CN114540416A - 一种表达载体、脂质纳米粒、抗肿瘤药物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种表达载体、脂质纳米粒、抗肿瘤药物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制药领域，公开了一种表达载体、脂质纳米粒、抗肿瘤药物及其制备方法和用途。所述表达载体包括肿瘤特异性启动子和蜂毒素基因，所述蜂毒素基因包括SEQID No.1所示序列。本发明还提供了一种脂质纳米粒，所述脂质纳米粒包括所述表达载体和包裹在所述表达载体表面的脂质层。本发明的脂质纳米粒在非肿瘤细胞中不表达蜂毒素，但在肿瘤细胞内能特异性表达蜂毒素，并能靶向肿瘤细胞进行递送，进而通过破坏肿瘤细胞的脂质生物膜结构、诱导肿瘤细胞凋亡等作用发挥抗肿瘤作用，从而实现更好的抗肿瘤治疗效果。本发明的脂质纳米粒具有更低毒、高效的抗肿瘤治疗效果，可广泛应用于抗肿瘤应用。

Description

一种表达载体、脂质纳米粒、抗肿瘤药物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物制药领域，特别是涉及一种表达载体、脂质纳米粒、抗肿瘤药物及其制备方法和用途。
背景技术
蜂毒素是蜜蜂蜂毒的主要活性成分，占蜂毒干重的40～50％，由26个氨基酸残基组成，其中N端含两个α-螺旋结构，C端为含多个碱性氨基酸的阳离子多肽。据报道，蜂毒素具有多种生物学功能，包括具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗炎等作用。特别是由于蜂毒素具有肿瘤细胞凋亡诱导作用和生物膜破坏作用，对黑色素瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌等肿瘤细胞均具有很强的杀伤作用；而对肿瘤细胞膜或细胞器膜结构的破坏导致的肿瘤杀伤作用可以避免肿瘤细胞的耐药性形成，因此在肿瘤治疗领域具有非常大的应用前景。
但蜂毒素在用于肿瘤等疾病的临床治疗中还存在许多问题，除了作为一种多肽药物本身存在的易被降解和清除、缺乏靶向性等问题外，蜂毒素还因为其本身带有的α-螺旋结构而具有对磷脂膜很强的亲和力，极易插入脂质生物膜并致孔，导致细胞内容物外泄，因此游离的蜂毒素具有很强的溶血作用和非特异性细胞毒性，而这种溶血副作用和组织毒性是其走向临床的最主要障碍之一；另外，蜂毒素多肽还因为含多个碱性氨基酸而带多个净正电荷，易与血液或组织中其他蛋白或分子等吸附结合，从而导致低生物利用度并存在潜在的毒性。
基于蜂毒素具有显著的临床应用前景，许多研究人员在尝试用各种方法解决蜂毒素临床应用所面临的溶血作用和非特异性细胞毒性。目前常用的策略包括：一是改变蜂毒素的氨基酸序列或使用PEG及其它分子进行化学修饰；二是使用包括无机纳米颗粒、聚合物纳米颗粒和脂质纳米载体等载荷蜂毒素，以实现降低蜂毒素在体内的毒性并提高对肿瘤组织和细胞的靶向递送能力。虽然这些方法都在一定程度上降低了蜂毒素的毒副作用，但依然还存在着较多的问题，包括化学修饰对蜂毒素活性的影响及仍存在的较强的溶血活性；基于电荷作用载荷蜂毒素的纳米载体系统在生理环境中的稳定性差，存在蜂毒素泄露等问题；而利用脂质载体载荷蜂毒素也存在蜂毒素泄露或蜂毒素脂质体与体内生物膜接触过程中引起的蜂毒素重分布等现象，使其在体内递送过程中依然具有较强毒副作用，无法满足临床应用。
现有技术手段都无法很好解决其在临床应用上所面临的问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种表达载体、脂质纳米粒、抗肿瘤药物及其制备方法和用途。
本发明的第一方面，提供一种表达载体，所述表达载体包括肿瘤特异性启动子和蜂毒素基因，所述蜂毒素基因包括SEQ ID No.1所示序列。
在某些实施方式中，所述肿瘤特异性启动子选自甲胎蛋白(AFP)启动子、癌胚抗原(CEA)启动子、缺氧诱导因子-1(HIF-1)启动子、乳腺癌相关抗原(DF3/MUC1)启动子、人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)启动子和存活素(Survivin)启动子中的一种。
优选地，所述肿瘤特异性启动子为人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子。所述肿瘤特异性启动子包括如SEQ ID No.2所示序列。
在某些实施方式中，所述表达载体为质粒。
优选地，所述表达载体的骨架为pVAX1。
在某些实施方式中，所述表达载体包括如SEQ ID No.3所示序列。
本发明的第二方面，提供一种脂质纳米粒，所述脂质纳米粒包括如上文所述的表达载体和包裹在所述表达载体表面的脂质层，所述脂质层由脂材形成。
在某些实施方式中，所述表达载体含有的N与所述脂材含有的P之间的比例为1：(1～10)。
优选地，所述表达载体含有的N与所述脂材含有的P之间的比例可以为1：(1～5)，也可以为1：(3～8)，也可以为1：(7～10)。在某个优选的实施方式中，为1：3.5。
在某些实施方式中，所述脂材选自阳离子脂质和辅助脂质中的一种或两种。
优选地，所述阳离子脂质选自氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵(DTAB)、溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DORI)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE)、溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HP)、溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HB)、溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HPc)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵(DPRIE)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵(DSRIE)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵(DMRIE)、N-(2-精胺甲酰基)-N′,N′-双十八烷基甘氨酰胺(DOGS)、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)、3β-[N-(N′,N′-二甲基胺乙基(胺基甲酰基]胆固醇(DC-CHOL)、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)、脂质多聚-L-赖氨酸(LPLL)和硬脂胺(SA)中的一种或多种。
更优选地，所述阳离子脂质为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)。
优选地，所述辅助脂质选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(CHOL)中的一种或多种。
