TW202332468A - 胜肽介導的活性劑遞送 - Google Patents

胜肽介導的活性劑遞送 Download PDF

Info

Publication number
TW202332468A
TW202332468A TW112102803A TW112102803A TW202332468A TW 202332468 A TW202332468 A TW 202332468A TW 112102803 A TW112102803 A TW 112102803A TW 112102803 A TW112102803 A TW 112102803A TW 202332468 A TW202332468 A TW 202332468A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
nucleic acid
peptide
cells
complex
rna
Prior art date
Application number
TW112102803A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI845133B (zh
Inventor
吳漢忠
洪銘祥
廖俊智
Original Assignee
中央研究院
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中央研究院 filed Critical 中央研究院
Publication of TW202332468A publication Critical patent/TW202332468A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI845133B publication Critical patent/TWI845133B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/609—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses positive strand RNA viruses

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本揭示內容是關於新穎的合成胜肽，以及其於活體外或活體內遞送活性劑(例如，核酸)的用途。本揭示內容因此提供一種適用於此用途的共價胜肽/核酸複合體。所述共價胜肽/核酸複合體是由本發明合成胜肽及一用以編碼一標的蛋白的核酸彼此共價鍵結所形成。所述共價胜肽/核酸複合體特別可用以轉形諸如樹突細胞等抗原呈現細胞。

