実体は、互いに共有結合しないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、及びそれらの組み合わせによって非共有結合的に会合している。
薬剤：本明細書で使用される場合、「薬剤」という用語は、例えば、小分子、ポリペプチド、核酸、糖類、脂質、金属、またはそれらの組み合わせもしくは複合体を含む、任意の化学クラスの化合物、分子、または実体を指し得る。いくつかの実施形態において、「薬剤」という用語は、ポリマーを含む化合物、分子、または実体を指し得る。いくつかの実施形態では、この用語は、１つ以上のポリマー部分を含む化合物または実体を指し得る。いくつかの実施形態では、「薬剤」という用語は、特定のポリマーまたはポリマー部分を実質的に含まない化合物、分子、または実体を指し得る。いくつかの実施形態では、この用語は、任意のポリマーまたはポリマー部分を欠くか、または実質的に含まない化合物、分子、または実体を指し得る。
アミノ酸：本明細書で使用されるその最も広い意味で、「アミノ酸」は、例えば、１つ以上のペプチド結合の形成を通じてポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、非天然アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｄ－アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然に存在するペプチドに一般的に見られる２０種の標準的なＬ－アミノ酸のうちのいずれかを指す。「非標準アミノ酸」とは、合成的に調製されるか、または天然源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチド中のカルボキシ末端及び／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、上記の一般構造と比較して、構造修飾を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造と比較して、メチル化、アミド化、アセチル化、ペグ化、グリコシル化、リン酸化、及び／または置換（例えば、アミノ基、カルボン酸基、１つ以上のプロトン、及び／またはヒドロキシル基の）によって修飾され得る。いくつかの実施形態では、このような修飾は、例えば、それ以外では同一の非修飾アミノ酸を含有するものと比較して、修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの循環半減期を変更し得る。いくつかの実施形態では、このような修飾は、それ以外では同一の非修飾アミノ酸を含有するものと比較して、修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの関連する活性を有意に変化させない。文脈から明らかになるように、いくつかの実施形態では、「アミノ酸」という用語は、遊離アミノ酸を指すために使用され得、いくつかの実施形態では、それは、ポリペプチドのアミノ酸残基を指すために使用され得る。
間：本明細書で使用される場合、「間」という用語は、境界を含む、示される上限と下限、または第１及び第２の境界との間に入る内容物を指す。
に対応する：本明細書で使用される場合、「に対応する」という用語は、適切な参照化合物または組成物との比較を通じて、化合物または組成物中の構造要素の位置／同一性を指定するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ポリマー中のモノマー残基（例えば、ポリペプチド中のアミノ酸残基またはポリヌクレオチド中の核酸残基）は、適切な参照ポリマー中の残基として「対応する」ものとして識別されてもよい。例えば、単純化の目的のために、ポリペプチド中の残基は、多くの場合、参照関連ポリペプチドに基づく標準的な番号付けシステムを使用して指定されることが多く、その結果、例えば、１９０位の残基に「対応する」アミノ酸は、実際に特定のアミノ酸鎖中の１９０番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ参照ポリペプチド中の１９０位に見出される残基に対応する必要があることを当業者は理解するであろうし、当業者は、「対応する」アミノ酸を識別する方法を容易に理解するであろう。例えば、当業者は、例えば、本開示に従って、ポリペプチド及び／または核酸中の「対応する」残基を同定するために利用され得る、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＣＳ－ＢＬＡＳＴ、ＣＵＤＡＳＷ＋＋、ＤＩＡＭＯＮＤ、ＦＡＳＴＡ、ＧＧＳＥＡＲＣＨ／ＧＬＳＥＡＲＣＨ、Ｇｅｎｏｏｇｌｅ、ＨＭＭＥＲ、ＨＨｐｒｅｄ／ＨＨｓｅａｒｃｈ、ＩＤＦ、Ｉｎｆｅｒｎａｌ、ＫＬＡＳＴ、ＵＳＥＡＲＣＨ、ｐａｒａｓａｉｌ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－Ｓｅａｒｃｈ、ＳｃａｌａＢＬＡＳＴ、Ｓｅｑｕｉｌａｂ、ＳＡＭ、ＳＳＥＡＲＣＨ、ＳＷＡＰＨＩ、ＳＷＡＰＨＩ－ＬＳ、ＳＷＩＭＭ、またはＳＷＩＰＥ等のソフトウェアプログラムを含む、様々な配列アラインメント戦略を認識するであろう。
ドメイン：本明細書で使用する場合、用語「ドメイン」は実体のセクションまたは一部を指す。いくつかの実施形態では、「ドメイン」は、実体の特定の構造的及び／または機能的特徴と関連付けられているので、ドメインがその親実体の残りの部分から物理的に分離される場合、特定の構造的及び／または機能的特徴を実質的にまたは完全に保持する。代替的または追加的に、ドメインは、その（親）実体から分離され、別の（受容体）実体と連結されるとき、実質的に、受容体実体に、親実体内でそれを特徴付ける１つ以上の構造的及び／または機能的特徴を保持及び／または付与する、実体の一部であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、ドメインは、分子（例えば、小分子、炭水化物、脂質、核酸、またはポリペプチド）の切片または一部である。いくつかの実施形態では、ドメインは、ポリペプチドの切片であり、いくつかのそのような実施形態では、ドメインは、特定の構造要素（例えば、特定のアミノ酸配列もしくは配列モチーフ、α－ヘリックス特性、β－シート特性、コイル状コイル特性、ランダムコイル特性等）、及び／または特定の機能特徴（例えば、結合活性、酵素活性、折り畳み活性、シグナル伝達活性等）によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ドメインは、特徴的な部分もしくは特徴的な配列要素であるか、またはそれらを含む。
操作された：一般に、「操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」という用語は、人間の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリヌクレオチドは、自然界においてその順序で一緒に連結されていない２つ以上の配列が、人の手によって操作されて、操作されたポリヌクレオチドにおいて互いに直接連結される場合、「操作された」と見なされる。当業者であれば、「操作された」核酸またはアミノ酸配列が、組換え核酸またはアミノ酸配列であり得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、第１の配列と作動可能に会合しているが、第２の配列と作動可能に会合していない自然に見出されるドメインコード配列調節配列を含み、それが第２の配列と動作可能に会合するように、人間の手によって連結される。同様に、細胞または生物は、その遺伝情報が変化するように操作された場合（例えば、以前に存在しなかった新しい遺伝物質が、例えば、形質転換、交配、体細胞ハイブリダイゼーション、トランスフェクション、形質導入、または他の機構によって導入されているか、または以前に存在した遺伝物質が、例えば、置換もしくは欠失変異によって、または交配プロトコルによって変化または除去される）、「操作された」と見なされる。一般的な実践であり、当業者には理解されている通り、操作されたポリヌクレオチドまたは細胞の子孫は、実際の操作が以前の実体に対して行われたとしても、通常、依然として「操作された」と称される。
遺伝子：本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、産物（例えば、ＲＮＡ産物及び／またはポリペプチド産物）をコードするＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子は、コード配列（すなわち、特定の産物をコードする配列）を含み、いくつかの実施形態では、遺伝子は、非コード配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、遺伝子は、コード配列（例えば、エクソン性）配列及び非コード（例えば、イントロン性）配列の両方を含んでもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子は、例えば、遺伝子発現の１つ以上の態様（例えば、プロモーター）を制御し得るか、またはそれに影響を与え得る１つ以上の調節要素を含んでいてもよい。遺伝子は、特定の状況、例えば、細胞において、内在性または非内在性であり得る。遺伝子は導入遺伝子であり得る。
遺伝子産物または発現産物：本明細書で使用される場合、「遺伝子産物」または「発現産物」という用語は、一般に、遺伝子から転写されたＲＮＡ（プレプロセッシング及び／またはポストプロセッシング）または遺伝子から転写されたＲＮＡによってコードされるポリペプチド（前修飾及び／または後修飾）を指す。
「改善する」、「増加する」、「阻害する」、または「減少する」：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加する」、「阻害する」、「減少する」という用語、またはそれらの文法的等価物は、ベースラインまたは他の基準測定値に対する値を示す。いくつかの実施形態では、適切な基準測定値は、特定の薬剤もしくは処置の比存在下で（例えば、前及び／または後に）、または適切な同等の基準薬剤の存在下で、他の点では同等の条件下で、特定の系内（例えば、単一の個体内）の測定値であってもよく、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、適切な基準測定値は、関連する薬剤または治療薬の存在下で、特定の方法で応答することが知られているか、または応答すると予想される同等の系における測定値であってもよく、またはそれを含んでもよい。
核酸：本明細書で使用される場合、その最も広い意味で、「核酸」は、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込まれ得る化合物及び／または物質である。文脈から明らかになるように、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指し、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであるか、またはＲＮＡを含み、いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであるか、またはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然核酸残基であるか、１つ以上の天然核酸残基を含むか、または１つ以上の天然核酸残基からなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の核酸類似体であるか、１つ以上の核酸類似体を含むか、または１つ以上の核酸類似体からなる。いくつかの実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しない点において核酸と異なる。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の「ペプチド核酸」であるか、１つ以上の「ペプチド核酸」を含むか、または１つ以上の「ペプチド核酸」からなり、当該技術分野で既知であり、骨格内のホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有し、本開示の範囲内であると見なされる。代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホチオエート結合及び／または５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン及びデオキシシチジン）であるか、１つ以上の天然ヌクレオシドを含むか、または１つ以上の天然ヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニルシチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレーションされた塩基、及びこれらの組み合わせ）であるか、１つ以上のヌクレオシド類似体を含むか、１つ以上のヌクレオシド類似体からなる。いくつかの実施形態では、核酸は、天然核酸中の糖類と比較して、１つ以上の修飾された糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、相補的テンプレートに基づく重合による酵素合成（インビボまたはインビトロで）、組換え細胞または系における複製及び化学合成のうちの１つ以上によって調製される。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、またはそれを超える残基の長さである。いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または完全に一本鎖であり、いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または完全に二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコードする配列の相補である少なくとも１つの要素を含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。
作動可能に連結された：本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、記載される構成要素が、それらがそれらの意図される様式で機能することを可能にする関係にある並立を指す。例えば、機能要素に「作動可能に連結された」制御要素は、機能要素の発現及び／または活性が、制御要素と互換性のある条件下で達成されるように関連付けられる。いくつかの実施形態では、「作動可能に連結された」制御要素は、目的とするコード要素と隣接しており（例えば、共有結合されている）、いくつかの実施形態では、制御要素は、目的とする機能要素に対してトランスに作用するか、またはそれ以外の場合、目的とする機能エレメントから作用する。
薬学的組成物：本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、活性剤が１つ以上の薬学的に許容される担体とともに製剤化される組成物を指す。いくつかの実施形態では、活性剤は、関連する集団に投与されるときに所定の治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンでの投与に適切な単位用量の量で存在する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、以下に適合したものを含む、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化することができる。経口投与、例えば、水薬（水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、口腔内、舌下、及び全身吸収を目的としたもの、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペースト；非経口投与、例えば滅菌溶液もしくは懸濁液、もしくは徐放性製剤としての皮下、筋肉内、静脈内、または硬膜外注射による；局所適用、例えば、クリーム、軟膏、または皮膚、肺、もしくは口腔に適用される制御放出パッチまたはスプレーとして；膣内もしくは直腸内、例えばペッサリー、クリーム、もしくはフォームとして；舌下；眼内；経皮的；または経鼻的、肺的、及び他の粘膜表面へ。
ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、自然界に生じるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、自然界に存在しないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、それが人の手の作用によって設計及び／または産生されるという点で操作されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはその両方を含んでいてもよく、またはそれらからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸のみまたは非天然アミノ酸のみを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸、Ｌ－アミノ酸、またはその両方を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸のみを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸のみを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１つ以上のペンダント基または他の修飾、例えば、１つ以上のアミノ酸側鎖を修飾または付着すること、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態において、かかるペンダント基または修飾は、これらの組み合わせを含む、アセチル化、アミド化、脂質化、メチル化、リン酸化、グリコシル化、糖化、硫酸化、マンノシル化、ニトロシル化、アシル化、パルミトイル化、プレニル化、ペグ化等からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは環状であってもよく、及び／または環状部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、環状ではなく、及び／または任意の環状部分を含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、直鎖状である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ステープル（ｓｔａｐｌｅｄ）ポリペプチドであってもよいか、またはステープルポリペプチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、「ポリペプチド」という用語は、参照ポリペプチド、活性、または構造の名前に付加されてもよく、そのような場合、本明細書では、関連する活性または構造を共有し、したがって、同じクラスまたはポリペプチドのファミリーのメンバーであると見なされ得るポリペプチドを指すために使用される。かかるクラスごとに、本明細書は、アミノ酸配列及び／または機能が既知であるクラス内の例示的なポリペプチドを提供し、及び／または当業者は認識するであろう。いくつかの実施形態では、かかる例示的なポリペプチドは、ポリペプチドクラスまたはファミリーのための参照ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドクラスまたはファミリーのメンバーは、クラスの基準ポリペプチドと、（いくつかの実施形態では、クラス内のすべてのポリペプチドと、）有意な配列類似性（例えば、相同性）もしくは同一性を示し、共通の配列モチーフ（例えば、特徴的な配列要素）を共有し、及び／または共通の活性（いくつかの実施形態では、同等レベルまたは指定された範囲内）を共有する。例えば、いくつかの実施形態では、メンバーポリペプチドは、少なくとも約３０～４０％である、しばしば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える、基準ポリペプチドとの全体的な配列類似性（例えば、相同性）または同一性の程度を示し及び／またはしばしば、９０％を超える、さらには９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える、非常に高い配列同一性を示す、少なくとも１つの領域（例えば、いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素であり得るか、またはそれを含み得る保存領域）を含む。かかる保存領域は、通常、少なくとも３～４個、多くの場合、最大２０個またはそれよりも多くのアミノ酸を包含し、いくつかの実施形態では、保存領域は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個またはそれよりも多くの連続するアミノ酸の少なくとも１つのストレッチを包含する。いくつかの実施形態では、有用なポリペプチドは、親ポリペプチドの断片を含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、それぞれ目的のポリペプチドで見出されるものとは異なる空間配置で互いに同じ親ポリペプチドに見出される、複数の断片を含んでもよく、またはそれらからなることができる有用なポリペプチド（例えば、親に直接結合した断片は、目的のポリペプチドで空間的に分離されてもよく、またその逆であり得、及び／または断片は、目的のポリペプチドにおいて、親とは異なる順序で存在してもよい）により、目的のポリペプチドは、その親ポリペプチドの誘導体である。
予防するまたは予防：本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」は、疾患、障害、及び／または状態の発生と関連して使用される場合、疾患、障害、及び／もしくは状態を発症するリスクを減少させること、及び／または疾患、障害、もしくは状態の１つ以上の特徴もしくは症状の発症を遅らせることを指す。ある疾患、障害または状態の発症が所定の期間遅れた場合、予防は完全と見なされ得る。
プロモーター：本明細書で使用される場合、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、コード配列の転写の開始及び／または処理能力に直接または間接的に（例えば、プロモーター結合タンパク質または物質を通じて）関与するＤＮＡ調節領域であり得る。プロモーターは、好適な条件下で、１つ以上の転写因子及び／または調節部分のプロモーターとの結合時に、コード配列の転写を開始し得る。コード配列の転写の開始に関与するプロモーターは、コード配列に「作動可能に連結」することができる。ある特定の事例において、プロモーターは、そのように指定された配列が、転写イベントを開始するのに必要な最小数の塩基または要素の一方または両方を含むように、転写開始部位（その３’末端）から上流（５’方向）位置に伸長するＤＮＡ調節領域であるか、またはそれを含むことができる。プロモーターは、エンハンサー配列及びリプレッサー配列などの発現制御配列であり得るか、それらを含むか、それらに作動可能に関連し得るか、またはそれらと作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性であってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、条件的（例えば、誘導性）プロモーターは、一方向性または双方向性であってもよい。プロモーターは、特定の種のゲノム中で発生することが知られている配列と同一の配列であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、転写調節領域を含有する配列を１つの源から得ることができ、転写開始領域を含有する配列を第２の源から得ることができるハイブリッドプロモーターであってもよいか、またはハイブリッドプロモーターを含んでいてもよい。導入遺伝子内のコード配列に制御要素を連結するためのシステムは、当該技術分野で周知である（一般的な分子生物学的及び組換えＤＮＡ技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記述されている）。
組換え：本明細書で使用される場合、「組換え」は、組換え手段によって設計、操作、調製、発現、作製、製造、及び／または単離されたポリペプチド、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されたポリペプチド；組換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリから単離されたポリペプチド；トランスジェニックであるか、そうでなければ操作されて、遺伝子もしくは複数の遺伝子、またはポリペプチドもしくはその１つ以上の成分（複数可）、部分（複数可）、要素（複数可）、もしくはドメイン（複数可）をコードする及び／またはそれらの発現を指示する遺伝子成分を発現する、動物（例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、魚等）から単離されたポリペプチド；及び／または選択された核酸配列要素を互いにスプライシング若しくはライゲーションすること、選択された配列要素を化学的に合成すること、及び／またはそれ以外の場合、ポリペプチドもしくはその１つ以上の成分（複数可）、部分（複数可）、要素（複数可）、もしくはドメイン（複数可）をコードする及び／またはそれらの発現を指示する核酸を生成すること、を含む、他の手段によって調整、発現、作製、または単離されたポリペプチド、を指すことが意図される。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素のうちの１つ以上が、自然界に見出される。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素のうちの１つ以上が、インシリコで設計される。いくつかの実施形態では、１つ以上のそのような選択された配列要素は、既知の配列要素の突然変異誘発（例えば、インビボまたはインビトロ）から、例えば、天然または合成供給源、例えば、目的の供給源生物（例えば、ヒト、マウス等）の生殖細胞系から生じる。
基準：本明細書で使用される場合、比較が行われる標準または対照を指す。例えば、いくつかの実施形態では、目的の、薬剤、動物、個体、集団、試料、配列または値が、参照または対照の、薬剤、動物、個体、集団、試料、配列または値と、比較される。いくつかの実施形態では、基準または対照は、目的物の試験または決定と実質的に同時に試験され、及び／または決定される。いくつかの実施形態では、基準または対照は、歴史的な基準または対照であり、任意選択的に、有形媒体で具体化される。典型的には、当業者に理解されるように、基準または対照は、評価されるものと同等の条件もしくは状況下で決定されるか、または特徴付けられる。当業者であれば、特定の可能な基準もしくは対照に対する信頼及び／または比較を正当化するのに十分な類似性が存在することを理解するだろう。
対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」は、生物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、いくつかの実施形態では、出生前のヒト形態を含む）を指す。いくつかの実施形態では、対象は、関連する疾患、障害または状態に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、ある疾患、障害または状態にかかりやすい。いくつかの実施形態では、対象は、ある疾患、障害または状態の、１つ以上の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態では、対象は、ある疾患、障害または状態の、症状または特徴を何ら示さない。いくつかの実施形態では、対象は、ある疾患、障害もしくは状態に対するかかりやすさ、またはある疾患、障害もしくは状態のリスクに特徴的な１つ以上の特徴を有する人である。いくつかの実施形態では、対象は、患者である。いくつかの実施形態では、対象は、診断及び／または治療が実施されているか、及び／または実施されていた個体である。
実質的な配列類似性：「実質的な配列類似性」という句は、本明細書では、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を指すために使用される。当業者よって理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置に保存的アミノ酸置換を含有する場合、一般に「実質的に類似している」と見なされる。保存的置換とは、アミノ酸が、適切に類似した構造的及び／または機能的特徴を有する非同一の残基によって置き換えられたものである。例えば、当業者に周知のように、ある特定のアミノ酸は、典型的には、「疎水性」もしくは「親水性」アミノ酸として、及び／または「極性」もしくは「非極性」側鎖を有するものとして分類される。同じタイプの別のアミノ酸に対するあるアミノ酸の置換は、しばしば保存的置換と見なされ得る。典型的なアミノ酸分類を、以下の表１及び２に要約する。
Figure 2022512977000002
Figure 2022512977000003
本技術分野で周知であるように、アミノ酸配列または核酸配列は、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較されてもよく、例えば、ヌクレオチド配列についてのＢＬＡＳＴＮ、及びアミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ等の市販コンピュータプログラムにおいて利用可能なものを含む。そのようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８、及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。類似の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、通常、類似性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上が、残基の関連するストレッチにわたって類似及び／または同一である場合、実質的に類似していると見なされる。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは、完全な配列である。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００以上の残基である。当業者によって理解されるように、実質的な配列類似性を有する配列は、互いの相同体であり得る。
実質的配列同一性：本明細書で使用される場合、「実質的な配列同一性」という表現は、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を指す。当業者によって理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置に同一の残基を含有する場合、一般に、「実質的に同一である」と見なされる。本技術分野で周知であるように、アミノ酸配列または核酸配列は、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較されてもよく、例えば、ヌクレオチド配列についてのＢＬＡＳＴＮ、及びアミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ等の市販コンピュータプログラムにおいて利用可能なものを含む。そのようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８、及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、通常、同一性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が、残基の関連するストレッチにわたって同一である場合、２つの配列は、実質的に同一であると見なされる。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは、完全な配列である。いくつかの実施形態では、関連するストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００以上の残基である。
治療薬：本明細書で使用される場合、「治療薬」という句は、一般に、生物に投与されたときに所望の薬理学的効果を引き起こす任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、薬剤は、適切な集団にわたって統計的に有意な効果を示す場合、治療剤であると見なされる。いくつかの実施形態では、適切な集団は、モデル生物の集団であってもよい。いくつかの実施形態では、適切な集団は、ある特定の年齢層、性別、遺伝的背景、既存の臨床状態などの様々な基準によって定義され得る。いくつかの実施形態では、治療薬は、ある疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状または特徴を軽減し、改善し、緩和し、阻害し、予防し、発症を遅延させ、重症度を低減し、及び／またはその発生率を低減するために使用することができる物質である。いくつかの実施形態では、「治療薬」は、ヒトへの投与のために市販される前に政府機関によって承認されているか、または承認される必要がある薬剤である。いくつかの実施形態では、「治療薬」は、ヒトへの投与に処方箋が必要とされる薬剤である。
治療レジメン：「治療レジメン」は、この用語が本明細書で使用される場合、関連集団全体にわたる投与が所望のまたは有益な治療転帰と相関し得る投薬レジメンを指す。