更优选地，所述辅助脂质选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和胆固醇(CHOL)中的一种或两种。进一步优选地，所述辅助脂质为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和胆固醇(CHOL)的混合物。较佳地，所述二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和胆固醇(CHOL)的摩尔比为(0.1～50)：(0.1～50)。在某个优选实施方式中，为40：10。
优选地，所述脂材包括阳离子脂质和辅助脂质。本发明中辅助脂质与阳离子脂质形成的脂质纳米粒更加稳定。更优选地，所述阳离子脂质和辅助脂质的摩尔比为(0.01～3)：1。较佳地，可以为(0.01～1.5)：1，也可以为(1～2.5)：1，也可以为(2～3)：1。在某个优选实施方式中，为1：1。
在某些实施方式中，所述脂质纳米粒还包括肿瘤靶向分子，所述脂质层表面修饰有所述肿瘤靶向分子。
优选地，所述脂材与所述肿瘤靶向分子的摩尔比为(20～150)：1。更优选地，可以为(20～80)：1，也可以为(70～120)：1，也可以为(110～150)：1。在某个优选实施方式中，为100：1。
优选地，所述肿瘤靶向分子选自蛋白、多肽和小分子化合物的一种或多种。所述肿瘤靶向分子能与肿瘤细胞发生特异性结合。
较佳地，所述肿瘤靶向分子为蛋白。具体地，所述蛋白选自转铁蛋白、乳铁蛋白和抗体中的一种或多种。
较佳地，所述肿瘤靶向分子为多肽。具体地，所述多肽为肿瘤细胞表皮生长因子肽(GE11)。
较佳地，所述肿瘤靶向分子为小分子化合物。具体地，所述小分子化合物选自叶酸和透明质酸中的一种或两种。
优选地，所述肿瘤靶向分子为由肿瘤靶向分子和连接剂通过酰胺键连接得到的产物。
更优选地，所述连接剂选自DSPE-PEG-NHS、DMPE-PEG-NHS、DPPE-PEG-NHS和DLPE-PEG-NHS中的一种和多种。
进一步优选地，所述连接剂为DSPE-PEG-NHS，DSPE-PEG-NHS中PEG的数均分子量为1000～3000。在某个优选实施方式中，所述PEG的数均分子量为2000。
具体地，所述肿瘤靶向分子为肿瘤细胞表皮生长因子肽GE11和连接剂DSPE-PEG-NHS通过酰胺键连接得到的产物，连接得到的产物为磷脂-聚乙二醇-细胞表皮生长因子肽GE11。磷脂-聚乙二醇-细胞表皮生长因子肽GE11(DSPE-PEG-GE11)可通过常规市售渠道获得或者通过现有技术中的制备方法获得。
所述脂材包括阳离子脂质和辅助脂质以及肿瘤靶向分子为磷脂-聚乙二醇-细胞表皮生长因子肽GE11，所述阳离子脂质、所述辅助脂质和所述磷脂-聚乙二醇-细胞表皮生长因子肽GE11之间的摩尔比为(10～50)：(0.2～100)：(0.05～10)。较佳地，摩尔比可以为(10～25)：(0.2～50)：(0.05～5)，也可以为(20～40)：(30～80)：(3～8)，也可以为(30～50)：(70～100)：(7～10)。在某个优选实施方式中，为50：50：1。
本发明的第三方面，提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括如上文所述的表达载体或如上文所述的脂质纳米粒，以及药学上可接受的辅料、稀释剂或赋形剂。
本发明的第四方面，提供如上文所述的脂质纳米粒的制备方法，包括如下步骤：将如上文所述的表达载体和所述脂材混合，透析，得到所述的脂质纳米粒。
在某些实施方式中，所述表达载体含有的N与所述脂材含有的P之间的比例为1：(1～10)。进一步优选地，比例可以为1：(1～5)，也可以为1：(3～8)，也可以为1：(7～10)。在某个优选的实施方式中，为1：3.5。
在某些实施方式中，所述脂材包括阳离子脂质和辅助脂质中的一种或两种。
优选地，所述阳离子脂质选自氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵(DTAB)、溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DORI)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE)、溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HP)、溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HB)、溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HPc)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵(DPRIE)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵(DSRIE)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵(DMRIE)、N-(2-精胺甲酰基)-N′,N′-双十八烷基甘氨酰胺(DOGS)、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)、3β-[N-(N′,N′-二甲基胺乙基(胺基甲酰基]胆固醇(DC-CHOL)、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)、脂质多聚-L-赖氨酸(LPLL)和硬脂胺(SA)中的一种或多种。
更优选地，所述阳离子脂质为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)。
优选地，所述辅助脂质选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇(CHOL)中的一种或多种。
更优选地，所述辅助脂质选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和胆固醇(CHOL)中的一种或两种。进一步优选地，所述辅助脂质为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和胆固醇(CHOL)的混合物。较佳地，所述二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和胆固醇(CHOL)的摩尔比为(0.1～50)：(0.1～50)。在某个优选实施方式中，为40：10。
优选地，所述阳离子脂质和辅助脂质的摩尔比为(0.01～3)：1。更优选地，可以为(0.01～1.5)：1，也可以为(1～2.5)：1，也可以为(2～3)：1。在某个优选实施方式中，为1：1。
在某些实施方式中，分别将所述表达载体和所述脂材溶解后混合。
优选地，将所述表达载体溶于溶剂，得到表达载体的溶液。所述溶剂为水。所述表达载体溶于水后形成表达载体的水溶液。
更优选地，所述表达载体的溶液的浓度为0.01～0.07mg/mL。更优选地，浓度可以为0.01～0.05mg/mL，可以为0.03～0.06mg/mL，可以为0.04～0.07mg/mL。在某个优选实施方式中，为0.03mg/mL。
优选地，所述脂材溶于有机溶剂，除去所述有机溶剂，得到脂质膜；脂质膜溶于溶剂，得到脂材溶液。所述有机溶剂选自氯仿。所述溶剂为乙醇。
更优选地，所述表达载体的溶液和所述脂材的溶液的体积比为(4～1)：1。进一步优选地，可以为(3～1)：1，也可以为(4～2)：1。在某个优选实施方式中，为3：2。
在某些实施方式中，所述透析的温度为1～10℃。
优选地，所述透析的温度可以为1～7℃，也可以为5～8℃，也可以为7～10℃。在某个优选实施方式中，为4℃。
