WO2012124688A1 - 肺送達のためのベクター、導入剤及び使用 - Google Patents

肺送達のためのベクター、導入剤及び使用 Download PDF

Info

Publication number
WO2012124688A1
WO2012124688A1 PCT/JP2012/056406 JP2012056406W WO2012124688A1 WO 2012124688 A1 WO2012124688 A1 WO 2012124688A1 JP 2012056406 W JP2012056406 W JP 2012056406W WO 2012124688 A1 WO2012124688 A1 WO 2012124688A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gala
lipid
chol
vector
mend
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/056406
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
憲司 楠本
原島　秀吉
英万 秋田
浩人 畠山
太一 石塚
Original Assignee
国立大学法人北海道大学
大鵬薬品工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人北海道大学, 大鵬薬品工業株式会社 filed Critical 国立大学法人北海道大学
Priority to CN201280023256.3A priority Critical patent/CN103561725B/zh
Priority to ES12757063T priority patent/ES2832330T3/es
Priority to JP2013504738A priority patent/JP5850915B2/ja
Priority to US14/004,942 priority patent/US9532950B2/en
Priority to EP12757063.8A priority patent/EP2687204B1/en
Publication of WO2012124688A1 publication Critical patent/WO2012124688A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention relates to vectors, transduction agents and uses for pulmonary delivery.
  • This application claims the benefit of priority of Japanese Patent Application No. 2011-55765 filed on March 14, 2011, the entirety of which is incorporated herein by reference. is there.
  • nucleic acid drugs As a vector for delivering target substances such as low molecular weight drugs, nucleic acid drugs, antibody drugs, peptides, proteins, and sugars to target sites, liposomes with functional molecules introduced on the outer surface of the liposome membrane have been actively developed. Has been done.
  • nucleic acid drugs include antisense, ribozyme, aptamer, decoy oligo, and siRNA.
  • siRNA is particularly attracting attention, and clinical trials have been conducted by several pharmaceutical companies and venture companies in the United States and Europe.
  • a liposome having a hydrophilic polymer for example, polyalkylene glycol such as polyethylene glycol
  • a hydrophilic polymer for example, polyalkylene glycol such as polyethylene glycol
  • the directivity of the liposome with respect to tumor cells can be improved by improving the blood retention of the liposome.
  • a multifunctional envelope-type nanostructure MEND: Multifunctional envelope-type nano device; hereinafter, may be abbreviated as “MEND” in the present specification
  • MEND Multifunctional envelope-type nano device
  • Liposomes in which GALA is introduced on the outer surface of the liposome membrane using cholesterol bound to GALA have been developed (see Non-Patent Document 1). Liposomes become encapsulated in endosomes when endocytosed, and the liposomes in endosomes are degraded by the fusion of endosomes with lysosomes. According to these liposomes, the liposome-encapsulated substance escapes from endosomes, resulting in cytoplasm. Can be released into.
  • GALA is an oligopeptide composed of 30 amino acid residues based on a repeating sequence of glutamic acid, alanine, leucine, and alanine (EALA), and is synthesized by a group such as Szoka (see Non-Patent Document 2).
  • EALA glutamic acid
  • Szoka a group such as Szoka
  • GALA has a random coil structure due to the electric repulsion of glutamic acid under neutral pH conditions, but the ⁇ -helix has a high affinity for lipid membranes by eliminating the electric repulsion under acidic conditions. It is known to take a structure (see Non-Patent Document 2).
  • GALA has so far caused membrane fusion between endosomal membranes and MEND lipid membranes under acidic conditions in endosomes by modifying GALA (Chol-GALA) bound to cholesterol (Chol) on the MEND surface. It has been used as a pH-responsive endosome escape promoting element that improves the activity of MEND by releasing an encapsulated substance into the cytoplasm (see Patent Document 3).
  • GALA has been used as a functional element for the purpose of improving intracellular kinetics, but has not been known as a lung migratory element.
  • lung is mentioned as one of the target organs of the liposome modified with a certain kind of endosome-soluble peptide (see Patent Document 4)
  • the composition of the peptide described here is glutamic acid, alanine, Based on the repeating sequence of leucine and alanine (EALA), the composition of the GALA peptide according to the present application is greatly different, and further, the description that the liposome modified with the peptide specifically migrates to the lung is There is no description suggesting this.
  • An object of the present invention is to provide a technique for specifically delivering a target substance to the lung.
  • Another object of the present invention is to provide a vector which does not aggregate or hardly aggregates after storage for a certain period of time and / or has excellent storage stability.
  • the present inventors have found that the GALA peptide exhibits a high ability to transfer to the lung and have completed the present invention. It was.
  • the present invention provides the following uses, substance introduction agents and vectors.
  • Item 1. Use of the GALA peptide represented by SEQ ID NO: 1 as a lung migratory element for delivering a target substance to the lung.
  • Item 2. The use according to Item 1, wherein the GALA peptide is bound to a component of the vector.
  • Item 3. Item 3.
  • Item 1 or 2 wherein the vector contains a lipid and / or cholesterol, and the GALA peptide is bound to a cationic lipid and / or cholesterol.
  • Item 4. Item 3. The use according to Item 1 or 2, wherein the vector contains a cationic lipid and / or cholesterol, and the GALA peptide is bound to the cationic lipid and / or cholesterol.
  • Item 5. A substance-introducing agent that targets a lung that contains a target substance in a vector and the vector contains a GALA peptide represented by SEQ ID NO: 1.
  • Item 6. Item 6.
  • Item 7. Item 7.
  • Item 7. The substance introduction agent according to Item 5 or 6, wherein the vector contains a cationic lipid and / or cholesterol, and the GALA peptide is bound to the cationic lipid and / or cholesterol.
  • the vector is polyalkylene glycol, dextran, pullulan, ficoll, polyvinyl alcohol, styrene-maleic anhydride alternating copolymer, divinyl ether-maleic anhydride alternating copolymer, amylose, amylopectin, chitosan, mannan, cyclodextrin, pectin, Item 9.
  • the substance introducing agent according to any one of Items 5 to 8 which is modified with a hydrophilic polymer selected from the group consisting of carrageenan.
  • Item 10 The substance introduction agent according to any one of Items 5 to 9, wherein the target substance is a physiologically active substance that acts in the lung.
  • Item 11. Item 11.
  • the substance introduction agent according to any one of Items 5 to 10, wherein the target substance is selected from the group consisting of drugs, nucleic acids, peptides, proteins, sugars, and complexes thereof.
  • the target substance is partial double-stranded RNA (mdRNA), nicked dsRNA (ndsRNA), dsRNA with gap (gdsRNA), short interfering nucleic acid (siNA), siRNA, microRNA (miRNA), short hairpin RNA (shRNA) ), Short interfering oligonucleotides, substituted short interfering oligonucleotides, modified short interfering oligonucleotides, chemically modified dsRNA, post-transcriptional gene silencing RNA (ptgsRNA), any duplex Item 12.
  • mdRNA partial double-stranded RNA
  • ndsRNA nicked dsRNA
  • gdsRNA with gap gdsRNA
  • siNA short interfering nucleic acid
  • Item 13 Item 13.
  • PEI polyethyleneimine
  • Item 14 A vector for delivering a target substance to the lung, comprising the GALA peptide represented by SEQ ID NO: 1 as an element for selectively delivering the substance to the lung.
  • Item 15. Item 15.
  • the vector according to Item 14 wherein the vector comprises a cationic lipid and / or cholesterol, and the GALA peptide is bound to the cationic lipid and / or cholesterol.
  • Item 17. The vector according to Item 17.
  • the vector is polyalkylene glycol, dextran, pullulan, ficoll, polyvinyl alcohol, styrene-maleic anhydride alternating copolymer, divinyl ether-maleic anhydride alternating copolymer, amylose, amylopectin, chitosan, mannan, cyclodextrin, pectin, Item 18.
  • Item 19 The vector according to Item 18, wherein the polyalkylene glycol is PEG (preferably, PEG having a molecular weight of 2000).
  • Item 20 is PEG (preferably, PEG having a molecular weight of 2000).
  • auxiliary lipid Helper Lipid.
  • Item 21 The vector according to item 20, wherein the auxiliary lipid is EPC, DOPC, DOPE, or SOPE.
  • Item 22 The vector according to any one of Items 14 to 19, further comprising an auxiliary lipid (Helper Lipid).
  • the vector is a liposome
  • the liposome composition is selected from cationic lipid / Chol / auxiliary lipid / STR-PEG / Chol-GALA or auxiliary lipid / Chol / STR-PEG / Chol-GALA (more preferably selected from DOTMA, DODAP or DSTAP) Cationic lipid / Chol / EPC, auxiliary lipid selected from DOPE or SOPE / STR-PEG / Chol-GALA or EPC / Chol / STR-PEG / Chol-GALA, more preferably DOTMA / Chol / EPC / STR -PEG / Chol-GALA, DODAP / Chol / EPC / STR-PEG / Chol-GALA, DSTAP / Chol / EPC / STR-PEG / Chol-GALA, DOTMA / Chol / DOPE / STR- EG / Chol-
  • the vector is a liposome containing DOTMA, Chol, and EPC as components of a lipid membrane, and the lipid composition (molar ratio) of the liposome is 10 to 50/20 to 50/20 to 70 for DOTMA / Chol / EPC.
  • Item 15 The vector according to Item 14, wherein the liposome further comprises 1 to 15 mol% of STR-PEG2000 and 0.1 to 5 mol% of Chol-GALA with respect to the total lipid amount of DOTMA / Chol / EPC.
  • Item 24 A method of introducing a target substance into a lung by administering to a mammal a vector encapsulating a target substance and binding a GALA peptide represented by SEQ ID NO: 1.
  • Item 25 A method for treating lung cancer, comprising a step of administering a vector encapsulating an anticancer agent and binding a GALA peptide represented by SEQ ID NO: 1 to a mammal having lung cancer.
  • Item 26. Item 25. The treatment method according to Item 24, wherein the lung cancer is a cancer that has metastasized to the lung.
  • Item 27. A therapeutic agent for lung cancer, wherein an anticancer agent is encapsulated in a vector bound with the GALA peptide represented by SEQ ID NO: 1.
  • Item 29. Item 16. The use according to Item 3, the substance introduction agent according to Item 7, and the vector according to Item 15, wherein the GALA peptide is bound to a lipid component in the range of 1 to 4 mol% with respect to the total amount of lipid.
  • a vector or substance introduction agent for specifically delivering a target substance to the lung.
  • the vector or the substance introduction agent of the present invention can be transferred to the lung, and at the same time, can be inhibited from transferring to the liver, which is a major accumulation organ.
  • the vector or substance introduction agent of the present invention particularly the liposome, has a knockdown effect that surpasses existing siRNA delivery carriers, particularly in the lung, and it has been demonstrated that the introduction effect of the target substance is very excellent. Since the vector and the substance introduction agent containing the GALA peptide used in the present invention have no aggregation problem, they do not clog blood vessels.
  • the result of having evaluated the pulmonary transfer property of a GALA modification liposome over time is shown.
  • An enlarged view of the vertical axis of FIG. The result of having evaluated the liver transfer property of a GALA modification liposome over time is shown.
  • the result of having mixed blood and GALA modification MEND in arbitrary ratios and evaluating the interaction with a blood cell component is shown.
  • GALA-modified MEND labeled with siRNA [ 32 P] and lipid membrane [ 3 H] was administered via the tail vein, and [ 32 P] and [ 3 H] contained in the lungs for 1 hour were measured.
  • the result of having evaluated the transfer property to the lung of the modified MEND is shown.
  • FIG. 2 shows the results of tail vein administration of GALA-modified MEND encapsulating fluorescence-labeled siRNA, and the evaluation of the localization of GALA-modified MEND in the lung 1 hour later using a confocal laser scanning microscope.
  • FIG. 3 shows the results of evaluation of the knockdown effect of GALA-modified MEND and GALA-unmodified MEND in the lung 24 hours after the tail vein administration of GALA-modified MEND and GALA-unmodified MEND by qRT-PCR method. The results of evaluating the knockdown effect of GALA-modified MEND in the lung 24 hours later by qRT-PCR after GALA-modified MEND administration in the tail vein are shown.
  • the results of evaluating the knockdown effect of GALA-modified MEND in the liver 24 hours after administration of GALA-modified MEND by the qRT-PCR method are shown.
  • the knockdown effect of MEND at the time of using DOTMA, DSTAP, and DODAP as a cationic lipid is shown.
  • the knockdown effect of each MEND when EPC, DOPE, and SOPE are used as the helper lipid is shown.
  • the change in body weight at the time of continuous administration of GALA-modified MEND for 4 days is shown.
  • the measurement result of AST and ALT at the time of MEND 4 day continuous administration is shown.
  • the result of the pharmacokinetics evaluation of PEG modification MEND is shown.
  • the knockdown effect of PEG modification MEND is shown.
  • the knockdown effect of a MEND preservation product is shown.
  • the result of storage stability after storing GALA-modified MEND at room temperature for 1 month is shown.
  • the results show that MENDs with different GALA modification amounts were administered into the tail vein, and the knockdown effect of GALA-modified MEND in the lung 24 hours later was evaluated by the qRT-PCR method.
  • the lung metastasis inhibitory effect by GALA modification MEND administration in a lung metastasis model is shown.
  • the knockdown effect by GALA modification MEND administration in a lung metastasis model is shown.
  • the vector of the present invention can realize selective migration to the lung by containing the GALA peptide.
  • the “GALA peptide represented by SEQ ID NO: 1” is the following 30 amino acid peptide. Ala Ala Leu Ala Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu His Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Trp
  • the peptide described in SEQ ID NO: 1 has 4 units of a partial structure of glutamic acid (E) -alanine (A) -leucine (L) -alanine (A) in the sequence, and the partial structure is preferably 3 units or It is preferable that amino acid deletion, substitution or addition is performed in the other amino acid sequence while retaining 4 units, more preferably 4 units.
  • These modified GALA peptides are also included in the “GALA peptide represented by SEQ ID NO: 1” of the present invention.
  • the number and position of amino acids to be deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 are one or more, preferably one or several, and the specific range is deletion. Is usually 1 to 4, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and substitution is usually 1 to 6, preferably 1 to 4 and more preferably 1 to 2 The addition is usually 1 to 12, preferably 1 to 6, and more preferably 1 to 4.
  • Amino acid substitutions include hydrophobic amino acids (Leu, Val, Ile, Ala), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), basic amino acids (Arg, Lys, His), acidic amino acids (Glu, Asp), neutral Similar amino acid substitutions between amino acids (Gly, Ser, Thr, Cys, Met, Gln, Asn, Pro) are preferred.
  • the GALA peptide may be simply referred to as “GALA”.
  • the GALA peptide is preferably bound to a component constituting the vector.
  • components constituting the vector include lipids, proteins or peptides, sugar chains, water-soluble or water-miscible polymers (neutral, cationic or anionic), surfactants, and the like.
  • the bond includes any bond such as a covalent bond, an ionic bond, a hydrogen bond, and a coordination bond, and is preferably a covalent bond or a coordination bond, and most preferably a covalent bond.
  • the GALA peptide is contained in a carrier (vector) that can introduce a substance into cells.
  • Carriers (vectors) that can introduce substances into cells include lipid-based transfection reagents, virus-derived particles, liposomes, polyplexes, micelles, and the like. In a preferred embodiment, they are modified or bound to liposomes.
  • the GALA peptide may be bound to any of the components of the liposome such as phospholipid, cholesterol, lipid (preferably cationic lipid), auxiliary lipid (Helper Lipid) and the like.
  • Chol-GALA cholesterol-associated peptide
  • —O (C ⁇ O) — is bonded to the N-terminal amino group of the GALA peptide
  • —NH 2 is the amino group protecting the C-terminal carboxyl group of the GALA peptide.
  • the bond between cholesterol and GALA peptide may be a urethane bond as described above, and may be either an ester bond or an ether bond.
  • the cholesteryl group may be bound to either the N-terminus or C-terminus of the GALA peptide, or may be bound to any amino acid side chain of the GALA peptide.
  • the cholesteryl group may be bonded to the GALA peptide via any linker such as alkylene, peptide, or polyether.
  • the C terminal is an amide, but the C terminal may be another group such as a carboxylic acid (COOH), an ester, or a salt of a carboxylic acid.
  • the GALA peptide When the GALA peptide is bound to a lipid component such as cholesterol or phospholipid and contained in the vector or substance introduction agent, the GALA peptide is 0.1 to 5 mol%, preferably 0.3 to 4 mol, based on the total amount of lipid. %, More preferably 0.5 to 4 mol%, still more preferably 1 to 4 mol%, particularly preferably about 1.5 to 2 mol%.
  • the “total lipid amount” shown in this specification does not include the amount of the lipid component bound to the modifying component of the liposome. That is, the amount of lipid component bound to the GALA peptide is not included.
  • the vector is PEG modified, the amount of lipid component attached to PEG is not included.
  • the GALA modification amount (the ratio of the lipid bound with the GALA peptide to the total lipid amount) Is 5 mol%.
  • the GALA peptide is 0.01 to 10% by weight, preferably 0.1 to 5% by weight, more preferably 0.5 to 4% by weight, in particular, of the total weight of the vector. Preferably, about 1 to 2.5% by weight is used.
  • a GALA peptide is bound to cholesterol
  • the GALA peptide can be bound to a component of a vector other than cholesterol, and such aspects will be apparent to those skilled in the art.
  • the vector and the substance introduction agent of the present invention have a zeta potential of about ⁇ 100 to 100 mV, preferably about ⁇ 50 to 50 mV, more preferably about ⁇ 30 to 30 mV at a pH near neutrality (for example, pH 7 or 7.4). is there.
  • the zeta potential can be measured using a zeta sizer.
  • the average particle size of the vector and the substance introduction agent of the present invention is not particularly limited.
  • the particle size is 30 to 1000 nm, preferably 50 to 300 nm, more preferably 50 to 200 nm, and particularly 50 to 150 nm.
  • the average particle diameter can be measured by, for example, a dynamic light scattering method, a static light scattering method, an electron microscope observation method, an atomic force microscope observation method, or the like.
  • the introduction agent of the present invention contains a target substance to be delivered into a cell together with a vector.
  • the target substance may be covalently bound to the vector or may form a complex with the vector.
  • the vector is a hollow particle, it can be enclosed or encapsulated inside the vector.
  • the target substance of the present invention is a physiologically active substance that exhibits an effect when introduced into lung cells.
  • the substance-introducing agent of the present invention can be used either in vitro or in vivo for delivery of a target substance into lung cells.
  • the type of the target substance is not particularly limited.
  • drugs for example, drugs, nucleic acids, peptides (bioactive peptides such as oxytocin, bradykinin, thyrotropin releasing factor, enkephalin, peptide hormones, etc.), proteins (enzymes, interleukins, etc.) Cytokines, cell transmission factors, cell growth factors, etc.), sugars or complexes thereof, and the like, and can be appropriately selected according to the type of lung disease, diagnosis, treatment and the like.
  • the “nucleic acid” includes analogs or derivatives thereof (for example, siRNA, peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA, etc.) in addition to DNA or RNA. Further, the nucleic acid may be either single-stranded or double-stranded, and may be either linear or circular.
  • the target substance is a drug
  • anticancer agents for example, anticancer agents, vasodilators, pulmonary vasculitis treatment agents, antibacterial agents, antiviral agents, anti-inflammatory agents, bronchodilators, antitussives, pulmonary fibrosis inhibitors, antituberculosis agents, etc. Is mentioned.
  • anticancer agents doxorubicin, daunorubicin, cisplatin, oxaliplatin, carboplatin, paclitaxel, irinotecan, SN-38, actinomycin D, vincristine, vinblastine, methotrexate, azathioprine, fluorouracil, mitomycin C, docetaxel, Famide, capecitabine, epirubicin, gemcitabine, mitoxantrone, leucovorin, vinorelbine, trastuzumab, etoposide, estramustine, prednisone, interferon alpha, interleukin-2, bleomycin, ifosfamide, mesna, altretamine, topotecan, cytarazolone, cytarazolone Dexamethasone, mercaptopurine, thioguanine, fludarabine, gemts Mab, idarubicin
  • vasodilator examples include bosentan, ambrisentan, beraprost sodium, sildenafil, epoprostenol and the like.
  • pulmonary vasculitis therapeutic agents include corticosteroids, cyclophosphamide, azathioprine, methotrexate, aspirin and the like.
  • antibacterial agents include amphotericin B.
