CN109893657B - 基因递送载体、药物复合物、抗肺纤维化药物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因递送载体、药物复合物、抗肺纤维化药物及应用。该基因递送载体包括PEG‑PEI共聚物以及与PEG‑PEI共聚物物理共混的PEI。这种PEI阳离子聚合物与PEG修饰过的PEG‑PEI共聚物共混形式的基因递送载体,同时具备了PEI和PEG‑PEI的优点,即一方面了利用了PEI阳离子聚合物作为递送载体具有转染率高、无免疫原性及无抗原性等优点,另一方面,因PEG修饰过的PEG‑PEI共聚物中PEG中和屏蔽了PEI表面的多余正电荷,降低了转染过程中对细胞的毒性,因而是一种新型的阳离子聚合物递送载体。
Description
技术领域
本发明涉及基因治疗领域,具体而言,涉及一种基因递送载体、药物复合物、抗肺纤维化药物及应用。
背景技术
基因治疗是通过导入外源基因的方法改善由基因异常或缺陷所导致疾病以及癌症的新技术,在治疗包括遗传病、传染病、癌症等疾病中应用广泛;它能够克服蛋白质药物治疗的不足,作为一种新型的治疗方法,被越来越多的研究和关注。
基因治疗过程分三部分:治疗基因的选择、治疗基因导入宿主细胞以及治疗基因的表达。其中,最关键的是第二步,即基因递送。很多实验证明,游离的基因可以被内吞进细胞,但这种方法的进程对于有效的生物效应来说太慢。而且,游离的DNA或RNA对血清中核酸酶的消化作用非常敏感,易于被降解。由于胞内障碍和胞外障碍都会阻碍基因的传递、转录和表达,因此,基因治疗需要合适的基因载体,基因载体可将外源基因导入靶细胞,并使其能够安全、稳定、高效地表达目标蛋白。如何提供一种安全有效的基因载体系统是此类基因治疗药物能够有效发挥其生物学功能的前提。
下面以肺纤维化这一病症为例,简要说明现有技术在基因治疗方面所存在的问题。
肺纤维化(Pulmonary fibrosis,PF)是一种呈进行性发展且不可逆的难治性肺部疾病,长期以来严重危害人类健康。它的形成机制尚不明确,主要认为是由多种因素引起的肺泡持续性损伤、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)反复破坏、修复并过度沉积导致正常肺组织结构变态重塑、功能缺失。高分辨率CT(highresolution computedtomography,HRCT)扫描可见胸膜下、两肺基底部网格状阴影和蜂窝影,肺功能测试显示限制性通气和弥散功能障碍;临床首先表现为进行性呼吸困难及低氧血症,最终可导致患者呼吸衰竭。近二十年来PF发病率逐年增加,生存中位数为2-9年,5年生存率20%-40%。且至今尚无有效防治手段。
目前肺纤维化的治疗方法主要包括药物治疗,如抗炎药物、抗纤维化药物、免疫抑制剂及氧气治疗及终期的肺移植等措施。然而现有的药物因存在各种不良反应而应用受限。目前肺移植为治疗晚期PF唯一的选择,但也存在器官供体稀少、机体免疫排斥反应及费用昂贵等问题。
肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF),是一种多功能性的细胞生长因子,由α链(分子量为69kD)和β链(分子量为34kD)通过二硫键连接而成,最初是从血小板和血浆中纯化得到,为强烈的刺激肝细胞增殖的促有丝分裂因子。HGF由肝间质细胞产生,而一般肝实质细胞则不产生HGF,HGF也可来源于肾和肺组织细胞,比如内皮细胞、肾小球系膜细胞、巨噬细胞及成纤维细胞等。HGF的主要作用机制是通过与细胞膜特异性C-met受体(一种跨膜酪氨酸激酶)结合并活化酪氨酸激酶,引起细胞内包括磷脂酰肌醇-3激酶、Grb/sos/Ras复合物、Gab1、Shp22、磷脂酶C及Ras-GTP酶活性蛋白等多个信号级联反应来发挥其多种生物学作用。因此HGF并不是肝特异性的生长因子,其可通过自分泌、内分泌、旁分泌的方式发挥生物学调控功能,比如刺激多种细胞分化、增殖、运动、再生、迁移及形态的发生,诱导血管的生成等。
HGF具有抗纤维化作用,大量体内外研究也逐步阐明了其抗纤维化作用机制,主要包括:(a)HGF通过抑制活化的肌成纤维细胞和系膜细胞,从而减少细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度堆积。(b)HGF通过增加基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达和降低纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1,TIMP-2)的表达,从而促进ECM的降解。(c)减少转化生长因子mRNA(transforming growth factor mRNA,TGF-β1mRNA)的表达及TGF-β1的分泌;TGF-β1是一种强烈的促纤维化细胞因子,可从多种方面促进纤维化发生和发展。研究证实TGF-β1主要通过激活Smad信号通路促进纤维化产生。而文献报道HGF可通过多种方式阻断此通路,有学者在培养大鼠间质成纤维细胞的研究中发现,HGF可以完全消除TGF-β1所诱导的Ⅰ型胶原及α-平滑肌激动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)蛋白的表达;而在培养人系膜细胞的实验中,HGF可快速上调Smad转录抑制因子(TGIF)的表达,并且通过稳定TGIF蛋白结构和功能来抑制TGF-β1的作用。而同时Yang J等在单侧输尿管梗阻动物模型研究中,发现术后3天给予HGF的治疗组α-SMA蛋白表达水平较模型组减少70%以上,ECM、TGF-β1及其受体的表达也明显降低。(d)保护内皮、上皮等细胞及抑制细胞凋亡的发生。(e)促进细胞增殖和分化。
但是外源性HGF蛋白质在血中不稳定,需重复注射HGF蛋白,但有可能导致低血压和肾脏毒性,从而影响外源性HGF的有效性。目前还无药用重组人HGF制剂上市,克服这些问题的策略是利用基因治疗手段,在体内转染HGF基因,以持续表达HGF蛋白从而达到治疗疾病的目的。但是,到目前为止,现有技术中并没有提供一种合适的基因递送载体来通过利用HGF基因的功能来治疗肺纤维化的方案。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基因递送载体、药物复合物、抗肺纤维化药物及应用,以提供一种能够高效、安全地向胞内递送基因的载体,以使HFG等基因在胞内发挥相应的生物学功能。
为了实现上述目的,根据本发明的一个方面,提供了一种基因递送载体,该基因递送载体包括PEG-PEI共聚物以及与PEG-PEI共聚物物理共混的PEI。
进一步地,PEG-PEI共聚物与PEI物理共混的质量比为2~5:1,优选为3:1。