治療上有効量：本明細書で使用される場合、それが投与される所望の効果をもたらす量を意味する。いくつかの実施形態では、この用語は、治療投薬レジメンに従って、疾患、障害、及び／または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい集団に投与される場合に、疾患、障害、及び／または状態を治療するのに十分な量を指す。いくつかの実施形態では、治療上有効量は、ある疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状の発生及び／または重症度を低減し、及び／またはそれらの発症を遅らせる量である。当業者は、「治療上有効量」という用語が、特定の個体で達成される成功した治療を実際には必要としないことを理解するであろう。むしろ、治療上有効量は、そのような治療を必要とする患者に投与される場合に、有意な数の対象において特定の所望の薬理学的応答を提供する量であり得る。いくつかの実施形態では、治療有効量への言及は、１つ以上の特定の組織（例えば、疾患、障害または状態に影響を受ける組織）または流体（例えば、血液、唾液、血清、汗、涙、尿など）で測定される量への言及であってもよい。当業者は、いくつかの実施形態では、治療有効量の特定の薬剤または療法が単回投与で処方及び／または投与され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、治療上有効な薬剤は、例えば、投薬レジメンの一部として、複数の用量で処方されてもよく、及び／または投与されてもよい。
治療：本明細書で使用される場合、「治療」（「治療する」または「治療すること」も含む）という用語は、特定の疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状、特徴、及び／または原因を部分的または完全に軽減し、改善し、緩和し、阻害し、その発症を遅延させ、その重症度を低減し、及び／またはその発生率を低減する療法の任意の投与を指す。いくつかの実施形態では、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態の兆候を示さない対象、及び／または疾患、障害、及び／または状態の初期兆候のみを示す対象のものであってもよい。代替的または追加的に、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の確立された兆候を示す対象のものであり得る。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態に罹患していると診断された対象のものであってもよい。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態の発症リスクの増加と統計的に相関する１つ以上の感受性因子を有することが知られている対象のものであり得る。
バリアント：分子、例えば、核酸、タンパク質、または小分子との関係で、本明細書で使用される場合、「バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、基準分子と有意な構造同一性を示すが、例えば、基準実体と比較して、１つ以上の化学部分の存在もしくは非存在、またはレベルにおいて、基準分子とは構造的に異なる分子を指す。いくつかの実施形態では、バリアントはまた、その基準分子と機能的に異なる。一般に、特定の分子が基準分子の「バリアント」であると適切に見なされるかどうかは、基準分子との構造的同一性の程度に基づく。当業者によって理解されるように、任意の生物学的または化学的基準分子は、特定の特徴的な構造要素を有する。バリアントは、定義上、１つ以上のそのような特徴的な構造要素を共有するが、基準分子と少なくとも１つの態様で異なる別個の分子である。ほんの数例を挙げると、ポリペプチドは、線形または三次元空間中の互いに対して指定された位置を有する、及び／または特定の構造モチーフ及び／または生物学的機能に寄与する、複数のアミノ酸を含む特徴的な配列要素を有し得、核酸は、線形または三次元空間中の互いに対して、指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基を含む特徴的な配列要素を有し得る。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、アミノ酸もしくはヌクレオチド配列の１つ以上の差異、及び／またはポリペプチドもしくは核酸（例えば、ポリペプチドもしくは核酸骨格に付着される）の共有結合成分である化学部分（例えば、炭水化物、脂質、リン酸基）の１つ以上の差異の結果として、基準ポリペプチドまたは核酸とは異なり得る。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％である基準ポリペプチドまたは核酸との全体的な配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準ポリペプチドまたは核酸と少なくとも１つの特徴的配列要素を共有しない。いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドまたは核酸は、１つ以上の生物学的活性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準ポリペプチドまたは核酸の生物学的活性のうちの１つ以上を共有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準ポリペプチドまたは核酸の生物学的活性のうちの１つ以上を欠く。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準ポリペプチドまたは核酸と比較して、１つ以上の生物学的活性のレベルの低下を示す。いくつかの実施形態では、基準のアミノ酸またはヌクレオチド配列と同一であるが、特定の位置での少数の配列変化を有する場合、目的のポリペプチドまたは核酸が、基準のポリペプチドまたは核酸の「バリアント」と見なされる。典型的には、バリアント中の残基の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、または約２％未満が、基準と比較して、置換、挿入、または欠失している。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準と比較して、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、または約１個の置換残基を含む。多くの場合、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準と比較して、非常に少数（例えば、約５未満、約４未満、約３未満、約２未満、または約１未満）の置換、挿入、または欠失された機能性残基（すなわち、特定の生物学的活性に関与する残基）を含む。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準と比較して、約５以下、約４以下、約３以下、約２以下、または約１以下の付加または欠失を含むが、いくつかの実施形態では、付加または欠失を含まない。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、基準と比較して、約２５未満、約２０未満、約１９未満、約１８未満、約１７未満、約１６未満、約１５未満、約１４未満、約１３未満、約１０未満、約９未満、約８未満、約７未満、約６未満の付加または欠失を含み、一般に、約５未満、約４未満、約３未満、または約２未満の付加または欠失を含む。いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドまたは核酸は、天然に見られるものである。いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドまたは核酸は、ヒトポリペプチドまたは核酸である。
パネルＡ及びパネルＢを含む。パネルＡは、リジン残基にて、パネルＢに示されるＰＥＧ１２で修飾されたミニヌクレオソームコアタンパク質が、ＤＮＡ分子との縮合反応を受けて、負荷ミニヌクレオソームを産生することができる方法の概略図の呈示である。各核酸分子は、ＤＮＡ中の負電荷を中和して負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質を形成するために、いくつかの（１～１０００）ミニヌクレオソームコアタンパク質を必要とし得る。概略図は、漫画図としてのみ意図され、負荷ミニヌクレオソームがコアタンパク質に関連する核酸を含む範囲を除き、負荷ミニヌクレオソームの実際の構造を表すことを意図するものではない。 配列中の最初のリジン残基にてＰＥＧ１２で修飾されたミニヌクレオソームコアタンパク質の製剤化後の質量分析から得られたデータを示すチャートである。 リジン残基にて１ｋＤａＰＥＧで修飾されたミニヌクレオソームコアタンパク質が、ＤＮＡ分子との縮合反応を受けて、負荷ミニヌクレオソームを産生することができる方法の概略図の呈示である。図３は、パネルＡ及びパネルＢを含む。パネルＡは、リジン残基にて、パネルＢに示される１ｋＤａＰＥＧで修飾されたミニヌクレオソームコアタンパク質が、ＤＮＡ分子との縮合反応を受けて、負荷ミニヌクレオソームを産生することができる方法の概略図の呈示である。各核酸分子は、ＤＮＡ中の負電荷を中和して負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質を形成するために、いくつかの（１～１０００）ミニヌクレオソームコアタンパク質を必要とし得る。概略図は、漫画図としてのみ意図され、負荷ミニヌクレオソームがコアタンパク質に関連する核酸を含む範囲を除き、負荷ミニヌクレオソームの実際の構造を表すことを意図するものではない。 パネルＡ及びパネルＢを含む。パネルＡは、リジン残基にて、パネルＢに示される２ｋＤａＰＥＧで修飾されたミニヌクレオソームコアタンパク質が、ＤＮＡ分子との縮合反応を受けて、負荷ミニヌクレオソームを産生することができる方法の概略図の呈示である。各核酸分子は、ＤＮＡ中の負電荷を中和して負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質を形成するために、いくつかの（１～１０００）ミニヌクレオソームコアタンパク質を必要とし得る。概略図は、漫画図としてのみ意図され、負荷ミニヌクレオソームがコアタンパク質に関連する核酸を含む範囲を除き、負荷ミニヌクレオソームの実際の構造を表すことを意図するものではない。 パネルＡ及びパネルＢを含む。パネルＡは、リジン残基にて、パネルＢに示される５ｋＤａＰＥＧで修飾されたミニヌクレオソームコアタンパク質が、ＤＮＡ分子との縮合反応を受けて、負荷ミニヌクレオソームを産生することができる方法の概略図の呈示である。各核酸分子は、ＤＮＡ中の負電荷を中和して負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質を形成するために、いくつかの（１～１０００）ミニヌクレオソームコアタンパク質を必要とし得る。概略図は、漫画図としてのみ意図され、負荷ミニヌクレオソームがコアタンパク質に関連する核酸を含む範囲を除き、負荷ミニヌクレオソームの実際の構造を表すことを意図するものではない。 パネルＡ及びパネルＢを含む。パネルＡは、リジン残基にて、パネルＢに示される１０ｋＤａＰＥＧで修飾されたミニヌクレオソームコアタンパク質が、ＤＮＡ分子との縮合反応を受けて、負荷ミニヌクレオソームを産生することができる方法の概略図の呈示である。各核酸分子は、ＤＮＡ中の負電荷を中和して負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質を形成するために、いくつかの（１～１０００）ミニヌクレオソームコアタンパク質を必要とし得る。概略図は、漫画図としてのみ意図され、負荷ミニヌクレオソームがコアタンパク質に関連する核酸を含む範囲を除き、負荷ミニヌクレオソームの実際の構造を表すことを意図するものではない。 パネルＡ、Ｂ、及びＣを含む一連の画像であり、これらの各々は、負荷ミニヌクレオソームの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）からの画像を提示する。 Ｅｌｉｓａによって測定した発現された第８因子タンパク質の濃度を示すグラフである。 パネルＡ、Ｂ、及びＣを含む一連の画像であり、これらの各々が、肝臓組織における、負荷ミニヌクレオソームに存在する核酸によってコードされるタンパク質の遺伝子発現を示す蛍光顕微鏡画像である。 パネルＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤを含む一連の画像であり、これらの各々が、マウスＲＰＥ組織における、負荷ミニヌクレオソームに存在する核酸によってコードされるタンパク質の遺伝子発現を示す蛍光顕微鏡画像である。パネルＡはＲＰＥ特異的発現を示す網膜切片である。パネルＢは、ＲＰＥ特異的発現を実証するＲＰＥ全載標本である。パネルＢ及びＤは、それぞれ、網膜切片及びＲＰＥ全載標本の未処理対照試料を表す。 パネルＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤを含む一連の画像であり、これらの各々が、ラット網膜組織における、負荷ミニヌクレオソームに存在する核酸によってコードされるタンパク質の遺伝子発現を示す蛍光顕微鏡画像である。パネルＡ及びＣは、ＲＰＥ特異的発現を実証する網膜切片であり、パネルＢ及びＤは、プラスミド注入対照試料を提示する。 パネルＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを含む一連の画像であり、これらの各々が、マウス網膜組織における、負荷ミニヌクレオソームに存在する核酸によってコードされるタンパク質の遺伝子発現を示す蛍光顕微鏡画像である。パネルＡは網膜ニューロンにおけるＧＦＰ発現を実証する網膜切片である。パネルＣは網膜光受容体におけるＧＦＰ発現を実証する網膜全載標本である。パネルＢ及びＤはそれぞれ、網膜切片及びＲＰＥ全載標本の未処理対照試料を表す。 パネルＡ、Ｂ及びＣを含む一連の画像であり、これらの各々が、マウス肺における、負荷ミニヌクレオソームに存在する核酸によってコードされるタンパク質の遺伝子発現を示す蛍光顕微鏡画像である。パネルＡは肺胞及び細気管支におけるＧＦＰ発現を示す。パネルＢは、ＣＦＴＲ染色を示す。パネルＣは、ＧＦＰ及びＣＦＴＲ染色の共局在化を実証するパネルＡ及びＢの併合である。 パネルＡ、Ｂ及びＣを含む一連の画像であり、これらの各々が、マウス肺上皮における、負荷ミニヌクレオソームに存在する核酸によってコードされるタンパク質の遺伝子発現を示す、より高倍率での蛍光顕微鏡画像である。パネルＡは肺胞及び細気管支におけるＧＦＰ発現を示す。パネルＢは、ＣＦＴＲ染色を示す。パネルＣは、ＧＦＰ及びＤＡＰＩ染色を含むＣＦＴＲの共局在化を実証するＡ及びＢの併合である。 マウス全肺組織における、負荷ミニヌクレオソームに存在する核酸によってコードされるタンパク質の遺伝子発現を示す一連の画像である。 マウス脳、腸及び膵臓組織における、負荷ミニヌクレオソームに存在する核酸によってコードされるタンパク質の遺伝子発現を示す、パネルＡ、Ｂ及びＣを含む一連の画像である。パネルＡは嗅覚ニューロンにおける発現パターンを示す。パネルＢ及びその下の挿入図は、小腸における発現パターンを示す。パネルＣとその下の挿入図は、膵臓における発現パターンを示す。 マウス気管組織における、負荷ミニヌクレオソームに存在する核酸によってコードされるタンパク質の遺伝子発現を示す、パネルＡ、Ｂ、及びＣを含む一連の画像である。パネルＡは、気管上皮及び内気管筋におけるＧＦＰ発現を示す。パネルＢは、内及び外気管筋における発現におけるジストロフィン染色パターンを示す。パネルＣは、内気管筋細胞におけるＧＦＰによるジストロフィン染色パターンの共局在化を実証するパネルＡ及びＢの併合である。 マウス筋肉組織における、負荷ミニヌクレオソームに存在する核酸によってコードされるタンパク質の遺伝子発現を示す、パネルＡ、Ｂ、及びＣを含む一連の画像である。パネルＡは、マウス筋肉細胞におけるＧＦＰ発現を示す。パネルＢは、マウス筋肉細胞における発現におけるジストロフィン染色パターンを示す。パネルＣは、マウス筋肉細胞におけるＧＦＰによるジストロフィン染色パターンの共局在化を実証するパネルＡ及びＢの併合である。 第１の用量及び第２の用量後にＥｌｉｓａによって測定された発現された第８因子タンパク質の濃度の増加を示すグラフであり、中和効果の欠如、または言い換えれば中和抗体活性の欠如を示唆する。
本開示は、とりわけ、ミニヌクレオソームコアタンパク質及びその使用に関する方法及び組成物を提供する。本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質には、とりわけ、（ａ）核酸結合ドメイン（ＮＡＢＤ）、（ｂ）標的化ドメイン、及び／または（ｃ）核酸放出ドメイン、及び／またはもしくは安定性ドメイン、及び／またはオリゴマー化ドメイン、及び／またはリンカードメインが含まれる。様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、１つ以上の核酸分子と会合して、負荷ミニヌクレオソームを形成する。様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、２つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質及び１つ以上の核酸分子を含む。様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、それを必要とする対象に投与される。
ポリヌクレオチド鎖は、典型的には、負電荷を有するリン酸塩を担持する。したがって、ヒストン等のタンパク質中の正電荷は、核酸を縮合するのに役立つ。本開示は、例えば、ヒストンに由来する核酸結合ドメインが、非ウイルス性タンパク質ベクターとして人工的に構築されたミニヌクレオソームコアタンパク質において利用され得ることを理解する。
ほとんどの哺乳類細胞は、ウイルス及び細菌のような分子または実体を認識（及び／またはそれらにより認識される）、結合、及び内在化する細胞表面結合部分または受容体を有する。本明細書に開示される様々な組成物及び方法は、そのような細胞表面結合モチーフを、ミニヌクレオソームコアタンパク質における核酸結合ドメイン及びポリアルギニンドメインと組み合わせて使用する。様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、１つ以上の核酸を縮合することができるか、または１つ以上の核酸の縮合に関与することができるか、または縮合を促進することができる。様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、例えば、負荷ミニヌクレオソーム内の関連する核酸の、特定の細胞型への、例えば、エンドサイトーシスを介して、または他の細胞侵入機構を介して内在化を促進する。したがって、様々な実施形態では、本開示は、細胞表面部分または受容体が細胞侵入機構を提供する、系、例えば、ヒトである系の細胞上に自然に存在する細胞表面部分または受容体と結合することができる標的化部分を組み込むミニヌクレオソームコアタンパク質を含む。様々な事例では、細胞表面部分または受容体は細胞型特異的であり、したがって、選択された細胞型への核酸の特異的送達を容易にする。
核酸分子は大きな負電荷を含有し、体液中の分解に脆弱であり、単純な注射または細胞への曝露を介して細胞に入ることはできない。その大きな負電荷は、ミニヌクレオソームコアタンパク質によって中和され、受動拡散または能動輸送によって細胞への侵入を可能にする特定の形状、サイズ、及び電荷の負荷ミニヌクレオソームを形成することができる。本明細書に記載される様々なミニヌクレオソームコアタンパク質は、核酸の適切な結合、縮合、及び標的化を可能にする。本明細書に記載のこれらのドメインは、ヒトタンパク質または他の生物に由来し得る。当業者であれば、細胞付着、内在化などの特定の機能を増強するためのアミノ酸配列を変更して、本明細書に記載のドメインを修飾または操作することを企図することができるが、これらに限定されない。当業者はまた、ドメインを逆配列に配置すること、またはドメイン内のアミノ酸位置を入れ替えること、またはこれらに限定されないが、アミノ酸にアセチル化、糖化などの様々な翻訳後修飾を追加することによっても企図することができる。
核酸結合ドメイン
本開示は、正荷電ドメインが核酸と会合するという認識を含む。本開示は、ミニヌクレオソームコアタンパク質に含まれ得る核酸結合ドメイン、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ結合ドメインを提供する。いくつかの事例では、ミニヌクレオソームコアタンパク質に存在するＤＮＡ結合ドメインは、本明細書に開示されるＤＮＡ結合ドメインである。いくつかの事例では、ミニヌクレオソームコアタンパク質に存在するＲＮＡ結合ドメインは、本明細書に開示されるＲＮＡ結合ドメインである。
いくつかの特定の事例では、本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質に存在するＤＮＡ結合ドメインであるＮＡＢＤは、ヒストンポリペプチド配列に由来し得る。遺伝子送達のためにＤＮＡをより小さな粒子にコンパクト化するためにポリリジンペプチドを利用するＤＮＡナノ粒子等の非ウイルスベクター（Ｌｉｕ Ｇ．ｅｔ ａｌ，２００３）が使用されており、少なくともいくつかの事例では、疾患の治療において成功または有意な応答はない（Ｋｏｎｓｔａｎ Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ，２００４）。本開示は、様々な実施形態において、ヒストンのＤＮＡ結合ドメイン、例えばアミノ酸配列ＫＲＨＲＫの使用を含む、著しく異なるアプローチを提供する。このアミノ酸配列は、２つの目的を果たし、第１に、核酸と会合するのに必要な強い正電荷を与えること、第２に、ミニヌクレオソームコアタンパク質構造にも安定性を与えることである。第３に、このＮＡＢＤ中のアミノ酸配列ＫＲＨは、プロタンパク質転換酵素の切断部位でもあるため、細胞内の遺伝子カーゴの効率的な放出を可能にする。
ＮＡＢＤの他の例を表３に提供する。
ＲＲＲＲＲ等のポリアルギニントラクトをミニヌクレオソームコアタンパク質に含めることにより、核酸結合を増加させるとともに、組成物の正電荷及び／または細胞浸透能力を増強することができる。ポリアルギニントラクトは、ミニヌクレオソームコアタンパク質による、及び／またはミニヌクレオソームコアタンパク質を含む負荷ミニヌクレオソームによる細胞の浸透を促進するのに好適な位置で、ミニヌクレオソームコアタンパク質に存在し得る。当業者であれば、そのような位置の決定を可能にする方法及び技術を認識するであろう。アルギニンは、リン脂質と相互作用して、２つ以上の脂質頭部のリン酸塩と同時に会合することから、二座または多座水素結合を形成するため、単一の脂質頭部基上のリン酸塩と相互作用する。アルギニンのみが二座水素結合を形成することができるため、ポリアルギニンはより多くの双性イオン性及び陰イオン性脂質と結合し得、したがってその輪郭長に沿って正曲率を生成し、したがって負のガウス曲率をもたらす（Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．２００５）。ポリアルギニントラクトはまた、ミニヌクレオソームコアタンパク質の安定性を改善するために、特異的に１つ以上のヒスチジン（Ｈ）アミノ酸（または任意の他のアミノ酸）を含むように修飾され得る。ヒスチジン（または任意の他のアミノ酸）は、表３に示すように、ポリアルギニントラクトの任意の位置に挿入され得る。ＡＮＴＰペネトラチン、及びＴＡＴ等の他のアルギニンに富むペプチドもまた、細胞浸透に同様の影響を示している。
本開示は、ミニヌクレオソームコアタンパク質の核のユークロマチン領域への局在化が、ミニヌクレオソームコアタンパク質中のリジンのアセチル化によって促進され得るという認識を含む。この安定化の機構は、少なくとも部分的に、翻訳後修飾されたヒストンを安定化させる機構に関連し得る。メチル化ヒストンはより密に詰まる。ヒストンメチル化は、動的であり得る。適用され得る他の翻訳後修飾は、リン酸化、グリコシル化、プレニル化、リポイル化、アルキル化、アシル化、糖化、ニトロシル化、硫酸化、カルバミル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ＮＥＤＤ化、ビオチン化、リボシル化等である。修飾は、本明細書で言及したものに限定されるものではない。他の修飾は、補因子、補酵素、疎水性基、親水性基、より小さい化学基、より小さいペプチド等の付着を含み得る。かかる修飾は、本明細書に記載のこれらのミニヌクレオソームコアタンパク質中のアミノ酸にも適用され得る。本明細書で言及される、表３の核酸結合ドメインは、表４、５、６、７、９、１０、１１、及び１２に提供される他のドメインと組み合わせて、核酸結合を強化するために、任意の位置でポリペプチドに組み込むことができる。
Figure 2022512977000004
Figure 2022512977000005
標的化ドメイン
本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質としては、ミニヌクレオソームを１つ以上の細胞または細胞型に標的化する標的ドメインが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質の標的ドメインは、１つ以上の細胞または細胞型への付着を可能にし、１つ以上の細胞または細胞型に侵入するアミノ酸ドメインである。標的化ドメインは、特定の細胞型に特異的であり得るが、一般的に細胞への侵入を容易にするドメインも含み得ることが理解されるべきである。一般に、ミニヌクレオソームコアタンパク質の標的化ドメインは、付着、細胞型特異的結合、及び内在化のうちの１つ以上に寄与し得る。標的ドメインは、例えば、細胞付着ドメイン、βガラクトース結合ドメイン、フコース結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、シアル酸結合ドメイン、糖タンパク質結合ドメイン、炭水化物結合ドメイン、リゾホスファチジン酸結合ドメイン、ｃＡＭＰ結合ドメイン、ヒアルロナン結合ドメイン、コンドロイチン硫酸結合ドメイン、インテグリン結合ドメイン、ヌクレオリン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、クラスリン結合ドメイン、Ｆｃ受容体結合ドメイン、アクチン結合ドメイン、エンドサイトーシスモチーフ、または核局在化シグナルであり得る。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質の標的ドメインは、１つ以上の細胞または細胞型への結合及び侵入を可能にし、哺乳動物、ウイルス、ウイルス粒子、プリオン、細菌、または真菌のアミノ酸配列に由来するアミノ酸ドメインである。
細胞付着標的ドメイン：
細胞付着は、ミニヌクレオソームコアタンパク質、または負荷ミニヌクレオソームがミニヌクレオソームコアタンパク質を含み、細胞に付着し、様々な事例では、細胞への侵入を促進することができる手段である。様々なウイルスは、宿主細胞への結合を可能にし、それらへの侵入を強化する付着分子またはドメインを有する。例えば、インフルエンザウイルスは、細胞表面上のシアル酸に結合することを可能にする血球凝集素をその表面上に有する。本開示は、とりわけ、シアル酸、ガラクトース、フコース、ヒアルロン酸、及び硫酸コンドロイチンへのミニヌクレオソームコアタンパク質の結合を可能にするいくつかのかかるドメイン、ならびに内在化のための細胞付着を強化する糖タンパク質を提供する。本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質は、１つ以上の細胞付着標的ドメインを含み得る。細胞付着標的ドメインとしては、表４に示すドメインが挙げられる。本開示の細胞付着ドメインは、任意の位置で、及び／または本明細書、例えば、表３、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２で提供する、１つ以上の他のドメインのうちのいずれかと組み合わせて、ミニヌクレオソームコアタンパク質中に存在することができる。
Figure 2022512977000006
Figure 2022512977000007
細胞付着はまた、ＲＧＤ、ＲＧＤＳなどのドメインによって達成され得る（Ｄ’Ｓｏｕｚａ ＳＥ ｅｔ ａｌ，１９９１）。インテグリン、ヌクレオリン、コラーゲン、クラスリン、Ｆｃ受容体等の細胞表面タンパク質への結合も、ウイルス及び他の粒子が細胞に侵入するのを助ける。本開示は、とりわけ、細胞取り込みを増加させるためのインテグリン、ヌクレオリン、コラーゲン、クラスリン、Ｆｃ受容体としての結合を可能にするドメインを提供する。細胞付着ドメインとしては、表５に示すドメインが挙げられる。表５に提供される細胞付着ドメインは、任意の位置で、及び／または本明細書例えば、表３、４、６、７、８、９、１０、１１、及び１２で提供する１つ以上の他のドメインのうちのいずれかと組み合わせて、ミニヌクレオソームコアタンパク質中に存在することができる。
Figure 2022512977000008
Figure 2022512977000009
内在化標的化ドメイン：
ウイルス及び哺乳類タンパク質におけるある特定のドメインは、細胞内在化に直接影響を及ぼし得る。例えば、ある特定のタンパク質のドメイン及び連続配列は、Ｏｌｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８に記載されている。例えば、ＰＰｘＹ－モチーフは、アデノウイルスの細胞への侵入に必要である（Ｗｏｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ，２０１０）（ｘは任意のアミノ酸であり得る）。内在化標的化ドメインの別の例は、黄体形成ホルモン（ＬＨ）受容体のカルボキシル末端テールにおいて、リガンド－受容体複合体を分解経路からリサイクル経路に誘導するＧＴＡＬＬモチーフ－５－アミノ酸残基ドメインである（Ｐａｎｄｅｙ，２００９）。ＧＴＡＬＬモチーフはまた、βアドレナリン受容体の内在化に関与することが示唆されているカルボキシル末端テトラペプチド配列モチーフＤＳＬＬとの配列相同性を示す。Ｐａｎｄｅｙはまた、クラスリン依存性カーゴが通常、アダプタータンパク質－２（ＡＰ－２）によって認識される、ＹＸＸＱ（ここでＸは任意のアミノ酸であり得る）などの短い配列モチーフを含み、アクセサリークラスリンアダプタータンパク質によって認識されるＡｓｎ－Ｐｒｏ－Ｘ－Ｔｙｒ配列（ＮＰＸＹ）モチーフを含み得ることについても考察する。トランスフェリン。ＮＰＸＹモチーフは、Ｋｉｒｃｈｈａｕｓｅｎ，１９９９によっても論じられている。ＮＰＴＹはまた、ＡＰＰのエンドサイトーシスモチーフである。内在化を可能にするクラスリン結合ドメインの別の例は、ＦＸＤＸＦ（Ｘは任意のアミノ酸であり得る）である（Ｌｅｎｅ Ｅ．Ｏｌｅｓｏｎ．２００８）。内在化標的化ドメインとしては、表６に提供されるドメインが挙げられる。
本開示によって提供される他の特徴は、１つ以上のロイシン及びイソロイシン残基を含み、これらの残基は、本質的に疎水性が高い。実際、ロイシンは、２番目に疎水性の高いアミノ酸である。様々な実施形態では、ロイシン残基は、ミニヌクレオソームコアタンパク質の組成物において複数の機能を果たすことができる。第１に、両親媒性分子の非極性面の疎水性は、ペプチド二次構造の安定化に重要な役割を果たす（Ｃｈｅｎ Ｙ．ｅｔ ａｌ，２００７）。第２に、ジロイシン型シグナルモチーフは、膜受容体及び膜タンパク質の細胞内区画への内在化及び輸送に不可欠であることが示されている。例えば、ＧＬＵＴ４（グルコース輸送体４）、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）、ＬＨ（黄体形成ホルモン）、ＴＧＮ（トランスゴルジ網）はすべて、細胞への内在化を助けるジロイシンモチーフを有する。Ｆｃ受容体ジロイシンモチーフもまた、エンドサイトーシスをシグナル伝達する（Ｗｕ Ｚ．ａｎｄ Ｓｉｍｉｓｔｅｒ Ｎ．Ｅ．，２００１）。表４に提供される内在化標的化ドメインは、任意の位置で、及び／または本明細書で例えば、表３、４、５、７、８、９、１０、１１、及び１２で、提供する１つ以上の他のドメインのうちのいずれかと組み合わせて、ミニヌクレオソームコアタンパク質中に存在することができる。
Figure 2022512977000010
Figure 2022512977000011
核標的化ドメイン。
様々な実施形態では、細胞侵入後、核酸カーゴが核に到達することが重要である。核内在化シグナルまたは核内移行機構への結合は、核局在化の鍵である。機能的な真核生物の核局在化シグナルは、バクテリオファージの末端タンパク質において広く存在する（Ｒｅｄｒｅｊｏ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ．ａｌ，２０１２）。ＣｈａｎとＪａｎｓは、ポリリジン自体が核局在化シグナルとして機能しないことを示している。したがって、非ウイルス遺伝子導入を強化するために核標的化シグナルを追加することは、論理的アプローチである（Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｊａｎｓ，１９９９）。ポリペプチド中のＮＬＳの位置も、その機能の鍵である。我々は、強化された核侵入のためのＮＬＳ配列を表７に列挙し、最も効率的な核侵入のためのＮＬＳシグナルの最適な位置を表１３に提供した。表７で、本明細書で言及される核酸結合ドメインは、任意の位置でミニヌクレオソームコアタンパク質に組み込まれて、表３、４、５、６、８、９、１０、１１、及び１２に提供される他のドメインと組み合わせて、核酸結合を強化することができる。
Figure 2022512977000012
Figure 2022512977000013
細胞型特異的標的化ドメイン：
様々な実施形態では、より高濃度の粒子が所望の細胞型に帰還することが最も望ましい。これは、増加した取り込み及び増加した発現－２つの好ましい遺伝子治療結果を可能にする。文献では、そのような特性のために発見されたモチーフはほとんどない。これらのほとんどは、ウイルス親和性が異なるキャプシドで異なることを示す実験に由来する。本開示は、様々な実施形態において、ニューロン、筋肉、肝臓、肺、腎臓、内皮細胞または腫瘍部位における発現を増強するための、それらの定義されたモチーフのいくつかの使用を含む。細胞型特異的標的化ドメインとしては、表８に示すドメインが挙げられる。表８の細胞型特異的標的化ドメインは、任意の位置で、及び／または本明細書例えば、表３、４、５、６、７、９、１０、１１、及び１２で提供する１つ以上の他のモチーフのうちのいずれかと組み合わせて、ミニヌクレオソームコアタンパク質中に存在することができる。