  • Antiviral agents include vidarabine, acyclovir, trifluorothymidine and the like.
  • anti-inflammatory agent examples include phenylbutazone, acetaminophen, ibuprofen, indomethacin, sulindac, piroxicam, diclofenac, prednisone, beclomethasone, dexamethasone and the like.
  • the target substance is a nucleic acid
  • mdRNA partial double-stranded RNA
  • ndsRNA nicked dsRNA
  • gdsRNA gapped dsRNA
  • siRNA siRNA
  • miRNA microRNA
  • shRNA hairpin RNA
  • ptgsRNA post-transcriptional gene silencing RNA
  • dsRNA double-stranded RNA
  • the target substance can be used alone or in admixture of two or more.
  • two or more siRNAs can be used in combination.
  • the substance introduction agent contains a nucleic acid such as siRNA as a target substance, it is preferable that a cation such as polyethyleneimine (PEI) coexists.
  • PEI polyethyleneimine
  • the double stranded RNA is at the 3 ′ end of the double stranded RNA, such as an overhang containing deoxyribonucleotides or two deoxyribonucleotides (eg, thymidine, adenine). It may contain 1 to 4 nucleotide overhangs at one or both ends. Double stranded RNA may have blunt ends at one or both ends. In some embodiments, the 5 'ends of the first and second strands are phosphorylated.
  • the 3 'terminal nucleotide overhang may comprise a ribonucleotide or deoxyribonucleotide that is chemically modified in the sugar, base, or backbone of the nucleic acid.
  • the 3'-terminal nucleotide overhang may comprise one or more universal base ribonucleotides.
  • the 3 'terminal nucleotide overhang may comprise one or more acyclic nucleotides.
  • the dsRNA is 5 ′ phosphate (Martinez et al., Ell Cell .. 110: 563-574, 2002; and Schwarz et al., Molec. Cell. 10: 537. -568, 2002) or a terminal phosphate group such as 5 ', 3' diphosphate.
  • Double-stranded RNA consists of 2′-deoxy, 2′-O-methyl, 2′-O-methoxyethyl, 2′-O-2-methoxyethyl, halogen, 2′-fluoro, 2′-O-allyl, Or it may further comprise 2 ′ sugar substitutions such as any combination thereof.
  • the double stranded RNA is alkyl, abasic, deoxyabasic, glyceryl, dinucleotide, acyclic nucleotide, on one or both ends of the first strand or one or more second strands, It further includes an end cap substituent such as an inverted deoxynucleotide moiety, or any combination thereof.
  • the double stranded RNA is independently phosphorothioate, chiral phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphate triester, aminoalkylphosphate triester, methylphosphonate, alkylphosphonate, 3′- Alkylene phosphonates, 5'-alkylene phosphonates, chiral phosphonates, phosphonoacetates, thiophosphonoacetates, phosphinates, phosphoramidates, 3'-aminophosphoramidates, aminoalkyl phosphoramidates, At least one modified internucleoside linkage, such as thionophosphoramidate, thionoalkylphosphonate, thionoalkylphosphate triester, selenophosphate, boranophosphate linkage, or any combination thereof.
  • Double-stranded RNA is 5-methylcytosine; 5-hydroxymethylcytosine; xanthine; hypoxanthine; 2-aminoadenine; 6-methyl, 2-propyl, or other alkyl derivatives of adenine and guanine; 8-substituted Adenine and guanine (8-aza, 8-halo, 8-amino, 8-thiol, 8-thioalkyl, 8-hydroxyl, etc.); 7-methyl, 7-deaza, and 3-deazaadenine and guanine; 2-thiouracil; 2 2-thiocytosine; 5-methyl, 5-propynyl, 5-halo (such as 5-bromo or 5-fluoro), 5-trifluoromethyl, or other 5-substituted uracil and cytosine; and 6- By using nucleic acid analogs such as azouracil, substitution or modification (including chemical modification) Can)
  • RNA such as double stranded RNA (dsRNA)
  • dsRNA double stranded RNA
  • Non-limiting examples of such chemical modifications include internucleotide phosphorothioate linkages, 2′-deoxyribonucleotides, 2′-O-methylribonucleotides, 2′-deoxy-2′-fluororibonucleotides, “acyclic” "Incorporation of nucleotides, 5'-C-methyl nucleotides, and glyceryl and / or reverse deoxyabasic residues at the termini. These chemical modifications can maintain RNAi activity in the cell.
  • the liposome is a closed vesicle having a lipid bilayer structure
  • it may be a multilamellar liposome (MLV), SUV (small unilamellar vesicle), LUV (large uniaxial molecular vesicle), GUV (giant unimolecular cellular), etc. It may be a single membrane liposome.
  • the vector (carrier) of the present invention can be modified with a hydrophilic polymer.
  • hydrophilic polymers examples include polyalkylene glycols (polyalkylene glycol copolymers such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, polybutylene glycol, or block copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol), dextran, pullulan, ficoll, and polyvinyl alcohol.
  • Styrene-maleic anhydride alternating copolymer divinyl ether-maleic anhydride alternating copolymer, amylose, amylopectin, chitosan, mannan, cyclodextrin, pectin, carrageenan, etc.
  • polyalkylene glycol polyethylene glycol, Polypropylene glycol, polybutylene glycol, or block copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol Copolymers of polyalkylene glycols such as body
  • PEG polyethylene glycol
  • the length of PEG can be appropriately selected within a molecular weight range of about 500 to 10,000, preferably a molecular weight of 1,000 to 5,000, and more preferably a molecular weight of 2,000.
  • lipids modified with PEG include DSPE (distearoyl phosphatidylethanolamine) -PEG2000, DMPE (dimyristol phosphatidylylamine) -PEG2000, DSG (distearoylyglycerol, PEG2000)
  • Examples thereof include C8 ceramide-PEG2000, C16 ceramide-PEG2000, and among these, STR-PEG2000 or C8ceramide-PEG2000 is preferable.
  • Those skilled in the art can select the molecular weight of other hydrophilic polymers as appropriate.
  • a liposome is modified with PEG, stearylated PEG (STR-PEG), C8 ceramide-PEG, or cholesterylated PEG (Chol-PEG) is used for lung migration performance and target substance (eg, nucleic acid drug such as siRNA).
  • target substance eg, nucleic acid drug such as siRNA.
  • a vector for example, a liposome preparation
  • DSPE-PEG, DSG-PEG, C16 ceramide-PEG, etc. in blood stability It is preferable for improving.
  • the hydrophilic polymer is preferably modified at a ratio of about 1 to 15 mol% when the lipid constituting the liposome is 100 mol%.
  • liposomes will be described as an example of vectors (carriers) for delivering a target substance in vitro or in vivo to the lung.
  • the present invention is not limited to liposomes, and any vector capable of introducing a GALA peptide into cells. These vectors (carriers) are included in the present invention.
  • the type of lipid constituting the lipid bilayer is not particularly limited, and specific examples thereof include phosphatidylcholine (for example, dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine).
  • phosphatidylcholine for example, dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine.
  • phosphatidylglycerol eg, dioleoylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylglycerol, dimyristoylphosphatidylglycerol, dipalmitoylphosphatidylglycerol, distearoylphosphatidylglycerol
  • phosphatidylethanolamine eg, dioleoyl Phosphatidylethanolamine, dilauroyl phospha Phospholipids such as diethanolamine, dimyristoylphosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, distearoylphosphatidiethanolamine
  • phosphatidylserine phosphatidylinositol, phosphatidic acid, cardiolipin, etc .
  • phosphatidic acid phosphatidic acid
  • cardiolipin etc.
  • sphingomyelin ganglioside, etc.
  • glycolipids examples thereof include glycolipids, and one or more of these can be used.
  • the phospholipid may be egg yolk, soybean or other natural lipid derived from animals and plants (eg, egg yolk lecithin, soybean lecithin, etc.), synthetic lipid or semi-synthetic lipid. These lipids can be used alone or in admixture of two or more.
  • lipid bilayers for example, cholesterol, cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol to physically or chemically stabilize the lipid bilayer and to regulate the fluidity of the membrane
  • Sterols derived from animals such as stigmasterol, sitosterol, campesterol, sterols derived from plants such as brassicasterol; Sterols derived from microorganisms such as timosterol and ergosterol; Sugars such as glycerol and sucrose; Triolein 1 type, or 2 or more types can be contained among glycerol fatty acid esters, such as trioctanoin.
  • the content is not particularly limited, but is preferably 5 to 40% (molar ratio) with respect to the total amount of lipid constituting the lipid bilayer, and is preferably 10 to 30% (molar ratio). Further preferred.
  • the liposome of the present invention has a GALA peptide composed of 30 amino acids on its surface.
  • the outer surface of the lipid bilayer is the surface of the liposome, and for the multilamellar liposome, the outer surface of the outermost lipid bilayer is the surface of the liposome.
  • the liposome of the present invention may have the above peptide in a portion other than the surface (for example, the inner surface of the lipid bilayer).
  • the vector of the present invention preferably contains a cationic lipid.
  • the cationic lipid include DODAC (dioctadecyldimethylammonium chloride), DOTMA (N- (2,3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylaluminumium), DDAB (didodecylamyloidium, dododecylamyloidium).
  • a preferred cationic lipid is DOTMA, DSTAP or DODAP, and particularly preferably DOTMA.
  • Cationic lipids can be used alone or in admixture of two or more.
  • DOTMA and DSTAP have quaternary amines and are always positively charged, while DODAP has tertiary amines and has no charge at physiological pH.
  • the structure and characteristics of the cationic lipid can be widened by changing the type and blending amount of the cationic lipid.
  • the vector of the present invention preferably contains an auxiliary lipid.
  • the co-lipid for example, EPC (egg phosphatidylcholine), DLPC (dilinoleoylphosphatidylcholine), DMPC (dimyristoylphosphatidylcholine), DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine), DSPC (distearoylphosphatidylcholine), POPC (palmitoyloleoylphosphatidylcholine), DOPC (dioleoylphosphatidylcholine), DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), SOPE ( stearyloylylphosphatidyl holine), and the like.
  • EPC egg phosphatidylcholine
  • DLPC diilinoleoylphosphatidylcholine
  • DMPC diimyristoylphosphatidylcholine
  • DPPC dipalmito
  • MEND containing DOPC as an auxiliary lipid shows no aggregation even after storage at room temperature for 1 month, and DOPC is excellent in storage stability.
  • the GALA peptide is modified with a hydrophobic group or a hydrophobic compound, the hydrophobic group or the hydrophobic compound is inserted into the lipid bilayer, and the peptide is exposed from the lipid bilayer.
  • the liposome which can be illustrated can be illustrated.
  • “the peptide is exposed from the lipid bilayer” means that the peptide is exposed from either the outer surface or the inner surface of the lipid bilayer, or is exposed from both Is included.
  • the hydrophobic group or the hydrophobic compound is not particularly limited as long as it can be inserted into the lipid bilayer.
  • the hydrophobic group include saturated or unsaturated fatty acid groups such as stearyl group, palmityl group, oleyl group, palmitooleyl group, linoleyl group, and linoleyl group, aliphatic alcohol, aliphatic amine, and other carbon atoms of 10 or more.
  • hydrocarbon-containing groups for example, sterol-derived groups such as cholesteryl group (Chol)
  • fatty acid groups having 10 to 20 carbon atoms for example, palmitoyl group, oleyl group) , Stearyl group, arachidoyl group, etc.
  • hydrophobic compound examples include phospholipids, glycolipids or sterols exemplified above, long-chain aliphatic alcohols (eg, phosphatidylethanolamine, cholesterol, etc.), polyoxypropylene alkyls, glycerin fatty acid esters, and the like. .
  • the liposome of the present invention can be prepared using a known method such as a hydration method, an ultrasonic treatment method, an ethanol injection method, an ether injection method, a reverse phase evaporation method, or a freezing / thawing method. Examples of liposome production by the hydration method are shown below.
  • a lipid membrane is obtained by dissolving a lipid that is a component of the lipid bilayer and the peptide modified with a hydrophobic group or a hydrophobic compound in an organic solvent, and then evaporating and removing the organic solvent.
  • examples of the organic solvent include hydrocarbons such as pentane, hexane, heptane, and cyclohexane; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene; methanol, ethanol, and the like Lower alcohols; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; ketones such as acetone and the like. These may be used alone or in combination of two or more. Subsequently, the lipid membrane can be hydrated and stirred or sonicated to produce a liposome having the peptide on its surface.
  • hydrocarbons such as pentane, hexane, heptane, and cyclohexane
  • halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform
  • aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene
  • methanol, ethanol, and the like Lower alcohols
  • Lipids which are constituents of the lipid bilayer, are dissolved in an organic solvent, and then the organic solvent is removed by evaporation to obtain a lipid membrane.
  • the lipid membrane is hydrated and stirred or sonicated to produce liposomes.
  • the peptide can be introduced onto the surface of the liposome by adding the peptide modified with a hydrophobic group or a hydrophobic compound to the external solution of the liposome.
  • the said peptide can be introduce
  • the preparation of liposomes in the case of using a quaternary amine as the cationic lipid is carried out by the same method as in Example 3-1, which will be described later, a method according to this, or a combination thereof with a conventional method.
  • the liposome can be prepared by a method similar to Example 3-2 described later, a method analogous thereto, or a combination of these with a conventional method.
  • the ratio of cationic lipid / Chol / auxiliary lipid can be appropriately changed.
  • the composition ratio is preferably 10 to 50/20 to 50/20 to 70, more preferably 20 to 40/30 to 50/20 to 40, and 30/40/30. It is particularly preferred.
  • a preferred combination of cationic lipid / Chol / auxiliary lipid is a cationic lipid selected from DOTMA, DODAP or DSTAP, or an auxiliary lipid selected from DOPE or SOPE, more preferably DOTMA / Chol / EPC, DODAP / Chol / EPC, DSTAP / Chol / EPC, DOTMA / Chol / DOPE, and DOTMA / Chol / SOPE.
  • the addition ratio of Chol-GALA can be changed as appropriate.
  • the total lipid amount (cationic lipid / Chol / total lipid of auxiliary lipid) for example, 0.1 to 5 mol%, preferably 0.3 to 4 mol%, more preferably 0.5 to 4 mol%, still more preferably 1 to 4 mol%, and particularly preferably 1.5 to 4 mol%. 2 mol%.
  • PEG can be appropriately modified to the liposome.
  • the addition ratio of PEG can be appropriately changed.
  • 0.1 to 15 mol% with respect to the total lipid amount (cationic lipid / Chol / total lipid of auxiliary lipid) Preferably, it is 1 to 5 mol%.
  • the added PEG is preferably PEG bonded to lipid, more preferably STR-PEG or C8 ceramide-PEG, and particularly preferably STR-PEG2000 or C8 ceramide-PEG2000.
  • neutral liposomes having the liposome composition as auxiliary lipid / Chol can be prepared using the above-mentioned auxiliary lipid, and the composition ratio (molar ratio) can be appropriately changed. It is preferably 10 to 60, more preferably 60 to 80/20 to 40, and particularly preferably 70/30.
  • auxiliary lipid / Chol are EPC / Chol, DLPC / Chol, DMPC / Chol, DPPC / Chol, DSPC / Chol, POPC / Chol, DOPC / Chol, DOPE / Chol, and SOPE / Chol, and more preferably Is EPC / Chol, DOPC / Chol, DOPE / Chol, SOPE / Chol, and particularly preferably EPC / Chol.
  • the addition ratio of Chol-GALA can be appropriately changed. For example, 0.1% of the total lipid amount (auxiliary lipid / total lipid of Chol) can be used.
  • PEG can be modified as appropriate to the liposome, and when PEG is modified, the addition ratio of PEG can be changed as appropriate and is based on the total lipid amount (auxiliary lipid / total lipid of Chol). Examples thereof include 0.1 to 15 mol%, and preferably 1 to 5 mol%.
  • the added PEG is preferably a PEG modified with lipid, more preferably STR-PEG or C8 ceramide-PEG, and particularly preferably STR-PEG2000 or C8 ceramide-PEG2000.
  • the preferred liposome composition of the present invention is cationic lipid / Chol / auxiliary lipid / STR-PEG / Chol-GALA or auxiliary lipid / Chol / STR-PEG / Chol-GALA, more preferably from DOTMA, DODAP or DSTAP.
  • the STR-PEG is particularly preferably STR-PEG2000 having a PEG molecular weight of 2000.
  • the most preferred liposome of the present invention has a composition of DOTMA / Chol / EPC / STR-PEG2000 / Chol-GALA, and the composition ratio (molar ratio) of DOTMA / Chol / EPC is 10 to 50/20 to 50/20.
  • STR-PEG2000 is preferably 1-15 mol% and Chol-GALA is 0.1-5 mol% with respect to the total lipid amount of DOTMA / Chol / EPC;
  • the composition ratio (molar ratio) of DOTMA / Chol / EPC is 20 to 40/30 to 50/20 to 40, and STR-PEG2000 is 1 to 5 mol% with respect to the total lipid amount of DOTMA / Chol / EPC.
  • Chol-GALA is more preferably 1 to 4 mol%;
  • the composition ratio (molar ratio) of DOTMA / Chol / EPC is 30/40/30.
  • STR-PEG2000 is 1 to 5 mol% and Chol-GALA is 1 with respect to the total lipid amount of DOTMA / Chol / EPC. Most preferred is 5 to 2 mol%. Since STR-PEG2000 and Chol-GALA are modifying components of liposomes, their added amount was expressed as a ratio relative to the total lipid amount of liposomes composed of three components of DOTMA / Chol / EPC as 100 mol%.
  • the target substance to be delivered into lung cells can be encapsulated inside the liposome of the present invention.
  • the target substance to be encapsulated in the substance introduction agent (especially liposome) of the present invention is the above-mentioned drug (anticancer agent, vasodilator, antibacterial agent, etc.), nucleic acid (DNA, RNA, analogs or derivatives thereof) depending on the type of lung disease (For example, siRNA, peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA, etc.), peptides (physiologically active peptides such as oxytocin, bradykinin, thyrotropin releasing factor, enkephalin, peptide hormones, etc.) etc.
  • lung disease By encapsulating a target substance, it is possible to treat or prevent lung disease, as used herein as “pulmonary disease”, lung cancer, pulmonary inflammatory disease, pulmonary fibrosis, pulmonary embolism, pulmonary hypertension, Pulmonary vasculitis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), asbestosis / dust disease, asthma, bronchodilation , Bronchopulmonary dysplasia (BPD), chronic bronchitis, chronic cough, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), cold, cystic fibrosis, emphysema, hantavirus, histoplasmosis, influenza, legionellosis, lymphatic vessel Leiomyosarcosis, pertussis, pleurisy, pneumothorax, primary alveolar hypoventilation syndrome, alveolar proteinosis, respiratory distress syndrome, RS virus, sarcoidosis, severe acute respiratory syndrome (SARS), tuberculosis, etc.
  • pulmonary disease lung cancer,
  • Pulmonary diseases that are preferable for treatment or prevention include pulmonary diseases related to pulmonary blood vessels, and include lung cancer, pulmonary hypertension, pulmonary vasculitis, etc.
  • Lung cancer includes not only primary lung cancer but also metastatic lung cancer that has metastasized from organs other than lung, and other organs that originate from lung cancer.
  • the substance introduction agent of the present invention in order to suppress cancer metastasis to (eg, adrenal gland, liver, brain, bone, etc.) Treatment of lung cancer, cancer from lung
  • the target substance encapsulated in the substance-introducing agent of the present invention for inhibiting metastasis include the above-mentioned anticancer agents (for example, amrubicin hydrochloride, gefitinib, cisplatin, vinblastine, mitomycin C, vinorelbine, paclitaxel, docetaxel, gemcitabine, carboplatin, Irinotecan, tegafur, etoposide, vincristine, cyclophosphamide, doxorubicin, ifosfamide, vindesine, etc.), factors involved in angiogenesis (eg, CD31, ESAM, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, Dll, SFRP, CD151, bFGF, TGF ⁇ 1, PDGF, HGF
  • Examples of the target substance to be encapsulated in the substance-introducing agent of the present invention for pulmonary hypertension include the aforementioned vasodilators (for example, bosentan, ambrisentan, beraprost sodium, sildenafil, epoprostenol, etc.), factors involved in vasodilation (e.g., endothelin receptor (ET a, ET B), PDE5, etc.) are preferred anti siRNA of.
  • vasodilators for example, bosentan, ambrisentan, beraprost sodium, sildenafil, epoprostenol, etc.
  • factors involved in vasodilation e.g., endothelin receptor (ET a, ET B), PDE5, etc.
  • the target substance to be encapsulated in the substance introduction agent of the present invention for pulmonary vasculitis corticosteroids, cyclophosphamide, azathioprine, methotrexate, aspirin and the like are preferable.
  • the substance introduction agent of the present invention can be used either alone or together with other treatments for lung diseases.
  • the target substance When the target substance is water-soluble, it is possible to encapsulate the target substance in the aqueous phase inside the liposome by adding the target substance to an aqueous solvent used when hydrating the lipid membrane in the production of liposomes. it can.
  • the target substance When the target substance is fat-soluble, the target substance can be encapsulated in the lipid bilayer of the liposome by adding the target substance to an organic solvent used in the production of the liposome.
  • “encapsulation” includes both a case where a target substance is contained inside a hollow particle such as a liposome and a case where the substance is held on a surface portion constituting a vector such as a lipid bilayer membrane.