在某些实施方式中，所述透析的时间为15～40h。
优选地，所述透析的时间可以为15～25h，也可以为20～35h，也可以为30～40h。在某个优选实施方式中，为24h。
在某些实施方式中，透析后，还包括与所述肿瘤靶向分子孵育的步骤。
优选地，所述肿瘤靶向分子选自蛋白、多肽和小分子化合物的一种或多种。所述肿瘤靶向分子能与肿瘤细胞发生特异性结合。
较佳地，所述肿瘤靶向分子为蛋白。具体地，所述蛋白选自转铁蛋白、乳铁蛋白和抗体中的一种或多种。
较佳地，所述肿瘤靶向分子为多肽。具体地，所述多肽为肿瘤细胞表皮生长因子肽(GE11)。
较佳地，所述肿瘤靶向分子为小分子化合物。具体地，所述小分子化合物选自叶酸和透明质酸中的一种或两种。
优选地，所述肿瘤靶向分子为由肿瘤靶向分子和连接剂通过酰胺键连接得到的产物。
更优选地，所述连接剂选自DSPE-PEG-NHS、DMPE-PEG-NHS、DPPE-PEG-NHS和DLPE-PEG-NHS中的一种和多种。
进一步优选地，所述连接剂为DSPE-PEG-NHS，DSPE-PEG-NHS中PEG的数均分子量为1000～3000。在某个优选实施方式中，所述PEG的数均分子量为2000。
优选地，所述肿瘤靶向分子为磷脂-聚乙二醇-肿瘤靶向分子(DSPE-PEG-GE11)。
优选地，将所述肿瘤靶向分子溶于溶剂后进行孵育。所述溶剂为水。所述肿瘤靶向分子溶于水后形成肿瘤靶向分子的水溶液，所述肿瘤靶向分子的水溶液的浓度为0.01～2mg/mL。在某个优选实施方式中，为1mg/mL。
优选地，所述孵育的温度为10～50℃。更优选地，所述孵育的温度可以为10～30℃，也可以为20～40℃，也可以为30～50℃。在某个优选实施方式中，为37℃。
优选地，所述孵育的时间为6～25h。更优选地，所述孵育的时间为6～15h，也可以为10～20h，也可以为18～25h。在某个优选实施方式中，为12h。
优选地，所述肿瘤靶向分子与所述脂材的摩尔比为(20～150)：1。较佳地，可以为(20～80)：1，也可以为(70～120)：1，也可以为(110～150)：1。在某个优选实施方式中，为100：1。
本发明的第五方面，提供如上文所述的表达载体或如上文所述的脂质纳米粒或如上文所述的抗肿瘤药物在制备如下至少一项功能的产品中的用途：
1)杀伤肿瘤细胞；
2)抑制肿瘤细胞增殖；
3)诱导肿瘤细胞凋亡；
4)破坏肿瘤细胞的生物膜；
5)预防和/或治疗肿瘤。
优选地，所述肿瘤细胞为癌细胞。
优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肝癌肿瘤、肺癌肿瘤、乳腺癌肿瘤和膀胱癌肿瘤中一种或多种。
本发明构建一种含肿瘤特异性启动子和蜂毒素基因的表达载体，实现了蜂毒素在肿瘤细胞内的特异性表达并发挥抗肿瘤作用，从而避免直接运用游离蜂毒素多肽进行抗肿瘤治疗时存在的包括溶血和非特异性细胞毒性等毒副作用。进一步，本发明将表达载体与脂材制成一种低毒、高表达效率的脂质纳米粒。此外，本发明在脂质纳米粒的表面修饰肿瘤特异性靶向分子，其能促进脂质纳米粒将构建的表达载体特异且高效的递送进肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内特异性表达出蜂毒素，实现在低系统和组织毒性下的更理想的抗肿瘤治疗效果。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明的脂质纳米粒对构建的表达载体的具有良好的压缩和包载效果，且稳定性高。
2)本发明的脂质纳米粒生物安全性高，对细胞毒性较小，能够用于抗肿瘤治疗研究。
3)本发明的脂质纳米粒在非肿瘤细胞中不表达蜂毒素，但在肿瘤细胞中特异性高表达蜂毒素；修饰肿瘤靶向分子后能提高脂质纳米粒在肿瘤细胞中的蜂毒素表达水平，具有肿瘤靶向特异性和表达特异性。
附图说明
图1显示本发明的实施例1中构建的表达载体(质粒phTERT-Mel)的结构示意图。
图2显示本发明的实施例1中构建的表达载体(质粒phTERT-Mel)的测序结果图。
图3显示本发明的实施例1中构建的表达载体(质粒phTERT-Mel)经EcoRI单酶酶切后的凝胶电泳图。其中，条带1为DNA Marker；条带2为未经酶切的质粒phTERT-Mel；条带3为EcoRI单酶切后的质粒phTERT-Mel。
图4显示本发明的实施例2中的无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)的粒径分布图。
图5显示本发明的实施例2中的无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)的电势分布图。
图6显示本发明的实施例2中的PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)粒径分布图。
图7显示本发明的实施例2中的PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)的电势分布图。
图8显示本发明的实施例2中的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)的粒径分布图。
图9显示本发明的实施例2中的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)的电势分布图。
图10显示本发明的实施例2中的无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)、PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)和GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)的电泳图。其中，条带1为DNA Marker；条带2为质粒phTERT-Mel；条带3为无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)；条带4为PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)；条带5为GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)。
图11显示本发明的实施例3中GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)分别在去离子水、PBS溶液、生理盐水和RPMI1640培养基中的稳定性考察结果图。
图12显示本发明的实施例4中含有eGFP的无修饰的脂质纳米粒(eGFP@LNP)、含有eGFP的PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-eGFP@LNP)、含有eGFP的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-eGFP@LNP)的细胞毒性实验结果图。
图13显示本发明的实施例5中YOYO-1和DiR共标记的脂质纳米粒对A549细胞特异性结合情况的confocal观测图。
图14显示本发明的实施例6中无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)、PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)和GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)在非肿瘤细胞HUVEC和肿瘤细胞A549中特异性表达蜂毒素的RT-PCR检测图。其中，左图为非肿瘤细胞HUVEC，右图为肿瘤细胞A549。