Figure 2022512977000014
Figure 2022512977000015
核酸放出ドメイン：
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームの「核酸放出ドメイン」（「ＮＡＲＤ」）は、細胞核への放出及び侵入を可能にするアミノ酸ドメインである。
粒子が細胞に侵入する前に放出されないことが非常に望ましい。細胞において、細胞質または核における核酸カーゴの放出が好ましい場合がある。細胞内での放出を補助し得るプロテアーゼ及びエンドペプチダーゼが存在する。プロタンパク質変換酵素及びエンドペプチダーゼは、ある特定のアミノ酸ドメインで切断され、そのような現象は、一旦細胞または核内に入ると核酸カーゴを放出することができるミニヌクレオソームコアタンパク質を設計するためにここで利用されている。ＫＲＨは、Ｐｃｓｋ１及びＰｃｓｋ２の切断部位である。プログルカゴンは、Ｐｃｓｋ１またはＰｃｓｋ２によって膵臓Ａ細胞及び腸細胞において組織特異的な様式で翻訳後処理される。ＮＲＲＫＫＲＡＬは、ＴＧＦＢ１のフューリン切断部位である。ＫＳＶＫＫＲＳＶＳＥＩＱは副甲状腺ホルモンのフューリン切断部位である。切断部位はまた、Ｅｘｐａｓｙ、ＯｍｉｃＸ、ＰＲＯＳＰＥＲｏｕｓ、Ｐｒｏｐ１．０、ＳｉｇｎａｌＰ－５．０、ＭＥＲＯＰＳ、ＣｕｔＤＢ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｕｔｔｅｒ等のバイオインフォマティクスプラットフォームを使用してインシリコで予測することができる。細胞質または核中のＤＮＡ放出するために粒子を放出するため、これらの切断部位を組み込む方法の例を提供する。表９において、本明細書に言及されるドメインは、任意の位置でミニヌクレオソームコアタンパク質に組み込まれて、表３、４、５、６、７、８、１０、１１、及び１２に言及される他のドメインと組み合わせて、核酸放出を強化することができる。
Figure 2022512977000016
Figure 2022512977000017
安定性ドメイン：
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームの「安定性ドメイン」は、負荷ミニヌクレオソームが体液、細胞質、及び核内で安定した状態を維持できるようにするアミノ酸ドメインである。
粒子の安定性は、細胞への安全な通過及び発現の長寿命にとって重要である。粒子が安定性を失ういくつかの理由がある。第１に、粒子は、血液及びその他の体液中で安定している必要がある。第２に、粒子は、エンドソームの侵入を安全に横切って、安全に脱出して細胞質にそれを出す必要がある。ウイルス粒子またはリサイクル受容体は、いくつかのドメインを使用してエンドソームに侵入し、エンドソームから脱出する。安定性を高めるためにエンドソーム侵入及び脱出ドメインを組み込むミニヌクレオソームコアタンパク質の例を提供する。表１０で、本明細書で言及されるドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質に、好ましくはＣ末端で組み込むことができるが、表３、４、５、６、７、８、９、１１、及び１２に提供される他のドメインと組み合わせる場合、任意の位置でも組み込まれて、ミニヌクレオソームコアタンパク質の安定性を高めることができる。当業者はまた、ペプチド中の疎水性アミノ酸のフッ素化を企図して、タンパク質安定性を高め、アセンブリを強化する等の手段を提供し、リガンド－受容体相互作用を強化することができる。当業者はまた、ペプチド中のアミノ酸に対する他の翻訳後修飾も企図して、タンパク質安定性を高め、アセンブリを強化する等の手段を提供し、リガンド－受容体相互作用を強化することができる。
Figure 2022512977000018
オリゴマー化ドメイン：
オリゴマー化は、モノマーが会合して二量体及び高次巨大分子複合体を含む多量体を形成する化学的プロセスである。タンパク質性分子のオリゴマー化は、モノマーの会合を促進するドメインによって促進されることが多い。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームの「オリゴマー化ドメイン」は、ミニヌクレオソームコアタンパク質または負荷ミニヌクレオソームがホモ二量体、ヘテロ二量体、四量体、八量体、または他の高次構造などの高次構造で会合することを可能にするアミノ酸ドメインである。オリゴマー化は、負荷ミニヌクレオソームのサイズを減少させ得る。ミニヌクレオソームコアタンパク質の多量体は、同じミニヌクレオソームコアタンパク質（例えば、同じアミノ酸配列を有する２つのミニヌクレオソームコアタンパク質）のうちの２つ以上を含むことができ、及び／または２つ以上の異なるミニヌクレオソームコアタンパク質（例えば、異なるアミノ酸配列を有する２つのミニヌクレオソームコアタンパク質）を含むことができる。本明細書に提供されるオリゴマー化ドメインの例は、決して限定されず、当業者は、かかるドメインが、酵母－ツーハイブリッドスクリーニング、質量分析に結合された親和性精製、テキストマイニングを含む様々な方法によって、または人工知能及び機械学習の適用によって、認識または識別され得ることを理解することができる。当業者はまた、誘導性ホモ二量体化系及び／または化学的に誘導された二量体化を使用して負荷ミニヌクレオソームを形成する誘導性系を作成することができる。
いくつかの実施形態において、オリゴマー化ドメインは、３つ以上のアミノ酸を含み得る。本明細書で、例えば、表１１に開示されるオリゴマー化ドメインは、例えば本明細書、例えば、表３、４、５、６、７、８、９，１０、及び１２で提供される他のドメインと組み合わせて、ミニヌクレオソームコアタンパク質の任意の位置でミニヌクレオソームコアタンパク質に組み込むことができる。特定の実施形態では、オリゴマー化ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のＣ末端に配置される。
Figure 2022512977000019
リンカー：
融合タンパク質を作製する技術分野では、タンパク質は、いくつかの例では、リンカーを含めることから利益を得ることができることが知られている。本開示は、例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質の２つのドメイン間に１つ以上のリンカーを含むミニヌクレオソームコアタンパク質を含む。リンカーは、タンパク質構造の安定性に寄与し得る。いくつかの場合には、リンカーは、ドメイン間の分離として機能し、他の場合には、それらは、タンパク質の機能に直接影響を及ぼし得る。いくつかのリンカーは剛性を増加させるため、タンパク質ドメインの効果的な分離を可能にする。リンカーはまた、切断部位を導入するために実装され得る。リンカーは、これらの理由のためにタンパク質工学の分野で使用されている。しかしながら、非ウイルス遺伝子導入の関連では、この戦略は利用されていない。本明細書では、リンカーをうまく使用して、所望の細胞型における選択的形質導入、遺伝子送達及び導入遺伝子発現等の機能目的のためにドメインを操作できることを示す（図１０）。
いくつかの実施形態では、リンカー配列は、１つ以上のアミノ酸を含んでいてもよい。本明細書に開示される例えば、表１２に開示されるリンカーアミノ酸配列は、配列番号２３８～３３５に示されるドメイン間のミニヌクレオソームコアタンパク質に組み込むことができ、リンカーは、表１及び表１２に提供されるアミノ酸またはアミノ酸配列のうちのいずれかを有するリンカーであり得る。リンカーは、表１２に提供されるものに限定されない他のアミノ酸配列を含有し得る。リンカー配列はまた、ユーザが選択した入力を使用してリンカー配列のデータベースを検索し、基準に適合するリンカー配列の出力を生成するＬＩＮＫＥＲと呼ばれるプログラムを介して生成することもできる。トレオニン、セリン、グリシン、プロリン、アルギニン、及びアラニンは、天然リンカー、したがって、ミニヌクレオソームコアタンパク質において好ましい残基である。
Figure 2022512977000020
Figure 2022512977000021
Figure 2022512977000022
ミニヌクレオソームコアタンパク質
ミニヌクレオソームコアタンパク質は、本明細書で提供される１つ以上のドメインを含み得る。
本明細書に開示されるミニヌクレオソームタンパク質は、核酸結合ドメイン、標的化ドメイン、及び／または核酸放出ドメイン、及び／または安定性ドメインを含有する、少なくとも正荷電アミノ酸配列を含む。ミニヌクレオソームコアタンパク質は、例えば、配列番号３３６～３８７のいずれかに記載のミニヌクレオソームコアタンパク質と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列であり得る。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、１０～１００個のアミノ酸のアミノ酸配列長を含み得る。アミノ酸は、例えば、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、５５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、例えば、１５～９０アミノ酸、２０～８０アミノ酸、２０～７０アミノ酸、２０～６０アミノ酸、または３０～４０アミノ酸の長さを有し得る。
ある特定の実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、本明細書に開示される１つ以上のドメインと、本明細書に開示されるドメインに存在しない１つ以上のアミノ酸とを含む。ある特定の事例では、本明細書に開示されるドメインのＮ末端またはＣ末端にある本明細書に開示されるドメインに存在しない、アミノ酸は、「隣接アミノ酸」と称され得、本明細書に開示される任意のドメインに存在しない、ミニヌクレオソームに存在する全てのアミノ酸の全体は、「非ドメインアミノ酸」と称され得る。
様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質の非ドメインアミノ酸は、ミニヌクレオソームコアタンパク質の電荷に寄与する配列を有し得る。様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質の非ドメインアミノ酸は、少なくとも１０％の正荷電アミノ酸、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％の正荷電アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ｐＨ７では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、１０～１００の間の全正電荷を有し得る。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、アミノ酸配列の任意の位置に配置された１つ以上の核酸結合ドメインを含有し得る。場合によっては、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、核酸結合ドメインのみを含有し得る。場合によっては、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、核酸結合ドメイン及びポリアルギニンドメインを含有し得る。場合によっては、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、核酸結合ドメイン及び標的化ドメインを含有し得る。場合によっては、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、ポリアルギニンドメイン及び標的化ドメインのみを含有し得る。場合によっては、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、ポリアルギニンドメイン、核酸放出ドメイン、及び標的化ドメインのみを含有し得る。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、アミノ酸配列の任意の位置に配置された１つ以上のポリアルギニンを含有していてもよい。ポリアルギニン配列は、４～３０個のアルギニンを含有し得る。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、１つ以上の標的化ドメインを含有し得る。標的化ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ酸配列の任意の位置に配置され得る。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、１つ以上の核酸放出ドメインを含有し得る。好ましくは、核酸放出ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ酸配列の中央に配置される。好ましくは、核酸放出ドメインは、Ｎ末端からの６個のアミノ酸の後、またはＣ末端からの６個のアミノ酸の前に配置される。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、１つ以上の安定性ドメインを含有し得る。好ましくは、安定ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ酸配列のＣ末端に配置される。場合によっては、安定性ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端に配置される。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、１つ以上のオリゴマー化ドメインを含み得る。ある特定の実施形態では、オリゴマー化ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ酸配列のＣ末端に配置される。場合によっては、オリゴマー化ドメインは、ミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端に配置される。
したがって、疑義を避けるために、本明細書に記載のミニヌクレオソームコアタンパク質は、（ａ）核酸結合ドメイン（ＮＡＢＤ）、及び（ｂ）標的化ドメインを含み得る。当業者であれば、これらの成分を含むポリペプチドが、本明細書に開示されるミニヌクレオソームコアタンパク質を構成し、任意選択で、本明細書に記載の追加の制限を受け、及び／または限定されないが、本明細書で提供される、または別様に当該技術分野で既知の、１つ以上のさらなるドメインを含むことを本開示から理解するであろう。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号１～２８うちのいずれかに記載の核酸結合ドメイン（例えば、表３に記載の核酸結合ドメイン）と少なくとも６５％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、及び／または、２つ以下のアミノ酸変化（例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換）または１つ以下のアミノ酸変化により、配列番号１～２８のうちのいずれかに記載の核酸結合ドメインと異なる、核酸結合ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号２９～５３のうちのいずれかに記載の細胞付着標的化ドメイン（例えば、表４に記載の細胞付着標的化ドメイン）と少なくとも６５％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、及び／または２つ以下のアミノ酸変化（例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換）または１つ以下のアミノ酸変化により、配列番号２９～５３のうちのいずれかに記載の細胞付着標的化ドメインと異なる、細胞付着標的化ドメインである標的化ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号５４～８１うちのいずれかに記載の細胞付着標的化ドメイン（例えば、表５に記載の細胞付着標的化ドメイン）と少なくとも６５％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、及び／または２つ以下のアミノ酸変化（例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換）または１つ以下のアミノ酸変化により、配列番号５４～８１うちのいずれかに記載の細胞付着標的化ドメインと異なる、細胞付着標的化ドメインである標的化ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号８２～１１５うちのいずれかに記載の内在化標的化ドメイン（例えば、表６に記載の内在化標的化ドメイン）と少なくとも６５％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、及び／または２つ以下のアミノ酸変化（例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換）または１つ以下のアミノ酸変化により、配列番号８２～１１５のうちのいずれかに記載の内部化標的化ドメインと異なる、内在化標的化ドメインである標的化ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号１１６～１３９のうちのいずれかに記載の核標的化ドメイン（例えば、表７に記載の核標的化ドメイン）と少なくとも６５％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、及び／または２つ以下のアミノ酸変化（例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換）または１つ以下のアミノ酸変化により、配列番号１１６～１３９のうちのいずれかに記載の核標的化ドメインと異なる、核標的化ドメインである標的化ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号１４０～１６４のうちのいずれかに記載の細胞型特異的標的化ドメイン（例えば、表８に記載の細胞型特異的標的化ドメイン）と少なくとも６５％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、及び／または２つ以下のアミノ酸変化（例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換）または１つ以下のアミノ酸変化により、配列番号１４０～１６４のうちのいずれかに記載の細胞型特異的標的化ドメインと異なる、細胞型特異的標的化ドメインである標的化ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号１６５～２０８のうちのいずれかに記載の核酸放出ドメイン（例えば、表９に記載の核酸放出ドメイン）と少なくとも６５％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、及び／または２つ以下のアミノ酸変化（例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換）または１つ以下のアミノ酸変化により、配列番号１６５～２０８のうちのいずれかに記載の核酸放出ドメインと異なる、核酸放出ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号２０９～２１９のうちのいずれかに記載の安定性ドメイン（例えば、表１０に記載の安定性ドメイン）と少なくとも６５％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、及び／または２つ以下のアミノ酸変化（例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換）または１つ以下のアミノ酸変化により、配列番号２０９～２１９のうちのいずれかに記載の安定性ドメインと異なる、安定性ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号２２０～２３７のうちのいずれかに記載のオリゴマー化ドメイン（例えば、表１１に記載のオリゴマー化ドメイン）と少なくとも６５％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、及び／または２つ以下のアミノ酸変化（例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換）または１つ以下のアミノ酸変化により、配列番号２２０～２３７のうちのいずれかに記載のオリゴマー化ドメインと異なる、オリゴマー化ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、配列番号２３８～３３５のうちのいずれかに記載のリンカードメイン（例えば、表１２に記載のリンカードメイン）と少なくとも６５％の配列同一性、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、及び／または２つ以下のアミノ酸変化（例えば、欠失、付加、もしくは置換、例えば、保存的置換）または１つ以下のアミノ酸変化により、配列番号２３８～３３５のうちのいずれかに記載のリンカードメインと異なる、リンカードメインを含むことができる。
ミニヌクレオソームコアタンパク質のドメインが本明細書に提供される、当業者は、本明細書に提供されるように、または他の方法で当業者によって本開示から理解されるように、任意の順序、配向、または配列で配置することができる。例えば、当業者は、例えば、本明細書に具体的に開示されていない１つ以上の介在するアミノ酸を有するか否かにかかわらず、個別に、または任意の対のドメイン間でもしくは任意のドメインに隣接するタンデム型の複数に含まれ得る任意の配列として、リンカーの意図される使用を理解するであろう。したがって、例えば、ＮＡＢＤは、標的ドメインのＣ末端またはＮ末端であり得る。追加のＮＡＢＤまたは追加の標的化ドメインを含むがこれらに限定されない、本明細書に提供される追加のドメインは、ＮＡＢＤのＣ末端またはＮ末端、ならびに標的化ドメインのＣ末端またはＮ末端であり得る。さらに、リンカーを含むミニヌクレオソームコアタンパク質中に存在する各ドメインについて、１つ以上のリンカードメインは、ドメインのＣ末端またはドメインのＮ末端を含むことができる。例示的なミニヌクレオソームタンパク質が本明細書で提供される。本開示から当業者には容易に明らかになるように、本明細書に提供されるドメインはモジュラーであり、任意の順序でそれらの意図される機能とともに含めることができ、及び／またはそれによって、それらが存在する順序に関係なく、意図される有用性または機能性を有するミニヌクレオソームを提供する。
当業者であれば、本開示のミニヌクレオソームコアタンパク質は、当該技術分野で既知の任意の数または種類の修飾（例えば、翻訳後修飾）を含むことができることをさらに理解するであろう。そのような修飾には、ペグ化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化、ＳＵＭＯ化、アミド化、脂質化、及び／またはメチル化が挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態において、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、ペグ化され得る。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、ミニヌクレオソームコアタンパク質とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との会合によって修飾される。ＰＥＧは、非イオン性、非毒性、生体適合性、及び高度親水性ポリマーである。ＰＥＧは、主に、生物学的巨大分子及び表面の共有結合修飾に使用される。ＰＥＧコンジュゲーションは、ポリペプチドの見かけのサイズを増加させるため、腎濾過を減少させ、生体内分布を変化させる。ペプチドのペグ化は、それらの溶解度の増加（疎水性ペプチドの場合）、腎クリアランスの減少による半減期の延長、及び宿主における最小免疫応答のためのマスクされた抗原性によって、治療特性を強化することができる。様々なＰＥＧ鎖長のＰＥＧが、５～４０ｋＤａの範囲の分子量を有するＦＤＡの認可を受けた薬物で使用されている。図１、３、４、５、及び６において、様々なＰＥＧ鎖長のＰＥＧを利用して、様々なサイズのミニヌクレオソームコアタンパク質を提供する方法の概略図を示す。
現在の粒子の多くは、１０ｋＤａ以上のサイズのＰＥＧを使用するが、より大きなＰＥＧサイズを使用する欠点は、粒子サイズも増加することである。（Ｆｅｕｚ Ｌ．ｅｔ ａｌ．２００７）。本開示は、とりわけ、様々なサイズ、好ましくは直径２０ｎｍ未満のミニヌクレオソームを製剤化するために、様々なＰＥＧ長を有する粒子を提供する。図１において、１２鎖の最小ＰＥＧ長、及びそれを利用してミニヌクレオソームコアタンパク質中のアミノ酸を修飾することができる方法を示す。負荷ミニヌクレオソームの最終的なサイズは、ミニヌクレオソームコアタンパク質を修飾するために使用されるＰＥＧサイズにも依存する。図２は、ＰＥＧ１２を付着させることによって、ペプチドの分子量がそれに応じて増加するが、ペプチドの溶解度などの物理的特徴を変化させないことを示す。
いくつかの実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、１７００ｇ／ｍｏｌ～２００００ｇ／ｍｏｌの間の総分子量、例えば、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、１０５００、１１０００、１１５００、または２００００ｇ／ｍｏｌの総分子量を有することができる。様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、例えば、１００Ｋｄａ～１０，０００ｋＤａの間の総分子量、例えば、１００、２００、５００、１０００、２，０００、３０００、５０００、８０００、及び１００００ｋＤａの総分子量を有し得る。
アミノ酸配列は、逆または任意の順序で使用され得る。ドメイン内の１つまたは非必須アミノ酸を変更して、ドメインの同じ電荷または他の特性を得ることも考慮し得る。
Figure 2022512977000023
Figure 2022512977000024
Figure 2022512977000025
Figure 2022512977000026
核酸カーゴ
本明細書で開示された負荷ミニヌクレオソームは、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその核酸類似体である核酸カーゴで負荷され得る。核酸カーゴは、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸カーゴは、直鎖状であっても環状であってもよい。核酸カーゴは、タンパク質、ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗体、ナノボディ、ダーピン（Ｄａｒｐｉｎ）、アンキリンリピート、またはポリペプチドのそれぞれの１つ以上をコードすることができる。例えば、核酸カーゴは、少なくとも１つの機能的タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子であり得る。様々な実施形態において、核酸カーゴは、阻害性ＲＮＡ、例えば、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡであり得る。
核酸カーゴは、任意の細胞の核に送達されたときに、例えば、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、抗体、ナノボディ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９、非コードＲＮＡをコードすることができる。発現は、本明細書で言及される実体に限定されない場合がある。
負荷ミニヌクレオソーム
本開示の負荷ミニヌクレオソームは、本開示の１つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質と、１つ以上のポリヌクレオチドとを含み得る。当業者であれば、かかる負荷ミニヌクレオソームが、様々な方法でミニヌクレオソームコアタンパク質及びポリヌクレオチドを組み合わせることから生成され得ることを本開示から理解するであろう。当業者は、少なくとも１つの実施形態において、負荷ミニヌクレオソームアセンブリが、本明細書に提供される１つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質及び１つ以上のポリヌクレオチドを、溶液中、例えば、限定されないが、水溶液中に、例えば、標準温度で、例えば、標準速度でのボルテックスで、含めると、単純に生じることを理解するであろう。したがって、負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質を生成する方法は、本明細書に提供されるアプローチ及び当業者に明らかであろう他のアプローチを含む。当業者は、少なくとも１つの実施形態では、負荷ミニヌクレオソームアセンブリが、本明細書に提供される１つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質及び１つ以上のポリヌクレオチドを、溶液中、例えば、限定されないが、水溶液中に、例えば、核酸の縮合を強化するのに役立つ触媒の存在下で、標準温度で含めると生じることを理解するであろう。
本開示の負荷ミニヌクレオソームは、非縮合状態及び縮合状態にあり得る。負荷ミニヌクレオソームは、核酸分子の負電荷の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が中和された縮合状態にある。核酸分子中の負の電荷の９０％未満が中和されたとき、負荷ミニヌクレオソームは、縮合されていない状態と見なされる。特に明記されない限り、本開示におけるミニヌクレオソームへの言及は、少なくとも縮合及び非縮合状態、ならびに該当する場合、それらの特徴を包含する。
ミニヌクレオソームは、例えば、１～１０，０００個のミニヌクレオソームコアタンパク質を含み得る。ミニヌクレオソームは、例えば、１～１００個の核酸カーゴ分子を含み得る。
いくつかの実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、直径０．５～５０ナノメートルのサイズであり得る。ミニヌクレオソームは、０．５～５０ｎｍの小径を維持しながら、最大５０ｋｂの長さを有することができる核酸カーゴ分子を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１００～１００００ｋＤａの、例えば、１００、２００、５００、１０００、３０００、５，０００、８０００、１００００ｋＤａの分子量を有することができる。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、－１００～１００の正味電荷を有し得る。いくつかの実施形態では、負荷ミニヌクレオソーム製剤のゼータ電位は、－１０ミリボルト～１００ミリボルトの範囲であり得る。いくつかの例では、核酸カーゴ及びミニヌクレオソームコアタンパク質の複合体は、ミニヌクレオソーム粒子を構築するために使用される核酸分子及びポリペプチド分子と比較して最小サイズに縮合される。最終的な正電荷対負電荷比は、およそ１：１であり、それによって、無電荷、わずかに正電荷、またはわずかに負電荷の分子を形成する。最終粒子は、棹状、球状または円形を含むいくつかの形状で形成され得るが、これらに限定されない。