  • the species to which the target substance is delivered is not particularly limited as long as it is a vertebrate having a lung, but is preferably a mammal.
  • mammals include humans, monkeys, cows, sheep, goats, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, rats, mice, guinea pigs, and the like.
  • the liposome of the present invention can be used in the state of a dispersion, for example.
  • a dispersion solvent for example, buffer solutions such as physiological saline, phosphate buffer solution, citrate buffer solution, and acetate buffer solution can be used.
  • additives such as sugars, polyhydric alcohols, water-soluble polymers, nonionic surfactants, antioxidants, pH regulators, hydration accelerators may be added to the dispersion.
  • the liposome of the present invention can also be used in a state where the dispersion is dried (for example, freeze-dried, spray-dried, etc.).
  • the dried liposome can be made into a dispersion by adding a buffer solution such as physiological saline, phosphate buffer, citrate buffer, or acetate buffer.
  • Each liposome can be used both in vitro and in vivo.
  • examples of the administration route include intravenous injection, infusion, etc., and the dosage and administration frequency depend on the type and amount of the target substance encapsulated in the liposome according to the present invention. It can be adjusted accordingly.
  • the liposome of the present invention can be safely administered without any weight loss or liver damage.
  • EPC was purchased from Nippon Oil & Fats (Tokyo, JAPAN).
  • DOTAP, DSTAP, DODAP, Cholesterol, DOPE, SOPE, DOPC, C8 Ceramide-PEG2000 were purchased from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA).
  • DOTMA was purchased from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokyo, JAPAN).
  • STR-PEG2000 was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • PEI branch type, Mw. Ave. 10,000
  • Transaminase CII-Test Wako was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • RNAlater was purchased from Ambion. High Capacity RNA-to-cDNA Kit and TaqMan Gene Expression Master Mix were purchased from Applied Biosystems.
  • CD31 Forward CAGAGCGGATAATTGCCATCC (SEQ ID NO: 10) CD31 Reverse: ACAGGATGGAAATCACAACTTTCATC (SEQ ID NO: 11) CD31 Probe: [FAM] ACCCTCAGGATCTCGCTGAACACCGC [TAMRA] (SEQ ID NO: 12) CD34 Forward: TCTGCCTGGAACTAAGTGAAGC (SEQ ID NO: 13) CD34 Reverse: CCTCAGACTGGGCTAGAAGCA (SEQ ID NO: 14) CD34 Probe: [FAM] ACCAGCATCAGCCCTCAGCCTCCTCC [TAMRA] (SEQ ID NO: 15) ICR mouse male 5 weeks old and C57BL / 6 mouse male 6 weeks old were purchased from Japan SLC. In addition, unless otherwise specified, commercially available special grades or first grades or equivalents thereof were used.
  • lipid thin film For the preparation of the lipid thin film, a pump DIVAC 1.2, Trap EVALA UNI TRAP UT-1000 (both Tokyo Science Instruments) were used.
  • sonication a bath sonicator AU-25C (Aiwa Medical Industry) was used.
  • ZETA SIZER Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd.) was used for the measurement of particle diameter and ⁇ potential by dynamic light scattering (DLS).
  • DLS dynamic light scattering
  • ABI 7500 real-time system (Applied Biosystems) was used.
  • the liquid scintillation counter TRI-CABB 1600TR (PACKARD) was used for ⁇ -ray measurement.
  • CLSM confocal laser scanning microscope
  • A1 Nikon
  • laser Ar laser and He / Ne laser were used.
  • PCR thermal cycler TP3000 (Takara Bio Inc.) was used.
  • Docu-pHMeter (Sartorius) was used.
  • the lipid used was adjusted to an arbitrary concentration (1 to 10 mM) by diluting with an appropriate amount of EtOH.
  • Chol-GALA was purified by reverse phase HPLC using COSMOSIL 5C4-AR-300 (Size 10 ⁇ 250 mm). H 2 O / 0.1% TFA was Buffer A, and CH 3 CN / 0.1% TFA was Buffer B. After injecting Chol-GALA (Purity:> 71%) dissolved in DMF (4 mg / mL as Crude) at a flow rate of 2.0 mL / min and 25 ° C., 50% B ⁇ 95% B (20 min) A gradient was applied (details below). Chol-GALA was recovered by detecting the absorbance at 215 nm and lyophilized.
  • the particle size and ⁇ (zeta) potential of Liposome and MEND were measured using Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK).
  • the experimental data is expressed as an average value ⁇ standard deviation of the experimental values of three times or more unless otherwise specified.
  • the test was performed by One-way ANOVA, and further multiple comparison was performed by the Dunnett method, and the case where P ⁇ 0.05 was considered significant.
  • lipid composition is EPC / Chol / STR-PEG2000 / Chol.
  • a lipid thin film, which is GALA was prepared (abbreviated as “GALA-Liposome” in FIG. 1).
  • GALA-Liposome lipid thin film represented by “Cationic-Liposome” in FIG. 1
  • the molar ratio of DOTMA (EtOH solution), Chol, and EPC is set to 30/40/30, and the lipid composition is obtained by the same operation as above.
  • a lipid thin film (Liposome b) was prepared in which DOTMA / Chol / EPC. 2) Preparation of liposome 10 mM HEPES buffer 5% Glucose (HBG) (in vivo experiment), 10 mM so that the lipid concentration prepared in 1) above is 2.64 mM (in vivo experiment) and 0.55 mM (in vitro experiment). After adding HEPES buffer (HB) (in vitro experiment), the mixture was hydrated at room temperature for 15 minutes or more. Then, the liposome was prepared by performing ultrasonic treatment for about 1 minute with a bathtub-type sonicator.
  • Example 2 Evaluation of liposome pharmacokinetics 1
  • Administration of liposome, recovery of organ, measurement of [ 3 H] The lipid membrane of the liposome prepared in 2) above is labeled with [ 3 H] did.
  • Mice ICR, 5 weeks old, rabbit
  • Mice were administered from the tail vein under the condition of 10 ⁇ L Liposome / g mouse.
  • Mice were treated with ether anesthesia 1, 5, 15 minutes and 1, 6 hours after administration, and then laparotomized. After blood was collected from the inferior vena cava, the lungs and liver were removed.
  • FIG. 1-A, FIG. 1-B, and FIG. 2 show the results of evaluating the migration of the GALA-modified liposome (GALA-Liposome) over time into the lungs and liver.
  • GALA-Liposome GALA-modified liposome
  • Example 3-1 Preparation of MEND1 1) Preparation of lipid thin film In the same manner as in Example 1, DOTMA (EtOH solution), Chol (EtOH solution), EPC (EtOH solution) were added to a glass test tube so that the molar ratio was 30/40/30, and an appropriate amount of EtOH was added.
  • lipid thin film (liposome b) whose lipid composition is DOTMA / Chol / EPC was prepared by distilling a solvent off.
  • DOTMA / Chol / EPC / STR-PEG2000 lipid thin film
  • MEND1 lipid thin film
  • DOTMA lipid thin film
  • Chol-GALA lipid thin film
  • siRNA core particle solution was added to the test tube prepared with the lipid thin film obtained in the above 1) so that the lipid concentration was 2.64 mM, and then hydrated at room temperature for 15 minutes or more. Then, MEND was prepared by performing ultrasonic treatment for about 1 minute with a bath sonicator, and MEND1 and GALA-MEND1 encapsulating siRNA core particles were prepared.
  • Example 3-2 Preparation of MEND2
  • DODAP EtOH solution
  • Chol EtOH solution
  • EPC EtOH solution
  • STR-PEG2000 (EtOH solution) was added to the obtained lipid solution, and 5 mol% of the total lipid amount of liposome c was added to prepare a lipid thin film having a lipid composition of DODAP / Chol / EPC / STR-PEG2000 (hereinafter referred to as “lipid lipid”). , And may be abbreviated as “MEND2”).
  • MEND2 lipid composition of DODAP / Chol / EPC / STR-PEG2000
  • MEND2 lipid composition of DODAP / Chol / EPC / STR-PEG2000
  • siRNA solution and the PEI solution were diluted with HBG (pH unadjusted (pH 5.0)) to prepare acidic solution core particles.
  • HBG pH unadjusted (pH 5.0)
  • MEND MEND is prepared by adding an equal amount of HBG (pH 8.1) to the siRNA core particle solution so that the prepared solution becomes neutral, and siRNA core particles are prepared.
  • Encapsulated MEND2 and GALA-MEND2 were prepared.
  • Example 4 Interaction with blood cells Mouse blood (containing heparin, 20 units / mL) and GALA-MEND1 solution were mixed at a volume ratio of 1: 1, and the condition was 37 ° C. Mix for 5 minutes using a shaker (Sample 1). Blood was further added to this mixed solution to obtain a volume ratio of 10: 1, and then mixed under the same conditions as before (Sample 2). 10 ⁇ L of Samples 1 and 2 were added on a slide glass and a cover glass was placed thereon, and then observed using a microscope.
  • FIG. 3 shows the results of evaluating the interaction with blood cell components by mixing blood and the obtained GALA-MEND1 at an arbitrary ratio.
  • MEND1 or GALA-MEND1 solution (2 mg siRNA / kg mouse) was administered from the tail vein of a mouse (ICR, 5 weeks old, sputum). One hour after administration, the mice were treated with ether anesthesia, then laparotomy was performed, blood was collected from the inferior vena cava, and the lungs were removed.
  • FIG. 4 shows the results of evaluating the transferability of GALA-modified MEND to the lung.
  • Example 6 Observation of localization of MEND in lung by CLSM MEND1 and GALA-MEND1 prepared using Cy5-labeled siRNA were used as administration samples.
  • MEND1 or GALA-MEND1 solution (2 mg siRNA / kg mouse) obtained in Example 3-1 was administered from the tail vein of a mouse (ICR, 5 weeks old, sputum). One hour after tail vein administration, the lungs were removed from the mice under anesthesia, and lung tissue pieces of about several mm were prepared.
  • the prepared lung tissue pieces were infiltrated into a GSL I-B4 Isolectin FITC conjugate (Funakoshi) solution (diluted to 20 ⁇ g / mL with physiological saline) for 30 minutes, and then observed using CLSM.
  • GSL I-B4 Isolectin FITC conjugate (Funakoshi) solution (diluted to 20 ⁇ g / mL with physiological saline) for 30 minutes, and then observed using CLSM.
  • FIG. 5 shows the results of evaluating the localization of GALA-modified MEND in the lung 1 hour later using a confocal laser scanning microscope after administering MEND1 or GALA-MEND1 encapsulating fluorescently labeled siRNA into the tail vein.
  • Example 7-1 In vivo knockdown effect with or without GALA modification Using GALA-modified MEND and GALA unmodified MEND, the knockdown effect with or without GALA modification was examined. 1) Preparation of MEND solution A GALA-MEND1 solution and a GALA-unmodified MEND1 solution were prepared in the same manner as in Example 3-1.
  • RNA extraction was performed using RNA mini kit and QIA cube (manufactured by QIAGEN) according to the attached protocol. 4) Reverse transcription reaction CDNA was prepared using 1 ⁇ g of Total RNA according to the attached protocol using High Capacity RNA-to-cDNA Kit.
  • Denture and reverse transcription reaction were performed using a thermal cycler under the conditions of Denatur (65 ° C., 5 min ⁇ 4 ° C., hold) and reverse transcription reaction (42 ° C., 60 min ⁇ 95 ° C., 5 min ⁇ 4 ° C., hold). . 5) mRNA quantification by Real-time PCR method MRNA (CD31) was quantified using a relative quantification method ( ⁇ Ct method) based on the TaqMan method. 100 ⁇ M Upper Primer 0.25 ⁇ L, 100 ⁇ M Lower Primer 0.25 ⁇ L, 100 ⁇ M probe 0.0625 ⁇ L, filtered DDW 6.9375 ⁇ L, TaqMan M.I. M.M.
  • initial denaturation was performed at 95 ° C. for 10 min, followed by 40 cycles of PCR reaction with 95 ° C. for 15 sec PCR denaturation reaction and 60 ° C. for 1 min annealing / extension reaction. .
  • CD34 as an internal standard gene, the amount of CD31 mRNA was calculated using relative quantification by the ⁇ Ct method.
  • FIG. 6 shows the results of evaluating the knockdown effects of GALA-MEND1 and MEND1 in the lung 24 hours later by qRT-PCR method after administering GALA-MEND1 and MEND1 into the tail vein.
  • GALA (+) indicates the result of GALA-MEND1
  • GALA ( ⁇ ) indicates the result of MEND1.
  • Example 7-2 In vivo knockdown evaluation 1
  • in vivo transcription, mRNA extraction, reverse transcription reaction, and mRNA quantification by Real-time PCR method were used.
  • GALA modification amount is 2 mol% with respect to the total lipid amount.
  • FIG. 7 shows the result of evaluating the knockdown effect of GALA-modified MEND in the lung 24 hours later by qRT-PCR method after administering GALA-modified MEND into the tail vein.
  • FIG. 8 shows the results of evaluating the knockdown effect of GALA-modified MEND in the liver 24 hours later by qRT-PCR method after administering GALA-modified MEND in the tail vein.
  • FIG. 9 shows the results of evaluating the knockdown effect of GALA-modified MEND in the spleen 24 hours later by qRT-PCR method after administering GALA-modified MEND into the tail vein.
  • GALA-modified MEND has a significantly stronger knockdown effect in the lung than AtuPLEX, which is an existing carrier.
  • GALA-modified MEND was shown to have a knockdown effect in the liver when administered at 1.0-4.0 mg / kg, as compared to the existing carrier AtuPLEX. Compared with FIG. 7, it was shown that the knockdown effect in the lung was much stronger than in the liver.
  • GALA-modified MEND did not have a significant knockdown effect in the spleen.
  • Example 7-3 Knockdown effect of MEND with different cationic lipids
  • GALA-MENDs with different cationic lipids were prepared, and the knockdown effects of each GALA-MEND were compared.
  • 1) Preparation of MEND GALA-MEND1 (lipid composition is DOTMA / Chol / EPC / STR-PEG2000 / Chol-GALA) using DOTMA as the cationic lipid was prepared by the same method as in Example 3-1, and the cation was prepared.
  • GALA-MEND3 (lipid composition is DSTAP / Chol / EPC / STR-PEG2000 / Chol-GALA) using DSTAP as a functional lipid is the same as the preparation method described in Example 3-1 except that DOTMA is changed to DSTAP. I went.
  • GALA-MEND2 (lipid composition is DODAP / Chol / EPC / STR-PEG2000 / Chol-GALA) using DODAP as the cationic lipid was prepared in the same manner as in Example 3-2. 2)
  • In vivo knockdown evaluation The knockdown effect of each GALA-MEND containing the different cationic lipids obtained in 1) above was evaluated. The evaluation method was the same as in Example 7-1.
  • FIG. 10 shows the knockdown effect of GALA-MEND1 to 3 when DOTMA, DODAP, and DSTAP are used as cationic lipids.
  • the dose was 0.5 mg siRNA / kg.
  • MEND according to the present invention has a high knockdown effect regardless of whether the cationic lipid is a tertiary amine or a quaternary amine.
  • MEND containing DOTMA as a cationic lipid has the highest knockdown effect.
  • Example 7-4 MEND Knockdown Effect with Different Helper Lipids MENDs with different helper lipids were prepared, and the knockdown effects of each MEND were compared.
  • MEND containing Helper lipid was performed by the same method as in Example 3-1. That is, a liposome having a DOTMA / Chol / Helper lipid ratio of 30/40/30 was prepared, and 5 mol% of STR-PEG2000 and 2 mol% of Chol-GALA were modified with respect to the total lipid amount of the liposome. GALA modified MEND was prepared.
  • FIG. 11 shows the knockdown effect of each GALA-modified MEND when EPC, DOPE, and SOPE are used as the helper lipid.
  • EPC is a lipid composition of DOTMA / Chol / EPC / STR-PEG2000 / Chol-GALA
  • DOPE is a lipid composition of DOTMA / Chol / DOPE / STR-PEG2000 / Chol-GALA
  • SOPE “" Indicates GALA modified MEND having a lipid composition of DOTMA / Chol / SOPE / STR-PEG2000 / Chol-GALA. The dose was 0.5 mg siRNA / kg.
  • the GALA-modified MEND solution prepared in 1) above was administered continuously for 4 days from the tail vein of a mouse (C57BL / 6, 6w, sputum) (using a 27G injection needle).
  • the body weight of the mice was measured each day from the start date of administration to 1 day after the final administration, and the change in body weight during continuous administration was calculated.
  • the dose was 1 or 2 mg siRNA / kg / day.
  • FIG. 12 shows changes in body weight during continuous administration of GALA-modified MEND for 4 days.
  • Example 8-2 MEND AST and ALT at the time of continuous administration for 4 days
  • the GALA-modified MEND used in Example 8-1 was administered to the mice via the tail vein for 4 consecutive days, and the mice were treated with ether anesthesia 24 hours after the final administration, followed by laparotomy, using a 23G injection needle and a 1 mL syringe. Blood was collected from the posterior vena cava. After leaving still at 4 degreeC for 4 hours, it centrifuged (4 degreeC, 12000 rpm, 2 minutes), and collect
  • the GALA-modified MEND according to the present invention was not observed to change in AST and ALT, and it was considered that liver damage did not occur the next day after continuous administration for 4 days.
  • Example 9 Evaluation of pharmacokinetics of PEG-modified MEND The pharmacokinetics of GALA-modified MEND with and without PEG modification were compared using PEG-unmodified GALA-modified MEND and PEG-modified GALA-modified MEND.
  • MEND produced by the method of Example 3-1 was used.
  • the amount of PEG modification was 1 mol% or 5 mol% with respect to the total lipid amount.
  • the pharmacokinetic evaluation of MEND was performed according to Example 5.
  • PEG unmodified MEND lipid composition: DOTMA / Chol / EPC
  • 1% STR-PEG2000 modified MEND lipid composition: DOTMA / Chol / EPC / STR-PEG2000
  • PEG-unmodified GALA-modified MEND lipid composition: DOTMA / Chol / EPC / Chol-GALA
  • PEG-modified GALA-modified MEND lipid composition: DOTMA / Chol / EPC / STR-PEG2000 / Chol-GALA
  • DOTMA / Chol / FIG. 14 shows a comparison of the lung migration rate of EPC / C8 Ceramide-PEG2000 / Chol-GALA).
  • Example 10 Knockdown effect of PEG-modified MEND Using PEG-unmodified GALA-modified MEND and PEG-modified GALA-modified MEND, the knockdown effect of GALA-modified MEND with and without PEG modification was compared.
  • the MEND used was the PEG-unmodified GALA-modified MEND and PEG-modified GALA-modified MEND used in Example 9. That is, STR-PEG2000 and C8ceramide-PEG2000 were used as PEG, and the amount of PEG modification was 1 mol% and 5 mol% with respect to the total lipid amount.
  • the same method as in Example 7-1 was used for the MEND knockdown evaluation. The dose was 1 mg siRNA / kg.
  • FIG. 15 shows a comparison of the knockdown effect between PEG-unmodified GALA-modified MEND and PEG-modified GALA-modified MEND.
  • the GALA-modified MEND used was the PEG-unmodified GALA-modified MEND and PEG-modified GALA-modified MEND used in Example 9.
  • STR-PEG2000 was used as the PEG, and the modification amount of the PEG was 5 mol% with respect to the total lipid amount.
  • MEND was stored for 16 days at room temperature in HBG solution (pH 7.4).
  • HBG solution pH 7.4
  • FIG. 16 shows the knockdown effect of PEG-unmodified GALA-modified MEND and PEG-modified GALA-modified MEND stored for 16 days at room temperature.
  • the GALA-modified MEND used was prepared by the method of Example 3-1, a method according to this, or a combination of these with conventional methods. MEND was stored in HBG solution for 1 month at room temperature. The properties of MEND after one month at room temperature are shown in FIG. In FIG.
  • EPC is DOTMA / Chol / EPC / STR-PEG2000 / Chol-GALA
  • DLPC is DOTMA / Chol / DLPC / STR-PEG2000 / Chol-GALA
  • DMPC is DOTMA / Chol / DMPC / STR-PEG2000 / Chol-GALA
  • DPPC is DOTMA / Chol / DPPC / STR-PEG2000 / Chol-GALA
  • DSPC is DOTMA / Chol / DSPC / STR-PEG2000 / Chol-GALA
  • POPC is DOTMA / Chol / POPC / STR-PEG2000 / Chol-GALA
  • DOPC is DOTMA / Chol / DOPC / STR-PEG2000 / Chol-GALA
  • DOPE is DO Shows the MA / Chol / DOPE / STR-PEG2000 / DOPE
  • FIG. 18 shows the results of the tail vein administration of MENDs with different GALA modification amounts, and evaluation of the knockdown effects of MENDs with different GALA modification amounts in the lung 24 hours later by the qRT-PCR method.
  • Example 14 Antitumor Effect in Melanoma Lung Metastasis Cancer Model by MEND Administration 1) Preparation of MEND Solution
  • a GALA-modified MEND solution and a GALA-unmodified MEND solution were prepared in the same manner as in Example 3-1.
  • GALA-modified MEND (1 mg) encapsulating control siRNA (anti-Luc (GL3)) or anti-CD31 siRNA every 3 days from the next day after transplantation of M16-administered B16-F10-luc2 cells to a melanoma lung metastasis cancer model siRNA / KG mouse) was administered to model mice, and the mice were laparotomized 17 days after tumor implantation, and the lungs were removed. The extracted lung was divided into two for evaluation of tumor lung metastasis and CD31 mRNA expression level. Note that the body weight of the mice was monitored during the MEND administration period.
  • the administration of GALA-modified MEND encapsulating anti-CD31 siRNA significantly suppressed the progression of lung metastasis compared to the untreated group and the control siRNA administration group.
  • administration of GALA-modified MEND encapsulating anti-CD31 siRNA significantly suppressed the expression level of CD31 mRNA compared to the untreated group and the control siRNA administration group. So far, it has been reported that knockout of CD31 or administration of anti-CD31 antibody inhibits angiogenesis in tumor tissue, and as a result, progression of melanoma lung metastasis is suppressed (Proc Natl Acad Sci US A. 2010 Oct 26; 107 (43): 18616-21).
  • the vector modified with the GALA peptide of the present invention specifically delivers a carrier for delivering a target substance specifically to the lung, preferably a medicine, more preferably a nucleic acid medicine such as siRNA to the lung. It became clear that it was useful as a career.
  • Liposomes (MEND) as substance introduction agents obtained in the examples had an average size of about 90 to 170 nm and a zeta potential in the range of ⁇ 50 to 50 mV.
  • the sizes and zeta potentials of the liposomes prepared in Examples 1 and 3 are shown in Table 2 and Table 3, respectively.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