图15显示本发明的实施例7中含有eGFP的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-eGFP@LNP)和GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)特异性诱导肿瘤细胞A549凋亡的流式检测图。其中，左图代表含有eGFP的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-eGFP@LNP)，右图代表GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
以下通过具体实施例对本发明作进一步阐述。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照试剂、仪器商家所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。
本发明的下述实施例中，DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-GE11均可以通过市售渠道获得。
实施例1表达载体的构建
本实施例中，以人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)为肿瘤特异性启动子，与蜂毒素基因(Melittin)构建获得表达载体，标记为质粒phTERT-Mel，包括如下：
肿瘤特异性启动子(hTERT promoter)的序列如SEQ ID NO.2所示：AGGGCCTCCACATCATGGCCCCTCCCTCGGGTTACCCCACAGCCTAGGCCGATTCGACCTCTCTCCGCTGGGGCCCTCGCTGGCGTCCCTGCACCCTGGGAGCGCGAGCGGCGCGCGGGCGGGGAAGCGCGGCCCAGACCCCCGGGTCCGCCCGGAGCAGCTGCGCTGTCGGGGCCAGGCCGGGCTCCCAGTGGATTCGCGGGCACAGACGCCCAGGACCGCGCTCCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCCCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGCGCTGCGTCCTGCTGCGCACGTGGGAA
蜂毒素(Melittin)基因序列如SEQ ID NO.1所示：GGAATTGGAGCAGTTCTGAAGGTATTAACCACAGGATTGCCCGCCCTCATAAGTTGGATTAAACGTAAGAGGCAACAG
肿瘤特异性启动子-蜂毒素基因序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如SEQ ID NO.3所示。
ACGCGTAGGGCCTCCACATCATGGCCCCTCCCTCGGGTTACCCCACAGCCTAGGCCGATTCGACCTCTCTCCGCTGGGGCCCTCGCTGGCGTCCCTGCACCCTGGGAGCGCGAGCGGCGCGCGGGCGGGGAAGCGCGGCCCAGACCCCCGGGTCCGCCCGGAGCAGCTGCGCTGTCGGGGCCAGGCCGGGCTCCCAGTGGATTCGCGGGCACAGACGCCCAGGACCGCGCTCCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCGCCTCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCCCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGCGCTGCGTCCTGCTGCGCACGTGGGAAGCTAGCAAGCTTGCCACCATGGGAATTGGAGCAGTTCTGAAGGTATTAACCACAGGATTGCCCGCCCTCATAAGTTGGATTAAACGTAAGAGGCAACAGTAGGAATTC
委托南京金斯瑞生物科技有限公司将如SEQ ID NO.3所示序列，克隆至pVAX1质粒中，构建得到含有蜂毒素基因和肿瘤特异性启动子的表达载体，标记为质粒phTERT-Mel。
质粒phTERT-Mel的结构示意图见图1。
对构建和扩增的质粒phTERT-Mel进行测序，结果如图2。
图2为本实施例中构建的表达载体(质粒phTERT-Mel)的测序结果图。
从图2可知，测序结果与设计的肿瘤细胞特异性启动子-蜂毒素基因序列相同。
图3为本实施例中构建的表达载体(质粒phTERT-Mel)经EcoRI单酶酶切后的凝胶电泳图。其中，条带1为DNA Marker；条带2为未经酶切的质粒phTERT-Mel；条带3为经EcoRI单酶酶切后的质粒phTERT-Mel。
从图3可知，单酶切后的条带大小为3000bp左右，符合所得质粒的大小。
实施例2脂质纳米粒的制备和表征
本实施例中，进行脂质纳米粒的制备和表征，包括如下：
(1)将摩尔比为50：40：10的DOTAP、DOPE和CHOL溶解于氯仿，转移至圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪除去氯仿，得到均匀覆盖圆底烧瓶底部的脂质薄膜。其中，溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)为阳离子脂质，二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和胆固醇(CHOL)为辅助脂质。
(2)用适量无水乙醇溶解脂质薄膜，得到脂质的乙醇溶液。
(3)将实施例1的质粒phTERT-Mel溶解于去离子水中，得到质粒终浓度为0.03mg/mL的质粒水溶液。
(4)按照质粒phTERT-Mel和阳离子脂质之间的氮磷比为1：3.5，以及质粒水溶液和脂质的乙醇溶液的体积比为3：2，将本实施例中步骤(2)所得的脂质的乙醇溶液与本实施例中步骤(3)所得的质粒水溶液混合，用移液枪吹打混匀，涡旋震荡10s得到均匀的混合溶液，室温静置30min。
(5)将步骤(4)所得的混合溶液置于截留量为3KD透析袋中，置于4℃去离子水中透析24h，得到含有质粒phTERT-Mel但无修饰的脂质纳米粒，标记为DNA@LNP。
(6)将DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-GE11分别溶于去离子水中，得到终浓度为1mg/mL的DSPE-PEG2000和1mg/mL的DSPE-PEG2000-GE11水溶液。分别制备并获得PEG修饰的脂质纳米粒和GE11修饰的脂质纳米粒，包括如下：
按照DSPE-PEG2000与阳离子脂质和辅助脂质总和的摩尔比为1：100将DSPE-PEG2000水溶液与步骤(5)得到的无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)混合，置于恒温摇床上在37℃温度下350rpm震荡孵育12h，使用10KD透析袋，于4℃条件下，用去离子水中透析24h，除去游离的脂质组分，得到PEG修饰的脂质纳米粒，标记为PEG-DNA@LNP。