Description

胜肽介導的活性劑遞送
本揭示內容是關於載體胜肽的領域；更具體來說，是關於可將核酸等活性劑遞送至細胞的新穎合成胜肽，以及其於治療及/或預防疾病的用途。
用以將核酸轉形(transform)到細胞內的傳統方法包含脂質介導的轉形；以聚-L-離胺酸、樹枝狀聚合物或聚乙烯亞胺等聚合型DNA結合陽離子進行的轉染(transfection)；電穿孔；磷酸鈣轉形以及病毒介導的轉染。然而，該些方法皆受限於低功效、細胞毒性、核酸大小的上限及/或於哺乳動物產生的不良反應。
因此，相關領域亟需一種改良型的載體胜肽，其相較於現有技術，在儲存過程中具有熱穩定性且具備更高的效率。
本揭示內容提供一種用以將核酸等活性劑遞送到宿主細胞內的新穎合成胜肽，以及其於治療及/或預防疾病(例如，由嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)造成之感染)的用途。
在一態樣中，本揭示內容提供了一種用以遞送標的蛋白之核酸的合成胜肽。所述合成胜肽具有式(I)的結構： 其中， X是一半胱胺酸(cysteine, C)的穩定殘基(stabilizing residue)； EED是一內小體脫離域(endosomal escaping domain)，其係由5個連續重複的組胺酸(histidine, H)殘基所組成；以及 CPD是一陽離子胜肽域(cationic peptide domain)，其胺基酸序列與序列編號：1或2具有至少90%的序列相似度。
依據本揭示內容較佳的實施方式，所述合成胜肽具有序列編號：3的胺基酸序列。
依據其他的實施方式，所述合成胜肽具有序列編號：4的胺基酸序列。
此外或任選地，所述合成胜肽的N端為乙醯化(acetylated)，且C端為醯胺化(amidated)。
在另一態樣中，本揭示內容提供了一種用以在一宿主細胞中表現外源性蛋白的方法；該方法包含： (a) 將本發明合成胜肽與一用以編碼該外源性蛋白的核酸以50:1到1:1的重量比混合，以形成一混合物； (b) 以氧氣對步驟(a)的混合物進行充氣(aerating)，以形成一複合體；以及 (c) 培養步驟(b)之複合體與宿主細胞，使宿主細胞表現外源性蛋白於其中。
依據本揭示內容較佳的實施方式，在步驟(a)中，所述合成胜肽與核酸是以20:1的重量比混合；且在步驟(b)中，於室溫以氧氣對混合物充氣16小時。
依據本揭示內容的實施方式，所述核酸是雙股DNA (double strand DNA, dsDNA)、單股DNA (single strand DNA, ssDNA)、小干擾RNA (small interference RNA, siRNA)、短髮夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)、傳訊 RNA (messenger RNA, mRNA)、微型RNA (micro RNA, miRNA)、轉送 RNA (transfer RNA, tRNA)或其組合。在某些實施例中，所述核酸是一用以編碼SARS-CoV-2棘蛋白(spike protein)之受體結合域(receptor binding domain, RBD)的dsDNA。在其他實施例中，所述核酸是一用以編碼SARS-CoV-2棘蛋白之RBD的mRNA。
依據本揭示內容的實施方式，宿主細胞是一抗原呈現細胞。例示性的抗原呈現細胞包含，但不限於：肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage)、腹腔巨噬細胞(peritoneal macrophage)、脾臟巨噬細胞(splenic macrophage)、單核球(monocyte)及樹突細胞(dendritic cell)。依據本揭示內容較佳的實施方式，宿主細胞是一樹突細胞，其可以是蘭格漢氏細胞(Langerhans cell)、未成熟的樹突細胞(immature dendritic cell)或是成熟的樹突細胞(mature dendritic cell)。
本揭示內容的另一態樣是關於一種由本發明合成胜肽與一標的蛋白之核酸形成的複合體，其可用以轉形細胞，使細胞表現標的蛋白於其中。
依據本揭示內容的實施方式，由本發明合成胜肽及標的蛋白之核酸形成的複合體是由一方法所製備，該方法包含：(i) 將合成胜肽與標的蛋白之核酸以50:1到1:1的重量比混合，以形成一混合物；以及(ii) 以氧氣對步驟(i)的混合物進行充氣，以形成複合體。
依據本揭示內容的實施方式，所述核酸是雙股DNA (dsDNA)、單股DNA (ssDNA)、小干擾RNA (siRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、傳訊 RNA (mRNA)、微型RNA (miRNA)、轉送 RNA (tRNA)或其組合。在某些實施例中，所述核酸是一用以編碼SARS-CoV-2棘蛋白之RBD的dsDNA。在其他實施例中，所述核酸是一用以編碼SARS-CoV-2棘蛋白之RBD的mRNA。
依據本揭示內容的實施方式，在步驟(i)中，本發明合成胜肽與核酸是以20:1的重量比混合；且在步驟(ii)中，以氧氣對混合物充氣16小時。
依據本揭示內容的實施方式，由本發明方法形成的複合體於25°C、4°C或-20°C至少穩定14天。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
1. 定義
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
在本揭示內容中，「表現」(express或expression)一詞是指一種將多核苷酸轉錄為mRNA，並將mRNA轉譯為胜肽、多肽或蛋白的過程。若多核苷酸是源自一適當之真核宿主的基因組DNA，表現可包含mRNA的剪切(splicing)反應。表現所需的控制元件包含用以與RNA聚合酶結合的啟動子序列，以及用以與核醣體結合的轉錄起始序列。舉例來說，細菌表現載體包含一啟動子(例如，lac啟動子)，以及作為轉錄起始的Shine-Dalgarno序列與起始密碼子AUG。相似地，真核表現載體包含一用以與RNA聚合酶結合II的異源或同源啟動子、一下游的多腺苷酸化訊號(polyadenylation signal)、一起始密碼子AUG，以及一用於與核醣體分離的終止密碼子。該些載體可為商業化產品，或是由本發明所屬技術領域所知方法的序列重組而得，舉例來說，本揭示內容用以建構載體之方法。
在本揭示內容中，「胜肽」(peptide)一詞是指一胺基酸殘基的聚合物。「合成胜肽」(synthetic peptide)在此是指一胜肽，其不包含存在於自然界之完整蛋白質分子。此種胜肽之所以是「合成的」，表示其乃是由人類利用技術手段所得，譬如化學合成、重組遺傳技術或將整個抗原切段。本揭示內容的合成胜肽是指一聚合物，其係由8到40個、較佳10到35個、更佳12到30個、最佳13個26個胺基酸殘基、胺基酸類似物、擬肽(peptidomimetics)或其組合所組成。合成胜肽中的胺基酸殘基可以肽鍵或其他鍵結(例如，酯、醚等)相互連接。在本揭示內容中，多肽中胺基酸殘基的位置是由多肽的N端開始編號。除非特定指明為特定異構體，否則當未明確闡述胺基酸為D-或L-胺基酸時，所述胺基酸可以是L-胺基酸，或可以是D-或L-胺基酸。「D-胺基酸」(D-amino acid)及「L-胺基酸」(L-amino acid)是指胺基酸的絕對構型，而非平面偏光旋轉的特定方向。
