CN113423834A - 微核小体核心蛋白及其在核酸递送中的用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了与微核小体核心蛋白和/或递送核酸有关的组合物和方法。具体地，本公开尤其包括用于递送核酸的非病毒性蛋白质媒介物。在各种实施方案中，本文提供的非病毒性蛋白质媒介物包含(a)核酸结合结构域；(b)靶向结构域；以及任选地(c)核酸释放结构域、稳定性结构域和/或寡聚化结构域，和/或接头结构域。

Description

微核小体核心蛋白及其在核酸递送中的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年11月8日提交的美国临时申请号62/757,683的权益，所述临时申请的公开内容以引用方式整体并入本文。
背景技术
AAV载体被视为当前基因治疗的黄金标准，并且在各种临床试验中已显示出前景，包括用于例如视网膜基因治疗以及肝脏、CNS和/或其他组织中的全身基因治疗的临床试验。随着至少三种不同的基因治疗获得监管批准，该领域有望进一步发展，使得患者可以获得这些改变生命的治疗。然而，尽管AAV载体是业界的黄金标准，但它还具有一定的局限性。需要改进和/或替代性的核酸递送技术。
发明内容
本公开提供了尤其与多肽有关的组合物和方法，所述多肽能够与核酸分子缔合，例如，以用于将核酸分子递送给需要基因治疗的受试者。因此，本公开尤其包括能够与核酸分子缔合的多肽，以及包含本文公开的多肽连同缔合的核酸分子的组合物。在不希望受到任何特定科学理论束缚的情况下，本公开预期，核酸分子与本文公开的多肽的缔合可以有利于核酸向靶细胞、受试者或其他系统的递送。
具体地，本公开尤其包括用于递送核酸的“微核小体核心蛋白”。在各种实施方案中，本公开的微核小体核心蛋白可以包含(a)核酸结合结构域(“NABD”)；(b)靶向结构域；以及任选地(c)另外的结构域，包括例如核酸释放结构域、稳定性结构域和/或寡聚化结构域中的一个或多个。与核酸货物缔合的一种或多种微核小体核心蛋白可以称为“负载的微核小体”。由于用于将核酸递送至靶标的负载的微核小体是非病毒的，因此微核小体是用于核酸递送的非病毒媒介物的实例。
本公开包括以下认识：本文所述的至少某些组合物和方法弥补与AAV载体相关的一种或多种缺陷，包括：
1)AAV与4.5kb DNA长度的有效负载极限相关，所述极限阻止了使用AAV治疗至少部分地由通常由大于4kb的核酸编码的基因产物的表达不足引起的疾病(例如，如CFTR、HTT、F8、DMD、ABCA4等之类的基因不可配合到AAV载体中)(Lai Y.等人，2010)。
2)已知AAV以低百分比和/或以位点非特异性方式整合(Smith R.H.,2008)。如果整合可能或确实破坏肿瘤抑制基因或对于细胞功能重要的基因，则随机或位点非特异性整合可能是有害的。
3)取决于AAV的血清型，25-70％的人具有预先存在的针对AAV的中和抗体，这意味着他们将不太可能受益于AAV疗法(Fitzpatrick Z.等人2018)。
4)使用AAV进行多次治疗极不可能有效，因为一旦对患者注射，患者就会产生大量针对该病毒的抗体。对于细胞周转率高(例如，肝细胞或气道上皮细胞的周转率)的一些疾病，可需要进行多次治疗。因此，由于在第一次治疗后增加的针对AAV的抗体，相同载体不可用于后续治疗或剂量。
5)一些疾病的有效治疗可需要递送通过静脉内注射施用的颗粒的大量有效负载，以便在体内转导细胞。高剂量的AAV带来其自身毒性，这是有齐全的文档记录的(HindererC.等人，2018)。
6)大多数疾病还与多器官缺陷相关，并且不可将AAV应用于同一身体内的各个器官。在一个部位应用一次将产生抗体，并且因此当以后续治疗或剂量注射时，其可能阻断体内其他位置的转导。
至少部分由于以上讨论的AAV缺陷，迫切需要AAV的替代物。在至少某些实施方案中，本文公开的非病毒载体克服了一个或多个以上讨论的AAV缺陷。
此外，现有的非病毒载体还与治疗功效的若干障碍相关，所述障碍包括：i)转染/转导效率低(Guerra-Crespo M等人，2003)；ii)在血液、体液和其他组织中的颗粒稳定性低(Barua和Mitragotri,2014)；iii)通过受体介导的内吞作用或细胞融合实现的细胞进入少；iv)在内体和溶酶体区室中的稳定性低，并且从其中的逃逸少；v)在细胞质中的扩散速率低；vi)核孔运输低；以及vii)用以允许在核中的生物学功能的DNA的释放低(Zabner J.等人，1995)。一些出版物已记录现有的非病毒载体不能转染有丝分裂后细胞或转染效率低(Wilke M.等人，1996)。某些现有的非病毒载体缺乏表达的长寿性(longevity)和/或产生的蛋白质量少，不足以治疗并且不可以有效方式靶向特定细胞类型。
因此，尽管在非病毒载体领域存在最先进的研究，但是许多现有的非病毒载体对于临床使用并不是最佳的。本文所讨论的至少某些实施方案的尤其有助于临床效用的某些特征可以包括但不限于：
尺寸和分子量：携带DNA分子的许多现有的非病毒载体具有直径为10-200nm的尺寸(Konstan M.W.等人，2004)。它们的分子量可以大于300kDa或大于500kDa。本公开尤其提供了非病毒性蛋白质媒介物和/或负载的微核小体，其直径<20nm并且具有<500kDa的分子量。在具体实施方案中，本文公开的非病毒性蛋白质媒介物和/或负载的微核小体可以更有效地进入核，可能通过被动扩散，这至少部分是因为典型的核孔直径仅为20nm，使得<20nm的尺寸可允许通过。
在体液中的稳定性：许多现有的非病毒载体在其可被递送至靶细胞之前在如血液或CSF的体液中降解(Barua和Mitragotri,2014)。本公开尤其提供了非病毒性蛋白质媒介物和/或负载的微核小体，其在生理上是稳定的并且/或者具有允许其在进入靶细胞之前和之后在血液和/或其他体液中稳定的特性。这些颗粒的至少一个目标是安全地到达期望细胞的核。
颗粒在核中的释放：许多现有的非病毒载体的寿命非常短，因为大多数在进入靶细胞之前就释放了所缔合的核酸，其余的则在细胞质中释放所缔合的核酸，在其中递送的DNA遇到破坏DNA的核酸酶(Zabner,J.等人，1995)。某些现有载体使其进入细胞核并提供非常低的表达水平，如果它们完全表达的话。除其他方面之外，本公开还认识到，以缓慢的速率而不是一次全部释放所缔合的核酸可以是有益的，这可允许表达的长寿性。
细胞类型特异性：现有的非病毒载体不靶向特定细胞类型，这与降低的转导水平以及因此减少的表达相关。本公开尤其提供了针对细胞类型特异性优化的非病毒载体。工程改造细胞类型特异性的某些手段在例如Templeton和Senzer,2011中有所描述。
综上所述，迫切需要在期望的持续时间内提供有效的表达水平，是非免疫原性且非毒性的并且具有限制性更少的有效负载能力的核酸递送技术。此外，数百万亨廷顿病、斯塔加特病(Stargardt)、杜氏肌营养不良、囊性纤维化和通过基因治疗可治疗的其他病状的患者的需求明确提出了对可以帮助治疗这些患者的技术的需求。
本公开提供了用于递送核酸的安全且有效的非病毒性蛋白质媒介物(“微核小体核心蛋白”)和负载的微核小体。
在各种实施方案中，微核小体核心蛋白与一种或多种核酸缔合。如本文所公开，与一种或多种核酸缔合的微核小体核心蛋白可以称为“负载的微核小体”。
在各种实施方案中，微核小体核心蛋白包含靶向结构域，其使负载的微核小体靶向一种或多种特定细胞类型以用于将核酸(诸如基因)递送至一种或多种特定细胞类型中和/或靶向表达于该一种或多种特定细胞类型。
在各种实施方案中，可以根据需要一次或重复地滴定和/或施用微核小体核心蛋白组合物(例如，包含一种或多种负载的微核小体的组合物)。此外，在各种实施方案中，微核小体核心蛋白或微核小体组合物(例如，包含一种或多种负载的微核小体的组合物)是非免疫原性且非毒性的。
在某些实施方案中，本文公开的微核小体核心蛋白可以利用适用于大分子摄取、病毒进入细胞、真核细胞中的核小体形成、细胞中的特定位置处的某些蛋白质的切割等的原理。
本文提供的组合物和方法的各种实施方案包括有利于以下中的一个或多个的结构域：增强的稳定性、靶向特定细胞类型，以及通过缓慢的核酸释放实现的增强的表达长寿性。
在各种实施方案中，微核小体核心蛋白和/或微核小体在体液中是稳定的并且/或者包含允许和/或靶向释放于或到核中的结构域。
在至少一个方面，本公开提供一种工程改造的多肽，其包含核酸结合结构域和靶向结构域，所述工程改造的多肽可以是微核小体核心蛋白。负载的微核小体可以是或可以提供非病毒载体，所述非病毒载体包含如本文所述的工程改造的多肽(例如，微核小体核心蛋白)和如本文所提供的或本领域另外已知的至少一种核酸分子。
在一些实施方案中，是或包含核酸结合结构域的工程改造的多肽(例如，微核小体核心蛋白)衍生自组蛋白多肽序列和/或是或包含氨基酸序列KRHRK的核酸结合结构域。在某些实施方案中，本公开的工程改造的多肽包含核酸结合结构域，所述核酸结合结构域是或包含包括以下的氨基酸序列：KRHRK、RRRRR、RRLARR、KKAKAAAKPKK、KKDGKKRKR、KKKLK、KKRIRK、RKKSK、KKPKK或其组合，但不限于此。
在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽包含核酸结合结构域，所述核酸结合结构域衍生自任何组蛋白序列或表3所述的那些或本文所述序列的组合，但不限于此。这些核酸结合结构域可来源于各种人蛋白质或其他生物体。本领域技术人员可预期通过改变氨基酸序列来修饰或工程改造“NABD”。本领域技术人员还可预期以相反的顺序，或通过在结构域内切换氨基酸位置或对氨基酸添加翻译后修饰来布置“NABD”。
在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽包含靶向结构域，所述靶向结构域是细胞附着结构域、β半乳糖结合结构域、岩藻糖结合结构域、肝素结合结构域、唾液酸结合结构域、糖蛋白结合结构域、碳水化合物结合结构域、溶血磷脂酸结合结构域、cAMP结合结构域、透明质酸结合结构域、硫酸软骨素结合结构域、整联蛋白结合结构域、核仁素结合结构域、胶原蛋白结合结构域、网格蛋白结合结构域、Fc受体结合结构域、肌动蛋白结合结构域、内吞基序、核定位信号或其组合，但不限于此。那些结构域的一些实例在表5中描述，但不限于这些。这些结构域可来源于任何人蛋白质或其他生物体。本领域技术人员可预期通过改变氨基酸序列来修饰或工程改造靶向结构域。本领域技术人员还可预期以相反的顺序，或通过在结构域内切换氨基酸位置或对氨基酸添加翻译后修饰来布置靶向结构域。
在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽包含靶向结构域，所述靶向结构域是内化结构域，其中内化结构域是或包含包括以下的氨基酸序列：FXDXF、PPSY、FEDNFVP、YIRV、YADW、YTQV、KKRPKP、SSDDE、RRASS、(YXXL)2、LPLTG、LAFTG或其组合，但不限于此。这些结构域可来源于人蛋白质或其他生物体。本领域技术人员可预期通过改变氨基酸序列来修饰或工程改造内化结构域。本领域技术人员还可预期以相反的顺序，或通过在结构域内切换氨基酸位置或对氨基酸添加翻译后修饰来布置内化结构域。
本领域技术人员应认识到，除非另有说明，否则如本说明书通篇在蛋白质序列中所用的，“X”可以指任何氨基酸。因此，除非另有说明，否则“X”是单个氨基酸的占位符，该位置可以填充本领域技术人员已知的任何单个氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽包含细胞附着靶向结构域，所述细胞附着靶向结构域是或包含选自以下的氨基酸序列：WGREERQ、NTQIH、WNNKTPH、TPH、VNRWS、XBBBXXBX、ARKKAAKA、QRR、SRR、WEPSRPFPVD、HRRTRKAPKRIRLPHIR、KRTGQYKLGSKTGPGQK、KKTK、KLRSQLVKK、RRRCGQKKK、BX(7)B、RIQNLLKITNLRIKFVK、KKEKDIMKKTI、KGE、RGD、RGDS、TTVVNPKYEGK、ERMSQIKRLLS、WRHRARS、GFOGER、LFDLM、WGREERQ、QSTEKRG、LPNTG及其组合，其中X可以是任何氨基酸，但不限于此。
在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽包含靶向结构域，所述靶向结构域是内化结构域细胞类型特异性靶向结构域，其中细胞类型特异性靶向结构域是或包含包括以下的氨基酸序列：ASSLNIA、KKEEEKKEEEKKEEE、LIFHKEQ、KFNKPFVFLI、QPEHSST、EYHHYNK、NGR、GEKGEP、KTKKK、KALKKK、KGKKK、CSVTCG、LRE、YKYNLNGRES、YRSL、KGGK7、KKKQYTSIHHG、KDEL、LADQDYTKTA或其组合，但不限于此。这些结构域可来源于人蛋白质或其他生物体。本领域技术人员可预期通过改变氨基酸序列来修饰或工程改造靶向结构域。本领域技术人员还可预期以相反的顺序，或通过在结构域内切换氨基酸位置或对氨基酸添加翻译后修饰来布置靶向结构域。
在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽包含具有可变长度的聚精氨酸结构域或在整个多肽序列中包含多个聚精氨酸结构域。
在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽包含核内化信号或核输入机制结合结构域。工程改造的多肽、核内化信号或核输入机制结合结构域可以是或包含包括以下的氨基酸序列：KKKYKLK、KKRKLE、TRSK、HRKRKR、NKRKRK、AEKSKKK、RKSK、KRVK、KRK、LQQTPLHLAVI、RRPR、PRPR、RPPP、RKKRKGK、PAAKRVKLD、KLKIKRPVK、PKKKRKV、QRKRQK、DSPE、FQVT、QSTEKRG、RQGLID、环状RKKH或其组合，但不限于此。这些结构域可来源于人蛋白质或其他生物体。本领域技术人员可预期通过改变氨基酸序列来修饰或工程改造核内化信号。本领域技术人员还可预期以相反的顺序，或通过在结构域内切换氨基酸位置或对氨基酸添加翻译后修饰来布置核内化信号。
在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽包含核酸释放结构域。核酸释放结构域是或包含包括以下的氨基酸序列：GRKKRRQRRRPQ、KRH、KSVKKRSVSEIQ、NRRKKRAL、KFERQ、VRGP、NKDS、NRDN、ANNR或其组合，但不限于此。这些结构域可衍生自各种蛋白质，所述蛋白质是存在于人或其他生物体中的肽酶、酶或其他蛋白质的底物。一些核酸释放结构域还可衍生自各种蛋白质的自溶位点。本领域技术人员可预期通过改变氨基酸序列来修饰或工程改造核酸释放结构域。本领域技术人员还可预期以相反的顺序，或通过在结构域内切换氨基酸位置或对氨基酸添加翻译后修饰来布置核酸释放信号。
在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽还包含稳定性结构域。在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽可以包含稳定性结构域，所述稳定性结构域是或包含包括以下的氨基酸序列：YTRF、GDAY、LLEE、RKKRRQRRR、YKSL、YENF、FQDL、YIGSR、IKVAV或其组合，但不限于此。这些结构域可来源于人蛋白质或其他生物体。本领域技术人员可预期通过改变氨基酸序列来修饰或工程改造稳定性结构域。本领域技术人员还可预期以相反的顺序，或通过在结构域内切换氨基酸位置或对氨基酸添加翻译后修饰来布置稳定性结构域。
在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽包含寡聚化结构域。在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽可以包含寡聚化结构域，所述寡聚化结构域选自表11的寡聚化结构域，但不限于此。寡聚化结构域的位置位于本公开的工程改造的多肽的C末端或任何其他位置。这些结构域可来源于人蛋白质或其他生物体。本领域技术人员可预期通过改变氨基酸序列来修饰或工程改造寡聚化结构域。本领域技术人员还可预期以相反的顺序，或通过在结构域内切换氨基酸位置或对氨基酸添加翻译后修饰来布置寡聚化结构域。
在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽包含接头。在一些实施方案中，本公开的工程改造的多肽可以包含接头，所述接头选自但不限于表12的示例性结构域。接头在本公开的工程改造的多肽中的位置可介于其他结构域之间以及任何其他位置。这些接头可来源于人蛋白质或其他生物体。本领域技术人员可预期通过改变氨基酸序列来修饰或工程改造接头结构域。本领域技术人员还可预期以相反的顺序，或通过在结构域内切换氨基酸位置或对氨基酸添加翻译后修饰来布置接头结构域。
在各种实施方案中，两个或更多个本公开的工程改造的多肽可以寡聚化。
在一些实施方案中，本公开包括一种组合物，所述组合物包含本公开的工程改造的多肽(例如，微核小体核心蛋白)连同至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，多肽是DNA或RNA多核苷酸。在一些实施方案中，多肽是或包含抑制性RNA，其中抑制性RNA是gRNA、siRNA、miRNA或shRNA。在各种实施方案中，一种或多种多肽和一种或多种多核苷酸不缔合，但是一起处于组合物例如试剂盒或溶液中。在各种实施方案中，一种或多种多肽和一种或多种多核苷酸缔合，例如缩合，例如以形成负载的微核小体。在某些实施方案中，多核苷酸与工程改造的多肽的比率介于1:3与1:2,000之间。在某些实施方案中，多核苷酸与工程改造的多肽的比率介于1:3与1:1,000之间、介于1:3与1:500之间、介于1:3与1:200之间、介于1:3与1:100之间，或介于1:3与1:50之间。在某些实施方案中，多核苷酸与工程改造的多肽的比率介于1:200与1:2,000之间、介于1:200与1:1000之间，或介于1:200与1:500之间。本领域技术人员还可预期对DNA或RNA分子的化学修饰。
在一些实施方案中，可以将本文提供的包含微核小体核心蛋白和/或负载的微核小体)的组合物施用于细胞、组织或受试者或使其与所述细胞、组织或受试者接触。应用条件可以是在体外、离体或在体内。这样的工程改造的细胞可包含药物载体，例如，可用于将治疗性材料(例如，本文提供的包含微核小体核心蛋白和/或负载的微核小体的组合物)递送至人体的各个部分，例如但不限于脑、视网膜、肠、胰腺、肺等，或与其相容的药物载体。
在一些实施方案中，使多核苷酸缩合的方法可包括使多核苷酸与如本文所述的微核小体核心蛋白接触。所述方法可包括中和多核苷酸的电荷或使多核苷酸缩合成纳米级颗粒的过程，其包括使多核苷酸与本文所述的微核小体核心蛋白接触。
在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以是支化肽或环状肽，但不限于这些特征。本领域技术人员可预期改变微核小体核心蛋白的特征以获得对各种细胞类型增强的向性。
本公开还提供了一种多核苷酸，其编码如本文所提供的工程改造的多肽(例如，微核小体核心蛋白)。编码工程改造的多肽的多核苷酸可以是DNA多核苷酸或RNA多核苷酸。在一些情况下，本公开提供了一种载体，其包含编码本公开的工程改造的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞，其包含编码如本文所提供的工程改造的多肽(例如，微核小体核心蛋白)的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体，或其包含所述多核苷酸的序列。在某些实施方案中，本公开的工程改造的多肽可以从一个或多个此类细胞中分离出来。
在各种实施方案中，本公开的工程改造的多肽(例如，微核小体核心蛋白)的一个或多个氨基酸是聚乙二醇化、乙酰化、甲基化、糖基化、磷酸化、sumo化(sumoylated)、酰胺化、脂化、异戊烯化、硫辛酰化、烷基化、酰化、糖化、亚硝酰化、硫酸化、氨甲酰化、羰基化、类泛素化(neddylated)、生物素化或核糖基化的。
定义
约：术语“约”在本文中关于值使用时，是指在参考值的上下文中相似的值。通常，熟悉上下文的本领域技术人员将理解在该上下文中“约”所涵盖的相关变化程度。例如，在一些实施方案中，术语“约”可涵盖在参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小之内的值的范围。
施用：如本文所用，术语“施用”通常是指将组合物施用给受试者或系统，以实现作为组合物或包含在所述组合物中的剂的递送。本领域普通技术人员将意识到在适当的情况下可用于施用于受试者例如人的多种途径。例如，在一些实施方案中，施用可以是眼部、口服、肠胃外、局部施用等。在一些特定实施方案中，施用可以是支气管(例如，通过支气管滴注)、经颊、皮肤(可以是或包括例如皮肤表面、皮内、皮间、透皮等中的一种或多种)、肠内、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、特定器官内(例如肝内)、粘膜、经鼻、口服、直肠、皮下、舌下、局部、气管(例如，通过气管内滴注)、阴道、玻璃体施用等。在一些实施方案中，施用可仅包括单剂量。在一些实施方案中，施用可包括应用固定数量的剂量。在一些实施方案中，施用可包括间歇给药(例如，在时间上分隔开的多次剂量)和/或定期(例如，通过共同的时间段分隔开的各个剂量)给药。在一些实施方案中，施用可包括持续至少选定时间段的连续给药(例如，灌注)。
与......相关：当该术语在本文使用时，如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另一事件或实体的存在、水平和/或形式相关联，则这两个事件或实体彼此“相关”。例如，如果特定实体(例如，多肽、遗传签名(genetic signature)、代谢物、微生物等)的存在、水平和/或形式与疾病、病症或病状的发病率和/或易感性(例如，在相关人群中)相关联，则所述特定实体被视为与特定疾病、病症或病状相关。在一些实施方案中，如果两个或更多个实体直接或间接相互作用，使得它们是和/或保持在物理上彼此接近，则它们在物理上彼此“缔合”。在一些实施方案中，彼此在物理上缔合的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施方案中，彼此在物理上缔合的两个或更多个实体不彼此共价连接，而是非共价缔合，例如通过氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性及其组合。