按照DSPE-PEG2000-GE11与阳离子脂质和辅助脂质总和的摩尔比为1：100将DSPE-PEG2000-GE11水溶液与步骤(5)得到的无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)混合，置于恒温摇床上在37℃温度下350rpm震荡孵育12h，使用10KD透析袋，于4℃条件下，用去离子水中透析24h，除去游离的脂质组分，得到GE11修饰的脂质纳米粒，标记为GE11-DNA@LNP。
检测：将步骤(5)得到的DNA@LNP、步骤(6)得到的PEG-DNA@LNP和GE11-DNA@LNP分别经过动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位。
使用琼脂糖浓度为1％的琼脂糖凝胶，于120mV条件下电泳40分钟后，用凝胶成像系统观察无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)，PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)和GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)中对质粒phTERT-Mel的包裹情况。
图4为本实施例中得到的无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)的粒径分布图。
图5为本实施例中得到的无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)的电势分布图。
从图4和图5可知，无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)的粒径为76.03nm(DLS检测)，粒径多分散系数(PDI)为0.180，zeta电位为21.3mV。
图6为本实施例中得到的PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)的粒径分布图。
图7为本实施例中得到的PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)的电势分布图。
从图6和图7可知，PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)为粒径为104.3nm(DLS检测)，粒径多分散系数(PDI)为0.161，zeta电位为14.3mV。
图8为本实施例中得到的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)的粒径分布图。
图9为本实施例中得到的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)的电势分布图。
从图8和图9可知，GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)的粒径为120.1nm(DLS检测)，粒径多分散系数(PDI)为0.210，zeta电位为12.2mV。
图10为本实施例中得到的无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)、PEG修饰的纳米粒(PEG-DNA@LNP)和GE11修饰的纳米粒(GE11-DNA@LNP)的电泳图。其中，条带1为DNA Marker；条带2为质粒phTERT-Mel；条带3为无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)；条带4为PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)；条带5为GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)。
从图10可知，PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)和GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)均能够实现对质粒phTERT-Mel的良好压缩和包载。
实施例3脂质纳米粒的稳定性研究
本实施例中，考察脂质纳米粒的稳定性，包括如下：
将实施例2中制备好的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)按照体积比为1：1的比例分别分散于去离子水、PBS溶液、生理盐水和RPMI1640培养基中。于不同时间点，采用动态光散射分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位，以考察脂质纳米粒体在不同溶液中的稳定性情况。
图11为实施例中的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)在去离子水、PBS溶液、生理盐水和RPMI1640培养基中的稳定性考察结果图。
从图11可知，GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)在去离子水中没有明显的粒径变化，在PBS溶液、生理盐水和RPMI1640培养基中粒径随时间变化略微增大50～100nm，但是均在24h后没有显著变化。
实施例4脂质纳米粒对肿瘤细胞A549的细胞毒性实验
本实施例中，考察脂质纳米粒对肿瘤细胞A549的细胞毒性，包括如下：
委托南京金斯瑞生物科技有限公司将eGFP克隆至pVAX1质粒，得到质粒peGFP。
按照实施例2的步骤，用质粒peGFP代替质粒phTERT-Mel，制备了含有eGFP的无修饰的脂质纳米粒，标记为eGFP@LNP，同时制备获得含有eGFP的PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-eGFP@LNP)和含有eGFP的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-eGFP@LNP)。
按照如下步骤考察了脂质纳米粒的细胞毒性。
(1)取处于对数生长期的A549细胞，消化后进行细胞计数；按照5×103个细胞/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL含10％FBS和1％双抗的RPMI 1640完全培养基，轻轻摇晃96孔板使细胞分布均匀；将96孔板置于细胞培养箱中，在37℃、5％CO2的条件下培养过夜。
(2)设置实验组如下：包括3个实验组、1个对照组和1个空白组，实验组包括eGFP@LNP组、PEG-eGFP@LNP组和GE11-eGFP@LNP组，具体为：
eGFP@LNP组：将本实施例中构建的含有eGFP的脂质无修饰的纳米粒(eGFP@LNP)用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基分别稀释至质粒浓度为0.1μg/mL、0.3μg/mL、0.9μg/mL、1.8μg/mL、3μg/mL加入至每孔细胞中。
PEG-eGFP@LNP组：将本实施例中构建的含有eGFP的PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-eGFP@LNP)用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基分别稀释至质粒浓度为0.1μg/mL、0.3μg/mL、0.9μg/mL、1.8μg/mL、3μg/mL加入至每孔细胞中。