进一步地,PEG-PEI共聚物的接枝率为5~25:1,优选为25:1。
进一步地,PEI及形成PEG-PEI共聚物的PEI为直链或支链PEI,优选PEI的分子量为20000~30000,更优选为25000,优选形成PEG-PEI共聚物的PEG的分子量为3000~10000,优选为5000。
为了实现上述目的,根据本发明的一个方面,提供了一种药物复合物,药物复合物包括药物载体及药物载体包封的基因药物,药物载体为上述任一种基因递送载体。
进一步地,基因药物为携带有HGF基因的质粒DNA;优选基因药物为pVAX-HGF。
进一步地,药物复合物中,药物载体对基因药物的包封率,按照N/P的摩尔比计,为1~40,优选为5~30,更优选为15~25,进一步优选为20~25,最优选为25。
进一步地,药物复合物的粒径为85~250nm,优选为90~110nm,更优选为100nm。
进一步地,药物复合物的zeta电位为+20~45mV,优选为+25~35mV,更优选为28~32mV。
根据本发明的第三个方面,提供了一种抗肺纤维化药物,抗肺纤维化药物为上述任一种药物复合物。
根据本发明的第四个方面,提供了上述任一种基因递送载体在制备基因治疗药物中的应用。
应用本发明的技术方案,首次提出了一种PEI阳离子聚合物与PEG修饰过的PEG-PEI共聚物共混形式的基因递送载体,这种共混形式的载体同时具备了PEI和PEG-PEI的优点,即一方面了利用了PEI阳离子聚合物作为递送载体具有转染率高、无免疫原性及无抗原性等优点,另一方面,因PEG修饰过的PEG-PEI共聚物中PEG中和屏蔽了PEI表面的多余正电荷,降低了转染过程中对细胞的毒性,因而是一种新型的阳离子聚合物递送载体。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1a至图1c示出了本发明的实施例1中不同载体的红外图谱;其中,图1a示出的是mPEG-SPA的红外图谱,图1b示出的是PEI的红外图谱,图1c示出的是PEG-PEI的红外图谱;
图2示出了本发明的实施例1中PEG-PEI载体的核磁共振图谱;
图3a和图3b分别示出了本发明的实施例2中不同载体在不同N/P比值下与质粒DNA形成的药物复合物的粒径和zeta电位结果;
图4示出了本发明的实施例2中不同载体形成的药物复合物的凝胶电泳阻滞实验结果,其直观地反映了不同载体对质粒DNA结合作用的强弱;
图5示出了本发明的实施例2中载体对DNA药物的包封率标准曲线;
图6示出了本发明的实施例3中不同载体在不同N/P比值下对细胞的转染效率的结果图;
图7示出了本发明的实施例3中不同载体在不同N/P比值下对细胞的毒性作用的结果图;
图8示出了本发明的实施例4中mix1/pVAX-HGF复合物的稳定性检测结果;
图9示出了本发明的实施例4中mix1/pVAX-HGF复合物在透射电镜下的结构形态;
图10示出了本发明的实施例5中mix1/pVAX-HGF复合物对肺纤维化大鼠体重的影响;
图11a、图11b、图11c、图11d及图11e分别示出了本发明的实施例5中mix1/pVAX-HGF对肺纤维化大鼠在呼气流量、每分通气量、呼气峰流速、吸气峰流速及潮气量这5个肺功能指标的影响;
图12示出了本发明的实施例5中不同载体包封复合物对肺纤维化大鼠病理损伤的影响;
图13示出了本发明的实施例5中mix1/pVAX-HGF复合物对肺纤维化大鼠肺组织胶原沉积的影响;
图14示出了本发明的实施例5中mix1/pVAX-HGF复合物对肺纤维化大鼠支气管肺泡灌洗液中总细胞数的影响;
图15示出了本发明的实施例5中mix1/pVAX-HGF复合物对肺纤维化大鼠肺组织羟脯氨酸含量的影响;
图16示出了本发明的实施例5中mix1/pVAX-HGF复合物对肺纤维化大鼠肺组织Col-Ⅰ含量的影响;
图17示出了本发明的实施例2中pVAX-HGF质粒的图谱。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的,现有技术有报道HGF对肺纤维化有一定的阻碍作用,但在基因治疗的应用层面上,由于受递送载体的限制,还没有利用该基因治疗肺纤维化的合适的药物的报道。为此,申请人以HGF(人肝细胞生长因子)基因的能抑制肺纤维化为例,对如何制备一种有效的基因治疗的药物进行了深入的研究。对现有报道HGF具有抗肺纤维化的报道进行了仔细分析,发现这些报道中的实验都是通过利用常规的裸质粒携带HFG转染各种细胞或动物模型进行实验而得出的结论,而裸质粒携带基因用于治疗,则存在诸多问题,比如由于基因分子量较大并且带有负电荷,裸质粒DNA或RNA不能透过细胞膜进入细胞,通常需通过电转、超声物理方法才能进入到细胞。而且,裸质粒DNA或RNA在体内不稳定,可迅速被DNA及RNA酶消化降解并由肾脏排出,导致其目的蛋白表达水平降低,从而达不到基因治疗的效果。
目前,用于基因治疗的载体主要包括两种:病毒载体(viral gene delivery)与非病毒载体(non-viral gene delivery)。病毒载体是用病毒外壳包裹核酸类药物,将外源基因导入宿主细胞中。病毒载体如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等,因转运能力强和具有较高的转染效率而得到广泛应用,但同时具有较大的副作用,比如免疫原性、较高的细胞毒作用、易引起炎症反应、装载DNA数量和大小有限、潜在致癌风险及安全性低等缺点。非病毒载体是一种新型的基因递送载体,能够弥补病毒载体的缺陷。非病毒载体可分为3大类:上述所提到的裸质粒DNA、阳离子脂质体及阳离子聚合物。
也就是说,上述的裸质粒尽管能够用于科学研究的实验中,但用于药物进行基因治疗时仍存在局限性。而上述其他的载体的利弊也有报道:Felgner]等在1987年首次使用二油丙基三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)以等质量比混合作为运载体并成功转染DNA,自此以后阳离子脂质体作为基因载体被广泛研究,目前有多种阳离子脂质体被广泛发展成高效的商品转染试剂。在体外实验与研究中阳离子脂质体具有良好的转染效果,但体内研究中,它会被机体迅速清除或者在肺内积蓄,产生毒性,并诱发强烈炎症反应,因此其在生物医疗领域及临床应用中仍受到限制。
阳离子聚合物,如聚乙烯亚胺(PEI)、多聚赖氨酸(PLL)、壳聚糖(CS)和聚酰胺-胺树形高分子(PAMAM)等,也已被用于基因载体系统研究。阳离子聚合物载体PEI自Boussif首次于1995年作为基因载体对真核细胞成功转染以来,已有很大发展。PEI结构中含有氨基,表面富含正电荷,能够通过静电作用与DNA或RNA等表面带有负电荷的核酸类生物大分子结合成复合物,将其压缩成50~200nm的稳定纳米粒结构,这种封闭的结构可有效保护DNA、RNA分子被溶酶体降解,同时PEI具有独特和强大的“质子海绵效应”,能够促进复合物被细胞摄取,可使PEI/DNA复合物从内涵体内逃逸转运入细胞核,因此PEI及PEI衍生物常作为转染试剂应用于体外和体内试验。