様々な実施形態では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、５ダルトン～２０ｋＤａの分子量の１つ以上のポリエチレングリコール分子で修飾され得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分は、ポリペプチド内の任意のアミノ酸残基に付着し得る。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対３つのミニヌクレオソームコアタンパク質（１：３）と、１つの核酸分子対３，０００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：３，０００）との間に、またはそれらの間の任意の範囲内に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対３つのミニヌクレオソームコアタンパク質（１：３）と、１つの核酸分子対２，０００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：２，０００）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対３つのミニヌクレオソームコアタンパク質（１：３）と、１つの核酸分子対１，０００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：１，０００）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対３つのミニヌクレオソームコアタンパク質（１：３）と、１つの核酸分子対５００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：５００）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対３つのミニヌクレオソームコアタンパク質（１：３）と、１つの核酸分子対２００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：２００）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対３つのミニヌクレオソームコアタンパク質（１：３）と、１つの核酸分子対１００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：１００）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対３つのミニヌクレオソームコアタンパク質（１：３）と、１つの核酸分子対５０のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：５０）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対５０のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：５０）と、１つの核酸分子対２，０００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：２，０００）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対５０のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：５０）と、１つの核酸分子対１，０００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：１，０００）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対５０のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：５０）と、１つの核酸分子対５００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：５００）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対５０のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：５０）と、１つの核酸分子対２００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：２００）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対５０のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：５０）と、１つの核酸分子対１００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：１００）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対２００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：２００）と、１つの核酸分子対２，０００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：２，０００）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対２００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：２００）と、１つの核酸分子対１，０００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：１，０００）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
様々な実施形態では、負荷ミニヌクレオソームは、１つの核酸分子対２００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：２００）と、１つの核酸分子対５００のミニヌクレオソームコアタンパク質（１：５００）との間に、核酸分子対ミニヌクレオソームコアタンパク質の比率を含む。
当業者であれば、ミニヌクレオソームコアタンパク質分子が、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、重炭酸塩、及び塩化物を含むいくつかの異なる塩条件を含むが、これらに限定されない、様々な手段によって生成及び／または構成され得ることを理解するであろう。負荷ミニヌクレオソームの最終製剤は、通常の生理食塩水、水、または任意の他の薬学的に許容される緩衝液中で構成され得る。
負荷ミニヌクレオソームの標的細胞または組織への送達
ある特定の実施形態では、ミニヌクレオソームは、標的細胞が網膜色素上皮（ＲＰＥ）である核酸を送達することができる。効率的な遺伝子療法のために、いくつかの実施形態は、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の多量のコピー数の遺伝子カーゴを１つの細胞型に送達することを含む。例えば、滲出型加齢黄斑変性において、ＲＰＥ中で抗ＶＥＧＦを発現することは、内皮細胞増殖及び血管漏出を阻害するために必要な治療レベルのタンパク質を提供し得る。本明細書では、ＲＰＥへの取り込みの増強を可能にするミニヌクレオソームコアタンパク質（配列番号３９２）の例を提供する（図１０、１１）。
ある特定の実施形態では、ミニヌクレオソームは、標的細胞が網膜のニューロンである核酸を送達することができる。アミノ酸ドメインＬＲＥ（配列番号１５６）は、ニューロンの付着を増強するために使用され得ることが記載されている（Ｄａｌｅ Ｄ，ｅｔ ａｌ，１９８９）。ミニヌクレオソームコアタンパク質（配列番号３８８）を有するＧＦＰ構築物（配列番号３９５）を使用して、非ウイルスベクターでこのようなドメインを使用し、網膜中の標的ニューロン細胞にＧＦＰを発現させた（図１２）。これは、網膜ニューロンで発現される遺伝子の遺伝子突然変異によって引き起こされる網膜変性を治療するためにＤＮＡまたはＲＮＡを送達するのに特に有用である可能性がある。
様々な実施形態において、ミニヌクレオソームは、例えば、筋肉細胞、肝臓細胞、内皮細胞、造血幹細胞、肺上皮細胞、末梢細胞、β細胞、腸上皮細胞、ミクログリア細胞、マクロファージ細胞、神経細胞、皮膚細胞、血液細胞等であるがこれらに限定されない標的細胞に、核酸を送達することができる。本明細書に記載のドメインの様々な組み合わせ（表３－１２）は、脳、網膜、腸、肝臓、肺、腎臓、筋肉、膵臓を含むが、これらに限定されない身体の他の部分における治療効果のために、負荷ミニヌクレオソームを特定の標的細胞型に送達することを可能にし得る。
薬学的組成物
本開示は、負荷ミニヌクレオソーム及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む「負荷ミニヌクレオソーム治療薬」を企図する。薬学的に許容される担体溶液の製剤は、好適な投薬及び治療レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。典型的には、これらの製剤は、所望の導入遺伝子の１０２個ゲノムコピー以上を含み得る。溶解度、バイオアベイラビリティ、半減期、保存期間などの他の要因は、当業者によって企図されるであろう。したがって、様々な用量及び治療レジメンが望ましい場合がある。負荷ミニヌクレオソーム治療薬は、網膜、肝臓、ＣＮＳ、腸管などを含むが、これらに限定されないヒト体内の様々な細胞型、組織型または臓器にヌクレオチドを送達するために使用することができる。
負荷ミニヌクレオソーム治療薬は、細胞または動物への投与に薬学的に許容されるように製剤化することができる。負荷ミニヌクレオソーム治療薬は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで投与され得る。負荷ミニヌクレオソーム治療薬は、単独で、または１つ以上の他の治療様式、例えば、抗体、ステロイド、ビタミン、ＡＡＶなどと組み合わせて、対象に投与することができる。
ある特定の事例において、負荷ミニヌクレオソーム治療薬は、それぞれまたは一緒に１つ以上の異なる発現産物をコードする１つ以上の核酸カーゴを含み得る。
ある特定の状況では、皮下、眼内、硝子体内、非経口、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、局所、経口、腹腔内注射による、または鼻腔吸入によるいずれかであるが、これらに限定されない技法によって、本明細書に開示される適切に製剤化された薬学的組成物で負荷ミニヌクレオソーム製剤を送達することが望ましいであろう。負荷ミニヌクレオソーム製剤の溶液は、滅菌水、滅菌生理食塩水中で調製され得、また、プルロニック酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）などの１つ以上の界面活性剤と好適に混合され得る。分散液をまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で調製することができる。保管調製物は、微生物の増殖を防止するための保存料を含有し得る。
負荷ミニヌクレオソーム治療薬の好適な投与手段は、治療される病態または疾患に基づいて、ならびに対象の年齢及び状態に基づいて選択され得る。投与の用量及び方法は、患者の体重、年齢、状態等に応じて変化し得、当業者に必要に応じて適切に選択され得る。
様々な事例では、負荷ミニヌクレオソーム治療薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含むように製剤化され得る。薬学的に許容される担体の例としては、生理学的に適合性のある、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含むことができる。
様々な実施形態では、本明細書に記載の負荷ミニヌクレオソーム治療剤、例えば、注射用滅菌製剤を含む組成物は、ビヒクルとして注射用蒸留水を使用して、従来の医薬慣行に従って製剤化され得る。例えば、生理食塩水またはグルコース、ならびにＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、及び塩化ナトリウム等の他のサプリメントを含有する等張溶液は、任意選択で、好適な可溶化剤、例えば、エタノール等のアルコール、及びプロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール等のポリアルコール、ならびにポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ－５０等の非イオン性界面活性剤、と組み合わせて、注射用水溶液として使用することができる。
本明細書に開示されるように、負荷ミニヌクレオソーム治療薬組成物は、当該技術分野で既知である任意の形態であり得る。そのような形態には、例えば、液体溶液（例えば、注射可能及び注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソーム、及び坐剤などの液体、半固体及び固体剤形が含まれる。
任意の特定の形態の選択または使用は、意図される投与様式及び治療用途に部分的に依存し得る。例えば、全身または局所送達を意図する組成を含有する組成物は、注射液または注入液の形態であり得る。したがって、負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、非経口モード（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射）による投与のために製剤化することができる。本明細書で使用される場合、非経口投与は、通常は注射による経腸及び局所投与以外の投与様式を指し、静脈内、鼻内、眼内、肺、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、肺内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、脳内、頭蓋内、頸動脈内ならびに胸骨内の注射及び注入を含むが、これらに限定されない。
非経口投与経路は、例えば、注射による投与、経鼻投与、経肺投与、または経皮投与であってもよい。投与は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射による全身または局所であり得る。
様々な実施形態において、本発明の負荷ミニヌクレオソーム治療薬組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、または高濃度での安定した保管に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。滅菌注射液は、本明細書に記載される組成物を、必要量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙される成分のうちの１つまたは組み合わせとともに組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、本明細書に記載の組成物を、塩基性分散媒及び上に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、本明細書に記載の組成物に加えて、その以前に滅菌濾過された溶液由来の任意の追加の所望の成分（以下を参照）の粉末を産生する、真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延させる試薬、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含めることによって達成することができる。
負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、水または別の薬学的に許容される液体中の無菌溶液または懸濁液を含む注射用製剤の形態で非経口投与することができる。例えば、負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、治療分子を、薬学的に許容されるビヒクルまたは媒体、例えば、滅菌水及び生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味賦形剤、希釈剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤と好適に組み合わせ、続いて、一般に許容される薬学的慣行に必要な単位用量形態で混合することによって製剤化することができる。薬学的製剤に含まれる負荷ミニヌクレオソーム治療剤の量は、指定された範囲内の好適な用量が提供されるような量である。油性液体の非限定的な例としては、ゴマ油及び大豆油が挙げられ、可溶化剤として安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと組み合わせることができる。含まれ得る他の項目は、リン酸緩衝液、または酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、塩酸プロカインなどの鎮静剤、ベンジルアルコールまたはフェノールなどの安定剤、及び抗酸化剤である。製剤化された注射は、好適なアンプル内にパッケージングされ得る。
いくつかの実施形態では、負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、０℃未満の温度（例えば、－２０℃または－８０℃）で保管するために製剤化することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、２～８℃（例えば、４℃）で最大２年（例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１年半、または２年）間保管するために製剤化され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、２～８℃（例えば、４℃）で少なくとも１年間安定して保管される。
特定の事例では、負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、溶液として製剤化することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば、好適な濃度で２～８℃（例えば、４℃）での保管に適した緩衝溶液として製剤化され得る。
本明細書に記載される負荷ミニヌクレオソーム治療薬を含む組成物は、免疫リポソーム組成物に製剤化され得る。このような製剤は、当該技術分野で既知の方法によって調製され得る。循環時間が増強されたリポソームは、例えば、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特定の実施形態では、組成物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤等の、急速な放出から化合物を保護する担体とともに製剤化され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーが使用され得る。かかる製剤の調製のための多くの方法は当該技術分野で知られている。例えば、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９７８）“Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．を参照されたい。
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒトなどの哺乳動物への肺内投与（例えば、吸入器またはネブライザーを介した投与）に好適な組成物に製剤化することができる。そのような組成物の製剤化方法は、当該技術分野において周知である。乾燥粉末吸入剤製剤及び製剤の投与に適した系もまた、当該技術分野において知られている。肺への投与は、経口及び／または鼻腔であり得る。肺送達のための薬学的デバイスの例としては、定量噴霧式吸入器、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、及びネブライザーが挙げられる。例えば、本明細書に記載の組成物は、乾燥粉末吸入器によって対象の肺に投与することができる。これらの吸入器は、分散性で安定した乾燥粉末製剤を肺に送達する推進剤を含まないデバイスである。乾燥粉末吸入器は、医学分野で周知であり、これらに限定されないが、以下が含まれる：ＴＵＲＢＯＨＡＬＥＲ（登録商標）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、ＡＩＲ（登録商標）吸入器（ＡＬＫＥＲＭＥＳ（登録商標）；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）、ＲＯＴＡＨＡＬＥＲ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、及びＥＣＬＩＰＳＥＴＭ（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ；Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）。また、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ ０４／０２６３８０号、第ＷＯ ０４／０２４１５６号、及び第ＷＯ ０１／７８６９３号を参照されたい。ＤＰＩデバイスは、インスリン及び成長ホルモン等のポリペプチドの肺投与に使用されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、定量噴霧式吸入器によって肺内投与され得る。これらの吸入器は、推進剤に依存して個別的用量の化合物を肺に送達する。追加のデバイス及び肺内投与方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５０２７１６６０号及び第２００９０１１０６７９号に記載されており、これらのそれぞれの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、眼への送達のために、例えば、薬学的に許容される溶液、懸濁液、または軟膏の形態で製剤化することができる。眼の治療で使用するための調製物は、例えば、防腐剤、緩衝液、張性剤、酸化防止剤及び安定剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、ならびに増粘剤などであるが、これらに限定されない追加の成分を含有する滅菌水溶液の形態であり得る。本明細書に記載される調製物は、従来の方法によって、例えば、１つ以上の組成物を含有する、点滴剤の形態で、または眼を治療溶液に浸すことによって、治療を必要とする対象（例えば、ＡＭＤに罹患している対象）の眼に局所投与することができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与に、眼の硝子体腔に薬物を導入するための様々なデバイスが適切であり得る。例えば、米国公開第２００２／００２６１７６号は、それが硝子体腔に突出して、医薬剤を硝子体腔に送達するように、強膜を通して挿入され得る薬学的含有プラグを記載する。別の例では、米国特許第５，４４３，５０５号は、眼の内部への薬物の持続的な放出のため、脈絡膜上腔または無血管領域に導入するための移植可能なデバイスを記載している。米国特許第５，７７３，０１９号及び同第６，００１，３８６号はそれぞれ、眼の強膜表面に取り付け可能な移植可能な薬物送達デバイスを開示している。負荷ミニヌクレオソーム治療薬を眼に送達するための追加の方法及びデバイス（例えば、経胸膜パッチ及びコンタクトレンズを介する送達）は、例えば、Ａｍｂａｔｉ ａｎｄ Ａｄａｍｉｓ（２００２）Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ２１（２）：１４５－１５１、Ｒａｎｔａ ａｎｄ Ｕｒｔｔｉ（２００６）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ ５８（１１）：１１６４－１１８１、Ｂａｒｏｃａｓ ａｎｄ Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ（２００８）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ５（１）：１－１０（１０）、Ｇｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｃｈａｕｈａｎ（２００４）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４５：２３４２－２３４７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｒｅｓ ３９：２４４－２５４、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ ０４／０７３５５１号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態では、皮下投与は、シリンジ、プレフィルドシリンジ、オートインジェクタ（例えば、使い捨てまたは再利用可能）、ペンインジェクタ、パッチインジェクタ、ウエアラブルインジェクタ、皮下注入セットを備えた携帯型シリンジ注入ポンプ、または皮下注入のための他のデバイスなどのデバイスによって、達成することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の負荷ミニヌクレオソーム治療薬組成物は、局所投与によって治療的に対象に送達され得る。本明細書で使用される場合、「局所投与」または「局所送達」は、負荷ミニヌクレオソーム治療薬組成物または負荷ミニヌクレオソーム治療薬の血管系を介した意図される標的組織または部位への輸送に依存しない送達を指すことができる。例えば、負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物は、組成物または薬剤の注射または移植によって、または組成物または薬剤を含有するデバイスの注射または移植によって送達されてもよい。ある特定の実施形態では、標的組織または部位の近傍での局所投与後、組成物または薬剤、またはその１つ以上の成分は、投与部位ではない意図される標的組織または部位に拡散し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物は、単位剤形で存在し、その単位剤形が自己投与に好適であり得る。そのような単位剤形は、容器、典型的には、例えば、バイアル、カートリッジ、プレフィルドシリンジ、または使い捨てペン内に提供されてもよい。米国特許第６，３０２，８５５号に記載される投薬デバイス等の投薬器（ｄｏｓｅｒ）も、例えば本明細書に記載される注射システムとともに使用され得る。
その用量が対象の障害を治療または予防することができる、本明細書に記載の負荷ミニヌクレオソーム治療剤組成物の好適な用量は、例えば、治療される対象の年齢、性別、及び体重、治療される状態または疾患、ならびに使用される特定の負荷ミニヌクレオソーム治療剤、を含む様々な要因に依存し得る。対象に投与される用量に影響を及ぼす他の要因としては、例えば、状態または疾患の種類または重症度が挙げられる。他の要因としては、例えば、同時にまたは以前に対象に影響を与える他の医学的障害、対象の一般的な健康、対象の遺伝子素因、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、ならびに対象に投与される任意の他の追加の治療法が挙げられる。また、任意の特定の対象に対する特定の用量及び治療レジメンは、医師の判断に基づいて調整することもできることも理解されたい。
負荷ミニヌクレオソーム治療剤溶液は、治療有効量の本明細書に記載の組成物を含み得る。かかる有効量は、投与された組成物の効果、または複数の薬剤が使用される場合は組成物と１つ以上の追加の活性剤の組み合わせ効果に部分的に基づいて、当業者によって容易に決定することができる。治療上有効量は、組成物の任意の毒性または有害な作用を治療的に有益な作用が上回る量であり得る。
注射に好適な負荷ミニヌクレオソーム治療製剤の薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液が含まれ得る。製剤は無菌であってもよく、シリンジに出入する適切な流れを可能にするために流動性でなければならない。製剤はまた、製造及び保管条件下で安定であり得る。担体は、例えば、水及び生理食塩水または緩衝水溶液を含有する溶媒または分散媒であり得る。好ましくは、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを、製剤に使用することができる。ヒト投与の場合、最終的な調製物及び組成物は、米国ＦＤＡ及びＥＵ規制基準で要求される無菌性、発熱性、及び一般的なエンドトキシンレベル、安全性及び純度基準を満たす必要がある。温度及び他のタンパク質への曝露は、負荷ミニヌクレオソームの特性を変化させ得る。最終調製物及び組成物は、適切な温度、好ましくは２～８℃または室温（２０～２５℃）で保管しなければならない。
加えて、当業者であれば、エレクトロポレーション、ソノフォレーシス、骨内注射方法を介するものであるか、または遺伝子銃を使用することによるものであり得る追加の送達方法もまた企図し得る。ベクターはまた、マイクロチップ、ナノチップ、またはナノ粒子に移植され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、キットに製剤化されてもよい。かかるキットは、治療目的または診断目的のために使用され得る。本開示は、とりわけ、ミニヌクレオソームコアタンパク質及び核酸からなる組成物の製剤化に使用され得る、ならびに本明細書に記載の１つ以上の疾患のために哺乳動物、特にヒトに投与するための治療薬の調製に用いられ得る、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、アジュバント、及び／または他の成分とともに、１つ以上の組成物を提供する。具体的には、かかるキットは、開示されたミニヌクレオソームコアタンパク質組成物のうちの１つ以上を、哺乳動物の様々な障害の治療に核酸を使用するための説明書と組み合わせて含んでよく、典型的には、便宜的な市販の包装のために調製された容器を含んでよい。
本明細書に記載の組成物は哺乳動物である動物、例えばヒトに投与され得る。本明細書に記載の組成物はまた、商業的に関心のある動物、家畜、ならびにイヌ及びネコなどの家庭用ペットにも適用可能である。キット中の組成物は、単独で、または治療用もしくは診断用の１つ以上の他の成分もしくは薬物と組み合わせて、部分的にまたは有意に精製された負荷ミニヌクレオソーム組成物を含むことができる。本明細書に開示される少なくとも１つの負荷のミニヌクレオソーム成分に基づく遺伝子治療組成物、及び組成物を治療剤として使用するための説明書を含む治療キットも調製することができる。かかるキットの容器手段は、典型的には、開示されたミニヌクレオソーム組成物（複数可）が入れられ、好ましくは適切に分注され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含み得る。
用途
本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、様々な実施形態において、小さいサイズ、受容体媒介または受動的拡散プロセスによって細胞に入る能力、遺伝子発現の位置の精度、遺伝子発現の持続時間の精度、及び／または標的細胞の核の細胞質に核酸が放出されるまでの保持を特徴とすることができる。ミニヌクレオソーム技術の望ましい用途のいくつかを、本明細書に記載する：
遺伝子療法
様々な実施形態では、本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、遺伝子療法の方法で使用することができる。遺伝子療法の一般原理は、当該技術分野で周知であり、治療値の発現産物（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質、または阻害性ＲＮＡ）を提供するためのそれを必要とする対象へのポリヌクレオチドの送達を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子療法は、遺伝子またはタンパク質補充療法（例えば、酵素補充療法）、増強、または標的阻害を含むことができる。様々な実施形態では、本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、シュタルガルト病、加齢黄斑変性、ハンチントン、血友病Ａ、脊髄性筋萎縮、アッシャー症候群等を含むが、これらに限定されない疾患を引き起こす任意の突然変異の有害な影響を救済するために適用され得る。かかる疾患において、遺伝子変異は、遺伝子が機能しないか、または利用できなくなる。そのような場合、機能的コピーによって変異遺伝子を置き換えることは、患者に有益であり得る。機能性ｃＤＮＡまたは全遺伝子を負荷ミニヌクレオソームに組み込み、それを所望の細胞または組織に送達することによって、様々な実施形態において、治療上の利益を受けることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、アップレギュレートされ、疾患を引き起こす遺伝子を阻害するために適用することができる。例えば、Ｐ５３過剰発現は、様々な疾患において説明されている。場合によっては、特定の細胞または組織で遺伝子をノックダウンして、炎症、低酸素症などを引き起こす遺伝子をダウンレギュレートして治療効果もたらすこともまた有益である。
エクスビボで操作された細胞
本開示のミニヌクレオソームは、エクスビボで細胞を操作するためを使用することができる。細胞は、様々な方法で治療薬を発現するように操作することができる。そのような細胞の１つは、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞である。免疫細胞は、殺傷及びクリアランスのためにがん細胞または他の有害な細胞型の免疫認識を可能にし得る新しいタンパク質または受容体を発現するように遺伝子操作することができる。かかる遺伝子操作は、エクスビボで実施され得る。様々な実施形態では、本明細書に提供されるミニヌクレオソームは、エクスビボで細胞を遺伝子操作する方法で使用することができる。本明細書に提供されるドメインの組み合わせは、負荷ミニヌクレオソームが様々なＴ細胞に侵入し、かかる細胞内の核に遺伝子カーゴを送達することを可能にし得る。遺伝子カーゴは、キメラ受容体の発現、遺伝子または他の治療エンティティのノックダウンをコード及び／または可能にし得る。次に、そのような細胞を、治療のために患者に注入してもよい。当業者は、免疫療法で使用するためのキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）を作製するために、負荷ミニヌクレオソームを使用することを企図し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるミニヌクレオソームをエクスビボで幹細胞を操作して、治療目的のために新しいタンパク質または受容体を発現させるために適用できる。本明細書に提供されるドメインの組み合わせは、負荷ミニヌクレオソームが様々な幹細胞に侵入して、かかる細胞内の核／細胞質に遺伝子カーゴを送達することを可能にし得る。遺伝子カーゴは、キメラ受容体の発現、遺伝子または他の治療実体のノックダウンを可能にし得る。次に、そのような細胞を、治療のために患者に注入してもよい。当業者は、免疫療法で使用するためのキメラ幹細胞またはキメラ造血幹細胞を作製するために、負荷ミニヌクレオソームを使用することを企図し得る。
遺伝子編集及び塩基除去修復
遺伝子編集、塩基編集、及び操作は、本明細書に記載のこのミニヌクレオソーム技術にも適用可能な領域である。遺伝子編集及び塩基除去修復は、ＤＮＡまたはＲＮＡレベルでの遺伝子変異の修正または遺伝子の編集を可能にする最先端の技術である。本出願に向けて、負荷ミニヌクレオソームは、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｓｐＣａｓ９、ｓａＣａｓ９、ｄＣａｓ９、シチジンデアミナーゼ、及びＤＮＡの切断または１つの塩基を別の塩基に変換するのを助けるいくつかの他の酵素をコードする核酸を組み込むことができる。当業者は、ＡＡＶに複数のｇＲＮＡ及びＣａｓ９または類似の編集酵素を組み込むことは煩雑であり、しばしば非効率的なプロセスであることを理解することができる。したがって、負荷ミニヌクレオソームへの核酸の容易な圧縮を可能にする本明細書に記載の方法及び組成物を使用することにより、いくつかのｇＲＮＡ、さらには最大のＣａｓ９遺伝子さえも組み込みが所望の細胞に送達されることが可能になる。
抗体送達