GE11-eGFP@LNP组：将本实施例中构建的含有eGFP的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-eGFP@LNP)用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基分别稀释至质粒浓度为0.1μg/mL、0.3μg/mL、0.9μg/mL、1.8μg/mL、3μg/mL加入至每孔细胞中。
对照组：每孔只加入等量不含胎牛血清的RPMI 1640培养基。
空白组：每孔不接种细胞，只加入等量不含胎牛血清的RPMI 1640培养基。
每组和每个浓度梯度设置3个复孔。
(3)弃去96孔板中的细胞培养液，用PBS冲洗后，按照分组，每孔加入100μL不同浓度的纳米粒或培养基，将加药完毕的96孔板放入培养箱中培养4h。
4h后，每孔加入10μL CCK-8试剂，轻轻摇晃96孔板使CCK-8试剂均匀分布；将96孔板放入培养箱中避光孵育2h，使用酶标仪检测在450nm处的吸光值，并代入下列公式计算细胞存活率：
细胞存活率＝(A-A2)/(A1-A2)×100％
其中A—实验组；
A1——对照组；
A2——空白组。
图12为本实施例中含有eGFP的无修饰的脂质纳米粒(eGFP@LNP)、含有eGFP的PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-eGFP@LNP)、含有eGFP的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-eGFP@LNP)的细胞毒性实验结果。
从图12可知，不同浓度的PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-eGFP@LNP)和GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-eGFP@LNP)处理A549细胞后，细胞的存活率均在85％以上，说明脂质纳米粒对A549细胞毒性较小，能够用于抗肿瘤治疗研究。
实施例5脂质纳米粒与肿瘤细胞A549的特异性结合研究
本实施例中，考察脂质纳米粒与肿瘤细胞A549细胞特异性结合情况，包括如下：
YOYO-1和DiR共标记的脂质纳米粒的制备：
(1)按照每50bp DNA对应一个YOYO-1分子的比例，将实施例2中步骤(3)得到的质粒phTERT-Mel的水溶液和YOYO-1于37℃恒温震荡仪上孵育2h，得到混合溶液；将混合溶液转移至截留量为10KD的透析袋中，使用4℃去离子水透析过夜，除去未结合的YOYO-1后，得到YOYO-1标记的质粒DNA的水溶液。
(2)按照DiR与总脂质(总脂质包括DOTAP、DOPE和CHOL)的摩尔比为1：100，以及DOTAP、DOPE、CHOL摩尔比为50：40：10的比例，取适量DOTAP、DOPE、CHOL的氯仿储备液和DiR储备液，旋蒸除去有机溶剂后，用适量无水乙醇溶解，得到脂质的乙醇溶液。
(3)按照本实施例中步骤(1)的质粒DNA与总脂质按照N/P比例为1：3.5，以及质粒水溶液与脂质的乙醇溶液之间的体积比为3：2，将本实施例中步骤(2)所得的脂质乙醇溶液加入到本实施例中步骤(1)所得的YOYO-1标记的质粒DNA中，用移液枪吹打混匀，涡旋震荡10s得到均匀的混合溶液，室温静置30min。
(4)将本实施例中步骤(3)所得的混合溶液置于截留量为3KD透析袋中，置于4℃去离子水中透析24h，得到透析产物。
(5)将DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-GE11分别溶于去离子水中，得到终浓度为1mg/mL的DSPE-PEG2000和1mg/mL的DSPE-PEG2000-GE11水溶液。分别制备并获得YOYO-1和DiR共标记的PEG-DNA@LNP和YOYO-1和DiR共标记的GE11-DNA@LNP，具体步骤如下：
按照DSPE-PEG2000与阳离子脂质和辅助脂质总和的摩尔比为1：100将DSPE-PEG2000溶液加入到本实施例中步骤(4)的透析产物中，置于恒温摇床上在37℃温度下350rpm震荡孵育12h，得到YOYO-1和DiR共标记的PEG-DNA@LNP。
按照DSPE-PEG2000-GE11与阳离子脂质和辅助脂质总和的摩尔比为1：100将DSPE-PEG2000-GE11溶液加入到本实施例中步骤(4)的透析产物中，置于恒温摇床上在37℃温度下350rpm震荡孵育12h，得到YOYO-1和DiR共标记的GE11-DNA@LNP。
(6)使用10KD透析袋，分别将本实施例中步骤(5)得到的YOYO-1和DiR共标记的PEG-DNA@LNP和YOYO-1和DiR共标记的GE11-DNA@LNP置于4℃去离子水中透析24h，除去游离的脂质组分。
检测：采用Confocal验证PEG-DNA@LNP和GE11-DNA@LNP对A549细胞的特异性结合作用，包括如下步骤：
1)取处于对数生长期的A549细胞，消化后进行细胞计数；按照5×104个细胞/孔的密度接种于提前放入含有细胞爬片的24孔板中，每孔加入500μL含10％FBS和1％双抗的RPMI1640完全培养基，轻轻摇晃24孔板使细胞分布均匀；将24孔板置于细胞培养箱中，在37℃、5％CO2的条件下培养过夜。
2)设置实验组如下：YOYO-1和DiR共标记的GE11修饰的脂质纳米粒GE11-DNA@LNP；YOYO-1和DiR共标记的PEG修饰的脂质纳米粒PEG-DNA@LNP。
3)弃去24孔板中的培养液，用PBS冲洗后，按照步骤2)的分组和方法加入脂质纳米粒；细胞培养液中质粒phTERT-Mel的浓度为2μg/mL。加药完毕后，将24孔板置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内孵育0.5h。
4)弃去24孔板中的溶液，用PBS冲洗后，按照制片方法，用多聚甲醛将细胞固定在爬片上，用DAPI染细胞核后，加抗荧光淬灭剂封片，于荧光显微镜下观察脂质纳米粒与A549细胞的特异性结合情况。
图13显示本发明的实施例5中YOYO-1和DiR共标记的PEG-DNA@LNP以及YOYO-1和DiR共标记的GE11-DNA@LNP与A549细胞特异性结合的Confocal观测图。其中，YOYO-1标记质粒并呈绿色荧光，DiR标记脂质并呈红色荧光，DAPI使细胞核染色并呈蓝色荧光。YOYO-1&DAPI代表分别在YOYO-1和DAPI的荧光激发波长下拍摄并合成的荧光图像，能够显示所述质粒与细胞核的位置分布情况；DiR&DAPI代表分别在DiR和DAPI的荧光激发波长下拍摄并合成的荧光图像，能够显示脂质与细胞核的位置分布情况。
从图13可知，经PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)和GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)处理后，A549细胞的生理状态正常；GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)组中A549细胞上的绿色荧光和红色荧光明显强于PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)组，说明GE11的修饰提高了脂质纳米粒与A549细胞的结合作用。