剂：如本文所用，术语“剂”可指任何化学类别的化合物、分子或实体，包括例如小分子、多肽、核酸、糖、脂质、金属，或其组合或复合物。在一些实施方案中，术语“剂”可指包括聚合物的化合物、分子或实体。在一些实施方案中，该术语可指包含一个或多个聚合部分的化合物或实体。在一些实施方案中，术语“剂”可指基本上不含特定聚合物或聚合部分的化合物、分子或实体。在一些实施方案中，该术语可指缺乏或基本上不含任何聚合物或聚合部分的化合物、分子或实体。
氨基酸：在其最广泛的意义上，如本文所用，“氨基酸”是指可以例如通过形成一个或多个肽键而掺入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构H2N–C(H)(R)–COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是非天然氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常存在于天然存在的肽中的二十种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论是合成制备的还是从天然来源获得的。在一些实施方案中，与以上一般结构相比，氨基酸(包括多肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸)可以包含结构修饰。例如，在一些实施方案中，与一般结构相比，可通过(例如，氨基、羧酸基团、一个或多个质子和/或羟基的)甲基化、酰胺化、乙酰化、聚乙二醇化、糖基化、磷酸化和/或取代对氨基酸进行修饰。在一些实施方案中，与含有原本同一的未修饰氨基酸的多肽相比，这样的修饰可例如改变含有修饰氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方案中，与含有原本同一的未修饰氨基酸的多肽相比，这样的修饰不显著改变含有修饰氨基酸的多肽的相关活性。从上下文将清楚地看出，在一些实施方案中，术语“氨基酸”可用于指游离氨基酸；在一些实施方案中，所述术语可用于指多肽的氨基酸残基。
介于...之间：如本文所用，术语“介于...之间”是指落在所指示的上边界与下边界之间或第一边界与第二边界之间的内容，包括边界。
对应于：如本文所用，术语“对应于”可用于通过与适当的参考化合物或组合物进行比较来指定结构元件在化合物或组合物中的位置/同一性。例如，在一些实施方案中，可将聚合物中的单体残基(例如，多肽中的氨基酸残基或多核苷酸中的核酸残基)鉴定为“对应于”适当的参考聚合物中的残基。例如，本领域普通技术人员应理解，为简明起见，通常使用基于参考相关多肽的规范编号系统来指定多肽中的残基，以使“对应于”位置190处的残基的氨基酸，例如，实际上不必须是特定氨基酸链中的第190个氨基酸，而是对应于参考多肽的第190位上存在的残基；本领域普通技术人员容易理解如何鉴定“对应”氨基酸。例如，本领域技术人员将知道各种序列比对策略，包括诸如BLAST、CS-BLAST、CUDASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAST、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM或SWIPE的软件程序，其可以用于例如鉴定根据本公开的多肽和/或核酸中的“对应”残基。
结构域：如本文所用的术语“结构域”是指实体的区段或部分。在一些实施方案中，“结构域”与实体的特定结构和/或功能特征相关，使得当结构域与其亲本实体的其余部分在物理上分开时，它基本或完全保留所述特定结构和/或功能特征。可替代地或另外地，结构域可以是或包括实体的一部分，当与所述(亲本)实体分开并与不同的(接受)实体连接时，所述部分基本上保留在亲本实体中对其进行表征的一个或多个结构和/或功能特征，并且/或者赋予接受实体所述一个或多个结构和/或功能特征。在一些实施方案中，结构域是分子(例如，小分子、碳水化合物、脂质、核酸或多肽)的区段或部分。在一些实施方案中，结构域是多肽的区段；在一些此类实施方案中，结构域通过特定的结构元件(例如，特定的氨基酸序列或序列基序、α-螺旋特征、β-折叠特征、卷曲螺旋特征、无规卷曲特征等)进行表征，并且/或者通过特定的功能特征(例如，结合活性、酶活性、折叠活性、信号传导活性等)进行表征。在一些实施方案中，结构域是或包含特征部分或特征序列元件。
工程改造的：通常，术语“工程改造的”是指已被人为操纵的方面。例如，当在自然界中没有按该顺序连接在一起的两个或更多个序列被人为操纵在工程改造的多核苷酸中直接彼此连接时，所述多核苷酸被视为“工程改造的”。本领域技术人员应理解，“工程改造的”核酸或氨基酸序列可以是重组核酸或氨基酸序列。在一些实施方案中，工程改造的多核苷酸包括结构域编码序列调节序列，其被发现在自然界中与第一序列可操作地缔合而不与第二序列可操作地缔合，通过人为连接，使得其与第二序列可操作地缔合。相当地，如果已对细胞或有机体进行操纵，使得其遗传信息发生改变(例如，已引入先前不存在的新遗传材料，例如通过转化、交配、体细胞杂交、转染、转导或其他机制，或先前存在的遗传材料被改变或移除，例如通过取代或缺失突变，或通过交配方案)，那么所述细胞或有机体被视为“工程改造的”。作为常规实践并且如本领域技术人员所理解的，即使对先前实体进行了实际操纵，工程改造的多核苷酸或细胞的后代也通常仍被称为“工程改造的”。
基因：如本文所用，术语“基因”是指编码产物(例如，RNA产物和/或多肽产物)的DNA序列。在一些实施方案中，基因包括编码序列(即，编码特定产物的序列)；在一些实施方案中，基因包括非编码序列。在一些特定实施方案中，基因可包括编码序列(例如外显子)和非编码序列(例如内含子)。在一些实施方案中，基因可包括一个或多个调节元件，例如其可控制或影响基因表达的一个或多个方面(例如，启动子)。在特定背景(例如细胞)中，基因可以是内源性或非内源性的。基因可以是转基因。
基因产物或表达产物：如本文所用，术语“基因产物”或“表达产物”通常是指由基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由基因转录的RNA编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。
“改善”、“增加”、“抑制”或“减少”：如本文所用，术语“改善”、“增加”、“抑制”、“减少”或其语法等同物指示相对于基线或其他参考测量结果的值。在一些实施方案中，适当的参考测量结果可以是或包括在不存在特定剂或治疗的相当条件下(例如，之前和/或之后)，或在适当的相当参考剂的存在下，在特定系统中(例如，在单一个体中)的测量结果。在一些实施方案中，适当的参考测量结果可以是或包括在相关剂或治疗的存在下已知或预期以特定方式响应的相当系统中的测量结果。
核酸：如本文所用，在其最广泛的意义上，“核酸”是指掺入或可以掺入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是通过磷酸二酯键掺入或可以掺入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文将清楚地看出，在一些实施方案中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包括单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包括RNA；在一些实施方案中，“核酸”是或包括DNA。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核酸残基，包括一个或多个天然核酸残基，或由其组成。在一些实施方案中，核酸是一个或多个核酸类似物，包括一个或多个核酸类似物，或由其组成。在一些实施方案中，核酸类似物与核酸的不同之处在于其不利用磷酸二酯骨架。例如，在一些实施方案中，核酸是一个或多个肽核酸，包括或一个或多个“肽核酸”或由其组成，所述肽核酸是本领域已知的并且在骨架中具有肽键代替磷酸二酯键，其被视为在本公开的范围内。可替代地或另外地，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键，而不是磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)，包括所述一个或多个天然核苷或由其组成。
在一些实施方案中，核酸是一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入型碱基(intercalated base)及其组合)，包括所述一个或多个核苷类似物或由其组成。在一些实施方案中，与天然核酸中的那些相比，核酸包括一种或多种修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能基因产物诸如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，通过以下方式中的一种或多种制备核酸：从天然来源分离、基于互补模板通过聚合作用酶促合成(在体内或体外)、在重组细胞或系统中增殖，以及化学合成。在一些实施方案中，核酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000个或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是部分或全部单链的；在一些实施方案中，核酸是部分或全部双链的。在一些实施方案中，核酸具有核苷酸序列，所述核苷酸序列包含编码多肽或是编码所述多肽的序列的互补序列的至少一个元件。在一些实施方案中，核酸具有酶促活性。
可操作地连接：如本文所用，“可操作地连接”是指并置，其中所述部件处于允许其以预期方式起作用的关系中。例如，“可操作地连接”至功能元件的控制元件的缔合方式使得功能元件的表达和/或活性在与控制元件相容的条件下实现。在一些实施方案中，“可操作地连接的”控制元件与感兴趣的编码元件是连续的(例如，共价连接)；在一些实施方案中，控制元件反作用于或以其他方式作用于感兴趣的功能元件。
药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”是指其中活性剂与一种或多种药学上可接受的载剂配制在一起的组合物。在一些实施方案中，活性剂以适于在治疗方案中施用的单位剂量的量存在，当向相关群体施用时，所述治疗方案显示出实现预定治疗效果的统计学上显著的可能性。在一些实施方案中，可将药物组合物特别地配制以用于以固体或液体形式施用，包括适于以下的那些：口服施用，例如，灌药(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如，靶向用于颊、舌下和系统性吸收的那些)、大丸药、粉剂、颗粒剂、应用于舌头的贴剂；肠胃外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，作为例如无菌溶液或混悬液，或持续释放制剂；局部应用，例如，作为霜剂、软膏，或控制释放的贴剂或应用于皮肤、肺或口腔的喷雾剂；作为例如子宫托、霜剂或泡沫剂阴道内或直肠内施用；舌下施用；眼部施用；经皮施用；或经鼻施用；肺部施用，以及施用至其他粘膜表面。
多肽：如本文所用，“多肽”是指氨基酸的任何聚合链。在一些实施方案中，多肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有非天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列是工程改造的，因为它是通过人手的动作设计和/或产生的。在一些实施方案中，多肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸或两者，或由其组成。在一些实施方案中，多肽可仅包含天然氨基酸或仅包含非天然氨基酸，或由其组成。在一些实施方案中，多肽可包含D-氨基酸、L-氨基酸或两者。在一些实施方案中，多肽可仅包含D-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可仅包含L-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可在多肽的N末端、在多肽的C末端或其任何组合包括一个或多个侧基或其他修饰，例如对一个或多个氨基酸侧链的修饰或附接。在一些实施方案中，此类侧基或修饰可选自由以下组成的组：乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、磷酸化、糖基化、糖化、硫酸化、甘露糖基化、亚硝酰化、酰化、棕榈酰化、异戊烯化、聚乙二醇化等，包括其组合。在一些实施方案中，多肽可以是环状的，并且/或者可包括环状部分。在一些实施方案中，多肽不是环状的，并且/或者不包括任何环状部分。在一些实施方案中，多肽是线性的。在一些实施方案中，多肽可以是或包括装订(stapled)多肽。在一些实施方案中，术语“多肽”可附加于参考多肽、活性或结构的名称；在此类情况下，该术语在本文中用于指共享相关活性或结构并且因此可以被视为相同多肽类别或家族的成员的多肽。对于每个这样的类别，本说明书提供了和/或本领域技术人员将认识到其中氨基酸序列和/或功能已知的类别内的示例性多肽；在一些实施方案中，此类示例性多肽是该多肽类别或家族的参考多肽。在一些实施方案中，多肽类别或家族的成员显示出与该类别的参考多肽(在一些实施方案中，与该类别内的所有多肽)的显著序列相似性(例如，同源性)或同一性，与其共享共同序列基序(例如，特征序列元件)，并且/或者共享共同的活性(在一些实施方案中，以相当的水平或在指定范围内)。例如，在一些实施方案中，成员多肽显示出与参考多肽的至少约30-40％，并且通常大于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的总体序列相似性(例如，同源性)或同一性程度，并且/或者包括显示出非常高的序列同一性(通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％)的至少一个区域(例如，保守区域，其在一些实施方案中可以是或包含特征序列元件)。这样的保守区域通常包含至少3-4个且通常最多20个或更多个氨基酸；在一些实施方案中，保守区域包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个连续氨基酸的至少一个链段。在一些实施方案中，可用的多肽可包括亲本多肽的片段或由其组成。在一些实施方案中，可用多肽可包括多个片段或由其组成，所述片段中的每一个相对于彼此以与感兴趣的多肽中所存在的不同的空间排列存在于相同的亲本多肽中(例如，在亲本中直接连接的片段在感兴趣的多肽中可在空间上分开或反之亦然，并且/或者片段可以与亲本中不同的顺序存在于感兴趣的多肽中)，使得感兴趣的多肽来源于其亲本多肽。
预防(Prevent或prevention)：如本文所用，“预防(prevent或prevention)”当与疾病、病症和/或病状的出现结合使用时，是指降低发展疾病、病症和/或病状的风险并且/或者延迟疾病、病症或病状的一个或多个特征或症状的发作。当疾病、病症或病状的发作已延迟预定时间段时，可认为完成了预防。
启动子：如本文所用，“启动子”或“启动子序列”可以是直接或间接(例如，通过启动子结合的蛋白质或物质)参与编码序列转录的起始和/或持续进行的DNA调节区域。在一个或多个转录因子和/或调节部分与启动子结合时，启动子可在合适的条件下起始编码序列的转录。参与编码序列的转录起始的启动子可以与编码序列“可操作地连接”。在某些情况下，启动子可以是或包含从转录起始位点(在其3'末端)延伸至上游(5'方向)位置的DNA调节区域，使得如此指定的序列包括起始转录事件所必需的最小数量的碱基或元件中的一者或两者。启动子可以是、包含或可操作地缔合至或可操作地连接至表达控制序列，诸如增强子和阻抑序列。在一些实施方案中，启动子可以是诱导型的。在一些实施方案中，启动子可以是组成型启动子。在一些实施方案中，条件型(例如，诱导型)启动子可以是单向或双向的。启动子可以是或包含与已知存在于特定物种的基因组中的序列同一的序列。在一些实施方案中，启动子可以是或包括杂合启动子，其中可以从一个来源获得含有转录调节区域的序列，并且可以从第二来源获得含有转录起始区域的序列。用于将控制元件与转基因内的编码序列连接的系统是本领域众所周知的(一般分子生物学和重组DNA技术描述于Sambrook、Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中)。
重组：如本文所用，“重组”旨在指通过重组手段设计、工程改造、制备、表达、产生、制造和/或分离的多肽，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽；从重组的组合性人多肽文库中分离的多肽；从动物(例如，小鼠、兔、绵羊、鱼等)中分离的多肽，所述动物是转基因的或已以其他方式被操纵以表达编码多肽或其一个或多个组分、部分、元件或结构域和/或指导它们的表达的一种或多种基因或基因组分；和/或通过任何其他手段制备、表达、产生或分离的多肽，所述手段包括将选定的核酸序列元件剪接或彼此连接，化学合成选定序列元件，和/或以其他方式生成编码多肽或其一个或多个组分、部分、元件或结构域和/或指导它们的表达的核酸。在一些实施方案中，一种或多种此类选定序列元件在自然界中存在。在一些实施方案中，一种或多种此类选定序列元件在电脑上进行设计。在一些实施方案中，一种或多种此类选定序列元件由已知序列元件的诱变(例如，体内或体外)产生，所述已知序列元件例如来自天然或合成来源，诸如在感兴趣的源生物体(例如，人、小鼠等)的生殖系中。
参考：如本文所用描述相对于与其进行比较的标准或对照。例如，在一些实施方案中，将感兴趣的剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，参考或对照与感兴趣的测试或确定基本上同时进行测试和/或确定。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地体现在有形介质中。通常，如本领域技术人员将理解的，在与所评估的那些相当的条件或情况下确定或表征参考或对照。本领域技术人员将认识到存在足够相似性的情况，以判断对特定的可能参考或对照的依赖和/或比较。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指生物体，通常是哺乳动物(例如，人，在一些实施方案中包括产前人形式)。在一些实施方案中，受试者患有相关的疾病、病症或病状。在一些实施方案中，受试者易患疾病、病症或病状。在一些实施方案中，受试者表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状或特征。在一些实施方案中，受试者不表现出疾病、病症或病状的任何症状或特征。在一些实施方案中，受试者是具有对疾病、病症或病状的易感性或风险所特有的一个或多个特征的受试者。在一些实施方案中，受试者是患者。在一些实施方案中，受试者是被和/或已被施用诊断和/或疗法的个体。
基本序列相似性：短语“基本序列相似性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将理解的，如果两个序列在对应位置包含保守氨基酸取代，则所述两个序列通常被视为“基本上相似的”。保守取代是其中氨基酸已被具有适当相似的结构和/或功能特征的非同一残基代替的取代。例如，如本领域普通技术人员所熟知的，某些氨基酸通常被分类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或具有“极性”或“非极性”侧链。一个氨基酸对相同类型的另一氨基酸的取代通常可视为保守取代。下表1和2汇总了典型的氨基酸分类：
表1
丙氨酸 Ala A 非极性 中性 1.8
精氨酸 Arg R 极性 正 -4.5
天冬酰胺 Asn N 极性 中性 -3.5
天冬氨酸 Asp D 极性 负 -3.5
半胱氨酸 Cys C 非极性 中性 2.5
谷氨酸 Glu E 极性 负 -3.5
谷氨酰胺 Gln Q 极性 中性 -3.5
甘氨酸 Gly G 非极性 中性 -0.4
组氨酸 His H 极性 正 -3.2
异亮氨酸 Ile I 非极性 中性 4.5
亮氨酸 Leu L 非极性 中性 3.8
赖氨酸 Lys K 极性 正 -3.9
甲硫氨酸 Met M 非极性 中性 1.9
苯丙氨酸 Phe F 非极性 中性 2.8
脯氨酸 Pro P 非极性 中性 -1.6
丝氨酸 Ser S 极性 中性 -0.8
苏氨酸 Thr T 极性 中性 -0.7
色氨酸 Trp W 非极性 中性 -0.9
酪氨酸 Tyr Y 极性 中性 -1.3
缬氨酸 Val V 非极性 中性 4.2
表2
歧义氨基酸(Ambiguous Amino Acids) 3字母 1字母
天冬酰胺或天冬氨酸 Asx B
谷氨酰胺或谷氨酸 Glx Z
亮氨酸或异亮氨酸 Xle J
未指定或未知氨基酸 Xaa X
如本领域中众所周知的，可使用多种算法中的任一种比较氨基酸或核酸序列，包括可在商业计算机程序中获得的那些，诸如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、gapped BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序描述于Altschul等人，Basiclocal alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul等人，Methods in Enzymology；Altschul等人，“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of protein database search programs,”Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；Baxevanis等人，Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis ofGenes and Proteins,Wiley,1998；以及Misener等人(编),Bioinformatics Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology,第132卷),Humana Press,1999中。除了鉴定相似序列之外，上述程序通常还提供相似性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的对应残基中的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多在残基的相关链段上是相似和/或同一的，则所述两个序列被视为基本上相似的。在一些实施方案中，相关链段是完整序列。在一些实施方案中，相关链段为至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500或更多个残基。如本领域普通技术人员将理解的，具有基本序列相似性的序列可以是彼此的同源物。