PEI结构基本单元为-CH-CH2-NH2-,使PEI几乎在任何pH条件下均具有质子化的能力,且PEI完全质子化时,电荷密度可高达23.3mmol/g。PEI可分为两类:直链PEI(lPEI)和支链PEI(bPEI)。而RudolphC等研究显示lPEI表面具有较低的表面电位,转染效率也较bPEI偏低。PEI分子量从700至800000不等,低分子量的PEI因缩合DNA效应不强,转染效率极低,而高分子量的PEI细胞毒性太大,以25K(25000)为宜。因此目前最常用的为分子量为25K的支链的PEI作为转染试剂。
尽管PEI具有制备和使用方便,成本低廉,基因装载能力大,转染率高,无免疫原性,无抗原性等优点,但目前PEI仍面临两个问题,一是在体内转染率明显较低,二是细胞毒性较大,此瓶颈阻碍其在临床医疗领域的使用。
体外研究中,PEI在多种细胞中均有较高的转染效率,但在体内其转染率明显降低。原因可能与体内复杂的生理环境有关:因为PEI/DNA复合物能够与体内纤维蛋白原、白蛋白、免疫球蛋白、红细胞等非特异性结合,导致其被核酸酶或网状内皮系统消化或清除,严重影响基因类药物到达靶部位的数量,所以转染效率降低。
PEI的细胞毒性与其表面多余正电荷密切相关,PEI表面多余的正电荷能够与带负电的蛋白结合,破坏细胞膜结构;并且载体表面电荷越多,毒性就越大,阳离子聚合物与细胞膜结合进入细胞后,会在细胞膜上形成许多微孔,严重时可致使细胞膜破裂,或者引起细胞膜变薄甚至腐烂,造成细胞膜损伤。PEI能够诱发细胞色素C的释放,从而引起细胞凋亡,还可激活细胞自噬系统等途径产生细胞毒作用,且其不能够被生物降解。Zou等体内研究表示,PEI的毒性还与其诱导红细胞聚集形成的微血栓相关。因此,进一步提高PEI的转染效率并降低其细胞毒性的研究日趋受到广泛关注。
为降低其毒性,并增强载体渗透性及改善其生物相容性,可对PEI结构进行改造,屏蔽多余正电荷,如对其伯胺乙酰化、引入琥珀酸或丙酸、引入中性壳聚糖、加入β-环糊精、组氨酸或聚乙二醇(PEG)。PEG作为电中性的亲水基,具有组织相容性良好、无毒、无免疫性等优点,被广泛用于修饰聚乳酸(PLA)等聚合物。PEG修饰PEI(接枝率为13)可使其毒性下降,研究表明用PEG-PEI处理细胞48h后,细胞活性仍保持84%。且PEG-PEI将DNA类药物特异性地导入肿瘤细胞时,结果仍可获得较高的转染效率。除此之外PEG因其具有良好的水溶性,增加PEI/DNA复合物的溶解度,减少其在体内的聚集。并且延长复合物在治疗部位的滞留时间,抑制巨噬细胞的吞噬作用,增加复合物对血管的渗透作用,所以适用于基因递送系统的修饰。
然而PEG中和了PEI表面的正电荷并改变了其构型,导致PEI对DNA的承载效果及细胞对PEI/DNA复合物的摄入量减少,降低了转染率。同时经研究显示PEG-PEI/DNA复合物在动物血液中过早解离而致使对肝脏的转染率下降。因此优化PEG修饰的大小和程度是研究PEG修饰基因载体的关键。
本申请通过PEG和PEI一系列不同的投料比,获得了不同接枝率的共聚物产物,最终发现接枝率为25时的共聚物能有效屏蔽PEI表面电荷并能与质粒DNA形成复合物。并且基于调节复合物表面电荷及粒径大小考虑,发明人尝试以PEG-PEI共聚物与PEI物理混合的形式作为基因的载体,并且试验了不同混合比例所形成的载体对携带HGF的质粒DNA的包裹效果,发现当PEG-PEI共聚物与PEI以质量比为3:1混合作为载体时,与pVAX-HGF形成的复合物(简称mix1)的粒径最小,能够将pVAX-HGF压缩为100nm左右的纳米颗粒,且略带正电(+30mv左右),有利于细胞的内吞作用。并进一步通过一系列实验证明mix1能够在一定程度上改善大鼠的肺功能,延缓肺纤维化进程。
由此证明,采用PEG-PEI共聚物与PEI物理共混调节的聚合物作为基因载体,不仅能够将基因包裹压缩成大小合适的纳米颗粒,而且使物理共混的聚合物呈弱正电性,有利于细胞内吞,从而便于将具有治疗效果的目的基因成功导入细胞内,从而实现目的基因的相应功能。
基于上述研究结果和发现,申请人提出了本申请的技术方案。在本申请一种典型的实施方式中,提供了一种基因递送载体,该基因递送载体包括PEG-PEI共聚物以及与PEG-PEI共聚物物理共混的PEI。
本申请首次提出了一种PEI阳离子聚合物与PEG修饰过的PEG-PEI共聚物共混形式的基因递送载体,这种共混形式的载体同时具备了PEI和PEG-PEI的优点,即一方面了利用了PEI阳离子聚合物作为递送载体具有转染率高、无免疫原性及无抗原性等优点,另一方面,因PEG修饰过的PEG-PEI共聚物中PEG中和屏蔽了PEI表面的多余正电荷,降低了转染过程中对细胞的毒性,因而是一种新型的阳离子聚合物递送载体。
上述共混形式的递送载体中,PEG-PEI共聚物与PEI物理共混的具体比例,可以根据实际需要合理优化设置。在一种优选的实施例中,PEG-PEI共聚物与PEI物理共混的质量比为2~5:1,优选为3:1。本申请中通过将两者的共混质量比控制在该范围内,具有转染效率高,且对细胞毒性小的优点。
进一步优选地,根据所欲递送的核酸药物的负电性的强弱,上述PEG-PEI共聚物与PEI物理共混的质量比可以是2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或5:1。在同一种PEG-PEI共聚物情况下,共混的PEI越多,共混形式的载体的正电性相对越强。
上述共混形式的载体中,载体所具备的正电性强弱也可以通过调节PEG-PEI共聚物中的PEG在PEI上的接枝率来实现,当PEG在PEI上的接枝率越高,对PEI正电荷中和的越多,进而使PEG-PEI共聚物的正电性相对越弱。反之,PEG在PEI上的接枝率越低,对PEI正电荷中和的相对越少,进而使PEG-PEI共聚物的正电性相对比较强些。在本申请中,申请尝试从5:1到30:1的不同程度的接枝率,结果发现当接枝率达到25:1时,难以实现更高程度的接枝率,即当接枝率达到25:1时,可实现对PEI的正电荷的中和。在一种优选的实施例中,PEG-PEI共聚物的接枝率为5~25:1,优选为25:1。
由于支链PEI相比直链PEI,具有相对较高的表面电位,转染效率相对较高,因而在一种优选的实施例中,PEI及形成PEG-PEI共聚物的PEI均为支链PEI。优选支链PEI的分子量为20000~30000,更优选为25000。分子量在该范围内转染效率高,且细胞毒性小。优选形成PEG-PEI共聚物的PEG的分子量为3000~10000,更优选为5000。PEG分子量在该范围内具有转染效率高,且低毒的效果。