抗体は、世界中の何百万人もの患者の生活を変化させてきた薬物の一種である。しかしながら、この療法の大きな欠点の１つは、患者、医師、及び介護者に多大な負担をかける、繰り返し投与する必要があることである。当業者は、ＤＮＡ分子が抗体を発現するために使用され得ることを理解することができる。本明細書に記載のミニヌクレオソーム技術は、抗体をベクター化し、患者の所望の細胞に送達して、患者の体内に長期デポーを作製し、複数回投与の負担を軽減する機会を提供する。抗体ドメインの一部または全体を発現するこれらのＤＮＡ分子は、負荷ミニヌクレオソームに組み込まれて、抗体薬を服用する患者に長期的な治療選択肢を作成することができる。当業者はまた、ミニヌクレオソームコアタンパク質を使用して、ナノボディ、抗体模倣物、融合ペプチド、抗体断片、ラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）もしくはラクダ科動物単一ドメイン抗体断片などの他の抗体様分子をベクター化し、送達することもできる。
ワクチン送達
遺伝子操作されたＤＮＡまたはＲＮＡは、抗原を産生して、防御免疫学的応答を提供することができる。核酸ワクチンは、従来のワクチンよりも広範囲の免疫学的応答等のいくつかの潜在的な利点を有する。本明細書に記載されるミニヌクレオソーム技術は、かかるＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を組み込んで、ヒトを含む動物の所望の細胞または組織に送達し、いくつかのウイルス、細菌または寄生虫感染から保護することができる。
化粧品
遺伝子操作されたＤＮＡまたはＲＮＡは、例えば、筋肉量を増強するため、火傷の被害者の皮膚を修復するため、体重減少のため、免疫機能を改善するため、老化を遅らせるため、及び多くの他の用途のために開発することができる。本明細書に記載されるミニヌクレオソーム技術は、所望の美容効果のために、適用可能なＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を組み込み、ヒトを含む動物における所望の細胞または組織に送達することができる。
様々な実施形態では、本開示は、ヒトまたは他の動物における疾患を予防または治療することに関連するベクターをさらに提供する。予防的または治療的に有効な量の組成物は、静脈内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮下、脳内、網膜下、硝子体内に、腰椎穿刺、局所、直腸、または局所器官もしくは腫瘍への直接送達を介して投与され得るが、これらの技術に限定されずに投与され得る。組成物は、核酸複合体の組成物を含み、各複合体は、単一もしくはそれ以上の核酸分子及び１つ以上のミニヌクレオソームコアタンパク質分子から本質的になる。
本開示は、とりわけ、特定の疾患を治療するため及び／または美容用途のため、ヒト細胞への効率的な送達のために、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの類似体等を縮合する改良された方法を提供する。送達される核酸はまた、ワクチンを送達するための用途を有し得る。
実施例１ミニヌクレオソームコアタンパク質の設計及び合成
この実施例は、ミニヌクレオソームコアタンパク質に関する方法及び組成物を表す。この実施例では、（核酸を負荷ミニヌクレオソームに縮合することができる）ペプチドのアミノ酸配列及びそれらの合成プロセスを記載する。
本実施例の負荷ミニヌクレオソームは、効率的な遺伝子導入及び負荷核酸カーゴの様々な細胞型への放出のために産生される。本実施例の負荷されたミニヌクレオソームは、細胞表面タンパク質への結合を介して細胞表面と積極的に関わって、細胞内の細胞質／核に移行され、核酸カーゴの放出を可能にするように設計される。これらの特徴は、構造化タンパク質／ＤＮＡ相互作用に基づいて設計されたミニヌクレオソームコアタンパク質及び負荷ミニヌクレオソームによって達成され得る。したがって、本実施例は、細胞付着、増強された取り込み、増強された安定性、標的細胞の核への能動輸送、及びペプチダーゼを介した放出のうちの１つ以上を増強する１つ以上のアミノ酸ドメインを含むミニヌクレオソームコアタンパク質を含む。
本実施例において、合成ミニヌクレオソームコアタンパク質は、これらに限定されないが、配列番号３８８～３９３のいずれか１つに記載の配列、または表３～１２に開示のドメインに由来する他の配列、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。本実施例のミニヌクレオソームコアタンパク質は、ｐＨ７で正味正電荷が＞８、等電点が＞９のペプチドである。例えば、配列番号３８８は、複数のニューロン付着ドメイン（ＬＲＥ）及びポリアルギニンドメイン（ＲＲＲＲＲ）と組み合わせた複数のＤＮＡ結合ドメイン（ＫＲＨＲＫ）を含むミニヌクレオソームコアタンパク質配列である。この同じ構築物において、ロイシン（Ｌ）はポリアルギニンドメインを取り囲み、疎水性アミノ酸で荷電ドメインを分離し、細胞付着ドメインが細胞表面に結合することを可能にする。この構築物では、ミニヌクレオソームコアタンパク質（配列番号３８８）が、ＬＲＥドメインを介したニューロンへの付着を強化するように設計され、一方、ポリアルギニンドメインは、細胞侵入を助ける。本実施例は、ある特定のドメイン間に配置された様々なリンカーを有するミニヌクレオソームコアタンパク質も含み、リンカーの例は、配列番号３８８～３９３に提供されるものを含む。設計により、配列番号３８８のＫＲＨはまた、核酸の放出を増強するためのＰＣＳＫ１の切断部位としても機能する。ミニヌクレオソームコアタンパク質に含まれ得る他の核酸放出ドメインまたは切断ドメインには、表９に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。ミニヌクレオソームコアタンパク質に含まれるためのドメインはまた、表９にあるものを含むがこれに限定されない他のペプチダーゼについても誘導することができる。
配列番号３８８～３９３によるミニヌクレオソームコアタンパク質を含む、本実施例のミニヌクレオソームコアタンパク質は、核酸分子との効率的な縮合、及び負荷ミニヌクレオソームの所望の細胞型、例えば、動物細胞及び組織への送達を可能にする配列特徴の様々な組み合わせを含む。本実施例の特定のミニヌクレオソームコアタンパク質では、基準負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質と比較して、例えば、オリゴマー化ドメイン（複数可）を欠くがそれ以外の場合アミノ酸配列において同一であるミニヌクレオソームコアタンパク質を含む負荷ミニヌクレオソームと比較して、ミニヌクレオソームコアタンパク質と核酸カーゴとの会合によって形成される負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質を、比較的小さいサイズを有するようにさせるために、オリゴマー化ドメインがミニヌクレオソームコアタンパク質に含まれる。例示的なオリゴマー化ドメインには、表１１に提供されるものが挙げられる。同様に、エンドソーム侵入シグナル及び脱出シグナルもまた、安定性及び放出の増強のためにミニヌクレオソームコアタンパク質に含まれ得る。
本実施例のミニヌクレオソームコアタンパク質は、様々な方法によって合成され得る。ミニヌクレオソームコアタンパク質を合成する１つの方法はペプチド合成である。ペプチド合成は、アミド結合を介したアミノ酸の連結を可能にする。例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、ミニヌクレオソームコアタンパク質の配列の順序で、１つのアミノ酸のカルボキシル基と次の所望のアミノ酸のアミノ基との間の縮合反応を介して化学的に合成され得る。ペプチド合成の確立された方法は、固相ペプチド合成として当該技術分野で知られている。
任意選択で、本開示のミニヌクレオソームコアタンパク質のアミノ（Ｎ末端）及びカルボキシ末端（Ｃ末端）を保護するために、いくつかの戦略を適用することができる。ミニヌクレオソームコアタンパク質が凍結乾燥される場合、凍結乾燥ペプチドは、合成プロセス中に使用される微量の塩を含 んでもよい。ミニヌクレオソームコアタンパク質の産生の他の方法は、細胞系において、またはミニヌクレオソームコアタンパク質をコードするインビボ形態ＤＮＡ構築物において、ミニヌクレオソームコアタンパク質を発現することを含む。産生されたミニヌクレオソームコアタンパク質は、当該技術分野で既知の様々な方法によって精製され得る。例えば、プロセス中にいくつかの樹脂を利用することができる。本実施例の様々な例では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は＞９０％の純度である。しかしながら、＜９０％のより低純度のコアタンパク質もまた、負荷ミニヌクレオソームを形成するために使用され得る。本実施例の様々な例では、ミニヌクレオソームコアタンパク質は、＞９０％でＰＥＧとコンジュゲートする。しかしながら、コンジュゲートより少ない（＜９０％）または非コンジュゲートコアタンパク質もまた、負荷ミニヌクレオソームを形成するために使用され得る。ミニヌクレオソームコアタンパク質の純度は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定することができ、同一性は、質量分析によって最小限まで確認することができる。
実施例２．負荷ミニヌクレオソームの産生
本実施例は、実施例１の負荷ミニヌクレオソームを含むがこれに限定されない、負荷ミニヌクレオソームの産生に関する技術を記載する。本実施例の負荷されたミニヌクレオソームは、正味の正電荷を有するミニヌクレオソームコアタンパク質と縮合された核酸カーゴ（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。ミニヌクレオソームコアタンパク質正味の正電荷は、核酸カーゴの負電荷を中和し、ナノメートルサイズの粒子をもたらす。前記ミニヌクレオソームコアタンパク質及びＤＮＡまたはＲＮＡのコンジュゲーションは、少量または大量に起こり得る。全ての塩基に関連する２つの負の電荷を意味する２つのリン酸塩が存在する。本実施例は、ＤＮＡ負電荷の少なくとも９０％がヌクレオソームコアタンパク質の正電荷によって中和されることを提供する。例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質との核酸の効率的な縮合のために、ＤＮＡ負電荷の９０～９５％を中和する必要がある。本実施例の様々なミニヌクレオソームコアタンパク質は、細胞付着、細胞取り込み、タンパク質安定性、標的細胞の核への能動輸送、及び核酸カーゴの放出のうちの１つ以上を増強するアミノ酸ドメインを含み得る。したがって、本明細書で提供される特定のミニヌクレオソームコアタンパク質は、特定の状況において特に有用であり得る。核酸とミニヌクレオソームコアタンパク質とを混合して負荷ミニヌクレオソームを産生するプロセス中、核酸とミニヌクレオソームコアタンパク質との混合物は、１００ｒｐｍｓ～４０００ｒｐｍｓの間で混合またはボルテックスすることができる。核酸のコンジュゲーションのプロセスにおいて、縮合反応を増強する特定の触媒、例えば、ＮａＯＨ及びスペルミジンが添加され得る。これらの触媒は、ポリペプチド及び核酸を添加する前に、反応器に添加することができる。核酸は、０．１マイクログラム／マイクロリットル～１００グラム／リットルの範囲の濃度で添加され得る。ミニヌクレオソームコアタンパク質は、０．１マイクログラム／マイクロリットル～１００グラム／リットルの濃度で添加され得る。核酸は、一度に添加されてもよく、または徐々に、例えば、着実にもしくは連続的してボルテックスしている溶液に滴下して添加されてもよい。混合が終了したら、縮合材料、すなわち、負荷ミニヌクレオソームを、精製の前に、数分間～数時間、例えば、２分間～６時間の期間にわたって平衡化させることができる。この段階で不純物を除去し、緩衝液を交換するために透析を行うことができる。負荷ミニヌクレオソームは、いくつかの技術を使用して精製され得る。かかる技法の１つは、１キロダルトン以上の分子量カットオフパラメータを有するカラムで粒子を高速で遠心分離することである。遠心分離速度は、試料体積に応じて、７０００×ｇ～１０，０００×ｇの範囲であってもよい。同様に、遠心分離の持続時間は、試料体積に応じて室温で２０分～１時間まで変化し得る。ミニヌクレオソームを精製するために利用可能な別の技法は、透析である。精製技術は、これら２つの技術に限定され得ず、当業者は、タンパク質／核酸複合体を精製するために使用することができる文献からの様々なさらなる精製技術を認識するであろう。最後に、負荷ミニヌクレオソームは、これらに限定されないが、エンドトキシンを含まない水、通常生理食塩水、または任意の他の緩衝溶液で溶出または収集され得る。ＤＮＡの予想される回収率は約３０～７０％である。負荷されたミニヌクレオソームはまた、分子量カットオフカラム中でさらに遠心分離を受けて、溶液中のベクターゲノムの量をさらに濃縮してもよい。本実施例において、負荷ミニヌクレオソームは、エンドトキシンの存在を最小限に抑えるように製剤化される。エンドトキシンの典型的な供給源には、プラスミド、ペプチド合成、または調製物で使用される材料が含まれることが知られている。したがって、本実施例に記載の調製中に、エンドトキシンを含まないプラスミドを使用することができ、エンドトキシンをスクラブした材料及び装置を使用することができる。
核酸とペプチドの一貫した混合のため、バイオリアクターを使用して、負荷ミニヌクレオソームを製剤化して、商業的使用及び臨床的使用のための粒子を生成することもできる。
実施例３負荷ミニヌクレオソームの好ましい形状／サイズ及び製剤
この実施例では、細胞及び哺乳動物対象、例えば、ヒトへの投与に有用な製剤を含む、様々な製剤化で負荷ミニヌクレオソームを産生するための技術が提供される。負荷ミニヌクレオソームは、ミニヌクレオソームコアタンパク質アミノ酸配列及び合成が行われる緩衝液の条件に基づいて、異なる形状及び／またはサイズのパラメータに製剤化することができる。負荷ミニヌクレオソームは、異なる条件、例えば、治療的使用に好適な溶解度で製剤化することができる。負荷ミニヌクレオソームの水及び／または通常生理食塩水中の溶解性は、患者への投与のための組成物の非毒性製剤化を可能にし、患者への送達を容易にするための１つの手段である。図７に示される負荷ミニヌクレオソームを形成するために、トリフルオロ酢酸緩衝液を使用して固相合成によってコアタンパク質を合成した。２００マイクログラムのＤＮＡ（配列番号３９６）を１ミリグラムの凍結乾燥コアタンパク質に添加し、一緒にボルテックスし、精製して、負荷ミニヌクレオソームを産生した（図７）。緩衝液交換を行い、ミニヌクレオソームの最終製剤を滅菌されたエンドトキシンを含まない水中で作製した。各種類のミニヌクレオソーム１ミリグラムを水で希釈し、次いでグリッド上に配置し、メタノール溶液中の０．７５％酢酸ウラニル中で新鮮に調製したもので２分間染色した。グリッドを１００％エタノールに浸し、次いでレンズ吸収紙で吸い取った。その後、グリッドを、フィルム側を上にして数分間風乾させ、Ｈａｍｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ ＨＲカメラで画像化するために撮影した（図７）。ルシフェラーゼをコードするプラスミドとして本開示の負荷ミニヌクレオソームコアタンパク質を生成する際にポリヌクレオチドが利用されるが、当業者は、本実施例が、本開示のミニヌクレオソームコアタンパク質がポリヌクレオチドと会合し、負荷ミニヌクレオソームを形成する一般的な能力を広く実証することを理解するであろう。ルシフェラーゼプラスミドは、限定されないが、あらゆる種類のプラスミド、直鎖核酸、ＲＮＡ、及びＤＮＡを含む、一般的な核酸を代表する。他の場合、例えば、他の配列または構造のＲＮＡまたはＤＮＡを、負荷ミニヌクレオソームの産生に使用することができる。配列番号３９３のコアタンパク質と縮合したルシフェラーゼプラスミドは、スパイラル／ヘリカル形状の負荷ミニヌクレオソームをもたらした（図７Ａ）。配列番号３９０を有するコアタンパク質と縮合したルシフェラーゼプラスミドは、棹状／小葉形状の負荷ミニヌクレオソームをもたらした（図７Ｂ）。ルシフェラーゼプラスミドとコアタンパク質配列番号３９１との縮合によって産生される負荷ミニヌクレオソームについて、環状分子と棹状分子の混合物が観察された（図７Ｃ）。球状または環状の負荷されたミニヌクレオソームを産生し得る、様々な電荷及び等電点を有する他の緩衝液の条件及びアミノ酸配列が存在する。異なる形状及びサイズの分子は、特定の細胞型への指向性を増強することができる。異なる形状のウイルスは、異なる細胞型をより効果的に形質導入する。例えば、タバコモザイクウイルスは、タバコ植物細胞を形質導入する棹状／ヘリカル形状のヌクレオキャプシド構造であり、ＨＩＶは、白血球細胞に感染する丸形またはボール状であり、ＡＡＶ２は、肝臓細胞を効果的に形質導入する正二十面体形である。我々は、筋肉細胞における棹状のものと比較して、スパイラル形のミニヌクレオソームのより良好な形質導入指向性を観察した（図１８）。本明細書に記載の異なる形状の負荷ミニヌクレオソームを製剤化することができた。個々のミニヌクレオソームは、独自の形状及びサイズに基づいて精製することもできる。
実施例４投与経路－静脈内（全身）及び血友病Ａなどの全身疾患への適用。
この実施例は、負荷ミニヌクレオソームが、静脈内経路によって送達され、肝臓及び他の臓器においてタンパク質を発現できることを実証する。標準技術を使用してＢａｌｂ／ｃマウスを拘束し、インスリン注射器を使用して、負荷ミニヌクレオソーム及びプラスミド対照を尾静脈注射で送達した。Ｆ８発現プラスミド構築物（「Ｆ８プラスミド」、例えば、図８、ＭＮ＃１及びＭＮ＃２、を参照）を、それぞれ配列番号３９０及び配列番号３９１をＦ８プラスミドＤＮＡ（配列番号３９４）と縮合させることによって調製した。ＧＦＰ発現構築物のプラスミド配列を配列番号８に提供する。本実施例では、負荷ミニヌクレオソームを肝細胞に標的化するために、核酸結合ドメイン（配列番号３）と一緒に２つのＮＧＲアミノ酸ドメインを組み込んだ。ＡＡＶ２のＮＧＲドメインは、αＶβ５インテグリン結合を促進することが示されている。ＮＧＲドメインは、ＡＡＶ２の受容体として知られるヘパラン硫酸結合に関与する。ＡＡＶ２は、高い肝臓指向性で知られている。これらのコアタンパク質に組み込まれたＫＲＨアミノ酸モチーフはまた、核酸の放出を増強するためのＰＣＳＫ１の切断部位として機能する。複数のＫＲＨアミノ配列を含めることは、負荷されたミニヌクレオソームの放出を増強するはずである。各マウスは、４０マイクログラム用量のＭＮ＃１、ＭＮ＃２、またはネイキッドプラスミドＦ８（配列番号３９４）のいずれかを受けた。Ｆ８タンパク質の発現を試験するために、治療前（１日前）及び治療後（治療後－３日、１週間、２週間、１カ月、３カ月、及び４カ月）に頬出血技術（ｃｈｅｅｋ ｂｌｅｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によって約１５０μｌの血液を収集した。血清を、標準技術を使用して血液から調製した。Ｆ８ Ｅｌｉｓａ（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ）を、１：６の血清希釈液を用いて製造業者の指示に従って行った。負荷ミニヌクレオソーム＃１（ＭＮ＃１には、配列番号３９０＋Ｆ８プラスミドが含まれる）及びＭＮ＃２（ＭＮ＃２には、配列番号３９１＋Ｆ８プラスミドが含まれる）は、前処理試料中のＥＬＩＳＡによって検出されるＦ８のレベルと比較して、約６倍多くのＦ８を発現した。ＭＮ＃１は、負荷ミニヌクレオソームの単回注射の３ヶ月及び４ヶ月後に有意に上昇した発現レベルを維持した（図８）。Ｆ８をコードするネイキッドプラスミド（ミニヌクレオソームコアタンパク質と複合体形成していない）で処置した対照マウスは、いずれの時点でもＦ８発現の有意な増加を示さなかった（図８）。
別の実験では、ＧＦＰ発現プラスミド（配列番号３９０＋ＧＦＰプラスミド、配列番号３９５）を担持する負荷ミニヌクレオソームの静脈内注射を受けたマウスから収集された組織において、直接ＧＦＰ蛍光が観察された（図９）。簡単に説明すると、マウスを１×ＰＢＳで灌流し、屠殺した。解剖後、肝臓全体を収集した。肝臓組織を４％パラホルムアルデヒド中に一晩固定し、その後１×ＰＢＳ中で洗浄し、１５％スクロース中に数時間浸漬し、その後、凍結保存のために３０％スクロース溶液中に一晩浸漬した。次いで、組織をプラスチックバイアルに入れ、切片作成のためにＯＣＴ化合物を使用して凍結した。クリオトームを用いて１０ミクロン厚の組織切片を得た。肝臓切片を、ＤＡＰＩの有りもしくは無しで、封入剤、カバースリップで取り付け、密封した。画像を、Ｌｅｉｃａ ＳＰ５共焦点及び落射蛍光スコープによって取得した。
結果は、静脈内経路によって送達された場合、ミニヌクレオソームは正常に肝臓に到達し、ミニヌクレオソームカーゴにコードされた遺伝子は肝臓細胞で発現されたことを示した（図９）。複数の肝細胞型における発現が観察された。本実施例の観察は、負荷ミニヌクレオソームの肝臓への送達が標的ドメインに依存しないことを示唆している。当業者は、本実施例で提供されるデータを鑑みて、肝臓と同様に、これらの臓器が通常、例えば、薬物のクリアランスで機能するため、負荷ミニヌクレオソームが、静脈内送達を介して腎臓及び脾臓中の細胞に送達され得ることを理解するであろう。
本開示を鑑みて、負荷ミニヌクレオソーム治療薬の使用によって治療することができる状態の一例は、血友病Ａである。血友病Ａは、凝固因子である第８因子の変異によって引き起こされる重篤な出血障害である。Ｘ連鎖劣性遺伝性様式で受け継がれる。これは、約５，０００人に１人の出生において発生する。最も深刻な影響は、死に至る可能性のある内出血である。重症度は、体内で循環するＦ８の量に依存する。血友病患者の７５％は、治療として組換えＦ８製品を服用する。Ｆ８療法を受ける対象は、静脈内に繰り返し注入され、経時的に患者、医師、及び介護者にとって大きな負担につながる。現在、ＡＡＶを介してＦ８の長期発現を提供するための遺伝子治療治験が進行中である。しかしながら、Ｆ８は、ＡＡＶに完全に組み込むことができない大型遺伝子である。したがって、この疾患を治療するためにＦ８の機能ドメインを送達するために、ｍｉｎｉ－Ｆ８が利用されてきた。Ｍｉｎｉ－Ｆ８は、完全長のＦ８と同じ機能能力及び安定性を有さないことがよく知られている。さらに、集団の２０～４０％は、ＡＡＶに対する中和抗体を既に有しており、これにより、大規模な血友病患者集団がＡＡＶベースの医薬品を受けることができなくなる。加えて、ＡＡＶ治療の最初の中止された経過の後にさらなる治療が必要になった場合、免疫原性のためにＡＡＶベクターを再投与することはできない。フルサイズのＦ８遺伝子を送達できること（図８）、及びその再投与可能な（ｒｅｄｏｓａｂｌｅ）性質のため（図１７）、負荷ミニヌクレオソームは、ＡＡＶ遺伝子治療のこれらの２つの問題を解決する。したがって、本開示は、血友病Ａが例示的である多くの状態で使用するために、静脈内送達モードを使用して、肝臓、腎臓、脾臓等の全身空間の異なる細胞型に、負荷ミニヌクレオソームを送達するための技術を提供する。
分泌されたタンパク質の欠陥にしばしば起因する他の全身性疾患も、負荷ミニヌクレオソーム治療薬を使用して治療することができる。本実施例（図８）は、静脈内に送達された負荷ミニヌクレオソーム（全身投与）が、治療閾値を上回るレベルでタンパク質を産生することを実証し、これは、様々な臨床試験によって決定される内在性レベルのおよそ１０％であり、とりわけ、分泌タンパク質が様々な細胞型によって発現することができる全身性疾患の治療のための治療薬としてのミニヌクレオソームの治療可能性を実証する。いくつかの場合には、発現は、細胞型特異的プロモーターを使用することによって、ある特定の細胞型に限定され得る。当業者は、本開示から、脳、心臓、筋肉などの他の組織もまた、静脈内送達を介してアクセス及び形質導入され得ることを理解するであろう。ミニヌクレオソームコアタンパク質に組み込まれた標的化機構は、その状況で役立つはずである。
静脈内注射される場合、負荷ミニヌクレオソームは、体重１ｋｇ当たり１ｅ５ゲノムコピーを超える用量、及び体重１ｋｇ当たり１ｅ２５コピーまでの用量で（例えば、体重１ｋｇ当たり約１ｅ５、１ｅ６、１ｅ７、１ｅ８、１ｅ９、１ｅ１０、１ｅ１５、１ｅ２０、もしくは１ｅ２５コピー、またはそれらの間の任意の範囲で）送達され得る。材料の体積は、１～９００ミリリットル（例えば、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００ミリリットル）の範囲であり得る。負荷ミニヌクレオソームはまた、繰り返し投与され得る（例えば、選択された体積及び／または数のゲノムコピーを、複数回投与できるか、または２回以上の投与に分割され得る）。
実施例５投与経路－眼内
この実施例は、負荷ミニヌクレオソームが、眼内経路によって送達され、網膜色素上皮（ＲＰＥ）または光受容体、双極細胞、及び神経節細胞などの他の網膜ニューロン内でタンパク質を発現できることを実証する。本実施例では、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ケタミン／キシラジン（９０～１００ｍｇ／ｋｇ＋１０ｍｇ／ｋｇ）でのＩＰ注射により麻酔し、顕微鏡の下に配置した。マウスの眼を局所トロピカミド（１％）で拡張し、１ｕｌの負荷ミニヌクレオソーム（マウスでの総用量１．５マイクログラム）を、角膜輪部下で２５ガーゼ針によって作製された切開部を通過する３２ガーゼ鈍針（ｂｌｕｎｔ ｎｅｅｄｌｅ）を使用して硝子体腔に注射した。様々な時点で、マウスを１０ｍｌの１×ＰＢＳで灌流し、次いで標準技術を使用して屠殺した。マウスを眼球摘出し、アイカップを収集し、４％パラホルムアルデヒド中で一晩インキュベートした。アイカップを１×ＰＢＳで洗浄した後、１５％スクロース中に数時間浸漬し、次いで、凍結保存のために３０％スクロース溶液中に一晩浸漬した。次いで、アイカップをプラスチックバイアルに入れ、凍結切片作成のためにＯＣＴ化合物を使用して凍結した。染色のため、１０ミクロンの厚さの組織切片を得た。網膜切片は、ＤＡＰＩの有りもしくは無しで封入剤、カバースリップで取り付けて、密封した。画像をＬｅｉｃａ ＳＰ５によって取得した。全載標本画像化のために、アイカップを４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定した。アイカップを１×ＰＢＳで洗浄し、網膜を除去し、残りのアイカップまたはＲＰＥ全載標本を染色のために処理した。ＲＰＥ組織を封入剤、カバースリップで全体を取り付けて、密封した。画像をＬｅｉｃａ ＳＰ５によって取得した。網膜及びＲＰＥ細胞において、ネイティブＧＦＰ蛍光が観察された（図１０、１１及び１２）。
ＲＰＥ細胞を標的とするために、本実施例は、ＭＥＲＴＫ等の食作用タンパク質に結合し得るミニヌクレオソームコアタンパク質（配列番号３９２）を利用した。ＲＰＥは、それらの微絨毛を光受容体内側／外側セグメント接合部に伸長する食細胞である。ＭＥＲＴＫは、それらの微絨毛で発現する。配列番号３９２において、表８に記載されるように、「イート・ミー（ｅａｔ ｍｅ）」シグナルを組み込んだ。文献では、「イート・ミー」シグナルは、食作用のために準備された細胞破片に露出したドメインとして記載される（Ｗｅｉ Ｌｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１６、参照により本明細書に組み込まれる）。本発明者の知る限り、これらの「イート・ミー」シグナルは、これまで非ウイルスベクターの関連では利用されたことがない。これらの「イート・ミー」シグナルドメインは、ＲＰＥ細胞を標的にする非ウイルスベクターにこれまでに適用されていなかった。
光受容体を選択的に形質導入するために、本実施例は、配列番号３８８のコアタンパク質のようなコアタンパク質を利用した。配列番号３８８は、網膜内のすべてのニューロンである神経節細胞、双極細胞、及び光受容体への形質導入を可能にし得る、本明細書の表８に記載のニューロン付着要素（ＬＲＥ）を含んでいた（図１２）。このニューロン付着ドメインは、これまで、標的ニューロンへの非ウイルスベクターに対して適用されていない。本開示は、このニューロン標的化ベクターが、局所投与または全身投与を介して脳内のニューロンを形質導入することができることを提供する。本開示はさらに、取り込みを増強するために光受容体細胞外マトリックスに付着するためのミニヌクレオソームにレクチン結合ドメイン（表４に記載）を組み込むことによって、光受容体結合及び内在化を標的化することを提供する。ミニヌクレオソームコアタンパク質（配列番号３９０）に組み込まれたインテグリン結合ドメインはまた、眼内送達時にラット眼内でのみＲＰＥ細胞を形質導入することができる（図１１）。さらに、２つ以上のドメインを利用して、複数の多様な細胞型を選択的に形質導入することができる。インテグリン結合特性を有するこのコアタンパク質（配列番号３９０）もまた、高レベルのαＶβ５インテグリンを発現する他の細胞型への核酸の送達に利用され得る。本開示はさらに、網膜内の光受容体、ＲＰＥ、ミュラー細胞、または他の細胞型を標的とする網膜下、脈絡膜上、髄腔内、または局所投与などの他の眼内注射技術の使用を提供する。
本明細書に提供されるのは、硝子体内または網膜下送達モードを使用して、負荷ミニヌクレオソームを網膜内の異なる細胞型に送達するための技術である。網膜変性のような疾患は、主に、光受容体で発現する遺伝子の突然変異によって引き起こされる。加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）及び脈絡毛細血管の疾患であり、１０００万人超えるアメリカ人及び世界中で１億人超える人々に影響を及ぼす。現在、遺伝子治療ベクターを光受容体及びＲＰＥに送達するための主な技術は、網膜内で網膜下にウイルスを注射する外科的手法である。しかし、網膜下手術は、訓練を受けた眼科外科医によって手術室で行われる複雑な手術である。少なくともアメリカでは、この手術を行うために訓練を受けた外科医はほんの一握りであるという点で、満たされていないニーズがある。患者及び医師の負担を軽減する１つの方法は、網膜を通過して、光受容体及びＲＰＥを形質導入することができる硝子体内注射可能なベクターを開発することである。硝子体内注射は、入院中にすべての眼科医によって行うことができる。負荷ミニヌクレオソーム療法は、硝子体内注射が光受容体及びＲＰＥを選択的に形質導入する可能性があるため、この問題を解決する（図１０、１１、及び１２）。これにより、ミニヌクレオソームは遺伝的欠陥を有するほとんどの網膜疾患の治療に非常に適している。
眼内注射される場合、負荷ミニヌクレオソームは、１眼当たり１ｅ５ゲノムコピーを超える用量で、及び１眼当たり１ｅ２５コピーまでの用量で（例えば、１眼当たり約１ｅ５、１ｅ６、１ｅ７、１ｅ８、１ｅ９、１ｅ１０、１ｅ１５、１ｅ２０、もしくは１ｅ２５コピー、またはそれらの間の任意の範囲で）送達され得る。材料の体積は、網膜下に注射される場合、１０～５００マイクロリットルの範囲（例えば、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、または５００マイクロリットル）にあり、注射が硝子体内、脈絡膜上、または前房内にされる場合、１０～２５０マイクロリットル（例えば、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、または２５０マイクロリットル）の範囲であり得る。負荷ミニヌクレオソーム治療薬はまた、繰り返し投与され得る（例えば、選択された体積及び／または数のゲノムコピーは、複数回投与され得るか、または２回以上の投与に分割され得る）。
実施例６投与経路－鼻腔内
この実施例は、負荷ミニヌクレオソームが、鼻腔内経路によって送達され、肺、気管、及び腸細胞内のタンパク質を発現できることを実証する。本実施例では、肺上皮の上皮細胞を標的とするために、２つのＮＧＲアミノ酸ドメインを、核酸結合ドメインとともにミニヌクレオソームコアタンパク質に含めた（配列番号３９０のＮＧＲアミノ酸ドメインの使用を参照されたい）。本発明者の知る限り、ＮＧＲドメインは、本明細書に開示されるように、非ウイルスＤＮＡ／タンパク質複合体を作製し、網膜細胞に送達するために利用されたことはない。ＡＡＶ２のＮＧＲドメインは、αＶβ５インテグリン結合を促進することが示されている。ＮＧＲドメインは、ＡＡＶ２の受容体として知られるヘパラン硫酸結合に関与する。
本実施例では、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ケタミン／キシラジン（９０～１００ｍｇ／ｋｇ＋１０ｍｇ／ｋｇ）でのＩＰ注射により麻酔し、麻酔したマウスを鼻腔内送達のための鼻領域を視覚化するために顕微鏡の下に配置してした。１ｕｌの負荷ミニヌクレオソーム（配列番号３９０＋ＧＦＰプラスミド）溶液を、１２マイクロリットルが各鼻側に送達されるまで、数秒ごとに鼻腔に送達した。２５マイクログラムの総用量が送達された。屠殺後、マウス肺を処理して、１０ミクロンの厚さの切片を得た。切片をＰＢＳ中で洗浄し、ブロッキング緩衝液（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１％ＢＳＡ、３％ロバ血清）中で１時間インキュベート後、ＣＦＴＲ抗体（ブロッキング緩衝液上で調製）ブロッキング緩衝液中で、４℃で一晩インキュベートした。翌日、ＰＢＳ中で３×５分間洗浄し、ブロッキング緩衝液中、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ－５５５（ロバ抗ウサギＩｇＧ二次）中で、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で３×５分間洗浄した。封入剤を添加し、カバースリップを適用し、密封した。ＧＦＰのネイティブ蛍光は、４８６ｎｍ波長のＬｅｉｃａＳＰ５スコープの４８６ｎｍチャネルで及びＣＦＴＲ発現が５５５ｎｍチャネルで得られた。負荷ミニヌクレオソーム発現は、早くも３日で、及びＰＩ－３ヶ月でも観察された（図１３）。ＣＦＴＲ染色とともに鮮明な緑色の蛍光によって示される肺胞及び細気管支の両方の上皮における発現を観察した（図１３Ａ及び１３Ｃ）。ＣＦＴＲ及びＧＦＰの共局在化（図１３Ｃ）は、肺上皮のミニヌクレオソームによってコードされる遺伝子の発現を示す。肺胞リング（ａｌｖｅｏｌｉ ｒｉｎｇ）から撮影したより高倍率画像（図１４Ａ、Ｂ、及びＣ）も、ＣＦＴＲ染色細胞における赤色蛍光とともに、上皮におけるＧＦＰ蛍光の明るい緑色の環を明確に示す。