本揭示內容及請求保護之發明概念亦包含蛋白/胜肽之胺基酸序列的微小變異，其中胺基酸序列的變異維持至少70%序列相似度，例如至少70%、71%、72%、73%、75%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相似度。可藉由特定修飾來改變本發明合成胜肽的特性，而不影響其生理活性。舉例來說，可改變及／或刪除某些胺基酸而不影響本發明胜肽的活性(即，介導核酸等活性劑遞送至宿主細胞的能力)。特別是，保留性胺基酸取代亦包含於其中。保留性取代為具有相似／相關側鏈之胺基酸間的相互取代。一般來說，由基因編碼的胺基酸可分為四大類：(1) 酸性胺基酸，即天門冬胺酸(aspartate)、麩胺酸(glutamate)；(2)鹼性胺基酸，即離胺酸(lysine)、精胺酸(arginine)、組胺酸(histidine)；(3)非極性胺基酸，即丙胺酸(alanine)、纈胺酸(valine)、白胺酸(leucine)、異白胺酸(isoleucine)、脯胺酸(proline)、苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)、色胺酸(tryptophan)；以及(4)非帶電極性胺基酸，即甘胺酸(glycine)、天門冬醯胺(asparagine)、麩醯胺酸(glutamine)、半胱胺酸(cysteine)、絲胺酸(serine)、蘇胺酸(threonine)、酪胺酸(tyrosine)。較佳的分類是：絲胺酸及蘇胺酸係屬脂肪羥基(aliphatic-hydroxy)類；天冬醯胺酸及麩醯胺係屬含醯胺(amide-containing)類；丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸係屬脂肪類；而苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸則屬芳香(aromatic)類。舉例來說，當可想見若以異白胺酸或纈胺酸取代白胺酸、以麩胺酸取代天門冬胺酸、以絲胺酸取代蘇胺酸，或是以一結構相似的胺基酸取代另一胺基酸時，並不會造成分子結合或蛋白特性的顯著改變，特別是當該取代位置不是位於框架區域時，胺基酸之間的取代更不會影響上述特性。可藉由檢測胜肽衍生物之特定活性來瞭解一胺基酸的改變是否可形成一具功能性的胜肽。可利用本發明所屬技術領域具有通常知識者所知的方法來製備蛋白/胜肽的片段或類似物。
「相似度」(identical)或「相似度百分比」(percent identity)在本揭示內容是指當比對或排列以產生最大對應時，二或多條序列或次序列相同或具有特定百分比的相同胺基酸殘基。在決定相似度百分比時，可並排序列以進行最佳比對(例如，可於第一胺基酸序列的序列中引入間隙，以與第二胺基酸序列進行最佳排列)。接著比對對應胺基酸位置的胺基酸殘基。當位於第一序列之一位置的胺基酸殘基與第二序列之對應位置的胺基酸殘基相同時，則該位置的分子相同。二條序列之間的百分比相似度是序列共享相同位置之數目的函數(即，%相似度=相同位置數/位置總數(例如，重疊位置)×100)。在某些實施方式中，二條序列具有相同的長度。
「內小體脫離域」(endosomal escaping domain, EED)一詞是指一胺基酸序列，其可幫助一巨分子(例如，核酸、胜肽/DNA複合體等)以無細胞毒性的方式由內小體(endosome)脫離至細胞質中。為達本揭示內容之目的，本發明合成胜肽的EED可幫助一運送至內小體的核酸運送至宿主細胞的細胞質中，據以防止運送的核酸進行內溶性消化。
「陽離子胜肽域」(cationic peptide domain, CPD)一詞是指一具有一或多個鹼性胺基酸殘基(例如，離胺酸及精胺酸)的胺基酸序列，進而在特定條件下(例如，pH ＜ 7.0)產生淨正電荷。為達本揭示內容之目的，本發明合成胜肽的CPD可幫助一巨分子(例如，核酸)的結合。
「抗原呈現細胞」(antigen presenting cell, APC)是指一種可以抗原-MHC複合體形式呈現一或多種抗原的細胞，其中該抗原-MHC複合體可為免疫系統中特定的作用細胞所辨識，進而誘發對抗呈現抗原的有效細胞免疫反應。雖然許多類型的細胞皆可於細胞表面呈現抗原以供T細胞辨識，唯有樹突細胞具有呈現有效量之抗原，並進一步活化初始T細胞以產生毒殺型T淋巴球(cytotoxic T-lymphocyte, CTL)反應的能力。例示性的APC包含，但不限於：巨噬細胞、B細胞及樹突細胞，例如未成熟的樹突細胞、成熟的樹突細胞及蘭格漢氏細胞。
「宿主細胞」(host cell)一詞包含任一種單細胞、多細胞、細胞培養或生物體中的細胞，其可以是或已經是以本發明胜肽/核酸複合體轉染的受體。其亦包含單一個細胞的子代，且基於自然、意外或刻意的突變，該子代不必然與原始親代細胞完全相同(形態上或是基因組或總DNA互補上)。細胞可以是原核或真核細胞、活體外或活體外細胞，其包含，但不限於：細菌細胞、酵母菌細胞、動物細胞及包含人類細胞等哺乳動物細胞。較佳地，宿主細胞是一抗原呈現細胞；更佳為一樹突細胞。
「樹突細胞」(dendritic cell, DC)一詞是指在一群可在各種淋巴及非淋巴組織中發現之形態相似的細胞類型。樹突細胞為生物體中最具潛力及較佳的APC。樹突細胞可與單核球有所區別，二者具有不同的表型。舉例來說，CD-14抗原是一種特定的分化標記，僅存在於單核球，而不會表現於樹突細胞。此外，成熟的樹突細胞不具吞噬性，而單核球則具有很強的吞噬活性。已知成熟的DC可提供T細胞活化及增生所有必要的訊號。
2. 本發明合成胜肽
本揭示內容至少部分是基於發明人發現一種新穎的合成胜肽，其可將核酸轉染至細胞，據以使細胞表現核酸。
本發明合成胜肽具有式(I)的結構： 其中， X是一半胱胺酸的穩定殘基； EED是一內小體脫離域，其係由5個連續重複的組胺酸殘基所組成；以及 CPD是一陽離子胜肽域，其胺基酸序列與NGERSGARSKQRRP (序列編號：1)或SKKPRQKRTATKA (序列編號：2)具有至少70%的序列相似度。
依據本揭示內容較佳的實施方式，所述合成胜肽具有CHHHHHNGERSGARSKQRRPHHHHHC (序列編號：3)的胺基酸序列。
依據其他的實施方式，所述合成胜肽具有CHHHHHSKKPRQKRTATKAHHHHHC (序列編號：4)的胺基酸序列。
可依據本發明所屬技術領域任一種標準胜肽合成流程來合成本發明合成胜肽。在一實施方式中，本發明合成胜肽是依據使用者操作流程利用固相胜肽合成法製備而得。
或者是，可利用重組技術來製備本發明合成胜肽。舉例來說，習知技藝人士可將一用以編碼本發明胜肽的核酸選殖至一表現載體，其中該核酸係可操作地連接至一調控序列，據以調控本發明胜肽於宿主細胞中表現。習知技藝人士可接著將載體導入一適當的宿主細胞以表現胜肽。可藉由諸如硫酸銨沉澱及分餾管柱層析等方法由宿主細胞純化表現的重組多肽。可依據以下實施例所述之方法來測試製得之胜肽的活性。
可利用本發明所屬技術領域所知的聚合型、生物可降解型微粒或是微膠囊來遞送上述核酸或多核苷酸。亦可藉由標準方法製備的脂質體使宿主攝取核酸。可將多核苷酸單獨併入遞送載體，或是與組織特異性抗體合併使用。亦或是，習知技藝人士可製備由質體或其他載體組成的分子共軛物，其中該質體或載體是藉由靜電或共價力與聚-L-離胺酸連接。或者是，可使用本發明所屬技術領域所知的組織特異性轉錄調控元件來達到組織特異標的之目的。將「裸DNA」 (naked DNA；即，無遞送載體)遞送至肌肉內、皮內或皮下是另一種於活體內表現的方式。
可對本發明合成胜肽的N端或C端進行修飾。例示性的N端修飾包含，但不限於：N-糖化(N-glycated)、N-烷基化(N-alkylated)及N-乙醯化(acetylated)胺基酸。末端修飾可以包含聚乙二醇化(pegylation)。例示性的C端修飾為C端醯胺化胺基酸。或者是，可以非肽鍵連結來取代一或多個肽鍵，或是利用可與特定側鏈或末端殘基反應的試劑來修飾個別的胺基酸基團。
