CN108250284A - 一种生产蜂毒肽的方法 - Google Patents

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    • C12N15/8201Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205Agrobacterium mediated transformation

Abstract

本发明提供了一种生产蜂毒肽的方法,具体利用发根农杆菌K599介导的大豆转基因技术生产蜂毒肽蛋白的方法,能够高效地表达蜂毒肽蛋白。同时,在目的蛋白中间使用蛋白酶切位点,保证了蜂毒肽不会杀死植物细胞,纯化后加入肠激酶后,蜂毒肽能够被切下来。此发明首次在大豆发根里面成功表达出蜂毒肽蛋白,较之前原核表达的蜂毒肽来说,其活性更强,可溶性更高,而且植物体内表达的蜂毒肽蛋白粗提取就可以用来做药,因为植物体内没有对人体有害的物质。

Description

一种生产蜂毒肽的方法
技术领域
本发明属于生物试剂发明领域,具体涉及一种生产蜂毒肽的方法。
背景技术
上世纪70年代,国外开始对蜂毒肽分子生物学研究,Kindas.Mugge等将从蜂王毒腺中提取的mRNA注入青蛙卵中,合成了蜂毒肽前体蛋白promeliain)。Vlasak等用质粒pBR322构建了蜂王毒腺cDNA文库,并以蜂王毒腺总mRNA制作探针进行杂交,获得了蜂毒肽的cDNA,而王关林等通过RT-PCR方法扩增得到了蜂毒肽前体蛋白的cDNA,测得序列长度为155bp,与Vlasak等发表的序列完全相同;另外再通过在蜂毒肽序列前引入羟胺裂解位点,以定点诱变的方式构建了诱变蛋白表达载体,该载体与β-半乳糖苷酶部分序列相融合,结果在大肠杆菌中成功地表达了诱变蛋白,为基因工程生产蜂毒肽提供了新途径。
但是,原核表达蜂毒肽有以下缺陷:(1)原核系统表达的真核生物蛋白质缺乏很多翻译后修饰,使得蜂毒肽的活性不如真核表达系统表达得多。(2)原核表达蜂毒肽为了避免蜂毒对细胞的毒害,通常会在其N端连入GST等标签蛋白从而表达为融合蛋白,这些融合蛋白的可溶性较差,也就是说具有生物活性的蜂毒肽的量非常少。(3)原核表达及真核酵母表达,在发酵的过程中,大肠杆菌及酵母体内会产生大量的内毒素,在纯化蜂毒肽的过程中,需要花费大量的成本去除对人体有害的细胞内毒素。
目前植物表达蜂毒肽的瓶颈在于蜂毒肽会使得细胞膜受到破坏,直接表达会造成工程菌、转基因植物的的细胞膜遭到破坏导致死亡。
密码子的选择和融合蛋白的选择也会对植物的表达蜂毒肽造成影响。因此我们根据植物的表达偏好,在保持蜂毒肽氨基酸序列保持不变的条件下,更改了一些氨基酸的密码子,使得蜂毒肽能够在植物当中正常表达。
另外我们在构建表达载体的过程中选择了保留蜂毒肽的内含子,这样可以保证蜂毒肽在克隆所用的工程大肠杆菌(DH5α)中不会导致工程菌的死亡。我们选择了截短的萤火虫荧光素酶(Nano Firefly Luciferase)作为与蜂毒肽融合表达的报告蛋白,该蛋白只有在有底物作用下发出荧光的特性,不仅能够抑制蜂毒肽的活性,并且能够方便地检测到蜂毒肽融合蛋白的表达。接着我们用羟胺裂解酶识别位点作为蛋白linker连接萤火虫荧光素酶与蜂毒肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产蜂毒肽的方法。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种生产蜂毒肽的方法,包括载体设计以及构建、电击转化K599农杆菌感受态、大豆的培养与侵染、蛋白纯化。
所述的载体设计以及构建为:设计引物Egfp F:5’-3’cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg,Egfp R:5’-3’CTTGTCGTCGTCGTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,millitin F:5’-3’ggacgacgacgacaagggaattggagcagttctgaa,millitin R:5’-3’GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC,首先各自以Pci Egfp载体和在公司合成的PCImillitin 为模板扩增出来egfp和millitin,然后利用Egfp F:5’-3’cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg和millitin R:5’-3’GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC引物进行重叠 pcr,将egfp和millitin扩增到一起,回收后和限制性内切酶BamHI线性化的Pcambia 3301载体连接,转化DH5a,菌落pcr验证大小正确的克隆送测序,测序正确的单菌落提取Pcambia 3301 nanoluc gfp millitin质粒并保菌。
Pci Egfp载体:设计Egfp引物如下:
Egfp F‘ cagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagga
Egfp R‘:TACCACGCGTGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG
pcr扩增出egfp产物,然后和EcoRI线性化的PCI(neo)载体连接构建成pci egfp载体。
PCI millitin 为millitin(蜂毒肽)合成到pci neo上。Millitin序列:ggaattggagcagttctgaaggtattaaccacaggattgcccgccctcataagttggattaaacgtaagaggcaacagggt。
所述的电击转化K599农杆菌感受态为将1微克Pcambia 3301 nanoluc gfpmillitin质粒和100微升K599感受态细胞混匀,然后1800V电击转化6ms,加入600微升LB液体培养基,220rpm 28℃孵育1h,4000rpm离心5min后,涂50ug/ml卡那霉素抗性的LB固体培养基平板,两天后挑取单克隆进行菌落PCR鉴定,鉴定正确的菌落保菌。
所述的大豆的培养与侵染为:将培养好的大豆子叶剪下来,用70%酒精表面消毒,并在子叶背部用刀片切掉1-2cm长的棱,将其平铺到培养皿里面,培养皿里面垫一层灭过的滤纸,并且加入5ml的双蒸水;与此同时,将前一步获得的K599农杆菌提前一晚上摇起来,至OD600为1.2,然后用10mM的MgSO4溶液调至OD600为0.35,吸取20微升用枪头打到子叶切口处,然后盖上培养皿盖子,封口膜封住,置于75 mmol*m−2*s−1光强16h光照/8h黑暗培养,15d后,看到伤口处有明显的根长出来,此时将培养皿转入全日照下,长大7d后,将根剪下来,进行蛋白检测。
蛋白纯化为:将剪下来的发根冻入液氮,并在研钵内研磨,随后加入植物裂解液,1克样品需要1ml裂解;4℃垂直混匀20min,然后14000g 4℃高速离心10min,吸取上清液,加入30μLGFP beas,垂直混匀4h,800g离心5min,然后加入1ml wash buffer,垂直混匀5min,反复洗5次,然后加入50μLPBS和15μL肠激酶,37℃过夜孵育,800g离心5min,吸取上清液后,超滤,得到蜂毒肽蛋白。
所述的植物裂解液含20 mM pH 7.5 HEPES,40mM KCl,1mM EDTA,1% Triton X-100,1mM PMSF;所述wash buffer含20 mM pH 7.5 HEPES,40mM KCl,1mM EDTA, 0.1%Triton X-100。
本发明的优点在于:本发明在构建表达载体的过程中选择了保留蜂毒肽的内含子,这样可以保证蜂毒肽在克隆所用的工程大肠杆菌(DH5α)中不会导致工程菌的死亡。我们选择了截短的萤火虫荧光素酶(Nano Firefly Luciferase)作为与蜂毒肽融合表达的报告蛋白,该蛋白只有在有底物作用下发出荧光的特性,不仅能够抑制蜂毒肽的活性,并且能够方便地检测到蜂毒肽融合蛋白的表达。接着我们用羟胺裂解酶识别位点作为蛋白linker连接萤火虫荧光素酶与蜂毒肽。
此发明首次在大豆发根里面成功表达出蜂毒肽蛋白,较之前原核表达的蜂毒肽来说,其活性更强,可溶性更高,而且植物体内表达的蜂毒肽蛋白粗提取就可以用来做药,因为植物体内没有对人体有害的物质。100g大豆发根大约能提纯出1mg蜂毒肽蛋白。
附图说明
图1 为载体设计图;其中将egfp 和蜂毒肽melittin融合表达,然后将其构建到Pcambia 3301 nanoluc 载体上面,一方面融合蛋白明显减小了蜂毒肽对宿主细胞的伤害,另一方面便于融合表达蛋白的检测。
图2 为大豆子叶在侵染蜂毒肽质粒之前(左)和侵染15d以后的图(右)。
图3 为蜂毒肽蛋白在大豆体内的表达结果;其中剪下1cm-2cm长的大豆发根,加入100微升1mM的nanoluc底物,然后进行检测,A行是进行侵染并且含有蜂毒肽质粒的大豆发根,能够看到明显发光,说明蜂毒肽蛋白能够在大豆体内成功表达,B行是注射空的K599的发根,不会表达nanoluc,也就不会有明显的发光。
图4 为蜂毒肽在大豆中表达的电泳图,其中将发根研磨后,裂解,IP,然后加入肠激酶酶切,最后western鉴定,加入GFP抗体检测,可以明显看到左边是flag-nanoluc-gfp-millitin融合蛋白,右边加了肠激酶后,蜂毒肽millitin蛋白被切下来,比之前的融合蛋白明显变小,说明蜂毒肽在大豆中成功表达。
图5 为蜂毒肽的二级图谱;其中将表达了蜂毒肽蛋白的大豆发根收集,研磨,裂解,然后用GFP beads IP下来,跑western胶后,切胶,酶解,然后上机用质谱仪鉴定蛋白,可以看到明显鉴定到蜂毒肽milittin的二级图谱,说明蜂毒肽蛋白确实能够在大豆体内成功表达。
具体实施方式
实施例1
1.载体设计以及构建:设计引物Egfp F:5’-3’cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg, Egfp R: 5’-3’CTTGTCGTCGTCGTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,millitin F:5’-3’ggacgacgacgacaagggaattggagcagttctgaa , millitin R:5’-3’GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC,首先各自以Pci Egfp载体和在公司合成的PCImillitin 为模板扩增出来egfp和millitin,然后利用Egfp F:5’-3’cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg和millitin R:5’-3’GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC引物进行overlap pcr,将egfp和millitin扩增到一起,回收后和限制性内切酶BamHI线性化的Pcambia 3301载体连接,转化DH5a,菌落pcr验证大小正确的克隆送测序,测序正确的单菌落提取质粒并保菌。