在本申请第二种典型的实施方式中,提供了一种药物复合物,该药物复合物包括药物载体及载体包裹的基因药物,药物载体为上述基因递送载体。通过利用上述基因递送载体包裹而形成的药物复合物具有递送效率高,使相应的基因药物安全高效地到达靶部位发挥相应的生物学功能,从而实现相应的基因治疗的效果。此处的基因药物可以是任何明确可以用于基因治疗的相关基因的DNA或重组DNA,重组DNA最好是人源性的重组DNA。
在一种优选的实施例中,上述基因药物为携带有HGF基因的质粒;优选基因药物为pVAX-HGF。如前述HGF基因具有抗肺纤维化的作用,因而利用上述基因递送载体递送HGF基因到达靶部位,从而有利于治疗和/或缓解肺纤维化。任何能够携带HGF基因的质粒均适用于本申请,具体质粒的使用可以根据实际需要从已知的商品化的质粒中进行合理选择,也可以采用自行设计或改造的质粒。本申请中所使用的pVAX质粒简单、载体小,用其来携带HGF基因使得质粒结构紧密,更易包裹,且转染效果较高。
根据前述基因递送载体中物理共混形式的PEI和PEG-PEI共聚物的质量比和PEG-PEI的接枝率高低,其对基因药物的压缩能力也略有差异。在一种优选的实施例中,药物复合物的粒径为85~250nm,优选为90~110nm,更优选为100nm。药物复合物的粒径在85~250nm范围内,既容易被细胞摄取,又不易被机体迅速排出,从而使得生物利用效率高。
上述药物复合物中,药物载体对基因药物的包封率可以根据实际需要合理设置,只要能够满足相应要求即可。本申请一种优选的实施例中,上述药物复合物中,包封率按照N/P的摩尔比计,可以为1~40,具体可以是1、2、3、4、5、6、10、15、20、25、30、35或40。优选为5~30,更优选为15~25,进一步优选为20~25,最优选为25。当N/P小于40时,所形成的药物复合物对细胞的毒性相对较小,以A549细胞为例,当N/P小于40时,细胞的存活率可以维持在85%以上。而当N/P为15~30时,药物复合物的粒径和zeta电位变化不大。而当N/P等于4时,药物载体对基因药物的包封率基本可达到100%(以HGF为例,包封率为99.8%)。当N/P为25时,药物复合物对细胞的转染效率最高。
基因递送载体包裹基因药物形成复合纳米颗粒大小的药物复合物,因基因递送载体采用的是本申请的PEI及PEG-PEI共聚物共混形式的载体,其仍属于阳离子聚合物,因而具有一定程度的正电性,而这种正电性对转染进入细胞是有利于的。在一种优选的实施例中,药物复合物的zeta电位为+20~45mV,优选为+25~35mV,更优选为+28~32mV,在20~45mV范围大小的正电性转染细胞的效率高,+25~35mV的转染效率更高,+28~32mV之间转染效率最高。
在本申请第三种典型的实施方式中,提供了一种抗肺纤维化药物,该抗纤维化药物为上述任一种药物复合物。上述含有HGF基因药物的药物复合物具有抗肺纤维化的作用,因而能够作为一种抗肺纤维化药物。
在本申请第四种典型的实施方式中,提供了上述任一种基因递送载体在制备基因治疗药物中的应用。本申请的基因递送载体适合递送任何能够进行基因治疗的基因药物。此处的基因药物不仅仅指DNA药物,也可以是RNA药物,因为RNA药物与DNA药物具有类似的带负电荷的特性,因而在利用本申请的基因递送载体包裹转染细胞时,具有类似的高效转染且保护药物不被机体迅速降解或清除的效果。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
实施例1
1.1 PEG-PEI共聚物的制备
采用一步反应法制备共聚物,合成原理如下式I所示,称取分支型的聚乙烯亚胺(bPEI,25kDa)74.8mg,于圆底烧瓶内,加PBS溶液(PH=7)5ml,磁力搅拌使其完全溶解,然后边搅拌边缓慢加入甲基化聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)粉末,共加入392mg,30min加完,并室温磁力搅拌反应过夜。
反应结束后,将产物溶液倒入超滤离心管中(截留分子量30K),离心至剩余液体1ml左右时补充4倍体积的纯水,重复离心3次,在浓缩产物溶液的同时去除溶液中未反应原料物质和盐杂质,最后将浓缩液体置于真空冷冻干燥器干燥24小时,得白色固体粉末状物质即为PEG-PEI共聚物,称重后于室温干燥的环境下保存备用。
上述式I中,n为50~250,m1+m2为200~700。
1.2 PEG-PEI共聚物结构表征(红外图谱分析与1H-NMR图谱)
称取5.0mg mPEG-SPA、12.5mg PEI原料药及反应产物PEG-PEI 5.2mg,分别采用KBr压片,然后在VERTEX70型红外光谱仪器上进行检测。
称取50.0mg mPEG-SPA、90.7mg PEI、及101.5mg反应产物PEG-PEI,分别放于3个1.5mlEP管中,分别向各管加入0.5ml D2O,超声使其完全溶解后,于离心机内3000rpm离心1min,小心吸取上清液于核磁管中(注:液体高度不得短于4cm),超声排除核磁管内气泡,然后在核磁共振仪器上进行检测,条件:温度27℃,600MHz。
1.3结果
mPEG-SPA与PEI按质量比为25:1的投料比经一步法反应后,浓缩、纯化、冷冻干燥后,最终得到产物316.77mg,产率为67.86%。
PEG-PEI产物的结构确证图采用IR法(如图1a、图1b和图1c)和1H-NMR法(如图2)。mPEG-SPA(图1a)、PEI(图1b)、PEG-PEI(图1c)的红外图谱分别显示,2889cm-1处为C-H的伸缩振动峰,1343cm-1~1468cm-1处为C-H的弯曲振动峰,1113cm-1为C-O的弯曲振动峰,1711cm-1为C=O(酯键)强伸缩振动峰。由此证明-OCH3,-CH2-CH2-O,O-C=O(酯基)的官能团的存在。
如PEI红外图谱(图1b)中所示2821cm-1为C-H的伸缩振动峰,3130cm-1N-H的伸缩振动峰,1605cm-1处为N-H变形振动峰,1299cm-1~1055cm-1为C-N的伸缩振动峰,919cm-1~595cm-1为N-H的面外弯曲振动峰。由此可证明乙烯亚胺单元(-CH2-CH2-NH-)的存在。
PEG-PEI红外图谱中如图1c所示,3410cm-1处为酰胺键的N-H伸缩振动峰,1568cm-1处为酰胺键的N-H伸缩振动峰,1648cm-1处为酰胺键C=O伸缩振动峰,1468cm-1~1400cm-1处为酰胺键C-N的伸缩振动峰。由此证明酰胺键的生成和酯键的消失。从而判断终产物为PEG-PEI聚合物。