实施例6脂质纳米粒在非肿瘤细胞和肿瘤细胞中的蜂毒素表达特异性研究
本实施例中，考察脂质纳米粒在肿瘤细胞A549和非肿瘤细胞HUVEC中的蜂毒素表达特异性，包括如下步骤：
(1)取处于对数生长期的人肺腺癌上皮细胞A549和人脐静脉内皮细胞HUVEC，消化后进行细胞计数；按照1.4×105个细胞/孔的密度接种于12孔板中，每孔加入1mL含10％FBS和1％含双抗的RPMI 1640完全培养基，轻轻摇晃12孔板使细胞分布均匀；将12孔板置于细胞培养箱中，在37℃、5％CO2的条件下培养过夜。
(2)弃去本实施例中步骤(1)的12孔板中的细胞培养液，PBS冲洗后，分别向A549细胞和HUVEC细胞培养板中加入用不含血清的RPMI 1640培养基稀释后的实施例2中所制备的无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)、PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)和GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)各1mL；并设置只加入等量phTERT-Mel质粒(不含有脂质纳米粒)的对照组和只加入等量培养基的空白组；每组设置3个复孔。细胞培养液中质粒的浓度为3μg/mL。加药完毕后，将24孔板置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内孵育4h。
(3)4h后，弃去细胞培养液，PBS冲洗后，每孔加入1mL含10％FBS和1％双抗的RPMI1640完全培养基；将12孔板置于细胞培养箱中，在37℃、5％CO2的条件下培养48h。
(4)12孔板每孔加入1mL Trizol试剂提取细胞总RNA，Nanodrop检测总RNA浓度及纯度。然后每组取4μg总RNA，反转录为cDNA，并对原液进行5倍稀释，最后使用SYBR Green染料进行实时荧光定量PCR。反应体系为20μL，引物终浓度为200nM，每孔取1μL稀释后的cDNA样本。以GAPDH为内参照。反应条件为95℃10min，95℃10s，60℃1min，共40个循环，引物序列如表1所示。
表1实时荧光定量PCR引物序列
基因 上游(5′-3′) 下游(5′-3′)
蜂毒素 GCCACCATGGGAATTGGAGC GAATTCCTACTGTTGCCTCTTACGT
GAPDH TGTGTCCGTCGTGGATCTGA CCTGCTTCACCACCTTCTTGA
图14为本实施例中无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)、PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)和GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)在正常细胞HUVEC和肿瘤细胞A549中特异性表达蜂毒素的RT-PCR检测图。其中，左图为非肿瘤细胞HUVEC，右图为肿瘤细胞A549。
从图14可知，无修饰的脂质纳米粒(DNA@LNP)、PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)和GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)在非肿瘤细胞HUVEC中都几乎没有蜂毒素mRNA表达或表达很少，而在肿瘤细胞A549中高表达，表明了构建的表达载体(即质粒phTERT-Mel)在肿瘤细胞中表达具有特异性。进一步的，在肿瘤细胞A549中，GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)组的蜂毒素mRNA水平明显高于PEG修饰的脂质纳米粒(PEG-DNA@LNP)组，说明GE11的修饰提高了脂质纳米粒与肿瘤细胞的结合和递送效率。
实施例7脂质纳米粒诱导肿瘤细胞A549凋亡研究
本实施例，考察脂质纳米粒对肿瘤细胞A549凋亡影响情况，包括如下：
(1)取处于对数生长期的A549细胞，消化后进行细胞计数；按照1.4×105个细胞/孔的密度接种于12孔板中，每孔加入1mL含10％FBS和1％双抗的RPMI 1640完全培养基，轻轻摇晃12孔板使细胞分布均匀；将12孔板置于细胞培养箱中，在37℃、5％CO2的条件下培养过夜。
(2)弃去12孔板中的细胞培养液，PBS冲洗后，向A549细胞中加入采用不含血清的RPMI 1640培养基稀释实施例2中所制备的GE11修饰的纳米粒(GE11-DNA@LNP)1mL；并设置对照组，对照组使用实施例4中制备获得的含有eGFP的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-eGFP@LNP)；细胞培养液中质粒的浓度为3μg/mL。加药完毕后，将24孔板置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内孵育4h。
(3)4h后，弃去细胞培养液，PBS冲洗后，每孔加入1mL含10％FBS和1％双抗的RPMI1640完全培养基；将12孔板置于细胞培养箱中，在37℃、5％CO2的条件下培养48h。
(4)弃去细胞培养液，PBS冲洗后，胰酶消化板中的细胞；分别用Annexin V-FITC/PI染色后，使用流式细胞仪，在激发波长/发射波长为494/535的条件下检测各组细胞的荧光强度。
图15为本实施例中含有eGFP的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-eGFP@LNP)和GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)诱导肿瘤细胞A549凋亡的流式检测图。其中，左图代表含有eGFP的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-eGFP@LNP)，右图代表GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)。
图15显示，对照组(即GE11-eGFP@LNP组)中绝大部分细胞均处于Q3象限，即正常细胞；而GE11-DNA@LNP组，即GE11修饰的脂质纳米粒组，细胞有10.3％分布于早期凋亡的Q1象限和18.3％分布于晚期凋亡的Q2象限，说明所制备的GE11修饰的脂质纳米粒(GE11-DNA@LNP)能够通过诱导肿瘤细胞A549凋亡。
本发明构建的表达载体，在非肿瘤细胞中则不表达蜂毒素，但在肿瘤细胞内特异性表达蜂毒素并发挥抗肿瘤作用，从而避免直接使用或通过载体输送蜂毒素多肽进行抗肿瘤治疗时存在的毒副作用，如溶血和非特异性细胞毒性等。本发明还提供含有表达载体的脂质纳米粒，通过肿瘤靶向分子对脂质纳米粒进行修饰从而使其具有肿瘤靶向性，能将构建的表达载体特异且高效的递送至肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内特异性表达出蜂毒素，具有递送和表达双特异性。本发明的脂质纳米粒能靶向肿瘤细胞并特异性表达蜂毒素，进而通过破坏肿瘤细胞内的脂质生物膜结构、诱导肿瘤细胞凋亡等作用发挥抗肿瘤作用，从而实现在低系统和组织毒性下的更理想的抗肿瘤治疗效果，可广泛应用于抗肿瘤应用。综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种表达载体、脂质纳米粒、抗肿瘤药物其制备方法和用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaattggag cagttctgaa ggtattaacc acaggattgc ccgccctcat aagttggatt 60