Pci Egfp载体:设计Egfp引物如下:
Egfp F‘ cagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagga;
Egfp R‘:TACCACGCGTGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG;
pcr扩增出egfp产物,然后和EcoRI线性化的PCI(neo)载体连接构建成pci egfp载体。
PCI millitin 为millitin(蜂毒肽)是合成到pci neo上。Millitin序列:ggaattggagcagttctgaaggtattaaccacaggattgcccgccctcataagttggattaaacgtaagaggcaacagggt。
2.电击转化K599农杆菌感受态:将1微克Pcambia 3301 nanoluc gfp millitin质粒和100微升K599感受态细胞混匀,然后1800V电击转化6ms,加入600微升LB液体培养基220rpm,28℃孵育1h,4000rpm离心5min后,涂卡那霉素抗性的LB板子,两天后挑取单克隆进行菌落PCR鉴定,鉴定正确的菌落保菌。
3.大豆的培养与侵染
将草炭土和蛭石1:1混匀后,加入一定量的水,至可用手捏成一团为止,然后将大豆种子播种并覆膜,放在26℃条件下培养,期间保证其湿度,大约培养一个礼拜后,大豆会发芽并破土而出,可以看到其子叶肥厚,此时将大豆子叶剪下来,用70%酒精表面消毒,并在子叶背部用刀片切掉1-2cm长的棱,将其平铺到培养皿里面,培养皿里面垫一层灭过的滤纸,并且加入5ml左右的双蒸水。与此同时,将K599农杆菌提前一晚上摇起来,至OD600为1.2左右,然后用10mM的MgSO4溶液调至OD600为0.35左右,吸取20微升左右用枪头打到子叶切口处,然后盖上培养皿盖子,封口膜封住,置于75 mmol m−2 s−1光强16h光照/8h黑暗培养,大约15d后,可以看到伤口处有明显的根长出来,此时将培养皿转入全日照下,长大约7d后,将根剪下来,可以进行蛋白检测。
4.蛋白纯化
将剪下来的发根冻入液氮,并在研钵内研磨,随后加入植物裂解液(20 mM HEPES [pH7.5], 40mM KCl,1mM EDTA,1% Triton X-100,1mM PMSF),一般1克样品需要1ml裂解。加入裂解液,4℃垂直混匀20min,然后14000g 4℃高速离心10min,吸取上清液,加入30微升GFPbeas,垂直混匀4h,800g离心5min,然后加入1ml wash buffer (20 mM HEPES [pH 7.5],40mM KCl,1mM EDTA,0.1% Triton X-100),垂直混匀5min,反复洗5次,然后加入50微升PBS和15微升肠激酶,37℃过夜孵育,800g离心5min,吸取上清液后,超滤,就得到蜂毒肽蛋白。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120> 一种生产蜂毒肽的方法
<130> 7
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cattctggcg ggatccatgg tgagcaaggg cgagg 35
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cttgtcgtcg tcgtccttgt acagctcgtc catgcc 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggacgacgac gacaagggaa ttggagcagt tctgaa 36
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagaaagctt ggatccttaa ccctgttgcc tcttac 36
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagcctcgag aattcatggt gagcaagggc gagga 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
taccacgcgt gaattccttg tacagctcgt ccatg 35
<210> 7
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggaattggag cagttctgaa ggtattaacc acaggattgc ccgccctcat aagttggatt 60
aaacgtaaga ggcaacaggg t 81