mPEG-SPA与PEI合成后产物的1H-NMR结果显示,δH3.28处为甲基质子共振信号峰,δH3.53、δH3.60、δH3.72处的吸收峰均属于mPEG-SPA中亚甲基质子的吸收位移(-CH2-);δH2.74和δH2.99处的吸收峰为分别与叔胺与仲胺相连接的亚甲基质子(-CH2-)的化学吸收位移。由此可见产物氢谱图上既有PEG上质子的特征吸收峰,又有PEI上质子的特征吸收峰,由此图谱可确定聚合物为PEG-PEI的共聚物。
共聚物的接枝率采用1H-NMR中质子峰积分面积计算。如图2所示,乙二醇单元(-CH2-CH2-OH)质子吸收峰为δH3.38~δH3.80,乙烯亚胺单元(-CH2-CH2-NH-)质子吸收峰为δH2.17~δH3.10。乙二醇单元和乙烯亚胺单元的质子峰积分面积之比为100:20.71,代入公式计算得产物中PEG和PEI的摩尔数之比n为24.91:1,即每分子PEI上接枝了25分子的PEG。则共聚物的分子量为24.91*5071+25000=149973,约为15万。由1H-NMR所计算的共聚物接枝比与反应原料药的真实投料比接近,说明此反应是为可控反应。
接枝率的计算公式如下式II所示:
注:S(CH2)为PEG中结构单元-CH2-CH2-OH的质子吸收峰面积,S(CH2CH2NH)为PEI中结构单元-CH2-CH2-NH的质子吸收峰面积;Mw(PEG)与Mw(PEI)分别表示PEG与PEI的分子量,分别为5000与25000,44与43分别表示PEG与PEI结构单元的分子量,4表示PEG与PEI结构单元中的氢原子数量。
共聚物的分子量按如下公式计算:Mw(PEG-PEI)=n×Mw(PEG)+Mw(PEI)。
实施例2
PEG-PEI:PEI/pVAX-HGF复合物的制备及理化性质
pVAX-HGF为携带HGF基因的质粒DNA,由本实验自行构建和制备,该质粒为人真核表达质粒,具有卡那霉素(kanamycin)抗性。具体的质粒图谱见图17,其中,Pcmv表示CMV的启动子,位于该质粒的137~724bp的位置。T7表示T7启动子,位于该质粒的664~683bp位置。HGF基因的cDNA位于736~2922bp。BGH pA表示BGH polyadenylation signal,BGH多聚腺甘酸尾巴,位于2960~3184bp。kanamycin表示卡那霉素,位于3357~4151bp。pUC ori是pUC质粒的复制起点,位于该质粒的4451~5124bp位置。
2.1 PEG-PEI/pVAX-HGF复合物的制备
用纯水将pVAX-HGF质粒稀释成50μg/ml的溶液;称取PEI及PEG-PEI,并将PEG-PEI与PEI分别以3:1、1:1、1:3的质量比混合(注:将此三种混合物分别称为mix1、mix2、mix3),用纯水将上述5种不同的聚合物配制成不同浓度的载体溶液。将载体溶液缓慢并且等体积加入质粒DNA稀释液中,充分吹吸混匀后,室温静置孵育30min,配制成N/P值(N/P值用于表征载体对质粒的包封率,其中N代表载体中的-NH2的摩尔数,而P代表质粒所携带的核酸中的磷酸)分别为5、10、15、20、25、30的复合物溶液,放于4℃层析柜保存备用,临用前室温静置10min。
2.2复合物粒径与电位的检测
向样品池内小心倒入适量待测复合物溶液,使液面不低于1.5cm,将样品池外部用棉布擦拭干净,放于样品槽内,室温条件下测定复合物粒径,每个样品测三次。向样品杯内小心倒入待测复合物溶液,并使溶液充满样品杯,盖上双侧塑料盖,放入样品槽内,室温条件下测定复合物zeta电位,每个样品测三次。
2.3复合物琼脂糖凝胶电泳阻滞实验
将复合物溶液各吸取9μl,以9:1的体积比与10×loading buffer混合,然后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳条件:电压80V,时间25min。电泳结束后,在凝胶成像仪紫外线下观察DNA条带。
2.4复合物的包封率测定
将质粒pVAX-HGF用纯水稀释成浓度为100μg/ml。称取聚合物PEI、PEG-PEI(25:1)、PEG-PEI(8.5:1)以及mix1配制所需不同浓度的载体溶液,并与质粒DNA配制成N/P为1、2、3、4、5、6的复合物溶液。于96孔板内每孔加入200μl双苯甲亚胺液(2μg/ml)。将待测样品于冷冻高速离心机内12000rpm离心4h,小心吸取10μl上清液至孔内中,轻轻拍打并晃动96孔板,将混合液混匀后,使用荧光酶标仪检测各孔OD值,每个样品设三个复孔。设置吸收波长为360nm,发射波长为460nm。
3.结果:
3.1复合物纳米粒的粒径和zeta电位
复合物纳米粒的粒径和zeta电位大小在细胞的内吞作用中有重要的意义,较小的粒径及表面略带电荷有利于复合物被细胞摄取。粒径与zeta均在马尔文粒度与电位仪上进行测定。图3a和图3b分别表示6种载体在不同N/P比值下与质粒DNA复合物的粒径和zeta电位结果
由图3a可以看出,PEI组复合物粒径为180-300nm;在N/P小于20时,变化较明显,随着N/P值的增大,粒径呈递减;当N/P大于20时,粒径逐渐趋于稳定,处于180nm左右。PEG-PEI组粒径变化趋势较PEI组更平缓,复合物粒径均为180nm-250nm。载体mix1、mix2、mix3比较发现,复合物粒径变化波动不大,且随着PEG-PEI质量分数增大,载体对DNA的压缩能力越明显,其中mix1组复合物粒径最小,在100nm左右,与其他组相比,更有助于细胞的摄取。
图3b是6种载体在不同N/P比值下与DNA复合物的zeta电位。从图中数据可以发现,各组复合物表面电位均大于+15mV;其中PEI组,复合物的电位在+35mV与+45mV之间波动变化;PEG-PEI组复合物随着N/P值的比增大,复合物表面的电位均波动不大,可能因为高比例的接枝率屏蔽了PEI表面正电荷,PEG-PEI组复合物表面电位在相同N/P值时,在各组中电位相对最低;而mix1、mix2、mix3三组比较发现,随着N/P值的增大,mix2、mix3组复合物表面电位逐渐升高,但mix1组几乎无波动,稳定处于+30mv,并且在相同N/P值时,mix1组复合物表面电位最小。细胞膜表面带负电,带正电荷的粒子易被细胞摄取,载体与DNA复合物表面略带正电,更有助于被细胞吞噬,并且对细胞的毒性伤害较小,从而能够提高转染率。
高接枝率的PEG能够有效屏蔽PEI表面正电荷,PEG-PEI共聚物所带电荷密度较低,与DNA结合时,复合物较疏松,导致粒径变大。而以PEG-PEI与PEI混合物作为载体时,既降低了复合物表面电荷,同时也增加了载体对DNA的压缩能力。因此,后续选择使DNA粒径压缩最小,又略带正电的mix1作为载体,进行后续实验。
3.2复合物琼脂糖凝胶电泳测定结合力