基本序列同一性：如本文所用，短语“基本序列同一性”是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将理解的，如果两个序列在对应位置包含同一残基，则所述两个序列通常被视为“基本上同一的”。如本领域中众所周知的，可使用多种算法中的任一种比较氨基酸或核酸序列，包括可在商业计算机程序中获得的那些，诸如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、gapped BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序描述于Altschul等人，Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul等人，Methods in Enzymology；Altschul等人，Nucleic AcidsRes.25:3389-3402,1997；Baxevanis等人，Bioinformatics:A Practical Guide to theAnalysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；以及Misener等人(编)，BioinformaticsMethods and Protocols(Methods in Molecular Biology,第132卷),Humana Press,1999中。除了鉴定同一序列之外，上述程序通常还提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的对应残基中的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在残基的相关链段上是同一的，则所述两个序列被视为基本上同一的。在一些实施方案中，相关链段是完整序列。在一些实施方案中，相关链段为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个残基。
治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”通常是指当施用于生物体时引起期望的药理效应的任何剂。在一些实施方案中，如果剂在适当群体中表现出统计学上显著的作用，则所述剂被视为治疗剂。在一些实施方案中，适当的群体可以是模型生物体的群体。在一些实施方案中，可通过各种标准限定适当的群体，诸如特定年龄组、性别、遗传背景、既往临床状况等。在一些实施方案中，治疗剂是可以用于对疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征进行减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟发作、降低严重程度和/或减少发病率的物质。在一些实施方案中，“治疗剂”是在可以被出售以施用给人之前已经或需要通过政府机构的批准的剂。在一些实施方案中，“治疗剂”是对于施用于人需要医学处方的剂。
治疗方案：如本文所用的该术语“治疗方案”是指其在相关群体中的施用可与期望的或有益的治疗结果相关联的给药方案。
治疗有效量：如本文所用，是指对施用对象产生期望效果的量。在一些实施方案中，该术语是指当根据治疗给药方案施用给罹患或易患疾病、病症和/或病状的群体时足以治疗疾病、病症和/或病状的量。在一些实施方案中，治疗有效量是降低疾病、病症和/或病状的一个或多个症状的发病率和/或严重程度，和/或延迟其发作的量。本领域普通技术人员将理解，术语“治疗有效量”实际上并不要求在特定个体中实现成功治疗。相反，治疗有效量可以是当施用给需要所述治疗的患者时在大量受试者中提供特定的期望药理反应的量。在一些实施方案中，对治疗有效量的提及可以是指在一种或多种具体组织(例如，受疾病、病症或病状影响的组织)或流体(例如，血液、唾液、血清、汗液、泪液、尿液等)中测量的量。本领域普通技术人员应理解，在一些实施方案中，治疗有效量的特定剂或疗法可以单剂量配制和/或施用。在一些实施方案中，治疗有效剂可以多个剂量，例如作为给药方案的一部分配制和/或施用。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指对特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征和/或病因进行部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、延迟发作、降低严重程度和/或降低发病率的疗法的任何施用。在一些实施方案中，这样的治疗可针对未表现出相关疾病、病症和/或病状的体征的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或病状的早期体征的受试者。可替代地或另外地，这样的治疗可针对表现出相关疾病、病症和/或病状的一个或多个确立体征的受试者。在一些实施方案中，治疗可针对已被诊断为患有相关疾病、病症和/或病状的受试者。在一些实施方案中，治疗可针对已知具有在统计学上与发展相关疾病、病症和/或病状的风险增加相关联的一种或多种易感性因素的受试者。
变体：如本文在分子例如核酸、蛋白质或小分子的上下文中所使用的，术语“变体”是指表现出与参考分子的显著结构同一性但在结构上不同于参考分子的分子，例如，在与参考实体相比，存在或不存在或处于一定水平的一种或多种化学部分的情况下。在一些实施方案中，变体在功能上也不同于其参考分子。通常，是否将特定分子恰当地视为参考分子的“变体”是基于其与参考分子的结构同一性程度。如本领域技术人员将理解的，任何生物学或化学参考分子具有某些特征性结构元件。根据定义，变体是独特的分子，其与参考分子共享一个或多个这样的特征性结构元件，但是在至少一个方面与其不同。仅举几个例子，多肽可具有包括在线性或三维空间上相对于彼此具有指定位置和/或有助于特定结构基序和/或生物功能的多个氨基酸的特征性序列元件；核酸可具有包括在线性或三维空间上相对于彼此具有指定位置的多个核苷酸残基的特征性序列元件。在一些实施方案中，由于氨基酸或核苷酸序列中的一个或多个差异和/或作为多肽或核酸的共价组分(例如，与多肽或核酸骨架附接)的化学部分(例如，碳水化合物、脂质、磷酸酯基团)中的一个或多个差异，变体多肽或核酸可不同于参考多肽或核酸。在一些实施方案中，变体多肽或核酸显示出与参考多肽或核酸至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列同一性。在一些实施方案中，变体多肽或核酸不与参考多肽或核酸共享至少一个特征性序列元件。在一些实施方案中，参考多肽或核酸具有一种或多种生物活性。在一些实施方案中，变体多肽或核酸共享参考多肽或核酸的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，变体多肽或核酸缺乏参考多肽或核酸的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，与参考多肽或核酸相比，变体多肽或核酸显示出降低水平的一种或多种生物活性。在一些实施方案中，如果感兴趣的多肽或核酸的氨基酸或核苷酸序列与参考的所述氨基酸或核苷酸序列同一，但在特定位置具有少量序列改变，则所述多肽或核酸被视为参考多肽或核酸的“变体”。典型地，与参考相比，变体中少于约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％或约2％的残基被取代、插入或缺失。在一些实施方案中，与参考相比，变体多肽或核酸包括约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2或约1个取代残基。通常，相对于参考，变体多肽或核酸包括非常少量的(例如，少于约5、约4、约3、约2或约1个)取代、插入或缺失的功能残基(即，参与特定生物活性的残基)。在一些实施方案中，与参考相比，变体多肽或核酸包括不超过约5、约4、约3、约2或约1个添加或缺失，并且在一些实施方案中，不包括添加或缺失。在一些实施方案中，与参考相比，变体多肽或核酸包括少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6个，并且通常少于约5、约4、约3或约2个添加或缺失。在一些实施方案中，参考多肽或核酸是自然界中存在的。在一些实施方案中，参考多肽或核酸是人多肽或核酸。
附图说明
图1包括图A和图B。图A是在赖氨酸残基处用图B所示的PEG12修饰的微核小体核心蛋白如何与DNA分子发生缩合反应以产生负载的微核小体的示意图。每个核酸分子可需要若干(1至1000个)微核小体核心蛋白来中和DNA中的负电荷，以形成负载的微核小体。该示意图仅旨在作为卡通图，并且除了负载的微核小体包含与核心蛋白缔合的核酸之外，不旨在代表负载的微核小体的实际结构。
图2是示出了在配制在序列中的第一个赖氨酸残基处用PEG12修饰的微核小体核心蛋白后，由质谱分析获得的数据的图。
图3是在赖氨酸残基处用1kDa PEG修饰的微核小体核心蛋白如何与DNA分子发生缩合反应以产生负载的微核小体的示意图。图3包括图A和图B。图A是在赖氨酸残基处用图B所示的1kDa PEG修饰的微核小体核心蛋白如何与DNA分子发生缩合反应以产生负载的微核小体的示意图。每个核酸分子可需要若干(1至1000个)微核小体核心蛋白来中和DNA中的负电荷，以形成负载的微核小体。该示意图仅旨在作为卡通图，并且除了负载的微核小体包含与核心蛋白缔合的核酸之外，不旨在代表负载的微核小体的实际结构。
图4包括图A和图B。图A是在赖氨酸残基处用图B所示的2kDa PEG修饰的微核小体核心蛋白如何与DNA分子发生缩合反应以产生负载的微核小体的示意图。每个核酸分子可需要若干(1至1000个)微核小体核心蛋白来中和DNA中的负电荷，以形成负载的微核小体。该示意图仅旨在作为卡通图，并且除了负载的微核小体包含与核心蛋白缔合的核酸之外，不旨在代表负载的微核小体的实际结构。
图5包括图A和图B。图A是在赖氨酸残基处用图B所示的5kDa PEG修饰的微核小体核心蛋白如何与DNA分子发生缩合反应以产生负载的微核小体的示意图。每个核酸分子可需要若干(1至1000个)微核小体核心蛋白来中和DNA中的负电荷，以形成负载的微核小体。该示意图仅旨在作为卡通图，并且除了负载的微核小体包含与核心蛋白缔合的核酸之外，不旨在代表负载的微核小体的实际结构。
图6包括图A和图B。图A是在赖氨酸残基处用图B所示的10kDa PEG修饰的微核小体核心蛋白如何与DNA分子发生缩合反应以产生负载的微核小体的示意图。每个核酸分子可需要若干(1至1000个)微核小体核心蛋白来中和DNA中的负电荷，以形成负载的微核小体。该示意图仅旨在作为卡通图，并且除了负载的微核小体包含与核心蛋白缔合的核酸之外，不旨在代表负载的微核小体的实际结构。
图7是一组图像，其包括图A、B和C，其中每个图示出了来自负载的微核小体的透射电子显微镜检查(TEM)的图像。
图8是示出了通过Elisa测量的所表达的因子8蛋白的浓度的图。
图9是一组图像，其包括图A、B和C，其中每个图是示出了由负载的微核小体中存在的核酸编码的蛋白质在肝脏组织中的基因表达的荧光显微图像。
图10是一组图像，其包括图A、B、C和D，其中每个图是示出了由负载的微核小体中存在的核酸编码的蛋白质在小鼠RPE组织中的基因表达的荧光显微图像。图A是展示RPE特异性表达的视网膜切片。图B是展示RPE特异性表达的RPE全标本(whole mount)。图B和D分别代表视网膜切片和RPE全标本的未处理的对照样品。
图11是一组图像，其包括图A、B、C和D，其中每个图是示出了由负载的微核小体中存在的核酸编码的蛋白质在大鼠视网膜组织中的基因表达的荧光显微图像。图A和C是展示RPE特异性表达的视网膜切片，并且图B和D示出了注射质粒的对照样品。
图12是一组图像，其包括图A、B、C和D，其中每个图是示出了由负载的微核小体中存在的核酸编码的蛋白质在小鼠视网膜组织中的基因表达的荧光显微图像。图A是展示视网膜神经元中的GFP表达的视网膜切片。图C是展示视网膜光感受器中的GFP表达的视网膜全标本。图B和D分别代表视网膜切片和RPE全标本的未处理的对照样品。
图13是一组图像，其包括图A、B和C，其中每个图是示出了由负载的微核小体中存在的核酸编码的蛋白质在小鼠肺中的基因表达的荧光显微图像。图A展示了肺泡和细支气管中的GFP表达。图B展示了CFTR染色。图C是图A和B的合并，其展示了GFP和CFTR染色的共定位。
图14是一组图像，其包括图A、B和C，其中每个图是示出了由负载的微核小体中存在的核酸编码的蛋白质在小鼠肺上皮中的基因表达的更高放大倍数的荧光显微图像。图A展示了肺泡和细支气管中的GFP表达。图B展示了CFTR染色。图C是图A和B的合并，其展示了GFP和CFTR(包括DAPI染色)的共定位。
图15是一组图像，其示出了由负载的微核小体中存在的核酸编码的蛋白质在小鼠整个肺组织中的基因表达。
图16是一组图像，其包括图A、B和C，其示出了由负载的微核小体中存在的核酸编码的蛋白质在小鼠脑、肠和胰腺组织中的基因表达。图A展示了在嗅觉神经元中的表达模式。图B及其下面的小图展示了在小肠中的表达模式。图C及其下面的小图展示了在胰腺中的表达模式。
图17是一组图像，其包括图A、B和C，其示出了由负载的微核小体中存在的核酸编码的蛋白质在小鼠气管组织中的基因表达。图A展示了气管上皮和内气管肌中的GFP表达。图B展示了内和外气管肌中的表达的肌营养不良蛋白染色模式。图C是图A和B的合并，其展示了肌营养不良蛋白染色模式与GFP在内气管肌细胞中的共定位。
图18是一组图像，其包括图A、B和C，其示出了由负载的微核小体中存在的核酸编码的蛋白质在小鼠肌肉组织中的基因表达。图A展示了小鼠肌细胞中的GFP表达。图B展示了小鼠肌细胞中的表达的肌营养不良蛋白染色模式。图C是图A和B的合并，其展示了肌营养不良蛋白染色模式与GFP在小鼠肌细胞中的共定位。
图19是示出了在第一剂量和第二剂量之后通过Elisa测量的所表达的因子8蛋白的浓度的增加的图，其表明中和作用的缺乏，或换句话说缺乏中和抗体活性。
具体实施方式
本公开尤其提供了与微核小体核心蛋白及其使用有关的方法和组合物。本文公开的微核小体核心蛋白尤其包含(a)核酸结合结构域(NABD)，(b)靶向结构域，和或(c)核酸释放结构域，和/或稳定性结构域，和/或寡聚化结构域，和/或接头结构域。在各种实施方案中，微核小体核心蛋白与一个或多个核酸分子缔合，以形成负载的微核小体。在各种实施方案中，负载的微核小体包含两个或更多个微核小体核心蛋白和一个或多个核酸分子。在各种实施方案中，将负载的微核小体施用给有需要的受试者。
多核苷酸链通常携带具有负电荷的磷酸酯。因此，蛋白质诸如组蛋白中的正电荷有助于缩合核酸。本公开认识到，衍生自例如组蛋白的核酸结合结构域可以在作为非病毒性蛋白质载体的人工构建的微核小体核心蛋白中使用。
大多数哺乳动物细胞具有识别(和/或被其识别)、结合和内化分子或实体如病毒和细菌的细胞表面结合部分或受体。本文公开的各种组合物和方法在微核小体核心蛋白中利用此类细胞表面结合基序与核酸结合结构域和聚精氨酸结构域的组合。在各种实施方案中，微核小体核心蛋白能够缩合一种或多种核酸，或参与或促进一种或多种核酸的缩合。在各种实施方案中，微核小体核心蛋白有利于例如负载的微核小体中的缔合核酸内化到特定细胞类型中，例如通过内吞作用或通过其他细胞进入机制。因此，在各种实施方案中，本公开包括掺入靶向部分的微核小体核心蛋白，所述靶向部分能够与天然存在于系统(例如，为人的系统)的细胞上的细胞表面部分或受体结合，其中细胞表面部分或受体提供细胞进入机制。在各种情况下，细胞表面部分或受体是细胞类型特异性的，并且因此有利于核酸向选定细胞类型的特异性递送。
核酸分子含有大的负电荷，易于在体液中降解，并且不能通过简单的注射或暴露于细胞而进入细胞。所述大的负电荷可以被微核小体核心蛋白中和，以形成具有一定形状、尺寸和电荷的负载的微核小体，其允许通过被动扩散或主动转运进入细胞。本文所述的各种微核小体核心蛋白允许核酸的正确结合、缩合和靶向。本文所述的这些结构域可来源于人蛋白质或其他生物体。本领域技术人员可预期通过改变氨基酸序列来修饰或工程改造本文所述的结构域，以增强某些功能，诸如细胞附着、内化等，但不限于这些。本领域技术人员还可预期以相反的顺序，或通过在结构域内切换氨基酸位置或对氨基酸添加各种翻译后修饰(诸如乙酰化、糖化等)来布置结构域，但不限于这些。
核酸结合结构域
本公开包括以下认识：带正电荷的结构域与核酸缔合。本公开提供了可以包含在微核小体核心蛋白中的核酸结合结构域，例如DNA和RNA结合结构域。在一些情况下，微核小体核心蛋白中存在的DNA结合结构域是本文公开的DNA结合结构域。在一些情况下，微核小体核心蛋白中存在的RNA结合结构域是本文公开的RNA结合结构域。
在一些特定情况下，作为本文公开的微核小体核心蛋白中存在的DNA结合结构域的NABD可以衍生自组蛋白多肽序列。至少在一些情况下，在疾病的治疗中使用利用聚赖氨酸肽将DNA压实成较小颗粒以用于基因递送的非病毒载体(诸如DNA纳米颗粒)(Liu G等人，2003)没有成功或没有明显反应(Konstan M.W.等人，2004)。本公开提供了一种明显不同的方法，所述方法在各种实施方案中包括使用组蛋白的DNA结合结构域，例如氨基酸序列KRHRK。此氨基酸序列用于两个目的：首先，它提供与核酸缔合所需的高度正电荷；其次，它还为微核小体核心蛋白结构提供稳定性。第三，此NABD中的氨基酸序列KRH也是前蛋白转化酶的切割位点，因此允许遗传货物在细胞中的有效释放。
表3提供了NABD的其他实例。
可以在微核小体核心蛋白中包含诸如RRRRR的聚精氨酸束(poly-argininetract)，以增加核酸结合并提高正电荷和/或组合物的细胞穿透能力。聚精氨酸束可以存在于微核小体核心蛋白中，其位置适于促进微核小体核心蛋白和/或包含微核小体核心蛋白的负载的微核小体对细胞的穿透。本领域技术人员将意识到允许确定这样的位置的方法和技术。通过同时与多于一个脂质头部的磷酸酯缔合，精氨酸与磷脂相互作用形成双齿或多齿氢键合，因此与单个脂质头部基团上的磷酸酯相互作用。由于只有精氨酸可以形成双齿氢键，因此聚精氨酸可以与更多的两性离子和阴离子脂质键合，并且因此沿其轮廓长度产生正曲率，从而导致负高斯曲率(Rothbard,J.B.等人2005)。聚精氨酸束也可被修饰成特别地包括一种或多种组氨酸(H)氨基酸(或任何其他氨基酸)以改善微核小体核心蛋白的稳定性。组氨酸(或任何其他氨基酸)可插入如表3所示的聚精氨酸束中的任何位置。其他富含精氨酸的肽(诸如ANTP穿膜肽(ANTP Penetratin))和TAT也已显示出对细胞穿透的类似影响。
本公开包括以下认识：可以通过微核小体核心蛋白中的赖氨酸的乙酰化来促进微核小体核心蛋白向核的常染色质区域中的定位。这种稳定化的机制可至少部分地涉及稳定化翻译后修饰的组蛋白的机制。甲基化的组蛋白包装更紧密。组蛋白甲基化可以是动态的。可以应用的其他翻译后修饰是：磷酸化、糖基化、异戊烯化、硫辛酰化、烷基化、酰化、糖化、亚硝酰化、硫酸化、氨甲酰化、羰基化、sumo化、类泛素化、生物素化、核糖基化等。修饰可不限于此处提到的这些。其他修饰可包括辅因子、辅酶、疏水基团、亲水基团、较小的化学基团、较小的肽等的附接。这种修饰也可以应用于本文所述的这些微核小体核心蛋白中的氨基酸。本文在表3中提及的核酸结合结构域可以与表4、5、6、7、9、10、11和12中提供的其他结构域组合地掺入多肽中的任何位置以增强核酸结合。
表3：
Figure BDA0003083810770000231
Figure BDA0003083810770000241
靶向结构域
本文公开的微核小体核心蛋白包含使微核小体靶向一种或多种细胞或细胞类型的靶向结构域。
在一些实施方案中，微核小体核心蛋白的靶向结构域是允许附着并进入一种或多种细胞或细胞类型的氨基酸结构域。应当理解，靶向结构域可以对于某些细胞类型具有特异性，但是也可以包含通常有利于进入细胞的结构域。通常，微核小体核心蛋白的靶向结构域可以有助于附着、细胞类型特异性结合和内化中的一种或多种。靶向结构域可以是例如细胞附着结构域、β半乳糖结合结构域、岩藻糖结合结构域、肝素结合结构域、唾液酸结合结构域、糖蛋白结合结构域、碳水化合物结合结构域、溶血磷脂酸结合、cAMP结合结构域、透明质酸结合结构域、硫酸软骨素结合结构域、整联蛋白结合结构域、核仁素结合结构域、胶原蛋白结合结构域、网格蛋白结合结构域、Fc受体结合结构域、肌动蛋白结合结构域、内吞基序或核定位信号。在一些实施方案中，微核小体核心蛋白的靶向结构域是氨基酸结构域，其允许结合并进入一种或多种细胞或细胞类型并且衍生自哺乳动物、病毒、病毒颗粒、朊病毒、细菌或真菌氨基酸序列。
细胞附着靶向结构域：
细胞附着是微核小体核心蛋白或负载的微核小体(包含微核小体核心蛋白)可以借此粘附于细胞，并在各种情况下有利于进入细胞的手段。各种病毒具有粘附分子或结构域，所述粘附分子或结构域允许与宿主细胞结合并增强向其中的进入。例如，流感病毒在其表面上具有血凝素，使其能够与细胞表面的唾液酸结合。本公开尤其提供允许微核小体核心蛋白与唾液酸、半乳糖、岩藻糖、透明质酸和硫酸软骨素，以及糖蛋白结合，从而增强细胞附着以进行内化的若干此类结构域。本文公开的微核小体核心蛋白可以包含一个或多个细胞附着靶向结构域。细胞附着靶向结构域包括表4中所示的结构域。本公开的细胞附着结构域可以存在于微核小体核心蛋白中的任何位置并且/或者与本文例如在表3、5、6、7、8、9、10、11和12中提供的任何一个或多个其他结构域组合。
表4：
Figure BDA0003083810770000251
Figure BDA0003083810770000261
Figure BDA0003083810770000271
细胞附着也可以通过诸如RGD、RGDS等结构域实现(D’Souza SE等人，1991)。与诸如整联蛋白、核仁素、胶原蛋白、网格蛋白、Fc受体的细胞表面蛋白的结合还有助于病毒和其他颗粒进入细胞。本公开尤其提供了允许与整联蛋白、核仁素、胶原蛋白、网格蛋白、Fc受体结合以增加细胞摄取的结构域。细胞附着结构域包括表5中所示的结构域。表5中提供的细胞附着结构域可以存在于微核小体核心蛋白中的任何位置并且/或者与本文例如在表3、4、6、7、8、9、10、11和12中提供的任何一个或多个其他结构域组合。
表5：
Figure BDA0003083810770000272
Figure BDA0003083810770000281
Figure BDA0003083810770000291
内化靶向结构域：
病毒和哺乳动物蛋白中的某些结构域可以直接影响细胞内化。例如，Oleson等人，2008中描述了某些蛋白质的结构域和顺序排列。例如，PPxY基序是腺病毒进入细胞所需要的(Wodrich等人，2010)，其中x可以是任何氨基酸。内化靶向结构域的另一个实例是GTALL基序-5个氨基酸残基的结构域，位于黄体生成素(LH)受体的羧基末端尾部，引导配体-受体复合物从降解途径至再循环途径(Pandey,2009)。GTALL基序还显示出与羧基末端四肽序列基序DSLL(已表明其参与β-肾上腺素能受体的内化)的序列同源性。Pandey还讨论了网格蛋白依赖性货物通常包含通过衔接蛋白2(AP-2)识别的短序列基序，诸如YXXQ(其中X可以是任何氨基酸)，并且可包含通过辅助网格蛋白衔接蛋白识别的Asn-Pro-X-Tyr序列(NPXY)基序。转铁蛋白。Kirchhausen,1999也论述了NPXY基序。NPTY也是APP的内吞基序。允许内化的网格蛋白结合结构域的另一个实例是FXDXF(其中X可以是任何氨基酸)(LeneE.Oleson.2008)。内化靶向结构域包括表6中提供的结构域。