可將不同的官能基加至合成胜肽之易受化學修飾的不同位點。可將官能基加至胜肽的末端。在某些實施方式中，官能基可改善胜肽一或多種特徵的活性，例如改善合成胜肽的穩定性、功效或專一性；改善合成胜肽對細胞膜及/或組織屏障的穿透性；改善組織定位；降低毒性或清除率；以及改善對細胞泵排出的抗性等。例示性之適合的官能基包含，但不限於該些可促進與其吸附之胜肽傳遞至細胞的官能基；舉例來說，藉由降低胜肽的親水性並增加胜肽的親脂性，非必要且較佳地，該些官能基可於細胞內被水解或酵素切割。羥基保護基包含酯、碳酸酯及胺甲酸酯保護基。胺基保護基包含烷氧基及芳氧基羰基(aryloxy carbonyl group)。羧酸保護基包含脂肪族、苯甲基及芳基酯。
「擬肽有機部分」(peptidomimetic organic moiety)可任選地取代(保守或非保守取代)本發明合成胜肽的胺基酸殘基。擬肽有機部分非必要且較佳地具有與被置換之胺基酸相似的空間、電子或構型特性，此類擬肽可用以取代基本位置的胺基酸，並進行保守性置換。擬肽可非必要地抑制由酵素或其他降解反應造成的胜肽降解。擬肽可非必要且較佳地由有機合成法製備而得。例示性之適用擬肽包含，但不限於：醯胺鍵之等價異構物(isosteres of amide bonds)、3-胺基-2-丙二酮-6-羧酸(3-amino-2-propenidone-6-carboxylic acid)、羥基-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-羧酸鹽(hydroxyl-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-carboxylate)，以及組胺酸異喹啉羧酸(histidine isoquinolone carboxylic acid)。
可非必要地對合成胜肽的任一部分進行化學修飾，舉例來說，加入官能基。非必要地，可在合成本發明胜肽時對胜肽進行修飾。例示性之修飾形式包含，但不限於：羧甲基化、醯化、磷酸化、醣化或脂肪醯化。
3. 胜肽介導的核酸遞送
本發明合成胜肽可於活體外或活體內將核酸遞送至細胞質或細胞特定的胞器(例如，細胞核)中。因此，本揭示內容提供一種用以使宿主細胞表現外源性標的蛋白的方法。本發明方法包含： (a) 將本發明合成胜肽與一用以編碼外源性蛋白的核酸以50:1到1:1的重量比混合，以形成一混合物； (b) 以氧氣對步驟(a)的混合物進行充氣，以形成本發明合成胜肽與核酸的複合體；以及 (c) 培養步驟(b)之複合體與宿主細胞，使宿主細胞表現外源性蛋白於其中。
依據本揭示內容的實施方式，所述核酸可以是雙股DNA (dsDNA)、單股DNA (ssDNA)、小干擾RNA (siRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、傳訊 RNA (mRNA)、微型RNA (miRNA)、轉送 RNA (tRNA)或其組合。
可由一或多種細胞或病原體萃取核酸，或是利用常規分子技術於活體外製備核酸。可利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)及活體外轉錄反應來擴增核酸。該些方法為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所知的技術。在某些實施例中，所述核酸是由SARS-CoV-2分離的dsDNA，且用以編碼SARS-CoV-2之棘蛋白的RBD。在其他實施例中，所述核酸是由SARS-CoV-2分離的mRNA，且用以編碼SARS-CoV-2之棘蛋白的RBD。
本發明方法首先將本發明合成胜肽與核酸(例如，用以編碼SARS-CoV-2棘蛋白之RBD的dsDNA或mRNA)以50:1到1:1的重量比混合，以形成混合物(步驟(a))，例如50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1的重量比；較佳地，重量比為20:1。
接著，以氧氣對步驟(a)的混合物進行充氣，直到本發明合成胜肽與核酸彼此共價連接形成一共價胜肽/核酸複合體(步驟(b))。充氣反應可於室溫進行10到24小時，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時；較佳地，16小時。
之後，使共價胜肽/核酸複合體與宿主細胞接觸足夠的時間，直到核酸轉入到宿主細胞的細胞質或細胞核，並表現由核酸編碼的外源性標的蛋白(步驟(c))。
本揭示內容的胜肽/核酸複合體可用以轉形任何種類的細胞，包含原核及真核細胞、培養的細胞、組織切片中的細胞，或是人類等動物體內的細胞。在一較佳的實施方式中，細胞是真核細胞。例示性之適用於本發明方法的細胞包含，但不限於：肝細胞、上皮細胞、造血細胞、內皮細胞、巨噬細胞、樹突細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉幹細胞、神經細胞、心肌細胞、脂肪細胞、血管平滑肌細胞、骨骼肌細胞、B細胞、T細胞、白血球、顆粒性白血球、纖維母細胞及網狀紅血球等。
依據本揭示內容的實施方式，所述宿主細胞是抗原呈現細胞。例示性的抗原呈現細胞包含，但不限於：肺泡巨噬細胞、腹腔巨噬細胞、脾臟巨噬細胞、單核球及樹突細胞。依據本揭示內容較佳的實施方式，所述宿主細胞是樹突細胞。樹突細胞源自骨髓前驅細胞，在周邊血液中少量循環，且以未成熟的蘭格漢氏細胞或是最終分化的成熟細胞存在。樹突細胞亦可由單核球分化而得。用以分離抗原呈現細胞、樹突前驅細胞及/或成熟樹突細胞的方法為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的技術。
可利用任一種本發明所屬技術領域所知的方法來偵測表現於宿主細胞(例如，樹突細胞)中的外源性標的蛋白，例如放射性免疫分析法、酵素免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、三明治免疫分析法、免疫放射量測定、原位免疫分析法(例如，以膠態金、酵素或放射性同位素標記)、西方墨點分析、免疫沉澱法、免疫螢光分析或PAGE-SDS。依據本揭示內容較佳的實施方式，是利用ELISA來偵測表現的標的蛋白(例如，SARS-CoV-2棘蛋白的RBD)。
4. 用以遞送核酸的脂質奈米顆粒
本揭示內容第2部分所述之合成胜肽亦可用以建構一種胜肽修飾的脂質奈米顆粒，以於活體外或活體內遞送核酸。
為達本發明目的，脂質奈米顆粒結構上包含一親水核、一由膽固醇及一或多種磷脂質(任選地以聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修飾)形成的脂質雙層殼，以及與PEG修飾之磷脂質連接的本發明合成胜肽(例如，序列編號：3)；其中，與合成胜肽連接的PEG修飾磷脂質是以合成胜肽及PEG皆分佈於親水核內及/或脂質雙殼層外的方式排列。較佳地，脂質奈米顆粒更包含核酸，其係包覆於本發明脂質奈米顆粒之親水核中。
例示性之適用於形成本發明胜肽修飾脂質奈米顆粒之脂質雙層殼的磷脂質包含，但不限於：磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)、卵磷脂(phosphatidylcholine, PC)、磷脂醯絲胺酸(phosphatidylserine, PS)、二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE)、二油醯基磷脂醯膽鹼(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(distearoylphosphatidylcholine, DSPC)、1,2-二油醯基-3-三甲基氯化銨(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane, DOTAP)、1,2-二硬脂醯基-3-三甲基氯化銨(1,2-distearoyl-3-trimethylammonium propane, DSTAP)、1,2-二肉荳蔻醯甘油(1,2-dimyristoyl glycerol, DMG)、神經醯胺磷酸膽鹼(ceramide phosphorylcholine)、神經醯胺磷酸乙醇胺(ceramide phosphorylethanolamine)，以及神經醯胺磷脂(ceramide phosphoryllipid)。