Claims (6)

1.一种生产蜂毒肽的方法,其特征在于:所述方法包括载体设计以及构建、电击转化K599农杆菌感受态、大豆的培养与侵染、蛋白纯化。
2.根据权利要求1所述的一种生产蜂毒肽的方法,其特征在于:所述的载体设计以及构建为:设计引物Egfp F:5’-3’ cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg,
Egfp R:5’-3’ CTTGTCGTCGTCGTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,
millitin F:5’-3’ ggacgacgacgacaagggaattggagcagttctgaa,
millitin R:5’-3’ GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC,
首先各自以Pci Egfp载体和合成的PCI millitin为模板扩增出来egfp和millitin,然后利用Egfp F:5’-3’ cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg和millitin R:5’-3’GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC引物进行重叠 pcr,将egfp和millitin扩增到一起,回收后和限制性内切酶BamHI线性化的Pcambia 3301载体连接,转化DH5a,菌落pcr验证大小正确的克隆送测序,测序正确的单菌落提取Pcambia 3301 nanoluc gfp millitin质粒并保菌。
3.根据权利要求1所述的一种生产蜂毒肽的方法,其特征在于:所述的电击转化K599农杆菌感受态为将1微克Pcambia 3301 nanoluc gfp millitin质粒和100微升K599感受态细胞混匀,然后1800V电击转化6ms,加入600微升LB液体培养基,220rpm 28℃孵育1h,4000rpm离心5min后,涂50ug/ml卡那霉素抗性的LB固体培养基平板,两天后挑取单克隆进行菌落PCR鉴定,鉴定正确的菌落保菌。
4.根据权利要求1所述的一种生产蜂毒肽的方法,其特征在于:所述的大豆的培养与侵染为:将培养好的大豆子叶剪下来,用70%酒精表面消毒,并在子叶背部用刀片切掉1-2cm长的棱,将其平铺到培养皿里面,培养皿里面垫一层灭过的滤纸,并且加入5ml的双蒸水;与此同时,将前一步骤中获得的K599农杆菌提前一晚上摇起来,至OD600为1.2,然后用10mM的MgSO4溶液调至OD600为0.35,吸取20微升用枪头打到子叶切口处,然后盖上培养皿盖子,封口膜封住,置于75 mmol*m−2*s−1 光强16h光照/8h黑暗培养,15d后,看到伤口处有明显的根长出来,此时将培养皿转入全日照下,长大7d后,将根剪下来,进行蛋白检测。
5.根据权利要求1所述的一种生产蜂毒肽的方法,其特征在于:蛋白纯化为:将剪下来的发根冻入液氮,并在研钵内研磨,随后加入植物裂解液,1克样品需要1ml裂解;4℃垂直混匀20min,然后14000g 4℃高速离心10min,吸取上清液,加入30μLGFP beas,垂直混匀4h,800g离心5min,然后加入1ml wash buffer,垂直混匀5min,反复洗5次,然后加入50μLPBS和15μL肠激酶,37℃过夜孵育,800g离心5min,吸取上清液后,超滤,得到蜂毒肽蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种生产蜂毒肽的方法,其特征在于:所述的植物裂解液含20mM pH 7.5 HEPES,40mM KCl,1mM EDTA,1% Triton X-100,1mM PMSF;所述wash buffer含20 mM pH 7.5 HEPES,40mM KCl,1mM EDTA, 0.1% Triton X-100。
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