　本発明は、ＧＡＬＡ又はＣｈｏｌ－ＧＡＬＡを含有するリポソームを用いることにより、従来にない優れた肺移行性を有するリポソームを提供する。さらに、当該リポソームを用いることにより、既存のキャリアに比して、ｓｉＲＮＡのノックダウン効果がより強い肺送達キャリアを提供する。

Description

肺送達のためのベクター、導入剤及び使用
本発明は、肺送達のためのベクター、導入剤及び使用に関する。
関連出願の相互参照
　本願は、2011年3月14日に出願した特願2011－55765号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）の優先権の利益を主張するものである。
近年、低分子医薬、核酸医薬、抗体医薬、ペプチド、タンパク質、糖等の目的物質を標的部位に送達させるためのベクターとして、リポソーム膜の外表面に機能性分子を導入したリポソームの開発が盛んに行われている。バイオ医薬品の中では、抗体医薬、タンパク質医薬に次ぐ次世代バイオ医薬として、核酸医薬の研究が活発に進められている。核酸医薬としては、例えば、アンチセンスやリボザイム、アプタマー、デコイオリゴ、そしてｓｉＲＮＡが挙げられる。核酸医薬の臨床応用は、未だ初期段階にあるが、中でもｓｉＲＮＡが注目され、これまでに欧米のいくつかの製薬企業やベンチャーにより臨床試験が行われている。しかしながら、その臨床試験のほとんどが局所投与に限定されている。デリバリーシステムを用いた全身投与による臨床試験も実施されてはいるものの、肝臓などの受動的な集積が期待できる一部の臓器に限られている。従って、ｓｉＲＮＡに代表される核酸医薬の適用範囲を拡大するためには、能動的な標的化を可能とするデリバリーシステムの構築が求められている。
　このようなデリバリーシステムの例として、例えば、リポソーム膜の外表面に親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール）が導入されたリポソームが開発されている（特許文献１及び特許文献２参照）。このリポソームによれば、リポソームの血中滞留性を向上させることにより、腫瘍細胞に対するリポソームの指向性を向上させることができる。また、多機能性エンベロープ型ナノ構造体（ＭＥＮＤ：Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ－ｔｙｐｅ　ｎａｎｏ　ｄｅｖｉｃｅ；以下、本明細書において「ＭＥＮＤ」と略す場合がある。）が提案されており、この構造体は、遺伝子、ペプチドなどを特定の細胞内に選択的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして用いることができる。
　また、ＧＡＬＡに結合したコレステロールを用いて、リポソーム膜の外表面にＧＡＬＡを導入したリポソームが開発されている（非特許文献１参照）。リポソームはエンドサイトーシスするとエンドソーム内に包含された状態となり、エンドソーム内のリポソームは、エンドソームがリソソームと融合することにより分解されるが、このリポソームによれば、リポソーム封入物質をエンドソームから脱出させ、細胞質中へ放出させることができる。
　ＧＡＬＡは、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、アラニン（ＥＡＬＡ）の繰り返し配列を基本とした３０個のアミノ酸残基から構成されるオリゴペプチドであり、Ｓｚｏｋａ等のグループによって合成され（非特許文献２参照）、現在まで種々の研究が行われている。ＧＡＬＡは、中性ｐＨ条件下では、グルタミン酸の電気反発によりランダムコイル構造をとっているが、酸性条件下ではその電気的反発が解消されることにより脂質膜との親和性が高いα－へリックス構造をとることが知られている（非特許文献２参照）。
　また、ＧＡＬＡは、これまで、コレステロール（Ｃｈｏｌ）に結合したＧＡＬＡ（Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ）をＭＥＮＤ表面に修飾することにより、エンドソーム内の酸性条件下において、エンドソーム膜とＭＥＮＤ脂質膜との膜融合を引き起こし、内封物質を細胞質中へと放出させることにより、ＭＥＮＤの活性を向上させるｐＨ応答性のエンドソーム脱出促進素子として用いられてきた（特許文献３参照）。
　上記のように、ＧＡＬＡは、細胞内動態の改善を目的とした機能性素子として用いられてきたが、肺移行性素子としては、これまで知られていない。
　また、ある種のエンドソーム溶解性ペプチドで修飾されたリポソームの標的器官の一つとして肺が挙げられているが（特許文献４参照）、ここで記載されているペプチドの構成は、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、アラニン（ＥＡＬＡ）の繰り返し配列を基本とした、本願に係るＧＡＬＡペプチドの構成とは大きく異なっており、さらに、当該ペプチドで修飾されたリポソームが肺に特異的に移行することについての記載はなく、また、これを示唆する記載もない。
特開平１－２４９７１７号公報 特開２００４－１０４８１号公報 特開２００６－２８０３０号公報 特表平１０－５０６００１号公報
Ｔ．Ｋａｋｕｄｏ等, Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ２００４；４３：５６１８－５６２３ Ｎ．Ｋ．Ｓｕｂｂａｒａｏ等, Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, １９８７；２６：２９６４－２９７２
本発明は、目的物質を肺に特異的に送達する技術を提供することを目的とする。
本発明は、また、一定期間保存後も凝集しないか、もしくはほとんど凝集しないか、及び／又は保存安定性にも優れたベクターを提供することを目的とする。
　本発明者らは、医薬などの目的物質を高効率に肺に移行する機能を有するキャリアについて研究を重ねた結果、ＧＡＬＡペプチドが高い肺移行性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
　さらに、ＧＡＬＡペプチドを含むベクター（例えばＧＡＬＡペプチド－脂質で修飾されたリポソーム）をＰＥＧで修飾しても、肺特異的な移行性が消失しないことを見出し、本発明を完成させるに至った。
　さらに、ＧＡＬＡペプチド又はＧＡＬＡペプチド－脂質で修飾されたリポソームに、Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄを添加することにより、一定期間保存後も凝集しないか、もしくはほとんど凝集しないか、及び／又は保存安定性に優れた物性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の使用、物質導入剤及びベクターを提供するものである。
項１．　配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドの、目的物質を肺に送達させるためのベクターの肺移行性素子としての使用。
項２．　前記ＧＡＬＡペプチドがベクターの構成成分に結合されている、項１に記載の使用。
項３．　前記ベクターが脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、項１または２に記載の使用。
項４．　前記ベクターがカチオン性脂質および／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、項１または２に記載の使用。
項５．　目的物質をベクターに内包し、かつ、前記ベクターが配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを含む肺を標的とする物質導入剤。
項６．　ＧＡＬＡペプチドがベクターの構成成分に結合されている、項５に記載の物質導入剤。
項７．　前記ベクターが脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、項５または６に記載の物質導入剤。
項８．　前記ベクターがカチオン性脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、項５または６に記載の物質導入剤。
項９．　前記ベクターがポリアルキレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンからなる群から選ばれる親水性ポリマーにより修飾されている、項５～８のいずれか１項に記載の物質導入剤。
項１０．　前記目的物質が肺で作用する生理活性物質である、項５～９のいずれか１項に記載の物質導入剤。
項１１．　前記目的物質が薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖及びこれらの複合体からなる群から選ばれる、項５～１０のいずれか１項に記載の物質導入剤。
項１２．　前記目的物質が部分二重鎖ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）、ニックの入ったｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）、ギャップのあるｄｓＲＮＡ（ｇｄｓＲＮＡ）、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、置換された短干渉オリゴヌクレオチド、修飾された短干渉オリゴヌクレオチド、化学修飾されたｄｓＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）からなる群から選ばれるいずれかの二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、項５～１１のいずれか１項に記載の物質導入剤。
項１３．　前記目的物質が核酸であり、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を核酸とともに含む、項１１又は１２に記載の物質導入剤。
項１４．　配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを肺に選択的に物質を送達させるための素子として含有する、目的物質を肺に送達させるためのベクター。
項１５．　前記ベクターが脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、項１４に記載のベクター。
項１６．　前記ベクターがカチオン性脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、項１４に記載のベクター。
項１７．　前記ベクターがカチオン性脂質を含み、カチオン性脂質がＤＯＴＭＡ、ＤＳＴＡＰ及びＤＯＤＡＰからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、項１５又は１６に記載のベクター。
項１８．　前記ベクターがポリアルキレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンからなる群から選ばれる親水性ポリマーにより修飾されている、項１４～１７のいずれか１項に記載のベクター。
項１９．　ポリアルキレングリコールがＰＥＧ（好ましくは、分子量が２０００のＰＥＧ）である項１８記載のベクター。
項２０．　さらに、補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ　Ｌｉｐｉｄ）を含むことを特徴とする、項１４～１９のいずれか１項に記載のベクター。
項２１．　補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ　Ｌｉｐｉｄ）がＥＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＯＰＥであることを特徴とする項２０記載のベクター。
項２２．　前記ベクターがリポソームであり、リポソーム組成がカチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／補助脂質／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ又は補助脂質／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ（より好ましくはＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＡＰ又はＤＳＴＡＰから選ばれるカチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＯＰＥから選ばれる補助脂質／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ又はＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡであり、更に好ましくはＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、ＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、ＤＳＴＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＳＯＰＥ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ又はＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ）である項１４記載のベクター。
項２３．　前記ベクターがＤＯＴＭＡ、Ｃｈｏｌ及びＥＰＣを脂質膜の構成要素として含むリポソームであり、前記リポソームの脂質組成（モル比）は、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣが１０～５０／２０～５０／２０～７０であり、前記リポソームは、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの総脂質量に対しＳＴＲ－ＰＥＧ２０００を１～１５モル％、Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡを０．１～５モル％をさらに含む、項１４記載のベクター。
項２４．　目的物質を内包し、かつ、配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを結合したベクターを哺乳動物に投与し、前記目的物質を肺に導入する方法。
項２５．　抗癌剤を内包し、かつ、配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを結合したベクターを肺癌を有する哺乳動物に投与する工程を含む、肺癌の治療方法。
項２６．　前記肺癌が肺転移した癌である項２４に記載の治療方法。
項２７．　配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを結合したベクターに抗癌剤を内包することを特徴とする肺癌治療剤。
項２８．　前記肺癌が肺転移した癌である項２７に記載の肺癌治療剤。
項２９．　前記ＧＡＬＡペプチドが、総脂質量に対し１～４モル％の範囲で脂質成分に結合されている、項３に記載の使用、項７に記載の物質導入剤、項１５に記載のベクター。
　本発明により、目的物質を肺に特異的に送達するためのベクターないし物質導入剤、特にリポソームが提供される。また、本発明のベクターないし物質導入剤、特にリポソームは、肺に移行すると同時に、主要集積臓器である肝臓への移行性を抑制することができる。さらに、本発明のベクターないし物質導入剤、特にリポソームは、特に肺において、既存のｓｉＲＮＡデリバリーキャリアを凌駕するノックダウン効果を示し、目的物質の導入効果が非常に優れていることが実証された。
本発明で使用するＧＡＬＡペプチドを含むベクター及び物質導入剤は、凝集の問題がないため、血管を詰まらせることがない。
ＧＡＬＡ修飾リポソームの肺移行性を経時的に評価した結果を示す。 図１－Ａの縦軸を拡大した図を示す。 ＧＡＬＡ修飾リポソームの肝臓移行性を経時的に評価した結果を示す。 血液とＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを任意の割合で混合し血球成分との相互作用を評価した結果を示す。 ｓｉＲＮＡを［３２Ｐ］で、脂質膜を［３Ｈ］で標識したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、１時間の肺に含まれる［３２Ｐ］、［３Ｈ］を測定することにより、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの肺への移行性を評価した結果を示す。 蛍光標識ｓｉＲＮＡを封入したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、１時間後の肺におけるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの局在を共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて評価した結果を示す。 ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ及びＧＡＬＡ未修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の肺でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ及びＧＡＬＡ未修飾ＭＥＮＤの各ノックダウン効果をｑＲＴ－ＰＣＲ法により評価した結果を示す。 ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の肺でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ－ＰＣＲ法により評価した結果を示す。 ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の肝臓でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ－ＰＣＲ法により評価した結果を示す。 ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の脾臓でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ－ＰＣＲ法により評価した結果を示す。 カチオン性脂質として、ＤＯＴＭＡ、ＤＳＴＡＰ及びＤＯＤＡＰを用いた場合のＭＥＮＤのノックダウン効果を示す。 Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄとして、ＥＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＯＰＥを用いた場合の各ＭＥＮＤのノックダウン効果を示す。 ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ４日連続投与時における体重変化を示す。 ＭＥＮＤ４日間連続投与時におけるＡＳＴ及びＡＬＴの測定結果を示す。 ＰＥＧ修飾ＭＥＮＤの体内動態評価の結果を示す。 ＰＥＧ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果を示す。 ＭＥＮＤ保存品のノックダウン効果を示す。 ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを室温で１ヶ月保存した後の保存安定性の結果を示す。 ＧＡＬＡ修飾量が異なるＭＥＮＤを尾静脈内投与し、２４時間後の肺でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ－ＰＣＲ法により評価した結果を示す。 肺転移モデルにおけるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ投与による肺転移抑制効果を示す。 肺転移モデルにおけるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ投与によるノックダウン効果を示す。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本発明のベクターは、ＧＡＬＡペプチドを含むことで、肺への選択的な移行を実現できる。
　「配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチド」は、下記の３０アミノ酸のペプチドである。
Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　（配列番号１）
　配列番号１記載のペプチドは、その配列中に、グルタミン酸（Ｅ）－アラニン（Ａ）－ロイシン（Ｌ）－アラニン（Ａ）の部分構造を４単位有するが、当該部分構造を好ましくは３単位又は４単位、より好ましくは、４単位を保持したまま、それ以外のアミノ酸配列において、アミノ酸の欠失、置換又は付加が行われることが好ましい。これらの改変型ＧＡＬＡペプチドも本発明の「配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチド」に含まれる。
　配列番号１記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数及び位置は、アミノ酸の個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個であり、その具体的な範囲は、欠失に関しては通常１～４個、好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個であり、置換に関しては通常１～６個、好ましくは１～４個、さらに好ましくは１～２個であり、付加に関しては通常１～１２個、好ましくは１～６個、さらに好ましくは１～４個である。アミノ酸の置換は、疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、中性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ）の間の類似アミノ酸の置換が好ましい。なお、本明細書において、ＧＡＬＡペプチドは、単に「ＧＡＬＡ」と称する場合がある。
　ＧＡＬＡペプチドは、ベクターを構成する構成成分に結合されるのが好ましい。ベクターを構成する成分としては、脂質、蛋白質若しくはペプチド、糖鎖、水溶性又は水混和性ポリマー（中性、カチオン性又はアニオン性）、界面活性剤などが挙げられる。結合は共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合などの任意の結合が挙げられるが、共有結合又は配位結合が好ましく、共有結合が最も好ましい。
　ＧＡＬＡペプチドは、細胞に物質を導入できるキャリア（ベクター）に含まれる。細胞に物質を導入できるキャリア（ベクター）としては、脂質ベースのトランスフェクション試薬、ウイルス由来の粒子、リポソーム、ポリプレックス、ミセルなどが挙げられ、好ましい実施形態ではリポソームに修飾ないし結合される。ベクターがリポソームの場合、ＧＡＬＡペプチドは、リン脂質、コレステロール、脂質（好ましくはカチオン性脂質）、補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ　Ｌｉｐｉｄ）等のリポソームの構成成分のいずれに結合させてもよい。コレステロール（コレステリル－ＯＨ）に結合された配列番号１のＧＡＬＡペプチドは、例えば以下の構造を有する（以下、「Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ」と略す場合がある）：
（コレステリル）-O(C=O)-(WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA)-NH2
　上記において、「－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－」はＧＡＬＡペプチドのＮ末端のアミノ基と結合しており、「－ＮＨ２」はＧＡＬＡペプチドのＣ末端のカルボキシル基がアミノ基で保護されていることを意味する。コレステロールとＧＡＬＡペプチドの結合は、上記のようにウレタン結合でもよく、エステル結合、エーテル結合のいずれでもよい。コレステリル基は、ＧＡＬＡペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれに結合してもよく、或いはＧＡＬＡペプチドの任意のアミノ酸の側鎖に結合してもよい。また、コレステリル基はアルキレン、ペプチド、ポリエーテルなどの任意のリンカーを介してＧＡＬＡペプチドに結合してもよい。さらに上記ではＣ末端がアミドになっているが、Ｃ末端はカルボン酸（ＣＯＯＨ）、エステル、カルボン酸の塩などの他の基であってもよい。
　ＧＡＬＡペプチドをコレステロール、リン脂質などの脂質成分に結合させてベクター若しくは物質導入剤に含ませる場合、ＧＡＬＡペプチドは総脂質量に対し、０．１～５モル％、好ましくは０．３～４モル％、より好ましくは０．５～４モル％、更に好ましくは、１～４モル％、特に好ましくは１．５～２モル％程度使用される。なお、本明細書中で示される「総脂質量」には、リポソームの修飾成分に結合した脂質成分の量は含まない。即ち、ＧＡＬＡペプチドに結合した脂質成分の量は含まれない。同様に、ベクターがＰＥＧ修飾された場合、ＰＥＧに結合した脂質成分の量は含まれない。
　例えば、ＧＡＬＡペプチドに結合していない脂質成分（総脂質量）が１００モル、ＧＡＬＡペプチドが結合した脂質成分が５モルの場合、ＧＡＬＡ修飾量（ＧＡＬＡペプチドが結合した脂質の総脂質量に対する割合）は、５モル％になる。
　ベクターが脂質成分以外から構成される場合でも、ＧＡＬＡペプチドはベクターの総重量の０．０１～１０重量％、好ましくは０．１～５重量％、より好ましくは０．５～４重量％、特に好ましくは１～２．５重量％程度使用される。
上記に、ＧＡＬＡペプチドをコレステロールに結合させる実施形態について記載したが、コレステロール以外のベクターの構成要素にＧＡＬＡペプチドを結合させることができ、その態様は当業者には明らかである。
　本発明のベクター及び物質導入剤のゼータ電位は、中性付近のｐＨ（例えばｐＨ７もしくは７．４）で－１００～１００ｍＶ程度、好ましくは－５０～５０ｍＶ程度、より好ましくは－３０～３０ｍＶ程度である。ゼータ電位は、ゼータサイザーを用いて測定することができる。
　本発明のベクター及び物質導入剤の平均粒径は、特に限定されるものではないが、例えば、粒子径３０～１０００ｎｍであり、好ましくは、５０～３００ｎｍ、より好ましくは５０～２００ｎｍ、特に５０～１５０ｎｍである。平均粒径は、例えば、動的光散乱法、静的光散乱法、電子顕微鏡観察法、原子間力顕微鏡観察法等により測定することができる。
　本発明の導入剤は、ベクターとともに細胞内に送達しようとする目的物質を含む。目的物質はベクターと共有結合してもよく、ベクターと複合体を形成してもよく、ベクターが中空粒子の場合には、ベクター内部に封入または内包することができる。本発明の目的物質は、特に肺細胞に導入されて効果を発揮する生理活性物質である。
　本発明の物質導入剤は、目的物質の肺細胞内送達のためにｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏのいずれでも使用することができる。
　目的物質の種類は特に限定されるものではなく、例えば、薬物、核酸、ペプチド（オキシトシン、ブラジキニン、チロトロビン放出因子、エンケファリン等の生理活性ペプチド、ペプチドホルモンなど）、タンパク質（酵素、インターロイキン等の各種サイトカイン、細胞伝達因子、細胞成長因子等）、糖又はこれらの複合体等が挙げられ、肺疾患の種類、診断、治療等の目的に応じて適宜選択することができる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ又はＲＮＡに加え、これらの類似体又は誘導体（例えば、ｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。
　目的物質が薬物の場合、例えば制がん剤、血管拡張薬、肺血管炎治療薬、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、気管支拡張剤、鎮咳剤、肺線維化抑制剤、抗結核薬等が挙げられる。具体的には、制がん剤として、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、オキザリプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、イリノテカン、ＳＮ－３８、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、アザチオプリン、フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ドセタキセル、シクロホスファミド、カペシタビン、エピルビシン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、ロイコボリン、ビノレルビン、トラスツズマブ、エトポシド、エストラムスチン、プレドニゾン、インターフェロンα、インターロイキン－２、ブレオマイシン、イホスファミド、メスナ、アルトレタミン、トポテカン、シタラビン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ゲムツズマブ、イダルビシン、ミトキサントロン、トレチノイン、アレムツズマブ、クロランブシル、クラドリビン、イマチニブ、エピルビシン、ダカルバジン、プロカルバジン、メクロレタミン、リツキシマブ、デニロイキンジフチトクス、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、アロプリノール、カルムスチン、タモキシフェン、フィルグラスチム、テモゾロマイド、メルファラン、ビノレルビン、アザシチジン、サリドマイド、およびマイトマイシン等が挙げられる。血管拡張薬として、ボセンタン、アンブリセンタン、ベラプロストナトリウム、シルデナフィル、エポプロステノール等が挙げられる。肺血管炎治療薬として、副腎皮質ステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート、アスピリン等が挙げられる。抗菌剤として、アムホテリシンＢ等が挙げられる。抗ウイルス剤として、ビダラビン、アシクロビル、トリフルオロチミジン等が挙げられる。抗炎症剤として、フェニルブタゾン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、インドメタシン、スリンダク、ピロキシカム、ジクロフェナック、プレドニゾン、ベクロメタゾン、デキサメタゾン等が挙げられる。