依據本揭示內容的實施方式，所述磷脂質可任選地以一PEG分子修飾。聚乙二醇(PEG)在本揭示內容是指環氧乙烷(ethylene oxide)的寡聚物及/或聚合物，且一般是指分子量低於20,000 公克/莫耳的寡聚物及/或聚合物(例如，PEG 400、PEG 2000等)。本發明使用PEG分子的目的在於防止聚集，以及延長本發明合成胜肽及由其形成之奈米顆粒的半衰期。在一較佳的實施方式中，本發明胜肽修飾之脂質奈米顆粒的脂質雙層殼是由磷脂質(例如，DSPC)、PEG修飾之磷脂質(例如，DMG-PEG 2000)及膽固醇以118: 3: 77的莫耳比所形成。
依據本揭示內容的實施方式，為製備本發明胜肽修飾的脂質奈米顆粒，先將合成胜肽(例如，序列編號：3)與PEG修飾之磷脂質(例如，DSPE-PEG 2000)鍵結，以形成一聚乙二醇化胜肽；接著將聚乙二醇化胜肽與膽固醇、磷脂質(例如，DSPC)及PEG修飾的磷脂質(例如，DMG-PEG 2000)混合於酒精溶液(例如，乙醇)中；於醋酸鈉溶液(pH 4.5)中重組DNA或RNA；將混合物置於奈米混合器(例如，Precision NanoSystems Ignite microfluidic system, San Jose, CA, USA)中，以製備本發明胜肽修飾的脂質奈米顆粒。亦或是，可利用任一種本發明所屬技術領域所知的常規技術來製備本發明胜肽修飾的脂質奈米顆粒。
本發明胜肽修飾的脂質奈米顆粒可吸引、捕捉或扣住帶負電荷的核酸，進而在特定pH值下使胜肽修飾的脂質奈米顆粒轉變為可包覆及裝載核酸的載體。依據本揭示內容的實施方式，胜肽修飾的脂質奈米顆粒可吸收或內化帶負電荷的核酸，例如將帶負電荷的核酸保留於其外表面，或是將整個帶負電荷的核酸包覆於其內部空間中。
例示性之適合為本發明胜肽修飾之脂質奈米顆粒吸收的核酸包含，但不限於：雙股DNA (dsDNA)、單股DNA (ssDNA)、小干擾RNA (siRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、傳訊 RNA (mRNA)、微型RNA (miRNA)、轉送 RNA (tRNA)及其組合。依據本揭示內容的實施方式，核酸為蛋白的mRNA (例如，病毒蛋白的mRNA)。在一較佳的實施方式中，本揭示內容之胜肽修飾的脂質奈米顆粒是用以裝載一或多種病毒蛋白(例如，SARS-CoV-2棘蛋白之RBD)的mRNA。
因此，本揭示內容亦提供用以將核酸(例如，SARS-CoV-2的dsDNA或mRNA)細胞內遞送至標的細胞以製備治療等級之標的蛋白(例如，SARS-CoV-2棘蛋白之RBD)的組合物及方法。
在本揭示內容中，「個體」(subject)一詞是指可接受本揭示內容之組合物及方法投予的動物，其包含，但不限於人類、非人類靈長類動物及囓齒動物等。一般來說，「個體」(subject)一詞在本揭示內容是指人類個體。
本揭示內容的組合物包含本發明胜肽修飾的脂質奈米顆粒，其預載有欲於標的細胞表現的核酸(例如，SARS-CoV-2棘蛋白之RBD的dsDNA或mRNA)；以及一或多種可促使標的細胞接觸及後續轉染的試劑。較佳地，本發明胜肽修飾的脂質奈米顆粒可使包覆的核酸到達標的細胞，並轉染標的細胞。因此，於遞送後，核酸可於標的細胞內編碼一或多種標的蛋白。本發明組合物及方法可用以標的大量類型的細胞，其包含，但不限於：肝細胞、上皮細胞、造血細胞、內皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、巨噬細胞、間葉幹細胞、神經細胞、心肌細胞、脂肪細胞、樹突細胞、血管平滑肌細胞、骨骼肌細胞、B細胞、T細胞、白血球、顆粒性白血球、纖維母細胞及網狀紅血球等等。依據本揭示內容的實施方式，預載有核酸之胜肽修飾的脂質奈米顆粒可成功為樹突細胞所吸收，接著轉染樹突細胞使其表現由核酸(例如，SARS-CoV-2之棘蛋白的mRNA)編碼的蛋白(例如，SARS-CoV-2之棘蛋白)。在某些實施方式中，欲表現之蛋白的表現量高於對照組的表現量(即，未經本發明胜肽修飾的脂質奈米顆粒處理之細胞的基礎表現量)。依據本揭示內容的實施方式，欲表現之蛋白於標的細胞(例如，樹突細胞)的表現量高於對照組的表現量至少1到100,000倍，舉例來說，高於對照組的表現量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、55、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000倍；較佳地，高於對照組的表現量至少5到50,000倍，舉例來說，高於對照組的表現量5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、55、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000倍；更佳地，高於對照組的表現量至少10到10,000倍，舉例來說，高於對照組的表現量10、20、30、40、50、55、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000倍。在某些實施方式中，在持續一段時間後仍可偵測到欲表現之蛋白的表現量，例如1天、2天、3天、4天、5天、1週或更久。
本揭示內容因此亦關於用以遞送核酸以治療或預防一個體之疾病的組合物及方法。具體來說，本發明組合物及方法是將病毒之核酸遞送至個體體內，其中組合物包含預載有病毒核酸之本發明胜肽修飾的脂質奈米顆粒，而方法則包含將一有效量之組合物投予至個體的標的組織，據以將包覆的病毒核酸遞送至標的組織(例如，肺臟及肝臟等)。遞送後，由病毒核酸編碼的病毒蛋白會於標的組織中進行表現，並作為抗原以誘發個體產生免疫反應，進而保護個體避免受到病毒感染及/或產生因病毒感染造成的疾病 (例如，嚴重急性呼吸症候群(severe acute respiratory syndrome, SARS))。
此外或非必要地，本揭示內容的組合物可與一或多種額外的載體、賦形劑或穩定劑共同配製。可依據當下的醫療操作、個體的臨床狀況、投予的部分和方法、投予的療程、個體的年齡、性別、體重及其他臨床相關因素來調整本揭示內容之組合物的投予及劑量。可依據臨床研究、藥學、臨床及醫藥領域之通常知識者所知的相關因素來決定本揭示內容欲達成目的之有效量。在某些實施方式中，投予量可一定程度地穩定、改善或消除疾病的症狀，或預防疾病的進展。舉例來說，適當的劑量及投藥療程至少會造成暫時性的蛋白質表現。
適當的投予路徑，舉例來說，包含口腔、直腸、陰道、黏膜、肺部(例如，氣管內或吸入等)或小腸內投予；腸胃外的投予包含肌肉內、皮下、髓內注射，以及鞘內、直接腦室內、靜脈內、腹腔內、鼻內或眼內注射。
或者是，可局部性而非全身性地投予本揭示內容的組合物，舉例來說，將組合物直接注射到標的組織。依據標的組織的不同，局部遞送可能會有不同的投予形式。舉例來說，包含本發明組合物的噴霧劑可藉由吸入(鼻腔、氣管或支氣管遞送)方式投予至個體；可將本揭示內容的組合物注射到疾病或疼痛位置。此外，可將組合物製備為口腔、氣管或食道投予的錠劑；或是製備為液體、片劑或膠囊的形式投予至胃或腸；或是可使用乳膏、滴劑或注射劑投予至眼部。