凝胶电泳阻滞实验能直观地反映载体对质粒DNA结合作用的强弱,核酸荧光染料DNAGreen和质粒DNA结合后,可在紫外线下显示强烈的荧光,当聚合物与DNA结合较紧密时,聚合物能够阻碍DNA Green插入到复合物中,在紫外光下看不到荧光;当聚合物与DNA结合不紧密时,DNA Green仍能够插入到复合物中,结合其中一部分质粒DNA,紫外光下观察可见显微弱的荧光。
结果如图4所示,发现当PEI组在N/P为2时,能够阻止DNA的电泳运动,即完全包裹;当PEG-PEI组在N/P为3时,能够将DNA包裹,但直至N/P为6时仍可看到微弱的荧光;而mix1组在N/P为3时,能够将DNA完全包裹。原因是PEG抵消了PEI的电荷,PEG-PEI和mix1与DNA结合不紧密或需要增加N/P值才能将质粒DNA完全结合。
3.3复合物包封率
按表1加样方式绘制标准曲线,以OD值为横坐标,DNA含量为纵坐标,结果如图5所示,在10ng-1μg范围内,线性关系良好,标准曲线方程为,y=113.52x+910.8(r2=0.9982)。
表1:
双苯甲亚胺是一种用来定量样品中双链DNA(dsDNA)的超灵敏荧光染料,DNA浓度的线性检测范围可以从50ng/ml到5μg/ml,检测的灵敏度和检测范围远远超过采用紫外分光光度计检测其在260nm吸收值的方法,并且双苯甲亚胺特异性的和dsDNA紧密结合,不受样品中RNA及单链DNA的干扰。
测得聚合物与DNA在不同N/P下形成复合物的包封率(表2),从表中可以发现,当N/P为4时,mix1可将质粒DNA完全包裹,包封率达99.8%,这与凝胶电泳阻滞实验基本相符。
表2不同复合物在不同N/P值时的包封率
实施例3 PEG-PEI介导质粒DNA的转染效率和细胞毒性的研究
3.1携带绿色荧光蛋白基因的质粒DNA转染A549细胞
制备PEI/pEGFP-C1,PEG-PEI/pEGFP-C1(25:1),PEG-PEI/pEGFP-C1(8.5:1),mix1/pEGFP-C1复合物溶液,每组均设5个N/P值梯度:5、10、15、20、25。阳性对照组为阳离子脂质体lipo2000,以最佳比例进行转染。每个样品设3个复孔。
转染前一天将A549细胞以5000个/孔的密度分别接种于96孔板中,培养约24小时后,细胞融合度达70%-80%时可进行转染。弃去旧培养液,用PBS缓冲液清洗细胞两次,加入100μl新的无胎牛血清的培养基,重新将96板置于细胞培养箱内。向EP管中加入76μl1640培养基溶液,然后加入4μl lipo2000,吹吸混匀;用不含血清的1640培养基溶液,将pEGFP-C1稀释成20ng/μl;脂质体和质粒DNA稀释液分别室温静置5min,将二者等体积充分混合并室温孵育20min。然后再超净台内向96孔板细胞中逐滴加入制备好的复合物溶液,每孔20μl(含0.2μg DNA),轻晃并拍打培养板,使复合物分布均匀,将96孔板重新放回培养箱内。培养4-8个小时,弃去旧培养液,PBS缓冲液清洗细胞两次,各孔加入100μl完全培养基(含10%胎牛血清),于细胞培养箱内继续培养。转染24小时后,于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。
为了直观地观察载体的转染能力,采用pEGFP作为报告基因,在A549两种细胞中进行转染实验,并通过荧光显微镜拍得绿色荧光照片。
图6是各聚合物载体介导的pEGFP质粒DNA在A549细胞中表达后的荧光照片。可以看出,在A549细胞中,聚合物PEI介导转染的细胞荧光图片中转染趋势是随N/P值增大图片中绿色亮点增多,当N/P为大于15时转染率逐渐减少,可能是由于PEI表面多余的正电荷的细胞毒性而致。而共聚物PEG-PEI组绿色荧光蛋白的表达均较低,可能是由于接枝的PEG抵消了PEI的正电荷,进而影响了细胞对复合物的内吞作用,导致进入细胞的基因量减少,从而表达减少;mix1组A549细胞图片中,绿色荧光点明显增多,且随N/P值增大转染效率也升高,当N/P为25时,mix1介导的转染效率最高,说明以PEI与PEG-PEI混合物作为载体介导基因进行转染的方式能够基因转染。
3.2复合物对A549细胞的毒性评价
参照前述方法制备PEI/pVAX-HGF,PEG-PEI/pVAX-HGF(25:1),PEG-PEI/pVAX-HGF(8.5:1),mix/pVAX-HGF复合物溶液,每组均设6个N/P值梯度:10、20、40、60、80、100。每个样品设3个复孔。
将A549细胞分别以5000个/孔的密度铺于96孔板内,置于细胞培养箱内培养24小时,弃去旧培养液,用PBS清洗细胞2次,向每孔加入80μl完全培养基(含10%血清)溶液,然后向培养板中样品孔每孔加入20μl样品溶液,对照孔中加20μl培养基溶液,空白孔为无细胞的培养基溶液,然后轻拍及摇晃培养板,使溶液混合均匀;将培养板在细胞培养箱内孵育,12小时后,向每孔中加入10μl CCK-8溶液(注:不要在空中生成气泡,否则会影响吸光度值),轻轻晃动培养板,使培养板内液体混匀。将培养板重新放入细胞培养箱内继续孵育2小时,然后将培养板置于多功能酶标仪内,测定细胞在450nm处的吸光度值。
根据细胞OD450值按照以下公式计算细胞存活率:
细胞存活率(%)=[(样品孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100%。
细胞毒作用是物质能否作为载体的重要指标之一,CCK-8的方法是用于测定细胞毒性试验中活细胞数量的一种灵敏度高,且方便操作的方法。本实验采用A549细胞作为研究载体的对象,考查了聚合物载体在不同N/P值时的细胞活力,并由此比较载体对细胞毒性的大小及安全使用范围。
阳离子聚合物载体的毒性的产生,主要原因是其表面正电与细胞膜的负电相互作用过强致使细胞膜结构损坏,不仅会引起细胞凋亡,还会在一定程度上降低基因转染效率。由图7可见,载体在细胞中呈现一定的细胞毒性。
载体聚合物作用细胞后,细胞活力变化如图7所示,PEI毒性最大,且变化幅度最大;PEG-PEI共聚物及mix组在N/P小于40时,A549细胞的细胞活力均在85%以上。
这是由于PEG对PEI的修饰能够有效掩蔽其表面过量的正电荷,阻碍PEI在转染过程中与细胞膜表面带负电的蛋白及磷脂类物质非特异性结合,从而损伤细胞;而且PEG为低毒性,水溶性较好的聚合物,PEG结合PEI能够增加载体的生物相容性;此双重因素有效降低PEI的细胞毒性。
实施例4 mix1/pVAX-HGF复合物的稳定性及形态学观察
4.1复合物稳定性检测
参照前述方法制备PEI/pVAX-HGF、PEG-PEI/pVAX-HGF、mix1/pVAX-HGF复合物溶液。向100μl pVAX-HGF终浓度为50μg/ml的复合物溶液中加入不同体积的肝素钠(肝素是线性阴离子聚电解质,大分子量的PEI含有较多的阳离子结合位点,肝素可与同样带负电的质粒DNA竞争性结合PEI和PEG-PEI),混匀后,室温放置45min,进行琼脂糖凝胶电泳检测,并在紫外灯下观察DNA条带。