目的物質が核酸の場合、例えば部分二重鎖ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）、ニックの入ったｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）、ギャップのあるｄｓＲＮＡ（ｇｄｓＲＮＡ）、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、置換された短干渉オリゴヌクレオチド、修飾された短干渉オリゴヌクレオチド、化学修飾されたｄｓＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）からなる群から選ばれるいずれかの二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が好ましく例示される。目的物質は単独で或いは２種以上を混合して用いることができる。例えば２種以上のｓｉＲＮＡを併用することも可能である。
物質導入剤がｓｉＲＮＡなどの核酸を目的物質として含む場合、ポリエチレンイミン（ＰＥI）のようなカチオンを共存させるのが好ましい。
　置換および修飾（化学修飾を含む）の１つの実施形態において、二重鎖ＲＮＡは、デオキシリボヌクレオチドまたは２つのデオキシリボヌクレオチド（例えばチミジン、アデニン）を含むオーバーハング等、二重鎖ＲＮＡの３’末端の一端または両端に１～４ヌクレオチドのオーバーハングを含み得る。二重鎖ＲＮＡは、一端または両端に平滑末端を有し得る。一部の実施形態において、第１および第２の鎖の５’末端はリン酸化されている。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、核酸の糖、塩基、または骨格において化学的に修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上の普遍的な塩基リボヌクレオチドを含むことができる。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上の非環式ヌクレオチドを含むことができる。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、ｄｓＲＮＡは、５’リン酸塩（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ．． １１０：５６３‐５７４， ２００２； およびＳｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． １０：５３７‐５６８，２００２を参照）または５’，３’二リン酸塩等の末端リン酸基をさらに含むことができる。
　二重鎖ＲＮＡは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－２－メトキシエチル、ハロゲン、２’－フルオロ、２’－Ｏ－アリル、またはこれらの任意の組み合わせ等の２’糖置換をさらに含み得る。さらなる実施形態において、二重鎖ＲＮＡは、第１の鎖または１つ以上の第２の鎖の一端または両端上に、アルキル、脱塩基、デオキシ脱塩基、グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、反転したデオキシヌクレオチド部分、またはこれらの任意の組み合わせ等の末端キャップ置換基をさらに含む。
　さらに他の実施形態において、二重鎖ＲＮＡは、独立してホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、メチルホスホン酸塩、アルキルホスホン酸塩、３’－アルキレンホスホン酸塩、５’－アルキレンホスホン酸塩、キラルホスホネート、ホスホノ酢酸塩、チオホスホノ酢酸塩、ホスフィン酸塩、ホスホロアミド酸塩、３’－アミノホスホロアミド酸塩、アミノアルキルホスホロアミド酸塩、チオノホスホロアミド酸塩、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸塩、ボラノリン酸結合、またはこれらの任意の組み合わせ等の、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合をさらに含み得る。
二重鎖ＲＮＡは、５‐メチルシトシン；５－ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２－アミノアデニン；６－メチル，２－プロピル、またはアデニンおよびグアニンのその他のアルキル誘導体；８－置換されたアデニンおよびグアニン（８－アザ、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル等）；７－メチル、７－デアザ、および３－デアザアデニンならびにグアニン；２－チオウラシル；２－チオチミン；２－チオシトシン；５－メチル、５－プロピニル、５－ハロ（５－ブロモまたは５－フルオロ等）、５－トリフルオロメチル、または他の５－置換されたウラシルおよびシトシン；ならびに６－アゾウラシルなどの核酸アナログを使用することで、置換ないし修飾(化学修飾を含む)することができる。
　二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などのＲＮＡは化学的に修飾され得る。このような化学修飾の非限定的な例には、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、２’－デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド、「非環状」ヌクレオチド、５’－Ｃ－メチルヌクレオチド、および末端へのグリセリルおよび／または逆方向デオキシ無塩基残基の導入が挙げられる。これらの化学修飾は、細胞内におけるＲＮＡｉ活性を維持することができる。
リポソームは、脂質二重層構造を有する閉鎖小胞である限り、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であってもよいし、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ）　、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ）　、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ）等の一枚膜リポソームであってもよい。
本発明のベクター（キャリア）は、親水性ポリマーにより修飾することができる。
親水性ポリマーとしては、ポリアルキレングリコール（ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、或いはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロック共重合体などのポリアルキレングリコールの共重合体）、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどが挙げられ、好ましくはポリアルキレングリコール（ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、或いはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロック共重合体などのポリアルキレングリコールの共重合体）、特に好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられ、これらの親水性ポリマーによりベクター（キャリア）を修飾するのが好ましい。ＰＥＧの長さは、５００～１００００程度の分子量の範囲で適宜選択することができ、好ましくは分子量が１０００～５０００であり、より好ましくは分子量が２０００である。ＰＥＧにより修飾された脂質としては、ＤＳＰＥ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）－ＰＥＧ２０００、ＤＭＰＥ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）－ＰＥＧ２０００、ＤＳＧ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）－ＰＥＧ２０００、ＤＭＧ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）－ＰＥＧ２０００、コレステリル化ＰＥＧ２０００、ＳＴＲ（Ｓｔｅａｒｙｌ）－ＰＥＧ２０００又はＣ８セラミド－ＰＥＧ２０００、Ｃ１６セラミド－ＰＥＧ２０００などが挙げられ、これらのうち、ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００又はＣ８セラミド－ＰＥＧ２０００が好ましい。他の親水性ポリマーの分子量も同様に当業者は適宜選択できる。
　例えばリポソームをＰＥＧ修飾する場合、ステアリル化ＰＥＧ（ＳＴＲ－ＰＥＧ）、Ｃ８セラミド－ＰＥＧ、コレステリル化ＰＥＧ（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ）を使用するのが、肺移行性能及び目的物質（例えばｓｉＲＮＡ等の核酸医薬）の機能発現を損ねることなく保存安定性に優れたベクター（例えばリポソーム製剤）を得るために好ましく、また、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＳＧ－ＰＥＧ、Ｃ１６セラミド－ＰＥＧ等を使用するのが、血中安定性を向上させるために好ましい。
　親水性ポリマーは、リポソームを修飾する場合、リポソームを構成する脂質を１００モル％とした場合に１～１５モル％程度の割合で修飾するのが好ましい。
　以下において、目的物質をｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏで肺に送達するベクター（キャリア）としてリポソームを例に挙げて説明するが、本発明はリポソームに限定されず、ＧＡＬＡペプチドを細胞内に導入可能な任意のベクター（キャリア）が本発明に包含される。
　本発明のリポソームにおいて、脂質二重層を構成する脂質の種類は特に限定されるものではなく、その具体例としては、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン等のリン脂質又はこれらの水素添加物；スフィンゴミエリン、ガングリオシド等の糖脂質が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を使用することができる。リン脂質は、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン等）、合成脂質又は半合成脂質のいずれであってもよい。これらの脂質は単独で又は２種以上を混合して使用することができる。
　脂質二重層には、脂質二重層を物理的又は化学的に安定させたり、膜の流動性を調節したりするために、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロール；グリセロール、シュクロース等の糖類；トリオレイン、トリオクタノイン等のグリセリン脂肪酸エステルのうち、１種又は２種以上を含有させることができる。その含有量は特に限定されるものでないが、脂質二重層を構成する総脂質量に対して５～４０％（モル比）であることが好ましく、１０～３０％（モル比）であることがさらに好ましい。
　脂質二重層には、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等の抗酸化剤；ステアリルアミン、オレイルアミン等の正荷電を付与する荷電物質；ジセチルホスフェート等の負電荷を付与する荷電物質；膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等の膜タンパク質を含有させることができ、その含有量は適宜調節することができる。
本発明のリポソームは、３０アミノ酸から構成されるＧＡＬＡペプチドを表面に有する。なお、一枚膜リポソームについては脂質二重層の外表面がリポソームの表面であり、多重膜リポソームについては最外層の脂質二重層の外表面がリポソームの表面である。また、本発明のリポソームは、表面以外の部分（例えば、脂質二重層の内表面）に上記ペプチドを有していてもよい。
　本発明のベクターには、好ましくはカチオン性脂質が含まれる。カチオン性脂質としては、例えば、ＤＯＤＡＣ（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ－（２，３－ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＤＡＢ（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）、ＤＯＴＡＰ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ　ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＣ－Ｃｈｏｌ（３β－Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’，－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）－ｃａｒｂａｍｏｌ　ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ＤＭＲＩＥ（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ　ａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＯＳＰＡ（２，３－ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ－Ｎ－［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ　ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、ＤＳＴＡＰ（１，２－Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－３－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＯＤＡＰ（ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ）等が挙げられる。好ましいカチオン性脂質はＤＯＴＭＡ、ＤＳＴＡＰ又はＤＯＤＡＰであり、特に好ましくはＤＯＴＭＡが挙げられる。カチオン性脂質は単独で又は２種以上を混合して使用することができる。
カチオン性脂質において、ＤＯＴＭＡ及びＤＳＴＡＰは４級アミンを有しており，常に正電荷を帯びているが，ＤＯＤＡＰは３級アミンを有しており，生理的ｐＨにおいて電荷を持たないものである。このようにカチオン性脂質の種類、配合量を変更することで、カチオン性脂質の構造，特徴に幅を持たせることができる。
　本発明のベクターは、好ましくは、補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄ）が含まれる。補助脂質としては、例えば、ＥＰＣ（ｅｇｇ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＬＰＣ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＭＰＣ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＰＰＣ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＳＰＣ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＰＯＰＣ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＯＰＣ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＯＰＥ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ），ＳＯＰＥ（ｓｔｅａｒｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）等が挙げられる。これらのうち、ＥＰＣ，ＤＯＰＣ，ＤＯＰＥ，ＳＯＰＥが好ましい。
　例えば、補助脂質として、ＤＯＰＣを含むＭＥＮＤは室温で１ヶ月保存後も凝集は全く見られず、ＤＯＰＣは保存安定性にも優れている。
本発明のリポソームの好ましい態様として、上記ＧＡＬＡペプチドが疎水性基又は疎水性化合物で修飾されており、疎水性基又は疎水性化合物が脂質二重層に挿入され、上記ペプチドが脂質二重層から露出しているリポソームを例示することができる。なお、本態様において、「ペプチドが脂質二重層から露出している」には、ペプチドが脂質二重層の外表面又は内表面のいずれか一方から露出している場合、両方から露出している場合が含まれる。
　疎水性基又は疎水性化合物は、脂質二重層に挿入され得る限り特に限定されるものでない。疎水性基としては、例えば、ステアリル基、パルミチル基、オレイル基、パルミトオレイル基、リノリル基、リノレイル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸基、脂肪族アルコール、脂肪族アミン或いはその他の炭素数１０以上の炭化水素基を含む基（例えばコレステリル基（Ｃｈｏｌ）などのステロール由来の基）又はそれらの誘導体等が挙げられるが、これらのうち特に炭素数１０～２０の脂肪酸基（例えば、パルミトイル基、オレイル基、ステアリル基、アラキドイル基等）が好ましい。また、疎水性化合物としては、例えば、上記に例示したリン脂質、糖脂質又はステロール、長鎖脂肪族アルコール（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、コレステロール等）、ポリオキシプロピレンアルキル、グリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。
　本発明のリポソームは、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて作製することができる。
水和法によるリポソームの製造例を以下に示す。
脂質二重層の構成成分である脂質と、疎水性基又は疎水性化合物で修飾された上記ペプチドとを有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；メタノール、エタノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、上記ペプチドを表面に有するリポソームを製造することができる。
　また、水和法による別の製造例を以下に示す。
　脂質二重層の構成成分である脂質を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得、この脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することによりリポソームを製造する。次いで、このリポソームの外液に、疎水性基又は疎水性化合物で修飾された上記ペプチドを添加することにより、リポソームの表面に上記ペプチドを導入することができる。また、脂質が溶解した有機溶剤に疎水性基又は疎水性化合物で修飾された上記ペプチドを添加することでリポソームの表面に上記ペプチドを導入することができる。
　例えば、カチオン性脂質として４級アミンを用いる場合のリポソームの調製は、後述する実施例３－１と同様の方法、これに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより、また、カチオン性脂質として３級アミンを用いる場合のリポソームの調製は、後述する実施例３－２と同様の方法、これに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより製造することができる。
　カチオン性リポソームの調製にあたり、カチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／補助脂質の割合は、適宜変更することができる。その組成比率（モル比）としては１０～５０／２０～５０／２０～７０であるのが好ましく、２０～４０／３０～５０／２０～４０であるのがより好ましく、３０／４０／３０であるのが特に好ましい。カチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／補助脂質の好ましい組合せとしては、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＡＰ又はＤＳＴＡＰから選ばれるカチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＯＰＥから選ばれる補助脂質であり、より好ましくはＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ、ＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ、ＤＳＴＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＳＯＰＥである。当該リポソームにＣｈｏｌ－ＧＡＬＡを修飾する場合には、Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡの添加割合は、適宜変更することができ、総脂質量（カチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／補助脂質の脂質の総量）に対して、例えば、０．１～５モル％が挙げられ、好ましくは０．３～４モル％、より好ましくは０．５～４モル％、更に好ましくは、１～４モル％、特に好ましくは１．５～２モル％である。また、当該リポソームに適宜ＰＥＧを修飾することができる。ＰＥＧ修飾する場合には、ＰＥＧの添加割合は、適宜変更することができ、総脂質量（カチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／補助脂質の脂質の総量）に対して、例えば、０．１～１５モル％が挙げられ、好ましくは１～５モル％である。なお、添加されるＰＥＧは脂質に結合したＰＥＧであることが好ましく、ＳＴＲ－ＰＥＧ又はＣ８セラミド－ＰＥＧがより好ましく、ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００又はＣ８セラミド－ＰＥＧ２０００が特に好ましい。
　また、上述の補助脂質を用いて、リポソーム組成を補助脂質／Ｃｈｏｌとした中性リポソームを調製することができ、その組成比率（モル比）としては適宜変更することができるが、４０～９０／１０～６０であるのが好ましく、６０～８０／２０～４０であるのがより好ましく、７０／３０であるのが特に好ましい。補助脂質／Ｃｈｏｌの好ましい組合せとしては、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＬＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ、ＳＯＰＥ／Ｃｈｏｌであり、より好ましくはＥＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥ／Ｃｈｏｌ、ＳＯＰＥ／Ｃｈｏｌであり、特に好ましくはＥＰＣ／Ｃｈｏｌである。当該リポソームにＣｈｏｌ－ＧＡＬＡを修飾する場合には、Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡの添加割合は、適宜変更することができ、総脂質量（補助脂質／Ｃｈｏｌの脂質の総量）に対して、例えば、０．１～５モル％が挙げられ、好ましくは０．３～４モル％、より好ましくは０．５～４モル％、更に好ましくは、１～４モル％、特に好ましくは１．５～２モル％である。 また、当該リポソームに適宜ＰＥＧを修飾することができ、ＰＥＧを修飾する場合には、ＰＥＧの添加割合は、適宜変更することができ、総脂質量（補助脂質／Ｃｈｏｌの脂質の総量）に対して、例えば、０．１～１５モル％が挙げられ、好ましくは１～５モル％である。なお、添加されるＰＥＧは脂質に修飾したＰＥＧであることが好ましく、ＳＴＲ－ＰＥＧ又はＣ８セラミド－ＰＥＧがより好ましく、ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００又はＣ８セラミド－ＰＥＧ２０００が特に好ましい。
　本発明の好ましいリポソーム組成としては、カチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／補助脂質／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ又は補助脂質／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡであり、より好ましくはＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＡＰ又はＤＳＴＡＰから選ばれるカチオン性脂質／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＯＰＥから選ばれる補助脂質／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ又はＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡであり、更に好ましくはＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、ＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、ＤＳＴＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＳＯＰＥ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ又はＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ－ＰＥＧ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡである。なお、ＳＴＲ－ＰＥＧはＰＥＧ分子量２０００であるＳＴＲ－ＰＥＧ２０００が特に好ましい。
　本発明の最も好ましいリポソームは、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡの組成を有し、そのＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの組成比率（モル比）は１０～５０／２０～５０／２０～７０であり、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの総脂質量に対して、ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００は１～１５モル％、Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡは０．１～５モル％であるのが好ましく；
そのＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの組成比率（モル比）は２０～４０／３０～５０／２０～４０であり、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの総脂質量に対して、ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００は１～５モル％、Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡは１～４モル％であるのがより好ましく；
そのＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの組成比率（モル比）は３０／４０／３０であり、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの総脂質量に対して、ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００は１～５モル％、Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡは１．５～２モル％であるのが最も好ましい。ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００とＣｈｏｌ－ＧＡＬＡはリポソームの修飾成分であるので、それらの添加量はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの３成分からなるリポソームの総脂質量を１００モル％とし、それに対する比率として表した。
　本発明のリポソームの内部には、肺細胞内に送達しようとする目的物質を封入することができる。