在某些實施方式中，本揭示內容的組合物是配製為可延長包覆其中之核酸的釋放時間。此種延長釋放的組合物可以延長個體的給藥間隔。舉例來說，可對個體每日投予一次、每日投予二次或每二天投予一次本揭示內容的組合物。在某些實施較佳的方式中，是對個體每週投予一次、每週投予二次、每10天投予一次、每二週投予一次、每三週投予一次、每四週投予一次、每個月投予一次、每六週投予一次、每八週投予一次、每二個月投予一次、每三個月投予一次、每四個月投予一次、每六個月投予一次、每八個月投予一次、每九個月投予一次或是每年投予一次本發明組合物。本揭示內容亦涵蓋可配製為積貯投予(depot administration；例如，肌肉內或皮下等)的組合物，以延長遞送或釋放核酸的時間。
本揭示內容亦關於冷凍乾燥的組合物，其包含一或多個本揭示內容所述之胜肽修飾的脂質奈米顆粒。本揭示內容之冷凍乾燥組合物可於投予前重組(reconstituted)或於活體內重組。舉例來說，一種冷凍乾燥組合物可配置為適當的劑型(例如，紙錠、桿狀或膜狀的皮內劑型)，其可隨著時間藉由個體的體液逐漸液化。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。
實施例
材料及方法
合成胜肽
以Fmoc SPPS利用CEM Liberty自動化微波胜肽合成儀來製備胜肽P1、P2及其個別的突變P1-1到P1-6與P2-1，其中各胜肽的NH 2末端具有乙醯化修飾，且COOH末端具有醯胺化修飾，據以改善其穩定性；之後以質譜儀來確認分析各胜肽(純度＞95%)。表1總結合成胜肽的胺基酸序列。
表1.  合成胜肽的胺基酸序列
胜 肽名稱 胺基酸序列 a 序列編號
P1 (C5HNTD 29-42C5H) CHHHHH NGERSGARSKQRRPHHHHHC 3
Tat-CPD (常規的CPD域Tat) CHHHHH RKKRRQRRRRHHHHHC 10
P1-1 (無EED及半胱胺酸的P1) NGERSGARSKQRRP 1
P1-2 (無N端半胱胺酸的P1) HHHHH NGERSGARSKQRRPHHHHH 5
P1-3 (無C端半胱胺酸的P1) CHHHHH NGERSGARSKQRRPHHHHH 6
P1-4 (無N端EED及半胱胺酸的P1) NGERSGARSKQRRPHHHHHC 7
P1-5 (無C端EED及半胱胺酸的P1) CHHHHH RKKRRQRRRR 8
P1-6 (於CDP區域具有不同正電荷胺基酸的P1) CHHHHH NGEKSGAKSRQKKPHHHHHC 9
P2 (C5HDD 255-267C5H) CHHHHH SKKPRQKRTATKAHHHHHC 4
P2-1 (無EED及半胱胺酸的P2) SKKPRQKRTATKA 2
a：粗體標示為陽離子胜肽域(cationic peptide domain, CPD)。
形成胜肽 -DNA 複合體
將質體DNA與胜肽以1:20 (w/w)的比例於25°C混合10分鐘。進一步將混合物與氧氣於25°C在250 rpm的振盪培養箱中反應16小時，以產生穩定的複合體。
實施例 1 本發明合成胜肽介導 293T 細胞表現蛋白
依「材料及方法」所述流程製備合成胜肽後，利用合成胜肽將用以編碼綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)或SARS-CoV-2棘蛋白之受體結合域的核酸轉染至293T細胞。
1.1 綠色螢光蛋白 (GFP)
將用以編碼GFP的DNA與表1列示之各合成胜肽以1:20 (w/w)的比例於25°C混合10分鐘。進一步將混合物與氧氣於25°C在250 rpm的振盪培養箱中反應16小時，以產生穩定的胜肽/DNA複合體。之後，將形成的胜肽/DNA複合體加至附著的293T細胞(3 x 10 4細胞)，並於37°C培養48小時。以螢光顯微鏡捕捉細胞的影像，表2總結定量結果。
表2.  本發明合成胜肽/DNA複合體於遞送編碼GFP之DNA的效率
胜 肽名稱 胺基酸序列 a 序列編號 GFP 表現
P1 (C5HNTD 29-42C5H) CHHHHH NGERSGARSKQRRPHHHHHC 3 +++
Tat-CPD (常規的細胞穿透胜肽Tat在CPD域中) CHHHHH RKKRRQRRRRHHHHHC 10 +
P1-1 (無EED及半胱胺酸的P1) NGERSGARSKQRRP 1 -
P1-2 (無N端半胱胺酸的P1) HHHHH NGERSGARSKQRRPHHHHH 5 -
P1-3 (無C端半胱胺酸的P1) CHHHHH NGERSGARSKQRRPHHHHH 6 -
P1-4 (無N端EED及半胱胺酸的P1) NGERSGARSKQRRPHHHHHC 7 -
P1-5 (無C端EED及半胱胺酸的P1) CHHHHH RKKRRQRRRR 8 -
P1-6 (於CDP區域具有不同正電荷胺基酸的P1) CHHHHH NGEKSGAKSRQKKPHHHHHC 9 +
P2 (C5HDD 255-267C5H) CHHHHH SKKPRQKRTATKAHHHHHC 4 ++
P2-1 (無EED及半胱胺酸的P2) SKKPRQKRTATKA 2 -
可於以P1胜肽/DNA複合體或P2胜肽/DNA複合體轉染的細胞觀察到綠色螢光，其中P1胜肽對編碼GFP之DNA的轉染效率最佳(表2)。此外， P1胜肽對編碼GFP之DNA的轉染效率優於CPD域為常規細胞穿透胜肽Tat對編碼GFP之DNA的轉染效率，暗示CPD域對於DNA遞送的不可或缺性(表2)。此外，具有內小體脫離域(EED)或半胱胺酸殘基缺失，或是CPD正電荷胺基酸殘基數量置換的P1突變體會喪失其遞送編碼GFP之DNA的能力(表2)。相似的結果亦可見於P2突變體。
整體來說，該些結果指出CPD中胺基酸的組合對DNA遞送相當重要。
1.2 SARS-CoV-2 棘 蛋白的受體結合域 (RBD)
將用以編碼SARS-CoV-2棘蛋白之RBD的DNA與P1 (序列編號：3)或P2 (序列編號：4)胜肽混合，以形成對應的胜肽/DNA複合體，接著依據實施例1.1所述之流程轉染附著的293T細胞。收集轉染293T細胞的上清液後，以ELISA來決定SARS-CoV-2棘蛋白之RBD的表現量。
結果顯示，在以P1/DNA複合體轉染的細胞中，SARS-CoV-2棘蛋白之RBD的表現量約為每毫升2,021奈克，而P2/DNA複合體轉染細胞之RBD的表現量則可忽略不計。
實施例 2 本發明胜肽 -DNA 複合體的儲存穩定性
本實施例將分析本發明胜肽-DNA複合體的儲存穩定性。據此，依據「材料及方法」所述流程，混合實施例1的P1胜肽及野生型RBD DNA，以形成P1胜肽-RBD DNA複合體。接著將得到的複合體與95%蔗糖混合，並於-20°C、4°C或25°C儲存7或14天，之後以ELSA來分析RBD的細胞表現量。表3總結分析結果。
表3.  以儲存於不同條件之P1胜肽-RBD複合體轉染細胞後RBD的表現量
RBD (奈克/毫升)
     溫度 (°C) 時間(天) -20°C 4°C 25°C
0 1,707
7天 1,976 2,590 1,807
0 1,241
14天 2,745 2,512 1,837
結果顯示，在將P1胜肽-RBD DNA複合體儲存於-20°C、4°C或25°C長達14天後，仍可成功偵測到RBD的表現。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
無
TW202332468A_112102803_SEQL.xml