本公开提供的其他特征包括一个或多个亮氨酸和异亮氨酸残基，所述残基本质上是高度疏水的。实际上，亮氨酸是第二最具疏水性的氨基酸。在各种实施方案中，亮氨酸残基可以在微核小体核心蛋白的组合物中发挥多种作用。首先，两亲性分子的非极性面的疏水性在稳定肽的二级结构中起着重要作用(Chen Y.等人，2007)。其次，已证明双亮氨酸类型的信号基序对于内化和将膜受体和膜蛋白运输到亚细胞区室中是必不可少的。例如，GLUT4(葡萄糖转运蛋白4)、LDL(低密度脂蛋白)；LH(黄体生成素)、TGN(反面高尔基网络)均具有有助于内化到细胞中的双亮氨酸基序。Fc受体双亮氨酸基序也提供内吞的信号(Wu Z.和Simister N.E.,2001)。表4中提供的内化靶向结构域可以存在于微核小体核心蛋白中的任何位置并且/或者与本文例如在表3、4、5、7、8、9、10、11和12中提供的任何一个或多个其他结构域组合。
表6：
Figure BDA0003083810770000292
Figure BDA0003083810770000301
Figure BDA0003083810770000311
核靶向结构域。
在各种实施方案中，重要的是在进入细胞后，核酸货物到达核。核内化信号或与核输入机制的结合是核定位的关键。功能性真核细胞核定位信号广泛分布在噬菌体的末端蛋白中(Redrejo-Rodríguez等人，2012)。Chan和Jans已经表明，聚赖氨酸本身并不用作核定位信号。因此，添加核靶向信号以增强非病毒基因转移是合乎逻辑的方法(Chan和Jans,1999)。NLS在多肽中的位置也是其功能的关键。我们已在表7中列出了用于增强核进入的NLS序列并在表13中提供了用于最有效的核进入的NLS信号的最佳位置。本文在表7中提及的结构域可以与表3、4、5、6、8、9、10、11和12中提供的其他结构域组合地掺入微核小体核心蛋白中的任何位置以增强核酸结合。
表：7
Figure BDA0003083810770000321
Figure BDA0003083810770000331
Figure BDA0003083810770000341
细胞类型特异性靶向结构域：
在各种实施方案中，最期望的是更大浓度的颗粒归巢到期望细胞类型中。这允许增加摄取并增加表达-两个有利的基因治疗输出。在文献中，存在很少被发现用于此类特性的基序。这些中的大多数来自已显示出病毒向性因不同衣壳而不同的实验。在各种实施方案中，本公开包括使用那些限定基序中的一些，以增强在神经元、肌肉、肝、肺、肾、内皮细胞或肿瘤部位中的表达。细胞类型特异性靶向结构域包括表8所示的结构域。表8的细胞类型特异性靶向结构域可以存在于微核小体核心蛋白中的任何位置并且/或者与本文例如在表3、4、5、6、7、9、10、11和12中提供的任何一个或多个其他基序组合。
表：8
Figure BDA0003083810770000342
Figure BDA0003083810770000351
核酸释放结构域：
在一些实施方案中，微核小体的“核酸释放结构域”(“NARD”)是允许释放并进入细胞核的氨基酸结构域。
非常期望颗粒在进入细胞之前不释放。在细胞中，核酸货物在细胞质或核处的释放可以是优选的。存在可以有助于在细胞内部释放的蛋白酶和内肽酶。前蛋白转化酶和内肽酶在某些氨基酸结构域处切割，并且这种现象在此处用于设计微核小体核心蛋白，所述蛋白一旦进入细胞或核内部就可以释放核酸货物。KRH是Pcsk1和Pcsk2的切割位点。胰高血糖素原在胰腺A细胞和肠细胞中通过Pcsk1或Pcsk2以组织特异性方式进行翻译后加工。NRRKKRAL是TGFB1的弗林蛋白酶切割位点。KSVKKRSVSEIQ是甲状旁腺激素中的弗林蛋白酶切割位点。还可以使用生物信息学平台诸如Expasy、OmicX、PROSPERous、Prop1.0、SignalP-5.0、MEROPS、CutDB、Peptide Cutter等在计算机上预测切割位点。我们提供了如何掺入用于释放颗粒的这些切割位点以将DNA释放在细胞质或核中的实例。本文在表9中提及的结构域可以与表3、4、5、6、7、8、10、11和12中提及的其他结构域组合地掺入微核小体核心蛋白中的任何位置以增强核酸释放。
表：9
Figure BDA0003083810770000361
Figure BDA0003083810770000371
稳定性结构域：
在一些实施方案中，微核小体的“稳定性结构域”是允许负载的微核小体在体液、细胞质和核中保持稳定的氨基酸结构域。
颗粒稳定性对于安全进入细胞和表达的长寿性非常重要。存在若干颗粒丧失稳定性的原因。首先，颗粒在血液和其他体液中应是稳定的。其次，颗粒需要安全地穿过内体入口并安全地逃逸以使其向外到达细胞质。病毒颗粒或再循环受体使用若干结构域进入内体并从中逃逸。我们提供了掺入内体进入和逃逸结构域以增加稳定性的微核小体核心蛋白的实例。当与表3、4、5、6、7、8、9、11和12中提供的其他结构域组合时，本文在表10中提及的结构域可以掺入微核小体核心蛋白中，优选地在C末端，但是也可以在任何位置，以增强微核小体核心蛋白的稳定性。本领域技术人员还可预期肽中的疏水性氨基酸的氟化，以提供增加蛋白质稳定性、增强组装等并加强配体-受体相互作用的手段。本领域技术人员还可预期对肽中的氨基酸的其他翻译后修饰，以提供增加蛋白质稳定性、增强组装等并加强配体-受体相互作用的手段。
表：10
Figure BDA0003083810770000381
寡聚化结构域：
寡聚化是单体缔合以形成多聚体(包括二聚体和更高阶的大分子复合物)的化学过程。蛋白质分子的寡聚化通常通过促进单体缔合的结构域促进。
在一些实施方案中，微核小体的“寡聚化结构域”是允许微核小体核心蛋白或负载的微核小体以更高阶的结构(诸如同源二聚体、异源二聚体、四聚体、八聚体或其他更高阶的结构)缔合的氨基酸结构域。寡聚化可以减小负载的微核小体的尺寸。微核小体核心蛋白的多聚体可以包括两个或更多个相同的微核小体核心蛋白(例如，两个具有相同氨基酸序列的微核小体核心蛋白)并且/或者可以包括两个或更多个不同的微核小体核心蛋白(例如，两个具有不同氨基酸序列的微核小体核心蛋白)。本文提供的寡聚化结构域的实例不以任何方式进行限制，并且本领域技术人员可以认识到，可通过各种方法识别或鉴定此类结构域，包括酵母双杂交筛选、与质谱法联用的亲和纯化、文本挖掘或通过应用人工智能和机器学习。本领域技术人员还可以使用诱导型同源二聚化系统和/或化学诱导的二聚化产生形成负载的微核小体的诱导型系统。
在一些实施方案中，寡聚化结构域可以包含3个或更多个氨基酸。本文例如在表11中公开的寡聚化结构域可以掺入微核小体核心蛋白中，处于微核小体核心蛋白的任何位置，例如，与本文例如在表3、4、5、6、7、8、9、10和12中提供的其他结构域组合。在某些特定实施方案中，寡聚化结构域位于微核小体核心蛋白的C末端。
表：11
Figure BDA0003083810770000391
Figure BDA0003083810770000401
接头：
在产生融合蛋白的领域中已知，在一些情况下，蛋白质可以受益于接头的包含。本公开包括微核小体核心蛋白，其包含一个或多个接头，例如在微核小体核心蛋白的两个结构域之间。接头可以有助于蛋白质结构稳定性。在一些情况下，接头用作结构域之间的分隔物，并且在其他情况下，所述接头可以直接影响蛋白质的功能。一些接头增加了刚度，因此允许蛋白质结构域的有效分隔。还可实施接头以引入切割位点。出于这些原因，接头已用于蛋白质工程改造领域中。然而，在非病毒基因转移的背景中，尚未采用此策略。我们在此处表明，接头可以成功地用于工程改造结构域以用于功能性目的，诸如在期望的细胞类型中进行选择性转导、基因递送和转基因表达(图10)。
在一些实施方案中，接头序列可以包含1个或更多个氨基酸。本文例如在表12中公开的接头氨基酸序列可以掺入微核小体核心蛋白的结构域之间，如SEQ ID NO:238-335所示，其中接头可以是具有表1和表12中提供的任何氨基酸或氨基酸序列的接头。接头可包含不限于表12中提供的那些的其他氨基酸序列。接头序列也可通过被称为LINKER的程序生成，所述程序使用用户选择的输入搜索接头序列的数据库，并生成符合标准的接头序列的输出。苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、精氨酸和丙氨酸是天然接头中以及因此微核小体核心蛋白中的优选残基。
表12.
Figure BDA0003083810770000402
Figure BDA0003083810770000411
Figure BDA0003083810770000421
Figure BDA0003083810770000431
微核小体核心蛋白
微核小体核心蛋白可以包含本文提供的一个或多个结构域。
本文公开的微核小体蛋白至少包含带正电荷的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有核酸结合结构域、靶向结构域和/或核酸释放结构域和/或稳定性结构域。微核小体核心蛋白可以是与如SEQ ID NO:336-387中的任一者所示的微核小体核心蛋白具有例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性的序列。
在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可包含10至100个氨基酸的氨基酸序列长度。氨基酸，例如10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、55、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。在某些实施方案中，微核小体核心蛋白可以具有例如15至90个氨基酸、20至80个氨基酸、20至70个氨基酸、20至60个氨基酸或30至40个氨基酸的长度。
在某些实施方案中，微核小体核心蛋白包含本文公开的一个或多个结构域和不存在于本文公开的结构域中的一个或多个氨基酸。在某些情况下，在本文公开的结构域中不存在的处于本文公开的结构域的N末端或C末端的氨基酸可以称为“侧翼氨基酸”，并且存在于微核小体中的在本文公开的任何结构域中不存在的氨基酸的总和可以称为“非结构域氨基酸”。
在各种实施方案中，微核小体核心蛋白的非结构域氨基酸可以具有有助于微核小体核心蛋白的电荷的序列。在各种实施方案中，微核小体核心蛋白的非结构域氨基酸包括至少10％带正电荷的氨基酸，例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的带正电荷的氨基酸。
在一些实施方案中，在pH7下，微核小体核心蛋白可具有介于10与100之间的总正电荷。
在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以包含位于氨基酸序列的任何位置的一个或多个核酸结合结构域。在一些情况下，微核小体核心蛋白可仅包含核酸结合结构域。在一些情况下，微核小体核心蛋白可包含核酸结合结构域和聚精氨酸结构域。在一些情况下，微核小体核心蛋白可包含核酸结合结构域和靶向结构域。在一些情况下，微核小体核心蛋白可仅包含聚精氨酸结构域和靶向结构域。在一些情况下，微核小体核心蛋白可仅包含聚精氨酸结构域、核酸释放结构域和靶向结构域。
在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可包含位于氨基酸序列的任何位置的一个或多个聚精氨酸。聚精氨酸序列可包含4-30个精氨酸。
在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可包含一个或多个靶向结构域。靶向结构域可位于微核小体核心蛋白的氨基酸序列中的任何位置。
在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可包含一个或多个核酸释放结构域。优选地，核酸释放结构域位于微核小体核心蛋白的氨基酸序列的中间。优选地，核酸释放结构域位于从N末端起6个氨基酸之后或从C末端起6个氨基酸之前。
在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以包含一个或多个稳定性结构域。优选地，稳定性结构域位于微核小体核心蛋白的氨基酸序列的C末端。在一些情况下，稳定性结构域位于微核小体核心蛋白的氨基酸序列的N末端。
在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以包含一个或多个寡聚化结构域。在某些特定实施方案中，寡聚化结构域位于微核小体核心蛋白的氨基酸序列的C末端。在一些情况下，寡聚化结构域位于微核小体核心蛋白的氨基酸序列的N末端。
因此，为了避免疑义，如本文所述的微核小体核心蛋白可以包含(a)核酸结合结构域(NABD)，以及(b)靶向结构域。本领域技术人员将由本公开认识到，包含这些组分的多肽将构成如本文所公开的微核小体核心蛋白，任选地受到本文所阐述的其他限制，并且/或者包括但不限于本文提供的或本领域另外已知的一个或多个另外的结构域。在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以包含核酸结合结构域，所述核酸结合结构域与如SEQ ID NO:1-28(例如，如表3所示)中的任一者所示的核酸结合结构域具有至少65％的序列同一性，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，并且/或者与如SEQ ID NO:1-28中的任一者所示的核酸结合结构域相差不超过两个氨基酸变化(例如，缺失、添加或取代，例如保守取代)或不超过一个氨基酸变化。在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以包含为细胞附着靶向结构域的靶向结构域，所述细胞附着靶向结构域与如SEQ ID NO:29-53(例如，如表4所示)中的任一者所示的细胞附着靶向结构域具有至少65％的序列同一性，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，并且/或者与如SEQ ID NO:29-53中的任一者所示的细胞附着靶向结构域相差不超过两个氨基酸变化(例如，缺失、添加或取代，例如保守取代)或不超过一个氨基酸变化。在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以包含为细胞附着靶向结构域的靶向结构域，所述细胞附着靶向结构域与如SEQ ID NO:54-81(例如，如表5所示)中的任一者所示的细胞附着靶向结构域具有至少65％的序列同一性，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，并且/或者与如SEQ ID NO:54-81中的任一者所示的细胞附着靶向结构域相差不超过两个氨基酸变化(例如，缺失、添加或取代，例如保守取代)或不超过一个氨基酸变化。在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以包含为内化靶向结构域的靶向结构域，所述内化靶向结构域与如SEQ ID NO:82-115(例如，如表6所示)中的任一者所示的内化靶向结构域具有至少65％的序列同一性，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，并且/或者与如SEQ ID NO:82-115中的任一者所示的内化靶向结构域相差不超过两个氨基酸变化(例如，缺失、添加或取代，例如保守取代)或不超过一个氨基酸变化。在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以包含为核靶向结构域的靶向结构域，所述核靶向结构域与如SEQ ID NO:116-139(例如，如表7所示)中的任一者所示的核靶向结构域具有至少65％的序列同一性，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，并且/或者与如SEQ ID NO:116-139中的任一者所示的核靶向结构域相差不超过两个氨基酸变化(例如，缺失、添加或取代，例如保守取代)或不超过一个氨基酸变化。在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以包含为细胞类型特异性靶向结构域的靶向结构域，所述细胞类型特异性靶向结构域与如SEQ ID NO:140-164(例如，如表8所示)中的任一者所示的细胞类型特异性靶向结构域具有至少65％的序列同一性，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，并且/或者与如SEQ ID NO:140-164中的任一者所示的细胞类型特异性靶向结构域相差不超过两个氨基酸变化(例如，缺失、添加或取代，例如保守取代)或不超过一个氨基酸变化。在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以包含核酸释放结构域，所述核酸释放结构域与如SEQID NO:165-208(例如，如表9所示)中的任一者所示的核酸释放结构域具有至少65％的序列同一性，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，并且/或者与如SEQ ID NO:165-208中的任一者所示的核酸释放结构域相差不超过两个氨基酸变化(例如，缺失、添加或取代，例如保守取代)或不超过一个氨基酸变化。在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以包含稳定性结构域，所述稳定性结构域与如SEQ ID NO:209-219(例如，如表10所示)中的任一者所示的稳定性结构域具有至少65％的序列同一性，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，并且/或者与如SEQ ID NO:209-219中的任一者所示的稳定性结构域相差不超过两个氨基酸变化(例如，缺失、添加或取代，例如保守取代)或不超过一个氨基酸变化。在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以包含寡聚化结构域，所述寡聚化结构域与如SEQ ID NO:220-237(例如，如表11所示)中的任一者所示的寡聚化结构域具有至少65％的序列同一性，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，并且/或者与如SEQ ID NO:220-237中的任一者所示的寡聚化结构域相差不超过两个氨基酸变化(例如，缺失、添加或取代，例如保守取代)或不超过一个氨基酸变化。在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以包含接头结构域，所述接头结构域与如SEQ ID NO:238-335(例如，如表12所示)中的任一者所示的接头结构域具有至少65％的序列同一性，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，并且/或者与如SEQ ID NO:238-335中的任一者所示的接头结构域相差不超过两个氨基酸变化(例如，缺失、添加或取代，例如保守取代)或不超过一个氨基酸变化。
本领域技术人员，本文提供的微核小体核心蛋白的结构域能够以如本文所提供的或如本领域技术人员由本公开将另外理解的任何次序、取向或顺序排列。例如，本领域技术人员应认识到接头的预期使用，例如作为任选序列，其可以单独地或以多个串联的方式包含在任何结构域对之间或与任何结构域相邻，其中具有或不具有一个或多个本文未具体公开的居间氨基酸。因此，例如，NABD可以是靶向结构域的C末端或N末端。本文提供的另外的结构域，包括但不限于另外的NABD或另外的靶向结构域，可以是NABD的C末端或N末端和靶向结构域的C末端或N末端。此外，对于存在于微核小体核心蛋白中的每个结构域，包括接头，一个或多个接头结构域可以包含在结构域的C末端或结构域的N末端。本文提供了示例性微核小体蛋白。如本领域技术人员由本公开将容易地显而易见的，本文提供的结构域是模块化的，并且能够以任何顺序与其预期功能一起被包含在内并且/或者由此为微核小体提供预期的效用或功能性，无论其所存在的顺序如何。
本领域技术人员将进一步认识到，本公开的微核小体核心蛋白可以包括任何数量或类型的本领域已知的修饰(例如，翻译后修饰)。此类修饰包括但不限于聚乙二醇化、乙酰化、甲基化、糖基化、磷酸化、sumo化、酰胺化、脂化和/或甲基化。在各种实施方案中，微核小体核心蛋白可以是聚乙二醇化的。
在一些实施方案中，通过微核小体核心蛋白与聚乙二醇(PEG)的缔合对微核小体核心蛋白进行修饰。PEG是非离子、无毒、生物相容且高度亲水性的聚合物。PEG主要用于生物大分子和表面的共价修饰。PEG缀合增加多肽的表观尺寸，从而减少肾过滤并改变生物分布。肽的聚乙二醇化可以增强治疗特性，这是由于它们的溶解度增加(对于疏水性肽而言)，通过降低的肾清除率延长了半衰期，并且遮蔽了抗原性，从而使宿主中的免疫应答降至最低。不同PEG链长的PEG已用于FDA批准的分子量在5-40kDa范围内的药物。在图1、3、4、5和6中，我们示出了如何利用不同PEG链长的PEG提供不同尺寸的微核小体核心蛋白的示意图。
许多当前的颗粒使用尺寸为10kDa或更大的PEG，然而，使用较大的PEG尺寸的缺点是它还增加粒度。(Feuz L.等人2007)。本公开尤其提供了具有不同PEG长度的颗粒，其用以配制具有不同尺寸-优选地直径小于20nm的微核小体。在图1中，我们示出了12个链的最小PEG长度，以及如何利用它来修饰微核小体核心蛋白中的氨基酸。负载的微核小体的最终尺寸还取决于用于修饰微核小体核心蛋白的PEG尺寸。图2示出，通过附接PEG12，肽的分子量相应地增加，但是不改变肽的物理特征，诸如溶解度。
在一些实施方案中，微核小体核心蛋白可以具有介于1700g/mol与20000g/mol之间的总分子量，例如，1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、10500、11000、11500或20000g/mol。在各种实施方案中，微核小体核心蛋白可以具有介于100Kda与10,000kDa之间的总分子量，例如100、200、500、1000、2,000、3000、5000、8000和10000kDa。
氨基酸序列可以反向或以任何顺序使用。还可预期改变结构域中的一种氨基酸或非必需氨基酸，以获得相同电荷或结构域的其他特性。
表13.