本実施例では、ミニヌクレオソームを介した全肺組織及び生体分布も評価した（図１５）。全肺組織を、灌流及び屠殺後にマウスから抽出した。肺組織を４％ＰＦＡで固定し、１×ＰＢＳで洗浄した。ＧＦＰネイティブ蛍光を検出するために、全組織をＯｄｙｓｓｅｙイメージャーに配置した。注入されていない対照は、蛍光を示さなかった（図１５）。ＧＦＰをコードするプラスミド核酸カーゴを含む負荷ミニヌクレオソームは、注入後５週間の試料において、全肺組織でＧＦＰの蛍光を示した（図１５）。
本明細書では、負荷ミニヌクレオソームを、鼻腔内送達モードを使用して、肺上皮、及び／または気管等の肺空間の組織中の異なる細胞型に送達するための技術が提供される。嚢胞性線維症等の遺伝的疾患は、肺及び他の臓器に影響を及ぼす。遺伝子を肺に送達するために、鼻腔内は選択経路の１つである。負荷ミニヌクレオソームが鼻腔内に送達されると、肺胞及び細気管支でタンパク質を発現することが観察された（図１３）。これらは、通常、嚢胞性線維症に関与するＣＦＴＲタンパク質を発現する組織である。他の疾患において、この投与経路を使用して、他の疾患を軽減し得る治療用タンパク質を産生することができる。鼻腔内経路はまた、腸及び脳などの他の臓器へのアクセスを提供し得る（図１６）。ＮＧＲドメインをミニヌクレオソームコアタンパク質（配列番号３９０）に含めることにより、高レベルの持続発現のために、核へのＤＮＡ分子の取り込み及び放出を強化することが可能になった。これは、図１６における、処置後５週間での、負荷ミニヌクレオソームから観察される鮮やかな緑色の蛍光と、未処置動物でのかかるパターンがないことによって証明される（図１６の最初の列の肺画像）。負荷ミニヌクレオソームの鼻腔内送達後に、気管上皮及び気管筋におけるＧＦＰの発現の形質導入も観察した（図１７）。
鼻腔内注入される場合、負荷ミニヌクレオソームは、体重１ｋｇ当たり１ｅ５ゲノムコピーを超える用量、及び体重１ｋｇ当たり１ｅ２５コピーまでの用量で（例えば、体重１ｋｇ当たり１ｅ５、１ｅ６、１ｅ７、１ｅ８、１ｅ９、１ｅ１０、１ｅ１５、１ｅ２０もしくは１ｅ２５コピー、またはそれらの間の任意の範囲で）送達され得る。材料の体積は、１～２００ミリリットル（例えば、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、または２００ミリリットル）の範囲であり得る。負荷ミニヌクレオソームはまた、繰り返し投与されてもよい。負荷ミニヌクレオソームはまた、腸、膵臓等にアクセスするために経口送達し得る。
実施例７投与経路－筋肉内
この実施例は、負荷ミニヌクレオソームが、筋肉内経路によって送達され、筋肉細胞においてタンパク質を発現できることを実証する。Ｂａｌｂ／ｃマウスをケタミン／キシラジン（９０～１００ｍｇ／ｋｇ＋１０ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射で麻酔し、インスリン注射器を使用して、脚あたり１７．５ｕｇの用量で、いくつかの負荷ミニヌクレオソームを両脚の筋肉に注射した（マウス当たり３５マイクログラムの総用量）。マウスを様々な時点で屠殺し、組織切片のため脚部筋肉を得た。ポリリジン（配列番号３９３）または他のドメイン組み合わせを有するミニヌクレオソーム（配列番号３８９）などのコアタンパク質を含有した構築物は、３ヶ月時点でＧＦＰ蛍光を示さなかった。驚くべきことに、注射から３ヶ月後に得られた筋肉組織切片では、配列番号３９１に示されるように、ガラクトース及びフコース結合ドメインを含有する負荷ミニヌクレオソームを注射した骨格筋細胞において鮮明な緑色の蛍光を観察した（図１８Ａ、Ｂ及びＣ）。これは、いくつかのドメインが、筋肉細胞への付着及び内在化の傾向がより高く、筋肉細胞への効率的な遺伝子導入に利用され得ることを示している。当業者は、そのようなドメインを筋肉指向性で知られている他のドメインと組み合わせることを企図することができる。
核酸カーゴによってコードされる遺伝子の発現の筋肉特異性を検証するために、内在性二次マーカーとしてジストロフィン免疫標識を利用した。ジストロフィン染色の赤色蛍光（パネルＢ；パネルＣに併合）で囲まれた鮮明な緑色蛍光（パネルＡ）の領域は、筋肉内に注射された負荷ミニヌクレオソームが筋肉細胞に遺伝子を送達することができることを明確に実証している（図１８）。ＧＦＰのネイティブ蛍光は、ＬｅｉｃａＳＰ５スコープの４８６ｎｍチャネルで得られた。赤色のジストロフィンは、ＲＦＰチャネル（５５５ｎｍ）である。図中の形質導入されていない筋肉細胞はまた、ＧＦＰシグナルと自己蛍光との間の鑑別のための内部対照としても機能する。
本明細書に提供されるのは、筋肉内送達モードによって負荷ミニヌクレオソームを筋肉細胞に送達するための技術である。多くの遺伝的筋ジストロフィーは、筋肉細胞の萎縮を引き起こす。これらの筋肉細胞に機能的遺伝子を送達するために、筋肉内経路は直接的な投与経路を提供する。負荷ミニヌクレオソームの筋肉指向性及び骨格筋細胞で遺伝子を発現す能力を実証した（図１８）。発現は、早ければ送達後２日目に筋肉細胞で観察された。本明細書に提供されるのは、ベクター取り込み及び遺伝子発現を増強し得る筋肉指向性のドメインであるが、これらに限定されない。また、筋肉内経路を介して送達されるスパイラル形状の負荷ミニヌクレオソームが、筋肉細胞を効果的にかつより長期間、この場合、小葉形状分子（データ図示せず）と比較して３ヶ月間形質導入する（図１８）ことも観察した。ベクターの形状は、遺伝子を筋肉細胞に送達する関連で以前に説明されていなかった。当業者は、筋肉細胞の細胞指向性を高めるために他の構造を利用することも考えられ得る。全体的に、ジストロフィン発現筋肉細胞におけるＧＦＰの発現は、負荷ミニヌクレオソームが、デュシェンヌ筋ジストロフィーまたは他の筋ジストロフィー等の疾患を救済する能力を示している。筋肉指向性はまた、表４に記載される他のドメインを含めることによって強化され得る。筋肉指向性はまた、静脈内送達によって達成され得る。
筋肉内経路を介して注入される場合、負荷ミニヌクレオソームは、体重１ｋｇ当たり１ｅ５ゲノムコピーを超える用量、及び体重１ｋｇ当たり１ｅ２５コピーまでの用量で（例えば、体重１ｋｇ当たり約１ｅ５、１ｅ６、１ｅ７、１ｅ８、１ｅ９、１ｅ１０、１ｅ１５、１ｅ２０もしくは１ｅ２５コピー、またはそれらの間の任意の範囲で）送達され得る。材料の体積は、１～９００ミリリットル（例えば、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００ミリリットル）の範囲であり得る。負荷ミニヌクレオソームはまた、繰り返し投与され得る（例えば、選択された体積及び／または数のゲノムコピーを、複数回投与できるか、または２回以上の投与に分割され得る）。負荷ミニヌクレオソームはまた、筋肉細胞にアクセスするために、静脈内に投与されてもよい。
実施例８負荷ミニヌクレオソームは、再投与可能である
この実施例は、ミニヌクレオソームがタンパク質の発現に中和効果を与えることなく再投与することができることを実証する（図１９）。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、標準的な拘束技術を使用して単純に拘束し、インスリンシリンジを使用して、負荷ミニヌクレオソームＭＮ＃１（配列番号３９０＋Ｆ８プラスミド）、及びＭＮ＃２（配列番号３９１＋Ｆ８プラスミド、配列番号３９３）を、尾静脈注射を介して送達した。各マウスは、２０マイクログラムの初回投与及び４０マイクログラムの２回目投与（初回投与の３０日後）を受けた。初回及び２回目の投与後３日目に頬出血技術によって血清を収集した。毎回約１５０ｕｌの血液を収集し、標準の技法を使用して血液から血清を収集した。Ｆ８Ｅｌｉｓａを実行して、負荷ミニヌクレオソームの静脈内送達後のＢａｌｂ／ｃマウスにおける血清中のＦ８の発現レベルを決定した。Ｆ８ Ｅｌｉｓａを製造業者（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ）の指示に従って実行した。すべてのアッセイについて１：６の血清希釈を行った。Ｆ８のタンパク質レベルの増加によって証明されるように、２回目の送達では、発現レベルに中和効果がないことを観察した（図１９）。
本明細書で提供されるのは、所望のタンパク質の発現レベルを増強するために繰り返し送達され得るミニヌクレオソームコアタンパク質及び負荷ミニヌクレオソームの例である。再投与可能性は、繰り返し投与を必要とする可能性のある任意の薬物にとって非常に重要な特徴である。遺伝子療法において、現在、ウイルスベクターの最も望ましくない特徴のうちの１つは、医薬品を再投与できないことである。注射されるウイルスベクターを患者に一度注射すると、中和抗体の形成を引き起こす。これは、それらが２回目に投与されるとき、免疫原性及び非発現性（ｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を引き起こす。本明細書では、ミニヌクレオソーム介した遺伝子送達がこの問題を解決することを示す。ミニヌクレオソームの非免疫原性は、自己ペプチドまたはヒト由来アミノ酸配列を組み合わせ、ペグ化によって増強するという設計によって操作される。文献では、ペグ化タンパク質は免疫系を回避することが示されている。この場合、マウスでは、人工ヒト由来コアタンパク質に対する免疫原性の欠如が、ペグ化の場合をさらに検証する。この再投与可能な特性は、必要に応じて患者に複数の治療を可能にする。発現レベルが経時的に低下する場合、この再投与可能な特性により、繰り返し治療をして発現を所望のレベルに高めることが可能である。このデータはまた、多臓器注入を必要とする一部の患者において、ミニヌクレオソーム媒介遺伝子導入が最も望ましいことを示す。当業者はまた、局所、経口、膣、腹腔内、眼内、髄腔内、脳内、皮下等の多くの他の投与経路を介して、またはリポソームもしくは他の合成材料へのカプセル封入を介して繰り返し投与を企図することもできる。
繰り返し投与は、体重１ｋｇ当たり１ｅ５ゲノムコピーを超える濃度、及び体重１ｋｇ当たり１ｅ２５コピーまでの用量で（例えば、体重１ｋｇ当たり約１ｅ５、１ｅ６、１ｅ７、１ｅ８、１ｅ９、１ｅ１０、１ｅ１５、１ｅ２０もしくは１ｅ２５コピー、またはそれらの間の任意の範囲で）送達され得る。材料の体積は、１～９００ミリリットル（例えば、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００ミリリットル）の範囲であり得る。負荷ミニヌクレオソームはまた、繰り返し投与され得る（例えば、選択された体積及び／または数のゲノムコピーを、複数回投与できるか、または２回以上の投与に分割され得る）。
実施例９一般的な技術
この実施例は、クローニング、ミニヌクレオソームの細胞への送達のための一般的な技法を記載する。これらのベクターの構築に適用され得るクローニング技法のいくつかは、導入遺伝子構築物の合成、ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニング、平滑末端クローニング、シームレスクローニング、ロングフラグメントクローニング、制限酵素消化及びライゲーションを含み得るが、これらの技法に限定されない。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、及びルシフェラーゼなどであるがこれらに限定されない、１つ以上の発現マーカーを発現し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、１つ以上の治療用ＲＮＡまたはタンパク質を発現してもよいが、これらに限定されない。
負荷ミニヌクレオソームは、ＨＥＫ細胞または他の動物細胞株で発現させることによってそれらの機能について試験することができ、インビトロで特性評価することができる。合成及び／または精製された負荷ミニヌクレオソームの、造血幹細胞または分化した末梢血単核細胞を形質導入する能力は、細胞を培養物中の負荷ミニヌクレオソームに曝露することによってアッセイすることができる。負荷ミニヌクレオソームは、ミニヌクレオソームへの曝露によって、またはトランスフェクション技法、または挿入のための他の物理的方法を介して、インビトロでキメラＴ細胞を形成するそれらの機能及び能力についても試験することができる。負荷ミニヌクレオソームは、それらの機能について試験することができ、それに限定されないが、マウスまたは任意の他の動物モデルで送達することによってインビボで特性評価される。
配列：
配列番号３８８
ＫＫＲＨＲＫ－［リンカー］－ＬＲＥ－［リンカー］ＫＲＨＲＫＬＲＲＲＲＲＬＫＲＨＲＫＫＲＨＲＫ－［リンカー］－ＬＲＥ－［リンカー］－Ｋ
（式中、［リンカー］は、表１２に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない）
配列番号３８９
ＫＫＫＲＨＲＫＲＫＲＫＲＫＲＲＲＲＫＫＫ－［リンカー］－ＡＳＳＬＮＩＡＫ－［リンカー］－ＲＲＲＲ
（式中、［リンカー］は、表１２に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない）
配列番号３９０
ＫＫＫＲＫ－［リンカー］－ＮＧＲ－［リンカー］－ＫＲＫＲＫＫＲＨＲＫＫＫＫＲＲＲＲＫＲＨＲＫ－［リンカー］－ＮＧＲ－［リンカー］－ＫＫＫ
（式中、［リンカー］は、表１２に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない）
配列番号３９１
ＫＫＫＲＨＲＫＫＫＫＫ－［リンカー］－ＲＧＤ－［リンカー］－ＫＫＫＫ－［リンカー］－ＮＴＱＩＨ－［リンカー］－ＲＲＲＲＲ－［リンカー］－ＴＰＨ－［リンカー］－ＫＫ
（式中、［リンカー］は、表１２に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない）
配列番号３９２
ＫＫＫＲＫ－［リンカー］－ＫＴＫＫＫ－［リンカー］－ＡＫ－［リンカー］－ＫＡＬＫＫＫ－［リンカー］－ＫＫＧＫＫＫＫＲＲＲＲＫＡＡＰＫＫ
（式中、［リンカー］は、表１２に記載される任意のアミノ酸配列であり得るが、これに限定されない）
配列番号３９３
ＣＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ
配列番号３９４
ＣＢＡ－Ｆ８プラスミド
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配列番号３９５
ＣＢＡ－ＧＦＰプラスミド
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配列番号３９６
ＣＢＡ－ルシフェラーゼプラスミド
ＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣＡＧＴＧＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＧＴＣＴＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴＣＴＡＴＣＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＣＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＡＡＧＧＣＴＡＴＧＡＡＧＡＧＡＴＡＣＧＣＣＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＡＴＴＧＣＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＣＡＣＡＴＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＡＡＡＴＧＴＣＣＧＴＴＣＧＧＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＣＴＡＴＧＡＡＡＣＧＡＴＡＴＧＧＧＣＴＧＡＡＴＡＣＡＡＡＴＣＡＣＡＧＡＡＴＣＧＴＣＧＴＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＴＴＣＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＧＧＧＣＧＣＧＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＧＡＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＧＣＣＣＧＣＧＡＡＣＧＡＣＡＴＴＴＡＴＡＡＴＧＡＡＣＧＴＧＡＡＴＴＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＣＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＴＴＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＧＡＡＣＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＣＣＣＡＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴＡＡＡＡＣＧＧＡＴＴＡＣＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＡＧＴＣＧＡＴＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＴＣＡＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＴＣＣＴＴＣＧＡＴＡＧＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＧＣＡＣＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＴＡＡＡＧＧＴＧＴＣＧＣＴＣＴＧＣＣＴＣＡＴＡＧＡＡＣＴＧＣＣＴＧＣＧＴＧＡＧＡＴＴＣＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＴＣＡＡＡＴＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴＡＣＴＧＣＧＡＴＴＴＴＡＡＧＴＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＴＣＣＡＴＣＡＣＧＧＴＴＴＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＡＣＴＡＣＡＣＴＣＧＧＡＴＡＴＴＴＧＡＴＡＴＧＴＧＧＡＴＴＴＣＧＡＧＴＣＧＴＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＴＣＡＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＡＴＴＣＡＡＡＧＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＡＡＣＣＣＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＡＣＴＣＴＧＡＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＴＣＴＡＡＴＴＴＡＣＡＣＧＡＡＡＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＣＣＣＣＴＣＴＣＴＡＡＧＧＡＡＧＴＣＧＧＧＧＡＡＧＣＧＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＧＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴＡＴＣＡＧＧＣＡＡＧＧＡＴＡＴＧＧＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＡＣＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＴＴＣＴＧＡＴＴＡＣＡＣＣＣＧＡＧＧＧＧＧＡＴＧＡＴＡＡＡＣＣＧＧＧＣＧＣＧＧＴＣＧＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＡＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＧＣＴＧＧＧＣＧＴＴＡＡＴＣＡＡＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＴＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＴＣＣＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＴＣＣＧＧＴＴＡＴＧＴＡＡＡＣＡＡＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＧＡＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＴＧＧＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＡＴＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＴＴＧＡＣＣＧＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＣＴＧＡＴＴＡＡＧＴＡＣＡＡＡＧＧＣＴＡＴＣＡＧＧＴＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＧＡＣＧＣＡＧＧＴＧＴＣＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＣＣＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＧＡＧＣＡＣＧＧＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＴＴＡＣＧＴＣＧＣＣＡＧＴＣＡＡＧＴＡＡＣＡＡＣＣＧＣＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＣＧＣＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＧＡＡＧＴＡＣＣＧＡＡＡＧＧＴＣＴＴＡＣＣＧＧＡＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＧＡＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＴＣＧＣＣＧＴＧＴＡＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＴＣＧＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＧＣＣＣＡＡＴＣＴＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＡＣＡＡＣＣＡＡＴＴＡＡＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＡＡＴＧＡＡＡＣＴＧＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＡＴＡＴＣＡＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＧＴＡＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＣＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＡＧＧＡＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＧＧＴＣＴＧＣＧＡＴＴＣＣＧＡＣＴＣＧＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＣＣＣＴＣＧＴＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧＧＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＡＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＣＧＡＣＴＧＡＡＴＣＣＧＧＴＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＣＴＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴＡＣＧＣＴＣＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡＴＣＡＣＴＣＧＣＡＴＣＡＡＣＣＡＡＡＣＣＧＴＴＡＴＴＣＡＴＴＣＧＴＧＡＴＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＣＧＡＡＡＴＡＣＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧＴＴＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＡＣＡＧＧＡＡＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＣＣＧＧＣＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＴＧＣＣＡＧＣＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＴＡＴＴＴＴＣＡＣＣＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＡＣＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＧＧＡＧＴＡＣＧＧＡＴＡＡＡＡ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ＴＣＣＣＡＴＡＣＡＡＧＣＧＡＴＡＧＡＴＴＧＴＣＧＣＡＣＣＴＧＡＴＴＧＣＣＣＧＡＣＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＧＣＣＣＡＴＴＴＡＴＡＣＣＣＡＴＡＴＡＡＡＴＣＡＧＣＡＴＣＣＡＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＴＡＡＴＣＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＣＧＴＴＴＣＣＣＧＴＴＧＡＡＴＡＴＧＧＣＴＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＴＴＡＴＧＴＡＡＧＣＡＧＡＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＡＴＣＴＴＧＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＴＴＴＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡ
参照による組み込み
本出願で参照される刊行物及び特許は、それらの全体が組み込まれている。
引用非特許文献：
１．Ｌａｉ，Ｙ，Ｙｕｅ，Ｙ ａｎｄ Ｄｕａｎ，Ｄ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆａｉｌｕｒｅ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ５ ｔｏ ｐａｃｋａｇｅ ａ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ ≧８．２ ｋｂ．（２０１０）．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８：７５－７９．
２．Ｓｍｉｔｈ Ｒ．Ｈ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ：ｖｉｒｕｓ ｖｅｒｓｕｓ ｖｅｃｔｏｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８；１５：８１７－８２２．
３．Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ Ｚ．，Ｌｅｂｏｒｇｎｅ Ｃ，Ｂａｒｂｏｎ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｅ－ｅｘｉｓｔｉｎｇ Ａｎｔｉ－ｃａｐｓｉｄ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８ Ｊｕｎ １５； ９：１１９－１２９．
４．Ｇｕｅｒｒａ－Ｃｒｅｓｐｏ Ｍ，Ｃｈａｒｌｉ ＪＬ，Ｒｏｓａｌｅｓ－Ｇａｒｃｉａ ＶＨ，Ｐｅｄｒａｚａ－Ａｌｖａ Ｇ，Ｐｅｒｅｚ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｌ．Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐｏｓｔ－ｍｉｔｏｔｉｃ ｒａｔ ｆｅｔａｌ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３；１２７（２）：１７９－９２．
５．Ｓｕｔａｐａ Ｂａｒｕａ ａｎｄ Ｓａｍｉｒ Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ．Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｃｒｏｓｓ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｎａｎｏ ｔｏｄａｙ．２０１４．９（２）：２２３－２４３．
６．Ｚａｂｎｅｒ，Ｊ．，Ｆａｓｂｅｎｄｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｍｏｎｉｎｇｅｒ，Ｔ．，Ｐｏｅｌｌｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｌｓｈ，Ｍ．Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｔｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ａ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：１８９９７－１９００７．
７．Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ＮＳ，Ｓｅｎｚｅｒ Ｎ（２０１１）Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｂｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｉｎｖａｇｉｎａｔｅｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｓｙｎｄｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｓ５：００２
８．Ｗｉｌｋｅ，Ｍ．，Ｆｏｒｔｕｎａｔｉ，Ｅ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｋ，Ｍ．，Ｈｏｏｇｅｖｅｅｎ，Ａ．Ｔ．，ａｎｄ Ｓｃｈｏｌｔｅ，Ｂ．Ｊ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｍｉｔｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９６）３：１１３３－ １１４２．
９．Ｇｅ Ｌｉｕ，ＤｅＳｈａｎ Ｌｉ，Ｍｕｒａｌｉ Ｋ Ｐａｓｕｍａｒｔｈｙ，ｅｔ ａｌ．２００３．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｆ Ｃｏｍｐａｃｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔ Ｐｏｓｔｍｉｔｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｖｏｌ．２７８，Ｎｏ．３５，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ａｕｇｕｓｔ ２９，ｐｐ．３２５７８－３２５８６
１０．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｗ．Ｋｏｎｓｔａｎ，Ｐａｍｅｌａ Ｂ．Ｄ．，Ｊｅｆｆｅｒｅｙ Ｓ．Ｗ．，Ｋａｔｈｌｅｅｎ Ａ．Ｈ．，Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ．Ｓ．，Ｌａｕｒａ Ｊ．Ｈ．Ｍ．，Ｔｏｍａｓｚ Ｈ．Ｋ．，Ｓｕｓａｎｎａｈ Ｌ．Ｈ．，Ｔａｍａｒａ Ｌ．Ｆ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｒ．Ｇ．，Ｓｈａｒｏｎ Ｍ．Ｏ．，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｍ．Ｐ．，Ｏｓｍａｎ Ｍ．，Ａｓｓｅｍ Ｇ．Ｚ．，Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｊ．Ｃ．Ｃｏｍｐａｃｔｅｄ ＤＮＡ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｎａｓａｌ Ｍｕｃｏｓａ ｏｆ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ Ａｒｅ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ Ｐａｒｔｉａｌ ｔｏ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．２００４．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１５：１２５５－１２６９