Claims (17)

  1. 一種具有式(I)結構的合成胜肽： 其中， X是一半胱胺酸的穩定殘基； EED是一內小體脫離域，其係由5個連續重複的組胺酸殘基所組成；以及 CPD是一陽離子胜肽域，其胺基酸序列與序列編號：1或2具有至少90%的序列相似度。
  2. 如請求項1所述之合成胜肽，其中該合成胜肽的N端為乙醯化，且C端為醯胺化。
  3. 一種胜肽-核酸複合體，其中該胜肽-核酸複合體是由一方法所形成，該方法包含： (i) 將請求項1所述之合成胜肽與一核酸以50:1到1:1的重量比混合，以形成一混合物；以及 (ii)  以氧氣對步驟(i)的混合物進行充氣，以形成該胜肽-核酸複合體。
  4. 如請求項4所述之胜肽-核酸複合體，其中在步驟(i)中，請求項1所述之合成胜肽與該核酸是以20:1的重量比混合。
  5. 如請求項4所述之胜肽-核酸複合體，其中在步驟(ii)中，以該氧氣對該混合物充氣16小時。
  6. 如請求項3所述之胜肽-核酸複合體，其中該核酸是雙股DNA (double strand DNA, dsDNA)、單股DNA (single strand DNA, ssDNA)、小干擾RNA (small interference RNA, siRNA)、短髮夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)、傳訊 RNA (messenger RNA, mRNA)、微型RNA (micro RNA, miRNA)、轉送 RNA (transfer RNA, tRNA)或其組合。
  7. 如請求項6所述之胜肽-核酸複合體，其中該核酸用以編碼SARS-CoV-2之棘蛋白的受體結合域。
  8. 如請求項4所述之胜肽-核酸複合體，其中該複合體在25°C、4°C或-20°C至少穩定7天。
  9. 如請求項8所述之胜肽-核酸複合體，其中該複合體在25°C、4°C或-20°C至少穩定14天。
  10. 一種用以在一宿主細胞中表現一外源性蛋白的方法，包含： (a) 將請求項1所述之合成胜肽與一用以編碼該外源性蛋白的核酸以50:1到1:1的重量比混合，以形成一混合物； (b) 以氧氣對步驟(a)的混合物進行充氣，以形成請求項1所述之合成胜肽與該核酸的複合體；以及 (c) 培養步驟(b)之複合體與該宿主細胞，使該宿主細胞表現外源性蛋白於其中。
  11. 如請求項10所述之方法，其中在步驟(a)中，請求項1所述之合成胜肽與該核酸是以20:1的重量比混合。
  12. 如請求項11所述之方法，其中在步驟(ii)中，以該氧氣對該混合物充氣16小時。
  13. 如請求項10所述之方法，其中該核酸是雙股DNA (double strand DNA, dsDNA)、單股DNA (single strand DNA, ssDNA)、小干擾RNA (small interference RNA, siRNA)、短髮夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)、傳訊 RNA (messenger RNA, mRNA)、微型RNA (micro RNA, miRNA)、轉送 RNA (transfer RNA, tRNA)或其組合。
  14. 如請求項13所述之方法，其中該核酸用以編碼SARS-CoV-2之棘蛋白的受體結合域。
  15. 如請求項10所述之方法，其中該宿主細胞是一抗原呈現細胞。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該抗原呈現細胞是選自由肺泡巨噬細胞、腹腔巨噬細胞、脾臟巨噬細胞、單核球及樹突細胞所組成的群組。
  17. 如請求項16所述之方法，其中該樹突細胞是蘭格漢氏細胞、未成熟的樹突細胞或成熟的樹突細胞。
TW112102803A 2022-01-27 2023-01-19 胜肽介導的活性劑遞送 TWI845133B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202263303593P 2022-01-27 2022-01-27
US63303593 2022-01-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202332468A true TW202332468A (zh) 2023-08-16
TWI845133B TWI845133B (zh) 2024-06-11