Figure BDA0003083810770000481
Figure BDA0003083810770000491
Figure BDA0003083810770000501
Figure BDA0003083810770000511
核酸货物
本文公开的负载的微核小体可以负载有核酸货物，所述核酸货物为例如RNA、DNA或其核酸类似物。核酸货物可以是单链或双链的。核酸货物可以是线性或环形的。核酸货物可以编码蛋白质、RNA、shRNA、miRNA、抗体、纳米抗体、Darpin、锚蛋白重复序列或多肽中的每一者中的一种或多种。例如，核酸货物可以是编码至少一种功能蛋白的cDNA分子。在各种实施方案中，核酸货物可以是抑制性RNA，例如gRNA、siRNA、miRNA或shRNA。
当递送到任何细胞的核中时，核酸货物可以编码例如RNA、蛋白质、多肽、抗体、纳米抗体、miRNA、shRNA、gRNA、Cas9、非编码RNA。表达可不限于本文提及的实体。
负载的微核小体
本公开的负载的微核小体可以包含一个或多个本公开的微核小体核心蛋白和一个或多个多核苷酸。本领域技术人员将由本公开认识到，可以通过以多种方式组合微核小体核心蛋白和多核苷酸来生成此类负载的微核小体。本领域技术人员将认识到，在至少一个实施方案中，负载的微核小体组装会简单地在将本文提供的一个或多个微核小体核心蛋白和一个或多个多核苷酸包含在溶液(例如但不限于水溶液)中时发生，例如在标准温度下并且例如以标准速度振荡。因此，生成负载的微核小体核心蛋白的方法包括本文提供的方法以及将对本领域技术人员显而易见的其他方法。本领域技术人员应认识到，在至少一个实施方案中，负载的微核小体组装将在将一个或多个本文提供的微核小体核心蛋白和一个或多个多核苷酸包含在溶液(例如但不限于水溶液)中时发生，例如，在标准温度下以及有助于增强核酸缩合的催化剂的存在下。
本公开的负载的微核小体可以处于未缩合状态和缩合状态。负载的微核小体处于缩合状态，其中核酸分子中至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的负电荷已被中和。当核酸分子中少于90％的负电荷被中和时，负载的微核小体被视为处于未缩合状态。除非指明，否则本公开中对微核小体的提及涵盖至少缩合和未缩合状态，以及其特征(在适用时)。
微核小体可以包含，例如，1至10,000个微核小体核心蛋白。微核小体可以包含，例如，1至100个核酸货物分子。
在一些实施方案中，负载的微核小体可以具有直径介于0.5至50纳米之间的尺寸。微核小体可以包含核酸货物分子，其可以具有最高至50kb的长度，同时维持介于0.5至50nm之间的小直径。
在一些实施方案中，负载的微核小体可以具有介于100与10000kDa之间的分子量，例如100、200、500、1000、3000、5,000、8000、10000kDa。
在各种实施方案中，负载的微核小体可以具有-100至100的净电荷。在一些实施方案中，负载的微核小体制剂的ζ电势可在-10毫伏至100毫伏的范围内。在一些实例中，与用于构建微核小体颗粒的核酸分子和多肽分子相比，核酸货物和微核小体核心蛋白的复合物被缩合至最小尺寸。最终的正负电荷比率为大约1:1，从而形成不带电荷、略带正电荷或略带负电荷的分子。最终颗粒可成形为若干形状，包括杆状、球形或环形，但不限于这些。
在各种实施方案中，可用分子量为5道尔顿至20kDa的一个或多个聚乙二醇分子修饰微核小体核心蛋白。聚乙二醇(PEG)部分可附接至多肽中的任何氨基酸残基。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比3个微核小体核心蛋白(1:3)与1个核酸分子比3,000个微核小体核心蛋白(1:3,000)之间或处于其间的任何范围内的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比3个微核小体核心蛋白(1:3)与1个核酸分子比2,000个微核小体核心蛋白(1:2,000)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比3个微核小体核心蛋白(1:3)与1个核酸分子比1,000个微核小体核心蛋白(1:1,000)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比3个微核小体核心蛋白(1:3)与1个核酸分子比500个微核小体核心蛋白(1:500)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比3个微核小体核心蛋白(1:3)与1个核酸分子比200个微核小体核心蛋白(1:200)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比3个微核小体核心蛋白(1:3)与1个核酸分子比100个微核小体核心蛋白(1:100)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比3个微核小体核心蛋白(1:3)与1个核酸分子比50个微核小体核心蛋白(1:50)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比50个微核小体核心蛋白(1:50)与1个核酸分子比2,000个微核小体核心蛋白(1:2,000)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比50个微核小体核心蛋白(1:50)与1个核酸分子比1,000个微核小体核心蛋白(1:1,000)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比50个微核小体核心蛋白(1:50)与1个核酸分子比500个微核小体核心蛋白(1:500)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比50个微核小体核心蛋白(1:50)与1个核酸分子比200个微核小体核心蛋白(1:200)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比50个微核小体核心蛋白(1:50)与1个核酸分子比100个微核小体核心蛋白(1:100)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比200个微核小体核心蛋白(1:200)与1个核酸分子比2,000个微核小体核心蛋白(1:2,000)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比200个微核小体核心蛋白(1:200)与1个核酸分子比1,000个微核小体核心蛋白(1:1,000)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
在各种实施方案中，负载的微核小体包括介于1个核酸分子比200个微核小体核心蛋白(1:200)与1个核酸分子比500个微核小体核心蛋白(1:500)之间的核酸分子与微核小体核心蛋白比。
技术人员应认识到，可以通过各种手段产生和/或构成微核小体核心蛋白分子，包括但不限于在若干不同的盐条件中，包括乙酸盐、三氟乙酸盐、碳酸氢盐和氯化物。负载的微核小体的最终制剂可以在生理盐水、水或任何其他药学上可接受的缓冲液中构成。
负载的微核小体递送至靶细胞或组织
在某些实施方案中，微核小体可以递送核酸，其中靶细胞是视网膜色素上皮(RPE)。对于有效的基因治疗，一些实施方案包括将遗传货物诸如DNA或RNA的大量拷贝递送到一种细胞类型中。例如，在湿性年龄相关性黄斑变性中，在RPE中表达抗VEGF可提供抑制内皮细胞增殖和血管渗漏所必需的治疗水平的蛋白质。我们在本文提供了微核小体核心蛋白(SEQ ID NO.392)的实例，其允许增强RPE中的摄取(图10、11)。
在某些实施方案中，微核小体可以递送核酸，其中靶细胞是视网膜中的神经元。已描述氨基酸结构域LRE(SEQ ID NO.156)可以用于增强的神经元附着(Dale D等人，1989)。我们已经在使用用以表达GFP的具有微核小体核心蛋白(SEQ ID NO.388)的GFP构建体(SEQID NO.395)的非病毒载体中利用了这样的结构域，以靶向视网膜中的神经元细胞(图12)。这尤其可用于递送DNA或RNA，以治疗由在视网膜神经元中表达的基因的遗传突变引起的视网膜变性。
在各种实施方案中，微核小体可以递送核酸，其中靶细胞是例如肌细胞、肝细胞、内皮细胞、造血干细胞、肺上皮细胞、周细胞、β细胞、肠上皮细胞、小胶质细胞、巨噬细胞、神经元细胞、皮肤细胞、血细胞等，但不限于这些。本文所述的结构域的各种组合(表3-12)可允许将负载的微核小体递送至某些靶细胞类型，以在身体的其他部位(包括脑、视网膜、肠、肝、肺、肾、肌肉、胰腺，但不限于此)实现治疗效果。
药物组合物
本公开预期一种“负载的微核小体治疗剂”，其包含负载的微核小体和至少一种药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂溶液的制剂是本领域技术人员众所周知的，合适的给药和治疗方案的开发也是如此。典型地，这些制剂可以包含102个基因组拷贝或更多的所需转基因。本领域技术人员将预期其他因素，诸如溶解度、生物利用度、半衰期、保质期。因此，各种剂量和治疗方案可以是期望的。负载的微核小体治疗剂可以用于将核苷酸递送至人体的多种细胞类型、组织类型或器官，包括视网膜、肝、CNS、肠等，但不限于此。
负载的微核小体治疗剂可以被配制成使得其对于施用至细胞或动物是药学上可接受的。负载的微核小体治疗剂可体外、离体或体内施用。负载的微核小体治疗剂可以单独或与一种或多种其他治疗方式，例如抗体、类固醇、维生素、AAV等组合施用给受试者。
在某些情况下，负载的微核小体治疗剂可以包含各自或共同编码一种或多种不同的表达产物的一种或多种核酸货物。
在某些情况下，将希望通过皮下、眼内、玻璃体内、肠胃外、静脉内、肌内、鞘内、局部、口服、腹膜内注射或通过鼻吸入(但不限于这些技术)来递送处于本文公开的适当配制的药物组合物中的负载的微核小体制剂。负载的微核小体制剂的溶液可在无菌水、无菌盐水中制备，并且还可适当地与一种或多种表面活性剂诸如普朗尼克酸(pluronic acid)混合。分散体也可在甘油、液态聚乙二醇以及其混合物中制备。储存制剂可包含防腐剂以防止微生物生长。
可以基于待治疗的病状或疾病以及受试者的年龄和状况来选择施用负载的微核小体治疗剂的合适手段。施用的剂量和方法可以根据患者的体重、年龄、状况等而变化，并且可以根据需要由本领域技术人员适当地选择。
在各种情况下，可以将负载的微核小体治疗剂组合物配制成包含药学上可接受的载剂或赋形剂。药学上可接受的载剂的实例包括但不限于任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。本发明的组合物可以包含药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐。
在各种实施方案中，可以根据常规药学实践，使用注射用蒸馏水作为媒介物来配制包含如本文所述的负载的微核小体治疗剂的组合物，例如注射用无菌制剂。例如，含有葡萄糖和其他补充剂(诸如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠)的生理盐水或等渗溶液可用作注射用水溶液，任选地与合适的增溶剂，例如醇诸如乙醇和多元醇诸如丙二醇或聚乙二醇，以及非离子表面活性剂诸如聚山梨酯80TM、HCO-50等组合。
如本文所公开，负载的微核小体治疗剂组合物可以是本领域已知的任何形式。此类形式包括例如液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或混悬液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。
任何特定形式的选择或使用可部分取决于预期的施用模式和治疗应用。例如，包含旨在用于全身或局部递送的组成的组合物可以是可注射或可输注溶液的形式。因此，负载的微核小体治疗剂组合物可以被配制用于通过肠胃外模式进行施用(例如，静脉内、皮下、腹膜内或肌内注射)。如本文所用，肠胃外施用是指除肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、鼻内、眼内、肺、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、肺内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、脑内、颅内、颈动脉内以及胸骨内注射和输注。
肠胃外施用途径可以是例如通过注射进行施用、经鼻施用、经肺施用或经皮施用。可以通过静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射进行全身或局部施用。
在各种实施方案中，可以将本发明的负载的微核小体治疗剂组合物配制成适于以高浓度稳定储存的溶液、微乳剂、分散体、脂质体或其他有序结构。可以通过将所需量的本文所述的化合物与一种上文列举的成分或成分的组合(根据需要)掺入适当的溶剂中，接着进行过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将本文所述的组合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述媒介物含有碱性分散介质和来自上文列举的那些的所需要的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，所述方法从其先前无菌过滤的溶液中得到本文所述的组合物外加任何另外的期望成分(参见下文)的粉末。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散体的情况下通过维持所需的粒度，并通过使用表面活性剂，可以维持溶液的恰当流动性。可以通过在组合物中包含例如单硬脂酸盐和明胶的延长吸收的试剂实现可注射组合物的延长吸收。
负载的微核小体治疗剂组合物能够以可注射制剂的形式肠胃外施用，所述可注射制剂包含处于水中或另一药学上可接受的液体中的无菌溶液或混悬液。例如，可以通过将治疗分子与药学上可接受的媒介物或介质(诸如无菌水和生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、稀释剂、媒介物、防腐剂、粘结剂)适当组合，然后以普遍接受的药学实践所需的单位剂量形式混合来配制负载的微核小体治疗剂组合物。药物制剂中包含的负载的微核小体治疗剂的量使得提供在指定范围内的合适剂量。油性液体的非限制性实例包括芝麻油和大豆油，并且可将其与作为增溶剂的苯甲酸苄酯或苯甲醇组合。可包括在内的其他物品是缓冲剂诸如磷酸盐缓冲剂或乙酸钠缓冲剂、舒缓剂诸如普鲁卡因盐酸盐、稳定剂诸如苯甲醇或苯酚，以及抗氧化剂。所配制的注射剂可以包装在合适的安瓿中。
在一些实施方案中，负载的微核小体治疗剂组合物可以配制成在低于0℃的温度(例如，-20℃或-80℃)下储存。在一些实施方案中，可以将组合物配制成在2-8℃(例如，4℃)下储存最多2年(例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、10个月、11个月、1年、11/2年或2年)。因此，在一些实施方案中，本文所述的组合物在2-8℃(例如4℃)下稳定储存至少1年。
在特定情况下，可以将负载的微核小体治疗剂组合物配制成溶液。在一些实施方案中，可以将组合物配制成例如浓度合适且适于在2-8℃(例如4℃)下储存的缓冲溶液。
可以在免疫脂质体组合物中配制包含如本文所述的负载的微核小体治疗剂的组合物。此类制剂可以通过本领域已知的方法制备。具有延长的循环时间的脂质体公开于，例如，美国专利号5,013,556中。
在某些实施方案中，可以用防止化合物快速释放的载剂配制组合物，诸如包括植入物和微囊化递送系统的控释制剂。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法是本领域中已知的。参见，例如，J.R.Robinson(1978)“Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems,”Marcel Dekker,Inc.,New York。
在一些实施方案中，可以将组合物配制成适于向哺乳动物诸如人肺内施用(例如，通过吸入器或雾化器进行施用)的组合物。用于配制此类组合物的方法是本领域众所周知的。干粉吸入制剂和用于施用所述制剂的合适的系统在本领域中也是已知的。肺部施用可以是口服和/或经鼻施用。用于肺部递送的药物装置的实例包括定量吸入器、干粉吸入器(DPI)和雾化器。例如，本文所述的组合物可以通过干粉吸入器施用至受试者的肺。这些吸入器是不含推进剂的装置，其将可分散且稳定的干粉制剂递送至肺。干粉吸入器在医学领域是众所周知的，并且包括但不限于：
Figure BDA0003083810770000571
(AstraZeneca；London,England)、
Figure BDA0003083810770000572
吸入器(
Figure BDA0003083810770000573
Cambridge,Mass.)；
Figure BDA0003083810770000574
(GlaxoSmithKline；London,England)；以及ECLIPSETM(Sanofi-Aventis；Paris,France)。另外参见，例如，PCT公布号WO 04/026380、WO 04/024156和WO 01/78693。DPI装置已经用于多肽诸如胰岛素和生长激素的肺部施用。在一些实施方案中，本文所述的组合物可以通过定量吸入器经肺内施用。这些吸入器依靠推进剂将离散剂量的化合物递送至肺。另外的装置和肺内施用方法在例如美国专利申请公布号20050271660和20090110679中阐述，其各自的公开内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以将负载的微核小体治疗剂组合物配制成例如以药学上可接受的溶液、混悬液或软膏的形式递送至眼。用于治疗眼的制剂可以是无菌水溶液的形式，其包含例如另外的成分，诸如但不限于防腐剂、缓冲剂、张度剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子湿润剂或澄清剂，以及增粘剂。可以通过常规方法，例如以滴剂的形式，或通过在包含一种或多种组合物的治疗溶液中洗眼来将如本文所述的制剂局部施用于需要治疗的受试者(例如，患有AMD的受试者)的眼。
在某些实施方案中，用于将药物引入眼的玻璃体腔中的多种装置对于如本文所述的组合物的施用可以是适当的。例如，美国公布号2002/0026176描述了一种包含药物的塞子，所述塞子可以穿过巩膜插入，使得其伸入到玻璃体腔中，以将药剂递送到玻璃体腔中。在另一个实例中，美国专利号5,443,505描述了一种可植入装置，其用于引入脉络膜上腔或无血管区域中，以将药物持续释放到眼的内部。美国专利号5,773,019和6,001,386各自公开了一种可附接至眼的巩膜表面的可植入药物递送装置。用于将负载的微核小体治疗剂递送至眼的其他方法和装置(例如，经巩膜贴剂和通过接触镜进行递送)描述于例如Ambati和Adamis(2002)Prog Retin Eye Res 21(2):145-151；Ranta和Urtti(2006)Adv DrugDelivery Rev 58(11):1164-1181；Barocas和Balachandran(2008)Expert Opin DrugDelivery 5(1):1-10(10)；Gulsen和Chauhan(2004)Invest Opthalmol Vis Sci 45:2342-2347；Kim等人(2007)Ophthalmic Res 39:244-254；以及PCT公布号WO 04/073551中，所述文献的公开内容通过引用整体并入本文。
在各种实施方案中，皮下施用可以借助于诸如注射器、预填充注射器、自动注射器(例如，一次性或可重复使用的)、笔式注射器、贴片注射器、可穿戴注射器、具有皮下输液器的非卧床注射器输注泵或用于皮下注射的其他装置之类的装置来完成。