　本発明の物質導入剤（特にリポソーム）に封入される目的物質は、肺疾患の種類により上述の薬物(制ガン剤、血管拡張薬、抗菌剤など)、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの類似体又は誘導体（例えばｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）、ペプチド（オキシトシン、ブラジキニン、チロトロビン放出因子、エンケファリン等の生理活性ペプチド、ペプチドホルモンなど）などが挙げられる。肺疾患の種類に応じて好適な目的物質を封入することにより、肺疾患の治療又は予防が可能である。本明細書における「肺疾患」としては、肺癌、肺の炎症性疾患、肺線維症、肺塞栓症、肺高血圧症、肺血管炎、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、石綿症／粉塵疾患（ｄｕｓｔ　ｄｉｓｅａｓｅ）、喘息、気管支拡張症、気管支肺形成異常（ＢＰＤ）、慢性気管支炎、慢性の咳、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、感冒、嚢胞性線維症、気腫、ハンタウイルス、ヒストプラズマ症、インフルエンザ、レジオネラ症、リンパ管平滑筋肉腫症、百日咳、胸膜炎、気胸症、原発性肺胞換気過少症候群、肺胞蛋白症、呼吸窮迫症候群、ＲＳウイルス、サルコイドーシス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、または結核等が挙げられ、これらに限定されない。治療又は予防対象として好ましい肺疾患としては、肺の血管に関わる肺疾患であり、肺癌、肺高血圧症、肺血管炎等が挙げられ、特には肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌を含む）が挙げられる。肺癌は原発性肺癌だけでなく、肺以外の臓器から転移してできた転移性肺癌も含む。更に、肺癌を原発巣とする他臓器（例えば、副腎、肝臓、脳、又は骨等）への癌転移を抑制するために、本発明の物質導入剤を使用することも可能である。このような、肺癌の治療、肺からの癌転移抑制のために本発明物質導入剤に封入される目的物質としては、上述の制がん剤（例えば、塩酸アムルビシン、ゲフィチニブ、シスプラチン、ビンブラスチン、マイトマイシンＣ、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、カルボプラチン、イリノテカン、テガフール、エトポシド、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、イホスファミド、ビンデシン等）、血管新生に関与する因子（例えば、ＣＤ３１、ＥＳＡＭ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｄｌｌ、ＳＦＲＰ、ＣＤ１５１、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ１、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ等）をターゲットとするｓｉＲＮＡが好ましく、ＣＤ３１、ＥＳＡＭ、ＣＤ１５１、ＶＥＧＦ又はＥＧＦをターゲットとするｓｉＲＮＡがより好ましく、抗ＣＤ３１　ｓｉ　ＲＮＡが特に好ましい。これらは、目的に応じて単独又は２種以上を混合して用いることができる。
　肺高血圧症のために本発明物質導入剤に封入される目的物質としては、上述の血管拡張剤（例えば、ボセンタン、アンブリセンタン、ベラプロストナトリウム、シルデナフィル、エポプロステノール等）、血管拡張に関与する因子（例えば、エンドセリン受容体（ＥＴＡ，ＥＴＢ）、ＰＤＥ５等）の抗ｓｉＲＮＡが好ましい。
　肺血管炎のために本発明物質導入剤に封入される目的物質としては、副腎皮質ステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート、アスピリン等が好ましい。
　本発明の物質導入剤は、単独または肺疾患のための他の治療と一緒のいずれかで用いられ得る。
　目的物質が水溶性である場合には、リポソームの製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に目的物質を添加することにより、リポソーム内部の水相に目的物質を封入することができる。また、目的物質が脂溶性である場合には、リポソームの製造にあたり使用される有機溶剤に目的物質を添加することにより、リポソームの脂質二重層に目的物質を封入することができる。本明細書において「封入」とは、リポソームのような中空粒子の内部に目的物質を含む場合と、脂質二重膜のようなベクターを構成する表面部分に保持される場合の両方を含む。
　目的物質を送達すべき生物種は、肺を有する脊椎動物であれば特に限定されるものではないが、哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。
　本発明のリポソームは、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン酸緩衝液，　酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。
　本発明のリポソームは、分散液を乾燥（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等）させた状態で使用することもできる。乾燥させたリポソームは、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン酸緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を加えて分散液とすることができる。
　各リポソームは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏのいずれにおいても使用することができる。各リポソームをｉｎ　ｖｉｖｏにおいて用いる場合には、投与経路として、例えば、静脈注射、点滴等が挙げられ、投与量及び投与頻度は、本発明に係るリポソームに封入された目的物質の種類や量等に応じて適宜調整することができる。
　本発明のリポソームは、また、体重減少、肝障害のいずれも見られず、安全に投与することができる。
　以下、本発明を実施例に基づき、より詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
　各実施例で用いた試薬、材料、動物等を以下に示す。
ＥＰＣは日本油脂（Ｔｏｋｙｏ，ＪＡＰＡＮ）から購入した。ＤＯＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＯＰＥ、ＳＯＰＥ、ＤＯＰＣ、Ｃ８　セラミド－ＰＥＧ２０００はＡｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）から購入した。ＤＯＴＭＡは東京化成工業株式会社（Ｔｏｋｙｏ，ＪＡＰＡＮ）から購入した。ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００は和光純薬株式会社より購入した。
Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ　（コレステリル－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－ＷＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡ－ＮＨ２，Ｍｗ．３４４４．０，　＞７１％　ｐｕｔｉｔｙ）は、前記特許文献３に記載の方法、これに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより合成した。
ＰＥＩ（ｂｒａｎｃｈ　ｔｙｐｅ，Ｍｗ．ａｖｅ．１０，０００）は和光純薬株式会社より購入した。
トランスアミナーゼＣII－テストワコーは和光純薬株式会社より購入した。
ＲＮＡｌａｔｅｒはＡｍｂｉｏｎより購入した。Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　Ｋｉｔ、ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　ＭｉｘはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入した。ｓｉＲＮＡ及びＣｙ５標識ｓｉＲＮＡの合成は北海道システムサイエンスに委託した。Ｐｒｉｍｅｒ及びＰｒｏｂｅの合成は常法に従い合成した。使用したｓｉＲＮＡ、Ｐｒｉｍｅｒ、Ｐｒｏｂｅの配列を以下に示す。
［ｓｉＲＮＡ］　
ＣＤ３１－１　ｓｅｎｓｅ　：　ＧＣＡＣＡＧＵＧＡＵＧＣＵＧＡＡＣＡＡＴＴ　(配列番号２)
ＣＤ３１－１　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　：　ＵＵＧＵＵＣＡＧＣＡＵＣＡＣＵＧＵＧＣＴＴ　（配列番号３）
ＣＤ３１－２　ｓｅｎｓｅ　：　ＧＵＧＣＡＵＡＧＵＵＣＡＡＧＵＧＡＣＡＴＴ　（配列番号４）
ＣＤ３１－２　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　：　ＵＧＵＣＡＣＵＵＧＡＡＣＵＡＵＧＣＡＣＴＴ　（配列番号５）
ＣＤ３１－３　ｓｅｎｓｅ　：　ＧＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＴ　（配列番号６）
ＣＤ３１－３　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　：　ＵＧＵＣＣＵＵＣＣＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＴＴ　（配列番号７）
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ｓｅｎｓｅ　：　ＧＣＧＣＵＧＣＵＧＧＵＧＣＣＡＡＣＣＣＴＴ　（配列番号８）
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　：　ＧＧＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＴＴ　（配列番号９）
　ＣＤ３１　ｓｉＲＮＡは上記３種類を等量混合して使用した。　
［Ｐｒｉｍｅｒ、Ｐｒｏｂｅ］　
ＣＤ３１　Ｆｏｒｗａｒｄ　：　ＣＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣ　（配列番号１０）
ＣＤ３１　Ｒｅｖｅｒｓｅ　：　ＡＣＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣ　（配列番号１１）
ＣＤ３１　Ｐｒｏｂｅ　：　［ＦＡＭ］　ＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＣ　［ＴＡＭＲＡ］（配列番号１２）
ＣＤ３４　Ｆｏｒｗａｒｄ　：　ＴＣＴＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＧＴＧＡＡＧＣ　（配列番号１３）
ＣＤ３４　Ｒｅｖｅｒｓｅ　：　ＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＧＧＣＴＡＧＡＡＧＣＡ　（配列番号１４）
ＣＤ３４　Ｐｒｏｂｅ　：　［ＦＡＭ］　ＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣ　［ＴＡＭＲＡ］（配列番号１５）
　ＩＣＲマウス雄５週齢、Ｃ５７ＢＬ／６マウス雄６週齢は日本ＳＬＣより購入した。
その他、特に記述がない限り、市販の特級または一級のもの、あるいはそれに準ずるものを用いた。
　また、各実施例で用いた機器等を以下に示す。
　脂質薄膜の調製には、ポンプＤＩＶＡＣ　１．２、トラップＥＶＡＬＡ　ＵＮＩ　ＴＲＡＰ　ＵＴ－１０００（いずれも東京理科器械）を用いた。
　超音波処理には、浴槽型ソニケーターＡＵ－２５Ｃ（アイワ医科工業）を使用した。動的光散乱（ＤＬＳ）　による粒子径、ζ電位の測定には、ＺＥＴＡ　ＳＩＺＥＲ　Ｎａｎｏ－ＺＳ　（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．）を用いた。
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲには、ＡＢＩ　７５００　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
　β線の測定には、液体シンチレーションカウンターＴＲＩ－ＣＡＢＢ　１６００ＴＲ（ＰＡＣＫＡＲＤ）　を用いた。
　共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）には、Ａ１（Ｎｉｋｏｎ）、対物レンズＰｌａｎ　Ａｐｏ　ＶＣ　２０×及び６０×、レーザーＡｒ　ｌａｓｅｒ及びＨｅ／Ｎｅ　ｌａｓｅｒを用いた。
　逆転写反応には、ＰＣＲサーマルサイクラーＴＰ３０００（タカラバイオ株式会社）を用いた。
ｐＨ測定には、Ｄｏｃｕ－ｐＨＭｅｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いた。
　使用した脂質は、適量のＥｔＯＨで希釈する事で任意の濃度（１～１０ｍＭ）に調製した。
　Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡはＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ４－ＡＲ－３００　（Ｓｉｚｅ　１０×２５０　ｍｍ）を用いて逆相ＨＰＬＣを行い精製した。Ｈ２Ｏ／０．１％　ＴＦＡをＢｕｆｆｅｒ　Ａ、ＣＨ３ＣＮ／０．１％　ＴＦＡをＢｕｆｆｅｒ　Ｂとした。Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ（Ｐｕｒｉｔｙ：　＞７１％）をＤＭＦに溶解したもの（Ｃｒｕｄｅとして４ｍｇ／ｍＬ）をインジェクションしたのち、流速２．０ｍＬ／ｍｉｎ、２５℃で、５０％　Ｂ→９５％　Ｂ（２０ｍｉｎ）とグラジエントをかけた（詳細は下記）。２１５ｎｍにおける吸光度で検出することでＣｈｏｌ－ＧＡＬＡを回収し、凍結乾燥させた。精製したＣｈｏｌ－ＧＡＬＡは、ＨＰＬＣで純度を確認した後、１ｍＭ　ＥｔＯＨ溶液として分注し、－８０℃で保存した。
＜条件＞　
インジェクション量：２５０μＬ（４ｍｇ／ｍＬ　ｉｎ　ＤＭＦ）
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ　
カラム温度：２５℃　
プロトコル：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ｌｉｐｏｓｏｍｅ、ＭＥＮＤの粒子径とζ（ゼータ）電位はＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて測定した。
　実験データは、特に断りのない限り３回以上の実験値の平均値±標準偏差で表記した。有意差検定を用いる場合にはＯｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡにより検定を行い、さらにＤｕｎｎｅｔｔ法にて多重比較を行い、Ｐ＜０．０５の場合を有意差ありとした。
 （実施例１）Ｌｉｐｏｓｏｍｅの調製
１）　脂質薄膜の調製　
ガラス試験管にＥＰＣ（ＥｔＯＨ溶液）、Ｃｈｏｌ（ＥｔＯＨ溶液）をモル比７０／３０で調製し（リポソームａ）、リポソームａの総脂質量に対して、ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００（ＥｔＯＨ溶液）を５モル％になるように添加し、ＥｔＯＨを適当量添加後、デシケーターで減圧乾燥し、溶媒を留去することで、脂質組成がＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００である脂質薄膜を調製した（図１では“Ｌｉｐｏｓｏｍｅ”と略す）。また、ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００にＣｈｏｌ－ＧＡＬＡを修飾する際には、リポソームａの総脂質量の２モル％を脂質溶液中に添加し、脂質組成がＥＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡである脂質薄膜を調製した（図１では“ＧＡＬＡ－Ｌｉｐｏｓｏｍｅ”と略す）。また、図１で“Ｃａｔｉｏｎｉｃ－Ｌｉｐｏｓｏｍｅ”で表される脂質薄膜を調製する際には、ＤＯＴＭＡ（ＥｔＯＨ溶液）、Ｃｈｏｌ、ＥＰＣをモル比３０／４０／３０とし、上記と同様の操作で脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣである脂質薄膜（リポソームｂ）を調製した。
２）　リポソームの調製　
上記１）で調製した脂質薄膜に脂質濃度が２．６４ｍＭ（ｉｎ　ｖｉｖｏ実験）、０．５５　ｍＭ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験）となるように１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ　５％　Ｇｌｕｃｏｓｅ（ＨＢＧ）（ｉｎ　ｖｉｖｏ実験）、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ＨＢ）（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験）を添加後、室温で１５分以上水和した。その後、浴槽型ソニケーターで約１分間超音波処理を行うことで、リポソームを調製した。
（実施例２）リポソームの体内動態評価
１）　リポソームの投与、臓器の回収、［３Ｈ］の測定
上記２）で調製されたリポソームの脂質膜を［３Ｈ］で標識することで投与サンプルとした。　
１０μＬ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅ／ｇ　ｍｏｕｓｅの条件で、マウス（ＩＣＲ、５週齢、♂）尾静脈より投与した。投与１、５、１５分および１、６時間後にエーテル麻酔によりマウスを処置した後、開腹し、下大静脈より採血した後、肺、肝臓を摘出した。生理食塩水で臓器をよく洗浄し、重量を測定した後（肝臓に関しては、肝臓を細断後よく混合し、肝臓０．２ｇを使用した。）、プラスチックバイアルに入れ、２ｍＬのＳｏｌｕｅｎｅ－３５０を添加し、５０℃で一晩インキュベーションすることで組織を溶解させた。この溶液に対して、Ｈｉｏｎｉｃ　ｆｌｕｏｒ　１０ｍＬを添加しよく混合させた後、４℃で一晩静置し、液体シンチレーションカウンターにて［３Ｈ］のカウントを測定した。また、［３Ｈ］の投与量を評価するため、投与したＬｉｐｏｓｏｍｅサンプル１０μＬに対してＨｉｏｎｉｃ　ｆｌｕｏｒ　１０ｍＬを添加し、よく混合させた後、４℃で一晩静置し、同様に［３Ｈ］のカウントを測定した。
 ２）　臓器移行量評価
各臓器サンプルの［３Ｈ］カウント（測定値）を測定に供した臓器重量で除することにより、各臓器１ｇに含まれる［３Ｈ］を算出した後、投与したリポソームに含まれる［３Ｈ］で除することで、投与量に対する臓器移行量を割合として算出した。
　ＧＡＬＡ修飾リポソーム（ＧＡＬＡ－Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）の肺及び肝臓移行性を経時的に評価した結果を図１－Ａ、図１－Ｂ及び図２に示す。
　図１－Ａ、図１－Ｂ及び図２に示すように、ＧＡＬＡで修飾されたリポソームの肺移行性が認められた。また、ＧＡＬＡで修飾されたリポソームの肺移行性向上のため、肝臓への移行性が減少していることが認められた。
（実施例３－１）ＭＥＮＤ１の調製
１）　脂質薄膜の調製　
実施例１と同様の方法により、ガラス試験管にＤＯＴＭＡ（ＥｔＯＨ溶液）、Ｃｈｏｌ（ＥｔＯＨ溶液）、ＥＰＣ（ＥｔＯＨ溶液）をモル比３０／４０／３０になるように添加し、ＥｔＯＨを適当量添加後、デシケーターで減圧乾燥し、溶媒を留去することで、脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣである脂質薄膜（リポソームｂ）を調製した。ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００（ＥｔＯＨ溶液）を修飾する際には、リポソームｂの総脂質量の５モル％を脂質溶液中に添加し、脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００である脂質薄膜（以下、“ＭＥＮＤ１”と略す場合がある）を調製した。Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡを修飾する際には、リポソームｂの総脂質量の２モル％を脂質溶液中に添加し、脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡである脂質薄膜（以下、“ＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１”と略す場合がある）を調製した。
２）　ｓｉＲＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘ（ｓｉＲＮＡコア粒子）の調製　
Ｃｈａｒｇｅ　ｒａｔｉｏ（＋／－）＝１．８となるようにＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘを調製した。ボルテックス中、０．３３３　ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ溶液に対して、０．１２５ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ溶液を滴下（ｖｏｌｕｍｅ比　ｓｉＲＮＡ溶液：ＰＥＩ溶液＝６：４）し、室温で１５分間以上インキュベーションすることで調製した。ｓｉＲＮＡ溶液およびＰＥＩ溶液は、ＨＢＧにより希釈したものを用いた。
３）ＭＥＮＤの調製
上記１）で得られた脂質薄膜を調製した試験管に、ｓｉＲＮＡコア粒子溶液を、脂質濃度が２．６４ｍＭになるように添加後、室温で１５分以上水和させた。その後、浴槽型ソニケーターで約１分間超音波処理を行うことでＭＥＮＤを調製し、ｓｉＲＮＡコア粒子を封入したＭＥＮＤ１及びＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１を作製した。
（実施例３－２）ＭＥＮＤ２の調製
１）　脂質薄膜の調製
実施例１記載の調製法に準じて、ガラス試験管にＤＯＤＡＰ（ＥｔＯＨ溶液）、Ｃｈｏｌ（ＥｔＯＨ溶液）、ＥＰＣ（ＥｔＯＨ溶液）をモル比３０／４０／３０になるように添加し、成分がＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣである脂質溶液（リポソームｃ）を調製した。得られた脂質溶液にＳＴＲ－ＰＥＧ２０００（ＥｔＯＨ溶液）を、リポソームｃの総脂質量の５モル％を添加し、脂質組成がＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００である脂質薄膜を調製した（以下、“ＭＥＮＤ２”と略す場合がある）。Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡを修飾する際には、リポソームｃの総脂質量の２モル％をＭＥＮＤ２の脂質溶液中に添加し、ＥｔＯＨを適当量添加後、デシケーターで減圧乾燥し、溶媒を留去することで、脂質組成がＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡである脂質薄膜を調製した（以下、“ＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ２”と略す場合がある）。
２）　ｓｉＲＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘ（ｓｉＲＮＡコア粒子）の調製
Ｃｈａｒｇｅ　ｒａｔｉｏ（＋／－）＝１．８となるようにＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘを調製した。ボルテックス中、０．３３３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ溶液に対して、０．１２５ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ溶液を滴下（ｖｏｌｕｍｅ比　ｓｉＲＮＡ溶液：ＰＥＩ溶液＝６：４）し、室温で１５分間以上インキュベーションすることで調製した。ｓｉＲＮＡ溶液およびＰＥＩ溶液は、ＨＢＧ（ｐＨ未調整　（ｐＨ　５．０））により希釈したものを用いることで酸性溶液コア粒子を調製した。
３）ＭＥＮＤの調製
上記１）で得られた脂質薄膜を調製した試験管に、ｓｉＲＮＡコア粒子溶液を、脂質濃度が２．６４ｍＭになるように添加後、室温で１５分以上水和させた。その後、浴槽型ソニケーターで約１分間超音波処理後、調製溶液が中性となるようにＨＢＧ（ｐＨ８．１）をｓｉＲＮＡコア粒子溶液と等量添加することでＭＥＮＤを調製し、ｓｉＲＮＡコア粒子を封入したＭＥＮＤ２及びＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ２を作製した。
（実施例４）血球との相互作用
マウス血液（へパリン含、２０　ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）とＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１溶液を１：１のｖｏｌｕｍｅ比になるように混合し、３７℃条件下でシェイカーを用いて５分間混合した（サンプル１）。この混合液に、血液をさらに添加しｖｏｌｕｍｅ比１０：１とした後、先ほどと同様の条件で混合した（サンプル２）。サンプル１、２をスライドガラス上に１０μＬ添加しカバーガラスを載せた後、顕微鏡を用いて観察した。　
　血液と得られたＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１を任意の割合で混合し血球成分との相互作用を評価した結果を図３に示す。
　図３に示すように、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤと血液との凝集は可逆的であることが認められた。
（実施例５）ＭＥＮＤの体内動態評価
ＭＥＮＤの脂質膜を［３Ｈ］、ｓｉＲＮＡを［３２Ｐ］で標識することで投与サンプルとした。　
マウス（ＩＣＲ、５週齢、♂）の尾静脈よりＭＥＮＤ１あるいはＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１溶液（２ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ｋｇ　ｍｏｕｓｅ）を投与した。投与１時間後にエーテル麻酔によりマウスを処置した後、開腹し、下大静脈より血液を採取した後、肺を摘出した。重量を測定した後、０．１ｍｇ程度をプラスチックバイアルに入れ、２ｍＬのＳｏｌｕｅｎｅ－３５０を添加し、５０℃で一晩インキュベーションすることで組織を溶解させた。
この溶液に対して、Ｈ２Ｏ２　２００μＬ（１００μＬ×２）を添加することで脱色処理をした後、Ｈｉｏｎｉｃ　ｆｌｕｏｒ　１０ｍＬを添加しよく混合させた。４℃で一晩静置し、液体シンチレーションカウンターにて［３Ｈ］、［３２Ｐ］のカウントを測定した。また、未投与マウスから摘出した肺に既知量のＭＥＮＤ１溶液を添加し同様の操作を行うことで検量線を作製し、［３Ｈ］、［３２Ｐ］の各臓器への移行量を算出した。
ｓｉＲＮＡを［３２Ｐ］で、脂質膜を［３Ｈ］で標識したＭＥＮＤ１あるいはＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１を尾静脈投与し、１時間の肺に含まれる［３２Ｐ］、［３Ｈ］を測定することにより、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの肺への移行性を評価した結果を図４に示す。
図４に示すように、ＧＡＬＡ修飾により、ＭＥＮＤ１の肺への移行性が有意に向上した。
（実施例６）ＣＬＳＭによるＭＥＮＤの肺での局在観察
Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡを用いて調製したＭＥＮＤ１およびＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１を投与サンプルとした。
マウス（ＩＣＲ、５週齢、♂）の尾静脈より実施例３－１で得られたＭＥＮＤ１あるいはＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１溶液（２ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ｋｇ　ｍｏｕｓｅ）を投与した。尾静脈投与１時間後に、麻酔下でマウスより肺を摘出し、数ｍｍ程度の肺組織片を作製した。作製した肺組織片をＧＳＬ　Ｉ－Ｂ４　Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ　ＦＩＴＣ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（フナコシ社製）溶液中（生理食塩水を用いて２０μｇ／ｍＬに希釈したもの）に３０分間浸透させた後、ＣＬＳＭを用いて観察した。
　蛍光標識ｓｉＲＮＡを封入したＭＥＮＤ１あるいはＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１を尾静脈投与し、１時間後の肺におけるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの局在を共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて評価した結果を図５に示す。
　図５に示すように、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤにおいて、肺への高い集積性が認められ、血管内皮細胞と共局在していることが示された。
（実施例７－１）ＧＡＬＡ修飾の有無によるｉｎ　ｖｉｖｏ　ノックダウン効果
　ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ及びＧＡＬＡ未修飾ＭＥＮＤを用いて、ＧＡＬＡ修飾の有無によるノックダウン効果を調べた。
１）ＭＥＮＤ溶液の調製
　実施例３－１と同様の方法により、ＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１溶液及びＧＡＬＡ未修飾のＭＥＮＤ１溶液を調製した。即ち、脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ＝３０／４０／３０で調製したリポソームの総脂質量に対しＳＴＲ－ＰＥＧ２０００を５モル％修飾したものがＭＥＮＤ１であり、更にＣｈｏｌ－ＧＡＬＡを総脂質量に対して２モル％修飾したものがＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１である。
２）　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６ｗ、♂）の尾静脈より上記１で得られたＭＥＮＤ溶液（０．５－４ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ｋｇ　ｍｏｕｓｅ）を投与した。尾静脈投与２４時間後に、エーテル麻酔によりマウスを処置した後、開腹し、各臓器（肺、肝臓、脾臓）を摘出した。摘出した臓器は、ＲＮＡｌａｔｅｒに浸し、４℃で一晩置いたのち、－２０℃で保存した。
３）　ｍＲＮＡ抽出　
－２０℃で保存した臓器サンプルを室温に戻し、２０－３０ｍｇを評量したのち、ＲＮＡ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔおよびＱＩＡ　ｃｕｂｅ（ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付のプロトコルに従いＲＮＡ抽出を行った。