Family

ID=87472295

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW112102803A TWI845133B (zh) 2022-01-27 2023-01-19 胜肽介導的活性劑遞送

Country Status (2)

Country Link
TW (1) TWI845133B (zh)
WO (1) WO2023146791A1 (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1187914B1 (en) * 1999-06-14 2005-05-25 Genentech, Inc. A structured peptide scaffold for displaying turn libraries on phage
WO2016014621A1 (en) * 2014-07-22 2016-01-28 The Regents Of The University Of California Endosomal escape domains for delivery of macromolecules into cells
US20190336608A1 (en) * 2016-06-09 2019-11-07 Curevac Ag Cationic carriers for nucleic acid delivery
EP3787664B1 (en) * 2018-05-03 2024-02-28 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Peptide hydrogels for delivery of immunosuppressive drugs and uses thereof
JP2023526495A (ja) * 2020-05-19 2023-06-21 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン

Also Published As

Publication number Publication date
TWI845133B (zh) 2024-06-11
WO2023146791A1 (en) 2023-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7462592B2 (en) Compositions and methods for polynucleotide delivery
US11382964B2 (en) Core/shell structure platform for immunotherapy
EP2204378B1 (en) A inhibiting agent for inhibition of angiogenesis, a method for preparing the agent, a method for modifying the agent and its use for manufacturing a medicament for treating tumor
CA2394758A1 (en) Histidine-containing copolymers enhance pharmaceutical agent delivery
JP2015500826A (ja) トランスフェリンペプチドを有するエキソソーム
US9399016B2 (en) Materials and complexes for the delivery of biologically-active materials to cells
WO2020097235A1 (en) Mini-nucleosome core proteins and use in nucleic acid delivery
JP2021502380A (ja) ｍＲＮＡを細胞に送達するための改善した脂質−ペプチドナノ複合体製剤
Karim et al. Scope and challenges of nanoparticle-based mRNA delivery in cancer treatment
JP6617930B2 (ja) 細胞質送達ペプチド
CN114540416A (zh) 一种表达载体、脂质纳米粒、抗肿瘤药物及其制备方法和用途
US11793756B2 (en) Anionic nanocomplexes for nucleic acid delivery
WO2023093596A1 (zh) 一种用于有效递送核酸的环状多肽载体及其变化形式
TWI845133B (zh) 胜肽介導的活性劑遞送
US20140050781A1 (en) Use of AGR3 for Treating Cancer
US8653236B2 (en) Therapeutic agents
US20180222957A1 (en) Modified cxcl12 polypeptides and uses thereof
WO2023069971A2 (en) Cd24-loaded vesicles for treatment of cytokine storm and other conditions
JP2001029087A (ja) 細胞内へ有用なアニオン性物質を送達するための複合体
LOONG Multifuctional peptides as biocompatible non-viral vectors for gene delivery