在一些实施方案中，本文所述的负载的微核小体治疗剂组合物可以通过局部施用的方式治疗性地递送给受试者。如本文所用，“局部施用”或“局部递送”可以指不依赖于负载的微核小体治疗剂组合物或负载的微核小体治疗剂通过血管系统向其预期的靶组织或部位的转运的递送。例如，可通过组合物或剂的注射或植入或通过包含所述组合物或剂的装置的注射或植入来递送负载的微核小体治疗剂组合物。在某些实施方案中，在靶组织或部位附近局部施用后，组合物或剂或其一种或多种组分可扩散至不是施用部位的预期靶组织或部位。
在一些实施方案中，本文提供的组合物以单位剂型存在，所述单位剂型可以适于自我施用。这样的单位剂型可提供在容器内，所述容器通常是例如小瓶、药筒、预填充注射器或一次性笔。给药器诸如美国专利号6,302,855中所述的给药器装置也可例如与如本文所述的注射系统一起使用。
本文所述的负载的微核小体治疗剂组合物的合适剂量(所述剂量能够治疗或预防受试者的病症)可以取决于多种因素，包括例如待治疗的受试者的年龄、性别和体重、待治疗的病状或疾病，以及所使用的特定的负载的微核小体治疗剂。影响施用给受试者的剂量的其他因素包括例如病状或疾病的类型或严重程度。其他因素可以包括例如同时或先前影响受试者的其他医学病症、受试者的总体健康状况、受试者的遗传倾向、饮食、施用时间、排泄率、药物组合，以及施用给受试者的任何其他另外的治疗剂。还应理解，用于任何特定受试者的具体剂量和治疗方案也可以基于医师的判断进行调整。
负载的微核小体治疗剂溶液可以包含治疗有效量的本文所述的组合物。如果使用多于一种剂，则本领域普通技术人员可以部分基于所施用的组合物的效果，或所述组合物与一种或多种另外活性剂的组合效果容易地确定此类有效量。治疗有效量可以是治疗有益作用超过组合物的任何毒性或有害作用的量。
适于注射的负载的微核小体治疗制剂的药物形式可以包括无菌水溶液或分散体。制剂可以是无菌的，并且必须是流体以允许适当地流入和流出注射器。制剂在制造和储存条件下也可以是稳定的。载剂可以是包含例如水和盐水或缓冲水溶液的溶剂或分散介质。优选地，在制剂中可以使用等渗剂，例如糖或氯化钠。对于施用给人来说，最终制剂和组合物应该满足如由US FDA和EU监管标准所要求的无菌性、致热原性和一般内毒素水平、安全性以及纯度标准。温度和暴露于其他蛋白质可以改变负载的微核小体的特性。最终制剂和组合物必须储存在适当的温度下，优选2-8摄氏度或室温(20-25摄氏度)。
另外，本领域技术人员还可预期，另外的递送方法可以是通过电穿孔、超声导入(sonophoresis)、骨内注射方法或通过使用基因枪。载体也可植入微芯片、纳米芯片或纳米颗粒中。
在某些实施方案中，本文所述的组合物可配制在试剂盒中。此类试剂盒可用于治疗或诊断目的。本公开尤其提供了与一种或多种药学上可接受的赋形剂、载剂、稀释剂、佐剂和/或其他组分在一起的一种或多种组合物，所述赋形剂、载剂、稀释剂、佐剂和/或其他组分可用于配制由微核小体核心蛋白和核酸组成的组合物，以及用于制备用于施用给哺乳动物和特别施用给人的治疗剂，以用于本文所述的一种或多种疾病。具体地，此类试剂盒可包括所公开的微核小体核心蛋白组合物中的一种或多种与关于使用核酸治疗哺乳动物的各种病症的说明书的组合，并且通常可包括为方便商业包装而准备的容器。
本文所述的组合物可以施用给动物，所述动物是哺乳动物，例如人。本文所述的组合物还适用于商业上感兴趣的动物、家畜和家庭宠物，诸如狗和猫。试剂盒中的组合物可以包含单独的或与用于治疗或诊断用途的一种或多种其他成分或药物组合的部分或显著纯化的负载的微核小体组合物。还可以制备治疗性试剂盒，其包括至少一种本文公开的基于负载的微核小体组分的基因治疗组合物，以及使用所述组合物作为治疗剂的说明书。用于此类试剂盒的容器装置通常可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，可将所公开的一种或多种微核小体组合物放入其中，并且优选地适当等分。
应用
在各种实施方案中，本文提供的微核小体可以通过以下各项表征：小尺寸、通过受体介导的扩散过程或被动扩散过程进入细胞的能力、基因表达位置的精确度、基因表达持续时间的精确度，和/或保留直到核酸在靶细胞的细胞质或核中释放。本文描述了微核小体技术的一些期望应用：
基因治疗
在各种实施方案中，本文提供的微核小体可以用于基因治疗的方法中。基因治疗的一般原理在本领域中是众所周知的，并且包括将多核苷酸递送给有需要的受试者以提供具有治疗价值的表达产物(例如，mRNA、蛋白质或抑制性RNA)。在一些实施方案中，基因治疗可以包括基因或蛋白质替代疗法(例如，酶替代疗法)、增强或靶标抑制。在各种实施方案中，本文提供的微核小体可以应用于拯救引起疾病的任何突变的有害作用，所述疾病包括但不限于囊性纤维化、杜氏肌营养不良、斯塔加特病、年龄相关性黄斑变性、亨廷顿病、A型血友病、脊髓性肌萎缩、乌谢尔综合征等。在此类疾病中，遗传突变使得基因无功能或不可用。在此类情况下，通过功能拷贝替代突变基因可对患者有益。在各种实施方案中，通过将功能性cDNA或完整基因掺入负载的微核小体中并将其递送至期望的细胞或组织，可得到治疗益处。
在一些实施方案中，可以应用本文提供的微核小体抑制上调和引起疾病的基因。例如，已经在各种疾病中描述了P53过表达。在一些情况下，敲低特定细胞或组织处的基因以使引起炎症、缺氧等的基因下调以具有治疗效果也是有益的。
离体工程改造的细胞
本公开的微核小体可以用于离体工程改造细胞。可以对细胞进行工程改造，以便以各种方式表达治疗剂。一种这样的细胞是免疫细胞，例如T细胞。可以对免疫细胞进行基因工程改造，以使其表达新的蛋白质或受体，所述蛋白质或受体可允许癌细胞或其他有害细胞类型的免疫识别，从而进行杀伤并清除。这样的基因工程改造可离体进行。在各种实施方案中，本文提供的微核小体可以用于离体基因工程改造细胞的方法中。本文提供的结构域的组合可允许负载的微核小体进入多种T细胞，并将遗传货物递送至此类细胞中的核。遗传货物可编码和/或允许嵌合受体的表达、基因的敲低或其他治疗实体。然后可将此类细胞输注到患者体内以进行治疗。本领域技术人员可预期使用负载的微核小体来产生用于免疫疗法的嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)。
在一些实施方案中，可以应用本文提供的微核小体对干细胞进行离体工程改造，以使其表达新的蛋白质或受体，以用于治疗目的。本文提供的结构域的组合可允许负载的微核小体进入多种干细胞，以将遗传货物递送至此类细胞的核/细胞质。遗传货物可允许嵌合受体的表达、基因的敲低或其他治疗实体。然后可将此类细胞输注到患者体内以进行治疗。本领域技术人员可预期使用负载的微核小体来产生用于免疫疗法的嵌合干细胞或嵌合造血干细胞。
基因编辑和碱基切除修复
基因编辑、碱基编辑和操纵也是本文所述的这种微核小体技术的适用领域。基因编辑和碱基切除修复是最先进的技术，其允许在DNA或RNA水平上校正基因突变或编辑基因。对于本申请，负载的微核小体可掺入编码gRNA、sgRNA、spCas9、saCas9、dCas9、胞苷脱氨酶以及有助于切割DNA或将一种碱基转化为另一碱基的若干其他酶的核酸。本领域技术人员可以认识到，将多种gRNA和Cas9或类似的编辑酶掺入AAV是一个麻烦且通常效率低下的过程。因此，使用能够容易地将核酸压实到负载的微核小体上的本文所述的方法和组合物允许掺入若干gRNA以及甚至最大的Cas9基因以递送至期望细胞。
抗体递送
抗体是一类药物，其已经改变了全球数百万患者的生活。然而，此疗法的一大缺点是需要重复施用，这给患者、医生和护理人员带来巨大负担。本领域技术人员可以认识到，DNA分子可以用于表达抗体。本文所述的微核小体技术提供了将抗体载体化并递送至患者的期望细胞中以在其体内产生长期贮库，以便减轻多次施用的负担的机会。可以将表达部分或全部抗体结构域的这些DNA分子掺入负载的微核小体中，以为服用抗体药物的患者提供长期治疗选择。本领域技术人员还可使用微核小体核心蛋白载体化并递送其他抗体样分子，诸如纳米抗体、抗体模拟物、融合肽、抗体片段、骆驼科动物或骆驼科动物单结构域抗体片段。
疫苗递送
基因工程改造的DNA或RNA可以产生抗原，以提供保护性免疫应答。核酸疫苗具有若干潜在的优势，诸如与常规疫苗相比广泛的免疫应答。本文所述的微核小体技术可以将此类DNA或RNA构建体掺入并递送至动物(包括人)的期望细胞或组织中，以使其免于若干病毒、细菌或寄生虫感染。
化妆品
基因工程改造的DNA或RNA可以被开发用于若干美容应用，例如提高肌肉质量、修复烧伤者的皮肤、减轻体重、改善免疫功能、延缓衰老以及许多其他应用。本文所述的微核小体技术可以将适用的DNA或RNA构建体掺入并递送至动物(包括人)的期望细胞或组织中，以实现期望的美容效果。
在各种实施方案中，本公开还提供了与预防或治疗人或其他动物的疾病有关的载体。预防或治疗有效量的组合物可以通过静脉内、肌内、鼻内、腹膜内、皮下、脑内、视网膜下、玻璃体内、通过腰椎穿刺、局部、直肠或直接递送至局部器官或肿瘤但不限于这些的技术进行施用。组合物包含核酸复合物，各复合物基本上由单个或多个核酸分子和一个或多个微核小体核心蛋白分子组成。
本公开尤其提供了缩合DNA、RNA及其类似物等的改进方法，以便有效递送到人细胞中，以治疗某些疾病和或用于美容应用。所递送的核酸还可具有递送疫苗的应用。
实施例
实施例1：微核小体核心蛋白的设计和合成
本实施例代表与微核小体核心蛋白有关的方法和组合物。在本实施例中，描述了肽的氨基酸序列(其可以将核酸缩合到负载的微核小体中)以及其合成过程。
产生本实施例的负载的微核小体，以用于有效的基因转移并将负载的核酸货物释放至各种细胞类型。本实施例的负载的微核小体被设计成通过与细胞表面蛋白的结合而主动与细胞表面衔接，从而易位至细胞的细胞质/核，并且允许核酸货物的释放。这些特征可以通过基于结构化的蛋白质/DNA相互作用设计的微核小体核心蛋白和负载的微核小体来实现。因此，本实施例包括微核小体核心蛋白，其包含增强细胞附着、增强的摄取、增强的稳定性、向靶细胞核的主动转运以及通过肽酶的释放中的一者或多者的一个或多个氨基酸结构域。
在本实施例中，合成的微核小体核心蛋白可包括但不限于根据SEQ ID NO:388-393中的任一者的序列，或衍生自本文在表3-12中公开的结构域的其他序列，或其任何组合。本实施例的微核小体核心蛋白是在pH 7下净正电荷>8且等电点>9的肽。例如，SEQ IDNO:388是微核小体核心蛋白序列，其包含与多个神经元附着结构域(LRE)和聚精氨酸结构域(RRRRR)组合的多个DNA结合结构域(KRHRK)。在此相同构建体中，亮氨酸(L)围绕聚精氨酸结构域，以用疏水性氨基酸分隔带电荷的结构域，从而使细胞附着结构域能够与细胞表面结合。在此构建体中，微核小体核心蛋白(SEQ ID NO:388)被设计用于通过LRE结构域增强对神经元的附着，而聚精氨酸结构域则将有助于细胞进入。本实施例还包括具有位于某些结构域之间的各种接头的微核小体核心蛋白，并且接头的实例包括SEQ ID NO:388-393中提供的那些。通过设计，SEQ ID NO:388中的KRH还用作PCSK1的切割位点，以增强核酸的释放。可以包含在微核小体核心蛋白中的其他核酸释放结构域或切割结构域包括但不限于表9中描述的那些。用于包含在微核小体核心蛋白中的结构域也可以针对其他肽酶衍生，包括但不限于表9中的那些。
本实施例的微核小体核心蛋白，包括根据SEQ ID NO:388-393的微核小体核心蛋白，包括序列特征的各种组合，所述序列特征允许与核酸分子的有效缩合并将负载的微核小体递送至期望细胞类型，例如动物细胞和组织。在本实施例的某些微核小体核心蛋白中，寡聚化结构域包含在微核小体核心蛋白中，以便使得通过微核小体核心蛋白与核酸货物的缔合形成的负载的微核小体核心蛋白与参考的负载的微核小体核心蛋白相比，例如，与包含缺乏一个或多个寡聚化结构域但其他氨基酸序列同一的微核小体核心蛋白的负载的微核小体相比，具有相对较小的尺寸。示例性的寡聚化结构域包括表11中提供的那些。类似地，内体进入和逃逸信号也可包含在微核小体核心蛋白中，以增强稳定性和释放。
本实施例的微核小体核心蛋白可以通过各种方法合成。合成微核小体核心蛋白的一种方法是肽合成。肽合成允许通过酰胺键连接氨基酸。例如，微核小体核心蛋白可以通过按微核小体核心蛋白的序列顺序一个氨基酸的羧基与下一个期望氨基酸的氨基之间的缩合反应以化学方式合成。肽合成的确立方法在本领域中称为固相肽合成。
可以任选地应用若干策略来保护本公开的微核小体核心蛋白的氨基(N末端)和羧基末端(C末端)。如果将微核小体核心蛋白冻干，则冻干的肽可包含痕量在合成过程中使用的盐。微核小体核心蛋白的其他产生方法包括在细胞系统或在体内由编码微核小体核心蛋白的DNA构建体表达微核小体核心蛋白。所产生的微核小体核心蛋白可以通过本领域已知的多种方法纯化。例如，在该过程中可使用若干树脂。在本实施例的各种情况中，微核小体核心蛋白的纯度>90％。然而，具有<90％的较低纯度的核心蛋白也可用于形成负载的微核小体。在本实施例的各种情况中，微核小体核心蛋白>90％与PEG缀合。然而，较少缀合(<90％)或非缀合的核心蛋白也可用于形成负载的微核小体。微核小体核心蛋白的纯度可以通过高压液相色谱(HPLC)确定，并且其同一性至少通过质谱法进行确认。
实施例2.负载的微核小体的产生
本实施例描述了与负载的微核小体(包括但不限于实施例1的负载的微核小体)的产生有关的技术。本实施例的负载的微核小体包含与具有净正电荷的微核小体核心蛋白缩合的核酸货物(DNA或RNA)。微核小体核心蛋白的净正电荷中和核酸货物的负电荷，从而产生纳米尺寸的颗粒。所述微核小体核心蛋白与DNA或RNA的缀合可以少量或大量发生。存在2个磷酸酯，意味着2个负电荷与每个碱基缔合。本实施例提供：至少90％的DNA负电荷被核小体核心蛋白的正电荷中和。例如，90-95％的DNA负电荷需要被中和，以使核酸与微核小体核心蛋白有效缩合。本实施例的各种微核小体核心蛋白可以包含增强细胞附着、细胞摄取、蛋白质稳定性、向靶细胞核的主动转运以及核酸货物的释放中的一种或多种的氨基酸结构域。因此，本文提供的某些微核小体核心蛋白在某些情况下可以是特别有用的。在将核酸和微核小体核心蛋白混合以产生负载的微核小体的过程中，可以将核酸和微核小体核心蛋白的混合物在100rpm至4000rpm之间混合或振荡。在核酸的缀合过程中，可添加增强缩合反应的某些催化剂，诸如NaOH和亚精胺。可以在添加多肽和核酸之前将这些催化剂添加到反应器中。可以在0.1微克/微升至100克/升范围内的浓度添加核酸。可以0.1微克/微升至100克/升的浓度添加微核小体核心蛋白。核酸可一次性添加或可逐渐添加，例如稳定地或依次滴加到振荡溶液中。一旦混合结束，在纯化之前，可使缩合的材料，即负载的微核小体平衡几分钟至几小时的时间段，例如2分钟的时间段至6小时的时间段。在此阶段可进行透析以除去杂质并交换缓冲液。可使用若干技术纯化负载的微核小体。一种这样的技术是在具有1千道尔顿或更高的分子量截留参数的柱中对颗粒高速离心。离心速度取决于样品体积可在7000xg至10,000xg的范围内。类似地，离心的持续时间可取决于样品体积从室温下20分钟到一小时不等。可用于纯化微核小体的另一技术是透析。纯化技术可不限于这两种技术，并且本领域技术人员将意识到可以用于纯化蛋白质/核酸复合物的来自文献的各种另外的纯化技术。最后，可将负载的微核小体洗脱或收集在不含内毒素的水、生理盐水或任何其他缓冲溶液中，但不限于这些。DNA的预期回收率是～30-70％。负载的微核小体还可在分子量截留柱中进行进一步离心，以进一步浓缩溶液中载体基因组的量。在本实施例中，负载的微核小体被配制成使内毒素的存在最小化。已知内毒素的典型来源包括质粒、肽合成或制备中使用的材料。因此，在本实施例中所述的制备过程中，可以使用不含内毒素的质粒，并且可以使用已经洗涤过内毒素的材料和设备。
也可以使用生物反应器配制负载的微核小体，以使核酸和肽持续混合以产生用于商业和临床用途的颗粒。
实施例3：负载的微核小体的有利形状/尺寸和制剂
在本实施例中提供了产生各种制剂形式的负载的微核小体的技术，所述制剂包括可用于向细胞和哺乳动物受试者(例如人)施用的制剂。基于微核小体核心蛋白氨基酸序列和发生合成的缓冲条件，可以将负载的微核小体配制为不同的形状和/或尺寸参数。负载的微核小体可以在不同条件下配制，例如具有适于治疗用途的溶解度。负载的微核小体在水和/或生理盐水中的溶解度是允许组合物的无毒制剂施用给患者并易于递送到患者体内的一种手段。为了形成图7所示的负载的微核小体，使用三氟乙酸盐缓冲液通过固相合成来合成核心蛋白。将200微克的DNA(SEQ ID NO:396)添加到1毫克的冻干核心蛋白中并振荡在一起，并且纯化以产生负载的微核小体(图7)。进行缓冲液交换，并且在无菌、不含内毒素的水中制成微核小体的最终制剂。将1微克的每种微核小体在水中稀释，并且接着放置在用新鲜制备的0.75％乙酸双氧铀的甲醇溶液染色的网格上，持续2分钟。将网格浸入100％乙醇中，并且接着将其印迹到镜头吸水纸中。然后使膜侧朝上将网格风干几分钟，并用HammatsuORCA HR相机进行成像(图7)。用于生成本公开的负载的微核小体核心蛋白的多核苷酸是编码荧光素酶的质粒，但是本领域技术人员应理解，本实施例在广义上证实了本公开的微核小体核心蛋白与多核苷酸缔合并形成负载的微核小体的一般能力。荧光素酶质粒通常代表核酸，包括但不限于质粒、线性核酸、各种RNA和DNA。在其他情况下，例如，可以使用其他序列或结构的RNA或DNA产生负载的微核小体。荧光素酶质粒与SEQ ID NO:393的核心蛋白缩合，产生螺旋状/螺旋形的负载的微核小体(图7A)。荧光素酶质粒与具有SEQ ID NO:390的核心蛋白缩合，产生杆状/小叶形的负载的微核小体(图7B)。对于通过荧光素酶质粒与核心蛋白SEQ ID NO:391的缩合产生的负载的微核小体，观察到环形和杆状分子的混合物(图7C)。存在可以产生球形或环形的负载的微核小体的其他缓冲条件和具有不同电荷和等电点的氨基酸序列。不同形状和尺寸的分子可以增强对某些细胞类型的向性。不同形状的病毒更有效地转导不同的细胞类型。例如，烟草花叶病毒是转导烟草植物细胞的杆状/螺旋形核衣壳结构，HIV是感染白细胞的圆形或球形的，并且AAV2是有效转导肝细胞的二十面体形状。在肌细胞中，与杆状微核小体相比，我们观察到螺旋状微核小体具有更好的转导向性(图18)。我们已经能够配制如本文所述的不同形状的负载的微核小体。还可以基于独特的形状和尺寸对不同的微核小体进行纯化。
实施例4：施用途径-静脉内(全身)以及在全身性疾病诸如A型血友病中的应用。
本实施例证实可以通过静脉内途径递送负载的微核小体，以在肝脏和其他器官中表达蛋白质。使用标准技术限制Balb/c小鼠，并使用胰岛素注射器通过尾静脉注射递送负载的微核小体和质粒对照。表达F8的质粒构建体(“F8质粒”；参见例如MN#1和MN#2,图8)是通过分别将SEQ ID NO:390和SEQ ID NO:391与F8质粒DNA(SEQ ID NO:394)缩合而制备的。SEQ ID NO:8中提供了表达GFP的构建体的质粒序列。在本实施例中，为了使负载的微核小体靶向肝细胞，我们在核酸结合结构域旁边掺入2个NGR氨基酸结构域(SEQ ID NO:3)。已显示AAV2中的NGR结构域促进αVβ5整联蛋白结合。NGR结构域与硫酸乙酰肝素结合有关，被称为AAV2的受体。已知AAV2具有高度肝向性。另外掺入这些核心蛋白中的KRH氨基酸基序用作PCSK1的切割位点，以增强核酸的释放。包含多个KRH氨基序列应增强负载的微核小体的释放。每只小鼠接受40微克剂量的MN#1、MN#2或裸质粒F8(SEQ ID NO:394)。为了测试F8蛋白的表达，在处理前(处理前1天)和处理后(处理后3天、1周、2周、1个月、3个月和4个月)，通过颊部采血技术收集～150μl血液。使用标准技术由血液制备血清。根据制造商的说明使用1:6血清稀释液进行F8 Elisa(Aviva Systems Biology)。负载的微核小体#1(MN#1包含SEQID NO:390+F8质粒)和MN#2(MN#2包含SEQ ID NO:391+F8质粒)所表达的F8比通过ELISA在处理前样品中检测到的F8的水平高大约六倍。在单次注射负载的微核小体之后的3个月和4个月，MN#1维持显著升高的表达水平(图8)。用编码F8的裸质粒(未与微核小体核心蛋白复合)处理的对照小鼠在任一时间点均未表现出F8表达的显著增加(图8)。
在另一个实验中，在从经过静脉内注射携带GFP表达质粒的负载的微核小体(SEQID NO:390+GFP质粒，SEQ ID NO:395)的小鼠中收集的组织中观察到直接GFP荧光(图9)。简单地说，将小鼠用1x PBS灌注并处死。解剖后收集整个肝脏。将肝脏组织在4％多聚甲醛中固定过夜，然后在1xPBS中洗涤，在15％蔗糖中浸泡几小时并且接着在30％蔗糖溶液中浸泡过夜以进行低温保存。然后将组织置于塑料小瓶中，并使用OCT化合物冷冻以用于切片。使用低温切片机获得10微米厚的组织切片。肝脏切片用具有或不具有DAPI的封固介质封固，盖上盖玻片并密封。通过Leica SP5共焦镜和落射荧光镜获得图像。