４）　逆転写反応　
Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　１μｇをＨｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　Ｋｉｔを用いて添付プロトコルに従い、ｃＤＮＡを調製した。Ｄｅｎａｔｕｒｅおよび逆転写反応は、サーマルサイクラーを用いて、Ｄｅｎａｔｕｒｅ　（６５℃，５ｍｉｎ→４℃，ｈｏｌｄ）、逆転写反応（４２℃，６０ｍｉｎ→９５℃，５ｍｉｎ→４℃，ｈｏｌｄ）の条件で行った。
５）　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ定量　
ＴａｑＭａｎ法に基づいた相対定量法（ΔΔＣｔ法）を用いてｍＲＮＡ（ＣＤ３１）の定量を行った。目的の濃度に希釈したｃＤＮＡ　５μＬに対して、１００μＭ　Ｕｐｐｅｒ　Ｐｒｉｍｅｒ　０．２５μＬ、１００μＭ　Ｌｏｗｅｒ　Ｐｒｉｍｅｒ　０．２５μＬ、１００μＭ　ｐｒｏｂｅ　０．０６２５μＬ、ｆｉｌｔｒａｔｅｄ　ＤＤＷ　６．９３７５μＬ、ＴａｑＭａｎ　Ｍ．Ｍ．２×１２．５μＬ添加した後、９５℃、１０ｍｉｎで初期変性を行った後、９５℃、１５ｓｅｃのＰＣＲ変性反応、６０℃、１ｍｉｎのアニーリング／伸長反応を１サイクルとして４０サイクルＰＣＲ反応を行った。ＣＤ３４を内部標準遺伝子として、ΔΔＣｔ法による相対定量を用いてＣＤ３１のｍＲＮＡ量を算出した。
　ＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１及びＭＥＮＤ１を尾静脈投与し、２４時間後の肺でのＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１及びＭＥＮＤ１の各ノックダウン効果をｑＲＴ－ＰＣＲ法により評価した結果を図６に示す。なお、図６において、ＧＡＬＡ（＋）はＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１、ＧＡＬＡ（－）はＭＥＮＤ１の結果を示している。
　図６に示すように、ＭＥＮＤにＧＡＬＡを修飾することによって肺におけるノックダウン効果が大幅に向上した。
（実施例７－２）Ｉｎ　ｖｉｖｏノックダウン評価
１）実施例７－１と同様の方法により、ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ｍＲＮＡ抽出、逆転写反応及びＲｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ定量を用いて、実施例３－１と同様の方法により作製したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ（脂質組成は、モル比でＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ＝３０／４０／３０であり、ＧＡＬＡ修飾量は総脂質量に対して２モル％である）を尾静脈投与し、２４時間後の肺、肝臓及び脾臓におけるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ－ＰＣＲ法により評価した。
　ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の肺でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ－ＰＣＲ法により評価した結果を図７に示す。
　ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の肝臓でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ－ＰＣＲ法により評価した結果を図８に示す。
　ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の脾臓でのＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ－ＰＣＲ法により評価した結果を図９に示す。
　　図７に示すように、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、既存のキャリアであるＡｔｕＰＬＥＸに比して、肺において、顕著に強いノックダウン効果を奏することが示された。
　また、図８に示すように、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、既存のキャリアであるＡｔｕＰＬＥＸに比して、肝臓において、１．０－４．０ｍｇ／ｋｇ投与時にノックダウン効果を奏することが示されたが、図７と比較して、肺における場合のノックダウン効果は肝臓における場合よりもはるかに強いことが示された。
　また、図９に示すように、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは脾臓では有意なノックダウン効果は認められなかった。
（実施例７－３）カチオン性脂質の異なるＭＥＮＤのノックダウン効果
　カチオン性脂質の異なるＧＡＬＡ－ＭＥＮＤを調製して、各ＧＡＬＡ－ＭＥＮＤのノックダウン効果を比較した。
１）ＭＥＮＤの調製
　カチオン性脂質としてＤＯＴＭＡを用いたＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１（脂質組成はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ）の調製は実施例３－１と同様の方法により行い、カチオン性脂質としてＤＳＴＡＰを用いたＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ３（脂質組成はＤＳＴＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ）の調製はＤＯＴＭＡをＤＳＴＡＰに変更する以外は実施例３－１記載の調製法に準じて行った。また、カチオン性脂質としてＤＯＤＡＰを用いたＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ２（脂質組成はＤＯＤＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ）の調製は、実施例３－２と同様の方法により行った。
２）ｉｎ　ｖｉｖｏノックダウン評価
上記１）で得られた異なるカチオン性脂質を含有する各ＧＡＬＡ－ＭＥＮＤにおけるノックダウン効果を評価した。評価方法は、前記実施例７－１と同様の方法により行った。
　カチオン性脂質として、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＡＰ及びＤＳＴＡＰを用いた場合のＧＡＬＡ－ＭＥＮＤ１～３のノックダウン効果を図１０に示す。なお、投与量は０．５ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ｋｇとした。
　図１０に示すように、カチオン性脂質が３級アミンか４級アミンかによらず、本発明に係るＭＥＮＤは高いノックダウン効果を奏することが示された。その中でもカチオン性脂質としてＤＯＴＭＡを含有するＭＥＮＤが最も高いノックダウン効果を奏することが示された。
　（実施例７－４）Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄが異なるＭＥＮＤのノックダウン効果
　Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄの異なるＭＥＮＤを調製して、各ＭＥＮＤのノックダウン効果を比較した。
　１）ＭＥＮＤの調製
　Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄを含むＭＥＮＤの調製は、前記実施例３－１と同様の方法により行った。即ち、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄをモル比３０／４０／３０とするリポソームを調製し、当該リポソームの総脂質量に対して、ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００を５モル％、Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡを２モル％修飾したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを調製した。
　２）ｉｎ　ｖｉｖｏノックダウン評価
　異なるＨｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄを含有する各ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤにおけるノックダウン効果を評価した。評価方法は、前記実施例７－１と同様の方法により行った。
　Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄとして、ＥＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＯＰＥを用いた場合の各ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果を図１１に示す。なお、図１１において、“ＥＰＣ”は脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、“ＤＯＰＥ”は脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、“ＳＯＰＥ”は脂質組成がＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＳＯＰＥ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡであるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを示す。また、投与量は０．５ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ｋｇとした。
　図１１に示すように、Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄの種類によらず、Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄを含む、本発明に係るＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤが高いノックダウン効果を奏することが示された。
（実施例８－１）ＭＥＮＤ４日連続投与時における体重変化
　１）ＭＥＮＤ溶液の調製
実施例３－１の方法に準じてＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ溶液を調製した。即ち、脂質組成は、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ＝３０／４０／３０（モル比）であり、ＧＡＬＡ修飾量は、総脂質量に対して２モル％とした。
上記１）で作製したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ溶液をマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６ｗ、♂）の尾静脈より４日間連続で投与した（２７Ｇの注射針を使用）。投与開始日から最終投与後１日まで各日マウスの体重を測定し、連続投与時における体重変化を算出した。なお、投与量は１あるいは２ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ｋｇ／ｄａｙとした。
　　ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ４日連続投与時における体重変化を図１２に示す。
　図１２に示すように、１～２ｍｇ／ｋｇにおいて、本発明のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、４日間連続投与時における体重減少が見られなかった。
（実施例８－２）ＭＥＮＤ　４日間連続投与時におけるＡＳＴ及びＡＬＴ
　実施例８－１で使用したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを４日間連続でマウスに尾静脈投与し、最終投与後２４時間にエーテル麻酔によりマウスを処置した後、開腹し、２３Ｇの注射針及び１ｍＬシリンジを用いて後大静脈より血液を採取した。４℃で４時間静置した後、遠心（４℃、１２０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ）し、上清を血清として回収した。血清５μＬに対してＡＳＴ及びＡＬＴ測定キット（トランスアミナーゼＣII－テストワコー）を用いて添付の方法に従い、血清中ＡＳＴ及びＡＬＴを測定した。その結果を図１３に示す。
　図１３に示すように、本発明に係るＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、ＡＳＴ及びＡＬＴにおいて変化が観察されず、４日間連続投与後翌日には肝障害は起きていないと考えられた。
（実施例９）ＰＥＧ修飾ＭＥＮＤの体内動態評価
ＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを用いて、ＰＥＧ修飾の有無によるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの体内動態を比較した。
　実施例３－１の方法により作製したＭＥＮＤを用いた。ＰＥＧ修飾量は総脂質量に対して１モル％あるいは５モル％とした。
ＭＥＮＤの体内動態評価は、実施例５に準じて行った。なお、ＰＥＧ未修飾ＭＥＮＤ（脂質組成：ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ）、１％ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００修飾ＭＥＮＤ（脂質組成：ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００）、１％Ｃ８セラミド－ＰＥＧ２０００修飾ＭＥＮＤ（脂質組成：ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／Ｃ８セラミド－ＰＥＧ２０００）の体内動態評価はＮ＝２で行った。
ＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ（脂質組成：ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ）とＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ（脂質組成：ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、及びＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／Ｃ８セラミド－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ）の肺移行率の比較を図１４に示す。
図１４に示すように、ＳＴＲ－ＰＥＧ及びＣ８セラミド－ＰＥＧをＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤに修飾しても高い肺移行性が認められた。
 （実施例１０）ＰＥＧ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果
　ＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを用いて、ＰＥＧ修飾の有無によるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果を比較した。
使用したＭＥＮＤは、実施例９で使用したＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを用いた。即ち、ＰＥＧはＳＴＲ－ＰＥＧ２０００及びＣ８セラミド－ＰＥＧ２０００を使用し、ＰＥＧ修飾量は総脂質量に対して１モル％及び５モル％とした。ＭＥＮＤのノックダウン評価は、実施例７－１と同様の方法を用いた。なお、投与量は１ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ｋｇとした。ＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果の比較を図１５に示す。
図１５に示すように、ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００及びＣ８セラミド－ＰＥＧ２０００をＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤに修飾しても高いノックダウン効果が得られ、さらにＰＥＧを修飾することによりＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの凝集を抑制することができた。
 （実施例１１）一定期間保存後ＰＥＧ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果
次に、一定期間保存後のＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果を比較した。
　用いたＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、実施例９で使用したＰＥＧ未修飾のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを用いた。なお、ＰＥＧは、ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００を用い、当該ＰＥＧの修飾量は総脂質量に対して５モル％とした。ＭＥＮＤは、ＨＢＧ溶液中（ｐＨ７．４）、室温で１６日間保存した。ＭＥＮＤのノックダウン評価は、実施例７－１と同様の方法を用いた。なお、投与量は１ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ｋｇとした。１６日間保存ＭＥＮＤのノックダウン評価はＮ＝２で行った。　室温で１６日間保存したＰＥＧ未修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤとＰＥＧ修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果を図１６に示す。
図１６に示すように、ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００修飾ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは室温で１６日間保存しても、肺において高いノックダウン効果を奏することが示された。
（実施例１２）ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの保存安定性
次に、Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄの変更によるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの物性への影響を、室温で１ヶ月後のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤの凝集の有無により確認した。
　用いたＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、実施例３－１の方法、これに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより作製した。ＭＥＮＤは、ＨＢＧ溶液中、室温で１ヶ月間保存した。室温で１ヶ月後のＭＥＮＤの性状を図１７に示す。なお、図１７において、“ＥＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、“ＤＬＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＬＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、“ＤＭＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、“ＤＰＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、“ＤＳＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、“ＰＯＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＰＯＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、“ＤＯＰＣ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＣ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ、“ＤＯＰＥ”はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ／ＳＴＲ－ＰＥＧ２０００／Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡ　の脂質組成からなるリポソームを示す。
図１７に示すように、Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄとしてＥＰＣ、ＤＬＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣを使用した場合、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、室温１ヶ月で凝集は見られず、また、Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄとしてＤＯＰＥを使用した場合、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは、室温１ヶ月でわずかにしか凝集が見られなかった。
（実施例１３） ｉｎ　ｖｉｖｏ　ノックダウンに及ぼすＧＡＬＡ修飾量の影響
ＧＡＬＡ修飾量が異なるＭＥＮＤを用いて、ＧＡＬＡ修飾量がノックダウン効果に及ぼす影響を評価した。即ち、実施例７－１と同様の方法により、ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ｍＲＮＡ抽出、逆転写反応及びＲｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ定量を用いて、実施例３－１と同様の方法により作製したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ（脂質組成は、モル比でＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／＝３０／４０／３０であり、当該リポソームの総脂質量に対するＳＴＲ－ＰＥＧ２０００修飾量は５モル％であり、ＧＡＬＡ修飾量は１～４モル％である）を尾静脈投与し、２４時間後の肺におけるＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤのノックダウン効果をｑＲＴ－ＰＣＲ法により評価した。ＧＡＬＡ修飾量が異なるＭＥＮＤを尾静脈投与し、２４時間後の肺でのＧＡＬＡ修飾量が異なるＭＥＮＤの各ノックダウン効果をｑＲＴ－ＰＣＲ法により評価した結果を図１８に示す。
図１８に示すように、ＧＡＬＡを１～４モル％修飾することによって、肺におけるノックダウン効果が向上し、特にＧＡＬＡを１．５～２モル％修飾することによって肺におけるノックダウン効果が最も向上した。
（実施例１４）ＭＥＮＤ投与によるメラノーマ肺転移がんモデルにおける抗腫瘍効果
１）ＭＥＮＤ溶液の調製
実施例３－１と同様の方法により、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ溶液及びＧＡＬＡ未修飾ＭＥＮＤ溶液を調製した。脂質組成は、脂質組成は、モル比でＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣ／＝３０／４０／３０であり、当該リポソームの総脂質量に対するＳＴＲ－ＰＥＧ２０００修飾量は５モル％であり、ＧＡＬＡ修飾量は２モル％である。
２）メラノーマ肺転移がんモデルの作製
ルシフェラーゼ（ＧＬ４）安定発現Ｂ１６－Ｆ１０マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６－Ｆ１０－ｌｕｃ２；　Ｃａｌｉｐｅｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　ＭＡ，　ＵＳＡ）を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０メディウム中で４８時間培養した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６ｗ、♂）の尾静脈より、Ｂ１６－Ｆ１０－ｌｕｃ２細胞（２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ）を投与することによりメラノーマ肺転移がんモデルを作製した（ｄａｙ０）。
３）メラノーマ肺転移がんモデルへのＭＥＮＤ投与
Ｂ１６－Ｆ１０－ｌｕｃ２細胞移植後翌日より３日おきに、コントロールｓｉＲＮＡ（ａｎｔｉ－Ｌｕｃ（ＧＬ３））あるいはａｎｔｉ－ＣＤ３１　ｓｉＲＮＡを封入したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ（１ｍｇ　ｓｉＲＮＡ／ＫＧ　ｍｏｕｓｅ）をモデルマウスに投与し、腫瘍移植後１７日にマウスを開腹し、肺を摘出した。摘出した肺は腫瘍肺転移評価とＣＤ３１　ｍＲＮＡ発現量評価用として２つに分割した。なお、ＭＥＮＤ投与期間中、マウスの体重をモニタリングした。
４）腫瘍肺転移の定量評価
アシストチューブ中で摘出した肺サンプルに対してｉｎ　ｖｉｖｏ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　１　ｍＬを添加し、ＰＯＬＹＴＲＯＮホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いてホモジナイズした。ホモジェネートをサンプルチューブに回収した後、遠心（４℃、１３，０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清２０μＬをＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　５０μＬと混合させた後、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ－ＰＳＮ，　ＡＴＴＯ社製）でルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｌｕｎｇ）は肺全体におけるｒｅｌａｔｉｖｅ　ｌｉｇｈｔ　ｕｎｉｔｓ（ＲＬＵ）として算出した。結果を図１９に示す。
５）ＣＤ３１　ｍＲＮＡ発現量評価
実施例７－１と同様の方法により、摘出した肺におけるＣＤ３１　ｍＲＮＡ量を算出した。結果を図２０に示す。
図１９に示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ３１　ｓｉＲＮＡを封入したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを投与することにより、未処置群およびコントロールｓｉＲＮＡ投与群に比べて有意に肺転移の進行が抑制された。また、図２０に示すように、ａｎｔｉ－ＣＤ３１　ｓｉＲＮＡを封入したＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを投与することにより、未処置群およびコントロールｓｉＲＮＡ投与群に比べて有意にＣＤ３１　ｍＲＮＡ発現量が抑制された。
これまでにＣＤ３１のノックアウトあるいは抗ＣＤ３１抗体投与は腫瘍組織における血管新生を阻害し、その結果メラノーマ肺転移の進行が抑制されることが報告されている(Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Oct 26;107(43):18616-21)。今回の得られたＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ投与により得られた肺転移の進行抑制効果は、ＣＤ３１　ｍＲＮＡのノックダウンにより肺転移腫瘍組織における血管新生が阻害されたことに起因していると考えられた。
なお、肺転移モデルマウスにおいてＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤ投与による体重減少は見られなかったことから、ＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤは毒性を示すことなく、肺転移の治療が可能であることが示唆された。
 これらの結果から、ＧＡＬＡ修飾リポソームが肺特異的に移行することが認められた。
さらに、ｓｉＲＮＡ封入ＧＡＬＡ修飾リポソームが、肺において効率的なノックダウン効果を有することが認められた。
また、本発明のＧＡＬＡ修飾ＭＥＮＤを投与しても、体重減少や肝障害が見られず、安全に投与することができることが確認された。
以上から、本発明のＧＡＬＡペプチドで修飾されたベクターは、目的物質を肺に特異的に送達させるためのキャリア、好ましくは医薬、より好ましくはｓｉＲＮＡ等の核酸医薬を肺に特異的に送達させるためのキャリアとして有用であることが明らかになった。
　実施例で得られた物質導入剤としてのリポソーム（ＭＥＮＤ）は、平均サイズが９０～１７０ｎｍ程度、ゼータ電位は－５０～５０ｍＶの範囲内であった。
実施例１及び３で調製したリポソームのサイズ及びゼータ電位をそれぞれ表２及び表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本明細書に記載された文献は、その全体が本明細書に参考として援用される。