结果如图8所示(其中N表示裸质粒pVAX-HGF,C表示复合物组,数字分别表示不同体积的肝素,M表示DL15000的DNA分子标记),结果可见共聚物组加2μl肝素时PEG-PEI/pVAX-HGF完全解离,而mix1组加4μl(即25IU)的肝素时复合物还未完全解离。说明mix1和质粒DNA结合更加紧密与稳定。
4.2 mix1/pVAX-HGF的结构形态观察
参照前述方法制备mix1/pVAX-HGF复合物溶液,取复合物一滴滴加铜网上,平放15min,用滤纸吸去多余液体,自然干燥后用醋酸铀染色2min,用滤纸吸去多余液体,自然干燥后置于透射电镜显微镜下观察复合物纳米粒的形态。
复合物纳米颗粒外层是水溶性的,易被醋酸铀染色,固颜色较深。在透射电镜下观察发现复合物形态为椭圆形或圆形,粒径为50-100nm。粒径低于粒度仪所测,可能是由于检测形态时干燥环境下,复合物纳米粒收缩所致(见图9,TEM,50000×)。
实施例5 mix1/pVAX-HGF复合物对大鼠肺纤维化的治疗作用
5.1大鼠肺纤维化模型的建立
60只雄性SD大鼠,按照体重随机分成4组,分别为:空白对照组(15只),模型组(15只)、mix1/pVAX-HGF治疗组(N/P=25)(15只)、裸质粒pVAX-HGF治疗组(15只)。
采用2%异戊巴比妥钠按50mg/kg剂量腹腔注射于各组大鼠,3-5min大鼠处于麻醉状态后,将其取仰卧位固定于鼠板上,并将鼠板与水平面呈45-60°角固定,用镊子将鼠舌拉至一侧,将支气管喉镜探入大鼠口腔,观察到呈开闭状态的支气管口,将微型喷雾注射器沿支气管口插入气管;其中模型组,mix1/pVAX-HGF、裸质粒pVAX-HGF组,向大鼠气管内按剂量(5mg/kg)一次性雾化喷入博莱霉素,而空白对照组大鼠气管内一次性雾化喷入相应体积的生理盐水。造模后每天观察大鼠状态并称量其体重。
5.2 mix1/pVAX-HGF对博莱霉素致大鼠肺纤维化的治疗作用
造模后第7天按方法向各组大鼠肺内注射基因药物(mix1/pVAX-HGF和裸质粒pVAX-HGF)250μl,其中空白对照组和模型组注射等体积纯水代替。给药后,分别在第7天、第14天、第28天检测各组大鼠肺功能变化,并在此三个时间点处死各组5只大鼠。
5.2.1 mix1/pVAX-HGF对肺纤维化大鼠体重的影响
分别于造模第0、1、2、3、4、5周称量各组大鼠体重,以观察肝细胞生长因子对肺纤维化大鼠体重的影响。
从图10中可以看出,造模后正常组大鼠体重呈逐渐升高状态,而模型组、mix1/pVAX-HGF和裸质粒pVAX-HGF在造模后第一周内体重迅速下降至150g以下,且与同时间点正常组大鼠体重有显著差异(p<0.01);初步判断博莱霉素诱导成功,导致大鼠进食量下降。造模后一周开始给药,从图中可以看出,给药后,mix1/pVAX-HGF治疗组大鼠体重缓慢升高,但体重始终低于正常组,且与正常组相比,有显著性差异(p<0.01)。
5.2.2 mix1/pVAX-HGF对肺纤维化大鼠肺功能的影响
给药后第7天,分别从各组动物中取5只大鼠(共20只),在肺功能检测室温适应1h后,放入系统呼吸装置的流量信号器内,适应数分钟,待大鼠呼吸平稳后,检测大鼠的各肺功能指标,分别为:潮气量(平静呼吸时每次吸入或呼出的气体量VT)、每分通气量(平静呼吸时每分钟吸入或呼出的气体量Mvv)、50%呼气流量(肺活量为50%时的呼气流量EF50%)、吸气峰流速(一个呼吸周期波中的最大负值流量PIF)、呼气峰流速(一个呼吸周期波中的最大正值流量PEF)。用于评价给药后大鼠肺功能的变化。给药后第14天、第28天仍然取上述20只大鼠重复以上操作。
由图11a、图11b、图11c、图11d及图11e(与正常组比较(**P<0.01);与模型组比较(##P<0.01)可发现,在给药后第7天,mix1/pVAX-HGF治疗组大鼠的50%呼气流量、每分通气量、呼气峰流量、吸气峰流量及潮气量均高于模型组,说明HGF对肺纤维化有一定的治疗作用。
5.2.3 mix1/pVAX-HGF对肺纤维化大鼠病理损伤的影响
收集BALF后,左肺弃去,小心分离完整右肺组织,生理盐水中小心清洗残血3次,并用滤纸吸去肺表面水分,分别剪下右肺中叶固定于10%福尔马林溶液中,石蜡包埋切片,HE染色,于倒置显微镜下观察给药后第7天、第14天、第28天各组大鼠肺组织的病理学变化。
HE染色结果显示(见图12,其中,A代表正常对照组;B代表模型组;C代表mix1/pVAX-HGF组;D代表pVAX-HGF组;1表示给药后第7天;2表示给药后14天;3表示给药后第28天;HE×200),正常对照组给药后第7天、第14天、28天肺泡无炎细胞浸润,无充血水肿,肺间质无纤维化。注射BLM后,模型组可见肺泡结构紊乱,肺泡壁增厚,部分肺泡塌陷融合,有炎性细胞浸润;给药后第14天和第28天,细胞外基质大量沉积,成纤维细胞过度增殖,肺组织可见大片的实变,肺泡间隔明显增宽,纤维化程度严重,肺泡结构完全丧失,显示造模成功。mix1/pVAX-HGF组给药后第7天,可见炎症细胞浸润较少,肺泡壁明显增厚;第14天,肺组织可见肺泡间隔增宽,肺泡结构有破坏,肺泡腔缩小,纤维组织增生,肺组织局灶性实变,较模型组有差异;而pVAX-HGF组肺组织病理改变与模型组相似,可见大量炎性细胞浸润,肺间质成纤维化明显,成纤维细胞过度增殖,肺泡间隔增宽。说明可能HGF基因对肺纤维化有一定的缓解作用。
5.2.4 mix1/pVAX-HGF对肺纤维化大鼠肺组织胶原沉积的影响
取前述肺组织石蜡包埋切片,Masson染色,于倒置显微镜下观察给药后第7天、第14天、第28天各组大鼠肺组织胶原沉积的影响。
Masson染色结果显示(见图13,注:A.正常对照组;B.模型组;C.mix1/pVAX-HGF组;D.pVAX-HGF组;1.给药后第7天;2.给药后14天;3.给药后第28天;Masson×2000),蓝色部分表示胶原沉积。可见模型组、裸质粒组的肺组织较对照组有明显的胶原沉积,肺部大片实,大量条索状纤维生成,而mix1/pVAX-HGF组在给药后第7天和第14天能够减少胶原的产生。
5.2.5 mix1/pVAX-HGF对肺纤维化大鼠支气管肺泡灌洗液(BronchoalveoarLavage Fluid,BALF)中总细胞数的影响
给药后第7天,分别从各组动物中取5只大鼠,采用2%异戊巴比妥钠按50mg/kg剂量腹腔注射于各组大鼠,3-5min大鼠处于麻醉状态后,采用腹主动脉放血的方式处死大鼠。迅速剪开大鼠颈部皮肤,小心钝性分离颈部肌肉,暴露气管,用持针器将气管挑起,剪一倒“T”型切口,将16号平头针头插入气管,棉线固定,持针器开胸,并结扎大鼠右肺,然后通过针头向大鼠左肺缓慢轻柔注入2ml 4℃预冷无菌生理盐水,反复抽洗3次,每次回抽率在保证在80%以上,重复灌洗两次,合并灌洗液,80目细胞筛滤去灌洗液中杂质,滤液与光学显微镜下计细胞总数,评价肺部炎性细胞浸润程度。给药后第14天、第28天分别取各组5只大鼠重复以上操作。