结果证实，当通过静脉内途径递送时，微核小体成功到达肝脏并且微核小体货物编码的基因在肝细胞中表达(图9)。观察到多种肝细胞类型中的表达。本实施例的观察结果表明，负载的微核小体向肝脏的递送不依赖靶向结构域。鉴于本实施例中提供的数据，本领域技术人员将理解，可以通过静脉内递送将负载的微核小体递送至肾和脾中的细胞，因为这些器官通常像肝脏一样具有清除例如药物的功能。
鉴于本公开，可以通过使用负载的微核小体治疗剂治疗的病状的一个实例是A型血友病。A型血友病是由因子8(一种凝血因子)的突变引起的严重的出血性病症。它以X连锁隐性方式遗传。每5,000名成活婴儿中大约存在1例。最严重的后果是可能导致死亡的内部出血。严重程度取决于体内循环的F8的量。75％的血友病患者采用重组F8产品作为疗法。接受F8疗法的受试者被反复静脉内输注，随着时间的流逝，这给患者、医生和护理人员带来巨大的负担。目前，正在进行基因治疗试验，以通过AAV递送F8的长期表达。然而，F8是不可完全掺入AAV中的大基因。因此，已经利用迷你F8来递送F8的功能结构域以治疗此疾病。众所周知，迷你F8不具有与全长F8相同的功能能力和稳定性。此外，20-40％的人口已经具有针对AAV的中和抗体，这将使得大量血友病患者群体不能接受基于AAV的药物。另外，如果在AAV治疗的第一个中止过程后需要进一步治疗，由于免疫原性，AAV载体不可重新给药。通过能够递送完整大小的F8基因(图8)并且由于其可重新给药的性质(图17)，负载的微核小体解决了AAV基因治疗的这两个问题。因此，本公开提供了使用静脉内递送模式将负载的微核小体递送到系统空间(诸如肝、肾、脾等)中的不同细胞类型中的技术，以用于许多病状，其中A型血友病是示例性的病状。
通常由分泌性蛋白的缺陷引起的其他全身性疾病也可以使用负载的微核小体治疗剂进行治疗。本实施例(图8)证实，静脉内递送(全身施用)的负载的微核小体产生的蛋白质水平高于治疗阈值，所述治疗阈值为通过各种临床试验确定的内源性水平的大约10％，这尤其表明了微核小体作为用于治疗例如其中分泌性蛋白可以通过多种细胞类型表达的全身性疾病的治疗剂的治疗潜力。在一些情况下，可以通过使用细胞类型特异性启动子将表达局限于某些细胞类型。本领域技术人员由本公开还将理解，也可通过静脉内递送来接近和转导其他组织，诸如脑、心脏、肌肉等。在那种情况下，内置于微核小体核心蛋白中的靶向机制应有所帮助。
当静脉内注射时，负载的微核小体可以大于1e5个基因组拷贝每千克体重的剂量且最高至1e25个拷贝每千克体重的剂量(例如，约1e5、1e6、1e7、1e8、1e9、1e10、1e15、1e20或1e25个拷贝每千克体重，或介于其间的任何范围)递送。材料的体积可在1-900毫升的范围内(例如，1、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800或900毫升)。负载的微核小体也可重复施用(例如，选定的体积和/或数量的基因组拷贝可以多次施用或分成两次或更多次剂量)。
实施例5：施用途径-眼内
本实施例证实可以通过眼内途径递送负载的微核小体，以在视网膜色素上皮(RPE)或其他视网膜神经元诸如光感受器、双极细胞和神经节细胞中表达蛋白质。在本实施例中，通过IP注射克他命/甲苯噻嗪(Ketamine/Xylazine)(90-100mg/kg+10mg/kg)将Balb/c小鼠麻醉并将其置于显微镜下。局部用托吡卡胺(Tropicamide)(1％)使小鼠的眼扩张，并且使用32号钝针头穿过角膜缘下方由25号针头形成的切口，将1ul负载的微核小体(在小鼠中的总剂量为1.5微克)注射到玻璃体腔中。在各个时间点，向小鼠灌注10ml的1xPBS，然后使用标准技术处死。摘除小鼠的眼球，收集视杯并在4％多聚甲醛中孵育过夜。用1xPBS洗涤视杯，然后在15％蔗糖中浸泡几小时，并且接着在30％蔗糖溶液中浸泡过夜以进行低温保存。然后将视杯置于塑料小瓶中，并使用OCT化合物冷冻以进行低温切片。获得10微米厚的组织切片用于染色。视网膜切片用具有或不具有DAPI的封固介质封固，盖上盖玻片并密封。通过Leica SP5获取图像。对于全标本成像，将视杯在4％多聚甲醛中固定过夜。在1xPBS中洗涤视杯，移除视网膜并且对其余的视杯或RPE全标本进行处理以用于染色。RPE组织用封固介质整体封固，盖上盖玻片并密封。通过Leica SP5获取图像。在视网膜和RPE细胞中观察到天然GFP荧光(图10、11和12)。
为了靶向RPE细胞，本实施例利用了可以结合吞噬蛋白如MERTK的微核小体核心蛋白(SEQ ID NO:392)。RPE是吞噬细胞，其微绒毛延伸至光感受器内/外段接合处。MERTK在那些微绒毛中表达。在SEQ ID NO:392中，我们掺入了如表8所述的“吃掉我”信号。在文献中，“吃掉我”信号被描述为暴露于准备用于吞噬的细胞碎片中的结构域(Wei Li,Journal ofCell physiology,2016，其以引用方式并入本文)。就本发明人所知，这些“吃掉我”信号以前从未在非病毒载体的背景下被利用过。这些“吃掉我”信号结构域先前尚未应用于非病毒载体以靶向RPE细胞。
为了选择性地转导光感受器，本实施例利用了核心蛋白，如SEQ ID NO:388的那些。SEQ ID NO:388包括本文在表8中描述的神经元附着元件(LRE)，其可以允许转导到均为视网膜中的神经元的神经节细胞、双极细胞和光感受器中(图12)。此神经元附着结构域先前尚未应用于非病毒载体以靶向神经元。本公开提供：此神经元靶向载体可以通过局部或全身施用来转导脑中的神经元。本公开还提供了通过将凝集素结合结构域(表4中所述)掺入微核小体中以便附着至光感受器细胞外基质以增强摄取来靶向光感受器结合和内化。掺入微核小体核心蛋白(SEQ ID NO:390)中的整联蛋白结合结构域还可以在眼内递送时仅转导大鼠的眼的RPE细胞(图11)。此外，可以利用多于一个结构域来选择性地转导多种不同的细胞类型。具有整联蛋白结合特性的此核心蛋白(SEQ ID NO:390)也可用于将核酸递送至表达高水平的αVβ5整联蛋白的其他细胞类型。本公开还提供了其他眼内注射技术的使用，所述技术诸如视网膜下、脉络膜上、前房內或局部施用，以靶向视网膜中的光感受器、RPE、Mueller细胞或其他细胞类型。
本文提供了使用玻璃体内或视网膜下递送模式将负载的微核小体递送到视网膜中的不同细胞类型中的技术。如视网膜变性之类的疾病主要是由在光感受器中表达的基因的突变引起的。年龄相关性黄斑变性(AMD)是视网膜色素上皮(RPE)和脉络膜毛细血管的疾病，其影响>1000万美国人和全球>1亿的人，目前，将基因治疗载体递送至光感受器和RPE的主要技术是外科技术，其中将病毒通过视网膜下注射到视网膜中。然而，视网膜下手术是由训练有素的眼外科医生在手术室中进行的复杂手术。至少存在一个未满足的需求，那就是，在美国只有一小部分外科医生受过训练可以进行这项手术。减轻患者和医生负担的一种方式是开发可以玻璃体内注射的载体，所述载体可以穿过视网膜以转导光感受器和RPE。玻璃体内注射可以由所有眼科医生在住院患者就诊时进行。负载的微核小体疗法解决了这个问题，因为玻璃体内注射可以选择性地转导光感受器和RPE(图10、11和12)。这使得微核小体非常适于治疗大多数具有遗传缺陷的视网膜疾病。
在眼内注射时，负载的微核小体可以大于1e5个基因组拷贝每只眼的剂量且最高至1e25个拷贝每只眼的剂量(例如，约1e5、1e6、1e7、1e8、1e9、1e10、1e15、1e20或1e25个拷贝每只眼，或介于其间的任何范围)递送。材料的体积在通过视网膜下注射时可在10-500微升的范围内(例如，1、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500微升)并且在注射通过玻璃体内、脉络膜上或前房内进行时在10-250微升的范围内(例如，1、5、10、20、30、40、50、100、150、200或250微升)。负载的微核小体治疗剂也可重复施用(例如，选定的体积和/或数量的基因组拷贝可以多次施用或分成两次或更多次剂量)。
实施例6：施用途径-鼻内
本实施例证实可以通过鼻内途径递送负载的微核小体以在肺、气管和肠细胞中表达蛋白质。在本实施例中，为了靶向肺上皮中的上皮细胞，在微核小体核心蛋白中在核酸结合结构域旁边包含2个NGR氨基酸结构域(参见，NGR氨基酸结构域SEQ ID NO:390的使用)。就本发明人所知，从未将NGR结构域用于产生非病毒DNA/蛋白质复合物并将其递送至视网膜细胞，如本文所公开。已显示AAV2中的NGR结构域促进αVβ5整联蛋白结合。NGR结构域与硫酸乙酰肝素结合有关，被称为AAV2的受体。
在本实施例中，通过IP注射克他命/甲苯噻嗪(90-100mg/kg+10mg/kg)将Balb/c小鼠麻醉，并且将麻醉的小鼠置于显微镜下观察鼻区的鼻内递送。将1ul负载的微核小体(SEQID NO:390+GFP质粒)溶液每隔几秒钟递送到鼻腔中，直到将12微升递送至每个鼻侧。递送25微克的总剂量。处死后，对小鼠的肺进行处理以获得10微米厚的切片。将切片在PBS中洗涤并在封闭缓冲液(0.1％TritonX-100、1％BSA、3％驴血清)中孵育1hr，然后在CFTR抗体(在封闭缓冲液中制备)封闭缓冲液中在4摄氏度下孵育过夜。第二天，在PBS中洗涤3x5min，并在封闭缓冲液中的AlexaFlour-555(驴抗兔IgG二抗)中在室温下孵育1小时，并在PBS中洗涤3x5 min。添加封固介质并且盖上盖玻片并密封。在486nm波长中在Leica SP5镜的486nm通道中获得GFP的天然荧光，并且在555nm通道中获得CFTR表达。我们最早在3天时以及在注射后(PI)3个月时观察到负载的微核小体表达(图13)。我们观察到在肺泡和细支气管的上皮中的表达(图13A和13C)，通过鲜绿色荧光以及CFTR染色示出。CFTR和GFP的共定位(图13C)表明由微核小体编码的基因在肺上皮中的表达。从肺泡环获取的更高放大倍数的图像(图14A、B和C)也清楚地显示出上皮中GFP荧光的亮绿色环以及CFTR染色细胞中的红色荧光。
在本实施例中，还评估了整个肺组织和通过微核小体实现的生物分布(图15)。在灌注并处死后，从小鼠中提取整个肺组织。将肺组织在4％PFA中固定并用1xPBS洗涤。将整个组织置于Odyssey成像仪中以检测GFP天然荧光。未注射的对照不显示出任何荧光(图15)。负载的微核小体(包含编码GFP的质粒核酸货物)在注射样品后5周在整个肺组织中显示出GFP荧光(图15)。
本文提供了使用鼻内递送模式将负载的微核小体递送到肺部空间(诸如肺上皮)和/或气管的组织中的不同细胞类型中的技术。诸如囊性纤维化之类的遗传疾病影响肺和其他器官。为了将基因递送至肺，鼻内是选择的途径之一。我们观察到，在鼻内递送时，负载的微核小体在肺泡和细支气管中表达蛋白质(图13)。这些是通常将表达与囊性纤维化有关的CFTR蛋白的组织。在其他疾病中，此施用途径可以用于产生可减轻其他疾病的治疗性蛋白质。鼻内途径还可提供通往其他器官诸如肠和脑的通道(图16)。在微核小体核心蛋白(SEQ ID NO:390)中包含NGR结构域允许增强DNA分子在核中的摄取和释放，以实现高水平的持续表达。这在图16中通过在处理后5周从负载的微核小体观察到的亮绿色荧光相对于未处理的动物中没有这一模式(图16中第一行的肺部图像)来证明。我们还观察到在鼻内递送负载的微核小体之后GFP的表达在气管上皮和气管肌中的转导(图17)。
在鼻内注射时，负载的微核小体可以大于1e5个基因组拷贝每千克体重的剂量且最高至1e25个拷贝每千克体重的剂量(例如，约1e5、1e6、1e7、1e8、1e9、1e10、1e15、1e20或1e25个拷贝每千克体重，或介于其间的任何范围)递送。材料的体积可在1-200毫升的范围内(例如，1、5、10、20、30、40、50、100或200毫升)。负载的微核小体也可重复施用。负载的微核小体也可口服递送以进入肠、胰腺等。
实施例7：施用途径-肌内
本实施例证实可以通过肌内途径递送负载的微核小体以在肌细胞中表达蛋白质。通过IP注射克他命/甲苯噻嗪(90-100mg/kg+10mg/kg)将Balb/c小鼠麻醉并且使用胰岛素注射器将若干负载的微核小体注射到两个腿肌中，每条腿17.5ug剂量(总剂量35微克每只小鼠)。在各个时间点处死小鼠并获得腿肌用于组织切片。包含核心蛋白(诸如聚赖氨酸(SEQ ID NO:393)或具有其他结构域组合的微核小体(SEQ ID NO:389))的构建体在3个月的时间点未显示GFP荧光。令人惊讶的是，在注射后3个月获得的肌肉组织切片中，我们观察到注射了含有半乳糖和岩藻糖结合结构域的负载的微核小体(如SEQ ID NO:391所示)的骨骼肌细胞中的鲜绿色荧光(图18A、B和C)。这表明一些结构域具有较高的附着并内化到肌细胞中的倾向，并且可以用于将基因有效地转移到肌细胞中。本领域技术人员可预期将此类结构域与已知具有肌肉向性的其他结构域组合。
为了验证由核酸货物编码的基因的表达的肌肉特异性，我们利用肌营养不良蛋白免疫标记作为内源性二级标志物。肌营养不良蛋白染色的红色荧光(图B；在图C中合并)环绕的鲜绿色荧光的区域(图A)清楚地表明，肌内注射的负载的微核小体可以将基因递送至肌细胞(图18)。GFP的天然荧光在Leica SP5镜的486nm通道中获得。红色的肌营养不良蛋白在RFP通道(555nm)获得。图中未转导的肌细胞也用作在GFP信号与自发荧光之间进行区分的内部对照。
本文提供了通过肌内递送模式将负载的微核小体递送到肌细胞中的技术。许多遗传性肌肉萎缩症导致肌细胞的萎缩。为了向这些肌细胞递送功能基因，肌内途径提供了直接施用途径。我们证实了负载的微核小体的肌肉向性和在骨骼肌细胞中表达基因的能力(图18)。早在递送后第2天就在肌细胞中观察到表达。本文提供了可以增强载体摄取和基因表达的肌肉向性结构域，但是不限于此。我们还观察到，与小叶形分子相比(数据未示出)，通过肌内途径递送的螺旋状的负载的微核小体有效地转导肌细胞并且持续较长的时间-在这种情况下为3个月(图18)。载体的形状以前没有在将基因递送至肌细胞的背景下描述过。本领域技术人员可预期利用其他结构来增加对肌细胞的细胞向性。总体来说，GFP在表达肌营养不良蛋白的肌细胞中的表达证实了负载的微核小体拯救如杜氏肌营养不良或其他肌营养不良症之类的疾病的能力。肌肉向性也可通过包含表4中所述的其他结构域来增强。肌肉向性也可通过静脉内递送实现。
当通过肌内途径注射时，负载的微核小体可以大于1e5个基因组拷贝每千克体重的剂量且最高至1e25个拷贝每千克体重的剂量(例如，约1e5、1e6、1e7、1e8、1e9、1e10、1e15、1e20或1e25个拷贝每千克体重，或介于其间的任何范围)递送。材料的体积可在1-900毫升的范围内(例如，1、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800或900毫升)。负载的微核小体也可重复施用(例如，选定的体积和/或数量的基因组拷贝可以多次施用或分成两次或更多次剂量)。负载的微核小体也可静脉内施用以进入肌细胞。
实施例8：负载的微核小体是可重新给药的
本实施例证实微核小体可以重新施用，而对蛋白质的表达没有任何中和作用(图19)。使用标准限制技术将Balb/c小鼠简单地限制，并使用胰岛素注射器通过尾静脉注射递送负载的微核小体MN#1(SEQ ID NO:390+F8质粒)和MN#2(SEQ ID NO:391+F8质粒，SEQ IDNO:393)。每只小鼠接受20微克第1剂量和40微克第2剂量(在第1剂量之后30天)。在第1和第2剂量后第3天，通过颊部采血技术收集血清。每次收集～150ul血液，并使用标准技术从血液中收集血清。进行F8 Elisa以确定静脉内递送负载的微核小体后Balb/c小鼠的血清中的F8表达水平。根据制造商(Aviva Systems Biology)的说明进行F8 Elisa。制备1:6血清稀释液用于所有测定。我们观察到，在第二次递送时，表达水平不存在中和作用，如通过F8蛋白水平的增加所证明(图19)。
本文提供了可以重复递送以提高期望蛋白的表达水平的微核小体核心蛋白和负载的微核小体的实例。对于可能需要重复施用的任何药物，可重新给药性是非常重要的特征。在基因治疗中，当前病毒载体最不期望的特征之一是不能重新施用药物产品。病毒载体一旦注射到患者体内就会导致形成中和抗体。这在它们第二次施用时导致免疫原性和难以表达。我们在此处表明，微核小体介导的基因递送解决了这个问题。微核小体的非免疫原性性质是通过设计来工程改造得到的：通过组合自身肽或人源氨基酸序列并通过聚乙二醇化增强。在文献中，已经显示聚乙二醇化的蛋白质逃避免疫系统。在这种情况下，在小鼠中，人工的人源核心蛋白的免疫原性的缺乏进一步验证了聚乙二醇化的情况。这种可重新给药性特征将允许在需要时对患者进行多次治疗。在表达水平随时间递减的情况下，这一可重新给药的特征将允许重复治疗以将表达提高至期望水平。这条数据还表明，在一些需要多器官注射的患者中，微核小体介导的基因转移将是最理想的。本领域技术人员还可预期通过许多其他施用途径，诸如局部、口服、阴道、腹膜内、眼内、鞘内、脑内、皮下等，或通过封装在脂质体或其他合成材料中进行重复给药。
重复剂量可以大于1e5个基因组拷贝每千克体重的浓度且最高至1e25个拷贝每千克体重的剂量(例如，约1e5、1e6、1e7、1e8、1e9、1e10、1e15、1e20或1e25个拷贝每千克体重，或介于其间的任何范围)递送。材料的体积可在1-900毫升的范围内(例如，1、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800或900毫升)。负载的微核小体也可重复施用(例如，选定的体积和/或数量的基因组拷贝可以多次施用或分成两次或更多次剂量)。
实施例9：通用技术
本实施例描述了用于将微核小体克隆、递送到细胞中的通用技术。可以应用来构建这些载体的一些克隆技术可包括-转基因构建体的合成、TOPO PCR克隆、平末端克隆、无缝克隆、长片段克隆、限制酶消化和连接，但不限于这些技术。DNA或RNA分子可表达一种或多种表达标志物，诸如GFP、YFP和荧光素酶，但不限于此。DNA或RNA分子可表达一种或多种治疗性RNA或蛋白质，但不限于此。
可以通过在HEK细胞或其他动物细胞系中表达负载的微核小体来体外测试其功能并表征。通过将细胞暴露于培养基中的负载的微核小体，可以测定合成和/或纯化的负载的微核小体转导造血干细胞或分化的外周血单核细胞的能力。还可以通过暴露于微核小体或通过转染技术或用于插入的其他物理方法，在体外测试负载的微核小体的功能和形成嵌合T细胞的能力。可以通过在小鼠或任何其他动物模型中递送来体内测试负载的微核小体的功能并表征，但不限于此。
序列：
SEQ ID NO:388
KKRHRK-[接头]-LRE-[接头]KRHRKLRRRRRLKRHRKKRHRK-[接头]-LRE-[接头]-K
(其中[接头]可以是表12中描述的任何氨基酸序列，但不限于此)
SEQ ID NO:389
KKKRHRKRKRKRKRRRRKKK-[接头]-ASSLNIAK-[接头]-RRRR
(其中[接头]可以是表12中描述的任何氨基酸序列，但不限于此)
SEQ ID NO:390
KKKRK-[接头]-NGR-[接头]-KRKRKKRHRKKKKRRRRKRHRK-[接头]-NGR-[接头]-KKK
(其中[接头]可以是表12中描述的任何氨基酸序列，但不限于此)
SEQ ID NO:391
KKKRHRKKKKK-[接头]-RGD-[接头]-KKKK-[接头]-NTQIH-[接头]-RRRRR-[接头]-TPH-[接头]-KK
(其中[接头]可以是表12中描述的任何氨基酸序列，但不限于此)
SEQ ID NO:392
KKKRK-[接头]-KTKKK-[接头]-AK-[接头]-KALKKK-[接头]-KKGKKKKRRRRKAAPKK
(其中[接头]可以是表12中描述的任何氨基酸序列，但不限于此)
SEQ ID NO:393
CKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKKK
SEQ ID NO:394
CBA-F8质粒
TCGCGCGTTTCGGTGATCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCGCCACCATGCAAATAGCACTCTTCGCTTGCTTCTTTCTGAGCCTTTTCAATTTCTGCTCTAGTGCCATCAGAAGATACTACCTTGGTGCAGTGGAATTGTCCTGGAACTATATTCAGAGTGATCTGCTCAGTGTGCTGCATACAGACTCAAGATTTCTTCCTAGAATGTCAACATCTTTTCCATTCAACACCTCCATCATGTATAAAAAGACTGTGTTTGTAGAGTACAAGGACCAGCTTTTCAACATTGCCAAGCCCAGGCCACCCTGGATGGGTTTGCTAGGTCCTACCATTTGGACTGAGGTTCATGACACAGTGGTCATTACACTTAAAAACATGGCTTCTCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTGTCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGATGAATATGAAGATCAGACAAGCCAAATGGAGAAGGAAGATGATAAAGTTTTCCCTGGTGAAAGTCATACTTATGTTTGGCAAGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCTCCATGTCTCACTTACTCATATATGTCTCATGTGGATCTGGTGAAAGATTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCTCTGCTAGTATGTAAAGAAGGCAGTCTCTCCAAAGAAAGAACACAGATGTTGTACCAATTTGTACTGCTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAGAGCTGGCACTCAGAAACAAACGACTCTTATACACAGTCTATGGATTCTGCATCTGCTAGAGACTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGCTATGTAAACAGGTCTCTTCCAGGTCTGATTGGATGCCATAGGAAATCAGTCTACTGGCACGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAATACACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTTTTGTGAGGAACCACCGTCAAGCTTCATTGGAGATATCACCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATAGATCTTGGGCAGTTCCTACTATTTTGTCATATCTCTTCCCATAAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGATAGCTGCCCTGAGGAATCCCAATGGCAAAAGAAAAATAATAATGAGGAAATGGAAGATTATGATGATGATCTTTATTCAGAAATGGATATGTTCACATTGGATTATGACAGCTCTCCTTTTATCCAAATTCGCTCGGTTGCTAAAAAGTACCCTAAAACTTGGATACATTATATTTCTGCTGAGGAGGAAGACTGGGACTATGCACCTTCAGTTCCTACCTCGGATAATGGAAGTTATAAAAGCCAGTATCTGAGCAATGGTCCTCATCGGATTGGTAGGAAATATAAAAAAGTCAGATTTATAGCATACACAGATGAAACCTTTAAGACTCGTGAAACTATTCAGCATGAATCAGGACTCTTGGGACCTTTACTTTATGGAGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATTTTTAAGAATCAAGCAAGCCGACCATATAACATTTACCCTCATGGAATCACTGATGTCAGTCCTCTACATGCAAGGAGATTGCCAAGAGGTATAAAGCACGTGAAGGATTTGCCAATTCATCCAGGAGAGATATTCAAGTACAAGTGGACAGTTACAGTAGAAGATGGACCAACTAAATCAGATCCACGGTGCCTGACCCGCTATTATTCAAGTTTCATTAACCCTGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTGATTGGCCCTCTTCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGGGGAAACCAGATGATGTCAGACAAAAGAAATGTCATCCTGTTTTCTATATTTGATGAGAACCAAAGCTGGTACATCACAGAGAACATGCAACGCTTCCTCCCCAATGCAGCTAAAACACAGCCCCAGGACCCTGGGTTCCAGGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGCTTGGAGTTGACAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGCACATTCTCAGTGTTGGAGCACAGACAGACTTCTTATCTATCTTCTTCTCTGGATATACTTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGATACACTTACCCTGTTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTTATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGGTCTTGGGGTGTCATAATTCAGACTTTCGGAAGAGAGGTATGACAGCATTGCTGAAAGTTTCTAGTTGTGACAAGAGCACTAGTGATTATTATGAAGAAATATATGAAGATATTCCAACACAGTTGGTGAATGAGAACAATGTCATTGATCCCAGAAGCTTCTTCCAGAATACAAATCATCCTAATACTAGGAAAAAGAAATTCAAAGATTCCACAATTCCAAAAAATGATATGGAGAAGATTGAGCCTCAGTTTGAAGAGATAGCAGAGATGCTTAAAGTACAGAGTGTCTCAGTTAGTGACATGTTGATGCTCTTGGGACAGAGTCATCCTACTCCACATGGCTTATTTTTATCAGATGGCCAAGAAGCCATCTATGAGGCTATTCATGATGATCATTCACCAAATGCAATAGACAGCAATGAAGGCCCATCTAAAGTGACCCAACTCAGGCCAGAATCCCATCACAGTGAGAAAATAGTATTTACTCCTCAGCCCGGCCTCCAGTTAAGATCCAATAAAAGTTTGGAGACAACTATAGAAGTAAAGTGGAAGAAACTTGGTTTGCAAGTTTCTAGTTTGCCAAGTAATCTAATGACTACAACAATTCTGTCAGACAATTTGAAAGCAACTTTTGAAAAGACAGATTCTTCAGGATTTCCAGATATGCCAGTTCACTCTAGTAGTAAATTAAGTACTACTGCATTTGGTAAGAAAGCATATTCCCTTGTTGGGTCTCATGTACCTTTAAACGTGAGTGAAGAAAATAGTGATTCCAACATATTGGATTCAACTTTAATGTATAGTCAAGAAAGTTTACCAAGAGATAATATATTATCAATGGAGAATGATAGATTACTCAGAGAGAAGAGGTTTCATGGAATTGCTTTATTGACCAAAGATAATACTTTATTCAAAGACAATGTCTCCTTAATGAAAACAAACAAAACATATAATCATTCAACAACTAATGAAAAACTACACACTGAGAGCCCAACATCAATTGAGAATAGTACAACAGACTTGCAAGATGCCATATTAAAGGTCAATAGTGAGATTCAAGAAGTAACAGCTTTGATTCATGATGGAACACTTTTAGGCAAAAATTCTACATATTTGAGACTAAACCATATGCTAAATAGAACTACCTCAACAAAAAATAAAGACATATTTCATAGAAAAGATGAAGATCCTATTCCACAAGATGAAGAGAATACAATCATGCCATTTTCCAAGATGTTGTTCTTGTCAGAATCTTCAAATTGGTTTAAAAAGACCAATGGAAATAATTCCTTGAACTCTGAGCAAGAACATAGTCCAAAGCAATTAGTATATTTAATGTTTAAAAAATATGTAAAAAATCAAAGTTTCTTGTCAGAGAAAAATAAAGTCACAGTAGAACAGGATGGATTTACAAAGAACATAGGACTTAAAGACATGGCTTTTCCACATAATATGAGCATATTTCTTACCACT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SEQ ID NO:395
CBA-GFP质粒
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATCCATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGTTAACTCGAGGGATCCATCGATGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGTGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAGCCCAATCTGAATAATGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACGGGCCAGAGCTGCA
SEQ ID NO:396
CBA-荧光素酶质粒
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAACCGGTCTCGAAGGCCTGCAGGCGGCCGCCGCCACCGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATTGCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCGCTCCCCTCTCTAAGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGTGGCTCCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGCAGGTGTCGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAATCCATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTCGTTAACTCGAGGGATCCATCGATGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGTGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAGCCCAATCTGAATAATGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACGGGCCAGAGCTGCA
以引用的方式并入
本申请中引用的出版物和专利已整体并入。
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专利引用：
Figure BDA0003083810770000911
Figure BDA0003083810770000921

Claims (42)

1.一种工程改造的多肽，其包含核酸结合结构域和靶向结构域。
2.如权利要求1所述的工程改造的多肽，其中所述核酸结合结构域衍生自组蛋白多肽序列。
3.如权利要求1或2所述的工程改造的多肽，其中所述核酸结合结构域是或包含氨基酸序列KRHRK。
4.如权利要求1所述的工程改造的多肽，其中所述核酸结合结构域是或包含包括以下的氨基酸序列：KRHRK、RRRRR、RRLARR、KKAKAAAKPKK、KKDGKKRKR、KKKLK、KKRIRK、RKKSK、KKPKK或其组合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的工程改造的多肽，其中所述靶向结构域是细胞附着结构域、β半乳糖结合结构域、岩藻糖结合结构域、肝素结合结构域、唾液酸结合结构域、糖蛋白结合结构域、碳水化合物结合结构域、溶血磷脂酸结合结构域、cAMP结合结构域、透明质酸结合结构域、硫酸软骨素结合结构域、整联蛋白结合结构域、核仁素结合结构域、胶原蛋白结合结构域、网格蛋白结合结构域、Fc受体结合结构域、肌动蛋白结合结构域、内吞基序、核定位信号或其组合。
6.如权利要求1-5中任一项所述的工程改造的多肽，其中所述靶向结构域是细胞附着靶向结构域。
7.如权利要求6所述的工程改造的多肽，其中所述细胞附着靶向结构域是或包含包括以下的氨基酸序列：WGREERQ、NTQIH、WNNKTPH、TPH、VNRWS、XBBBXXBX、ARKKAAKA、QRR、SRR、WEPSRPFPVD、HRRTRKAPKRIRLPHIR、KRTGQYKLGSKTGPGQK、KKTK、KLRSQLVKK、RRRCGQKKK、BX(7)B、RIQNLLKITNLRIKFVK、KKEKDIMKKTI、KGE、RGD、RGDS、TTVVNPKYEGK、ERMSQIKRLLS、WRHRARS、GFOGER、LFDLM、WGREERQ、QSTEKRG、LPNTG或其组合。
8.如权利要求1-5中任一项所述的工程改造的多肽，其中所述靶向结构域是内化结构域。
9.如权利要求8所述的工程改造的多肽，其中所述内化结构域是或包含包括以下的氨基酸序列：FXDXF、PPSY、FEDNFVP、YIRV、YADW、YTQV、KKRPKP、SSDDE、RRASS、(YXXL)2、LPLTG、LAFTG或其组合。
10.如权利要求1-5中任一项所述的工程改造的多肽，其中所述靶向结构域是细胞类型特异性靶向结构域。
11.如权利要求10所述的工程改造的多肽，其中所述细胞类型特异性靶向结构域是或包含包括以下的氨基酸序列：ASSLNIA、KKEEEKKEEEKKEEE、LIFHKEQ、KFNKPFVFLI、QPEHSST、EYHHYNK、NGR、GEKGEP、KTKKK、KALKKK、KGKKK、CSVTCG、LRE、YKYNLNGRES、YRSL、KGGK7、KKKQYTSIHHG、KDEL、LADQDYTKTA或其组合。
12.如权利要求1-11中任一项所述的工程改造的多肽，其还包含聚精氨酸结构域。
13.如权利要求1-12中任一项所述的工程改造的多肽，其还包含核内化信号或核输入机制结合结构域。
14.如权利要求11所述的工程改造的多肽，所述核内化信号或核输入机制结合结构域是或包含包括以下的氨基酸序列：KKKYKLK、KKRKLE、TRSK、HRKRKR、NKRKRK、AEKSKKK、RKSK、KRVK、KRK、LQQTPLHLAVI、RRPR、PRPR、RPPP、RKKRKGK、PAAKRVKLD、KLKIKRPVK、PKKKRKV、QRKRQK、DSPE、FQVT、QSTEKRG、RQGLID、环状RKKH或其组合。
15.如权利要求1-14中任一项所述的工程改造的多肽，其还包含核酸释放结构域。
16.如权利要求15所述的工程改造的多肽，其中所述核酸释放结构域是或包含包括以下的氨基酸序列：GRKKRRQRRRPQ、KRH、KSVKKRSVSEIQ、NRRKKRAL、KFERQ、VRGP、NKDS、NRDN、ANNR或其组合。
17.如权利要求1-16中任一项所述的工程改造的多肽，其还包含稳定性结构域。
18.如权利要求17所述的工程改造的多肽，其中所述稳定性结构域是或包含包括以下的氨基酸序列：YTRF、GDAY、LLEE、RKKRRQRRR、YKSL、YENF、FQDL、YIGSR、IKVAV或其组合。
19.如权利要求1-18中任一项所述的工程改造的多肽，其还包含寡聚化结构域。
20.如权利要求19所述的工程改造的多肽，其中所述寡聚化结构域选自表11的寡聚化结构域，任选地其中所述寡聚化结构域位于所述工程改造的多肽的C末端。
21.如权利要求1-20中任一项所述的工程改造的多肽，其中所述多肽包含接头，任选地其中所述接头是根据SEQ ID NO:154-250中的任一者的接头。
22.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-21中任一项所述的工程改造的多肽。
23.如权利要求22所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA或RNA。
24.一种载体，其包含如权利要求22或23所述的多核苷酸。
25.一种细胞，其包含如权利要求1-21中任一项所述的工程改造的多肽、如权利要求22或23所述的多肽，或如权利要求24所述的载体。
26.一种制备如权利要求1-21中任一项所述的工程改造的多肽的方法，其包括在细胞中表达如权利要求22或23所述的多核苷酸。
27.如权利要求26所述的方法，其还包括从所述细胞中分离所述工程改造的多肽。
28.一种组合物，其包含：
(i)至少一种多核苷酸，以及
(ii)至少一种如权利要求1-21中任一项所述的工程改造的多肽。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述至少一种多核苷酸是或包含DNA或RNA。
30.如权利要求28或29所述的组合物，其中所述至少一种多核苷酸包含编码多肽的核苷酸序列。
31.如权利要求28-30中任一项所述的组合物，其中所述至少一种多核苷酸是或包含mRNA。
32.如权利要求28或29所述的组合物，其中所述至少一种多核苷酸包含抑制性RNA。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述抑制性RNA是gRNA、siRNA、miRNA或shRNA。
34.如权利要求28-33中任一项所述的组合物，其包含至少两种如权利要求1-21中任一项所述的工程改造的多肽，其中如权利要求1-21中任一项所述的第一工程改造的多肽能够与如权利要求1-21中任一项所述的第二工程改造的多肽寡聚合。
35.如权利要求28-34中任一项所述的组合物，其中多核苷酸与如权利要求1-21中任一项所述的工程改造的多肽的比率介于1:3与1:2,000之间。
36.如权利要求35所述的组合物，其中多核苷酸与如权利要求1-21中任一项所述的工程改造的多肽的比率介于1:3与1:1,000之间，介于1:3与1:500之间，介于1:3与1:200之间，介于1:3与1:100之间，或介于1:3与1:50之间。
37.如权利要求28-36中任一项所述的组合物，其中多核苷酸与如权利要求1-21中任一项所述的工程改造的多肽的比率介于1:200与1:2,000之间，介于1:200与1:1000之间，或介于1:200与1:500之间。
38.如权利要求28-37中任一项所述的组合物，其包含药物载体。
39.一种方法，其包括向细胞、组织或受试者施用如权利要求28-38中任一项所述的组合物。
40.一种使多核苷酸缩合的方法，其包括使所述多核苷酸与如权利要求1-21中任一项所述的多肽接触。
41.一种中和多核苷酸的电荷的方法，其包括使所述多核苷酸与如权利要求1-21中任一项所述的多肽接触。
42.如权利要求1-20中任一项所述的工程改造的多肽，其中所述多肽的一个或多个氨基酸是聚乙二醇化、乙酰化、甲基化、糖基化、磷酸化、sumo化、酰胺化、脂化、异戊烯化、硫辛酰化、烷基化、酰化、糖化、亚硝酰化、硫酸化、氨甲酰化、羰基化、类泛素化、生物素化或核糖基化的。
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