Claims (15)

  1. 配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドの、目的物質を肺に送達させるためのベクターの肺移行性素子としての使用。
  2. 前記ＧＡＬＡペプチドがベクターの構成成分に結合されている、請求項１に記載の使用。
  3. 前記ベクターが脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、請求項１または２に記載の使用。
  4. 前記ベクターがカチオン性脂質および／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、請求項１または２に記載の使用。
  5. 目的物質をベクターに内包し、かつ、前記ベクターが配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを含む肺を標的とする物質導入剤。
  6. ＧＡＬＡペプチドがベクターの構成成分に結合されている、請求項５に記載の物質導入剤。
  7. 前記ベクターが脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、請求項５または６に記載の物質導入剤。
  8. 前記目的物質が薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖及びこれらの複合体からなる群から選ばれる、請求項５～７のいずれか１項に記載の物質導入剤。
  9. 配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを肺に選択的に物質を送達させるための素子として含有する、目的物質を肺に送達させるためのベクター。
  10. 前記ベクターが脂質及び／又はコレステロールを含み、前記ＧＡＬＡペプチドがカチオン性脂質及び／又はコレステロールに結合されている、請求項９に記載のベクター。
  11. 前記ベクターがカチオン性脂質を含み、カチオン性脂質がＤＯＴＭＡ、ＤＳＴＡＰ及びＤＯＤＡＰからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、請求項９又は１０に記載のベクター。
  12. 前記ベクターがポリアルキレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンからなる群から選ばれる親水性ポリマーにより修飾されている、請求項９～１１のいずれか１項に記載のベクター。
  13. さらに、補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ　Ｌｉｐｉｄ）を含み，補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ　Ｌｉｐｉｄ）がＥＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ又はＳＯＰＥであることを特徴とする請求項９～１２のいずれか１項に記載のベクター。
  14. 前記ベクターがＤＯＴＭＡ、Ｃｈｏｌ及びＥＰＣを脂質膜の構成要素として含むリポソームであり、前記リポソームの脂質組成(モル比)は、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣが１０～５０／２０～５０／２０～７０であり、前記リポソームは、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＥＰＣの総脂質量に対しＳＴＲ－ＰＥＧ２０００を１～１５モル％、Ｃｈｏｌ－ＧＡＬＡを０．１～５モル％をさらに含む、項９記載のベクター。
  15. 目的物質を内包し、かつ、配列番号１で表されるＧＡＬＡペプチドを結合したベクターを哺乳動物に投与し、前記目的物質を肺に導入する方法。
PCT/JP2012/056406 2011-03-14 2012-03-13 肺送達のためのベクター、導入剤及び使用 WO2012124688A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201280023256.3A CN103561725B (zh) 2011-03-14 2012-03-13 用于肺递送的载体、导入剂及用途
ES12757063T ES2832330T3 (es) 2011-03-14 2012-03-13 Vector para administración pulmonar, agente inductor y usos
JP2013504738A JP5850915B2 (ja) 2011-03-14 2012-03-13 肺送達のためのベクター、導入剤及び使用
US14/004,942 US9532950B2 (en) 2011-03-14 2012-03-13 Vector for pulmonary delivery, inducing agent, and uses
EP12757063.8A EP2687204B1 (en) 2011-03-14 2012-03-13 Vector for pulmonary delivery, inducing agent, and uses

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011055765 2011-03-14
JP2011-055765 2011-03-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012124688A1 true WO2012124688A1 (ja) 2012-09-20

Family

ID=46830755

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/056406 WO2012124688A1 (ja) 2011-03-14 2012-03-13 肺送達のためのベクター、導入剤及び使用

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9532950B2 (ja)
EP (1) EP2687204B1 (ja)
JP (1) JP5850915B2 (ja)
CN (1) CN103561725B (ja)
ES (1) ES2832330T3 (ja)
WO (1) WO2012124688A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014069401A1 (ja) * 2012-10-29 2014-05-08 株式会社カルディオ 肺疾患特異的治療剤
JP2016501233A (ja) * 2012-11-30 2016-01-18 インスメッド， インコーポレイテッド プロスタサイクリン化合物およびプロスタサイクリン化合物を使用する方法
US10010518B2 (en) 2013-10-25 2018-07-03 Insmed Incorporated Prostacyclin compounds, compositions and methods of use thereof
US10343979B2 (en) 2014-11-18 2019-07-09 Insmed Incorporated Methods of manufacturing treprostinil and treprostinil derivative prodrugs
US11458098B2 (en) 2019-04-29 2022-10-04 Insmed Incorporated Dry powder compositions of treprostinil prodrugs and methods of use thereof

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9587001B2 (en) 2012-10-19 2017-03-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Conjugated knottin mini-proteins containing non-natural amino acids
KR101398764B1 (ko) 2013-08-29 2014-05-27 강릉원주대학교산학협력단 입자의 이동에 의해 분석물질을 검출하는 장치 및 방법
US11452759B2 (en) * 2015-01-19 2022-09-27 Technion Research & Development Foundation Limited Ubiquitin ligase KPC1 promotes processing of P105 NF-κB1 to p50, eliciting strong tumor suppression
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
CN109893657B (zh) * 2019-02-28 2022-04-29 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 基因递送载体、药物复合物、抗肺纤维化药物及应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01249717A (ja) 1988-03-30 1989-10-05 Fuji Photo Film Co Ltd リポソームの製造方法
JPH10506001A (ja) 1991-09-30 1998-06-16 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 核酸複合体を高等真核生物の細胞に導入するための組成物
JP2004010481A (ja) 2002-06-03 2004-01-15 Mebiopharm Co Ltd リポソーム製剤
JP2006028030A (ja) 2004-07-12 2006-02-02 Japan Science & Technology Agency リポソーム封入物質がエンドソームから脱出可能なリポソーム
JP2007145761A (ja) * 2005-11-28 2007-06-14 Tokyo Univ Of Pharmacy & Life Science 細胞膜透過性ペプチド修飾多糖−コレステロールまたは多糖−脂質非ウイルス性ベクターおよびその製造方法
WO2008105178A1 (ja) * 2007-02-28 2008-09-04 National University Corporation Hokkaido University リポソーム用生体成分抵抗性増強剤及びこれにより修飾されたリポソーム
WO2010067617A1 (ja) * 2008-12-12 2010-06-17 国立大学法人 北海道大学 脂質膜構造体

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5981273A (en) 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
DE69730218D1 (de) * 1996-04-11 2004-09-16 Univ British Columbia Fusogene liposomen
GB9801120D0 (en) * 1998-01-21 1998-03-18 Secr Defence Detection system
US6410328B1 (en) * 1998-02-03 2002-06-25 Protiva Biotherapeutics Inc. Sensitizing cells to compounds using lipid-mediated gene and compound delivery
US6245427B1 (en) * 1998-07-06 2001-06-12 DüZGüNES NEJAT Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles
US6673894B1 (en) * 2001-02-27 2004-01-06 Nucleus Remodeling, Incorporated Inhibitor of cell proliferation and methods of use thereof
EP1383480A4 (en) * 2001-04-30 2006-05-24 Targeted Genetics Corp Lipid-Containing Drug Delivery Complexes and Method of Producing the Same
US7741431B2 (en) * 2005-02-01 2010-06-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposomes containing novel targeting and/or fusogenic peptides, preparations containing them and therapeutic use thereof
US7534819B2 (en) * 2005-06-10 2009-05-19 University Of Washington Compositions and methods for intracellular delivery of biotinylated cargo
JP2015110522A (ja) * 2012-03-21 2015-06-18 国立大学法人北海道大学 機能性タンパク質を細胞内に送達するためのキャリア

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01249717A (ja) 1988-03-30 1989-10-05 Fuji Photo Film Co Ltd リポソームの製造方法
JPH10506001A (ja) 1991-09-30 1998-06-16 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 核酸複合体を高等真核生物の細胞に導入するための組成物
JP2004010481A (ja) 2002-06-03 2004-01-15 Mebiopharm Co Ltd リポソーム製剤
JP2006028030A (ja) 2004-07-12 2006-02-02 Japan Science & Technology Agency リポソーム封入物質がエンドソームから脱出可能なリポソーム
JP2007145761A (ja) * 2005-11-28 2007-06-14 Tokyo Univ Of Pharmacy & Life Science 細胞膜透過性ペプチド修飾多糖−コレステロールまたは多糖−脂質非ウイルス性ベクターおよびその製造方法
WO2008105178A1 (ja) * 2007-02-28 2008-09-04 National University Corporation Hokkaido University リポソーム用生体成分抵抗性増強剤及びこれにより修飾されたリポソーム
WO2010067617A1 (ja) * 2008-12-12 2010-06-17 国立大学法人 北海道大学 脂質膜構造体

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KENJI KUSUMOTO ET AL.: "Haikekkan Naihi Saibo Hyotekigata siRNA Delivery System no Kochiku", DRUG DELIV. SYS., vol. 26, no. 3, 28 May 2011 (2011-05-28), pages 293, XP008171171 *
MARTINEZ ET AL., CELL, vol. 110, 2002, pages 563 - 574
N.K. SUBBARAO ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 26, 1987, pages 2964 - 2972
PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 107, no. 43, 26 October 2010 (2010-10-26), pages 18616 - 21
SCHWARZ ET AL., MOLEC. CELL, vol. 10, 2002, pages 537 - 568
T. KAKUDO ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 43, 2004, pages 5618 - 5623

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014069401A1 (ja) * 2012-10-29 2014-05-08 株式会社カルディオ 肺疾患特異的治療剤
JPWO2014069401A1 (ja) * 2012-10-29 2016-09-08 株式会社カルディオ 肺疾患特異的治療剤
JP2016501233A (ja) * 2012-11-30 2016-01-18 インスメッド， インコーポレイテッド プロスタサイクリン化合物およびプロスタサイクリン化合物を使用する方法
US10010518B2 (en) 2013-10-25 2018-07-03 Insmed Incorporated Prostacyclin compounds, compositions and methods of use thereof
US10526274B2 (en) 2013-10-25 2020-01-07 Insmed Incorporated Prostacyclin compounds, compositions and methods of use thereof
US10995055B2 (en) 2013-10-25 2021-05-04 Insmed Incorporated Prostacyclin compounds, compositions and methods of use thereof
US11795135B2 (en) 2013-10-25 2023-10-24 Insmed Incorporated Prostacyclin compounds, compositions and methods of use thereof
US10343979B2 (en) 2014-11-18 2019-07-09 Insmed Incorporated Methods of manufacturing treprostinil and treprostinil derivative prodrugs
US11148997B2 (en) 2014-11-18 2021-10-19 Insmed Incorporated Methods of manufacturing treprostinil and treprostinil derivative prodrugs
US11458098B2 (en) 2019-04-29 2022-10-04 Insmed Incorporated Dry powder compositions of treprostinil prodrugs and methods of use thereof
US11759425B2 (en) 2019-04-29 2023-09-19 Insmed Incorporated Dry powder compositions of treprostinil prodrugs and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CN103561725B (zh) 2018-08-31
EP2687204A1 (en) 2014-01-22
JP5850915B2 (ja) 2016-02-03
US9532950B2 (en) 2017-01-03
ES2832330T3 (es) 2021-06-10
EP2687204A4 (en) 2014-09-03
EP2687204B1 (en) 2020-10-14
CN103561725A (zh) 2014-02-05
US20140079770A1 (en) 2014-03-20
JPWO2012124688A1 (ja) 2014-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5850915B2 (ja) 肺送達のためのベクター、導入剤及び使用
JP6768664B2 (ja) 分子の細胞内送達のためのペプチドおよびナノ粒子
EP1842558B1 (en) Composition for inhibiting expression of target gene
AU2011353233B2 (en) Carrier for negatively charged drugs comprising a cationic lipid and a preparation method thereof
JP2022542389A (ja) 拘束された脂質を含むナノ材料およびその使用
EP3784258A1 (en) Artificial exosome composition and related methods
JP5991966B2 (ja) ｐＨ応答性ペプチドを含むナノ粒子
JP5931212B2 (ja) 弱酸性ｐＨ応答性ペプチド及び該ペプチドを含むリポソーム
JP2018016642A (ja) 脂質粒子の製造法および脂質粒子を有する核酸送達キャリア
WO2016010111A1 (ja) 脂質粒子の製造法および脂質粒子を有する核酸送達キャリア
KR20240072931A (ko) 히스티딘을 포함하는 지질 나노입자 및 그 제조방법
WO2010110318A1 (ja) 核酸を含有する動脈硬化性疾患治療剤

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12757063

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013504738

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012757063

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14004942

Country of ref document: US