从图14中可以看出,给药后第7、14、28天,模型组大鼠BALF中总细胞数均显著高于正常组,说明博莱霉素可导致大鼠肺炎性细胞及成纤维细胞显著增多;与模型组相比,给药后第7、14、28天,mix1/pVAX-HGF治疗组大鼠BALF中总细胞数减少,且在第7天时,有统计学差异(p<0.05);而裸质粒pVAX-HGF治疗组大鼠BALF中总细胞数在各时间段与模型组相当,较正常组明显增多。
5.2.6 mix1/pVAX-HGF对肺纤维化大鼠肺组织羟脯氨酸(HYP)含量的影响
收集BALF后,左肺弃去,小心分离完整右肺组织,生理盐水中小心清洗残血3次,并用滤纸吸去肺表面水分,分别剪下右肺上叶迅速放入液氮中,最后将肺组织从液氮中移入-80℃超低温冰箱保存。检测时取出冻存的肺组织并严格参照羟脯氨酸(碱水解法)试剂盒说明书检测各组大鼠在给药后第7天、第14天、第28天肺组织中HYP的含量变化。
从图15中可以看出,给药后第7、14、28天,模型组大鼠肺组织各时间点HYP的含量均高于正常组(P<0.05或P<0.01),说明造模成功;而给药后第7、14天,mix1/pVAX-HGF治疗组大鼠肺组织中HYP含量显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),但给药后第28天mix1/pVAX-HGF治疗组大鼠肺组织中HYP含量与模型组无显著性差异;裸质粒pVAX-HGF治疗组在各时间点HYP含量均显著高于正常组(P<0.01),且和模型组无显著性差异。
5.2.7 mix1/pVAX-HGF对肺纤维化大鼠肺组织Col-Ⅰ含量的影响
分别剪下右肺下叶迅速放入液氮中,然后将肺组织从液氮中移入-80℃超低温冰箱保存。检测时取出冻存的肺组织,称取肺组织块质量放于1.5ml EP管中,按1:9质量比加入生理盐水,于组织匀浆机中匀浆,4℃离心机离心,取上清,严格参照Col-ⅠELISA试剂盒说明书检测各组大鼠在给药后第7天、第14天、第28天肺组织中Col-Ⅰ的含量变化。
从图16((与正常组比较**P<0.01;与模型组比较(##P<0.01))中可以看出,给药后第7、14、28天,模型组大鼠肺组织各时间点Col-Ⅰ的水平均显著高于正常组,说明造模成功;而给药后第7、14、28天,mix1/pVAX-HGF治疗组大鼠肺组织中Col-Ⅰ低于模型组,其中第7天与模型组相比有统计学差异(P<0.05),说明mix1/pVAX-HGF能够抑制肺纤维化的发展;而裸质粒pVAX-HGF治疗组和模型组无显著性差异。
从以上的描述中,可以看出,本发明上述的实施例实现了如下技术效果:本申请通过合成高接枝率的聚乙二醇-聚乙烯亚胺(PEG-PEI)共聚物,结合PEI高转染效率和PEG的低毒性特点,将PEG-PEI共聚物与PEI的混合物作为基因递送载体,递送pVAX-HGF至肺纤维化大鼠肺内,实现了HGF基因对肺纤维化的治疗作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (24)
1.一种基因递送载体,其特征在于,所述基因递送载体包括PEG-PEI共聚物以及与所述PEG-PEI共聚物物理共混的PEI,所述PEG-PEI共聚物与所述PEI物理共混的质量比为2~5:1,所述PEG-PEI共聚物的接枝率为5~25:1。
2.根据权利要求1所述的基因递送载体,其特征在于,所述PEG-PEI共聚物与所述PEI物理共混的质量比为3:1。
3.根据权利要求1所述的基因递送载体,其特征在于,所述PEG-PEI共聚物的接枝率为25:1。
4.根据权利要求1所述的基因递送载体,其特征在于,所述PEI及形成所述PEG-PEI共聚物的PEI为直链或支链PEI。
5.根据权利要求4所述的基因递送载体,其特征在于,所述PEI的分子量为20000~30000。
6.根据权利要求5所述的基因递送载体,其特征在于,所述PEI的分子量为25000。
7.根据权利要求6所述的基因递送载体,其特征在于,形成所述PEG-PEI共聚物的PEG的分子量为3000~10000。
8.根据权利要求7所述的基因递送载体,其特征在于,形成所述PEG-PEI共聚物的PEG的分子量为5000。
9.一种药物复合物,所述药物复合物包括药物载体及所述药物载体包封的基因药物,其特征在于,所述药物载体为权利要求1至8中任一项所述的基因递送载体。
10.根据权利要求9所述的药物复合物,其特征在于,所述基因药物为携带有HGF基因的质粒DNA。
11.根据权利要求10所述的药物复合物,其特征在于,所述基因药物为pVAX-HGF。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的药物复合物,其特征在于,所述药物复合物中,所述药物载体对所述基因药物的包封率,按照N/P的摩尔比计,为1~40。
13.根据权利要求12所述的药物复合物,其特征在于,所述药物复合物中,所述药物载体对所述基因药物的包封率,按照N/P的摩尔比计,为5~30。
14.根据权利要求13所述的药物复合物,其特征在于,所述药物复合物中,所述药物载体对所述基因药物的包封率,按照N/P的摩尔比计,为15~25。
15.根据权利要求14所述的药物复合物,其特征在于,所述药物复合物中,所述药物载体对所述基因药物的包封率,按照N/P的摩尔比计,为20~25。
16.根据权利要求15所述的药物复合物,其特征在于,所述药物复合物中,所述药物载体对所述基因药物的包封率,按照N/P的摩尔比计,为25。
17.根据权利要求9至11中任一项所述的药物复合物,其特征在于,所述药物复合物的粒径为85~250nm。
18.根据权利要求17所述的药物复合物,其特征在于,所述药物复合物的粒径为90~110nm。
19.根据权利要求18所述的药物复合物,其特征在于,所述药物复合物的粒径为100nm。
20.根据权利要求9至11中任一项所述的药物复合物,其特征在于,所述药物复合物的zeta电位为+20~45mV。
21.根据权利要求20所述的药物复合物,其特征在于,所述药物复合物的zeta电位为+25~35 mV。
22.根据权利要求21所述的药物复合物,其特征在于,所述药物复合物的zeta电位为28~32 mV。
23.一种抗肺纤维化药物,其特征在于,所述抗肺纤维化药物为权利要求10至22中任一项所述的药物复合物。
24.权利要求1至8中任一项所述的基因递送载体在制备基因治疗药物中的应用。
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