１１．Ｄ’Ｓｏｕｚａ ＳＥ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ ＭＨ，Ｐｌｏｗ ＥＦ．Ａｒｇｉｎｙｌ－ｇｌｙｃｙｌ－ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ（ＲＧＤ）：ａ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｔｉｆ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．１９９１ Ｊｕｌ；１６（７）：２４６－５０．
１２．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｎａｔｈａｎ Ｋａｔｚ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｌ．Ｂｕｚａ，Ｃｅｃｉｌｉａ Ｄｙｅｒ，Ｔａｍａｒａ Ｇｏｏｄｅ，Ｐｅｔｅｒ Ｂｅｌｌ，Ｌａｕｒａ Ｋ．Ｒｉｃｈｍａｎ，ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ．Ｓｅｖｅｒｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｌｅｔｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｈｉｇｈ－Ｄｏｓｅ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＳＭＮ．２０１８．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｖｏｌ ２９．Ｎｏ ３．
１３．Ｗｏｄｒｉｃｈ Ｈ，Ｈｅｎａｆｆ Ｄ，Ｊａｍｍａｒｔ Ｂ，Ｓｅｇｕｒａ－Ｍｏｒａｌｅｓ Ｃ，Ｓｅｅｌｍｅｉｒ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａ Ｃａｐｓｉｄ－Ｅｎｃｏｄｅｄ ＰＰｘＹ－Ｍｏｔｉｆ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ６（３）：ｅ１０００８０８．
１４．Ｋａｉｌａｓｈ Ｎ．Ｐａｎｄｅｙ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １４，５３３９－５３６０，Ｊｕｎｅ １，２００９
１５．Ｃｌａｉｒｅ Ｓｕｎｙａｃｈ，Ａｎｇｅｌａ Ｊｅｎ，Ｊｕｅｌｉｎ Ｄｅｎｇ，Ｋａｔｈｌｅｅｎ Ｔ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｙｖｅｌｉｎｅ Ｆｒｏｂｅｒｔ，Ｊａｃｑｕｅｓ Ｇｒａｓｓｉ，Ｍａｒｙ Ｗ．ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，Ｒｏｇｅｒ Ｍｏｒｒｉｓ．Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．２２ Ｎｏ．１４．ｐｐ．３５９１±３６０１，２００３
１６．Ｍｏｄｅｓｔｏ Ｒｅｄｒｅｊｏ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｄａｎｉｅｌ Ｍｕｎｏｚ－Ｅｓｐｉｎ，Ｉｓａｂｅｌ Ｈｏｌｇｕｅｒａ，Ｍａｒｉｏ Ｍｅｎｃｉａ，ａｎｄ Ｍａｒｇａｒｉｔａ Ｓａｌａｓ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ ａｒｅ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．ＰＮＡＳ．２０１２．Ｖｏｌ １０９．Ｎｏ ４５．１８４８２－１８４８７．
１７．Ｃｈｅｅ Ｋａｉ Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ａ Ｊａｎｓ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ Ｄｏｅｓ Ｎｏｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ａ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｖｏｌ １０．Ｎｏ １０．１９９９．
１８．Ｊａｎｓ ＤＡ，Ｍｏｌｌ Ｔ，Ｎａｓｍｙｔｈ Ｋ，Ｊａｎｓ Ｐ．Ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｔｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＳＷ１５ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９５ Ｊｕｌ ２１； ２７０（２９）：１７０６４－７．
１９．Ｋｉｒｃｈｈａｕｓｅｎ Ｔ，１９９９．Ａｄａｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｆｆｉｃ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．１９９９；１５：７０５－３２．
２０．Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ ＶａｎｄｅＶｏｎｄｅｌｅ Ｊａｎｏｓ Ｖｏｒｏｓ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａ．Ｈｕｂｂｅｌｌ．ＲＧＤ－Ｇｒａｆｔｅｄ Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ－ｇｒａｆｔ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｂｌｏｃｋ Ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｗｈｉｌｅ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．７，２００３
２１．Ｌ．Ｆｅｕｚ ｅｔ ａｌ．：Ｓｍａｌｌ－ａｎｇｌｅ ｎｅｕｔｒｏｎ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ＰＬＬ ｇｒａｆｔｅｄ ＰＥＧ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｕｓｈｅｓ．Ｅｕｒ．Ｐｈｙｓ．Ｊ．Ｅ ２３，２３７－２４５（２００７）．
２２．Ｓｕｎ Ｔｉａｎ，Ｑｉｎｇｓｈｅｎｇ Ｈｕａｎｇ，Ｙｉｎｇ Ｆａｎｇ，Ｊｉａｎｈｕａ Ｗｕ．（２０１１）ＦｕｒｉｎＤＢ：ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ２０－ｒｅｓｉｄｕｅ ｆｕｒｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ｍｏｔｉｆｓ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｒｕｇｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．，１２，１０６０－１０６５．
２３．Ｎａｊｊａｒ Ｋ，Ｅｒａｚｏ－Ｏｌｉｖｅｒａｓ Ａ，Ｐｅｌｌｏｉｓ Ｊ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｒ ｃｅｌｌ－ｉｍｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｔｏ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ ｒｅａｇｅｎｔ ｏｆ ＴＡＴ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１５；１０３
２４．Ｔａｓｈｉｒｏ Ｋ，Ｓｅｐｈｅｌ Ｇ．Ｃ．，Ｗｅｅｋｓ Ｂ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｒ．，Ｋｌｅｉｎｍａｎ，Ｈ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．１９８９．Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ＩＫＶＡＶＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒｍ ｔｈｅ Ａ ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｌａｍｉｎｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｅｌｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｉｔｅ ｇｒｏｗｔｈ．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６４，１６１７４－１６１８２．
２５．Ｇｒａｆ，Ｊ．，Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｒ．，Ｋｌｅｉｎｍａｎ，Ｈ．Ｋ．，Ｒｏｂｅｙ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．１９８７．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｃｅｌｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｓｉｔｅ（ｙｉｇｓｒ）ｉｎ ｔｈｅ ｂ１－ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｌａｍｉｎｉｎ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，８８，４９１．
２６．Ｍｉｓｈｒａ，Ａ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｖ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｃｏｒｉｄａｎ，Ｒ．ａｎｄ Ｗｏｎｇ，Ｇ．（２００８）ＨＩＶ ＴＡＴ ｆｏｒｍｓ ｐｏｒｅｓ ｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｓａｄｄｌｅ－ｓｐｌａｙ ｃｕｒｖａｔｕｒｅ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｂｉｄｅｎｔａｔｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．４７，２９８６－２９８９．
２７．Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｊｅｓｓｏｐ，Ｔ．Ｃ．ａｎｄ Ｗｅｎｄｅｒ，Ｐ．Ａ．（２００５）Ａｄａｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ：ｔｈｅ
２８．ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ－ｒｉｃｈ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５７，４９５－５０４．
２９．Ｙｕｘｉｎ Ｃｈｅｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｔ．Ｇｕａｒｎｉｅｒｉ Ａｄｒｉａｎａ Ｉ．Ｖａｓｉｌ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｌ．Ｖａｓｉｌ，Ｃｏｌｉｎ Ｔ．Ｍａｎｔ，ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｈｏｄｇｅｓ．Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ －Ｈｅｌｉｃａｌ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．２００７．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ａｐｒ．２００７，ｐ．１３９８－１４０６
３０．Ｗｕ Ｚ，Ｓｉｍｉｓｔｅｒ ＮＥ．Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ－ ａｎｄ ｄｉｌｅｕｃｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１．ｅｂ １６；２７６（７）：５２４０－７．Ｅｐｕｂ ２０００ Ｎｏｖ ２８．
３１．Ｊｏｈｎ Ｐ．Ｈ．Ｔｈ’ｎｇ，Ｒｏｈｙｕｎ Ｓｕｎｇ，Ｍｉｎｇ Ｙｅ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊ．Ｈｅｎｄｚｅｌ．Ｈ１ ｆａｍｉｌｙ ｈｉｓｔｏｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００５；２８０：２７８０９－２７８１４
３２．Ｃａｒｄｉｎ ＡＤ，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ＨＪ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏ－ｇｌｙｃａｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ９：２１－３２．
３３．Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｍ，Ｎｏｇｕｅ’ｓ ＭＶ，Ａｎｄｒｅｕ Ｄ，Ｂｏｉｘ Ｅ（２０１２）Ｔｈｅ ‘‘ＣＰＣ Ｃｌｉｐ Ｍｏｔｉｆ’’：Ａ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｆｏｒ Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（８）：ｅ４２６９２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４２６９２
３４．Ｎｅｌｓｏｎ Ｃ．Ｄｉ Ｐａｏｌｏ，Ｏｌｅｋｓａｎｄｒ Ｋａｌｙｕｚｈｎｉｙ，ａｎｄ Ｄｍｉｔｒｙ Ｍ．Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖ．Ｆｉｂｅｒ Ｓｈａｆｔ－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ＫＫＴＫ Ｍｏｔｉｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｉｎｆｅｃｔ Ｌｉｖｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖ．２００７，ｐ．１２２４９－１２２５９
３５．Ｌａｅｔｉｔｉａ Ｊｅａｎ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ Ｍｉｚｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｊ．Ｌａｒｓｅｎ，Ｊａｃｑｕｅｓ Ｍｉｚｏｎ ａｎｄ Ｊｅａｎ－Ｐｈｉｌｉｐｐｅ Ｓａｌｉｅｒ．Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ ａ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ＢＸ７Ｂ ｔｙｐｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｈ３ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒ－ａ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，５４４±５５３（２００１）
３６．Ｋｏｋｏｎａ Ｋｏｕｚｉ－Ｋｏｌｉａｋｏｓ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｇ．Ｋｏｌｉａｋｏｓ，ＥｆｆｉｅＣ．Ｔｓｉｌｉｂａｒｙ，Ｌｅｏ Ｔ．Ｆｕｒｃｈｔ Ｓ，ａｎｄ Ａｒｉｓｔｉｄｉｓ Ｓ．Ｃｈａｒｏｎｉｓ．Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ Ｍａｊｏｒ Ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ ｏｎ Ｌａｍｉｎｉｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ｏｎ ｔｈｅＢ１ Ｃｈａｉｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８９．Ｖｏｌ ２６４．Ｎｏ ３０．
３７．Ｊｏｊｉ Ｉｉｄａ，Ａｌｅｘａｎｄｒａ Ｍ．Ｌ．Ｍｅｉｊｎｅ，Ｔｈｅｏｄｏｒｅ Ｒ．Ｏｅｇｅｍａ，Ｊｒ．，Ｔｅｄ Ａ．Ｙｅｄｎｏｃｋ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｌ．Ｋｏｖａｃｈ，Ｌｅｏ Ｔ．Ｆｕｒｃｈｔ，ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｂ．ＭｃＣａｒｔｈｙ．Ａ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ｉｎ α４β１Ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７３，５９５５－５９６２．
３８．Ｍｅｌｉｓｓａ Ｓ．Ｍａｇｉｎｎｉｓ，Ｊ．Ｃｒａｉｇ Ｆｏｒｒｅｓｔ，Ｓａｒａｈ Ａ．Ｋｏｐｅｃｋｙ－Ｂｒｏｍｂｅｒｇ，Ｓ．Ｋｅｎｔ Ｄｉｃｋｅｓｏｎ，Ｓａｍｕｅｌ Ａ．Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｍａｒｙ Ｍ．Ｚｕｔｔｅｒ，Ｇｌｅｎ Ｒ．Ｎｅｍｅｒｏｗ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｍ．Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，ａｎｄ Ｔｅｒｅｎｃｅ Ｓ．Ｄｅｒｍｏｄｙ．Ｂｅｔａ１ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｒｅｏｖｉｒｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｒ．２００６，ｐ．２７６０－２７７
３９．Ａｌｆｒｅｄ Ａ．Ｒｅｓｚｋａ，Ｙｏｋｉｃｈｉ Ｈａｙａｓｈｉ，ａｎｄ Ａｌａｎ Ｅ Ｈｏｒｗｉｔｚ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ／３１ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＣｅＵ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １１７，Ｎｕｍｂｅｒ ６，Ｊｕｎｅ １９９２ １３２１－１３３０
４０．Ｋｕｓａｋａｗａ Ｔ，Ｓｉｍａｋａｍｉ Ｔ，Ｋａｎｅｋｏ Ｓ，Ｙｏｓｈｉｏｋａ Ｋ，Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｓ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＮＳ５Ｂ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ ＧＡＲ ｄｏｍａｉｎ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００７．Ｊｕｎ １４１（６）９１７－２７
４１．Ｃ．Ｇｒａｈａｍ Ｋｎｉｇｈｔ，Ｌａｕｒｅｎｃｅ Ｆ．Ｍｏｒｔｏｎ，Ａｎｔｈｏｎｙ Ｒ．Ｐｅａｃｈｅｙ，Ｄａｎｎｙ Ｓ．Ｔｕｃｋｗｅｌｌ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｗ．Ｆａｒｎｄａｌｅ，ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊ．Ｂａｒｎｅｓ．Ｔｈｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ａ－ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ α１β１ ａｎｄ α２β１Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｔｈｅ Ｓａｍｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＧＦＯＧＥＲ，ｉｎ Ｎａｔｉｖｅ（Ｔｒｉｐｌｅ－ｈｅｌｉｃａｌ）Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０００．Ｖｏｌ ２７５．Ｎｏ．１
４２．Ｋａｌｔｈｏｆｆ Ｃ，Ａｌｖｅｓ Ｊ，Ｕｒｂａｎｋｅ Ｃ，Ｋｎｏｒｒ Ｒ，Ｕｎｇｅｗｉｃｋｅｌｌ ＥＪ．（２００２）．Ｕｎｕｓｕａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＡＰ１８０ ａｎｄ ｅｐｓｉｎ １．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：８２０９－８２１６
４３．Ｉｇｏｒ Ｂｅｉｔｉａ Ｏｒｔｉｚ ｄｅ Ｚａｒａｔｅ，Ｌｉｌｉａ Ｃａｎｔｅｒｏ－Ａｇｕｉｌａｒ，Ｍａｇａｌｉｅ Ｌｏｎｇｏ，Ｃｌａｒｉｓｓｅ Ｂｅｒｌｉｏｚ－Ｔｏｒｒｅｎｔ，ａｎｄ Ｆｌｏｒｅ Ｒｏｚｅｎｂｅｒｇ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ Ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｔａｉｌ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｔｏ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌ－Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃ．２００７，ｐ．１３８８９－１３９０３
４４．Ｓｈａｙｎｏｏｒ Ｄｒａｍｓｉ，Ｓｏｐｈｉｅ Ｍａｇｎｅｔ，Ｓｏｐｈｉｅ Ｄａｖｉｓｏｎ，Ｍｉｃｈｅｌ Ａｒｔｈｕｒ．Ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ３２（２００８）３０７－３２０
４５．Ｏｌｌｉ Ｐｅｎｔｉｋａｉｎｅｎ，Ａｎｎａ－Ｍａｒｊａ Ｈｏｆｆｒｅｎ，Ｊｏｈａｎｎａ Ｉｖａｓｋａ，Ｊａｒｍｏ Ｋａｐｙｌａ，Ｔｏｍｍｉ Ｎｙｒｏｎｅｎ，Ｊｙｒｋｉ Ｈｅｉｎｏ，ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ．“ＲＫＫＨ” Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｓｎａｋｅ Ｖｅｎｏｍ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｏｆ Ｂｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａ Ｂｉｎｄ Ｎｅａｒ ｔｈｅ Ｍｅｔａｌ Ｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ α２ Ｉ－ｄｏｍａｉｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７４，３１４９３－３１５０５．
４６．Ｔｈｏｍａｓ Ｂｒａｎｄ．Ｔｈｅ Ｐｏｐｅｙｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ｃＡＭＰ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｓｔｒｉａｔｅｄ Ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｅｖ．Ｄｉｓ．２０１８，５，１８
４７．Ａｓｃｈ ＡＳ，Ｓｉｌｂｉｇｅｒ Ｓ，Ｈｅｉｍｅｒ Ｅ，Ｎａｃｈｍａｎ ＲＬ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｔｉｆ（ＣＳＶＴＣＧ）ｉｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ＣＤ３６ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｆｅｂ １４ １９９２；１８２（３）：１２０８－１２１７．
４８．Ｎｏｒａ Ｂ Ｃａｂｅｒｏｙ，Ｙｉｘｉｏｎｇ Ｚｈｏｕ１ ａｎｄ Ｗｅｉ Ｌｉ．Ｔｕｂｂｙ ａｎｄ ｔｕｂｂｙ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ａｒｅ ｎｅｗ ＭｅｒＴＫ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１０）２９，３８９８－３９１０
４９．Ｃｈｉ－Ｙｉ Ｙｕ，Ｚｈｅｎｈｕａ Ｙｕａｎ，Ｚｈｏｎｇｒｅｎ Ｃａｏ，Ｂｉｎｇ Ｗａｎｇ，Ｃｈｕｎｐｉｎｇ Ｑｉａｏ，Ｊｕａｎ Ｌｉ，Ｘｉａｏ Ｘｉａｏ．Ａ ｍｕｓｃｌｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ＡＡＶ２ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｔｒｏｐｉｓｍ ｕｐｏｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９ Ａｕｇｕｓｔ； １６（８）：９５３－９６２
５０．Ｈ Ｂｕｎｉｎｇ，ＭＵ Ｒｉｅｄ，Ｌ Ｐｅｒａｂｏ，ＦＭ Ｇｅｒｎｅｒ，ＮＡ Ｈｕｔｔｎｅｒ，Ｊ Ｅｎｓｓｌｅ ａｎｄ Ｍ Ｈａｌｌｅｋｎ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００３）１０，１１４２－１１５１．
５１．Ｗｉｓｃｈｎｊｏｗ Ａ，Ｓａｒｋｏ Ｄ，Ｊａｎｚｅｒ Ｍ，Ｋａｕｆｍａｎ Ｃ，Ｂｅｉｊｅｒ Ｂ，Ｂｒｉｎｇｓ Ｓ，Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ Ｕ，Ｌａｒｂｉｇ Ｇ，Ｋｕｂｅｌｂｅｃｋ Ａ，Ｍｉｅｒ Ｗ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１６；２７：１０５０－１０５７．
５２．Ｌｏｒｒａｉｎｅ Ｍ．Ｗｏｒｋ，Ｈｉｌｄｅｇａｒｄ Ｂｕｎｉｎｇ，Ｅｌａ Ｈｕｎｔ，Ｓｔｕａｒｔ Ａ．Ｎｉｃｋｌｉｎ，Ｌａｕｒａ Ｄｅｎｂｙ，Ｎｉｃｏｌａ Ｂｒｉｔｔｏｎ，Ｋｒｉｓｔｅｎ Ｌｅｉｋｅ，Ｍａｒｇａｒｅｔｅ Ｏｄｅｎｔｈａｌ，Ｕｔａ Ｄｒｅｂｂｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈａｌｌｅｋ，ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗ Ｈ．Ｂａｋｅｒ．Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｅｄ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｔｒｏｐｉｓｍ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．４，Ａｐｒｉｌ ２００６
５３．Ｌｏｒｒａｉｎｅ Ｍ．Ｗｏｒｋ，Ｓｔｕａｒｔ Ａ．Ｎｉｃｋｌｉｎ，Ｎｉｃｋ Ｊ．Ｒ．Ｂｒａｉｎ，Ｋａｔｅ Ｌ Ｄｉｓｈａｒｔ，Ｄａｎ Ｊ．Ｖｏｎ Ｓｅｇｇｅｒｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈａｌｌｅｋ，Ｈｉｌｄｅｇａｒｄ Ｂｕｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗ Ｈ．Ｂａｋｅｒ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００４
５４．Ｗａｄｉｈ Ａｒａｐ，Ｒｅｎａｔａ Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，Ｅｒｋｋｉ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ Ｔｕｍｏｒ Ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１６ Ｊａｎ １９９８：Ｖｏｌ．２７９，Ｉｓｓｕｅ ５３４９，ｐｐ．３７７－３８０
５５．Ｄａｌｅ Ｄ．Ｈｕｎｔｅｒ，Ｂｒｅｎｄａ Ｅ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｗ．Ｍｏｃｋ，Ｓｔｅｖｅｎ Ｒ Ａｄａｍｓ，Ｊｏｈｎ Ｒ Ｍｅｒｌｉｅ，ａｎｄ Ｊｏｓｈｕａ Ｒ．Ｓａｎｅｓ．Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ－Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｓｉｔｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｂａｓａｌ Ｌａｍｉｎａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ－Ｌａｍｉｎｉｎ．Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．５９，９０５－９１３，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １，１９８９，
５６．Ｅｒｉｃ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓａｎｄｒａ Ｍａｄａｙ，Ｊｅｆｆ Ｓｆａｋｉａｎｏｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈｕｌｌ，Ｂｅｔｔｉｎａ Ｗｉｎｃｋｌｅｒ，Ｄａｖｉｄ Ｓｈｅｆｆ，Ｈｅｉｋｅ Ｆｏｌｓｃｈ，ａｎｄ Ｉｒａ Ｍｅｌｌｍａｎ．Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ＮｇＣＡＭ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｒｅｆｌｅｃｔｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７０，Ｎｏ．４，Ａｕｇｕｓｔ １５，２００５ ５９５－６０５
５７．Ｍａｔｔｈｅｗ Ｊ．Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｔｈａｔ ｃｒｅａｔｅ ｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．，ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ ５，４６４－４６９（２００４）．
５８．Ｄａｈｌｉｎ－Ｈｕｐｐｅ Ｋ，Ｂｅｒｇｌｕｎｄ ＥＯ．，Ｒａｎｓｃｈｔ Ｂ，Ｓｔａｌｌｃｕｐ ＷＢ．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌ１ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｐｒｏｘｉｍａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｔｈａｔ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｃｈｏｒａｇｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７；９（２）：１４４－５６．
５９．Ｐ Ｚｈｅｎｇ，Ｊ Ｅａｓｔｍａｎ，Ｓ Ｖ Ｐｏｌ，ａｎｄ Ｓ Ｗ．Ｐｉｍｐｌｉｋａｒ．ＰＡＴ１，ａ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｔｈｅ ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．Ｖｏｌ．９５，ｐｐ．１４７４５－１４７５０，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９８
６０．Ｄａｎｉｅｌ Ｊ．－Ｆ．Ｃｈｉｎｎａｐｅｎ，Ｈｉｍａｎｉ Ｃｈｉｎｎａｐｅｎ，Ｄａｖｉｄ Ｓａｓｌｏｗｓｋｙ，ａｎｄ Ｗａｙｎｅ Ｉ．Ｌｅｎｃｅｒ．Ｒａｆｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ：ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｏ ＥＲ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２００７ Ｊａｎｕａｒｙ； ２６６（２）：１２９－１３７．
６１．Ｄ．Ｇｏｗａｎｌｏｃｋ Ｒ．Ｔｅｒｖｏ，Ｂｕｍ－Ｙｅｏｌ Ｈｗａｎｇ，Ｓａｒａｄａ Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ，Ｌｏｒｅｎ Ｌ．Ｌｏｏｇｅｒ，Ｄａｖｉｄ Ｖ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ａｌｌａ Ｙ．Ｋａｒｐｏｖａ．Ａ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＡＡＶ Ｖａｒｉａｎｔ Ｐｅｒｍｉｔｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｒｏｎｓ．２０１６，Ｎｅｕｒｏｎ ９２，３７２－３８２
６２．Ｋ Ｉｎａｂｅ，Ｍ Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｓ Ｔａｊｉｍａ，Ｋ Ｉｋｕｔａ，ａｎｄ Ｙ Ａｉｄａ．Ｔｈｅ ＹＸＸＬ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｏ ｖｉｒｉｏｎｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９ Ｆｅｂ；７３（２）：１２９３－３０１．