aaacgtaaga ggcaacag 78
<210> 2
<211> 446
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agggcctcca catcatggcc cctccctcgg gttaccccac agcctaggcc gattcgacct 60
ctctccgctg gggccctcgc tggcgtccct gcaccctggg agcgcgagcg gcgcgcgggc 120
ggggaagcgc ggcccagacc cccgggtccg cccggagcag ctgcgctgtc ggggccaggc 180
cgggctccca gtggattcgc gggcacagac gcccaggacc gcgctcccca cgtggcggag 240
ggactgggga cccgggcacc cgtcctgccc cttcaccttc cagctccgcc tcctccgcgc 300
ggaccccgcc ccgtcccgac ccctcccggg tccccggccc agccccctcc gggccctccc 360
agcccctccc cttcctttcc gcggccccgc cctctcctcg cggcgcgagt ttcaggcagc 420
gctgcgtcct gctgcgcacg tgggaa 446
<210> 3
<211> 559
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgcgtaggg cctccacatc atggcccctc cctcgggtta ccccacagcc taggccgatt 60
cgacctctct ccgctggggc cctcgctggc gtccctgcac cctgggagcg cgagcggcgc 120
gcgggcgggg aagcgcggcc cagacccccg ggtccgcccg gagcagctgc gctgtcgggg 180
ccaggccggg ctcccagtgg attcgcgggc acagacgccc aggaccgcgc tccccacgtg 240
gcggagggac tggggacccg ggcacccgtc ctgccccttc accttccagc tccgcctctc 300
cgcgcggacc ccgccccgtc ccgacccctc ccgggtcccc ggcccagccc cctccgggcc 360
ctcccagccc ctccccttcc tttccgcggc cccgccctct cctcgcggcg cgagtttcag 420
gcagcgctgc gtcctgctgc gcacgtggga agctagcaag cttgccacca tgggaattgg 480
agcagttctg aaggtattaa ccacaggatt gcccgccctc ataagttgga ttaaacgtaa 540
gaggcaacag taggaattc 559

Claims (11)

1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括肿瘤特异性启动子和蜂毒素基因，所述蜂毒素基因包括如SEQ ID No.1所示序列。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述肿瘤特异性启动子选自甲胎蛋白启动子、癌胚抗原启动子、缺氧诱导因子-1启动子、肿瘤抗原粘蛋白启动子、人端粒酶逆转录酶启动子、分泌性白细胞蛋白酶抑制因子启动子和存活素启动子中的一种。
3.一种脂质纳米粒，其特征在于，所述脂质纳米粒包括如权利要求1或2所述的表达载体和包裹在所述表达载体表面的脂质层，所述脂质层由脂材形成。
4.如权利要求3所述的脂质纳米粒，其特征在于，所述脂质纳米粒还包括肿瘤靶向分子，所述脂质层表面修饰有所述肿瘤靶向分子。
5.如权利要求4所述的脂质纳米粒，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：
1)所述脂材选自阳离子脂质和辅助脂质中的一种或两种；
2)所述肿瘤靶向分子选自蛋白、多肽和小分子化合物的一种或多种；
3)所述肿瘤靶向分子为由所述肿瘤靶向分子和连接剂通过酰胺键连接得到的产物；
4)所述表达载体含有的N与所述脂材含有的P之间的比例为1：(1～10)；
5)所述脂材与所述肿瘤靶向分子的摩尔比为(20～150)：1。
6.如权利要求5所述的脂质纳米粒，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：
A1)所述阳离子脂质选自氯化三甲基-23-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵、N-(2-精胺甲酰基)-N′,N′-双十八烷基甘氨酰胺、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N′,N′-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯、脂质多聚-L-赖氨酸和硬脂胺中的一种或多种；
A2)所述辅助脂质选自二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和胆固醇中的一种或多种；
A3)所述肿瘤靶向分子为多肽；优选地，为肿瘤细胞表皮生长因子肽；
A4)所述连接剂选自DSPE-PEG-NHS、DMPE-PEG-NHS、DPPE-PEG-NHS和DLPE-PEG-NHS中的一种或多种。
7.如权利要求6所述的脂质纳米粒，其特征在于，所述脂材包括阳离子脂质和辅助脂质；和/或，所述连接剂为DSPE-PEG-NHS，所述PEG的分子量为1000～3000。
8.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括如权利要求1或2所述的表达载体或如权利要求3-7任一项所述的脂质纳米粒，以及药学上可接受的辅料、稀释剂或赋形剂。
9.如权利要求1或2所述的表达载体或如权利要求3-7任一项所述的脂质纳米粒或如权利要求8所述的抗肿瘤药物在制备如下至少一项功能的产品中的用途：
B1)杀伤肿瘤细胞；
B2)抑制肿瘤细胞增殖；
B3)诱导肿瘤细胞凋亡；
B4)破坏肿瘤细胞的生物膜；
B5)预防和/或治疗肿瘤。
10.如权利要求3-7任一项所述的脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将所述表达载体和所述脂材混合，透析，得到所述的脂质纳米粒。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：
1)分别将所述表达载体和所述脂材溶解后混合；
2)将所述表达载体溶于溶剂，得到表达载体的溶液；
3)将所述脂材溶于有机溶剂，除去所述有机溶剂，得到脂质膜；脂质膜溶于溶剂，得到脂材的溶液；
4)在制备过程中加入所述肿瘤靶向分子。
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