６３．Ｔｏｎ－Ｔｈａｔ，Ｈ．，ａｎｄ Ｏ．Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ．２００３．Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｐｉｌｉ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０：１４２９－１４３８．
６４．Ａｒａｖｉｎｄ Ａｓｏｋａｎ，Ｊｕｌｉｅ Ｂ．Ｈａｍｒａ，Ｌａｋｓｈｍａｎａｎ Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ，Ｍａｖｉｓ Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ，ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ．Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２ Ｃｏｎｔａｉｎｓ ａｎ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ ５ ｂｅｔａ１ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｖｉｒａｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｅｐｔ．２００６，ｐ．８９６１－８９６９
６５．Ｊｉ－Ｓｅｏｎ Ｐａｒｋ，Ｄｏｎｇ－Ｈｏｕ Ｋｉｍ，Ｓｅｕｎｇ－Ｙｏｎｇ Ｙｏｏｎ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｂｙ ｉｔｓ ＫＦＥＲＱ ｍｏｔｉｆ．ＢＭＢ Ｒｅｐ．２０１６； ４９（６）：３３７－３４２
Figure 2022512977000027
Figure 2022512977000028
Figure 2022512977000029
様々な実施形態では、本開示の操作されたポリペプチド（例えば、ミニヌクレオソームコアタンパク質）の１つ以上のアミノ酸は、ペグ化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化、ＳＵＭＯ化、アミド化、脂質付加化、プレニル化、リポイル化、アルキル化、アシル化、糖化、ニトロシル化、硫酸化、カルバミル化、カルボニル化、ＮＥＤＤ化（ｎｅｄｄｙｌａｔｅｄ）、ビオチン化、またはリボシル化されている。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
核酸結合ドメインと、標的化ドメインと、を含む、操作されたポリペプチド。
（項目２）
前記核酸結合ドメインが、ヒストンポリペプチド配列に由来する、項目１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目３）
前記核酸結合ドメインが、アミノ酸配列ＫＲＨＲＫであるか、またはそれを含む、項目１または２に記載の操作されたポリペプチド。
（項目４）
前記核酸結合ドメインが、ＫＲＨＲＫ、ＲＲＲＲＲ、ＲＲＬＡＲＲ、ＫＫＡＫＡＡＡＫＰＫＫ、ＫＫＤＧＫＫＲＫＲ、ＫＫＫＬＫ、ＫＫＲＩＲＫ、ＲＫＫＳＫ、ＫＫＰＫＫ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目５）
前記標的化ドメインが、細胞付着ドメイン、βガラクトース結合ドメイン、フコース結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、シアル酸結合ドメイン、糖タンパク質結合ドメイン、炭水化物結合ドメイン、リゾホスファチジン酸結合ドメイン、ｃＡＭＰ結合ドメイン、ヒアルロナン結合ドメイン、コンドロイチン硫酸結合ドメイン、インテグリン結合ドメイン、ヌクレオリン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、クラスリン結合ドメイン、Ｆｃ受容体結合ドメイン、アクチン結合ドメイン、エンドサイトーシスモチーフ、核局在化シグナル、またはこれらの組み合わせである、項目１～４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
（項目６）
前記標的化ドメインが、細胞付着標的化ドメインである、項目１～５のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
（項目７）
前記細胞付着標的化ドメインが、ＷＧＲＥＥＲＱ、ＮＴＱＩＨ、ＷＮＮＫＴＰＨ、ＴＰＨ、ＶＮＲＷＳ、ＸＢＢＢＸＸＢＸ、ＡＲＫＫＡＡＫＡ、ＱＲＲ、ＳＲＲ、ＷＥＰＳＲＰＦＰＶＤ、ＨＲＲＴＲＫＡＰＫＲＩＲＬＰＨＩＲ、ＫＲＴＧＱＹＫＬＧＳＫＴＧＰＧＱＫ、ＫＫＴＫ、ＫＬＲＳＱＬＶＫＫ、ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ、ＢＸ（７）Ｂ、ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ、ＫＫＥＫＤＩＭＫＫＴＩ、ＫＧＥ、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＴＴＶＶＮＰＫＹＥＧＫ、ＥＲＭＳＱＩＫＲＬＬＳ、ＷＲＨＲＡＲＳ、ＧＦＯＧＥＲ、ＬＦＤＬＭ、ＷＧＲＥＥＲＱ、ＱＳＴＥＫＲＧ、ＬＰＮＴＧ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目６に記載の操作されたポリペプチド。
（項目８）
前記標的化ドメインが、内在化ドメインである、項目１～５のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
（項目９）
前記内在化ドメインが、ＦＸＤＸＦ、ＰＰＳＹ、ＦＥＤＮＦＶＰ、ＹＩＲＶ、ＹＡＤＷ、ＹＴＱＶ、ＫＫＲＰＫＰ、ＳＳＤＤＥ、ＲＲＡＳＳ、（ＹＸＸＬ）２、ＬＰＬＴＧ、ＬＡＦＴＧ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目８に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１０）
前記標的化ドメインが、細胞型特異的標的化ドメインである、項目１～５のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１１）
前記細胞型特異的標的化ドメインが、ＡＳＳＬＮＩＡ、ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥ、ＬＩＦＨＫＥＱ、ＫＦＮＫＰＦＶＦＬＩ、ＱＰＥＨＳＳＴ、ＥＹＨＨＹＮＫ、ＮＧＲ、ＧＥＫＧＥＰ、ＫＴＫＫＫ、ＫＡＬＫＫＫ、ＫＧＫＫＫ、ＣＳＶＴＣＧ、ＬＲＥ、ＹＫＹＮＬＮＧＲＥＳ、ＹＲＳＬ、ＫＧＧＫ ７ 、ＫＫＫＱＹＴＳＩＨＨＧ、ＫＤＥＬ、ＬＡＤＱＤＹＴＫＴＡ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目１０に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１２）
ポリアルギニンドメインをさらに含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１３）
核内在化シグナルまたは核内移行機構結合ドメインをさらに含む、項目１～１２のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１４）
前記核内在化シグナルまたは核内移行機構結合ドメインが、ＫＫＫＹＫＬＫ、ＫＫＲＫＬＥ、ＴＲＳＫ、ＨＲＫＲＫＲ、ＮＫＲＫＲＫ、ＡＥＫＳＫＫＫ、ＲＫＳＫ、ＫＲＶＫ、ＫＲＫ、ＬＱＱＴＰＬＨＬＡＶＩ、ＲＲＰＲ、ＰＲＰＲ、ＲＰＰＰ、ＲＫＫＲＫＧＫ、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ、ＰＫＫＫＲＫＶ、ＱＲＫＲＱＫ、ＤＳＰＥ、ＦＱＶＴ、ＱＳＴＥＫＲＧ、ＲＱＧＬＩＤ、環状ＲＫＫＨ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目１１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１５）
核酸放出ドメインをさらに含む、項目１～１４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１６）
前記核酸放出ドメインが、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ、ＫＲＨ、ＫＳＶＫＫＲＳＶＳＥＩＱ、ＮＲＲＫＫＲＡＬ、ＫＦＥＲＱ、ＶＲＧＰ、ＮＫＤＳ、ＮＲＤＮ、ＡＮＮＲ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目１５に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１７）
安定性ドメインをさらに含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１８）
前記安定性ドメインが、ＹＴＲＦ、ＧＤＡＹ、ＬＬＥＥ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＹＫＳＬ、ＹＥＮＦ、ＦＱＤＬ、ＹＩＧＳＲ、ＩＫＶＡＶ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、項目１７に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１９）
オリゴマー化ドメインをさらに含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
（項目２０）
前記オリゴマー化ドメインが、表１１のオリゴマー化ドメインから選択され、任意選択的に、前記オリゴマー化ドメインが、前記操作されたポリペプチドのＣ末端に配置される、項目１９に記載の操作されたポリペプチド。
（項目２１）
前記ポリペプチドが、リンカーを含み、任意選択的に、前記リンカーが、配列番号１５４～２５０のうちのいずれか１つに対応するリンカーである、項目１～２０のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
（項目２２）
項目１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目２３）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡである、項目２２に記載のポリヌクレオチド。
（項目２４）
項目２２または２３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目２５）
項目１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド、項目２２もしくは２３に記載のポリペプチド、または項目２４に記載のベクターを含む、細胞。
（項目２６）
項目１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドを作製する方法であって、細胞において、項目２２または２３に記載のポリヌクレオチドを発現させることを含む、前記方法。
（項目２７）
前記細胞から前記操作されたポリペプチドを単離することをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
（ｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）少なくとも１つの項目１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドと、を含む、組成物。
（項目２９）
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、ＤＮＡもしくはＲＮＡであるか、またはそれを含む、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、項目２８または２９に記載の組成物。
（項目３１）
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡであるか、またはそれを含む、項目２８～３０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３２）
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、阻害性ＲＮＡを含む、項目２８または２９に記載の組成物。
（項目３３）
前記阻害性ＲＮＡが、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである、項目３２に記載の組成物。
（項目３４）
項目１～２１のいずれか一項に記載の少なくとも２つの操作されたポリペプチドを含み、項目１～２１のいずれか一項に記載の第１の操作されたポリペプチドが、項目１～２１のいずれか一項に記載の第２の操作されたポリペプチドとオリゴマー化し得る、項目２８～３３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５）
前記ポリヌクレオチド対項目１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドの比が、１：３～１：２，０００である、項目２８～３４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３６）
前記ポリヌクレオチド対項目１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドの比が、１：３～１：１，０００、１：３～１：５００、１：３～１：２００、１：３～１：１００、または１：３～１：５０である、項目３５に記載の組成物。
（項目３７）
前記ポリヌクレオチド対項目１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドの比が、１：２００～１：２，０００、１：２００～１：１０００、または１：２００～１：５００である、項目２８～３６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３８）
薬学的担体を含む、項目２８～３７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３９）
項目２８～３８のいずれか一項に記載の組成物を、細胞、組織、または対象に投与することを含む、方法。
（項目４０）
ポリヌクレオチドを縮合する方法であって、前記ポリヌクレオチドを項目１～２１のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含む、前記方法。
（項目４１）
ポリヌクレオチドの電荷を中和する方法であって、前記ポリヌクレオチドを項目１～２１のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含む、前記方法。
（項目４２）
前記ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸が、ペグ化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化、ＳＵＭＯ化、アミド化、脂質付加化、プレニル化、リポイル化、アルキル化、アシル化、糖化、ニトロシル化、硫酸化、カルバミル化、カルボニル化、ＮＥＤＤ化（ｎｅｄｄｙｌａｔｅｄ）、ビオチン化、またはリボシル化されている、項目１～２０のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。

Claims (42)

  1. 核酸結合ドメインと、標的化ドメインと、を含む、操作されたポリペプチド。
  2. 前記核酸結合ドメインが、ヒストンポリペプチド配列に由来する、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  3. 前記核酸結合ドメインが、アミノ酸配列ＫＲＨＲＫであるか、またはそれを含む、請求項１または２に記載の操作されたポリペプチド。
  4. 前記核酸結合ドメインが、ＫＲＨＲＫ、ＲＲＲＲＲ、ＲＲＬＡＲＲ、ＫＫＡＫＡＡＡＫＰＫＫ、ＫＫＤＧＫＫＲＫＲ、ＫＫＫＬＫ、ＫＫＲＩＲＫ、ＲＫＫＳＫ、ＫＫＰＫＫ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
  5. 前記標的化ドメインが、細胞付着ドメイン、βガラクトース結合ドメイン、フコース結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、シアル酸結合ドメイン、糖タンパク質結合ドメイン、炭水化物結合ドメイン、リゾホスファチジン酸結合ドメイン、ｃＡＭＰ結合ドメイン、ヒアルロナン結合ドメイン、コンドロイチン硫酸結合ドメイン、インテグリン結合ドメイン、ヌクレオリン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、クラスリン結合ドメイン、Ｆｃ受容体結合ドメイン、アクチン結合ドメイン、エンドサイトーシスモチーフ、核局在化シグナル、またはこれらの組み合わせである、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
  6. 前記標的化ドメインが、細胞付着標的化ドメインである、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
  7. 前記細胞付着標的化ドメインが、ＷＧＲＥＥＲＱ、ＮＴＱＩＨ、ＷＮＮＫＴＰＨ、ＴＰＨ、ＶＮＲＷＳ、ＸＢＢＢＸＸＢＸ、ＡＲＫＫＡＡＫＡ、ＱＲＲ、ＳＲＲ、ＷＥＰＳＲＰＦＰＶＤ、ＨＲＲＴＲＫＡＰＫＲＩＲＬＰＨＩＲ、ＫＲＴＧＱＹＫＬＧＳＫＴＧＰＧＱＫ、ＫＫＴＫ、ＫＬＲＳＱＬＶＫＫ、ＲＲＲＣＧＱＫＫＫ、ＢＸ（７）Ｂ、ＲＩＱＮＬＬＫＩＴＮＬＲＩＫＦＶＫ、ＫＫＥＫＤＩＭＫＫＴＩ、ＫＧＥ、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＴＴＶＶＮＰＫＹＥＧＫ、ＥＲＭＳＱＩＫＲＬＬＳ、ＷＲＨＲＡＲＳ、ＧＦＯＧＥＲ、ＬＦＤＬＭ、ＷＧＲＥＥＲＱ、ＱＳＴＥＫＲＧ、ＬＰＮＴＧ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、請求項６に記載の操作されたポリペプチド。
  8. 前記標的化ドメインが、内在化ドメインである、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
  9. 前記内在化ドメインが、ＦＸＤＸＦ、ＰＰＳＹ、ＦＥＤＮＦＶＰ、ＹＩＲＶ、ＹＡＤＷ、ＹＴＱＶ、ＫＫＲＰＫＰ、ＳＳＤＤＥ、ＲＲＡＳＳ、（ＹＸＸＬ）２、ＬＰＬＴＧ、ＬＡＦＴＧ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、請求項８に記載の操作されたポリペプチド。
  10. 前記標的化ドメインが、細胞型特異的標的化ドメインである、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
  11. 前記細胞型特異的標的化ドメインが、ＡＳＳＬＮＩＡ、ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥ、ＬＩＦＨＫＥＱ、ＫＦＮＫＰＦＶＦＬＩ、ＱＰＥＨＳＳＴ、ＥＹＨＨＹＮＫ、ＮＧＲ、ＧＥＫＧＥＰ、ＫＴＫＫＫ、ＫＡＬＫＫＫ、ＫＧＫＫＫ、ＣＳＶＴＣＧ、ＬＲＥ、ＹＫＹＮＬＮＧＲＥＳ、ＹＲＳＬ、ＫＧＧＫ７、ＫＫＫＱＹＴＳＩＨＨＧ、ＫＤＥＬ、ＬＡＤＱＤＹＴＫＴＡ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、請求項１０に記載の操作されたポリペプチド。
  12. ポリアルギニンドメインをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
  13. 核内在化シグナルまたは核内移行機構結合ドメインをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
  14. 前記核内在化シグナルまたは核内移行機構結合ドメインが、ＫＫＫＹＫＬＫ、ＫＫＲＫＬＥ、ＴＲＳＫ、ＨＲＫＲＫＲ、ＮＫＲＫＲＫ、ＡＥＫＳＫＫＫ、ＲＫＳＫ、ＫＲＶＫ、ＫＲＫ、ＬＱＱＴＰＬＨＬＡＶＩ、ＲＲＰＲ、ＰＲＰＲ、ＲＰＰＰ、ＲＫＫＲＫＧＫ、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ、ＰＫＫＫＲＫＶ、ＱＲＫＲＱＫ、ＤＳＰＥ、ＦＱＶＴ、ＱＳＴＥＫＲＧ、ＲＱＧＬＩＤ、環状ＲＫＫＨ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、請求項１１に記載の操作されたポリペプチド。
  15. 核酸放出ドメインをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
  16. 前記核酸放出ドメインが、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ、ＫＲＨ、ＫＳＶＫＫＲＳＶＳＥＩＱ、ＮＲＲＫＫＲＡＬ、ＫＦＥＲＱ、ＶＲＧＰ、ＮＫＤＳ、ＮＲＤＮ、ＡＮＮＲ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、請求項１５に記載の操作されたポリペプチド。
  17. 安定性ドメインをさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
  18. 前記安定性ドメインが、ＹＴＲＦ、ＧＤＡＹ、ＬＬＥＥ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＹＫＳＬ、ＹＥＮＦ、ＦＱＤＬ、ＹＩＧＳＲ、ＩＫＶＡＶ、もしくはこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列であるか、またはそれを含む、請求項１７に記載の操作されたポリペプチド。
  19. オリゴマー化ドメインをさらに含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
  20. 前記オリゴマー化ドメインが、表１１のオリゴマー化ドメインから選択され、任意選択的に、前記オリゴマー化ドメインが、前記操作されたポリペプチドのＣ末端に配置される、請求項１９に記載の操作されたポリペプチド。
  21. 前記ポリペプチドが、リンカーを含み、任意選択的に、前記リンカーが、配列番号１５４～２５０のうちのいずれか１つに対応するリンカーである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
  22. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  23. 前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
  24. 請求項２２または２３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  25. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド、請求項２２もしくは２３に記載のポリペプチド、または請求項２４に記載のベクターを含む、細胞。
  26. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドを作製する方法であって、細胞において、請求項２２または２３に記載のポリヌクレオチドを発現させることを含む、前記方法。
  27. 前記細胞から前記操作されたポリペプチドを単離することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
  28. （ｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチドと、
    （ｉｉ）少なくとも１つの請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドと、を含む、組成物。
  29. 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、ＤＮＡもしくはＲＮＡであるか、またはそれを含む、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２８または２９に記載の組成物。
  31. 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡであるか、またはそれを含む、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、阻害性ＲＮＡを含む、請求項２８または２９に記載の組成物。
  33. 前記阻害性ＲＮＡが、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである、請求項３２に記載の組成物。
  34. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の少なくとも２つの操作されたポリペプチドを含み、請求項１～２１のいずれか一項に記載の第１の操作されたポリペプチドが、請求項１～２１のいずれか一項に記載の第２の操作されたポリペプチドとオリゴマー化し得る、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記ポリヌクレオチド対請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドの比が、１：３～１：２，０００である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 前記ポリヌクレオチド対請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドの比が、１：３～１：１，０００、１：３～１：５００、１：３～１：２００、１：３～１：１００、または１：３～１：５０である、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記ポリヌクレオチド対請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドの比が、１：２００～１：２，０００、１：２００～１：１０００、または１：２００～１：５００である、請求項２８～３６のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 薬学的担体を含む、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 請求項２８～３８のいずれか一項に記載の組成物を、細胞、組織、または対象に投与することを含む、方法。
  40. ポリヌクレオチドを縮合する方法であって、前記ポリヌクレオチドを請求項１～２１のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含む、前記方法。
  41. ポリヌクレオチドの電荷を中和する方法であって、前記ポリヌクレオチドを請求項１～２１のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含む、前記方法。
  42. 前記ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸が、ペグ化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化、ＳＵＭＯ化、アミド化、脂質付加化、プレニル化、リポイル化、アルキル化、アシル化、糖化、ニトロシル化、硫酸化、カルバミル化、カルボニル化、ＮＥＤＤ化（ｎｅｄｄｙｌａｔｅｄ）、ビオチン化、またはリボシル化されている、請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3097512A1 (en) * 2018-05-18 2019-11-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Targeted intracellular delivery of large nucleic acids
AU2021254697A1 (en) * 2020-04-13 2022-11-10 Summation Bio Inc. Modified mini-nucleosome core proteins and use in nucleic acid delivery
CA3226457A1 (en) * 2021-07-30 2023-02-02 Amy WALKER Nanoparticles and peptides for the delivery of cargos to muscle cells
EP4124345A1 (en) * 2021-07-30 2023-02-01 4basebio UK Ltd Nanoparticles for muscle delivery
WO2023014724A2 (en) * 2021-08-03 2023-02-09 Summation Bio, Inc. Scaffold matrix attachment regions for gene therapy

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050048606A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-03 Shu Wang Recombinant polypeptide useful for neurotrophin receptor mediated gene delivery and as neurotrophin agonist

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5670347A (en) * 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
EP0832269A1 (en) * 1995-06-07 1998-04-01 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
JP2002514892A (ja) * 1995-06-08 2002-05-21 コブラ セラピューティクス リミテッド 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用
AU1029099A (en) * 1997-10-10 1999-05-03 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Transfection system for the transfer of nucleic acids into cells
AU2002254357A1 (en) * 2001-03-22 2002-10-08 Dendreon Corporation Nucleic acid molecules encoding serine protease cvsp14, the encoded polypeptides and methods based thereon
EP1594973B1 (en) * 2003-02-10 2011-12-07 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Transposon-based targeting system
JP4521519B2 (ja) * 2003-05-26 2010-08-11 学校法人慶應義塾 部分ヒストンテイル型イムノポーター
WO2004108883A2 (en) * 2003-06-10 2004-12-16 Toolgen, Inc. Transducible dna-binding proteins
US20060018911A1 (en) * 2004-01-12 2006-01-26 Dana Ault-Riche Design of therapeutics and therapeutics
PL391627A1 (pl) * 2010-06-25 2012-01-02 Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
US9746475B2 (en) * 2011-03-14 2017-08-29 University Of Southern California Antibody and antibody mimetic for visualization and ablation of endogenous proteins
US10407469B2 (en) * 2016-04-01 2019-09-10 Northwestern University Programmable polypeptide and nucleic acid nanoparticles
US20180179553A1 (en) * 2016-12-14 2018-06-28 Ligandal, Inc. Compositions and methods for nucleic acid and/or protein payload delivery

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050048606A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-03 Shu Wang Recombinant polypeptide useful for neurotrophin receptor mediated gene delivery and as neurotrophin agonist

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 143, no. 2, JPN6023038889, 11 January 2010 (2010-01-11), pages 233 - 242, ISSN: 0005158770 *
THE AAPS JOURNAL, vol. 9, no. 1, JPN6023038888, 2007, pages 3 - 18, ISSN: 0005158771 *

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